KR20170000798A - 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물 - Google Patents

자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자연살해세포를 제1 인터루킨 (IL-2), 제2 인터루킨 (IL-12, IL-15 및 IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨) 및 항-NKp46 항체를 포함하는 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는, 세포 증식 및 항암 효과가 향상된 자연살해세포 증식 방법 및 자연살해 세포 증식용 조성물에 관한 것이다.

Description

자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물 {Method and Composition for Proliferating of Natural Killer Cell}
본 발명은 자연살해세포의 증식 방법 및 증식용 조성물, 및 증식된 자연살해세포의 항암 효과 증가에 관한 것이다.
면역세포치료법에 이용되고 있는 자연살해세포(natural killer cell, 이하 "NK 세포"라 칭함)는 형태학적으로 세포질에 큰 과립을 가지는 세포로, 혈액 내 림프구의 약 5∼15%를 차지한다. 현재까지 밝혀진 NK 세포의 주요기능으로는 종양세포를 살해할 수 있는 능력, 바이러스 감염세포에 대한 세포독성, 및 세균과 진균을 살해하는 능력 등이 있다. 따라서 NK 세포는 항종양, 면역 및 미생물에 대한 보호면역에 대하여 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
NK 세포는 T 세포수용체, CD4 또는 면역글로불린 같은 세포표면 수용체를 가지고 있지 않아 기존의 T 세포 및 B 세포와는 다른 독특한 면역세포로 분류된다. 특히 NK 세포는 비특이적으로 암을 살상할 수 있는 능력이 있는 세포로 알려져 있다. 이러한 NK 세포의 살해능력은 림포카인 활성 살생세포(lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구(tumor infiltration lymphocytes, TIL)와 함께 고형암 치료에 활용되거나, 또는 공여자 임파구 주입(donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법(Tilden. A. B. et al., J. Immunol., 136)을 수행함으로써, 골수이식이나 장기 이식시 발생하는 거부반응을 방지하기 위한 새로운 세포치료 법으로 응용될 수 있다. 또한, NK 세포의 분화와 활성에서의 결함은 유방암(Konjevic G, et al., Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2001), 흑색종암(Ryuke Y, et al., Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), 폐암(Villegas FR, et al., Lung Cancer, 35: 23-28, 2002) 등 다양한 암 질환과 관련되어 있음이 보고되어, 이러한 질환들의 치료 분야에서 NK 세포 치료법이 대두되고 있다.
NK 세포를 항암 등 면역 세포치료에 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보가 요구된다. 그러나 전술한 바와 같이 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 혈액 내 림프구의 5~15%에 불과하고, 특히 암 환자에서는 종종 NK 세포의 수, 분화 및 기능이 저하되어 있어, 사실상 질병 치료를 위해 충분한 세포수의 확보가 어려운 실정이다. 또한 기존에 개발된 NK 세포의 증식 방법에 따라 얻어진 NK 세포는 증식율 및 세포독성 활성능에 있어서 다양한 편차가 존재한다. 따라서 충분한 암세포 살상능을 유지하는 NK 세포의 다량 확보를 위한, 새로운 NK 세포의 증식 또는 분화 방법이 절실히 요구된다.
본 발명의 일 목적은 항암효과가 향상된 자연살해세포의 증식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자연살해세포 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자연살해세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자연살해세포의 증식용 조성물을 제공하는 것이다.
일 양태는 NK 세포를 제1 인터루킨, 제2 인터루킨 및 항-NKp46 항체를 포함하는 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 NK 세포 증식 방법을 제공한다.
상기 제1 인터루킨은 IL-2일 수 있다.
상기 제2 인터루킨은 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨일 수 있다. 또한 바람직하게는 상기 제2 인터루킨은 IL-12, IL-18, IL-12/IL-18, 또는 IL-12/IL-15/IL-18일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 IL-18일 수 있다.
상기 NK 세포의 배양은 감마글로불린(IgG) 및 피브로넥틴의 존재 하에 상기의 제1 인터루킨, 제2 인터루킨, 및 항-NKp46 항체를 포함하는 배양액에서 배양하는 것일 수 있다. 본 발명의 방법은 NK 세포를 감마글로불린(IgG) 및 피브로넥틴의 존재 하에서 배양함으로써, NK 세포의 항암 효과가 보다 향상될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "세포 증식"은 세포가 일련의 세포 분열 단계를 거쳐 배양물에서 세포의 수가 증가하거나 또는 세포가 분화하는 것을 의미한다. 용어 "자연살해세포 증식"은 일련의 세포 분열 단계를 거쳐 배양물에서 NK 세포의 수가 증가하거나 또는 미성숙 혈액 세포에서 NK 세포로의 분화에 의해 NK 세포의 수가 증가하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "자연살해세포 증식"은 NK 세포수의 증가, 또는 미분화된 림프구 세포가 NK세포의 형질을 획득하여 NK 세포로 분화 또는 NK 세포가 미성숙 상태에서 성숙 NK 세포로 되는 상태를 포함할 수 있다.
상기 증식의 원료가 되는 NK 세포는 상업적으로 구입하거나, 인간 또는 동물로부터 채취할 수 있으며, 바람직하게는 NK 세포에 의한 치료를 필요로 하는 인간으로부터 공급받을 수 있다. 또한 상기 NK 세포는 생체 내 임의의 조직 공급원으로부터 공급받을 수 있다. 예를 들면 상기 NK 세포는 생체로부터 채취된 혈액 중에 포함될 수 있다. 상기 혈액은 NK 세포를 포함하는 혈액이라면 본 발명의 NK 세포 증식 방법에 적용하기 위한 NK 세포 공급원으로서 이용가능하며, 예를 들면 전혈, 제대혈, 골수, 또는 말초혈액일 수 있다.
상기 자연살해세포 증식은 예를 들면 말초혈액 단핵세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 용어 "말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)"는 포유동물, 바람직하게는 사람의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포로서, 주로 B 세포, T 세포, 자연살해 세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취한 말초혈액으로부터 통상의 제조방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직하게 상기 PBMC는 피콜(Ficoll)을 이용한 비중 원심분리법을 이용하여 말초혈액으로부터 분리할 수 있다.
또한 상기 말초혈액 단핵세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 얻어지는 것, 즉 자가(autologous) 말초혈액 단핵세포일 수 있다. 상기 말초혈액 단핵세포가 자가 말초혈액 단핵세포일 경우, 증식된 NK 세포 집단에서 일부 T 세포가 존재하더라도, 모든 세포가 환자 본인 유래이기 때문에 T 세포를 제거할 필요가 없다는 장점이 있다.
또한 본 발명의 NK 세포의 증식 방법에 이용되는 말초혈액 단핵세포는 동결되어 보존된 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 말초혈액 단핵세포는 혈액에서 분리한 후, 동결시킨 다음 이를 다시 해동시켜 NK 세포 증식에 이용할 수 있다. 상기 동결은 종래의 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 -42℃ 범위의 제1 동결단계, -42 내지 -15℃ 범위의 제2동결단계, 및 -15 내지 -120℃ 범위의 제3 동결단계로 이루어진 동결 방법에 의해 동결될 수 있다. 이 경우, 각 동결단계는 온도 범위 내의 여러 불연속적 온도에서 순차적으로 일정시간 시료를 유지시킴으로써, 각 동결단계의 온도 범위의 상한선 또는 하한선까지 온도를 상승 또는 하강시킬 수 있다. 일 구체예에서, 제1 동결단계는 0℃에서 10~15분, -12℃에서 5~10분, 및 -42℃에서 0.5~1분 동안의 조건으로 동결시키고, 상기 제2 동결단계는 제1 동결단계 후 -25℃에서 1~3분, 및 -15℃에서 1~3분의 조건으로 동결시키며, 상기 제3 동결단계는 제2 동결단계 후 -42℃에서 20~40분 및 -120℃에서 20~50분의 조건으로 동결시키는 과정으로 이루어질 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 제1 동결단계는 4~-40℃ 범위에서 0.5~5℃/m으로 동결하고, 상기 제2 동결 단계는 제1 동결단계 후 -40~-90℃ 범위에서 1~10℃/m의 조건으로 동결시키며, 상기 제3 동결단계는 제2 동결단계 후 -90~-120℃ 범위에서 1~10℃/m의 조건으로 동결시키는 과정으로 이루어질 수 있다. 동결방법의 각 동결단계는 CRF(controlled rate freezer)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 말초혈액 단핵세포를 동결시킬 경우, 분리된 세포를 cryostor CS10 또는 ALyS505NK-EX와 Albumin+DMSO의 혼합액으로 세포를 부유하여 적정한 세포수가 되도록 조절한 후 동결하는 것이 바람직하다. 상기 동결보존된 말초혈액 단핵세포는 해동 후 본 발명에 따른 NK 세포의 배양 및 증식에 제공될 수 있으며, 동결과정을 거침으로써 환자로부터 혈액을 채취한 후 원하시는 시기에 배양 및 증식과정을 거쳐 사용할 수 있다는 장점을 가진다. 대부분의 면역세포 치료제는 임상에서 효과적인 세포수를 생산하기 위하여 배양기간을 2주간 설정함에 따라, 배양기간을 고려하여 환자가 2주마다 채혈을 해야 하는 부담이 있으며, 환자의 컨디션에 따라 세포배양에 영향을 미칠 수 있다. 그러나 본 발명은 높은 생존율을 유지하며, 활성화된 NK 세포의 배양방법에 효과적으로 적용할 수 있는 말초혈액 단핵세포의 동결방법과 해동방법을 제공한다. 이에 따라, 환자의 컨디션이 좋은 때에 많은 양의 혈액을 확보하여 분리 후 동결하여 보관해 놓을 수 있어, 환자의 컨디션에 상관없이 규칙적으로 NK 세포의 생산 및 투여를 가능하게 한다.
일 양태에 따른 NK 세포 증식 방법은 감마글로불린(IgG) 및 피브로넥틴의 존재 하에서 NK 세포를 배양할 수 있다. 상기 감마글로불린 및 피브로넥틴 존재 하에서의 배양은 예를 들면, 배양액 중에 감마글로불린 및 피브로넥틴이 포함되어 있거나, 또는 배양면(세포와 접촉할 수 있는 배양용기의 면)에 감마글로불린 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기에서 세포를 배양하는 것일 수 있다. 바람직하게는 감마글로불린 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기 안에서 NK 세포를 배양하는 것일 수 있다. 상기 감마글로불린 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기는 감마글로불린 및 피브로넥틴을 함유하는 용액을 가하여 코팅함으로써 제작될 수 있다. 또한 상기 피브로넥틴 대신에 공지된 접착 단백질을 사용할 수 있으며, 예를 들면 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 일 실시예에서 배양용기(예를 들어 T75 플라스크)에 감마글로불린 및 피브로넥틴이 함유된 용액을 가한 후, 저온(예를 들면 2~4℃)에서 인큐베이션함으로써 감마글로불린 및 피브로넥틴에 의한 배양 용기의 코팅을 수행할 수 있다.
상기 감마글로불린의 농도는 0.1~1 ng/㎖, 1~10 ng/㎖, 10~100 ng/㎖ 또는 1~100 ng/㎖일 수 있다. 감마글로블린은 NK 세포의 FcγRIII를 자극하여 NK 세포를 활성화시킬 수 있다.
상기 피브로넥틴의 농도는 0.1~50 ㎍/㎖, 1~50 ㎍/㎖, 5~50 ㎍/㎖, 10~50 ㎍/㎖일 수 있다. 피브로넥틴은 NK 세포의 이동을 촉진하여 세포간의 상호작용을 원할하게 할 수 있다.
또한 일 양태에 따른 NK 세포 증식 방법은 NK 세포를 제1 인터루킨 (인터루킨-2(IL-2)), 제2 인터루킨(인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨), 항(anti)-NKp46 항체를 포함하는 배양액에서 배양한다. 상기 배양액은 통상의 면역세포 배양용 배지에 항-NKp46 항체, 제2 인터루킨 및 IL-2를 포함하는 것일 수 있다. 면역 세포 배양용 배지로는 예를 들면, ALyS505NK-EX (Cell Science ＆ Technology Inst. Inc., 일본), RPMI1640 (Life technologies, 미국), x-vivo10 (Lonza, 미국), CellGro SCGM (CellGenix, 독일), KBM (Kohjin bio, 일본) 등의 배양액을 사용할 수 있다. 전술한 면역 세포 배양용 배지에 상기한 자연살해 세포의 항-NKp46 항체, 제2 인터루킨, 및 IL-2를 가하여 본 발명의 일 양태에서 사용하기 위한 배양액을 준비할 수 있다. 또한, IL-2를 함유하여 시판되는 면역세포 배양용 배지에 항-NKp46 항체, 및 제2 인터루킨을 가하여 준비할 수도 있다. 또한 상기 배양액은 제2 인터루킨, 항-NKp46 항체 및 IL-2를 포함하는 면역세포 배양용 배지라면 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 배양액에 포함되는 IL-2의 농도는 500-5,000 IU/㎖, 600-4,000 IU/㎖, 700-3,000 IU/㎖, 800-2,000 IU/㎖, 900-1,500 IU/㎖, 900~1,200 IU/㎖ 또는 1,000~1,200 IU/㎖일 수 있다. 상기 IL-2는 NK 세포의 성장을 촉진시킬 수 있다.
상기 배양액에 포함되는 항-NKp46 항체의 농도는 0.1~10 ㎍/㎖, 0.5~10 ㎍/㎖, 1~10 ㎍/㎖, 또는 5~10 ㎍/㎖ 일 수 있다. NKp46은 NK 세포의 활성화 수용체로서, 이에 따라 본 발명의 항-NKp46 항체는 NKp46를 자극하여 NK 세포를 활성화시킬 수 있다.
상기 배양액에 포함되는 제2 인터루킨의 농도는 0.1~100 ng/㎖, 1~100 ng/㎖, 10~100 ng/㎖, 20~100 ng/㎖, 30~~100 ng/㎖, 50~100 ng/㎖, 또는 70~100 ng/㎖ 일 수 있다. 본 발명의 제2 인터루킨은 NK 세포의 증식효율을 높일 수 있을 뿐 아니라, NK 세포의 활성화(activation)를 크게 증가시킬 수 있는 성분이다. 따라서 본 발명은 IL-2 및 항-NKp46 항체 이외에 제2 인터루킨을 이용함으로써, IL-2 및 항-NKp46 항체가 갖는 NK 세포의 증식 및 활성화를 보강 및 시너지 효과를 가지게 되어, 기존의 NK 세포 증식 방법과 비교하여 더욱 우수한 NK 세포의 증식 효과를 가질 수 있다.
결국 본 발명의 NK 세포 증식을 위한 조성물에 포함되는 성분인 IL-2, 제2 인터루킨 및 항-NKp46 항체의 조합은 NK 세포의 증식 및 배양효율을 극대화시킬 수 있으며, 최적화된 최소의 조성으로 인하여 비용면에서도 매우 절감효과가 뛰어나다고 할 것이다.
상기 배양액은 혈장 또는 혈청을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양액에 포함되는 혈장 또는 혈청은 NK 세포 배양을 위해 이용되는 PMBC를 분리시킨 말초혈액으로부터 얻을 수 있다. 상기 혈장의 농도는 전체 배양액에 대해 1~20 v/v%, 1~15 v/v%, 2~15 v/v%, 5~15 v/v%, 또는 5~10 v/v% 일 수 있다.
일 구체예에서 NK 세포가 투여되는 환자의 말초혈액으로부터 PBMC 및 혈장(또는 혈청)을 각각 분리하고, 얻어진 PBMC는 상기 IL-2, 제2 인터루킨, 항-NKp46 항체, 및 상기 말초혈액으로부터 분리된 혈장(또는 혈청)을 포함하는 배지 중에 배양될 수 있다. 또한 상기 배양은 감마글로불린 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기 내에서 배양되는 것이 바람직하다.
상기 말초혈액 단핵세포의 배양은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO2 배양기에서 수행될 수 있으며, 배양액을 2일 혹은 3일에 한 번씩 첨가해 주면서 계속적으로 배양할 수 있다. 또한, 배지에 가해지는 PBMC의 농도는 4 X 105 ~ 5 X 107 cells/㎖의 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다. 배양기간은 예를 들면 7~20일, 8~18일, 10~16일, 10~15일 또는 10~14일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 원하는 NK 세포수의 수득을 위해 상기 배양일 수 범위 내 또는 범위 밖에서 적절히 설정할 수 있다. 배양 용기는, 상업적으로 입수 가능한 디쉬, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 배양백을 포함할 수 있다.
한편, NK 세포를 최대한 증식시키기 위하여 배양은 각 단계별로 배양될 수 있다. 이 경우, 각 배양 단계는 배양액 성분, 배양 용기 및 배양 기간이 동일하거나 다를 수 있으며, 각 단계별 최적의 배양기간을 찾아냄으로써 최종적으로 NK 세포의 증식이 이루어질 수 있다. 또한 본 발명은 배양 기간 동안, 플라스크 내에 2~3일 간격으로 배양조성물(또는 배양액)을 추가하여 배양하는 것을 특징으로 하며, 이로써 NK 세포의 배양이 효과적으로 이루어지도록 도와주는 역할을 한다.
일 구체예에서 본 발명의 NK 세포 증식 방법은 감마글로불린 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기에 말초혈액 단핵세포와 제1 인터루킨, 제2 인터루킨, 항-NKp46 항체 및 혈장을 포함하는 배양액을 넣고 배양하는 제1 배양 단계; 및 상기 제1 배양 단계로부터 얻은 배양물에 제1 인터루킨, 제2 인터루킨, 항-NKp46 항체 및 혈장을 포함하는 배양액을 더 첨가하여 배양하는 제2 배양 단계를 포함할 수 있다. 상기 증식 방법에 있어서, 상기 제1 인터루킨은 인터루킨-2(IL-2)일 수 있다. 또한 상기 제2 인터루킨은 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨일 수 있다. 또한 상기 제1 인터루킨 및 상기 제2 인터루킨은 상기한 바와 같다.
상기 혈장은 말초혈액 단핵세포가 유래된 말초혈액으로부터 수득되는 것일 수 있다. 상기 혈장 대신 혈청을 사용할 수 있다.
상기 제1 배양 단계에서 배양액에 포함되는 IL-2의 농도는 500-5000 IU/㎖, 600-4000 IU/㎖, 700-3000 IU/㎖, 800-2000 IU/㎖, 900-1500 IU/㎖, 900~1,200 IU/㎖ 또는 1,000~1,200 IU/㎖일 수 있다.
상기 제1 배양 단계는 제1 인터루킨(IL-2), 제2 인터루킨 (IL-12, IL-15, 및 IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨), 항-NKp46 항체 및 혈장을 포함하는 배양액 중에서 말초혈액 단핵세포를 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 또는 10일 동안 배양할 수 있으며, 예를 들면 3일, 4일, 5일, 6일, 바람직하게는 5일 동안 배양할 수 있다.
본 발명에 따른 NK 세포 증식 방법은 상기 제1 배양 단계 중, 배양물에 IL-2 및 혈장을 포함하는 배양액을 추가로 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 추가로 첨가되는 IL-2 및 혈장을 포함하는 배양액은 제1 배양 단계의 배양 3일째 및/또는 배양 4일째에 첨가할 수 있다. 상기 추가로 첨가되는 배양액에 포함되는 IL-2의 농도는 제1 배양 단계의 배양액의 IL-2의 농도와 동일할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 첨가되는 배양액의 부피는 배양물의 부피와 동일할 수 있다.
본 발명의 NK 세포 세포 증식 방법은 일 구체예에서 제1 배양 단계로부터 얻은 배양물에 제1 인터루킨(IL-2), 제2 인터루킨 (IL-12, IL-15, 및 IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨), 항-NKp46 항체 및 혈장을 포함하는 배양액을 더 첨가하여 배양하는 제2 배양 단계를 포함한다.
상기 제2 배양 단계는 제1 배양 단계의 배양물을 새로운 용기로 옮겨서 수행될 수 있다. 상기 새로운 용기는 감마글로불린 및 피브로넥틴을 포함하지 않을 수 있다. 상기 제2 배양 단계 배양액의 IL-2의 농도는 제1 배양 단계의 배양액의 IL-2의 농도와 동일할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 제2 배양 단계에서 배양액에 포함되는 IL-2의 농도는 500-5,000 IU/㎖, 600-4,000 IU/㎖, 700-3,000 IU/㎖, 800-2,000 IU/㎖, 900-1,500 IU/㎖, 900~1,200 IU/㎖ 또는 1,000~1,200 IU/㎖일 수 있다. 상기 제2 배양 단계에서 배양물에 첨가되는 제1 인터루킨(IL-2), 제2 인터루킨 (IL-12, IL-15, IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨), 항-NKp46 항체 및 혈장을 포함하는 배양액은 배양물과 동일한 부피일 수 있다.
상기 제2 배양 단계는 배양액 중에서 세포를 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일 동안 배양할 수 있으며, 바람직하게는 1일, 2일, 또는 3일 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 NK 세포 증식 방법은 배양물의 IL-2의 농도를 배양물 첨가 이전 농도 대비 4/5 이하 내지 1/10 이하로 낮춰 준 후 배양하는 제3 배양 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 IL-2 농도는 예를 들면 배양물 첨가 이전 농도 대비 1/100 내지 3/5, 1/100 내지 1/4, 1/100 내지 2/5, 1/100 내지 1/3, 또는 1/100 내지 1/5 일 수 있다. 상기 배양액 중 IL-2의 농도를 낮춰 주는 것은 배양물에 IL-2를 포함하지 않는 배양액을 첨가하는 것에 의해 수행될 수 있다. 상기 제3 배양 단계에서 첨가되는 배양액은 혈장을 포함할 수 있다.
상기 제3 배양단계에서 배양물의 IL-2의 농도는 1500-1300 IU/㎖, 1300-1000 IU/㎖, 1000-600 IU/㎖, 600-500 IU/㎖, 500-400 IU/㎖, 400-300 IU/㎖, 300~200 IU/㎖, 200~100 IU/㎖일 수 있다.
또한 각 배양 단계의 배양액에는 NK 세포를 증폭시키는 효과를 해치지 않는 것을 조건으로, 적절한 단백질, 사이토카인, 항체, 화합물 그 외의 성분이 포함될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 증식된 세포는 CD56, CD16, NKG2D, 퍼포린 및 그란자임B로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 발현하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 발현은 증식 전의 말초혈관혈액세포 또는 세포 집단, 또는 증식 전의 자연살해세포 또는 세포 집단에 비해 상기 인자를 더 많이 발현하는 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 증식된 자연살해세포를 포함하는 말초혈관혈액세포 또는 세포 집단, 또는 증식된 자연살해세포 또는 세포 집단은 전체 세포 중 또는 전체 세포 집단 중 상기 인자를 적어도 70% 이상, 적어도 80%이상, 적어도 90%이상, 적어도 95%이상, 적어도 96%이상, 적어도 97%이상, 적어도 99%이상, 또는 100% 발현하는 것일 수 있다. 상기 "% 발현" 또는 "발현율"은 시료 내 총 세포 수 대비 상기 인자 중 하나 이상을 발현하는 NK 세포의 백분율을 의미하는 것일 수 있다. 상기 세포 또는 세포 집단 중 상기 인자의 발현 또는 발현율은 유세포분석기를 이용하여 검출한 값에 의해 판단할 수 있다.
다른 구체예에 있어서 본 발명은 상기 NK 세포 증식 방법에 의하여 증식된 NK 세포를 덱스트란 및 알부민을 포함하는 용액에 현탁하여 상기 NK 세포를 보관하는 단계를 더 포함하여 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
일 실시예에서 본 발명의 NK 세포 증식 방법에 의해 증식된 NK 세포는 PBMC와 비교하여 높은 정도의 항암물질을 발현하였으며, 우수한 항암활성을 보였다(도 7 내지 도 9 참조).
다른 양태는 상기 증식된 NK 세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 포함되는 NK 세포 및 NK 세포의 증식 방법에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 인간을 포함할 수 있다.
상기 암은 백혈병, 유방암, 난소암, 뇌암, 흑색종암, 위암, 간암, 대장암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은, 상기의 NK 세포 증식 방법에 따라 배양된 NK 세포를 포함하는 세포 집단을 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 상기의 방법에 따라 배양된 세포 집단 외에 배양에 이용된 배양액 또는 배양물을 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 배양물로부터 분리된 세포 집단과 사이토카인 등의 추가 성분을 포함하지 않는 새 배양액이나 생리식염수를 포함할 수 있다. 상기 새 배양액은 NK 세포의 배양에 이용된 배지와 같은 조성을 갖는 배지 또는 다른 조성의 배지가 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, NK 세포의 투여량은 암 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 투여형태, 투여경로 및 기간에 따라 상이하지만, 예를 들면, 1일 1×106 내지 1×109 cells/kg의 용량, 바람직하게는 1×107 내지 1×109 cells/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여될 수도 있다. 또한, 액제, 현탁액, 에멀젼 등의 액상 단위 제제로 제제화될 경우, 역시 상기 세포농도로 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기한 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 증식된 NK 세포를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수, 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함할 수 있다. 기타 통상의 보존제 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 상기 NK 세포 또는 NK 세포를 포함하는 세포집단 이외에 다양한 항종양제나 기타 치료제를 포함할 수 있다.
다른 양태는 상기 증식된 NK 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 개체 및 암에 대해서는 앞서 기재한 바와 같다.
상기 증식된 NK 세포를 개체 투여하는 단계에 있어서, 투여경로는 경구적으로 또는 비경구적(예를 들면, 주사)으로 투여될 수 있으며, 주사는 정맥주사, 피하주사, 근육내주사 또는 복강내주사일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다.
다른 양태는 암 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 상기 증식된 NK 세포의 용도를 제공한다.
다른 양태는 제1 인터루킨(IL-2), 제2 인터루킨 (인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨) 및 항-NKp46 항체를 포함하는 NK 세포 증식용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태는 NK 세포 증식용 조성물의 제조를 위한 제1 인터루킨(IL-2), 제2 인터루킨 (인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨) 및 항-NKp46 항체를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
상기 NK 세포 증식용 조성물은 감마글로불린, 피브로넥틴을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, 제1 인터루킨 및 제2 인터루킨은 각각 상기한 바와 같다.
상기 증식용 조성물 중 IL-2의 농도는 500-5000 IU/㎖, 600-4000 IU/㎖, 700-3000 IU/㎖, 800-2000 IU/㎖, 900-1500 IU/㎖, 900~1,200 IU/㎖ 또는 1,000~1,200 IU/㎖일 수 있다.
상기 증식용 조성물 중 제2 인터루킨의 농도는 0.1~100 ng/㎖, 1~100 ng/㎖, 10~100 ng/㎖, 20~100 ng/㎖, 30~~100 ng/㎖, 50~100 ng/㎖, 또는 70~100 ng/㎖ 일 수 있다.
상기 증식용 조성물 중 항-NKp46 항체의 농도는 0.1~10 ㎍/㎖, 0.5~10 ㎍/㎖, 1~10 ㎍/㎖, 또는 5~10 ㎍/㎖ 일 수 있다.
상기 NK 세포 증식용 조성물은 말초혈액 단핵세포에서 NK 세포를 증식 또는 분화시키기 위한 것일 수 있다.
상기 NK 세포 증식용 조성물은 혈장 또는 혈청을 더 포함할 수 있다. 또한 조성물에 추가되는 혈장 또는 혈청은 NK 세포가 분리된 혈액에서 얻은 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 증식용 조성물에 포함되는 혈장은 말초혈액 단핵세포가 분리된 말초혈액으로부터 수득되는 것일 수 있다.
상기 증식용 조성물은 감마글로불린, 피브로넥틴, 제1 인터루킨(IL-2), 제2 인터루킨 (IL-12, IL-15, IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인터루킨)및 항-NKp46 항체 성분 이외에, PBMC 배양 및 NK 세포 증식을 위한 필수 성분 또는 기타 담체, 또는 보조제를 포함할 수 있다.
일 양태에 따른 자연살해세포 증식 방법 또는 자연살해세포 증식용 조성물은 자연살해세포의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있으며, 세포독성 활성이 증가된 자연살해세포를 안정적으로 제공할 수 있다. 또한 이에 따라 제조된 자연살해세포는 항암 치료 등 질병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 증식 방법에 의한 총 세포수(A)와 NK 세포수(B)의 증식배수 결과이다.
도 2는 다양한 구체예에 따른 증식 방법에 의해 얻어진 총 세포수(A)와 NK 세포 비율(B)의 결과이다.
도 3은 IL-2 농도에 따른 NK 세포 증식 효과를 나타내는 결과이다.
도 4는 IL-12 및 IL-18 농도에 따른 NK 활성을 나타내는 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 증식 방법에 의한 NK 세포의 유세포 분석 결과이다.
도 6은 일 구체예에 따라 얻어진 NK 세포의 활성화수용체를 유세포 분석기를 이용하여 보여주는 결과이다.
도 7은 일 구체예에 따라 얻어진 NK 세포에서 항암 물질의 발현을 확인하기 위한 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 다양한 구체예에 따라 얻어진 NK 세포의 백혈병 세포주인 K562 세포에 대한 암세포 살상도 (cell lysis) %를 유세포 분석 방법으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 9는 일 구체예에 따라 얻어진 NK 세포의 암세포 살상도 (cell lysis) %를 유세포 분석 방법으로 평가한 결과를 보여준다. K562 (만성백혈병), OVCAR3 (난소암), Hep3B (간암), HepG2 (간암), A704 (신장암), DU145 (전립선암)에 대한 암세포 살상도에 대한 것이다.
도 10은 Donor 1의 배양전 PBMC 특성을 보여준다. A. NK 세포 (Q9, CD3-CD56+)의 비율, B. CD16이 발현하는 NK 세포 (Q2, CD16+CD56+), C. B세포 (Q5, CD3-CD19+), D. K562세포에서 cytotoxicity (7AAD+, E:T=10:1)
도 11은 Donor1의 동결 및 해동의 과정을 거친 PBMC로 14일 배양한 세포의 특성을 보여준다. A. NK 세포 (Q5, CD3-CD56+)의 비율, B. CD16이 발현하는 NK 세포 (Q10, CD16+CD56+), C. B세포 (Q1, CD3-CD19+), D. K562세포에서 cytotoxicity (7AAD+, E:T=10:1).
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 말초혈액 단핵세포 준비
1. 혈액으로부터 말초혈액 단핵세포 ( PMBC ) 및 자가 혈장 분리
혈액은 정상인의 정맥으로부터 채혈하여 준비하였다. 이 때 채혈용기는 헤파린이 포함된 채혈 튜브를 사용하였다. 환자로부터 채취한 혈액을 피콜(Ficoll)(#17-1440-02, GE Healthcare 또는 동등이상)이 담긴 튜브(#352070, BD 또는 동등이상) 2개에 각각 30㎖씩 조심스럽게 옮겨 담았다. 혈액이 담긴 튜브를 2,500rpm로 10분간 break off 상태에서 원심 분리한 후, 상층의 혈장 부분을 새로운 튜브에 옮겨 담았다.
옮겨 담은 혈장을 히트 블록(Heat block)에서 30분 동안 불활성화시킨 후, 4,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 튜브에서 상층액을 새로운 튜브로 옮겨, 혈장이라 표기한 후 2~8℃에 보관하였다.
상기 혈액과 피콜을 넣고 원심분리한 튜브에서 혈장을 채취하고 남은 하층에 있는 미황색 층을 새로운 튜브에 적혈구 층과 혼입되지 않도록 주의하여 옮겨 담은 후, Ca/Mg 유리(free) DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) (#14190, Gibco)를 넣어 주었다. 그 다음 1,500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전 세포를 RBC 용해 버퍼(Red Blood Cell Lysis buffer)(#158904, Qiagen) 5㎖로 부유시켰다. 이 후, 세포 현탁액을 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였고, 상층액이 제거된 튜브에 Ca/Mg 유리 DPBS를 넣어 다시 1,500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거되고 남은 침전 세포를 Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 배지 1㎖로 부유시켰다.
상기 Alys505NK-EX로 부유시킨 세포 현탁액에서 소량을 취하여 Ca/Mg 유리 DPBS로 상기 양의 100배로 희석한 다음, 희석액 소량을 취하여 동일 볼륨의 트리판 블루와 섞은 후 혈구계산판(hemocytometer)에 올려놓고 세포수 및 생존율을 측정하였다.
2. PBMC의 동결
상기 실시예 1.1에서 얻어지는 모든 세포 현탁액을 1,500rpm, 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 2 내지 8℃에서 보관해 둔 Cryostor CS10 또는 ALyS505NK-EX+Albumin+DMSO 혼합액으로 세포를 부유하여, 세포수가 1~100 × 106 cells/㎖이 되도록 만들었다. 부유한 세포를 2㎖ 동결 바이얼(cryogenic vial)에 1㎖ 씩 분주 한 다음 CRF(controlled rate freezers)를 사용하여 0℃에서 10~15분, -12℃에서 5~10분, 및 -42℃에서 0.5~1분 동안의 조건으로 제1단계 동결시키고, 제1 동결단계 후 -25℃에서 1~3분, 및 -15℃에서 1~3분의 조건으로 동결시키며, 제2 동결단계 후 -42℃에서 20~40분, 및 -120℃에서 20~50분의 조건으로 동결시키거나, 또는 4~-40℃ 범위에서 3℃/m으로 제1 단계 동결하고, 제1 동결단계 후 -40~-90℃ 범위에서 5℃/m의 조건으로 제2 단계 동결시키며, 제2 동결단계 후 -90~-120℃ 범위에서 5℃/m의 조건으로 동결시켰다. 동결한 세포를 LN2 탱크로 옮겨 보관하였다 (-130℃ 이하).
3. 동결된 PBMC의 해동
히트 블록을 37℃가 되도록 셋팅한 다음, T 플라스크에 10% 혈장(plasma)이 첨가된 배양액을 넣었다. 세포 농도에 따라 배양액 볼륨은 예를 들어 4㎖, 6㎖, 8㎖, 또는 10㎖ 등으로 다양하게 조절해줄 수 있다. 상기 실시예 2.2에서 동결해 놓았던 동결 바이얼을 히트 블록에 넣어 동결된 PBMC를 녹였다. 동결된 PBMC가 반 정도 녹았을 때, 배양액이 담긴 T 플라스크로 옮겼다. 이어서, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣고 하루 동안 배양하였다. 배양된 PBMC를 튜브에 모은 후 Ca/Mg 유리(free) DPBS를 첨가하고 1,500rpm, 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 원심분리에 의해 분리된 세포를 소량의 배양액으로 부유시킨 후 세포수를 측정하였다. 동결보관된 세포의 해동 후 생존율은 표 1에 기재한다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 동결보관된 후 해동된 PMBC는 93% 이상이 생존하였는바, 높은 생존율이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
해동 후 PBMC 생존율
Origin 생존율 ( % )
Donor 1 98.07
Donor 2 93
Donor 3 97.4
실시예 2. NK 세포의 배양
2.1. 피브로넥틴 및 감마글로불린으로 코팅된 배양 플라스크 준비
2.1.1. 피브로넥틴 및 감마글로불린 코팅 배양 플라스크 (1)
15㎖ 튜브에 0.1㎖ 피브로넥틴(#FC-010, Millipore) 및 0.121㎖ 감마글로불린(#020A1004, 녹십자)을 넣은 다음, Ca/Mg 유리 DPBS을 9.779㎖을 첨가하였다. 제조된 코팅액을 피펫을 이용하여 T75 플라스크(#156499, Nunc)에 넣어 주고 16시간 이상 2~8℃에서 반응시켰다. 세포 배양 전 잔여 코팅액을 Ca/Mg 유리 DPBS로 세척한 후 제거하였다.
2.1.2. 피브로넥틴 및 감마글로불린 코팅 배양 플라스크 (2)
위 실시예 2.1.1에서 피브로넥틴의 양 10㎕, 감마글로불린 양 1.21㎖ 만을 달리하여 실시예 2.1.1과 동일하게 피브로넥틴 및 감마글로불린으로 코팅된 배양 플라스크를 준비하였다.
2.1.3. 피브로넥틴 코팅 배양 플라스크
15㎖ 튜브에 0.2㎖ 피브로넥틴(#FC-010, Millipore) 을 넣고, Ca/Mg 유리 DPBS로 10ml이 될 때까지 가하였다. 이 후 상기 실시예 2.1.1.과 동일한 과정에 의해 피브로넥틴으로만 코팅된 배양 플라스크를 준비하였다.
2.2. NK 세포의 1차 배양
2.2.1. NK 세포의 1차 배양 (1)
실시예 1에서 준비된 세포 현탁액을 취하여 상기 실시예 2.1에서 제조된 코팅 플라스크에 넣고, 자가혈장 1.5㎖과 항-NKp46(#MAB1850, R&D)용액 0.03㎖, IL-18 (#B003-2, R&D) 0.075㎖, Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 13.4625㎖을 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 2~3일간 배양하였다. 이 후 플라스크에 자가혈장 1.5㎖ 및 Alys505NK-EX 13.5㎖을 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 1~2일간 배양하였다.
2.2.2. NK 세포의 1차 배양 (2)
실시예 2.2.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(상동)용액 3㎕, IL-18 (상동)을 37.5㎕, Alys505NK-EX을 2회 첨가하고 총 35.95㎖을 사용한 것만 달리하여 실시하였다.
2.2.3. NK 세포의 1차 배양 (3)
실시예 2.2.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(상동)용액 15㎕, IL-12 (#554613, BD)을 7.5㎕, Alys505NK-EX을 2회 첨가하고 총 26.98㎖을 사용한 것만 달리하여 실시하였다.
2.2.4. NK 세포의 1차 배양 (4)
실시예 2.2.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(상동)용액 15㎕, IL-12 (상동)를 7.5㎕, IL-18 (상동)을 총 37.5㎕, Alys505NK-EX을 2회 첨가하고 총 26.94㎖을 사용한 것만 달리하여 실시하였다.
2.2.5. NK 세포의 1차 배양 (5)
실시예 2.2.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(상동)용액 0.03㎖, IL-12 (상동)을 총 7.5㎖, IL-15 (#247-IL-0025, R&D)를 총 12.5㎕, IL-18을 총 37.5㎕, Alys505NK-EX을 2회 첨가하고 총 26.913㎖을 사용한 것만 달리하여 실시하였다.
2.3. NK 세포의 2차 배양
2.3.1. NK 세포의 2차 배양 (1)
실시예 2.2.1의 1차 배양 후 배양기에서 세포가 배양되고 있는 T75 플라스크를 꺼내서 세포를 모은 후 T175 플라스크(#159910, Nunc)에 옮겼다. 자가혈장 3㎖ 및 Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 27㎖을 T175 플라스크에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 1~2일간 배양하였다. 이 후, 자가혈장 6㎖과 항-NKp46 용액 0.12㎖, IL-18 0.03㎖, Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 53.85㎖을 첨가한 다음 다시 CO2 인큐베이터에서 1~2일간 배양하였다.
2.3.2. NK 세포의 2차 배양 (2)
실시예 2.3.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(#MAB1850, R&D)용액 0.06㎖, IL-18 (#B003-2, R&D) 0.06㎖, Alys505NK-EX 53.88㎖을 사용한 것만 달리하여 실시예 2.2.2의 배양물의 2차 배양을 실시하였다.
2.3.3. NK 세포의 2차 배양 (3)
실시예 2.3.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(#MAB1850, R&D)용액 0.12㎖, IL-12 (#554613, BD) 0.03㎖, Alys505NK-EX 53.85㎖을 사용한 것만 달리하여 실시예 2.2.3의 배양물의 2차 배양을 실시하였다.
2.3.4. NK 세포의 2차 배양 (4)
실시예 2.3.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(#MAB1850, R&D)용액 0.06 ㎖, IL-12 (상동) 0.03㎖, IL-18 (상동) 0.02㎖, Alys505NK-EX 44.89㎖을 사용한 것만 달리하여 실시예 2.2.4의 배양물의 2차 배양을 실시하였다.
2.3.5. NK 세포의 2차 배양 (5)
실시예 2.3.1과 모든 절차는 동일하되, 항-NKp46(#MAB1850, R&D)용액 0.06㎖, IL-12 (상동) 0.03㎖, IL-15 (상동) 0.06㎖, IL-18 (상동) 0.02㎖, Alys505NK-EX 62.83㎖을 사용한 것만 달리하여 실시예 2.2.5의 배양물의 2차 배양을 실시하였다.
2.4. NK 세포의 3차 배양
상기 실시예 2.3에서 배양된 T175 플라스크의 세포 및, 자가 혈장을 300 IU/㎖ IL-2을 함유하는 배양액에 넣고, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 2~3일 후 새로운 동일 볼륨의 배양액 (300 IU/㎖의 IL-2를 함유하는 배양액)을 세포가 배양되고 있는 세포 현탁액과 섞어준 후 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
상기 배양 (1차배양, 2차배양 및 3차배양 모두)에서, IL-2가 첨가된 배양액 대신, IL-2가 첨가되지 않은 면역 세포 배양액에 IL-2를 소정의 양으로 각각 첨가하여 사용할 수도 있다.
실시예 3. 배양된 NK 세포의 증식 및 활성화의 확인
3.1. 배양된 세포의 총 세포수와 NK 세포 증식배수 확인
상기 실시예 2.4에서 배양된 세포를 모두 수거한 후, 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 인산완충식염수에 부유시켰다. 세포 부유액에서 10㎕를 취하여 인산완충식염수로 희석한 다음, 희석액 10㎕를 취하여 트리판 블루 10㎕와 섞은 후 혈구계산판(hemocytometer)에 올려놓고 세포수 및 생존율을 측정하였다. 세포수는 (생 세포수 + 죽은 세포수)×1/4 ×2 ×희석배수×총 부피×104 의 수식으로 구했고, 세포 생존율은 생 세포수÷(생 세포수 + 죽은 세포수)×100의 수식으로 구했다.
본 발명에 사용된 실험 조건 및 결과를 요약하면 아래 표 2, 도 2 및 도 8과 같다.
No. Flask 코팅 mAb Cytokine 세포수 (x10 7 cells) NK cells (%) K562 lysis (%)
Fibronectin 감마글로불린 NKp46 IL-2 IL-12 IL-15 IL-18 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
1 　 　 o o 　 　 　 68 9.8 21.3 5.1 0 0
2 o 　 o o 　 　 　 96 11.12 25.6 3.4 0 0
3 o o o o 　 　 　 318 46.47 41.8 2.46 78 1.47
4 　 　 　 o o 　 　 226 45.22 54.3 6.17 36 2.42
5 　 　 　 o o 　 o 264 34.13 66.1 4.46 41 1.46
6 　 　 　 o o o o 248 59.14 65.6 3.47 39 3.55
7 　 　 　 o 　 　 o 496 67.13 74.2 4.47 43 2.42
8 　 　 o o 　 　 o 494 53.2 77.1 4.4 56 3.4
9 o o o o o 　 　 226 25.13 57.7 4.46 81.8 3.47
10 o o o o o 　 o 260 32.14 68.3 2.17 82.9 1.17
11 o o o o o o o 250 44.14 68.9 3.14 76.9 2.17
12 o o o o 　 　 o 504 45.14 78.1 3.47 82.7 1.46
종합하면, IL-2와 IL-18의 조합이 세포수 및 NK 비율을 증가시키는 데 효과적인 것으로 나타났다. IL-12, IL-15, 또는 IL-12 및 IL-15의 혼합물, 또는 IL-18이 NK 비율을 높이는 데 효과적인 것으로 나타났다.
3.2. 제1 인터루킨의 농도에 따른 NK 세포 증식 효과 확인
실시예 1에서 준비된 세포 현탁액을 취하여 상기 실시예 2.1에서 제조된 코팅 플라스크에 넣고, 자가혈장 1.5㎖과 항-NKp46(#MAB1850, R&D)용액 0.03㎖, IL-18 (#B003-2, R&D) 0.075㎖, IL-2가 첨가되지 않은 Alys505NK-EX (#01400P10, CSTI) 13.4625㎖을 첨가하였고, IL-2는 0 내지 10,000 IU/㎖ 농도로 첨가(도 3 참조) 하여 CO2 인큐베이터에서 총 14일간 배양하였다. 14일 동안 배양한 세포를 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 인산완충식염수에 부유시켰다. 부유한 세포 중 10㎕의 검체를 채취하여 인산완충식염수로 희석한 다음 희석액을 10㎕를 취하여 트리판 블루 10㎕와 섞은 후 혈구계산판(hemocytometer)에 올려놓고 세포수를 측정하였다. 세포수 측정 방법은 실시예 3.1과 동일하다. NK세포의 수는 유세포 분석을 통해 얻어진 NK세포 비율을 통해 계산하였다. 100 IU/㎖의 IL-2 농도를 1로 놓고, 나머지 IL-2 농도 처리에 따른 NK세포의 증식 배수를 계산하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, IL-2의 농도가 500 내지 5000 IU/㎖ 범위일 때, 100 IU/㎖의 IL-2 농도보다 6배 이상의 NK 세포의 증식 효과를 나타냈다.
3.3. 제2 인터루킨의 농도에 따른 NK 세포 활성 확인
1.7㎖ 튜브에 1㎕ 피브로넥틴(#FC-010, Millipore) 및 1.21㎕ 감마글로불린(#020A1004, 녹십자)을 넣은 다음, Ca/Mg 유리 DPBS을 97.79㎕을 첨가하였다. 제조된 코팅액을 피펫을 이용하여 96 웰 플레이트 (#167008, Nunc)에 넣어 주고 16시간 이상 2 내지 8℃에서 반응시켰다. 세포 배양 전 잔여 코팅액을 Ca/Mg 유리 DPBS로 세척한 후 제거하였다. 제조된 96 웰 플레이트에 실시예 1에서 준비된 세포 현탁액을 취하여 넣어주고, 자가혈장 10㎕와 항-NKp46(#MAB1850, R&D)용액 0.2㎕, IL-2가 1000 IU/㎖이 첨가된 Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 89.8㎕를 첨가하였고, IL-12는 0 내지 10 ng/㎖ 농도로 첨가 하였으며(도 4A 참조), IL-18은 0 내지 300ng/㎖ 농도로 첨가하여(도 4B 참조), CO2 인큐베이터에서 총 48시간 배양하였다. 48시간 후 상등액을 새로운 튜브로 옮겨 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액만 새로운 튜브로 옮겼다. NK세포의 활성은 IFN-gamma ELISA 키트 (#DIF50, R&D)를 이용하여 IFN-gamma 분비량으로 확인하였다.
그 결과 도 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, IL-12는 0.1 내지 10ng/㎖농도 범위에서 높은 IFN-gamma가 분비되었고 IL-18은 1 내지 100 ng/㎖농도 범위에서 높은 IFN-gamma의 분비량이 측정되었다.
3.4. 배양된 NK 세포의 활성 수용체 발현 확인
유세포 분석(Flow cytometry)을 이용하여 실시예 2에서 배양되어 수거된 NK 세포의 표면 항원을 분석하였다. 구체적으로 수거된 세포를 Ca/Mg 유리 DPBS 에 부유시키고, 1500rpm으로 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 얻었다. 얻어진 세포 펠렛에 형광물질을 포함하는 항체(CD3-FITC, CD56-APC, CD16-PE)를 각각 가한 후, 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액을 가하여 8,000 rpm으로 1분 동안 1회 원심분리하고, 유세포 분석기(FACSCalibur, BD)로 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따라 증식된 세포는 증식 전의 PBMCs에 비해 CD56, 및 CD16을 더 많이 발현하고, CD3을 더 적게 발현하는 것을 알 수 있다.
또한 NK 세포의 활성 수용체의 발현 여부를 유세포분석기를 이용하여 확인하였다. 구체적으로 수거된 세포를 Ca/Mg 유리 DPBS 에 부유시키고, 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 얻었다. 얻어진 세포 펠렛에 형광물질을 포함하는 항체(KIRDL1-PE, NKG2A-PE, NKG2D-PE, NKp30-PE, NKp44-PE, NKp46-PE)를 각각 가한 후, 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액을 가하여 8000 rpm으로 1분 동안 1회 원심분리하고, 유세포 분석기(Guava 8HT, merk)로 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따라 증식된 세포는 증식 전의 PBMCs에 비해 NKG2D, NKp30, NKp44, 또는 NKp46를 더 많이 발현하는 것을 확인할 수 있다.
3.5. 배양된 NK 세포의 항암 능력 분석
1) 항암물질 발현 정도 분석
실시예 2에서 제조된 NK 세포의 항암물질 발현 정도를 확인하기 위해 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석하였다. 구체적으로 수거된 세포를 Ca/Mg 유리 DPBS 에 부유시키고, 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 얻었다. 얻어진 세포 펠렛에 Fixation/Permeabilization solution (#51-2090KZ, BD)을 처리한 다음 형광물질을 포함하는 항체 (Perforin-PE, GranzymeB-PE, TRAIL-PE)를 각각 가한 후 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. Perm/Wash buffer(#51-2091KZ,BD)를 가하여 8000 rpm으로 1분 동안 2회 원심분리하고, 유세포 분석기(FACSCalibur, BD)로 분석하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 증식된 세포는 증식 전의 PBMCs에 비해 퍼포린(perforin), 그란자임 B(granzymeB), 또는 TRAIL을 더 많이 발현하는 것을 확인할 수 있다.
2) 암세포 살상 능력 확인
대상 암 세포로 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 세포주인 K562 및 다양한 고형암 세포주(Hep3B, OVCAR3, HepG2, A704, DU145) 를 수거하여 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 Ca/Mg 유리 DPBS로 세척하였다. 세척 된 세포 펠렛에 배양액을 첨가하여 5×105 cells/㎖의 농도로 세포를 준비하였다. 준비된 세포에 CFSE (#c34554, Life technologies)을 처리하여 CO2 인큐베이터에서 10분간 인큐베이션하였다. Ca/Mg 유리 DPBS로 두 번 세척한 다음 제조된 NK세포와 함께 처리하여 CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나기 10분 전 7AAD를 처리하고 인큐베이션이 끝난 후에 세포를 시험관으로 수거하여 유세포 분석기(FACSCalibur, BD)로 암세포 살상 능력을 분석하였다. 암세포 살상능 수치는 아래의 공식으로 계산하였다.
Cytotixicity (%) = (sample처리군-자연유리)/(100-자연유리)×100
K562 lysis 결과는 도 9 및 표 2와 같으며, 다양한 고형암 세포주에 대한 lysis 결과는 도 9와 같다.
결과적으로, 피브로넥틴, 감마글로불린으로 코팅된 플라스크에 항-NKp46 조합 사용이, 높은 K562 제거효능을 보였으며, OVCAR3 (난소암), Hep3B (간암), HepG2 (간암), A704 (신장암), DU145 (전립선암) 등의 다양한 고형암에서도 E : T 비율(Effector cell 수 : Target cell 수)에 따라 제거효능이 증가하였다. 상기 Effector cell은 NK 세포를 의미하며, 상기 Target cell은 암세포를 의미한다.
3.6. 동결 PBMC를 이용한 NK 세포의 배양 결과
Donor 3명의 혈액에서 분리된 PBMC와 동결 PBMC로 14일 동안 본 발명의 증식방법으로 배양한 세포의 특성을 유세포분석기(flowcytometry)를 이용하여 CD3, CD16, CD19, CD56 발현 유무를 확인하고 K562세포에 대한 세포 독성도(cytotoxicity)를 확인하였다. 그 결과, Donor 1의 NK 세포수는 968배 증가하였으며 NK 세포 (CD3-CD56+)의 비율이 10.5%에서 78.8%로 증가하였다 (표 3, 도 10 및 도 11).
배양 전 PBMC및 동결PBMC로 14일 배양한 세포의 세포수 및 생존율
No. Origin 분석세포 총 세포수 NK 세포수 생존율( % )
1 Donor 1 PBMC 3×107 3.2×106 100
14 day 3.9×109 3.1×109 97.4
2 Donor 2 PBMC 3.33×107 5.1×106 93.69
14 day 5.4×109 4.2×109 96.73
3 Donor 3 PBMC 3×107 8.5×106 98.1
14 day 3.1×109 2.66×109 94.6
또한 Donor2의 NK 세포수는 823배 증가하였고 (표 3), NK 세포 (CD3-CD56+)의 비율이 15.2%에서 77.2%로 증가하였다 (표4).
배양 전 PBMC 및 동결 PBMC로 14일 배양한 세포의 특성분석
No. Origin 분석세포 표현형 분석 ( % ) cytotoxicity ( % )
CD3-CD56+ CD16+CD56+ CD3-CD19+
1 Donor 1 PBMC 10.5 11.2 8.08 4.03
14 day 78.8 86.1 0.34 82.36
2 Donor 2 PBMC 15.2 13.2 8.72 5.89
14 day 77.2 84.7 0.14 79.93
3 Donor 3 PBMC 28.4 5.88 16.6 6.8
14 day 85.8 90 0.07 90.6
이러한 결과는 본 발명의 PBMC동결방법과 해동방법, 그리고 NK 세포 배양방법에 의하여 동결 PBMC가 NK 세포로 배양될 수 있음을 보여주는 것이다.
이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

  1. 자연살해세포를
    제1 인터루킨으로서 IL-2;
    제2 인터루킨으로서, IL-12, IL-15 및 IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상; 및
    항-NKp46 항체를 포함하는 배양액에서 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 증식 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 감마글로불린 및 피브로넥틴의 존재 하에서 배양하는 것인 자연살해세포의 증식 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포 증식은 말초혈액 단핵세포를 배양하는 것인 자연살해세포의 증식 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포는 동결 보존된 후 해동된 상태인 것인 자연살해세포의 증식 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 동결은 4 내지 -42 ℃의 범위의 제1 동결단계, -42 내지 -15 ℃ 범위의 제2 동결단계 및 -15 내지 -120 ℃ 범위의 제3 동결단계로 이루어진 동결방법에 의해 수행되는 것인 자연살해세포의 증식 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포 증식 방법은
    감마글로불린 및 피브로넥틴이 코팅된 배양용기에 말초혈액단핵세포와 배양액을 넣고 배양하는 제1 배양단계; 및
    상기 제1 배양 단계에서 배양된 배양물에 배양액을 더 첨가하여 배양하는 제2 배양단계를 포함하는 것인 자연살해세포의 증식 방법으로서,
    상기 배양액은 제1 인터루킨으로서 IL-2; 제2 인터루킨으로서, IL-12, IL-15 및 IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상; 항-NKp46 항체; 및 혈장을 포함하는 것인 자연살해세포의 증식 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 혈장은 말초혈액 단핵세포가 유래된 말초혈액으로부터 분리된 것인 자연살해세포의 증식 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 제1 및 제2 배양단계의 배양액 중 IL-2의 농도는 500 내지 5000 IU/㎖인 것인 자연살해세포의 증식 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 제2 배양 단계 이후 배양물 중 IL-2의 농도를 4/5 내지 1/10 이하로 낮춰 배양하는 제3 배양 단계를 더 포함하는 것인 자연살해세포 증식 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 제3 배양 단계의 배양액 중 IL-2의 농도는 100 내지 1500 IU/㎖인 것인 자연살해세포 증식 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 방법에 따라 증식된 자연살해세포는 CD56, CD16, NKG2D, 퍼포린(perforin) 및 그란자임B(granzymeB)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 전체 세포 중 적어도 70% 이상 발현하는 것인 자연살해세포 증식 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따라 증식된 자연살해세포를 덱스트란 및 알부민을 포함하는 용액에 현탁하여 보관하는 단계를 포함하는 자연살해세포 제조 방법.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법에 따라 증식된 자연살해세포를 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  14. 제1 인터루킨으로서, IL-2;
    제2 인터루킨으로서, IL-12, IL-15 및 IL-18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상; 및
    항-NKp46 항체를 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 조성물은 감마글로불린 및 피브로넥틴을 더 포함하는 것인 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 조성물은 말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포를 증식시키기 위한 것인 자연살해세포 증식용 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포는 동결 보존된 후 해동된 상태인 것인 자연살해세포 증식용 조성물.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 조성물은 말초혈액 단핵세포가 유래된 말초혈액에서 분리된 혈장을 추가로 포함하는 것인 자연살해세포 증식용 조성물.
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