CN117362438B - 一种抗relt重组单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及化学免疫学技术领域，尤其涉及一种抗RELT重组单克隆抗体及其制备方法和应用；所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；其中，单克隆抗体体具有中和RELT功能的生物活性；该抗RELT重组单克隆抗体能够与RELT蛋白分子的结合具有高特异性和高灵敏度，同时由于该抗RELT重组单克隆抗体具有中和RELT功能的生物活性，因此该抗RELT重组单克隆抗体能够特异性地识别和检测不同组织及细胞上RELT蛋白的表达，并在检测RELT蛋白时呈阳性高表达，可以避免多杂带的缺陷，有利于提高检测或评估的准确性和可靠性。

Description

一种抗RELT重组单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及化学免疫学技术领域，尤其涉及一种抗RELT重组单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
RELT(Receptor Expressed on Lymphoid Tissues)是一种分子量为43kDa的膜受体蛋白，隶属于TNF受体超家族(TNF Receptor Superfamily,TNFRSF)，又被称作TNFRSF19L。RELT胞外段含三个保守的富含半胱氨酸结构域，而胞内段缺乏死亡结构域，因此属于非死亡受体的范畴。与TNF受体超家族其他成员一样，RELT以膜结合态和游离态两种形式存在，其中从膜结合态向游离态的转变以胞外段脱落(Ectodomain Shedding)的方式实现，在该过程中，RELT胞外近膜部分第137位氨基酸可被剪切释放，成为可溶性的sRELT(Soluble RELT)，这上述过程由基质金属蛋白酶(Metalloprotease)和解整联素(Disintegrin)家族成员ADAM17，ADAM9，ADAM10，ADAM19，MMP7，Elastase，Proteinase 3等介导完成。RELT高表达于免疫细胞如T细胞、树突状细胞(Dendritic cell，DC)中，且与免疫系统活化密切相关；另有现有研究发现肿瘤患者的血清游离可溶性RELT(Soluble RELT,sRELT)会显著增加，这提示RELT可能是肿瘤的潜在早期诊断标志物，因此RELT有望成为干预自身免疫病和肿瘤等免疫相关疾病的新靶点。
现阶段除RELT外，其他所有的28种TNFRSF家族成员均已鉴定到与之相对应的配体及下游信号通路，但由于目前在售的RELT抗体存在效价比低、特异性差等问题，难以满足于细胞水平和组织水平RELT蛋白检测的需求，例如在实际应用中，RELT抗体产品(MAB1385)由于诱导RELT蛋白多克隆抗体的抗原多肽序列的设计原因，使得其特异性不佳，检测时存在多杂带的缺陷；因此如何提供一种优质可靠且准确的抗RELT重组单克隆抗体是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种抗RELT重组单克隆抗体及其制备方法和应用，以解决现有技术中RELT抗体所存在效价比低和特异性差的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种抗RELT重组单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
其中，所述单克隆抗体体具有中和RELT功能的生物活性。
可选的，所述单克隆抗体是由特定抗原免疫淋巴细胞得到的，所述特定抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本申请提供了一种编码基因，所述基因包括编码第一方面所述的单克隆抗体的基因组，所述基因组包括编码重链可变区的第一基因片段和编码轻链可变区的第二基因片段；
所述第一基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第二基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第三方面，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括第二方面所述的编码基因。
第四方面，本申请提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括第三方面所述的核酸分子，所述重组表达载体包括重组质粒。
第五方面，本申请提供了一种制备第四方面所述的重组表达载体的制备方法，所述制备方法包括：
采用引物组对第三方面所述的核酸分子进行PCR扩增，得到扩增产物；
向表达载体上克隆所述扩增产物，得到重组表达载体；
其中，所述引物组包括重链可变区引物组和轻链可变区引物对。
第六方面，本申请提供了一种抗RELT重组单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：
采用第四方面所述的重组表达载体转染细胞，并进行培养，得到细胞培养液；
收集所述细胞培养液的上清液，并进行纯化，得到抗RELT重组单克隆抗体。
第七方面，本申请提供了一种RELT蛋白分子检测装置，所述检测装置的生物成分包括第一方面所述的单克隆抗体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的核酸分子和第四方面所述的重组表达载体中的至少一种，所述检测装置包括检测试剂盒、抗体芯片和抗体探针中的至少一种。
第八方面，本申请提供了一种抗RELT重组单克隆抗体的应用，所述应用包括将第一方面所述的单克隆抗体用于制备对自身免疫性疾病的治疗药物中。
可选的，所述自身免疫性疾病包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、多发性硬化病、桥本氏甲状腺炎、原发性黏液性水肿、甲状腺功能亢进、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、萎缩性胃炎和自身免疫性肾小球肾炎中的至少一种。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种抗RELT重组单克隆抗体，由于重链可变区和轻链可变区中都含有与抗原特异性识别并与之结合的结合域，通过针对RELT抗原的氨基酸序列进行优化和设计，并以此针对RELT抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别进行设计，可以使得该抗RELT重组单克隆抗体能够与RELT蛋白分子的结合具有高特异性和高灵敏度，同时由于该抗RELT重组单克隆抗体具有中和RELT功能的生物活性，因此该抗RELT重组单克隆抗体能够特异性地识别和检测不同组织及细胞上RELT蛋白的表达，并在检测RELT蛋白时呈阳性高表达，可以避免多杂带的缺陷，有利于提高检测或评估的准确性和可靠性。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一种抗RELT重组单克隆抗体制备方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的一种重组表达载体制备方法的流程示意图；
图3为本申请实施例提供的采用兔子制备抗RELT重组单克隆抗体的方法流程示意图；
图4为本申请实施例提供的RELT蛋白抗原性分析结果示意图；
图5为本申请实施例提供的三次免疫后不同兔子血清效价ELISA检测的统计图；
图6为本申请实施例提供的抗RELT重组单克隆抗体的纯度检测结果示意图；
图7为本申请实施例提供的抗RELT重组单克隆抗体与市售RELT抗体的Westernblotting检测指标对比图；
图8为本申请实施例提供的抗RELT重组单克隆抗体的免疫荧光检测结果示意图；
图9为本申请实施例提供的抗RELT重组单克隆抗体对T细胞活化及分化的影响示意图；
图10为本申请实施例提供的抗RELT重组单克隆抗体减缓NOD小鼠自发糖尿病进展的示意。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。同时“受试者”、“个体”或“患者”在本申请中可互换使用，其是指脊椎动物，尤其是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于鼠类、猴子、人类，农场动物，运动动物和宠物，还包括体外获得的或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如图1所示，本申请实施例提供了一种抗RELT重组单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
其中，所述单克隆抗体体具有中和RELT功能的生物活性。
本申请实施例中，针对该抗RELT重组单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列进行分别设计，可以避免单独设计重链可变区或轻链可变区导致最终结合形成的抗体存在不稳定表达的情况，同时还能提高该单克隆抗体识别不同组织及细胞上RELT蛋白的特异性和灵敏度，并使得该抗RELT重组单克隆抗体具有中和RELT的生物活性。
需要说明的是，由于该抗RELT重组单克隆抗体的高特异性和高灵敏度，因此在用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(WB)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域中，可以准确且可靠的检测出不同组织及细胞上RELT蛋白的表达。
同时该抗RELT重组单克隆抗体所具有的上述特性还使得其能够识别重组RELT抗原蛋白和不同组织及细胞上的RELT分子，因此该抗RELT重组单克隆抗体还可以应用在免疫组化病理诊断剂以及ELISAkit批量生产中。
在一些可选的实施方式中，所述单克隆抗体是由特定抗原免疫淋巴细胞得到的，所述特定抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本申请实施例中，该特定抗原是通过对RELT分子序列进行分析，并依据RELT蛋白分子在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构后进行选择性设计得到的多肽序列，设计结果如图4所示。
在免疫淋巴细胞前，先通过人工合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，再将合成的多肽作为免疫用特定抗原的原料；免疫淋巴细胞时，将该多肽经与载体蛋白KLH或OVA偶联制备成完全抗原，以此作为免疫原来免疫动物模型。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供了一种编码基因，所述基因包括编码所述单克隆抗体的基因组，所述基因组包括编码重链可变区的第一基因片段和编码轻链可变区的第二基因片段；
所述第一基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第二基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本申请实施例中，在设计的抗RELT重组单克隆抗体的基础上，进一步引入编码重链可变区的第一基因片段和编码轻链可变区的第二基因片段，可以在实际生产过程选择性的利用编码基因直接翻译和表达出如SEQ ID NO.4所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQID NO.5所示的轻链可变区氨基酸序列，进而可以得到完整的抗RELT重组单克隆抗体。
该编码基因是基于上述单克隆抗体来实现，该单克隆抗体的具体组成和序列信息可参照上述实施例，由于该编码基因采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括所述编码基因。
该核酸分子是基于上述编码基因来实现，该编码基因的具体序列信息可参照上述实施例，由于该核酸分子采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括所述核酸分子，所述重组表达载体包括重组质粒。
该重组表达载体是基于上述核酸分子来实现，该核酸分子的具体序列信息可参照上述实施例，由于该重组表达载体采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
如图2所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供了一种制备所述重组表达载体的制备方法，所述制备方法包括：
S1.采用引物组对所述核酸分子进行PCR扩增，得到扩增产物；
S2.向表达载体上克隆所述扩增产物，得到重组表达载体；
其中，所述引物组包括重链可变区引物组和轻链可变区引物对。
该方法是针对上述重组表达载体的制备方法，该重组表达载体的具体组成和序列信息可参照上述实施例，由于该方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
如图1所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种抗RELT重组单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：
S1.采用所述重组表达载体转染细胞，并进行培养，得到细胞培养液；
S2.收集所述细胞培养液的上清液，并进行纯化，得到抗RELT重组单克隆抗体。
该方法是针对上述重组表达载体的制备方法，该重组表达载体的具体组成和序列信息可参照上述实施例，由于该方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
需要说明的是该制备方法的具体流程为：
(1)免疫兔子：先对RELT蛋白分子序列进行分析(包括氨基酸序列特异性与保守性分析、蛋白可表达性分析、蛋白抗原性分析)，依据RELT在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择32aa～169aa多肽序列作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后作为免疫原，免疫兔子；该多肽序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，是经过人工合成所得的多肽序列；
(2)筛选抗原特异性B细胞：取免疫兔子的外周血样品、经外周血B细胞分离、阳性B细胞分选，获得可高效分泌抗体的单个阳性B淋巴细胞，从单个阳性B淋巴细胞分离出总RNA；
(3)获得抗体序列：利用特异性的引物组，通过PCR扩增技术获得如SEQ ID NO.2所示的抗体重链可变区核苷酸序列和如SEQ ID NO.3所示的抗体轻链可变区核苷酸序列；该引物组包括重链可变区引物组和轻链可变区引物对，其中，重链可变区引物对的上游引物如SEQ ID NO.6所示，重链可变区引物对的下游引物如SEQ ID NO.7所示；所述轻链可变区引物对的上游引物如SEQ ID NO.8所示，所述轻链可变区引物对的下游引物如SEQ ID NO.9所示；
(4)抗体表达和纯化：将上述核苷酸序列克隆至表达载体中，使用转染试剂瞬时转染培养的HEK293F细胞，培养扩增后收集细胞上清，使用Protein A纯化上清液，得到纯度＞95％抗RELT重组单克隆抗体。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供了一种RELT蛋白分子检测装置，所述检测装置的生物成分包括所述单克隆抗体、所述编码基因、所述核酸分子和所述重组表达载体中的至少一种，所述检测装置包括检测试剂盒、抗体芯片和抗体探针中的至少一种。
该RELT蛋白分子检测装置是基于上述单克隆抗体、编码基因、核酸分子或重组表达载体来实现的，该单克隆抗体、编码基因、核酸分子或重组表达载体的具体序列信息可参照上述实施例，由于该RELT蛋白分子检测装置采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供了一种抗RELT重组单克隆抗体的应用，所述应用包括将所述单克隆抗体用于制备对自身免疫性疾病的治疗药物中；
其中，所述自身免疫性疾病包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、多发性硬化病、桥本氏甲状腺炎、原发性黏液性水肿、甲状腺功能亢进、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、萎缩性胃炎和自身免疫性肾小球肾炎中的至少一种。
该应用是基于上述抗RELT重组单克隆抗体来实现，该抗RELT重组单克隆抗体的具体序列信息和组成可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例中所用实验动物都根据《医学实验动物管理实施细则》对小鼠进行处理，同时各个实验动物如NOD小鼠、C57BL/6小鼠、NOD-SCID小鼠等都在SPF级动物设施中维持。
实施例1
抗RELT重组单克隆抗体的制备和筛选流程：
(1)抗原制备：
通过对RELT分子序列进行分析，依据RELT蛋白分子在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构后进行选择性设计，结果如图4所示，依据图4所示的结果选择32aa～169aa的肽段合成免疫抗原的多肽，该多肽序列为：PTPITPWLCPPGKEPDPDPGQGTLCRT CPPGTFSASWNSYPCQPHYRCSLQKRLEAQAGTATHDTMCGDCQHGWFGPQGVPHVPCQP CSKAPPSTGGCDESGRRGRRGVEVAAGTSSNGEPRQPGNGTRAGGPEETAA(SEQ IDNo.1)。
免疫时，将该多肽经与偶联蛋白KLH或OVA偶联制备成完全抗原，作为免疫原对兔子进行免疫。
(2)完全抗原免疫动物：
将含有SEQ ID NO:1所示多肽序列完全抗原(RELT抗原)分别与完全弗氏佐剂混合并乳化，采用皮下注射方法分别免疫多只新西兰大白兔，间隔两周后再将该RELT抗原与不完全弗氏佐剂混合并乳化，后进行第二次免疫；
随后间隔4周后进行第三次免疫，三次免疫后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价，结果如图5所示；
选取RELT抗原免疫抗体效价最高的兔子(E19399)，间隔1周进行第四次免疫；再次间隔1周进行第五次免疫；至此完成标准63天免疫过程，进行下一步的阳性单个B细胞分离。
(3)单个B细胞分离：
待第五次免疫结束后，安乐死兔子，随后分离脾脏，组织剪剪碎后过70μm滤网，裂解红细胞获得脾脏单细胞悬液，流式抗体(CD3-PE，CD4-PE，CD8-PE，CD11B-PE，CD11C-PE，MHCII-PE以及CD19-APC)和生物素标记抗原RELT-biotin-FITC标记后，利用流式细胞仪分选出特异识别抗原的阳性B细胞lin(CD3、CD4、CD8、CD11B、CD11C、MHCII)-CD19+RELT-biotin+，分选出特异识别抗原的单个B细胞阳性克隆。
(4)筛选最佳阳性B细胞克隆：
培养分选出的1000个单一B淋巴细胞克隆(经抗原富集)；每个阳性克隆B淋巴细胞单独培养，置于37℃、浓度为5％的CO2的培养箱中，培养3～5天后收取细胞悬液，离心后取上清进行ELISA检测，筛选出效价最好的特异识别抗原的阳性B克隆，记录为E19399-5B2。
(5)E19399-5B2淋巴细胞抗体序列克隆：
从E19399-5B2阳性B淋巴细胞中分离出总RNA，依据TaKaRa反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)说明书，将总RNA逆转录成cDNA，利用特异性引物组(重链可变区引物对，VH-F：AGACTGGGCTGCGCTGGCTTC，VH-R：GTGAGGGTGCCCGAG；轻链可变区引物对：VK-F：ATGGACAYGAGGGCCCCCACTC，VK-R:GGTGGGAAGATGAGGACAGTAGG)扩增抗体序列，随后基因测序获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列，然后将抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列克隆至真核表达载体pCDNA3.4中，完成抗体克隆工作，可供后续细胞转染使用。
(6)细胞转染与单抗的制备及纯化：
使用HEK 293F悬浮细胞进行转染：提前准备好待转染用的HEK293F细胞，离心换新鲜的培养基后分别放入24孔板中，按所需要的数量设置每孔1.5mL、密度为3*106个/mL。
将制备的pCDNA3.4真核表达载体与PEI按比例1:6混合后加入到准备好的HEK293F细胞中，置于37℃、浓度为5％的CO2的摇床中培养。培养3～5天后，收取细胞悬液，离心后取上清，使用Protein A纯化上清液，得到纯度＞95％的抗体，检测结果如图6所示。纯化后的单抗浓度测定、分装、于4℃～8℃的冰箱中保存。
最终E19399-5B2抗RELT重组兔单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由如SEQ IDNo.2所示的DNA序列所编码，抗RELT重组兔单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由如SEQID No.3所示的DNA序列所编码，具体序列如下：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTACTCAGAGGTGTCCAGTGT
CAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTCTTCAAGCCAACGGATACCCTGACACTCAC
CTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTATGCAATGTCCTGGGTCCGCCAGACTCC
AGGGATTGGGCTGGAGTGGATCGGGATCGTTAATGTTGCTGGTGATACAGCCTACGCGA
GCTGGGCGATGAGCCGATCCACCATCACCAGAAACACCAACGACAACACGGTGACTCTG
AAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTACACGACATGGTGA
GAATATTGGTGACATGTGGGGCCCAGGCACCCTGATTGCCGTCTCCTCAGTGCCTGCAAC
CCCCCCGATCATCTTCCCGCTGACCTGCCCCGGGTGTGTACTGAAAGACACTTCAGCGAC
CATTGTCGCCGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGA
ACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCC
TCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAAC
GTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAG
CAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCC
AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG
ACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTG
CGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAG
CACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCC
ACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCC
CTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGT
CAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAA
GAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGC
TCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTC
TTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCC
CGCTCTCCGGGTAAATAG(SEQ ID No.2)。
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCATCTGTGACCCTGTGATGACCCAGACTCCATCTTCCACGTCTGCGGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATGCTAACAACTACTTATCCTGGTTTCAGAAGAAACCAGGACAGCCTCCCAAGCAACTGATCTATGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCGCCTACTATTGTGCAGGCGGTTTTACTGGTGCGATTTTTCCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID No.3)。
将获得的两个碱基序列翻译成对应的氨基酸序列，分析并获得E19399-5B2抗RELT重组单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，E19399-5B2抗RELT重组单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.5所示：
METGLRWLLLVAVLRGVQCQSVKESGGGLFKPTDTLTLTCTVSGFSLSTYAMSWVRQTPGIGLEWIGIVNVAGDTAYASWAMSRSTITRNTNDNTVTLKMTSLTAADTATYFCTRHGENIGDMWGPGTLIAVSSVPATPPIIFPLTCPGCVLKDTSATIVAGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK*(SEQ ID No.4)。
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGAICDPVMTQTPSSTSAAVGGTVTINCQASQSVYANNYLS WFQKKPGQPPKQLIYDASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAAAYYCAGGFTGAIF PFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDG*
(SEQ ID No.5)
实施例2
在实施例1所得的抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2的基础上，进行后续实验：
将该抗RELT重组单克隆抗体作为一抗，采用Western blotting检测，具体步骤包括：
(1)提取小鼠CD4+细胞总蛋白，8％浓度胶上样20μL，恒压80V电泳，待marker分层后，将电压调至110V直至不同分子量蛋白充分分离。
(2)转膜：配制转膜液(200mL的甲醇+5.8g的Tris+2.9g的Gly，用dd水稀释至1000mL)，置于4℃冰箱预冷，将固定好的转膜夹放入转膜槽中，在转膜槽内倒满转膜液，最后将转膜槽放在装满冰的泡沫盒内，恒流180mA，转膜2.5h。
(3)封闭：TBST配置5％的牛奶，1h或4℃封闭过夜。
(4)一抗孵育：封闭结束后，TBST快速洗膜3遍。将抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2的浓度稀释成0.5μg/mL，再将封闭好的膜放入对应的已稀释抗体中，置4℃摇床孵育过夜；
(5)取出膜放入TBST液中洗涤5次(5×10min)；
(6)二抗孵育：将HRP-抗兔IgG用TBST以1:5000倍数稀释，混匀后加入膜条，室温孵育1h；
(7)取出膜条放在TBST液中洗涤5次(5×10min)；
(8)将ECL AB液按1:1混合(各0.5mL)，均匀地浇到PVDF膜上，孵育2min；
(9)曝光：干净的卫生纸润湿擦干显色暗盒，将膜铺在暗盒内，排除气泡，把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X光胶片作不同时间段的曝光；
(10)曝光：将胶片放在显影液中1min～3min后，用清水涮洗，随后放于定影液中约9min，最后65℃烤箱中烤干，根据marker确定目的条带，分析结果，结果如图7所示。
图7中条带大小为43kDa，由图可知，在泳道中抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2能够特异性的识别CD4+T细胞裂解液中的RELT蛋白，分子量在43kDa左右，说明本申请的抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2能够高特异性的识别RELT蛋白，且结合特异性显著优于市售的抗体。
实施例3
在实施例1所得的抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2的基础上，进行后续实验：
将该抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2作为一抗，进行免疫荧光检测，具体步骤包括：
(1)样本切片准备：将经10％中性甲醛固定石蜡包埋后的小鼠胰腺切片于60℃恒温箱中烤片1h～2h，保存备用。
(2)切片脱蜡置水：待组织上的石蜡充分溶解后，依次将玻片放于二甲苯Ⅰ(15min)、二甲苯Ⅱ(15min)、二甲苯Ⅲ(10min)、无水乙醇Ⅰ(5min)、无水乙醇Ⅱ(5min)、95％乙醇Ⅰ(5min)、95％乙醇Ⅱ(5min)、80％乙醇(5min)，最后置于流水(自来水)中冲洗2min，完成脱蜡置水。
(3)抗原修复：推荐使用高温热修复法修复，将玻片置于盛有柠檬酸钠修复液(弱酸性溶液，现配现用)的洗脱盒，再将洗脱盒放置于高压锅内，加热沸腾后5min即可。上述操作是由于醛类固定会导致蛋白交联，从而遮蔽抗原表位，并使得染色信号减弱，所以要进行抗原修复。
(4)自发荧光淬灭：加自发荧光淬灭剂A液孵育30min后用双蒸水洗5min，再加B液孵育5min，双蒸水洗5min，PBST冲洗一次。
(5)封闭：封闭液(取10％的BSA 100μL+驴血清50μL+850μL的PBS)室温封闭1h，封闭完不用洗，甩掉封闭液即可。
(6)一抗孵育：在玻片样本区域用组化笔画圈标记出组织，加入100μL的10ng/mL的抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育1h，PBST冲洗3次,每次5min。
(7)二抗孵育：采用1:200～1:400的稀释倍数稀释二抗(二抗稀释液为：封闭液稀释10倍后使用)室温孵育1h，孵育完毕后PBST冲洗片3次，每次5min，纯化水冲洗1次。
(8)染核：DAPI染核，浸没组织位置即可，2min～5min(不宜时间过久)，1xPBS洗，5minx3次。
(9)封片：加抗荧光淬灭剂对样品进行封片，荧光显微镜下观察结果如图8所示。
由图8结果所示，RELT蛋白在小鼠胰腺组织中呈绿色荧光信号，这说明本申请的抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2的特异性好、阳性信号强，因此可用于免疫荧光染色。
实施例4
在实施例1所得的抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2的基础上，进行后续实验：
将该抗RELT重组单克隆抗体进行中和功能的细胞实验验证，具体步骤包括：
(1)提前12h包被培养板：anti-αCD3(5μg/mL)+anti-αCD28(5μg/mL)包被培养板。
(2)T细胞分选：将B6背景小鼠安乐死，在酒精中泡5min，取小鼠脾脏置于1640中(小皿)；取出70μm滤网，置于50mL离心管上，取出1mL注射器的推子，将脾脏置于滤网上，加入少量1640以润洗滤网和脾脏，一边用推子研磨脾脏一边不断加入1640以充分将脾脏研磨成单细胞悬液取脾脏，裂解红细胞重悬后制备单细胞悬液，利用/>kit磁珠分选获得/>T细胞。
(3)于anti-αCD3/αCD28包被的细胞培养板，接种分选的T细胞培养12h，其中一组加入抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2抗体10μL，另一组为对照；检测T细胞活化标志物CD25和CD69的表达。结果如图9所示，加入抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2后可显著抑制T细胞活化。
(4)于anti-αCD3/αCD28包被的细胞培养板，接种分选的T细胞，并加入IL-2(10ng/mL)+IL-12(10ng/mL)培养72h，其中一组加入抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2抗体10μL，另一组为对照；检测T细胞亚群分化。
结果如图9所示，加入抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2后可显著抑制Th1细胞亚群分化。
实施例5
在实施例1所得的抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2的基础上，进行后续实验：
将该抗RELT重组单克隆抗体进行中和功能的动物模型实验验证，具体步骤包括：
(1)取8周龄NOD小鼠分别给予抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2(n＝15)或对照IgG(n＝15)(10mg每公斤体重，约合100μg每只小鼠)，腹腔注射，每周三次，共计给药两周，随后停止给药。
(2)停药后每周监测血糖，连续两次血糖水平超过12.8mM视作1型糖尿病发病；当其中一组发病率达到80％时，终止实验。
(3)对照组小鼠在14周龄即开始发病，30周龄时发病率达到80％；抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2处理组小鼠在18周龄开始发病，发病时间滞后且在30周龄时发病率仅45％，证明抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2对NOD小鼠自发糖尿病具有抑制作用，结果如图10所示。
由于抗RELT重组单克隆抗体E19399-5B2抗体具有中和RELT的生物活性，而如图10所示的细胞实验结果表明，该E19399-5B2抗体可显著抑制RELT功能活性；结合小鼠动物实验结果，证明该E19399-5B2抗体可以通过阻断RELT生物学功能，并抑制T细胞活化及Th1亚群分化，因此可以减缓1型糖尿病等自身免疫病疾病进展。
综上所述，本申请实施例提供的一种抗RELT重组单克隆抗体，该单克隆抗体应用广泛，能准确识别RELT的表达，同时经过多种不同方式的检测发现，该抗体可以特异性识别并结合RELT蛋白抗原表位，可应用于免疫组织化学(IHC)、间接ELISA、免疫印记(Westernblotting)、抗体芯片制备、流式细胞术等检测与筛查领域；需要特别强调的是，该单克隆抗体具有中和RELT的生物活性，且小鼠动物实验结果表明：该抗体可显著抑制RELT功能活性。
本申请实施例还公开了涉及制备抗RELT重组单克隆抗体所需的RELT抗原具体序列、抗RELT重组单克隆抗体的氨基酸序列、编码该RELT重组兔单克隆抗体的核苷酸序列、重组表达载体、制备方法及抗RELT重组单克隆抗体在RELT蛋白检测方法或装置中的应用等。
本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种抗RELT重组单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
其中，所述单克隆抗体具有中和RELT功能的生物活性。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是由特定抗原免疫淋巴细胞得到的，所述特定抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种抗RELT重组单克隆抗体的应用，其特征在于，所述应用为将如权利要求1或2所述的单克隆抗体用于制备对1型糖尿病的治疗药物中。
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