JPH06165690A

JPH06165690A - 血清不含およびミトゲン不含インタールーキン−２の試験管内での効率生産方法

Info

Publication number: JPH06165690A
Application number: JP5220468A
Authority: JP
Inventors: Fabricius Hans-Ake; ハンス−アケ・フアブリシウス
Original assignee: Fuupaa Trading Co Nv; HOOPER TRADING CO NV
Current assignee: Fuupaa Trading Co Nv; HOOPER TRADING CO NV
Priority date: 1984-01-27
Filing date: 1993-08-13
Publication date: 1994-06-14

Abstract

(57)【要約】【構成】インキュベーション工程を少くとも７０％の
酸素と少くとも５％の二酸化炭素を含有する酸素に富ん
だ雰囲気のもとに実施することによって、血清不含およ
びミトゲン不含のインタールーキン−２含有上澄みを生
産する。【効果】インタールーキン−２の収率が改良される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、Ｔ細胞生長因子（ＴＣＧＦ）、
インタールーキン−２（Ｉnterleukin−２）（ＩＬ−
２）としても知られている、を試験管内の培養系におい
て生産する改良された方法に関する。さらに詳しくは、
本発明は、先行の米国特許出願第１９３，１１２号（１
９８０年１０月２日）および同第２４７，７６９号（１
９８１年３月２６日）、それらの開示の全部をここに引
用によって加える、中に開示されている血清不含および
ミトゲン不含インタールーキン−２の調製物を生産する
試験管内培養生産法の改良に関する。詳しくは、本発明
は、インタールーキン−２の収率を改良するためにロー
ラーびん培養系を使用することに関する。また、本発明
は、培養を高い酸素濃度において実施するそれ以上の改
良に関する。

【０００２】近年において、インタールーキン−２を包
含する、種々のリンフォカイン類の免疫相乗作用に関す
る広範な量の研究が存在する。１９８０年７月に、西ド
イツのゲイゼンハイムにおいてＩnternational Ｗorks
hop on Ｉnterleukin−２（インタールーキン−２に
ついての国際研究会）が開催され、そしてこの会合に基
づくシンポジウムの刊行物はＢehring Ｉnstitute Ｍ
itteilunger，Ｎo．６７，Ｄecember １９８０中に刊
行された。

【０００３】ネズミおよびヒトのインタールーキン−２
は、たとえば、次ぎの刊行物に記載されるようにして、
部分的に精製されかつ特徴づけられた：Ｓ．Ａ．Ｒosen
berg，et al”Ｉn Ｖitro Ｇrowth of Ｍurine
ＴＣells．III．Ｍthod for Ｓeparation of Ｔ
Ｃell Ｇrowth Ｆactor（ＴＣＧＦ）Ｆrom Ｃonca
navalin Ａ and Ｂiological Ａctivity of the
Ｒesulting ＴＣＦＧ”，Ｊ．of Ｉmmunological
methods，３３，３３９−３５０（１９８０）；Ｊ．Ｗa
tson，et al”Ｔ−Ｃell Ｇrowth Ｆactors：Ｉnter
leukin−２”，Ｉmmunology Ｔoday，Ｄecember １９
８０，１１３−１１６ページ；Ｄ．Ｍochizuki，et a
l，”Ｂiochemical and Ｂiological Ｃharacteriza
tin ofＬymphocyte Ｒegulatory Ｍolecules．IV．
Ｐurification of Ｉnterleukin−２ from a Ｍur
ine ＴＣell Ｌymphoma”，Ｊ．of Ｉmmunolog
y，Ｖol．１２５，Ｎo．６，２５７９−２５８３（Ｄe
c．１９８０）；Ｊ．Ｗ．Ｍier and Ｒ．Ｃ．Ｇall
o”Ｐurification and Ｓome Ｃhracteristics of
Ｈuman Ｔ−Ｃell Ｇrowth Ｆactor（ＴＣＧＦ）
Ｆrom ＰＨＡ−Ｓtimulated Ｌymphocyte Ｃonditio
ned Ｍedia”。

【０００４】リンフォカイン類、ことにインタールーキ
ン−２、の免疫相乗効果は、たとえば、次ぎのものを含
むいくつかの刊行物に記載されている：Ｐapermaster，
etal”Ｐreliminary Ｏbservations on Ｔumor Ｒe
gressions Ｉnduced ＢyＬocal Ａdministration o
f a Ｌymphoid Ｃell Ｃulture Ｓupernatant Ｆ
raction in Ｐatients Ｗith Ｃutaneuos Ｍetast
atic Ｌesions”，Ｊ．of Ｉmmunology and Ｉmmun
opathology，Ｖol．５，３１−４７（１９７６）；Ｈen
ney，et al”Ｉnterleukin−２Ａugments Ｎatural
ＫillerＣell Ａctivity”，Ｎature Ｖol．２９
１，３３５−３３８（Ｍay ２８，１９８１）；Ｌotz
e，et al．，”Ｔhe Ｉn Ｖivo Ｄistribution of
Ａutologous Ｈuman and Ｍurine Ｌymphoid Ｃel
ls Ｇrown in ＴＣell Ｇrowth Ｆactor（ＴＣ
ＧＦ）：Ｉmplications for Ｔhe ＡdoptiveＩmmuno
therapy of Ｔumors”，Ｊ．of Ｉmmunology，Ｖo
l．１２，Ｎo．４（Ｏctober １９８０）。本発明者ら
自信の臨床研究は、腫瘍患者におけるインタールーキン
−２の生体内投与による有害な副作用がないことを明ら
かにした。血清不含の組織培養系の重要性は、たとえ
ば、次ぎの刊行物を含むいくつかの刊行物において認識
されている：Ｂ．Ｗ．Ｎeedleman and Ｊ．Ｍ．Ｗeil
er，”Ｈuman Ｌymphocyte Ｔransformation Ｉnduc
ed by Ｍitogens and Ａntigens Ｉn ＡＳerum
−Ｆree Ｔissue Ｃulture Ｓystem”，Ｊ．ofＩmmu
nological Ｍethods，４４，３−１４（１９８
１）；Ｈ．Ｓ．Ｗarrenand Ｒ．Ｇ．Ｐembrey，”Ａ
Ｍethod Ｆor Ｔhe Ｐroduction ＡndＱuantitativ
e Ａssey Ｏf Ｈuman Ｌymphokine Ｐreparation
s”，Ｊ．ofＩmmunological Ｍethods，４１，９−２
１（１９８１）。

【０００５】ネズミのレクチン不含インタールーキン−
２の調製物の生産は、次ぎの文献に記載されている：
Ｐ．Ｊ．Ｓpiess and Ｓ．Ａ．Ｒosenberg，”ＡＳ
imlified Ｍethod Ｆor Ｔhe Ｐroduction Ｏf
Ｍurine Ｔ−Ｃell ＧrowthＦactor Ｆree Ｏf Ｌ
ectin”，Ｊ．of Ｉmmunological Ｍethods，４２，
１３−２２２（１９８１）。

【０００６】しかしながら、今日まで、インタールーキ
ン−２を大規模で培養系において生産することは不可能
であり、またインタールーキン−２を合成的にあるいは
遺伝子工学により生産することは成功しなかった。

【０００７】試験管内の細胞培養系におけるインタール
ーキン−２の収率を最適化する試みは、たとえば、最適
化の型およびミトゲンの濃度、細胞の数および細胞の
型、および他の同様な因子に大きく集中された。たとえ
ば、次ぎの刊行物を参照：Ｊose Ｍ．Ａlvarez，et a
l”Ｈuman Ｔ cell Ｇrowth Ｆactor Ｉ．Ｏptica
l Ｃonditions Ｆor Ｉts Ｐroduction”，Ｊ．of
Ｉmmunology，Ｖol．１２３，Ｎo．３，９７７−９
８３（Ｓept．１９７９）。これらの方法により、あ
る程度の成功を達成したが、なおより大きい収率はイン
タールーキン−２の研究および応用に対して、とくに長
期間の商業的使用において高度に有益であろう。

【０００８】次ぎの刊行物によると、３７℃においてロ
ーラードラム上でインキュベーションされたミトゲン感
作末梢血球からリンフォカイン類が生産された：Ｏ．
Ａ．Ｈoltermann，et al，”Ｒegression of Ｃutan
euos Ｎeoplasms ＦollowingＤelayed−Ｔype Ｈype
rsensitivity Ｃhalleng Ｒeactions to Ｍicrobia
l Ａntigens or Ｌymphokines”，Ｊ．of Ｍedicin
e，Ｖol．６，Ｎo．２，１５７，１６８（１９７５）。
しかしながら、ローラードラムを使用するインキュベー
ション工程のそれ以上の詳細については報告されていな
い。通常、ローラードラム上の培養を用いるとき、ドラ
ムは約１〜６rpmで回転される。

【０００９】従来の培養系、たとえば、平皿、培養管、
または培養びんにおいて、培養される細胞はそれぞれの
培養器の底に急速に蓄積する傾向がある。インタールー
キン−２（ＩＬ−２）の試験管内生産における細胞は、
細胞が「粘着性」となりかつ一緒に塊となる傾向がある
とき、ミトゲン（たとえば、ＰＨＡ）刺激工程の間に蓄
積するように思われる。この細胞の蓄積は、次ぎの結果
を生ずる：（１）培地の下層の急速な栄養の欠乏；（２）代謝生産物および合成されたタンパク質の蓄積
（それらのあるものは毒性であるか、あるいはＩＬ−２
の生産に関して抑制的であることがある）；（３）密な細胞対細胞の接触は、再び特異的サプレッサ
ー細胞によるＩＬ−２生産の抑制を生ずる可能性があ
る。

【００１０】このような「従来の」培養系、すなわち、
細胞が沈降することができかつ培地が循環されない系、
においてコンディショニングされた媒質は、細胞毒性Ｉ
Ｌ−２依存性Ｔ細胞の試験管内生育のために十分に高い
ＩＬ−２レベルを生ずるためには、５〜１０倍程度の濃
縮を必要とする。事実、あるバッチは非常に高い濃縮を
必要とし、一方他方のバッチは活性をまったく示さな
い。

【００１１】したがって、これらの従来の培養系におけ
るＩＬ−２生産は、一般に低くかつ高度に予測不可能で
あることが理解できる。ＩＬ−２を商業的規模で生産し
なくてはならない場合は、高度に予測不可能である。さ
らに、従来の培養系、ことに平らな培養皿、たとえば、
ペトリ皿をの使用は、長い生産時間を必要としかつ、多
数のプラスチック皿を必要とするため、ＩＬ−２の有用
な収率を得るためには大きい空間および体積要件を有す
る。同様な空間および体積要件は、培養管系を用いると
き存在する。

【００１２】ヒトの源からのインタールーキン−２の生
産に現在実施されているような従来の培養系における他
の経済的欠点は、末梢単核血球を得ることに高い経費を
必要とし、そして出発全血供給物の非使用部分の浪費で
ある。

【００１３】また、培養器中の培地が、しばしば数イン
チを超える、層を形成する試験管内培養系によるインタ
ールーキン−２の大規模生産において、液体培地中への
酸素の拡散（インキュベーターの空気／ＣＯ₂混合物の
空気からの）に対するバリヤーが存在することが、本発
明者らにより発見された。事実、３〜５mmを超える液相
は、液体コンディショニング培地の厚さ全体を通ずる酸
素の浸透に対してある種の有意なバリヤーを示す。

【００１４】これらの欠点および他の欠点は、われわれ
の同時係属出願第１９３，１１２号および同第２４７，
７６９号中に記載されている静止試験管内細胞培養系の
すべての改良である、本発明の種々の実施態様により回
避される。

【００１５】したがって、１つの面において、本発明
は、末梢単核血球（ＰＢＬ）を多孔質支持体（たとえ
ば、ナイロウール、セファロースゲル、中級繊維系な
ど）上に充填し、そして液体細胞培地および雰囲気をイ
ンキュベーションを通じて再循環させかつダイアフィル
トレイション（diafiltration）により新しい培地を補
充する方法を提供する。培養流体のみの再循環は、培地
の下層における栄養の欠乏を防止し、かつ代謝生産物お
よび合成された生産物を細胞環境から除去する。

【００１６】細胞の塊状化または蓄積および有害な副作
用の防止に向けられた本発明のより好ましい実施態様に
おいて、刺激工程およびコンディショニング工程の両者
を急速に回転するローラーびん培養系において実施す
る。

【００１７】ローラー培養系は、前述の細胞の蓄積から
生ずる欠点のすべて、たとえば、最初に述べた実施態様
によりとくに処理されない細胞対細胞の接触を回避す
る。こうして、急速に回転するローラーびん培養系によ
り、次ぎの利点が提供される：（１）コンディショニングおよび刺激工程全体の期間に
おいて完全に均質な培養系を確保し、これにより局所的
欠乏を防止する、ローラー作用による強い混合；（２）培養体積全体にわたる代謝生産物および合成され
たタンパク質の分散、これによる起こりうる毒性のまた
は抑制的な生産物の濃縮の、高度に低くかつ大きく微々
たる蓄積；（３）均一な細胞懸濁液の維持、これによる細胞対細胞
の接触から生ずる抑制の防止。

【００１８】ローラー培養系の他の利点の例は、次ぎの
通りである：数１０００ｌまで−パイロットプラント規
模−の高度に活性なＩＬ−２コンディショニングした培
地の生産を可能とする大きい体積の培地の取扱い可能
性；再使用可能なびんによる比較的低いコスト、小さい
空間および体積要件、および大きい分別しない体積の取
扱い。事実、ＩＬ−２依存性細胞毒性Ｔ細胞の試験管内
生育には、コンディショニングした培地の濃縮はしばし
ば不必要であるが、コンディショニングした培地のわず
かに２〜５倍の濃縮は好ましい。

【００１９】本発明の他の面、ことに大規模の生産に有
用な、静止（たとえば、平皿）および動的（すなわち、
ローラびん）の培養系における面において、ＩＬ−２の
収率は培養工程を高い酸素濃度で、とくに約７０〜９５
％の酸素、５〜１５％の二酸化炭素および残部の主とし
て窒素を含有する気体混合物を用いて実施することによ
り、５〜１０倍以上改良される。静止培養系において、
比較的深い液体細胞培地中の酸素のための長い拡散距離
は、高い酸素濃度により補償され、増大した濃度のＩＬ
−２が生じ、その濃度は従来の空気／ＣＯ₂気体混合物
において得られる収率よりも典型的には５倍高い。

【００２０】ローラー培養系において、高濃度の酸素の
存在は、コンディショニングされた培地中で信頼すべき
高い収率および酸素濃度のＩＬ−２を提供し、細胞毒性
Ｔ細胞の試験管内生育について、このコンディショニン
グされた培地は５０倍まで、好ましくは５〜１０倍まで
希釈することができる。比較して、通常の空気／ＣＯ₂
の雰囲気を用いるローラー培養において生産されたＩＬ
−２コンディショニングされた培地は、ＩＬ−２依存性
細胞毒性Ｔ細胞の生育を支持するために０〜５倍濃縮し
なくてはならない。もちろん、これはなお静止培養系の
有意の改良である。

【００２１】ローラー培地の代わりに充填された細胞を
もつ多孔質担体を用いる実施態様においてさえ、高い酸
素濃度は、ＩＬ−２の収率を増大し、かつ細胞不含循環
培地を連続的に酸素化し、そうでなければ再コンディシ
ョニングする（たとえば、pＨ、栄養、生産物の取り出
し、など）ことにより、いっそう容易にコントロールさ
れた酸素の供給が可能であるという利点を提供する。

【００２２】前述の実施態様の各々に適用可能な、本発
明のなお他の実施態様において、この方法の経済性は末
梢核血球についてバッフィコートの細胞を使用すること
により実質的に改良される。バッフィコートの細胞は、
全血の血奬および赤血球を回収するように処理された全
血から副生物として得られ、かつ凝血の防止のためにヘ
パリンの添加を必要としない、という利点を有する。こ
うして、通常廃棄されるバッフィコートの細胞は、貯蔵
血液から赤血球および全血血奬の通常の生産よりも実質
的に追加のコストをかけないで回収することができる。
その上、赤血球の回収率は、われわれの先行出願に記載
されかつこの分野においてよく知られている手順により
得られたＰＢＬからよりも、バッフィコートの細胞から
の方か高い。

【００２３】本発明の前記および他の目的は、（１）洗
浄して外部の細胞膜表面へ結合した血清タンパク質の実
質的にすべてを除去したＩＬ−２生産性１次細胞を、液
体組織培地中でローラーびん培養系においてインキュベ
ーションすることにより、刺激し、前記培地は血清タン
パク質およびミトゲンを補充されており、そして前記ロ
ーラーびん培養系は均質な培地を提供し、代謝生産物お
よび合成されたタンパク質を培地全体中に分散させ、か
つ培地中の均一な細胞懸濁液を維持するために十分な速
度で回転させ、（２）刺激された細胞を分離および洗浄
して、前記血清タンパク質およびミトゲンの実質的にす
べてを除去し、そして（３）工程（２）において得られ
た細胞を、血清タンパク質不含およびミトゲン不含液体
組織培地の存在下にローラーびん培養系においてインキ
ュベーションすることにより、コンディショニングし、
前記ローラーびん培養系は、均質な培地を提供し、代謝
生産物および合成されたタンパク質を培地全体中に分散
させ、かつ培地中の均一な細胞懸濁液を維持するために
十分な速度で回転させ、これによりインタールーキン−
２を液相中に移す、ことによって、血清不含およびミト
ゲン不含のインタールーキン−２含有上澄みを生産する
第１実施態様において達成される。一般に、直径４〜５
インチ（１０．２〜１２．７cm）のびんについて、びん
の約６rpmに相当する、少なくとも２０rpmのローラー速
度は本発明の目的を達成するために十分である。われわ
れのもとの方法におけるように、刺激およびコンディシ
ョニングのインキュベーション工程は、それぞれ約４〜
８時間および１８〜２４時間の期間実施する。

【００２４】この実施態様の好ましいモードに従い、前
述の先行出願中に記載されているように、刺激された細
胞から分離された液体組織培地を再循環させて細胞の引
き続くバッチを刺激し、そして組織培地から分離された
コンディショニングされた細胞をまた再刺激のために再
循環させる。

【００２５】われわれの前の出願中に記載されている手
順に従い、刺激およびコンディショニングの間のインキ
ュベーションは静止条件下に実施する。すなわち、刺激
工程の場合において血清およびミトゲンを補充した液体
組織培地および細胞、およびコンディショニングの場合
において血清不含およびミトゲン不含液体組織培地の存
在下に細胞を、適当な容器、たとえば、ペトリ皿に単に
入れ、そしてインキュベーターに入れ、ここでそれらを
約３７℃の温度において、５〜１０％のＣＯ₂を含有す
る空気／ＣＯ₂混合物を用いてインキュベーションす
る。

【００２６】今回、細胞を静止容器内で培養するとき、
インタールーキン−２生産性細胞は一緒に凝集し、これ
によりインタールーキン−２の生産に有効な細胞の数が
減少すると同時に、ＩＬ−２の濃度は静置培養器の底部
において実質的に高くなる傾向があり、したがって、イ
ンタールーキン−２の受容体を有する培養器中の細胞上
に吸着されるべき、そのように生産されたインタールー
キン−２が消費される傾向が大きいことが、発見され
た。

【００２７】凝集する減少を回避しかつ培養器全体を通
じてインタールーキン−２のより均一な濃度を得るため
に、１〜６rpmで回転させる従来のローラー培養機械を
用いて、ローラー培養系を利用することを試みた。しか
しながら、これらの速度における実施はミトゲン（たと
えば、フィトヘマグリチニンーＰＨＡ）刺激の間細胞が
「粘着性」となることおよび一緒に凝集することを防止
しなかった。直径４インチ（１０．２cm）のびんを用い
るとき、リンフォカイン類生産性細胞は１５rpm程度に
高い回転速度においてなお凝集することがわかった。

【００２８】本発明によれば、ローラー培養器内の細胞
の凝集は、ローラー培養系のローラーを少なくとも２０
rpm〔直径５インチ（１２．７cm）のびんについて約６r
pmに相当する〕に変更することにより、完全にまたは実
質的に完全に排除される。血清不含およびミトゲン不含
培養上澄みは、刺激およびコンディショニング工程の間
のインキュベーションを少なくとも２０rpmで回転させ
たローラー培養系において実施する、前に開示された方
法の変更により生産すとき、インタールーキン−２の収
率を１０倍以上増加した。

【００２９】また、培養上澄み中のインタールーキン−
２の収率のさらにそれ以上の改良は、ローラーびんの表
面を変更してその表面の不規則性を除去することによ
り、達成できることを発見した。典型的にはガラス材料
から作られたローラーびんの表面中の不規則性は、イン
タールーキン−２生産性細胞を包含する細胞を引き裂く
傾向があることがわかった。ローラー表面の平滑化は、
ローラー表面上に薄いシリコーンコーティングを形成す
ることにより、効果的に達成された。こうして、ローラ
ーびん培養器のローラーがシリコーン化されていない
と、出発末梢単核血球の約３０〜５０％がＰＨＡ刺激の
間に失われ、これに対してローラーびん培養器がシリコ
ーン化するとわずかに細胞の約１５〜３０％が破壊され
るに過ぎない。

【００３０】本発明の第２実施態様において、ＩＬ−２
の改良された収率は、（１）洗浄して外部の細胞膜表面
へ結合した血清タンパク質の実質的にすべてを除去した
ＩＬ−２生産性１次細胞を、血清タンパク質およびミト
ゲンを補充された液体組織培地中で約７０〜約９５％の
酸素および約５〜１５％の一酸化炭素からなる（残部は
主として窒素であり、少量の他の不活性気体が通常空気
中に存在する）酸素に富んだ雰囲気のもとにインキュベ
ーションすることにより、刺激し、（２）刺激された細
胞を分離および洗浄して、前記血清タンパク質およびミ
トゲンの実質的にすべてを除去し、そして（３）工程
（２）において得られた細胞を、血清タンパク質不含お
よびミトゲン不含液体組織培地の存在下に工程（１）に
記載する酸素に富んだ雰囲気のもとにインキュベーショ
ンすることにより、得られる。

【００３１】インキュベーション（刺激およびコンディ
ショニング）工程の間の酸素に富んだ雰囲気を使用する
この実施態様は、最初に述べたローラーびん培養系に適
用することができ、あるいは、静止培養系、たとえば、
平皿、管、または回転びんの培養系に適用することがで
きる。液体組織培地およびコンディショニングされた細
胞の両者の再循環も、この実施態様に適用可能である。

【００３２】ことに第１実施態様に適用されるような、
本発明の前述の第２実施態様を実施する好ましいモード
において、ＩＬ−２生産性細胞は、従来技術により全血
から赤血球および結晶を分離するとき副生物として得ら
れるバッフィコートの細胞である。この実施態様によれ
ば、バッフィコートの細胞は、インタールーキン−２の
生産に使用するとき、実質的に新鮮であるべきであり、
たとえば、２〜３時間以上経過したものであってはなら
ない。

【００３３】以下の実施例を参照しながら、本発明をさ
らに詳述する。

【００３４】ローラーびん培養装置は、液体組織培地お
よび細胞を含有するローラーびんのための従来の装置の
いずれであることもできる。このような装置は、生物学
において、ことにウイルスの生物学において、広く使用
されている。しかしながら、これらの装置は通常約１〜
６rpm程度の比較的遅い速度で作動する。したがって、
この装置は少なくとも２０rpmの高い速度で作動するよ
うに修正しなくてはならない。

【００３５】典型的には、ローラーびん培養装置は、少
なくとも１対の、好ましくは２対の水平に配置された平
行なローラーを含み、前記ローラーはローラー培養びん
を１対のローラーの両者上に静置させるために十分に短
い距離で間隔を置いて位置する。１対のローラーの一方
または両方を回転すると、それと接触するびんは回転す
る。回転方向は重要ではない。

【００３６】有用であることがわかった装置の１つの配
置は、２つのびんを収容する３本の平行なローラーを含
む。すべての３本のローラーを回転することができ、あ
るいは外側の２本のローラーのみを駆動させ、かつ中央
のローラーを自由回転させることができる。また、中央
のみのローラーを駆動させ、かつ外側の２本を自由回転
させることも可能である。２組以上の３本ローラーを重
ねた関係で準備することができる。ただし、その場合、
列の間にびんの直径を受け入れるために十分な間隔を設
ける。

【００３７】前述のように、これらのローラー培養装置
は通常わずかに１〜６rpmの回転をローラーに付与する
ように設計されている。

【００３８】本発明者らの研究によると、これらの速度
において、粘着性細胞の凝集を回避できないことが示さ
れた。１５rpm程度に高いローラー速度を生成するよう
に装置を修正することにより、凝集の減少を克服するこ
とは、なお不可能であった。しかしながら、少なくとも
２０rpmのローラー速度を生成するように装置をさらに
変更することにより、粘着性インタールーキン−２生産
性細胞が凝集してそれに付随する欠点を生ずることを防
止できるようになる。

【００３９】ローラー速度の上限は、とくに臨界的では
ないが、細胞の引き裂きや破壊を生ずるほど高くあって
はならない。通常約５０rpmまでのローラーの加速は満
足すべきものであるが、特定の利益はこれより高い速度
では得られない。一般に、約２０〜５０rpm、好ましく
は２２〜４０rpm程度のローラー速度は、粘着性細胞の
凝集を回避するために十分であり、これは、４〜５イン
チ（１０．２〜１２．７cm）の直径をもちかつ５０〜２
００mlの培地を含有するローラーびんについて、約５〜
約２０rpm、好ましくは約５〜１５rpmのローラーびんの
回転に相当する。大きい大きさまたは小さい大きさのロ
ーラーびん、細胞の高いまたは低い濃度および培地の
量、ローラーとローラーびんとの間のローリング摩擦の
異る量などについて、完全な、培地の均質性、代謝生産
物および合成された生産物の分散、および均一な細胞懸
濁液の維持を確保するために十分な混合を実施するため
に最小のローラーの回転速度は、簡単な実験により容易
に決定される。

【００４０】ことに、ローラーびん容器を細胞の刺激お
よびコンディショニングに反復使用するとき、表面の不
規則性の形成を回避することが好ましい。たとえば、ロ
ーラーびん培養系をガラスから作る。数回の洗浄後、こ
れらのびんの表面は粗くかつ不規則となり、細胞を引き
裂く傾向をもつ。ガラス表面の粗面化を防止する１つの
手段は、表面をシリコーン溶液でコーティングすること
である。このような手順は、この分野において知られて
いる。

【００４１】たとえば、１つの適当なシリコーン化溶液
は、サーバ社（Ｓwrva，西ドイツ、ハイデルベルグ）か
ら商品名”Ｓiliconloesung Ｓerva”、物品番号３５
１３０ IIIａで商業的に入手できる。小体積のシリコ
ーン溶液をローラーびん上に注ぐ。内表面がシリコーン
で完全に覆われたとき、過剰の溶液をデカント除去す
る。びんを室温においてノズルを下向きにして乾燥す
る。ここで、びんを１時間１００〜１５０℃に加熱する
ことにより、シリコーンの残りのフィルムを燃焼してガ
ラスにする。処理したびんは疎水性の非常に滑らかな表
面を有し、そして新しいシリコーンン化手順を必要とす
るまで、それを５〜１０回使用することができる。シリ
コーン化処理は、刺激およびコンディショニングの間の
細胞の損失を減少するために重要である。

【００４２】ローリングびんを使用する培養法は、われ
われの先行出願、たとえば、米国特許出願第２４７，７
６９号に記載する方法と本質的に同一の方法であること
ができる。こうして、ＩＬ−２生産性細胞を通常の（す
なわち、癌または腫瘍ではない）１次細胞系、たとえ
ば、前述のように入手しかつ洗浄した末梢単核血球のい
ずれであることもできる。細胞共与体は、ヒツジ、ブ
タ、ウシまたはヒトであることができる。また、温度お
よび雰囲気は従来、普通に使用されている条件、たとえ
ば、３７℃および空気／５〜１５％のＣＯ₂の雰囲気で
あることができる。

【００４３】しかしながら、とくにヒトにおける使用に
おいて、経済性およびインタールーキン−２の収率の観
点から最良の結果を得るためには、ＩＬ−２生産性細胞
はバッフィコートの細胞であることができ、そして雰囲
気は酸素に富んだ、たとえば、７０〜９５％、好ましく
は８０〜９５％のＯ₂（容量パーセント）の雰囲気であ
り、緩衝剤は約５〜１５％、好ましくは５〜１０％の二
酸化炭素（ＣＯ₂）であり、残部は実質的に窒素であ
り、そして微量の不活性気体、たとえば、アルゴンが通
常空気中に存在する。

【００４４】

【実施例】

実施例１ローラーびん培養法の特定の例として、末梢単核血球を
まず前述のようにして得る。簡単に述べると、血液銀行
から得たヒト血液をヘパリン、すなわち、抗凝固剤と混
合する。血液をフィコールーハイパーク（Ｆicoll−hyp
aque）混合物含有無菌管中に層状に入れ、次いでこれを
遠心する。各管中のフィコールーハイパークより上に形
成した末梢単核血球の生じた層を、ピペットで注意して
抜き出す。次いで、細胞を清浄な管内にプールし、たと
えば、ＲＰＭＩ１６４０で希釈する。この管を細胞を
破壊しない速度で遠心し、そして上澄みを廃棄する。次
いで、細胞を同一の方法で新しい部分のＲＰＭＩ溶液で
反復洗浄する。約５００〜１０００×１０⁶個の細胞を
含有する生じた洗浄細胞のペレットを、約５〜１０mlの
ＲＰＭＩ溶液で希釈する。

【００４５】次いで、細胞は組織培地、たとえば、１０
〜１５％の血清を補充した約４mgのフィトヘマグルチニ
ン（ＰＨＡ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中において
約３×１０⁶の密度に生長を促す（seed out）ことがで
きる。血清の代わりに、血奬のヒトインタールーキン−
２誘発タンパク質（ＰＨＩＬＩＰ）（同時係属の米国特
許出願第２５５，２５１号、１９８１年４月１７日出願
に記載されており、その開示をここに引用によって加え
る）を使用できる。

【００４６】この時点において、細胞およびレクチン含
有培地をローラー培養びんに移す。直径４〜５インチ
（１０．２＾１２．７cm）のびんを使用し、そして各び
んに５０〜２００mlの培地を充填する。ローラーびん
は、空気／ＣＯ₂（５〜１０％）混合物を充填した後、
ローラー装置を備えるインキュベーター内に入れる。イ
ンキュベーター内の温度は約３７℃である。ローラーを
約２５rpm（約６rpmのローラーびんの速度）で回転さ
せ、そして細胞を約４〜８時間、好ましくは約４時間イ
ンキュベーションする。

【００４７】その後、びんをインキュベーターから取り
出し、そして刺激された細胞を含有する培地をデカント
して遠心管に入れ、そして前述のように従来法で数回沈
降および洗浄し、次いで新しい培地中で、再び約３，０
００，０００／mlの細胞密度に生長を促す。この場合に
おいて、細胞含有培地（ＰＨＡまたは血清タンパク質を
補充されていない）を再びローラーびん中に５０〜２０
０mlの部分づつ移し、そして刺激工程におけるのと同一
条件でインキュベーションするが、ただしコンディショ
ニングのインキュベーションの時間は約１８〜２４時
間、好ましくは約２０時間に増加する。

【００４８】その後、培地を再びローラーびんから遠心
管に移し、われわれの前の出願（たとえば、米国特許出
願第２４７，７６９号参照）おけるように処理する。細
胞は引き続くＰＨＡ再刺激および再コンディショニング
において少なくとも５回の追加のサイクルで再利用可能
である。

【００４９】実施例２実施例１を反復するが、ただし刺激およびコンディショ
ニング工程のインキュベーションは９０％のＯ₂、５％
のＣＯ₂および５％のＮ₂を含有する雰囲気のもとで実施
する。

【００５０】ローラーびんプラス空気／ＣＯ₂混合物か
ら、ローラーびんプラス９０％のＯ₂から、および通常
の大気の酸素（空気）＋１０％のＣＯ₂を用いる５０ml
のファルコン（Ｆalcon）ブルー・カップ・プラスチッ
ク管中のＰＨＡ刺激（比較例１）から、のコンディショ
ニングした培養上澄みのインタールーキン−２活性を試
験し（各３回の反復実験）そして結果を下表に示す。

【００５１】

【表1】

【００５２】比較例２〜３ローラーをわずかに約１５rpmの速度でローラーを回転
する以外、実施例１および２を反復する。結果は比較例
と実質的に同一であり、そして実質的な細胞の凝集が観
察される。

【００５３】実施例３ＰＢＬ細胞の代わりにバッフィコートの細胞を使用する
以外、実施例２を反復する。バッフィコートの細胞は次
ぎのようにして得られる：赤血球の保存剤、たとえば、
赤血球を保存するための標準溶液であるＡＣＤ（アデニ
ン、クエン酸塩、デキストロース）を含有する容器内
に、血液を集める。全血の保存物中でインタールーキン
−２を生産するために必要な、ヘパリンの使用は、不必
要である。収集後、新しい血液試料を１０００〜１５０
０×Ｇにおいて２０分間遠心する。赤血球は沈降し、そ
して白血球は赤血球の沈降物上に薄い層（バッフィコー
ト）を形成するであろう。その後、バッフィコートを赤
血球の層から吸い出し、インタールーキン−２の生産に
使用する。白血球および赤血球を含有しない血奬を集
め、そして、たとえば、工業的目的および全血奬の患者
への注入に使用する。沈降した赤血球を通常のように臨
床目的（たとえば、血液の注入）に使用できる。バッフ
ィコートの細胞を集めない以外、前述の方法で、大分部
の血液貯蔵所は赤血球を調製する。白血球は一般に無価
値であると考えられている。血液貯蔵物は通常使用前に
数日または数週間冷蔵庫に貯蔵される。この時間の間
に、赤血球は死ぬであろう。これらのバッフィコートの
細胞を用いると、血液貯蔵物に追加のコストをほとんど
必要としないで、インタールーキン−２生産の原料を得
ることが可能である。

【００５４】白血球をここでＩＬ−２の生産のために処
理するとき、白血球を汚染する赤血球および血小板から
フィコールーハイパーク勾配により、前述と正確に同一
の方法で分離する。回収された細胞の数は、ヘパリン保
存から回収された細胞の数よりも通常約２０％だけ高い
であろう。バッフィコートの細胞は、ＩＬ−２生産のた
めに刺激するとき、絶対に新鮮であることが非常に重要
である。バッフィコートの細胞は２〜３時間より古くあ
ってはならない。まったく予測されないことには、バッ
フィコートの使用は１つの制限を有することが発見され
た：通常の酸素濃度のもとでバッフィコート中でＩＬ−
２を生産しようと試みるとき、有意の生産はまったく発
見されないであろう。したがって、１つの必要条件は前
述の同一の方法において酸素に富んだ雰囲気を使用する
ことである。得られた結果は実施例２と実質的に同一で
ある。

【００５５】比較例４バッフィコートの細胞をＰＢＬ細胞の代わりに使用する
以外実施例２を反復するとき、ＩＬ−２の生産は実質的
に観察されない。この比較例はバッフィコートの細胞を
インキュベーションの間に高い酸素濃度を必要とするこ
とを示すが、この理由は完全には説明することはできな
い。

【００５６】本発明の改善された方法により得られたイ
ンタールーキン−２含有上澄みは、濾過後、たとえば、
われわれの先願に記載されている如きアミコン（Ａmico
n）ＹＭ−１０フィルターで濾過後、高度に精製された
生成物となる。インタールーキン−２を含有するコンデ
ィショニングされた上澄みの生産物の純度は、タンパク
質含量で生物学的活性を比較することによって証明され
る。そのようなインタールーキン−２を含有する調整物
の生物学的活性は、アミコンＹＭ−１０フィルターで濾
過する前に５０倍までに希釈された物質中で検出するこ
とができる。濾過後、生物学的活性は濾過工程中の試料
体積の減少と同じファクターを掛け合せられる。濾過前
に、５０倍に希釈して検出し得且つ濾過によって元の体
積の１／１０に濃縮される生物学的活性を有するインタ
ールーキン−２を含有する上澄みは、濾過後において
１：５００の希釈で検出される生物学的活性を有するで
あろう。濾過された上澄みのタンパク含量は、細胞バッ
チの細胞損失の固有の差に依存して、通常５〜２０μg
／mlの範囲にある。また、各提供者の細胞はミトゲン刺
激によりＩＬ−２を生産する固有の異なった能力を有し
ている。したがって、本発明は高純度の血清不含および
ミトゲン（たとえば、レクチン）不含インタールーキン
−２を含有するコンディショニングされた上澄みの試験
管内生産についての本発明者らのもとの手順の有意の改
良を提供することが認められる。これらの上澄みは抑制
された自然キラー細胞の機能を有する患者の処置におい
て、腫瘍患者における免疫欠乏の診断および処置におい
て、および一般に米国特許出願第２４７，７６９号に前
に記載された、または他の著者により記載された実用性
において、有用である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＩＬ−２生産性１次細胞を、血清タンパ
ク質とミトゲンを補充された液体組織培地中でインキュ
ベーションすることによって刺激し；刺激された細胞を
分離および洗浄して血清およびミトゲンの実質的にすべ
てを除去し；そして、洗浄された細胞を、新しい液体組
織培地の存在下、血清タンパク質とミトゲンの不存在下
にコンディショニングし、それによってインタールーキ
ン−２を液相中に移す工程により、血清不含およびミト
ゲン不含のインタールーキン−２含有上澄みを生産する
方法において、インキュベーション工程を、少くとも７０％の酸素と少
くとも５％の二酸化炭素を含有する酸素に富んだ雰囲気
のもとに実施する、ことを特徴とする血清不含およびミ
トゲン不含のインタールーキン−２含有上澄みを生産す
る方法。
【請求項２】酸素に富んだ雰囲気は８０〜９５％のＯ
₂、５〜１０％のＣＯ₂を含有し、そして残部は実質的に
窒素である特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】ＩＬ−２生産性細胞はヒト提供者から得
られたバッフィコートの細胞である特許請求の範囲第１
または２項記載の方法。