CN114292812A - 一种流式细胞术分选牙鲆cd4+t淋巴细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流式细胞术分选牙鲆CD4+T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：取牙鲆头肾组织，经Percoll密度梯度离心法，获得头肾淋巴细胞；在头肾淋巴细胞中加入抗牙鲆CD4‑1和CD4‑2分子的单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG孵育；以磷酸盐缓冲液为流式细胞仪的鞘液，用胎牛血清润洗1.5mL无酶离心管，将其置于流式细胞仪分选仓中的流式收集管上；孵育抗体后的淋巴细胞经流式细胞仪分析，设置CD4+T淋巴细胞门进行细胞分选；荧光显微镜下观察分选细胞的纯度，并通过PI和台盼蓝染色测定细胞的活性。本发明通过使用适合于鱼类淋巴细胞的磷酸盐缓冲液和收集分选细胞的装置，创造性地建立了流式细胞术分离海水鱼类CD4+T淋巴细胞的方法，具有重要的科学意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于海洋脊椎动物细胞生物学技术领域，涉及一种利用流式细胞仪分选牙鲆CD4+ T淋巴细胞的方法。
背景技术
牙鲆（ Paralichthys olivaceus ）是我国北方重要的海水养殖经济鱼类。近年来，养殖过程中频发的细菌和病毒性疾病带来了严重经济损失，制约了牙鲆养殖业的健康发展。疫苗接种是防治水产动物病害的一种有效手段。疫苗作用的发挥依赖机体适应性免疫机制的激活，这一过程中T淋巴细胞扮演着重要角色，CD4+ T细胞通过分泌细胞因子参与调控其它免疫细胞的活化和特异性抗体的产生。利用特异性识别CD4分子的单克隆或多克隆抗体，CD4+ T淋巴细胞已在多种鱼类中被鉴定出来。但由于水生动物独特的生理特性，例如渗透压和变温，抗体等工具的欠缺以及技术参数的缺失，导致无法实现高纯度和高活性的鱼类CD4+ T淋巴细胞分选。
近年来，随着流式细胞仪技术的发展，越来越广泛地应用于对免疫细胞或某一类特定细胞的分选，取代了磁珠分选细胞的技术。流式细胞仪技术具有分选标准多样、分选纯度高、细胞活性好、单个细胞等优点。该技术对哺乳动物细胞的分选具有较为成熟的试剂和操作规程，但是在具体操作过程中，由于流式细胞仪参数的调节和技术操作不规范，会导致无法有效地分离纯度高、活性好的细胞。目前，有关流式细胞术运用于鱼类特定免疫细胞分选的报道较少，主要受限于水生动物独特的生理特性，例如渗透压和变温，特异性抗体的欠缺以及分选技术参数的缺失。利用流式细胞仪商品化的试剂和适用于哺乳动物细胞分选的参数，无法实现鱼类免疫细胞高纯度、高得率和高活性的分选，导致有关鱼类免疫细胞的深入测序，亚群精细解析和功能性实验无法开展。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种流式细胞术分选牙鲆CD4+ T淋巴细胞的方法，通过该方法能够分选出高纯度、高活性和高得率的牙鲆CD4+ T淋巴细胞，能够满足后续的单细胞测序或功能性实验。
一种流式细胞术分选牙鲆CD4+ T淋巴细胞的方法，其特征在于所述方法的包括如下步骤：
步骤一，取牙鲆头肾组织，置于铁纱网上，加抗凝剂研磨成单细胞悬液，离心去除红细胞，取上清液经Percoll密度梯度离心，获得牙鲆头肾淋巴细胞；
步骤二，将牙鲆头肾淋巴细胞调整密度后，加入抗牙鲆CD4-1和CD4-2分子的单克隆抗体孵育，随后再加入FITC标记的羊抗鼠IgG孵育，作为后续流式细胞仪的进样；
步骤三，以适用于鱼类细胞渗透压的磷酸盐缓冲液为流式细胞仪的鞘液，用胎牛血清润洗1.5mL无酶离心管，使用自制细胞收集装置准备收集分选的细胞；
步骤四，以孵育抗体后的牙鲆头肾淋巴细胞上样，通过流式细胞仪进行分析，对牙鲆头肾淋巴细胞中的CD4+ T淋巴细胞设置圈门，调整流式细胞仪的分选角度，进行细胞分选；
步骤五，分选后的细胞经离心富集后，通过流式细胞仪回测，分析分选后细胞的纯度，对细胞进行PI染色，流式细胞仪分析细胞的活性，同时吸取富集后的细胞滴片衬染DAPI，置于荧光显微镜下观察；
步骤六，利用台盼蓝对分选后的细胞进行染色，滴加在计数板上，置于显微镜下观察，进一步确定细胞的存活率，同时吸取细胞放置于96孔板中进行培养观察。
步骤三所述的适用于鱼类细胞渗透压的磷酸盐缓冲液配方为：NaCl 8 g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4•12H2O 2.9 g，蒸馏水定容至1L，pH= 7.4，此配方明显区别于配方为由含盐缓冲液和防腐剂组成的商品化鞘液。
步骤三所述的胎牛血清浓度为血清原液，且剩余约80 µL胎牛血清原液在1.5mL无酶离心管中。
步骤三所述的自制细胞收集装置为润洗过胎牛血清的1.5mL无酶离心管置于流式分选收集管上方，且在1.5mL无酶离心管中剩余约80 µL胎牛血清原液。
本发明的优点在于：本发明通过使用适合于鱼类淋巴细胞的磷酸盐缓冲液和收集分选细胞的装置，创造性地建立了流式细胞术分离海水鱼类CD4+ T淋巴细胞的方法，通过该方法能够实现牙鲆CD4+ T淋巴细胞高纯度、高活性和高得率的分选，解决了使用商品化的鞘液和分选收集装置不能获得海水鱼类淋巴细胞的问题，使得分选后的细胞可以满足后续单细胞测序或其它功能性实验，是对海水鱼类免疫细胞功能研究的技术突破，具有重要的科学意义和应用价值。
附图说明
图1为自制收集装置用于流式细胞仪分选后的牙鲆CD4+ T淋巴细胞收集的示意图。
图2为流式细胞仪分析牙鲆头肾淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞的比例图。
图中，A为淋巴细胞散点图，B为去除细胞粘连体，C为CD4+ T淋巴细胞比例的十字象限图，D为阳性比例的圈门设置。
图3为流式细胞仪分析分选后的CD4+ T细胞纯度和活性图。
图中，A为分选后CD4+ T淋巴细胞的十字象限图，B为分选后阳性细胞的纯度图，C为PI染色分析分选后细胞的活性图。
图4为免疫荧光观察分选后的细胞纯度图。
A为分选后的CD4+T淋巴细胞带有绿色荧光信号，B为阳性绿色荧光信号和DAPI衬染细胞核后的叠加图，Bar=20µm。
图5为台盼蓝染色分析细胞活性图。
图中，A为在计数板上观察台盼蓝染色分选后的CD4+T淋巴细胞，Bar=200µm；B为分选富集后的细胞置于96孔板中在显微镜下观察的图像，Bar=20µm。
图6为台盼蓝染色分析用商品化鞘液分选牙鲆CD4+T淋巴细胞的活性图。
具体实施方式
为更加清楚解释本发明的技术方案，下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1：
步骤一，取一条约0.7 ± 0.2 kg左右的健康牙鲆，经MS-222麻醉后，取出牙鲆头肾组织，放置于200目的铁纱网上，用药匙轻轻按压研磨，边按压边滴加适用于鱼类细胞的抗凝剂（RPMI-1640 50 mL，肝素钠0.0067 g，BSA 0.5 g），制备成30mL的头肾组织单细胞悬液；在4℃条件下，经100 × g离心10 min去除头肾中的红细胞和大的组织块，取上清液缓慢加入到配制好的1.02/1.07 g/cm3 Percoll（20mL体系的配方为1.07 g/cm3：9.8 mLPercoll，2 mL 1.5M NaCl，8.2 mL超纯水；1.02 g/cm3：2.16 mL Percoll，2 mL 1.5MNaCl，15.84 mL超纯水）密度梯度上，840× g离心30 min后，1mL注射器吸取1.02/1.07 g/cm3 Percoll密度梯度界面层的淋巴细胞，收集细胞，并用适用于鱼类淋巴细胞的磷酸盐缓冲液（PBS，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4•12H2O 2.9 g，蒸馏水定容至1L，pH7.4）清洗2-3次，每次400× g离心5min，所有离心操作均在4℃条件下进行。
步骤二，将牙鲆头肾淋巴细胞用PBS调整密度为5× 106-1× 107个/mL，分为阳性组和对照组，阳性组加入抗牙鲆CD4-1和CD4-2分子的单克隆抗体（1:1000稀释，其制备方法分别参考中国专利CN 2018102846126和2018102846111），对照组加入鼠阴性血清（1:1000），在37℃条件下，孵育1.5h，PBS清洗2-3次后，加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1:1000），37℃孵育1h。PBS清洗2-3次后，1mL PBS重悬细胞，即可进行后续的上机和分选操作，流式细胞仪为BD Aria Ⅲ Fusion。
步骤三，在流式细胞仪开机之前，提前配制10L PBS缓冲液，经0.22 µm滤膜抽滤和高温高压灭菌处理，将流式细胞仪的商品化鞘液换成适用于鱼类细胞渗透压的10L PBS缓冲液。采用自制收集装置收集流式细胞仪分选后的牙鲆CD4+ T淋巴细胞：用胎牛血清原液润洗1.5mL无酶离心管，剩余约80 µL胎牛血清原液在1.5mL无酶离心管中，使得分选后的细胞能够舒缓落入离心管中，将离心管置于流式细胞仪分选仓中的流式收集管上，用1.5mL无酶离心管来收集分选后的细胞，可以缩短分选过程中细胞落下的距离，减少细胞损伤，以此来提高细胞存活率。采用自制收集装置的收集如分选后的细胞如图1，先将胎牛血清原液润洗1.5mL无酶离心管，剩余约80 µL胎牛血清原液在1.5mL无酶离心管中，将离心管置于流式细胞仪分选仓中的流式收集管上，用1.5mL无酶离心管来收集分选后的细胞。
步骤四，流式细胞仪按照操作手册上的规范，正常开机，通过CST微球校正流式细胞仪液流及荧光，通过Accordrop试剂调节液滴延迟。取孵育抗体后的牙鲆头肾淋巴细胞上样进行分析，首先通过阴性对照组调整电压，取阳性组细胞上样记录分析结果，对牙鲆头肾淋巴细胞中的CD4+ T淋巴细胞设置圈门。结果表明，孵育CD4抗体后的淋巴细胞，部分细胞显示出荧光信号阳性（Q4），细胞分为两群（Q3和Q4），P3门内为阳性细胞比例，即牙鲆头肾淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞比例为25.6±1.3%（参见图2）。调整流式细胞仪的分选角度，确保分选后的细胞能够落在1.5mL收集管的液面中央，对P3门内的CD4+ T淋巴细胞进行分选，直至1.5mL离心管收集约1mL细胞后，停止收集。
步骤五，分选后的细胞在4℃条件下，400× g离心5min，弃上清，加入PBS清洗1-2次，200 µL PBS重悬细胞，取100µL细胞加入PI染料，室温下染色10min，通过流式细胞仪上机回测，验证分选后细胞的纯度，同时分析细胞的活性。同时将细胞衬染DAPI，在荧光显微镜下观察阳性信号。结果显示，分选后的细胞纯度高达99.4±0.5%，PI染色比例为3.4±0.8%，表明活细胞比例高达96.6%（参见图3）。荧光显微镜下显示分选后的细胞均带有绿色点状荧光信号，分选纯度较高（参见图4）。
步骤六，另取100µL离心富集后的细胞加入台盼蓝染料进行染色，吸取细胞滴加在计数板上，显微镜下观察细胞存活率并进行计数。结果显示，分选后的细胞台盼蓝着色极少，表明细胞存活率较高，在96孔板中对分选后的细胞短暂培养后进行观察发现，细胞浑圆透亮，表明细胞状态较好（参见图5）。
作为对比，在其它参数不变，采用商品化鞘液，且不使用自制收集装置的条件下，对分选后的牙鲆CD4+ T淋巴细胞进行台盼蓝染色并观察，发现分选后的细胞多被台盼蓝着色，表明细胞存活率低，且细胞出现破裂、皱缩（参见图6）。
通过对比，可以发现本发明通过使用适合于鱼类淋巴细胞的磷酸盐缓冲液和收集分选细胞的装置，能够实现流式细胞术对牙鲆CD4+ T淋巴细胞高纯度、高活性和高得率的分选，解决了使用商品化的鞘液和分选收集装置不能获得海水鱼类淋巴细胞的问题，取得了良好的效果。
Claims (4)
1.一种流式细胞术分选牙鲆CD4+T淋巴细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取牙鲆头肾组织，置于铁纱网上，加抗凝剂研磨成单细胞悬液，离心去除红细胞，取上清液经Percoll密度梯度离心，获得牙鲆头肾淋巴细胞；
步骤二，将牙鲆头肾淋巴细胞调整密度后，加入抗牙鲆CD4-1和CD4-2分子的单克隆抗体孵育，随后再加入FITC标记的羊抗鼠IgG孵育，作为后续流式细胞仪的进样；
步骤三，以适用于鱼类细胞渗透压的磷酸盐缓冲液为流式细胞仪的鞘液，用胎牛血清润洗1.5mL无酶离心管，使用自制细胞收集装置准备收集分选的细胞；
步骤四，以孵育抗体后的牙鲆头肾淋巴细胞上样，通过流式细胞仪进行分析，对牙鲆头肾淋巴细胞中的CD4+T淋巴细胞设置圈门，调整流式细胞仪的分选角度，进行细胞分选；
步骤五，分选后的细胞经离心富集后，通过流式细胞仪回测，分析分选后细胞的纯度，对细胞进行PI染色，流式细胞仪分析细胞的活性，同时吸取富集后的细胞滴片衬染DAPI，置于荧光显微镜下观察；
步骤六，利用台盼蓝对分选后的细胞进行染色，滴加在计数板上，置于显微镜下观察，进一步确定细胞的存活率，同时吸取细胞放置于96孔板中进行培养观察。
2.根据权利要求1所述的流式细胞术分选牙鲆CD4+T淋巴细胞的方法，其特征在于，步骤三所述的适用于鱼类细胞渗透压的磷酸盐缓冲液配方为：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4•12H2O 2.9 g，蒸馏水定容至1L，pH =7.4。
3.根据权利要求1所述的流式细胞术分选牙鲆CD4+T淋巴细胞的方法，其特征在于，步骤三所述的胎牛血清浓度为血清原液。
4.根据权利要求1所述的流式细胞术分选牙鲆CD4+T淋巴细胞的方法，其特征在于，步骤三所述的自制细胞收集装置为润洗过胎牛血清的1.5mL无酶离心管置于流式分选收集管上方，且在1.5mL无酶离心管中剩余约80 µL胎牛血清原液。
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