CN113637066B - 中国花鲈t淋巴细胞表面标志分子cd8的特异性抗体制备方法及应用 - Google Patents

中国花鲈t淋巴细胞表面标志分子cd8的特异性抗体制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种中国花鲈T细胞表面标志分子CD8α的特异性抗体制备方法及其应用，用于制备多克隆抗体的抗原表位的氨基酸序列为THYSSKFNDAKIQQN。本发明克隆了中国花鲈T细胞表面标志分子CD8α基因，精准地制备了中国花鲈CD8α分子的特异性抗体，填充了中国花鲈免疫基因的空白，为在转录水平上检测中国花鲈CD8α免疫基因的表达变化提供了可能，并为检测中国花鲈CD8α+T淋巴细胞提供了重要工具。本发明通过抗原性分析筛选抗原性较高的多肽段，制备该多肽的抗体，实现对T淋巴细胞的鉴定及后续检测。

Description

中国花鲈T淋巴细胞表面标志分子CD8的特异性抗体制备方法 及应用
技术领域
本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及一种中国花鲈(Lateolabraxmaculatus)T淋巴细胞表面标志分子CD8的特异性抗体制备方法及其应用。
背景技术
T淋巴细胞是机体主要的免疫细胞，参与机体的体液免疫应答和细胞免疫应答。其中，CD8 T淋巴细胞作为T淋巴细胞的主要功能亚群之一，在免疫过程中发挥着多种免疫功能，如在抵抗病原入侵等相关免疫防御中，CD8+T细胞发挥着至关重要的作用。CD8+T细胞表面的TCR识别APC表面的内源性抗原肽-MHC I类分子复合物后，活化成CTL细胞，与被病原体入侵的靶细胞直接接触，产生颗粒酶和穿孔素等杀伤因子或者通过死亡受体途径，对靶细胞直接进行杀伤，进而清除病原体。在哺乳动物中，对CD8+T淋巴细胞亚群的特性及免疫功能已研究比较透彻，为开展疾病防治，评价机体免疫状态等开创了新局面。
CD8分子为双链跨膜糖蛋白，由α和β两条链组成的异二聚体形式存在，属Ig超家族成员，主要表达于成熟的T淋巴细胞表面，可作为鉴定CD8 T淋巴细胞亚群的标志分子。研究发现，鱼类的CD8分子分为α和β两条链，每条链各有一个1个胞外Ig区，1个跨膜区，其中Ig区是其识别抗原肽段的区域。近年来，关于不同鱼类CD8分子的研究相继开展，但对于未公布序列的鱼类，克隆CD8分子的基因是研究T淋巴细胞的前提。
中国花鲈(Lateolabrax maculatus)是一种海水养殖鱼类，其具备肉质鲜美，生长快，易于养殖等特点，且市场需求量大，是我国重要海水养殖经济鱼类。然而近年来频发的养殖病害是妨碍其养殖业发展的重要因素。许多研究和实践表明疫苗是防治水产病害的一种有效措施。疫苗作用的发挥依赖机体适应性免疫机制的激活，在这一过程中T细胞扮演着重要角色。然而，由于缺少T淋巴标志分子的基因，因此对中国花鲈T淋巴细胞的分类、鉴定以及关于T细胞的免疫学功能都鲜有报道。因此，克隆中国花鲈T淋巴细胞的标志分子基因并制备其特异性抗体，有助于在转录水平研究基因的定位、组织分布及不同病原和免疫原刺激下的动态变化，对于在蛋白水平检测中国花鲈T淋巴细胞亚群数量变化、评价细胞免疫应答水平以及研制高效、绿色渔用疫苗均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种中国花鲈T细胞表面标志分子CD8α的特异性抗体制备方法及其应用，利用其制备的抗体标记物可鉴定并检测中国花鲈的CD8+T细胞，为鉴定中国花鲈T淋巴细胞亚群提供重要的免疫学工具。
本发明根据克隆的中国花鲈CD8α分子基因可作为CD8 T淋巴细胞亚群的标志物，从而用于鉴定CD8+T细胞，进而可深入研究CD8+T细胞的功能特性，以及评价鱼类细胞免疫应答水平并作为研制高效、绿色渔用疫苗的评价指标。
本发明首先提供一种中国花鲈CD8α分子的序列，其一种氨基酸序列如下：
MDQKWIHILVILVFYQKITSGAGEETVVKEGEAVDILCSPGEVSTLIVWFRMLDTSGMDFIATFTKHGMTKATATHYSSKFNDAKIQQNILTLKSFNKARDIGTYCCATLYKGVELRFGKVTRLVGEKKVEVAVRAPVTTTTTTKQNLCTTGPACVCNTDKHQVETTPSLSCTPIILGPLAGGCGLLLLLLIISTLYCNKIRTKRCPHHYKRKLRTMPPGKQTMTNRPI(SEQ ID NO:1)；
编码上述CDS的核苷酸序列如下：
ATGGACCAGAAGTGGATTCATATTCTGGTGATTCTGGTGTTTTATCAAAAGATTACTTCAGGGGCTGGTGAAGAAACTGTCGTAAAGGAGGGGGAGGCGGTCGACATCTTGTGTAGTCCTGGTGAAGTGAGCACCCTGATCGTCTGGTTTCGAATGCTGGACACATCTGGCATGGACTTCATTGCAACTTTCACCAAACACGGCATGACAAAAGCAACCGCAACCCATTACTCTTCCAAATTCAATGACGCAAAGATTCAGCAAAATATCTTAACACTGAAGTCATTCAACAAAGCTCGTGACATCGGTACTTACTGCTGTGCGACTCTTTACAAGGGTGTCGAACTGAGGTTCGGGAAAGTAACTCGACTGGTCGGAGAAAAAAAAGTTGAAGTGGCAGTGAGAGCACCCGTGACCACCACCACCACCACCAAACAAAATCTTTGCACAACTGGCCCGGCATGCGTTTGTAACACCGATAAACATCAAGTGGAAACCACACCGTCCTTGTCTTGTACTCCAATCATACTGGGCCCGCTGGCCGGCGGCTGTGGCCTCCTTCTTCTGCTCCTCATCATCAGCACTCTGTACTGCAATAAAATAAGGACAAAGAGATGCCCACACCATTACAAAAGAAAGCTGCGGACCATGCCTCCTGGAAAACAAACAATGACCAACAGACCCATTTAA(SEQ ID NO:2)。
本发明还提供用于制备多克隆抗体的抗原表位，所述的抗原表位的氨基酸序列为THYSSKFNDAKIQQN(SEQ ID NO:3)。
本发明所提供的抗原表位用于制备多克隆抗体，其一种制备方法，是将抗原表位与血蓝蛋白(KLH)偶联后，免疫Balb/c小鼠，取抗血清后处理得到抗中国花鲈T细胞表面标志分子CD8α特异性抗体。
本发明所提供的特异性抗体在制备鉴定中国花鲈T细胞亚群试剂，或在制备中国花鲈CD8α+T细胞免疫应答研究试剂中的应用。
本发明克隆了中国花鲈T细胞表面标志分子CD8α基因，精准地制备了中国花鲈CD8α分子的特异性抗体，填充了中国花鲈免疫基因的空白，为在转录水平上检测中国花鲈CD8α免疫基因的表达变化提供了可能，并为检测中国花鲈CD8α+T淋巴细胞提供了重要工具。本发明通过抗原性分析筛选抗原性较高的多肽段，制备该多肽的抗体，实现对T淋巴细胞的鉴定及后续检测。
附图说明
图1为中国花鲈CD8α分子的基因及蛋白序列信息图。
图2为中国花鲈CD8α分子的系统发育进化树分析图。
图3为中国花鲈CD8α分子的多重序列比对分析图。
图4为中国花鲈CD8α分子的二级结构和三级结构分析图，其中A为CD8α分子的二级结构域，B为CD8α分子的三级结构域。
图5为中国花鲈CD8α分子的抗原表位参数分析图。
图6为免疫印迹法分析抗体与中国花鲈CD8α重组蛋白及肾脏白细胞的特异性结合图。
图7为间接免疫荧光法分析CD8α抗体与中国花鲈外周血白细胞表面的特异性结合反应图，其中第1列表示在100倍物镜下观察的抗体与血细胞表面发生特异性结合反应，荧光信号强，第二列2为DAPI衬染细胞核，第三列3为1、2的叠加图。
图8为流式细胞术分析中国花鲈CD8α+T细胞的比例散点图及数据统计图，其中A.散点图B.统计图。
图9为流式细胞术分析中国花鲈CD8α+T细胞在KLH刺激后的比例变化图。
具体实施方式
申请人在研究中通过克隆得到了中国花鲈CD8α分子的基因，发现对其制备多克隆抗体，可以从标志分子的蛋白表达层面鉴定中国花鲈CD8α+T细胞，使鉴定手段更加简便，结果也更加明确。但由于CD8α分子序列中不同区域的抗原特性不同，并不是CD8α分子序列所有的抗原区域制备出的抗体都能有效的检测到中国花鲈CD8α+T细胞。因此，本发明从CD8α分子序列的自身特性出发，结合生物信息学分析筛选得到抗原性强且易于被抗体识别的氨基酸序列；以此序列的合成的多肽作为抗原可获得的特异性良好的抗体，将为中国花鲈T淋巴细胞表面标志分子CD8提供一种新的特异性抗体制备方法。
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1：中国花鲈T细胞表面标志分子CD8α的基因克隆
1、基因克隆
1)设计基因保守序列部分的简并引物
查找NCBI上已公布的其他鱼类的CD8α蛋白序列，通过Blast查找与鲈形目同源性较高的鱼类的序列，利用BioEdit找到序列上较为保守的区域(连续相同的氨基酸大于或等于6个)，对此CD8α基因的保守部分分别设计各自的简并引物，并根据中国花鲈的密码子偏好性优化简并引物。
简并引物 对应的氨基酸序列
5’——3’ F：CTGGTGATTYTRGTRTTT ELK/RFG
5’——3’ R：YAGMAGAAGRAGGCCACA CGLLLL
2)扩增核心片段
使用上述1)中设计的简并引物，以中国花鲈的cDNA为模板，对CD8α基因进行扩增。扩增过程，结合温度梯度PCR及Touchdown PCR方法对PCR过程进行优化，直至扩增出核心片段。琼脂糖凝胶电泳对扩增得到的PCR产物进行检测，紫外光下观察凝胶成像结果，预估大小处目的条带所在的凝胶用刀切下，连接入表达载体，转入克隆菌，并挑取单克隆菌落送于公司测序，比对返还的序列结果。
简并引物扩增的核心序列：
LVILVFYQKITSGAGEETVVKEGEAVDILCSPGEVSTLIVWFRMLDTSGMDFIATFTKHGMTKATATHYSSKFNDAKIQQNILTLKSFNKARDIGTYCCATLYKGVELRFGKVTRLVGEKKVEVAVRAPVTTTTTTKQNLCTTGPACVCNTDKHQVETTPSLSCTPIILGPLAGGCGLLLL
3)Race获得中国花鲈CD8α基因ORF序列
将上述核心序列分别利用3’Race和5’Race扩增获得CD8α基因的全长，根据race技术及获得的核心序列片段，设计了一系列特异性引物，其中两个GSP引物成功扩增得到了中国花鲈CD8α基因的ORF序列。
3’race引物 GGTGAAGAAACTGTCGTAAAGGAG
5’race引物 CAGTCGAGTTACTTTCCCGAACCTCA
最终确定了中国花鲈CD8α基因编码CDS的核苷酸序列为：ATGGACCAGAAGTGGATTCATATTCTGGTGATTCTGGTGTTTTATCAAAAGATTACTTCAGGGGCTGGTGAAGAAACTGTCGTAAAGGAGGGGGAGGCGGTCGACATCTTGTGTAGTCCTGGTGAAGTGAGCACCCTGATCGTCTGGTTTCGAATGCTGGACACATCTGGCATGGACTTCATTGCAACTTTCACCAAACACGGCATGACAAAAGCAACCGCAACCCATTACTCTTCCAAATTCAATGACGCAAAGATTCAGCAAAATATCTTAACACTGAAGTCATTCAACAAAGCTCGTGACATCGGTACTTACTGCTGTGCGACTCTTTACAAGGGTGTCGAACTGAGGTTCGGGAAAGTAACTCGACTGGTCGGAGAAAAAAAAGTTGAAGTGGCAGTGAGAGCACCCGTGACCACCACCACCACCACCAAACAAAATCTTTGCACAACTGGCCCGGCATGCGTTTGTAACACCGATAAACATCAAGTGGAAACCACACCGTCCTTGTCTTGTACTCCAATCATACTGGGCCCGCTGGCCGGCGGCTGTGGCCTCCTTCTTCTGCTCCTCATCATCAGCACTCTGTACTGCAATAAAATAAGGACAAAGAGATGCCCACACCATTACAAAAGAAAGCTGCGGACCATGCCTCCTGGAAAACAAACAATGACCAACAGACCCATTTAA；
其翻译的氨基酸序列如下：
MDQKWIHILVILVFYQKITSGAGEETVVKEGEAVDILCSPGEVSTLIVWFRMLDTSGMDFIATFTKHGMTKATATHYSSKFNDAKIQQNILTLKSFNKARDIGTYCCATLYKGVELRFGKVTRLVGEKKVEVAVRAPVTTTTTTKQNLCTTGPACVCNTDKHQVETTPSLSCTPIILGPLAGGCGLLLLLLIISTLYCNKIRTKRCPHHYKRKLRTMPPGKQTMTNRPI*。
2、生物信息学分析
利用MEGA 5.0软件，构建了CD8α分子的系统进化树(图2)；利用DNAMAN软件对得到的中国花鲈的CD8α蛋白序列与其他鱼类的序列进行多重序列比对分析(图3)。分析结果显示，克隆得到的中国花鲈CD8α基因的氨基酸序列与已报到的其它鱼类的同源性相似度达到60～70％，在氨基酸上存在30％左右的差异。
实施例2：中国花鲈CD8α分子特异性抗体的制备
1、CD8α分子抗原肽的制备
(1)利用线上蛋白质二级结构预测分析软件SMART预测和分析了中国花鲈CD8α分子的蛋白二级结构域(http://smart.embl-heidelberg.de)，结果显示，中国花鲈CD8α分子的跨膜区在175～197位区，其中1～174位区显示为胞外区，胞外区存在一个Ig样结构域，198～230为胞内区。预测跨膜区和结构域的目的在于保证分析设计的抗原肽位于中国花鲈CD8α蛋白的胞外区及Ig样结构域上(图4A)。利用蛋白质三级结构的在线预测系统Swissmodel(https://swissmodel.expasy.org/interactive)，对中国花鲈CD8α蛋白的三级结构进行同源构建并分析，建立了蛋白的三维结构模型(图4B)。
(2)采用DNAStar软件对中国花鲈CD8α分子抗原表位参数进行分析，参数主要包括亲水性(Hydrophilicity Plot-Kyte-Doolittle)、柔韧性(Flexible Regions-Karplus-Schulz)、抗原性(Antigenic Index-Jameson-Wolf)和表面可及性(Surface ProbabilityPlot-Emini)等(图5A)。综合各参数，取位于β-转角和无规则卷曲区域，取亲水性指数≥0、表面可及性指数≥1和抗原性指数≥0的氨基酸区段作为潜在表位。从中可以看出中国花鲈CD8α分子抗原表位可能存在的位置。
(3)采用IEDB在线预测软件，结合DNAStar软件分析结果，对中国花鲈CD8α分子抗原表位进一步预测，预测出可能的B细胞线性表位(图5B)。
从图5A中可以看出中国花鲈CD8α分子抗原表位可能存在的位置大多位于胞外区域。而图5B所示的B细胞线性表位也分布在该区域。
(4)综合以上预测数据，最终确定候选抗原肽。首先，排除位于跨膜区和胞内区的抗原表位，使得抗原肽位于胞外区段和Ig样结构域上。其次，抗原肽应位于二级结构中的无规则卷曲和β-转角区域。最后，分析抗原表位参数及预测的潜在抗原表位，确定抗原肽的具体位置，最终选择中国花鲈CD8α分子抗原肽为75THYSSKFNDAKIQQN89。抗原肽由公司合成并偶联血蓝蛋白载体，纯度经质谱验证。
2、免疫
用合成的中国花鲈CD8α多肽-KLH复合物作为抗原免疫小鼠。每次的免疫剂量为1mg，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周，均为腹腔注射：
1)基础免疫：CD8α多肽-KLH复合物与弗氏完全佐剂等量(V/V)混匀作为抗原；
2)加强免疫：CD8α多肽-KLH复合物与弗氏不完全佐剂等量(V/V)混匀作为抗原；
3)二次加强免疫：CD8α多肽-KLH复合物与弗氏不完全佐剂等量(V/V)混匀作为抗原；
4)再次加强免疫：CD8α多肽-KLH复合物与弗氏不完全佐剂等量(V/V)混匀作为抗原。
5)最后一次免疫后，间隔三天，进行眼球采血。将采集的血液，于室温下倾斜静置2h，4℃冰箱中过夜。次日，将离心管在4℃、8000g条件下离心10min，小心吸取上清作为多克隆抗体。
实施例3:制备的多抗的免疫印迹法鉴定
(1)十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳：
①将纯化的中国花鲈CD8α重组蛋白和中国花鲈脾脏白细胞分别加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3～5min；
②将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10μl，在恒流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流(50-70mA)，电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；凝胶部分用于转膜，部分放置在考马斯亮蓝染液中染色1h。
③剪取一块与电泳凝胶相同大小的PVDF膜(孔径0.22μm)，经甲醇激活并纯水浸泡后，以电转移缓冲液(电转移缓冲液：25mmol/L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)润湿，放在电泳后的凝胶上。在PVDF膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与PVDF膜及滤纸形成一套夹心的“三明治”；
④将“凝胶三明治”置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将PVDF膜面向正极；电泳恒压30V，通电1.5小时；
⑤转移完毕，取出PVDF膜。
(2)蛋白免疫印迹：
①将PVDF膜用PBS洗10分钟，然后置于3％的牛血清白蛋白溶液(PBS配)中封闭1h，37℃；
②用PBST洗3次，每次5分钟；
③孵育一抗：取制备的鼠抗花鲈CD8α多克隆抗体、未免疫的鼠血清(对照)以1：1000的比例进行稀释，将PVDF膜浸没其中，在37℃恒温箱中孵育1.5h；
④同②法洗涤三次；
⑤将PVDF膜加入辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(1:10000稀释)中，37℃孵育1小时；
⑥同②法洗涤三次；
⑦把PVDF膜放入反应机器中用发色液(1：1配制发色液)发色；
⑧同时把放置在考马斯亮蓝中的凝胶在沸水中煮至条带清晰，PDVF膜上发出条带的位置对应到凝胶上，将对应的条带小心切下送去质谱。
结果：CD8α抗体与中国花鲈CD8α重组蛋白在16.4kDa处发生特异性反应，与中国花鲈脾脏白细胞在30kDa处发生特异性反应(图6)，显示条带，而阴性对照无条带显示。
实施例4：中国花鲈CD8α抗体的间接免疫荧光方法鉴定
①将percoll不连续密度梯度离心获得的中国花鲈外周血白细胞，以PBS重悬白细胞，将浓度调整到5×106个/ml。
②把白细胞悬液滴在干净的载玻片上，每滴50μl，在室温下湿盒中沉降1小时后取出放入4％多聚甲醛中固定20分钟，取出风干。
③以免疫的小鼠血清为第一抗体，阴性对照为鼠阴性血清，加在载玻片的细胞样品上，37℃湿盒中孵育1小时。
④取出载玻片，用PBS洗三次，每次5分钟。
⑤以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体为第二抗体，加在细胞样品上，37℃湿盒中孵育45分钟。
⑥取出载玻片，同④浸洗，甘油封片。
⑦荧光显微镜下观察。
结果：中国花鲈CD8α抗体与中国花鲈部分白细胞表面发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在100倍油镜下能够观察到绿色荧光信号在细胞膜表面呈散点状分布，这与CD8α蛋白分布于T淋巴细胞表面的事实相吻合，而阴性对照则没有观察到荧光信号(图7)。
实施例5：中国花鲈CD8α抗体在检测中国花鲈CD8α+T细胞数量比例中的应用
①选取暂养一周后的健康中国花鲈(500±5g)，采用乙醚麻醉后，于尾静脉抽取中国花鲈外周血白细胞，同时取中国花鲈的脾脏和头肾组织，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取中国花鲈外周血、脾脏及头肾的白细胞。将提取的中国花鲈各组织白细胞用无菌PBS缓冲液稀释成细胞密度为1×106cells/ml的细胞悬液。
②取从每个组织样品分别准备两份白细胞悬液，一份为检测样品，一份为对照样品，离心倒掉上清后，往检测样品中加入1ml中国花鲈CD8α多克隆抗体重悬，同组织对照组加入等量鼠阴性血清，37℃孵育1.5h。
③于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
④用1ml异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠Ig二抗重悬③中洗涤离心后的细胞沉淀，37℃孵育1h。
⑤于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
⑥离心洗涤完成后，用500μl无菌PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
结果：各组织阴性对照样品流式分析的散点图未有阳性反应细胞群出现，而与中国花鲈CD8α抗体孵育的中国花鲈各组织白细胞流式分析散点图呈现两个细胞群，说明CD8α抗体能与中国花鲈部分白细胞发生特异性结合，检测结果显示中国花鲈外周血白细胞中CD8α+细胞数量比例为3.0％，脾脏组织白细胞中的CD8α+细胞数量比例为9.4％，头肾组织白细胞中的CD8α+细胞数量比例为8.4％(图8)。
实施例6：中国花鲈CD8α抗体在检测中国花鲈CD8α+T细胞KLH刺激后数量比例变化中的应用
①将暂养1周的健康中国花鲈(500±5g)随机分为两组，每组5条。实验组注射1mg/ml KLH，对照组不进行任何处理。具体实验操作为：取1个2.5ml的无菌注射器，向一只注射器内加入2ml KLH溶液，将抗原采用腹腔注射的方式注射给鱼体，每条鱼注射400微升。
②于免疫后第3天，选取健康的中国花鲈，采用乙醚麻醉后，于尾静脉抽取中国花鲈外周血白细胞，同时取中国花鲈的脾脏和头肾组织，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取中国花鲈外周血、脾脏及头肾的白细胞。将提取的中国花鲈各组织白细胞用无菌PBS缓冲液稀释成细胞密度为1×106cells/ml的细胞悬液。
③取从每个组织样品分别准备两份白细胞悬液，一份为检测样品，一份为对照样品，离心倒掉上清后，往检测样品中加入1ml中国花鲈CD8α多克隆抗体重悬，对照组为未刺激的鱼体同组织细胞，37℃孵育1h。
④于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
⑤用1ml异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠Ig单抗重悬④中洗涤离心后的细胞沉淀，37℃孵育1h。
⑥于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
⑦离心洗涤完成后，用500μl无菌PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
结果：与各组织阴性对照样品流式分析的散点图相比，KLH刺激后，中国花鲈CD8α抗体孵育的中国花鲈各组织白细胞流式分析散点图中的阳性细胞群呈现增加趋势，说明中国花鲈CD8α+T细胞能够被T细胞刺激物KLH激活，发生应答变化，检测结果显示中国花鲈外周血白细胞中CD8α+细胞数量比例由3.0％增加到10.1％，脾脏组织白细胞中的CD8α+细胞比例由9.4％增加到10.1％，头肾组织白细胞中的CD8α+细胞比例由8.4％增加到10.5％(图9)。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 中国花鲈T淋巴细胞表面标志分子CD8的特异性抗体制备方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asp Gln Lys Trp Ile His Ile Leu Val Ile Leu Val Phe Tyr Gln
1 5 10 15
Lys Ile Thr Ser Gly Ala Gly Glu Glu Thr Val Val Lys Glu Gly Glu
20 25 30
Ala Val Asp Ile Leu Cys Ser Pro Gly Glu Val Ser Thr Leu Ile Val
35 40 45
Trp Phe Arg Met Leu Asp Thr Ser Gly Met Asp Phe Ile Ala Thr Phe
50 55 60
Thr Lys His Gly Met Thr Lys Ala Thr Ala Thr His Tyr Ser Ser Lys
65 70 75 80
Phe Asn Asp Ala Lys Ile Gln Gln Asn Ile Leu Thr Leu Lys Ser Phe
85 90 95
Asn Lys Ala Arg Asp Ile Gly Thr Tyr Cys Cys Ala Thr Leu Tyr Lys
100 105 110
Gly Val Glu Leu Arg Phe Gly Lys Val Thr Arg Leu Val Gly Glu Lys
115 120 125
Lys Val Glu Val Ala Val Arg Ala Pro Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr
130 135 140
Lys Gln Asn Leu Cys Thr Thr Gly Pro Ala Cys Val Cys Asn Thr Asp
145 150 155 160
Lys His Gln Val Glu Thr Thr Pro Ser Leu Ser Cys Thr Pro Ile Ile
165 170 175
Leu Gly Pro Leu Ala Gly Gly Cys Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile
180 185 190
Ile Ser Thr Leu Tyr Cys Asn Lys Ile Arg Thr Lys Arg Cys Pro His
195 200 205
His Tyr Lys Arg Lys Leu Arg Thr Met Pro Pro Gly Lys Gln Thr Met
210 215 220
Thr Asn Arg Pro Ile
225
<210> 2
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaccaga agtggattca tattctggtg attctggtgt tttatcaaaa gattacttca 60
ggggctggtg aagaaactgt cgtaaaggag ggggaggcgg tcgacatctt gtgtagtcct 120
ggtgaagtga gcaccctgat cgtctggttt cgaatgctgg acacatctgg catggacttc 180
attgcaactt tcaccaaaca cggcatgaca aaagcaaccg caacccatta ctcttccaaa 240
ttcaatgacg caaagattca gcaaaatatc ttaacactga agtcattcaa caaagctcgt 300
gacatcggta cttactgctg tgcgactctt tacaagggtg tcgaactgag gttcgggaaa 360
gtaactcgac tggtcggaga aaaaaaagtt gaagtggcag tgagagcacc cgtgaccacc 420
accaccacca ccaaacaaaa tctttgcaca actggcccgg catgcgtttg taacaccgat 480
aaacatcaag tggaaaccac accgtccttg tcttgtactc caatcatact gggcccgctg 540
gccggcggct gtggcctcct tcttctgctc ctcatcatca gcactctgta ctgcaataaa 600
ataaggacaa agagatgccc acaccattac aaaagaaagc tgcggaccat gcctcctgga 660
aaacaaacaa tgaccaacag acccatttaa 690
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr His Tyr Ser Ser Lys Phe Asn Asp Ala Lys Ile Gln Gln Asn
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种中国花鲈CD8α基因，其特征在于，所述的基因，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:1。
2.如权利要求1所述的中国花鲈CD8α基因，其特征在于，所述的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种用于制备多克隆抗体的抗原表位肽，所述的抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。
4.权利要求3所述的抗原表位肽在制备多克隆抗体中的应用。
5.一种制备多克隆抗体的方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求3所述的抗原表位肽免疫动物后，取抗血清后处理得到多克隆抗体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的抗原表位肽与血蓝蛋白偶联后免疫动物。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的动物为Balb/c小鼠。
8.一种多克隆抗体，其特征在于，所述的多克隆抗体是使用权利要求5-7任一项所述的方法制备的。
9.权利要求8所述的多克隆抗体在制备鉴定中国花鲈T细胞亚群试剂，或在制备中国花鲈CD8α+ T细胞免疫应答研究试剂中的应用。
10.一种鉴定中国花鲈T细胞亚群的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求8所述的多克隆抗体来进行鉴定。
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