JPH0819157B2 - 血清不含およびミトゲン不含ｔ細胞生長因子およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、胸腺誘導リンパ球のための血清不含および
ミトゲン不含生長因子（すなわち、Ｔ細胞生長因子）お
よびその製造法に関する。また、本発明は、腫瘍に悩む
患者の処置およびキラー細胞の生長の改良における、前
述のＴ細胞の使用に関する。

Ｔ細胞生長因子（TCGF）は、インタールーキン（Inte
rleukin）２（IL2）とも呼ばれ、遺伝質発生（blastoge
nesis）および胸腺に依存する細胞毒性リンパ球（Ｔ細
胞）の増殖を活性化する機能を有するタンパク質であ
る。以後、Ｔ細胞生長因子（TCGF）およびインタールー
キン２（IL2）を、同一物質の表示のために互換的に使
用する。IL2は細胞培養においてＴリンパ球系統の生長
を支持する能力によつて定義される。IL2は、特定の細
胞毒性および生来のキラ性質によつて区別されるＴ細胞
の下位固体群を活性化する。“生来のキリング（natura
l killing）”は、このような細胞の腫瘍細胞を、前も
つて感作しないで、殺す能力を意味する。これらの細胞
は、自発的悪性腫瘍に対する免疫反応において、最も重
要なエフエクター細胞である。自然キラー細胞は、腫瘍
に対する体中の防御の最初の系統であるので、重要であ
る。腫瘍患者における自然キラー細胞の活性は抑制され
ることが発見された。したがつて、患者における自然キ
ラー細胞が刺激されて活性になると、腫瘍細胞の生長
は、停止されうる。

さらに、IL2はウイルスの病気に対する防御に使用で
きることが示唆された。その上、決定的な役割は移植組
織の拒否におけるIL2に帰すことができる。移植手術後
の患者におけるIL2の生産を抑制することにより、移植
組織を拒否する患者の可能性は実質的に減少する 前述のように、腫瘍患者は、IL2を生成する生体外の
能力の欠乏に帰する細胞の免疫系の機能に欠けることが
発見された。腫瘍は生き残るためにこの欠乏を起こし、
そして起こさなくてはならないと仮定すると、治療手順
は、不活性の自然キラー細胞を活性化するために、IL2
を含有する製剤を患者に供給することによつて確立する
ことができる。

このような治療手順は、インターフエロンについての
それに類似する。最近、ほとんどの興味はインターフエ
ロンのガンへの効果に向けられた。インターフエロンは
ウイルスに感染された細胞を殺すとき有効であることが
知られているが、ガンへのその効果はまだ未知である。
ヒトに有効であるためには、ヒトの血液から抽出しなく
てはならないということは種の特異性、すなわちインタ
ーフエロンの特異性であることに注意することは重要で
ある。他方において、ウシの血液および脾からの細胞を
用いて生産したIL2はヒトの細胞を活性化することがわ
かつた。これはまたブタの血液および脾にも適用され
る。しかし、マウスまたはラツトから抽出したIL2は、
供給体がヒトに生物学的に関係がなさすぎる種に属する
ので、ヒトの細胞を活性化しない。ウシ、ブタおよびヒ
ツジのような大型の動物から抽出したIL2は、ヒトの細
胞を活性化するであろう。IL2では、供給体の血液に含
まれる肝炎のウイルスが患者へ導入される危険は、ウシ
またはブタのリンパ球を用いることにより回避できると
いうことにおいて意味がある。他の利点は、ウシおよび
ブタのリンパ球の供給がヒトの細胞よりも非常に大きい
ということである。

Lucas,et al.,“Parameters of Lymphoeyte Activati
on（リンパ球活性化のパラメーター）”によれば、IL2
はインターフエロンと同一でないが、インターフエロン
を含有する刺激された白血球の上層中に存在する。多
分、白血球インターフエロンの製剤の治療学的効果の一
部分はその中に含有されるIL2のためである。

IL2の製造は、Alvarez,et al“Human T-Cell Growth
Factor（ヒトのＴ細胞生長因子）”、J.of Immunology,
123、３、977（1979）およびGillis,et al.,“T-Cell g
rowth Factor:parameters of production and quantita
tive microassay for activity（Ｔ細胞生長因子：製造
のパラメーターおよび活性の定量的マイクロアツセ
イ）”、J.of Immunology,120、2027（1978）に考察さ
れている。一般に、IL2は末梢周辺単核血液細胞をミト
ゲンまたは抗原で刺激することによつて製造される。フ
イトヘムアグルチニン−（PHA）不含Ｔ細胞は、Fagani,
et al.,“Removal of PHA from conditioned medium by
affinity chromatography（親和性クロマトグラフイー
によるコンデイシヨニングした培地からのPHAの取り出
し”、J.of Immunological Methods,33、313（1980）中
に考察されている。その中に記載されている方法は、め
んどうであるが、血清を含有する生成物を提供する。多
数のタンパク質類を含有する血清の存在は、IL2の真の
効果をマスクすることがあり、そしてこのような血清含
有製剤の反復注射は患者にアレルギー反応およびアナフ
イラキシー反応をいつもきまつたように起こす。その
上、血清が沈殿し、フイルターの孔を詰まらせるので、
濃縮することができない。

本発明は、血清不含およびミトゲン不含Ｔ細胞生長因
子の製造に成巧した。従来、血清が細胞の生長に必要で
あるということが認められてきた。結局、血清は細胞の
培養において常に使用される。血清不含の製造により、
本発明の生長因子は高度に濃縮することができ、そして
その活性は300〜500倍増加することができる。その上、
毒性物質、たとえば、レクチンは生長因子中に存在しな
いので、生長因子を抽出した細胞はその活性が失なわれ
るまでに数回使用することができる。結局、抽出法の効
率は先行技術よりも実質的に改良できる。

本発明によれば、生長因子は、末梢単核血球を供給体
の血液または脾から分離し、この血球を血清およびミト
ゲンを補充した組織培養基の存在で刺激し、刺激した血
球を洗浄して血清およびミトゲンを除去し、そして血球
をコンデイシヨニングして生長因子を組織培養基の液相
へ移すことによつて、得られる。

したがって、本発明によれば、ミトゲンによって刺激
したヒト、ウシまたはブタの末梢単核血球のコンデイシ
ヨニング培養物に由来し、該培養物を0.2〜0.4ミクロン
の細孔を有する濾過媒体で濾過し、そしてタンパク質を
吸収しない限外濾過フイルター膜で限外濾過して得られ
た細胞不含で、血清不含およびミトゲン不含のＴ細胞生
長因子調製物、が提供される。

血清不含およびミトゲン不含Ｔ細胞生長因子は、腫瘍
の患者中の自然キラー細胞の生長を刺激して腫瘍細胞の
生長を防止し、あるいは腫瘍細胞を除去するために使用
できる。

本発明によれば、血清およびミトゲンを含有しないＴ
細胞（胸腺誘導リンパ球）生長因子（TCGF）が提供され
る。新規なTCGFを製造するために、次の方法、すべて無
菌条件下で実施した、を採用できる。

第１の実施態様において、血液を供給体から抜き出
す。供給体として、ウシ、ブタおよびヒトを使用でき
る。本発明のＴ細胞生長因子は種に特異性ではない。し
たがつて、ウシまたはブタの血液からの生長因子の抽出
物をヒトの患者に投与することができる。ヒトの血液は
供給が非常に制限され、そして肝炎の担体である危険が
あるという事実からみて、ウシおよびブタの血液は好ま
しい。抜き出した血液をヘパリンのような抗凝固剤と混
合する。末梢単核血球を、この分野で知られた方法を用
いて血液から単離する。有用な単離法の一例として、Fi
coll-hypaque（フイコール−ハイパーク）として商業的
に入手できる、高い密度のポリマーの溶液を含有する管
へ血液を層状に入れ、そして遠心分離する。末梢単核血
球はポリマー溶液より上に集められ、そして注意して取
り出す。フイコール−ハイパーク溶液はわずかに毒性で
あるので、取り出しはよく注意して実施しなくてはなら
ない。このようにして得られた末梢単核血球を、滅菌溶
液で数回、通常３回洗浄して、フイコール−ハイパーク
溶液を完全に除去する。洗浄とは、血球を滅菌溶液中に
おだやかに懸濁し、そして遠心分離して溶液から再び分
離する。低い遠心速度と短かい時間（たとえば、10分間
300G）を用いて血球の割れや破壊を防ぐ。血球の洗浄に
有用な滅菌溶液は、商業的に入手できる配合物Roswell
Park Memorial Institute（ロスウエル・パーク・メモ
リアル・インスチチユート）（RPMI）1640である。遠心
分離後、上層を廃棄し、そして滅菌溶液の新鮮な部分を
それに加える。次いで洗浄を反復する。次いで、血球は
それ以上の処理を行うことができる。このような分離を
大幅に短縮する、血液から単核血球を自動的に分離する
機械は、現在入手できる。

別法として、ウシ、ブタまたはヒトから脾を、血液の
代わりに、単核血球に非常に富んだ源として使用でき
る。脾から単核血球を分離する方法は、この分野で知ら
れている。一般に、脾を滅菌塩溶液中で細かく分割し、
次いでステンレス鋼製の網に通す。次いで単核血球を含
有するこのようにして得られた懸濁液を、血液について
前述した手順に従つて、処理してそれから血球を抽出す
る。脾かな単核血球を抽出することにより、大量の血球
が得られる。典型的には、２〜10×10¹²の血球を供給体
の血液から集めることができる。

一例として、脾を供給体から取り出す。その後、それ
を滅菌塩溶液〔たとえば、商業的に入手できるハンク
（Hank）のBalanced Salt Solution（釣り合わせた塩溶
液）〕中で1mmの大きさの片に細かく分割し、そして約
0.1mmの網目を有するステンレス鋼製の網に強制的に通
す。このようなステンレス鋼製の網は、商業的に容易に
入手できる。次いで、このようにして得られた血球含有
懸濁液は、フイコール−ハイパークのこう配上に層状に
配置して、前述のように、単核血球を抽出する。通常、
数グラムの血球が得られる（1gは約10¹²の血球を含有す
る）。

次の工程において、単核血球をミトゲンで刺激する。
この工程において、血球を血清とミトゲンを補充した組
織培養基中に懸濁し、そして適当な期間培養する。有用
な組織培養基はRPMI1640である。RPMI1640に、15％vol/
volのヒトのAB血清とRPMI1640の1mlあたり４ミクログラ
ムのミトゲンを補充する。本発明においてとくに好まし
いミトゲンはフイトヘムアグルチニン（PHA）である。
他の有用なミトゲンの例は、コンカナバリンＡ（Con
A）、Escherichia coliリポ多糖（LPS）およびアメリカ
ヤマゴボウ（Pokeweed）のミトゲン（PWM）である。懸
濁液中の血球密度は、RPMI1640の1mlあたり約３×10⁶に
調整する。この懸濁液を、約５〜10％、好ましくは約7.
5％の二酸化炭素を含有する雰囲気中で、約37℃の温度
において約４〜12時間培養する。培養は４〜12時間実施
できるが、４時間は最適であることがわかつた。この培
養工程において用いる実験条件（たとえば、温度、湿
度、雰囲気中のCO₂の量）は、組織培養においてしばし
ば用いられている“標準”条件に類似し、このような条
件はこの分野においてよく知られている。

培養後、血球を溶液から、たとえば、遠心分離によ
り、分離する。このようにして得られた上層をデカント
し、好ましいならば、再循環のため保持する。しかしな
がら、使用前に、バクテリアの存在を防ぐため、上層を
過することが好ましい。血球を血清とPHAを含有しな
い組織培養基、たとえばRPMI1640の新らしい部分で数回
洗浄して、血球ペレット中に存在する血清とミトゲンの
すべてを除去する。洗浄手順は血球を培養基中に懸濁
し、次いで、前述のように、血球をそれから分離するこ
とからなる。３回の洗浄（すなわち、RPMI1640の新らし
い部分中の３回の連続した懸濁および遠心分離、洗浄溶
液は各洗浄後廃棄する）は、血清およびミトゲンの実質
的にすべてを除去するのに十分であることがわかつた。
放射性同位体標識法を用いて得られた結果は、３回の洗
浄後、血清およびミトゲンの実質的にすべてが除去され
たことを証明する。

さらに、３回の洗浄後、血球ペレット中に洗浄前に存
在する物質の希釈率は約30×10⁶と推定される。したが
つて、洗浄された血球と接触する血清およびミトゲンの
濃度は実質的にゼロ付近に減少する。洗浄後、血球を血
清不含、ミトゲン不含の組織培養基、たとえば、RPMI16
40中に再び懸濁する。この懸濁液は、そのままコンデイ
シヨニングして生長因子を血球から液相へ移すことがで
きる。

コンデイシヨニング工程において、RPMI1640中の細胞
の懸濁液を組織培養において用いる標準の条件下に、約
12〜20時間、好ましくは約15〜約20時間、最も好ましく
は約18時間培養する。

培養によるコンデイシヨニング後、血球を懸濁液か
ら、たとえば遠心分離により、分離する。生成物のＴ細
胞生長因子を含有する上層を集める。血球に関すると、
血球は培養基、血清およびPHAからなる上層で再刺激す
ることができる。上層および血球の再循環は５回まで実
施できる。

Ｔ細胞生長因子（IL2）含有上層をさらに過する。
フイルターは好ましくは約0.2〜0.4ミクロンの開口を有
する。この過工程は好ましくは本発明の方法に含め
て、血球不含上層の製造を保証する。次いで過した上
層を処理して、より濃縮された生成物を得ることができ
る。上層を濃縮するために、上層を、タンパク質を吸収
しない限外フイルターで限外過する。IL2はタンパク
質と信じられるので、常態でタンパク質を吸収する限外
フイルターは明らかに排除すべきである。この濃縮工程
の目的は、塩、糖および水のような小さい分子を上層か
ら除去することである。こうして、10,000〜30,000の分
子量の過範囲を有する限外フイルターを使用すべきで
ある。とくに有用な限外フイルターの例は、アミコン・
カンパニー（米国）製のYM-10およびYM-30型限外フイル
ターである。それらの限外フイルターはタンパク質を吸
収しない。限外フイルターの膜の上部に保持された液状
生成物は、所望の目的生成物である。通常、50部〜250
部の濃縮率が得られる。液体の形の最終生成物は、４℃
で約１〜２か月間そして−20℃で約１年間、その活性を
失なうことなく、頂蔵することができる。こうして、ヒ
ト、ウシまたはブタの供給体の血液または脾から血清不
含およびミトゲン不含Ｔ細胞生長因子が得られる。ウシ
の供給体も使用できる。

前述の手順において、培養工程を除いた実験工程のす
べては室温すなわち20〜25℃において実施する。さら
に、全体の方法は無菌条件下で実施する。これに関し
て、滅菌した限外フイルターを入手できないとき、液状
生成物を使用前再滅菌することが必要である。また、組
織培養基を液状生成物から除去し、それを患者への注射
用の注入溶液で置換することが望ましいであろう。

生成物のＴ細胞生長因子がミトゲン（PHA）を含有し
ないことを確認するために、２組の実験を実施した。実
験の第１組は、血球の刺激に用いるPHAを放射線標識付
けすることからなる。生ずるＴ細胞生長因子の300倍の
濃縮物において、もとの活性の１％より小が測定され
る。実験の第２組において、抗PHA抗体を生成物のＴ細
胞生長因子に加え、次いでこれを微小力価の測定（micr
otitering）に付す。対照試料と抗PHA抗体含有試料とを
比較すると、両試料にＴ細胞生長因子の活性に差がない
ことを示される。

生成物のＴ細胞生長因子が血清を含有しないことを示
すために、血清の50％を構成するアルブミンを本発明の
血球刺激工程においてマスカーとして使用する。マンシ
ニ（Mancini）が示唆する放射免疫拡散テストを用い
て、生成物のＴ細胞生長因子中のアルブミンの活性を決
定する。アルブミンを血清のマスカーとして使用した本
発明に従つて得られたＴ細胞生長因子の300倍の濃縮物
において、アルブミンの活性は測定されない。それゆ
え、前述の試験は本発明のＴ細胞生長因子がミトゲン不
含および血清不含であることを明らかに確立する。

前述のように、血清不含Ｔ細胞生長因子は本発明の重
要な特徴である。血清の存在はIL2の活性に影響をおよ
ぼさないが、血清不含の製剤は使用における危険を低下
する。患者は血清タンパク質に対してアレルギー生とな
ることもある。その上、血清不含Ｔ細胞生長因子は限外
フイルターの使用により濃縮できる。このような濃縮
は、血清がフイルターの孔を詰まらせるので、血清の存
在では不可能である。

本発明の他の実施態様において、Ｔ細胞生長因子を製
造する別の方法が提供される。この方法はＴ細胞がガラ
ス、プラスチックおよびナイロンのような支持体へ付着
するＴ細胞生長因子生成血球（producer cell）と支持
体へ付着しないＴ細胞生長因子応答血球（responder ce
ll）とからなるという事実に基づく。血球を適当な支持
体と接触させることにより、生成血球は支持体へ付着
し、そして所望のＴ細胞生長因子を生成するためのそれ
以上の処理が可能となる。

この実施態様において、末梢単核血球を前述のように
供給体の血液または脾から分離する。血球を反復して、
たとえば３回RPMI1640のような滅菌溶液で洗浄する。次
いで、滅菌溶液中に懸濁する血球は、付着する部分と付
着しない部分とに分離するために使用できる。

血球を分離するために、懸濁液を適当な支持体、たと
えば、ガラスビーズ、ナイロンウールおよび中空の多孔
質繊維と接触させる。支持体は好適には適当な寸法のカ
ラムのような容器に貯蔵することができる。支持体への
生成血球の付着は急速ではないので、十分な時間を経過
させるべきである。その後、RPMI1640のような滅菌溶液
を支持体上に流して付着しない応答血球を除去する。こ
のような血球分離工程後、生成血球および支持体を貯蔵
する容器またはカラムへヒトのAB血清およびPHAのよう
なミトゲンを補充した組織培養基、たとえば、RPMI1640
を加えることによつて、生成血球を刺激する。RPMI1640
への血清およびPHAの添加量は、第１の方法において記
載した量と同一である。この混合物（すなわち、血球、
組織培養基および支持体）を４〜12時間、好ましくは４
時間培養する。

培養後、組織培養基を排出し、そして末梢単核血球の
他のバツチの刺激のために取つておく。支持体と刺激し
た血球を、補充物質を含有しない組織培養基の新らしい
部分で洗浄して、血清とミトゲンのすべてを除去する。

次いで、新鮮な組織培養基を加えて容器を満たす。こ
こで血球はコンデイシヨニングできる状態ある。

血球をコンデイシヨニングするため、血球を支持する
支持体を組織培養基実験において使用する標準条件下で
12〜24時間、好ましくは15〜20時間、最も好ましくは18
時間培養する。培養後、生成物を含有する組織培養基を
集め、組織培養基の新らしい部分を加えて形成した生成
物を洗浄して除去し、集める。支持体と血球を洗浄する
ために使用する新鮮な組織培養基の量は通常重要ではな
く、ここで主目的は生成物のできるだけ多くを除去する
ことである。このようにして集められたＴ細胞生長因子
含有組織培養基を、濃縮して最終生成物を得る。濃縮工
程において用いる条件は、前述の条件と同一である。血
球を支持する支持体は、第１の培養／刺激工程において
前に集めた血清およびミトゲンを補充した組織培養基を
再循環することによつて、再刺激することができる。

生成血球を支持体へ付着することにより、いくつかの
利点を達成することができる。第１に、血球を分離する
ために回転または遠心分離を必要としないので、非常に
速い方法が提供される。第２に、組織培養基の供給速度
および出口流速を調整することにより、血球の洗浄を連
続工程とすることができ、こうしてこの方法を短縮する
ことができる。事実、連続でないことがある唯一の工程
は２つの培養工程であり、そしてすべての他の工程は連
続とすることができる。第３に、支持体と血球は１つの
容器に貯蔵されるので、この容器を刺激し、そして数
回、典型的には５回再刺激することができ、そして容器
は使い捨て材料から作り、規定の回数使用したのち支持
体および血球の容器全体を廃棄することができる。

支持体として、ガラスビーズ、ナイロンウール、およ
び中空の多孔質繊維を使用できる。ガラスビーズとナイ
ロンウールを使用するとき、それらをカラムに詰め、配
置することができる。新鮮な組織培養基をカラムに上部
から供給し、そして洗浄液または生成物の溶液を底部か
ら抜き出す。カラムの寸法は、方法の規模に従つて変え
ることができる。ガラスビーズの有効寸法は、所望の表
面積に依存する。通常、ビーズの直径は20〜100ミクロ
ンであり、好ましくは1mmを越えるべきでない。別法と
して、ガラスビーズはフリツトガラスの床の形であるこ
とができる。床の多孔度および厚さはとくに臨界的でな
く、変化することができる。ナイロンウールに関する、
それは適当な大きさのカラムまたは容器に単に詰めるこ
とができる。ナイロンウールの空隙体積は、実験的に
（すなわち、試行錯誤で）決定することができる。

壁に孔を有する中空繊維については、孔の大きさはと
くに臨界的でない。血球を繊維の内部に供給し、処理す
る。血清およびミドゲンを補充した組織培養基で血球を
刺激する。次いで血清およびミトゲンを壁の孔に通す。
その後、血球を補充物質を含まない培養基の存在でコン
デイシヨニングする。コンデイシヨニング後、生成物の
Ｔ細胞生長因子を含有する組織培養基を繊維の内部から
流し出し、濃縮して最終生成物を形成する。

上の説明において、通常の培養条件下で12〜20時間コ
ンデイシヨニングすると、Ｔ細胞生長因子は解放されて
培養基中に解放される。次の手順を用いて、生長因子含
有生成物の活性を決定した。

末梢単核血球を供給体の血液から分離する。血球を計
数し、そして血球を補充物質不含組織培養基、たとえ
ば、RPMI1640中で一夜培養する。このような浸漬によ
り、血球の表面へ付着した血清タンパク質およびマクロ
フアージは離脱するようになる。血球密度はRPMI1640の
1mlあたり100万に調整する。

前述のようにコンデイシヨニングしたのち得られた未
濃縮の生長因子含有上層を、微小力価板（microtiter p
late）の第１列に付着させる。ための第２列は生長因子
の溶液を含有し、その濃度は第１列の濃度の半分であ
る。同様に、第３列は第１列の半分である。結局、1:2
の上層濃度の希釈率は板の上部分から下に向かつて動く
につれて得られる、微小力価板が得られる。

一夜培養した単核血球の測定した数を、微小力価板の
各ために加える。Ｔ細胞生長因子で刺激された結果とし
て、血球の生長を監視する。有意な生長の合理的標準を
決定するために、本発明者らは７日で血球密度が二倍に
なる逆希釈（invesse of dilution）を適用した。この
ような標準を用いることにより、有意な生長は４〜32、
最も通常８〜16の逆希釈に見い出されることを発見し
た。この標準を用いて、第１図に示すＴ細胞生長因子の
活性とコンデイシヨニング時間との間の関係を決定し
た。

前述の手順は、インタールーキン１（IL1）としても
知られるリンパ球活性化因子（LAF）よりはむしろＴ細
胞生長因子（IL2）についての測定値を与えると信じら
れる。このように信じられる理由は、次のとおりであ
る。

定義すると、IL1は血清中でＴ細胞の芽細胞形質転換
（blast transformation）を誘発することができるが、
Ｔ細胞系統を維持することができる。IL1は、抗原とマ
クロフアージとの間の反応により生成されると信じられ
ている。第２工程として、IL1は抗原およびＴヘルパー
細胞と反応してIL2を生成する。IL1を生成する。IL1お
よびIL2の生成の機構についてのくわしい分析は、Wagne
r,et al.,Immunological Rev.,vol.51、215（1980）に
記載されている。こうして、IL2（Ｔ細胞生長因子）の
効果を決定するとき、細胞により生成されたIL1がアツ
セイにより影響をうけないように注意すべきである。末
梢単核血球を少なくとも12時間、好ましくは12〜18時間
予備培養するのは、単核血球の表面へ付着している血清
タンパク質を除去する目的である。血清タンパク質を除
去すると、IL1の生物学的活性は停止する。結局、予備
培養した単核血球は未濃縮のＴ細胞生長因子との間の接
触から生ずる血球の生長は、IL2のみに帰すことができ
る。単核血球が血清不含条件下で予微培養されないと、
血球はIL1に応答する。これらの血球がＴ細胞生長因子
と接触すると、IL1およびIL2の両者による血球の生長が
起こりうる。したがつて、予備培養しないで測定した活
性は２つの生長因子の結果であり、明らかに不精確であ
る。

本発明の血清不含およびミトゲン不含生長因子は、多
数の領域において実用性を有する。それは腫瘍患者にお
ける免疫不足の診断および処置に使用できる。腫瘍に悩
む患者は通常Ｔ細胞生長因子に欠け、すなわち、自然キ
ラー細胞の機能が抑制されていることが発見された。患
者を本発明の生長因子で刺激することにより、自然キラ
ー細胞の機能の抑制を逆転または排除することができ、
こうして腫瘍細胞は殺されるようになる。これに関し
て、末梢単核血球を患者から集め、本発明のＴ細胞生長
因子で刺激することができる。血球が十分に生長したの
ち、血球を患者に再導入して、患者の腫瘍細胞への抵抗
力を増加する。

また、本発明のＴ細胞生長因子は、特別の抗原に対し
て特別の細胞系統または自然キラー細胞系統を感作する
ことにより、特別の免疫応答を生成するために使用でき
る。次いで、このような細胞系統を治療的に使用して、
寄生虫および細菌の感染、たとえば、結核およびマラリ
アと戦うために使用することができる。IL2生成細胞は
結核の患者において抑制されることが示された。このよ
うな抑制は、結核菌に対して作用するように特別に感作
された細胞系統で患者を処置することにより、克服する
ことができる。

他方において、Ｔ細胞生長因子は自然キラー細胞の機
能を刺激または改良することができることが示された。
この生長因子を除去するか、あるいは減少することによ
り、患者が移植された器官を拒絶する傾向はコントロー
ルされうる。移植患者に免疫抑制剤、たとえば、コルチ
ソン類を投与して、移植された器官の拒絶反応を防止す
ることが普通に行われている。コルチソン類は、IL1お
よびIL2の両者の生成を抑制するマクロフアージを殺す
ことにより、細胞の免疫系に作用する。しかしながら、
移植された器官の非常にいつそう効力のある拒絶体であ
るIL2の生成をのみを停止することが望ましい。移植さ
れた器官の拒絶を防止するために、血清不含IL2を抗原
として使用して、動物中に抗原を発生させることができ
る。次いで、これらの抗体は移植器官の拒絶を抑制する
ために使用されうる。

次の実施例により、本発明をさらに説明する。

実施例１ １パイントのプラスチツク袋に入れられ、凝血抑制剤
のヘパリンと混合されたヒトの血液を血液銀行から入手
する。20本の50ml容の滅菌した試験管に、フイコール−
ハイパーク混合物を予備充填する。血液をフイコール−
ハイパーク含有試験管に層状に入れる。これらの試験管
を400Gで10分間遠心分離する。遠心分離の結果、末梢単
核血球のリングが各試験管中のフイコール−ハイパーク
層の上に形成する。この末梢単核血球の層を、ピペツト
により注意して抜き出す。10本の試験管から集めた血球
を本の50ml容の管に入れ、加えた血球の量はほぼ25mlで
ある。この試験管に約25mlのRPMI1640溶液を加えて、試
験管中のフイコール−ハイパークの濃度を希釈する。フ
イコール−ハイパークはわずかに毒性であるので、それ
を血球から注意して分離する。

血球とRPMI1640を含有する試験管を、300Gで10分間遠
心分離する。遠心力は低く保持して、血球の不必要な破
壊を回避する。遠心分離後、上層を廃棄する。

RPMI溶液の新鮮な部分を試験管に加える。血球をこの
溶液中に再懸濁することにより洗浄する。このような再
懸濁は、溶液と血球をピペツトに吸込み、次いでこの混
合物を試験管に流入させることによつて、実施する。も
う一度、血球の懸濁液をおだやかに処理して、血球の破
壊を避ける。次いで、懸濁液を300Gで10分間遠心分離し
て、血球ペレツトと上層を得、そして上層を廃棄する。
この洗浄手順を合計３回反復し、各洗浄において得られ
た上層を廃棄し、そして血球のペレツトを保持する。洗
浄後、血球を５〜10mlのRPMI1640溶液中に懸濁し、計数
する。通常、血球は500〜1,000百万の血球を含有する。

フイトヘムアグルチニン（PHA）の原溶液（高度に精
製されたもの、Wellcome）を、15％V/VABヒト血清を補
充したRPMI1640溶液に加えて、補充されたRPMI1640の1m
lあたり４ミクログラムのPHAを含有する溶液を形成す
る。このようにして得られたRPMI1640溶液を血球に加
え、加えたRPMI1640の体積を調整して、補充したRPMI16
40溶液の1mlあたり10百万の血球密度が得られる。血球
／溶液混合物を50ml容の試験管に入れ、次いでこれらの
試験管を培養器（National Incubator Company）に４時
間入れる。培養器は7.5％のCO₂を含有する雰囲気中で30
℃および90％の湿度に維持する。

培養後、試験管を培養器から取り出し、室温において
300Gで10分間遠心分離する。上層をデカントし、後の使
用のため取つておく。血清とPHAとを含有しないRPMI164
0の新鮮な部分を、試験管に約30mlのマークまで導入す
る。血球を再懸濁し、洗浄する。その後、この懸濁液を
遠心分離する。この洗浄、懸濁および分離の工程を３回
反復し、各回血清不含およびPHA不含RPMI1640溶液の新
鮮な部分を用いる。血球ペレツトを３回洗浄することに
より、血清の濃度は約３×10⁷のフアクターで希釈され
る。

最後の洗浄後、３×10⁶/mlの血球密度を有する懸濁液
は遠心分離しない。その代わり、懸濁液を培養器に入
れ、18時間培養する。18時間、懸濁液を300Gで10分間遠
心分離する。上層をデカントし、取つておく。血球のペ
レツトをPHA中に再懸濁し、最終の培養（刺激）工程後
取つておいた、PHAおよび血清を含有する上層中に再懸
濁する。刺激（補充したRPMI1640溶液の存在で血球を培
養する）およびコンデイシヨニング（血清とPHAとを含
有しないRPMI1640溶液の存在で血球を培養する）の手順
を反復する。血球の同じバツチを５回まで再刺激および
再コンデイシヨニングすることが可能であることが、わ
かつた。

コンデイシヨニング（すなわち、第２の培養工程）後
集めた上層を、開口0.2〜0.4ミクロンの滅菌フイルター
で過する。上層を濃縮するとき使用する限外フイルタ
ーを血球が詰まらすことがあるので、この過工程は必
要である。次いで過した上層を−20℃で凍結し、貯蔵
する。各試験において集められた上層の量は少量である
ので、上層のいくつかのバツチを集めた後、上層の濃縮
を通常実施する。

上層を濃縮するため、薄いチヤンネル系の限外フイル
ターを使用する。このような限外フイルターはアミコン
・カンパニー（米国）で作られている。使用するフイル
ター膜はYM-10またはYM-30である。これらの膜は、タン
パク質を吸収しないので、使用する。生成物は膜の上部
に保持される。濃縮工程の結果、上層を約50〜100回濃
縮する。

濃縮工程に関すると、活性は上層中で濃縮前希釈部分
２と16の間に見い出された。したがつて、上層を50回濃
縮する場合、濃縮物を100〜800の間の範囲の希釈率で希
釈することができ、なお“有意の生長”を提供すること
ができる。

濃縮した上層を−20℃で凍結し、そしてその生物学的
活性に影響をおよぼさないで、１年より長い間貯蔵する
ことができる。

一般に、血球の１パイントの袋は濃縮前にほぼ1,000
〜1,200mlの上層を生ずる。濃縮後、約25mlの上層が通
常得られる。

実施例２ 末梢単核血球を単離し、実施例１に記載する手順に従
つて、RPMI1640で３回洗浄する。洗浄後、血球は支持体
へ付着できる状態にある。この実施例において、直径50
〜100ミクロンのガラスビーズを、直径50mm、長さ300mm
のガラスカラム中に貯蔵する。このカラムの直径および
長さは、それぞれ20〜50mmおよび200〜300mmの間で変え
ることができる。RPMI1640中に懸濁した洗浄した末梢単
核血球をカラムに注入し、このカラムの流出を停止し
て、血球をガラス表面へ付着させる。付着は遅いので、
１時間付着を行う。その後、カラム全体を37℃で１時間
培養する。

新鮮なRPMI1640溶液を次いでカラムに供給して、付着
しない血球を流し出す。使用するRPMI1640溶液の量は、
カラムの体積の約２倍である。これに関して、カラムに
加えに加えるRPMI1640の量をカラムの底で取り出す量に
等しくして、カラムが常に満たされているようにする。
RPMI1640溶液の全量をカラムに加えた後、溶液をカラム
から完全に排出する。その後、カラムの底部からの流出
を停止する。ここで血球は刺激できる状態にある。

血球を刺激するために、15％のヒトAB血清とRPMI1640
溶液の1mlあたり４ミクログラムのPHAとを補充したRPMI
1640溶液をこのカラムに充てんする。次いでこのカラム
を密閉し、組織の培養に用いる通常の条件、すなわち37
℃および7.5％のCO₂雰囲気のもとに培養する。このカラ
ムを４時間培養する。次いで補充したRPMI1640溶液をカ
ラムから排出し、後の使用のため集める。カラムの血球
を、補充物質を含有しないRPMI1640のカラムの２倍量で
洗浄する。もう一度、新鮮なRPMI1640をカラムの上部に
加え、これに対して“使用した"RPMI1640を底部から取
り出し、２つの流れの流速を調整して、カラムが溶液で
常に充てんされているようにする。２つのカラムの体積
のRPMI1640溶液をカラムに加えた後、この溶液をカラム
から排出させる。血球はここでコンデイシヨニングでき
る状態にある。

血球をコンデイシヨニングするために、カラムをRPMI
1640の新鮮な部分で満たし、密閉する。このカラムを次
に通常の培養条件下で18時間培養する。その後、生成物
の生長因子を含有するRPMI1640溶液をカラムから排出す
る。次いでRPMI1640の新鮮な部分をカラムに加えて、生
長因子のできるだけ多くを取り出す。このようにして集
めたRPMI1640溶液の部分を次に濃縮する。他方におい
て、カラム中の血球はここで刺激およびコンデイシヨニ
ングの他のサイクルを行うことができる。

この実施例は、本発明のＴ細胞生長因子を生成する連
続なバツチ法を示す。

実施例３ 実施例２に概説した手順を反復するが、ただしガラス
ビーズを充てんしたカラムの代わりにフイルターとして
フリツトガラスの層を有する漏斗を使用する。

実施例４ 脾をヒトの供給体から無菌条件下に取り出す。この脾
を各々0.2〜0.4gの重さの小片に切る。切つた脾を網目
の大きさ約0.1mmの２つのステンレス鋼製の網の間に置
く。網をおだやかに一緒にし、脾を滅菌塩溶液で同時に
流して、ポタージユ様生成物を形成する。これは単核血
球を含有する。このようにして得られた生成物をフイコ
ール−ハイパークこう配上に層状に配置して、実施例１
に概説する手順に従つて、単核血球およびＴ細胞生長因
子を抽出する。

実施例５ この実施例は、本発明において得られたＴ細胞因子の
有意の生長を決定するとき採用するバイオアツセイに関
する。末梢単核血球を、実施例１に概説する手順に従い
単離する。次いで血球を計数し、補充物質不含RPMI1640
溶液中に約18時間分散する。その結果、血球表面へ付着
した血清タンパク質とマクロフアージは離脱するように
なる。新らしいRPMI1640を、浸漬後の懸濁液に加えて、
血球密度を百万/mlに調整する。一方の方向に８列のた
めと他方の方向に12列のためを有する微小力価板を用い
て、バイオアツセイを実施する。各ためについて、最大
充てん体積は250ミクロリツトルである。実施例１にお
いて得られた生成物の上層の200ミクロリツトルを、微
小力価板の第１列に入れる。第２列に、100ミクロリツ
トルの生成物の上層を、補充物質不含RPMI1640の100ミ
クロリツトルと一緒に入れる。こうして、1:2の希釈率
を第１列と第２列との間で得る。第３列において、上層
の濃度は列２の濃度の半分に等しい。同様に、板中のた
めの列の残部に、１つの列中のＴ細胞生長因子の濃度が
前の列の濃度の半分であるように、RPMI1640溶液を満た
す。

一夜培養した末梢単核血球の50ミクロリツトルを各た
めの中に入れる。血球を７日間生長させる。血球は、各
ため中に含有されるＴ細胞生長因子により刺激される結
果、生長し始める。２組の試験を実施して、実験の平均
値を得る。

有意な生長は、上に定義するように、部分または力価
４〜32において見い出される。

Ｔ細胞生長因子の各バツチの強度を、対照として使用
した生長因子の既知のストツクを比較するこきができ
る。本発明の生長因子を治療の目的に使用するとき、生
成物の強度を決定すること、すなわち、どの力価が許容
しうる活性を含有するかを決定することが必要である。

実施例６ この実施例は、腫瘍に悩まされる患者におけるＴ細胞
生長因子の抑制の決定に関する。

血球試料を患者から抜き出し、そして200,000末梢単
核血球をそれから単離する。血球を、15％V/VのヒトAB
血清および４ミクログラムPHA/mlRPMI1640を補充したRP
MI1640および柔らかい寒天と混合する。次いで、この混
合物を通常の組織培養条件下で７〜９日間培養する。

PHAによる刺激の結果、Ｔ細胞生長因子は寒天の表面
上に自然キラー細胞のコロニーを生成し、生育し始め
る。このコロニーは斑の形をとる。定量として、寒天表
面上のコロニーを計数する。この数は供給した血球の数
に基づく。これに関して、コロニーとは、50より多い血
球を含有する斑を意味する。健康な患者、すなわち、腫
瘍に悩まされない患者について、1,000〜1,500のコロニ
ーが得られるであろう。

同様なアツセイを、腫瘍に悩まされていることがわか
つている他の患者について実施する。結果を表１に要約
し、第２図にグラフで表わす。結果から明らかなよう
に、試験した患者の71人のうち６人だけが誤まつた陰
性、すなわち、正常に思われる結果を与えた。

比較として、上の手順を健康な患者から採取した血球
に適用する。健康な患者と腫瘍の患者から得られたアツ
セイのデータを第３図に示す。この表が示すように、IL
2の生成は腫瘍の患者からの末梢血球中で抑制される。

上に概説した試験手順は、ある人が腫瘍に悩まされて
いるかどうかを決定する高度に完全で正確な試験であ
る。

実施例７ この実施例における実験は、腫瘍の患者からの血球と
健康な供給体からの血球との同時培養が、健康な供給体
からのＴ細胞のコロニーの生長を抑制することを明らか
にするために実施する。

末梢単核血球を、腫瘍の患者から採取した血液試料か
ら単離する。血球の単離法は、実施例１に説明するもの
と同一である。血球の試料を、実施例６に概説した血清
およびPHAを補充したRPMI1640および柔らかい寒天と個
々に混合し、その後この混合物を培養する。このように
して得られた血球はバツチＡを表わす。

健康な患者からの血球を、前節に示す方法を用いて刺
激する。このようにして得られた血球は、バツチＢを表
わす。

血球の第３バツチ、すなわち、バツチＣは、バツチＡ
およびＢからの試料を混合し、そしてこの混合物を、血
清およびPHAを補充したRPMI1640および柔らかい寒天の
存在で培養することによつて、得る。バツチＡ、Ｂおよ
びＣについて得られた結果を、第４図に示す。これらの
結果から明らかなように、健康な供給体および腫瘍の患
者からの血球の同時培養はＴ細胞コロニーの生長を抑制
する。

実施例８ この実施例における実験は、本発明の血清不含および
ミトゲン不含Ｔ細胞生長因子を腫瘍の患者における生体
外の自然キラー細胞の生長を増加するために使用できる
ことを明らかにする。

末梢単核血球を、腫瘍の患者から採取した血液試料か
ら単離する。単離の手順は、実施例１に示すものと同一
である。この血球を、1.25mlのかたい寒天、0.2mlの柔
らかい寒天、および0.05mlの実施例１におけるようにし
て得られた濃縮したＴ細胞生長因子からなる培養系に加
える。この培養系を、通常の組織培養条件下で７日間培
養する。寒天上のコロニーの形成によつて証明されるよ
うな、自然キラー細胞の生長が認められる。

対照実験として、同じ患者から採取した単離した末梢
単核血球の他の試料を、1.25mlのかたい寒天、0.2mlの
柔らかい寒天および0.05mlのRPMI1640からなる培養系へ
加える。この培養系を、通常の組織培養条件下で７日間
培養する。対照の手順および試験の手順の両方におい
て、200,000/mlの血球密度を用いる。

前述の実験を多数の患者について反復する。これらの
実験において得られた結果を第５図に要約する。この第
５図において、直線は、１人の特定の患者について本発
明のＴ細胞生長因子の存在および不存在で得られた、コ
ロニーの数を接続する。これらの結果から明らかなよう
に、本発明のＴ細胞生長因子を用いて処理すると、Ｔ細
胞のコロニーの生長、すなわち、自然キラー細胞の生
産、は明らかに増大する。

実施例９ 次の試験は、Ｔ細胞生長因子の腫瘍細胞を殺す能力を
決定するために実施する。HaLa系統からの腫瘍細胞を、
⁵¹Crで標識付けする。細胞を洗浄し、そして毒性のリン
パ芽球とともに18時間培養する。上層をデカントし、細
胞を遠心分離する。ターゲツト（すなわち、標識付けし
た）腫瘍細胞からの⁵¹Crの解放は、細胞が殺されたこと
を示す。結果を表２に要約する。

実施例10 この実施例は、本発明のＴ細胞生長因子中に毒性物
質、すなわち、レクチン類が存在しないことを明らかに
する。

試験は10匹のラツトを用いて実施する。各ラツトに、
実施例１において得られたＴ細胞生長因子の50倍の濃縮
物の15mlを注射する。ラツトへのＴ細胞生長因子の影響
を観察する。４週間後、ラツトの９匹を殺し、体を検査
する。毒性物質の存在による悪影響は、これらのラツト
のリンパ腺中に発見されない。第10番目のラツトは、６
カ月後でさえ注射からの悪影響を示さなかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、IL2の活性とコンデイシヨニング時間との間
の関係を示す。 第２図は、腫瘍の患者からの血球の生体外PHA刺激に応
答したＴ細胞コロニーの生長において得られた結果を要
約する。 第３図は、腫瘍の患者と健康な患者からの血球中のIL2
の生産の比較を示す。 第４図は、腫瘍の患者および健康な患者からのＴ細胞、
および健康な患者および腫瘍の患者からの混合Ｔ細胞の
コロニーの生長からの結果を示す。 第５図は、腫瘍の患者からの血球の、IL2の存在下およ
び不存在下の、Ｔ細胞コロニーの生長において得られた
結果を要約する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特公 昭45−22558（ＪＰ，Ｂ１) 米国特許3438859（ＵＳ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ミトゲンによって刺激したヒト、ウシまた
   はブタの末梢単核血球のコンデイシヨニング培養物に由
   来し、該培養物を0.2〜0.4ミクロンの細孔を有する濾過
   媒体で濾過し、そしてタンパク質を吸収しない限外濾過
   フイルター膜で限外濾過して得られた細胞不含で、血清
   不含およびミトゲン不含のＴ細胞生長因子調製物。