JPH0646956B2 - 血清不含およびミトゲン不含インタ−ル−キン−２の試験管内の効率生産法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｔ細胞生長因子（ＴＣＧＦ）、インタールー
キン−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）（ＩＬ−２）
としても知られている、を試験管内の培養系において生
産する改良された方法に関する。さらに詳しくは、本発
明は、先行の米国特許出願第１９３，１１２号（１９８
０年１０月２日）および同第２４７，７６９号（１９８
１年３月２６日）、それらの開示の全部をここに引用に
よって加える、中に開示されている血清不含およびミト
ゲン不含インタールーキン−２の調製物を生産する試験
管内培養生産法の改良に関する。詳しくは、本発明は、
インタールーキン−２の収率を改良するためにローラー
びん培養系を使用することに関する。また、本発明は、
培養を高い酸素濃度において実施するそれ以上の改良に
関する。

近年において、インタールーキン−２を包含する、種々
のリンフォカイン類の免疫相乗作用に関する広範な量の
研究が存在する。１９８０年７月に、西ドイツのゲイゼ
ンハイムにおいてＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒ
ｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（イン
タールーキン−２についての国際研究会）が開催され、
そしてこの会合に基づくシンポジウムの刊行物はＢｅｈ
ｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇ
ｅｒ，Ｎｏ．６７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８０中に刊
行された。

ネズミおよびヒトのインタールーキン−２は、たとえ
ば、次ぎの刊行物に記載されるようにして、部分的に精
製されかつ特徴づけられた：Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ，ｅｔ ａｌ”Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｇｒｏｗｔｈ ｏ
ｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．III．Ｍｔｈｏｄ
ｆｏｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＧＦ）Ｆｒｏｍ
Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｕ
ｌｔｉｎｇ ＴＣＦＧ”，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，３３，３３９−３５０
（１９８０）；Ｊ．Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ”Ｔ−Ｃ
ｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｉｎｔｅｒｌ
ｅｕｋｉｎ−２”，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａ
ｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８０，１１３−１１６ペー
ジ；Ｄ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ，”Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｎ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙ
ｔｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．I
V．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅ
ｕｋｉｎ−２ ｆｒｏｍ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｔ Ｃｅ
ｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ”，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２５，Ｎｏ．６，２５７９−２５８
３（Ｄｅｃ．１９８０）；Ｊ．Ｗ．Ｍｉｅｒ ａｎｄ
Ｒ．Ｃ．Ｇａｌｌｏ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｓｏｍｅ Ｃｈｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ
Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒ（ＴＣＧＦ） Ｆｒｏｍ ＰＨＡ−Ｓｔｉｍｕｌａｔ
ｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ
Ｍｅｄｉａ”。

リンフォカイン類、ことにインタールーキン−２、の免
疫相乗効果は、たとえば、次ぎのものを含むいくつかの
刊行物に記載されている：Ｐａｐｅｒｍａｓｔｅｒ，ｅ
ｔ ａｌ”Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｏｂｓｅｒｖａｔ
ｉｏｎｓ ｏｎ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ
Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｙ Ｌｏｃａｌ Ａｄｍｉｎｉｓ
ｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌ
ｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ Ｆｒａ
ｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｕ
ｔａｎｅｕｏｓ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｌｅｓｉｏｎ
ｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，３１−４７
（１９７６）；Ｈｅｎｎｅｙ，ｅｔ ａｌ”Ｉｎｔｅｒ
ｌｅｕｋｉｎ−２ Ａｕｇｍｅｎｔｓ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｖｏｌ．２９１，３３５−３３８（Ｍａｙ
２８，１９８１）；Ｌｏｔｚｅ，ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈ
ｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｒ
ｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｇｒｏｗｎ
ｉｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（Ｔ
ＣＧＦ）：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｈｅ
Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏ
ｆ Ｔｕｍｏｒｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．４（Ｏｃｔｏｂｅｒ １９８
０）。本発明者ら自信の臨床研究は、腫瘍患者における
インタールーキン−２の生体内投与による有害な副作用
がないことを明らかにした。

血清不含の組織培養系の重要性は、たとえば、次ぎの刊
行物を含むいくつかの刊行物において認識されている：
Ｂ．Ｗ．Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｅｉ
ｌｅｒ，”Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｒａ
ｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｉ
ｔｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｉｎ Ａ
Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｓｙｓｔｅｍ”，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４４，３−１４（１９８１）；
Ｈ．Ｓ．Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｒ．Ｇ．Ｐｅｍｂｒｅ
ｙ，”Ａ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｓ
ｓｅｙ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１，９−２１（１９
８１）。

ネズミのレクチン不含インタールーキン−２の調製物の
生産は、次ぎの文献に記載されている：Ｐ．Ｊ．Ｓｐｉ
ｅｓｓ ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，”Ａ
Ｓｉｍｌｉｆｉｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｔ−Ｃｅ
ｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｒｅｅ Ｏｆ
Ｌｅｃｔｉｎ”，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４２，１３−２２２（１９８
１）。

しかしながら、今日まで、インタールーキン−２を大規
模で培養系において生産することは不可能であり、また
インタールーキン−２を合成的にあるいは遺伝子工学に
より生産することは成功しなかった。

試験管内の細胞培養系におけるインタールーキン−２の
収率を最適化する試みは、たとえば、最適化の型および
ミトゲンの濃度、細胞の数および細胞の型、および他の
同様な因子に大きく集中された。たとえば、次ぎの刊行
物を参照：Ｊｏｓｅ Ｍ．Ａｌｖａｒｅｚ，ｅｔ ａ
ｌ”Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒ Ｉ．Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
Ｆｏｒ Ｉｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｊ．ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２３，Ｎｏ．３，９
７７−９８３（Ｓｅｐｔ．１９７９）。これらの方法に
より、ある程度の成功を達成したが、なおより大きい収
率はインタールーキン−２の研究および応用に対して、
とくに長期間の商業的使用において高度に有益であろ
う。

次ぎの刊行物によると、３７℃においてローラードラム
上でインキュベーションされたミトゲン感作末梢血球か
らリンフォカイン類が生産された：Ｏ．Ａ．Ｈｏｌｔｅ
ｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．”Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏ
ｆ Ｃｕｔａｎｅｕｏｓ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ Ｆｏｌ
ｌｏｗｉｎｇ Ｄｅｌａｙｅｄ−Ｔｙｐｅ Ｈｙｐｅｒ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈａｌｌｅｎｇ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｎｔｉｇｅ
ｎｓ ｏｒ Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ”，Ｊ．ｏｆ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．２，１５７，１６
８（１９７５）。しかしながら、ローラードラムを使用
するインキュベーション工程のそれ以上の詳細について
は報告されていない。通常、ローラードラム上の培養を
用いるとき、ドラムは約１〜６ｒｐｍで回転される。

従来の培養系、たとえば、平皿、培養管、または培養び
んにおいて、培養される細胞はそれぞれの培養器の底に
急速に蓄積する傾向がある。インタールーキン−２（Ｉ
Ｌ−２）の試験管内生産における細胞は、細胞が「粘着
性」となりかつ一緒に塊となる傾向があるとき、ミトゲ
ン（たとえば、ＰＨＡ）刺激工程の間に蓄積するように
思われる。この細胞の蓄積は、次ぎの結果を生ずる： （１）培地の下層の急速な栄養の欠乏； （２）代謝生産物および合成されたタンパク質の蓄積
（それらのあるものは毒性であるか、あるいはＩＬ−２
の生産に関して抑制的であることがある）； （３）密な細胞対細胞の接触は、再び特異的サプレッサ
ー細胞によるＩＬ−２生産の抑制を生ずる可能性があ
る。

このような「従来の」培養系、すなわち、細胞が沈降す
ることができかつ培地が循環されない系、においてコン
ディショニングされた媒質は、細胞毒性ＩＬ−２依存性
Ｔ細胞の試験管内生育のために十分に高いＩＬ−２レベ
ルを生ずるためには、５〜１０倍程度の濃縮を必要とす
る。事実、あるバッチは非常に高い濃縮を必要とし、一
方他方のバッチは活性をまったく示さない。

したがって、これらの従来の培養系におけるＩＬ−２生
産は、一般に低くかつ高度に予測不可能であることが理
解できる。ＩＬ−２を商業的規模で生産しなくてはなら
ない場合は、高度に予測不可能である。さらに、従来の
培養系、ことに平らな培養皿、たとえば、ベトリ皿をの
使用は、長い生産時間を必要としかつ、多数のプラスチ
ック皿を必要とするため、ＩＬ−２の有用な収率を得る
ためには大きい空間および体積要件を有する。同様な空
間および体積要件は、培養管系を用いるとき存在する。

ヒトの源からのインタールーキン−２の生産に現在実施
されているような従来の培養系における他の経済的欠点
は、末梢単核血球を得ることに高い経費を必要とし、そ
して出発全血供給物の非使用部分の浪費である。

また、培養器中の培地が、しばしば数インチを超える、
層を形成する試験管内培養系によるインタールーキン−
２の大規模生産において、液体培地中への酸素の拡散
（インキュベーターの空気／ＣＯ_２混合物の空気から
の）に対するバリヤーが存在することが、本発明者らに
より発見された。事実、３〜５ｍｍを超える液相は、液
体コンディショニング培地の厚さ全体を通ずる酸素の浸
透に対してある種の有意なバリヤーを示す。

これらの欠点および他の欠点は、われわれの同時係属出
願第１９３，１１２号および同第２４７，７６９号中に
記載されている静止試験管内細胞培養系のすべての改良
である、本発明の種々の実施態様により回避される。

したがって、１つの面において、本発明は、末梢単核血
球（ＰＢＬ）を多孔質支持体（たとえば、ナイロウー
ル、セファロースゲル、中級繊維系など）上に充填し、
そして液体細胞培地および雰囲気をインキュベーション
を通じて再循環させかつダイアフィルトレイション（ｄ
ｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により新しい培地を補充す
る方法を提供する。培養流体のみの再循環は、培地の下
層における栄養の欠乏を防止し、かつ代謝生産物および
合成された生産物を細胞環境から除去する。

細胞の塊状化または蓄積および有害な副作用の防止に向
けられた本発明のより好ましい実施態様において、刺激
工程およびコンディショニング工程の両者を急速に回転
するローラーびん培養系において実施する。

ローラー培養系は、前述の細胞の蓄積から生ずる欠点の
すべて、たとえば、最初に述べた実施態様によりとくに
処理されない細胞対細胞の接触を回避する。こうして、
急速に回転するローラーびん培養系により、次ぎの利点
が提供される： （１）コンディショニングおよび刺激工程全体の期間に
おいて完全に均質な培養系を確保し、これにより局所的
欠乏を防止する、ローラー作用による強い混合； （２）培養体積全体にわたる代謝生産物および合成され
たタンパク質の分散、これによる起こりうる毒性のまた
は抑制的な生産物の濃縮の、高度に低くかつ大きく微々
たる蓄積； （３）均一な細胞懸濁液の維持、これによる細胞対細胞
の接触から生ずる抑制の防止。

ローラー培養系の他の利点の例は、次ぎの通りである：
数１０００まで−パイロットプラント規模−の高度に
活性なＩＬ−２コンディショニングした培地の生産を可
能とする大きい体積の培地の取扱い可能性；再使用可能
なびんによる比較的低いコスト、小さい空間および体積
要件、および大きい分別しない体積の取扱い。事実、Ｉ
Ｌ−２異存性細胞毒性Ｔ細胞の試験管内生育には、コン
ディショニングした培地の濃縮はしばしば不必要である
が、コンディショニングした培地のわずかに２〜５倍の
濃縮は好ましい。

本発明の他の面、ことに大規模の生産に有用な、静止
（たとえば、平皿）および動的（すなわち、ローラび
ん）の培養系における面において、ＩＬ−２の収率は培
養工程を高い酸素濃度で、とくに約７０〜９５％の酸
素、５〜１５％の二酸化炭素および残部の主として窒素
を含有する気体混合物を用いて実施することにより、５
〜１０倍以上改良される。静止培養系において、比較的
深い液体細胞培地中の酸素のための長い拡散距離は、高
い酸素濃度により補償され、増大した濃度のＩＬ−２が
生じ、その濃度は従来の空気／ＣＯ_２気体混合物におい
て得られる収率よりも典型的には５倍高い。

ローラー培養系において、高濃度の酸素の存在は、コン
ディショニングされた培地中で信頼すべき高い収率およ
び酸素濃度のＩＬ−２を提供し、細胞毒性Ｔ細胞の試験
管内生育について、このコンディショニングされた培地
は５０倍まで、好ましくは５〜１０倍まで希釈すること
ができる。比較して、通常の空気／ＣＯ_２の雰囲気を用
いるローラー培養において生産されたＩＬ−２コンディ
ショニングされた培地は、ＩＬ−２依存性細胞毒性Ｔ細
胞の生育を支持するために０〜５倍濃縮しなくてはなら
ない。もちろん、これはなお静止培養系の有意の改良で
ある。

ローラー培地の代わりに充填された細胞をもつ多孔質担
体を用いる実施態様においてさえ、高い酸素濃度は、Ｉ
Ｌ−２の収率を増大し、かつ細胞不含循環培地を連続的
に酸素化し、そうでなければ再コンディショニングする
（たとえば、ｐＨ、栄養、生産物の取り出し、など）こ
とにより、いっそう容易にコントロールされた酸素の供
給が可能であるという利点を提供する。

前述の実施態様の各々に適用可能な、本発明のなお他の
実施態様において、この方法の経済性は末梢核血球につ
いてバッフィコートの細胞を使用することにより実質的
に改良される。バッフィコートの細胞は、全血の血漿お
よび赤血球を回収するように処理された全血から副生物
として得られ、かつ凝血の防止のためにヘパリンの添加
を必要としない、という利点を有する。こうして、通常
廃棄されるバッフィコートの細胞は、貯蔵血液から赤血
球および全血血漿の通常の生産よりも実質的に追加のコ
ストをかけないで回収することができる。その上、赤血
球の回収率は、われわれの先行出願に記載されかつこの
分野においてよく知られている手順により得られたＰＢ
Ｌからよりも、バッフィコートの細胞からの方か高い。

本発明の前記および他の目的は、（１）洗浄して外部の
細胞膜表面へ結合した血清タンパク質の実質的にすべて
を除去したＩＬ−２生産性１次細胞を、液体組織培地中
でローラーびん培養系においてインキュベーションする
ことにより、刺激し、前記培地は血清タンパク質および
ミトゲンを補充されており、そして前記ローラーびん培
養系は均質な培地を提供し、代謝生産物および合成され
たタンパク質を培地全体中に分散させ、かつ培地中の均
一な細胞懸濁液を維持するために５〜２０ｒｐｍのロー
ラーびんの回転速度で回転させ、（２）刺激された細胞
を分離および洗浄して、前記血清タンパク質およびミト
ゲンの実質的にすべてを除去し、そして（３）工程
（２）において得られた細胞を、血清タンパク質不含お
よびミトゲン不含液体組織培地の存在下にローラーびん
培養系においてインキュベーションすることにより、コ
ンディショニングし、前記ローラーびん培養系は、均質
な培地を提供し、代謝生産物および合成されたタンパク
質を培地全体中に分散させ、かつ培地中の均一な細胞懸
濁液を維持するために５〜２０ｒｐｍのローラーびんの
回転速度で回転させ、これによりインタールーキン−２
を液相中に移す、ことによって、血清不含およびミトゲ
ン不含のインタールーキン−２含有上澄みを生産する第
１実施態様において達成される。一般に、直径４〜５イ
ンチ（１０．２〜１２．７ｃｍ）のびんについて、びん
の約６ｒｐｍに相当する、少なくとも２０ｒｐｍのロー
ラー速度は本発明の目的を達成するために十分である。
われわれのもとの方法におけるように、刺激およびコン
ディショニングのインキュベーション工程は、それぞれ
約４〜８時間および１８〜２４時間の期間実施する。

この実施態様の好ましいモードに従い、前述の先行出願
中に記載されているように、刺激された細胞から分離さ
れた液体組織培地を再循環させて細胞の引き続くバッチ
を刺激し、そして組織培地から分離されたコンディショ
ニングされた細胞をまた再刺激のために再循環させる。

われわれの前の出願中に記載されている手順に従い、刺
激およびコンディショニングの間のインキュベーション
は静止条件下に実施する。すなわち、刺激工程の場合に
おいて血清およびミトゲンを補充した液体組織培地およ
び細胞、およびコンディショニングの場合において血清
不含およびミトゲン不含液体組織培地の存在下に細胞
を、適当な容器、たとえば、ペトリ皿に単に入れ、そし
てインキュベーターに入れ、ここでそれらを約３７℃の
温度において、５〜１０％のＣＯ_２を含有する空気／Ｃ
Ｏ_２混合物を用いてインキュベーションする。

今回、細胞を静止容器内で培養するとき、インタールー
キン−２生産性細胞は一緒に凝集し、これによりインタ
ールーキン−２の生産に有効な細胞の数が減少すると同
時に、ＩＬ−２の濃度は静置培養器の底部において実質
的に高くなる傾向があり、したがって、インタールーキ
ン−２の受容体を有する培養器中の細胞上に吸着される
べき、そのように生産されたインタールーキン−２が消
費される傾向が大きいことが、発見された。

凝集する減少を回避しかつ培養器全体を通じてインター
ルーキン−２のより均一な濃度を得るために、１〜６ｒ
ｐｍで回転させる従来のローラー培養機械を用いて、ロ
ーラー培養系を利用することを試みた。しかしながら、
これらの速度における実施はミトゲン（たとえば、フィ
トヘマグリチニン−ＰＨＡ）刺激の間細胞が「粘着性」
となることおよび一緒に凝集することを防止しなかっ
た。直径４インチ（１０．２ｃｍ）のびんを用いると
き、リンフォカイン類生産性細胞は１５ｒｐｍ程度に高
い回転速度においてなお凝集することがわかった。

本発明によれば、ローラー培養器内の細胞の凝集は、ロ
ーラー培養系のローラーを少なくとも２０ｒｐｍ［直径
５インチ（１２．７ｃｍ）のびんについて約６ｒｐｍに
相当する］に変更することにより、完全にまたは実質的
に完全に排除される。血清不含およびミトゲン不含培養
上澄みは、刺激およびコンディショニング工程の間のイ
ンキュベーションを少なくとも２０ｒｐｍで回転させた
ローラー培養系において実施する、前に開示された方法
の変更により生産するとき、インタールーキン−２の収
率を１０倍以上増加した。

また、培養上澄み中のインタールーキン−２の収率のさ
らにそれ以上の改良は、ローラーびんの表面を変更して
その表面の不規則性を除去することにより、達成できる
ことを発見した。典型的にはガラス材料から作られたロ
ーラーびんの表面中の不規則性は、インタールーキン−
２生産性細胞を包含する細胞を引き裂く傾向があること
がわかった。ローラー表面の平滑化は、ローラー表面上
に薄いシリコーンコーティングを形成することにより、
効果的に達成された。こうして、ローラーびん培養器の
ローラーがシリコーン化されていないと、出発末梢単核
血球の約３０〜５０％がＰＨＡ刺激の間に失われ、これ
に対してローラーびん培養器がシリコーン化するとわず
かに細胞の約１５〜３０％が破壊されるに過ぎない。

本発明の第２実施態様において、ＩＬ−２の改良された
収率は、（１）洗浄して外部の細胞膜表面へ結合した血
清タンパク質の実質的にすべてを除去したＩＬ−２生産
性１次細胞を、血清タンパク質およびミトゲンを補充さ
れた液体組織培地中で約７０〜約９５％の酸素および約
５〜１５％の一酸化炭素からなる（残部は主として窒素
であり、少量の他の不活性気体が通常空気中に存在す
る）酸素に富んだ雰囲気のもとにインキュベーションす
ることにより、刺激し、（２）刺激された細胞を分離お
よび洗浄して、前記血清タンパク質およびミトゲンの実
質的にすべてを除去し、そして（３）工程（２）におい
て得られた細胞を、血清タンパク質不含およびミトゲン
不含液体組織培地の存在下に工程（１）に記載する酸素
に富んだ雰囲気のもとにインキュベーションすることに
より、得られる。

インキュベーション（刺激およびコンディショニング）
工程の間の酸素に富んだ雰囲気を使用するこの実施態様
は、最初に述べたローラーびん培養系に適用することが
でき、あるいは、静止培養系、たとえば、平皿、管、ま
たは回転びんの培養系に適用することができる。液体組
織培地およびコンディショニングされた細胞の両者の再
循環も、この実施態様に適用可能である。

ことに第１実施態様に適用されるような、本発明の前述
の第２実施態様を実施する好ましいモードにおいて、Ｉ
Ｌ−２生産性細胞は、従来技術により全血から赤血球お
よび結晶を分離するとき副生物として得られるバッフィ
コートの細胞である。この実施態様によれば、バッフィ
コートの細胞は、インタールーキン−２の生産に使用す
るとき、実質的に新鮮であるべきであり、たとえば、２
〜３時間以上経過したものであってはならない。

以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに詳述す
る。

ローラーびん培養装置は、液体組織培地および細胞を含
有するローラーびんのための従来の装置のいずれである
こともできる。このような装置は、生物学において、こ
とにウイルスの生物学において、広く使用されている。
しかしながら、これらの装置は通常約１〜６ｒｐｍ程度
の比較的遅い速度で作動する。したがって、この装置は
少なくとも２０ｒｐｍの高い速度で作動するように修正
しなくてはならない。

典型的には、ローラーびん培養装置は、少なくとも１対
の、好ましくは２対の水平に配置された平行なローラー
を含み、前記ローラーはローラー培養びんを１対のロー
ラーの両者上に静置させるために十分に短い距離で間隔
を置いて位置する。１対のローラーの一方または両方を
回転すると、それと接触するびんは回転する。回転方向
は重要ではない。

有用であることがわかった装置の１つの配置は、２つの
びんを収容する３本の平行なローラーを含む。すべて３
本のローラーを回転することができ、あるいは外側の２
本のローラーのみを駆動させ、かつ中央のローラーを自
由回転させることができる。また、中央のみのローラー
を駆動させ、かつ外側の２本を自由回転させることも可
能である。２組以上の３本ローラーを重ねた関係で準備
することができる。ただし、その場合、列の間にびんの
直径を受け入れるために十分な間隔を設ける。

前述のように、これらローラー培養装置は通常わずかに
１〜６ｒｐｍの回転をローラーに付与するように設計さ
れている。

本発明者らの研究によると、これらの速度において、粘
着性細胞の凝集を回避できないことが示された。１５ｒ
ｐｍ程度に高いローラー速度を生成するように装置を修
正することにより、凝集の減少を克服することは、なお
不可能であった。しかしながら、少なくとも２０ｒｐｍ
のローラー速度を生成するように装置をさらに変更する
ことにより、粘着性インタールーキン−２生産性細胞が
凝集してそれに付随する欠点を生ずることを防止できる
ようになる。

ローラー速度の上限は、とくに臨界的ではないが、細胞
の引き裂きや破壊を生ずるほど高くあってはならない。
通常約５０ｒｐｍまでのローラーの加速は満足すべきも
のであるが、特定の利益はこれより高い速度では得られ
ない。一般に、約２０〜５０ｒｐｍ、好ましくは２２〜
４０ｒｐｍ程度のローラー速度は、粘着性細胞の凝集を
回避するために十分であり、これは、４〜５インチ（１
０．２〜１２．７ｃｍ）の直径をもちかつ５０〜２００
ｍｌの培地を含有するローラーびんについて、約５〜約
２０ｒｐｍ、好ましくは約５〜１５ｒｐｍのローラーび
んの回転に相当する。

大きい大きさまたは小さい大きさのローラーびん、細胞
の高いまたは低い濃度および培地の量、ローラーとロー
ラーびんとの間のローリング摩擦の異る量などについ
て、完全な、培地の均質性、代謝生産物および合成され
た生成物の分散、および均一な細胞懸濁液の維持を確保
するために十分な混合を実施するために最小のローラー
の回転速度は、簡単な実験により容易に決定される。

ことに、ローラーびん容器を細胞の刺激およびコンディ
ショニングに反復使用するとき、表面の不規則性の形成
を回避することが好ましい。たとえば、ローラーびん培
養系をガラスから作る。数回の洗浄後、これらのびんの
表面は粗くかつ不規則となり、細胞を引き裂く傾向をも
つ。ガラス表面の粗面化を防止する１つの手段は、表面
をシリコーン溶液でコーティングすることである。この
ような手順は、この分野において知られている。

たとえば、１つの適当なシリコーン化溶液は、サーバ社
（Ｓｗｒｖａ，西ドイツ、ハイデルベルグ）から商品名
“Ｓｉｌｉｃｏｎｌｓｕｎｇ Ｓｅｒｖａ”、物品番
号３５１３０ IIIａで商業的に入手できる。小体積の
シリコーン溶液をローラーびん上に注ぐ。内表面がシリ
コーンで完全に覆われたとき、過剰の溶液をデカント除
去する。びんを室温においてノズルを下向きにして乾燥
する。ここで、びんを１時間１００〜１５０℃に加熱す
ることにより、シリコーンの残りのフィルムを燃焼して
ガラスにする。処理したびんは疎水性の非常に滑らかな
表面を有し、そして新しいシリコーン化手順を必要とす
るまで、それを５〜１０回使用することができる。シリ
コーン化処理は、刺激およびコンディショニングの間の
細胞の損失を減少するために重要である。

ローリングびんを使用する培養法は、われわれの先行出
願、たとえば、米国特許出願第２４７，７６９号に記載
する方法と本質的に同一の方法であることができる。こ
うして、ＩＬ−２生産性細胞を通常の（すなわち、癌ま
たは腫瘍ではない）１次細胞系、たとえば、前述のよう
に入手しかつ洗浄した末梢単核血球のいずれであること
もできる。細胞共与体は、ヒツジ、ブタ、ウシまたはヒ
トであることができる。また、温度および雰囲気は従
来、普通に使用されている条件、たとえば、３７℃およ
び空気／５〜１５％のＣＯ_２の雰囲気であることができ
る。

しかしながら、とくにヒトにおける使用において、経済
性およびインタールーキン−２の収率の観点から最良の
結果を得るためには、ＩＬ−２生産性細胞はバッフィコ
ートの細胞であることができ、そして雰囲気は酸素に富
んだ、たとえば、７０〜９５％、好ましくは８０〜９０
％のＯ_２（容量パーセント）の雰囲気であり、緩衝剤は
約５〜１５％、好ましくは５〜１０％の二酸化炭素（Ｃ
Ｏ_２）であり、残部は実質的に窒素であり、そして微量
の不活性気体、たとえば、アルゴンが通常空気中に存在
する。

実施例１ ローラーびん培養法の特定の例として、末梢単核血球を
まず前述のようにして得る。簡単に述べると、血液銀行
から得たヒト血液をヘパリン、すなわち、抗凝固剤と混
合する。血液をフィコールーハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ
−ｈｙｐａｑｕｅ）混合物含有無菌管中に層状に入れ、
次いでこれを遠心する。各管中のフィコールーハイパー
クより上に形成した末梢単核血球の生じた層を、ピペッ
トで注意して抜き出す。次いで、細胞を清浄な管内にブ
ールし、たとえば、ＲＰＭＩ １６４０で希釈する。こ
の管を細胞を破壊しない速度で遠心し、そして上澄みを
廃棄する。次いで、細胞を同一の方法で新しい部分のＲ
ＰＭＩ溶液で反復洗浄する。約５００〜１０００×１０
^６個の細胞を含有する生じた洗浄細胞のペレットを、約
５〜１０ｍｌのＲＰＭＩ溶液で希釈する。

次いで、細胞は組織培地、たとえば、１０〜１５％の血
清を補充した約４ｍｇのフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）を含有するＲＰＭＩ １６４０中において約３×１
０^６の密度に生長を促す（ｓｅｅｄ ｏｕｔ）ことがで
きる。血清の代わりに、血漿のヒトインタールーキン−
２誘発タンパク質（ＰＨＩＬＩＰ）（同時係属の米国特
許出願第２５５，２５１号、１９８１年４月１７日出願
に記載されており、その開示をここに引用によって加え
る）を使用できる。

この時点において、細胞およびレクチン含有培地をロー
ラー培養びんに移す。直径４〜５インチ（１０．２＾１
２．７ｃｍ）のびんを使用し、そして各びんに５０〜２
００ｍｌの培地を充填する。ローラーびんは、空気／Ｃ
Ｏ_２（５〜１０％）混合物を充填した後、ローラー装置
を備えるインキュベーター内に入れる。インキュベータ
ー内の温度は約３７℃である。ローラーを約２５ｒｐｍ
（約６ｒｐｍのローラーびんの速度）で回転させ、そし
て細胞を約４〜８時間、好ましくは約４時間インキュベ
ーションする。

その後、びんをインキュベーターから取り出し、そして
刺激された細胞を含有する培地をデカント遠心管に入
れ、そして前述のように従来法で数回沈降および洗浄
し、次いで新しい培地中で、再び約３，０００，０００
／ｍｌの細胞密度に生長を促す。この場合において、細
胞含有培地（ＰＨＡまたは血清タンパク質を補充されて
いない）を再びローラーびん中に５０〜２００ｍｌの部
分づつ移し、そして刺激工程におけるのと同一条件でイ
ンキュベーションするが、ただしコンディショニングの
インキュベーションの時間は約１８〜２４時間、好まし
くは約２０時間に増加する。

その後、培地を再びローラーびんから遠心管に移し、わ
れわれの前の出願（たとえば、米国特許出願第２４７，
７６９号参照）おけるように処理する。細胞は引き続く
ＰＨＡ再刺激および再コンディショニングにおいて少な
くとも５回の追加のサイクルで再利用可能である。

実施例２ 実施例１を反復するが、ただし刺激およびコンディショ
ニング工程のインキュベーションは９０％のＯ_２、５％
のＣＯ_２および５％のＮ_２を含有する雰囲気のもとで実
施する。

ローラーびんブラス空気／ＣＯ_２混合物から、ローラー
びんプラス９０％のＯ_２から、および通常の大気の酸素
（空気）＋１０％のＣＯ_２を用いる５０ｍｌのファルコ
ン（Ｆａｌｃｏｎ）ブルー・カップ・プラスチック管中
のＰＨＡ刺激（比較例１）から、のコンディショニング
した培養上澄みインタールーキン−２活性を試験し（各
３回の反復実験）そして結果を下表に示す。

比較例２〜３ ローラーをわずかに約１５ｒｐｍの速度でローラーを回
転する以外、実施例１および２を反復する。結果は比較
例と実質的に同一であり、そして実質的な細胞の凝集が
観察される。

実施例３ ＰＢＬ細胞の代わりにバッフィコートの細胞を使用する
以外、実施例２を反復する。バッフィコートの細胞は次
ぎのようにして得られる：赤血球の保存剤、たとえば、
赤血球を保存するための標準溶液であるＡＣＤ（アデニ
ン、クエン酸塩、デキストロース）を含有する容器内
に、血液を集める。全血の保存物中でインタールーキン
−２を生産するために必要な、ヘパリンの使用は、不必
要である。収集後、新しい血液試料を１０００〜１５０
０×Ｇにおいて２０分間遠心する。赤血球は沈降し、そ
して白血球は赤血球の沈降物上に薄い層（バッフィコー
ト）を形成するであろう。その後、バッフィコートを赤
血球の層から吸い出し、インタールーキン−２の生産に
使用する。白血球および赤血球を含有しない血漿を集
め、そして、たとえば、工業的目的および全血漿の患者
への注入に使用する。沈降した赤血球を通常のように臨
床目的（たとえば、血液の注入）に使用できる。バッフ
ィコートの細胞を集めない以外、前述の方法で、大分部
の血液貯蔵所は赤血球を調製する。白血球は一般に無価
値であると考えられている。血液貯蔵物は通常使用前に
数日または数週間冷蔵庫に貯蔵される。この時間の間
に、赤血球は死ぬであろう。これらのバッフィコートの
細胞を用いると、血液貯蔵物に追加のコストをほとんど
必要としないで、インタールーキン−２生産の原料を得
ることが可能である。

白血球をここでＩＬ−２の生産のために処理するとき、
白血球を汚染する赤血球および血小板からフィコールー
ハイパーク勾配により、前述と正確に同一の方法で分離
する。回収された細胞の数は、ヘパリン保存から回収さ
れた細胞の数よりも通常約２０％だけ高いであろう。バ
ッフィコートの細胞は、ＩＬ−２生産のために刺激する
とき、絶対に新鮮であることが非常に重要である。バッ
フィコートの細胞は２〜３時間より古くあってはならな
い。まったく予測されないことには、バッフィコートの
使用は１つの制限を有することが発見された：通常の酸
素濃度のもとでバッフィコート中でＩＬ−２を生産しよ
うと試みるとき、有意の生産はまったく発見されないで
あろう。したがって、１つの必要条件は前述の同一の方
法において酸素に富んだ雰囲気を使用することである。
得られた結果は実施例２と実質的に同一である。

比較例４ バッフィコートの細胞をＰＢＬ細胞の代わりに使用する
以外実施例２を反復するとき、ＩＬ−２の生産は実質的
に観察されない。この比較例はバッフィコートの細胞を
インキュベーションの間に高い酸素濃度を必要とするこ
とを示すが、この理由は完全には説明することはできな
い。

本発明の改善された方法により得られたインタールーキ
ン−２含有上澄みは、濾過後、たとえば、われわれの先
願に記載されている如きアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ＹＭ
−１０フィルターで濾過後、高度に精製された生成物と
なる。インタールーキン−２を含有するコンディショニ
ングされた上澄みの生産物の純度は、タンパク質含量で
生物学的活性を比較することによって証明される。その
ようなインタールーキン−２を含有する調整物の生物学
的活性は、アミコンＹＭ−１０フィルターで濾過する前
に５０倍までに希釈された物質中で検出することができ
る。濾過後、生物学的活性は濾過工程中の試料体積の減
少と同じファクターを掛け合せられる。濾過前に、５０
倍に希釈して検出し得且つ濾過によって元の体積の１／
10に濃縮される生物学的活性を有するインタールーキン
−２を含有する上澄みは、濾過後において１：５００の
希釈で検出される生物学的活性を有するであろう。濾過
された上澄みのタンパク含量は、細胞バッチの細胞損失
の固有の差に依存して、通常５〜２０μｇ／ｍｌの範囲
にある。また、各提供者の細胞はミトゲン刺激によりＩ
Ｌ−２を生産する固有の異なった能力を有している。し
たがって、本発明は高純度の血清不含およびミトゲン
（たとえば、レクチン）不含インタールーキン−２を含
有するコンディショニングされた上澄みの試験管内生産
についての本発明者らのもとの手順の有意の改良を提供
することが認められる。これらの上澄みは抑制された自
然キラー細胞の機能を有する患者の処置において、腫瘍
患者における免疫欠乏の診断および処置において、およ
び一般に米国特許出願第２４７，７６９号に前に記載さ
れた、または他の著者により記載された実用性におい
て、有用である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血清不含およびミトゲン不含のインタール
   ーキン−２含有上澄みを生産する方法であって、 （１） 外部の細胞膜表面へ結合したタンパク質の実質
   的にすべてを洗浄して除去したＩＬ−２生産性１次細胞
   を、液体組織培地中でローラーびん培養系においてイン
   キュベーションすることによって刺激し、前記培地は血
   清タンパク質およびミトゲンを補充されており、そして
   前記ローラーびん培養系は均質な培地を提供し、代謝生
   産物および合成されたタンパク質を培地全体中に分散さ
   せ、かつ培地中の均一な細胞懸濁液を維持するために５
   〜２０ｒｐｍのローラーびんの回転速度で回転されてお
   り、 （２） 刺激された細胞を分離および洗浄して、血清お
   よびミトゲンの実質的にすべてを除去し、そして （３） 工程（２）において得られた細胞を、血清不含
   およびミトゲン不含液体組織培地の存在下にローラーび
   ん培養系においてインキュベーションすることによって
   コンディショニングし、前記ローラーびん培養系は、均
   質な培地を提供し、代謝生産物および合成されたタンパ
   ク質を培地全体中に分散させ、かつ培地中の均一な細胞
   懸濁液を維持するために５〜２０ｒｐｍのローラーびん
   の回転速度で回転されており、それによってインタール
   ーキン−２を液相中に移す、 ことを特徴とする血清不含およびミトゲン不含のインタ
   ールーキン−２含有上澄みを生産する方法。
2. 【請求項２】刺激工程およびコンディショニング工程に
   おけるインキュベーションは、７０〜９５％の酸素およ
   び５〜１５％のＣＯ₂を含有する雰囲気中で実施される
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】出発末梢単核血球はヒト提供者から得られ
   たバッフィコートの細胞である特許請求の範囲第１また
   は２項記載の方法。
4. 【請求項４】ローラーびんは、約４インチ（約１０．２
   ｃｍ）〜約５（約１２．７ｃｍ）の直径を有しかつ約５
   ０〜２００ｍｌの液体組織培地を充填されており、そし
   て刺激工程およびコンディショニングインキュベーショ
   ン工程におけるローラーびんは、ローラーびん培養系の
   ローラーによって少くとも６ｒｐｍの速度で回転される
   特許請求の範囲第１項記載の方法。