CN112831468A - 改良til细胞诱导的tcm/tscm细胞及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫细胞靶向治疗实体瘤技术领域,特别涉及一种改良肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)诱导分化为TCM和TSCM细胞及应用。TIL为聚集在肿瘤病灶区域内的CD8+T淋巴细胞,在肿瘤免疫机制中处于免疫应答和调控作用的前沿,为攻克实体瘤带来一线曙光,但从肿瘤组织分离培养肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞很困难,而且TIL大多处于耗竭状态,很难扩增。为了解决从肿瘤组织分离制备TIL得率低,增殖活性低的问题,本人通过将肿瘤组织块和低温冻存的PBMC或新鲜分离的PBMC共培养的方法,获得改良TIL细胞,将其诱导成TIL‑TCM或TIL‑TSCM细胞,有望提供具有更强生存能力和效应功能的肿瘤反应性T细胞。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞靶向治疗实体瘤技术领域,特别涉及一种改良肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)诱导分化为记忆性免疫细胞(TCM)和干细胞样记忆性T细胞(TSCM),还涉及TIL-TCM和TIL-TSCM细胞的应用。
背景技术
过继性细胞治疗技术为打破肿瘤患者中枢和外周免疫耐受,恢复或增强其抗肿瘤免疫功能提供了一种有效的方法,但实体瘤治疗效果较差。肿瘤浸润T淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL),其主要为聚集在肿瘤病灶区域内的CD8+T淋巴细胞,在肿瘤免疫机制中处于免疫应答和调控作用的前沿,TIL细胞为攻克实体瘤带来一线曙光,但从肿瘤组织分离培养原代肿瘤细胞以及肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞很困难, 而且TIL大多是处于耗竭状态的T细胞,很难扩增。
TCM和TSCM细胞在体内再次遭遇相同抗原时可迅速活化发挥免疫效应,同时具有自我更新能力,能够提供更为长期的免疫保护,可能为过继性细胞治疗提供更为合适的免疫效应细胞,有望在回输体内后建立更长期的抗肿瘤免疫。分离制备改良TIL细胞并诱导成TIL-TCM和TIL-TSCM有望提供具有更强生存能力和效应功能的实体肿瘤反应性T细胞。
发明内容
为了解决从肿瘤组织分离制备TIL得率低,增殖活性低的问题,本人通过将肿瘤组织块和低温冻存的PBMC或新鲜分离的PBMC共培养的方法,获得改良TIL细胞,并将其诱导成TIL-TCM或TIL-TSCM细胞,TIL-TCM或TIL-TSCM诱导活化率高的诱导方法。
从外周血中分离PBMC或复苏低温冻存的PBMC细胞,并用CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞,将大小1-5mm3的肿瘤组织块和T细胞共培养,用本人发明的 TCM诱导培养试剂盒(申请号2018111113228)和TSCM诱导培养试剂盒(申请号2019103666958),诱导为TIL-TCM细胞或TIL-TSCM细胞。解决肿瘤患者TIL细胞增殖能力差和免疫无能的问题。
一种改良TIL细胞制备,诱导活化为TIL-TCM或TIL-TSCM的方法,包括以下步骤:
健康人PBMC冻存复苏,或抽取患者外周血并分离PBMC,并用CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞,取患者肿瘤组织,手术剪剪成1-5mm3的组织块,和T细胞共培养。
TIL-TCM诱导:
D0天用TCM-II ,包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时。上述T细胞按照密度1×106/mL用TCM-III重悬,其中添加300-2000u/mL 人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL人白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mL IL-2。
第二天以后用 TCM-I培养液对TIL-TCM细胞进行扩增培养,经过8-10天的扩增培养,收获达到临床应用标准的TIL-TCM细胞,并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测,细胞鉴定结果表明,细胞活性达到95%以上,同时含有较高比例的CD8+CD62L+CD45RO+和CD4+CD62L+CD45RO+细胞。
TIL-TSCM诱导:
D0天用TSCM-II 包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时。上述T按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬,其中添加50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、5-30ng/mL人白介素7、5-30ng /mL 人白介素21,5-30ng /mL人白介素15。第二天以后用TSCM-I培养液对TIL-TSCM细胞进行扩增培养,经过15-30天的扩增培养,收获达到临床应用标准的TIL-TSCM细胞,并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测,细胞鉴定结果表明,细胞活性达到95%以上,同时含有较高比例的CD3+-BV421/CD4+-APC-Cy/CD8+APC/CD62L+PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE细胞。
台盼蓝染色法获取TIL-TCM细胞及TIL-TSCM细胞体外刺激活化后生长曲线。
本实验结果为改良的TIL细胞诱导的TCM或TSCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础,解决了肿瘤患者T细胞增殖能力差和免疫无能问题。
本发明所述肿瘤组织为人体实体恶性肿瘤组织,包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等。
本发明所述疾病包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等。
本发明的有益效果:
1)本发明为改良的TIL细胞诱导的TCM或TSCM细胞应用于临床肿瘤治疗提供了基础,解决了肿瘤患者TIL细胞增殖能力差和免疫无能问题;
2)目前制备的TIL免疫细胞在体内难以长期存活,极大的影响了过继性细胞治疗的临床疗效。记忆性T细胞具有长效记忆性,提高了过继性细胞治疗的临床疗效;
3)本发明获得的TIL-TCM诱导效率达到行业内领先水平,CD8+ TIL-TCM比例高达95.95%,CD4+ TIL-TCM细胞比例高达94.15%;
4)本发明获得的TIL-TSCM诱导效率达到行业内领先水平,CD8+ TIL-TSCM比例高达100%,CD4+ TIL-TSCM细胞比例高达99.56%。
附图说明:
图1 体外诱导培养8天后CD8+TIL-TCM和CD4+TIL-TCM比例;
图2 TIL-TCM体外刺激活化后生长曲线;
图3体外诱导培养15天时CD8+TIL-TSCM和CD4+TIL-TSCM比例;
图4 TIL-TSCM体外刺激活化后生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
一、PBMC细胞的分离与冻存:
a.PBMC细胞的分离:外周血用电动助吸器按照每管不多于35 mL,平均分至50 mL离心管中,931 g,离心8 min,吸取上层血浆至50 mL离心管中,取1.5 mL于EP管中,标记,-80℃保存。用NA稀释血细胞,使得血细胞:NA为1:1,混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层,形成完整的界面。596 g,离心20 min。可见明显分层。吸弃第一层上清,小心轻柔地将第二层的白色细胞层分别吸至不同的洁净50 mL离心管中。分别向各管中加NA,稀释混匀,定容至40mL/管。931 g,离心8 min。吸弃上清,加NA重悬细胞。冻存处理前留取细胞悬液计数和活力测定。
b.PBMC细胞冷冻保存:纯化后细胞重悬于自配冷冻保存液中,轻轻混匀后置-20℃冰箱冷却平衡5-15 min到4 ℃以下,同时把冻存管放4 ℃冰箱平衡15 min。分装入2 -10mL冻存管内,管壁做好标识。放在样本冻存盒,转移至程序降温盒仪器,最终将细胞保存于-196 ℃液氮内,降温梯度如下:
(a)4℃等待,至产品放入程序降温仪;
(b)以5℃/min 降至0℃,保持5min;
(c)以2℃/min 降至-10℃,保持5min;
(d)以1℃/min 降至-45℃,保持35min;
(e)以5℃/min 降至-90℃,保持5min;
(f)结束。
二、PBMC冷冻后复苏:取出冻存管,迅速投入 37 ℃水浴中,并不断轻轻摇动,保证管内液体在1 min 内80%溶解,将细胞吸到一定量 DMEM 洗涤液中,并洗涤冻存管1 次,移入50 mL 离心管中,233 g 离心5 min。弃上清,加入适量培养基,轻轻混匀,留取500 微升做计数测细胞活性。
实施例2
在实施例1基础上,制备改良TIL细胞:
CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞,将肿瘤组织加工成体积为1-5mm3的组织块,和T细胞共培养。
实施例3
在实施例2的基础上,制备TIL-TCM细胞:
D0天用TCM-II ,包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时。上述T细胞按照密度1×106/mL用TCM-III重悬,其中添加500u/mL IFN-γ、120u/mL IL-1α、1000u/mLIL-2、30IU/mL IL-7、30IU/mLIL-15、80ng/mL CD3单抗、80ng/mL CD28。第二天以后用 TCM-I培养液对TIL-TCM细胞进行扩增培养,经过8-10天的扩增培养,收获达到临床应用标准的TIL-TCM细胞,并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测,细胞鉴定结果表明,细胞活性达到95%以上,同时含有较高比例的CD8+CD62L+CD45RO+和CD4+CD62L+CD45RO+细胞,CD8+TCM比例高达95.95%,CD4TCM细胞比例高达94.15%,见图1。台盼蓝染色法获取TIL-TCM体外刺激活化后生长曲线(至体外培养至10天),见图2。
实施例4
在实施例2的基础上,制备TIL-TSCM细胞:
D0天用TSCM-II 包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时。上述T按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬,其中添加8ng/mL人白介素7、8ng /mL 人白介素21,8ng/mL人白介素15、80ng/mL CD3单抗、80ng/mL CD28。第二天以后用 TSCM-I培养液对TIL-TSCM细胞进行扩增培养,经过15-30天的扩增培养,收获达到临床应用标准的TIL-TSCM细胞,并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测,细胞鉴定结果表明,细胞活性达到95%以上,同时含有较高比例的CD3+-BV421/CD4+-APC-Cy/CD8+APC/CD62L+ PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE细胞,CD8TSCM和CD4TSCM分别占比100%和99.56%,见图3; 台盼蓝染色法获取TIL-TSCM细胞体外刺激活化后生长曲线,见图4。
本发明中使用的主要仪器和试剂如下:
无血清培养基(X-VIVO15)、Pague plus分离液、重组人IFN-γ、重组人IL-2、重组人IL-15、IL-7、鼠抗人CD3单克隆抗体和鼠抗人CD28单克隆抗体,肿瘤组织块,Ⅱ级生物安全柜(Termoscitific)、低温台式台式离心机(Beckman Coulter)、超低温冰箱和二氧化碳培养箱(Termoscitific)和流式细胞分析仪。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受实施例的限制,其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种临床用改良TIL-TCM和TIL-TSCM诱导培养和质量控制鉴定的方法,其特征在于,包含从新鲜或低温冻存的人体外周血单个核细胞中分离纯化T细胞,T细胞和肿瘤组织块共培养,获得改良TIL,用本人发明的TCM诱导试剂盒和TSCM诱导试剂盒将TIL诱导扩增为TIL-TCM和TIL-TSCM的方法及应用:
(1)从外周血中分离PBMC或复苏低温冻存的PBMC细胞,并用CD3磁珠分选纯化出CD3阳性的T细胞,将大小1-5mm3的肿瘤组织块和T细胞共培养;
(2)TIL-TCM诱导:D0天用TCM-II ,包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时,上述(1)中T细胞按照密度1×106/mL用TCM-III重悬,其中添加300-2000u/mL 人干扰素γ、50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、50-200u/mL人白介素1α、30IU/mL人白介素7、30IU/mL人白介素15、500-2000u/mL IL-2,第二天以后用 TCM-I培养液对TIL-TCM细胞进行扩增培养,经过8-10天的扩增培养,收获达到临床应用标准的TIL-TCM细胞,并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测,细胞鉴定结果表明,细胞活性达到95%以上,同时含有较高比例的CD8+CD62L+CD45RO+和CD4+CD62L+CD45RO+细胞;
(3)TIL-TSCM诱导:
D0天用TSCM-II 包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时,上述(1)中T按照细胞密度1×106/mL用TSCM-III重悬,其中添加50-200ng/mLCD3单抗、50-200ng/mLCD28单抗、5-30ng/mL人白介素7、5-30ng /mL 人白介素21,5-30ng /mL人白介素15,第二天以后用 TSCM-I培养液对TIL-TSCM细胞进行扩增培养,经过15-30天的扩增培养,收获达到临床应用标准的TIL-TSCM细胞,并对细胞制剂进行内毒素、活性和表型检测,细胞鉴定结果表明,细胞活性达到95%以上,同时含有较高比例的CD3+-BV421/CD4+-APC-Cy/CD8+APC/CD62L+ PE-cy7/CD45RO-Percp-Cy5.5CD/45RA+FITC/CD95+PE细胞;
(4)TIL-TCM和TIL-TSCM诱导培养后鉴定:用本人发明的TCM和TSCM鉴定试剂盒进行鉴定。
2.应用权利要求1所述的方法制备TIL-TCM和TIL-TSCM的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)外周血PBMC分离或冻存PBMC复苏和T细胞纯化:
(2)实体瘤组织块获取:将肿瘤组织加工成体积为1-5mm3的组织块;
所述肿瘤组织为人体实体恶性肿瘤组织,包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等;
(3)质量检测合格的TIL-TCM或TIL-TSCM细胞装入50-100ml生理盐水中,制成免疫细胞制剂,配合肿瘤临床治疗需要静脉回输。
3.根据权利要求2所述的TIL-TCM,其特征在于步骤(2)中T细胞按照密度1x106ml接种,和组织块共培养前采用TCM-II包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时,采用六孔板、T75、T175培养瓶和1L培养袋生产获得了临床应用TCM细胞,培养时间为8-10天。
4.根据权利要求2所述的TIL-TSCM,其特征在于步骤(2)中T细胞按照密度1x106ml接种,采用TSCM-II包被六孔板或培养瓶,平放于37℃培养箱中大于2小时,采用六孔板、T75、T175培养瓶和1L培养袋生产获得了临床应用TSCM细胞,培养时间为15-30天。
5.根据权利要求2所述的TIL-TCM或TIL-TSCM细胞,其特征在于培养后5天用DC负载肿瘤抗原进行肿瘤抗原再刺激。
6.根据权利要求2所述的TIL-TCM或TIL-TSCM细胞,其特征在于所述细胞制剂的质量控制鉴定方法,按照国家食品药品监督管理总局公布的《药品注册管理办法(修订稿)》意见中“生物制品注册分类和申报资料要求(试行)”进行质量控制,保证临床应用时的安全性。
7.根据权利要求2所述的TIL-TCM或TIL-TSCM细胞,其特征在于在获得本发明TIL-TCM或TIL-TSCM细胞之前,用生理盐水洗涤并重悬所述TIL-TCM或TIL-TSCM细胞3-4次,直至满足《中国药典》要求的无菌、内毒素的检测指标,保证本发明的TIL-TCM或TIL-TSCM细胞在回输给患者是残留的本发明所述的培养基组分和诱导因子组合物不会引起患者不适反应。
8.所述TIL-TCM或TIL-TSCM细胞组合物包含3x106-2x107/ml的本发明TIL-TCM或TIL-TSCM细胞,其有效量为50ml-100ml/个体的生理盐水组合物,密度为1x105-3x107/ml,优选为1x106-2x107/ml,还包括人血白蛋白;其中,以所述组合物为基础,所述人血白蛋白的质量体积含量为1-5%,优选为3%。
9.根据权利要求2所述的干细胞样记忆性免疫细胞,其特征在于上述步骤TIL-TCM或TIL-TSCM组合物使用的方式为滴注,具体地,使用所述TIL-TCM或TIL-TSCM细胞组合物的方式为采用6号针头或7号针头、输血器,静脉注射或静脉滴注,优选使用所述TIL-TCM或TIL-TSCM细胞组合物的方式为在手臂或者下肢采用7号针头输液器进行静脉滴注,以上所述TIL-TCM或TIL-TSCM细胞组合物都是一次静脉滴注的剂量,一个疗程三-四次静脉滴注治疗,从第一次开始期间连续或每间隔一天再回输下一次,一个疗程结束后,如有必要,间隔时间为一年或两年后还可继续再治疗。
10.一种权利要求1-9中任一项所述的TIL-TCM或TIL-TSCM细胞在临床实体肿瘤治疗和药物中的应用,包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等。
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN115433713A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-12-06 | 中山大学孙逸仙纪念医院深汕中心医院 | 一种自体肿瘤引流淋巴结淋巴细胞的制备方法及其应用 |
WO2023078427A1 (zh) * | 2021-11-05 | 2023-05-11 | 瑞创生物技术有限公司 | 一种体外大规模扩增富含Tscm和Tcm的双阴性T细胞的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5874307A (en) * | 1994-06-28 | 1999-02-23 | The Institute Of Physical And Chemical Research | Process for induction culture of cytotoxic T lymphocytes having killing activity against tumor cells |
CN106119193A (zh) * | 2016-07-28 | 2016-11-16 | 上海闪锦生物科技有限公司 | 一种兼有nk细胞特质的抗原特异性t细胞的制备方法 |
CN109266607A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-01-25 | 路春光 | 一种优化的临床用tcm分选、诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用 |
-
2019
- 2019-11-22 CN CN201911158558.1A patent/CN112831468A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5874307A (en) * | 1994-06-28 | 1999-02-23 | The Institute Of Physical And Chemical Research | Process for induction culture of cytotoxic T lymphocytes having killing activity against tumor cells |
CN106119193A (zh) * | 2016-07-28 | 2016-11-16 | 上海闪锦生物科技有限公司 | 一种兼有nk细胞特质的抗原特异性t细胞的制备方法 |
CN109266607A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-01-25 | 路春光 | 一种优化的临床用tcm分选、诱导培养和质量控制鉴定试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
董强刚: "抗原特异性T细胞过继免疫治疗的临床研究:现状与前景展望", 《中国细胞生物学学报》 * |
陈晚华等: "TIL肿瘤过继细胞治疗研究进展", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023078427A1 (zh) * | 2021-11-05 | 2023-05-11 | 瑞创生物技术有限公司 | 一种体外大规模扩增富含Tscm和Tcm的双阴性T细胞的方法 |
CN115433713A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-12-06 | 中山大学孙逸仙纪念医院深汕中心医院 | 一种自体肿瘤引流淋巴结淋巴细胞的制备方法及其应用 |
CN115433713B (zh) * | 2022-03-03 | 2023-10-27 | 中山大学孙逸仙纪念医院深汕中心医院 | 一种自体肿瘤引流淋巴结淋巴细胞的制备方法及其应用 |
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