CN108341875A - 抗牙鲆t细胞表面标志分子cd4-1的单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

抗牙鲆t细胞表面标志分子cd4-1的单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4‑1的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞JF‑CD4‑1‑2A10，保藏号为：CCTCC NO：C201879，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年03月29日的杂交瘤细胞分泌的。所述单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示单抗能与牙鲆CD4‑1多肽发生特异性结合，免疫间接荧光和流式细胞术表明单抗能特异性识别牙鲆淋巴细胞表面CD4‑1分子，免疫印迹结果显示：本发明的单克隆抗体能特异性识别牙鲆CD4‑1重组蛋白以及分子量约为52 kDa的牙鲆天然CD4‑1蛋白。本发明制备了抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4‑1的单克隆抗体，为检测牙鲆CD4‑1+T淋巴细胞提供了重要工具。

Description

抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种抗牙鲆（Paralichthys olivaceus）T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体及其制备方法，其属于鱼类分子免疫学技术领域。
背景技术
CD4分子为单链跨膜糖蛋白，属Ig超家族成员，主要表达于成熟的T淋巴细胞表面。CD4+细胞作为一类重要的T淋巴细胞参与体液免疫和细胞免疫，在抵抗病原入侵等相关免疫防御中发挥着至关重要的作用。CD4+ T细胞TCR识别APC表面的外源性抗原肽-MHC类分子复合物后，活化成Th细胞，产生多种细胞因子，趋化和激活其他免疫细胞来清除病原体。CD4分子同样是人类免疫缺陷病毒（HIV）gp120的受体，即HIV可感染CD4+细胞，引发获得性免疫缺陷综合征。在哺乳动物中，CD4+细胞的特性及免疫功能已研究比较透彻，为开展疾病防治，评价机体免疫状态等开创了新局面。
近年来，关于鱼类CD4分子的研究取得了长足进展，主要集中在CD4分子的基因克隆和基因表达方面。研究发现，鱼类的CD4分子主要有两种类型，即CD4-1和CD4-2分子。CD4-1分子包含4个胞外Ig区，1个跨膜区和1个较短的胞质尾巴，Ig区是其识别抗原肽段的区域。不同鱼类CD4-2分子的胞外Ig区数目存在一定差异，虹鳟和牙鲆CD4-2分子具有2个胞外Ig区，而鲶鱼CD4-2分子含有3个胞外Ig区。鱼类CD4-1和CD4-2分子与高等动物CD4分子相比较均具有保守的胞外样Ig结构域及胞内酪氨酸激酶结合位点P56lck，而CD4-2分子具有更原始的结构，因此推测在进化过程中由CD4-2分子分化产生了CD4-1分子。温轶等（2010）以河豚为研究模型发现硬骨鱼类中存在类似Treg T细胞，并且表明是CD4-2+ T细胞而不是CD4-1+T细胞，发挥了类似高等动物CD4的功能。Toda（2011）对鲫鱼研究表明CD4-1+淋巴细胞在形态，组织分布和基因表达上与哺乳动物CD4+淋巴细胞类似。Kato等（2013）克隆得到了牙鲆CD4-1和CD4-2基因，并在转录水平研究了基因的定位、组织分布及不同病原和免疫原刺激下的动态变化。然而，由于缺少有利的工具来标记CD4+ T淋巴细胞，从蛋白水平对鱼类CD4+ T淋巴细胞进行分类、鉴定以及关于鱼类CD4+ T细胞的免疫学功能都鲜有报道。
牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国北方重要的海水养殖鱼类，然而近年来频发的养殖病害是妨碍牙鲆养殖业发展的重要因素，疫苗是防治水产病害的一种有效手段。疫苗作用的发挥依赖机体适应性免疫机制的激活，在这一过程中T细胞扮演着重要角色。因此，制备牙鲆CD4分子单克隆抗体，对于检测牙鲆CD4+ T淋巴细胞数量变化、评价鱼类细胞免疫应答水平以及研制高效、绿色鱼用疫苗均具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体及其制备方法，用于检测牙鲆CD4-1+ T细胞数量变化，为鉴定鱼类CD4+ T淋巴细胞提供重要的免疫学工具。
本发明根据牙鲆CD4+ T细胞的数量变化，从而可判断鱼体的健康状况，进而可深入研究CD4+ T细胞的功能特性，以及评价鱼类细胞免疫应答水平和用于研制高效、绿色鱼用疫苗。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞JF-CD4-1-2A10，保藏号为：CCTCC NO：C201879，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年03月29日的杂交瘤细胞分泌的。
所述杂交瘤细胞JF-CD4-1是以牙鲆CD4-1多肽-血蓝蛋白（KLH）复合物作为抗原制备的，所述牙鲆CD4-1多肽的氨基酸序列结构为：356PPKKTSLPSLKSRP369。
所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体经间接酶联免疫反应实验结果显示单抗能与未偶联KLH的CD4-1多肽发生特异性结合。
所述单克隆抗体与牙鲆部分白细胞表面发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在100倍油镜下能够观察到绿色荧光信号在细胞膜表面呈散点状分布。
所述单克隆抗体能特异性识别分子量约45kDa的牙鲆CD4-1重组蛋白以及分子量约为52 kDa的牙鲆天然CD4-1蛋白，显示紫褐色条带并经质谱验证。
一种所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：运用生物信息学软件预测分析牙鲆CD4-1抗原表位，选择抗原性强的14个氨基酸（356PPKKTSLPSLKSRP369）通过多肽合成技术合成并偶联KLH载体，以偶联载体的多肽免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，经间接酶联免疫法、免疫荧光法和免疫印迹法，筛选出分泌抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞JF-CD4-1-2A10，采用常规方法扩大培养上述所得到的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1单克隆抗体。
一种所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体在制备检测牙鲆CD4-1+T细胞含量变化的检测试剂中的应用。
一种所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体在制备牙鲆CD4-1+ T细胞免疫应答研究试剂中的应用。
本发明的单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示单抗能与牙鲆CD4-1多肽发生特异性结合，免疫印迹结果显示：本发明的单克隆抗体能特异性识别分子量约为45kDa的牙鲆CD4-1重组蛋白以及能识别分子量约为52kDa的牙鲆天然CD4-1蛋白。免疫荧光检测结果显示，本发明的单克隆抗体能特异性识别部分白细胞的膜表面CD4-1分子。流式细胞术分析结果显示，牙鲆外周血、脾脏、头肾中均存在CD4-1+ T淋巴细胞，其中头肾中含量最高。
在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1单克隆抗体。
本发明的优点在于：由于本发明制备了抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1单克隆抗体，为检测牙鲆CD4-1+ T淋巴细胞提供了重要工具。本发明重要的制备技术路线是：运用生物信息学软件分析预测牙鲆CD4-1分子的抗原表位，选择抗原性强的14个氨基酸序列合成，偶联上KLH，以多肽-KLH复合物作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，再经过免疫学检测筛选方法筛选出抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1单克隆抗体。这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。
由于使用的间接酶联免疫技术，通过包被未偶联KLH的牙鲆CD4-1多肽于酶标板上，使得确认该发明单抗与牙鲆CD4-1多肽发生反应。本发明的制备方法将免疫印迹法和免疫荧光、流式细胞术以及质谱分析技术结合起来，能够更加直观的显示该发明单抗与牙鲆CD4-1分子发生特异性结合反应。
附图说明
图1为牙鲆CD4-1分子跨膜区及结构域预测图。
其中A为跨膜区，B为结构域。
图2为牙鲆CD4-1分子的二级结构分析图。
图3为牙鲆CD4-1分子的抗原表位参数分析图。
其中a为亲水性，b为柔韧性，c为抗原性，d为表面可及性。
图4为牙鲆CD4-1分子的B细胞线性抗原表位预测图。
图5为ELISA方法分析单克隆抗体对牙鲆CD4-1多肽的特异性结合图。
其中1表示单抗与牙鲆CD4-1多肽发生结合反应的OD值；2表示骨髓瘤细胞上清液与牙鲆CD4-1多肽反应的OD值，即阴性对照；3表示空白对照，即未包被牙鲆CD4-1多肽组。
图6为间接免疫荧光法分析单抗与牙鲆外周血白细胞表面的特异性结合反应图。
其中A1表示在100倍物镜下观察的单抗与血细胞表面发生特异性结合反应，荧光信号强，A2为DAPI衬染细胞核，A3为A1、A2的叠加图；B1为骨髓瘤细胞上清液孵育牙鲆外周血白细胞，即阴性对照，B2为DAPI衬染细胞核，B3为B1、B2的叠加图。
图7为免疫印迹法分析单抗与牙鲆CD4-1重组蛋白特异性结合图。
其中条带1表示分子量标准蛋白；条带2表示纯化后的牙鲆CD4-1重组蛋白SDS-PAGE图谱；条带3表示单抗与牙鲆CD4-1重组蛋白发生结合反应；条带4表示阴性对照。
图8为免疫印迹法分析单抗与牙鲆脾脏白细胞的特异性结合反应图。
其中条带1表示分子量标准蛋白；条带2表示牙鲆脾脏白细胞的SDS-PAGE图谱；条带3表示单抗与牙鲆脾脏白细胞52kDa蛋白发生结合反应；条带4表示阴性对照。
图9为牙鲆CD4-1单抗与脾脏白细胞的特异性结合反应后，52kDa蛋白切胶质谱图。
其中A为牙鲆CD4-1氨基酸序列，划线部分为质谱匹配到的氨基酸序列；B为质谱结果的指纹图谱，星号标记的为匹配到的峰值。
图10为流式细胞术分析单抗与牙鲆外周血白细胞的特异性结合反应图。
其中A表示外周血白细胞的散点图；B表示外周血中牙鲆CD4-1+ T细胞比例的流式直方图。
图11为牙鲆CD4-1单抗检测外周血、脾脏和头肾中CD4-1+ T细胞比例柱状图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1：牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1抗原肽的制备及单抗的研制
一、抗原肽的制备
（1）从NCBI GenBank数据库下载牙鲆CD4-1氨基酸序列，运用TMHMM软件对牙鲆CD4-1的跨膜序列进行分析，SMART软件分析其结构域。预测跨膜区和结构域的目的在于保证分析设计的抗原肽位于牙鲆CD4-1蛋白的胞外区及Ig样结构域上。结果显示，牙鲆CD4-1的跨膜区在415~437位区域，其中1~414位区域显示为胞外区，438~464位区域为胞内区（图1A）。牙鲆CD4-1分子胞外有4个Ig样结构域，其中19~118，200~320位氨基酸为可变区，122~193，325~408位氨基酸为恒定区（图1B）。
（2）利用SOPMA Server 对牙鲆CD4-1的二级结构进行预测，研究表明，抗原表位多位于二级结构中β-转角和无规则卷曲所在位置。结果显示，牙鲆CD4-1基因中柔性结构占氨基酸总数的47.41%，其中无规则卷曲占39.22%，β-转角为8.19%。α-螺旋和延伸链即β-折叠分别占20.04%和32.54%，各种结构在牙鲆CD4-1氨基酸序列中的分布情况见图2。
（3）采用DNAStar软件对牙鲆CD4-1分子抗原表位参数进行分析，参数主要包括亲水性（Hydrophilicity Plot - Kyte-Doolittle）、柔韧性（Flexible Regions - Karplus-Schulz）、抗原性（Antigenic Index - Jameson-Wolf）和表面可及性（SurfaceProbability Plot - Emini）。综合各参数，取位于β-转角和无规则卷曲区域，取亲水性指数≥0、表面可及性指数≥1和抗原性指数≥0的氨基酸区段作为潜在表位。从图3中可以看出牙鲆CD4-1分子抗原表位可能存在的位置。
（4）采用IEDB在线预测软件，结合DNAStar软件分析结果，对牙鲆CD4-1分子抗原表位进一步预测，选取综合评分较高的区域作为候选B细胞线性抗原表位。预测出11个可能的B细胞线性表位主要位于14~39、48~56、121~130、138~174、194~219、239~252、263~285、291~300、324~332、351~387、453~463氨基酸区段（图4）。
（5）综合以上预测数据，最终确定候选抗原肽。首先，排除位于跨膜区和胞内区的抗原表位，使得抗原肽位于胞外区段和Ig样结构域上。其次，抗原肽应位于二级结构中的无规则卷曲和β-转角区域。最后，分析抗原表位参数及预测的潜在抗原表位，确定抗原肽的具体位置，同时参考人工合成多肽的难易程度，最终选择牙鲆CD4-1抗原肽为356PPKKTSLPSLKSRP369。抗原肽由公司合成并偶联血蓝蛋白载体，纯度经质谱验证。
二、免疫
用牙鲆CD4-1多肽-KLH复合物作为抗原免疫小鼠。每次的免疫剂量为1mg，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后3次免疫间隔为1周，前两次为腹腔注射，后两次为尾静脉注射：
（1）基础免疫：CD4-1多肽-KLH复合物与福氏完全佐剂等量（V/V）混匀作为抗原；
（2）加强免疫：CD4-1多肽-KLH复合物与福氏不完全佐剂等量（V/V）混匀作为抗原；
（3）二次加强免疫：CD4-1多肽-KLH复合物作为抗原；
（4）融合前三天的扩增免疫：CD4-1多肽-KLH复合物作为抗原。
三、细胞融合
（1）采用乙醚麻醉小鼠后，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液。本发明中关于实验动物的处理均符合动物福利的要求。
（2）分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀用RPMI-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用含有1%HAT的RPMI-1640 (含10%胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。
（3）取3×107个处于对数生长期的P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞，1000rpm离心3min，去上清液后，用RPMI-1640溶液重悬；
（4）将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000rpm离心3min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀成糊状；用吸管吸取预温到37℃的聚乙二醇溶液lml，滴加到离心管内，在1min内加完；然后在37℃水浴静置5min；
（5）继续滴加已经预温到37℃的RPMI-1640溶液15ml，使PEG稀释而失去作用；
（6）补加RPMI-1640溶液至40ml，经1000rpm离心3min，弃去上清液；
（7） 将沉淀的细胞用3ml 37℃的RPMI-1640（含10%胎牛血清）细胞培养液重悬，冻存2ml；
（8）将剩下的1ml细胞悬液加入(2)制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中；
（9）将培养板放入37℃，CO2浓度为4.5%的培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，大约两周后，取杂交瘤细胞培养上清液检测。
四、筛选和克隆
(1）筛选：融合后，待杂交瘤细胞群长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞。
① 包被抗原：将未偶联KLH的CD4-1多肽用碳酸盐包被液（pH 9.6）稀释至浓度为50µg/ml，加入96孔酶标板中（100µl/孔），4℃包被过夜；
② 吸出包被液，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤，每次5min，洗三次；
③ 每孔加入200µl 3%的牛血清白蛋白(PBS配)，37℃封闭1h；
④ 同②法洗涤三次；
⑤ 将杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50µl加入至酶标板，37℃温箱孵育1h；
⑥ 同②法洗涤三次；
⑦ 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50µl加入至酶标板，37℃温箱孵育1h；
⑧ 同②法洗涤三次；然后每孔加入100µl 4-硝基酚磷酸盐（pNPP）应用液，暗处反应5~20min，每孔加入50µl 2M的NaOH，稳定3~5min即可用405nm工作波长测定OD值。
以骨髓瘤细胞上清作为阴性对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时该孔为阳性。
（2）克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下：
① 采用乙醚麻醉小鼠后，无菌取出胸腺，在100目网筛上研磨，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；
② 把胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液,胸腺细胞沉淀用10ml RPMI-1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬；
③ 把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；
④ 细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100µl，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；
⑤ 放入CO2培养箱中培养；
⑥ 两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。
五、冻存
取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存液（9份RPMI-1640培养基＋1份二甲亚砜），使最终细胞密度为5×106个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80℃超低温冰箱内过夜（8~12小时）后，再浸入液氮内长期保存。本发明获得的生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，其名称为：杂交瘤细胞JF-CD4-1-2A10，保藏号为：CCTCC NO：C201879，保藏日期为：2018年03月29日。
实施例2：本发明单抗的间接酶联免疫法鉴定
(1) 包被抗原：将未偶联KLH的CD4-1多肽用碳酸盐包被液（pH 9.6）稀释至浓度为50µg/ml，加入96孔酶标板中（100µl/孔），4℃包被过夜；
(2) 吸出包被液，用PBST洗涤，每次5min，洗三次；
(3) 每孔加入200µl 3%的牛血清白蛋白(PBS配) 37℃封闭1h；
(4) 同(2)法洗涤三次；
(5) 将上述筛选和克隆出的杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50µl加入至酶标板，37℃温箱孵育1h；
(6) 同(2)法洗涤三次；
(7) 碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:4000稀释）作为第二抗体按每孔50µl加入至酶标板,37℃温箱孵育1h；
(8) 同(2)法洗涤三次；然后每孔加入100µl pNPP应用液，暗处反应5~20min，每孔加入50µl 2M的NaOH，稳定3~5min即可用405nm工作波长测定OD值。
用骨髓瘤细胞上清作为阴性对照，包被PBS作为空白对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算阳性孔与对照孔吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时为阳性。
结果：阳性孔吸光值为0.547；阴性对照为0.103，空白对照为0.098。此结果证实本发明单抗能与牙鲆CD4-1多肽发生特异性结合反应（图5）。
实施例3：本发明单抗的间接免疫荧光方法鉴定
（1）将percoll不连续密度梯度离心获得的牙鲆外周血白细胞以0.01M PBS重悬白细胞，将浓度调整到1×107个/ml。
（2）把血细胞悬液滴在干净的载玻片上，每滴10µl，在室温下湿盒中沉降1小时后取出放入丙酮中固定20分钟，取出风干。
（3）以杂交瘤上清（杂交瘤培养液）为第一抗体，阴性对照为骨髓瘤细胞上清，加在载玻片的血细胞样品上，37℃湿盒中孵育45分钟。
（4）取出载玻片，用0.01M PBS洗三次，每次5分钟。
（5）以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体为第二抗体，加在血细胞样品上，37℃湿盒中孵育45分钟。
（6）取出载玻片，同④浸洗，甘油封片。
（7）荧光显微镜下观察。
结果：本发明单抗与牙鲆部分白细胞表面发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在100倍油镜下能够观察到绿色荧光信号在细胞膜表面呈散点状分布，这与CD4-1蛋白分布于T淋巴细胞表面的事实相吻合，而阴性对照则没有观察到荧光信号（图6）。
实施例4:本发明单抗的免疫印迹法鉴定
（1）十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳：
① 将纯化的牙鲆CD4-1重组蛋白和牙鲆脾脏白细胞分别加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3~5min；
② 将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10µl，在恒流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流（50-70mA），电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；凝胶部分用于转膜，部分放置在考马斯亮蓝染液中染色1h。
③ 剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22µm)以电转移缓冲液（电转移缓冲液：25mmol/L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20%甲醇，pH 8.3）润湿，放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的“三明治”；
④ 将“凝胶三明治”置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；电泳恒流200mA，通电5小时；
⑤ 转移完毕，取出硝酸纤维素膜。
（2）免疫印迹：
① 将硝酸纤维素膜用PBS洗10分钟，然后置3%的牛血清白蛋白溶液（PBS配）中封闭1h，37℃；
② 用PBST洗3次，每次5分钟；
③ 将硝酸纤维素膜置于杂交瘤细胞培养上清中，37℃缓慢摇动1小时；以骨髓瘤细胞上清孵育硝酸纤维素膜作为阴性对照；
④ 同② 法洗涤三次；
⑤ 将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(1:4000稀释)中，37℃缓慢摇动1小时；
⑥ 同② 法洗涤三次；
⑦ 把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液（NBT-BCIP发色液）中发色，直到颜色清晰为止；
⑧ 用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
同时把放置在考马斯亮蓝中的凝胶在沸水中煮至条带清晰，硝酸纤维素膜上发出紫褐色条带的位置对应到凝胶上，将对应的条带小心切下送去质谱。
结果：本发明单抗与牙鲆CD4-1重组蛋白45kDa发生特异性反应（图7），与牙鲆脾脏白细胞52kDa蛋白发生特异性反应（图8），显示紫褐色条带，而阴性对照无条带显示。将52kDa对应的凝胶上条带切下质谱，质谱结果证明单抗所识别的蛋白确实为牙鲆CD4-1蛋白（图9）。
实施例5：本发明单抗的流式细胞术鉴定
（1）选取暂养一周后的健康牙鲆，体长15 cm，采用乙醚麻醉后，于尾静脉抽取牙鲆外周血白细胞，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取牙鲆外周血白细胞。将提取的牙鲆外周血白细胞用无菌PBS缓冲液稀释成细胞密度为1×106 cells/ml的细胞悬液。
（2）取细胞悬液500μl，实验组加入500μl鼠抗牙鲆CD4-1的单克隆抗体，对照组加入500μl骨髓瘤细胞上清，37℃孵育1h。
（3）于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
（4）用1ml FITC标记的羊抗鼠Ig单抗重悬（3）中洗涤离心后的细胞沉淀，37℃孵育1h。
（5）于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
（6）离心洗涤完成后，用500μl无菌PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
结果：阴性对照样品流式分析的直方图呈现单峰，未有阳性反应细胞群，而与本发明单抗孵育的牙鲆白细胞流式分析直方图呈现双峰，说明本发明单抗可与牙鲆部分白细胞发生特异性结合，CD4-1阳性细胞比率为7.9%（图10）。
实施例6：本发明单抗在检测牙鲆外周血、脾和头肾中CD4-1+ T细胞数量比例中的应用
（1）选取暂养一周后的健康牙鲆，体长15 cm，采用乙醚麻醉后，于尾静脉抽取牙鲆外周血白细胞，同时取牙鲆的脾脏和头肾组织，利用percoll不连续密度梯度离心分离获取牙鲆外周血、脾脏及头肾的白细胞。将提取的牙鲆各组织白细胞用无菌PBS缓冲液稀释成细胞密度为1×106 cells/ml的细胞悬液。
（2）取从每个组织样品分别准备两份500μl白细胞悬液，一份为检测样品，一份为对照样品，往检测样品中加入500μl牙鲆CD4-1单克隆抗体，同组织对照组加入500μl骨髓瘤细胞上清，37℃孵育1h。
（3）于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
（4）用1ml FITC标记的羊抗鼠Ig单抗重悬（3）中洗涤离心后的细胞沉淀，37℃孵育1h。
（5）于680g，4℃条件下离心收集细胞，并用无菌PBS重悬洗涤细胞，洗涤三次，每次5分钟。
（6）离心洗涤完成后，用500μl无菌PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。
结果：各组织阴性对照样品流式分析的直方图呈现单峰，未有阳性反应细胞群，而与本发明单抗孵育的牙鲆各组织白细胞流式分析直方图呈现双峰，说明本发明单抗可与牙鲆部分白细胞发生特异性结合，检测结果显示牙鲆外周血白细胞中CD4-1+ 细胞数量比例为7.6%，脾脏组织白细胞中的CD4-1+ 细胞数量比例为12.3%，头肾组织白细胞中的CD4-1+ 细胞数量比例为16.4%（图11）。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。

Claims (8)

1.一种抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞JF-CD4-1-2A10，保藏号为：CCTCC NO：C201879，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年03月29日的杂交瘤细胞分泌的。
2.如权利要求1所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体，其特征在于：所述杂交瘤细胞JF-CD4-1-2A10是以牙鲆CD4-1多肽-KLH复合物作为抗原制备的。
3.如权利要求2所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体，其特征在于：所述牙鲆CD4-1多肽的氨基酸序列结构为：356PPKKTSLPSLKSRP369。
4.如权利要求1所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体与牙鲆部分白细胞表面发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，在100倍油镜下能够观察到绿色荧光信号在细胞膜表面呈散点状分布。
5.如权利要求1所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体与牙鲆CD4-1重组蛋白45kDa发生特异性反应，并与牙鲆脾脏白细胞52kDa蛋白发生特异性反应，显示紫褐色条带。
6.一种如权利要求1-5任意一项所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：运用生物信息学软件预测分析牙鲆CD4-1抗原表位，选择抗原性强的14个氨基酸（356PPKKTSLPSLKSRP369）通过多肽合成技术合成并偶联KLH载体，以偶联载体的多肽免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，经间接酶联免疫法、免疫荧光法和免疫印迹法，筛选出分泌抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞JF-CD4-1-2A10，采用常规方法扩大培养上述所得到的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1单克隆抗体。
7.一种如权利要求1-5任意一项所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体在制备检测牙鲆CD4-1+ T细胞含量变化的检测试剂中的应用。
8.一种如权利要求1-5任意一项所述抗牙鲆T细胞表面标志分子CD4-1的单克隆抗体在制备牙鲆CD4-1+ T细胞免疫应答研究试剂中的应用。
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