CN111579791A - 一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒 - Google Patents

一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种锌转运体8胰岛自身抗体（ZnT8A）的电化学发光检测试剂盒，属于生物医学检测技术领域。该试剂盒的检测原理是将经过标记的重组ZnT8抗原蛋白分子置于非放射性液相环境进行结合，血清中的ZnT8自身抗体在液相环境中与硫代钌衍生物活性酯标记的重组ZnT8胰岛抗原蛋白充分结合，同时通过与生物素聚乙二醇活性酯标记的重组ZnT8胰岛抗原蛋白被抓取固定于链霉亲和素石墨烯平板上，血清中的抗体量通过结合于特异性抗体的抗原蛋白上硫代钌衍生物活性酯（Sulfo‑TAG）所释放的信号计算即可得到。该试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，操作简便无放射污染，具有很好的临床应用价值。

Description

一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒及其应用。
背景技术
1型糖尿病(type 1diabetes mellitus,T1DM)是遗传易感个体在某些环境因素(病毒感染、营养等)触发下，由自身免疫介导的以胰岛β细胞损害为主要特征的器官特异性自身免疫性疾病。胰岛自身抗体是目前T1DM胰岛β细胞自身免疫破坏的最可靠生物学标志，对胰岛自身抗体的检测有助于了解T1DM的自身免疫病程，并对T1DM患者的诊断、鉴别诊断，以及一般人群和患者一级亲属的风险预测有极大的价值。目前公认的胰岛自身抗体包括谷氨酸脱酸酶抗体(glutamic acid decarboxylase-65autoantibodies,GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(insulinoma antigen 2autoantibodies,IA-2A)、胰岛素自身抗体(insulin autoantibodies,IAA)和锌转运体-8自身抗体(zinc transporter-8autoantibodies,ZnT8A)。
ZnT8特异性的表达在胰岛β细胞分泌囊泡膜上，通过将Zn2+从细胞质向富含胰岛素的囊泡内聚集，参与胰岛素的成熟和储存。其自身抗体ZnT8A在T1DM患者中较早出现，2岁以上患者中的阳性率随着年龄增长而增加，且稳定性高。在其他胰岛自身抗体均为阴性的以T1DM临床特征起病的初诊糖尿病患者中有26％的患者ZnT8A呈阳性。因此，ZnT8A被认为是独立于经典抗体、年龄、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)以外的T1DM标志物，对GADA，IA2A和IAA有重要的补充作用，在传统抗体的基础上联合检测ZnT8A将大大提高T1DM发病初期阳性抗体的检出率。
目前，ZnT8A的检测方法主要有酶联免疫吸附试验法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)、化学发光法(chemiluminescent immunoassay,CLIA)、荧光素酶免疫沉淀法(luciferase immunoprecipitation system，LIPS)和放射免疫沉淀法(radio-binding assay,RBA)。从国际胰岛自身抗体标准化检测小组(islet autoantibodystandardization program,IASP)的随机盲测认证结果来看，不论是检测的敏感性还是特异性，RBA-ZnT8A检测法均显著优于其他抗体检测法，是目前国际上唯一公认的ZnT8A检测金标准。然而，RBA抗体检测方法由于放射性核素的使用，对临床推广工作带来了限制。CLIA和LIPS法的检测灵敏度与RBA法接近，但可能存在非特异性荧光干扰等问题，影响了其检测结果的特异性。
发明内容
本发明针对现有RBA-ZnT8A检测法存在的由于使用放射性核素而限制临床推广这一技术问题，提供了一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒，通过建立高敏电化学法(ECL)用于ZnT8A检测，该方法具有较高的灵敏度和特异性，操作简便无放射污染，具有很好的临床应用价值。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒，包括：标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白、标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白、链霉亲和素石墨烯平板和信号激发液；
所述重组ZnT8胰岛抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述试剂盒还包括：pH 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白。
进一步地，所述标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白是将重组ZnT8胰岛抗原蛋白与生物素聚乙二醇活性酯混合，避光孵育后经纯化得到。
进一步地，所述标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白是将重组ZnT8胰岛抗原蛋白分别与硫代钌衍生物活性酯混合，避光孵育后经纯化得到。
利用上述试剂盒检测样本中锌转运体8胰岛自身抗体的方法，包括以下步骤：
步骤1，将抗原缓冲液加至待测血清样本中，孵育，得到抗原-抗体复合物；
步骤2，用封闭液对链霉亲和素石墨烯平板进行封闭处理；
步骤3，将抗原-抗体复合物加至封闭后的链霉亲和素平板上，然后加入信号激发液，通过MSD电化学发光仪检测硫代钌衍生物活性酯的发光信号，判断待测血清样本中是否存在目标抗体以及目标抗体的含量；
所述抗原缓冲液是将标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白和标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白加至抗原稀释液中得到，所述抗原稀释液为5％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述抗原缓冲液中标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白和标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8胰岛抗原蛋白的浓度比为：25～6400ng/mL:25～6400ng/mL。
有益效果：
1、本发明中使用的重组ZnT8胰岛抗原蛋白由重组人ZnT8质粒经昆虫细胞系统表达，在给予生物素聚乙二醇活性酯和硫代钌衍生物活性酯修饰和结合位点的同时，不改变蛋白本身的自然结构域，因此极大的保持了ZnT8胰岛抗原蛋白与血清自身抗体结合反应的关键生物基团活性。
2、与其他检测方法相比，本发明的ECL-ZnT8A基于电化学发光技术，信号分子硫代钌衍生物活性酯需在电激发的情况下才能产生信号，因此整个实验流程无需避光，不受实验操作人员技术水平差异的影响。
3、在实验完成加入所有液体后，并不会被激发出任何信号。只有送入仪器，通过电极电激发后方才产生信号，每孔激发与信号采集时长统一，避免了像ELISA底物与终止液加入顺序先后所导致的数据差异，数据稳定度极高。
4、与常规抗体检测法不同，进行第二抗体标记的抗人IgG抗体不用于胰岛特异性抗体检测，从而避免了血清自身抗体测定中的高背景。
5、由于在ECL-ZnT8A测定中，标记的胰岛抗原蛋白能够捕获血清中所有类别的免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA和IgE)，故相较于传统ZnT8A抗体检测法，ECL-ZnT8A具有更高的检查灵敏度。
6、ECL-ZnT8A能有效检出更高亲和力、更高风险的疾病特异性胰岛自身抗体，降低由于交叉分子免疫反应引起的非疾病特异性低亲和力一过性抗体的假阳性率。
附图说明
图1为实施例1中标记前后ZnT8抗原蛋白的可有效的吸收阳性血清中的ZnT8A。
图2为实施例1中依据158例健康对照者血清ECL-ZnT8A指数的99％百分位数确定阳性界值。
图3为实施例1中ECL-ZnT8A和RBA-ZnT8A检测ZnT8A指数的相关性(n＝120)。
具体实施方式
目前，胰岛自身抗体的生物学检测技术不断进步。在现有的ZnT8A检测方法中，RBA-ZnT8A检测的敏感性和特异性均优于其他方法，尤其在对T1DM患者的诊断和预测具上显示出极大的优势。其主要原因可能在于传统的ELISA等检测方法中，用于检测的抗原蛋白被固定于固相板，从而限制了抗原识别表位和血清中抗体的结合。而RBA-ZnT8A检测法是一种利用放射核素标记抗原蛋白的液相检测方法，能使抗原抗体进行充分的免疫结合，是国际上公认的ZnT8A标准化检测金标准。然而，RBA-ZnT8A检测方法由于放射性核素的使用，对临床推广工作带来了限制。CLIA和LIPS法的检测灵敏度与RBA法接近，但可能存在非特异性荧光干扰等问题，影响了其检测结果的特异性。
基于以上限制，本发明开发建立了新型ECL-ZnT8A检测法，其检测原理是将经过标记的重组ZnT8抗原蛋白分子置于非放射性液相环境进行结合，血清中的ZnT8自身抗体在液相环境中与硫代钌衍生物活性酯标记的重组ZnT8胰岛抗原蛋白(ZnT8-Sulfo-TAG)充分结合，同时通过与生物素聚乙二醇活性酯标记的重组ZnT8胰岛抗原蛋白(ZnT8-Biotin)被抓取固定于链霉亲和素石墨烯平板上，血清中的抗体量通过结合于特异性抗体的抗原蛋白上Sulfo-TAG所释放的信号计算所得。与其他检测方法相比，ECL-ZnT8A基于电化学发光技术，信号分子Sulfo-TAG需在电激发的情况下才能产生信号，因此整个实验流程无需避光，不受实验操作人员技术水平差异的影响。此外，在实验完成加入所有液体后，并不会被激发出任何信号。只有送入仪器，通过电极电激发后方才产生信号，每孔激发与信号采集时长统一，避免了像ELISA底物与终止液加入顺序先后所导致的数据差异，数据稳定度极高。此外，与常规抗体检测法不同，进行第二抗体标记的抗人IgG抗体不用于胰岛特异性抗体检测，从而避免了血清自身抗体测定中的高背景。
本发明首先验证了ECL检测中用于与自身抗体结合的重组ZnT8抗原蛋白的有效性，并通过棋盘稀释法，确定了400ng/mL的ZnT8-Biotin和200ng/mL的ZnT8-Sulfo-TAG为ECL-ZnT8A反应体系的最适浓度。然后，选取了ZnT8A指数低、中、高的血清在批内和批间各重复检测5次，验证了该方法稳定可靠，与RBA-ZnT8A的阳性判断一致性高达96.70％(Kappa值为0.929)，且ZnT8A指数呈显著正相关(相关系数r＝0.806，P＜0.001)。ECL检测T1DM患者的ZnT8A阳性率为52％(52/100)，显著高于健康对照组的0.99％(2/202)和T2DM组的1.3％(2/150)。
由于在ECL-ZnT8A测定中，标记的胰岛抗原蛋白能够捕获血清中所有类别的免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA和IgE)，故相较于RBA抗体检测法，ECL-ZnT8A具有更高的检查灵敏度。结果中显示的3例ECL-ZnT8A阳性而RBA-ZnT8A阴性的血清样本有2例来自于经RBA证实除ZnT8A外其他胰岛自身抗体阳性的T1DM患者，而另1例血清的ZnT8A指数则均在两种方法的阳性判断界值附近。抗体的疾病特异性是指具有疾病诊断和鉴别价值的高亲和力和高风险抗体。既往检出的携带非疾病特异性低亲和力阳性胰岛自身抗体的人群，尤其是携带单一阳性抗体者，在临床随访中并未观察到自身免疫糖尿病的发病。而在数月至数年内进行的后续抗体检测中，这些原先阳性的自身抗体丢失，表现为“短暂的一过性阳性”，即生物学上的“假阳性”。本发明结果中显示的1例RBA-ZnT8A阳性而ECL-ZnT8A阴性的样本来自于健康对照组血清，说明ECL-ZnT8A能有效检出更高亲和力、更高风险的疾病特异性胰岛自身抗体，降低由于交叉分子免疫反应引起的非疾病特异性低亲和力一过性抗体的假阳性率。
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
本发明采用的信号激发液购自Meso Scale Diagnostics，R92TC-1；生物素聚乙二醇活性酯购自Thermo，A39259；硫代钌衍生物活性酯购自Meso Scale Diagnostics，R91AO-2；磷酸盐缓冲液购自Sigma；牛血清白蛋白(BSA)购自Roche，738328。
本发明中的重组ZnT8胰岛抗原蛋白是由重组人ZnT8质粒经转录翻译获得，具体过程如下：
1、根据GenBank公布的ZnT8全长基因编码序列，选取ZnT8-R/W抗原蛋白C末端(aa268-369)作为克隆表达序列，设计特异性上下游引物，采用重叠延伸PCR技术进行重组人ZnT8基因的扩增和纯化，获得目的基因ZnT8-R/W(aa 268-369)碱基序列如下：GAAGGTGTGCCAAAGAGCCTGAATTACAGTGGTGTGAAAGAGCTTATTTTAGCAGTCGACGGGGTGCTGTCTGTGCACAGCCTGCACATCTGGTCTCTAACAATGAATCAAGTAATTCTCTCAGCTCATGTTGCTACAGCAGCCAGCCGGGACAGCCAAGTGGTTCGGAGAGAAATTGCTAAAGCCCTTAGCAAAAGCTTTACGATGCACTCACTCACCATTCAGATGGAATCTCCAGTTGACCAGGACCCCGACTGCCTTTTCTGTGAAGACCCCTGTGACGGTGGCGGGTCAGGCGGAAGCGGTGGAGGCTC CGAAGGTGTGCCAAAGAGCCTGAATTACAGTGGTGTGAAAGAGCTTATTTTAGCAGTCGACGGGGTGCTGTCTGTGCACAGCCTGCACATCTGGTCTCTAACAATGAATCAAGTAATTCTCTCAGCTCATGTTGCTACAGCAGCCAGCTGGGACAGCCAAGTGGTTCGGAGAGAAATTGCTAAAGCCCTTAGCAAAAGCTTTACGATGCACTCACTCACCATTCAGATGGAATCTCCAGTTGACCAGGACCCCGACTGCCTTTTCTGTGAAGACCCCTGTGAC(SEQ ID NO.2)。
将纯化后的PCR产物接入pFast-bac1载体的BamH I和Hind III之间，获得pFast-bac1-ZnT8-R/W(aa 268-369)表达质粒。将获得的重组质粒转入TOP10克隆株，挑取阳性克隆子测序，结果显示获得序列与理论序列100％匹配。
2、构建重组杆状病毒表达载体Bacmid：DH10Bac E.coli感受态细胞冰上解冻，将200ng的pFast-bac1-ZnT8-R/W(aa 268-369)转移载体缓慢加入感受态细胞中，轻轻混匀；冰浴30min，然后42℃水浴热激90s，再次冰浴5min；无菌条件下向培养管中加入900μL的SOC培养基，37℃、225rpm，振荡培养4h；将培养好的菌液于3500rpm，离心3min，弃去大部分上清，留约100μl培养基重悬菌体；将重悬液均匀涂布于LB平板(含50μg/mL的卡那霉素、7mg/mL的庆大霉素、10mg/mL的四环素、100mg/mL的x-gal、40mg/mL的IPTG)上，37℃倒置培养48h，观察菌落生长情况。随机挑取平板上的白色单克隆菌落进行PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测经过PCR鉴定显示在预计的分子量大小处出现目的条带，表明有外源基因片段的插入。
将Bacmid转染sf9细胞并培养，当细胞出现感染迹象时，转移细胞上清至15mL离心管，1000rpm离心5min去除细胞及碎片，将含病毒的上清液转移至另一无菌EP管，并进行病毒扩增及收获。Sf9细胞以2×106/mL瓶接种于500mL细胞培养瓶中；待细胞生长至对数期，接病毒感染sf9细胞；48～72h内收集细胞及上清，用于重组蛋白表达。
利用低压层析系统，上清液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值达到基线；用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCL，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值达到基线；用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCL，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(pH 7.4)进行透析过夜；进行10％SDS-PAGE分析，证实获得重组ZnT8胰岛抗原蛋白，其氨基酸序列为：6×HIS-TAG*MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHV ATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCDGGGSGGSGGGS MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASWDS QVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD*6×HIS-TAG(SEQ ID NO.1)。
在上述过程中，重组人ZnT8-R/W(aa 268-369)基因由两段ZnT8基因胞内段C末端从268-369的氨基酸重复序列组成，中间由铰链(SEQ ID NO.2中划线部分)进行连接。其中第一段序列的325位点为精氨酸(R)，第二段序列的325位点为色氨酸(W)。该重组人ZnT8基因涵盖了亚洲人与白人的325位点的常见等位基因，在捕获ZnT8胰岛自身抗体的过程中起着重要的作用。
重组人ZnT8质粒的表达选用昆虫细胞表达系统作为外源基因表达载体是因为：(1)昆虫细胞表达系统基因组较小，且基因组上有多种限制性内切酶酶切位点，使其易于操作且理论上可容纳任何外源基因；(2)昆虫细胞表达系统基因中有很多极晚期基因，它们能够高效表达目的蛋白；(3)作为真核表达系统的一种，能对目的蛋白进行表达后修饰。
合适的蛋白质表达体系对翻译后的蛋白质活性至关重要，本发明选用昆虫细胞表达系统表达出的蛋白质不仅高效、稳定，而且极大的保持了其关键的生物基团活性，这对后续的修饰与结合至关重要。
进一步地，为了保证后续检测实验的准确性，在本发明中需要精确控制重组ZnT8胰岛抗原蛋白的标记过程，以确保重组ZnT8胰岛抗原蛋白上活性基团能与标记物的有效结合，且不影响后续对ZnT8胰岛自身抗体的捕获。经上述昆虫细胞表达系统翻译后的重组ZnT8胰岛抗原蛋白分两部分进行标记：一部分与生物素聚乙二醇活性酯(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)反应，生成生物素标记的重组ZnT8胰岛抗原蛋白(ZnT8-Biotin)；另一部分与硫代钌衍生物活性酯(Sulfo-TAG)反应，生成硫代钌衍生物标记的重组ZnT8胰岛抗原蛋白(ZnT8-Sulfo-TAG)。具体标记条件如下：在弱碱性条件(pH 7.4～7.9)下以1:10-1:15的摩尔比例将重组ZnT8胰岛抗原蛋白分别与3mmol/L的生物素聚乙二醇活性酯和3mmol/L的硫代钌衍生物活性酯混合反应1-2小时，过柱纯化，去除未标记上的生物素聚乙二醇活性酯和硫代钌衍生物活性酯，计算标记后的浓度，以备后用。
实施例1
本实施例中，采用的RBA-ZnT8A检测主要步骤是经试管内快速转录翻译的35S标记ZnT8抗原蛋白与待测血清在4℃过夜孵育后，抗原抗体复合物被包被有蛋白A-琼脂糖的96孔聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)过滤平板所捕获，经过高通量洗涤后，采用液体闪烁液置于β-Counter计数仪获取CPM(counts per minute,每分钟脉冲数)值，ZnT8A指数＝(标本放射计数-阴参放射计数)/(阳参放射计数-阴参放射计数)。阳性判断标准：RBA-ZnT8A指数≥0.054。
研究对象包括：
1、健康对照组：共360例，无糖尿病家族病史及自身免疫疾病史，空腹及餐后2h血糖正常。来自于健康志愿者以及江苏省人民医院健康体健中心的健康人。其中158例健康对照的99％百分位数，用于确定阳性阈值，另外202例用于健康对照组的检测，用于评价特异性。
2、T1DM组：共100例，均按照1999年WHO糖尿病诊断标准进行诊断，以酮症酸中毒起病，依赖胰岛素治疗。来自于2016年至2019年江苏省人民医院门诊和病房的T1DM患者。
3、T2DM组：共150例，均按照1999年WHO糖尿病诊断标准进行诊断。来自于2016年至2019年江苏省人民医院门诊和病房的T2DM患者。
所有健康对照和患者均于空腹肘静脉采血，分离血清后于-70℃冰箱中保存。
ECL-ZnT8A检测，包括以下步骤：
步骤1.标记抗原：以1:10-1:15的摩尔比例将重组ZnT8胰岛抗原蛋白分别与3mmol/L的生物素聚乙二醇活性酯和3mmol/L的硫代钌衍生物活性酯混合，室温避光孵育1-2小时；标记后的生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白和硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白经小分子树脂纯化柱过滤收集于无菌离心管，分装后保存于-80℃。
步骤2.配备抗原缓冲液：取所需用量抗原稀释液(含5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)置于洁净离心管中，加入适量的生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白和硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白混匀，使其终浓度符合ECL-ZnT8A抗原抗体反应体系的最佳比例浓度。
步骤3.标记抗原与待测血清孵育：在96孔V型血清加样平板中以双副孔加样待测血清，每孔4μL血清予磷酸盐缓冲液稀释至20μL终体积后，加入20μL抗原缓冲液，混匀，置于水平摇床上，450转室温振荡2小时后，用自粘性铝箔纸封板，4℃孵育过夜(18-24小时)，得到抗原-抗体复合物。
步骤4.封闭链霉亲和素石墨烯平板：从4℃冰箱中取出链霉亲和素石墨烯平板，平衡至室温。每孔加入150μL封闭液(含3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)，避光于4℃过夜。
步骤5.捕获抗原抗体复合物：第二天，弃掉链霉亲和素石墨烯平板中的封闭液，每孔加入150μL洗涤液(含0.5‰吐温-20的磷酸盐缓冲液)进行洗涤，在吸水纸上拍干，洗涤3次。随后在每孔中加入步骤3已孵育好的30μL抗原-抗体复合物混合液，用自粘性铝箔纸封板后，于水平摇床上室温振荡1小时。振荡结束后，弃去孔中液体，同上使用洗涤液洗涤3次。
步骤6.上机检测：在链霉亲和素石墨烯平板每孔中加入150μL信号激发液，避免产生气泡。随后，选定检测程序，在MSD电化学发光仪器上完成检测。
ZnT8A指数通过下式计算得到：
ZnT8A指数＝(标本CPS计数-阴参CPS计数)/(阳参CPS计数-阴参CPS计数)。
实验结果：
1、重组ZnT8抗原蛋白与血清ZnT8A的有效结合
为验证重组ZnT8A抗原蛋白能否与血清中的ZnT8A胰岛自身抗体有效结合，分别将标记前的重组ZnT8抗原蛋白及标记后的生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白和硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白与ZnT8A阳性血清混合后，进行RBA-ZnT8A检测，并以磷酸盐缓冲液为对照。
如图1所示，ZnT8胰岛抗原蛋白、生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白(ZnT8-Biotin)、硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白(ZnT8-Sulfo-TAG)与阳性血清混合后RBA-ZnT8A指数分别为-0.060、0.005、0.026，相较于阳性血清与磷酸盐缓冲液混合后的0.993，吸收率均高于95％，证明标记前后的重组人ZnT8胰岛抗原蛋白、生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白、硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白均能有效结合阳性血清中的ZnT8A自身抗体。
2、ECL-ZnT8A反应体系中生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白和硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白的最佳比例浓度
固定其他条件不变，在96孔V型血清加样平板中，采用已标记的不同浓度梯度(6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25ng/mL)的标记抗原，分别与阳性、阴性血清进行反应，通过表1所示棋盘稀释法摸索生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白和硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白的最佳比例浓度，以建立ECL-ZnT8A抗原抗体的最适反应体系。
表1：ECL-ZnT8A抗原抗体比例优化试验棋盘稀释法
Figure BDA0002475345460000091
表2：棋盘稀释法信噪比结果
Figure BDA0002475345460000092
参照国际权威实验室通用胰岛自身抗体质量控制信-噪比(阳性标准值/阴性标准值)＞15的要求，并考虑生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白和硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白比例用量的经济性，选择终浓度为25-6400ng/mL的生物素聚乙二醇活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白和25-6400ng/mL的硫代钌衍生物活性酯化ZnT8胰岛抗原蛋白进行抗原抗体反应。
3、ECL-ZnT8A阳性界值的判断
对158例健康对照者血清进行ECL-ZnT8A检测，ZnT8A指数中位数为0.002(-0.009～0.129)。如图2所示，取99％百分位数为截点，确定ECL-ZnT8A阳性界值为0.103。158例健康对照者中有2例ECL-ZnT8A阳性，阳性率为1.27％。
由于不同人群实验值或有差异，各实验室可根据自身实验条件和所取健康人群建立本实验室阳性界值参考范围，如本例中若取此158例健康对照98％～99.5％百分位数截点，阳性界值参考范围为0.08～0.15。
4、稳定性
根据ZnT8A指数低、中、高在正常人和T1DM患者中选择3份血清在批内和批间各重复检测5次(n＝5)，批内和批间变异系数(coefficient of variance,CV)见表3。
表3：ECL-ZnT8A指数的变异情况
Figure BDA0002475345460000101
结果显示ECL-ZnT8A检测ZnT8A指数的批内CV为3.4％～8.2％，批间CV为10.5％～12.8％，阴阳性结果判断重复性100％。
5、ECL-ZnT8A与RBA-ZnT8的比较
选取120例血清样本(包括60例健康对照，50例T1DM患者，10例ZnT8A阳性血清)同时进行ECL-ZnT8A和RBA-ZnT8A检测。图3显示了两种方法测得的ZnT8A指数呈显著正相关(r＝0.806，P＜0.001)。采用Cohen's kappa系数分析两中检测方法对120例血清样本ZnT8A阳性结果的一致性，结果显示，两种方法ZnT8A均阳性的样本有43例，两者结果均为阴性的样本共73例；同时有3例样本ECL-ZnT8A阳性而RBA-ZnT8A阴性，也有1例样本RBA-ZnT8A阳性而ECL-ZnT8A阴性(表4)。
表4：ECL-ZnT8A和RBA-ZnT8A的一致性比较(n＝120)
Figure BDA0002475345460000102
总体而言，ECL-ZnT8A和RBA-ZnT8A检测法具有很强的一致性(Kappa值为0.929，P＜0.001)，阳性判断一致率达96.7％(116/120)。
6、ECL-ZnT8A的临床应用
(1)健康人的ECL-ZnT8A水平。
对202名健康对照者进行ECL-ZnT8A水平的检测，ZnT8A指数中位数0.003(-0.018～0.161)，其中阳性2例，占0.99％。
(2)T1DM患者的ECL-ZnT8A水平。
检测100例T1DM患者ECL-ZnT8A水平，ECL-ZnT8A指数中位数为0.108(-0.011～1.594)，ECL-ZnT8A阳性52例，阳性率为52％，显著高于健康对照者的0.99％(χ2＝118.528，P＜0.001)。
(3)T2DM患者ECL-ZnT8A水平。
对150例T2DM患者进行ECL-ZnT8A检测，ECL-ZnT8A指数中位数为0.021(-0.019～0.385)，其中阳性2例，占1.33％。与健康对照组相比，差异无统计学意义(χ2＝0.090，P＝0.570)。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> 一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒
<130> 20200430
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1 5 10 15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
20 25 30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
35 40 45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
50 55 60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
85 90 95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys
115 120 125
Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly
130 135 140
Val Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln
145 150 155 160
Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln
165 170 175
Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met
180 185 190
His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp
195 200 205
Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
210 215
<210> 2
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgtgc caaagagcct gaattacagt ggtgtgaaag agcttatttt agcagtcgac 60
ggggtgctgt ctgtgcacag cctgcacatc tggtctctaa caatgaatca agtaattctc 120
tcagctcatg ttgctacagc agccagccgg gacagccaag tggttcggag agaaattgct 180
aaagccctta gcaaaagctt tacgatgcac tcactcacca ttcagatgga atctccagtt 240
gaccaggacc ccgactgcct tttctgtgaa gacccctgtg acggtggcgg gtcaggcgga 300
agcggtggag gctccgaagg tgtgccaaag agcctgaatt acagtggtgt gaaagagctt 360
attttagcag tcgacggggt gctgtctgtg cacagcctgc acatctggtc tctaacaatg 420
aatcaagtaa ttctctcagc tcatgttgct acagcagcca gctgggacag ccaagtggtt 480
cggagagaaa ttgctaaagc ccttagcaaa agctttacga tgcactcact caccattcag 540
atggaatctc cagttgacca ggaccccgac tgccttttct gtgaagaccc ctgtgac 597

Claims (7)

1.一种锌转运体8胰岛自身抗体的电化学发光检测试剂盒，包括：标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白、标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白、链霉亲和素石墨烯平板和信号激发液；
所述重组ZnT8 胰岛抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：pH 7.2~7.4的磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白是将重组ZnT8 胰岛抗原蛋白与生物素聚乙二醇活性酯混合，避光孵育后经纯化得到。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白是将重组ZnT8 胰岛抗原蛋白分别与硫代钌衍生物活性酯混合，避光孵育后经纯化得到。
5.利用权利要求1所述的试剂盒检测样本中锌转运体8胰岛自身抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，将抗原缓冲液加至待测血清样本中，孵育，得到抗原-抗体复合物；
步骤2，用封闭液对链霉亲和素石墨烯平板进行封闭处理；
步骤3，将抗原-抗体复合物加至封闭后的链霉亲和素石墨烯平板上，然后加入信号激发液，通过MSD电化学发光仪检测硫代钌衍生物活性酯的发光信号，判断待测血清样本中是否存在目标抗体以及目标抗体的含量；
所述抗原缓冲液是将标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白和标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白加至抗原稀释液中得到，所述抗原稀释液为5%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述抗原缓冲液中标记有生物素聚乙二醇活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白和标记有硫代钌衍生物活性酯的重组ZnT8 胰岛抗原蛋白的浓度比为：25~6400ng/mL:25~6400ng/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述封闭液为含3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
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