CN115039764B - 一种自然杀伤细胞的冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存方法，属于细胞冻存技术领域。本发明通过合理设置自然杀伤细胞的冻存程序，可以最大限度的降低冻存降温过程中对自然杀伤细胞的影响，降低了细胞样品温度下降过程中相变时温度的的剧烈跳动，尽量减少细胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤，能够使自然杀伤细胞的长期低温保存。

Description

一种自然杀伤细胞的冻存方法

技术领域

本发明属细胞冻存技术领域，具体涉及一种自然杀伤细胞的冻存方法。

背景技术

细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使细胞代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，所以可以长期保存。

在细胞冻存时“降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度”是冻存成功与否的重要关键。降温速度慢：冰晶由细胞外开始形成，造成胞外渗透压变小，细胞内水份移动至细胞外造成细胞脱水。降温速度快：水分流动时间短，细胞内外渗透压改变程度小，但大量水分留在细胞内造成大量胞内冰晶形成，使得细胞器损坏。这些都可能引起细胞损伤、凋亡或坏死，也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因变异等现象。由此可知，最适合的冻存条件为“在增加细胞渗透压稳定性的溶液中，以慢到能减少胞内冰晶形成，但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞”。

慢冻快融是大家在细胞冻存复苏时一直遵守的原则。慢冻可使细胞逐步脱水，且细胞内不会产生大量冰晶；慢冻有两种办法：一是手动降温：将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。二是使用程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热)，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜)，然后移至液氮中保存。程序降温精准度更高，优于手动降温。

那对于细胞来说，慢冻的降温速率和快融的加热速率有没有具体参考标准呢？对于绝大多数哺乳动物细胞，1℃/min的降温速率是较合适的冻存速度，适用于细胞疗法中的T/NK等免疫细胞及MSCs等干细胞的冻存，通过程序降温设备即可实现标准可控的冻存。市面上的程序降温设备主要利用液氮的热对流来进行降温，通过控制液氮流入量实现对降温速率的控制，降温速率可快达99.9℃/min。

Jasmin Baboo等人发现当冻存时的降温速率在1℃/min甚至更低时，复苏时的加热速率(1.6～113℃/min范围内)对细胞活性并无明显影响；但当冻存时的降温速率在10℃/min时，复苏时较低的加热速率(1.6℃/min和6.2℃/min)会导致复苏后活细胞数量明显下降，但较高的加热速率(113℃/min和45℃/min)对于复苏后活细胞数量则没有明显影响。

通过冷冻显微镜研究发现，细胞活性呈现的这种规律是与冻存及复苏时冰晶结构变化是密切相关的，而冰晶形态又与降温速度密切相关。

慢速降温时(1℃/min甚至更低)冰晶的结构较大且均衡，无论复苏的速率多少，冰晶结构都没有明显变化；但快速降温时(10℃/min)，冰结构表现出高度非晶形，表现为更细微的树突状结构，在复苏过程更容易形成再结晶，尤其接下来以较低加热速率(6.2℃/min或更低)复苏时，就很容易出现再结晶的现象，从而对细胞造成损害，影响细胞生物学活性；但用较高速率复苏快速降温(10℃/min)的细胞样品，冰晶没有足够时间形成再结晶，这是快融可以避免再结晶对细胞造成损害的原因。

因此，对于细胞治疗产品，冻存工艺环节精确的控速降温对后续细胞药物的生物学活性是至关重要的。

目前，尚没有针对免疫细胞尤其是自然杀伤细胞的降温冻存程序。如果只是单纯的使用传统的1℃/min，达不到理想的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种自然杀伤细胞的冻存方法，本发明的冻存方法适合自然杀伤细胞的长期低温保存。

本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存方法，包括以下步骤：

将待冻存的自然杀伤细胞和冻存液混合，得到混合液，将所述混合液置于液氮冻存袋中进行冻存；

所述冻存的程序为：

由初始温度降温至4℃，降温速率为2℃/min；

由4℃降温至-12℃，降温速率为1℃/min；

由-12℃降温至-60℃，降温速率为24℃/min；

-60℃保持1min；

由-60℃升温至-25℃，升温速率为15℃/min；

由-25℃降温至-40℃，降温速率为1℃/min；

由-40℃降温至-150℃，降温速率为10℃/min；

-150℃保持10min。

优选的，所述初始温度为15～25℃。

优选的，所述初始温度为20℃。

优选的，所述升温或降温匀速进行。

优选的，所述冻存液包括以下体积百分含量的原料：DMSO 8～12％，右旋糖酐0.2～3％，人血白蛋白3～15％。

优选的，所述冻存液的溶剂为质量体积浓度为0.9％的氯化钠注射液。

优选的，每mL所述冻存液中包含2×10⁷～8×10⁷个自然杀伤细胞。

优选的，所述-150℃保持10min之后，液氮保存。

本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存方法，包括以下步骤：将待冻存的自然杀伤细胞和冻存液混合，得到混合液，将所述混合液置于液氮冻存袋中进行冻存；所述冻存的程序为：由初始温度降温至4℃，降温速率为2℃/min；由4℃降温至-12℃，降温速率为1℃/min；由-12℃降温至-60℃，降温速率为24℃/min；-60℃保持1min；由-60℃升温至-25℃，升温速率为15℃/min；由-25℃降温至-40℃，降温速率为1℃/min；由-40℃降温至-150℃，降温速率为10℃/min；-150℃保持10min。在细胞制剂由液态转为固态时(相变过程)，释放能量，温度会突然升高。温度跳跃幅度较大，冰晶大量形成，会对细胞造成损伤。本发明通过合理设置自然杀伤细胞的冻存程序，采用慢速降温，减少温度的剧烈波动，可以最大限度的降低冻存降温过程中对自然杀伤细胞的影响，降低了细胞样品温度下降过程中相变时温度的的剧烈跳动，尽量减少细胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤，能够使自然杀伤细胞的长期低温保存。

附图说明

图1为袋装细胞程序1降温曲线图(红色的为设置的降温曲线，蓝色的为样品降温曲线)；

图2为袋装细胞程序2降温曲线图(红色的为设置的降温曲线，蓝色的为样品降温曲线)；

图3为不同冻存程序冻存前后细胞活力的变化；

图4为不同冻存程序冻存前后细胞表型变化；

图5为不同冻存程序冻存前后对肺癌H358细胞的杀伤变化，效靶比为10：1。

具体实施方式

本发明提供了一种自然杀伤细胞的冻存方法，包括以下步骤：

将待冻存的自然杀伤细胞和冻存液混合，得到混合液，将所述混合液置于液氮冻存袋中进行冻存；

所述冻存的程序为：

由初始温度降温至4℃，降温速率为2℃/min；

由4℃降温至-12℃，降温速率为1℃/min；

由-12℃降温至-60℃，降温速率为24℃/min；

-60℃保持1min；

由-60℃升温至-25℃，升温速率为15℃/min；

由-25℃降温至-40℃，降温速率为1℃/min；

由-40℃降温至-150℃，降温速率为10℃/min；

-150℃保持10min。

在本发明中，所述初始温度优选为15～25℃，更优选为20℃。

在本发明中，所述升温或降温匀速进行。

本发明对所述冻存液没有特殊限制，采用本领域的常规自然杀伤细胞的冻存液即可；所述冻存液优选的包括以下体积百分含量的原料：DMSO 8～12％，右旋糖酐0.2～3％，人血白蛋白5～15％和20～200IU/mL的IL-2；所述冻存液的溶剂优选为质量体积浓度为0.9％的氯化钠注射液；所述冻存液参见中国专利CN202110766427.2。

在本发明中，每mL所述冻存液中优选的包含2×10⁷～8×10⁷个自然杀伤细胞。

在本发明中，所述冻存采用的仪器优选为SY-LAB程序降温仪，购自于奥地利。

在本发明中，所述-150℃保持10min之后，优选的进行液氮保存。

术语解释：

自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)，是人体天然免疫细胞中的重要组分，NK细胞可以通过表面TCR和相关的CD3分子的缺失，以及CD56的表达来鉴定，在宿主抗肿瘤免疫中具有重要作用

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

冻存液由以下体积浓度的组分组成：DMSO 10％，右旋糖酐1％和人血白蛋白5％，冻存液的溶剂是质量体积浓度为0.9％的氯化钠注射液。

将自然杀伤细胞和冻存液混合后，置于液氮冻存袋中，进行冻存；

冻存仪器：SY-LAB程序降温仪，奥地利。

冻存程序(程序2)参见如下表1：

表1

对比例1

除冻存程序不同外，其他和实施例1相同。冻存程序(程序1)参见表2。

表2

实施例2比较实施例1和对比例1的不同降温程序对细胞的影响

一、细胞冻存过程

1.培养的SNK细胞用225离心管离心收集，每瓶200mL细胞悬液，25℃离心，1200g，5min，轻轻倒掉上清液；

2.每瓶加入100mL 0.9％的氯化钠注射液，重悬细胞，25℃离心，1200g，5min，轻轻倒掉上清液；

3.每瓶加入100mL 0.9％的氯化钠注射液，重悬均匀细胞，取出1mL细胞悬液进行计数，其余细胞25℃离心，1200g，5min，轻轻倒掉上清液；

4.根据上述细胞计数结果，加入适量的冻存液，细胞密度调整至(3～8)×10⁷cell/ml。

5.上述4中的细胞悬液转移到冻存袋中；

6.用热合仪对冻存袋的管路进行封口；

7.将装有细胞的冻存袋放入冻存仪中，分别按实施例1和对比例1的降温程序，进行程序降温冻存细胞；

8.将上述冻存好的细胞袋转移至液氮中，保存；

9.根据试验需要，定期取出冻存细胞袋，检测相关功能。

二、检测过程

(一)细胞活力的检测方法

1.仪器/设备：细胞计数仪、移液器

2.试剂：AO/PI染液、1×PBS

3.耗材：0.5ml EP管、细胞计数板、枪头

4.检验操作：

待测样品制备：自然杀伤细胞稀释倍数选择参照表1：

(1)冻存前细胞计数和活力检测不稀释：取自然杀伤细胞悬液500μl到1.5ml EP管中，将1ml的移液器调至300μl轻轻吹打10次混匀，备用。

(2)冻存复苏的细胞10倍稀释：吸取20μl细胞悬液到0.5ml EP管中，加入180μl 1×PBS溶液，用1ml的移液器调轻轻吹打10次混匀，备用。

(二)细胞表型的检测方法

将待测细胞用带荧光的抗体染色后制成单细胞悬液。以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过A/D转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。以标记同型对照抗体的细胞荧光强度为阴性，就可以得到被特定抗体识别的细胞在所有细胞中占的百分比。

1.仪器/设备：细胞计数仪、涡旋振荡器、高速离心机、流式细胞仪、移液器。

2.试剂：AO/PI染液、1×PBS、CD3-FITC、CD56-APC、CD16-PE/CY7。

3.试验操作：

(1)取适量细胞数量的待测样品至15ml离心管(详见分样记录)，1500rpm，离心5min，弃去上清，加入一定量的1×PBS进行重悬，使细胞悬液浓度为1×10⁷细胞/ml。

(2)加样：吸取100μl处理后的待测样品于流式管1中，按照下表管号加入相对应的抗体。

(3)抗体孵育：抗体孵育：加入抗体后，涡旋混匀，避光孵育15min，避光孵育结束后，每管加入2ml 1×PBS重悬，1500rpm，离心5min，弃去上清，再向每管中加入500μl 1×PBS，涡旋混匀。

(4)上机检测：选择流式仪中“SNK细胞表型”进行上机分析；将检测结果流式图彩色打印附在本检验记录后。

(三)检测冻存前后细胞对靶细胞的杀伤方法

1.设备仪器

超净工作台、酶标仪、离心机、CO₂培养箱等；

2.实验试剂耗材

RPMI-1640培养基、FBS、Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST试剂盒、U型96孔板、靶细胞完全培养基；

3.实验操作

参照Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST试剂盒说明书中方法1“一步法”

(1)配制Working Solution

1)加1ml Assay Buffer至Dye Mixture中。

2)完全溶解后转移到Assay Buffer的瓶子中。

(2)效靶细胞实验

(E：自然是杀伤效应细胞、T：肿瘤靶细胞)

1)根据表1分别在E低对照、T高对照孔、T高对照Blank孔、T低对照孔和背景Blank孔加入相应体积的RPMI-1640+2％FBS培养基。

2)靶细胞若为贴壁细胞则弃旧培养基，加入PBS(1×)5～10mL，洗涤两遍，加入1～2mL的TrypLE Express消化，加靶细胞完全培养基终止；若靶细胞为悬浮细胞，则直接取细胞培养液；离心900rpm，5min，弃上清，用培养基10mL(RPMI 1640+2％FBS)重悬，离心900rpm，5min。弃上清，加入5mL(RPMI 1640+2％FBS)重悬计数，配制靶细胞悬液，加入96孔板E+T、T低及T高孔50μl/孔，每孔靶细胞数为4×10³个(密度为8×10⁴/mL)；每种靶细胞做3个重复。

3)将效应细胞悬液900rpm，5min离心，弃上清，加入10mL(RPMI 1640+2％FBS)重悬，离心900rpm，5min。弃上清，加入5mL(RPMI 1640+2％FBS)重悬计数，配制效应细胞悬液，按照效靶比从高到低进行倍比(1/2)稀释40:1、20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1，在E+T及E低对照孔加入效应细胞50μL悬液。E低对照每个浓度也做3个复孔。

12)在37℃5％CO₂培养箱内培养3h(根据实验情况也可杀伤24h或更长)以保证效应细胞和靶细胞充分接触。培养3h后在T高对照孔和T高对照Blank孔中加入10μL LysisBuffer。放入37℃5％CO₂培养箱中培养1h

15)关闭室内灯光，在每孔中加入100μL Working Solution，采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应20～30min(15min以后每隔5min观察1次，根据反应情况终止)。

16)在每孔中加入50μL Stop Solution后，立即用酶标仪测定490nm的吸光度。

表3各孔的溶液量(低损伤法)

注：E表示效应细胞，T表示靶细胞，E+T表示添加效应细胞和靶细胞，E低对照表示只添加效应细胞，T高对照表示只添加靶细胞，T高对照blank表示添加培养基和Lysisbuffer；T低对照表示添加靶细胞；背景blank表示加培养基后不加lysis buffer；各孔加入的效应细胞悬液体积和靶细胞悬液体积应相同，各孔的总体积(不含Lysis Buffer)应保持一致。

表4

(4)结果的计算

从样品和对照的吸光度-背景Blank的吸光度后，算出n＝6的平均值。

细胞损伤率根据如下公式算出。

细胞损伤率(％)＝[(A-B-E)/(C-D-E)]×100

A：E+T孔的吸光度-背景Blank的吸光度

B：E低对照孔的吸光度-背景Blank的吸光度；

C：T高对照孔的吸光度-背景Blank的吸光度；

D：T高对照Blank的吸光度-背景Blank的吸光度；

E：T低对照的吸光度-背景Blank的吸光度。

实验结果

1、降温曲线图

袋装细胞程序2(对比例1的程序)降温曲线图参见图1(上面的线代表样品降温曲线，下面的代表设置的箱体降温曲线)，袋装细胞程序1(实施例1的程序)降温曲线图参见图2(上面的线代表样品降温曲线，下面的代表设置的箱体降温曲线)。由图1和图2可以看出，图1降温过程中相变时，样品温度曲线波动较大，图2降温过程中相变时，样品温度曲线波动较小，样品温度整体下降平缓。

2、对细胞活力的影响

细胞冻存一个月后，应用程序2冻存的细胞活力与冻存前无明显变化，冻存程序1冻存的细胞活力显著降低(P<0.05)，参见图3。

3、对细胞表型的影响

细胞冻存1个月，应用程序2冻存的细胞，NK细胞比例与冻存前无明显变化，参见图4。

4、对细胞杀伤功能的影响

参见图5。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种自然杀伤细胞的冻存方法，由以下步骤组成：

将待冻存的自然杀伤细胞和冻存液混合，得到混合液，将所述混合液置于液氮冻存袋中进行冻存；

所述冻存的程序为：

由初始温度降温至4℃，降温速率为2℃/min；

由4℃降温至-12℃，降温速率为1℃/min；

由-12℃降温至-60℃，降温速率为24℃/min；

-60℃保持1min；

由-60℃升温至-25℃，升温速率为15℃/min；

由-25℃降温至-40℃，降温速率为1℃/min；

由-40℃降温至-150℃，降温速率为10℃/min；

-150℃保持10min；

冻存液由以下体积浓度的组分组成：DMSO 10％，右旋糖酐1％和人血白蛋白5％，冻存液的溶剂是质量体积浓度为0.9％的氯化钠注射液；

所述初始温度为20℃。

2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述升温或降温匀速进行。

3.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，每mL所述冻存液中包含2×10⁷～8×10⁷个自然杀伤细胞。

4.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述-150℃保持10min之后，液氮保存。