JPH089967A - 癌細胞障害性ｔリンパ球の誘導培養方法 - Google Patents

癌細胞障害性ｔリンパ球の誘導培養方法

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JPH089967A
JPH089967A JP6145908A JP14590894A JPH089967A JP H089967 A JPH089967 A JP H089967A JP 6145908 A JP6145908 A JP 6145908A JP 14590894 A JP14590894 A JP 14590894A JP H089967 A JPH089967 A JP H089967A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 癌細胞を含む生組織または固定化癌組織と該
癌組織が由来するヒト癌患者等の個体の末梢血リンパ球
とを共存培養する工程を含む該癌細胞に対する殺細胞能
を持つ細胞障害性Ｔリンパ球の誘導培養方法；並びに上
記工程に加えてさらに該癌細胞の共存なしに培養する工
程を含む上記細胞障害性Ｔリンパ球の増殖培養方法。 【効果】 癌組織から癌細胞を分離し純粋培養を行うこ
となく、特定の癌細胞に対して殺癌細胞を有する細胞障
害性Ｔリンパ球細胞を簡便かつ確実に誘導培養すること
ができるので有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、癌細胞に対する殺細胞
能を持つＴリンパ球細胞を誘導培養する方法に関する。
さらに具体的には、本発明は癌患者に由来する特定の癌
細胞に対する殺細胞能を持つＴリンパ球細胞を、体外に
おいて誘導し増殖させる培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌細胞を特異的に殺すことができるリン
パ球細胞として細胞障害性Ｔリンパ球(cytotoxic T lym
phocyte, 以下、本明細書においてCTL と称する場合が
ある)が知られている。細胞障害性Ｔリンパ球は単核細
胞分画から誘導し増殖させることができるが、誘導・増
殖後にもCTL の誘導培養を開始する時点でターゲットと
して使用した癌細胞種のみを攻撃対象とし、他の癌細胞
種は全く攻撃しないほど非常に癌細胞特異性が高いもの
である。
【０００３】従来、CTL を末梢血の単核細胞分画から誘
導し増殖させる誘導培養法においては、純粋培養した樹
立癌細胞株や、組織から分離され純粋培養に近い状態で
培養された癌細胞がターゲット（標的細胞）として用い
られている。しかし、実際にヒト癌手術材料を出発材料
として得られる癌細胞は、癌細胞以外に他の組織細胞が
共存していることが多く、必ずしも純粋培養が可能では
ないという問題があった。
【０００４】また、純粋培養された癌細胞であっても、
遺伝子工学的方法で処理する等により積極的に不死化し
ない限り癌細胞株として樹立される例は少なく、大多数
の癌細胞は継代培養中に分裂不能となってしまうという
問題もある。さらに、生きている癌細胞が存在するとわ
かっている癌組織手術材料を用いた場合にも、癌細胞が
体外培養に適応せず、初代培養開始後数日を経ずして癌
細胞が死滅してしまうことが少なからずあった。このた
め、癌細胞株の樹立もしくは癌細胞の初代培養が困難な
例では、必然的にCTL の誘導培養も困難であり、癌組織
から確実にCTLを誘導培養できる方法の開発が望まれて
いた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ターゲットとなる癌細胞を分離することなく、該癌
細胞を含む癌組織をそのまま用い、末梢血を出発材料と
してCTL を誘導培養および増殖培養する方法を提供する
ことにある。さらに具体的には、本発明は、癌細胞の初
代培養の成功、不成功にわずらわされることなく、癌組
織が生組織であっても、生組織が得られないため固定組
織しかない場合であっても、末梢血に由来するCTL を確
実に誘導培養できる方法を提供することを目的としてい
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記の課題を
解決すべく鋭意努力した結果、癌組織と該癌組織が由来
する患者本人の末梢血リンパ球分画とを共存培養するこ
とにより、該癌細胞が生きていると固定されているとに
かかわらず該癌細胞に対するCTL が誘導されることを見
出した。さらに上記の方法により得られるCTL が、癌組
織を除去した後にも、CTL 単独で殺癌細胞能を失なうこ
となく継続して増殖培養が可能であることを見出した。
本発明は上記に知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】すなわち本発明は、癌細胞を含む癌組織と
該癌組織が由来する個体の末梢血リンパ球とを共存培養
する工程を含む該癌細胞に対する殺細胞能を持つ細胞障
害性Ｔリンパ球の誘導培養方法を提供するものである。
本発明の好ましい態様によれば、該個体がヒト癌患者で
ある上記方法；該癌組織として生組織を用いる上記方
法；該癌組織として固定化組織を用いる上記方法；該癌
組織として細切片または薄切片にした癌組織を用いる上
記方法；該癌組織中の該癌細胞と該末梢血リンパ球とが
相互に接触できる細胞密度で該共存培養を行う上記方
法；正常Ｔリンパ球の培養が可能な培地を用いて該共存
培養を行う上記方法が提供される。
【０００８】また、本発明によれば、上記の方法により
培養された細胞障害性Ｔリンパ球が提供される。さら
に、上記の方法により培養された細胞障害性Ｔリンパ球
をさらに該癌細胞の共存なしに増殖培養する方法が提供
される。この方法は、養子免疫療法等に使用する大量の
細胞障害性Ｔリンパ球を製造できるので有用である。本
発明により、上記の方法により得られた細胞障害性Ｔリ
ンパ球を有効成分として含む医薬組成物が制癌剤として
提供される。
【０００９】本発明の方法に用いる癌組織は癌細胞を含
む組織であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ウサ
ギ、ラット、マウス等の哺乳類の癌手術材料等から入手
することができる。好ましくは、癌組織は養子免疫療法
を行うべきヒト癌患者から手術により摘出された癌手術
材料から入手できる。例えば、摘出された癌手術材料を
そのまま癌組織として用いてもよいし、あるいは、癌手
術材料から癌組織を切り出してもよい。癌組織は、癌細
胞が含まれる組織であれば特に限定されるものではな
く、生組織、生体組織固定方法で処理された固定化組織
標本、パラフィンなどの組織包埋剤で包埋された組織標
本から包埋用薬品・樹脂を除去した残存組織、凍結保存
した組織を融解した組織等のいずれを用いてもよい。こ
れらのうち、摘出直後の手術材料から分離した生組織、
ホルマリンで固定した固定組織標本に由来する組織染色
用薄切片から包埋剤を除去した残存組織を用いることが
好ましい。
【００１０】本発明の方法に従って癌組織を用いる場
合、上記の癌組織を細切または薄切して用いるのが好適
である。癌組織を細切片または薄切片にする方法は特に
限定されないが、切断面に癌細胞が表出するように切断
することが望ましい。手術用はさみ、メス、かみそり等
の鋭利な刃先を持つ用具で細切する方法は特に好ましい
方法である。細切または薄切した癌組織の大きさは特に
限定されないが、好ましくは最大の厚さが 0.0005 mmか
ら 10 mm程度のもの、さらに好ましくは、最大の厚さが
0.002 mm から 1 mm のものを用いることができる。
【００１１】癌組織として生組織を用いる場合には、上
記の様にして得た細切片を細胞培養用培地で洗浄しても
よい。この際に、細胞培養用培地にインターフェロンγ
を添加して数日間インキュベートした後、該細胞培養用
培地を捨てることによって細切片を洗浄することができ
る。インターフェロンγの濃度は特に限定されるもので
はないが、例えば 5 ng/ml程度が好ましい。
【００１２】本発明の方法に用いる末梢血リンパ球とし
ては、上記の癌細胞を含む癌組織が由来する個体の末梢
血から得られたものを用いることができる。例えば、末
梢血リンパ球として該癌組織が由来するヒト癌患者本人
の末梢血から得た単核細胞分画を用いることができる。
末梢血を出発材料として単核細胞分画を得る方法は特に
限定されず、得られた分画に含まれるＴリンパ球が生存
している条件であればどのような方法を採用してもよ
い。
【００１３】本発明の方法は、末梢血リンパ球を上記の
癌組織と共存培養してCTL を誘導培養することを特徴と
している。共存培養の方法は特に限定されないが、例え
ば、上記の単核細胞分画を細胞培養用培地に懸濁し、こ
の懸濁液を上記の方法で得た癌組織細切片に添加して培
養することにより行うことができる。共存培養は、癌組
織中の癌細胞と末梢血リンパ球とが相互に接触できる細
胞密度で行えばよく、例えば、癌細胞に対して末梢血リ
ンパ球を 0.1〜10倍程度、好ましくは 0.5〜2倍程度の
割合とし、全細胞の密度を 10,000 〜 2,000,000個／m
l、好ましくは 500,000〜1,000,000 個／ml程度となる
ように培養を行えばよい。
【００１４】細胞培養用培地は、Ｔリンパ球が生存でき
る培地ならばいかなるものを用いてもよい。例えば、RH
AMα培地 (Kawai, K., Sasaki, T., Saijo-Kurita, K.,
Akaza, H., Koiso, K., and Ohno, T., Cancer Immuno
l. Immunother. 35, 225-229, 1992 に LAK mcdium と
して記載されている) 、AIM V 培地 (GIBCO BRL, Life
Technologies, INC.) 、またはRPMI1640培地などに、イ
ンターロイキン-2等の各種サイトカインを添加したもの
を用いることができる。
【００１５】例えば、RHAMα培地にインターロイキン-
2、インターロイキン-1、インターロイキン-4、及び／
又はインターロイキン-6を添加した培地を好適に使用で
きる。これらのサイトカインの濃度は特に限定されず、
いずれも 1 U/ml から2,000 U/ml程度で用いることがで
きる。例えば、インターロイキン-2については 67 U/m
l、インターロイキン-1については 167 U/ml 、インタ
ーロイキン-4については 67 U/ml、インターロイキン-6
については 134 U/ml 程度で用いることが好ましい。こ
れらのサイトカインは４種類を同時に添加してもよい
が、単独で、あるいは任意の組み合わせとして用いても
よい。
【００１６】上記の共存培養の条件は当業者に周知の条
件に従えばよいが、例えば、培養温度を 33 ℃から 41
℃程度、望ましくは 37 ℃とし、気相として空気もしく
は適当な濃度の酸素を含み培地のpHを7.4 前後に保つた
めに適当な濃度の炭酸ガスを含む不活性ガスを用いるこ
とができる。共存培養期間は特に限定されるものではな
いが、４日以上が好ましい。このような共存培養操作を
行うことにより誘導されてきたリンパ球細胞を、本発明
の細胞障害性Ｔリンパ球として用いることができる。な
お、単核細胞分画と癌組織細切片の共存培養方法の詳細
は以下の実施例に明らかにされているが、本発明の方法
はこれらの方法の細部に限定されることはない。
【００１７】本発明の別な態様によれば、上記の方法に
より誘導培養された細胞障害性Ｔリンパ球から癌組織を
除き、さらに培養を継続することができる。その結果、
単層培養され増殖した細胞障害性Ｔリンパ球を含む培養
物を製造することができる。この培養物から分離採取さ
れた細胞障害性Ｔリンパ球は、養子免疫療法などのあら
ゆる種類の癌治療法や、癌研究等に使用するのに特に好
適である。なお、増殖してきたCTL の分離採取方法は当
業者に周知の方法によればよい。例えば、得られた細胞
障害性Ｔリンパ球を有効成分として含む医薬組成物を当
業者に周知の方法で製造することができ、例えば注射等
の方法により癌組織の由来する患者に投与することがで
きる。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】
実施例１：生癌組織からのCTL 誘導培養 38才の男性患者から脳腫瘍（診断名はグリオプラストー
マ・マルチフォーム)の再発時の摘出癌組織を無菌的な
状態のまま得た。癌組織は肉眼では正常組織の混入はな
いと判断された。この癌組織を、ダルベッコ改変MEM 培
地に10% の牛胎児血清を添加した癌細胞培養培地にわず
かに浸した状態で、眼科用はさみを用いて長径が1mm 以
下になるまで細切した。細切は術後4 時間以内に終了し
た。この細切した癌組織の一部を以下のCTL 誘導培養に
使用し、残りをジメチルスルフォキシド10% を含む通常
の細胞凍結保存用培地に浸して通常の細胞凍結法に従っ
て凍結保存した。
【００１９】プラスチック製 24 穴培養プレートに、1
穴あたり 1 ml の癌細胞培養培地と細切した癌組織片を
5〜10個を加えて初代培養を開始した。培養温度を 37
℃、気相を 95%空気−5%炭酸ガスとし、2 〜3 日おきに
培地を半交換した。培養２週間後に、癌組織からはい出
し付着成育してきた細胞は、シート状のものとアストロ
細胞状のものと2 種類が見分けられた。
【００２０】別途、本人と家族の同意を得た上で、同一
の患者からヘパリン入り末梢血 20mlを得た。この末梢
血から、Ficoll-Hypaqueを使用する通常の方法（商品
名: Lymphosepal 、免疫生物研究所製を使用）により、
単核細胞分画を分離した。この細胞をダルベッコのリン
酸緩衝生理食塩水 (Dulbecco's phosphate bufferred s
aline: 以後 PBSと称する) で一度、さらにCTL 用培地
で一度洗浄した。CTL 用培地としては、基礎培地として
のRHAMα培地に、患者血しょうを 5%(v/v)、インターロ
イキン-2を 67 U/ml、インターロイキン-1を 167 U/ml
、インターロイキン-4を 67 U/ml、インターロイキン-
6を 134 U/ml に添加したものを用いた。さらにこれら
にインターフェロンγを 5 ng/mlに添加した培地を作製
し、CTL-IFNγ用培地とした。
【００２１】あらかじめ培養していない細切したばかり
の半固体状の癌組織を、6 穴プラスチック製培養プレー
トに一穴あたりおよそ 200μl となるように加え、さら
に上述の方法によって得た末梢血単核細胞約 5,000,000
個を 5 ml のCTL 用培地もしくはCTL-IFN γ用培地に懸
濁して添加し、単核細胞と癌組織の共存培養によるCTL
誘導培養を開始した。培養温度は 37 ℃、気相は95% 空
気-5% 炭酸ガスとした。5 日後、癌組織の残骸を取り除
き、培地に浮遊しているリンパ球様細胞を 1,000 rpm、
５分間の遠心分離にて回収した。CTL 用培地とCTL-IFN
γ用培地のいずれの培地を使用した場合にも、リンパ球
様細胞をここで新鮮なCTL 用培地に懸濁して、CTL 誘導
培養のため 3〜5 日毎に培地を交換しながらさらに培養
を続けた。増殖してきた細胞を、CTL 誘導培養に使用し
た培地に対応して、それぞれCTLもしくはCTL-IFN γと
した。
【００２２】比較のため、単核細胞をLAK 用培地に 5,0
00,000個/5mlの細胞密度で懸濁し、6 穴プラスチック製
培養プレートに一穴あたり 5 ml となるように添加し、
14日間培養した。これにより増殖したリンパ球をLAK 細
胞とした。LAK 用培地としては、基礎培地としてのRHAM
α培地に、患者血しょうを 5%(v/v)、インターロイキン
-2を 200 U/ml 添加したものを用いた。その他の培養条
件はCTL の誘導培養の場合と同じ条件とした。CTL 、CT
L-IFN γ、およびLAK 細胞の増殖結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】 ────────────────────────────────── 培養開始後の日数 誘導培養したリンパ球 1 6 10 13 15 ────────────────────────────────── LAK 5000 3136 6700 8350 24400 CTL 5000 3600 6600 10750 32800 CTL-IFN γ 5000 3350 5300 11050 37560 ────────────────────────────────── （表中の数値の単位は千個／穴）
【００２４】CTL 誘導培養開始から14日後のCTL 、CTL-
IFN γ、もしくはLAK 細胞の殺癌細胞活性を測定するた
めに、凍結保存しておいた癌組織を融解し、酵素処理に
よって分散した癌細胞を得た。酵素処理は以下のように
行った。およそ 200 mg 程度の癌組織をPBS で洗浄し、
40 ml の RPMI1640 培地に 10%(v/v) の牛胎児血清、20
mgのコラゲナーゼ (Sigma 社製 Type I)、0.5 mgのデオ
キシリボヌクレアーゼ(Sigma 社製) 、2 mgのヒアルロ
ニダーゼ (Sigma 社製) を添加した液を加え、室温で10
分間攪拌した。癌組織から分散された癌細胞を 1,000 r
pm、3 分間の遠心分離により沈殿させた。PBS で一度洗
浄した癌細胞に対してインターロイキンを含まず 5%(v/
v)の患者血しょうを含むRHAMα培地を10ml添加し、癌細
胞を懸濁させた。
【００２５】上記のように分離した癌細胞と誘導培養し
たリンパ球とを 1:1.4の割合で混合して 115,000個/ml
とし、プラスチック製24穴培養プレートに一穴あたり 1
mlとなるように加えた。この混合物を 48 時間培養
し、一穴の全細胞数を血球計算盤を用いて数えた。一
方、同様にして、癌細胞あるいはリンパ球のみを、イン
ターロイキンを含まず 5%(v/v)の患者血しょうを含むRH
AMα培地1ml とともに24時間培養し、一穴の全細胞数を
血球計算盤を用いて数えた。これらの細胞数から、培養
後に生残したCTL もしくはLAK 細胞の数を差し引いて、
リンパ球によって殺されず生残している癌細胞数を算出
し、リンパ球を添加しなかった癌細胞の生残数に対する
割合を求めた。１点の測定のために3 穴を使用し、その
平均値と標準偏差を求めた。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】 添加したリンパ球の種類 生残癌細胞の割合±標準偏差 ────────────────────────────────── LAK 66.6 ± 7.9% CTL 17.8 ± 16.1% CTL-IFNγ −4.6 ± 5.9% ──────────────────────────────────
【００２７】本法によって得られたCTL をFITC蛍光色素
標識抗CD3 モノクロナール抗体（ニチレイ社製）で蛍光
抗体染色し、鏡検下で観察したところ、95% の細胞が蛍
光陽性であった。また、FITC蛍光色素標識抗CD4 モノク
ローナル抗体（ベクトンディッキンソン社製）またはFI
TC蛍光色素標識抗CD8 モノクローナル抗体（ベクトンデ
ィッキンソン社製）で蛍光抗体染色し、鏡検下で観察し
たところ、それぞれ、5%、80% が蛍光陽性であった。
【００２８】実施例２：固定癌組織からのCTL 誘導培養 53才の男性胃癌患者から、癌性腹水約250ml を採取し
た。別途、胃癌原発部位を摘出した際に作製された病理
検査用ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本のうち、
病理検査に使用した残りから 2μm 厚の未染色薄切切片
を入手した。病理診断は胃粘膜由来進行性アデノカルチ
ノーマであった。さらに、同一患者から本人同意のうえ
ヘパリン入り末梢血20mlを入手した。実施例１と同じ方
法で、癌患者末梢血からLAK 細胞を得た。
【００２９】癌性腹水から腹水細胞を 1,000rpm 、5 分
間の遠心分離によって分離し、通常のFicoll-Hypaqueを
使用する方法（商品名: Lymphosepal 、免疫生物研究所
製を使用）により、単核細胞分画（リンパ球分画でもあ
る）、癌細胞分画、赤血球分画とに分離した。実施例１
のCTL 用培地において 5%(v/v)患者血しょうを 10%(v/
v) 牛胎児血清に変更したTIL 用培地を単核細胞分画に
添加し、1,000,000 個/ml として培養した。一週間後、
このTIL 用培地中のインターロイキン-2を 67 U/mlのま
まとしたうえで、インターロイキン-1を 16.7 U/ml、イ
ンターロイキン-4を 6.7 U/ml 、インターロイキン-6を
13.4 U/mlに下げた改変TIL 用培地を使用して適宣希釈
し培養を続けた。増殖してきた細胞を TILとした。
【００３０】また癌細胞分画を 10%(v/v) の牛胎児血清
を含むダルベッコ改変MEM 培地に 1,000,000個/ml とな
るように懸濁し、その 5 ml を直径 6 cm のプラスチッ
クディッシュに播種して２日間培養した。培養温度は 3
7 ℃、気相は 95%空気−5 %炭酸ガスとした。この後、
まだ浮遊している細胞層を除去し、付着している細胞層
に新鮮な培地を添加して培養を継続した。適宣培地交換
を続けて培養した結果、１ヶ月後にコンフルエントとな
り、継代培養をさらに3 ヶ月以上続けても安定して増殖
培養できる状態に達したので、この細胞株をGT3TKBと命
名した。
【００３１】癌患者末梢血から実施例１と同じ方法で単
核細胞分画を得、単核細胞のおよそ5,000,000 個を実施
例１と同じ5ml のCTL 用培地に懸濁した。あらかじめ培
養しておいた癌細胞約6,000,000 個を含む 6 cm のプラ
スチック製ディッシュにこの懸濁液を添加し、単核細胞
と癌細胞の共存によるCTL 誘導培養を開始した。培養温
度は 37 ℃、気相は95% 空気−5 % 炭酸ガスとした。５
日後、培地に浮遊しているリンパ球様細胞を 1,000 rp
m、3 分間の遠心分離にて回収し、ここで新鮮なCTL 用
培地に懸濁して、３〜５日毎に培地を交換しながら培養
を続けた。増殖してきた細胞を、CTL 誘導培養に使用し
た生きている標的癌細胞に対応して、CTL(live) とし
た。
【００３２】一方、ホルマリン固定パラフィン包埋組織
薄切片から、トルエンとエタノールを用いて包埋用パラ
フィンを洗い去り、さらに組織片を70% エタノール、PB
S で繰り返し洗浄してからプラスチック製 24 穴培養プ
レートの穴に入れた。上述の方法で得た単核細胞を実施
例１と同じCTL 用培地に懸濁し、一穴あたり 1,000,000
個となるように 1 ml の培地とともに播種し、CTL 誘導
培養を開始した。培養温度を 37 ℃、気相を 95%空気−
5%炭酸ガスとし培地を２日毎に半交換した。
【００３３】一週間後には大部分のリンパ球が死亡した
が、切片に付着したリンパ球は増殖していた。増殖し培
地に浮遊しているリンパ球を 1,000 rmp、３分間の遠心
分離にて回収し、新鮮なCTL 用培地に懸濁して、さらに
培地を交換しながら培養を続けた。この際、白岩らの方
法（白岩浩志ら: Biotherapy, 4, 427, 1990）に従って
培養表面を抗CD3 抗体でコートした穴を使用した。増殖
してきた細胞をCTL 誘導培養に使用した固定された標的
癌細胞に対応して CTL(fix) とした。
【００３４】こうして得られた LAK、TIL 、CTL(live)
、CTL(fix)、の細胞表面抗原CD3 、CD4 、CD8 、CD16
の有無を、FITC標識蛍光モノクローナル抗体で蛍光染色
して調べた。また、生きているGT3TKB細胞を標的癌細胞
として、これらのリンパ球の殺癌細胞活性を以下の方法
で調べた。得られた結果を表３に示す。
【００３５】5%の牛胎児血清を含むダルベッコ改変MEM
培地 1 ml あたり癌細胞 100,000個を懸濁した懸濁液を
作製し、プラスチック製 96 穴培養プレートの一穴に0.
1mlづつ播種した。培養温度と気相は上記と同じとし、
一夜培養後、付着して生き残った癌細胞数を数えて一穴
あたりの細胞数とした。培地を捨て、リンパ球を懸濁し
たアッセイ培地 0.1mlを添加して 48 時間培養した。リ
ンパ球の数は、癌細胞数に対する比（以後、E/T 比と称
する）で 0.5、１、または２となるように調節した。ア
ッセイ培地としては、基礎培地としてのRHAMα培地に、
牛胎児血清を 5%(v/v)、インターロイキン-2を 67 U/m
l、インターロイキン-1を 167 U/ml となるように添加
したものを用いた。
【００３６】培養後、培地を捨てて一穴あたり 0.05 ml
の 10%(v/v) ホルマリンを添加し、生残している癌細胞
とその癌細胞に強く付着しているリンパ球を固定した。
固定後プレートごと水洗いし、一穴あたり 0.1 ml の
0.4%(v/v)クリスタルバイオレット水溶液を加えて１時
間室温で染色した。水洗後に風乾し、一穴あたり0.1ml
のエタノールを加えた後、紫色の色素量を 540 nm の波
長で比色定量した。リンパ球を添加していない癌細胞に
ついても比色定量値を求め、これを分母にしてリンパ球
を添加した場合の比色定量値を分子にとり、付着生残細
胞の割合を計算し殺癌細胞活性を表した。一点の測定に
は８穴を使用した。
【００３７】上記の測定の際、リンパ球を添加した穴の
生残癌細胞に強く付着したリンパ球に由来する比色定量
値は、生残癌細胞そのものに由来する比色定量値に比
べ、ほとんど無視できる程度に小さいことを、一穴あた
りの癌細胞数を揃えてリンパ球を付着させて洗浄除去し
た予備実験であらかじめ確認した。この実施例の結果か
ら、誘導培養された CTL(live)およびCTL(fix)が、とも
に細胞表面にCD8 抗原を有しており、患者自身の癌細胞
であるGT3TKB細胞の大部分を殺す能力があることが明ら
かとなった。
【００３８】
【表３】 ─────────────────────────────────── 細胞表面抗原 殺癌細胞活性* (E/T比=1) ────────────────── 生残癌細胞の割合 リンパ球 CD3 CD4 CD8 CD16 ±標準偏差 ─────────────────────────────────── LAX 94.6 % 28.1% 34.0 % 5.4% 94.3±2.6 % TIL 99.1 % 7.5% 84.0 % 3.3% 98.0±3.7 % CTL(live) 97.0 % 3.1% 93.6 % 0.1% 1.3±2.3 % CTL(fix) 97.2 % 2.8% 92.5 % 0.1% 24.1±1.0 % ─────────────────────────────────── * 標的癌細胞はGT3TKB細胞。
【００３９】さらに、CTL(fix)について、理化学研究所
細胞開発銀行（茨城県つくば市）より入手した他の樹立
胃癌細胞株に対する殺癌細胞活性を上述の方法で測定し
た。結果を表４に示す。この結果から、CTL(fix)は自家
癌であるGT3TKBを特異的に殺す能力を持ち、他家癌細胞
であるGC1Y細胞はほとんど殺さず、HGC-27細胞には弱い
殺細胞効果を持つことが明らかになった。
【００４０】
【表４】 ─────────────────────────────────── E/T比 標的胃癌細胞 0.5 1 2 ──────────────────────────────────── GT3TKB 31.9 ± 5.7% 9.7 ± 1.9% 1.7 ± 1.9% HGC-27 81.7 ± 5.7% 35.6 ± 5.4% 9.5 ± 2.1% GCIY 135.3 ±15.4% 124.8 ±13.5% 79.7 ± 6.5% ───────────────────────────────────
【００４１】
【発明の効果】本発明の方法によれば、癌細胞を含む生
組織あるいは固定化組織をそのまま用いて、その特定の
癌細胞に対して殺癌細胞を持つ細胞障害性Ｔリンパ球細
胞を体外で誘導培養することができる。本発明の方法に
よれば、癌組織から癌細胞を分離し純粋培養を行う必要
がないので簡便であり、所望の細胞障害性Ｔリンパ球細
胞を迅速に大量培養することができる。得られた細胞障
害性Ｔリンパ球細胞は、癌患者に対する養子免疫療法、
リンパ球による殺癌細胞の機構研究、リンパ球に外来遺
伝子を導入することによる遺伝子治療などに有用であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/28 7431−4Ｃ (72)発明者 轟 健 茨城県つくば市松代５丁目５番地12

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 癌細胞を含む癌組織と該癌組織が由来す
    る個体の末梢血リンパ球とを共存培養する工程を含む該
    癌細胞に対する殺細胞能を持つ細胞障害性Ｔリンパ球の
    誘導培養方法。
  2. 【請求項２】 該癌組織として生組織または固定化組織
    を用いる請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 該癌組織中の該癌細胞と該末梢血リンパ
    球とが相互に接触できる細胞密度で該共存培養を行う請
    求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の方法により誘導培養さ
    れた細胞障害性Ｔリンパ球。
  5. 【請求項５】 癌細胞を含む癌組織と該癌組織が由来す
    る個体の末梢血リンパ球とを共存培養する工程によって
    誘導される該癌細胞に対する殺細胞能を持つ細胞障害性
    Ｔリンパ球を、さらに該癌細胞の共存なしに培養する細
    胞障害性Ｔリンパ球の増殖培養方法。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法により増殖培養さ
    れた細胞障害性Ｔリンパ球。
  7. 【請求項７】 請求項４または請求項６に記載の細胞障
    害性Ｔリンパ球を有効成分として含む制癌剤。
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