KR20230104897A - 생체 세포의 복수의 세포 클러스터를 동결 보존하기 위한 방법 - Google Patents
생체 세포의 복수의 세포 클러스터를 동결 보존하기 위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
생체 세포의 복수의 세포 클러스터(1, 2)를 동결 보존하기 위한 방법은 세포 클러스(1, 2)의 하나 이상의 특성에 따라 세포 클러스터(1, 2)를 두 개 이상의 분획(4)으로 분류하는 단계, 상이한 컨테이너(21) 내에 수집하는 단계, 및 두개 이상의 분획(4)의 세포 클러스터(1, 2)를 동결 보존하는 단계를 포함하고, 각 분획에 대하여 특정한 전처리 방법 및/또는 동결 방법이 사용되는 것을 특징으로 한다. 분류 장치를 갖는 생체 세포의 복수의 세포 클러스터(1, 2)를 동결 보존하기 위한 동결 보존 장치(100)가 또한 설명된다.
Description
본 발명은 생체 세포(세포 응집체라고도 함), 예를 들어, 세포 조직 또는 오르가노이드의 복수의 세포 클러스터를 동결 보존하기 위한 방법 및 동결 보존 장치에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들어 생물의학 및/또는 생명공학 분야에 적용된다.
생명공학/약리학 연구 및 생물의학, 예를 들어, 이식 의학에서, 복수의 생체 세포의 세포 클러스터에 대한 적용에 관심이 있다. 특히, 세포 클러스터는 완전한 장기를 형성하지 않고 생물학적 유기체의 장기 기능의 특정한 특성을 에뮬레이트하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 세포 클러스터에는 네이티브 생물학적 조직(체내에서 배양된 세포-매트릭스 클러스터), 회전 타원체(구형의 세포 클러스터) 또는 오르가노이드(체외에서 인공적으로 배양된 세포-매트릭스 클러스터)가 포함된다. 세포 클러스터의 형성은 며칠, 몇 주 또는 심지어 몇 달의 배양 시간이 필요할 수 있으며, 개별 세포 클러스터는 상이한 속도로 성장한다. 결과적으로, 배양 방법은 전형적으로 다양한 성숙 또는 성장 단계에서의, 특히 상이한 크기의 세포 클러스터를 가지고 비균질 샘플들을 생산한다.
생물학적 물질, 예를 들어 세포, 세포 성분 및/또는 세포 그룹의 동결 보존은 일반적으로 알려진 방법이며 이를 사용하여 생물학적 물질이 생명력을 유지하면서 동결된다. 동결은 소정의 동결 프로토콜에 따라 일어나는데, 일반적으로 동결 프로세스 동안 얼음 결정의 형성을 방지하거나 억제하는 동결 보호제(CPA)를 사용한다. 공정 매개변수(전처리 및 후속 동결의 컨디션)는 특히 생물학적 재료의 특성에 기초하여 선택된다(예: M. A. 테일러 외의 리뷰 "Tranfus. Med. Hemother." 46;2019, 197-215 "세포, 조직 및 장기의 동결 보존에 대한 세로운 접근법" 검토 참조).
생명력 수율이 높은 개별 세포들의 현탁액을 효과적으로 동결 보존하기 위해, 세포 유형에 특화된 공정 매개변수들, 예를 들어 보조제의 조성, 작용 지속시간 및 냉각 속도가 최적화되는데, 이는 많은 노력과 상당한 경험을 필요로 할 수 있다. 세포 클러스터의 동결 보존에서, 보존의 성공은 공정 매개변수의 선택에 훨씬 더 심각하게 의존하며, 이는 최적화된 동결 매개변수를 선택하는 노력도 증가한다는 것을 의미한다.
현탁된 개별 세포의 동결 보존은 특히 느린 동결로 인해 더욱 광범위하게 사용되고 있지만, 예를 들어 조직, 회전 타원체 또는 오르가노이드와 같은 상이한크기의 확장된 3-차원 세포 클러스터의 비균질 샘플은 지금까지 저속 동결을 사용하여 제한된 수율로만 동결 가능해왔다. 예를 들어, 세포 클러스터 내에서 원하는 농도에 이르는 보조제의 필요한 작용 지속시간은 클러스터의 직경에 따라 4배 증가한다. 위에서 언급한 비균질성, 특히 다분산은 전형적으로 세포 클러스터에 대한 관습적인 (확장 가능한) 생산 방법의 경우에 발생하기 때문에, 또한 세포 유형 및 특정 크기에 대해 최적으로 선택된 보존 프로토콜의 경우에, 조치의 부적절한 지속 시간과 크기 편차에 대한 조건으로 인해 손실이 발생한다. 따라서 세포 클러스터의 다분산 샘플의 기존의 동결 보존에서 동결 매개변수 선택에서 타협을 수용하는 것이 지금까지 항상 필요했다.
유리화(초고속 냉각에 의한 유리화)를 사용하여 상대적으로 작은 세포 클러스터를 보존하는 것이 또한 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 매우 높은 농도의 보조제를 제공하고 3차원 조직 클러스터의 모든 지점에서 초고속으로 유리 전이 온도 이하의 온도에 도달하기 위하여 매우 엄격한 기술적 한계가 유리화에부과된다. 이는 무엇보다도 수성 배양액의 제한된 열전도성으로 인해 상한이 있는 샘플의 부피와 관련이 있다 (λ = 0.56 W/Km, α = 0.14 mm2/s). 하지만, 보조제의 농도 및 지속시간은 또한 해당 작용제(agent)의 세포 독성에 의해 제한된다. 또한, 열응력 균열로 인한 손상 확률은 샘플 크기가 증가함에 따라 증가한다. 따라서 유리화는 크기가 상이한 복수의 세포 클러스터를 가진 샘플의 정례적인 보존에 적합하지 않다.
실제로, 동결 매개변수 선택에 대한 상기 제한은 크기가 상이한 세포 클러스터들을 가진 샘플을 동결 보존할 때만 발생하는 것이 아니다. 샘플의 비균질성은 함께 준비된 세포 클러스터의 다양한 다른 특성들, 예를 들어 상이한 형태 또는 탄력성에서 비롯될 수 있다.
본 발명의 목적은 복수의 생체 세포의 세포 클러스터의 동결 보존을 위한 개선된 방법 및 개선된 동결 보존 장치를 제공하는 것이며, 이를 통해 기존의 기술의 단점을 피할 수 있다. 이는 특히 다양한 세포 유형에 대한 공정 매개변수, 수율, 효율성 및/또는 유용성의 최적화와 관련하여 세포 클러스터의 동결 보존을 개선하기 위한 것이다.
이러한 목적은 독립 청구항들의 특징을 갖는 생체 세포들의 복수의 세포 클러스터들을 동결 보존하기 위한 방법 및 동결 보존 장치에 의해 달성된다. 본 발명의 유리한 실시예들 및 응용들은 종속 청구항에 의해 제공된다.
본 발명의 제 1 일반 양태에 따르면, 상기 목적은, 세포 클러스터의 하나 이상의 소정의 특성에 기초하여 세포 클러스터를 두 개 이상의 분획들 내로 분류하는 단계, 상이한 컨테이너에 분획들을 포집하는 단계, 두 개 이상의 분획들에 세포 클러스터를 동결 보존하는 단계를 포함하는, 생체 세포의 복수의 세포 클러스터를 동결 보존 하기 위한 방법에 의해 달성되는데, 여기서 특정한 전처리 방법들 및/또는 동결 방법들이 각 분획에 대하여 사용된다.
본 발명의 제 2 일반 양태에 따르면, 상기 목적은 동결 보존 장치에 의해 달성되는데, 이는 생체 세포의 복수의 세포 클러스터를 동결 보존하도록 조정되고, 분류 장치, 동결 장치를 포함하며, 분류 장치는 세포 클러스터의 하나 이상의 소정의 특성에 기초하여 세포 클러스터들을 두 개 이상의 분획 내로 분류하도록 조정되고, 컨테이너 장치는 두 개 이상의 상이한 컨테이너를 구비하고, 그 각각은 분획들 중 하나를 포집하도록 배열되고, 동결 장치는 세포 클러스터들을 두 개 이상의 분획에서 동결 보존하기 위해 조정되고, 여기서 동결 장치는 각 분획에 대하여 특정 전처리 방법 및/또는 동결 방법을 적용하도록 조정된다. 바람직하게는, 본 발명의 제 1 일반 양태 또는 방법의 일실시예에 따른 동결 보존을 위한 방법을 수행하기 위하여 동결 보존 장치 또는 그것의 실시예가 적용된다.
본 발명에 따르면, 세포 클러스터는 세포 클러스터의 하나 이상의 소정의 특성에 기초하여 두 개 이상의 분획으로 분류된다. 일반적으로, 최대 5개 또는 최대 10개의 분획이 형성된다. 그럼에도 불구하고, 최대 20개 이상의 분획도 제공될 수 있다.
유리하게는, 세포 클러스터의 분획에 의해 두 개 이상의 균질한 분획이 생성되며, 이러한 분획 각각에 대해 동결 보존을 위한 분획 공정 매개변수를 최적화할 수 있다. 발명자들은 동결 보존을 위한 최적의 공정 매개변수가 세포 유형어 의존할 뿐만 아니라 세포 클러스터 자체의 특성, 예를 들어 세포 클러스터, 에도 의존한다는 것을 발견했다. 또한, 본 발명자들은, 기존의 방법들에서, 비균질한 분획 내의 상이한 크기의 세포 클러스터들이, 각각의 크기에 대하여, 보조제들과 물이 세포 클러스터 내에 상이하게 분포되어, 따라서, 동결에 상이한 효과를 갖는다는 것을 발견하였는데, 이는 동결 보존의 성공과 수율에 불리하다. 본 발명에 따르면, 균질한 분획을 생성함으로써, 비균질한 분획의 기존의 처리의 한계를 극복할 수 있다.
균질한 분획을 준비하는 것은 세포 클러스터들의 응용, 예를 들어 연구 목적 또는 이식 치료에 대하여 추가적인 이점이 있고, 여기서 성숙 또는 발달 단계가 동일하거나 유사한 세포 클러스터들을 갖는 분획에 관심이 있다. 이러한 분획들은 배양 방법을 사용하여 원하는 목적을 위하여 획득되어지고 동결 보존에 처하고 냉동 상태인 유사한 세포 클러스터들에 의해 형성될 수 있다.
용어 "세포 클러스터"는 예를 들어 조직(특히 조직 모델), 회전 타원체 또는 오르가노이드 같은 연속적이고 바람직하게는 3차원으로 확장된 살아있는 생체 세포의 그룹을 나타낸다. 세포 클러스터는 배타적으로 세포로만 구성되거나 세포에 부가된 세포외 기질 물질을 포함할 수도 있다. 세포 클러스터는 예를 들어 생체 세포를 배양하거나 및/또는 유기체에서 추출하여 준비된다. 용어 "분획"은 배양액을 둘러싼 액체 내의 복수의 세포 클러스터를 나타낸다.
분류(fractionation) 초기의 비균질 샘플로부터 소정의 분획 갯수로 세포 클러스터들을 분리(정렬, 분리 공정)하는 것으로 구성된다. 분리는 각 분획에 셀 군집이 포함되고 각 분획의 셀 군집이 하나 이상의 동일한 속성을 갖도록 이루어진다. 이는 각 분획의 세포 클러스터가 하나 이상의 속성과 관련하여 동일하거나, 사소한 차이를 갖는데, 해당 차이가 동결 보존, 특히 전처리 방법과 동결 방법에 대한 최적 매개변수 선택에 영향을 미치지 않을 정도로 사소한 차이를 가지고 있음을 의미한다. 각 분획은 논의가 되는 속성들 중 하나 이상과 관련하여 균질하다. 분류은 특히 바람직하게는 세포 클러스터를 변경하지 않는 분리 방법이다. 특히, 세포 클러스터는 분류 시에도 손상되지 않은 상태로 유지되는데; 즉, 세포 클러스터는 조각으로 분해되지 않다.
분류 장치는 바람직하게는 세포 클러스터들을 상이한 분획들로 분리하고, 분획들을 상이한 컨테이너들 내로 분사하기 위해, 주변 배양액에서 세포 클러스터들의 조성을 수용하도록 조정된 분리 장치를 포함한다.
본 발명에 따르면, 분획은 상이한 컨테이너에 수집되는데, 즉, 분류는 상이한 컨테이너 내로 분리되는 것을 포함한다. 각 컨테이너는 일반적으로 분획을 위한 용기를 포함하는데, 이는 전형적으로 동등한 세포 클러스터 및 배양액을 둘러싼 액체, 예를 들어 영양 배양액을 포함한다.. 상이한 컨테이너들의 용기들은 서로 분리되어 있다.
바람직하게는, 분획은 후속으로 동결 보존이 일어나는 컨테이너 내에 수집된다. 유리하게는, 결과로써, 분류 및 동결 보존으로 구성된 방법과 동결 보존 장치의 구조가 단순화되고, 분류 후 세포 클러스터에 대한 일부 원치 않는 영향이 방지된다.
동결 보존에서, 분류중에 얻은 분리된 분획들은 냉동된다. 대안적으로, 동결 전에, 분획들은 주변 배양액의 변화 및/또는 주변 배양액 내 세포 클러스터들의 농축에 처해질 수 있다.
세포 클러스터의 동결 보존은 전처리 방법 및 후속으로 동결 방법을 포함한다. 세포 클러스터의 전처리(또는 배양)는 세포 클러스터가 동결될 수 있도록 준비하는 것을 포함하는데, 예를 들어, 액체 주변 배양액의 조성은 보조제 또는 CPA(보존 결과를 개선하기 위해 사용되는 모든 첨가제들의 전체)로 조정되고, 분획의 부피는 조정되며, 분획내의 세포 클러스터의 밀도가 조정되고, 및/또는 세포 클러스터가 변경되고, 예를 들어 물리적 및/또는 화학적 방법을 사용하여 투과가능해진다. 세포 클러스터의 전처리는 바람직하게는 주변 배양액이 액체 상태인 온도, 특히 상온에서 수행된다. 동결은 0°C 미만의 분획 온도를 동결 보존 온도, 예를 들어 -80°C ~ -200°C로 낮추는 것을 포함한다. 동결에 대한 동결 매개변수는 예를 들어 온도 하강의 시간 프로파일 및 설정된 동결 보존 온도이다.
동결 보존의 전처리 방법 및 동결 방법은 그 자체로 공지된 방법으로 수행되지만, 본 발명에 따르면, 두 개 이상의 분획 각각의 세포 클러스터의 동결 보존에는 특정한 전처리 방법 및/또는 동결 방법이 사용된다. 각 분획에 대해, 상이한 공정 매개변수, 특히 전처리 및/또는 동결 매개변수들이 제공된다. 각 분획에 대해, 특히 최대 생명력 유지 및/또는 최대 기능성 유지를 위해 세포 클러스터의 동결 보존이 최적화되도록 공정 매개변수가 선택된다.
동결 보존을 위한 공정 매개변수의 적용은 이전에 선택된 전처리 매개변수 및 동결 매개변수의 조정을 포함한다. 최적의 전처리 매개변수 및 동결 매개변수는 세포 클러스터를 사용하는 일련의 테스트를 사용하여 결정될 수 있고, 및/또는 전문가 문헌의 참조 실험으로부터 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 동결 보존을 위한 샘플에 특화된 공정 매개변수의 선택은 유리하게는 상이한 세포 유형에 대한 동결 보존의 수율, 효율 및/또는 적용 가능성 향상을 가능하게 한다.
동결 보존 온도까지 냉동한 후, 냉동 분획은 콜드 체인의 중단없이 바람직하게는 극저온 뱅크에 보관하기 위해 제공된다. 저장은 동결 보존 온도에서 벗어날 수 있는 저장 온도에서 극저온 뱅크에서 수행된다.
유리하게, 세포 클러스터의 분류를 위한 기초로 사용될 수 있는 복수의 이용 가능한 특성들이 존재한다. 본 발명의 바람직한 실시예들에 따르면, 세포 클러스터의 분류는 크기, 형상, 질량, 탄성, 유압 전도성, 동결 보호제 (CPA) 투과성, 동결 보호제에 대한 저항성, 세포 클러스터의 화학적 특성 및 세포 조성을 포함하는 특성들중 하나 이상에 기초하여 수행된다. 따라서, 분류 장치는 이러한 특성들 중 하나 이상에 기초하는 분류에 적용된다. 위의 물리적 및 화학적 특성들은 특히 효과적인 분획과 동결 보존을 위한 최적화된 공정 매개변수 선택에 적합한 것으로 유리하게 입증되었다.
세포 클러스터들은 복수의 특성들에 기초하여, 예를 들어 크기 및 CPA 투과성에 기초하여 분류될 수 있다. 복수의 특성들에 따른 분류에서, 바람직하게는 다단계 분류가 제공되고, 제 1 단계에서는, 제 1 특성, 예를 들어, 세포 클러스터들의 크기와 같은 특성이 시험되고, 하나 이상의 추가 단계에서, 하나 이상의 추가적인 특성, 예를 들면 CPA 투과성과 같은 특성이 시험된다.
크기에 따른 분류가 제공되는 것이 특히 바람직하다. 크기에 따른 분리를 위해서, 다수의 완만한 분리 방법들이 이용 가능하다. 동결 보존을 위한 공정 매개변수의 효율은 특히 세포 클러스터의 크기에 따라 크게 달라질 수 있다. 세포 클러스터의 크기는 예를 들어, 그 단면적 치수, 특히 직경 또는 물질 수송 및/또는 동결 공정에 영향을 미치는 세포 클러스터의 기타 특징의 기하학적 측정을 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 각각의 세포 클러스터들의 특정 모양으로 분획들 내로 분류하는 것이 특히 선호된다. 세포 클러스터의 형상은 주변 배양액내의 세포 클러스터에 의해 적어도 대략적으로 가정되는 기하학적 형상, 예를 들어 구형 또는 길쭉한 원통형 또는 불규칙한 형상이다.
동결 보존에서, 각 분획은 분획별로 선택된 전처리 매개변수를 특징으로 하는 전처리에 처해진다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시예들에 따르면, 분획에 대한 전처리 방법들은 지속시간, 온도, 압력, 배양액 조성, 가스 공급 조성, 투과성 조건 및 전처리 배양액의 이동을 포함하는 하나 이상의 전처리 매개변수 측면에서 상이하다. 이러한 전처리 매개변수는 높은 수율로 효과적인 동결 보존을 위해 세포 클러스터의 전처리에 특히 우수하게 적합하다는 것이 유리하게 입증되었다.
유리하게, 본 발명의 추가적인 변형들에 따르면, 분획들에 대한 전처리 방법들은 하나 이상의 전처리 매개변수들의 시간 프로파일 측면에서 상이할 수 있다. 전처리 방법은 전처리 매개변수의 상이한 시간 의존성을 특징으로 할 수 있다. 시간 의존성은 유리하게는 전처리의 최적화에서 추가적인 자유도를 달성한다.
본 발명의 더욱 바람직한 변형들에 따르면, 분획들에 대한 동결 방법은 지속시간, 특히 냉각 속도, 온도, 압력, 배양액 조성, 가스 공급 조성 및 동결 배양액의 이동을 포함하는동결 매개변수들 중 하나 이상의 측면에서 상이한 것으로 규정된다. 따라서, 동결 장치는 바람직하게는 동결 매개변수들 중 하나 이상을 갖는 동결 방법을 적용하도록 조정된다. 이는 유리하게 각각 동일한 세포 클러스터를 갖는 상이한 분획들에 대한 동결 보존을 최적화하는 데 사용될 수 있는 복수의 매개변수를 사용할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시예에 따르면, 세포 클러스터의 분류는 세포 클러스터가 유체 환경에서 분리되는 유동적인 분류을 포함하는 경우, 이는 세포 클러스터를 준비단계로부터 액체 배양액에 보관될 수 있기 때문에 추가적인 이점을 발생시킨다, 특히, 그것들의 배양 및 바로 이어지는 동결은 기체 또는 증기 환경으로의 일시적인 전환을 방지한다.
본 발명의 유리한 실시예에 따르면, 분류 및 동결 보존은 자동화된 방식으로 수행된다. 동결 보존 장치는 자동화된 작동, 특히 동결 보존 장치의 조작자의 개입 없는 작동을 위해 조정된다. 자동화는 프로세스 오류 방지, 공정 매개변수 설정의 재현성 및 정확성 및 기계에 의한 높은 처리량 분류를 고속 및 높은 처리량으로 별도의 분획들을 다운스트림 동결 보존하는 별도의 분획 내로 수행할 수 있는 가능성 측면에서 이점을 제공한다.
본 발명의 추가적인 변형에 따르면, 세포 클러스터의 분류는 유체 흐름에서 분류, 특히 크기 기반 분류를 포함하는 경우에, 세포 클러스터들은 유체 흐름의 유동력, 유체 흐름의 유전영동력과 유체 흐름의 음파 중 하나 이상의 영향하에서 유체 흐름의 흐름 프로파일에서 상이한위치에 배열된다. 유체 흐름의 흐름 프로파일은 흐름의 단면에서 흐름 속도의 위치 의존적 분포로 구성된다. 이는 흐름 프로파일의 상이한 위치들을 통해 세포 클러스터들을 흐름에서 상이한 흐름 경로들 내로 분리한다. 흐름 프로파일의 개별 부분들을 개별적인 부분 흐름을 통해, 예를 들어, 유체 시스템의 부분 채널 및/또는 상이한 방향으로 컨테이너로 가이드함으로써 상이한 컨테이너 내로 전달된다.
바람직하게는, 분류 장치의 유체 시스템은 채널 및 유체 요소, 예를 들어 브랜치 및/또는 교차로를 포함하며, 2 mm 미만의 특징적인 단면 치수를 갖는 유체 마이크로 시스템이다. 유체 흐름은 특히 바람직하게는 평행한, 소용돌이 없는 흐름인데, 이는 유리하게 흐름 내의 분리를 개선하고 흐름 프로파일의 다양한 위치로 세포 클러스터의 분리로부터 거리를 두고 흐름 프로파일의 부분들을 컨테이너들 내로 안내하는 것을 가능하게 한다.
유체 흐름의 유동력을 사용하는 분류는 수동 유체공학에 의한 크기 기반 분류이다. 세포 클러스터들은 크기에 따라 흐름 프로파일내의 다양한 위치에서 정렬되며, 따라서 분리될 수 있다. 수동 유체공학은 다음의 이점을 갖는다. 이는 세포 클러스터에 최소한의 부담만 주고 크기 센서를 필요로 하지 않는 비접촉식 방법이다. 세포 클러스터들의 비균질 혼합물은 부분적으로 추가될 수 있고 통과 시간 차이(크로마토그래피 원리, 필드 흐름 분류)에 의해 분리될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 선호되는 것은 연속적인 방법, 예를 들어 핀치 흐름 분류(PFF: Pinched Flow Fractionation)인데, 이는 보다 더 단순한 장치 설계를 가능하게하고 보다 쉽게 확장 가능하다. 예를 들어, PFF에서 상이한 크기의 세포 클러스터들은 배출구, 특히 노즐 부분을 통해, 다른 각도로 떠나간다.
유체 흐름에서 유전영동력을 사용하는 분류는 크기 기반 분류 또는 활성 유체 장치를 이용하는 세포 클러스터의 전기적 특성에 따른 분류, 예를 들어, 세포 클러스터의 유전 특성, 예를 들어 편광성 또는 표면 전하에 따른 분리이다. 이러한 분리 방법을 위해, 분류 장치는 바람직하게는 유체 흐름에서 유전영동력을 인가하도록 조정되는 전극 장치를 구비한다. 전극 장치는 예를 들어, 교류 전압이 인가되면 유체 시스템에서 흐름 방향과 편향 각도(0°와 동일하지 않음)를 형성하는 유전영동장 장벽을 생성하는 전극을 포함한다. 세포 클러스터에 작용하는 유전영동장 장벽의 강도는 세포 클러스터의 크기에 따라 달라진다. 흐름 방향과 직각으로 세포 클러스터에 작용하는 유전영동력은 흐름 내의 유동력과 중첩된다. 세포 클러스터는 크기 및/또는 유전 특성과 유동력에 따라 다른 위치에서 전극을 통과할 수 있으며 흐름 프로파일에서 그에 따라 배치될 수 있다. 유리하게도, 이것은 어떠한 업스트림 센서도 필요로 하지 않는 비접촉식 방법을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 장치 비용은 수동 유체공학에 대해서 보다 더 높다.
대안적으로, 유전영동력에 의한 분류는 센서와 결합될 수 있다. 센서 장치는 세포 클러스터의 하나 이상의 특성을 검출하도록 조정된 전극 장치의 업스트림에 배치될 수 있다. 개별 세포 클러스터들이 검출된 특성에 기초하여 흐름 프로파일내의 다양한 위치로 가이드되도록, 전극 장치는 센서 장치로부터의 출력 신호에 기초하여 제어된다.
음파에 의한 분류는 유체 흐름에서 수행되는데; 따라서 크기 기반 분류의 또 다른 변형은 능동 유체공학에 의해 제공된다. 적합한 주파수의 음향장(고정적인 및/또는 이동하는 음파)과 음파의 최소장에서 축적되는 불활성 몸체의 능력이 분류에 사용된다. 이 경우에도 업스트림 센서가 필요 없는 비접촉식 방법을 제공한다. 어쿠스틱 분류(acoustic fractionation)를 사용할 수 있는 크기 범위는 유전영동 분류에서 보다 유리하게 크다. 이러한 분리 방법을 위해, 분류 장치는 바람직하게는 유체 흐름에서 음파를 발생시키도록 조정되는 음원 장치를 구비한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 세포 클러스터의 하나 이상의 특성 및/또는 둘 이상의 분획의 하나 이상의 상태 변수가 감지 수단에 의해 감지된다. 따라서, 동결 보존 장치는 바람직하게는 세포 클러스터의 하나 이상의 특성 및/또는 두 개 이상의 분획 중 하나 이상의 상태 변수를 검출하도록 조정되는 센서 장치를 구비한다. 세포 클러스터의 하나 이상의 특성 감지를 통한 검출은 특히 바람직하게는 분류 바로 전에 직접적으로 수행되고, 분획의 하나 이상의 상태 변수 감지를 통한 검출은 특히 바람직하게는 동결 보존 바로 전에 직접적으로 수행된다. 분류 전에 세포 클러스터의 하나 이상의 속성을 감지하는 것은 유리하게는 분류를 위한 기초로 사용될 수 있는 세포 클러스터의 속성 그룹을 증가시킨다. 동결 보존 전에 분획들의 하나 이상의 상태 변수를 감지하면 분획의 상태에 기초하여 동결 보존을 위한 공정 매개변수를 추가로 최적화할 수 있는 이점이 있다. 분획의 상태 변수들은 예를 들어 세포 클러스터들의 밀도 또는 크기이다.
동결 보존 후 세포 클러스터의 추가 사용을 위한 본 발명의 추가적인 특히 중요한 이점은 생명력을 유지하는 해동이 또한 분획별로 발생할 수 있다는 것이다. 본 발명의 유리한 변형에 따르면, 둘 이상의 분획의 세포 클러스터의 해동은 각 분획에 대해 특정 해동 방법이 사용되도록 일어난다. 해동 매개변수는, 동결 보존을 위한 공정 매개변수와 마찬가지로, 개별적으로 분류된 분획에 대해 별도로 최적화되어 해동된 세포 클러스터의 생명력률을 증가시킬 수 있다.
일반적으로, 각 분획에 대해 특정한 해동 방법이 사용되고, 각 분획의 한 개 이상의 속성에 기초하여 세포 클러스터의 분류에 의해 얻어지고 동결되는 두 개 이상의 분획의 생명력 유지 해동을 위한 방법 및 해당 방법을 수행하도록 구성된 해동 장치는 본 발명의 추가적인 독립적인 주제로 간주될 수 있다.
생체 세포의 복수의 세포 클러스터를 동결 보존하기 위한 방법과 함께 개시된 특징들 및 그것의 실시예들은 마찬가지로 동결 보존 장치 또는 그것의 실시예들의 바람직한 특징들이다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 양태 및 바람직한 특징은, 특히 방법에 관한 것으로서, 동결 보존 장치 및 그 구성 요소에도 적용된다.
본 발명의 추가적인 세부 사항 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 후술하기로 한다.
도면은 다음과 같이 개략적으로 표시된다:
도 1: 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 특징을 갖는 동결 보존 장치의 구성 요소 및 복수의 세포 클러스터를 동결 보존하기 위한 일련의 방법; 및
도 2: 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 클러스터의 유전영동 분리에 적합한 분류 장치.
도 1: 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 특징을 갖는 동결 보존 장치의 구성 요소 및 복수의 세포 클러스터를 동결 보존하기 위한 일련의 방법; 및
도 2: 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 클러스터의 유전영동 분리에 적합한 분류 장치.
본 발명의 바람직한 실시예들의 특징들은 세포 클러스터의 크기 기반 분류의 사용에 대한 예시적인 참조의 수단에 의해 아래에 설명된다. 실제로, 본 발명의 구현은 크기 기반 분획에 제한되지 않고, 추가적인 예와 함께 후술되는 바와 같이, 세포 클러스터의 다른 특성에 기초한 분류를 통해 오히려 대안적으로 또는 추가적으로 가능하다는 것이 강조된다. 생물학적 재료의 동결 보존으로부터 공지된 바와 같이, 구체적인 예에서 사용된 동결 보존을 위한 세포 클러스터와 그 준비 및 공정 매개변수의 세부 사항 및/또는 해동 매개변수가 선택된다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 분류 장치(10), 컨테이너 장치(20) 및 동결 장치(30)를 갖는, 복수의 세포 클러스터(1, 2) 및 이를 위해 사용되는 동결 보존 장치(100)를 위한 방법의 단계S1 내지 S4를 보여준다. 도 1은 추가적으로 세포 클러스터(1, 2)를 준비하는 단계 S0 및 냉동 세포 클러스터를 극저온 뱅크(40)에 저장하는 단계 S5를 보여준다. 도 1에 표시된 예시는 예를 들어 세포 클러스터 1, 2의 자동화된 유체 크기 기반 분류를 수행하는 데 사용된다.
단계 S0에서 비균질한 샘플, 예를 들어 크기가 상이한 세포 클러스터 1, 2의 혼합물 및/또는 CPA에 대한 상이한 민감도를 갖는 세포 클러스터 1, 2의 혼합물이 준비된다. 세포 클러스터 1, 2는 예를 들어, 영양소 배양액에서 배양되고 성인 줄기 세포로부터 분화 인자를 사용하여 공지된 방법으로 형성된 오르가노이드를 포함하고, 예를 들어, 10 μm에서 10 mm 이상의 범위의 단면 치수를 갖는다. 세포 클러스터 1, 2는 예를 들어 배양 용기에 준비된다.
단계 S1에서, 세포 클러스터 1, 2는 개략적으로 나타낸 분류 장치(10)을 이용하여 개별 분획(4) (분획) 내로 분리되는데, 각 분획에는 특정 크기의 세포 클러스터들이 들어있다. 분류 장치(10)는, 예를 들어, 도 2를 참조하여 후술하는 바와 같이 구성되며, 바람직하게는 자동화된 방식으로 작동된다. 분획(4)은 S2 단계에서 컨테이너 장치(20)의 컨테이너(21) 내로 전달된다. 컨테이너(21)는 바람직하게는 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브, 특히 단계 S3 및 단계 S4의 후속 동결 보존에 사용되는 PP 튜브로 구성된다(단계 S5의 도면 참조). 대안적으로, 컨테이너는 파우치나 마이크로티터(microtitre) 플레이트와 같은 다른 컨테이너로 구성될 수 있다. 다른 대안에 따르면, 컨테이너(21)는 동결 장치(30)의 인큐베이션 유닛(31)의 일부일 수 있다. 개별 분획(4)은, 소정의 적재량, 특히 밀도(주변 배양액의 단위 부피당 세포 클러스터의 질량)에 도달할 때까지, 저장을 위해 제공된 컨테이너(21) 안에 수집된다.
동결 장치(30)는 인큐베이션 유닛(31)과 냉각 유닛(32)를 포함한다. 동결 장치(30)에서, 개별 분획(4)는 해당 크기에 적응된 전처리 및 동결 프로토콜에 따른다.
분획의 전처리는 인큐베이션 유닛(31)내에서 이루어진다. 이는, 각 분획(4)에 대해 완전하고 개별적인 배양 프로그램이 실행된다는 것을 의미한다. 그 공정에서, 적어도 CPA(특히 동결 보호제)가 추가되는데, 세포클러스터가 이와 함께 로딩되도록 의도된다. 세포 클러스터의 크기가 증가하면, 예를 들어 CPA 농도 증가 및/또는 배양 시간 증가가 사용된다. 적절한 동결 보호제 및 그 농도는 테스트를 사용하여 결정할 수 있다.
배양은 또한 소정의 온도 조절 T(t), 소정의 동결 보호제(CPA) 농도 프로파일 C(t, CPA1, CPA2 등)를 갖는 가스 및/또는 관류의 공급을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 세포 클러스터가 견딜 경우, 일시적으로 막(membrane) 투과성 및/또는 심지어 독성 CPA가 공급될 수 있다. 또한, 하나 이상의 분획(비막 투과성 CPA로 로딩하기 위한)의 얼음 핵 생성(과냉각을 감소 및 제어하기 위한), 중간 순환(T 및 C 균질화를 위한) 및/또는 세포 클러스터의 투과성(투과성)이 전처리 방법의 일부일 수 있다. 투과성은 예를 들어 화학적으로(예를 들어 DMSO를 사용하여), 음파를 사용하여(소노포레이션), 전기장을 사용하여(전기 천공법), 리포좀 물질을 사용하여 및/또는 막의 상변환을 통한 열변조에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 인큐베이션 유닛(31)의 전처리는 분획(4)의 동결 포인트 이상의 온도로 분획(4)을 사전 냉각하는 것을 포함한다.
인큐베이션 유닛(31)은 바람직하게는 컨테이너(21)를 위한 개별 용기, 예를 들어 개별 공동을 갖거나, 바람직하게는 동일한 부피의 분획을 위한 저장소에 의한 컨테이너를 공급한다. 인큐베이션 유닛(31)은 CPA(순차적 첨가 및/또는 농도 증가)를 공급하고 및/또는 컨테이너로부터 배양액을 배출하기 위한 펌프 장치를 포함한다. 또, 인큐베이션 유닛(31)에는 바람직하게는, 각 컨테이너내의 전처리중에 배양액을 이동시키기 위한 구동, 예를 들면 교반 기구가 마련된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 사전 냉각 유닛이 제공될 수 있는데, 이는 과냉각 분획에 적합하다. 과냉각은 세포 클러스터의 세포내의 멤브레인 변화를 유도할 수 있으며, 그 결과로써 전처리, 예를 들어 CPA의 흡수가 영향을 받을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 음원이 추가로 제공될 수 있는데, 이를 사용하여 분획의 세포 클러스터가 초음파 처리될 수 있다. 초음파 처리는 세포 클러스터의 세포내의 멤브레인 변화, 특히 투과성을 유도할 수 있다.
크기 의존적 배양의 추가 전처리 매개변수에는 예를 들어 개별 CPA의 농도, 개별 CPA의 작용 지속시간, 개별 CPA의 시간 경과에 따른 농도 프로파일, 적응된 온도 프로파일(> 0°C), 예를 들어 인큐베이션 유닛(31) 및 CPA 저장소 및/또는 주위 배양액(관류) 내의 변화와 함께 혼합 장치를 통한 배양액 조성의 지속적인 변화를 포함한다.
그뒤에, 분획(4)은 동결 유닛(32)에서 냉동된다(단계 S4). 분획(4)의 세포 클러스터의 특성, 예를 들어, 크기 또는 세포 클러스터의 개별 구성 요소의 유압 전도도, 배양액내의 막 투과성과 삼투 활성 첨가제의 비율 및/또는 과냉각과 같은 기타 특성에 따라, 개별 분획(4)는 상이한 냉각 속도 및/또는 상이한 냉각 프로파일로 제어된 방식으로 동결된다. 예를 들어, -1K/min 이하인 냉각속도가 사용된다. 냉각은 예를 들어 -80°C 이하, 예를 들어 -140°C 이하의 동결 보존 온도에 이르기까지 이루어진다.
개별 분획 동결에 대한 온도 프로파일은 예를 들어 평형 속도, 과냉각 감소를 위한 제어 핵생성 및/또는 균질 냉각 속도에 대한 조정을 설정하기 위해 (선택적으로 배양액의 순환 및/또는 냉각 유닛(32)의 열 교환기에 있는 분획 컨테이너의 형태 적합성 사용에 의한) 분획 부피를 통해 선택될 수 있다.
각 분획에 대해, 냉각 유닛(32)는 하나 이상의 냉각 요소와 열 교환기를 갖는 냉각 챔버를 포함한다. 냉각 요소는 예를 들어 펠티어(Peltier) 요소, 스털링(Stirling) 쿨러 또는 냉각수 흐름 쿨러이며, 예를 들어 액체 질소 또는 이소펜탄과 함께 작동한다. 냉각 요소는 정의된 냉각 속도를 설정하도록 조정된다. 열교환기는 예를 들어, 각각의 분획의 컨테이너를 위한 용기, 바람직하게는 컨테이너와 용기 사이에 형상 적합성을 갖는 용기를 포함한다. 컨테이너(21)가 동결 장치(30)의 인큐베이션 유닛(31)의 일부인 경우, 동결 전에 저온 컨테이너, 예를 들어 상기 PP 튜브 내로의 이송이 이루어진다. 냉각 유닛(32)은 선택적으로 핵생성 장치, 예를 들어 콜드 니들을 구비할 수 있는데, 이를 통해 제어된 핵생성이 컨테이너 내에서 유도될 수 있다.
마지막으로, 컨테이너가 닫히고 냉동된 분획은 극저온 온도(예를 들어 -140°C)에서 극저온 뱅크(cryobank)(40)에 저장된다(단계 S5). 극저온 뱅크(40)로의 이송은, 예를 들어 냉각된 수문을 사용하거나 동결 장치(30)를 극저온 뱅크(40)에 직접 연결함으로써 콜드 체인을 중단하지 않고 이루어진다.
해동에 대해, 도 1에 나타낸 공정은 해동 장치(표시되지 않음)를 사용하여 순서가 반대로 된다. 해동 중에는, 크기가 조정된 동결 공정과 마찬가지로, 해동 중 및/또는 보조제가 세척될 때까지 제 1 회수 단계에서 개별 분획은 또한 상이한 인큐베이션 유닛에서 별도로 처리된다. 예를 들어, 크기 의존적 해동 속도, 고삼투압 해동 배양액에서의 크기 의존적 배양 및/또는 해동 분획로부터의 크기 의존적 세척이 제공된다. 결과적으로, 예를 들어, 상대적으로 큰 세포 클러스터의 대사는 독성이 있고 막 투과성이 있는 CPA의 충분한 희석을 보장하기 위하여 냉각된 환경에 의해 느려질 수 있지만, 반면에 작은 세포 클러스터의 경우 이러한 공정은 더 빨리 일어날 수 있다.
해동 후에, 해동된 분획이 생명력 테스트를 받고, 생명력이 감지되면, 소정의 용도-의존적인 컨테이너 포맷, 예를 들어 마이크로타이터(microtitre) 판 또는 현탁 바이오리액터로 전송되는 분할 단계가 제공될 수 있다. 이 경우에, 크기 기반 분류가 유지되거나 생략될 수 있다.
해동 및/또는 분할은 예를 들어 유체 장치, 특히 유체 마이크로 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
도 2는 예를 들어 메인 채널(11A)과 분기 채널(11B)을 갖는 유체 장치(11), 특히 유체 마이크로 시스템의 형태인 분류 장치(10)를 보여주며, 이를 통해 상이한 크기의 세포 클러스터(1, 2, 3)를 갖는 액체 주변 배양액의 현탁액이 화살표(A) 방향으로 흐른다. 제어 장치(13)에 연결된 전극 장치(12)와 센서 장치(14)는 메인 채널(11A)에 위치한다. 메인 채널(11A)는 분기 채널(11B)로 분기되는데, 그 각각은 컨테이너 장치(20)의 컨테이너(21)에 연결된다.
전극 장치(12)는 예를 들어 메인 채널(11A)의 바닥 및/또는 커버 플레이트에 두 개의 스트립 같은 전극 또는 전극 쌍으로 구성된다. 제어 장치(13)로부터의 교류 전압이 전극에 인가되면, 전극 장치(12)는 흐름 A에 대해 직각으로 필드 장벽을 생성할 수 있다. 필드 장벽은 흐름과 함께 도착하는 세포 클러스터와 일치하도록 일시적으로 생성될 수 있다. 필드 장벽과 흐름 A의 유동력의 상호 작용에 의해, 세포 클러스터는 분기 채널(11B) 중 하나로 이어지는 소정의 흐름 경로 상으로 안내될 수 있다(예를 들어 세포 클러스터(1)의 점선 흐름 경로 B 참조).
센서 장치(14)는 예를 들어 광학 센서, 특히 이미지 처리 장치에 연결된 카메라이다. 세포 클러스터(1, 2, 3) 및 그들의 각각의 크기는 센서 장치(14)를 사용하여 감지될 수 있다. 세포 클러스터(1, 2, 3)의 위치와 크기에 대한 정보는 제어 장치(13)로 전달된다. 세포 클러스터(1, 2, 3)가 크기에 기초하여 분기 채널(11B) 중 하나로 가이드되고, 이를 통해 컨테이너(21) 중 하나 안으로 가이드되도록, 제어 장치(13)는 세포 클러스터(1, 2, 3)를 소정의 크기를 갖는 세개의 바람직한 분획에 할당하고 전극 장치(12)를 제어한다.
도 2의 실시예에 대한 대안으로, 전극 장치(12)는 유전영동 필드 케이지를 포함할 수 있고, 센서 장치(14)는 필드 케이지 내의 세포 클러스터를 감지하도록 조정될 수 있다. 세포 클러스터는 센서를 사용하여 필드 케이지에서 차례로 감지되고, 특성에 기초하여 복수의 분획들 중 하나에 할당되며, 선택적 추가 유전영동 편향 및 필드 케이지 해제에 의하여 해당 분획내로 가이드된다.
유전영동력을 이용한 크기 기반 분류에 대해 대안적으로 또는 추가적으로, 하기의 분리 방법 중 하나 이상이 분류를 위해 제공될 수 있다. 수동 분리 방법에는 예를 들어 흐름 프로파일의 분류(예를 들어 PFF), 밀도 기반 분류(예를 들어 침전) 및 기하학적 분류(예를 들어 스크린 사용)이 포함될 수 있다. 능동적 분리 방법에는 어쿠스틱 분리(예를 들어 고정적인 초음파 사용) 또는 광학 분리(예를 들어 광학 핀셋 사용)가 포함될 수 있다.
광학 센서에 대안적으로, 예를 들어 세포 클러스터에서 임피던스 측정이 제공될 수도 있고 (예를 들어 "쿨터 카운터(Coulter Counter)" 장치), 임피던스 측정 결과에 기초하여 분류가 수행될 수 있다.
도 1 및 도 2를 참조하여 설명한 크기 기반 분류는 다른 특성과 관련된 분류로 보충되거나 이로 대체될 수 있다. 예를 들어, 분류장치의 유체 장치, 예를 들어 유체 장치의 필드 케이지에서, 동결 보호제에 대한 세포 클러스터의 세포 투과성 및/또는 동결 보호제에 대한 저항성 테스트가 수행될 수 있다. 테스트 결과에 따라, 상이한 분획들이 형성될 수 있으며, 이들은 후속적으로 상이한 공정 매개변수들을 사용하여 동결 보존된다. 예를 들어, 세포의 CPA 투과성이 낮은 세포 클러스터는 세포의 CPA 투과성이 증가된 세포 클러스터보다 더 긴 CPA 배양 지속시간을 사용하여 처리된다.
전술한 설명과 도면 및 청구항에 개시된 본 발명의 특징은 그 다양한 실시예에서 본 발명을 구현하기 위해 개별적으로 조합적으로 또는 하위 조합 모두에서 의의가 있을 수 있다.
Claims (16)
- 생체 세포의 복수의 세포 클러스터(1, 2, 3)를 동결 보존하기 위한 방법에 있어서 다음 단계들을 포함하는 방법:
- 세포 클러스터(1, 2, 3)를 세포 클러스터(1, 2, 3)의 하나 이상의 특성에 의존하여 두 개 이상의 분획(4)으로 분류하기,
- 상이한 컨테이너(21)에 분획(4) 수집하기,
- 각 분획에 대하여 특정 전처리 방법 및/또는 동결 방법이 사용되는, 두 개 이상의 분획(4)의 세포 클러스터(1, 2, 3)를 동결 보존하기.
- 제 1항에 있어서,
- 세포 클러스터(1, 2, 3)의 분류는 크기, 형상, 질량, 탄성, 유압 전도성, 동결 보호제 (CPA (cryoprotectant)) 투과성, 동결 보호제에 대한 내성, 화학적 구성, 및 세포 클러스터(1, 2, 3)의 세포 조성을 포함하는 특성 중 하나 이상에 기초하여 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
- 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
- 분획 (4)에 대한 전처리 방법은 지속시간, 온도, 압력, 배양액 조성, 가스 공급 조성, 투과성 조건 및 전처리 배양액의 이동을 포함하는 전처리 매개변수 중 하나 이상의 측면에서 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3항에 있어서,
- 분획(4)에 대한 전처리 방법은 전처리 매개변수 중 하나 이상의 시간 프로파일 측면에서 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
- 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
- 분획 (4)에 대한 동결 방법들은 지속 시간, 온도, 압력, 배양액 조성, 가스 공급 조성 및 동결 배양액의 이동을 포함하는 동결 매개변수 중 하나 이상의 측면에서 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
- 전 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 특징들 중 하나 이상을 포함하는 방법:
- 세포 클러스터(1, 2, 3)의 분류은 유체 분획을 포함하고, 여기서 세포 클러스터(1, 2, 3)는 유체 환경에서 분리되고,
- 분획(4)은 후속으로 동결 보존이 일어나는 컨테이너(21) 내에 수집되고,
- 냉동 분획(4)은 콜드 체인을 중단하지 않고 극저온 뱅크(40)에 저장하기 위해 제공되고,
- 분류 및 동결 보존은 자동화된 방식으로 수행된다.
- 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
- 세포 클러스터(1, 2, 3)의 분류는 유체 흐름에서의 분류를 포함하는데, 여기서 세포 클러스터(1, 2, 3)는 유체 흐름의 유동력, 유체 흐름에서의 유전영동력, 및 유체 흐름에서의 음파 중 하나 이상의 영향 하에서 유체 흐름의 흐름 프로파일 내에서 서로 상이한 위치에 배열되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
- 세포 클러스터(1, 2, 3)의 하나 이상의 특성 및/또는 두 개 이상의 분획(4) 중 하나 이상의 상태 변수는 감지에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 전 항들 중 어느 한 항에 있어서, 다음 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 각 분획에 대해 특정한 해동 방법이 사용되는, 두 개 이상의 분획 (4)에서 세포 클러스터(1, 2, 3)를 해동하는 단계.
- 생체 세포의 복수의 세포 클러스터(1, 2, 3)의 동결 보존용으로 적합한 동결 보존 장치(100)에 있어서, 다음을 포함하는 장치:
- 세포 클러스터(1, 2, 3)를 세포 클러스터(1, 2, 3)의 하나 이상의 속성(1, 2, 3)에 의존하여 두 개 이상의 분획(4)으로 분류하기 위해 적용되는 분류 장치(10),
- 각 컨테이너는 분획(4) 중 하나를 수집하기 위해 배열되는,
두 개 이상의 상이한 컨테이너(21)를 가진 컨테이너 장치(20),
- 동결 장치(30), 상기 두 개 이상의 분획(4)에서 세포 클러스터(1, 2, 3)를 동결 보존하기 위해 적용되며, 동결 장치(30)는 각 분획(4)에 대해 특정한 전처리 방법 및/또는 동결 방법을 사용하기 위해 적용되는 동결 장치.
- 제10항에 따른 동결 보존 장치에 있어서,
- 분류 장치(10)는 크기, 형상, 질량, 탄성, 유압 전도성, 동결 보호제(CPA) 투과성, 동결 보호제에 대한 저항성, 화학적 조성, 및 세포 클러스터(1, 2, 3)의 세포 조성을 포함하는 특성들중 하나 이상의 특성에 기초하여 세포 클러스터(1, 2, 3)를 분류하기 위해 적용되는 것을 특징으로 하는 동결 보존 장치.
- 제10항 또는 제11항에 따른 동결 보존 장치에 있어서,
- 매개변수는 지속시간, 온도, 압력, 배양액 조성, 가스 공급 조성, 투과성 조건 및 전처리 중 배양액의 이동을 포함하고, 동결 장치(30)는 전처리 매개변수 및/또는 상기 매개변수의 시간 프로파일, 상기 매개변수들의 하나 이상의 측면에서 상이한 전처리 방법을 적용하도록 조정되는 것을 특징으로 하는 동결 보존 장치.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 동결 보존 장치에 있어서,
- 매개변수는 지속시간, 온도, 압력, 배양액 조성, 가스 공급 조성 및 동결 중 배양액의 이동을 포함하고, 동결 장치(30)는 동결 매개변수들 중 하나 이상의 측면에서 상이한 동결 방법을 적용하도록 조정되는 것을 특징으로 하는 동결 보존 장치.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
하기의 특징 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 동결 보존 장치:
- 분류 장치(10)는 유체 환경, 특히 유체 흐름에서 세포 클러스터(1, 2, 3)를 분리하도록 조정된 유체 장치(11)를 포함하고,
- 두 개 이상의 컨테이너(21)는 동결 장치(30)의 일부이고
- 동결 보존 장치(100)는 자동 운전을 위해 조정된다.
- 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 동결 보존 장치에 있어서,
- 분류 장치(10)는 유체 흐름 내에 유전영동력을 인가하도록 적용된 전극 장치(12)를 포함하고, 및/또는 유체 흐름 내에 음파를 발생시키도록 적용된 음원 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 동결 보존 장치.
- 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 동결 보존 장치에 있어서,
- 세포 클러스터(1, 2, 3)의 하나 이상의 특성 및/또는 두 개 이상의 분획(4) 중 하나 이상의 상태 변수를 검출하도록 조정된 센서 장치(14)를 포함하는 것을 특징으로 하는 동결 보존 장치.
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