CN113687067B - 针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，该试剂盒包括细胞检测组件━含荧光标记的AChR单亚基抗原的转染细胞。上述试剂盒通过CBA方法制备得到，能够在很大程度上保留AChR的天然构象，较少产生非特异性吸附和交叉反应，且具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明还公开了上述检测试剂盒的应用，将上述试剂盒用于检测待测血清中是否存在针对AChR单亚基的自身抗体，从而分析其与MG患者疾病严重程度的关系，为临床治疗提供新指标、新方案。也可以将AChR‑Ab按照亚基进行分类并归纳其临床症状，针对这些症状进行对症治疗将是未来AChR‑MG治疗的首选方向。

Description

针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和抗体检测技术领域，涉及针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒及其应用。

背景技术

重症肌无力(MG)是一种由针对神经肌肉接头蛋白的抗体(Ab)引起的自身免疫性疾病，病症是波动性肌肉无力和易疲劳。MG全球患病率为(150～250)/百万，预估年发病率为(4～10)/百万。我国MG发病率约为0.68/10万，女性发病率略高；住院死亡率为14.69‰，主要死亡原因包括呼吸衰竭、肺部感染等。

在约85％MG患者中可检测到针对肌肉乙酰胆碱受体(AChR)的抗体。已知肌肉AChR由五个同源亚基组成，在胎儿或失神经肌肉中为(α₁)2、β₁、δ、γ，在成人肌肉中为(α₁)2、β₁、δ、ε(如图12所示)。每个亚基都有一个高度结构化的细胞外结构域(ECD)，四个跨膜结构域和部分结构化的细胞内结构域。自身抗体靶向AChR亚基的ECD，其异质性较强，可在同一患者中发现针对AChR五个单亚基的自身抗体。据报道，约50％的AChR自身抗体与α单亚基结合，尤其是与主要免疫抗原性区域(MIR)结合。该区域由α单亚基ECD上的重叠表位形成，其核心表位位于第67-76位氨基酸之间。此外，已有研究证明，针对α单亚基的自身抗体比针对其他单亚基的自身抗体更具致病性。

AChR-Ab的存在对MG具有近100％的特异性，然而，其对于临床治疗的指导价值还不明朗。Lindstrom等在1976年和Sanders等在2014年发表的文章表明，AChR-Ab的浓度与疾病的严重程度无关。但Masuda等在2012年发表的文章表明，仅考虑MIR定向抗体的浓度时，这种相关性就会出现。另一方面，Oosterhuis等在1983年发表的文章表明，在个别患者中，抗体浓度与疾病的严重程度和治疗反应性有关。Sophianos等在1989年发表的文章中表明，这种情况可能是由于针对AChR五个单亚基的自身抗体对AChR贡献程度不同导致的。Kostelidou等人在2007年发表的文章，通过免疫吸附已检测到针对AChR五个单亚基的自身抗体，但其与疾病的严重程度和治疗反应性的关系仍不清楚。

多年来，AChR-Ab的检测方法已经取得很大进展。最开始放射免疫沉淀测定(RIPA)被广泛采用，之后开发了几种非放射性检测方法，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光免疫沉淀测定(FIPA)和基于细胞的测定(CBA)。RIPA灵敏度高，特异性强，可以定量检测到低浓度AChR-Ab，但一些AChR-Ab是构象依赖性的，不与该测定中使用的可溶性AChR的ECD结合；此外，RIPA试剂的有效期短，约为一个月，不适合像中国这样一个地域辽阔的国家，而且还存在放射性污染的缺点。ELISA灵敏度高，有效期长，但其使用强酸终止液会污染环境；此外，ELISA需要依赖价格昂贵的试剂盒从而导致检测成本较高。FIPA灵敏度高、特异性强，但裂解液中的去垢剂可能会破坏AChR的天然构象，影响AChR和抗体相互作用的效果；此外，FIPA中的蛋白A珠可能对AChR有非特异性吸附或者对样品中的其他蛋白有交叉反应。

在过去的几年中，因为可以鉴定出以前未能检测出的针对膜蛋白空间构象表位的致病性抗体，CBA的应用逐渐普及。与RIPA相比，CBA能够更好表达AChR构象依赖性表位，转染细胞通过固定和封闭后保存时间较长，可长期使用。与ELISA相比，CBA的检测下限较低，所使用试剂均为常规试剂，不需要依赖价格昂贵的试剂盒，检测成本较低。与FIPA相比，CBA不使用裂解液和蛋白A珠，很大程度上保留了AChR的天然构象，较少产生非特异性吸附和交叉反应。CBA具有灵敏度高、特异性强的特点，其特异性达99％，此处的特异性是指疾病诊断的特异性。因此，构建一种灵敏度高、特异性强的检测MG患者血清中针对AChR单亚基自身抗体的方法至关重要。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，该检测试剂盒可对MG患者血清中AChR单亚基的自身抗体进行检测，从而探究五种单亚基抗体与MG患者疾病严重程度的关系。

本发明的目的之二在于提供针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，所述试剂盒中包括细胞检测组件，所述细胞检测组件的制备包括以下步骤：

S1：获取AChR单亚基的目的基因；

S2：将步骤S1得到的AChR单亚基的目的基因分别与荧光标记载体连接，构建得到真核表达质粒；

S3：将步骤S2得到的真核表达质粒分别转染细胞，得到含荧光标记的AChR单亚基抗原的转染细胞，即细胞检测组件。

进一步地，所述AChR单亚基分别为α₁、β₁、δ、ε、γ，载体为pCMV6-AC-GFP。

进一步地，所述S1包括以下步骤：

(1)从肝脏细胞系中提取的总RNA为模板反转录得到cDNA；

(2)通过NCBI检索关键词CHRNA1、CHRNB1、CHRND、CHRNE、CHRNG，分别得到人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因对应的mRNA转录本，根据选定的mRNA转录本的CDS设计相应的上游引物和下游引物，PCR扩增步骤(1)得到的cDNA得到相应的人AChR亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因；

(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因；并将纯化后的α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因进行双酶切。

进一步地，所述步骤(2)α₁的上游引物为ATTGCGATCGCCATGGAGCCCTGGCCT，下游引物为CGACGCGTTCCTTGCTGATTTAATTCAATGAGTCGACC；

β₁的上游引物为ATTGCGATCGCCATGACCCCAGGGGCT，下游引物为CGACGCGTAGGAAAGGGGTCTGGAGG；

δ的上游引物为ATTGCGATCGCCATGGAGGGGCCAGTG，下游引物为CGACGCGTGATGAAGCGCTTGTCCTGC；

ε的上游引物为ATTGCGATCGCCATGGCAAGGGCTCCG，下游引物为CGACGCGTAGGCTGGATACACGGCGCGTA；

γ的上游引物为ATTGCGATCGCCATGCATGGGGGCCAGG，下游引物为CGACGCGTGTCTGGTGAGGGCAGGTA。

进一步地，所述S2包括以下步骤：

(1)将pCMV6-AC-GFP载体进行双酶切、胶回收得到纯化的pCMV6-AC-GFP载体片段，将步骤S1得到的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因片段分别和纯化的pCMV6-AC-GFP载体片段连接，得到五种连接产物；

(2)将步骤(1)得到的五种连接产物转化感受态细胞得到五种转化产物，然后将五种转化产物涂布于培养板中，每种均挑选单菌落增菌培养；提取质粒，分别得到五种真核表达质粒pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ。

进一步地，所述S3包括以下步骤：接种HEK293细胞至培养系统中，当细胞融合度为50％时将步骤S2得到的五种真核表达质粒用转染试剂分别转染细胞，分别得到含荧光标记的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ抗原的转染细胞，即细胞检测组件。

进一步地，所述试剂盒还包括固定液、通透液、封闭液、洗涤液、阳性对照、阴性对照。优选地，固定液为4％的甲醛；通透液为0.5％Triton X-100；封闭液为1％牛血清白蛋白；洗涤液为PBS；阳性对照为商品化大鼠单克隆抗体；阴性对照为健康人血清。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒的应用，所述试剂盒中的荧光标记的AChR单亚基抗原与待测血清进行免疫反应，用于检测待测血清中是否存在针对AChR单亚基的自身抗体。

进一步地，所述检测过程包括：

(1)将步骤S3得到的细胞检测组件进一步固定、通透、封闭；

(2)将步骤(1)得到的细胞与待测血清共同孵育，进行免疫反应。

进一步地，所述步骤(2)的过程包括：

(2.1)将血清标本进行比例稀释；

(2.2)将步骤(1)通透、封闭后的细胞与(2.1)稀释后的血清混合并共同孵育；

(2.3)步骤(2.2)孵育完成后对细胞进行洗涤，然后加入对应的二抗孵育，孵育完成后再次洗涤，使用荧光显微镜进行观察。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，该试剂盒包括细胞检测组件━含荧光标记的AChR单亚基抗原的转染细胞。上述试剂盒通过CBA方法制备得到，能够在很大程度上保留AChR的天然构象，较少产生非特异性吸附和交叉反应，且具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明还提供了针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒的应用，将上述试剂盒用于检测待测血清中是否存在针对AChR单亚基的自身抗体，从而分析其与MG患者疾病严重程度的关系，为临床治疗提供新指标、新方案。也可以将AChR-Ab按照亚基进行分类并归纳其临床症状，针对这些症状进行对症治疗将是未来AChR-MG治疗的首选方向。此外，定期监测AChR亚基自身抗体的浓度对MG患者的预后情况具有指导意义。

附图说明

图1为本发明pCMV6-AC-GFP载体结构图；

图2为本发明pCMV6-AC-GFP-α₁真核表达质粒结构图；

图3为本发明pCMV6-AC-GFP-β₁真核表达质粒结构图；

图4为本发明pCMV6-AC-GFP-δ真核表达质粒结构图；

图5为本发明pCMV6-AC-GFP-ε真核表达质粒结构图；

图6为本发明pCMV6-AC-GFP-γ真核表达质粒结构图；

图7为本发明pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ五种真核表达质粒单、双酶切鉴定图；

图8为本发明间接免疫荧光法验证人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ蛋白水平表达图；

图9为本发明免疫印迹法验证人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ蛋白水平表达图；

图10为本发明CBA法检测健康人血清中针对人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ的自身抗体应用图；

图11为本发明CBA法检测MG患者血清中针对人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ的自身抗体应用图；

图12为肌肉AChR在胎儿、成人肌肉中的同源亚基组成示意图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例

针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，试剂盒中包括细胞检测组件、固定液、通透液、封闭液、洗涤液、阳性对照、阴性对照。其中细胞检测组件为含荧光标记的AChR单亚基抗原的转染细胞；固定液为4％的甲醛；通透液为0.5％Triton X-100；封闭液为1％牛血清白蛋白；洗涤液为PBS；阳性对照为商品化大鼠单克隆抗体；阴性对照为健康人血清。

其中细胞检测组件的制备过程包括以下步骤：

S1:获取AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因

(1)从人肝脏细胞系中提取的总RNA为模板反转录得到cDNA。

(1.1)RNA提取操作步骤：

①贴壁细胞：弃去培养基，用PBS清洗一次。每10cm²培养面积的细胞加入1mL RNAisolater，使之充分覆盖到细胞表面，然后用移液器将细胞吹打下来。将裂解液转移至1.5mL离心管中，用移液器反复吹打直至充分裂解，冰上静置5分钟。

②向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿。剧烈震荡15秒成乳浊液，4℃静置5分钟。

③4℃环境下以12000rpm离心15分钟。

④小心取出离心管。此时溶液分为三层：无色的水相(上层)、白色中间层以及红色的有机层(下层)。小心吸取上层水相至一个新的离心管中。

⑤加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10分钟。

⑥12000rpm、4℃离心10分钟，通常可以看到白色沉淀。

⑦小心弃去上清，加入1mL 75％乙醇(用RNase-free ddH₂O配制)。轻弹管底，让沉淀悬浮起来，并上下颠倒数次，室温静置5分钟。

⑧12000rpm、4℃离心5分钟，弃去上清。

⑨在洁净的环境中室温敞口干燥沉淀2～5分钟，注意不可过分干燥，否则会导致RNA难以溶解。

⑩加入适量的RNase-free ddH₂O溶解沉淀，必要时可用移液器轻轻吹打几下，待完全溶解后，取少量检测，其余在-80℃保存。

(1.2)反转录得到cDNA

①在Microtube管中根据表1配制下列反应液。

表1

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2μL
gDNA Eraser	1μL
		Total RNA	1μg
RNase Free ddH<sub>2</sub>O	Up to 10μL

②42℃保温2分钟后，4℃保存。

③在上述Microtube管中按照表2配制下列反转录反应液，缓慢混匀。

表2

试剂	使用量
		上述反应液	10μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1μL
		RT Primer Mix	1μL
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)	4μL
		RNase Free ddH<sub>2</sub>O	4μL
Total	20μL

④按下列条件进行反转录反应，最终得到cDNA：

步骤一、37℃，15min；

步骤二、85℃，5sec；

步骤三、4℃hold。

(2)通过NCBI检索关键词CHRNA1、CHRNB1、CHRND、CHRNE、CHRNG，分别得到人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因对应的mRNA转录本NM_000079.4、NM_000747.3、NM_000751.3、NM_000080.4、NM_005199.5，根据选定的mRNA转录本的CDS设计五对带有AsiSI和MluI酶切位点的特异性引物(表3)。将反应组分ddH₂O、上游引物、下游引物、cDNA、2×Phanta MaxMaster Mix依次加入并充分混匀。根据引物Tm值设置退火温度，设置对应的反应程序进行PCR，得到相应的人AChR亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因。

表3

PCR反应体系如表4所示：

表4

成分	体积
		2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)	25μL
上游引物(10μmol)	2μL
		下游引物(10μmol)	2μL
cDNA	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50uL

AChRα₁的PCR反应程序如表5.1、AChRβ₁、δ、ε、γ的PCR反应程序如表5.2所示。

表5.1

表5.2

(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因；并将纯化后的α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因进行双酶切。

(3.1)将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳过程的参数设置为电压90V，时间60分钟。电泳结束后，将1500bp左右的凝胶切下，使用胶回收试剂盒回收目的基因胶条，得到纯化的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因。

(3.2)人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因双酶切

将纯化后的带有酶切位点的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因用限制性核酸内切酶AsiSI和MluI进行双酶切，37℃水浴锅中酶切4小时。目的基因双酶切体系如表6所示。

表6

成分	体积
		DNA	20μL
10×快切酶Buffer	3μL
		AsiSI	1.3μL
MluI	1.3μL
		ddH<sub>2</sub>O	up to 30μL

S2：将步骤S1得到的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因分别与载体pCMV6-AC-GFP连接，构建得到五种真核表达质粒pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ。

(1)将pCMV6-AC-GFP载体进行双酶切、胶回收得到纯化的pCMV6-AC-GFP载体片段，将步骤S1得到的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因片段分别和纯化的pCMV6-AC-GFP载体片段连接，得到五种连接产物。

(1.1)pCMV6-AC-GFP载体双酶切

本发明选用表达绿色荧光蛋白的pCMV6-AC-GFP载体(购自OriGene)作为真核表达载体，由SnapGene得出其结构图(图1)。将带有相同酶切位点的pCMV6-AC-GFP用限制性核酸内切酶AsiSI和MluI进行双酶切，37℃水浴锅中酶切4小时。载体双酶切体系如表7所示。

表7

成分	体积
		DNA	15.5μL
10×快切酶Buffer	3μL
		AsiSI	3.3μL
MluI	3.3μL
		ddH<sub>2</sub>O	up to 30μL

(1.2)pCMV6-AC-GFP载体片段胶回收

将pCMV6-AC-GFP载体片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳过程的参数设置为电压90V，时间60分钟。电泳结束后，将7000bp左右的凝胶切下，使用胶回收试剂盒回收载体胶条，得到纯化pCMV6-AC-GFP载体片段。

(1.3)连接

将人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因片段和pCMV6-AC-GFP载体片段使用T4 DNA连接酶在16℃下连接20小时。α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因片段与pCMV6-AC-GFP载体片段的摩尔比为2:1。连接反应体系如表8所示。

表8

成分	体积
		载体片段	2μL
目的基因片段	0.9μL
		10×T4 DNA连接酶Buffer	1μL
T4 DNA连接酶	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	up to 10μL

(2)将步骤(1)得到的五种连接产物转化感受态细胞得到五种转化产物，然后将五种转化产物涂布于培养板中，每种均挑选单菌落增菌培养；提取质粒，分别得到五种真核表达质粒pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ。

(2.1)转化

将上述得到的五种连接产物转化DH5α感受态细胞得到五种转化产物，然后将五种转化产物涂布于含有100mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养板中，37℃生长16小时后挑选单菌落增菌培养。使用质粒提取试剂盒提取五种真核表达质粒，分别命名为pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ。上述五种真核表达质粒结构图如图2至6所示。

(2.2)单、双酶切鉴定

对步骤(2.1)得到的pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ五种真核表达质粒进行单酶切和双酶切，并对单酶切、双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，琼脂糖凝胶电泳过程的参数设置为电压90V，时间60分钟。单酶切、双酶切反应体系如表9、表10所示。

表9

成分	体积
		DNA	3μL
10×快切酶Buffer	2μL
		MluI	1μL
ddH<sub>2</sub>O	up to 20μL

表10

成分	体积
		DNA	3μL
10×快切酶Buffer	2μL
		AsiSI	1μL
MluI	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	up to 20μL

图7为pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ五种真核表达质粒的单、双酶切鉴定图，结果表明上述五种质粒成功构建。

(2.3)测序鉴定

对pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ五种真核表达质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，上述质粒的序列分别为SEQ.NO.1、SEQ.NO.2、SEQ.NO.3、SEQ.NO.4、SEQ.NO.5，对测序后的拼接结果进行BLAST分析，结果与NCBI完全一致，同源性100％。

S3：将步骤S2得到的五种真核表达质粒分别转染细胞，得到含荧光标记的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ抗原的转染细胞，即细胞检测组件。

(1)接种HEK293细胞至培养系统中，当细胞融合度为50％时将步骤S2得到的五种真核表达质粒用转染试剂分别转染细胞，分别得到含荧光标记的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ抗原的转染细胞，即细胞检测组件。

(1.1)细胞培养

用胰蛋白酶将贴壁生长的HEK293细胞从培养瓶中消化下来，并以1000rpm离心5分钟，弃上清，再将细胞重悬，计数并以1×10⁴个细胞/孔的密度铺在48孔细胞培养板上，培养基为DMEM附加10％胎牛血清、100单位/mL青霉素、100单位/mL链霉素，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养至少24小时。

(1.2)细胞转染

当细胞融合度为50％时，使用Invigentech将pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ五种真核表达质粒分别瞬时转染细胞。对于AChRα₁单亚基自身抗体估计，每个孔使用0.6μg的pCMV6-AC-GFP-α₁质粒进行转染。对于AChRβ₁、δ、ε、γ单亚基自身抗体估计，每个孔的添加量与α₁单亚基相同。最终分别得到含荧光标记的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ抗原的转染细胞，即细胞检测组件。

由于大部分AChRα₁、β₁、δ、ε、γ单亚基在内质网会被泛素化降解，只有一小部分单亚基进入高尔基体糖基化后转运到细胞膜上，所以本发明通过使用蛋白酶体抑制剂MG-132进一步提高AChRα₁、β₁、δ、ε、γ单亚基在细胞膜上的表达。泛素化的AChRα₁、β₁、δ、ε、γ单亚基在暴露于MG-132时不能被蛋白酶体降解，可以通过去泛素化作用“回收”，从而使单亚基水平增加。高尔基体AChRα₁、β₁、δ、ε、γ单亚基池的增加可能原因是单亚基在内质网水平的降解速度较慢，这将促进单亚基成熟并在细胞膜上表达。

瞬时转染和稳定转染各有优缺点(表11)，本发明根据实验目的选择表达效率较高的瞬时转染。瞬时转染是指外源基因进入宿主细胞后存在于游离的载体上，而不整合到宿主细胞的染色体上，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，从而产生高水平的表达。一般在外源基因导入细胞两天后收获细胞。

表11

实验例1

对瞬时转染的细胞进行鉴定和评估

(1)间接免疫荧光验证蛋白水平表达

(1.1)将步骤S3得到的细胞检测组件进一步固定、通透、封闭

转染48小时后，48孔细胞培养板中贴壁生长的HEK293细胞用PBS稀释的4％甲醛4℃下固定20分钟。用PBS洗涤一次后，将细胞用PBST(PBS稀释的0.5％Triton X-100)通透，然后用含1％牛血清白蛋白的PBST在4℃下封闭过夜。

(1.2)AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ抗原与商品化大鼠单克隆抗体反应(阳性对照)

将通透、封闭后的48孔细胞培养板中的HEK293细胞与以1:100的比例用PBST稀释的商品化大鼠单克隆抗体在室温下孵育2小时。PBS洗涤三遍后，将细胞与以1:1000的比例用PBST稀释的Alexa Fluor 594偶联的山羊抗大鼠IgG在室温下孵育2小时。孵育完成后用PBS洗涤三遍，向每孔中加入适量DAPI染色液，室温染色10分钟，吸除DAPI染色液，用PBS洗涤三遍。最后使用荧光显微镜完成视觉检查和成像，所有照片均在相似的显微镜设置下获得。

检测结果如图8，DAPI染核定位显示细胞核呈蓝色。HEK293细胞表达的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ蛋白定位于细胞膜，细胞膜呈绿色。当将通透、封闭后的HEK293细胞与针对AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ的大鼠单克隆抗体和二抗孵育后，细胞膜呈红色。最终形成抗原抗体二抗复合物固定在细胞表面，在荧光显微镜下观察得到绿色和红色的双色荧光。

(2)免疫印迹验证蛋白水平表达

(2.1)总蛋白提取

转染48小时后，去除贴壁细胞的培养基，用预冷的PBS轻轻洗一遍；在6孔板的每个孔中加入100μL RIPA裂解液与1μL PMSF，冰上裂解20分钟，收集细胞裂解液于1.5mL干净离心管中，以12000rpm的转速4℃下离心30分钟。

(2.2)蛋白变性

离心后，上清即为蛋白提取液，吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×蛋白上样缓冲液，待干式恒温器温度升至98℃，将其加热变性10分钟。

(2.3)制胶

配制10％分离胶，将制好的胶溶液加入预先安装好的制胶器中，加水封胶，水平放置30分钟后倒掉水。配制5％浓缩胶，将制好的胶溶液加入制胶器中，插入样品梳，赶走气泡，水平放置30分钟后拔走样品梳，加入1×电泳液。

(2.4)电泳

上样时，为保证每个泳道蛋白样体积一致，体积相差较大的用1×的蛋白上样缓冲液补齐。浓缩胶使用90V电压、电泳30分钟，使蛋白样压齐，待样品进入分离胶时，调为120V电压、电泳60分钟。

(2.5)转膜

切下26kD左右的GFP蛋白凝胶、36kD左右的GAPDH蛋白凝胶以及70～100kD的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的蛋白凝胶，剪下比蛋白凝胶稍大的PVDF膜，用湿转法在冰水浴中转膜，200mA的电流转膜55分钟。

(2.6)封闭

用1×TBST配制的5％脱脂奶粉作为封闭液，将蛋白膜条室温封闭2小时。

(2.7)抗体孵育

将商品化大鼠单克隆抗体以1:1000稀释于1×TBST中，AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的蛋白膜条与之4℃过夜孵育；用1×TBST将目的蛋白膜条摇晃洗3次，每次10分钟；将HRP标记的山羊抗大鼠IgG以1:5000稀释于1×TBST中，目的蛋白膜条与之在室温摇晃孵育2小时；最后用1×TBST将目的蛋白膜条摇晃洗3次，每次10分钟。GFP蛋白膜条、GAPDH蛋白膜条的抗体孵育过程同AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的蛋白膜条。

(2.8)曝光

打开Amersham Imager 600成像仪，将ECL发光液A液与B液1:1混匀，吸取混匀的发光液滴加在PVDF膜上，进行曝光。

如图9所示，AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ蛋白在HEK293细胞成功表达。

实验例2

针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒的应用

MG最重要的诊断依据是病人的临床表现，其次是辅助检查。MG诊断标准符合a和b-d中的任意一条：

a.患者存在肌肉易疲劳无力，且活动后加重休息后减轻或缓解；

b.新斯的明试验阳性；

c.肌电图阳性；

d.血清抗体检测阳性。

据此标准共纳入1000例MG患者。

本发明检测血清中自身抗体过程为：

(1)将步骤S3得到的细胞检测组件进一步固定、通透、封闭。

转染48小时后，48孔细胞培养板中贴壁生长的HEK293细胞用PBS稀释的4％甲醛于4℃固定20分钟。用PBS洗涤一次后，将细胞用PBST通透，然后用含1％牛血清白蛋白的PBST在4℃下封闭过夜。

(2)将步骤(1)得到的细胞与待测血清共同孵育，进行免疫反应。

(2.1)取临床MG患者的血清作为标本，并用PBST以1:20的比例对血清进行稀释；

(2.2)将步骤(1)通透封闭后的48孔细胞培养板中的HEK293细胞与上步稀释后的血清混合，在室温下孵育2小时；

(2.3)孵育完成后，用PBS洗涤三遍后，将细胞与以1:1000用PBST稀释的DyLight594偶联的羊抗人IgG Fc二抗在室温下孵育2小时。孵育完成后再次用PBS洗涤三次，使用荧光显微镜完成视觉检查和成像。

图10、图11分别为本发明CBA法检测健康人血清(阴性对照)、不同MG患者血清(阳性血清)中针对人AChR单亚基的自身抗体应用图。五种真核表达质粒转染到对应的HEK293细胞中表达绿色荧光蛋白，加入患者血清后发生免疫反应，merge后呈现黄色荧光效果，表明该血清样本中含有针对AChR单亚基的自身抗体。健康人血清检测则无上述免疫反应发生，merge后依旧为绿色荧光效果。由此可知本发明得到的针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒可以用于检测待测血清中是否存在针对AChR单亚基的自身抗体，并可根据检测结果分析其与MG患者疾病严重程度有无关系。

综上，本发明提供了针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，该试剂盒能够在很大程度上保留AChR的天然构象，较少产生非特异性吸附和交叉反应，且具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明将针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒用于检测待测血清中是否存在针对AChR五个不同单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ的自身抗体，从而分析其与MG疾病严重程度的关系，为临床治疗提供新指标、新方案。也可以将AChR-Ab按照亚基进行分类并归纳其临床症状，针对这些症状进行对症治疗将是未来AChR-MG治疗的首选方向。此外，定期监测AChR亚基自身抗体的浓度对MG患者的预后情况具有指导意义。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒及其应用

<130> 说明书

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccagtgcgat tccttcaggc aggagaggca ctggggaggg gtcacaggga tgccacccgg 60

gatctgttca ggaaacagct atgaccgcgg ccggccgttt aaactctttc ttcaccggca 120

tctgcatccg gggtcttgaa ggcgtgctgg tactccacga tgcccagctc ggtgttgctg 180

tgatcctcct ccacgcggcg gaaggcgaac atggggcccc cgttctgcag gatgctgggg 240

tggatggcgc tcttgaagtg catgtggctg tccaccacgg agctgtagta gccgccgtcg 300

cgcaggctga aggtgcgggt gaagctgcca tccagatcgt tatcgcccat ggggtgcagg 360

tgctccacgg tggcgttgct gcggatgatc ttgtcggtga agatcacgct gtcctcgggg 420

aagccggtgc ccatcacctt gaagtcgccg atcacgcggc cggcctcgta gcggtagctg 480

aagctcacgt gcagcacgcc gccgtcctcg tacttctcga tgcgggtgtt ggtgtagccg 540

ccgttgttga tggcgtgcag gaaggggttc tcgtagccgc tggggtaggt gccgaagtgg 600

tagaagccgt agcccatcac gtggctcagc aggtaggggc tgaaggtcag ggcgcctttg 660

gtgctcttca tcttgttggt catgcggccc tgctcggggg tgccctctcc gccgcccacc 720

agctcgaact ccacgccgtt cagggtgccg gtgatgcggc actcgatctc catggcgggc 780

aggccgctct cgtcgctctc catctcgagc ggccgcgtac gcgttccttg ctgatttaat 840

tcaatgagtc gacctgcaaa cacggctagg gttccgatga tgcaaacaag catgaagact 900

ccgaggagta tgtggtccat caccattgca acgtacttcc actctgccgc cgcattgtta 960

gactcctggt ctgacttcat ggtctctgcg atgtacttga tgccctcgat ggcacttttc 1020

acctcggggt gtttgatcag gggagagtgg aagcccatgg gtggaggccc tggctttcca 1080

gaaatgtcag agatatcaat gtcttctgta aaaatctttt tgtcttgctt ttctctggat 1140

ggtcttttca ttgtggagaa aaacatgata tttgggatag tgtcgataaa aaccttccgc 1200

acccagttgg gcatgacatg ggtgctgggt gagcggtggt gtgtgttgat gacgatgaca 1260

gtgatgatga tggaggcaat gacgaacacc atggtgaaca gcatgtattt tccaatcaag 1320

ggcacagcac tggacgtgga ggggatcagc tccacgatga ccagaaggaa cacagtcaaa 1380

gacagtaaga cagagatgct cagagtcatc ttctcccctg agtctgtggg caggtagaat 1440

accaggccag ttaagaagga gaagagcagg caggggatga tgacgttgac gatgaagtag 1500

aggggcaggc gctgcatgac gaagtggtag gtgatgtcca ggtagggggt gtcggggcag 1560

caggaatagg tcacggagtg cttccagccc cgggactcct tgatcaccca ctccccgctc 1620

tccatgaagt tgctcaggtc tggctggtcg ctttccgggt tgatggccac gacagagccg 1680

tcgtaggtcc aggtgcccag cttcatgctg cagttctgtt catcaaaggg aaagtgggtg 1740

acgatgatct cacagtagct tttaaagatg gctggaggtg tccacgtgat gtggccagtg 1800

tactgcagga gcactttggt gaacttgaca atagcaaagt caccatctgc attgttatag 1860

agaacaaggt ctgggcgcca gatcttttct gaaggaatgt gaattttttt cacaccgcca 1920

tagtcatctg gattccattt taggttgtaa tccacccatt gctgtttcag acgcacattg 1980

gttgtcacga tctgatttac ttcatccaca ttgatgagct gtatcagctg caggcccacg 2040

gtgacctcca cgacctggcg gtggtcttcc actggccgca ccacgctgct gtagtcttta 2100

aatagctttg ccaccagacg ggtctcatgt tcggagccca ggacgaggcc agctgagcaa 2160

aggctaaaga gcaggaggag aggccagggc tccatggcga tcgcggcggc agatctcctc 2220

ggtaccggat ccagtcgacg aattcccggc cgccctatag tgagtcgtat tacaaaattc 2280

tgacggtcac taaacgagct ctgctattgt cactcgga 2318

<210> 2

<211> 2453

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgaatggc actaatagca gagctcgttt agtgaccgtc agaattttgt aatacgactc 60

actatagggc ggccgggaat tcgtcgactg gatccggtac cgaggagatc tgccgccgcg 120

atcgccatga ccccaggggc tctgctgatg ctgctggggg cgctgggggc gccgctcgcc 180

ccaggcgtcc gcggctcgga ggcggagggt cgactccggg agaaactttt ctctggctat 240

gatagctccg tgcggccagc gcgggaggtg ggagaccgtg tcagggtcag cgttggtctc 300

atcctggcgc aactcatcag cctgaacgag aaggatgaag agatgagcac aaaggtgtac 360

ttagacctgg agtggactga ctacaggctg agctgggacc ctgcggagca cgacggcatc 420

gattcgctcc gcatcacggc ggaatccgtg tggctccctg acgtggtgct actgaacaac 480

aatgatggga attttgacgt ggctctggac attagcgtcg tggtgtcctc cgacggctcc 540

gtgcgttggc aacccccggg catctatcgc agcagctgca gcatccaggt cacctacttc 600

cccttcgact ggcagaattg cactatggtg ttcagctcct acagctacga cagctcggag 660

gtcagcctgc agacaggcct gggtcctgac gggcaagggc atcaggaaat ccacattcat 720

gaagggactt tcattgagaa tggccagtgg gagattatcc acaagccctc tcggctaatc 780

cagcctccag gcgatcctag gggagggagg gaaggacagc gccaggaagt catcttctac 840

ctcatcatcc gccgcaagcc tctcttctac ctggtcaacg tcattgcccc atgcatcctc 900

atcactcttc tggccatctt cgtcttctac ctgccaccag atgcaggaga gaagatgggg 960

ctctcaatct ttgccctgct gacccttact gtgttcctgc tgctgctggc tgacaaagta 1020

cctgagacct cactatcagt acccattatt atcaagtacc tcatgtttac catggtcctc 1080

gtcaccttct cagtcatcct tagtgtcgtg gttctcaacc tgcaccaccg ctcaccccac 1140

acccaccaaa tgcccctttg ggtccgtcag atcttcattc acaaacttcc gctgtacctg 1200

cgtctaaaaa ggcccaaacc cgagagagac ctgatgccgg agccccctca ctgttcttct 1260

ccaggaagtg gctggggtcg gggaacagat gaatatttca tccggaagcc gccaagtgat 1320

tttctcttcc ccaaacccaa taggttccag cctgaactgt ctgcccctga tctgcggcga 1380

tttatcgatg gtccaaaccg ggctgtggcc ctgcttccgg agctacggga ggtcgtctcc 1440

tctatcagct acatcgctcg acagctgcag gaacaggagg accacgatgc gctgaaggag 1500

gactggcagt ttgtggccat ggtagtggac cgcctcttcc tgtggacttt catcatcttc 1560

accagcgttg ggaccctagt catcttcctg gacgccacgt accacttgcc ccctccagac 1620

ccctttccta cgcgtacgcg gccgctcgag atggagagcg acgagagcgg cctgcccgcc 1680

atggagatcg agtgccgcat caccggcacc ctgaacggcg tggagttcga gctggtgggc 1740

ggcggagagg gcacccccga gcagggccgc atgaccaaca agatgaagag caccaaaggc 1800

gccctgacct tcagccccta cctgctgagc cacgtgatgg gctacggctt ctaccacttc 1860

ggcacctacc ccagcggcta cgagaacccc ttcctgcacg ccatcaacaa cggcggctac 1920

accaacaccc gcatcgagaa gtacgaggac ggcggcgtgc tgcacgtgag cttcagctac 1980

cgctacgagg ccggccgcgt gatcggcgac ttcaaggtga tgggcaccgg cttccccgag 2040

gacagcgtga tcttcaccga caagatcatc cgcagcaacg ccaccgtgga gcacctgcac 2100

cccatgggcg ataacgatct ggatggcagc ttcacccgca ccttcagcct gcgcgacggc 2160

ggctactaca gctccgtggt ggacagccac atgcacttca agagcgccat ccaccccagc 2220

atcctgcaga acgggggccc catgttcgcc ttccgccgcg tggaggagga tcacagcaac 2280

accgagctgg gcatcgtgga gtaccagcac gccttcaaga ccccggatgc agatgccggt 2340

gaagaaagag tttaaacggc cggccgcggt catagctgtt tcctgaacag atcccgggtg 2400

gcatccctgt gacccctccc cagtgcctct cctgccctga atgaatctac tgg 2453

<210> 3

<211> 2499

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggtggata atagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga attttgtaat acgactcact 60

atagggcggc cgggaattcg tcgactggat ccggtaccga ggagatctgc cgccgcgatc 120

gccatggagg ggccagtgct gacactgggg ctgctggctg ccctggcggt gtgtggcagc 180

tgggggctga acgaggagga gcggctgatc cggcacctgt ttcaagagaa gggctacaac 240

aaggagctcc ggcccgtggc acacaaagag gagagtgtgg acgttgccct ggccctcaca 300

ctctccaacc tcatctccct gaaagaagtt gaggagaccc tcactaccaa tgtgtggata 360

gagcacggct ggacagacaa ccggctgaag tggaatgctg aagaatttgg aaacatcagt 420

gtcctgcgcc tccccccgga catggtgtgg ctcccagaga ttgtgctgga gaacaacaat 480

gacggctcct tccagatctc ctactcctgc aacgtgcttg tctaccacta cggcttcgtg 540

tactggctgc cacctgccat cttccgctcc tcctgcccca tctctgtcac ctatttcccc 600

ttcgactggc agaactgctc cctcaagttc agttccctca agtatacggc caaagagatc 660

accctgagcc tgaaacagga tgccaaggag aaccgcacct accccgtgga gtggatcatc 720

attgatcctg aaggcttcac agagaacggg gagtgggaga tagtccaccg gccggccagg 780

gtcaacgtgg accccagagc ccctctggac agccccagcc gccaggacat caccttctac 840

ctcatcatcc gccgcaagcc cctcttctac atcatcaaca tcctggtgcc ctgcgtgctc 900

atctccttca tggtcaacct ggtcttctac ctaccggctg acagtggtga gaagacatca 960

gtggccatct cggtgctcct ggctcagtct gtcttcctgc tgctcatctc caagcgtctg 1020

cctgccacat ccatggccat cccccttatc ggcaagttcc tgctcttcgg catggtgctg 1080

gtcaccatgg ttgtggtgat ctgtgtcatc gtgctcaaca tccacttccg aacacccagc 1140

acccatgtgc tgtctgaggg ggtcaagaag ctcttcctgg agaccctgcc ggagctcctg 1200

cacatgtccc gcccagcaga ggatggaccc agccctgggg ccctggtgcg gaggagcagc 1260

tccctgggat acatctccaa ggccgaggag tacttcctgc tcaagtcccg cagtgacctc 1320

atgttcgaga agcagtcaga gcggcatggg ctggccaggc gcctcaccac tgcacgccgg 1380

cccccagcaa gctctgagca ggcccagcag gaactcttca atgagctgaa gccagctgtg 1440

gatggggcaa acttcattgt taaccacatg agggaccaga acaattacaa tgaggagaaa 1500

gacagctgga accgagtggc ccgcacagtg gaccgcctct gcctgtttgt ggtgacgcct 1560

gtcatggtgg tgggcacagc ctggatcttc ctgcagggcg tttacaacca gccaccaccc 1620

cagccttttc ctggggaccc ctactcctac aacgtgcagg acaagcgctt catcacgcgt 1680

acgcggccgc tcgagatgga gagcgacgag agcggcctgc ccgccatgga gatcgagtgc 1740

cgcatcaccg gcaccctgaa cggcgtggag ttcgagctgg tgggcggcgg agagggcacc 1800

cccgagcagg gccgcatgac caacaagatg aagagcacca aaggcgccct gaccttcagc 1860

ccctacctgc tgagccacgt gatgggctac ggcttctacc acttcggcac ctaccccagc 1920

ggctacgaga accccttcct gcacgccatc aacaacggcg gctacaccaa cacccgcatc 1980

gagaagtacg aggacggcgg cgtgctgcac gtgagcttca gctaccgcta cgaggccggc 2040

cgcgtgatcg gcgacttcaa ggtgatgggc accggcttcc ccgaggacag cgtgatcttc 2100

accgacaaga tcatccgcag caacgccacc gtggagcacc tgcaccccat gggcgataac 2160

gatctggatg gcagcttcac ccgcaccttc agcctgcgcg acggcggcta ctacagctcc 2220

gtggtggaca gccacatgca cttcaagagc gccatccacc ccagcatcct gcagaacggg 2280

ggccccatgt tcgccttccg ccgcgtggag gaggatcaca gcaacaccga gctgggcatc 2340

gtggagtacc agcacgcctt caagaccccg gatgcagatg ccggtgaaga aagagtttaa 2400

acggccggcc gcggtcatag ctgtttcctg aacagatccc gggtggcatc cctgtgaccc 2460

ctccccagtg cctctcctgc cctgaatgtg aaaagctgg 2499

<210> 4

<211> 2429

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgaatggga caatagcaga gctcgtttag tgaccgtcag aattttgtaa tacgactcac 60

tatagggcgg ccgggaattc gtcgactgga tccggtaccg aggagatctg ccgccgcgat 120

cgccatggca agggctccgc ttggggtcct gctcctcttg gggcttctcg gcaggggtgt 180

ggggaagaac gaggaactgc gtctttatca ccatctcttc aacaactatg acccaggaag 240

ccggccagtg cgggagcctg aggatactgt caccatcagc ctcaaggtca ccctgacgaa 300

tctcatctca ctgaatgaaa aagaggagac tctcaccact agcgtctgga ttggaatcga 360

ttggcaggat taccgactca actacagcaa ggacgacttt gggggtatag aaaccctgcg 420

agtcccttca gaactcgtgt ggctgccaga gattgtgctg gaaaacaata ttgatggcca 480

gttcggagtg gcctacgacg ccaacgtgct cgtctacgag ggcggctccg tgacgtggct 540

gcctccggcc atctaccgca gcgtctgcgc agtggaggtc acctacttcc ccttcgattg 600

gcagaactgt tcgcttattt tccgctctca gacgtacaat gccgaagagg tggagttcac 660

ttttgccgta gacaacgacg gcaagaccat caacaagatc gacatcgaca cagaggccta 720

tactgagaac ggcgagtggg ccatcgactt ctgcccgggg gtgatccgcc gccaccacgg 780

tggcgccacc gacggcccag gggagactga cgtcatctac tcgctcatca tccgccggaa 840

gccgctcttc tacgtcatta acatcatcgt gccctgtgtg ctcatctcgg gcctggtgct 900

gctcgcctac ttcctgccgg cgcaggccgg cggccagaaa tgcacggtct ccatcaacgt 960

cctgctcgcc cagaccgtct tcttgttcct cattgcccag aaaatcccag agacttctct 1020

gagcgtgccg ctcctgggca ggttccttat tttcgtcatg gtggtcgcca cgctcattgt 1080

catgaattgc gtcatcgtgc tcaacgtgtc ccagcggacg cccaccaccc acgccatgtc 1140

cccgcggctg cgccacgttc tcctggagct gctgccgcgc ctcctgggct ccccgccgcc 1200

gcccgaggcc ccccgggccg cctcgccccc aaggcgggcg tcgtcggtgg gcttattgct 1260

ccgcgcggag gagctgatac tgaaaaagcc acggagcgag ctcgtgtttg aggggcagag 1320

gcaccggcag gggacctgga cggctgcctt ctgccagagc ctgggcgccg ccgcccccga 1380

ggtccgctgc tgtgtggatg ccgtgaactt cgtggccgag agcacgagag atcaggaggc 1440

caccggcgag gaagtgtccg actgggtgcg catggggaat gcccttgaca acatctgctt 1500

ctgggccgct ctggtgctct tcagcgtggg ctccagcctc atcttcctcg gggcctactt 1560

caaccgagtg cctgatctcc cctacgcgcc gtgtatccag cctacgcgta cgcggccgct 1620

cgagatggag agcgacgaga gcggcctgcc cgccatggag atcgagtgcc gcatcaccgg 1680

caccctgaac ggcgtggagt tcgagctggt gggcggcgga gagggcaccc ccgagcaggg 1740

ccgcatgacc aacaagatga agagcaccaa aggcgccctg accttcagcc cctacctgct 1800

gagccacgtg atgggctacg gcttctacca cttcggcacc taccccagcg gctacgagaa 1860

ccccttcctg cacgccatca acaacggcgg ctacaccaac acccgcatcg agaagtacga 1920

ggacggcggc gtgctgcacg tgagcttcag ctaccgctac gaggccggcc gcgtgatcgg 1980

cgacttcaag gtgatgggca ccggcttccc cgaggacagc gtgatcttca ccgacaagat 2040

catccgcagc aacgccaccg tggagcacct gcaccccatg ggcgataacg atctggatgg 2100

cagcttcacc cgcaccttca gcctgcgcga cggcggctac tacagctccg tggtggacag 2160

ccacatgcac ttcaagagcg ccatccaccc cagcatcctg cagaacgggg gccccatgtt 2220

cgccttccgc cgcgtggagg aggatcacag caacaccgag ctgggcatcg tggagtacca 2280

gcacgccttc aagaccccgg atgcagatgc cggtgaagaa agagtttaaa cggccggccg 2340

cggtcatagc tgtttcctga acagatcccg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc 2400

ctctcctgcc ctgatggggt actgcccgg 2429

<210> 5

<211> 2498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaatgggag caatagcaga gctcgtttag tgaaccgtca gaattttgta atacgactca 60

ctatagggcg gccgggaatt cgtcgactgg atccggtacc gaggagatct gccgccgcga 120

tcgccatgca tgggggccag gggccgctgc tcctcctgct gctgctggct gtctgcctgg 180

gggcccaggg ccggaaccag gaggagcgcc tgctcgcaga cctgatgcaa aactacgacc 240

ccaacctgcg gcccgcggaa cgagactcgg atgtggtcaa tgtcagcctg aagctaaccc 300

tcaccaacct catctccctg aacgagcgag aggaagccct caccaccaat gtctggatag 360

agatgcagtg gtgcgactat cgcctgcgct gggatccgcg agactacgaa ggcctgtggg 420

tgctgagggt gccgtccacc atggtgtggc ggccggatat cgtgctggag aacaacgtgg 480

acggtgtctt cgaggtggcc ctctactgca atgtgctcgt gtcccctgac ggctgtatct 540

actggctgcc gcctgccatc ttccgttccg cctgctctat ctcagtcacc tacttcccct 600

tcgactggca gaactgctcc cttatcttcc agtcccagac ttacagcacc aatgagattg 660

atctgcagct gagtcaggaa gatggccaga ccatcgagtg gattttcatt gaccctgagg 720

ccttcacaga gaatggggag tgggccatcc agcaccgacc agccaagatg ctcctggacc 780

cagcggcgcc agcccaggaa gcaggccacc agaaggtggt gttctacctg ctcatccagc 840

gcaagcccct cttctacgtc atcaacatca tcgccccctg tgtgctcatc tcctctgtcg 900

ccatcctcat ccacttcctt cctgccaagg ctgggggcca gaagtgtacc gtcgccatca 960

acgtgctcct ggcccagact gtcttcctct tccttgtggc caagaaggtg cctgaaacct 1020

cccaggcggt gccactcatc agcaagtacc tgaccttcct cctggtggtg accatcctca 1080

ttgtcgtgaa tgctgtggtt gtgctcaatg tctccttgcg gtctccacac acacactcca 1140

tggcccgagg ggtccgcaag gtgttcctga ggctcttgcc ccagctgctg aggatgcacg 1200

ttcgcccgct ggccccggca gctgtgcagg acacccagtc ccggctacag aatggctcct 1260

cgggatggtc gatcacaact ggggaggagg tggccctctg cctgcctcgc agtgaactcc 1320

tcttccagca gtggcagcgg caagggctgg tggcggcagc gctggagaag ctagagaaag 1380

gcccggagtt agggctgagc cagttctgtg gcagcctgaa gcaggctgcc ccagccatcc 1440

aggcctgtgt ggaagcctgc aacctcattg cctgtgcccg gcaccagcag agtcactttg 1500

acaatgggaa tgaggagtgg ttcctggtgg gccgagtgct ggaccgcgtc tgcttcctgg 1560

ccatgctctc gctcttcatc tgtggcacag ctggcatctt cctcatggcc cactacaacc 1620

gggtgccggc cctgccattc cctggagatc cacgccccta cctgccctca ccagacacgc 1680

gtacgcggcc gctcgagatg gagagcgacg agagcggcct gcccgccatg gagatcgagt 1740

gccgcatcac cggcaccctg aacggcgtgg agttcgagct ggtgggcggc ggagagggca 1800

cccccgagca gggccgcatg accaacaaga tgaagagcac caaaggcgcc ctgaccttca 1860

gcccctacct gctgagccac gtgatgggct acggcttcta ccacttcggc acctacccca 1920

gcggctacga gaaccccttc ctgcacgcca tcaacaacgg cggctacacc aacacccgca 1980

tcgagaagta cgaggacggc ggcgtgctgc acgtgagctt cagctaccgc tacgaggccg 2040

gccgcgtgat cggcgacttc aaggtgatgg gcaccggctt ccccgaggac agcgtgatct 2100

tcaccgacaa gatcatccgc agcaacgcca ccgtggagca cctgcacccc atgggcgata 2160

acgatctgga tggcagcttc acccgcacct tcagcctgcg cgacggcggc tactacagct 2220

ccgtggtgga cagccacatg cacttcaaga gcgccatcca ccccagcatc ctgcagaacg 2280

ggggccccat gttcgccttc cgccgcgtgg aggaggatca cagcaacacc gagctgggca 2340

tcgtggagta ccagcacgcc ttcaagaccc cggatgcaga tgccggtgaa gaaagagttt 2400

aaacggccgg ccgcggtcat agctgtttcc tgaacagatc ccgggtggca tccctgtgac 2460

ccctccccag tgcctctcct gacgctgacc gcctccca 2498

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attgcgatcg ccatggagcc ctggcct 27

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgacgcgttc cttgctgatt taattcaatg agtcgacc 38

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attgcgatcg ccatgacccc aggggct 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgacgcgtag gaaaggggtc tggagg 26

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attgcgatcg ccatggaggg gccagtg 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgacgcgtga tgaagcgctt gtcctgc 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attgcgatcg ccatggcaag ggctccg 27

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgacgcgtag gctggataca cggcgcgta 29

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

attgcgatcg ccatgcatgg gggccagg 28

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgacgcgtgt ctggtgaggg caggta 26

Claims (4)

1.针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括细胞检测组件、固定液、通透液、封闭液、洗涤液、阳性对照、阴性对照以及DyLight 594偶联的羊抗人IgGFc二抗；

所述细胞检测组件的制备包括以下步骤：

S1：获取AChR单亚基的目的基因；

S2：将步骤S1得到的AChR单亚基目的基因分别与荧光标记载体连接，构建得到真核表达质粒；

S3：将步骤S2得到的真核表达质粒分别转染细胞，得到含荧光标记的AChR单亚基抗原的转染细胞，即细胞检测组件；

所述AChR单亚基分别为α₁、β₁、δ、ε、γ，所述荧光标记载体为pCMV6-AC-GFP；

所述S2包括以下步骤：

(1)将pCMV6-AC-GFP载体进行双酶切、胶回收得到纯化的pCMV6-AC-GFP载体片段，将步骤S1得到的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因片段分别和纯化的pCMV6-AC-GFP载体片段连接，得到五种连接产物；

(2)将步骤(1)得到的五种连接产物转化感受态细胞得到五种转化产物，然后将五种转化产物涂布于培养板中，每种均挑选单菌落增菌培养；提取质粒，分别得到五种真核表达质粒pCMV6-AC-GFP-α₁、pCMV6-AC-GFP-β₁、pCMV6-AC-GFP-δ、pCMV6-AC-GFP-ε、pCMV6-AC-GFP-γ；

所述检测试剂盒在使用时，操作过程包括：(A)将步骤S3得到的细胞检测组件进一步固定、通透、封闭；(B)将步骤(A)得到的细胞与待测血清共同孵育，进行免疫反应；

所述步骤(B)的过程包括：(a)将血清标本进行比例稀释；(b)将步骤(A)通透、封闭后的细胞与步骤(a)稀释后的血清混合并共同孵育；(c)步骤(b)孵育完成后对细胞进行洗涤，然后加入DyLight 594偶联的羊抗人IgG Fc二抗孵育，孵育完成后再次洗涤，使用荧光显微镜进行观察。

2.如权利要求1所述的针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述S1包括以下步骤：

(1)从肝脏细胞系中提取的总RNA为模板反转录得到cDNA；

(2)通过NCBI检索关键词CHRNA1、CHRNB1、CHRND、CHRNE、CHRNG，分别得到人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因对应的mRNA转录本，根据选定的mRNA转录本的CDS设计相应的上游引物和下游引物，PCR扩增步骤(1)得到的cDNA得到相应的人AChR亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因；

(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后的人AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因；并将纯化后的α₁、β₁、δ、ε、γ目的基因进行双酶切。

3.如权利要求2所述的针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述α₁的上游引物为ATTGCGATCGCCATGGAGCCCTGGCCT，下游引物为CGACGCGTTCCTTGCTGATTTAATTCAATGAGTCGACC；

β₁的上游引物为ATTGCGATCGCCATGACCCCAGGGGCT，下游引物为CGACGCGTAGGAAAGGGGTCTGGAGG；

δ的上游引物为ATTGCGATCGCCATGGAGGGGCCAGTG，下游引物为CGACGCGTGATGAAGCGCTTGTCCTGC；

ε的上游引物为ATTGCGATCGCCATGGCAAGGGCTCCG，下游引物为CGACGCGTAGGCTGGATACACGGCGCGTA；

γ的上游引物为ATTGCGATCGCCATGCATGGGGGCCAGG，下游引物为CGACGCGTGTCTGGTGAGGGCAGGTA。

4.如权利要求1所述的针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述S3包括以下步骤：接种HEK293细胞至培养系统中，当细胞融合度为50％时将步骤S2得到的五种真核表达质粒用转染试剂分别转染细胞，分别得到含荧光标记的AChR单亚基α₁、β₁、δ、ε、γ抗原的转染细胞，即细胞检测组件。

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