CN108040460A - 冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品的方法，包括以下步骤：i)体外培养使用来自患有III或IV期黑素瘤的患者的中转皮肤结节、神经结或转移的样品收集的肿瘤浸润淋巴细胞，包括暴露中转皮肤结节、神经结或转移的样品中所包含的所述肿瘤浸润淋巴细胞，然后刺激由暴露步骤所产生的肿瘤浸润淋巴细胞，和随后扩增经刺激的肿瘤浸润淋巴细胞；ii)将由步骤i)获得的至少一种样品与在生理可接受的介质中包含以下的组合物混合：a)人血清白蛋白，b)至少一种糖，和c)至少两种选自DMSO、L‑半胱氨酸、辅酶Q10和C3‑C5烷二醇的成分，随后iii)冷冻由步骤ii)获得的混合物。

Description

冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的方法
技术领域
本发明涉及冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品的方法，包括以下步骤：
i)体外培养来自患有3期或4期黑素瘤的患者的中转(in-transit)皮肤结节、淋巴结或转移的样品的肿瘤浸润淋巴细胞，包括具体步骤，
ii)将由步骤i)获得的至少一种样品与在生理可接受的介质中包含以下的组合物混合：
a)人血清白蛋白，
b)至少一种糖，和
c)至少两种选自DMSO、L-半胱氨酸、辅酶Q10和C3-C5烷二醇的成分，然后
iii)冷冻由步骤ii)获得的混合物。
背景技术
冷冻保存是其中生物样品储存于极低温度下的方法。生物材料的冷冻保存通常通过将所述材料冷冻于适当的支持物例如由玻璃或塑料材料制成的管或瓶(在冷冻保存领域通常称为“吸管”或冷冻管)来进行，所述支持物适于在低温下长期储存。
然而，冷冻保存带来若干问题和技术限制。解冻期间尤其可能出现细胞损坏，导致细胞凋亡或细胞破裂。此外，冷冻保存的细胞的存活可能取决于冷冻期间使用的条件和技术。控制冷却速率是重要的：以低速率冷却使得细胞外可冷冻的水有序地结晶-细胞变得脱水、收缩并且水离开细胞。在相反的情况中，胞内冰的形成导致膜结构的破坏，这对于细胞是致死的。
对于大部分哺乳动物细胞，和用于细胞治疗的产品和药物的情况一样，不管细胞是否遗传改造，使用冷冻保护剂以保存细胞的完整性和功能性也是至关重要的。
目前，用于细胞治疗的产品的工业规模(尤其是欧洲或全世界)的制备提出了新的问题，例如施用的最终产品的稳定性和与起始生物材料有关的可变性。
在大部分情况下，最终产品包装成：
-在(白蛋白或盐水溶液类型的)液体介质中新鲜的，其中保存限于几小时或几天，或
-在基于DMSO的简单制剂中冷冻，长期而言其不是很稳定且不是很有效。相当数量的死细胞、相当数量的可能具有免疫原性影响的碎片和通常使用的赋形剂对患者的毒性都是限制因素。通常建议洗涤细胞以去除这些有毒元素(不管是生物的或非生物的)：这些方案与工业规模的分布不相容。此外，与其他“常规”类药物不同，它们在施用和储存方面不提供太多灵活性。
因此，需要开发用于细胞治疗的产物和/或药物，其长期(即数月)稳定、容易使用、可以直接注射且无毒性。
发明内容
本发明可以满足该需要。事实上，根据本发明的冷冻保存方法可以获得用于细胞治疗的包括肿瘤浸润淋巴细胞的产品，其随时可使用(即无需洗涤即可注射，这避免了所有额外的引起细胞活力降低和损失的操作)、长期稳定、容易使用且无毒性。
因此，本发明涉及冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品的方法，包括以下步骤：
i)体外培养来自患有3期或4期黑素瘤的患者的中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品的肿瘤浸润淋巴细胞，包括暴露中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品中包含的所述肿瘤浸润淋巴细胞，然后刺激由暴露步骤产生的肿瘤浸润淋巴细胞，最后扩增经刺激的肿瘤浸润淋巴细胞，以获得肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品，
ii)将由步骤i)获得的至少一种样品与在生理可接受的介质中包含以下的组合物混合：
a)人血清白蛋白，
b)至少一种糖，和
c)至少两种选自DMSO、L-半胱氨酸、辅酶Q10和C3-C5烷二醇的成分，然后
iii)冷冻由步骤ii)获得的混合物。
本发明还涉及在生理可接受的介质中包含以下的组合物在冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞(也称为TIL)的至少一种样品中的用途：
a)人血清白蛋白，
b)至少一种糖，和
c)至少两种选自DMSO、L-半胱氨酸、辅酶Q10和C3-C5烷二醇的成分，
所述样品通过体外培养来自患有期3或4期黑素瘤的患者的中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品的肿瘤浸润淋巴细胞而获得，所述培养包括暴露(emergence)中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品中所包含的所述肿瘤浸润淋巴细胞，然后刺激由暴露步骤所产生的肿瘤浸润淋巴细胞，最后扩增经刺激的肿瘤浸润淋巴细胞。
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)意欲是指遗传改造或非遗传改造的肿瘤浸润淋巴细胞。
因此，用于根据本发明冷冻保存方法的组合物(步骤ii))在生理可接受的介质中包含：
a)人血清白蛋白，
b)至少一种糖，和
c)至少两种选自DMSO、L-半胱氨酸、辅酶Q10和C3-C5烷二醇的成分。
“生理可接受的介质”意欲是指包含电离质的水介质。电离质例如是具有氯化物、碳酸盐、氢氧化物或辛酸盐类型的阴离子的钠盐、钾盐、镁盐和/钙盐。药学可接受的介质优选是包含氯化钠和辛酸钠的水性介质。
根据本发明的冷冻保存方法所用的组合物包含人血清白蛋白(化合物a))。该蛋白质是高分子量(约65kDa)血浆蛋白。它是血浆中最丰富的蛋白质；其正常平均浓度为38-48g/l。它可以缓冲pH并维持渗透性。其纯度优选95％。也可以使用人血清白蛋白的一个或多个片段和/或衍生物，所述片段或衍生物是非免疫原性的并具有类似于人血清白蛋白的渗透性。
优选地，人血清白蛋白、其片段和/或衍生物以相对于组合物总重量的2-10重量％、优选2.5-6重量％、优选3.5-4.5重量％的含量存在。
在本申请中，除非另有说明，含量相对于组合物总重量按重量计。
根据本发明的冷冻保存方法所用的组合物还包含至少一种糖(化合物b))。糖通过保持渗透平衡提高细胞存活和功能。一部分渗透入细胞并可以使膜结构稳定。糖优选选自单糖、二糖和三糖。
单糖优选选自葡萄糖、半乳糖、果糖和甘露糖。二糖优选具有式A-B，其中A和B各自独立地选自葡萄糖、果糖和甘露糖。糖优选是二糖。二糖优选葡萄糖二聚体。更优选地，二糖选自海藻糖和蔗糖。更优选地，二糖是海藻糖。
三糖优选选自棉子糖(半乳糖、葡萄糖和果糖的三聚体)、麦芽三糖和异麦芽三糖(葡萄糖三聚体)。
糖优选以0.05M-1M、优选0.07M-0.5M、优选0.08M-0.12M的浓度存在于根据本发明的组合物中。
最后，根据本发明的冷冻保存方法所用的组合物包含至少两种选自DMSO、L-半胱氨酸、辅酶Q10和C3-C5烷二醇的成分(化合物c))。
DMSO或二甲亚砜是式CH3-SO-CH3的极性非质子有机溶剂。它是胞内冷冻保护剂，其主要目的是替代胞内液体，因此其可以预防形成冰晶和引起膜结构破裂的冷冻/解冻阶段固有的渗透应力。它优选以2-15重量％、优选2.5-4.5重量％的含量存在于本发明组合物中。
L-半胱氨酸是具有硫醇基-SH的氨基酸。它优选以0.05mM-5mM、优选0.5mM-2mM的浓度存在于组合物中。
辅酶Q10，也称为泛醌，是包含醌基的化合物。其化学名称是2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌。它优选以0.005-1重量％、优选0.007-0.5重量％、优选0.007-0.1重量％的含量存在于组合物中。C3-C5烷二醇优选是包含3到5个碳原子和2个羟基的直链、支链或环状烷烃。它优选选自包含3到5个碳原子和2个羟基的直链烷烃。更优选地，它选自丙烷-1,2-二醇、戊烷-1,5-二醇和丁烷-2,3-二醇。C3-C5烷二醇优选是丙烷-1,2-二醇(也称为丙二醇)。
C3-C5烷二醇优选以3-10体积％、优选3-7体积％存在于组合物中。
根据本发明的冷冻保存方法所用的组合物优选包含至少两种以下成分作为化合物c)：
-DMSO和L-半胱氨酸，或
-辅酶Q10和C3-C5烷二醇，优选丙二醇。
根据本发明的冷冻保存方法的步骤ii)所用的组合物优选在生理可接受的介质中包含：
a)人血清白蛋白，优选为2.5-6重量％的含量，
b)糖，优选海藻糖，优选为0.07M-0.5M的浓度，和
c)DMSO和L-半胱氨酸，优选分别为2-5重量％的含量和0.5mM-2mM的浓度。
或者，根据本发明的冷冻保存方法的步骤ii)所用的组合物优选在生理可接受的介质中包含：
a)人血清白蛋白，优选为2.5-6重量％的含量，
b)糖，优选海藻糖，优选为0.07M-0.5M的浓度，和
c)辅酶Q10和丙烷-1,2-二醇，优选分别为0.007-0.1重量％和3-10体积％的含量。
、根据本发明的冷冻保存方法是特别有利的，且目的在于冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品。事实上，如实施例所证实，根据本发明的冷冻保存方法的步骤ii)所用的组合物可以持久且有效地冷冻保存TIL(尤其是解冻后长达4个月)。
肿瘤浸润淋巴细胞(或TIL)是通常在来自患有晚期黑素瘤(3期或4期)的患者的中转皮肤结节、淋巴结或转移中发现的淋巴细胞。它们涉及肿瘤细胞的死亡，并且目前作为用于细胞治疗的产品正在各种临床试验中进行测试。TIL通常来源于患者本身；它们是自体同源的。为此，它们取自患者、分离自肿瘤并且在体外增殖。
更具体地，根据本发明方法所用的TIL样品通过包含以下步骤的体外培养步骤i)获得：
-暴露中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品中所包含的肿瘤浸润淋巴细胞。该暴露也称为“原代培养”或“引出(exit)”；它是期间中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品中初始包含的肿瘤浸润淋巴细胞移入培养基并在体外培养的步骤，
-刺激由暴露步骤产生的肿瘤浸润淋巴细胞，最后
-扩增由刺激步骤产生的肿瘤浸润淋巴细胞。
暴露TIL的步骤优选通过原始培养来自患有3期或4期黑素瘤的患者的中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品、优选在闭合的培养容器中进行。事实上，TIL的来源是患有3期或4期黑素瘤的患者的中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品：它可以通过活检取样(样品取自肿瘤)。原始培养优选在不含血清的补充有白介素-2(IL-2)的X-VIVO型选择性培养基(由Cambrex公司销售)中进行。
“闭合的培养容器”意欲是指可以将培养的细胞保持在适合的介质中，而所述细胞不会直接接触外部环境的系统。因此，所述容器是闭合的，即特别在培养期间，当将TIL和培养基引入容器时，其内部体积不与环境空气接触。
暴露TIL后，后者经历刺激步骤，优选在隔开的闭合的培养容器中。这使得与在打开或非隔开系统中进行的相同技术相比，TIL总产量在数量上明显增加(高达2.5倍)。这也使得所产生的TIL的质量增加。事实上，在所产生的TIL中，CD8+TIL的比例大于在常规条件下所产生的(85％对比60％)，且相对于自体同源的肿瘤系具有更大的特异性细胞毒素活性(14％对比2％)。
根据优选的实施方式，在至少存在非增殖照射的异基因饲养细胞下刺激所述TIL。例如通过照射使得这些异基因饲养细胞是非增殖的。优选通过与由源自健康人供体血液的(非增殖)单核细胞和通过Epstein-Barr病毒转化的(非增殖)B细胞(优选株系LAZ388)形成的混合物共培养来刺激TIL。
非增殖异基因饲养细胞和TIL优选在不含血清的补充有白介素-2(IL-2)的X-VIVO型选择性培养基(由Cambrex公司销售)中共培养。此外，刺激步骤期间，优选将促进淋巴细胞扩增的有丝分裂试剂例如PHA-L(L型植物血细胞凝集素)与淋巴细胞平行引入闭合的刺激容器。
通常，隔开的闭合培养容器包含至少两个隔室，一个称为技术室，另一个称为平息室，它们彼此通信，且至少一个端口打开进入隔室之一。将悬浮于培养基中的TIL和非增殖照射的异基因饲养细胞经由所述端口引入，所述培养基经由该端口或其他端口更新。
TIL刺激步骤随后是扩增步骤。通常，收获经刺激的TIL然后将其转入培养系统。将袋孵育，并每周两次向各袋添加补充有IL-2的新培养基。
因此获得袋，其中TIL的浓度为1.106-3.106个淋巴细胞/ml。
从一个步骤到另一个步骤，可以在不同的闭合培养容器中进行暴露、刺激和扩增步骤。在这种情况下，从一个闭合容器转移到另一个在无菌条件下进行，例如通过Terumo的型无菌连接仪器连接，将管用作端口。作为一个变体，在制造时将用于暴露、刺激和扩增的闭合容器预先彼此连接，以形成闭合系统。
这种系统可以在闭合系统中进行T淋巴细胞的完全培养，从而限制污染风险。
在根据本发明的冷冻保存方法中，将TIL样品与上述组合物混合的步骤ii)通常通过稀释进行。TIL样品优选在液体形式的化合物a)中，优选50％体积中取得，然后添加优选预先混合在一起以获得2x浓度的溶液的化合物b)和c)。混合步骤i)可以在约4℃或在室温下(即20℃)下进行。
TIL样品优选进行离心，弃掉上清液，并将沉淀悬于上述组合物中。
关于根据本发明冷冻保存方法的冷冻(步骤iii))，它优选在从+4℃或室温降至-100℃至-160℃的温度降低内进行。冷冻步骤(步骤ii))优选在降至-100℃至-180℃，优选-140℃至-160℃的温度下进行。
然后将样品储存在通常低于-130℃的温度下。
优选地，冷冻iii)通过在+4℃将步骤ii)中获得的混合物置于浸没于异丙醇混合物中的容器来进行，使所有东西的温度为-70℃至-100℃。该系统(“Nalgene盒中冷冻”)借助于酒精的缓慢冷却使得每分钟有效的线性温度降低为-1℃至-2℃。或者，优选地，冷冻iii)通过程序化冰箱进行。这种冰箱尤其由Air Liquide或Cryobiosystem销售。它们尤其允许更加可重复的温度降低和更复杂的方案。
优选地，冷冻iii)尤其通过程序化冰箱根据以下步骤进行：
-将步骤ii)中获得的混合物置于+4℃温度下；然后
-每分钟1℃将温度从+4℃降低至-40℃；然后
-在液态或气态氮的容器中，每分钟10℃将温度从-40℃降低至-150℃，以到达平均约-150℃的最终储存温度。
由此获得的冷冻产品可在约-150℃保持几个月。
现在本发明将通过以下非限制性实施例来示例。
具体实施方式
实施例1：根据本发明方法制备并冷冻保存TIL样品
TIL产物构成自体同源性质的高级治疗药物产品(ATMP)。它由仅用于作为起始材料供体的患者的活细胞组成(在这种情况下淋巴结取自患者)。将离体扩增后的来自患者的TIL再注入相同患者：这是自体同源的系统。
方法如下：
起始原料由肿瘤浸润淋巴细胞组成，所述肿瘤浸润淋巴细胞浸润分离自患皮肤恶性黑素瘤的患者的淋巴结的转移性肿瘤。
患者预先进行病毒学筛选(CMV、乙肝和丙肝、HIV、HTLV、EBV和微细小病毒B19)。
方法的步骤i)：获得TIL样品：
每次手术无菌收集取样自(皮肤、肺和/或淋巴结)被转移期的黑素瘤细胞侵袭的样品片，然后“干燥”(不在转移介质中调节)地置于无菌容器中。然后将它们切成1到2mm的片段。
然后将取样的各肿瘤样品的片段冷冻于冷冻管中，以等待其制备。
TIL的暴露步骤：
将肿瘤片段的冷冻管解冻并置于包含X VIVO 培养基和IL-2的12孔培养平板的孔中。将平板在37℃和5％CO2下孵育。
在倒置显微镜下检查孔，用添加有IL-2的培养基更新一半体积，每周两次。
培养10-12天后，收获从肿瘤片引出的TIL，且使用规定量的这些TIL用于刺激。
TIL的刺激步骤：
在PHA-L存在下将预先获得的活TIL与照射的饲养细胞共培养，所述照射的饲养细胞由异基因淋巴细胞(源自由3个健康供体的CPA捐赠试剂盒的环残余物组成的安全的单核细胞库)和照射的LAZ细胞(通过Epstein-Barr病毒转化的异基因B系：株系LAZ388)组成。
需要照射饲养细胞以阻断这些细胞的增殖而不会不利地影响它们的饲养作用(产生可溶性因子、在其表面上表达标志物等)，这对于TIL的活化和增殖是重要的。
将TIL(1.8.106个细胞)和饲养细胞(异基因的淋巴细胞：240.106个细胞；LAZ388：120.106个细胞)在X VIVO培养基和IL-2的60个96孔平板中培养。将平板在37℃和5％CO2下孵育。
每周两次，去除孔中存在的上部三分之一的培养基并用新的培养基和IL-2替换。10-13天后，TIL增殖并在孔底部形成不透明沉淀。然后收集所有孔的内容物。
TIL的增殖步骤：
将从96孔平板收集的TIL转入培养袋并重新调节细胞浓度。孵育袋，每周两次向各袋添加新的X VIVO培养基和IL-2以将袋中TIL的浓度调节到1.106个淋巴细胞/ml。
方法的步骤ii)：将TIL样品与冷冻保存组合物混合：
袋培养(扩增步骤)10天后，通过离心降低从袋收获的TIL细胞悬液的体积以浓缩TIL，并将其在缓冲的生理盐水(0.9％NaCl)中洗涤。然后将包含细胞的沉淀与以下组合物之一混合：
-“组合物A”，包含3.5％DMSO、1mM L-半胱氨酸、0.1M海藻糖和4％人血清白蛋白(HSA)；或
-“组合物B”，包含5％丙二醇、0.01％辅酶Q10、0.1M海藻糖和4％人血清白蛋白(HSA)。
方法的步骤iii)：冷冻获得的混合物：
将在步骤ii)结束时获得的各混合物冷冻于-150℃。
将各产物以冷冻形式储存于温度低于-150℃的气态氮容器中，以等待解冻和向患者施用。
产生的各冷冻管包含：
1.1.75x106个活细胞。
2.固定为75x106个活细胞/ml的恒定的细胞浓度。
3.产物体积是1ml。
4.细胞组成如下：
a.活性物质：
i.大于99％CD45+细胞。
ii.大于50％CD45+CD3+CD8+免疫活性的T淋巴细胞，其响应于CD3+CD25+活化共表达IFNg和CD107a(＝可能性测试)。
b.杂质：
i.痕量HMB45+肿瘤细胞(<所使用分析法的检测极限1％)。
ii.痕量CD45+CD3-CD19+B淋巴样细胞(<所使用分析法的检测极限1％)。
iii.痕量CD45+CD3-CD56+和/或CD16+NK细胞(<所使用分析法的检测极限1％)。
iv.细胞碎片(＝通过流式细胞术或通过剩余DNA试验检测)。
实施例2：根据本发明冷冻保存TIL的组合物的有效性
此处使用的细胞是如实施例1的步骤i)所述获得的TIL。
制剂
根据本发明的组合物与以下相比进行测试：
-简单制剂(阴性对照)，其是已知的且广泛用于造血细胞移植单元，但其具有有限的储存能力：这是10％DMSO+4％人血清白蛋白(HSA)的混合物；和
-新鲜制剂，其中将细胞置于4％人血清白蛋白中并直接分析，这是阳性对照。
评估根据本发明的2个组合物：
-“组合物A”，包含3.5％DMSO、1mM L-半胱氨酸、0.1M海藻糖和4％人血清白蛋白(HSA)；和
-“组合物B”，包含10％丙二醇、0.01％辅酶Q10、0.1M海藻糖和4％人血清白蛋白(HSA)。
冷冻方法：
-在Nalgene盒中冷冻是已知的人工参考：4℃下将管置于充满异丙烷-酒精的混合物的密封盒中，然后所有东西均置于-80℃，酒精的缓慢冷却使得每分钟有效的线性温度降低为-1℃至-2℃；
-电子控制通过CRF(程序化冰箱)的自动冷冻；它使得产生线性或非线性曲线，以优化冷冻产量。该方法是可重复的。
以冷冻形式在最多-150℃储存1个月后，在解冻后的终点评估细胞。
材料和方法
冷冻保护剂和试剂
仪器
方法
从单个起始材料(其是由连续细胞培养/正常过程产生的新鲜细胞悬液)开始，设想4个研究组：
-普通T0组＝这涉及培养基离心之前分析的新鲜T0细胞。
-参考组(阴性对照)(管1)＝这涉及根据阶段性方法通过Nalgene盒(手工方法)冷冻于10％DMSO+4％HSA中的细胞。相比于非冷冻阳性对照细胞，该方法在之前研究中描述为对细胞的中等应力。
-阳性对照组T1＝这涉及保持于4％人血清白蛋白以模拟新鲜可注射的制剂的非冷冻细胞。
-测试组(管2)＝这涉及通过CRF冷冻(管3)方法冷冻于根据本发明组合物(组合物A或B)中的细胞。
更具体地，方案如下：
-T0的新鲜细胞处于由Nantes UTCG(细胞和基因治疗单元)定义的适合的培养条件之下。列举TIL细胞，测量它们的活力和它们的增殖(700.106个活细胞是全部条件所必需的)：这建立T0＝非配制的新鲜细胞参考
-该实验(在源自3个不同供体的不同最终产品上)独立进行3次
-每种条件产生75.106个细胞的3个冷冻管
-T0和T1单次产生(每种条件107个细胞)
-将悬浮液分配在一个250ml的烧瓶中，即每管225.106个活细胞
-400g离心8分钟
-各冷冻管的最终悬浮液体积为1ml，细胞浓度为75x106个活细胞/ml
-离心后，通过微量移液管或抽吸泵小心去除上清液
-将细胞放入1.5ml的4％HSA用于管1和2的条件
-将细胞悬液(＝500μl)转入3个编号的冷冻管
-逐滴添加500μl 2x浓度的冷冻培养基
-闭合冷冻管
-将管2置于根据本发明组合物中，然后在+4℃将基于DMSO的制剂孵育10分钟，在+4℃将基于C3-C5烷二醇的制剂孵育30分钟，然后冷冻于CRF。
-将管1冷冻于预先在+4℃稳定的Nalgene盒中。
将测试组的冷冻管通过控制速率冰箱(CRF)冷冻，其中它们经历程序化温度降低，在+4℃在先孵育后，每分钟-1℃降至-40℃的阶段，然后-10℃/分钟降至储存温度(-130℃)快速冷冻。然后在-150℃在气态氮容器中进行储存。
将参考组的冷冻管置于Nalgene盒(＝冷冻盒)，置于+4℃。将所有东西直接转移到-80℃冰箱过夜。最多48小时后将冷冻管转移到气态氮容器储存。
解冻
至少1个月后，通过快速法解冻冷冻管。为此，从氮容器取出冷冻管，然后在-80℃利用Nalgene盒将其转移到质量控制中心。一旦到达，立即将其浸没于+37℃水浴中直到全部的冰消失(约1分钟后)。将所有东西直接编号并根据以下“评价标准”段落中所述的测试进行分析。4小时后对阳性对照T1(在人血清白蛋白配制)进行相同分析。
命名冷冻管
NA：不适用
细胞浓度：所有瓶的细胞浓度相同，即每瓶1毫升75.106个细胞。
评价标准
评价标准是：
-解冻后和4小时后(核计数器类型)通过自动方法的活力。
-解冻后和4小时后编号活细胞。
-3天内测试细胞增殖(再培养后保持2天：通过CFSE测试)。
在温度控制为+37℃的水浴中快速解冻后分析细胞。解冻是快速的，直到全部的冰消失(其模拟适于人注射的产物的制备)，然后将管在室温(15℃-25℃)下保持4小时以验证解冻稳定性。
结果
结果在下表1-3中给出。
为了将组合物保留于TIL中，它在解冻后给出的结果必须大于85％的阳性对照(T1：4％血清白蛋白HSA中配制的细胞)且明显大于阴性对照(10％DMSO+4％HSA)，且4小时后的降低必须不能超过20％的阳性对照。
在记录最终产品中细胞群体稳定性的CD8/CD4比例的情况下，所述比例的变化不能大于40％。
表1：通过手工计数或曙红测定的解冻后4％HSA中的活力
在室温(RT)下4h后，由组合物A得到的平均活力是69.20％(T1的87.6％)，由组合物B得到的平均活力为70.97％(T1的89.9％)，这明显大于阴性对照的活力(53.00％)。
表2：CFSE染色后2天内TIL的增殖
批次1 T0 T1 组合物A 组合物B 阴性对照
CD45+
CD45+CD3+CD4+ 66.68％ 67.18％ 60.90％ 61.00％ 60.70％
CD45+CD3+CD8+ 28.72％ 28.33％ 30.50％ 30.90％ 31.20％
对照 好 好 好
CD45+CD3+CD25+ 14.49％ 12.55％ 14.90％ 15.30％ 14.50％
CD8/CD4比例 0.43 0.42 0.50 0.51 0.51
批次2 T0 T1 组合物A 组合物B 阴性对照
CD45+ 99.86％ 99.44％ 99.92％ 99.60％ 99.09％
CD45+CD3+CD4+ 47.30％ 46.65％ 56.30％ 54.33％ 55.89％
CD45+CD3+CD8+ 48.26％ 47.63％ 20.12％ 20.07％ 21.33％
对照 0.56％ 0.39％ 0.74％ 0.52％ 0.57％
CD45+CD3+CD25+ 16.47％ 12.91％ 50.82％ 47.69％ 38.48％
CD8/CD4比例 1.02 1.02 0.36 0.37 0.38
批次3 T0 T1 组合物A 组合物B 阴性对照
CD45+ 99.88％ 99.88％ 99.87％ 99.85％ 99.74％
CD45+CD3+CD4+ 77.14％ 77.46％ 76.11％ 76.70％ 70.24％
CD45+CD3+CD8+ 16.70％ 16.98％ 17.09％ 16.58％ 19.25％
对照 0.38％ 0.38％ 0.54％ 0.50％ 0.46％
CD45+CD3+CD25+ 35.95％ 30.81％ 43.78％ 43.16％ 40.11％
CD8/CD4比例 0.22 0.22 0.22 0.22 0.27
平均值 T0 T1 组合物A 组合物B 阴性对照
CD45+CD3+CD4+ 63.71％ 63.76％ 64.44％ 64.01％ 62.28％
CD45+CD3+CD8+ 31.23％ 30.98％ 22.57％ 22.52％ 23.93％
CD45+CD3+CD25+ 22.30％ 18.76％ 36.50％ 35.38％ 31.03％
CD25+ 11.86％ 10.44％ 19.03％ 17.54％ 14.34％
恢复率T1 118.9％ 100％ 194.6％ 188.6％ 165.4％
恢复率标准差 0.0％ 4.5％ 113.7％ 102.3％ 74.0％
CD8/CD4比例 0.56 0.55 0.36 0.36 0.39
表3：通过流式细胞术的细胞表征
总之，测试的2个制剂实现了规格设置(相对于阳性对照(4％血清白蛋白中配制的新鲜细胞，其是可注射的溶液)差异小于15％)。
对于制剂A：
-解冻后活力达到阳性对照值的97.3％并在4小时后保持为87.6％(作为绝对值，解冻后76.8％，然后4小时后69.2％)。这证实制剂是有效的且死细胞碎片的量是有限的。
-解冻再培养2天后细胞的增殖能力大于阳性对照(+10.3％)：这证实它们在解冻后的恢复/持久能力。
-细胞的功能性被保留，因为它们脱粒的能力(＝调节介导其免疫活性的细胞因子的合成，响应于CD3/CD28活化)被保留(恢复率方面阳性对照的91.0％)。
-CD25+活化细胞(IL-2受体的一部分)的百分比大于阳性对照(+94.6％)，且还反映了细胞的活化/增殖的能力。
-由于已知对冷冻/解冻周期更敏感的细胞毒素CD8+淋巴细胞的比例减少，仅CD8/CD4比例受到不利影响(0.36而不是0.55)。这种温和的降低对于产物是可容忍的。
对于制剂B：
-活力达到阳性对照值的102.6％并在4小时后保持为89.9％(即解冻后81％的活细胞，4小时后为71％)。
-解冻后2天内细胞的增殖能力大于阳性对照(恢复率方面112.4％)。
-细胞的功能性被保留，因为它们脱粒的能力(响应于CD3/CD28活化的细胞因子的合成)是87.0％。
-活化细胞的百分比大于阳性对照(+88.6％)。
-由于细胞毒素CD8+淋巴细胞的死亡率增加，仅CD8/CD4比例受到不利影响(0.36而不是0.55)，这不会不利地影响细胞的功能性。
结论
该研究证实制剂A和B：
-好于Nalgene盒中进行10％DMSO+4％HSA阴性对照(其冷冻有效性和稳定性是有限的)；和
-与非冷冻阳性对照的规格相似(相对于4％人白蛋白中的新鲜细胞的差异小于15％)。
这表明使用具有协同性化合物的复合制剂能够明显改进解冻后细胞的一般特征。
这些制剂的益处在于以下性质：
-无毒性；即解冻后即可使用，这使得可以克服医院的任何药物的处理操作，
-持久的细胞冷冻稳定性(几个月)，
-4小时的解冻稳定性，涵盖患者注射之前的准备和处理时间，
-与工业储存限制的相容性，
-保留细胞的一般特性和功能特性。
因此，它们响应细胞治疗中遇到的普遍问题。

Claims (14)

1.一种冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品的方法，包括以下步骤：
i)体外培养来自患有3期或4期黑素瘤的患者的中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品的肿瘤浸润淋巴细胞，包括暴露中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品中所包含的所述肿瘤浸润淋巴细胞，然后刺激由暴露步骤所产生的肿瘤浸润淋巴细胞，最后扩增经刺激的肿瘤浸润淋巴细胞，以获得肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品，
ii)将由步骤i)获得的至少一种样品与在生理可接受的介质中包含以下的组合物混合：
a)人血清白蛋白，
b)至少一种糖，和
c)至少两种选自DMSO、L-半胱氨酸、辅酶Q10和C3-C5烷二醇的成分，然后
iii)冷冻由步骤ii)获得的混合物。
2.如权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征在于所述糖选自单糖、二糖和三糖。
3.如权利要求2所述的冷冻保存方法，其特征在于所述糖是选自海藻糖和蔗糖的二糖。
4.如权利要求1-3之一所述的冷冻保存方法，其特征在于所述C3-C5烷二醇选自丙烷-1,2-二醇、戊烷-1,5-二醇和丁烷-2,3-二醇。
5.如权利要求1-4之一所述的冷冻保存方法，其特征在于所述人血清白蛋白以相对于组合物总重量的2-10重量％、优选2.5-6重量％的含量存在。
6.如权利要求1-5之一所述的冷冻保存方法，其特征在于所述糖以0.05M-1M、优选0.07M-0.5M的浓度存在。
7.如权利要求1-6之一所述的冷冻保存方法，其特征在于步骤ii)使用的组合物包含：
a)人血清白蛋白，优选为2.5-6重量％的含量，
b)海藻糖，优选为0.07M-0.5M的浓度，和
c)DMSO和L-半胱氨酸，优选分别为2-15重量％的含量和0.5mM-2mM的浓度。
8.如权利要求1-6之一所述的冷冻保存方法，其特征在于步骤ii)使用的组合物包含：
a)人血清白蛋白，优选为2.5-6重量％的含量，
b)海藻糖，优选为0.07M-0.5M的浓度，和
c)辅酶Q10和丙烷-1,2-二醇，优选分别为0.007-0.1重量％的含量和3-10体积％的含量。
9.如权利要求1-8之一所述的冷冻保存方法，其特征在于所述冷冻iii)在降至-100℃至-180℃，优选-140℃至-160℃的温度下进行。
10.如权利要求1-9之一所述的冷冻保存方法，其特征在于所述冷冻iii)通过在+4℃将步骤ii)中获得的混合物置于浸没于异丙醇混合物的容器中来进行，使所有东西的温度为-70℃至-100℃。
11.如权利要求1-10之一所述的冷冻保存方法，其特征在于所述冷冻iii)通过程序化冰箱进行。
12.在生理可接受的介质中包含以下的组合物在冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞的至少一种样品中的用途：
a)人血清白蛋白，
b)至少一种糖，和
c)至少两种选自DMSO、L-半胱氨酸、辅酶Q10和C3-C5烷二醇的成分，
所述样品通过体外培养来自患有3期或4期黑素瘤的患者的中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品的肿瘤浸润淋巴细胞而获得，所述培养包括暴露中转皮肤结节、淋巴结或转移的样品中所包含的所述肿瘤浸润淋巴细胞，然后刺激由暴露步骤所产生的肿瘤浸润淋巴细胞，最后扩增经刺激的肿瘤浸润淋巴细胞。
13.如权利要求1-11之一所述的冷冻保存方法或如权利要求12所述的用途，所述由暴露步骤产生的肿瘤浸润淋巴细胞在至少存在非增殖照射的异基因饲养细胞下进行刺激。
14.如权利要求1-11或13之一所述的冷冻保存方法或如权利要求12或13所述的用途，其中通过与混合物共培养来刺激所述由暴露步骤产生的肿瘤浸润淋巴细胞，所述混合物由源自健康人供体血液的单核细胞和通过Epstein-Barr病毒转化的B细胞，优选株系LAZ388形成所有单核细胞和B细胞都是非增殖的。
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