KR101560849B1 - 자가면역 질환을 확인하기 위해 키메라 수용체를 사용하는 민감하고 신속한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가면역 질환의 진단 및 관리에서 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 그레이브스병(Graves' disease)의 진단 및 관리를 위한 개선된 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 방사능에 대한 요구를 방지하고, 그레이브스병의 진단에 전통적으로 사용된 방법에 비해 더욱 간단하고, 경제적이며 신속할 뿐만 아니라, 또한 기존의 루시퍼레이스(luciferase)-기반의 자가항체 검출 분석법의 민감도 및 검출 능력을 더 개선시킨다. 이같은 개선은 덱사메타손이 포함되지만 이에 한정되지 않는 글루코코르티코이드의 존재 하에 키메라 TSH 수용체를 포함하는 분석법의 우수한 성능을 기초로 한다.

Description

자가면역 질환을 확인하기 위해 키메라 수용체를 사용하는 민감하고 신속한 방법{SENSITIVE AND RAPID METHODS OF USING CHIMERIC RECEPTORS TO IDENTIFY AUTOIMMUNE DISEASE}

본 발명은 자가면역 질환의 진단에서 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 그레이브스병(Graves' disease)의 진단 및 관리에서 사용하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 조성물은 혈중 갑상샘 자극 면역글로불린에 대한 민감도 및 특이성이 개선된 키메라 갑상샘 자극 호르몬 수용체를 포함한다. 이같은 키메라 수용체를 사용하는 분석법이 글루코코르티코이드의 존재 하에 최적화될 수 있다.

그레이브스병 ("미만성 독성 갑상샘종"으로 또한 지칭됨)은 갑상샘 상에 존재하는 수용체를 인식하고 이에 결합하여, 갑상샘 성장 및 갑상샘 호르몬의 과잉생산을 초래하는 자가항체의 작용으로 인한 갑상샘항진증의 주요 원인이다. 그레이브스병은 아동기 및 청소년기에서의 갑상샘항진증의 가장 빈번한 원인인 것으로 보고되었다 ([Boter and Brown, J. Pediatr. 132:612-618 (1998)] 참조).

그레이브스병에 대한 현재의 진단 기술은 미진한 점이 많다. 일반적으로, 시판되는 방법들은 성가시고 어렵다. 또다른 방법들은 진단을 필요로 하는 사람에게 방사성 추적자를 투여하는 것을 필요로 한다. 그러나, 가장 중요하게, 대부분의 현재 사용되는 방법들에는 신속하고, 정확하며 비용-효율적인 테스트가 수행될 수 있도록 하는 충분한 민감도가 없다.

안전하고, 사용하기 쉬우며, 민감하고, 특이적이고, 비용-효율적인 그레이브스병 분석 시스템이 여전히 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 자가면역 질환의 진단 및 관리에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 그레이브스병의 진단 및 관리를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 조성물은 혈중 갑상샘 자극 면역글로불린에 대한 민감도 및 특이성이 개선된 키메라 갑상샘 자극 호르몬 수용체를 포함한다. 이같은 키메라 수용체를 사용하는 분석법이 글루코코르티코이드의 존재 하에 최적화될 수 있다.

한 실시양태에서, a) i) 키메라 TSH 수용체 및 루시퍼레이스(luciferase) 유전자를 코딩하는 안정적으로 형질감염된 벡터를 포함하는 세포주; ii) 그레이브스병에 걸린 것으로 추측되는 환자로부터 유래된 혈청 샘플; 및 iii) 글루코코르티코이드를 포함하는 세포 배양 배지를 제공하는 단계; b) 혈청 샘플을 루시퍼레이스 유전자가 검출가능한 신호를 방출하도록 하는 조건 하에 세포주 및 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 신호 강도를 측정하고, 이때 강도가 샘플 내에 존재하는 타이로트로핀 자극 호르몬 수용체 자가항체 농도와 상관되는 단계 c)를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손, 프레드니손, 하이드로코르티손, 플루티카손, 또는 코르티손을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 접촉 단계는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 TSH 수용체는 래트 융모성 호르몬 고나도트로핀 수용체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 아미노산 서열은 인간 TSH 수용체 아미노산 서열의 아미노산 잔기 262-335에 상응하는 73개의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 혈청 샘플은 TSH 수용체 자가항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 자가항체는 TSH 자극 자가항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 자가항체는 TSH 차단 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 혈청 TSH 자가항체를 검출할 수 있는 루시페린-루시퍼레이스 시스템 및 키메라 TSH 수용체를 포함하고, 이때 상기 시스템이 글루코코르티코이드를 포함하는 키트가 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손, 프레드니손, 하이드로코르티손, 플루티카손, 또는 코르티손을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 수용체는 인간 TSH 수용체 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 수용체는 래트 융모성 호르몬 수용체 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 래트 수용체 아미노산 서열은 아미노산 잔기 262-335를 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 키메라 TSH 수용체 및 루시페린-루시퍼레이스 시스템을 발현할 수 있는 세포주를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 키메라 TSH 수용체 및 루시퍼레이스 유전자를 코딩하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 벡터에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 당단백질 알파 서브유닛 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포주는 CHO 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포주는 RD 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 키트는 사용설명서 시트를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 a) i) 갑상샘-자극 자가항체를 함유하는 것으로 추측되는 테스트 샘플, ii) 테스트 수단 내에 함유된 글루코코르티코이드를 포함하는 배양된 세포로서, 이때 세포가 키메라 TSH 수용체 및 루시페린-루시퍼레이스 시스템을 발현하는 배양된 세포, 및 iii) 폴리에틸렌 글리콜을 제공하는 단계; b) 갑상샘-자극 항체가 루시페린-루시퍼레이스 시스템을 사용하여 검출가능하도록 하는 조건 하에 테스트 샘플을 배양된 세포 및 폴리에틸렌 글리콜에 노출시키는 단계; 및 c) 검출가능한 갑상샘-자극 항체의 존재에 대해 관찰하는 단계를 포함하는, 테스트 샘플 내의 갑상샘-자극 자가항체의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손, 프레드니손, 하이드로코르티손, 플루티카손, 또는 코르티손을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 바람직한 실시양태에서, 배양된 세포는 RDluc 및 CHORluc 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 관찰 단계는 발광측정기를 사용하여 수행된다. 추가적인 실시양태에서, cAMP 농도가 루시페린-루시퍼레이스 시스템에 의해 결정된다. 또다른 실시양태에서는 방법이 성장 배지를 추가로 포함하는 한편, 또다른 실시양태에서는 방법이 자극 배지를 추가로 포함한다. 일부 특히 바람직한 실시양태에서, 배양된 세포가 성장 배지에 노출된 후 테스트 샘플에 노출된다. 추가적인 실시양태에서, 배양된 세포가 테스트 샘플을 함유하는 자극 배지에 노출된다. 또다른 특히 바람직한 실시양태에서, 자극 배지가 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

본 발명은 a) i) 갑상샘-자극 자가항체를 함유하는 것으로 추측되는 테스트 샘플, ii) 글루코코르티코이드를 포함하는 배양된 세포로서, 이때 세포가 테스트 수단 내에 함유된 RD-Rluc 또는 CHO-Rluc 세포를 포함하는 군으로부터 선택되고, 세포가 키메라 TSH 수용체를 발현하는 배양된 세포, 및 iii) 폴리에틸렌 글리콜을 제공하는 단계; b) 갑상샘-자극 항체가 루시페린-루시퍼레이스 시스템을 사용하여 검출가능하도록 하는 조건 하에 테스트 샘플을 배양된 세포 및 폴리에틸렌 글리콜에 노출시키는 단계; 및 c) 검출가능한 갑상샘-자극 항체의 존재에 대해 관찰하고, 이때 관찰 단계가 발광측정기를 사용하여 수행되는 단계를 포함하는, 테스트 샘플 내의 갑상샘-자극 자가항체의 존재를 결정하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손, 프레드니손, 하이드로코르티손, 플루티카손, 또는 코르티손을 포함하는 군으로부터 선택된다. 추가적인 실시양태에서, cAMP 농도가 루시페린-루시퍼레이스 시스템에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서는 방법이 성장 배지를 추가로 포함하는 한편, 또다른 실시양태에서는, 방법이 자극 배지를 추가로 포함한다. 일부 특히 바람직한 실시양태에서, 배양된 세포가 성장 배지에 노출된 후 테스트 샘플에 노출된다. 추가적인 또다른 실시양태에서, 배양된 세포가 테스트 샘플을 함유하는 자극 배지에 노출된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 자극 배지가 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

본 발명은 a) i) 갑상샘-자극 자가항체를 함유하는 것으로 추측되는 테스트 샘플, ii) 글루코코르티코이드를 포함하는 배양된 세포로서, 이때 세포가 테스트 수단 내에 함유된 RD-Rluc 또는 CHO-Rluc 세포를 포함하는 군으로부터 선택되고, 세포가 키메라 TSH 수용체를 발현하는 배양된 세포, iii) 성장 배지, 및 iv) 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 자극 배지를 제공하는 단계; b) 배양된 세포를 성장 배지에 노출시켜, 성장된 세포를 생산하는 단계; c) 갑상샘-자극 항체가 루시페린-루시퍼레이스 시스템을 사용하여 검출가능하도록 하는 조건 하에 테스트 샘플을 성장된 세포 및 자극 배지에 노출시키는 단계; 및 d) 검출가능한 갑상샘-자극 항체의 존재에 대해 관찰하고, 이때 관찰 단계가 발광측정기를 사용하여 수행되는 단계를 포함하는, 테스트 샘플 내의 갑상샘-자극 자가항체의 존재를 결정하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손, 프레드니손, 하이드로코르티손, 플루티카손, 또는 코르티손을 포함하는 군으로부터 선택된다. 추가적인 실시양태에서, cAMP 농도가 루시페린-루시퍼레이스 시스템에 의해 결정된다.

도 1은 6％ PEG-8000을 함유하는 자극 배지를 이용하는 분석법에서의 3개의 그레이브스병 IgG 샘플 (치료되지 않은 그레이브스 환자로부터의 샘플)의 일련의 3배 희석물에 대한 결과를 제공한다.
도 2는 35명의 치료되지 않은 그레이브스 환자로부터의 IgG에 대한 CHO-Rluc 루시퍼레이스 결과와 FRTL-5 cAMP 결과의 비교를 제공한다.
도 3은 35명의 치료되지 않은 그레이브스 환자로부터의 IgG에 대한 CHO-Rluc 루시퍼레이스 결과와 CHO-R cAMP 결과의 비교를 제공한다.
도 4는 35명의 치료되지 않은 그레이브스 환자로부터의 IgG에 대한 CHO-R cAMP 결과와 FRTL-5 cAMP 결과의 비교를 제공한다.
도 5는 CHO-Rluc 세포의 bTSH에 대한 응답의 선형성을 나타낸다.
도 6은 FRTL-5 세포 (LCA TSI 검사물의 10 ㎕ 샘플)를 사용한, TSI 결과가 공지되어 있는 일군의 샘플들에 대한 결과를 나타낸다.
도 7은 일군의 정상 샘플 (10 ㎕의 AML "정상" 검사물)에 대한 결과를 나타낸다.
도 8은 2,324개의 염기쌍을 포함하고 730개의 아미노산을 코딩하는, 키메라 hTSH/mLH (Mc4) 수용체에 대한 DNA 서열의 한 실시양태를 나타낸다. 밑줄이 그어진 문자는 인간 TSHR 서열이다. 이탤릭체 문자는 래트 LHR 서열이다. 래트 LHR 서열 내의 "*" (T)는 야생형 서열에서는 G이다. 이러한 G → T 돌연변이로 아르기닌에서 세린으로의 아미노산 변화가 초래되었다.
도 9는 고리형 AMP (cAMP) 조절 요소 (CRE)를 포함하는 뉴클레오티드 236개의 당단백질 알파 서브유닛 프로모터 (AF401991)와 HEK 세포로부터 PCR에 의해 증폭된 GPH 프로모터의 서열 정렬의 한 실시양태를 나타낸다. 음영이 진 부분은 상동성을 가리킨다. 비-하이라이트 부분은 플라스미드 내의 프로모터의 플랭킹(flanking) 영역을 명시한다.
도 10은 음성 및 양성 TSI-함유 혈청에 대한 CHO-RMc4, RD-RMc4 및 CHO-RLuc 세포주의 응답을 나타내는 예시적인 데이터를 제시한다.
도 10a: TSI 음성 및 양성 혈청으로 유도된 CHO-RLuc 및 CHO-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법.
도 10b: TSI 음성 및 양성 혈청으로 유도된 CHO-RLuc 및 CHO-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터 유래된 S/N의 비율.
도 10c: TSI 음성 및 양성 혈청으로 유도된 CHO-RLuc 및 RD-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법.
도 10d: TSI 음성 및 양성 혈청으로 유도된 CHO-RLuc 및 RD-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터 유래된 S/N의 비율.
도 10e: TSI 음성 및 양성 혈청으로 유도된 CHO-RLuc, CHO-RMc4 및 RD-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터 유래된 S/N의 비율.
도 11은 혈청 희석 프로파일에 응답한 RD-RMc4 및 CHO-RLuc 세포주에 대한 신호-대-노이즈(noise) (S/N) 비율을 나타내는 예시적인 데이터를 제시한다.
도 11A: TSI 양성 혈청의 동일한 희석물로 유도된 CHO-RLuc 및 RD-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터의 S/N 비율
도 11B: TSI 양성 혈청의 희석물들로 유도된 CHO-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터의 S/N 비율.
도 11C: TSI 양성의 더 높은 희석물들로 유도된 CHO-RMc4 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터의 S/N 비율.
도 12는 CHO-RMc4 세포주와 CHO-RLuc 세포주 간의 TSH 민감도를 비교하는 예시적인 데이터를 제시한다.
도 13은 CHO-RMc4 및 CHO-RLuc 세포주를 사용한 인간 혈청으로부터의 신호-대-노이즈 비율의 분포를 제시하는 예시적인 데이터를 제시한다.
도 14는 임상 환자 혈청 샘플에 대한 CHO-RMc4, RD-RMc4 및 CHO-RLuc 세포주의 상대적인 민감도를 나타내는 예시적인 데이터를 제시한다.
도 15는 예시적인 아미노산 서열들을 제시한다: 황체형성 호르몬 수용체:
도 15A: 칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus) (백색의 술을 이룬 귀가 있는 명주원숭이) CAJ57370
도 15B: 코투르닉스 자포니카(Coturnix japonica) (일본 메추라기) AAB32614
도 15C: 갈루스 갈루스(Gallus gallus) (닭) NP_990267
도 15D: 무스 무스쿨루스(Mus musculus) (마우스) AAB24402
도 15E: 보스 타우루스(Bos taurus) (소) NP_776806
도 16은 테스트 플레이트 내의 TSI 샘플들의 대표적인 배열을 도해한다.
도 17은 별법적인 글루코코르티코이드인 플루티카손, 프레드니손, 하이드로코르티손 및 코르티손이 40 μM 덱사메타손과 비교했을 때 CHO-RMc4 분석법의 등가의 신호 강도를 제공한다는 것을 나타내는 예시적인 상대 광도 (RLU: Relative Light Unit) 데이터를 제시한다.
도 18은 별법적인 글루코코르티코이드인 플루티카손, 프레드니손, 하이드로코르티손 및 코르티손이 개선된 CHO-RMc4 분석법을 제공한다는 것을 나타내는 예시적인 혈청 기준 단위 백분율 (SSR％: Serum Reference Unit ％) 데이터를 제시한다.

정의

본 명세서 및 청구항에서의 용어 "샘플" 및 "검사물"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 한편으로는, 이들은 검사물 또는 배양물을 포함하도록 의도된다. 다른 한편으로는, 이들은 생물학적 샘플 및 환경 샘플 양쪽 모두를 포함하도록 의도된다. 이러한 용어들은 체액 (예를 들어, 혈액), 뿐만 아니라 고형 조직을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 인간 및 기타 동물로부터 수득된 모든 유형을 포함한다.

생물학적 샘플은 동물 (인간 포함), 유체 또는 조직, 식품 및 성분 예컨대 낙농 물품, 채소, 육류 및 육류 부산물, 및 폐기물일 수 있다. 이러한 예들은 본 발명에 적용가능한 샘플 유형을 한정하는 것으로 간주되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "키트"는 시약 및 기타 물질의 조합물과 관련하여 사용된다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 특이적 항원과 반응하는 임의의 면역글로불린 분자와 관련하여 사용된다. 이 용어가 임의의 공급원 (예를 들어, 인간, 설치류, 비-인간 영장류, 염소, 소, 말, 양 등)으로부터 수득된 임의의 면역글로불린 (예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 등)을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용된 용어 "항원"은 항체와 반응할 수 있는 임의의 물질과 관련하여 사용된다. 이러한 용어는 임의의 항원 및 "면역원" (즉, 항체의 형성을 유도하는 물질)을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 면역원성 반응에서, 항원 (면역원) 또는 항원의 일부분의 존재에 응답하여 항체가 생산된다.

본원에서 사용된 용어 "항원 단편" 및 "항원의 일부분"은 항원의 일부분과 관련하여 사용된다. 항원 단편 또는 일부분은 전체 항체의 작은 백분율에서 큰 백분율까지의 범위의, 그러나 항원의 100％는 아닌 다양한 크기로 발생할 수 있다. 그러나, 적어도 항원의 일부분이 특정된 경우, 전체 항원이 존재할 수 있는 것으로 생각된다. 항원 단편 또는 일부분이 항체가 인식하는 "에피토프"를 포함할 수 있지만, 반드시 포함할 필요는 없는 것으로 생각된다. 항원 단편 또는 일부분은 또한 면역원성일 수 있거나 면역원성이지 않을 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "자가항체"는 개체 자신의 조직 또는 세포의 항원성 구성성분에 대해 반응할 수 있는 항체를 지칭한다 (예를 들어, 항체가 "자가" 항원을 인식하여 이에 결합한다).

본원에서 사용된 용어 "면역분석법"은 항체가 항원의 검출에서 사용되는 임의의 방법과 관련하여 사용된다. 직접적인 면역분석법, 간접적인 면역분석법, 및 "샌드위치" 면역분석법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는 광범위한 면역분석법 포맷이 이러한 정의에 포함되는 것으로 생각된다. 그러나, 본 발명이 임의의 특정 포맷에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 방사선면역분석법 (RIA), 면역형광 분석법 (IFA), 및 ELISA, RIA 및/또는 IFA 방법에 대한 변형이 포함되지만 이에 한정되지 않는 기타 분석법 포맷이 포함되는 또다른 포맷이 본 발명의 방법에서 유용할 것으로 생각된다.

본원에서 사용된 용어 "포획 항체"는 항원에 결합함으로써 이어서 적용되는 항체에 의한 항원의 인식을 허용하는데 사용되는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 포획 항체가 미량역가 웰에 결합되어, 웰에 첨가된 샘플 내에 존재하는 관심 항원에 결합하는 역할을 할 수 있다. 그후, 또다른 항체 ("1차 항체"로 명명됨)가 항원-항체 복합체에 결합하는데 사용되어, 결과적으로 항체-항원-항체 복합체로 구성된 "샌드위치"가 형성된다. 이러한 복합체의 검출이 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 1차 항체가 표지 예컨대 비오틴, 효소, 형광 마커, 또는 방사성이 있도록 제조될 수 있고, 이러한 표지를 사용하여 직접적으로 검출될 수 있다. 별법적으로, 1차 항체를 인식하는 표지된 "2차 항체" 또는 "리포터 항체"가 첨가되어, 항체-항원-항체-항체 복합체로 구성된 복합체를 형성할 수 있다. 또다시, 그후 적합한 리포터 시약이 첨가되어, 표지된 항체가 검출된다. 임의의 개수의 추가적인 항체가 원하는 대로 첨가될 수 있다. 효소, 형광 마커 또는 방사성이 포함되지만 이에 한정되지 않는 마커로 이러한 항체들이 또한 표지될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "리포터 시약" 또는 "리포터 분자"는 항원에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있는 화합물과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 리포터 시약은 효소 기질에 부착된 비색 물질일 수 있다. 항체 및 항원의 결합 시, 효소가 이의 기질 상에 작용하여, 색이 나타나도록 한다. 기타 리포터 시약에는 형광발생성(fluorogenic) 및 방사성 화합물 또는 분자가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 정의는 검출 시스템의 일부로서 비오틴 및 아비딘을 기초로 하는 화합물 (예를 들어, 뉴트라비딘 및 스트렙타비딘이 포함되지만 이에 한정되지 않음)을 사용하는 것을 또한 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 비오틴화 항체가 아비딘이 코팅된 고체 지지체와 함께 본 발명에서 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "신호"는 반응, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 결합이 발생하였다는 지시약과 관련하여 사용된다. 방사성, 형광발생성 반응, 발광 및 효소 반응 형태의 신호가 본 발명에서 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 정량적으로, 뿐만 아니라 정성적으로 신호를 평가할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "신호 강도"는 신호 세기의 규모를 지칭하고, 이때 강도는 반응 기질의 양과 상관된다. 예를 들어, 루시페린-루시퍼레이스 시스템은 타이로트로핀 자극 호르몬 수용체 자가항체에 의해 생성된 cAMP의 양과 상관되는 신호 강도를 생성시킨다.

본원에서 사용된 용어 "루시페린-루시퍼레이스 시스템"은 생성되는 발광이 검출될 수 있도록 하는 조건 하에 기질 (즉, 예를 들어, cAMP)의 존재 하에 루시페린 및 루시퍼레이스의 접촉을 허용하는 임의의 공정 또는 방법을 지칭한다. 이같은 시스템은 벡터에 의해 코딩되어 형질감염된 숙주 세포 내에 포함될 수 있거나, 또는 별도의 키트 용기들 내에 제공되어 내용물들이 함께 혼합될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "고체 지지체"는 시약 예컨대 항체, 항원, 및 기타 화합물이 부착될 수 있는 임의의 고체 물질과 관련하여 사용된다. 예를 들어, ELISA 방법에서, 미량역가 플레이트의 웰이 종종 고체 지지체를 제공한다. 고체 지지체의 또다른 예에는 현미경 슬라이드, 커버슬립, 비드, 입자, 세포 배양 플라스크, 뿐만 아니라 다수의 기타 아이템들이 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "세포 염색"은 세포의 가시화를 강화하도록 세포를 표지 또는 염색하는데 사용되는 방법과 관련하여 사용된다. 이러한 염색 또는 표지는 플루오로크롬, 효소, 금 및 요오드가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 화합물의 사용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 정의는 테스트 (즉, 분석법)가 윈위치의 샘플에 대해 수행되는 "원위치 발색 분석법"과 같은 방법을 포함하는 것으로 생각된다. 원위치 발색 분석법이 면역분석법 (즉, ELISA)의 사용을 수반할 것으로 또한 생각된다.

본원에서 사용된 용어 "성장 배지"는 비타민, 아미노산, 보조인자, 및 배양물 내의 세포의 성장 및 복제를 강화하는 임의의 기타 적합한 영양소가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 성장 인자를 함유하도록 제형된 배양 배지를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "자극 배지"는 TSH 및/또는 TSI에 의한 자극을 강화함으로써, 생성되는 신호 (예를 들어, cAMP 및/또는 루시퍼레이스)를 증가시키기 위해, 특정 구성성분이 부족하도록 제형된 배지를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "기아 배지"는 성장 배지 내에 포함된 하나 이상의 성장 인자가 부족하도록 제형된 배지를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 배지는 단기간 동안 세포를 유지시키는데 필요한 염 및 글루코스만을 함유한다.

본원에서 사용된 용어 "생물" 및 "미생물"은 바이러스 및 박테리아 (리케치아(rickettsia) 및 클라미디아(chlamydia) 포함)가 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 종 또는 유형의 미생물을 지칭하도록 사용된다. 따라서, 이 용어는 DNA 및 RNA 바이러스, 뿐만 아니라 리케치알레스(Rickettsiales) 및 클라미디알레스(Chlamydiales) 목의 생물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "배양물"은 하나 이상의 미생물을 함유하는 것으로 추측되는 임의의 샘플 또는 검사물을 지칭한다. "순수 배양물"은 존재하는 생물이 특정 속 및 종의 유일한 품종인 배양물이다. 이는 1가지를 초과하는 속 및/또는 종의 미생물이 존재하는 배양물인 "혼합 배양물"과 대조를 이룬다.

본원에서 사용된 용어 "세포 유형"은 세포의 공급원 또는 특성과 관계없이 임의의 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "세포주"는 1차 세포주, 유한 세포주, 연속 세포주, 및 형질전환된 세포주가 포함되는, 시험관내에서 배양되는 세포를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "1차 세포 배양물", 및 "1차 배양물"은 동물 또는 곤충 조직으로부터 직접 수득된 세포 배양물을 지칭한다. 이러한 배양물은 성체로부터, 뿐만 아니라 태아 조직으로부터 유래될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "유한 세포주"는 노화 전에 제한된 횟수로 집단이 배가될 수 있는 세포 배양물을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "연속 세포주"는 1차 또는 유한 세포주 내의 세포들의 집단이 외관상으로 성장을 멈추지만, 감소된 세포 크기, 더 높은 성장 속도, 더 높은 클로닝 효율, 증가된 종양발생성, 및 가변성 염색체 상보체의 일반적인 특성이 있는 세포들의 집단이 나타나는 "위기" 단계를 겪은 세포 배양물을 지칭한다. 이러한 세포들은 시험관 내에서의 자발적인 형질전환으로부터 종종 초래된다. 이러한 세포들은 수명이 무한하다.

본원에서 사용된 용어 "형질전환된 세포주"는 상기 기술된 바와 같은 특성들이 있는 연속 세포주로 형질전환된 세포 배양물을 지칭한다. 형질전환된 세포주는 종양 조직으로부터 직접 유래될 수 있고, 또한 전체 바이러스 (예를 들어, SV40 또는 EBV), 또는 벡터 시스템을 사용하는 형질전환 바이러스로부터 유래된 DNA 단편으로의 세포의 시험관내 형질전환에 의해 또한 유래될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "하이브리도마"는 2개의 세포 유형을 함께 융합시킴으로써 생산된 세포를 지칭한다. 통상적으로 사용되는 하이브리도마에는 면역화된 동물로부터의 항체-분비 B 세포와 시험관 내에서 무한 성장할 수 있는 악성 골수종 세포주의 융합에 의해 생성된 하이브리도마가 포함된다. 이러한 세포들은 클로닝되어, 모노클로날 항체를 제조하는데 사용된다.

본원에서 사용된 용어 "혼합 세포 배양물"은 2가지 유형의 세포의 혼합물을 지칭한다. 일부 바람직한 실시양태에서는 세포가 유전자 조작되지 않은 세포주인 한편, 또다른 바람직한 실시양태에서는 세포가 유전자 조작된 세포주이다. 일부 실시양태에서, 세포 유형들 중 하나 이상이 "허용성"이다 (즉, 바이러스가 배양물 내에서 복제될 수 있고 세포에서 세포로 확산될 수 있다). 본 발명은 샘플 내의 바이러스의 검출, 확인 및/또는 정량에 적절한 세포 유형들의 임의의 조합물을 포함하고, 여기에는 사용된 모든 세포 유형이 유전자 조작되지 않은 혼합 세포 배양물, 세포 유형들 중 하나 이상은 유전자 조작되고, 나머지 세포 유형들은 유전자 조작되지 않은 혼합물, 및 모든 세포 유형이 유전자 조작된 혼합물이 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "세포내 기생충의 검출에 적절한"은 샘플 내의 세포내 기생충의 존재를 검출하는데 성공적으로 사용될 수 있는 세포 배양물을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양물은 감염에 대한 이의 감수성을 유지할 수 있고/있거나 세포내 기생충의 복제를 지지한다. 본 발명이 특정 세포 유형 또는 세포내 기생충에 한정되도록 의도되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "감염에 대해 감수성인"은 바이러스 또는 또다른 세포내 생물로 감염되게 되는 세포의 능력을 지칭한다. 이는 "허용성" 감염을 포함하지만, 이러한 용어가 이렇게 한정되도록 의도되지 않는데, 이는 세포는 감염되었지만, 생물이 반드시 복제되고/되거나 감염된 세포에서 또다른 세포로 확산되는 것은 아닌 상황을 이러한 용어가 포함하도록 의도되기 때문이다. 본원에서 사용된 "바이러스 증식"이라는 구절은 감염성 바이러스가 허용성 세포 유형에서 허용성 또는 감수성 특성의 추가적인 세포로 확산 또는 계대되는 것을 기술한다.

본원에서 사용된 용어 "단층", "단층 배양물", 및 "단층 세포 배양물"은 기판에 부착되어 세포 1개 두께의 층으로 성장하는 세포를 지칭한다. 단층은 플라스크, 튜브, 커버슬립 (예를 들어, 쉘(shell) 바이알), 롤러 병 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 용기에서 성장될 수 있다. 또한 세포는 비드가 포함되지만 이에 한정되지 않는 마이크로캐리어(microcarrier)에 부착되어 성장될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "현탁액" 및 "현탁 배양물"은 기판에 부착되지 않으면서 생존 및 증식하는 세포를 지칭한다. 현탁 배양물은 조혈 세포, 형질전환된 세포주, 및 악성 종양으로부터의 세포를 사용하여 전형적으로 생산된다..

본원에서 사용된 용어 "배양 배지", 및 "세포 배양 배지"는 시험관 내의 세포 (즉, 세포 배양물)의 성장을 지지하는데 적절한 배지를 지칭한다. 이 용어가 임의의 특정 배양 배지에 한정되도록 의도되지 않는다. 예를 들어, 이러한 정의가 성장 배지, 뿐만 아니라 유지 배지를 포함하도록 의도된다. 실제로, 이 용어가 관심 세포 배양물의 성장에 적절한 임의의 배양 배지를 포함하도록 의도된다.

본원에서 사용된 용어 "편성(obligate) 세포내 기생충" (또는 "편성 세포내 생물)은 생존 및/또는 복제를 위해 세포내 환경을 필요로 하는 임의의 생물을 지칭한다. 편성 세포내 기생충에는 바이러스, 뿐만 아니라 하기의 목의 대부분의 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 박테리아가 포함되는 다수의 또다른 생물이 포함된다: i) 리케치알레스: 예를 들어, 콕시엘라(Coxiella), 리케치아(Rickettsia) 및 에를리키아(Ehrlichia); 및 ii) 클라미디알레스: 예를 들어, 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis), 클라미디아 시타시(C. psittaci). 용어 "세포내 기생충"은 상기에 간략하게 기술된 편성 세포내 기생충을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 숙주 동물의 세포 내에서 발견될 수 있는 임의의 생물을 지칭한다. 예를 들어, 세포내 기생충에는 브루셀라(Brucella), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움(Mycobacterium) (예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및 마이코박테리움 레프라에(M. leprae)), 및 플라스모디움(Plasmodium), 뿐만 아니라 로칼리마에아(Rochalimaea)가 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "항미생물제"는 미생물의 성장을 억제하거나 이를 사망시키는 임의의 화합물과 관련하여 사용된다. 이 용어가 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연적으로 또는 합성에 의해 생산되는 항생제와 같은 화합물을 포함하지만 이에 한정되지 않도록 의도된다. 이 용어가 미생물의 성장을 억제하거나 이를 사망시키는데 유용한 화합물 및 요소를 포함하도록 또한 의도된다.

본원에서 사용된 용어 "발색 화합물", 및 "발색 기질"은 이의 색 흡수 또는 방출 특성에 의해 검출 시스템에서 유용한 임의의 화합물을 지칭한다. 이 용어는 시각적으로 또는 광학 기기로 검출가능한, 가용성, 뿐만 아니라 불용성의 임의의 효소 절단 생성물을 포함하도록 의도된다. 색 변화로 검출가능한 최종 생성물을 생산하는 모든 효소 기질이 "발색"의 의미 내에 포함된다. 여기에는 "색"의 전통적인 의미로 사용되는 임의의 색, 예컨대 남색, 청색, 적색, 황색, 녹색, 주황색, 갈색 등, 뿐만 아니라 형광으로 검출가능한 색 (예를 들어, 플루오레세인의 황녹색, 로다민의 적색 등)을 생산하는 플루오로크롬 또는 형광발생성 화합물이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 염료 (예를 들어, pH) 및 발광 화합물과 같은 기타 지시약이 이러한 정의 내에 포함되도록 의도된다.

본원에서 사용될 때, 용어 "pH 지시약", "산화환원 지시약", 및 "산화-환원 지시약"의 통상적으로 사용되는 의미가 의도된다. 따라서, "pH 지시약"은 pH 변화의 검출에 통상적으로 사용되는 모든 화합물을 포함하고, 여기에는 페놀 레드, 뉴트럴 레드, 브롬티몰 블루, 브롬크레졸 퍼플, 브롬크레졸 그린, 브롬클로로페놀 블루, m-크레졸 퍼플, 티몰 블루, 브롬크레졸 퍼플, 자일레놀 블루, 메틸 레드, 메틸 오렌지, 및 크레졸 레드가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 "산화환원 지시약", 및 "산화-환원 지시약"은 산화/환원 전위 (즉, "eH")의 검출에 통상적으로 사용되는 모든 화합물을 포함하고, 여기에는 다양한 유형 또는 형태의 테트라졸륨, 레자주린, 및 메틸렌 블루가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "접종 현탁액", 또는 "접종물"은 테스트될 생물에 접종될 수 있는 현탁액과 관련하여 사용된다. 용어 "접종 현탁액"이 특정 유체 또는 액체 물질에 한정되도록 의도되지 않는다. 예를 들어, 접종 현탁액은 물, 염수, 또는 수성 용액으로 구성될 수 있다. 접종 현탁액이 물, 염수 또는 임의의 수성 물질이 첨가되는 성분을 포함할 수 있는 것으로 또한 생각된다. 한 실시양태에서, 성분이 의도되는 미생물에 유용한 하나 이상의 성분을 포함하는 것이 구현된다. 본 발명이 특정 성분에 한정되도록 의도되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "1차 단리"는 샘플로부터 직접적으로 생물을 배양하는 프로세스를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "단리"는, 1차 단리인지 또는 임의의 후속 배양인지와 관계없이, 생물의 임의의 배양을 지칭하고, 여기에는 유지 및/또는 사용을 위한 생물의 스톡(stock) 배양물의 "계대" 또는 "전달"이 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "추정 진단"은 환자의 질환에서 수반되는 병인학적 생물에 관하여 치료의에게 약간의 지침을 제공하는 예비 진단을 지칭한다. 추정 진단은 미생물의 예비 확인을 지칭하도록 본원에서 사용되는 "추정 확인"을 종종 기초로 한다.

본원에서 사용된 용어 "확정 진단"은 환자 질환의 병인체가 확인된 최종 진단을 지칭하도록 사용된다. 용어 "확정 확인"은 속 및/또는 종 수준으로의 생물의 최종 확인과 관련하여 사용된다.

본원에서 사용된 용어 "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 기술의 수단에 의해 함께 연결된 DNA 절편들로 구성된 DNA 분자를 지칭한다.

DNA 분자는 "5' 말단" 및 "3' 말단"이 있는 것으로 언급되는데, 이는 하나의 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트가 한쪽 방향으로 이의 이웃의 3' 산소에 포스포디에스테르 연결을 통해 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오티드들이 제조되도록 모노뉴클레오티드들이 반응되기 때문이다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 말단은 이의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 3' 산소에 연결되지 않은 경우에는 "5' 말단"으로, 이의 3' 산소가 후속 모노뉴클레오티드 펜토스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않은 경우에는 "3' 말단"으로 지칭된다. 본원에서 사용된 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오티드에 대해 내부인 경우에도, 5' 및 3' 말단이 있는 것으로 또한 언급될 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 개별적인 요소들은 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'인 것으로 지칭된다. 이러한 용어법은 전사가 DNA 가닥을 따라 5' → 3' 방식으로 진행된다는 사실을 반영한다. 연결된 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 요소는 일반적으로 코딩 영역의 5' 또는 상류에 위치한다 (인핸서 요소는 프로모터 요소 및 코딩 영역의 3'에 위치하는 경우에도 이의 효과를 발휘할 수 있다). 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호는 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치한다.

용어 "유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 있는 올리고뉴클레오티드"는 유전자의 코딩 영역을 포함하는 DNA 서열, 또는, 다시 말하면 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 서열을 지칭한다. 코딩 영역은 cDNA 또는 게놈 DNA 형태로 존재할 수 있다. 전사의 적합한 개시 및/또는 1차 RNA 전사물의 정확한 프로세싱을 허용하도록 필요하다면 적절한 제어 요소 예컨대 인핸서, 프로모터, 스플라이스(splice) 접합부, 폴리아데닐화 신호 등이 유전자의 코딩 영역에 인접하여 놓일 수 있다. 별법적으로, 본 발명의 벡터에서 사용되는 코딩 영역은 내인성 인핸서 및/또는 프로모터, 스플라이스 접합부, 개재 서열, 폴리아데닐화 신호 등, 또는 내인성 및 외인성 제어 요소 양쪽 모두의 조합물을 함유할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "전사 단위"는 전사의 개시 부위와 종결 부위 사이의 DNA의 절편 및 효율적인 개시 및 종결에 필요한 조절 요소를 지칭한다. 예를 들어, 인핸서/프로모터, 코딩 영역, 및 종결 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 DNA 절편이 전사 단위를 이룰 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "조절 요소"는 핵산 서열의 발현의 일부 양상을 제어하는 유전 요소를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사의 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 또다른 조절 요소는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결 신호 등 (하기 정의됨)이다.

본원에서 사용된 용어 "리포터 유전자 구축물", 또는 "리포터 유전자 벡터"는 리포터 유전자의 생성물을 코딩하는 서열, 및 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 특정 숙주 생물 내에서의 발현에 필요한 적합한 핵산 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 공지되어 있다.

용어 "리포터 유전자"는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서 요소에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 서열을 포함하는 구축물이 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 활성화에 필요한 인자들을 함유하는 세포 (또는 함유하도록 제조될 수 있는 세포) 내로 도입되는 경우 쉽게, 정량가능하게 분석되는 유전자 생성물 (전형적으로, 효소)를 코딩하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 리포터 유전자의 예로는 β-갈락토시데이스를 코딩하는 박테리아 유전자 (lacZ), 박테리아 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이스 (cat) 유전자, 반딧불이 루시퍼레이스 유전자 및 β-글루쿠로니데이스를 코딩하는 유전자 (GUS)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

진핵생물 내의 전사 제어 신호는 "프로모터" 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 수반되는 세포 단백질과 특이적으로 상호작용하는 DNA 서열들의 짧은 어레이로 구성된다 ([Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)]). 프로모터 및 인핸서 요소가 효모, 곤충 및 포유류 세포가 포함되는 다양한 진핵생물 공급원 및 바이러스로부터 단리되었다 (유사한 제어 요소, 즉, 프로모터들이 원핵생물에서 또한 발견된다). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 어떠한 세포 유형이 관심 단백질을 발현하는데 사용되는지에 좌우된다. 일부 진핵생물 프로모터 및 인핸서는 숙주 범위가 넓은 반면, 또다른 것들은 세포 유형의 한정된 부분집합에서 기능성이다 (리뷰를 위해 [Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986)], 및 [Maniatis, et al., 상기 문헌 (1987)] 참조). 예를 들어, SV40 초기 유전자 인핸서는 다수의 포유류 종으로부터의 광범위한 세포 유형에서 매우 활성이고, 포유류 세포에서의 단백질의 발현에 널리 사용되었다 ([Dijkema, et al., EMBO J. 4:761 (1985)]). 광범위한 포유류 세포 유형에서 활성인 프로모터/인핸서 요소의 2개의 또다른 예는 인간 신장 인자 1α 유전자 ([Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264:5791 (1989)]; [Kim et al., Gene 91:217 (1990)]; 및 [Mizushima and Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 (1990)]), 및 라우스(Rous) 육종 바이러스 ([Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)]) 및 인간 사이토메갈로바이러스 ([Boshart et al., Cell 41 :521 (1985)])의 긴 말단 반복부로부터의 것들이다.

용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능 양쪽 모두를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 절편을 의미한다 (예를 들어, 프로모터 및 인핸서 기능 양쪽 모두를 함유하는 레트로바이러스의 긴 말단 반복부). 인핸서/프로모터는 "내인성", 또는 "외인성", 또는 "이종성"일 수 있다. 내인성 인핸서/프로모터는 게놈 내의 소정의 유전자와 천연적으로 연결되는 것이다. 외인성 (이종성) 인핸서/프로모터는 유전자 조작 (즉, 분자생물학 기술)에 의해 유전자와 병렬로 놓이는 것이다.

발현 벡터 상의 "스플라이싱 신호"의 존재는 종종 재조합 전사물의 더 높은 수준의 발현을 초래한다. 스플라이싱 신호는 1차 RNA 전사물로부터의 인트론의 제거를 매개하고, 스플라이스 도너 및 어셉터 부위로 구성된다 ([Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), pp. 16.7-16.8]). 통상적으로 사용되는 스플라이스 도너 및 어셉터 부위는 SV40의 16S RNA로부터의 스플라이스 접합부이다.

진핵생물 세포에서의 재조합 DNA 서열의 효율적인 발현은 생성된 전사물의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 신호를 필요로 한다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견되고, 뉴클레오티드 수백개의 길이이다. 본원에서 사용된 용어 "폴리 A 부위", 또는 "폴리 A 서열"은 신생 RNA 전사물의 종결 및 폴리아데닐화 양쪽 모두를 지시하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리 A 꼬리가 없는 전사물은 불안정하고 급속하게 분해되기 때문에, 재조합 전사물의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 발현 벡터에서 사용되는 폴리 A 신호는 "이종성" 또는 "내인성"이다. 내인성 폴리 A 신호는 게놈 내의 소정의 유전자의 코딩 영역의 3' 말단에서 천연적으로 발견되는 것이다. 이종성 폴리 A 신호는 하나의 유전자로부터 단리되어 또다른 유전자의 3'에 놓이는 것이다. 통상적으로 사용되는 이종성 폴리 A 신호는 SV40 폴리 A 신호이다. SV40 폴리 A 신호는 237 bp BamHI/BcII 제한 단편 상에 함유되고, 종결 및 폴리아데닐화 양쪽 모두를 지시한다 ([Sambrook, 상기 문헌, 16.6-16.7]). 이러한 237 bp 단편은 671 bp BamHI/PstI 제한 단편 내에 함유된다.

용어 "유전자 조작된 세포주"는 분자생물학 기술 (즉, 재조합 DNA 기술)에 의해 세포주 내로 도입된 이종성 DNA를 함유하는 세포주를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "벡터"는 적어도 프로모터 및 관심 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이같은 관심 유전자는 아미노산 서열을 이러한 아미노산 서열 (즉, 예를 들어, TSH 수용체 아미노산 서열)을 발현하기 위한 목적으로 코딩할 수 있다. 벡터는 안정적으로 형질감염된 세포를 형성하도록 외래 DNA 내로 통합되는 능력을 지닌다.

용어 "안정적인 형질감염", 또는 "안정적으로 형질감염됨"은 형질감염된 세포의 게놈 내로의 외래 DNA의 도입 및 통합을 지칭한다.

용어 "안정적인 형질감염체"는 게놈 DNA 내로 외래 DNA가 안정적으로 통합된 세포를 지칭한다.

용어 "안정적인 형질감염" (또는 "안정적으로 형질감염됨")은 형질감염된 세포의 게놈 내로의 외래 DNA의 도입 및 통합을 지칭한다. 용어 "안정적인 형질감염체"는 게놈 DNA 내로 외래 DNA가 안정적으로 통합된 세포를 지칭한다.

용어 "RDluc"는 루시퍼레이스 유전자로 안정적으로 형질감염된 RD 세포주를 지칭한다. 추가로, RD-Rluc는 루시퍼레이스 유전자로 안정적으로 형질감염되고 외인성 수용체 (즉, 예를 들어, Mc4 수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 TSH 수용체)를 디스플레이하는 RD 세포주를 지칭한다.

용어 "CHOluc"는 루시퍼레이스 유전자로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 지칭한다. 추가로, CHO-Rluc는 루시퍼레이스 유전자로 안정적으로 형질감염되고 외인성 수용체 (즉, 예를 들어, 야생형 수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 TSH 수용체)를 디스플레이하는 CHO 세포주를 지칭한다. 별법적으로, CHO-RMc4luc는 키메라 수용체 (즉, 예를 들어, 래트 융모성 고나도트로핀 수용체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 TSH 수용체)를 디스플레이하는, 루시퍼레이스 유전자로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "선별가능 마커"는 선별가능 마커가 발현되는 세포에게 항생제 또는 약물에 대한 저항성을 부여하는 효소 활성을 코딩하는 유전자의 사용을 지칭한다. 선별가능 마커는 "우성"일 수 있다; 우성 선별가능 마커는 임의의 포유류 세포주에서 검출될 수 있는 효소 활성을 코딩한다. 우성 선별가능 마커의 예로는 포유류 세포에서 약물 G418에 대한 저항성을 부여하는 박테리아 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼레이스 유전자 (neo 유전자로 또한 지칭됨), 항생제 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 박테리아 하이그로마이신 G 포스포트랜스퍼레이스 (hyg) 유전자 및 마이코페놀산의 존재 하에 성장하는 능력을 부여하는 박테리아 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼레이스 유전자 (gpt 유전자로 또한 지칭됨)가 포함된다. 또다른 선별가능 마커는 이들이 관련 효소 활성이 없는 세포주와 함께 사용되어야 한다는 점에서 우성이 아니다. 비-우성 선별가능 마커의 예로는 tk 세포주와 함께 사용되는 티미딘 카이네이스 (tk) 유전자, CAD-결핍 세포와 함께 사용되는 CAD 유전자 및 hprt 세포주와 함께 사용되는 포유류 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼레이스 (hprt) 유전자가 포함된다. 포유류 세포주에서의 선별가능 마커의 사용의 리뷰가 [Sambrook et al., 상기 문헌, pp.16.9-16.15]에서 제공된다.

용어 "~를 코딩하는 핵산 분자", "~를 코딩하는 DNA 서열", 및 "~를 코딩하는 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥을 따라서 있는 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드의 순서가 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따라서 있는 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, DNA 서열이 아미노산 서열을 코딩한다.

부착성 세포주와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "합류성(confluent)" 또는 "합류(confluency)"는 배양물 전반의 세포가 서로 접촉되어 세포의 연속 시트 또는 "단층"인 것으로 보이는 것을 형성하는 상태를 정의한다.

본원에서 사용된 용어 "세포병변 효과" 또는 "CPE"는 바이러스와 같은 외부 작용제로부터 초래되는 세포 구조에서의 변화 (즉, 병리학적 효과)를 기술한다. 통상적인 세포병변 효과에는 세포 파괴, 합포체 (즉, 융합된 거대 세포) 형성, 세포 둥글어짐, 액포 형성, 및 봉입체형성이 포함된다. CPE는 생육성으로 유지되도록 필요한 기능을 수행하는 허용성 세포 숙주의 능력에 부정적으로 영향을 미치는, 허용성 세포에 대한 바이러스의 작용으로부터 초래된다. 시험관내 세포 배양 시스템에서, 합류성 단층의 일부로서의 세포가 바이러스를 함유하는 검사물과의 접촉 후 비-합류 영역을 나타내는 경우에 CPE가 명백하다. 관찰된 현미경 효과는 일반적으로 성질이 국소적(focal)이고, 단일 비리온에 의해 병소(focus)가 시작된다. 그러나, 샘플 내의 바이러스 로드(load)에 따라, 충분한 기간의 인큐베이션 후 단층 전반에 걸쳐 CPE가 관찰될 수 있다. 바이러스에 의해 유도된 CPE를 나타내는 세포는 일반적으로 둥근 형상으로 형태가 변화되고, 장기간에 걸쳐서는 사망하여 단층 내의 이의 고착점으로부터 방출될 수 있다. 다수의 세포가 국소적 파괴의 지점에 도달했을 때, 이러한 영역을 바이러스 플라크로 칭하고, 이는 단층 내의 구멍으로 나타난다. 당업자는 세포병변 효과를 용이하게 식별할 수 있고 구별할 수 있다.

약어 "ONPG"는 o-니트로페닐-13-D-갈락토피라노시드를 나타낸다. ONPG는 효소 β-갈락토시데이스 (β-gal)에 대한 기질이다. ONPG와 β-gal 간의 반응으로 405 nm에서 분광광도법으로 정량할 수 있는 황색 생성물이 생산된다.

약어 "X-gal"은 β-갈락토시데이스 효소에 대한 기질인 화학 화합물 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-(3-D-갈락토피라노시드를 나타낸다. X-gal과 β-갈락토시데이스 간의 반응으로 시각적으로 식별할 수 있는 청색 침전물이 형성된다.

용어 "hybriwix"는 DNA 혼성화에 의한 세포들의 감염된 단층 내의 특정 바이러스 DNA의 정량을 허용하는 다이아그노스틱 하이브리즈 인크. (Diagnostic Hybrids, Inc.; Athens, Ohio)의 제품을 나타낸다. "DNA 혼성화"는 분자들의 염기 서열이 염기 쌍형성 규칙에 따라 매칭(matching)되는 2개의 상보적인 DNA 분자들의 어닐링(annealing)이다. DNA 혼성화는 공지된 DNA 또는 "프로브"에 대한 혼성화에 의해 알려지지 않은 또는 "표적" DNA를 확인하거나 정량하는데 사용된다. 전형적으로, 프로브는 감마 카운터로 검출 및 정량될 수 있는 방사선동위원소인 ¹²⁵I와 같은 리포터 분자로 표지된다.

본원에서 사용된 "플라크 감소 분석법" 또는 "PRA"라는 구절은 약물에 노출된 세포 단층에서의 플라크 형성 감소를 계수함으로써 항-바이러스 약물의 효능을 결정하는데 사용되는 표준 방법을 기술한다. "플라크"는 "CPE"의 한정된 영역이다. 일반적으로, 이는 세포 단층이 단일 감염 바이러스로 감염된 후, 바이러스가 복제되어 단층의 인접 세포들에 확산된 결과이다. 플라크는 "바이러스 감염 병소"로 또한 지칭될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "허용성"은 바이러스와 이의 추정 숙주 세포 간의 상호작용 이벤트의 결론을 기술한다. 이러한 프로세스는 숙주 세포 표면에 바이러스가 흡착되는 것으로 시작되고, 감염성 비리온의 방출로 종결된다. 세포가 또다른 세포로의 바이러스의 확산을 쉽게 허용한다면 세포는 "허용성"이다. 플라크 감소 분석법, 젤 전기영동으로부터 수득된 결과를 기초로 하는 바이러스 단백질의 생산 비교 및/또는 정량, DNA 또는 RNA 함량을 분석하기 위한 혼성화 분석을 사용하는 상대 비교 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는, 소정의 세포주의 허용성을 결정하기 위한 다수의 방법이 이용가능하다.

본원에서 사용된 용어 "감수성"은 허용성 또는 비-허용성 숙주 세포가 바이러스를 흡착할 수 있고 바이러스가 이를 투과할 수 있는 정도를 기술한다. 투과될 수 있지만 비리온을 방출하지 않는다는 점에서, 세포주가 허용성이지 않으면서 감수성일 수 있다. 그러나, 허용성 세포주는 감수성이어야 한다.

본원에서 사용된 "~ 상에 시딩(seeding on)"이라는 구절은 현탁된 세포의 수성 용액을 표면에 부착된 세포를 함유하는 용기 내로 옮긴 후, 현탁된 세포 또는 "시드"가 중력에 의해 침강되고, 부착된 세포에 비교적 균일한 방식으로 붙어서, 혼합물로서 최종 세포 단층 내로 통합되도록 하는 충분한 기간 동안 용기를 보관하는 행위를 기술한다. "혼합된 세포 단층"이 "~ 상에 시딩" 프로세스로부터 초래된다.

본원에서 사용된 "~ 내에 시딩(seeding in)"이라는 구절은 현탁된 조직 배양물 세포들의 2개 이상의 수성 용액 (각각의 세포 현탁액은 세포 성질이 상이함)을 혼합하고, 세포들의 이같은 혼합물을 용기로 옮기고, 상기 용기를 현탁된 세포들이 중력에 의해 침강되고, 임의의 단일 세포 유형의 분포가 원래의 혼합물 내의 세포들의 상대적인 비율을 가리키도록 비교적 균일한 방식으로 붙도록 하는 충분한 기간 동안 보관하는 것을 기술한다.

본원에서 사용된 용어 "스타츠(starts)"는 바이러스의 1차 감염을 나타내는 리포터 세포를 지칭한다. 바이러스가 리포터 세포 (유전자 조작된 세포)를 감염시키고, 리포터 유전자의 발현을 유도한다. 리포터 세포는 비-허용성일 수 있고 (즉, 리포터 세포의 허용성이 필수적이지 않음), 여전히 스타츠를 생산할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "키메라"는 2개 이상의 상이한 종으로부터의 부분들을 함유하는 임의의 핵산 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 1차 아미노산 서열이 2개 이상의 상이한 종 (즉, 예를 들어, hTSH/rLH-R 또는 RMc4)으로부터의 부분들을 함유하는 경우 단백질이 키메라일 수 있다. 1차 아미노산 서열이 동일한 종 또는 상이한 종으로부터의 여부와 상관없이 2개 이상의 상이한 단백질로부터의 부분들을 함유하는 경우 단백질이 또한 키메라일 수 있다. 4차 아미노산 구조가 2개 이상의 상이한 종으로부터의 단백질들을 함유하는 경우 단백질이 또한 키메라일 수 있다. 추가로, 1차 뉴클레오티드 서열이 2개 이상의 상이한 종으로부터의 부분들을 함유하는 경우 핵산이 키메라일 수 있다. 1차 뉴클레오티드 서열이 동일한 종 또는 상이한 종으로부터의 여부와 상관없이 2개 이상의 상이한 단백질들로부터의 부분들을 함유하는 경우 핵산이 또한 키메라일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "글루코코르티코이드"는 글루코스신합성을 증가시켜, 간 글리코겐 및 혈액 글루코스의 농도를 상승시키는 임의의 코르티코스테로이드 화합물을 지칭한다: 이러한 군에는 덱사메타손, 프레드니손, 하이드로코르티손, 플루티카손, 코르티솔, 코르티손, 또는 코르티코스테론이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

상세한 설명

본 발명은 자가면역 질환의 진단에서 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 그레이브스병의 진단 및 관리에서 사용하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 한 조성물은 혈중 갑상샘 자극 면역글로불린에 대한 민감도 및 특이성이 개선된 키메라 갑상샘 자극 호르몬 수용체를 포함한다. 이같은 키메라 수용체를 사용하는 분석법이 글루코코르티코이드의 존재 하에 최적화될 수 있다.

또한, 본 발명은 개체의 면역 상태 및 응답을 모니터링하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 백신 수용자의 면역 응답을 모니터링하는 것에서 본 발명의 용도가 발견된다. 본 발명은 세포 표면 수용체에 대한 바이러스의 부착을 가속화 및 강화시켜, 샘플 내의 바이러스를 검출 및 정량하는 분석법에서 증가된 민감도를 제공하기 위한 방법 및 조성물을 추가로 제공한다.

I. 그레이브스병

전형적으로, 청소년에서의 그레이브스병의 임상 상황은 매우 쉽게 인식된다. 환자는 더욱 통상적으로는 남성보다는 여성이고, 발한, 심계항진, 신경질, 과민성, 불면증, 떨림, 잦은 배변, 및 양호한 식욕에도 불구하고 체중이 손실되는 것이 포함되지만 이에 한정되지 않는 증상들을 보고한다. 신체 검사는 일반적으로 경미한 돌출, 응시, 눈꺼풀 내림 지연, 평할성 광범위 비-압통 갑상샘종, 커다란 심장음이 있는 빈맥 (특히 운동 후)을 나타내고, 종종 수축기 잡음 또는 좌측 흉골연 스크래치, 떨림, 손발톱박리증, 및 수장 홍반을 나타낸다; 종종, 갑상샘 위로 잡음이 들리고, 목의 잡음이 거의 항상 존재한다. 이러한 증상이 있는 환자에서, 그레이브스병이 쉽게 인식되고, 실험실 테스트로 확증될 수 있다 ([Federman, Thyroid, Dale and Federman (eds.), Scientific American Medicine, 3:1-6, Scientific American, New York, NY, (1997)] 참조).

상기 기술된 징후 및 증상들이 성가실 수 있지만, 질환의 또다른 증상들이 더욱 위험할 수 있다. 가장 방해가 되는 증상 중 하나는 눈근육마비, 소포 결막염, 결막부종 및 시력 상실이 동반되는 중증 안구돌출이다. 추가적인 증상들에는 피부병증, 정강뼈앞 점액부종, 곤봉화, 및 가장 중증인 경우의 선단비대증이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 징후 및 증상들은 그레이브스병의 대표적인 자가면역 병인을 가리킨다.

그레이브스병의 전형적인 임상 양상에도 불구하고, 진단을 확증할 뿐만 아니라, 관리 및 치료를 위한 예후 지시약을 제공하기 위한 방법이 필요하다. 또한, 갑상샘항진증의 원인이 불명확한 경우, 병인을 결정하기 위해 진단 테스트가 사용되어야 한다. 생체내 방법 예컨대 방사성-요오드 흡수 (RAIU)가 그레이브스병 환자의 진단 및 모니터링에서 사용될 수 있지만 (예를 들어, [Baldet et al., Acta Endocrinol. (Copenh) 116:7-12 (1987)] 참조), 이러한 목적으로 개발된 시험관내 분석 시스템의 2가지 기본 군이 있다. 하나는 일부 갑상샘 자극 지수 (예를 들어, cAMP 생성)의 측정에 의존적이고, 나머지는 방사성표지된 갑상샘 자극 호르몬 (TSH)이 이의 수용체에 결합하는 것을 억제하는 갑상샘-자극 자가항체 (TSAb)의 능력을 평가한다. 이러한 방법들은 TSAb에 대한 생물검정 및 시험관내 분석법을 포함한다. 그러나, 그레이브스병 진단에서 갑상샘-자극 면역글로불린 (TSI 또는 TSAb)을 측정하기 위한 방법의 광범위한 적용이 보고되어 있지 않다. (예를 들어, [Rapoport et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 58:332-338 (1984)] 참조). 또한, 그레이브스병 환자의 혈청에서, 갑상샘 호르몬 수용체를 인식하는 면역글로불린 G (IgG) 분자들의 이종성 집단이 있다는 것이 인지되었다 (예를 들어, [Yokoyama et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 64:215-218 1987)] 참조). 추가로, TSH-결합 억제 분석법이 갑상샘-자극 활성을 반드시 반영하지는 않는다는 것의 인지는 이같은 분석법의 임상 적용에 대한 동의에 도달하려는 시도에서 혼란의 원인이 되었다 (예를 들어, [McKenzie and Zakarija, J. Clin. Endocrinol. Metabol., 69:1093-1096 (1989)] 참조). 민감도 및 특이성 면에서의 제한이 또한 문제였다. 실제로, 이용가능한 분석 시스템과 관련된 문제점들이 갑상샘 퍼록시데이스 항체의 측정이 근원적인 갑상샘 자가면역에 대한 충분히 민감한 마커라는 논쟁을 초래하였다 ([Botero and Brown, 상기 문헌] 참조).

상기 문헌 [Rapoport et al.]에서 지적된 바와 같이, 표준화된 방식으로, 그리고 다수의 샘플에 대해 쉽게 수행될 수 있는 이용가능한 분석법이 민감도 및/또는 특이성의 면에서 상당한 제한이 있어, 이러한 테스트들을 임상 용도에 신뢰할 수 없게 만든다. 이러한 문제점들은 방사성표지된 TSH가 인간 갑상샘 형질막에 결합하는 것을 억제하는 TSI의 능력을 측정하는 분석법에 주로 적용된다 (즉, 분석법이 TSI 활성 그 자체를 측정하지 않는다). 또한, 모든 항-TSH 수용체 항체가 자극성이지는 않다. [Rapoport et al., 상기 문헌]에서 인간 갑상샘 혈장막 내의 아데닐레이트 사이클레이스 활성의 TSI 자극을 사용하는 분석법이 민감도가 심각하게 부족하다는 것을 추가로 지적하였다. 일부 분석법들은 일반적인 임상 용도에 비실용적이고 (신선한 인간 갑상샘 조직의 사용에 의존하는 것들 포함), 제한된 샘플 용량으로의 극도로 어려운 기술을 수반하며, 매우 힘들고/힘들거나 비경제적이다 (예를 들어, [Rapoport et al., 상기 문헌] 참조). 배양된 개 및 돼지 갑상샘 세포를 사용하여 TSH에 대한 cAMP 응답을 측정하는 분석법의 발달이 인간 갑상샘 세포와의 사용에 대해 나중에 개조되었고, 이는 잠재적으로 우수한 결과를 제공하였다. 이러한 방법들 중 일부 (예를 들어, [Rapoport et al., 상기 문헌]에 논의된 방법)에서의 신선한 갑상샘 세포에 대한 요구에 더하여, 다수는 검사물을 분석하기 전의 지루하고 시간이 걸리는 샘플 제조를 또한 요구한다. 예를 들어, 일부 프로토콜은 힘들고 시간이 걸리는 투석 방법 및/또는 테스트 혈청 내의 면역글로불린을 황산암모늄 또는 폴리에틸렌 글리콜로 침전시키는 것을 요구한다 (예를 들어, [Rapoport et al., 상기 문헌]; 및 [Kasagi et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 62:855-862 (1986)] 참조).

이러한 분석 시스템들에서 부딪히는 문제점들을 고려하여, 수행하기 쉽고, 신뢰할 수 있으며, 민감하고, 그레이브스병 자가항체에 대해 특이적인 분석법을 개발하려는 노력으로 또다른 방법들이 조사되었다. 예를 들어, cAMP 생산을 측정하는 바이오어세이의 사용은 연속 배양에서 성장된 비-인간 기원의 세포의 사용, 또는 1차 배양물로서 사용되거나 필요에 따라 사용하기 위해 분취량으로 동결된 인간 세포에 의존한다. 인간 갑상샘 세포를 사용하는 것의 문제점에는 수술에 의해 수득된 갑상선 조직의 응답성에서의 가변성이 포함된다. 따라서, 비-인간 기원의 세포가 인기를 얻었고, 여기에는 래트 갑상샘 세포주 (FRTL-5)가 포함된다. 이는 잘 연구되고 특성화된, 형질전환되지 않은 분화된 세포주이다 (예를 들어, [Bidey et al., J. Endocrinol., 105:7-15 (1985)]; 및 [Michelangeli et al., Clin. Endocrinol., 40:645-652 (1994)] 참조). 그러나, 다수의 불이익이 이러한 세포들을 그레이브스 병 분석법에 대해 덜 이상적이게 한다. 예를 들어, 세포들이 느리게 성장하고, TSH에 대한 요구를 포함하여 성장 요건이 까다롭다. 그 결과, 합리적인 수준의 민감도를 달성하기 위해 분석법 전에 5일 이상 동안 TSH를 세포에서 박탈하는 것이 필요하다.

JP09 세포 (기능성 인간 TSH 수용체로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 세포) 및 인간 TSH 수용체를 안정적으로 발현하는 기타 세포주와 같은 세포들이 이후에 발달되어, 그레이브스병 자가항체의 검출에 이용가능한 분석 시스템이 크게 개선되었다. 이러한 세포들은 천연 갑상선세포의 것에 필적하는 TSH 수용체를 지니고, TSH 및 갑상샘-자극 항체 (TSAb)에 응답한 G-단백질 커플링, 아데닐레이트 사이클레이스의 활성화 및 cAMP 생성을 수반하는 기능성 신호 전달 시스템을 소유한다 (예를 들어, [Michelangeli et al., 상기 문헌] 참조). 유사한 진단 정보를 제공하지만, FRTL-5 세포와 비교하여 더욱 민감하고, 더 빠르게 성장하며, 성장 요건이 덜 까다롭고, 추출되지 않은 혈청에 응답하기 때문에 이러한 세포들은 FRTL-5 세포보다 우수한 것으로 보고되었다 ([Michelangeli et al., 상기 문헌]; [Kakinuma et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol, 82:2129-2134 (1997)]를 또한 참조). 또한, 이러한 방법들은 더욱 신속하고, 재생가능하며, 아마도 인간 수용체에 대해 지시된 인간 자가항체의 검출에 대해 더욱 특이적일 것이다. 추가로, 이러한 분석법들은 FRTL-5 세포주를 사용하는 것에 비해 수행하기가 더 쉽고 덜 귀찮다 (예를 들어, [Vitti et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 76:499-503 (1993)] 참조). 그러나, 이러한 분석법들은 cAMP를 검출 및 정량하기 위해 방사성의 사용에 의존하고 (예를 들어, 방사선면역분석법), 그 결과 여전히 귀찮다.

II . 그레이브스병에 대한 진단 분석법

그레이브스병은 항체-매개 자가면역 반응에 의해 야기되는 갑상샘 장애이다. 그레이브스 환자에서, TSHR을 인식하는 자가항체 (TRAb)는 이종성이고, 여기에는 주로 갑상샘 자극 항체 (TSAb) 및 갑상샘 차단 항체 (TBAb)가 포함된다. TSAb는 갑상샘항진증을 야기하는 TSH 작동제로 작용하는 반면, TBAb는 갑상샘저하증을 야기하는 TSH 길항제로서 기능한다. TSAb 및 TBAb가 TSHR 상의 상이한 에피토프에 결합하지만, TBAb 결합은 TSAb의 자극 효과를 "중화"할 수 있다. TSAb가 TSHR에 결합했을 때, 이는 cAMP 신호전달 경로를 유도하고, TBAb에는 이러한 효과가 없다.

현재, 여러 바이오어세이가 그레이브스병을 진단하는데 사용된다. 크로누스(Kronus)® 라디오 리셉터 어세이 (Radio Receptor Assay)(RRA) 키트가 TRAb의 결정에 사용되고, TSAb 및 TBAb 양쪽 모두를 검출하지만, 둘을 구별할 수 없다. 환자 혈청 내의 TRAb를 검출하는 그레이브스 진단 CHO-Luc 세포주가 다이아그노스틱 하이브리즈 인크. (DHI)에서 기존에 개발되었다. 이러한 세포주는 야생형 TSH 수용체 유전자 및 인간 당단백질 알파 서브유닛 프로모터에 의해 구동되는 반딧불이 루시퍼레이스 유전자를 공동-발현한다. 이러한 야생형 TSHR에는 TSAb 및 TBAb에 결합하는 에피토프들이 있다. 수용체에 대한 TBAb의 결합은 TSAb의 결합을 조정할 수 있어, TSAb에 의한 더 낮은 자극을 초래한다.

갑상샘 자극 호르몬 (TSH) 수용체에 대해 지시된 갑상샘-자극 자가항체 (TSAb)는 고리형-아데노신 모노포스페이트 (cAMP)의 생산을 담당하는 효소인 갑상샘 아데닐릴 사이클레이스를 자극할 수 있다. 이러한 자가항체는 그레이브스병을 앓고 있는 환자의 검출 및 확인을 위한 진단 마커로 사용되었는데, 이는 이러한 자가항체가 이러한 질환에 걸린 환자에서 나타나는 갑상샘항진증을 초래하는 것으로 보이기 때문이다. 그러나, 하기에 더욱 상세하게 논의된 바와 같이, 이러한 TSAb를 검출 및 측정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법들은 복잡하고 시간이 걸린다.

A. cAMP 검출

TSAb를 측정하는 한 방법은 "FRTL-5"로 공지된 래트 갑상샘 세포주를 이용한다. 인터티로이드 리써치 파운데이션 (Interthyroid Research Foundation; Baltimore, MD)로부터 입수가능한 이러한 세포주는 인간 TSAb와 교차반응하는 수용체를 발현한다. TSAb의 존재 하에 (즉, 예를 들어, 이러한 항체를 함유하는 그레이브스 환자로부터의 혈청에 세포가 노출되는 경우), FRTL-5 세포가 cAMP를 생산하도록 자극된다. 그후, 용해된 세포 또는 세포가 담긴 배지의 일부분에서 방사선면역분석법 방법을 사용하여 이러한 cAMP가 측정된다. FRTL-5 세포는 그레이브스병의 질병특유적인 자가항체에 대한 최초의 성공적인 바이오어세이의 기초를 형성하였다. 미국 특허 번호 4,609,622 (거명에 의해 본원에 포함됨).

B. FRTL-5 세포 분석법 및 기아 배지

문헌 [Vitti et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 76:499 (1993)]에 기술된 바와 같이 수행된 FRTL-5 세포를 사용하는 전형적인 분석법은 FRTL-5 세포를 96-웰 플레이트 (30,000개의 세포/웰)에서 세포 배양 배지에서 사용되는 정상적인 성장 구성성분에 더하여 6개의 호르몬을 함유하는 특수 완전 배지 (즉, 예를 들어, 6H 배지) 내에 시딩(seeding)하는 것을 수반한다. 5％ CO₂, 37℃의 습식 인큐베이터에서 2-3일 인큐베이션 한 후 (즉, 세포가 합류성일 때), 배지를 6H 배지 내의 6개의 호르몬 중 하나인 TSH가 결핍된 "기아 배지"로 교환한다 (따라서, 5H 배지가 초래된다). 그후, 세포를 2-3일마다 배지를 교환하면서 인큐베이터에서 4-5일 동안 유지시킨다. 이러한 기간 동안, 세포는 성장 또는 증식하지 않는다. 이어서, 세포가 진단 분석법에서 사용될 수 있다.

C. 방사성표지 분석법 및 자극 배지

기아 배지를 제거하고, 포스포디에스터레이스가 cAMP를 분해하는 것을 방지하기 위해 포스포디에스터레이스 억제제 (예를 들어, 0.5 mM 메틸이소부틸잔틴; IBMX)를 함유하는 특수 저-염화나트륨, 고-글루코스 완충제 (HBSS NaCl + 222 mM 수크로스; 이러한 완충제에 대한 조성은 하기와 같다: 0.0608 g/L KH₂PO₄, 0.144 g/L CaCl₂, 0.373 g/L KCl, 0.048 g/L MgSO₄, 0.097 g/L Na₂PHO₄, 1.0 g/L D-글루코스, 76 g/L (즉, 222 mM) 수크로스, 4.77 g/L HEPES, 및 10 g/L BSA; pH 7.2 - 7.4)를 포함하는 자극 배지를 첨가함으로써, 그레이브스병에 대한 초기 진단 방법들이 수행되었다. 환자 면역글로불린 (IgG)의 특수 제조 샘플, 대조군, 및 표준물을, 일반적으로 3중으로, 적합한 웰에 첨가하고, 플레이트를 5％ CO₂, 37℃의 습식 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 이러한 인큐베이션 후, 5-10 ㎕의 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 방사선면역분석법 시스템에서 사용하여, cAMP의 존재를 검출한다. 전형적으로, 이러한 분석법을 약 6개의 표준물로 이중으로 실행하고, 환자 및 대조군을 또한 이중으로 실행한다. 분석법은 일반적으로 하룻밤 동안의 인큐베이션을 필요로 하고, 유리 방사성표지 cAMP를 항체에 결합된 방사성표지 cAMP로부터 분리하기 위해 다음 날 약 1시간이 필요하다.

방사성 및 긴 제조 시간이 FRTL-5 분석법의 부정적인 양상이기 때문에, 개선된 시스템이 개발되었다. 한 연구는 분석 시스템의 민감도를 증가시키기 위해 낮은 염 조건을 사용하는 것을 수반하였다 ([Kosugi et al., Endocrinol., 125:410-417 (1989)] 참조). 이러한 바이오어세이에서의 추가적인 개선은 인간 TSH 수용체로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 ("CHO") 세포의 균주를 수반하였다 ("CHO-R"; [Vitti et al., 상기 문헌] 참조). 이러한 세포주는 FRTL 분석법에 비해 2가지 주요 개선을 제공하였다. 먼저, 이러한 방법은 래트 TSH 수용체 대신 인간 TSH 수용체의 사용을 수반하는데, 이는 TSAb의 검출을 위한 더 큰 특이성 및 아마도 민감도를 제공할 것이다. 두번째로, 6-8일 기간에 걸친 특수 6H 배지 및 5H 배지 교환이 요구되지 않는데, 이는 CHO-R 세포가 표준 보충 배지에서 잘 성장하고, 웰을 접종하는데 사용된 세포 현탁액의 밀도에 따라, 시딩 후 1-3일 동안 사용될 수 있기 때문이다. 또한, FRTL-5 세포와의 비교 연구는 CHO-R 세포가 그레이브스 TSAb의 검출에서 더욱 정확할 수 있다는 것을 나타냈다 ([Vitti et al.] 참조).

D. CHO-Rluc 세포주를 사용하는 루시퍼레이스 유전자 분석법

리포터 유전자 (즉, 예를 들어, 루시퍼레이스)의 사용을 통해 TSI에 의해 야기된 cAMP의 증가된 양을 쉽게 평가하도록 디자인된 CHO-R 세포의 사용에 의해 추가적인 개선이 제공되었다 ([Evans et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 84:374 (1999)]). 따라서, 이러한 조작된 세포주 (즉, CHO-Rluc)의 도입으로, cAMP 검출 및 정량을 위해 기존에 개발된 방사선면역분석법에서 사용된 방사성 화합물의 사용에 내재된 복잡성 및 위험이 제거된다. 이러한 세포들을 사용하여, 세포로부터 배지를 제거하고, 용해 완충제를 첨가하고, 20-30분 동안 용해가 일어나도록 하고, 용해물의 샘플을 제거하고, 루시퍼레이스 기질을 첨가하고, 발광측정기를 사용하여 15초 간격에 걸쳐 광 출력을 측정함으로써 간단하게 루시퍼레이스가 측정된다. 그러나, 하기 실험 섹션에 지시된 바와 같이, 이러한 방법은 모호한 결과를 제공하고, 추가적인 개선을 필요로 하였다.

한 실시양태에서, CHO-Rluc 프로토콜의 장점을 통합하면서, 신뢰도 및 재현성의 면에서 추가적인 장점을 제공하는 방법이 본 발명에서 구현된다. 치료되지 않은 그레이브스병 환자로부터의 면역글로불린 및 TSH를 사용하는 발광측정 분석법에서 CHO-Rluc 세포의 사용을 허용하는 것을 포함하여, 본 발명의 방법의 개발에 상당한 개발 노력이 바쳐졌다.

원래 사용된 표준 프로토콜은 18-24시간의 인큐베이션 후 합류성 단층이 생산된 농도로 시딩하도록, 동결 스톡으로부터 CHO-Rluc 세포를 이식하는 것을 수반하였다. 먼저, 성장 배지를 제거하고, 자극 배지를 단층에 첨가하고, 여기에 일련의 TSH 표준물 (예를 들어, 0, 10, 100, 1000 μIU TSH/㎖), 및 환자 IgG 샘플을 첨가하였다. 이러한 접근법에서 불량한 결과가 산출되기 때문에, 하룻밤 동안의 기아 또는 컨디셔닝 기간을 테스트하였다.

기아 기간은 배경값이 더 낮은 개선된 결과를 초래하였고, TSH 표준물 및 테스트 환자 샘플에 대해 양호한 결과를 생성시키는 것으로 보였다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 항원 및 항체 결합을 강화하기 위해 사용된 추가적인 실험 옵션을 또한 테스트하였다. 이러한 실험에서, PEG가 자극 배지에 첨가되었다.

다양한 실험에서, 상이한 배지 제형 및 조합물이 하기의 실험 섹션에 기술된 바와 같이 테스트되었다. 예를 들어, 자극 배지로의 기아는 0 μIU/㎖ TSH 표준물에 대해 (32,103), 10 μIU TSH/㎖ 샘플에 대해 -1,148, 1000 μIU TSH/㎖ 샘플에 대해 47,478, 및 IgG 샘플 #13에 대해 19,350의 RLU/초 값을 초래하였다. 여기에서, 그리고 하기의 논의에서, 괄호 안의 숫자는 0 μIU TSH/㎖ 값을 나타내고, 이는 순량(net) 값을 산출하기 위해 표준물 또는 샘플에 대한 값으로부터 차감된다.

표준 HBSS로의 기아는 0 μU/㎖ TSH 대조군에 대해 (21,671), 10 μIU TSH/㎖ 샘플에 대해 1,336, 1000 μIU TSH/㎖ 샘플에 대해 82,466, IgG 샘플 #13에 대해 39,082의 RLU/초 값을 초래하였다. 표준 HBSS 및 자극 배지 내의 6％ PEG로의 기아는 0 μIU/㎖ TSH 대조군에 대해 (32,562), 10 μIU TSH/㎖ 샘플에 대해 5,980, 1000 μIU 5 TSH/㎖ 샘플에 대해 207,831, 및 IgG 샘플 #13에 대해 174,461의 RLU/초 값을 초래하였다. 따라서, 표준 HBSS로의 기아가 TSH 및 그레이브스병 샘플에 대해 더 높은 값을 산출하였고, 자극 배지 내로의 PEG의 혼입은 더욱 더 높은 값을 산출하였다. 이러한 더 높은 값들은 상기 기술된 방법들에 비해 본 발명의 방법에 더 높은 수준의 민감도를 부여하는 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 기아 기간을 수반하는 이러한 분석법들의 긴 기간은 불리하다. 3-4일 분석법 기간을 단축시킨 분석법 개선이 분석법 민감도 및 정확성을 또한 개선시킬 수 있는 것으로 가정되었다.

E. 키메라 TSH 수용체 세포주

한 실시양태에서, TSH/LH/TSH 키메라 수용체 (즉, 예를 들어, RMc4)를 반딧불이 루시퍼레이스 유전자와 함께 발현하는 재조합 세포주 (즉, 예를 들어, CHO 및 RD)가 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, 발현이 인간 당단백질 알파 서브유닛 프로모터에 의해 구동된다. 발명 메커니즘을 이해할 필요는 없지만, 키메라 수용체를 사용함으로써, 차단 항체 (즉, 예를 들어, TBAb)의 결합이 제거 및/또는 감소되는 것으로 생각된다. 한 실시양태에서, 키메라 수용체는 TSAb 결합 영역만이 발현되도록 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다. CHO-Luc 세포 또는 크로누스® 분석법에 비교했을 때 이러한 재조합 세포주의 특이성이 증가된 것으로 생각된다.

III . 면역 응답 발달의 모니터링

상기 지시된 바와 같이, 본 발명은 면역 응답 발달을 모니터링하기 위한 방법 및 조성물을 또한 제공한다. 특히, 본 발명은 백신접종에 대한 개체의 응답을 모니터링하는데 적절한 방법 및 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 면역전 혈청 (즉, 백신의 투여 전에 수집된 혈청)이 대조군 목적을 위한 기준선으로 사용될 수 있다. 또한 이같은 혈청이 백신접종 직후에 (예를 들어, 백신접종 1-2주 후), 뿐만 아니라 백신접종 후 수개월 동안 주기적으로 수집될 것이다. 그후, 혈청 샘플이 중화 항체의 존재 및 양에 대해 테스트된다.

일부 실시양태에서, 바이러스 항원에 대한 응답을 모니터링하기 위해 진단 분석법이 수행된다. 이같은 분석법에서, ELVIS™ (Diagnostic Hybrids, Athens, OH)와 같은 세포가 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액과 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, PEG는 항원-항체 반응을 강화함으로써, 더 높은 반응성을 초래한다.

IV . CHO - Mc4luc 및 RD - Mc4luc 세포주에서의 TSI 검출

한 실시양태에서, 유전자 조작된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및/또는 인간 횡문근육종 세포 (RD)를 그레이브스병의 진단 및/또는 그레이브스병 치료법의 모니터링을 위해 사용하는 것이 본 발명에서 구현된다.

그레이브스병을 앓고 있는 환자를 확인하고 이들의 치료법을 모니터링하기 위해 환자 혈청 내의 그레이브스병에 특이적인 자극 자가항체의 검출 및 측정을 위한 다양한 세포 및 반응이 임상 실험실에서 현재 사용된다. 예를 들어, 야생형 인간 갑상샘 자극 호르몬 수용체 (TSHR)를 함유하는 유전자 변형된 CHO 세포 및 CRE-Luc 리포터 시스템을 포함하는 세포가 수많은 실험실에서 활용된다. 그러나, 이러한 세포들은 성장을 위한 1일, 및 테스트 결과 입수가능성에 시간 제약을 부과하는, 기아를 위한 1일을 필요로 한다. 제3일에, 그레이브스 자가항체의 존재를 검출하기 위해 환자의 혈청 검사물을 세포 및 반응 완충제와 함께 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 이러한 여러 날의(multi-day) 분석법 절차를 요구하지 않는 방법이 구현된다. 한 실시양태에서, 이러한 더 짧은 방법에는 기아 기간 인큐베이션이 없다. 그레이브스 질환을 진단하기 위한 빠르고, 정확하며, 민감성인 분석법의 장점이 하기에 더욱 상세하게 설명된다.

한 실시양태에서, 갑상샘 자극 면역글로불린 (TSI) 검출 세포주 (CHO-RLuc)를 개선하기 위한 방법이 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, 세포주는 키메라 수용체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 수용체는 인간 갑상샘 자극 호르몬 수용체 (TSHR) 및 래트 황체형성 호르몬 (LH)을 포함한다 (즉, 예를 들어, RMc4 수용체). 발명 메커니즘을 이해할 필요는 없지만, 진단 분석법에서의 기아 기간이 필요하지 않도록 키메라 TSH 수용체가 TSI에 대한 개선된 결합 특이성을 제공하는 것으로 여겨진다.

한 실시양태에서, CHO 세포 및/또는 RD 세포 (또는 기타 포유류 세포)에서 Mc4 키메라 수용체를 발현시키는 방법이 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 CRE-Luc를 TSI를 검출하기 위해 리포터 유전자로 사용하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 수용체는 자극 자가항체에 우선적으로 (즉, 차단 자가항체와 대조적으로) 결합함으로써 야생형 수용체보다 큰 특이성을 제공한다. 한 실시양태에서, 키메라 수용체는 자극 자가항체에 우선적으로 (즉, 차단 자가항체와 대조적으로) 결합함으로써 야생형 수용체보다 큰 민감도를 제공한다. 한 실시양태에서, 세포 배양물이 PEG를 추가로 포함한다. 발명 메커니즘을 이해할 필요는 없지만, 그레이브스 환자 혈청에 자극 자가항체 및 차단 자가항체 양쪽 모두가 있을 수 있기 때문에, 야생형 TSH-R 수용체는 양쪽 항체에 동등하게 결합할 것으로 여겨진다. 추가로, 차단 자가항체가 자극 자가항체 활성을 조정 및 억제할 수 있는 것으로 여겨진다.

개시된 세포주에서 발현된 이러한 키메라 TSH-R 수용체는 현재 사용되는 세포주에 비해 하기의 장점을 제공한다:

1. 시스템이 더 낮은 루시퍼레이스 활성 배경을 초래하여, 더 높은 신호:노이즈 (S:N) 또는 신호:배경 (S:B) 비율에 이른다.

2. 세포주가 TSI 결합으로부터 초래되는 결과를 최대화하기 위해 현재 사용되는 세포주에 대한 요건인 하룻밤 동안의 "기아"를 필요로 하지 않는다. 이러한 변화는 현재의 3일 분석법에서 2일 분석법으로 소요 시간을 감소시키고, 이는 실험실, 의사 및 환자에게 매우 유리하다.

3. 분석법이 자극 항체를 측정하도록 디자인되는데, 이때 야생형 TSH-R은 자극 항체 및 차단 항체 양쪽 모두에 대해 응답성인 반면, 이러한 Mc4 키메라 수용체는 자극 항체에 대해서만 응답성임으로써, 측정되는 것에 대해 더 큰 특이성을 제공한다.

V. 키메라 TSH 수용체

한 실시양태에서, 높은 검출 민감도 및 특이성으로 갑상샘 자극 호르몬 수용체 (TSH-R) 자가항체 (즉, 예를 들어, 갑상샘 자극 면역글로불린; TSI)를 검출하는 신규 진단 세포주가 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, 세포주는 재조합 차이니즈 햄스터 난소 세포 (즉, 예를 들어, CHO-K1 세포)를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포주는 인간 횡문근육종 (RD) 세포를 포함한다.

한 실시양태에서, 반딧불이 루시퍼레이스 리포터 유전자에 연결된 hTSH/rLH-R 융합 단백질 (즉, 예를 들어, RMc4)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 당단백질 호르몬 알파 서브유닛 프로모터와 작동가능하게 조합된 벡터가 본 발명에서 구현된다. 한 실시양태에서, 세포주가 이러한 벡터로 형질감염된다. 한 실시양태에서, 형질감염된 세포주는 루시퍼레이스 리포터 신호가 검출되도록 하는 조건 하에 인간 TSH-R/래트 황체형성 호르몬 (LH) 키메라 수용체 (hTSH/rLH-R)를 발현한다.

A. 키메라 구축

TSH 및 그레이브스병과 관련된 갑상샘 자극 자가항체에 대한 결합 부위의 신원을 인간/래트 키메라 TSH-R 구축물을 구축함으로써 먼저 시험하였다. 인간 TSH-R을 상응하는 래트 서열로 부분적으로 치환하는 것으로 하기의 키메라 수용체들이 초래되었다: i) 아미노산 잔기 8-165가 치환된 Mc1+2; ii) 아미노산 잔기 90-165가 치환된 Mc2; 및 iii) 아미노산 잔기 261-370이 치환된 Mc4. 데이터는 아미노산 잔기 8-165가 TSH에 의해 요구되는 것과 동일하지 않은 갑상샘 자극 자가항체에 대해 특이적인 에피토프를 함유한다는 것을 시사하였다. 특발성 점액부종 갑상샘 자극 항체, 그레이브스병 갑상샘 자극 항체, 및 TSH 간에 결합 부위에서의 유의한 이질성이 관찰되었다. [Tahara et al., "Immunoglobulins From Graves' Disease Patients Interact With Different Sites On TSH Receptor/LH/CG Receptor Chimeras Than Either TSH Or Immunoglobulins From Idiopathic Myxedema Patients" Biochem Biophys Res Comm 179:70-77 (1991)].

초기의 연구들은 래트 TSH 수용체 및 래트 황체형성 호르몬 융모성 고나도트로핀 수용체로부터의 절편들을 포함한 키메라 TSH 수용체의 형질감염 및 발현을 실연하였다. 다양한 래트 TSH 아미노산 서열이 상응하는 래트 LH/GC 서열로 치환되었다. 데이터는 아미노산 잔기 268-304가 cAMP 응답을 생성시키는데 결정적이지 않지만 TSH 고치환력 결합 부위를 제거하였음을 실연하였다. [Akamizu et al., "Chimeric Studies Of The Extracellular Domain Of The Rat Thyrotropin (TSH) Receptor: Amino Acids (268-304) In The TSH Receptor Are Involved In Ligand High Affinity Binding, But Not In TSH Receptor-Specific Signal Transduction" Endocr J 40:363-372 (1993)]. 인간 TSH 수용체의 아미노산 잔기 90-165가 황체형성 호르몬 융모성 고나도트로핀 수용체로부터의 등가의 아미노산 잔기로 치환된 키메라 인간 TSH 수용체를 사용하여 i) TSH-결합 억제성 면역글로불린; ii) 갑상샘-자극 항체; 및 iii) 갑상샘 차단 항체의 결합을 비교함으로써 항-TSH 수용체 항체의 이질성이 다루어졌다. 결합 데이터는 2가지 상이한 유형의 갑상샘-자극 항체, 3가지 상이한 유형의 TSH-결합 억제성 면역글로불린, 및 하나의 비-기능성 항체가 있을 수 있음을 시사한다.

그레이브스병과 관련이 있는 것으로 추측되는 다양한 유형의 혈중 항체를 검출 및 특성화하기 위해 키메라 TSH 수용체들이 보고되었다. 이같은 항체들은 TSH-R을 활성화시킬 수 있는 자극 자가항체, 및 TSH 또는 자극 자가항체에 의한 TSH-R 결합을 차단할 수 있는 차단 자가항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 인간 TSH-R (hTSH-R)과 황체형성 호르몬 인간 융모성 고나도트로핀 수용체 (LH-hCG-R)의 키메라에는 hTSH-R의 아미노산 261-370이 인간 LH/CG-R로부터의 등가의 잔기로 치환된 RMc4 키메라가 포함되었다. 그레이브스병혈청 샘플로부터의 정제된 IgG 샘플의 cAMP 생산을 자극하는 능력이 방사선면역분석법에 의해 측정되었다. [Kung et al., Epitope Mapping of TSH Receptor-Blocking Antibodies In Graves' Disease That Appear During Pregnancy, J Clin Endocrinol Metab 86:3647- 3653 (2001)].

2가지 유형의 TSH-R 키메라 구축물을 사용함으로써 TSH 자극 자가항체와 차단 자가항체 간의 상호작용이 다루어졌다. 첫번째 키메라는 인간 TSH-R 아미노산 잔기 90-165가 래트 황체형성 호르몬 융모성 고나도트로핀 수용체로부터의 등가의 잔기로 치환된 Mc2로 칭해진다. 두번째 키메라는 인간 TSH-R 아미노산 잔기 8-165가 래트 황체형성 호르몬 융모성 고나도트로핀 수용체로부터의 등가의 잔기로 치환된 Mc1+2로 칭해진다. 그레이브스병 환자 내의 혈중 자가항체의 평가는 차단 자가항체가 자극 자가항체의 작용을 강하게 길항하지 않지만, 현재의 CHO-hTSH-R 진단 분석법 방법에 의해 측정 시 자극 자가항체 활성을 과소평가하는 것을 초래할 수 있음을 나타냈다. [Kim et al., "The Prevalance And Clinical Significance Of Blocking Thyrotropin Receptor Antibodies In Untreated Hyperthyroid Graves' Disease" Thyroid 10:579-586 (2000)].

키메라 hTSH/rLH-R 수용체 (RMc4)의 DNA 서열은 총 2,324개의 염기쌍을 함유하고, 730개의 아미노산을 코딩한다. 도 8. 이러한 키메라 수용체에서, 아미노산 번호 262에서 335까지 범위의 인간 TSH-R 영역이 래트 황체형성 호르몬 (LH) 수용체로부터의 상응하는 73개의 아미노산으로 치환되었다.

루시퍼레이스 리포터의 발현을 구동하는 서열은 뉴클레오티드 236개의 당단백질 알파 서브유닛 프로모터이고, 이는 고리형 AMP (cAMP) 조절 요소 (CRE)를 함유하고, PCR에 의해 클로닝되었다. 클로닝된 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열분석에 의해 결정되었고, Genebank 서열 AF401991과의 서열 비교에 의해 확인되었다. 클로닝된 프로모터와 HEK 세포로부터 PCR에 의해 증폭된 GPH 프로모터의 정렬은 2개의 서열이 동일하다는 것을 가리킨다. 도 9.

C. 키메라 진단 분석법

그후, 음성 및 양성 TSI 혈청에 대한 CHO-RMc4luc, RD-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주의 응답을 비교하였다. 세포들을 TSI 음성 및 양성 혈청과 함께 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 세포들을 용해시키고, 루시퍼레이스 활성을 베리타스 (Veritas) 마이크로플레이트 발광측정기로 측정하였다. 결과는 CHO-RMc4luc 및 RD-RMc4luc 세포주 양쪽 모두 CHO-Rluc 세포에 비교했을 때 검출 민감도가 훨씬 더 높았음을 가리켰다. 도 10a, 10b, 10c, 10d 및 10e. TSI 양성 혈청 대 음성 혈청으로부터의 루시퍼레이스 RLU의 비율 (S/N의 비율)의 비교는 CHO-RMc4luc 및 RD-RMc4luc 세포가 CHO-Rluc 세포주보다 6-8배 및 2.1-4배 더 민감하였음을 나타낸다. 각각 도 10b 및 10d. CHO-RMc4luc 세포는 RD-RMc4luc 세포보다 약 1.3 내지 3.5배 더 민감하였다. 도 10e. 또한, CHO-RMc4luc는 유도된 루시퍼레이스 활성의 수준이 TSI 음성 혈청으로 테스트했을 때 CHO-Rluc보다 낮아서, 더 낮은 배경 및 증가된 신호/음성 (S/N) 비율에 이르렀다. 도 10a. 또한, CHO-RMc4luc 및 RD-RMc4luc 세포주 양쪽 모두 매우 낮은 표준 편차 값을 나타냈다. 각각 도 10a 및 도 10c. #19로 칭해진 TSI 양성 혈청은 CHO-RMc4luc, RD-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주 상에서 높은 루시퍼레이스 유도 수준을 나타냈다. 이러한 혈청을 희석하고, 이러한 세포주들 상에서 테스트하여, 민감도를 비교하였다. 도 10e.

추가로, 단계적으로 희석된 TSI 양성 혈청으로 유도된 CHO-Rluc, CHO-RMc4luc 및 RD-RMc4luc 세포주 간의 검출 민감도를 비교하였다. 예를 들어, TSI 양성 혈청을 단계적으로 희석하고, 여러 세포주들 상에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. RD-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주는 1:2 내지 1:8 사이의 혈청 희석 범위에서 S/N의 비율의 선형 응답을 나타냈다. 그러나, RD-RMc4luc에 대한 용량 응답의 기울기 (값), 및 따라서 검출 민감도가 CHO-Rluc 세포주의 것보다 훨씬 더 높았다. 도 11A. CHO-RMc4luc는 혈청이 없거나 낮은 희석물에서 S/N의 비율의 선형 응답을 나타내지 않았다. 도 11B. 그러나, CHO-RMc4luc 세포는 1:32 내지 1:128 범위의 혈청 희석물로부터 S/N의 비율의 선형 응답을 나타냈다. 도 11C. 용량 응답의 기울기 (값)이 RD-RMc4luc 세포주의 것보다 훨씬 더 높았음을 유념한다. 도 11A 대 도 11C.

CHO-RMc4luc 세포주를 TSH 민감도에 대해 CHO-Rluc 세포주와 또한 비교하였다. 재조합 인간 TSH로 유도된 CHO-Rluc, CHO-RMc4luc 및 RD-RMc4luc 세포주를 사용하여 루시퍼레이스 분석법으로부터 S/N 비율이 유래되었다. 다양한 농도의 재조합 인간 TSH를 3시간 동안 CHO-RMc4luc 또는 CHO-Rluc 세포주와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 루시퍼레이스 분석법을 수행하였다. 결과는 이들 양쪽 모두가 5μIU/㎖만큼 낮은 농도의 TSH를 검출할 수 있지만, CHO-RMc4luc의 검출 민감도가 CHO-Rluc 세포주의 민감도보다 더욱 높았음을 가리켰다. 도 12.

CHO-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주를 이들의 특이성에 대해 인간 황체형성 호르몬 (hLH,) 인간 난포 자극 호르몬 (hFSH) 및 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG) (모두 공통적인 알파 서브유닛을 공유함)이 포함되는 또다른 뇌하수체 전엽 호르몬을 사용하여 또한 테스트하였다. 어떠한 세포주도 테스트된 호르몬들과의 교차 활성을 나타내지 않았다. 표 1.

CHO-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주를 정상 인간 혈청을 스크리닝하는데 사용하여 루시퍼레이스 분석법으로부터 유래된 S/N의 비율의 분포를 결정하였다. 108명의 정상 인간으로부터의 혈청으로 유도된 CHO-Rluc 및 CHO-RMc4luc 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터 유래된 S/N 비율의 분포의 비교를 수행하였다. 모든 혈청 샘플을 CHO-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주 양쪽 모두에서 테스트하였다. 공지된 정상 혈청을 S/N 비율을 계산하기 위한 기준물로 사용하였다. CHO-RMc4luc 세포주의 분포는 CHO-Rluc 세포주의 것과 매우 유사한 패턴을 드러냈다. CHO-Rluc 세포의 평균은 1이었고, CHO-RMc4luc는 0.88이었다. CHO-Rluc의 표준 편차는 0.23이었고, CHO-Luc는 0.21이었다. 도 13.

임상 환자 혈청 샘플에 대한 CHO-RMc4luc, RD-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주의 응답을 비교하였다. 12개의 임상 혈청 샘플로 유도된 CHO-Rluc, CHO-RMc4luc 및 RD-RMc4luc 세포주에 대한 루시퍼레이스 분석법으로부터 S/N의 비율이 유래되었다. 12개의 혈청 샘플 각각을 CHO-RMc4luc, RD-RMc4luc 및 CHO-Rluc 세포주에서 테스트하였다. 이러한 샘플들의 루시퍼레이스 활성을 공지된 음성 혈청 샘플 (음성 기준물)로부터의 것과 비교하였다. 이러한 연구의 결과는 CHO-RMc4luc 및 RD-RMc4luc 세포주 양쪽 모두가 CHO-Rluc 세포주와 비교했을 때 검출 민감도가 더욱 높았고, 이때 CHO-RMc4luc 세포주가 가장 민감한 세포주였음을 가리켰다. 도 14.

VI . 키메라 수용체 분석법 및 기아 프리 ( Pre )-컨디셔닝 기간

상기 논의된 바와 같이, CHO-RMc4luc 세포주는 현재 사용되는 CHO-Rluc 세포주에 비해 민감도 및 특이성에서 확실한 장점을 제공한다. 예를 들어, CHO-RMc4luc 세포는, 그레이브스병 항체에 의한 자극되는 경우, 상대 광도 (RLU) 출력에 의해 측정 시 증가된 루시퍼레이스 응답을 제공한다. 이러한 개선은 프로토콜로부터 1일 기아 단계의 제거를 허용한다.

CHO-Rluc 세포주에 대해 사용된 표준 절차는 기아 기간을 포함한다. 기아 포맷에 대한 프로토콜은 제1일의 성장을 위한 세포 이식, 제2일의 기아, 및 제3일의 자극 및 RLU 측정이다. 기아 기간이 제거되는 경우, "제2일 기아" 단계가 제거되고, 최종 결과가 제3일 대신 제2일에 의사에게 보고될 수 있으며, 이는 더욱 더 바람직하다. 사용자에 대한 노동이 현저하게 감소되고, 의사는 다음날 결과를 얻을 수 있고, 이들 모두가 1일의 기아가 있는 CHO-Rluc 프로토콜에 의해 제공되는 것보다 높은 정확도의 분석법으로 제공되기 때문에, 이러한 비-기아 프로토콜은 사용자 및 의사에게 현저한 장점을 제공한다.

기아 기간은 정상 혈청과 그레이브스 양성 혈청 간의 RLU 또는 ％ 분리를 증가시키기 위해 사용되었다. 이러한 RLU 분리는 분석법의 정확도와 직접적으로 관련된다. 2가지 상이한 세포주인 CHO-Rluc 및 CHO-RMc4luc를 사용하여 그레이브스 양성 및 정상 혈청 검사물을 사용하여 기아 기간의 효과를 테스트하였다. 표 8 참조.

그레이브스 양성 및 음성 혈청에 대한 RLU 값이 기아 CHO-Rluc 및 CHO-RMc4luc 세포, 및 비-기아 CHO-RMc4luc 세포에 대한 각각의 프로토콜을 사용하여 수득되었다. CHO-RMc4luc 세포에 대한 기아의 의도된 효과는 세포 내의 루시퍼레이스 활성의 배경 수준을 감소시킴으로써, 그레이브스 양성 혈청과 그레이브스 음성 혈청 간의 RLU의 비율을 상승시키는 것이었다. 이러한 혈청 셋트들에 대해, 기아 CHO-Rluc에 대한 평균 비율은 3.25×이고, 비-기아 CHO-RMc4luc에 대해서는 7.29×이며, 기아 CHO-RMc4luc 세포에 대해서는 11.5×이다.

따라서, 비-기아 CHO-RMc4luc 세포가 기아 CHO-Rluc 세포에 비해 광도 (즉, 따라서 민감도)에서의 2배를 초과하는 증가를 제공한다. 이는 1일 더 짧게 지속되고 더욱 정확하고 민감한 결과를 제공하는 프로토콜의 명확한 장점을 제공한다. 혈청:기준물 비율 (SRR)은 RLU 값을 백분율로서 비교하고, CHO-RMc4luc 세포 (기아 또는 비-기아 여부와 관계 없음)가 정상 혈청과 그레이브스병 혈청 간의 RLU 간의 개선된 분리를 제공한다는 것을 추가로 확증한다. 제시된 차단 값은 대략적이고, 분석된 값이 특정 프로토콜/세포주의 차단 값 이상인 경우 그레이브스병을 가리킨다.

VII . 글루코코르티코이드로의 키메라 수용체 분석법 개선

상기 데이터는 기아 기간이 CHO-RMc4luc 세포의 정확도 및 민감도의 개선을 또한 제공한다는 것을 가리키기 때문에, 기아 기간이 없는 우수한 CHO-RMc4luc 세포 분석법을 개발하도록 추가적인 연구가 지시되었다.

한 셋트의 데이터가 실시예 15에 따라 수집되었고, 이때 CHO-RMc4luc 세포가 기아 기간을 거친 후, 다양한 농도의 덱사메타손 (DEX)과 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 덱사메타손이 RLU 강도를 기아 기간 단독에 의해 제공되는 것에 비해, 그리고 이를 초과하여 유의하게 개선시켰음을 명확하게 가리킨다. 표 9.

데이터는 덱사메타손이 기준 혈청 RLU 판독값을 감소시키면서 동시에 환자 #18 RLU 판독치를 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다. 전체적으로, 덱사메타손의 존재는 환자 #18 혈청 샘플에 대한 S/B 비율에서의 약 80％ 증가를 초래한다.

이러한 관찰은 덱사메타손이 기아 기간 대신 사용되는 경우 개선된 분석법이 초래될 수 있다는 제안을 제공하였다. 그 결과, 기아 기간에 노출된 세포와 성장 배지 내의 덱사메타손 (40 μM)에만 노출된 세포 간의 비교가 수행되었다. 실시예 16 참조. 상이한 프로토콜들을 비교하기 위해, 그레이브스 양성 및 그레이브스 음성 혈청에 대한 RLU 결과를 함께 평균내고, 기준 표준물을 초과하는 이들 각각의 백분율을 계산하였다. 표 10.

데이터는 비-기아 CHO-RMc4luc 세포 + 덱사메타손 존재가 비-기아 CHO-RMc4luc 세포 + 덱사메타손 부재에 비해 혈중 TSI의 더욱 민감한 (따라서, 더욱 정확한) 검출을 제공한다는 것을 실연한다. 예를 들어, 기아 기간이 적용되지 않은 그레이브스 양성 환자 혈청에서, CHO-rMc4luc 세포 + 덱사메타손 존재는 발광에서 365％ 증가 (기준물에 비해)를 나타낸 반면, CHO-rMc4 세포 + 덱사메타손 부재는 광도에서의 189％ 증가를 나타냈다.

그레이브스 양성 환자 혈청을 그레이브스 음성 환자 혈청과 비교했을 때 덱사메타손으로의 민감도 및 정확성에서의 개선이 더욱 더 극적이다. 예를 들어, 덱사메타손의 존재 하에, 그레이브스 양성 혈청과 그레이브스 음성 혈청 간의 차이는 309％ (즉, 예를 들어, 365％ - 56％)이지만, 덱사메타손의 부재 하에서는 그레이브스 양성 혈청과 그레이브스 음성 혈청 간의 차이가 157％ (즉, 예를 들어, 189％ - 32％)이다.

이러한 결과는 덱사메타손이 더 강한 발광성 신호 강도로 인해 민감도 면에서 더 양호한 분석 시스템을 제공한다는 것을 명확하게 나타낸다. 이같은 개선은 개선된 테스트 정확성을 초래하고, RMc4luc 테스트 플랫폼과 조합되는 경우, 기아 배지 기간을 요구하는 임의의 앞서 개시된 TSI 항체 분석법보다 더욱 신속하고 정확한 진단 분석법이 본 발명에서 구현된다.

이러한 효과가 덱사메타손에 한정되지 않고, 전부는 아니지만 대부분의 글루코코르티코이드로부터 예상될 수 있다는 것이 추가적인 연구에서 실연되었다. 예를 들어, 본원에 제시된 데이터는 또다른 글루코코르티코이드가 CHO-RMc4luc 분석법의 민감도를 또한 개선시켜, 기아 배지 기간의 대용과 비교하여 등가의 민감도를 제공한다는 것을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 글루코코르티코이드의 존재는 분석법이 3일보다는 2일 내에 수행될 수 있다는 장점을 제공한다.

별법적인 글루코코르티코이드 (GC)가 상대 광도 (RLU) 및 백분율로 표현되는 혈청 기준물 비율 (SRR％)을 기초로 덱사메타손 (40 μM)에 비교되었다. 이러한 목적을 위해, 모두 다섯 (5) 개의 테스트된 글루코코르티코이드들이 기아 기간의 부재 하에 RMc4luc 분석법의 민감도를 개선시키는 것에서 일반적인 효과를 나타낸다.

실시예 17에 개요된 프로토콜에 따라 데이터를 수집하였다. 각각의 글루코코르티코이드 (GC) 농도에서의 정상 대조군에 대한 RLU 값 또는 SRR％ 값을 이러한 농도에서의 양성 대조군에 대한 RLU 값 또는 SRR％ 값에서 각각 차감함으로써 각각의 글루코코르티코이드 (GC) 농도에 대한 RLU 값 또는 SRR％ 값에서의 차이 (Δ)로서 데이터가 계산되었다.

데이터는 모두 4개의 GC가 적어도 6000 RLU만큼 신호 강도를 개선시키고, 이때 하이드로코르티손 및 코르티손은 덱사메타손과 신호 강도가 등가임을 실연한다. 도 17 참조. 그러나, SRR％로서 데이터가 계산된 경우, 모든 별법적인 GC와 비교했을 때 덱사메타손이 신호-대-노이즈 비율을 약 2배만큼 개선시키는 것을 볼 수 있다. 도 18 참조. 그럼에도 불구하고, 데이터는 임의의 글루코코르티코이드가 기아 배지 기간이 요구되지 않도록 RMc4luc 분석법 민감도 및 정확성에서 개선을 제공할 수 있다는 것을 실연한다.

VII . 키트

또다른 실시양태에서, 본 발명은 키메라 TSH 수용체를 사용하는 그레이브스병 진단 분석법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 바람직하게는 키트는 본 발명의 세포주-기반 진단 방법을 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 덱사메타손, 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손, 또는 플루티카손을 포함하지만 이에 한정되지 않는 글루코코르티코이드를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 모든 대조군, 분석법을 수행하기 위한 지침, 및 결과의 분석 및 제시를 위한 임의의 소프트웨어를 포함하는, 환자 혈청 내의 혈중 TSH 자가항체를 검출하기 위한 그레이브스병 진단 분석법을 수행하기 위해 필요하거나 수행하는데 충분한 모든 성분들을 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 세포주를 형질감염시킬 수 있는 키메라 TSH 수용체를 코딩하는 벡터를 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 단일 반응에서 진단 분석법을 수행하기 위해 필요한 또는 수행하는데 충분한 모든 물질을 포함하고, 진단, 예후, 또는 예측 정보를 (예를 들어, 연구원 또는 임상의에게) 제공한다. 예를 들어, 이같은 키트는 키메라 TSH 수용체 및 루시퍼레이스 리포터 시스템을 포함하는 세포주를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 Mc4 키메라 TSH 수용체에 대한 제1 핵산 서열, 루시페린/루시퍼레이스 리포터 시스템에 대한 제2 핵산 서열, 및 프로모터에 대한 제3 서열을 포함하는 벡터를 하나 이상 포함한다. 또다른 실시양태는 완충제, 대조군 시약, 검출 기구, 소프트웨어, 설명서, 및 TSH 자가항체 표준 제제를 또한 포함한다.

키트는 빛 또는 기타 불리한 조건에 의한 시약의 분해를 방지하도록 적합한 시스템 (예를 들어, 불투명 용기) 또는 안정화제 (예를 들어, 항산화제)를 또한 임의적으로 포함할 수 있다. 각각의 용액 또는 조성물이 바이알 또는 병 내에 함유될 수 있고, 모든 바이알이 상업적인 판매를 위해 상자 내에 인접하게 한정되어 담길 수 있다.

키트는 그레이브스병의 진단, 검출 및/또는 치료에서의 시약의 용도를 제공하는 지침 (즉, 프로토콜)을 함유하는 설명서 물질을 임의적으로 포함할 수 있다. 설명서 물질은 전형적으로 기록 또는 인쇄된 물질을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 설명서를 저장할 수 있고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에서 구현된다. 이같은 매체에는 전자 저장 매체 (예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들어, CD ROM) 등이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 매체는 이같은 설명서 물질을 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소를 포함할 수 있다.

실험

본 발명의 특정한 바람직한 실시양태 및 양상들을 실연하고 추가로 설명하기 위해 하기의 실시예들이 제공되고, 이는 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

하기의 실험 개시내용에서, 하기의 약어들이 적용된다: eq (등가물); M (몰 농도); μM (마이크로몰 농도); N (노르말 농도); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); ㎎ (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); ng (나노그램); 또는 L (리터); ㎖ (밀리리터); ㎕ (마이크로리터); μIU (마이크로 국제 단위); ㎝ (센티미터); ㎜ (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); ℃ (섭씨 온도); sec. 또는 s (초); min. 및 m (분); MW (분자량); 갑상샘 자극 호르몬 또는 타이로트로핀 (TSH); bTSH (소 TSH); TSI (갑상샘 자극 면역글로불린); TSAb (갑상샘 자극 항체); EDTA (에틸렌 디아민 테트라아세트산); RLU/초 (초 당 상대 광도); GM 또는 PM (성장 배지 또는 이식 배지); SM (기아 배지); HBSS (행크스 균형 염 용액); EMEM (이글 최소 필수 배지); FBS 또는 FCS (소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청); DMSO (디메틸 술폭시드); CHO (차이니즈 햄스터 난소 세포); CHO-R (인간 TSH 수용체로 형질감염된 CHO 세포); CHO-Rluc (cre-루시퍼레이스 리포터 유전자 복합체로 형질감염된 CHO-R 세포); Oxoid (Oxoid (Basingstoke, England)); BBL (Becton Dickinson Microbiology Systems (Cockeysville, ME)); DIFCO (Difco Laboratories (Detroit, Nil)); U.S. 바이오케미칼(Biochemical) (U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, OH)); 피셔(Fisher) (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)); 시그마(Sigma) (Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)); ATCC (American Type Culture Collection (Rockville, Maryland)); LTI (Life Technologies (Rockville, MD)); 및 프로메가(Promega) (Promega Corp. (Madison, WI)).

하기의 방법들에서, 이러한 방법들에서 사용된 모든 용액은 무균성이었고 (TSH, 대조군, 환자 검사물은 제외), 방부 처리되었다. 모든 조작은 생물안전 작업대에서 무균 조건 하에 수행되었다. 세포 배양 배지 (예를 들어, 햄(Ham) F- 12, EMEM 등)는 LTI로부터 수득되었고, 부가적인 시약 예컨대 비-필수 아미노산은 Sigma로부터 수득되었다.

세포의 동결 바이알은 해동 및 본 발명의 방법에서의 사용 직전까지 이의 -80 ℃ (또는 이보다 낮은) 보관 온도로부터 가온되도록 허용되지 않아야 하는데, 온도의 사이클링은 생육력 손실을 초래할 수 있기 때문이다. 실온에서 불안정한 디티오트레이톨을 함유하기 때문에, 5× 세포 용해 용액은 1× 용액의 제조를 위해 필요한 부피를 제거하기에 충분히 길게만 이의 -20℃ 보관 온도로부터 제거되어야 한다. 디티오트레이톨을 또한 함유하기 때문에, 재구성된 루시퍼레이스 기질 용액은 사용 직전까지 -20℃에서 동결되어 유지되어야 하고, 사용 시점에 제거되고 25-37℃ 수조 내에 놓여, 해동되고 실온에 도달할 수 있다.

일반적으로, 액체를 웰 (예를 들어, 미량역가 플레이트 등)로부터 제거할 때, 액체를 생물안전 후드 내에서 웰로부터 저장소 내로 버릴 수 있다. 플레이트를 무균성의 흡수 와이프 상에 거꾸로 놓아서 나머지 액체를 빼내어 제거할 수 있다. 또는, 흡인기 상에서 미세한 팁을 사용하여 흡인에 의해 액체를 제거할 수 있다. 흡인이 사용되는 경우, 액체가 웰에서 넘쳐 나오지 않도록 가파른 각도로 플레이트가 유지되고, 흡인기 팁이 거의 바닥으로 웰의 측면 아래로 지시되어, 액체를 제거하고 최소 잔여물만을 남긴다. 그러나, 세포 단층의 교란을 방지하기 위해 주의하여야 하는데, 이는 흡인기에 의해 세포가 쉽게 제거될 수 있기 때문이다.

하기의 방법들에 지시된 바와 같이, 검사물, 표준물, 및 대조군이 삼중으로 실행되는 것이 권장된다. 용액 3의 점성 성질 및 웰에서 적합한 혼합을 달성하는 것의 어려움으로 인해, 이러한 시약들의 전체 삼중 부피 + 10％ (33 ㎕)가 용액 3의 필요한 삼중 부피 + 10％ (330 ㎕)에 전달되고, 철저하게 혼합되고, 110 ㎕가 삼중 웰에 전달될 때 최상의 재현성이 달성되었다.

세포 단층의 제조 (예를 들어, 미량역가 플레이트의 웰 내에서의 제조)에서, 세포가 웰 내에서 균일하게 분포되는 것이 바람직하다. 따라서, 균일하지 않은 세포 분포를 피하기 위해, 웰 내로의 세포 현탁액의 전달은 진동이 없는 생물안전 후드 내에서 수행되어야 한다. 플레이트 내의 모든 웰에 세포가 제공된 후, 플레이트를 덮고, 30분 동안 진동이 없는 고형 표면 상에 조심스럽게 놓아서, 세포가 웰의 바닥에 교란되지 않고 부착되도록 한다. 이는 세포의 균일한 분포가 각각의 웰 내에 존재하는 것을 돕는다.

실시예 1

테스트용 CHO - Rluc 세포의 제조

이러한 실험에서, 그레이브스병 환자에서 TSI를 검출하기 위한 테스트 방법에서 사용하기 위해 W-25 CHO-R 세포로부터 CHO-Rluc 세포가 제조되었다. 퓨로마이신-저항성 세포들의 풀을 수득하고, 소 TSH에 응답한 광 출력에 대해 테스트하였다. 광 출력이 가장 높은 클론들을 하기에 기술된 실험에서 사용하기 위해 선택하였다.

CHO-Rluc 세포를 세포 배양 플라스크 (예를 들어, T-225 플라스크) 내에서 햄 F-12 배지, 10％ FBS (보체를 불활성화시키기 위해 56℃에서 30분 동안 가열됨), 2 mM 글루타민, 및 1× 비-필수 아미노산을 함유하는 성장 배지에서 성장시켰다. 5％ 이산화탄소를 함유하는 습식 대기에서 35-37℃에서 플라스크를 인큐베이션하였다.

세포 배양물이 합류에 도달한 후, 각각의 플라스크로부터 배지를 흡인하고, 세포 단층을 Ca 및 Mg⁺⁺가 없는 HBSS로 세정하였다. 그후, 세포를 탈착시켜 거의 단세포성인 현탁액으로 분산시키기 위해, 7 ㎖의 0.25％ 트립신/1 mM EDTA 용액을 각각의 플라스크에 첨가하고, 약 5-10분 동안 실온에서 단층과 반응시켰다. 그후, 세포 현탁액을 약 5분 동안 300-400×g에서 원심분리하였다. 그후, 상등액을 제거하고, 펠렛화된 세포를 1× HBSS 및 20％ FBS를 함유하는 EMEM 4 ㎖을 동결방지 배지 (1× HBSS 및 15％ DMSO를 함유하는 EMEM) 4 ㎖과 혼합함으로써 제조된 8 ㎖의 배지에 재현탁시켰다.

그후, 각각의 세포 현탁액의 분취량을 사용하여, 현탁액 내에 존재하는 세포의 개수를 결정하였다. 혈구계를 사용하여 세포수를 결정하는 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 이러한 결정이 달성될 수 있다. 따라서, 임의의 방법을 사용하여 현탁액 내의 세포수를 결정할 수 있는 것으로 생각된다. 현탁액 내의 세포의 개수를 기초로, 세포를 표준 동결 바이알 내로 약 2×10⁶개의 세포로 부피를 분취하였다. 그후, 세포를 단기 보관을 위해 -90℃에서 동결 보관하였다. 장기 보관을 위해서는, 세포를 액체 질소 (약 -200℃)에서 보관하였다.

실시예 2

CHO - Rluc 분석법 플레이트 제조 및 테스트

이러한 실험에서, 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조된 CHO-Rluc 세포가 그레이브스병의 진단을 위한 분석법에서 사용되었다. 테스트용으로 24개의 단층을 제조하기 위해, 50-100 ㎕의 0.1％ 젤라틴 용액 (Sigma)을 첨가함으로써 96웰 미량역가 플레이트 내의 24개의 웰을 먼저 처리하여, 테스트용으로 선택된 24개의 웰의 바닥에 세포가 부착되는 것을 강화하였다. 약 1분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 젤라틴 용액을 각각의 웰로부터 흡인에 의해 제거하였다. 젤라틴이 1분보다 길게 웰 상에 잔존할 수 있다는 것을 유념하였다. 젤라틴은 세포가 더욱 빠르게 웰에 부착되고 더욱 신속하게 합류에 도달하도록 콜라겐으로 웰을 코팅하는 역할을 한다. 그러나, 젤라틴 없이 세포를 이식하여 합류로 성장시킬 수 있고, 세포가 여전히 잘 작용한다.

실시예 1에 기술된 바와 같이 생산된 CHO-Rluc 세포의 동결 바이알을 37℃ 수조에서 급속하게 해동시켜, 약 0.4 ㎖의 세포 현탁액을 제공하였고, 이를 피펫을 사용하여 잘 혼합하였다. 그후, 세포를 2.5 ㎖ GM ("이식 배지"로 또한 지칭됨)에 첨가하고, 1-2초 동안 와류시킴으로써 철저히 혼합하고, 세포 현탁액의 100 ㎕ 분취량을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 덮었다. 각각의 웰 내에 세포가 균일하게 분포되도록 하는 것이 바람직하다. 따라서, 균일하지 않은 세포 분포를 피하기 위해, 세포 이식 및 미량역가 플레이트의 벽으로의 세포 부착을 위해 미량역가 플레이트가 진동이 없는 후드 내에 놓여야 한다. 그후, 이식된 세포를 5％ CO₂를 함유하는 습식 대기에서 약 20-24 시간 동안 35-37℃에서 인큐베이션하여, 세포가 거의 또는 완전히 합류성인 단층을 형성하도록 하였다.

그후, 단층을 교란시키지 않도록 주의하면서 (즉, 합류성 단층이 웰 내에 잔존함), GM을 각각의 웰로부터 가능한 한 완전하게 흡인하였다. 단층을 웰 당 약 100 ㎕의 기아 배지 (Ca⁺⁺ (0.14 g/L) 및 Mg⁺⁺ (0.048 g/L)를 함유하는 HBSS)로 헹궜다. 기아 배지를 흡인한 후, 신선한 100 ㎕의 기아 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포 단층이 건조되지 않도록 충분히 신속하게 이러한 단계들을 수행하는 것이 중요하다. 그후, 플레이트를 하룻밤 동안 35-37℃, 5％ CO₂, 습식 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 단층 교란을 피하도록 주의하면서 기아 배지를 웰로부터 흡인하였다. 그후, 약 100 ㎕의 자극 배지를 각각의 단층에 첨가하였고, 이때 또다시 단층이 건조되지 않도록 빠르게 작업하였다.

그후, 앞서 기술된 것에 대한 별법적인 방법에서, 10 ㎕의 환자, 대조군, 및 TSH 표준물 용액을 적합한 웰에 첨가하였다. 희석제 (즉, HBSS-NaCl + 222 mM 수크로스)로 TSH 표준물 및 IgG 샘플이 희석되었다. 0, 10, 100, 1000, 및 5000 μIU의 농도에서 TSH 표준물이 테스트되었다. 분석법에서의 사용을 위해 환자 샘플이 10 ㎎ 단백질/㎖의 농도로 희석되었다. 자극 배지가 점성이기 때문에, 현탁액의 철저한 혼합이 중요하였다. 단층의 현미경 검사에 의해 혼합의 적절성을 확인하였다. 플레이트를 4시간 동안 35-37℃에서 5％ CO₂, 습식 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 배지를 각각의 웰로부터 주의깊게 흡인하고, 150 ㎕의 용해 용액 (Promega)을 각각의 웰에 첨가하였다. 용해 용액은 25 mM 트리스-포스페이트, pH 7.8, 2 mM 디아미노사이클로헥산 테트라아세트산 (CDTA), 2 mM 디티오트레이톨 (DTT), 10％ 글리세롤, 및 1 ％ 트리톤 X-100을 함유하였다. 그후, 플레이트를 30분 동안 실온에서 인큐베이션하여, 단층이 용해되도록 하였다. 용해 후, 각각의 웰을 스크레이핑(scraping)하고, 파이펫 팁을 사용하여 교반하였다. 그후, 25 ㎕의 용해물을 각각의 웰로부터 제거하고, 발광측정기 튜브 (12×75 ㎜, 폴리프로필렌) 내에 놓은 후, 50 ㎕의 루시퍼레이스 기질 (Promega)을 첨가하였다. 튜브를 1-2초 동안 와류시키고, 5초 지연 및 10초 판독의 셋팅을 사용하여 RLU/초 값을 결정하였다. 평균 순량 값을 수득하기 위해, "0 TSH" (즉, 음성 대조군) 샘플의 평균을 모든 테스트 평균 값에서 차감하였다.

실시예 3

IgG 샘플의 제조

이러한 실험에서, 환자의 IgG를 본 발명의 방법에서의 테스트를 위해 제조하였다. B. Y. 조(Cho) 박사 (Department of Internal Medicine, Seoul National University, College of Medicine, Seoul, Korea)가 38명의 잘 알려지고 특성화된, 치료되지 않은 그레이브스병 환자로부터의 동결건조된 IgG 샘플을 제공하였다. 대부분의 샘플들이 CHO-R 및 FRTL-5 세포를 사용하는 표준 방법에서 앞서 테스트되었기 때문에, 이러한 테스트 결과들이 이러한 샘플 중 35개에 대해 공지되었다.

동결건조에 대비하여, IgG를 당업계에 공지된 바와 같이 단백질 A-세파로스 CL-4B 컬럼을 사용하여 친화력-정제한 후, 4℃에서 100 부피의 증류수에 대해 투석하였다. 투석수를 2일 기간에 걸쳐 8시간 마다 교체하였다. 변성된 단백질을 4℃, 1500×g에서 15분 동안의 원심분리에 의해 제거한 후, IgG를 동결건조시키고, 본원에 기술된 실험에서 사용될 때까지 -20℃에서 보관하였다.

일부 실험에서, 정제된 치료되지 않은 그레이브스 IgG를 정상 혈청 (하기 실시예 7에 논의된 정상갑상샘기능 혈청) 내에 희석하고, 하기 기술된 CHORluc 분석법을 사용하여 분석하였다.

실시예 4

CHO - Rluc 분석법

이러한 실험에서, 문헌 [Evans et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 84:374 (1999)]에 기술된 방법을 사용하여 CHO-Rluc 세포의 성능을 평가하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 96-웰 미량역가 플레이트에서 사용된 24개의 웰 내의 세포 단층으로부터의 배지를 흡인하고, 10％ 숯-스트리핑된(charcoal-stripped) 송아지 혈청 (Sigma)을 함유하는 100 ㎕ 햄 F-12 배지로 교체하고, 하룻밤 동안 35-37℃에서 5％ CO₂를 함유하는 습식 대기에서 인큐베이션하였다.

그후, 10 ㎕의 광범위한 농도 (예를 들어, 0, 10, 100, 및 1000 μIU)로 희석된 소 TSH 표준물 및 그레이브스 IgG (10 ㎎ 단백질/㎖의 농도로 숯-스트리핑된 송아지 혈청에 용해됨)를 각각의 4중 웰에 첨가하였다. 각각의 웰 내의 현탁액을 혼합하고, 플레이트를 4시간 동안 35-37℃에서 5％ CO₂를 함유하는 습식 대기에서 인큐베이션하였다. 그후, 배지를 각각의 웰로부터 흡인하고, 150 ㎕의 용해 완충제 (Promega, 상기 기술됨)를 각각의 웰에 첨가하였다. 그후, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여, 웰 내의 세포가 용해되도록 하였다. 그후, 25 ㎕의 각각의 용해물을 12×75 폴리에틸렌 발광측정기 튜브로 옮기고, 여기에 50 ㎕의 루시퍼레이스 기질 (Promega)을 첨가하여 혼합한 직후에, 5초 지연 및 10초 판독의 셋팅에서 발광측정기에서 판독하였다. 발광측정기 판독값은 상대 광도/초 (RLU/초)로서 결과를 제공하였다. 음성 또는 "0" TSH 표준물 값을 각각의 판독값으로부터 차감하였다. 한 실행에서, 0 μU/㎖ TSI 표준물에 대한 평균 순량 값은 68,011 RLU/초였고, 10 μIU/㎕를 함유하는 샘플에 대한 결과는 4031 RLU/초, 1000 μIU를 함유하는 샘플은 222,801 RLU/초, 한 그레이브스 IgG 테스트 샘플은 384 RLU/초 (샘플 #1), 또다른 그레이브스 IgG 테스트 샘플은 -3012 RLU/초 (샘플 #9)였다.

그레이브스 IgG 샘플 #1 및 샘플 #9이 표준 FRTL-5 세포 및 cAMP RIA 분석법을 사용하여 앞서 분석되었다. cAMP 분석법에서, FRTL-5 세포로의 153을 초과하는 값이 TSI의 존재에 대해 양성으로 간주된다. 샘플 #1에 대한 FRTL-5 세포로의 cAMP 값은 212였고, 샘플 #9에 대한 cAMP 값은 803이었다. 173을 초과하는 CHO-R 값이 그레이브스병에 대해 양성인 것으로 간주되는 분석 시스템에서, 이러한 샘플들 (#1 및 #9)에 대한 CHO-R 값은 각각 116 및 1733이었다. 따라서, 이러한 결과들은 그레이브스병의 검출을 위해 상이한 세포주들을 사용하여 수득된 결과들 간에 모순이 있다는 것을 명확하게 가리킨다. 실제로, [Evans et al., 상기 문헌]의 방법에서는 양쪽 IgG 샘플에 대해 음성 결과가 산출되었고, 이는 CHO-Rluc로의 이러한 시스템이, 소 TSH에 대한 응답은 매우 양호하였다는 사실에도 불구하고, 인간 TSI의 검출에 소용없다는 것을 가리킨다.

또한, 본 발명의 발달 동안 (하기 기술된 바와 같음), CHO-Rluc 세포가 숯-스트리핑된 송아지 혈청을 함유하는 배지 내에 24시간 동안 이식되면 (즉, 합류에 도달하도록), 정상 FBS가 사용된 상황과 달리, 세포들이 단지 웰이 바닥에 부착될 뿐, 인큐베이션 기간 동안 증식하여 합류성이게 되지 않았다는 것이 결정되었다. 따라서, 이러한 놀라운 결과는 배지에서 숯-스트리핑된 혈청을 사용하는 것이 5H 배지에서의 FRTL-5 세포의 인큐베이션과 다소 유사하게, 세포에 대한 기아 단계를 초래하였음을 가리킨다.

일부 실험에서, 정상 혈청 내에 희석된 정제된 치료되지 않은 그레이브스 IgG가 CHO-Rluc 분석법 (PEG 사용)에서 테스트되었다. IgG #10 (2 ㎎/㎖)에 대해, RLU/초 값은 131,461이었고; IgG #15 (2 ㎎/㎖)에 대해서는, RLU/초 값이 180,327이었으며; IgG #27 (5 ㎎/㎖)에 대해서는, RLU/초 값이 179,777이었고; IgG#32 (5 ㎎/㎖)에 대해서는, RLU/초 값이 112,627이었다. 이러한 결과들은 CHO-Rluc 분석법이 혈청의 존재 하에 TSI를 측정한다는 것을 명확하게 나타낸다.

실시예 5

배지 제형의 개발

앞서 기술된 실험들을 고려하여, 소 TSH 및 인간 TSI의 측정에서 CHO-Rluc 세포와 함께 사용하는 것에 대해 여러 배지 제형들의 효과를 연구하였다. 이러한 실험에서, bTSH 표준물 및 그레이브스병 환자의 혈청으로부터 추출된 IgG를 사용하여, CHO-Rluc 분석법에서의 "기아" 및 "자극" 단계에 대해 다양한 배지 제형을 테스트하였다.

이러한 실험에서, 96-웰 미량역가 플레이트의 웰 내에 함유된 세포 단층 (상기 기술된 바와 같음)이 합류에 도달하면, 성장 배지를 흡인에 의해 제거하고, 100 ㎕의 기아 배지를 각각의 단층에 첨가하였다. 그후, 플레이트를 16-24시간 동안35-37℃에서, 5％ CO₂를 함유하는 습식 대기에서 인큐베이션하여, 세포 기아를 일으키거나 세포를 컨디셔닝하였다. 그후, 기아 배지를 웰로부터 흡인하였다.

분석법을 수행하기 위해, 10 ㎕의 환자 검사물 IgG, bTSH 표준물, 및 IgG 대조군 (정상 및 그레이브스병 혈청)을 단층에 삼중으로 첨가하였다. 각각의 웰 내에서 현탁액이 혼합되었고, 이를 상기 조건 하에 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 액체를 각각의 단층으로부터 흡인에 의해 제거하고, 150 ㎕의 용해 완충제 (Promega, 상기 기술된 바와 같음)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여, 단층 내의 세포를 용해시켰다.

TSH 표준물 또는 TSH 수용체에 대한 항체에 의해 야기된 세포 자극의 양을 측정하기 위해, 25 ㎕의 용해물을 발광측정기 튜브에 첨가하고, 여기에 50 ㎕의 기질 용액 (Promega)을 첨가함으로써 세포 용해물 내의 루시퍼레이스를 측정하였다. 현탁액을 혼합한 후, 5초 지연 및 10초 판독의 셋팅으로 발광측정기에서 판독하여, 각각의 샘플에 대한 RLU를 결정하였다.

TSI 또는 TSH 자극에 세포를 사용하기 위해, 기아 배지를 흡인에 의해 제거하고, 100 ㎕의 자극 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 이러한 자극 배지는 HBSS-NaCl + 222 mM 수크로스였다. 하기의 표 2는 HBSS-NaCl + 222 mM 수크로스 및 표준 HBSS 제형의 비교를 제공한다.

이러한 자극 배지 제형은 FRTL-5 및 CHO-R 세포에서의 TSI의 측정에서 통상적으로 사용되는 제형이다.

다양한 기아 배지 제형을 테스트하기 위한 실험들의 결과가 하기 표 3에 표시된다. 이러한 실험에서, HBSS-NaCl + 222 mM 수크로스 자극 배지가 사용되었다. 표 3에서 나타난 바와 같이, 20 mM 수크로스가 있는 표준 HBSS에서 최상의 신호 대 노이즈 비율 (즉, 가장 낮은 배경 및 그레이브스 IgG에 대한 가장 높은 값)이 산출되었다.

실시예 6

PEG 의 사용

PEG가 반응 속도를 보조하거나 강화시키기 위해 시험관내 항원/항체 반응에서 사용될 수 있기 때문에, PEG가 자극 배지 내로 혼입된 실험이 수행되었다. 이러한 화합물이 항원/항체 복합체의 오프(off)-속도 또는 해리를 감소시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 방법에서의 PEG의 사용을 연구하였다.

HBSS-NaCl 수크로스 내의 12％ PEG-8000 (즉, 평균 MW 8,000)로의 예비 결과는 세포들 간의 공간이 증가된 단층을 초래하였다. 이러한 명백한 삼투 스트레스를 감소시키기 위해, HBSS-NaCl + 111 mM 수크로스 내의 6％ PEG-8000을 테스트하였다. 이러한 실험에서, 최상의 결과가 산출된 기아 배지 (즉, 표준 HBSS + 20 mM 수크로스)가 사용되었다. 결과가 하기 표 4에 제시된다.

표 4에 지시된 바와 같이, 첨가된 bTSH, 뿐만 아니라 그레이브스 IgG에 응답한 CHO-Rluc 세포로부터의 발광 신호를 6％ PEG-8000의 혼입이 유의하게 및 실질적으로 강화시켰다.

추가적인 실험을 수행하여 자극 배지에서 사용하기 위한 PEG-8000의 최적 농도를 결정하였다. FRTL-5 cAMP 값이 957인 1개의 그레이브스 샘플 (그레이브스 IgG #20)에 대한 순량 값이 표 5에 제시된다. 표 5에 지시된 바와 같이, 6％ PEG에서 그레이브스 TSAb에 대한 최대 신호가 산출되었다.

후속 실험들은 기아 배지가 20 mM 수크로스를 함유할 필요가 없음을 나타냈는데, 이는 있을 때의 결과 또는 없을 때의 결과에 통계적으로 유의한 차이가 없기 때문이다.

또한, 본 발명의 분석법이 갑상샘-자극 면역글로불린을 용량-의존적인 방식으로 측정한다는 것을 실연하기 위해 실험을 수행하였다. 이러한 실험에서, 3개의 그레이브스병 IgG 샘플 (#6, #11, 및 #16)을 테스트하였다. 6％ PEG-8000를 함유하는 자극 배지 및 상기 기술된 방법을 사용하여 일련의 3배 희석물을 제조하였다. 결과가 도 1에 제시되고, 이는 희석물의 선형성을 나타낸다. IgG 샘플을 10 ㎎/㎖ 스톡으로부터 제조한 후, 희석하지 않고 테스트하고, 0.3333, 0.1111, 0.0371, 0.0123, 및 0.0041 희석물로 단계 희석 (3배 희석)하였다 (즉, 3.333 ㎎/㎖을 산출한 후, 이를 3배 희석하여 1.111 ㎎/㎖을 산출하는 식).

IgG 샘플 #6에 대한 FRTL-5 값은 2080인 한편, IgG 샘플 #11에 대한 FRTL-5 값은 4453이었고, IgG 샘플 #16에 대해서는, 이러한 값이 830이었다. 하기의 표 6은 이러한 샘플 각각에 대한 결과를 열거한다. 상관 계수 (r)는 IgG 샘플 #6은 0.857, 샘플 #11은 0.858, 샘플 #16은 0.995였다.

실시예 7

PEG 를 사용하는 별법적인 프로토콜

이러한 실험에서, PEG를 사용하는 별법적인 프로토콜을 테스트하였다. 먼저, CHO-Rluc 세포의 동결 바이알을 해동시키고, 성장 배지 내에 희석하고 (각각의 세포 바이알의 내용물을 2.5 ㎖ 배지에 첨가함), 100 ㎕의 이러한 세포 현탁액을 앞서 기술된 바와 같이 제조된 96-웰 미량역가 플레이트의 24개의 젤라틴-코팅 웰 각각에 첨가하였다. 플레이트를 20-24시간 동안 35-37에서, 5％ CO₂를 함유하는 대기가 있는 습식 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 이는 느슨하게 합류성인 단층을 제공하였다.

성장 배지를 제거하고, 단층을 100 ㎕의 기아 배지 (Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺가 있는 정상 HBSS)로 헹구고, 최종 100 ㎕을 각각의 단층에 첨가한 후, 하룻밤 동안 상기 기술된 조건 하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 기아 배지를 제거하고, 6％ PEG를 함유하는 자극 배지 (즉, 상기 기술된 바와 같음) 100 ㎕를 각각의 단층에 첨가하였다. 그후, 10 ㎕의 각각의 표준물 및 샘플을 웰 내에 놓았다 (3중). 또다른 부피들이 테스트되었지만 (예를 들어, 25 ㎕, 50 ㎕, 및 75 ㎕), 수득된 값은 10 ㎕ 부피로 수득된 것들과 실질적으로 등가였다. 따라서, 샘플 및 시약을 보존하기 위해, 그리고 일부 혈청 샘플 내에 존재하는 잠재적으로 방해성인 물질들의 농도를 최소화하기 위해, 더 적은 부피가 사용되었다.

웰 내용물들을 혼합하고, 단층을 상기 기술된 바와 같이 4시간 동안 인큐베이션하였다 (즉, 자극 단계). 배지를 각각의 웰로부터 제거하고, 150 ㎕의 용해 용액 (상기 기술된 바와 같음)을 각각의 웰에 첨가하였다. 용해가 일어나도록 단층을 실온에서 30분 동안 방치하였다. 그후, 25 ㎕의 각각의 용해물을 개별적인 발광측정기 튜브에 첨가하였다. 50 ㎕의 루시퍼레이스 기질 (상기 기술된 바와 같음)을 각각의 튜브에 첨가하고, 내용물들을 혼합하고, 즉각적으로 튜브를 5초 지연 및 10초 판독 시간의 셋팅으로 발광측정기에서 판독하였다.

정상갑상샘기능 혈청의 정상 범위를 결정하기 위한 실험에서, 기준 실험실에서 수득된 24개의 검사물에 상기 기술된 바와 같은 CHO-Rluc 분석법을 사용하여 실험을 실행하였다. 이러한 혈청들은 샘플들 중 어느 것도 갑상샘 테스트에 제출되지 않았다는 점에서 정상갑상샘기능성이었다. 평균 (55,334 RLU/초) 및 표준 편차 (1 SD 7,434 RLU/초)가 이러한 24개의 정상갑상샘기능 샘플에 대해 계산되었다. 결과가 도 7에 제시된다. 그후, SD 값에 3을 곱하여, 77,636 RLU/초의 정상이고 그레이브스병이 아닌 값에 대한 차단값이 산출되었다. 이러한 차단값은 정상 집단의 99％ 초과를 포함한다; 이보다 큰 값은 TSI 양성인 것으로 간주되었다.

별도의 실험 셋트에서, TSI에 대해 cAMP RIA 및 FRTL-5 세포를 사용하는 시판되는 비법 테스트 실험에 의해 앞서 테스트된, 17개의 환자 검사물의 군을 CHO-Rluc 세포를 상기 절차와 함께 사용하여 테스트하였다. FRTL-5 테스트 결과는 환자 검사물 중 16개가 TSI에 대해 음성임을 가리켰다 (즉, 1개만 양성이었다). FRTL-5/cAMP 분석법에 의해 확인된 단일 양성 검사물 (258％, 또는 분석법 차단값이 130％인 경우 차단값의 1.98×)은, 도 7에 나타난 바와 같이, 77,636 RLU/초의 차단값의 2.45×를 기초로 CHO-Rluc 분석법에 의해 마찬가지로 양성이었다 (190,691 RLU/초). FRTL-5/cAMP 분석법에 의해 음성인 (즉, 정상인) 16개의 환자 검사물의 CHO-Rluc 값은 분석법에 대한 정상 범위를 수립하기 위해 사용된 24개의 정상 혈청과 양호하게 일치하는 것으로 발견되었다. 도 7 참조.

실시예 8

CHO - Rluc 방법과 표준 방법의 비교

이러한 실험에서, 6％ PEG-8000을 함유하는 자극 배지를 이용하는 본 발명의 방법을 표준 HBSS-함유 기아 배지 및 자극 배지를 사용하는 방법과 비교하여, 조(Cho) 박사로부터 수득된 치료되지 않은 그레이브스병 IgG 검사물 중 35개에 대한 루시퍼레이스 값을 수득하였다. 본 발명의 방법에서 사용된 것과 동일한 IgG 샘플을 사용하여 FRTL-5 및 CHO-R 세포로 조(Cho) 박사에 의해 수득된 cAMP 값이 도 2, 3 및 4에서 CHO-R 루시퍼레이스 결과와 비교되어 제시된다. 도 5는 bTSH에 대한 루시퍼레이스 응답의 선형성을 나타낸다.

도 2는 CHO-Rluc 루시퍼레이스 결과와 FRTL-5 cAMP 결과의 비교를 제공한다. 이러한 도면은 이러한 방법들 간의 상관관계가 꽤 양호하다는 것을 가리킨다. 도 3은 CHO-Rluc 루시퍼레이스 결과와 CHO-R cAMP 결과의 비교를 제공한다. CHO-R CAMP 차단값은 173이었다. 이러한 차단값 미만의 값은 하기와 같았다 (CHOluc RLU/초): 110 (219,913), 113 (14,434), 116 (25,373), 152 (84,493), 156 (7576), 및 161 (61,321). 이러한 도면에 지시된 바와 같이, CHO-R cAMP 결과의 범위가 CHO-Rluc 값과 비교하여 비교적 좁다. 이는 CHO-R cAMP 결과와 FRTL-5 cAMP 결과의 비교를 제공하는 도 4에서 또한 나타난다. CHO-R 값은 173이었다. FRTL-5 차단값은 153이었다. 차단값 미만의 값은 하기와 같았다 (FRTL-5 값): 110 (830), 113 (283), 116 (212), 152 (1100), 156 (388), 및 161 (335). 도 2에 제시된 테스트에 대한, IgG 대조군 (ICN)에 대한 평균 ± SD 값은 472 ± 4015 (n=8)였다.

도 5는 CHO-Rluc 세포의 bTSH에 대한 응답의 선형성을 나타낸다. 이러한 실험에서, bTSH의 희석물이 테스트되었다. 수득된 RLU/초 값이 하기 표 7에서 제시된다.

bTSH에 대한 응답의 이러한 선형성 및 민감도가 TSH 수용체에 대한 차단 항체 (예를 들어, TSH 수용체를 차단함으로써, 갑상샘 호르몬 생산 및 방출을 방지하여 갑상샘저하증을 초래하는, 위축성 갑상샘염 및 하시모토 갑상샘염 환자 내의 자가항체)의 검출에서 유용하다고 판명될 것으로 생각된다. 이러한 도면은 왜 CHO-R 세포주가 FRTL-5 세포주만큼 그레이브스병 환자 혈청으로부터의 TSI에 대해 민감하지 않은지의 적어도 부분적인 설명을 또한 제공한다. 이러한 결과들에서, 상관 계수 (r)은 0.9925였다. 3 S.D. (표준 편차) 민감도는 1.3 μIU TSH/㎖였다.

실시예 9

면역 응답의 모니터링

이러한 실험에서, 백신 수용자의 면역 응답이 측정 및 모니터링된다. 본 발명이 이렇게 한정되도록 의도되지 않지만, 이러한 실시예는 단순 헤르페스 (HSV) 백신에 대한 대상의 면역 응답의 모니터링을 기술한다.

백신의 투여 전에, 혈청 샘플 (즉, 면역전 혈청)을 기준선 또는 대조군으로서 사용하기 위해 대상으로부터 수집하고, 테스트할 때까지 동결 보관한다. 혈청 샘플을 백신의 투여 후 주기적인 간격으로 또한 수집한다 (예를 들어, 백신접종 후 1-2주, 1개월, 2개월 등). 필요에 따라 혈청을 해동하고, 중화 항체의 존재 및 양 (즉, 역가)를 결정하기 위한 분석법에서 사용한다. 혈청을 단계 희석하고, 기지량의 HSV와 혼합한다. 이러한 샘플들을 2 mM 글루타민, 2％ FBS, 및 PEG (예를 들어, 6％ PEG 8000)를 함유하는 HBSS와 함께 이글 MEM을 포함하는 희석제에서 희석한다. 그러나, 사용된 바이러스 및 분석 시스템에 적합한 대로, 상이한 농도 및 유형의 PEG를 함유하는 희석제가 포함되는 또다른 희석제가 본 방법에서 사용될 것으로 또한 생각된다. 이러한 샘플들을 HSV 감염 시 β-갈락토시데이스와 같은 효소를 생산할 수 있는 세포 (예를 들어, ELVIS™ 세포, Diagnostic Hybrids)를 함유하는 세포 단층에 첨가한다. 표준 세포 배양 조건 하에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 단층을 용해시키고, 효소 활성을 발색 또는 발광 방법을 사용하여 측정한다.

백신에 대한 양성 응답이 백신접종후 혈청의 최저 희석물에 의해 지시되고, 이는 샘플 내의 HSV를 중화한다 (즉, 면역전 대조군과 비교하여 낮은 OD. 또는 발광 값에 의해 지시되는 바와 같음).

요약하면, 본 발명은 사용 용이성, 신뢰도, 민감도, 특이성, 비용-효율성, 및 재현성의 장점과 함께 방사성의 방지를 포함하는, 종래 기술에 비하여 수많은 진전 및 장점을 제공한다.

실시예 10

키메라 TSH -R 플라스미드의 구축

본 실시예는 그레이브스병 자가항체를 검출하기 위한 키메라 TSH-R 수용체를 포함하는 세포주를 구축하는 한 실시양태를 제시한다.

플라스미드 구축

TSH-R 키메라 수용체를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 네오마이신 저항성 유전자를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 플라스미드를 루시퍼레이스 유전자 및 당단백질 호르몬 알파 서브유닛 프로모터에 결찰시켰다

인간 당단백질 알파 서브유닛 프로모터 클로닝

염색체 DNA를 인간 배아 신장 세포로부터 퀴아젠(QIAGEN) RNA/DNA 키트 (QIAGEN 카탈로그# 14123)를 사용하여 단리하였다. 당단백질 알파 서브유닛 프로모터 단편을 PCR 주형으로서의 단리된 염색체 DNA 및 하기에 제시된 2쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다:

5'PCR 프라이머:

3' PCR 프라이머:

.

Sac I 제한 부위가 5' PCR 프라이머의 5' 말단에 부가된 한편, Bgl II 제한 부위가 3' PCR 프라이머의 5' 말단에 부가되었다 (양쪽 모두 밑줄이 그어진 서열로 제시됨). PCR 증폭을 위해, BD 어드밴티지(Advantage) 2 폴리머라제 믹스 (BD Bioscience Palo Alto CA)를 사용하였고, PCR 반응을 열 사이클러 (Eppendorf Mastercycler Personal, Germen.)에서 수행하였다. 94℃에서 30초 동안 40 사이클을 수행하여, DNA를 변성시켰다. 그후, 샘플을 63℃에서 30초 동안 열 사이클러 내에서 프라이머에 어닐링시키고, 사이클 당 1분 30초 동안 68℃에서 확장을 유도하였다. 2개의 앰플리콘 (1.2 kb 및 0.6 kb)을 플라스미드 벡터 pcDNA2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하고, ABI 377 자동 서열분석기 (Davis Sequencing Inc.) 상에서 BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing 방법을 사용하여 서열분석하였다.

플라스미드 pGHP / Luc 의 구축

인간 당단백질 알파 서브유닛 프로모터를 Sac I 및 Bgl II로의 제한 절단에 의해 벡터 pcDNA2.1로부터 단리하였다. 그후, 생성된 316 bp 단편을 pGHP/Luc로 명명된 플라스미드의 구축을 위해 pGL2 인핸서 플라스미드 (Promega, Madison, WI)의 Sac I/Bgl II 부위 내로 서브클로닝하였다.

플라스미드 pMc4 - neo 의 구축

항생제 선별 (양성 클론 선별)을 위한 네오마이신 저항성 유전자를 벡터 pMC 1 (Stratagene Cedar Creek, TX)으로부터 XhoI 및 HicII의 제한 효소로 단리하였다. 그후, 생성된 단편을 SV40 프로모터에 의해 구동되는 TSHR/LH 키메라 수용체를 함유하는 플라스미드 pMc4 (Leonard Kohn. 박사로부터 수득됨)의 XbaI 부위 내로 서브클로닝하였다. 최종 플라스미드는 pMc4-neo로 명명되었다.

플라스미드 pMc4 - Bsd 의 구축

벡터 pCMV/Bsd (Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 제한 효소 XhoI 및 XbaI로 단리된 항생제 선별 유전자 블라스토시딘(Blastocidin)을 TSHR/LH 키메라 수용체를 함유하는 플라스미드 pMc4의 XbaI 부위 내로 서브클로닝하였다. [Tahara et al., "Immunoglobulins From Graves' Disease Patients Interact With Different Sites On TSH Receptor/LH/CG Receptor Chimeras Than Either TSH Or Immunoglobulins From Idiopathic Myxedema Patients" Biochem Biophys Res Comm 179:70-77 (1991)]. 최종 플라스미드는 pMc4-Bsd로 명명되었다.

플라스미드 pMc4 - GHP / Luc 의 구축

인간 당단백질 알파 서브유닛 프로모터가, 반딧불이 루시퍼레이스 리포터 유전자와 함께, SmaI 및 AccI에 의한 제한 절단 후에 벡터 pMc4/Luc로부터 단리되었다. 그후, 단리된 DNA 단편을 pMc4-neo 플라스미드의 PfoI 부위 내로 서브클로닝하였다. 최종 플라스미드는 pMV4-GHP/Luc로 명명되었다.

실시예 11

포유류 세포 선별

7개의 상이한 포유류 세포주를 테스트하여, 고리형 AMP 기초 수준이 가장 낮고 잠재적인 유도가능 수준이 가장 높은 세포주를 선별하였다. CHO 및 RD 세포가 가장 낮은 고리형 AMP 기초 활성 및 가장 높은 잠재적인 유도가능 수준을 나타냈음이 결과에서 나타났다. 이러한 실험적 연구 접근법은 세포 배양물 유형의 적합한 선별에 의해 분석법 민감도를 최대화한다. 예를 들어, 더 낮은 고리형 AMP 기초 수준은 루시퍼레이스 분석법의 민감도를 증가시킨다. 또한, 고리형 AMP의 가장 높은 유도된 발현은 루시퍼레이스 분석법의 정확성을 개선시킨다.

실시예 12

키메라 TSH -R 플라스미드로의 CHO 세포주의 형질감염/선별

본 실시예는 CHO 세포의 영구적인 혈질감염을 기술한다.

차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO-K1; ATCC 번호: CCL-61, Manassas VA)를 선형화된 (XmnI) pMc4-GPH/루시퍼레이스 플라스미드로 제조사의 지침에 따라 HyFect® (Denville Scientific, Metuchen, NJ.)를 사용하여 형질감염시켰다. 그후, CHO-K1 세포를 10％ (v/v) 소 태아 혈청 및 9가지 필수 아미노산이 있는 햄 F12 배지에서 37℃에서 5％ CO₂를 함유하는 습식 대기에서 성장시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포들을 합치고, 96웰 플레이트 내로 이식하여, 10％ FBS가 있는 햄 F12 배지에서 0.5 ㎎/㎖ G418로 선별하였다.

실시예 13

키메라 TSH -R 플라스미드로의 RD 세포주의 형질감염/선별

본 실시예는 검출을 용이하게 하기 위해 인간 횡문근육종 (RD) (ATCC 번호: CCL-136) 세포주를 2개의 플라스미드 pGHP/Luc 및 pMc4-Bsd로 연속하여 형질감염시키는 것을 기술한다.

RD 세포를 선형화된 pGPH/Luc (Sca1) 플라스미드로 제조사의 지침에 따라 HyFect (Denville Scientific, Metuchen, NJ.)를 사용하여 형질감염시켰다. 세포를 0.5 ㎎/㎖의 네오마이신으로 선별하였다. 그후, 이러한 형질감염 및 선별로부터의 최적의 클론을 선형화된 플라스미드 pMc4-Bsd로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 네오마이신 (0.5 ㎎/㎖) 및 블라스티시딘 (5 ㎍/㎖) 양쪽 모두로 세포를 선별하여, 최종 RD 재조합 세포주가 생산되었다.

모든 CHO 및 RD 항생제 저항성 클론을 TSI-양성 및 정상 혈청으로 테스트하여, TSI의 검출에 사용될 수 있는 클론을 선별하였다. TSI 유도 양성 클론을 한계 희석 클로닝에 적용하여, 단일 클론을 추가로 선별하였다.

최종 클론은 현재 시판되는 제품보다 높은 민감도로 그레이브스병을 진단하고/하거나 그레이브스병 환자의 약물 치료를 모니터링하는 능력을 지닌다. 이러한 세포주들은 10회를 초과하여 계대되는 양호한 안정성을 나타내고, 매우 유사한 성능 특성을 계속 나타낸다.

실시예 14

TSI 함유 혈청으로의 세포주의 유도

동결 바이알로부터의 CHO 세포를 성장 배지 (10 (v/v) ％ 소 태아 혈청 및 9가지의 필수 아미노산이 있는 햄 F12 배지) 내에 희석하고, 16시간 동안 37℃ 및 5％ CO₂에서 성장시켰다. 16시간 후, 배지를 제거하고, CHO 세포를 헹구고, 100 ㎕/웰의 "기아" HBSS 배지를 재공급하였다. 그후, CHO 세포를 22-24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, CHO 세포를 헹구고, 100 ㎕/웰의 반응 완충제를 재공급하였다. 그후, CHO 세포를 환자 혈청의 BSA, PEG, 수크로스, 글루코스, 및 염을 함유하는 반응 완충제 (Diagnostic Hybrids 카탈로그# 40-300500) 내의 1:11 희석물로 4시간 동안 37℃ 및 5％ CO₂에서 유도하였다.

RD 세포를 10 (v/v) ％ 소 태아 혈청이 있는 이글 최소 필수 배지 (EMEM)에서 37℃ 및 5％ CO₂에서 16-24시간 동안 성장시켰다. 그후, RD 세포를 4시간 동안 37℃ 및 5％ CO₂에서 반응 완충제 (Diagnostic Hybrids 카탈로그# 40-300500) 내의 환자 혈청으로 직접적으로 유도하였다.

상기 상술에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 거명에 의해 본원에 포함된다. 기술된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시양태들과 관련하여 기술되었지만, 청구된 발명이 이같은 특정 실시양태들에 과도하게 한정되지 않아야 한다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 진단, 세포 배양 및/또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식들의 다양한 변형이 하기의 청구항의 범주 내인 것으로 의도된다.

실시예 15

기아 CHO - RMc4luc 세포에 대한 덱사메타손의 효과

CHO-Rluc (041307A) 및 CHO-RMc4luc (062707, P8, 3×10⁶개/㎖) 세포를 5 ㎖의 CHO 성장 배지에서 각각 성장시켰다. 각각의 덱사메타손 농도 (100, 50, 40, 25, 12.5, 및 0 μM)에 대해 CHO-Rluc 분석법에 대해서는 66,666개의 세포/웰, CHO-RMc4luc 분석법에 대해서는 50,000개의 세포/웰이도록, 이러한 세포 스톡으로부터 충분한 양을 취하여 6개의 튜브 내로 분취하였다. 덱사메타손 스톡은 CHO-성장 배지 내의 500 μM였다. 모든 덱사메타손은 신선하게 제조되었다. 이러한 바이알들을 스핀-다운(spin-down)시키고, 세포를 CHO 성장 배지 내의 상이한 농도의 덱사메타손에서 놓았다.

그후, 세포를 24시간 동안 성장시키고, 기아 배지로 헹군 후, 동일물을 함유한 덱사메타손-함유 기아 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 세포를 반응 완충제로 헹구고, 혈청 (1:11로 희석됨)을 웰 내에 이미 존재하는 100 ㎕의 반응 완충제에 첨가하였다. 사용된 혈청은 i) 기준물 121506R; ii) PC 121506P; 및 iii) 환자 #18 TSI 혈청이었다. 기준물 및 환자 #18 혈청 양쪽 모두 동일하게 처리되었고, 모두 6가지 농도의 덱사메타손과 함께 인큐베이션되었다.

4시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 75 ㎕의 Bright Glo®로 용해시키고, 5분 동안 용해시킨 후, 베리타스 발광측정기 상에서 판독하였다.

실시예 16

기아 기간 대 덱사메타손 처리의 비교

9개의 인간 혈청 샘플이 제조되었고, 이때 4개의 샘플은 그레이브스병에 대해 양성인 것으로 공지되었고, 5개의 샘플은 그레이브스병에 대해 음성인 것으로 공지되었다. 9개의 샘플 각각을 비-기아/덱사메타손 프로토콜 및 기아 프로토콜 양쪽 모두의 각각의 조건에서 테스트하였다.

1. 비-기아/덱사메타손 프로토콜

3개의 세포 플레이트를 CHO-RMc4 프로토콜을 사용하여 분석하였다. 플레이트 1: CHO-Mc4luc 세포 (4×10⁶개의 세포/플레이트) + CHO-Mc4 반응 완충제 내의 40 μM 덱사메타손을 함유하는 성장 배지. 플레이트 2: CHO-RMc4luc 세포 (4×10⁶개의 세포/플레이트) + CHO-Mc4 반응 완충제 내의 40 μM 덱사메타손이 없는 성장 배지. 플레이트 3: CHO-Rluc 세포 (4×10⁶개의 세포/플레이트) + CHO-Rluc 반응 완충제 내의 40 μM 덱사메타손이 없는 성장 배지.

각각의 플레이트에 16시간 성장 기간, 3시간 유도 기간, 및 10분 용해 기간이 진행되었다.

2. 기아 프로토콜

3개의 플레이트를 CHO-R 프로토콜을 사용하여 분석하였다. 플레이트 1: CHO-RMc4 세포 (4×10⁶개의 세포/플레이트) + CHO-Mc4 반응 완충제 내의 40 μM 덱사메타손을 함유하는 성장 배지. 플레이트 2: CHO-RMc4luc 세포 (4×10⁶개의 세포/플레이트) + CHO-Mc4 반응 완충제 내의 40 μM 덱사메타손이 없는 성장 배지. 플레이트 3: CHO-Rluc 세포 (4×10⁶개의 세포/플레이트) + CHO-Rluc 반응 완충제 내의 40 μM 덱사메타손이 없는 성장 배지. 각각의 프로토콜에 대한 샘플 정렬이 동일하게 배열되었다. 도 16 참조.

각각의 플레이트에 24시간 성장 기간, 24시간 기아 기간, 4시간 유도 기간, 및 5분 용해 기간이 진행되었다. 각각의 샘플에 대한 광도를 베리타스 발광측정기를 사용하여 측정하였다.

실시예 17

별법적인 글로코코르티코이드와 덱사메타손의 비교

본 실시예는 CHO-RMc4 분석법의 개선된 민감도가 실시예 16에 따라 기아 배지 기간을 덱사메타손 (Dex)으로 교체하는 것에 한정되지 않는다는 것을 나타내는 데이터를 제공한다. 이러한 데이터는 4개의 별법적인 글루코코르티코이드 (GC)가 신호 강도를 개선시키는데 등가의 효과를 지닌다는 것을 나타낸다.

4개의 GC가 본 연구에서 시험되었다: i) 프레드니손 (Sigma); ii) 하이드로코르티손 (Sigma); iii) 플루티카손 프로피오네이트 (Sigma); 및 iv) 코르티손 (Sigma). 스톡 농도 (100 mM)의 각각의 GC가 DMSO에서 제조되었다. 그후, DMSO 내의 1:10 (10 mM) 및 1:100 (1 mM) 희석물을 100 mM 스톡으로부터 제조하였다. 모든 DMSO/GC 스톡은 눈에 보이는 침전물 없이 투명하였다.

상이한 농도의 각각의 GC를 함유하는 성장 배지가 하기와 같이 제조되었다: i) 100 μM GC 배지: 5 ㎕의 100 mM GC 스톡 + 5 ㎖ SR097 (Dex 없음); ii) 50 μM GC 배지: 2.5 ㎕의 100 mM GC 스톡 + 5 ㎖ SR097 (Dex 없음); iii) 10 μM GC 배지: 5 ㎕의 10 mM GC 스톡 + 5 ㎖ SR097 (Dex 없음); iii) 1 μM GC 배지: 5 ㎕의 1 mM GC 스톡 + 5 ㎖ SR097 (Dex 없음); 및 iv) 0.1 μM GC 배지: 0.5 ㎕의 1 mM GC 스톡 + 5 ㎖ SR097 (Dex 없음). 40 μM 덱사메타손 대조군 샘플이 이러한 다양한 농도의 별법적인 글루코코르티코이드들과 비교하여 실행되었다. 추가적인 대조군에는 용매 대조군으로서의 1 ㎕/㎖ 디메틸술폭시드 (DMSO)를 함유하는 성장 배지, 및 어떠한 글로코코르티코이드도 없는 성장 배지가 포함되었다.

테스트된 각각의 글루코코르티코이드에 대해 2개의 마이크로웰 플레이트를 사용하여 각각의 분석법이 수행되었다. 각각의 플레이트에 대한 샘플 설계가 하기에서 확인된다:

A. 플레이트 1

B. 플레이트 2

미처리 데이터가 하기에 제시된다. 표 8 참조.

<표 8>

SEQUENCE LISTING <110> Diagnostic Hybrids, Inc. Brown, James L. <120> Sensitive and Rapid Methods of Using Chimeric Receptors to Identify Autoimmune Disease <130> DHI-16216 <140> PCT/US2008/011027 <141> 2007-09-24 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gagctcatgt gtatggctca ataaaattac gtacaaagtg acagc 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 agatcttcgt cttatgagtt ctcagtaact gcagtataat gaagt 45 <210> 3 <211> 2324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 ggcgatttcg gaggatggag aaatagcccc gagtcccgtg gaaaatgagg ccggcggact 60 tgctgcagct ggtgctgctg ctcgacctgc ccagggacct gggcggaatg gggtgttcgt 120 ctccaccctg cgagtgccat caggaggagg acttcagagt cacctgcaag gatattcaac 180 gcatccccag cttaccgccc agtacgcaga ctctgaagct tattgagact cacctgagaa 240 ctattccaag tcatgcattt tctaatctgc ccaatatttc cagaatctac gtatctatag 300 atgtgactct gcagcagctg gaatcacact ccttctacaa tttgagtaaa gtgactcaca 360 tagaaattcg gaataccagg aacttaactt acatagaccc tgatgccctc aaagagctcc 420 ccctcctaaa gttccttggc attttcaaca ctggacttaa aatgttccct gacctgacca 480 aagtttattc cactgatata ttctttatac ttgaaattac agacaaccct tacatgacgt 540 caatccctgt gaatgctttt cagggactat gcaatgaaac cttgacactg aagctgtaca 600 acaatggctt tacttcagtc caaggatatg ctttcaatgg gacaaagctg gatgctgttt 660 acctaaacaa gaataaatac ctgacagtta ttgacaaaga tgcatttgga ggagtataca 720 gtggaccaag cttgctggac gtgtctcaaa ccagtgtcac tgcccttcca tccaaaggcc 780 tggagcacct gaaggaactg atagcaagaa acacctggac tcttaagaca ctgccctcca 840 aagaaaaatt cacgagcctc ctggtcgcca cgctgaccta ccccagccac tgctgcgcct 900 tcagtaattt gccgaagaaa gaacagaatt tttcattttc catttttgaa aacttctcca 960 aacaatgcga aagcacagtt agaaaagcag ataacgagac gctttattcc gccatctttg 1020 aggagaatga actcagtggc tgggatgagc tcaaaaaccc ccaggaagag actctacaag 1080 cttttgacag ccattatgac tacaccatat gtggggacag tgaagacatg gtgtgtaccc 1140 ccaagtccga tgagttcaac ccgtgtgaag acataatggg ctacaagttc ctgagaattg 1200 tggtgtggtt cgttagtctg ctggctctcc tgggcaatgt ctttgtcctg cttattctcc 1260 tcaccagcca ctacaaactg aacgtccccc gctttctcat gtgcaacctg gcctttgcgg 1320 atttctgcat ggggatgtac ctgctcctca tcgcctctgt agacctctac actcactctg 1380 agtactacaa ccatgccatc gactggcaga caggccctgg gtgcaacacg gctggtttct 1440 tcactgtctt tgcaagcgag ttatcggtgt atacgctgac ggtcatcacc ctggagcgct 1500 ggtatgccat caccttcgcc atgcgcctgg accggaagat ccgcctcagg cacgcatgtg 1560 ccatcatggt tgggggctgg gtttgctgct tccttctcgc cctgcttcct ttggtgggaa 1620 taagtagcta tgccaaagtc agtatctgcc tgcccatgga caccgagacc cctcttgctc 1680 tggcatatat tgtttttgtt ctgacgctca acatagttgc cttcgtcatc gtctgctgct 1740 gttatgtgaa gatctacatc acagtccgaa atccgcagta caacccaggg gacaaagata 1800 ccaaaattgc caagaggatg gctgtgttga tcttcaccga cttcatatgc atggccccaa 1860 tctcattcta tgctctgtca gcaattctga acaagcctct catcactgtt agcaactcca 1920 aaatcttgct ggtactcttc tatccactta actcctgtgc caatccattc ctctatgcta 1980 ttttcaccaa ggccttccag agggatgtgt tcatcctact cagcaagttt ggcatctgta 2040 aacgccaggc tcaggcatac cgggggcaga gggttcctcc aaagaacagc actgatattc 2100 aggttcaaaa ggttacccac gacatgaggc agggtctcca caacatggaa gatgtctatg 2160 aactgattga aaactcccat ctaaccccaa agaagcaagg ccaaatctca gaagagtata 2220 tgcaaacggt tttgtaagtt aacactacac tactcacaat ggtaggggaa cttacaaaat 2280 aatagtttct tgaatatgca ttccaatccc atgacacccc caac 2324 <210> 4 <211> 304 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgtgtatgg ctcaataaaa ttacgtacaa agtgacagcg tactctcttt tcatgggctg 60 accttgtcgt caccatcacc tgaaaatggc tccaaacaaa aatgacctaa gggttgaaac 120 aagataagat caaattgacg tcatggtaaa aattgacgtc atggtaatta caccaagtac 180 ccttcaatca ttggatggaa tttcctgttg atcccagggc ttagatgcag gtggaaacac 240 tctgctggta taaaagcagg tgacgacttc attatactgc agttactgag aactcataag 300 acga 304 <210> 5 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 attcgccctt gagctcatgt gtatggctca ataaaattac gtacaaagtg acagcgtact 60 ctcttttcat gggctgacct tgtcgtcacc atcacctgaa aatggctcca aacaaaaatg 120 acctaagggt tgaaacaaga taagatcaaa ttgacgtcat ggtaaaaatt gacgtcatgg 180 taattacacc aagtaccctt caatcattgg atggaatttc ctgttgatcc cagggcttag 240 atgcaggtgg aaacactctg ctggtataaa agcaggtgag gacttcatta tactgcagtt 300 actgagaact cataagacga agatctaagg gcgaatt 337 <210> 6 <211> 85 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 6 Gln Thr Leu Ile Ala Thr Ser Ser Tyr Ser Leu Lys Lys Leu Pro Ser 1 5 10 15 Arg Glu Lys Phe Ala Asn Leu Leu Asp Ala Thr Leu Thr Tyr Pro Ser 20 25 30 His Cys Cys Ala Phe Arg Asn Val Pro Thr Lys Glu Gln Asn Phe Ser 35 40 45 Phe Ser Ile Ser Lys Asn Phe Pro Lys Gln Cys Glu Ser Thr Val Arg 50 55 60 Lys Gln Asn Asn Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Ile Phe Ala Glu Ser Gly 65 70 75 80 Gln Ser Gly Trp Asp 85 <210> 7 <211> 173 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 7 Ile Leu Ile Leu Asn Thr Lys Asn Leu Leu His Ile Glu Asp Gly Ala 1 5 10 15 Phe Arg Asn Leu Pro Arg Leu Lys Tyr Leu Ser Ile Cys Asn Thr Gly 20 25 30 Ile Ile Glu Phe Pro Asp Leu Thr Gln Ile Phe Ser Ser Glu Ala His 35 40 45 Phe Ile Leu Glu Leu Cys Asp Asn Leu Arg Met Thr Thr Ile Pro Gln 50 55 60 Asn Ala Phe Arg Gly Met Ser Asn Glu Ser Leu Thr Leu Lys Leu Tyr 65 70 75 80 Lys Asn Gly Phe Glu Asp Ile His Ser His Ala Phe Asn Gly Thr Lys 85 90 95 Leu Asn Gln Leu Ile Leu Lys Asp Asn Lys Asn Leu Arg Arg Ile His 100 105 110 Asn Asp Ala Leu Arg Gly Ala Ile Gly Pro Asp Val Leu Asp Ile Ser 115 120 125 Ser Thr Ala Leu Glu Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Ala Ile Gln 130 135 140 Val Leu Asn Gly Met Ser Ser Tyr Ser Leu Lys Arg Leu Pro Pro Leu 145 150 155 160 Asp Lys Phe Ser Ser Leu Leu Glu Ala Val Leu Thr Tyr 165 170 <210> 8 <211> 728 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 8 Met Leu Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Leu Leu Pro Gly 1 5 10 15 Ala Gly Gly Gly Arg Cys Pro Gln Arg Cys Ala Cys Thr Gln Pro Ala 20 25 30 Leu Arg Cys Pro Thr Pro Pro Pro Gly Ala Arg Pro Ala Pro Ala Arg 35 40 45 Ala Ser Phe Thr His Leu Pro Val Lys Val Ile Pro Ser His Ala Phe 50 55 60 Glu Gly Leu Arg Asp Ala Phe Ile Ile Glu Ile Ser Gln Ser Asp Ser 65 70 75 80 Leu Glu Arg Ile Glu Ala Ser Ala Phe Asp Ser Leu Pro Ala Leu Ser 85 90 95 Glu Ile Leu Ile Leu Asn Thr Lys Asn Leu Leu His Ile Glu Asp Gly 100 105 110 Ala Phe Arg Asn Leu Pro Arg Leu Lys Tyr Leu Ser Ile Cys Asn Thr 115 120 125 Gly Ile Ile Glu Phe Pro Asp Leu Thr Gln Ile Phe Ser Ser Glu Ala 130 135 140 His Phe Ile Leu Glu Leu Cys Asp Asn Leu Arg Met Thr Thr Ile Pro 145 150 155 160 Gln Asn Ala Phe Gln Gly Met Ser Asn Glu Ser Leu Thr Leu Lys Leu 165 170 175 Tyr Lys Asn Gly Phe Glu Asp Ile His Ser His Ala Phe Asn Gly Thr 180 185 190 Lys Leu Asn Gln Leu Ile Leu Lys Asp Asn Lys Asn Leu Arg Arg Ile 195 200 205 His Asn Asp Ala Leu Arg Gly Ala Thr Gly Pro Asp Val Leu Asp Ile 210 215 220 Ser Ser Thr Ala Leu Glu Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Ala Ile 225 230 235 240 Gln Val Leu Asn Ala Met Ser Ser Tyr Ser Leu Lys Arg Leu Pro Pro 245 250 255 Leu Asp Lys Phe Ser Ser Leu Leu Glu Ala Val Leu Thr Tyr Pro Ser 260 265 270 His Cys Cys Ala Phe Gln Asn Leu Arg Thr Glu Lys Gln Asn Ser Leu 275 280 285 Leu Ser Ile Phe Asp Asn Phe Ser Lys Gln Cys Glu Ser Thr Met Arg 290 295 300 Lys Pro Ala Ser Glu Val Phe Tyr Arg Asp Ala Ser Ser Asn Thr Ser 305 310 315 320 Leu Trp Pro Ala Glu Lys His Met Tyr Pro Leu Glu Thr Gly Glu Glu 325 330 335 Ala Phe Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Val Phe Tyr Glu Asp Glu Met Thr 340 345 350 Gly Phe Asp Phe Glu Tyr Asp Phe Cys Gln Pro Lys Ile Leu Thr Cys 355 360 365 Thr Pro Glu Pro Asp Ala Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Leu Gly Tyr 370 375 380 Ser Phe Leu Arg Val Leu Ile Trp Phe Ile Asn Ile Leu Ala Leu Ala 385 390 395 400 Gly Asn Phe Ile Val Leu Leu Val Leu Ile Thr Ser His Tyr Lys Leu 405 410 415 Thr Val Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ser Phe Ala Asp Phe Cys 420 425 430 Met Gly Leu Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Ala Gln Thr Ser 435 440 445 Gly Gln Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ser Gly Cys 450 455 460 Ser Thr Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr 465 470 475 480 Thr Leu Thr Val Ile Thr Ile Glu Arg Trp His Thr Ile Thr Tyr Ala 485 490 495 Met Gln Leu Asp Arg Lys Leu Arg Leu Arg His Ala Val Pro Ile Met 500 505 510 Leu Gly Gly Trp Val Phe Ser Ile Leu Ile Ala Val Leu Pro Leu Leu 515 520 525 Gly Val Ser Ser Tyr Met Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile 530 535 540 Glu Thr Gly Leu Ser Gln Ala Tyr Ile Leu Leu Ile Leu Met Leu Asn 545 550 555 560 Val Ile Ala Phe Leu Val Ile Cys Ala Cys Tyr Ile Lys Ile Tyr Val 565 570 575 Ala Val Gln Asn Pro Glu Leu Val Ala Ala Asn Lys Asp Thr Lys Ile 580 585 590 Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Ile Phe Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala 595 600 605 Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile Ser Ala Ala Ile Lys Val Pro Leu Ile 610 615 620 Thr Val Thr Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Val Asn 625 630 635 640 Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln 645 650 655 Arg Asp Phe Phe Leu Leu Met Ser Lys Leu Gly Cys Cys Lys Ser Arg 660 665 670 Ala Glu Leu Tyr Arg Val Asn Tyr Phe Ser Ala Tyr Thr Pro Asn Cys 675 680 685 Lys Asn Gly Ser Ser Ala Pro Gly Pro Ser Lys Ala Ser Gln Ala Leu 690 695 700 Leu Leu Leu Ser Ala Ser Glu Lys Leu Cys Lys Thr Arg Arg Ser Thr 705 710 715 720 Lys Lys Ser Gln Pro Glu Cys Gln 725 <210> 9 <211> 58 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 9 Met Gly Arg Arg Val Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu Val Leu Ala Met 1 5 10 15 Leu Val Leu Lys Gln Ser Gln Leu His Ser Pro Glu Leu Ser Gly Ser 20 25 30 Arg Cys Pro Glu Pro Cys Asp Cys Ala Pro Asp Gly Ala Leu Arg Cys 35 40 45 Pro Gly Pro Arg Ala Gly Leu Ala Arg Leu 50 55 <210> 10 <211> 701 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 10 Met Gly Arg Pro Ser Leu Ala Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Pro Pro Ala Pro Leu Leu Trp Ala Leu Arg Pro Ala Pro Cys 20 25 30 Pro Glu Pro Cys Ser Cys Pro Pro Asp Gly Ala Leu Arg Cys Pro Gly 35 40 45 Pro Gln Ala Gly Leu Ser Arg Leu Ser Leu Thr Tyr Leu Pro Ile Lys 50 55 60 Val Ile Pro Ser Gln Ala Phe Arg Gly Leu Asn Glu Val Ile Lys Ile 65 70 75 80 Glu Ile Ser Gln Ser Asp Ser Leu Glu Lys Ile Glu Ala Asn Ala Phe 85 90 95 Asp Asn Leu Leu Asn Leu Ser Glu Ile Leu Ile Gln Asn Thr Lys Asn 100 105 110 Leu Val His Ile Glu Ala Gly Ala Phe Thr Asn Leu Pro Arg Leu Lys 115 120 125 Tyr Leu Ser Ile Cys Asn Thr Gly Ile His Lys Leu Pro Asp Val Thr 130 135 140 Lys Ile Phe Ser Ser Glu Phe Asn Phe Ile Leu Glu Ile Cys Asp Asn 145 150 155 160 Leu His Ile Thr Thr Ile Pro Arg Asn Ala Phe Gln Gly Met Asn Asn 165 170 175 Glu Ser Ile Thr Leu Lys Leu Tyr Gly Asn Gly Phe Glu Glu Ile Gln 180 185 190 Ser His Ala Phe Asn Gly Thr Thr Leu Ile Ser Leu Glu Leu Lys Glu 195 200 205 Asn Ala Arg Leu Glu Lys Met His Asn Asp Ala Phe Arg Gly Ala Thr 210 215 220 Gly Pro Ser Ile Leu Asp Ile Ser Ser Thr Lys Leu Gln Ala Leu Pro 225 230 235 240 Thr Tyr Gly Leu Glu Ser Ile Gln Thr Leu Ile Ala Thr Ser Ser Tyr 245 250 255 Ser Leu Lys Lys Leu Pro Ser Arg Glu Lys Phe Thr Asn Leu Leu Asp 260 265 270 Ala Thr Leu Thr Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Arg Asn Leu Pro 275 280 285 Thr Asn Glu Gln Asn Phe Ser Phe Ser Ile Phe Lys Asn Phe Ser Lys 290 295 300 Gln Cys Glu Ser Thr Ala Arg Arg Pro Asn Asn Glu Thr Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Ala Ile Phe Ala Glu Ser Glu Leu Ser Gly Trp Asp Tyr Asp Tyr Gly 325 330 335 Phe Cys Leu Pro Lys Thr Leu Gln Cys Ala Pro Glu Pro Asp Ala Phe 340 345 350 Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Phe Leu Arg Val Leu Ile 355 360 365 Trp Leu Ile Asn Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Val Thr Val Leu Phe 370 375 380 Val Leu Leu Thr Ser Arg Tyr Lys Leu Thr Val Pro Arg Phe Leu Met 385 390 395 400 Cys Asn Leu Ser Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly Leu Tyr Leu Leu Leu 405 410 415 Ile Ala Ser Val Asp Ala Gln Thr Lys Gly Gln Tyr Tyr Asn His Ala 420 425 430 Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ser Gly Cys Ser Ala Ala Gly Phe Phe Thr 435 440 445 Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu Thr Val Ile Thr Leu 450 455 460 Glu Arg Trp His Thr Ile Thr Tyr Ala Ile Gln Leu Asp Gln Lys Leu 465 470 475 480 Arg Leu Lys His Ala Ile Pro Val Met Leu Gly Gly Trp Leu Phe Ser 485 490 495 Thr Leu Ile Ala Val Leu Pro Leu Val Gly Val Ser Asn Tyr Met Lys 500 505 510 Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Val Glu Ser Thr Leu Ser Gln Val 515 520 525 Tyr Ile Leu Thr Ile Leu Ile Leu Asn Val Met Ala Phe Ile Ile Ile 530 535 540 Cys Ala Cys Tyr Ile Lys Ile Tyr Phe Ala Val Gln Asn Pro Glu Leu 545 550 555 560 Met Ala Thr Asn Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys Lys Met Ala Val Leu 565 570 575 Ile Phe Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala Ile 580 585 590 Ser Ala Ala Phe Lys Val Pro Leu Ile Thr Val Thr Asn Ser Lys Val 595 600 605 Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Val Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe Leu 610 615 620 Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp Phe Phe Leu Leu Leu 625 630 635 640 Ser Lys Phe Gly Cys Cys Lys Tyr Arg Ala Glu Leu Tyr Arg Arg Lys 645 650 655 Asp Phe Ser Ala Tyr Ile Ser Asn Cys Lys Asn Gly Phe Thr Gly Ser 660 665 670 Asn Lys Pro Ser Arg Ser Thr Phe Lys Leu Thr Thr Leu Gln Cys Gln 675 680 685 Tyr Ser Ala Val Leu Asp Lys Thr Cys Tyr Lys Glu Cys 690 695 700

Claims (15)

1. a) i) 키메라 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 수용체를 코딩하는 서열인 서열 3의 핵산 및 루시퍼레이스(luciferase) 유전자를 포함하는 안정적으로 형질감염된 벡터를 포함하는 비-기아 세포주;
   ii) 그레이브스병(Graves' disease)에 걸린 것으로 추측되는 환자로부터 유래된 혈청 샘플; 및
   iii) 세포 배양 배지
   를 제공하는 단계;
   b) 상기 루시퍼레이스 유전자가 발현되고 상기 세포주가 검출가능한 신호를 방출하도록 하는 조건 하에서, 상기 혈청 샘플을 상기 세포주 및 상기 배지와 배양하는 단계
   를 포함하는, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
2. 제1항에 있어서, 신호 강도를 측정하는 단계 c)를 추가로 포함하는 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법으로서, 상기 신호 강도가 상기 샘플 내에 존재하는 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 수용체 자가항체 농도와 정적 상관관계(positive correlation)인, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 배양 단계 b)에서의 상기 배지가 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함하는, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 키메라 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 수용체가 래트 융모성 호르몬 고나도트로핀 수용체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 인간 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 수용체 아미노산 서열의 아미노산 잔기 262-335에 상응하는 73개의 아미노산을 포함하는 것인, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
6. 키메라 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 수용체를 코딩하는 서열인 서열 3의 핵산 및 루시퍼레이스 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 혈청 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 자가항체를 검출할 수 있는 키트.
7. 제6항에 있어서, 상기 벡터로 형질감염된 세포주를 추가로 포함하는 키트로서, 상기 세포주가 상기 키메라 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 수용체 및 루시퍼레이스 유전자를 발현할 수 있는 것인, 키트.
8. 제6항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 포함하는 키트.
9. 삭제
10. 제7항에 있어서, 상기 세포주가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 및 인간 횡문근육종(RD) 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
11. a) i) 갑상샘-자극 자가항체를 함유하는 것으로 추측되는 테스트 샘플,
    ii) 테스트 수단 내에 함유되어 있는 배양된 비-기아 세포로서, 상기 테스트 샘플이 상기 갑상샘-자극 자가항체를 함유하는 경우, 서열 3의 핵산에 의해 코딩되는 키메라 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 수용체 및 루시퍼레이스를 발현하는 배양된 비-기아 세포, 및
    iii) 폴리에틸렌 글리콜
    을 제공하는 단계;
    b) 상기 테스트 샘플 중의 상기 갑상샘-자극 항체의 존재가 상기 루시퍼레이스를 사용하여 검출가능하도록 하는 조건 하에서, 상기 테스트 샘플을 상기 배양된 비-기아 세포 및 상기 폴리에틸렌 글리콜에 노출시키는 단계; 및
    c) 검출가능한 갑상샘-자극 항체의 존재에 대해 관찰하는 단계
    를 포함하는, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 배양된 비-기아 세포가 루시퍼레이스 유전자로 안정적으로 형질감염된 인간 횡문근육종(RD) 세포 및 루시퍼레이스 유전자로 안정적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 관찰 단계가 발광측정기를 사용하여 수행되는, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 루시퍼레이스가 고리형-아데노신 모노포스페이트(cAMP) 농도를 결정하는, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.
15. 제14항에 있어서, 성장 배지 및 자극 배지로 구성된 군으로부터 선택된 배지를 추가로 포함하는, 갑상샘 자극 호르몬(TSH) 항체 검출 방법.

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