CN109666763A - 一种多重pcr检测eb病毒的试剂盒、用于检测评估eb病毒活性的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性的试剂盒及其制备方法。本发明通过两个特定的靶区域，设计特异性的引物和探针，实现对EBV‑DNA的准确检测；通过筛选特异性的抗体采用双抗体夹心的原理实现对EBNA‑1蛋白的准确检测。本发明将多重PCR检测EBV‑DNA及ELISA检测EBNA‑1蛋白联合使用，可以高效、特异的检测人血清中EBV在激活或潜伏感染状态下的病毒促癌活性，克服了现有试剂盒不能检测处于潜伏感染状态下的EBV病毒促癌活性，有利于EBV相关性肿瘤的疗效预测和预后判定。

Description

一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性 的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性的试剂盒及其制备方法。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种嗜人类B淋巴细胞的γ疱疹病毒，它是第 一个发现与人类肿瘤相关且普遍感染人类的疱疹病毒。随着分子生物学技术的进步及EBV 相关性肿瘤发病机制及预后因素研究的深入，越来越多的研究发现，EBV相关性肿瘤患者 EBV检测阳性率达90％以上，对EBV活性检测对于EBV相关性肿瘤的疗效预测和预后判定有重要意义。
目前多数应用PCR检测EBV-DNA复制来评估EBV促癌活性，但是目前PCR检测大 多是针对单一的目标区域，如EBNA-1区域或BamHI-W，由于EB病毒核酸拷贝数变异大， 特别是BamHI-W序列不同人群拷贝数差异很大，单独使用不能准确定量，对于复制期的 EBV感染较为敏感，但是对于潜伏感染的敏感性较差，而EBV相关肿瘤患者大多数的EBV 处于潜伏感染。对于潜伏期的病毒感染或既往感染，往往采用病毒抗原检测的办法评估 病毒感染情况，但大多数EBV抗原并不能有效反映病毒感染状态，却不能反应病毒活性。
因此，如何选择合适的基因靶区域进行PCR检测，并选择合适的目标病毒抗原进行检 测，实现联合检测，高效、特异的检测人血清中EBV在激活或潜伏感染状态下的病毒促癌活性，成为了目前亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一是提供一种多重PCR检测EB病毒的试 剂盒，以BamH1-w保守序列和LMP1序列结合作为靶基因区域，对EB病毒特异性的DNA 片段体现出良好的检测效果并且可以更准确检测EBV病毒阳性率。
本发明的目的之二是提供一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒，特定靶区域多重 PCR定量，结合特定病毒抗原检测，可以高效、特异的检测人血清中EBV在激活或潜伏 感染状态下的病毒促癌活性，克服了现有试剂盒不能检测处于潜伏感染状态下的EBV病 毒促癌活性，有利于EBV相关性肿瘤的疗效预测和预后判定。
同时，本发明的目的之三是提供一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒的制备方法。
一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒，包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对和内参探针；第一探针、第二探针和内参探针的5’端分别标记不同的荧光基团；其中第一引物对的序列为：
上游引物：5’-GGTGGCCCTGGGGTAAGTCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’-GGGGGCCTGTGGTGGTGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
第一探针的序列为：5’-CCCTGAAGATGCCGGACCCTGCCTGGAGAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
第二引物对的序列为：
上游引物EBF-4：5’-CTAGCGACTCTGCTGGAAAT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物EBR-5：5’-GAGTGTGTGCCAGTTAAGGT-3’，如SEQ ID NO.5所示；
第二探针序列为：5’-GGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAG-3’，如SEQ ID NO.6所示。
可选的，所述内参引物对的序列为：
上游引物：5’-CTGTGCTATCCCTGTACGCCTCTG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物：5’-CTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，如SEQ ID NO.8所示；
内参探针的序列为：5’-ACACTGTGCCCATCTACGA-3’，如SEQ ID NO.9所示。
其中第一引物对和第一探针为根据EB病毒基因保守序列BamH1-w(BWRF1)序列 中的靶片段进行设计，该靶片段的序列如SEQ ID NO.12所示；
第二引物对和第二探针为根据EB病毒基因保守序列LMP1序列中的靶片段进行设计， 该靶片段的序列如SEQ ID NO.13所示；
内参引物对和内参探针为根据β-actin基因进行设计，该靶片段的序列如SEQ IDNO.14 所示。
可选的，所述第一探针5’端标记的荧光基团为FAM；第二探针5’端标记的荧光基团为Cy3；内参探针的5’端标记的荧光基团为HEX。
可选的，所述第一探针、第二探针和内参探针的3’端标记荧光猝灭基团BHQ-3。
可选的，还包括阴性质控品、阳性质控品、阳性标准品、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶。
其中阴性质控品为不含有EB病毒DNA片段的重组质粒；阳性质控品含有EB病毒DNA片段的重组质粒；
阳性标准品为含有含有1×1010copy/ml EB病毒靶片段重组质粒，该靶靶片段序列如 SEQ ID NO.15所示。阳性标准品在使用过程中根据需要稀释为不同浓度，用于绘制标准曲 线；
PCR反应缓冲液为：pH8.0,0.1mol/L的Tris-HCl，含有20mmol/L的MgCl2。
一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒，包括上述多重PCR检测EB病毒的试剂盒和elisa试剂盒；其中elisa试剂盒包括第一抗体包被的酶标板、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物、显色剂、清洗液；第一抗体和第二抗体均为EBNA-1抗 体，第一抗体和第二抗体的抗原表位不同。
可选的，所述第一抗体为采用第一抗原多肽通过动物免疫筛选获得；第二抗体为采用 第二抗原多肽通过动物免疫筛选获得；其中第一抗原多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.10 所示，第二抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
可选的，所述显色剂为TMB显色剂。
上述检测评估EB病毒活性的试剂盒的制备方法，包括
1)制备多重PCR检测EB病毒的试剂盒：
A：依次根据序列设计合成所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对、内参探针；在第一探针、第二探针和内参探针标记所需的荧光基团；
B：按要求制备阴性质控品、阳性标准品、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶；
C将步骤A和步骤B制备的各个引物对、各个探针和制备的各个组分按要求组装成多 重PCR试剂盒；
2)制备elisa试剂盒：
a：按照第一抗原多肽和第二抗原多肽氨基酸序列合成第一抗原多肽和第二抗原多肽， 然后利用合成的第一抗原多肽和第二抗原多肽依次分别进行动物免疫、细胞融合、腹水制 备和配对抗体筛选获得第一抗体和第二抗体；
b：采用第一抗体包被酶标板，采用生物素标记第二抗体；按要求制备链霉亲和素标 记的辣根过氧化物和显色剂；
c：将步骤a和步骤b制备的第一抗体包被的酶标板、生物素标记的第二抗体、链霉亲 和素标记的辣根过氧化物和显色剂组装成所述的elisa试剂盒；
3)将步骤1)制备的多重PCR试剂盒和步骤2)制备的elisa试剂盒组装成所述的试剂盒。
一种采用上述试剂盒检测评估EB病毒活性的应用，其特征在于，其使用方法包括以 下操作步骤：
Ⅰ：将检测血液样本血清分离，作为血清样本；提取血清DNA，作为DNA样本；
Ⅱ：多重PCR检测步骤Ⅰ制备的DNA样本：
①：绘制标准曲线：配置PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液、0.8mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸，5U DNA聚合酶，0.4μmol/L的第一引物对、第二引物对和内参引物对， 0.4μmol/L的第一探针、第二探针和内参探针；
秒，进行45个循环，检测时选择FAM通道检测两个靶区域的Ct值；
绘制标准曲线：按照上述同样的方法配置PCR反应体系，在反应体系中加入不同已知 DNA拷贝数的EB病毒阳性标准品，检测两个靶区域的Ct值，分别绘制两个靶区域Ct值 与DNA拷贝数的标准曲线；
②：DNA样本中EB病毒DNA拷贝数的检测：按照上述同样的方法配置PCR反应体 系，在反应体系中加入待测DNA样本，检测两个靶区域的Ct值，分别将检测到的两个靶 区域的Ct值带入对应的标准曲线，即得DNA样本中的EB病毒DNA拷贝数；
Ⅲ：Elisa检测EBNA-1蛋白含量：①：绘制标准曲线：将50μl已知浓度的EBNA-1 蛋白标准品加入包被有第一抗体的酶标板，37℃孵育30min，清洗酶标板，加入100μl生 物标记的第二抗体，37℃孵育2小时，清洗酶标板，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物 孵育30min，清洗酶标板，加入显色剂，37℃放置5分钟，终止反应，酶标仪检测A490nm 的吸光度；
按照上述同样的方法检测不同浓度EBNA-1蛋白标准品的吸光度，绘制吸光度与EBNA-1蛋白浓度之间的标准曲线；
②：血清样本检测：取血样样本50μl，按照上述同样的方法检测血清样本的吸光度， 将检测的吸光度带入上述绘制的吸光度与EBNA-1蛋白浓度之间的标准曲线，计算血清样 本中的EBNA-1蛋白含量。
本发明试剂盒具有以下有益效果：
1)多重PCR可以对EBV-DNV两个位点DNA序列进行鉴定，减少PCR反应假阴性 的可能，从而使检测结果更加准确；
2)EBNA-1是一种EBV编码的核蛋白，在所有EBV相关的肿瘤中均可表达，可以控 制EBV游离基因的复制以及调控病毒的转录，能影响包括在转录、翻译和细胞信号转导 中起重要作用的宿主细胞基因的表达，EBNA-1的过表达可促进EBV相关肿瘤细胞体外的 增殖及侵袭转移能力，可以有效提示EBV相关肿瘤中EBV的促癌活性，可以有效反映EBV 基因在宿主细胞中的稳定性；
3)本发明将多重PCR检测EBV-DNA及ELISA检测EBNA-1蛋白联合使用，通过多 重PCR检测EBV-DNA判断EBV病毒是否处于激活状态，再结合Elisa检测血清中EBNA-1 蛋白的表达量，判断病毒是否处于复制激活状态，可以高效、特异的检测人血清中EBV 在激活或潜伏感染状态下的病毒促癌活性，克服了现有试剂盒不能检测处于潜伏感染状态 下的EBV病毒促癌活性，有利于EBV相关性肿瘤的疗效预测和预后判定。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、 方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒，包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对、内参探针、阴性质控品、阳性质控品、阳性标准品、PCR反应缓冲 液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶；第一探针5’端标记的荧光基团为FAM；第二探 针5’端标记的荧光基团为Cy3；内参探针的5’端标记的荧光基团为HEX；第一探针、第二 探针和内参探针的3’端标记荧光猝灭基团BHQ-3；
其中第一引物对的序列为：
上游引物：5’-GGTGGCCCTGGGGTAAGTCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’-GGGGGCCTGTGGTGGTGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
第一探针的序列为：5’-CCCTGAAGATGCCGGACCCTGCCTGGAGAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
第二引物对的序列为：
上游引物EBF-4：5’-CTAGCGACTCTGCTGGAAAT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物EBR-5：5’-GAGTGTGTGCCAGTTAAGGT-3’，如SEQ ID NO.5所示；
第二探针序列为：5’-GGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAG-3’，如SEQ ID NO.6所示。
内参引物对的序列为：
上游引物：5’-CTGTGCTATCCCTGTACGCCTCTG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物：5’-CTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，如SEQ ID NO.8所示；
内参探针的序列为：5’-ACACTGTGCCCATCTACGA-3’，如SEQ ID NO.9所示。
其中阴性质控品为不含有EB病毒DNA片段的重组质粒；阳性质控品含有EB病毒DNA片段的重组质粒；
阳性标准品为含有含有1×1010copy/ml EB病毒靶片段重组质粒，该靶靶片段序列如 SEQ ID NO.15所示；阳性标准品在使用过程中根据需要稀释为不同浓度，用于绘制标准曲 线；
PCR反应缓冲液为：pH8.0,0.1mol/L的Tris-HCl，含有20mmol/L的MgCl2。
使用本实施例多重PCR检测EB病毒的试剂盒的操作方法为：
(1)配置PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液(pH8.0,0.1mol/L的Tris-HCl，含有20mmol/L的MgCl2)，0.8mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸，5U DNA聚合酶，0.4μmol/L的 上游引物及下游引物，0.4μmol/L的探针。
(2)分别将不同的模板：5μl的核酸提取物，或5μl阴性质控品，或5μl阳性质控品，或5μl标准品与上述反应体系混合后进行荧光定量PCR。
(3)放入荧光定量PCR系统中进行检测，荧光定量PCR反应条件为：95度分钟预 变性，95度10秒，55度15秒，72度15秒，进行45个循环；检测不同荧光通道不同目 标靶区域的PCR扩增曲线，反应结束之后按照软件通过Ct值以及标准曲线计算EBV DNA 拷贝数。
实施例2
一种检测血清中EBNA-1蛋白含量的elisa试剂盒，包括第一抗体包被的酶标板、生物 素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物、TMB显色剂、清洗液、终止液；第一抗体和第二抗体均为EBNA-1抗体，第一抗体为采用氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示 的第一抗原多肽通过动物免疫筛选获得；第二抗体为采用氨基酸序列如SEQ ID NO.11所 示的第二抗原多肽通过动物免疫筛选获得。
其中第一抗体和第二抗体的制备方法具体为：
(1)合成抗原多肽：按照设计的氨基酸序列合成第一抗原多肽和第二抗原多肽；
(2)动物免疫：选择6～8周龄的Babl/c小鼠免疫进行抗原多肽免疫，免疫方式选择为皮下多点注射，免疫剂量为：100ug/只，免疫周期分三次，间隔两周，首次利用同等体 积比例的弗氏完全佐剂进行免疫，间隔两周后进行二次免疫，二次免疫为同等体积比例的 弗氏不完全佐剂乳化后免疫，免疫数量为：5只/组；每两周免疫一次，进行3次之后，在 第四次冲击免疫时不加佐剂进行抗原直接尾静脉免疫；
(3)细胞融合：融合前一周复苏骨髓瘤细胞系(SP2/0细胞株)，同时调整细胞状态与数目，融合当天将冲击免疫后的小鼠处死后取脾脏，制备获得单个脾细胞悬液后与SP2/0细胞株利用PEG2000化学融合剂进行细胞融合，融合后利用含HAT的基础培养基调整细 胞密度进行细胞铺板；
(4)融合上清检测：待融合后第九天进行间接ELISA检测，挑选阳性孔进行验证，后期包括细胞株稳定性与抗体分泌能力稳定性验证，待细胞株评价完成后进行扩大培养；
(5)腹水制备与抗体获得：将鉴定无问题的细胞株进行腹水制备与抗体纯化操作，纯化前首先利用亚型金顶试剂盒进行抗体亚型鉴定，确定纯化方式，而后利用亲和层析法进行纯化；
(6)单克隆抗体筛选配对抗体：按照ELISA间接法进行抗体筛选工作，分别包被第一抗原多肽和第二抗原多肽，抗原包被计量为50ng/孔，4℃条件下过夜，第二日弃去上清，加入封闭液至于37℃条件下2h。抽取细胞培养上清100uL，加入ELISA平板96孔中，37℃ 条件下孵育30min，洗版5次。加入二抗试剂(1：1000)100uL/孔，37℃孵育30min，洗 板5次，加入TMB底物100uL/孔，显色10min；参考阴性对照与阳性对照，确定阳性孔 数目，筛选阳性单克隆抗体，即对应为第一抗体和第二抗体。
使用本实施例elisa试剂盒检测样本中EBNA1蛋白含量的操作方法为：将50ul样本加 入含有包被有第一抗体的酶标板中，37℃孵育30min，利用PBST洗液清洗三次每次3分钟，加入100ul的生物素标记的第二抗体，37℃孵育2个小时，利用PBST洗液清洗三次 每次3分钟，加入链霉亲和素标记的HPR，37℃孵育30分钟，利用PBST洗液清洗5次 每次5分钟，加入TMB显色液，37℃放置5分钟，加入终止液10ul，酶标仪检测A490nm 的吸光度；检测不同浓度EBNA1蛋白标准品对应的吸光度，绘制标准曲线，将检测的待 测样品的吸光度带入标准曲线，计算待测样品中EBNA1蛋白含量。
实施例3
一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒，包括实施例1提供的多重PCR检测EB病毒的试剂盒和实施例2提供的Elisa试剂盒。
对比例1
本对比例多重PCR检测EB病毒的试剂盒，与实施例1的不同之处在于，第一引物对和第一探针序列不同，本对比例第一引物对和第一探针序列是针对SEQ ID NO.16所示的靶序列，具体的引物序列为：
正向引物：CTGGACACTTATGTTTCAA
反向引物：GGGACAATATCAGGCTAA
探针序列为：HEX-TATGGTCACTCAGGCACGGTC-BHQ；
其他与实施例1相同。
对比例2
本对比例检测血清中EBNA-1蛋白含量的elisa试剂盒，与实施例2的不同之处在于， Elisa试剂盒的第一抗体为采用氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的第一抗原多肽通过动物 免疫筛选获得；第二抗体为采用氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的第二抗原多肽通过动 物免疫筛选获得；其他与实施例2相同。
试验例1
采用实施例3的试剂盒对临床血清样本的EB病毒活性进行检测：具体方法包括以下 操作步骤：
(1)血清分离
去抗凝血1ml，2000rpm离心10min，取上层血清进行下游操作；
(2)血清DNA提取
按照QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒说明书进行操作，吸取20μl QIAGEN蛋白酶 (或者蛋白酶K)至1.5ml离心管的底部；加入200μl待提取基因组的血清至离心管中， 加入200μl Buffer AL至离心管中，涡旋振荡15s混匀，56℃孵育10min，快速离心，去除 残留在1.5ml离心管盖子中的液滴，加入200μl的乙醇(100％)，涡旋振荡15s混匀，振荡 完毕后，快速离心，去除残留在1.5ml离心管盖子中的液滴，将混合物转移至QIAamp Mini 离心管柱，6000g离心1min，将QIAamp Min离心柱放入一个新的干净2ml接收管中， 小心打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW1，盖紧盖子，6000g(8000rpm)离 心1min；将QIAamp Mini离心柱转移至一个新的2ml收集管中，将滤液连同使用过的收 集管丢弃；弃滤液，小心打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW2(盖紧盖子， 最大转速(20000g；14000rpm)离心3min；将QIAamp Mini离心柱转移到一个新的1.5ml 收集管，小心打开离心柱，加入50μl Buffer AE，室温(15-25℃)孵育1min，然后6000g (8000rpm)离心1min，即完成；
(3)QPCR检测血清DNA中EBV DNA含量
按照实施例1提供的多重PCR检测EB病毒的试剂盒的操作方法，检测对应的血清DNA样本中的EBV DNA含量；
(4)Elisa检测血清中EBNA1蛋白含量
按照实施例2提供的Elisa试剂盒的操作方法检测对应的血清中EBNA1蛋白含量；
(5)结果分析：每个临床样本的检测结果如下表1所示：
表1
*对照标准品，EBV DNA拷贝数<103copies/ml,可排除EBV感染；EBV DNA拷贝数103-105有感染 EBV风险；EBV DNA拷贝数>105copies/ml说明患者存在EBV感染。
EBNA1蛋白含量检测，EBNA1含量为<10pg/ml,EBV潜伏期；EBNA1含量为10-100pg/ml，EBV 激活期；EBNA1含量为>100pg/ml说明EBV病毒活性较高。
对比试验例
1、通过准确率检测试验分别对实施例1和对比例1试剂盒的准确率进行检测，结果表明实施例1优于对比例1；
2、通过准确率和特异性试验分别对实施例2和对比例2试剂盒的准确率和特异性进 行检测，结果表明实施例2优于对比例2。
由此可见本发明通过创造性的选择多重PCR试剂盒中的两个靶区域，以及通过创造性 的选择第一抗体和第二抗体，提高试剂盒的准确率和特异性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参 照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而 这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范 围。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒、用于检测评估EB病毒活性的试剂盒及其制备方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtggccctg gggtaagtct g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggggcctgt ggtggtgag 19
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctgaagat gccggaccct gcctggagac 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagcgactc tgctggaaat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagtgtgtgc cagttaaggt 20
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggtcgtcat catctccacc ggaaccagaa g 31
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtgctatc cctgtacgcc tctg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttctcctta atgtcacgca cgat 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acactgtgcc catctacga 19
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg
1 5 10 15
Gly Thr Ala Leu
20
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Gly Gln
20
<210> 12
<211> 211
<212> DNA
<213> epstein-barr virus
<400> 12
ggtggccctg gggtaagtct gggaggcaga gggtcggcct aggcccgggg aagtggaggg 60
ggatcgcccg ggtctctgtt ggcagagtcc gggcgatcct ctgagaccct ccgggcccgg 120
acggtcgccc tcagcccccc agacagaccc cagggtctcc aggcagggtc cggcatcttc 180
aggggcagca ggctcaccac cacaggcccc c 211
<210> 13
<211> 337
<212> DNA
<213> epstein-barr virus
<400> 13
ctagcgactc tgctggaaat gatggaggcc ctccacaatt gacggaagag gttgaaaaca 60
aaggaggtga ccagggcccg cctttgatga cagacggagg cggcggtcat agtcatgatt 120
ccggccatgg cggcggtgat ccacaccttc ctacgctgct tttgggttct tctggttccg 180
gtggagatga tgacgacccc cacggcccag ttcagctaag ctactatgac taacctttct 240
ttacttctag gcattaccat gtcataggct tgcctgactg actctccctc catttactgg 300
gaatgcctta gctaatcacc ttaactggca cacactc 337
<210> 14
<211> 233
<212> DNA
<213> epstein-barr virus
<400> 14
ctgtgctatc cctgtacgcc tctggccgta ccactggcat cgtgatggac tccggtgacg 60
gggtcaccca cactgtgccc atctacgagg ggtatgccct cccccatgcc atcctgcgtc 120
tggacctggc tggccgggac ctgactgact acctcatgaa gatcctcacc gagcgcggct 180
acagcttcac caccacggcc gagcgggaaa tcgtgcgtga cattaaggag aag 233
<210> 15
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtggccctg gggtaagtct gggaggcaga gggtcggcct aggcccgggg aagtggaggg 60
ggatcgcccg ggtctctgtt ggcagagtcc gggcgatcct ctgagaccct ccgggcccgg 120
acggtcgccc tcagcccccc agacagaccc cagggtctcc aggcagggtc cggcatcttc 180
aggggcagca ggctcaccac cacaggcccc cctagcgact ctgctggaaa tgatggaggc 240
cctccacaat tgacggaaga ggttgaaaac aaaggaggtg accagggccc gcctttgatg 300
acagacggag gcggcggtca tagtcatgat tccggccatg gcggcggtga tccacacctt 360
cctacgctgc ttttgggttc ttctggttcc ggtggagatg atgacgaccc ccacggccca 420
gttcagctaa gctactatga ctaacctttc tttacttcta ggcattacca tgtcataggc 480
ttgcctgact gactctccct ccatttactg ggaatgcctt agctaatcac cttaactggc 540
acacactcct gtgctatccc tgtacgcctc tggccgtacc actggcatcg tgatggactc 600
cggtgacggg gtcacccaca ctgtgcccat ctacgagggg tatgccctcc cccatgccat 660
cctgcgtctg gacctggctg gccgggacct gactgactac ctcatgaaga tcctcaccga 720
gcgcggctac agcttcacca ccacggccga gcgggaaatc gtgcgtgaca ttaaggagaa 780
g 781
<210> 16
<211> 124
<212> DNA
<213> epstein-barr virus
<400> 16
ctggacactt atgtttcaag cagctcacct atggtcactc aggtcactca ggcacggtcg 60
cccctccgag tgaccagtca ccttccagac tatgcataca ctgaatttag cctgatattg 120
tccc 124
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ala Thr Cys Thr Leu Gly Ser Asp Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Glu
1 5 10 15
Ile Pro Val Ala
20
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Val Leu Val Thr Pro Val Cys Leu Pro Asp Ser Ile Val Arg Lys Glu
1 5 10 15
Leu Asn Thr Ala
20

Claims (8)

1.一种多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，包括第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对和内参探针；第一探针、第二探针和内参探针的5’端分别标记不同的荧光基团；其中第一引物对的序列为：
上游引物：5’-GGTGGCCCTGGGGTAAGTCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物：5’-GGGGGCCTGTGGTGGTGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
第一探针的序列为：5’-CCCTGAAGATGCCGGACCCTGCCTGGAGAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
第二引物对的序列为：
上游引物EBF-4：5’-CTAGCGACTCTGCTGGAAAT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物EBR-5：5’-GAGTGTGTGCCAGTTAAGGT-3’，如SEQ ID NO.5所示；
第二探针序列为：5’-GGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAG-3’，如SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述内参引物对的序列为：
上游引物：5’-CTGTGCTATCCCTGTACGCCTCTG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物：5’-CTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，如SEQ ID NO.8所示；
内参探针的序列为：5’-ACACTGTGCCCATCTACGA-3’，如SEQ ID NO.9所示。
3.如权利要求1或2所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述第一探针5’端标记的荧光基团为FAM；第二探针5’端标记的荧光基团为Cy3；内参探针的5’端标记的荧光基团为HEX。
4.如权利要求1或2所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述第一探针、第二探针和内参探针的3’端标记荧光猝灭基团BHQ-3。
5.如权利要求3所述的多重PCR检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品、阳性质控品、阳性标准品、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶。
6.一种用于检测评估EB病毒活性的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求5所述的试剂盒和elisa试剂盒；其中elisa试剂盒包括第一抗体包被的酶标板、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物、显色剂、清洗液；第一抗体和第二抗体均为EBNA-1抗体，第一抗体和第二抗体的抗原表位不同。
7.如权利要求6所述的检测评估EB病毒活性的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为采用第一抗原多肽通过动物免疫筛选获得；第二抗体为采用第二抗原多肽通过动物免疫筛选获得；其中第一抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，第二抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
8.一种如权利要求7所述的检测评估EB病毒活性的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括
1)制备多重PCR检测EB病毒的试剂盒：
A：依次根据序列设计合成所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针、内参引物对、内参探针；在第一探针、第二探针和内参探针标记所需的荧光基团；
B：按要求制备阴性质控品、阳性标准品、PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶；
C将步骤A和步骤B制备的各个引物对、各个探针和制备的各个组分按要求组装成多重PCR试剂盒；
2)制备elisa试剂盒：
a：按照第一抗原多肽和第二抗原多肽氨基酸序列合成第一抗原多肽和第二抗原多肽，然后利用合成的第一抗原多肽和第二抗原多肽依次分别进行动物免疫、细胞融合、腹水制备和配对抗体筛选获得第一抗体和第二抗体；
b：采用第一抗体包被酶标板，采用生物素标记第二抗体；按要求制备链霉亲和素标记的辣根过氧化物和显色剂；
c：将步骤a和步骤b制备的第一抗体包被的酶标板、生物素标记的第二抗体、链霉亲和素标记的辣根过氧化物和显色剂组装成所述的elisa试剂盒；
3)将步骤1)制备的多重PCR试剂盒和步骤2)制备的elisa试剂盒组装成所述的试剂盒。
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