CN112930114A - 由冷冻保存的肿瘤样品扩增til - Google Patents

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Abstract

公开了由冷冻保存的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，以及使用扩增的TIL治疗人类疾病(包括癌症)的方法。制备用于冷冻的肿瘤组织包括：破碎肿瘤组织，以及在冷冻保存培养基中孵育碎片。在一个实施方式中，可在2℃至8℃下，在冷冻保存培养基中孵育碎片约30分钟至约80分钟。可通过使用液氮的蒸汽相(例如使用干燥的冷冻运输器)进行速冻来冷冻碎片。在一些实施方式中，公开了冷冻保存的肿瘤组织的组合物。

Description

由冷冻保存的肿瘤样品扩增TIL
相关申请
本国际PCT申请要求2018年9月20日提交的美国临时专利申请号62/733,937和2019年7月29日提交的美国临时专利申请号62/879,881的优先权，其全部内容各自通过引用并入本文。
技术领域
本文所述的发明总体上涉及淋巴细胞的扩增，更具体但非排他地涉及由冷冻保存的肿瘤组织扩增淋巴细胞。
背景技术
使用过继性转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，tumor infiltrating lymphocyte)治疗难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的潜在有效方法。Gattinoni等，Nat.Rev.Immunol.，2006，6，383-393。成功的免疫治疗需要大量的TIL；因此，生产和商业化需要稳健可靠的方法。由于细胞扩增的众多技术、物流和监管问题，此种商业化扩增一直是一项严峻的挑战。由于其效率，基于IL-2的TIL扩增随后进行“快速扩增过程”(REP，rapidexpansion process)已成为TIL扩增的优选方法。Dudley等，Science，2002，298，850-54；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2005，23，2346-57；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2008，26，5233-39；Riddell等，Science 1992，257，238-41；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42。REP可以在14天内使TIL扩增1000倍，尽管它需要通常来自多个供体的、大量过量(例如200倍)的经辐照的同种异体外周血单核细胞((PBMC，peripheral blood mononuclear cell)，也称为单核细胞(MNC))作为饲养细胞(饲养细胞)，以及抗CD3抗体(OKT3)和高剂量的IL-2。Dudley等，J.I mmunother.2003,26,332-42。经历REP程序的TIL在一些黑色素瘤患者的宿主免疫抑制后产生了成功的过继性细胞治疗。
目前的TIL生产方法受到时长、成本、无菌问题以及本文所述的其他因素的限制，使得此类方法商业化的潜力受到严重限制。目前方法的许多限制之一是依赖于新鲜的肿瘤组织来开始生产，由于更长距离运输新鲜肿瘤方面的困难，这通常需要昂贵且高价的本地生产设施。迫切需要提供不依赖于新鲜肿瘤组织且适合于商业规模生产且监管批准可用于地理分布广泛的人类患者的TIL生产工艺和疗法。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了TIL扩增方法，所述方法利用冷冻的肿瘤组织作为起始TIL来源材料来产生治疗性TIL群。
在一个实施方式中，本发明提供了冷冻保存肿瘤组织以生产肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(i)破碎肿瘤组织；
(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相(vapor phase)进行速冻(flash freezing)。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：
(i)破碎肿瘤样品；
(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻(flashfreezing)。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：
(i)破碎肿瘤样品；
(ii)在约2℃至约8℃的温度下，在包含约10％v/v二甲基亚砜的冷冻保存培养基中孵育碎片约20分钟至约70分钟；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。
在一个实施方式中，本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；以及
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一个实施方式中，本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织；
(b)在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟；
(c)冷冻肿瘤组织；
(d)以冷冻状态储存肿瘤组织；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；以及
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，储存培养基包含2％v/v至12％v/v(体积：体积)二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，储存培养基包含5％v/v DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含10％v/v DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含5％v/v至10％v/v DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％v/v、2％v/v、3％v/v、4％v/v、5％v/v、6％v/v、7％v/v、8％v/v、9％v/v、10％v/v、11％v/v、12％v/v、13％v/v、14％v/v和15％v/v。在一些前述实施方式中，储存培养基的其余部分是水性培养基。
在一些实施方式中，储存培养基包含2％w/w至12％w/w(重量：重量)二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，储存培养基包含5％w/w的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含10％w/w的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含5％w/w至10％w/w DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％w/w、2％w/w、3％w/w、4％w/w、5％w/w、6％w/w、7％w/w、8％w/w、9％w/w、10％w/w、11％w/w、12％w/w、13％w/w、14％w/w和15％w/w。在一些前述实施方式中，储存培养基的其余部分是水性培养基。
在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织30分钟至约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约45分钟。在这样在实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织60分钟。
在一些实施方式中，储存培养基包含约5％v/v DMSO，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。在一些实施方式中，储存培养基包含约10％v/v DMSO，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟至约60分钟。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(iv)冷冻容器；以及
(v)储存容器，使容器保持冷冻；
(b)解冻容器；
(c)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(b)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(c)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(d)冷冻容器；
(e)储存容器，使容器保持冷冻；
(d)解冻容器；
(f)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(g)取出至少多个TIL；以及
(h)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成直径为1.5mm至6mm、厚度为1.5mm至6mm。在其他实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成约6mm×6mm×6mm。
在一些实施方式中，储存培养基还包含抗细菌剂(antibacterial agent)。在一些实施方式中，抗细菌剂是庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含浓度为至少50μg/mL的庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含抗细菌剂、抗真菌剂(antifungalagent)及它们的组合。在一些实施方式中，抗真菌剂是两性霉素B，含量为约0.25μg/mL至约2.5μg/mL。在一些实施方式中，抗真菌剂是Fungin，含量为约5μg/mL至约50μg/mL。
在一些实施方式中，在进行方法的冷冻步骤之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)或另一种合适的培养基或溶液洗涤新鲜的肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括至少三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次洗涤后均更换HBSS。
在一些实施方式中，解冻步骤包括将容器浸入37℃水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，冷冻步骤包括在约-125℃至约-195℃下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，方法用来自人类受试者的新鲜肿瘤样品进行。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增步骤(c)和第二次扩增步骤(e)之间的分装(split)。在一个实施方式中，分装发生在第16天。在一些实施方式中，第一次培养步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(c)至步骤(e)在约21天内完成；在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)进行约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)在约16天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(d)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；其中，步骤(c)至步骤(d)的转换在不打开系统的情况下发生；
(e)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，步骤(d)至步骤(e)的转换在不打开系统的情况下发生；
(f)收获从步骤(f)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(e)至步骤(f)的转换在不打开系统的情况下发生；
(g)将来自步骤(f)的收获的TIL群转移至输液袋；其中，步骤(f)至步骤(g)的转换在不打开系统的情况下发生；
(h)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(g)的包含收获的TIL群的输液袋；以及
(i)向受试者施用来自步骤(g)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)从受试者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(e)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；
(f)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(g)解冻肿瘤组织；
(h)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；步骤(h)至步骤(i)的转换在不打开系统的情况下发生；
(j)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；步骤(i)至步骤(j)的转换在不打开系统的情况下发生；
(k)收获从步骤(j)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(j)至步骤(k)的转换在不打开系统的情况下发生；
(l)将步骤(k)中收获的治疗性TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(k)至步骤(l)的转换在不打开系统的情况下发生；
(m)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(l)的包含治疗性TIL群的输液袋；以及
(n)向受试者施用来自步骤(m)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，癌症选自：宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤、难治性黑色素瘤(refractory melanoma)、转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约30分钟；
(c)解冻肿瘤组织；
(d)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基处理肿瘤组织，产生TIL；
(e)取出至少多个TIL；以及
(f)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约30分钟；
(c)冷冻肿瘤组织；
(d)以冷冻状态储存肿瘤组织：
(e)解冻肿瘤组织；
(f)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基处理肿瘤组织，产生TIL；
(g)取出至少多个TIL；以及
(h)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)冷冻容器；以及
(v)储存容器，使容器保持冷冻；
(c)解冻容器；
(d)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(e)取出至少多个TIL；以及
(f)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，在进行方法的冷冻步骤之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤新鲜的肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括至少三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次洗涤后均更换HBSS。
在一些实施方式中，解冻步骤包括将容器浸入37℃水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，冷冻步骤包括在约-125℃至约-195℃下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增(或第一次培养)步骤和第二次扩增(或第二次培养)步骤之间的分装。在一个实施方式中，分装发生在第16天。在一些实施方式中，第一次培养步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(i)至步骤(k)(如适用)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(i)至步骤(k)(如适用)在约21天内完成；在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(i)至步骤(k)(如适用)在约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(i)至步骤(k)(如适用)在约16天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)从受试者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(c)解冻肿瘤组织；
(d)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(e)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；其中，步骤(d)至步骤(e)的转换在不打开系统的情况下发生；
(f)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，步骤(e)至步骤(f)的转换在不打开系统的情况下发生；
(g)收获从步骤(f)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(f)至步骤(g)的转换在不打开系统的情况下发生；
(h)将从步骤(g)收获的治疗性TIL群转移至输液袋；其中，步骤(g)至步骤(h)的转换在不打开系统的情况下发生；
(i)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(h)的包含治疗性TIL群的输液袋；以及(j)向受试者施用来自步骤(i)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，在进行方法的冷冻步骤之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤新鲜的肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括至少三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次洗涤后均更换HBSS。
在一些实施方式中，解冻步骤包括将容器浸入37℃水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，冷冻步骤包括在约-125℃至约-195℃下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增步骤和第二次扩增步骤之间的分装。在一个实施方式中，分装发生在第16天。在一些实施方式中，第一次扩增步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增步骤在约7天内完成，第二次扩增步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约21天内完成；在一些实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约16天内完成。
在一些实施方式中，本发明的扩增方法在约16天内完成。在一些实施方式中，扩增方法包括第一次扩增步骤(pre-REP步骤)和第二次扩增步骤(REP步骤)。在一个实施方式中，第一次扩增步骤为约3天至约5天。在另一个实施方式中，第一次扩增步骤为约3天。在另一个实施方式中，第一次扩增步骤为约5天。在一些实施方式中，第二次扩增步骤为约11天至约13天。在另一个实施方式中，第二次扩增步骤为约11天。在另一个实施方式中，第二次扩增步骤为约13天。在一些实施方式中，第一次扩增步骤为约5天，第二次扩增步骤为约11天。在一些实施方式中，第一次扩增步骤为约3天，第二次扩增步骤为约13天。
在一些实施方式中，在第二次扩增步骤期间，将TIL分装到另外的容器。在一些实施方式中，在第二次扩增步骤的第5天分装TIL。在一些实施方式中，在第二次扩增步骤的第6天分装TIL。在一些实施方式中，第二次扩增步骤为约11天，在第二次扩增步骤的第5天分装TIL。在一些实施方式中，第二次扩增步骤为约13天，在第二次扩增步骤的第6天分装TIL。
在一些实施方式中，第一次扩增步骤为3天，第二次扩增步骤为13天，在第二次扩增步骤的第6天(整个过程的第9天)分装TIL。在一些实施方式中，第一次扩增步骤为5天，第二次扩增步骤为11天，在第二次扩增步骤的第5天(总过程的第10天)分装TIL。
在一些实施方式中，在第二次扩增步骤期间使用饲养细胞。在一个实施方式中，在1/100比例(1/100th scale)的过程中，在第二次扩增步骤期间使用约2×106至50×106个饲养细胞。在另一个实施方式中，使用约25×106个饲养细胞。在另一个实施方式中，使用约50×106个饲养细胞。在一些实施方式中，在全规模(full scale)过程中，使用约2×109至50×109个饲养细胞。在一些实施方式中，在全规模过程中，使用约2.5×109或约5×109个饲养细胞。在一些实施方式中，饲养细胞是PBMC。
在一些实施方式中，第二次扩增步骤用约5×106至约200×106个TIL接种。在一些实施方式中，第二次扩增步骤用来自第一次扩增步骤的约5％至约25％的TIL接种。在一些实施方式中，第二次扩增步骤用来自第一次扩增步骤的约10％至约20％的TIL接种。在一些实施方式中，第二次扩增步骤用来自第一次扩增步骤的约10％的TIL接种。
其他实施方式包括这些组成和方法的组合和变型。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的前述发明内容以及以下具体实施方式。
图1：描述了2A过程的一个实施方式的主要步骤，包括在步骤B中破碎后可选地冷冻保存新鲜肿瘤组织。从第一次扩增培养开始至步骤E结束的总时间为约22天。
图2：图A至C描述了TIL制备过程的一个实施方式的各个步骤，包括冷冻保存新鲜肿瘤碎片，使得可以随后开始pre-REP培养。
图3：描述了TIL制备的一个实施方式，包括冷冻保存新鲜肿瘤碎片，然后将其随后用于开始pre-REP培养。
图4：描述了TIL制备的一个实施方式，包括冷冻保存新鲜肿瘤碎片，然后将其随后用于开始pre-REP培养。
图5：整体上比较了过程1C的一个实施方式与过程2A的示例性实施方式。过程2A预期由新鲜肿瘤组织碎片或解冻的冷冻保存的肿瘤组织碎片开始pre-REP培养。
图6：进一步比较了过程1C的实施方式与过程2A的实施方式。
图7：描述了2A过程的一个实施方式，其中，REP在“早期”开始。
图8：比较了源自Gen 2A过程和经改变的Gen 2A过程(记为“Gen 2.2”)的活细胞总数，其中，用新鲜的、速冻的或在2℃至8℃下在储存培养基中孵育30分钟或60分钟后冷冻的pre-REP培养物来开始。在pre-REP培养结束时进行细胞计数。
图9：比较了源自Gen 2A过程和经改变的Gen 2A过程(记为“Gen 2.2”)的活细胞总数，其中，用新鲜的、速冻的或在2℃至8℃下在储存培养基中孵育30分钟或60分钟后冷冻的pre-REP培养物来开始。在REP培养结束时进行细胞计数。
图10：比较了由源自Gen 2A过程和经改变的Gen 2A过程(记为“Gen 2.2”)的细胞产生的IFN-γ，其中，用新鲜的、速冻的或在2℃至8℃下在储存培养基中孵育30分钟或60分钟后冷冻的pre-REP培养物来开始。
图11：描述了与Gen 2.2实施方式的主要步骤相比，Gen 2实施方式的主要步骤。
图12：描述了1/100比例TIL生产过程的主要步骤。
图13：图13A-13E描述了在pre-REP期间收集的来自5位不同患者的肿瘤样品的活细胞总数(TVC)。使用新鲜肿瘤样品(Gen2对照)和冷冻肿瘤样品测量TVC。在第11天记录新鲜肿瘤样品的TVC，在第7天记录冷冻肿瘤样品的TVC。图13A(患者M1125)显示了肿瘤样品进行不同冷冻方法的唯一患者：用液氮的蒸汽相进行速冻，在用液氮的蒸汽相进行速冻之前，在2℃至8℃下孵育30分钟或60分钟。对于其余患者S13018、OV8022、T6042和O8026(分别为图13B-13E)，在速冻之前在2℃至8℃下孵育肿瘤样品60分钟。对于每个患者，将肿瘤样品切成3mm直径的碎片，将4个至6个碎片用于培养。图上的每个条形表示外推至全规模的TVC(乘以10)。在图13A中，与新鲜的相比，冷冻的早期pre-REP培养物产生约1％的TVC；在图13B中，与新鲜的相比，冷冻的早期pre-REP培养物产生约25％的TVC；在图13C中，与新鲜的相比，冷冻的早期pre-REP培养物产生约200％的TVC；在图13D中，与新鲜的相比，冷冻的早期pre-REP培养物产生约96％的TVC；在图13E中，与新鲜的相比，冷冻的早期pre-REP培养物产生约3％的TVC。数据表明，来自第7天的冷冻肿瘤样品的TVC与来自第11天的新鲜肿瘤样品的TVC相当。
图14：图14A-14E描述了在早期REP期间收集的与图13相同的5名患者的肿瘤样品的TVC。如图13所示，在第11天(新鲜)和第7天(冷冻)收获细胞。在图14A中，与新鲜的相比，冷冻的早期REP培养物产生约86％的TVC；在图14B中，与新鲜的相比，冷冻的早期REP培养物产生约98％的TVC；在图14C中，与新鲜的相比，冷冻的早期REP培养物产生约124％的TVC；在图14D中，与新鲜的相比，冷冻的早期REP培养物产生约286％的TVC；在图14E，与新鲜的相比，冷冻的早期REP培养物产生约167％的TVC。数据表明，在早期REP期间，来自第7天的冷冻肿瘤样品的总产量(以TVC衡量)与来自第11天的新鲜肿瘤样品的TVC相当。
图15：图15描述了来自4名患者的新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品中的CD8/CD4比率。新鲜或冷冻的REP TIL样品用流式细胞术抗体(CD3-BUV395、CD62LBV421、CD57-PB、CD11c-BV711、CD28-BB515、CD19-BUV563、CCR7-PE、CD123-BV605、CD27PE-CF594、CD14-BV-650、TCRg/d-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD45RA-A700、CD56-BUV737、CD8-BV786、CD4-PE-Cy7AND、CD16-APC-Vio770)染色。TIL基于TCR a/b+或g/d+、单核细胞(CD14+)、NK(CD56+、CD16+、CD56+/CD16+和B细胞(CD19+))来鉴定，并基于CD3+CD45+细胞测定纯度。患者M1125和T6042表现出CD8高表达，但总体而言，新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的CD8/CD4比率相当。
图16：图16A-16H描述了与图15相同的4名患者中CD3+CD45+表达和其他标志物表达。图16A和16B描述了患者M1125的数据；图16C和16D为患者S13018的数据；图16E和16F为患者OV8022的数据；图16G和图16H为患者T6042的数据。数据显示新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的TIL纯度相当。
图17：图17A-17C显示了新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品中表达CD4或CD8的细胞中CD28、CD27和CD57的表达。图17A为患者M1125，图17B为患者S13018，图17C为患者T6042。数据显示新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的分化状态相当。
图18：图18A-18C显示了新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品中表达CD4或CD8的细胞的记忆状态。图18A为患者M1125；图18B为患者S13018；图18C为患者T6042。数据显示新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的记忆状态相当。TN：幼稚(CD45RA+CCR7+)，TCM：中枢记忆(CD45RA-CCR7+)，TEM：效应记忆(CD45RA-CCR7-)，TEMRA/TEFF：RA+效应记忆/效应(CD45RA+CCR7)，中枢记忆/活化细胞(CD45RA+CD62L+)。所示条形图为门控CD4+或CD8+时阳性CD45+/-或CCR7+/-或CD62L+/-的百分比。
图19：图19A-19C显示了3名患者中表达CD4(上图)或CD8(下图)的细胞的新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品中的活化/耗竭标志物：M1125(图19A)；S13018(图19B)；和T6042(图19C)。通过多色流式细胞仪确定REP TIL的活化和耗竭。肿瘤组织用抗体(CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle 594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780)染色并使用流式细胞仪测量表达。总体而言，新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的TIL活化/耗竭状态相当。
图20：图20A-20C显示了3名患者的新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品中的IFNγ功能：M1125(图20A)；S13018(图20B)；和T6042(图20C)。将1×105REP TIL接种在抗CD3平板中24小时。收集培养上清液，使用IFNγQantikine ELISA试剂盒测量IFNγ细胞因子。条形图表示三次测量的平均值+SD。学生“t”检验用于计算统计显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。总体而言，数据表明冷冻肿瘤样品的IFNγ功能更高。
图21：图21A-21C显示了3名患者的新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的粒酶B(GzmB)功能：M1125(图21A)；S13018(图21B)；和T6042(图21C)。将1×105REP TIL接种在抗CD3平板中24小时。收集培养物上清液，使用Duo set ELISA试剂盒测量粒酶B。条形图表示的是三次测量的平均值+SD。学生“t”检验用于计算统计显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。总体而言，数据表明冷冻肿瘤样品的颗粒酶B(GzmB)的功能相当/更高。
图22：图22A-22C显示了3名患者的新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品中的CD107A表达：M1125(图22A)；S13018(图22B)；和T6042(图22C)。在用PMA/IO刺激或不用PMA/IO刺激的情况下刺激2×105REP TIL 2小时，然后对CD107A-APC700染色，通过流式细胞仪进行分析。条形图表示门控CD8或CD4时的CD107A阳性细胞。总体而言，数据表明新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的CD107A表达相当。
图23：图23A-23C显示了3名患者的新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品相对于1301细胞的端粒长度：M1125(图23A)；S13018(图23B)；和T6042(图23C)。使用Dako/AgilentPathology Solutions(流式细胞术的Telomere PNA试剂盒/FITC)试剂盒进行Flow-FISH，遵循制造商的说明来测量端粒重复序列的平均长度。在每个测定中，将1301T细胞白血病细胞系(SigmaAldrich，圣路易斯，密苏里州)用作内部参考标准。单独计数TIL，以1:1比率与1301细胞混合。将2×106TIL与2×106 1301细胞混合，使用FITC偶联的端粒PNA探针(FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-CCC-TAA)进行原位杂交，使用流式细胞仪(BD canto II)进行分析。根据以下公式，将测试样品的端粒荧光表示为1301细胞的荧光几何平均值(fl)的百分比：相对端粒长度＝[(平均FITC fl测试细胞数w/探针-平均FITC fl测试细胞数w/o探针)×1301细胞的DNA指数×100]/[(平均FITC fl 1301细胞数w/探针-平均FITC fl1301细胞数w/o探针)×测试细胞的DNA指数。数据表明，冷冻肿瘤样品的端粒长度与新鲜肿瘤样品相当或更好。
图24：图24是流程图，显示了由新鲜肿瘤碎片和冷冻肿瘤碎片的TIL扩增过程的某些实施方式：新鲜方法(“GEN2”)、早期REP方法1(“ER-1”)和早期REP方法2(“ER-2”)。
图25：图25显示了结构I-A和结构I-B，包含源自例如4-1BBL或结合4-1BB的抗体的三个线性连接的TNFRSF结合结构域，其折叠形成三价蛋白质，其然后通过IgG1-Fc(包括CH3和CH2结构域)连接至第二个三价蛋白，然后用于通过二硫键(小的细长椭圆形)将两个三价蛋白连接在一起，从而稳定结构并提供激动剂(其能够将6个受体的细胞内信号传导结构域和信号传导蛋白结合在一起以形成信号传导复合体)。
序列表
SEQ ID NO：1是莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是阿地白细胞介素(aldesleukin)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是重组人IL-4蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是重组人IL-7蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是重组人IL-15蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是重组人IL-21蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是人4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是鼠4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。
SEQ ID NO：12是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链。
SEQ ID NO：13是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：14是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：15是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR1。
SEQ ID NO：16是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR2。
SEQ ID NO：17是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR3。
SEQ ID NO：18是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：19是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：20是4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：21是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。
SEQ ID NO：22是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。
SEQ ID NO：23是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：24是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：25是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。
SEQ ID NO：26是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。
SEQ ID NO：27是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。
SEQ ID NO：28是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：29是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：30是4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：31是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：32是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：33是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：34是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：35是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：36是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：37是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：38是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：39是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：40是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：41是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：42是TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：43是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：44是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：45是TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：46是4-1BB配体(4-1BBL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47是4-1BBL多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：48是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：49是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：50是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：51是4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：52是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：53是4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：54是人OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55是鼠OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。
SEQ ID NO：57是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链。
SEQ ID NO：58是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：59是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：60是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。
SEQ ID NO：61是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。
SEQ ID NO：62是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。
SEQ ID NO：63是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：64是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：65是OX40激动剂单克隆抗体他利昔珠单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：66是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。
SEQ ID NO：67是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。
SEQ ID NO：68是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：69是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：70是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。
SEQ ID NO：71是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。
SEQ ID NO：72是OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。
SEQ ID NO：73是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。
SEQ ID NO：74是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。
SEQ ID NO：75是OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。
SEQ ID NO：76是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。
SEQ ID NO：77是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。
SEQ ID NO：78是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：79是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：80是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。
SEQ ID NO：81是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。
SEQ ID NO：82是OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。
SEQ ID NO：83是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。
SEQ ID NO：84是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。
SEQ ID NO：85是OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。
SEQ ID NO：86是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：87是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：88是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。
SEQ ID NO：89是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。
SEQ ID NO：90是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。
SEQ ID NO：91是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。
SEQ ID NO：92是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。
SEQ ID NO：93是OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。
SEQ ID NO：94是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：95是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：96是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。
SEQ ID NO：97是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。
SEQ ID NO：98是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。
SEQ ID NO：99是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。
SEQ ID NO：100是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。
SEQ ID NO：101是OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。
SEQ ID NO：102是OX40配体(OX40L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：103是OX40L多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：104是OX40L多肽的替代性可溶部分。
SEQ ID NO：105是OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：106是OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：107是OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：108是OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：109是OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：110是OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：111是OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：112是OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：113是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：114是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：115是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：116是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：117是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：118是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：119是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：120是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：121是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：122是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：123是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：124是人源化的OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：125是OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：126是OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：127是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗(nivolumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：128是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：129是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：130是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：131是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：132是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：133是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：134是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：135是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：136是PD-1抑制剂尼沃鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：137是PD-1抑制剂帕博利珠单抗(pembrolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：138是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：139是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：140是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
S EQ ID NO：141是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：142是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：143是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：144是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：145是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：146是PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：147是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗(durvalumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：148是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：149是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：150是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：151是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：152是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：153是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：154是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：155是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：156是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：157是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗(avelumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：158是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：159是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：160是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：161是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：162是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：163是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：164是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：165是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：166是PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：167是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗(atezolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：168是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：169是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：170是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：171是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：172是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：173是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：174是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：175是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：176是PD-L1抑制剂阿特利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有专利和出版物均通过引用全文并入本文。
定义
术语“冷冻”指组织、细胞组合物或其他组合物由于暴露于寒冷而变硬或变刚。本文所用的术语涵盖冷冻保存的概念，冷冻保存是在非常低的温度下储存细胞、组织等的过程，其中，所储存的细胞、组织等保持其活力。
术语“冷冻储存”指将已经冷冻的组合物保持在非常低的温度下，其中，所储存的细胞、组织等保持其活力。
术语“速冻(flash freezing)”、“速冻(snap freezing)”、“速冻(flash frozen)”和“速冻(snap frozen)”指极其迅速地(非限制性实例为在不到约两分钟内)导致冷冻。
术语“LOVO细胞处理系统”和“LOVO”指Fresenius Kabi USA,LLC制造的细胞处理系统。这两个术语还指由任何供应商制造的任何仪器或设备，其可在无菌和/或封闭系统环境中通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)泵送包含细胞的溶液，从而实现连续流动和细胞处理，以去除上清液或不含沉淀的细胞培养基。在一些实施方式中，此种细胞收集器和/或细胞处理系统可在封闭的无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
术语“Fungin”指由美国加利福尼亚州圣地亚哥的InvitroGen出售的抗真菌剂FunginTM(目录号ant-fn-1和ant-fn-2)。Fungin是匹马菌素(pimaricin)(CAS 7681-93-8)的可溶制剂。如本文所用，“Fungin”涵盖匹马菌素或纳他霉素(natamycin)的任何商业制剂。
术语“Fungizone”是E.R.Squibb和Sons,LLC的商标，指抗真菌的两性霉素B(CAS1397-89-3)。两性霉素B可商购，例如可购自美国密苏里州圣路易斯的SIGMA-Aldrich(目录号A2942，在去离子水中的250μg/mL溶液)。如本文所用，“Fungizone”涵盖两性霉素B的任何商业制剂。
术语“生理缓冲等渗盐溶液”指本领域技术人员已知的许多此类盐溶液中的任一种，其中，溶液被配制为生理pH和等渗盐浓度。在本领域中，这些通常称为平衡盐溶液。此种生理缓冲等渗盐溶液可包括但不限于Hank平衡盐溶液(“HBSS”)、Tris缓冲盐溶液(“TBS”)、磷酸盐缓冲盐溶液(“PBS”)或Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(“DPBS”或“dPBS”)。
术语“体内”指发生在受试者体内的事件。
术语“体外”指在受试者体外发生的事件。体外检测包括使用活细胞或死细胞的基于细胞的检测，并且还可以包括不使用完整细胞的无细胞检测。
术语“离体”指涉及对已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。适当地，该细胞、组织和/或器官可通过手术或治疗方法返回到受试者的身体。
术语“快速扩增”指在一周的时间内抗原特异性TIL的数量增加至少约3倍(或者4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或者9倍)，更优选在一周的时间内增加至少约10倍(或者20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或者90倍)，或者最优选在一周的时间内增加至少约100倍。下文概述了许多快速扩增方案。
本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或者“TIL”指最初作为白细胞获得的细胞群，它们已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和次代TIL。“原代TIL”是如本文所述从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次代TIL”是如本文所讨论的已经扩增或者增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于大量TIL(bulk TIL)和扩增的TIL(“REP TIL”或者“post-REP TIL”)。TIL细胞群可以包括经基因修饰(genetically modified)的TIL。
本文的“细胞群”(包括TIL)指许多具有共同特征的细胞。通常，群的数量通常为1×106至1×1010，不同的TIL群包含不同的数量。例如，在IL-2存在下，原代TIL的初始增长产生约1×108个细胞的大量TIL群。通常，进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞的群用于输注。
本文的“冷冻保存的TIL”指经处理且储存在约-150℃至-60℃温度下的原代TIL、大量TIL或扩增的TIL(REP TIL)。用于冷冻保存的一般方法也在本文其他地方描述，包括在实施例中。为清楚和避免疑惑起见，“冷冻保存的TIL”能够与可用作原代TIL来源的冷冻组织样品区分开。
本文的“解冻的冷冻保存的TIL”指先前被冷冻保存然后被处理以恢复至室温以上温度(包括但不限于细胞培养温度或可以将TIL施用于患者的温度)的TIL群。
TIL通常可以利用细胞表面标志物在生物化学上定义，或者通过其浸润肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外，或者，TIL可通过在重新引入患者后其浸润实体瘤的能力在功能上定义。
术语“冷冻保存培养基”或者“冷冻保存培养基”指可用于冷冻保存细胞的任何培养基。此类培养基可以包括：包含5％v/v DMSO至10％v/v DMSO的培养基。此类培养基也可以包括：包含7％v/v DMSO至10％v/v DMSO的培养基。示例性的培养基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及它们的组合。术语“CS10”指从Stemcell Technologies或者BiolifeSolutions商购的冷冻保存培养基。CS10培养基可以用商品名“
Figure BDA0003044135750000251
CS10”来指代。CS10培养基是包含DMSO的无血清无动物成分的培养基。
术语“中枢记忆T细胞”指CD45R0+并且组成性地表达CCR7(CCR7高)和CD62L(CD62高)的人T细胞亚群。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。在TCR触发后，中枢记忆T细胞主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中枢记忆T细胞在血液中的CD4区室(compartment)中占优势，并且在人体中按比率富集在淋巴结和扁桃体。
术语“效应记忆T细胞”指人或哺乳动物T细胞的亚群，其与中枢记忆T细胞一样，为CD45R0+，但丧失CCR7的组成型表达(CCR7低)，并且异质性或CD62L的表达低(CD62L低)。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激后迅速分泌高水平的炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL-4和IL-5。效应记忆T细胞在血液的CD8区室中占优势，并且在人体中在肺、肝和肠中按比率富集。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。
术语“封闭系统”指的是对外部环境封闭的系统。适用于细胞培养方法的任何封闭系统均可用于本发明的方法。封闭系统包括例如但不限于封闭的G容器。一旦将肿瘤碎片加入封闭系统中，系统就不会向外部环境开放，直至TIL准备好施用于患者。
本文用于描述破坏肿瘤的方法的术语“破碎”(fragmenting)、“使成碎片”(fragment)和“碎片化的”(fragmented)包括机械破碎方法，例如压碎、切片、分装和粉碎肿瘤组织，以及任何其他破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。优选地，外周血单核细胞是辐照的同种异体外周血单核细胞。PBMC是一种抗原呈递细胞。
术语“抗CD3抗体”指抗体或者它的变体(例如单克隆抗体)，包括：针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥特昔珠单抗(otelixizumab)、特普利珠单抗(teplizumab)和威司利珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)指单克隆抗体或者其生物类似物或者变体，包括针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中CD3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体，还包括市售形式，如OKT-3(30ng/mL，纯MACS GMP CD3，Miltenyi Biotech，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)和莫罗单抗或者其变体、保守性氨基酸取代、糖型(glycoform)或者生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC，American Type CultureCollection)，并且其分配的ATCC登录号为CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC，European Collection of Authenticated CellCultures)中，并且其分配的目录号为86022706。
表1：莫罗单抗的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750000271
表2：白细胞介素的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750000272
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括其人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及变体。IL-2描述于例如Nelson,J.I mmunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79，其公开内容在此引入作为参考。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：3)。例如，术语IL-2包括人类重组形式的IL-2，例如，阿地白细胞介素(PROLEUKIN，可从多个供应商商购，每个单独使用的小管2200万IU)，以及可从美国新罕布什尔州朴茨茅斯的CellGenix,Inc.(CELLGRO GMP)或美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)商购的重组形式的IL-2和其他供应商的其他商业等价物。阿地白细胞介素(des-alanyl-1，丝氨酸-125人IL-2)是IL-2的非糖基化人重组形式，分子量为约15kDa。适用于本发明的阿地白细胞介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：4)。术语IL-2还包括如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化的IL2前药NKTR-214，可从美国加利福尼亚州南旧金山的Nektar Therapeutics公司商购。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公开号US2014/0328791A1和国际专利申请公开号WO2012/065086A1中，其公开内容在此引入作为参考。适用于本发明的缀合的IL-2的替代形式描述于美国专利4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，其公开内容在此引入作为参考。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容在此引入作为参考。
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)指称为白细胞介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节幼稚辅助性T细胞(Th0细胞)向Th2 T细胞的分化。Steinke和Borish,Respir.Res.2001,2,66-70。在被IL-4活化后，Th2 T细胞随后在正反馈环中产生另外的IL-4。IL-4还刺激B细胞增殖和II类MHC表达，并诱导B细胞转换为IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific，Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号GibcoCTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：5)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)指称为白细胞介素7的糖基化组织衍生细胞因子，其可以从基质细胞和上皮细胞以及树突状细胞中获得。Fry和Mackall,Blood2002,99,3892-904。IL-7可以刺激T细胞的生长。IL-7与IL-7受体结合，IL-7受体是由IL-7受体α和共用γ链受体(common gamma chain receptor)组成的异二聚体，其在一系列信号中对T细胞的胸腺内发育和外周存活具有重要作用。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific，Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：6)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括其人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri,Blood 2001,97,14-32中，其公开内容在此引入作为参考。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚单位。重组人IL-15是非糖基化多肽单链，含有114个氨基酸(和N-末端甲硫氨酸)，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-230-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific,Inc.(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQID NO：7)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)指称为白细胞介素-21的多效细胞因子蛋白，并且包括所有形式的IL-21，包括其人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc.2014,13,379-95，其公开内容在此引入作为参考。IL-21主要由自然杀伤T细胞和活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21是非糖基化多肽单链，含有132个氨基酸，分子量为15.4kDa。重组人IL-21可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific,Inc.(人IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQID NO：8)。
术语“有效量”或者“治疗有效量”指如本文所述的化合物或者化合物组合的量足够实现预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可根据预期应用(体外、体内和离体)或者所治疗的受试者和疾病状况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度或者施用方式而变化。该术语还适用于会在靶细胞中诱导特定应答(例如血小板粘附和/或细胞迁移的减少)的剂量。具体剂量将取决于所选择的具体化合物、要遵循的施用方案、化合物是否与其他化合物联合施用、施用时间、施用组织以及携带化合物的物理递送系统。
如本文所使用的术语“治疗效果”涵盖治疗益处和/或预防益处。预防作用包括：延迟或消除疾病或病症的出现，延迟或消除疾病或病症的症状的发作，减慢、停止或逆转疾病或病症的进展，或它们的任何组合。
术语“药学上可接受的载体”或者“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有的溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，以及惰性成分。此种药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂对活性药物成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则可预期其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分(例如其他药物)也可以掺入所述组合物和方法中。
当本文中使用范围来描述例如物理或化学性质(例如分子量或化学式)时，旨在包括范围的所有组合和子组合以及其中的具体实施方式。当指代数字或数值范围时，术语“约”的使用意指所指代的数字或数值范围在实验可变性内(或在统计实验误差内)的近似值，因此该数值或数字范围可以变化。该变化通常为所述数值或数值范围的0％至15％、优选为0％至10％、更优选为0％至5％。术语“包括”(以及相关术语，例如“包含”、“含有”或“具有”或“涵盖”)包括那些实施方式，例如“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”的任何物质、方法或过程的实施方式。
本发明的化合物还包括抗体。术语“抗体”及其复数形式的“抗体”指完整的免疫球蛋白及其任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”还指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的VH和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR))，其可散布有更保守的区域(称为框架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原表位相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”)指保留与抗原特异性结合能力的抗体的一个以上片段(例如IL-33、ST2、CD20、PD-1、PD-L1或PD-L2)。已显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，该片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，该片段是包含两个Fab片段的二价片段，这两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接；(iii)Fd片段，该片段由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，该片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)结构域抗体(dAb)片段(Ward等，Nature，1989，341，544-546)，该片段由VH或VL结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由不同基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，从而使它们成为单条蛋白链，其中，VL和VH区配对形成单价分子，称为单链Fv(scFv)；例如，参见Bird等，Science，1988，242：423-426和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85：5879-5883。此种scFv抗体还意在包含在抗体的术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”之内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，该片段的效用以与完整抗体相同的方式筛选。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中，框架区和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人抗体”不意图包括这样的抗体：该抗体中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列被嫁接到人框架序列。
术语“人单克隆抗体”指具有可变区的表现出单一结合特异性的抗体，其中，框架区和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的与无限增殖化细胞融合的B细胞，所述B细胞的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体；(b)从宿主细胞(如转染瘤)分离的抗体，该宿主细胞被转化以表达人抗体；(c)从重组的组合人源抗体文库中分离的抗体；以及(d)通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有可变区，其中，框架和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方式中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列：尽管它们源自人种系VH和VL序列并与之相关，但在体内人抗体种系库中可能不自然存在。
如本文所用，“同种型(isotype)”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。在哺乳动物中，有五种抗体同种型：IgA、IgD、IgG、IgM和IgE。在人类中，IgG同种型有四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgA同种型有两个亚类：IgA1和IgA2。
在本文中，短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”指与治疗部分缀合的抗体或其片段，例如细菌毒素、细胞毒性药物或含放射性核素的毒素。可使用本领域可用的方法将有毒部分与本发明的抗体缀合。
术语“人源化抗体(单数)”、“人源化抗体(复数)”和“人源化”意指这样的抗体：该抗体中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列被嫁接到人框架序列上。可在人框架序列内进行其他框架区修饰。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是包含来自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，受体的高变区的残基被非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的具有所需特异性、亲和力和能力的15个高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个(通常两个)可变结构域，其中，全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可选地包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。有关更多细节，参见Jones等，Nature 1986，321：522-525；Riechmann等，Nature 1988，332：323-329；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.1992，2：593-596。
术语“嵌合抗体”意指这样的抗体：该抗体中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一物种，例如可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列源自人抗体的抗体。
“双抗体(diabody)”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。该片段包含同一多肽链中相连的轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用接头(该接头太短以至于不允许同一条链上两个结构域配对)，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。例如，欧洲专利号EP 404,097、国际专利公开号WO 93/11161以及Bolliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90：6444-6448中更充分地描述了双抗体。
术语“糖基化”指修饰的抗体衍生物。非糖基化(aglycoslated)抗体缺乏糖基化。例如，可以改变糖基化以增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内一个以上糖基化位点来实现。例如，可进行一个以上氨基酸取代，导致消除一个以上可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。如美国专利号5,714,350和6,350,861中所述，非糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。另外地或替代地，可制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基(fucosyl)残基量减少的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或平分型(bisecting)GlcNac结构增加的抗体。已证明此种改变的糖基化模式增加了抗体的能力。例如，此种碳水化合物修饰可通过在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。本领域中已描述了糖基化机制改变的细胞，该细胞可用作表达本发明的重组抗体从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺少岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系通过使用两个置换型载体(replacement vector)靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生(例如，参见美国专利公开号2004/0110704或Yamane-Ohnuki等，Biotechnol.Bioeng，2004，87：614-622)。作为另一个实例，欧洲专利号EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因(编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得在此种细胞系中表达的抗体通过减少或消除α-1,6键相关的酶而显示出低岩藻糖基化；该专利还描述了对于将岩藻糖添加到N-乙酰氨基葡萄糖(结合抗体的Fc区)具有低酶活性或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。国际专利公开号WO03/035835描述了变体CHO细胞系(Lec 13细胞)，其将岩藻糖附着于Asn(297)-连接的碳水化合物的能力降低，还导致该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields等，J.Biol.Chem.2002，277：26733-26740)。国际专利公开号WO 99/54342描述了被工程化为表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，从而导致抗体的ADCC活性增加(参见Umana等，Nat.Biotech.1999，17：176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶将抗体的岩藻糖残基切掉。例如，如Tarentino等，Biochem.1975，14：5516-5523中所述，岩藻糖苷酶(α-L-岩藻糖苷酶)可从抗体中去除岩藻糖基残基。
“聚乙二醇化”指：在一个以上PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，修饰的抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的活性酯或醛衍生物)典型地发生反应。聚乙二醇化可以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已被用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可以是非糖基化抗体。聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明所述的抗体，如欧洲专利号EP0154316和EP 0401384以及美国专利号5,824,778中所述。
术语“生物仿制药”指这样的生物制品：尽管临床上非活性成分存在微小差异，它与美国许可的参考生物产品高度相似，并且就产品的安全性、纯度和效力而言，该生物制品和参考产品之间在临床上没有有意义的差异。此外，生物类似或“生物仿制”药是一种生物制药，其与已经被欧洲药品管理局授权使用的另一种生物制药类似。“生物仿制药”一词也被其他国家和地区监管机构同义使用。生物制品或生物制药是由生物源(例如细菌或酵母)制造或衍生的药物。它们可以由相对小的分子组成，例如人胰岛素或促红细胞生成素，或复杂分子例如单克隆抗体。例如，如果参考抗CD20单克隆抗体是利妥昔单抗(rituximab)，则由药物监管机构批准的关于利妥昔单抗的抗CD20单克隆抗体“生物相似于”利妥昔单抗或是利妥昔单抗的“生物仿制药”。在欧洲，生物类似或“生物仿制”药是一种生物制药，它类似于已经被欧洲药品管理局(EMA)授权使用的另一种生物制药。经修订，欧洲用于类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)第726/2004号第6条和指令第2001/83/EC号第10(4)条，因此在欧洲，根据法规(EC)第726/2004号第6条和指令第2001/83/EC号第10(4)条的规定，生物仿制药可以被授权或允许进行授权或作为用于授权的申请主题。已经授权的原始生物医药产品在欧洲可称为“参考药物产品”。CHMP生物仿制药产品指南中概述了将产品视为生物仿制药的一些要求。此外，产品具体指南(包括与单克隆抗体生物仿制药有关的指南)由EMA以产品为基础提供，并在其网站上公布。在质量特征、生物活性、作用机制、安全性和/或功效方面，本文所述的生物仿制药可以与参考药物产品类似。另外，生物仿制药可以用于或旨在用于治疗与参考药物产品相同的病症。因此，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的质量特征。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的生物活性。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的安全性。或者，或另外，可以认为如本文所述的生物仿制药具有与参考药物产品类似或高度相似的功效。如本文所述，将欧洲的生物仿制药与已经由EMA授权的参考药物产品进行比较。然而，在某些情况下，在某些研究中可以将生物仿制药与已经在欧洲经济区之外授权的生物医药产品(非欧洲经济区授权的“比较物”)进行比较。这些研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所用，术语“生物仿制药”还涉及已经或可以与非EEA授权的比较物比较的生物医药产品。某些生物仿制药是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如，抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物仿制药可具有在氨基酸结构中具有不显著影响多肽功能的微小修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)的氨基酸序列。生物仿制药可包含与其参考药物产品的氨基酸序列具有97％以上序列同一性的氨基酸序列，例如97％、98％、99％或100％。生物仿制药可包含一种以上与参考药物产品的翻译后修饰不同的翻译后修饰，例如但不限于，糖基化、氧化、脱酰胺和/或截短，条件是该不同不会导致药品的安全性和/或功效发生变化。生物仿制药可具有与参考药物产品相同或不同的糖基化模式。特别地，尽管不是唯一的，如果差异涉及或旨在解决与参考药物产品相关的安全问题，则生物仿制药可具有不同的糖基化模式。另外，生物仿制药可以在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈递方面偏离参考药物产品，条件是不损害药品的安全性和功效。与参考药物产品相比，生物仿制药可包括例如药代动力学(PK)和/或药效学(PD)概况的差异，但仍被认为与参考药物产品足够相似，以获得授权或认为适合授权。在某些情况下，与参考药物产品相比，生物仿制药表现出不同的结合特性；其中，管理机构如EMA认为不同的结合特性不是生物类似产品授权的障碍。术语“生物仿制药”也被其他国家和地区监管机构同义使用。
术语“血液恶性肿瘤(hematological malignancy)”指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于ALL、CLL、SLL、急性髓样白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”指影响B细胞的血液恶性肿瘤。
术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。术语“实体瘤癌症”指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
术语“液体肿瘤”指本质上是流体的异常细胞团。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液恶性肿瘤。从液体肿瘤获得的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
如本文所用，术语“微环境”可以指整个的实体瘤或血液肿瘤微环境，或指微环境内的单个细胞亚群。如本文所用，肿瘤微环境指“促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、促进治疗抵抗力并为显性转移灶的繁殖提供利基的细胞、可溶性因子、信号分子、细胞外基质以及机制线索”的复杂混合物，如Swartz等，Cancer Res.，2012，72，2473中所述。尽管肿瘤表达应该被T细胞识别到的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统很少清除肿瘤。
在一个实施方式中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，在输注本发明的TIL之前用非清髓性化疗预治疗患者。在一些实施方式中，可以提供TIL群；其中，在输注本发明的TIL之前，用非清髓性化疗对患者进行预治疗。在一个实施方式中，非清髓性化疗是环磷酰胺60mg/kg/天、持续2天(TIL输注前第27和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/天、持续5天(TIL输注前第27至第23天)。在一个实施方式中，在根据本发明的非清髓性化疗和TIL输注(在第0天)后，患者以720,000IU/kg每8小时接受一次IL-2的静脉输注，直至生理耐受。
实验发现表明，过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前的淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争成分(“细胞因子沉降”)而在增强治疗疗效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的rTIL之前对患者使用淋巴耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。
在两个以上核酸或多肽的情况下，术语“序列同一性”，“百分比同一性”和“序列百分比同一性”(或其同义词，例如“99％相同”)指，当比较和比对(视需要的话，引入缺口)以获得最大对应性时，两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查，来测量同一性百分比。本领域已知各种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。测定序列同一性百分比的合适程序包括，例如可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站获得的BLAST程序套件。可以使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(加利福尼亚州南旧金山的Genentech)或可从DNASTAR获得的MegAlign是可用于比对序列的其他公共可用软件程序。本领域技术人员可通过特定的比对软件确定用于最大比对的适当参数。在某些实施方式中，使用比对软件的默认参数。
本发明的某些实施方式包含抗体(例如抗IL-33或抗ST2抗体和/或抗CD20抗体和/或抗PD-1抗体、PD-L1抗体和/或抗PD-L2抗体)的变体。如本文所用，术语“变体”包括但不限于如下的抗体：其通过在参考抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置处的一个以上取代、缺失和/或添加而包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体的氨基酸序列可包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如取代相似带电荷或不带电荷的氨基酸。该变体保留了特异性结合参考抗体的抗原的能力。
为避免疑义，本文旨在将结合本发明的特定方面、实施方式或实施例描述的特定特征(例如整数、特征、值、用途、疾病、配方、化合物或组)理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。因此，这些特征可以在适当时与本文所定义的任何定义、权利要求或实施方式结合使用。本说明书中公开的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些特征和/或步骤互斥的组合。本发明不限于任何公开的实施方式的任何细节。本发明延伸到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的任何新特征或特征的新组合，或延伸到如此公开的任何方法或过程的任何新步骤或任何步骤的新组合。
肿瘤的冷冻保存方法
本发明提供了冷冻保存肿瘤组织以生产肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(i)破碎肿瘤组织；
(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。
在一个实施方式中，将肿瘤组织破碎成直径为约1.5mm至约6mm的近似球形的碎片。在一个优选实施方式中，近似球形的碎片的直径为约6mm。在一个实施方式中，近似球形的碎片的直径为约3mm。
在一些实施方式中，将肿瘤组织破碎成最短边缘长度为至少1.5mm、最长边缘长度为约6mm的大致矩形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤组织破碎成边缘长度为约1.5mm至6mm的大致立方体的碎片。在一个实施方式中，大致立方体的碎片的边缘长度为约6mm。在一个实施方式中，大致立方体的碎片的边缘长度为约3mm。
在一些实施方式中，修剪组织样品以将非肿瘤组织与肿瘤组织分离。
在一些实施方式中，肿瘤组织来自解剖的肿瘤。在一个实施方式中，肿瘤组织来自肿瘤活检。在一些实施方式中，肿瘤组织来自切口活检(incisional biopsy)。在一些实施方式中，肿瘤组织来自切除活检(excisional biopsy)。在一些实施方式中，肿瘤组织可来自一个以上芯针活检(core needle biopsy)。
在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成横截面为约1.5mm×1.5mm、约2mm×2mm、约2.5mm×2.5mm、约3mm×3mm、约3.5mm×3.5mm、约4mm×4mm、约4.5mm×4.5mm、约5mm×5mm、约5.5mm×约5.5mm或约6mm×约6mm的碎片。
在一个实施方式中，肿瘤组织为不到12小时大(old)。在一个实施方式中，肿瘤组织不到8小时大。在一个实施方式中，肿瘤组织不到3小时、不到2小时或不到1小时大。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含2％v/v至12％v/v(体积：体积)的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％v/v DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含10％v/v DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％v/v至10％v/v DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％v/v、2％v/v、3％v/v、4％v/v、5％v/v、6％v/v、7％v/v、8％v/v、9％v/v、10％v/v、11％v/v、12％v/v、13％v/v、14％v/v和15％v/v。在一些前述实施方式中，冷冻保存培养基的其余部分是水性培养基。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含2％w/w至12％w/w(重量：重量)的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％w/w的DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含10％w/w的DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％w/w至10％w/w DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％w/w、2％w/w、3％w/w、4％w/w、5％w/w、6％w/w、7％w/w、8％w/w、9％w/w、10％w/w、11％w/w、12％w/w、13％w/w、14％w/w和15％w/w。在一些前述实施方式中，冷冻保存培养基的其余部分是水性培养基。
在一个实施方式中，冷冻保存培养基包含至少一种抗微生物剂(antimicrobialagent)。在一个实施方式中，至少一种抗微生物剂是庆大霉素，其浓度为至少50μg/mL。在一些实施方式中，至少一种抗微生物剂是青霉素；在一些实施方式中，至少一种抗微生物剂是链霉素。在一些实施方式中，至少一种抗微生物剂是抗真菌剂。在一些实施方式中，抗真菌剂是两性霉素B。在一些实施方式中，抗真菌剂是FunginTM。在一些实施方式中，使用抗微生物剂的组合。在一些实施方式中，至少一种抗真菌剂与一种以上抗细菌剂组合使用。
在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育肿瘤碎片约20分钟至约70分钟。在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育肿瘤碎片约30分钟至约60分钟。在一些实施方式中，孵育至少10分钟；至少20分钟；至少25分钟；至少30分钟；至少35分钟；至少40分钟；至少45分钟；至少50分钟；至少55分钟；至少60分钟；或至少70分钟。在一些实施方式中，孵育约10分钟；约20分钟；约25分钟；约30分钟；约35分钟；约40分钟；约45分钟；约50分钟；约55分钟；约60分钟；或约70分钟。在一些实施方式中，孵育少于10分钟；少于20分钟；少于25分钟；少于30分钟；少于35分钟；少于40分钟；少于45分钟；少于50分钟；少于55分钟；少于60分钟；或少于70分钟。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片密度成正比。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片的表面积体积比成正比。
在一些实施方式中，在约2℃至约8℃的温度下在冷冻保存培养基中孵育肿瘤碎片。
在一些实施方式中，用生理缓冲等渗盐溶液洗涤肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次连续洗涤后均更换生理缓冲等渗盐溶液。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Hank平衡盐溶液(HBSS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Tris缓冲盐溶液(TBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包含Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(DPBS)。在一些实施方式中，一次连续洗涤中的生理缓冲等渗盐溶液可以是与一次或多次其他连续洗涤中所用生理缓冲等渗盐溶液不同的生理缓冲等渗盐溶液。
在一个实施方式中，冷冻在约-125℃至约-196℃的温度进行。在一个实施方式中，冷冻在约-140℃至约-185℃的温度下进行。在一个实施方式中，冷冻在约-140℃至约-175℃的温度下进行。在一个实施方式中，冷冻在约-145℃的温度下进行。在一些实施方式中，冷冻在液氮的蒸汽相中进行。
本领域公知的一个问题是在冷冻过程期间不损伤细胞或组织的情况下对它们进行冷冻保存。不受理论的束缚，冷冻期间损伤的一种来源是细胞内冰核化，导致细胞破裂。Muldrew和McGann在“The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezinginjury”，Biophysical Journal 1994，66：532-41中概述了针对细胞冷冻保存(特别是整个组织冷冻保存)这一公知且广为人知的困难的定量理论(quantitative theory)。Acker和McGann在后来的文章“Membrane damage occurs during the formation ofintracellular ice”，Cryo Letter2001，22：241-54中进一步发展了细胞内冰形成和细胞损伤的基本机制。
检测了冷冻期间的损伤，其中，在解冻时，组织已基本上丧失了其生理结构，或构成组织的细胞已基本上丧失其活力。活力可通过引入培养基中的细胞与产生或显示正常细胞功能标志物的此类细胞的数量相比的分数来确定。本领域已知许多用于鉴定活细胞分数的方法，例如但不限于染料拒染试验(例如台盼蓝拒染)。例如，参见Strober，Curr.Protoc.Immunol.，2001，附录3B，可访问https://dx.doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs21。不受限制，活力也可通过代谢活性测定法(例如MTT测定法)来确定，其中，MTT即3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑被细胞酶代谢成甲腊(formazan)。此种酶促反应将黄色的MTT转变为紫色的甲腊。例如，参见Berridge等，Tetrazolium dyes as tools in cell biology:new insights into their cellularreduction，Biotechnology Annual Review，2005，11:127-152；Mosmann，“Rapidcolorimetric assay for cellular growth and survival:application toproliferation and cytotoxicity assays”，J.Immunol.Methods，1983，65(1-2)：55-63。
不受理论的束缚，推测缓慢冷却会产生无害的细胞内冰，参见Acker和McGann，“Protective effect of intracellular ice during freezing？”，Cryobiology，2003，46(2)：197-202。在没有过度细胞损伤的情况下实现冷冻或在不显著降低细胞活力的情况下实现冷冻的常规方法是采用缓慢的冷冻速率。Watson等的美国专利5,891,617强调了此种方法，例如权利要求1的步骤(c)教导了非常慢的冷却速度：“约-0.3℃/分钟以下”。类似地，Comhaire等的美国专利9,938,495教导了干细胞“使用不含DMSO的冷冻保存培养基通过缓慢冷冻获得解冻后的高细胞活力”。
基于这些示例性教导，本公开的方法和产品是令人惊讶和出乎意料的。此外，本公开(包括实施例和其中的数据)证明了以下问题的解决方案：快速且有效地冷冻保护肿瘤组织、肿瘤碎片或肿瘤样品，以用于生产用于治疗用途的肿瘤浸润淋巴细胞。
在一些实施方式中，冷冻保存肿瘤组织以制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法还包括步骤(iv)：在低于至少-130℃的温度下储存冷冻的碎片。在一些实施方式中，冷冻的碎片储存在液氮的蒸汽相中。在一些实施方式中，将冷冻的碎片浸没在液氮中储存。在一些实施方式中，储存冷冻保存的碎片用于随后制备用于自体治疗用途的TIL。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约20分钟至约70分钟；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；以及
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)破碎肿瘤样品；
(b)在储存培养基中孵育肿瘤碎片；
(c)以冷冻状态储存肿瘤碎片；
(d)解冻肿瘤碎片；
(e)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基处理肿瘤碎片，产生TIL；
(f)取出至少多个TIL；以及
(g)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，储存培养基包含2％v/v至12％v/v(体积：体积或体积比体积)的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，储存培养基包含5％v/v的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含10％v/v的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含5％v/v至10％v/v的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％v/v、2％v/v、3％v/v、4％v/v、5％v/v、6％v/v、7％v/v、8％v/v、9％v/v、10％v/v、11％v/v、12％v/v、13％v/v、14％v/v和15％v/v。在一些前述实施方式中，储存培养基的其余部分是水性培养基。
在一些实施方式中，储存培养基包含2％w/w至12％w/w(重量：重量或重量比重量)的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，储存培养基包含5％w/w的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含10％w/w的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含5％w/w至10％w/w的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％w/w、2％w/w、3％w/w、4％w/w、5％w/w、6％w/w、7％w/w、8％w/w、9％w/w、10％w/w、11％w/w、12％w/w、13％w/w、14％w/w和15％w/w。在一些前述实施方式中，储存培养基的其余部分是水性培养基。
在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约20分钟至约70分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织30分钟至约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约15分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约30分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约45分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约75分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织60分钟。
在一些实施方式中，储存培养基包含约5％v/v的DMSO，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。在一些实施方式中，储存培养基包含约10％v/v的DMSO，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟至约60分钟。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片密度成正比。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片的表面积体积比成正比。
冷冻保存的肿瘤碎片
在一些实施方式中，本发明提供了用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：
(i)破碎肿瘤样品；
(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。
在一些实施方式中，本发明提供了用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：
(i)破碎肿瘤样品；
(ii)在约2℃至约8℃的温度下，在包含10％v/v DMSO的冷冻保存培养基中孵育碎片约20分钟至约70分钟；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。
在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成直径为约1.5mm至6mm的近似球形的碎片。在一个实施方式中，近似球形的碎片的直径为约6mm。在一个实施方式中，近似球形的碎片的直径为约3mm。在一个实施方式中，近似球形的碎片的直径选自下组：约20mm、约19mm、约18mm、约17mm、约16mm、约15mm、约14mm、约13mm、12mm、约11mm、约10mm、约9mm、约8mm、约7mm、约6mm、约5mm、约4mm、约3mm、约2mm和约1mm。
在一些实施方式中，将肿瘤样品破碎成最短边缘长度为至少1.5mm、最长边缘为约6mm的大致矩形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成边缘长度为约1.5mm至6mm的大致立方体的碎片。在一个实施方式中，大致立方体的碎片的边缘长度为约6mm。在一个实施方式中，大致立方体的碎片的边缘长度为约3mm。在一个实施方式中，大致立方体的碎片的边缘长度选自下组：约20mm、约19mm、约18mm、约17mm、约16mm、约15mm、约14mm、约13mm、约12mm、约11mm、约10mm、约9mm、约8mm、约7mm、约6mm、约5mm、约4mm、约3mm、约2mm和约1mm。
在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约2mm3至约200mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约5mm3至约150mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约25mm3至约150mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约50mm3至约150mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约100mm3至约125mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约50mm3至约75mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约75mm3至约100mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约200mm3至约1000mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，将肿瘤样品破碎成体积为约500mm3至约800mm3的近似球形的碎片。在一个实施方式中，近似球形的碎片的直径选自下组：约20mm、约19mm、约18mm、约17mm、约16mm、约15mm、约14mm、约13mm、12mm、约11mm、约10mm、约9mm、约8mm、约7mm、约6mm、约5mm、约4mm、约3mm、约2mm和约1mm。
在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成碎片，其中，碎片的横截面为约1.5mm×1.5mm、约2mm×2mm、约2.5mm×2.5mm、约3mm×3mm、约3.5mm×3.5mm、约4mm×4mm、约4.5mm×4.5mm、约5mm×5mm、约5.5mm×约5.5mm、约6mm×6mm、约6.5mm×6.5mm、约7mm×7mm、约7.5mm×7.5mm、约8mm×8mm、约8.5mm×8.5mm、约9mm×9mm、约9.5mm×9.5mm、约10mm×10mm、约10.5mm×10.5mm、约11mm×11mm、约11.5mm×11.5mm或约12mm×12mm。
在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成碎片，其中，碎片的横截面积为约2mm2至约3mm2、约3mm2至约4mm2、约4mm2至约5mm2、约5mm2至约6mm2、约6mm2至约7mm2、约7mm2至约8mm2、约8mm2至约9mm2、约9mm2至约10mm2、约10mm2至约11mm2、约11mm2至约12mm2、约12mm2至约20mm2、约20mm2至约50mm2、约50mm2至约100mm2或约100mm2至约500mm2。在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成碎片，其中，碎片的横截面积为约1.5mm2、约2mm2、约2.5mm2、约3mm2、约3.5mm2、约4mm2、约4.5mm2、约5mm2、约5.5mm2、约6mm2、约6.5mm2、约7mm2、约7.5mm2、约8mm2、约8.5mm2、约9mm2、约9.5mm2、约10mm2、约10.5mm2、约11mm2、约11.5mm2、约12mm2、约20mm2、约25mm2、约30mm2、约40mm2、约50mm2、约100mm2、约200mm2、约300mm2、约400mm2、约500mm2、约750mm2或约1000mm2。
在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成碎片，其中，碎片的体积为约2mm3至约3mm3、约3mm3至约4mm3、约4mm3至约5mm3、约5mm3至约6mm3、约6mm3至约7mm3、约7mm3至约8mm3、约8mm3至约9mm3、约9mm3至约10mm3、约10mm3至约11mm3、约11mm3至约10mm3 12mm3或约12mm3至约20mm3。在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成碎片，其中，碎片的体积为约1.5mm3、约2mm3、约2.5mm3、约3mm3、约3.5mm3、约4mm3、约4.5mm3、约5mm3、约5.5mm3、约6mm3、约6.5mm3、约7mm3、约7.5mm3、约8mm3、约8.5mm3、约9mm3、约9.5mm3、约10mm3、约10.5mm3、约11mm3、约11.5mm3、约12mm3、约20mm3、约25mm3、约30mm3、约40mm3、约50mm3、约100mm3、约200mm3、约300mm3、约400mm3、约500mm3、约750mmmm3或约1000mm3。
在一些实施方式中，肿瘤样品来自解剖的肿瘤。在一个实施方式中，肿瘤样品来自肿瘤活检。在一些实施方式中，肿瘤样品来自切口活检。在一些实施方式中，肿瘤样品来自切除活检。在一些实施方式中，肿瘤样品可以来自一个以上芯针活检。
在一个实施方式中，在冷冻之前，肿瘤样品为不到12小时大。在一个实施方式中，在冷冻之前，肿瘤样品为不到8小时大。在一个实施方式中，在冷冻之前，肿瘤样品肿瘤组织为不到3小时、不到2小时或不到1小时大。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含2％v/v至12％v/v(体积：体积或体积比体积)的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％v/v的DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含10％v/v的DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％v/v至10％v/v的DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％v/v、2％v/v、3％v/v、4％v/v、5％v/v、6％v/v、7％v/v、8％v/v、9％v/v、10％v/v、11％v/v、12％v/v、13％v/v、14％v/v和15％v/v。在一些前述实施方式中，冷冻保存培养基的其余部分是水性培养基。
在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含2％w/w至12％w/w(重量：重量或重量比重量)的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％w/w的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含10％w/w的DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含5％w/w至10％w/w的DMSO。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含选自以下百分比的DMSO：1％w/w、2％w/w、3％w/w、4％w/w、5％w/w、6％w/w、7％w/w、8％w/w、9％w/w、10％w/w、11％w/w、12％w/w、13％w/w、14％w/w和15％w/w。在一些前述实施方式中，冷冻保存培养基的其余部分是水性培养基。
在一个实施方式中，冷冻保存培养基包含至少一种抗微生物剂。在一个实施方式中，至少一种抗微生物剂是庆大霉素，其浓度为至少20μg/mL。在一些实施方式中，至少一种抗微生物剂是庆大霉素，其浓度为至少50μg/mL。在一些实施方式中，至少一种抗微生物剂是青霉素；在一些实施方式中，至少一种抗微生物剂是链霉素。在一些实施方式中，至少一种抗微生物剂是抗真菌剂。在一些实施方式中，抗真菌剂是两性霉素B。在一些实施方式中，抗真菌剂是FunginTM。在一些实施方式中，使用抗微生物剂的组合。在一些实施方式中，至少一种抗真菌剂与一种以上抗细菌剂组合使用。
在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育肿瘤碎片约30分钟至约60分钟。在一些实施方式中，孵育至少10分钟；至少20分钟；至少25分钟；至少30分钟；约35分钟；约40分钟；约45分钟；约50分钟；约55分钟；或约60分钟。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片密度成正比。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片的表面积体积比成正比。
在一些实施方式中，在约2℃至约8℃的温度下在冷冻保存培养基中孵育肿瘤碎片。
在一些实施方式中，用生理缓冲等渗盐溶液洗涤肿瘤样品。在一些实施方式中，洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次连续洗涤后均更换生理缓冲等渗盐溶液。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Hank平衡盐溶液(HBSS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Tris缓冲盐溶液(TBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包含Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(DPBS)。在一些实施方式中，一次连续洗涤中的生理缓冲等渗盐溶液可以是与一次或多次其他连续洗涤中所用的生理缓冲等渗盐溶液不同的生理缓冲等渗盐溶液。
在一个实施方式中，冷冻在约-125℃至约-180℃的温度下进行。在一个实施方式中，冷冻在约-140℃至约-175℃的温度下进行。在一个实施方式中，冷冻在约-145℃的温度下进行。在一些实施方式中，冷冻在液氮的蒸汽相中进行。
在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为1个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为2个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为3个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为4个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为5个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为6个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为7个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为8个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为9个。在一个实施方式中，以上或此处的任何实施方式所用肿瘤碎片的数量为10个。
由冷冻保存的肿瘤碎片生产TIL
本发明提供了将来自冷冻保存的肿瘤碎片的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)由冷冻保存的肿瘤碎片获得第一TIL群；
(ii)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；以及
(iii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第三TIL群的数量比第二TIL群的数量大至少50倍或100倍；其中，第二次扩增进行至少14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群。
本发明提供了制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基中培养冷冻保存的肿瘤碎片，产生TIL；
(b)在包含经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基中扩增TIL，产生扩大数量的TIL；以及
(c)可选地冷冻保存扩大数量的TIL。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约30分钟；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；以及
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)破碎肿瘤样品；
(b)在约2℃至约8℃的温度下在储存培养基中孵育肿瘤碎片约30分钟；
(c)以冷冻状态储存肿瘤碎片；
(d)解冻肿瘤碎片；
(e)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤碎片，产生TIL；
(f)取出至少多个TIL；以及
(g)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，储存培养基包含2％v/v DMSO至12％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方式中，储存培养基包含5％v/v的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含10％v/v的DMSO。在一些实施方式中，储存培养基包含约5％v/vDMSO至10％v/vDMSO。
在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织30分钟至约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约45分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。
在一些实施方式中，在储存培养基中孵育肿瘤组织约20分钟至约70分钟。在一些实施方式中，在储存培养基中孵育肿瘤组织约30分钟至约60分钟。在一些实施方式中，孵育至少10分钟；至少20分钟；至少25分钟；至少30分钟；约35分钟；约40分钟；约45分钟；约50分钟；约55分钟；或约60分钟。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片密度成正比。在一些实施方式中，孵育时间与肿瘤碎片的表面积体积比成正比。
在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育横截面为约1.5mm×1.5mm的肿瘤碎片约20分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟或少于约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育横截面为约2mm×2mM的肿瘤碎片约20分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟或约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育横截面为约3mm×3mm的肿瘤碎片至少20分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟或约60分钟。在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育横截面为约4mm×4mm的肿瘤碎片约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约60分钟或约70分钟。在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育横截面为约5mm×5mm的肿瘤碎片约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约60分钟或约70分钟。在一些实施方式中，在冷冻保存培养基中孵育横截面为约6mm×6mm的肿瘤碎片至少20分钟、约30分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约60分钟或约70分钟。
在一些实施方式中，储存培养基包含约5％v/v的DMSO，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约60分钟。在一些实施方式中，储存培养基包含约10％v/v的DMSO，在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少约30分钟至约60分钟。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括在包含IL-2的培养基中孵育冷冻保存的肿瘤碎片，其中，TIL的数量扩大。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了100倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了150倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了200倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了250倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约300倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约350倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约400倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约450倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约500倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约550倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约600倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约700倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约750倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约800倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约850倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约900倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约1000倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约1200倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约1500倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约1600倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约2000倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约2100倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约2200倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了约2500倍。在一些实施方式中，TIL的数量扩大了大于2500倍。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织生产TIL的方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(iv)冷冻容器；以及
(v)储存容器，使容器保持冷冻；
(b)解冻容器；
(c)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；以及
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织生产TIL的方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(e)冷冻容器；
(f)储存容器，使容器保持冷冻；
(g)解冻容器；
(h)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(i)取出至少多个TIL；以及
(j)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻保存的肿瘤碎片生产TIL的方法还包括将OKT-3添加至第一培养基。
在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成直径为1.5mm至6mm、厚度为1.5mm至6mm。在其他实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成约6mm×6mm×6mm。在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成横截面为约1.5mm×1.5mm、约2mm×2mm、约2.5mm×2.5mm、约3mm×3mm、约3.5mm×3.5mm、约4mm×4mm、约4.5mm×4.5mm、约5mm×5mm、约5.5mm×约5.5mm或约6mm×6mm的碎片。
在一些实施方式中，储存培养基还包含抗细菌剂。在一些实施方式中，抗细菌剂是庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含浓度为至少20μg/mL的庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含浓度为至少50μg/mL的庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含抗细菌剂、抗真菌剂及它们的组合。在一些实施方式中，抗真菌剂是两性霉素B，含量为约0.25μg/mL至约2.5μg/mL。在一些实施方式中，抗真菌剂是FunginTM，含量为约5μg/mL至约50μg/mL。
在一些实施方式中，用生理缓冲等渗盐溶液洗涤肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次连续洗涤后均更换生理缓冲等渗盐溶液。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Hank平衡盐溶液(HBSS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Tris缓冲盐溶液(TBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包含Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(DPBS)。在一些实施方式中，一次连续洗涤中的生理缓冲等渗盐溶液可以是与一次或多次其他连续洗涤中所用生理缓冲等渗盐溶液不同的生理缓冲等渗盐溶液。
在一些实施方式中，解冻步骤包括将容器浸入37℃水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，冷冻步骤包括在约-125℃至约-195℃下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，方法用来自人类受试者的新鲜肿瘤样品进行。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)组织和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增(或第一次培养)步骤和第二次扩增(或第二次培养)步骤之间的分装。在一个实施方式中，分装发生在约第16天。在一些实施方式中，第一次培养步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(c)至步骤(e)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约21天内完成；在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约16天内完成。
在一些实施方式中，第一培养基包含OKT-3。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(d)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；其中，步骤(c)至步骤(d)的转换在不打开系统的情况下发生；
(e)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，步骤(d)至步骤(e)的转换在不打开系统的情况下发生；
(f)收获从步骤(f)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(e)至步骤(f)的转换在不打开系统的情况下发生；
(g)将来自步骤(f)的收获的TIL群转移至输液袋；其中，步骤(f)至步骤(g)的转换在不打开系统的情况下发生；
(h)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(g)的包含收获的TIL群的输液袋；以及(i)向受试者施用来自步骤(g)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)从受试者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(e)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；
(f)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(g)解冻肿瘤组织；
(h)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来在封闭系统中进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；步骤(h)至步骤(i)的转换在不打开系统的情况下发生；
(j)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；步骤(i)至步骤(j)的转换在不打开系统的情况下发生；
(k)收获从步骤(j)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(j)至步骤(k)的转换在不打开系统的情况下发生；
(l)将步骤(k)中收获的治疗性TIL群转移至输液袋；其中，步骤(k)至步骤(l)的转换在不打开系统的情况下发生；
(m)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(l)的包含治疗性TIL群的输液袋；
(n)解冻来自步骤(m)的输液袋中的治疗性TIL群；以及
(o)向受试者施用来自步骤(n)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，癌症选自：宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤、难治性黑色素瘤、转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：在冷冻之前，在约2℃至约8℃下，在储存培养基中孵育肿瘤组织30分钟；
(c)解冻肿瘤组织；
(d)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(e)取出至少多个TIL；以及
(f)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)在2℃至8℃下，在储存培养基中孵育肿瘤组织30分钟；
(c)以冷冻状态储存肿瘤组织；
(d)解冻肿瘤组织；
(e)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(f)取出至少多个TIL；以及
(g)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)冷冻容器；以及
(v)储存容器，使容器保持冷冻；
(c)解冻容器；
(d)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(e)取出至少多个TIL；以及
(f)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(e)冷冻容器；
(f)储存容器，使容器保持冷冻；
(g)解冻容器；
(h)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(i)取出至少多个TIL；以及
(j)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，用生理缓冲等渗盐溶液洗涤肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次连续洗涤后均更换生理缓冲等渗盐溶液。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Hank平衡盐溶液(HBSS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括Tris缓冲盐溶液(TBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包括磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。在一些实施方式中，生理缓冲等渗盐溶液包含Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液(DPBS)。在一些实施方式中，一次连续洗涤中的生理缓冲等渗盐溶液可以是与一次或多次其他连续洗涤中所用生理缓冲等渗盐溶液不同的生理缓冲等渗盐溶液。
在一些实施方式中，解冻步骤包括将容器浸入37℃的水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，冷冻步骤包括在约-125℃至约-195℃下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)组织和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增(或第一次培养)步骤和第二次扩增(或第二次培养)步骤之间的分装。在一个实施方式中，分装发生在约第16天。在一些实施方式中，第一次培养步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约21天内完成；在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约16天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)从受试者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(c)解冻肿瘤组织；
(d)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(e)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；其中，步骤(d)至步骤(e)的转换在不打开系统的情况下发生；
(f)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，步骤(e)至步骤(f)的转换在不打开系统的情况下发生；
(g)收获从步骤(f)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(f)至步骤(g)的转换在不打开系统的情况下发生；
(h)将来自步骤(g)的收获的TIL群转移至输液袋；其中，步骤(g)至步骤(h)的转换在不打开系统的情况下发生；
(i)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(h)的包含收获的TIL群的输液袋；以及(j)向受试者施用来自步骤(i)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)从受试者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(e)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；
(f)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(g)解冻肿瘤组织；
(h)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(i)在封闭系统中，通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；步骤(h)至步骤(i)的转换在不打开系统的情况下发生；
(j)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；步骤(i)至步骤(j)的转换在不打开系统的情况下发生；
(k)收获从步骤(j)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(j)至步骤(k)的转换在不打开系统的情况下发生；
(l)将步骤(k)中收获的治疗性TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(k)至步骤(l)的转换在不打开系统的情况下发生；
(m)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(l)的包含治疗性TIL群的输液袋；
(o)解冻来自步骤(m)的输液袋中的治疗性TIL群；以及
(p)向受试者施用来自步骤(o)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)冷冻容器；以及
(v)储存容器，使容器保持冷冻；
(b)解冻容器；
(c)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；以及
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(e)冷冻容器；
(f)储存容器，使容器保持冷冻；
(g)解冻容器；
(h)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(i)取出至少多个TIL；以及
(j)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成直径为1.5mm至6mm、厚度为约1.5mm至约6mm。在其他实施方式中，将新鲜肿瘤组织修剪成约6mm×6mm×6mm。
在一些实施方式中，储存培养基还包含抗细菌剂。在一些实施方式中，抗细菌剂是庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含浓度为至少20μg/mL的庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含浓度为至少50μg/mL的庆大霉素。在一些实施方式中，储存培养基包含抗细菌剂、抗真菌剂及它们的组合。在一些实施方式中，抗真菌剂是两性霉素B，含量为约0.25μg/mL至约2.5μg/mL。在一些实施方式中，抗真菌剂是Fungin，含量为约5μg/mL至约50μg/mL。
在一些实施方式中，在进行方法的修剪步骤之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤新鲜的肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括至少三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次洗涤后均更换HBSS。
在一些实施方式中，解冻步骤包括将容器浸入37℃水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，冷冻步骤包括在约-125℃至约-195℃下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，用来自人类受试者的新鲜肿瘤样品进行方法。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增(或第一次培养)步骤和第二次扩增(或第二次培养)步骤之间的分装。在一个实施方式中，分装发生在第16天。在一些实施方式中，第一次培养步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(c)至步骤(e)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在21天内完成；在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(c)至步骤(e)或步骤(h)至步骤(j)(如适用)在约16天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(d)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；其中，步骤(c)至步骤(d)的转换在不打开系统的情况下发生；
(e)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，步骤(d)至步骤(e)的转换在不打开系统的情况下发生；
(f)收获从步骤(f)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(e)至步骤(f)的转换在不打开系统的情况下发生；
(g)将来自步骤(f)的收获的TIL群转移至输液袋；其中，步骤(f)至步骤(g)的转换在不打开系统的情况下发生；
(h)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(g)的包含收获的TIL群的输液袋；以及(i)向受试者施用来自步骤(g)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)从受试者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(e)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；
(f)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(g)解冻肿瘤组织；
(h)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；步骤(h)至步骤(i)的转换在不打开系统的情况下发生；
(j)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；步骤(i)至步骤(j)的转换在不打开系统的情况下发生；
(k)收获从步骤(j)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(j)至步骤(k)的转换在不打开系统的情况下发生；
(l)将步骤(k)中收获的治疗性TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(k)至步骤(l)的转换在不打开系统的情况下发生；
(m)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(l)的包含治疗性TIL群的输液袋；
(n)解冻来自步骤(m)的输液袋中的治疗性TIL群；以及
(o)向受试者施用来自步骤(n)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，癌症选自：宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤、难治性黑色素瘤、转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：在冷冻之前，在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约20分钟至约70分钟；
(c)解冻肿瘤组织；
(d)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(e)取出至少多个TIL；以及
(f)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
本发明提供了由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约20分钟至约70分钟；
(c)以冷冻状态储存肿瘤组织；
(d)解冻肿瘤组织；
(e)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(f)取出至少多个TIL；以及
(g)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)冷冻容器；以及
(v)储存容器，使容器保持冷冻；
(c)解冻容器；
(d)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(e)取出至少多个TIL；以及
(f)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
在一些实施方式中，在进行修剪组织的步骤之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤新鲜的肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括至少三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次洗涤后均更换HBSS。
在一些实施方式中，解冻步骤包括将容器浸入37℃水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，冷冻步骤包括在约-125℃至约-195℃下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增(或第一次培养)步骤和第二次扩增(或第二次培养)步骤之间的分装。在一个实施方式中，分装发生在第16天。在一些实施方式中，第一次培养步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(e)至步骤(g)(如适用)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(e)至步骤(g)(如适用)在约21天内完成；在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(e)至步骤(g)(如适用)在约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(d)至步骤(f)或步骤(e)至步骤(g)(如适用)在约16天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，这些方法包括：
(a)从受试者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(c)解冻肿瘤组织；
(d)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(e)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；其中，步骤(d)至步骤(e)的转换在不打开系统的情况下发生；
(f)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，步骤(e)至步骤(f)的转换在不打开系统的情况下发生；
(g)收获从步骤(f)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(f)至步骤(g)的转换在不打开系统的情况下发生；
(h)将来自步骤(g)的收获的TIL群转移至输液袋；其中，步骤(g)至步骤(h)的转换在不打开系统的情况下发生；
(i)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(h)的包含收获的TIL群的输液袋；以及(j)向受试者施用来自步骤(i)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
在一些实施方式中，在进行储存肿瘤组织的方法的步骤(i)之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤新鲜的肿瘤组织。在一些实施方式中，洗涤包括至少三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次洗涤后均更换HBSS。
在一些实施方式中，步骤(c)包括将容器浸入37℃的水浴中约5分钟。
在一些实施方式中，储存肿瘤组织的方法的步骤(iv)包括在约-125℃至约-195℃的温度下冷冻容器。在一些实施方式中，在约-125℃至约-150℃下冷冻容器；在一些实施方式中，在约-125℃至约-145℃下冷冻容器；在其他实施方式中，在约-135℃下冷冻容器。
在一些实施方式中，肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、子宫内膜肿瘤组织、甲状腺肿瘤组织、卵巢肿瘤组织、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和HPV阳性肿瘤组织。
在一些实施方式中，方法还包括在第一次扩增(或第一次培养)步骤和第二次扩增(或第二次培养)步骤之间的分装。在一个实施方式中，分装发生在第16天。在一些实施方式中，第一次培养步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约7天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约14天内完成。在一些实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约22天内完成。在其他实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约21天内完成；在一些实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约20天内完成；在一些实施方式中，步骤(e)至步骤(g)在约16天内完成。
在一些实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约5天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约3天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约5天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约11天内完成。在其他实施方式中，第一次扩增(或第一次培养)步骤在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)步骤在约13天内完成。可选地，可在第二次扩增(或第二次培养)的第5天或第6天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在上述制备或扩增TIL的方法的一些实施方式中，OKT-3从第0天开始存在于培养基中。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的治疗受试者的癌症的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的治疗受试者的癌症的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的治疗受试者的癌症的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约11天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的治疗受试者的癌症的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约11天内完成，在第二次扩增(或第二次培养)的约第5天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成，在第二次扩增(或第二次培养)的约第6天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约11天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约11天内完成，在第二次扩增(或第二次培养)的约第5天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的由冷冻肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成，在第二次扩增(或第二次培养)的约第6天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成，在第二次扩增(或第二次培养)的约第6天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约11天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约5天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约11天内完成，在第二次扩增(或第二次培养)的约第5天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的任何前述方法，使得在第一次扩增(或第一次培养)的步骤中，第一次扩增(或第一次培养)在约3天内完成，第二次扩增(或第二次培养)在约13天内完成，在第二次扩增(或第二次培养)的约第6天，将第二次扩增物(或第二次培养物)分装成两个以上培养物。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的任何前述方法，使得第一次扩增(或第一次培养)在成分明确的(defined)培养基中进行。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的任何前述方法，使得第二次扩增(或第二次培养)在成分明确的培养基中进行。
在一些实施方式中，本发明提供了适当改变的任何前述方法，使得第一次扩增(或第一次培养)和第二次扩增(或第二次培养)在相同或不同的成分明确的培养基中进行。
TIL生产过程
本领域技术人员已知多种TIL扩增方法。例如，Jin等，J.Immunother.，2012，35(3)：283-292，“Simplified Method of the Growth of Human Tumor InfiltratingLymphocytes in Gas permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment”(其公开内容通过引用并入本文)教导了生产用于临床的TIL的简化方法。Jin等教导了第一次TIL培养后进行快速扩增(REP)方案，其结合使本领域技术人员能产生临床上有用的量的TIL。在一些实施方式中，本发明提供了制备TIL的方法，该方法包括以下步骤：冷冻保存肿瘤、解冻肿瘤，以及进行Jin等所述的方法。简而言之，该过程涉及以下过程。可通过酶促肿瘤消化物和锐利解剖产生的肿瘤碎片(约1mm3至8mm3)来开始培养TIL。通过在酶培养基(RPMI1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育然后机械解离(GentleMACS，Miltenyi Biotec，Auburn，CA)产生肿瘤消化物。将肿瘤置于酶培养基中后，立即机械解离约1分钟。然后将材料在37℃、5％CO2下孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟，在37℃、5％CO2下再次孵育30分钟。然后将肿瘤第三次机械破碎约1分钟。如果在第三次机械破碎后存在大块组织，则可以对样品进行1或2次额外的机械解离，进行或不进行在37℃、5％CO2下孵育额外30分钟。在最终孵育结束时，如果细胞悬液中含有大量的红细胞或死细胞，则可以使用Ficoll进行密度梯度分离，去除这些细胞。当在24孔板(Costar 24孔细胞培养簇，平底；康宁公司，康宁，纽约)中开始TIL培养时，每个孔接种在2mL含IL-2的完全培养基(CM)(6000IU/mL；Chiron Corp.，Emeryville，CA)中的1×106个肿瘤消化细胞或1个尺寸为约1mm3至8mm3的肿瘤碎片。CM包含含有GlutaMAX的RPMI 1640并补充有10％的人AB血清、25mM Hepes和约10μg/mL庆大霉素。当在40mL容量、10cm2透气硅底部的透气烧瓶(G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿，明尼苏达州)中开始培养时，每个烧瓶中装有在10至40mL含IL-2的CM中的10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤碎片。G-Rex 10和24孔板均在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中孵育，在培养开始5天后，除去一半培养基并用新鲜的含IL-2的CM替换，第5天后，每2至3天更换一半的培养基。使用T-175烧瓶、透气袋或透气G-Rex烧瓶进行TIL的REP。对于T-175烧瓶中的TIL REP，将悬浮在150mL培养基中的1×106TIL加入每个T-175烧瓶中。将TIL与经辐照(50Gy)的同种异体PBMC(作为“饲养细胞”)以1:100比率一起培养，在CM和AIM-V培养基(50/50培养基)的1:1混合物中培养细胞，补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3。将T-175烧瓶在37℃、5％CO2下孵育。在第5天，使用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在第7天，将来自2个T-175烧瓶的细胞合并在3L袋中，将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V加入300mL TIL悬液中。每天或每两天一次对每个袋中的细胞数量进行计数，添加新鲜培养基以使细胞数量保持在0.5×106至2.0×106细胞/mL。对于容量500mL、100cm2透气硅底部的烧瓶(G-Rex 100，Wilson Wolf)中的TIL REP，将5×106至10×106个TIL与经辐照的同种异体PBMC以1:100比率在400mL50/50培养基中一起培养，培养基中补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3。将G-Rex100烧瓶在37℃、5％CO2下孵育。在第5天，取出250mL上清液，放入离心瓶中，以1500rpm(491g)离心10分钟。TIL沉淀物用150mL新鲜的50/50培养基和3000IU/mL的IL-2重悬并加回到原来的G-Rex 100烧瓶中。当在G-Rex 100烧瓶中连续扩增TIL时，在第7天，用每个烧瓶中存在的300mL培养基悬浮每个G-Rex 100中的TIL，将细胞悬液分成三份100mL等分试样，用于接种3个G-Rex 100烧瓶。向每个烧瓶中加入150mL含5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。将G-Rex 100烧瓶在37℃、5％CO2下孵育，在4天后，将含3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V加入到每个G-Rex 100烧瓶中。在培养的第14天收获细胞。
在一些实施方式中，本发明的扩增方法包括由冷冻的肿瘤制备细胞扩增物。从患者收集肿瘤样品，根据本文公开的方法冷冻保存。准备好扩增细胞时，对于以1/100比例进行的过程，使用37℃水浴将约6个直径2mm至3mm的冷冻肿瘤碎片解冻5+1分钟，然后用无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)(补充有庆大霉素)进行洗涤。然后将碎片放入G-Rex 10M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)或其他透气容器中，G-Rex 10M烧瓶或其他透气容器中装有含约6,000IU/mL rhIL-2的CM1培养基或无血清或成分明确的培养基。将这些pre-REP(或第一次扩增)培养物在37℃培养箱中孵育5天。在第5天，收获pre-REP细胞，通过在装有CM2培养基或无血清或成分明确的培养基(含有3,000IU/mL rhIL-2和30ng/mL OKT-3)的G-Rex 5M烧瓶(Wilson Wolf Mfg.，新布赖顿，明尼苏达州)或其他可透气容器中共培养10％的pre-REP TIL与25×106或50×106PBMC饲养细胞，来开始REP(或第二次扩增)。在第10天，将培养物分装到G-Rex 5M烧瓶或其他透气容器中，含有不超过10×106个细胞。将分装的培养物在含有3,000IU/mL rhIL-2的CM4培养基或其他无血清或成分明确的培养基中孵育另外6天。在第16天，收获细胞并使用CryoStor10(Biolife，美国)冷冻。该过程在本文中称为“早期REP方法1”过程或“ER-1”。
在一些实施方式中，本发明的扩增方法包括由冷冻的肿瘤制备细胞扩增物。从患者收集肿瘤样品，根据本文公开的方法冷冻保存。准备好扩增细胞时，对于以1/100比例进行的过程，使用37℃水浴将约6个直径2mm至3mm的冷冻肿瘤碎片解冻5+1分钟，然后用无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)(补充有庆大霉素)进行洗涤。然后将碎片放入G-Rex 10M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)或其他透气容器中，G-Rex 10M烧瓶或其他透气容器中装有含约6,000IU/mL rhIL-2的CM1培养基或无血清或成分明确的培养基。将这些pre-REP(或第一次扩增)培养物在37℃培养箱中孵育3天。在第3天，收获pre-REP细胞，通过在装有CM2培养基或无血清或成分明确的培养基(含有3,000IU/mL rhIL-2和30ng/mL OKT-3)的G-Rex 5M烧瓶(Wilson Wolf Mfg.，新布赖顿，明尼苏达州)或其他可透气容器中共培养10％的pre-REP TIL与25×106或50×106PBMC饲养细胞来开始REP(或第二次扩增)。在第9天，将培养物分装到G-Rex 5M烧瓶或其他透气容器中，含有不超过10×106个细胞。将分装的培养物在含有3,000IU/mL rhIL-2的CM4培养基或其他无血清或成分明确的培养基中孵育另外7天。在第16天，收获细胞并使用CryoStor10(Biolife，美国)冷冻。该过程在本文中称为“早期REP方法2”过程或“ER-2”。
在一些实施方式中，本发明提供了生产TIL的方法，该方法包括以下步骤：冷冻保存肿瘤、解冻肿瘤和进行以下过程。可通过使用癌症抗原(一种以上例如表位或细胞，包括其抗原性部分)在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)进行快速扩增来产生TIL，该抗原可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15，优选IL-2)的存在下用载体(例如HLA-A2结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gp100:209-217(210M))来表达。通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原进行再刺激，来迅速扩增体外诱导的TIL。或者，例如，可以用经辐照的自体淋巴细胞或经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2对TIL进行再刺激。可以选择能高度强烈地识别由每个肿瘤细胞基因组编码的预估10,000个遗传突变而产生的任何独特抗原的TIL。然而，抗原不需要是独特的。可以选择能高度强烈地识别癌症的一种以上抗原(包括一种以上抗原的抗原部分，例如表位)或癌症细胞的T细胞。“癌症抗原”和“癌症的抗原”旨在涵盖所有上述抗原。如果癌症为黑色素瘤(例如转移性黑色素瘤)，则优选选择能高度强烈地识别MART-1(例如MART-1：26-35(27L))、gp100(例如gp100：209-217(210M))或源自肿瘤编码突变的“独特”或患者特异性抗原的TIL。可以筛选TIL的高度强烈识别的其他合适的黑色素瘤抗原包括但不限于酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)1、TRP2和MAGE。抗原(例如NY-ESO-1、端粒酶、p53、HER2/neu、癌胚抗原或前列腺特异性抗原)可用于筛选TIL的高度强烈识别，以治疗肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等。筛选TIL包括但不限于酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白。
由于其速度和效率，基于IL-2的TIL扩增以及随后的“快速扩增过程”(REP)已成为TIL扩增的优选方法。Dudley等，Science，2002，298，850-54；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2005，23，2346-57；Dudley等，J.Clin.Oncol.，2008，26，5233-39；Riddell等，Science1992，257，238-41；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42。REP可以在14天内使TIL扩增1000倍，尽管它需要通常来自多个供体的、大量过量(例如200倍)的经辐照的同种异体外周血单核细胞作为饲养细胞(饲养细胞)，以及抗CD3抗体(OKT3)和高剂量的IL-2。Dudley等，J.I mmunother.2003,26,332-42。冷冻保存的肿瘤碎片是用于初始培养或第一次培养以制备用于治疗或其他目的的TIL的合适起点。
图1描述了含有一些这些特征的一个示例性TIL过程(称为过程2A)。图5和6描述了另一个示例性TIL过程(称为过程1C)，并将其与过程2A进行了比较。过程2A的一个实施方式如图1所示。
如本文所讨论的，本发明可以包括与冷冻保存的TIL的再刺激有关的步骤，以在移植入患者之前增加其代谢活性并因此增加相对健康，以及测试所述代谢健康的方法。如本文一般概述的，TIL通常取自患者样品并在移植入患者之前进行操作以扩大其数量。在一些实施方式中，TIL可以可选地进行如下所述的基因操作。
在一些实施方式中，可将TIL冷冻保存并解冻以用于给患者施用。一旦解冻，在输注给患者之前，也可以对它们进行再刺激以增加它们的代谢作用。
在一些实施方式中，如下文详述以及实施例和附图所述，第一次扩增(包括称为pre-REP的过程以及图1中显示为步骤A的过程)缩短为3天至14天，第二次扩增(包括称为REP的过程以及图1中显示为步骤B的过程)缩短为7天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增(例如图1中步骤B所述的扩增)缩短为11天，并且第二次扩增(例如图1中步骤D所述的扩增)缩短为11天。在一些实施方式中，如下文详述以及实施例和附图所述，第一次扩增和第二次扩增(例如图1中步骤B和步骤D所述的扩增)总和缩短为22天。
以下标记A、B、C等的“步骤”参考图1和本文所述某些实施方式。下述的和图1中步骤的顺序是示例性的，本申请和本文公开的方法预期步骤的任何组合或顺序，以及附加步骤、步骤的重复和/或步骤的省略。
步骤A：获得患者肿瘤样品
通常，TIL最初从患者肿瘤样品获得(“原代TIL”)，然后如本文所述地扩增为更大的群用于进一步操作，可选地，如本文所概述的冷冻保存、再刺激，并可选地评估表型和代谢参数作为TIL健康的指示。
可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品，通常通过手术切除、穿刺活检或者用于获得含有肿瘤和TIL细胞混合物的样品的其他手段。通常，肿瘤样品可以来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或者转移性肿瘤。肿瘤样品也可以是液体肿瘤，例如，从血液恶性肿瘤获得的肿瘤。实体瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方式中，有用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为据报道恶性黑色素瘤肿瘤具有特别高水平的TIL。
术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或者液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或者恶性的。术语“实体瘤癌”指恶性、肿瘤性或者癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、恶性上皮肿瘤和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。在一些实施方式中，癌症选自：宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。
术语“血液恶性肿瘤”指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性髓样白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”指影响B细胞的血液恶性肿瘤。
一旦获得肿瘤样品，通常使用锐器解剖法(sharp dissection)将肿瘤样品切成1mm3至约8mm3的小块；其中，约2mm3至3mm3是特别有用的。使用酶促肿瘤消化液从这些碎片培养TIL。此种肿瘤消化液可通过在酶培养基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸盐、10mcg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育然后机械解离(例如使用组织解离剂)来产生。肿瘤消化液可通过如下方法产生：将肿瘤置于酶培养基中并将肿瘤机械解离约1分钟，然后在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后在上述条件下进行机械解离和孵育的重复循环，直至仅存在小的组织碎片。在该过程结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用FICOLL分支亲水性多糖进行密度梯度分离以除去这些细胞。可以使用本领域已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。任何前述方法都可以用于本文所述扩增TIL的方法或治疗癌症的方法的任何实施方式中。
通常，收获的细胞悬液称为“原代细胞群”或者“新鲜收获的”细胞群。
在一些实施方式中，破碎包括物理破碎，包括例如切碎和消化。在一些实施方式中，破碎是物理破碎。在一些实施方式中，破碎是切碎。在一些实施方式中，破碎是通过消化。在一些实施方式中，可由酶促肿瘤消化液和从患者获得的肿瘤碎片来对TIL进行初始培养。
在一些实施方式中，当肿瘤是实体瘤时，例如在步骤A(如图1所提供)中获得肿瘤样品后，肿瘤经历物理破碎。在一些实施方式中，破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施方式中，破碎发生在在冷冻保存之后。在一些实施方式中，破碎发生在获得肿瘤之后并且没有任何冷冻保存的情况下。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将10、20、30、40或者更多个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将30或40个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将40个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方式中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施方式中，通过锐器解剖法获得肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施方式中，肿瘤为(1mm至4mm)×(1mm至4mm)×(1mm至4mm)。在一些实施方式中，肿瘤为1mm×1mm×1mm。在一些实施方式中，肿瘤为2mm×2mm×2mm。在一些实施方式中，肿瘤为3mm×3mm×3mm。在一些实施方式中，肿瘤为4mm×4mm×4mm。在其中在开始培养之前先冷冻肿瘤组织的实施方式中，肿瘤为约6mm×6mm×6mm。
在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的量最小化。在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的出血组织的量最小化。在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的坏死组织的量最小化。在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的脂肪组织的量最小化。
在一些实施方式中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施方式中，在不用解剖刀进行锯切运动的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施方式中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，肿瘤消化物通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNase和1.0mg/mL胶原酶)中孵育，然后机械解离(GentleMACS，MiltenyiBiotec，Aubum，加利福尼亚州)来产生。将肿瘤置于酶培养基中后，可以机械解离肿瘤约1分钟。然后将溶液在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟。在37℃、5％CO2中再次孵育30分钟后，可以第三次机械破碎肿瘤约1分钟。在一些实施方式中，在第三次机械破碎后，如果存在大块组织，则对样品施加1或者2次另外的机械解离，在或者不在37℃、5％CO2中进行另外的30分钟孵育。在一些实施方式中，在最终孵育结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或者死细胞，则可以使用Ficoll进行密度梯度分离以除去这些细胞。
在一些实施方式中，在第一次扩增步骤之前收获的细胞悬液称为“原代细胞群”或者“新鲜收获的”细胞群。
在一些实施方式中，可选地，可在收获样品后将细胞冷冻，在进入步骤B所描述的扩增之前冷冻保存，这将在下文进一步详细描述，以及在图1中进行举例说明。
步骤B：第一次扩增
在一些实施方式中，本发明方法提供获得年轻TIL，年轻TIL能够在施用给受试者/患者后增加复制周期，因此相对于较老TIL(例如，“较老TIL”在施用给受试者/患者之前还经历了更多轮的离体复制)可以提供其他治疗益处。文献中已经描述了年轻TIL的特征，例如Donia等，Scandinavian Journalof Immunology，75：157-167(2012)；Dudley等，ClinCancer Res，16：6122-6131(2010)；Huang等，J Immunother，28(3)：258-267(2005)；Besser等，Clin Cancer Res，19(17)：OF1-OF9(2013)；Besser等，J Immunother，32：415-423(2009)；Bunds等，J Immunother，32：415-423(2009)；Robbins等，J Immunol，2004；173：7125-7130；Shen等，J Immunother，30：123-129(2007)；Zhou等，J Immunother，28：53-62(2005)和Tran等，J Immunother，31：742-751(2008)，其全部内容通过引用整体并入本文。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因片段的体细胞重组来产生。这些基因片段：V(可变区)、D(多变区)、J(结合区)和C(恒定区)确定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR，T-cell receptor)的结合特异性和下游应用。本发明提供了产生TIL的方法，该TIL显示并增加T细胞谱系的多样性。在一些实施方式中，通过本方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，与新鲜收获的TIL和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图1中所示那些之外的方法)制备的TIL相比，通过本发明方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，与新鲜收获的TIL和/或使用如图5和/或图6所示的称为过程1C的方法制备的TIL相比，通过本方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，第一次扩增中获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方式中，免疫球蛋白多样性是免疫球蛋白重链多样性。在一些实施方式中，免疫球蛋白多样性是免疫球蛋白轻链多样性。在一些实施方式中，多样性是T细胞受体多样性。在一些实施方式中，多样性是选自α、β、γ和δ受体之一的T细胞受体的多样性。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。
例如，如图1的步骤A中所述，切开或者消化肿瘤碎片后，在(相对于肿瘤和其他细胞)有利于TIL生长的条件下，在含有IL-2的血清中培养所得细胞。在一些实施方式中，在2mL孔中的包含灭活的人AB血清和6000IU/mL的IL-2的培养基中孵育肿瘤消化物。培养此原代细胞群一段时间，通常为3天至14天，产生大量TIL群，通常为约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群7天至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群10至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群约11天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。
在一个优选实施方式中，TIL的扩增可以如下进行：使用如下文和此处所述的初始大量TIL扩增步骤(例如，如图1的步骤B中所述的那些，其可以包括称为pre-REP的过程)，然后进行如下文步骤D和此处所述的第二次扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后可选地进行冷冻保存，然后进行如下文和此处所述的第二次步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。可选地，可以对从该过程获得的TIL进行如本文所述的表型特征和代谢参数的表征。
在用24孔板开始TIL培养的实施方式中，例如，使用Costar 24孔细胞培养板、平底(康宁公司，康宁，纽约)，可在每个孔接种2mL含有IL-2(6000IU/mL；Chiron Corp.，埃默里维尔，加利福尼亚州)的完全培养基(CM)中的1×106个肿瘤消化细胞或者一个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。
在一些实施方式中，第一次扩增培养基被称为“CM”，其中CM是培养基的缩写。在一些实施方式中，步骤B的CM由含有GlutaMAX的RPMI 1640组成，补充有10％人AB血清、25mMHEPES和10mg/mL庆大霉素。在用容量为40mL、透气硅底为10cm2的透气烧瓶(例如，G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿，明尼苏达州)开始培养的实施方式中(图1)，各个烧瓶装有在10至40mL含有IL-2的CM中的10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或者5至30个肿瘤碎片。在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中孵育G-Rex 10和24孔板，培养开始5天后，移除一半培养基，换上新鲜的CM和IL-2，在第5天后，每2至3天更换一半的培养基。
在制备肿瘤碎片后，在(相对于肿瘤和其他细胞)有利于TIL生长的条件下，在含有IL-2的血清中培养所得细胞(即碎片)。在一些实施方式中，在2mL孔中的含有灭活的人AB血清(或在一些情况下，如本文所述，在aAPC细胞群存在下)和6000IU/mL IL-2的培养基中，孵育肿瘤消化液。将该原代细胞群培养一段时间，通常为10至14天，产生大量TIL群，通常约1×108个大量TIL细胞。在一些实施方式中，第一次扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体。在一些实施方式中，IL是重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg至30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的IL-2储备溶液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方式中，IL-2储备溶液的终浓度为4×106IU/mg至8×106IU/mg IL-2。在一些实施方式中，IL-2储备溶液的终浓度为5×106IU/mg至7×106IU/mg IL-2。在一些实施方式中，IL-2储备溶液的终浓度为6×106IU/mg IL-2。在一些实施方式中，如实施例E中所述地制备IL-2储备溶液。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约10,000IU/mL的IL-2，约9,000IU/mL的IL-2，约8,000IU/mL的IL-2，约7,000IU/mL的IL-2，约6000IU/mL的IL-2或约5,000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约9,000IU/mL的IL-2至约5,000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约8,000IU/mL的IL-2至约6,000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约7,000IU/mL的IL-2至约6,000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约6,000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或者约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL，或者约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或者约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-15。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。
在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或者约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第一次扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-21。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。
在一个实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL以及50ng/mL至100ng/mL的OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，OKT-3抗体是莫罗单抗。
在一些实施方式中，细胞培养基在细胞培养基中包含一种以上TNFRSF激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂是4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自：乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中TNFRSF激动剂为0.1μg/mL至100μg/mL的浓度添加TNFRSF激动剂。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中TNFRSF激动剂为20μg/mL至40μg/mL的浓度添加TNFRSF激动剂。
在一些实施方式中，除一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，其中，一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方式中，第一次扩增的培养基被称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方式中，将其称为CM1(培养基1)。在一些实施方式中，CM由具有GlutaMAX的RPMI 1640组成，补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气烧瓶(例如G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing，新布莱顿，明尼苏达州)中开始培养的实施方式中(图1)，各个烧瓶装有在含有IL-2的10-40mL CM中的10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤碎片。将G-Rex 10和24孔板在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中培养，培养开始5天后，取出一半培养基，换上新鲜的CM和IL-2，在第5天后，每2-3天更换一半的培养基。在一些实施方式中，CM是实施例中描述的CM1，参见实施例1。在一些实施方式中，第一次扩增发生在初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施方式中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括例如图1的步骤B中所述的那些过程，其可以包括有时称为pre-REP的那些过程)过程被缩短为3天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5中所示的，以及包括例如图1的步骤B中所述的扩增，第一次扩增(包括例如图1的步骤B中所述的那些过程，其可以包括有时称为pre-REP的那些过程)被缩短为7天至14天。在一些实施方式中，步骤B的第一次扩增被缩短为10天至14天。在一些实施方式中，例如如图1的步骤B中所述的扩增中所讨论的，第一次扩增被缩短为11天。
在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可以持续7天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行11天。
在一些实施方式中，在第一次扩增期间，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在第一次扩增期间，包括例如在根据图1的步骤B期间以及如此处所述，可以包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，在第一次扩增期间，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在根据图1的步骤B期间以及如此处所述，可以包括IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括被称为pre-REP的过程；例如，根据图1的步骤B)的过程被缩短为3天至14天。在一些实施方式中，步骤B的第一次扩增被缩短为7至14天。在一些实施方式中，步骤B的第一次扩增被缩短为10至14天。在一些实施方式中，第一次扩增被缩短为11天。
在一些实施方式中，第一次扩增(例如根据图1的步骤B)在封闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，如此处所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
步骤C：第一次扩增向第二次扩增的转变
在一些情况下，可以使用下文讨论的方案，立即冷冻保存从第一次扩增获得的大量TIL群，包括例如从例如图1所示的步骤B获得的TIL群。或者，可以对第一次扩增获得的TIL群(称为第二TIL群)进行第二次扩增(其可以包括有时被称为REP的扩增)，然后如下文所述冷冻保存。类似地，在基因修饰的TIL将被用于治疗的情况下，第一TIL群(有时被称为大量TIL群)或者第二TIL群(在一些实施方式中可以包括被称为REP TIL群的群)可在扩增之前或者第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行基因修饰以用于合适的治疗。
在一些实施方式中，储存从第一次扩增(例如，如图1所示的步骤B)获得的TIL直至进行表型选择。在一些实施方式中，从第一次扩增(例如，如图1所示的步骤B)获得的TIL不储存而是直接进行第二次扩增。在一些实施方式中，在第一次扩增之后且在第二次扩增之前，不冷冻保存从第一次扩增获得的TIL。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的约3天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的约4天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的约4天至10天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的约7天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的约14天。
在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的1天至14天。在一些实施方式中，第一次TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的3天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的4天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的5天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的6天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的7天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的8天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的9天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的10天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的11天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的12天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的13天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的1天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的2天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的3天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的4天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的5天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的6天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的7天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的8天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的9天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的10天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生破碎后的11天。
在一些实施方式中，在第一次扩增之后和第二次扩增之前不储存TIL，TIL直接进行第二次扩增(例如，在一些实施方式中，从步骤B向步骤D转变的期间不进行储存)(如图1所示)。在一些实施方式中，如本文所述，转变在封闭系统中发生。在一些实施方式中，来自第一次扩增的TIL(即第二TIL群)不经历转变期而直接进入第二次扩增。
在一些实施方式中，在封闭系统生物反应器中进行第一次扩增向第二次扩增的转变(例如根据图1的步骤C)。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
细胞因子
如本领域已知，本文所述的扩增方法通常使用含有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基。
或者，另外可以使用细胞因子的组合进行TIL的快速扩增和/或第二次扩增；其中，IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合如国际公开号WO2015/189356和国际公开号WO2015/189357中概述的那样，其全部内容通过引用明确并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15；IL-2和IL-21；IL-15和IL-21；以及IL-2、IL-15和IL-21，发现后者在许多实施方式中特别有用。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞(特别是本文所述的T细胞)的产生。
步骤D：第二次扩增
在一些实施方式中，在收获和初始大量处理之后(例如在步骤A和步骤B之后)，TIL细胞群的数量增加，该转变称为步骤C，如图1所示。此种进一步的扩增在本文中称为第二次扩增，其可以包括本领域中通常称为快速扩增过程(REP；以及图1的步骤D所示的过程)的扩增过程。通常在透气容器中使用包含多种组分的培养基来完成第二次扩增，所述组分包括饲养细胞、细胞因子源(cytokine source)和抗CD3抗体。
在一些实施方式中，TIL的第二次扩增或第二次TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及图1的步骤D中所示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL烧瓶或容器进行。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方式中，第二次TIL扩增可进行约14天。
在一个实施方式中，第二次扩增可以使用本公开的方法在透气容器中进行(包括例如称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所示的过程)。例如，可在白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增TIL。非特异性T细胞受体刺激可包括，例如，抗CD3抗体，例如约30ng/mL的OKT-3，一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil，拉里坦，新泽西州或Miltenyi Biotech，奥本，加利福尼亚州商购)或者UHCT-1(可从BioLegend，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国商购)。可选地在T细胞生长因子(如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下，可通过在第二次扩增期间包括一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)在体外诱导TIL的进一步刺激，快速扩增TIL，该抗原可可选地由载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-L26-35(27L)或gp100：209-217(210M)。其他合适的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2区和VEGFR2，或其抗原性部分。也可通过用表达HLA-A2的抗原呈递细胞脉冲的相同癌症抗原再刺激，来快速扩增TIL。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2进一步再刺激TIL。在一些实施方式中，再刺激作为第二次扩增的一部分发生。在一些实施方式中，在经辐照的自体淋巴细胞或者经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的存在下，发生第二次扩增。
在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL，或约8000IU/mL的IL-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000IU/mL至2000IU/mL、2000IU/mL至3000IU/mL、3000IU/mL至4000IU/mL、4000IU/mL至5000IU/mL、5000IU/mL至6000IU/mL、6000IU/mL至7000IU/mL、7000IU/mL至8000IU/mL，或8000IU/mL的IL-2。
在一个实施方式中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL的OKT-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/mL至1ng/mL、1ng/mL至5ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL，20ng/mL至30ng/mL、30ng/mL至40ng/mL、40ng/mL至50ng/mL、50ng/mL至100ng/mL的OKT-3抗体。在一些实施方式中，OKT-3抗体是莫罗单抗。
在一些实施方式中，细胞培养基在细胞培养基中包含一种以上TNFRSF激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方式中，TNFRSF激动剂是4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自：乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中TNFRSF激动为0.1μg/mL至100μg/mL的浓度添加TNFRSF激动剂。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中TNFRSF激动为20μg/mL至40μg/mL的浓度添加TNFRSF激动剂。
在一些实施方式中，除一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度为约3000IU/mL的IL-2和初始浓度为约30ng/mL的OKT-3抗体，其中，一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方式中，在第二次扩增期间采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，第二次扩增期间(包括例如根据图1的步骤D过程，以及如此处所述)可以包括IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，在第二次扩增期间采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在根据图1的步骤D过程中，以及如此处所述，可以包括IL-2、IL-15和IL-21及它们的任何组合。
在一些实施方式中，第二次扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞和可选的TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方式中，第二次扩增发生在补充细胞培养基中。在一些实施方式中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方式中，第二次扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。
在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15、约400IU/mL的IL-15、约300IU/mL的IL-15、约200IU/mL的IL-15、约180IU/mL的IL-15、约160IU/mL的IL-15、约140IU/mL的IL-15、约120IU/mL的IL-15或者约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约400IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约300IU/mL的IL-15至约100IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约200IU/mL的IL-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-15。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约180IU/mL的IL-15。
在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21、约15IU/mL的IL-21、约12IU/mL的IL-21、约10IU/mL的IL-21、约5IU/mL的IL-21、约4IU/mL的IL-21、约3IU/mL的IL-21、约2IU/mL的IL-21、约1IU/mL的IL-21或者约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约15IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约12IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约10IU/mL的IL-21至约0.5IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约5IU/mL的IL-21至约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约2IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5IU/mL的IL-21。在一个实施方式中，细胞培养基还包含IL-21。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约1IU/mL的IL-21。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞(APC)是PBMC。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1：25、约1：50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400，或约1：500。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC的比率为1：50至1：300。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，TIL比PBMC的比率为1:100至1：200。
在一个实施方式中，REP和/或第二次扩增在烧瓶中进行；其中，大量TIL与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL的OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL的IL-2混合于150mL培养基中。进行培养基更换(通常通过吸入新鲜培养基替换2/3培养基)，直至细胞转移至替代生长室。如下文更充分讨论的，替代生长室包括G-REX烧瓶和透气容器。
在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第二次扩增(其可以包括称为REP过程)缩短至7天至14天。在一些实施方式中，第二次扩增缩短至11天。
在一个实施方式中，REP和/或第二次扩增可以使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran等，J.I mmunother.，2008，31，742-51；Dudley等，J.I mmunother.，2003，26，332-42)或透气培养皿(G-REX烧瓶)进行。在一些实施方式中，第二次扩增(包括称为快速扩增的扩增)在T-175烧瓶中进行，并且可以将悬浮于150mL培养基中的约1×106个TIL添加至每个T-175烧瓶中。TIL可在CM和AFM-V培养基的1:1混合物中培养，补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。T-175烧瓶可在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以使用含有3000IU/mLIL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，可以将来自两个T-175烧瓶的细胞合并在3L袋中，将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM V添加至300mL的TIL悬液中。每天或每2天计数各个袋中的细胞数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持为0.5×106至2.0×106个细胞/mL。
在一个实施方式中，第二次扩增(其可以包括称为REP的扩增，以及图1的步骤D中提到的那些)可在容量为500mL、透气硅底为100cm2的透气烧瓶(G-Rex 100，可从WilsonWolf Manufacturing Corporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国商购)中进行，5×106或10×106TIL可与PBMC一起培养在400mL的50/50培养基中，补充有5％人AB血清、3000IU/mLIL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)。G-REX 100烧瓶可在37℃、5％CO2中孵育。在第5天，可以取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491×g)离心10分钟。TIL沉淀可以用150mL含有5％人AB血清、3000IU/mL的IL-2的新鲜培养基重悬并加回到原来的G-REX 100烧瓶中。当TIL在G-REX 100烧瓶中连续扩增时，在第7天，可以将每个G-REX 100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，并且可以将细胞悬液分成可用于接种3个G-REX 100烧瓶的3个100mL等分试样。然后可以向各个烧瓶中添加150mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V。G-Rex 100烧瓶可在37℃、5％CO2中孵育，4天后，可以向每个G-REX 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。可在培养的第14天收获细胞。
在一个实施方式中，第二次扩增(包括称为REP的扩增)在烧瓶中进行；其中，大量TIL与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合于150mL培养基中。在一些实施方式中，进行培养基更换，直至细胞转移至替代生长室。在一些实施方式中，通过吸入新鲜培养基来更换2/3的培养基。在一些实施方式中，如下文更充分讨论的，替代生长室包括G-REX烧瓶和透气容器。
在一个实施方式中，进行第二次扩增(包括称为REP的扩增)，并且还包括筛选肿瘤反应性优异的TIL的步骤。可以使用本领域已知的任何筛选方法。例如，美国专利申请公开号2016/0010058A1所述的方法(其公开内容通过引用并入本文)可用于筛选肿瘤反应性优异的TIL。
可选地，可以使用本领域已知的标准检测法，在第二次扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后进行细胞活力检测。例如，可以对大量TIL样品进行台盼蓝拒染试验实验(trypanblue exclusion assay)，其选择性地标记死细胞并允许活力评估。在一些实施方式中，可以使用Cellometer K2自动细胞计数器(Nexcelom Bioscience,劳伦斯，马萨诸塞州)对TIL样品进行计数和检测活力。在一些实施方式中，根据Cellometer K2 Image Cytometer标准自动细胞计数器方案测定活力。
在一些实施方式中，TIL的第二次扩增(包括称为REP的扩增)可以使用如前所述的T-175烧瓶和透气袋(Tran KQ、Zhou J、Durflinger KH等，2008，J.Immunother.，31：742-751和Dudley ME、Wunderlich JR、Shelton TE等，2003，J.Immunother.，26：332-342)或透气G-Rex烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增使用烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增使用透气G-Rex烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增在T-175烧瓶中进行，将约1×106TIL悬浮于约150mL培养基中，将它加至每个T-175烧瓶中。将TIL与经辐照的(50Gy)同种异体PBMC(作为“饲养”细胞)以1:100比率一起培养，将细胞在CM和AIM-V培养基的1:1混合物(50/50培养基)中培养，补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。将T-175烧瓶在37℃、5％CO2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，使用含有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，将来自2个T-175烧瓶的细胞合并于3L袋中，将300mL含有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL TIL悬液中。可以每天或每2天计数各个袋中的细胞数，并且可以添加新鲜培养基以使细胞计数保持为约0.5×106至约2.0×106个细胞/mL。
在一些实施方式中，第二次扩增(包括称为REP的扩增)在具有100cm2透气硅底的500mL容量的烧瓶(G-REX 100，Wilson Wolf)中进行(图1)，约5×106或10×106TIL与经辐照同种异体PBMC以1:100的比率在400mL的50/50培养基中培养，该50/50培养基补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3。将G-Rex 100烧瓶在37℃、5％CO2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，取出250mL上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491g)离心10分钟。然后TIL沉淀可以用150mL含有3000IU/mL的IL-2的新鲜50/50培养基重悬，并加回到原来的G-Rex 100烧瓶中。在TIL在G-REX 100烧瓶中连续扩增的实施方式中，在第7天，将每个G-Rex100中的TIL悬浮于各个烧瓶中存在的300mL培养基中，将细胞悬液分成用于接种3个G-Rex100烧瓶的3个100mL等分试样。然后向各个烧瓶中添加150mL含有5％人AB血清和3000IU/mLIL-2的AIM-V。G-REX100烧瓶在37℃、5％CO2中孵育，4天后，向每个G-REX 100烧瓶中添加150mL含有3000IU/mL IL-2的AIM-V。在培养的第14天收获细胞。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体是通过有限但大量的基因片段的体细胞重组产生的。这些基因片段：V(可变区)、D(多变区)、J(结合区)和C(恒定区)，确定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了产生TIL的方法，其显示并增加T细胞谱系的多样性。在一些实施方式中，通过本方法获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，在第二次扩增中获得的TIL显示出T细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白重链多样性。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白轻链多样性。在一些实施方式中，多样性是T细胞受体多样性。在一些实施方式中，多样性是选自α、β、γ和δ受体之一的T细胞受体的多样性。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方式中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方式中，TCRab(即TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方式中，如下文更详细讨论的，第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)。
在一些实施方式中，第二次扩增(例如根据图1的步骤D)在封闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
饲养细胞和抗原呈递细胞
在一个实施方式中，在REP TIL扩增期间和/或在第二次扩增期间，本文所述的第二次扩增步骤(例如，包括例如图1的步骤D中所述的那些以及称为REP的那些扩增)需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(PBMC)。使用标准方法(如Ficoll-Paque梯度分离)获得PBMC，参见例如“单核细胞的分离：方法学与应用”，GE生命科学技术出版物：可获自https://us.vwr.com/assetsvc/asset/en_US/id/16286835/contents。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理被灭活并用于REP步骤，如实施例所述，它提供了评估经辐照的同种异体PBMC的复制机能不全(replication incompetence)的示例性方案。
在一些实施方式中，如果第14天的活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数，则认为PBMC复制机能不全并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。
在一些实施方式中，如果在OKT3和IL-2存在下，与REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，第7天和第14天培养的活细胞的总数没有增加，则认为PBMC复制机能不全并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。在一些实施方式中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2的存在下培养。
在一些实施方式中，如果在OKT3和IL-2存在下，与REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，第7天和第14天培养的活细胞的总数没有增加，则认为PBMC复制机能不全并接受PBMC用于本文所述的TIL扩增步骤。在一些实施方式中，PBMC在5-60ng/mL OKT3抗体和1000-6000IU/mL IL-2的存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在10-50ng/mL的OKT3抗体和2000-5000IU/mL的IL-2的存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在20-40ng/mL OKT3抗体和2000-4000IU/mL IL-2的存在下培养。在一些实施方式中，PBMC在25-35ng/mL OKT3抗体和2500-3500IU/mL IL-2的存在下培养。
在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞是PBMC。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞是人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方式中，第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：25、约1：50、约1:100、约1:125、约1:150、约1:175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400，或者约1：500。在一个实施方式中，第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为1：50至1：300。在一个实施方式中，第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为1:100至1：200。
在一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约100×106个TIL的比率。在另一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约50×106个TIL的比率。在又一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约25×106个TIL。
在一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤在第二次扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离获得。在一个实施方式中，使用人工抗原呈递(aAPC)细胞代替PBMC。
通常，同种异体PBMC通过辐照或者热处理被灭活，用于本文所述的TIL扩增步骤，包括附图和实施例中所述的示例性步骤。
在一个实施方式中，在第二次扩增中使用人工抗原呈递细胞替代PBMC或者与PBMC组合。
细胞因子
如本领域已知，本文所述的TIL扩增方法通常使用含有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基。
或者，另外可以使用细胞因子的组合进行TIL的快速扩增和/或第二次扩增；其中，IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合如国际公开号WO2015/189356和国际公开号WO2015/189357中概述的那样，其全部内容通过引用明确并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15；IL-2和IL-21；IL-15和IL-21；以及IL-2、IL-15和IL-21，发现后者在许多实施方式中特别有用。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞(特别是本文所述的T细胞)的产生。
步骤E：收获TIL
在第二次扩增步骤后，可以收获细胞。在一些实施方式中，例如，在如图1中所提供的一个、两个、三个、四个或者更多次扩增步骤之后收获TIL。在一些实施方式中，例如，在如图1中所提供的两次扩增步骤之后收获TIL。
可以以任何适当和无菌的方式收获TIL，包括例如通过离心。收获TIL的方法是本领域熟知的，并且任何此种已知方法可与本发明方法一起使用。在一些实施方式中，使用自动化系统收获TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可从多种来源商购获得，包括例如FreseniusKabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International,Inc.。任何基于细胞的收集器均可用于本方法。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收集器。在一些实施方式中，细胞收集是通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)。术语“LOVO细胞处理系统”还指任何供应商制造的可在无菌和/或封闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或者过滤器(例如旋转膜或者旋转过滤器)的任何仪器或者设备，其允许连续流动和细胞处理以除去上清液或不含沉淀的细胞培养基。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在封闭的无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方式中，收获(例如根据图1的步骤E)是在封闭系统生物反应器中进行的。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是G-REX-10或者G-REX-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。
一些实施方式中，根据实施例7中所述过程进行图1的步骤E。在一些实施方式中，通过注射器在无菌条件下进入封闭系统，以保持系统的封闭性和无菌性。在一些实施方式中，采用如实施例7所述的封闭系统。
在一些实施方式中，根据实施例7中所述的方法收获TIL。在一些实施方式中，使用本文所述的方法收获第1天至第11天的TIL(在实施例7中称为第11天TIL收获)。在一些实施方式中，使用本文所述的方法收获第12天至第22天的TIL(在实施例7中称为第22天TIL收获)。
步骤F：最终制剂/转移至输液袋
在如图1中以示例性顺序提供的步骤A至E之后以及如上文和此处详述的概述完成后，将细胞转移至容器以用于对患者给药。在一些实施方式中，一旦使用上述扩增方法获得治疗足够数量的TIL，将它们转移至容器以用于对患者给药。
在一个实施方式中，将使用本公开的APC扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域已知的任何合适的途径施用。在一个实施方式中，T细胞以单次动脉内或静脉内输注，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内。
抗CD3抗体作为可选的培养基成分
在一些实施方式中，本文所述的扩增方法(包括称为REP的那些，参见例如图1)中使用的培养基还包含抗CD3抗体。与IL-2组合的抗CD3抗体诱导TIL群的T细胞活化和细胞分裂。用全长抗体以及Fab和F(ab′)2片段可看到此种效果，前者通常是优选的；例如参见Tsoukas等，J.I mmunol.，1985，135，1719，其全部内容通过引用并入本文。
如本领域技术人员将理解，许多合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人类、灵长类动物、大鼠和犬抗体。在具体实施方式中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(包括表1所示的实施方式)(可从新泽西州拉里坦的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的Miltenyi Biotech商购)。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥特昔珠单抗(otelixizumab)、特普利珠单抗(teplizumab)和威司利珠单抗(visilizumab)。
4-1BB(CD137)激动剂作为可选的培养基成分
在一个实施方式中，TNFRSF激动剂是4-1BB(CD137)激动剂。4-1BB激动剂可以是本领域已知的任何4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可以是能够结合人或哺乳动物4-1BB的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可能同时具有重链和轻链。如本文所用，术语“结合分子”还包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体以及抗体片段(例如Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段、上述任一项的表位结合片段以及工程化形式的与4-1BB结合的抗体(例如scFv分子))。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是抗原结合蛋白，其是完全人抗体。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是抗原结合蛋白，其是人源化抗体。在一些实施方式中，用于本文公开方法和组合物的4-1BB激动剂包括：抗4-1BB抗体、人抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB Adnectin、抗4-1BB结构域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗-4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体诱导强烈的免疫应答。Lee等，PLOS One 2013,8,e69677。在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是激动性抗4-1BB人源化单克隆抗体或激动性抗4-1BB完全人单克隆抗体(即源自单个细胞系的抗体)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌托鲁单抗或乌瑞鲁单抗或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是乌托鲁单抗或乌瑞鲁单抗或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可以是融合蛋白。在一个优选实施方式中，与激动性单克隆抗体(通常具有两个配体结合结构域)相比，多聚体4-1BB激动剂，例如三聚体或六聚体4-1BB激动剂(具有三个或6个配体结合结构域)，可以诱导更高的受体(4-1BBL)聚集和内部细胞信号复合物的形成。例如，Gieffers等，Mol.CancerTherapeutics 2013,12,2735-47描述了三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更高聚体融合蛋白，其包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc并可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白。
已知激动性4-1BB抗体和融合蛋白诱导强烈的免疫应答。在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是以足以减少毒性的方式特异性结合4-1BB抗原的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞的细胞毒性)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BB激动剂是消除Fc区功能性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方式中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和力和激动剂活性结合人4-1BB(SEQ ID NO：9)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是与人4-1BB(SEQ ID NO：9)结合的结合分子。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是与鼠4-1BB(SEQ ID NO：10)结合的结合分子。表3总结了与4-1BB激动剂或结合分子结合的4-1BB抗原的氨基酸序列。
表3：4-1BB抗原的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750000941
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约100pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约90pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约80pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约70pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约60pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约50pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约40pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB或以约30pM以下的KD结合人4-1BB或鼠4-1BB。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约7.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠4-1BB、以约8×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠4-1BB、以约8.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠4-1BB、以约9×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠4-1BB、以约9.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠4-1BB或以约1×106 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠4-1BB。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约2×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.1×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.2×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.3×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.4×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.5×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.6×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.7×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.8×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB、以约2.9×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB或以约3×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠4-1BB。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，所述4-1BB激动剂以约10nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约9nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约8nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约7nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约6nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约5nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约4nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约3nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB、以约2nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB或以约1nM以下的IC50结合人4-1BB或鼠4-1BB。
在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是乌托鲁单抗(也称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌托鲁单抗可从Pfizer，Inc.商购。乌托鲁单抗是一种免疫球蛋白G2-λ，抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]，智人(完全人)单克隆抗体。乌托鲁单抗的氨基酸序列在表4中列出。乌托鲁单抗在Asn59和Asn292处包含糖基化位点；在第22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)和362-420(CH3)位包含重链链内二硫键；在第22'-87'(VH-VL)和136'-195'(CH1-CL)位包含轻链链内二硫键；在IgG2A/B同工型第218-130、219-219、222-222和225-225位、在IgG2A同工型第218-218、219-219、222-222和225-225位以及在IgG2B同工型第219-130(2)、222-222和225-225位包含链间重链-重链二硫键；以及在IgG2A同工型第130-213'(2)位、在IgG2A/B同工型第218-213'和130-213'位以及在IgG2B同工型第218-213'(2)位包含链间重链-轻链二硫键。乌托鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利号8,821,867；8,337,850和9,468,678以及国际专利申请公开号WO 2012/032433A1，其各自公开内容通过引用并入本文。乌托鲁单抗的临床前特征描述于Fisher等，CancerImmunolog.&Immunother.2012,61,1721-33。目前，乌托鲁单抗在各种血液学和实体瘤适应症中的临床试验包括美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)clinicaltrials.gov识别号NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066和NCT02554812。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：11给出的重链和SEQ ID NO：12给出的轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含乌托鲁单抗的重链和轻链的CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：13所示的序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：14所示的序列，及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQID NO：14所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：13和SEQID NO：14所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含分别与SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1结构域、重链CDR2结构域和重链CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1结构域、轻链CDR2结构域和轻链CDR3结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是药品监管机构参考乌托鲁单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该抗体4-1BB抗体包含与参考药物产品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性并且与参考药物产品或参考生物制品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的4-1BB激动剂抗体，其中，4-1BB激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物制品制剂的制剂形式提供，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可能会被药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)授权。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。
表4：与乌托鲁单抗有关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750000971
在一个优选实施方式中，4-1BB激动剂是单克隆抗体乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513和20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可购自Bristol-Myers Squibb，Inc.和Creative Biolabs，Inc.。乌瑞鲁单抗是一种免疫球蛋白G4-κ，抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]，智人(全人)单克隆抗体。表5列出了乌瑞鲁单抗的氨基酸序列。乌瑞鲁单抗在第298位(和第298’位)包含N-糖基化位点；在第22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)和368-426(CH3)位(以及在第22”-95”、148”-204”、262”-322”和368”-426”位)包含重链链内二硫键；在第23'-88'(VH-VL)和136'-196'(CH1-CL)位(以及在第23”'-88”'和136”'-196”'位)包含轻链链内二硫桥；在第227-227'和230-230”位包含链间重链-重链二硫键；以及在第135-216'和135'-216”位包含链间重链-轻链二硫键。乌瑞鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利号7,288,638和8,962,804，其公开内容通过引用并入本文。Segal等，Clin.CancerRes.2016(可访问http://dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272)描述了乌瑞鲁单抗的临床前和临床特征。乌瑞鲁单抗在各种血液学和实体瘤适应症中的当前临床试验包括美国国立卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992和NCT01471210。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含由SEQ ID NO：21给出的重链和由SEQ IDNO：22给出的轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包括重链和轻链，所述重链和轻链分别具有SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQID NO：22所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链和轻链的CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：23所示的序列，4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：24所示的序列，及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQID NO：24所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别与SEQ ID NO：23和SEQID NO：24所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1结构域、重链CDR2结构域和重链CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1结构域、轻链CDR2结构域和轻链CDR3结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是由药品监管机构参考乌瑞鲁单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该抗体4-1BB抗体包含与参考药物产品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性并且与参考药物产品或参考生物制品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的4-1BB激动剂抗体，其中，4-1BB激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物制品制剂的制剂形式提供，其中，参考药物产品或参考生物制品为乌瑞鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可能会被药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)授权。在一些实施方式中，在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。
表5：与乌瑞鲁单抗有关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750000991
Figure BDA0003044135750001001
在一个实施方式中，4-1BB激动剂选自：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(LeincoTechnologies B591)、由保藏于ATCC号HB-11248且公开于美国专利号6974863的细胞系产生的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、公开于美国专利申请公开号US2005/0095244的抗体、美国专利号7,288,638(例如20H4.9-IgG1(BMS-663031))中公开的抗体、美国专利6,887,673(例如4E9或BMS-554271)中公开的抗体、美国专利号7,214,493中公开的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、美国专利号6,905,685中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利号6,362,325(例如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3E1)中公开的抗体、美国专利号6,974,863中公开的抗体(例如53A2)、美国专利号6,210,669中公开的抗体(例如1D8、3B8或3E1)、美国专利号5,928,893中描述的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、国际专利中公开的抗体专利申请公开号WO 2012/177788、WO2015/119923和WO 2010/042433中公开的抗体，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中，每个前述专利或专利申请出版物的公开内容均通过引用并入本文。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是国际专利申请公开号WO 2008/025516A1，WO2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1和WO 2010/078966A1；美国专利申请公开号US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734A1和US 2015/0126710A1；以及美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460中描述的4-1BB激动融合蛋白，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是如图25中结构I-A(C端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N端Fc抗体片段融合蛋白)所描述的4-1BB激动融合蛋白或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物：
如图25中结构I-A和I-B所示，圆柱指单个多肽结合结构域。结构I-A和结构I-B包含三个线性连接的TNFRSF结合结构域，该结合结构域源自例如4-1BBL或与4-1BB结合的抗体，它们折叠形成三价蛋白，然后通过IgG1-Fc(包括CH3和CH2结构域)与第二个三价蛋白连接，然后通过二硫键(小的细长椭圆)将两个三价蛋白连接在一起，从而稳定结构，提供能够将6个受体的细胞内信号传导结构域和信号传导蛋白结合在一起形成信号复合体的激动剂。例如，表示为圆柱的TNFRSF结合结构域可以是scFv结构域，scFv结构域包含例如通过接头连接的VH链和VL链，该接头可包含亲水性残基和Gly和Ser序列以具有柔韧性，以及包含Glu和Lys序列以具有溶解性。可以使用任何scFv结构域设计，例如描述于de Marco,Microbial Cell Factories,2011,10,44；Ahmad等，Clin.&Dev.Immunol.2012,980250；Monnier等，Antibodies,2013,2,193-208；或并入本文其他地方的参考文献中的那些。此种形式的融合蛋白结构描述于美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460，其公开内容通过引用并入本文。
结构I-A的其他多肽结构域的氨基酸序列在表6中给出。Fc结构域优选包含完整的恒定结构域(SEQ ID NO：31的氨基酸17-230)和完整的铰链结构域(SEQ ID NO：31的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：31的氨基酸4-16)。连接C端Fc抗体的优选的接头可以选自SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：41给出的实施方式，包括适用于融合其他多肽的接头。
表6：具有C端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-A)的TNFRSF融合蛋白(包括4-1BB融合蛋白)的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001011
Figure BDA0003044135750001021
结构I-B的其他多肽结构域的氨基酸序列在表7中给出。如果Fc抗体片段融合至TNRFSF融合蛋白的N-末端(如结构I-B)，则Fc模块的序列优选为SED ID NO：42所示的序列，接头序列优选选自SED ID NO：43至SEQ ID NO：45所示的那些实施方式。
表7：具有N末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)的TNFRSF融合蛋白(包括4-1BB融合蛋白)的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001022
在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域选自：乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、选自表4或表5中所述可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链，前述可变重链和可变轻链的任意组合，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包含4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO：46的序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域包含可溶性4-1BBL序列。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO：47的序列。
在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域是scFv结构域，该scFv结构域包含分别与SEQ IDNO：13和SEQ ID NO：14所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域是scFv结构域，该scFv结构域包含分别与ID NO：23和SEQ ID NO：24所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或结构I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该4-1BB结合结构域是scFv结构域，该scFv结构域包含分别与表8所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区，其中，VH结构域和VL结构域通过接头连接。
表8：用作融合蛋白中4-1BB结合结构域或用作scFv 4-1BB激动剂抗体的其他多肽结构域
Figure BDA0003044135750001031
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，还包含位于N端和/或C端的其他结构域，其中，该其他结构域是Fab或Fc片段结构域。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，还包含位于N端和/或C端的其他结构域，其中，其他结构域是Fab或Fc片段结构域，其中，每个可溶性4-1BB结构域均缺少茎(stalk)区(有助于三聚化作用并提供与细胞膜的一定距离，但不是4-1BB结合结构域的一部分)，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中，每个可溶性TNF超家族细胞因子结构域都缺乏茎区，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，其中每个TNF超家族细胞因子结构域均是4-1BB结合结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是4-1BB激动性scFv抗体，其包含与任何前述VL结构域连接的任何前述VH结构域。
在一个实施方式中，4-1BB激动剂是BPS Bioscience 4-1BB激动剂抗体(目录号79097-2)，可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的BPS Bioscience商购。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是Creative Biolabs 4-1BB激动剂抗体(目录号MOM-18179)，可从美国纽约州Shirley的Creative Biolabs商购。
OX40(CD134)激动剂作为可选的培养基成分
在一个实施方式中，TNFRSF激动剂是OX40(CD134)激动剂。OX40激动剂可为本领域已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可为能够结合人或哺乳动物OX40的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG1、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类的免疫球蛋白重链。OX40激动剂或OX40结合分子可同时具有重链和轻链。如本文所用，术语“结合分子”还包括与OX40结合的抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体以及抗体片段(例如，Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段，以上任一项的表位结合片段)以及抗体的工程形式(例如scFv分子)。在一个实施方式中，OX40激动剂是抗原结合蛋白，其是全人抗体。在一个实施方式中，OX40激动剂是抗原结合蛋白，其是人源化抗体。在一些实施方式中，用于本公开的方法和组合物中的OX40激动剂包括：抗OX40抗体、人抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40纤连蛋白、抗OX40域抗体、单链抗OX40片段、重链抗OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选实施方式中，OX40激动剂是激动性抗OX40人源化或全人单克隆抗体(即，源自单个细胞系的抗体)。
在一个优选实施方式中，OX40激动剂或OX40结合分子也可为融合蛋白。包含与OX40L融合的Fc结构域的OX40融合蛋白描述于例如Sadun等，J.Immunother.J.Immunol.2009，182，1481-89。在一个优选实施方式中，与激动性单克隆抗体(其通常具有两个配体结合结构域)相比，多聚体OX40激动剂(例如，(具有三个或6个配体结合结构域的)三聚体或六聚体OX40激动剂)可诱导优异的受体(OX40L)聚类和内部细胞信号复合物形成。包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc并且可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白的三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更大的融合蛋白描述于例如Gieffers等，Mol.Cancer Therapeutics 2013，12，2735-47。
已知激动性OX40抗体和融合蛋白诱导强烈的免疫应答。Curti等，CancerRes.2013，73，7189-98。在一个优选实施方式中，OX40激动剂是以足以减少毒性的方式特异性结合OX40抗原的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂是激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白，其消除了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞的细胞毒性)。在一些实施方式中，OX40激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，OX40激动剂是消除Fc区功能性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方式中，OX40激动剂的特征在于以高亲和力和激动性活性结合人OX40(SEQ ID NO：54)。在一个实施方式中，OX40激动剂是与人OX40(SEQ ID NO：54)结合的结合分子。在一个实施方式中，OX40激动剂是与鼠OX40(SEQ ID NO：55)结合的结合分子。表9总结了与OX40激动剂或结合分子结合的OX40抗原的氨基酸序列。
表9：OX40抗原的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001051
Figure BDA0003044135750001061
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括OX40激动剂，所述OX40激动剂以约100pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约90pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约80pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约70pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约60pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约50pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约40pM以下的KD结合人或鼠OX40或以约30pM以下的KD结合人或鼠OX40。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括OX40激动剂，所述OX40激动剂以约7.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠OX40、以约8×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠OX40、以约8.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠OX40、以约9×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠OX40、以约9.5×105 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠OX40或以约1×106 1/M·s以上的kassoc结合人或鼠OX40。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括OX40激动剂，所述OX40激动剂以约2×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.1×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.2×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.3×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.4×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.5×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.6×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.7×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.8×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40、约2.9×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40或约3×10-5 1/s以下的kdissoc结合人或鼠OX40。
在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括OX40激动剂，所述OX40激动剂以约10nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约9nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约8nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约7nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约6nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约5nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约4nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约3nM以下的IC50结合人或鼠OX40、约2nM以下的IC50结合人或鼠OX40或约1nM以下的IC50结合人或鼠OX40。
在一些实施方式中，OX40激动剂是他利昔珠单抗(也被称为MEDI0562或MEDI-0562)。他利昔珠单抗可从AstraZeneca，Inc.的MedImmune子公司商购。他利昔珠单抗是免疫球蛋白G1-kappa、抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4，OX40，CD134)]、人源化和嵌合单克隆抗体。他利昔珠单抗的氨基酸序列列于表10。他利昔珠单抗包含：在301和301”位的N-糖基化位点，具有岩藻糖基化的复合双触角CHO型聚糖；在22-95位(VH-VL)、148-204位(CH1-CL)、265-325位(CH2)和371-429位(CH3)(以及22”-95”位、148”-204”位、265”-325”位和371”-429”位)的重链链内二硫键；在23'-88'位(VH-VL)和134'-194'位(CH1-CL)(以及23”'-88”'位和134”'-194”'位)的轻链内二硫键；在230-230'位和233-233”位的链间重链-重链二硫键；以及在224-214'位和224'-214”'位的链间重链-轻链二硫键。目前他利昔珠单抗在多种实体瘤适应症中的临床试验包括U.S.National Institutesof Health clinicaltrials.gov识别码NCT02318394和NCT02705482。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含由SEQ ID NO：56给出的重链和由SEQ ID NO：57给出的轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包括分别具有SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57中所示序列或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：57所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQID NO：56和SEQ ID NO：57所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含他利昔珠单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：58所示的序列及其保守氨基酸酸取代，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：59所示的序列及其保守氨基酸酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ IDNO：58和SEQ ID NO：59所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含分别与SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含：分别具有SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62所示序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65所示序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方式中，OX40激动剂是由药物监管机构参考他利昔珠单抗批准的OXA40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)且与参考药物产品或参考生物产品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物产品是他利昔珠单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的OX40激动剂抗体，其中，以不同于参考药物产品或参考生物产品的制剂的制剂提供OX40激动剂抗体，其中，参考药物产品或参考生物制剂产品是他利昔珠单抗。OX40激动剂抗体可得到药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)的授权。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是他利昔珠单抗。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是他利昔珠单抗。
表10：与他利昔珠单抗相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001081
Figure BDA0003044135750001091
在一些实施方式中，OX40激动剂是11D4，其是可从Pfizer，Inc.商购的全人抗体。11D4的制备和性质描述于美国专利号7,960,515、8,236,930和9,028,824，其公开内容通过引用并入本文。表11列出了11D4的氨基酸序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含由SEQ ID NO：66给出的重链和由SEQ ID NO：67给出的轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67中所示的序列或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示的序列具有至少99％序列同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示的序列具有至少98％序列同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示的序列具有至少97％序列同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示的序列具有至少96％序列同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67所示的序列具有至少95％序列同一性的重链和轻链。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含11D4的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：68所示的序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：69所示的序列，及其保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71和SEQID NO：72所示序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75所示序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构参考11D4批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)且与参考药物产品或参考生物产品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物产品为11D4。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的OX40激动剂抗体，其中，以不同于参考药物产品或参考生物产品的制剂的制剂提供OX40激动剂抗体，其中，参考药物产品或参考生物制剂产品是11D4。OX40激动剂抗体可得到药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)的授权。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是11D4。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是11D4。
表11：与11D4有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001101
Figure BDA0003044135750001111
在一些实施方式中，OX40激动剂是18D8，其是可从Pfizer，Inc.商购的全人抗体。18D8的制备和性质描述于美国专利号7,960,515、8,236,930和9,028,824，其公开内容通过引用并入本文。表12列出了18D8的氨基酸序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含由SEQ ID NO：76给出的重链和由SEQ ID NO：77给出的轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包括分别具有SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77中所示的序列或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQID NO：76和SEQ ID NO：77所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含18D8的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：78所示的序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：79所示的序列，及其保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81和SEQID NO：82所示序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：85所示序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构参考18D8批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)且与参考药物产品或参考生物产品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物产品是18D8。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的OX40激动剂抗体，其中，以不同于参考药物产品或参考生物产品的制剂的制剂提供OX40激动剂抗体，其中，参考药物产品或参考生物制剂产品是18D8。OX40激动剂抗体可得到药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)的授权。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是18D8。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是18D8。
表12：与18D8有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001121
Figure BDA0003044135750001131
在一些实施方式中，OX40激动剂是Hu119-122，其是可从GlaxoSmithKline plc.商购的人源化抗体。Hu119-122的制备和性质描述于美国专利号9,006,399和9,163,085以及国际专利公开号WO2012/027328中，其公开内容通过引用并入本文。表13列出了Hu119-122的氨基酸序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含Hu119-122的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：86所示的序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：87所示的序列及其保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ IDNO：86和SEQ ID NO：87所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89和SEQID NO：90所示序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93所示序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构参考Hu119-122批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)且与参考药物产品或参考生物产品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的OX40激动剂抗体，其中，以不同于参考药物产品或参考生物产品的制剂的制剂提供OX40激动剂抗体，其中，参考药物产品或参考生物制剂产品是Hu119-122。OX40激动剂抗体可得到药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)的授权。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是Hu119-122。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是Hu119-122。
表13：与Hu119-122有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001141
在一些实施方式中，OX40激动剂是Hu106-222，其是可从GlaxoSmithKline plc.商购的人源化抗体。Hu106-222的制备和性质描述于美国专利号9,006,399和9,163,085以及国际专利公开号WO2012/027328中，其公开内容通过引用并入本文。Hu106-222的氨基酸序列在表14中列出。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含Hu106-222的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：94所示的序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：95所示的序列，及其保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方式中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97和SEQID NO：98所示序列及其保守性氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：101所示序列及其保守性氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方式中，OX40激动剂是药物监管机构参考Hu106-222批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如97％、98％、99％或100％序列同一性)且与参考药物产品或参考生物产品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的OX40激动剂抗体，其中，OX40激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物产品的制剂的形式提供，其中，参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。OX40激动剂抗体可得到药品监管机构(例如美国FDA和/或欧盟EMA)的授权。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。在一些实施方式中，生物类似物以还包含一种以上赋形剂的组合物的形式提供，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物产品是Hu106-222。
表14：与Hu106-222有关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001151
Figure BDA0003044135750001161
在一些实施方式中，OX40激动剂抗体是MEDI6469(也称为9B12)。MEDI6469是鼠单克隆抗体。Weinberg等，J.Immunother.2006，29，575-585。在一些实施方式中，OX40激动剂是由Biovest Inc.(Malvern，马萨诸塞州，美国)保藏的9B12杂交瘤产生的抗体，如在Weinberg等，J.Immunother.2006，29，575-585中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，抗体包含MEDI6469的CDR序列。在一些实施方式中，抗体包含MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一个实施方式中，OX40激动剂是L106 BD(Pharmingen产品#340420)。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen产品#340420)的CDR。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen产品#340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方式中，OX40激动剂是ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的CDR。在一些实施方式中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa CruzBiotechnology，目录号20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方式中，OX40激动剂是鼠单克隆抗体抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，可从InVivoMAb，BioXcellInc，West Lebanon，NH商购。
在一个实施方式中，OX40激动剂选自国际专利申请公开号WO95/12673、WO95/21925、WO2006/121810、WO2012/027328、WO2013/028231、WO2013/038191和WO2014/148895；欧洲专利申请EP0672141；美国专利申请公开号US2010/136030、US2014/377284、US2015/190506和US2015/132288(包括克隆20E5和12H3)；以及美国专利号7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399和9,163,085中描述的OX40激动剂，其各自公开内容均通过引用整体并入本文。
在一个实施方式中，OX40激动剂是如结构I-A(C末端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc抗体片段融合蛋白)中所述的OX40激动性融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A和I-B的性质如上所述和描述于美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460，其公开内容通过引用并入本文。表6给出了结构I-A的多肽结构域的氨基酸序列。Fc结构域优选包含完整的恒定结构域(SEQ ID NO：31的氨基酸17-230)、完整的铰链结构域(SEQ ID NO：31的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQID NO：31的氨基酸4-16)。用于连接C末端Fc抗体的优选的接头可以选自SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：41给出的实施方式，包括适合于融合其他多肽的接头。同样，表7中给出了结构I-B的多肽结构域的氨基酸序列。如果Fc抗体片段融合至TNRFSF融合蛋白的N-末端(如结构I-B)，则Fc模块的序列优选为SED ID NO：42所示的序列，接头序列优选选自SED ID NO：43至SEQ ID NO：45所示的那些实施方式。
在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上选自下组的OX40结合结构域：他利昔珠单抗的可变重链和可变轻链、11D4的可变重链和可变轻链、18D8的可变重链和可变轻链、Hu119-122的可变重链和可变轻链、Hu106-222的可变重链和可变轻链、选自表19中所述可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链，前述可变重链和可变轻链的任何组合，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含OX40L序列的OX40结合结构域。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含序列SEQ ID NO：102的OX40结合结构域。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含可溶性OX40L序列的OX40结合结构域。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含序列SEQID NO：103的OX40结合结构域。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上包含序列SEQ ID NO：104的OX40结合结构域。
在一个实施方式中，根据结构1A或1B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域为包含VH和VL区的scFv结构域，VH和VL区分别与SEQ ID NO：NO：58和SEQ ID NO：59中所示序列具有至少95％同一性，其中，VH和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含FH和VL区的scFv结构域，VH和VL区分别与SEQ ID NO：68和SEQID NO：69所示序列具有至少95％同一性，其中，VH和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH和VL区的scFv结构域，该VH和VL区分别与SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示序列具有至少95％同一性，其中，VH和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含FH和VL区的scFv结构域，VH和VL区分别与SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示序列具有至少95％同一性，其中，VH和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含VH和VL区的scFv结构域，VH和VL区分别与SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95所示序列具有至少95％同一性，其中，VH和VL结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该OX40结合结构域是包含FH和VL区的scFv结构域，VH和VL区与表15中所示VH和VL序列具有至少95％同一性，其中，VH和VL结构域通过接头连接。
表15：用作融合蛋白中OX40结合结构域(例如结构I-A和I-B)或用作scFv OX40激动剂抗体的其他多肽结构域
Figure BDA0003044135750001181
Figure BDA0003044135750001191
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性OX40结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性OX40结合结构域，其在N-末端和/或C-末端还包含其他结构域，其中所述其他结构域是Fab或Fc片段结构域。在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40结合结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性OX40结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性OX40结合结构域，还包含在N末端和/或C末端的其他结构域，其中，该其他结构域是Fab或Fc片段结构域，其中，每个可溶性OX40结合结构域缺少茎区域(有助于三聚作用并提供到细胞膜的一定距离，但不是OX40结合结构域的一部分)，并且第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中，每个可溶性TNF超家族细胞因子结构域缺少茎区域，并且第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，其中TNF超家族细胞因子结构域是OX40结合结构域。
在一些实施方式中，OX40激动剂是MEDI6383。MEDI6383是OX40激动性融合蛋白，可如美国专利号6,312,700中所述制备，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动性scFv抗体，其包含与任何前述VL结构域连接的任何前述VH结构域。
在一个实施方式中，OX40激动剂是Creative Biolabs OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可从Creative Biolabs，Inc.(美国纽约州雪莉市)商购。
在一个实施方式中，OX40激动剂是OX40激动性抗体克隆Ber-ACT35，可从BioLegend，Inc.(美国加利福尼亚州圣地亚哥)商购。
可选的细胞活力分析
可选地，可以在第一次扩增(有时称为初始大量扩增)后，使用本领域已知的标准检测法进行细胞活力检测。例如，可以对大量TIL的样品进行台盼蓝拒染实验，其选择性地标记死细胞并允许活力评估。用于测试活力的其他检测可包括但不限于阿尔玛蓝测定法(Alamar blue assay)以及MTT检测。
细胞计数、活力、流式细胞术
在一些实施方式中，进行细胞计数和/或测量活力。可以使用FACSCantoTM流式细胞仪(BD Biosciences)，用抗体(例如但不限于可从BD Bio-sciences(BD Biosciences,加利福尼亚圣何塞)商购的那些)通过流式细胞术来测量标志物(例如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56)以及本文公开或描述的任何其他标志物的表达。可以使用一次性c-芯片血细胞计数器(VWR，巴达维亚，伊利诺伊州)手动计数细胞，并且可以使用本领域已知的任何方法评估活力，包括但不限于台盼蓝染色。也可基于美国申请15/863,634“Processes forProduction of Tumor Infiltrating Lymphocytes and Uses of Same inImmunotherapy”来分析细胞的活力，其全部内容通过引用并入本文。
在一些情况下，可以使用下文讨论的方案立即冷冻保存大量TIL群。或者，可以对大量TIL群进行REP，然后如下所述进行冷冻保存。类似地，在经基因修饰的TIL将会用于治疗的情况下，可以对大量TIL群或REP TIL群进行基因修饰以用于合适的治疗。
根据本公开，测定TIL活力和/或进一步用于施用于受试者的方法。在一些实施方式中，测定肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法包括：
(i)获得第一TIL群；
(ii)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；以及
(iii)通过向第二TIL群的细胞培养基中补充另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第三TIL群的数量至少是第二TIL群的50倍；
(iv)收获、洗涤和冷冻保存第三TIL群；
(v)在冷冻温度下储存冷冻保存的TIL；
(vi)解冻第三TIL群，提供解冻的第三TIL群；
(vii)通过向第三群的细胞培养基中补充IL-2、OKT-3和APC，对解冻的第三TIL群的一部分进行另外的第二次扩增，持续至少3天的另外的扩增阶段(有时称为reREP阶段)；其中，进行第三次扩增，获得第四TIL群；其中，将第四TIL群中的TIL数量与第三TIL群中的TIL数量进行比较，获得比率；
(viii)基于步骤(vii)中的比率，确定解冻的TIL群是否适合施用于患者；
(ix)当在步骤(viii)中确定第四TIL群中的TIL数量与第三TIL群中的TIL数量的比率大于5：1时，将治疗有效剂量的解冻的第三TIL群施用于患者。
在一些实施方式中，在步骤(vii)之后测定TIL的活力。
本公开还提供了测定TIL的其他方法。在一些实施方式中，本公开提供了测定TIL的方法，所述方法包括：
(i)获得冷冻保存的第一TIL群的一部分；
(ii)解冻冷冻保存的第一TIL群的该部分；
(iii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群的该部分来进行第一次扩增，持续至少3天的另外的扩增阶段(有时称为reREP阶段)，产生第二TIL群；其中，将第一TIL群的该部分与第二TIL群进行比较，获得TIL数量的比率；其中，第二TIL群的TIL数量与第一TIL群的该部分的TIL数量的比率大于5：1；
(iv)基于步骤(iii)中的比率，确定第一TIL群是否适合用于对患者的治疗性施用；
(v)当在步骤(iv)中确定第二TIL群中的TIL数量与第一TIL群中的TIL数量的比率大于5：1时，确定第一TIL群适合用于治疗性施用。
在一些实施方式中，第二TIL群中的TIL数量与第一TIL群的该部分的TIL数量的比率大于50：1。
在一些实施方式中，方法还包括根据如本文提供的任何实施方式中所述的方法，对步骤(i)的冷冻保存的整个第一TIL群进行扩增。
在一些实施方式中，方法还包括将步骤(i)的冷冻保存的整个第一TIL群施用于患者。
细胞培养基
在一个实施方式中，扩增TIL的方法，包括上文讨论以及在图1中举例说明的那些，可以包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或者约5,800mL至约8700mL的细胞培养基。在一些实施方式中，培养基是无血清培养基。在一些实施方式中，第一次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方式中，第二次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方式中，第一次扩增和第二次扩增中的培养基均是无血清的。在一个实施方式中，使用不超过一种类型的细胞培养基扩增TIL的数量。可以使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen，Carlsbad CA)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增TIL数量所需的培养基的量和培养基的种类数量。在一个实施方式中，扩增TIL的数量可以包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率喂养细胞。在透气容器中扩增细胞的数量通过降低扩增细胞所需的喂养频率，简化了扩增细胞数量所需的程序。
在一些实施方式中，在本文公开的扩增过程中使用的培养基是无血清培养基或成分明确的培养基。在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代品。在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基用于预防和/或减少部分由于含血清培养基的批次间变化导致的实验差异。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代品。在一些实施方式中，基础细胞培养基包含但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无异源体系(Xeno-Free)培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM，Minimal Essential Medium)、基础培养基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最小必需培养基(αMEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和Iscove的改良Dulbecco培养基。
在一些实施方式中，血清补充剂或血清替代品包括但不限于一种以上CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代品、一种以上白蛋白或白蛋白替代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代物、一种以上胶原前体、一种以上抗生素以及一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分明确的培养基包含白蛋白和一种以上选自下组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，成分明确的培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代品与常规生长培养基一起使用，常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无异源体系培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、基础培养基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最小必需培养基(αMEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和Iscove的改良Dulbecco培养基。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基中的血清替代品总浓度(体积％)为无血清培养基或成分明确的培养基总体积的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方式中，血清替代品总浓度为无血清培养基或成分明确的培养基的总体积的约3％。在一些实施方式中，血清替代品总浓度为无血清培养基或成分明确的培养基的总体积的约5％。在一些实施方式中，血清替代品总浓度为无血清培养基或成分明确的培养基的总体积的约10％。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基是CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。CTSTMOpTmizerTM的任何制剂可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM是1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mLCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合(使用前混合在一起)。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，成分明确的培养基是CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(ThermoFisher Scientific)。CTSTMOpTmizerTM的任何制剂可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM是1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合(使用前混合在一起)。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺，并且还包含约3000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺，并且还包含约6000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM的2-巯基乙醇，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM的2-巯基乙醇，并且还包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)和55mM的2-巯基乙醇，并且还包含约1000IU/mL至约6000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约1000IU/mL至约8000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约3000IU/mL的IL-2。在一些实施方式中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM中补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代品(SR)(ThermoFisher Scientific)和约2mM谷氨酰胺，并且还包含约6000IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即
Figure BDA0003044135750001251
)。在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即
Figure BDA0003044135750001252
)。
在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方式中，无血清培养基或成分明确的培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施方式中，国际PCT公开号WO/1998/030679中描述的成分明确的培养基(其内容通过引用并入本文)可用于本发明。在该公开物中，描述了无血清的真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养物中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含或通过组合一种以上选自下组的成分获得：一种以上白蛋白或白蛋白替代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代品、一种以上胶原前体、一种以上微量元素以及一种以上抗生素。在一些实施方式中，成分明确的培养基还包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方式中，成分明确的培养基包含白蛋白或白蛋白替代物和一种以上选自下组的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代品、一种以上胶原前体和一种以上微量元素。在一些实施方式中，成分明确的培养基包含白蛋白和一种以上选自下组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、铁饱和转铁蛋白、胰岛素以及含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方式中，基础细胞培养基选自：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、基础培养基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最小必需培养基(αMEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基，以及Iscove的改良Dulbecco培养基。
在一些实施方式中，在成分明确的培养基中，甘氨酸的浓度为约5mg/L至200mg/L，L-组氨酸的浓度为约5mg/L至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5mg/L至300mg/L，L-蛋氨酸的浓度为约5mg/L至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5mg/L至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1mg/L至1000mg/L，L-羟脯氨酸的浓度为约1mg/L至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1mg/L至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10mg/L至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2mg/L至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3mg/L至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5mg/L至500mg/L，硫胺素的浓度为约1mg/L至20mg/L，还原型谷胱甘肽的浓度为约1mg/L至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度为约1mg/L至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1mg/L至50mg/L，胰岛素的浓度为约1mg/L至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001mg/L至0.0001mg/L，白蛋白(例如
Figure BDA0003044135750001262
I)的浓度为约5000mg/L至50,000mg/L。
在一些实施方式中，成分明确的培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基中的浓度范围”下所列的浓度范围存在。在其他实施方式中，成分明确的培养基中的非微量元素部分成分以下表A中标题“1X培养基中的优选实施方式”下所列的浓度范围存在。在其他实施方式中，成分明确的培养基是包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在这些实施方式的一些中，无血清补充剂包含下表A中标题“补充剂中的优选实施方式”所列类型和浓度的非痕量部分成分。
表A：非微量元素部分成分的浓度
Figure BDA0003044135750001261
Figure BDA0003044135750001271
在一些实施方式中，成分明确的培养基的摩尔渗透压浓度(osmolarity)为约260mOsmol至350mOsmol。在一些实施方式中，摩尔渗透压浓度为约280mOsmol至310mOsmol。在一些实施方式中，成分明确的培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L的碳酸氢钠。成分明确的培养基还可以补充有L-谷氨酰胺(终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(终浓度为约100μM)。
在一些实施方式中，Smith等，“Ex vivo expansion of human T cells foradoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement”，Clin Transl Immunology，2015，4(1)(doi：10.1038/cti.2014.31)中描述的成分明确的培养基可用于本发明。简而言之，将RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基，并补充有0、2％，5％或10％的CTSTM免疫细胞血清替代品。
在一个实施方式中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基未经过滤。使用未过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需步骤。在一个实施方式中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基不含β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS60-24-2)。
在一个实施方式中，所述方法的持续时间包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在其中装有细胞培养基的第一透气容器中培养肿瘤组织样品；由肿瘤组织样品获得TIL；在装有细胞培养基的第二透气容器中扩增TIL的数量持续约7天至14天，例如约11天。在一些实施方式中，pre-REP为约7天至14天，例如约11天。在一些实施方式中，REP为约7天至14天，例如约11天。
在一个实施方式中，在透气容器中扩增TIL。使用本领域已知的方法、组成和装置，包括在美国专利申请公开号US2005/0106717A1中描述的那些(其公开内容通过引用并入本文)，使用透气容器，用PBMC来扩增TIL。在一个实施方式中，TIL在透气袋中扩增。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如Xuri细胞扩增系统W25(Xuri Cell Expansion System W25)(GE Healthcare)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统来扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如OMNI
Figure BDA0003044135750001281
细胞培养袋(Lampire Biological Laboratories)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增TIL，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增TIL，例如EXP-PAKTM细胞扩增生物容器(CharterMedical)。在一个实施方式中，用于扩增TIL的细胞扩增系统的每次扩增步骤使用相同的透气容器。在一个实施方式中，用于扩增TIL的细胞扩增系统的每次扩增步骤使用不同的透气容器。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，其体积选自约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L。
在一个实施方式中，可在G-Rex烧瓶(可从Wilson Wolf Manufacturing商购)中扩增TIL。此类实施方式允许细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增为10×106～30×106个细胞/cm2。在一个实施方式中，无需喂养细胞。在一个实施方式中，只要培养基在G-Rex烧瓶中位于约10cm的高度，就不进行喂养。在一个实施方式中，不进行喂养但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方式中，细胞因子可以作为丸剂添加而无需将细胞因子与培养基混合。此种容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增TIL，并且包括在美国专利申请公开号US2014/0377739A1、国际公开号WO2014/210036A1、美国专利申请公开号US2013/0115617Al、国际公开号WO2013/188427A1、美国专利申请公开号US2011/0136228A1、美国专利号US8,809,050B2、国际公开号WO2011/072088A2、美国专利申请公开号US2016/0208216A1、美国专利申请公开号US2012/0244133A1、国际公开号WO2012/129201A1、美国专利申请公开号US2013/0102075A1，美国专利号US8,956,860B2、国际公开号WO2013/173835A1和美国专利申请公开号US2015/0175966A1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。这些方法也描述于Jin等，J.I mmunotherapy 2012,35,283-292。
可选的TIL的基因工程
在一些实施方式中，可选地对TIL进行基因工程改造以包括另外的功能，包括但不限于高亲和力T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或者NY-ESO-1)的TCR，或者与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或者谱系限制性细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。
用于生产TIL的封闭系统
本发明提供了TIL培养期间封闭系统的使用。此种封闭系统允许预防和/或减少微生物污染，允许使用更少的烧瓶，并允许降低成本。在一些实施方式中，封闭系统使用两个容器。
此种封闭系统在本领域中是公知的，并且可在例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guid ances/Blood/ucm076779.htm上找到。
无菌连接设备(STCD，sterile connecting device)在两根兼容管之间产生无菌连接处。该步骤允许无菌连接各种容器和管径。在一些实施方式中，封闭系统包括如实施例4中所述的鲁尔锁和热封系统。在一些实施方式中，在无菌条件下通过注射器进入封闭系统，以保持系统的无菌性和封闭性。在一些实施方式中，采用如实施例6所述的封闭系统。在一些实施方式中，根据实施例4“最终制剂和填充”中所述方法，将TIL配制成最终产品制剂。
在一些实施方式中，从获得肿瘤碎片的时间开始直至TIL准备好施用于患者或者冷冻保存，封闭系统使用一个容器。在一些实施方式中，当使用两个容器时，第一容器是封闭G容器，并且在不打开第一封闭G容器的情况下将TIL群离心并转移至输液袋。在一些实施方式中，当使用两个容器时，输液袋是含有HypoThermosol的输液袋。封闭系统或者封闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦添加了肿瘤样品和/或肿瘤碎片，系统就紧密密封与外界隔离，形成了一个不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵的封闭环境。
在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约100％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约95％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约90％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约10％至约90％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约15％至约85％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或者约100％。
封闭的系统允许在无微生物污染和/或微生物污染显著减少的情况下的TIL生长。
此外，各个TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压随着细胞的培养而变化。因此，即使循环了适用于细胞培养的培养基，封闭的环境仍然需要持续保持TIL增殖的最佳环境。为此，期望通过传感器来监测封闭环境的培养液中的物理因素(pH、二氧化碳分压和氧气分压)，其信号用于控制安装在培养环境入口处的气体交换器，根据培养液的变化实时调节封闭环境的气体分压，从而优化细胞培养环境。在一些实施方式中，本发明提供了封闭细胞培养系统，该系统包括在封闭环境入口处的配备有监测装置的气体交换器，该监测装置测量封闭环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压，并根据来自监控设备的信号自动调整气体浓度来优化细胞培养环境。
在一些实施方式中，连续或者间歇地控制封闭环境内的压力。即，例如可通过压力维持装置来改变封闭环境中的压力，从而确保该空间处于适用于TIL生长的正压状态，或者处于促进流体渗出的负压状态，从而促进细胞增殖。此外，通过间歇地施加负压，可通过封闭环境的体积的暂时收缩来均匀且有效地替换封闭环境中的循环液体。
在一些实施方式中，可以更换或者添加用于TIL增殖的最佳培养组分，并且可以添加例如IL-2和/或OKT3的因子及它们的组合。
可选的TIL的冷冻保存
如以上在图1的步骤A至E中所讨论的，冷冻保存可能发生在整个TIL扩增过程中的许多节点，包括在收获TIL后用于保存治疗产品的过程的最后阶段。在一些实施方式中，可以冷冻保存第二次扩增后的扩增的TIL群(例如根据图1的步骤D提供)。冷冻保存通常可通过将TIL群放入冷冻溶液(例如85％补体灭活的AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO))中完成。将溶液中的细胞放入冻存管中，在-80℃下储存24小时，并可选地转移至气态氮气冷冻机以冷冻保存。参见Sadeghi等，Acta Oncologica 2013,52,978-986。在一些实施方式中，将TIL冷冻保存在5％DMSO中。在一些实施方式中，将TIL冷冻保存在加有5％DMSO的细胞培养基中。在一些实施方式中，根据实施例6和7中提供的方法冷冻保存TIL。
适当时，将细胞从冷冻机中取出，在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中，并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域中已知的，可以对解冻的TIL进行计数并评估活力。
可以可选地冷冻保存大量TIL群或者扩增的TIL群。在一些实施方式中，对治疗性TIL群进行冷冻保存。在一些实施方式中，对第二次扩增后收获的TIL进行冷冻保存。在一些实施方式中，对图1的示例性步骤F中的TIL进行冷冻保存。在一些实施方式中，TIL冷冻保存在输液袋中。在一些实施方式中，在放入输液袋中之前对TIL进行冷冻保存。在一些实施方式中，对TIL进行冷冻保存并且不放置在输液袋中。在一些实施方式中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(DMSO)。这通常是通过将TIL群置于冷冻溶液中来完成，例如85％补体灭活的AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO)。将溶液中的细胞放入冻存管中，在-80℃下储存24小时，并可选地转移至气态氮气冷冻机进行冷冻保存。参见Sadeghi等，Acta Oncologica 2013,52,978-986。
适当时，将细胞从冷冻机中取出，在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中，并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域中已知的，可以对解冻的TIL进行计数并评估活力。
在一个优选实施方式中，使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10，BioL ifeSolutions)对TIL群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用包含二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基对TIL群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用1:1(体积：体积)比率的CS10和细胞培养基对TIL群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用约1∶1(体积：体积)比率的CS10和细胞培养基(还包含另外的IL-2)对TIL群进行冷冻保存。
如以上在步骤A至E中所讨论的，冷冻保存可能发生在整个TIL扩增过程中的许多节点。在一些实施方式中，可以冷冻保存根据步骤B的第一次扩增后的大量TIL群或者根据步骤D的一个以上第二次扩增后的扩增的TIL群。冷冻保存通常可通过将TIL群放入冷冻溶液(例如85％补体灭活的AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO))中完成。将溶液中的细胞放入冻存管中，在-80℃下储存24小时，并可选地转移至气态氮气冷冻机以冷冻保存。参见Sadeghi等，Acta Oncologica 2013,52,978-986。
适当时，将细胞从冷冻机中取出，在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中，并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域中已知的，可以对解冻的TIL进行计数并评估活力。
在一些情况下，可以使用下文讨论的方案立即对步骤B的TIL群进行冷冻保存。或者，可以对大量TIL群进行步骤C和D，然后在步骤D之后进行冷冻保存。类似地，在将基因修饰的TIL用于治疗的情况下，可以对步骤B或者步骤D的TIL群进行基因修饰以用于适当的治疗。
药物组合物、剂量和施用方案
在一个实施方式中，将使用本公开方法扩增的TIL作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是TIL在无菌缓冲液中的悬液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域已知的任何合适途径施用。在一些实施方式中，T细胞以单次动脉内或静脉内输注施用，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可以施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方式中，特别是当癌是黑色素瘤时，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL。在一个实施方式中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，特别是当癌是黑色素瘤时，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的数量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL数量的范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度小于药物组合物的例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％，或0.0001％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％，或者0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度范围为药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度范围为药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或者v/v。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或者0.0001g。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或者10g。
本发明的药物组合物中提供的TIL在宽剂量范围内有效。精确的剂量取决于施用途径、施用化合物的形式、待治疗对象的性别和年龄、待治疗对象的体重，以及主治医师的偏好和经验。如果合适，也可以使用临床确定的TIL剂量。使用本文方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量，将取决于所治疗的人或哺乳动物、病症或病症的严重程度、施用率、活性药物成分的配置和处方医生的自由裁量权。
在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，TIL可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每2天一次。只要有必要，TIL的施用可以继续。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg，或者约2.85mg/kg至约2.95mg/kg。
在一些实施方式中，TIL的有效剂量的范围为约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg，或者约198至约207mg。
有效量的TIL可通过具有类似用途的药剂的任何可接受的施用方式以单剂量或多剂量施用，包括鼻内和透皮途径，通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、局部，通过移植或者通过吸入。
治疗患者的方法
治疗方法从初始TIL的收集和TIL的培养开始。例如，此类方法在本领域中已被Jin等，J.Immunotherapy，2012，35(3)：283-292描述，其通过引用整体并入本文。下文整个部分(包括实施例)描述了治疗方法的实施方式。
发现根据本文所述的方法(包括例如在上述步骤A至F中所述或者根据上述步骤A至F(例如也在图1中所示))产生的扩增的TIL在治疗癌症患者中具有特定用途(例如，如在Goff等，J.Clinical Oncology,2016,34(20):2389-239以及补充内容中所述；通过引用全文并入本文)。在一些实施方式中，如先前所述，由切除的转移性黑色素瘤沉积物来生长TIL(参见，Dudley等，J Immunother.,2003,26:332-342；通过引用整体并入本文)。新鲜肿瘤可在无菌条件下解剖。可以收集代表性样品用于正式病理分析。可以使用2mm3至3mm3的单个碎片。在一些实施方式中，每名患者获得5、10、15、20、25或者30个样品。在一些实施方式中，每名患者获得20、25或者30个样品。在一些实施方式中，每名患者获得20、22、24、26或者28个样品。在一些实施方式中，每名患者获得24个样品。可以将样品置于24孔板的各个孔中，保持在具有高剂量IL-2(6,000IU/mL)的生长培养基中，并监测肿瘤的破坏和TIL的增殖。如本文所述，可将处理后剩余有活细胞的任何肿瘤酶消化成单细胞悬液并冷冻保存。
在一些实施方式中，可以对成功生长的TIL进行取样以进行表型分析(CD3、CD4、CD8和CD56)，在有条件时针对自体肿瘤进行测试。如果过夜共培养产生的干扰素-γ(IFN-γ)水平>200pg/mL且是背景的2倍，则认为TIL具有活性(reactive)。(Goff等，JImmunother.,2010,33:840-847；通过引用整体并入本文)。在一些实施方式中，可以选择表现出自体反应性(autologous reactivity)或者充分生长模式的培养物用于第二次扩增(例如在根据图1的步骤D中所提供的第二次扩增)，包括有时称为快速扩增(REP)的第二次扩增。在一些实施方式中，选择具有高自体反应性(例如，第二次扩增期间高增殖)的扩增的TIL用于另外的第二次扩增。在一些实施方式中，选择具有高自体反应性(例如，在如图1的步骤D中所提供的第二次扩增期间高增殖)的TIL用于根据图1的步骤D的另外的第二次扩增。
在一些实施方式中，患者不直接进行ACT(过继性细胞转移)，例如，在一些实施方式中，在收获肿瘤和/或第一次扩增后，不立即使用细胞。在此类实施方式中，TIL可以冷冻保存并在给患者施用前2天解冻。在此类实施方式中，TIL可以冷冻保存并在给患者施用前1天解冻。在一些实施方式中，TIL可以冷冻保存并在给患者施用前即刻解冻。
可通过流式细胞术(例如FlowJo)以及本文所述的任何方法，分析冷冻保存的输液袋TIL样品的细胞表型的表面标志物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA(BD Biosciences)。通过使用标准酶联免疫吸附测定技术，检测血清细胞因子。血清IFN-γ升高被定义为>100pg/mL且大于4 3基线水平。
在一些实施方式中，通过本文提供的方法产生的TIL(例如图1中示例的那些)提供了令人惊讶的TIL的临床疗效的改善。在一些实施方式中，与通过除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1示例的那些之外的方法)产生的TIL相比，通过本文提供的方法产生的TIL(例如图1中示例的那些)显示出增加的临床疗效。在一些实施方式中，除本文所述那些之外的方法包括被称为过程1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施方式中，增加的疗效通过DCR、ORR和/或其他临床反应来测量。在一些实施方式中，与通过除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1中示例的那些之外的方法，例如Gen1过程)产生的TIL相比，通过本文提供的方法(例如图1中示例的那些)产生的TIL显示出相似的反应时间和安全性特征。
在一些实施方式中，IFN-伽马(IFN-γ)指示治疗疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，用TIL治疗的受试者血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方式中，采用IFN-γ产生的效价测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。可通过测定用本发明方法(包括例如图1所述的那些)制备的TIL治疗的受试者离体血液、血清或者TIL中细胞因子IFN-γ的水平，来检测IFN-γ的产生。在一些实施方式中，IFN-γ的增加指示用本发明方法产生的TIL治疗患者的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ增加了1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了3倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了4倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了5倍。在一些实施方式中，使用Quantikine ELISA试剂盒检测IFN-γ。在一些实施方式中，在用本发明方法制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中检测IFN-γ，包括例如图1中描述的那些。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图1所述的那些)制备的TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图1所述的那些)制备的TIL治疗的受试者的TIL血清中的IFN-γ。
在一些实施方式中，与通过其他方法(包括非图1中所示的那些方法，例如被称为过程1C过程的方法)产生的TIL相比，通过本发明的方法(包括例如图1中所述的那些)制备的TIL表现出增加的多克隆性。在一些实施方式中，明显改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或临床功效的增加。在一些实施方式中，多克隆性指T细胞库多样性。在一些实施方式中，多克隆性的增加可以指示就施用本发明的方法产生的TIL而言的治疗功效。在一些实施方式中，使用除本文提供的方法之外的方法(包括例如除图1所述那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方式中，使用除本文提供的方法之外的方法(包括例如除图1所述那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了1倍。在一些实施方式中，使用除本文提供的方法之外的方法(包括例如除图1所述那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了2倍。在一些实施方式中，使用除本文提供的方法之外的方法(包括例如除图1所述那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了10倍。在一些实施方式中，使用除本文提供的方法之外的方法(包括例如除图1所述那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了100倍。在一些实施方式中，使用除本文提供的方法之外的方法(包括例如除图1所述那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了500倍。在一些实施方式中，使用除本文提供的方法之外的方法(包括例如除图1所述那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了1000倍。
如本领域已知的以及如本文所述，功效的量度可包括疾病控制率(DCR)以及总反应率(ORR)。
治疗癌症和其他疾病的方法
本文所述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一个实施方式中，它们用于治疗过度增殖性疾病。它们还可以用于治疗如此处及以下段落中描述的其他病症。
在一些实施方式中，过度增殖性疾病是癌症。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是实体瘤癌症。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是血液恶性肿瘤。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注TIL之前用非清髓性化疗预治疗患者。在一个实施方式中，非清髓性化疗是以60mg/kg/天施用环磷酰胺持续2天(TIL输注前第27和26天)和以25mg/m2/天施用氟达拉滨持续5天(TIL输注前第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和TIL输注(在第0天)后，患者以720,000IU/kg每8小时接受一次IL-2的静脉输注，直至生理耐受。
本文所述化合物和化合物组合在治疗、预防和/或控制所示疾病或病症中的疗效可使用本领域已知的各种模型进行测试，为人类疾病的治疗提供指导。例如，用于确定卵巢癌治疗疗效的模型描述于例如Mullany等，Endocrinology 2012,153,1585-92；以及Fong等，J.Ovarian Res.2009,2,12。用于确定胰腺癌治疗疗效的模型描述于Herreros-Villanueva等，World J.Gastroenterol.2012,18,1286-1294。用于确定乳腺癌治疗疗效的模型描述于例如Fantozzi，Breast Cancer Res.2006,8,212。用于确定黑色素瘤治疗疗效的模型描述于例如Damsky等，Pigment Cell&Melanoma Res.2010,23,853–859。用于确定肺癌治疗疗效的模型描述于例如Meuwissen等，Genes&Development,2005,19,643-664。用于确定肺癌治疗疗效的模型描述于例如Kim,Clin.Exp.Otorhinolaryngol.2009,2,55-60；以及Sano,Head Neck Oncol.2009,1,32。
在一些实施方式中，IFN-伽马(IFN-γ)指示过度增殖性疾病治疗的治疗疗效。在一些实施方式中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方式中，采用了IFN-γ产生的效价测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。可通过测定用本发明方法(包括例如图1中所述那些)制备的TIL治疗受试者的血液中细胞因子IFN-γ的水平，来检测IFN-γ的产生。在一些实施方式中，与用称为过程1C的方法(如图5和/或图6中所示)制备的TIL治疗的受试者相比，本发明方法获得的TIL在用本发明方法的TIL治疗的受试者的血液中提供增加的IFN-γ。在一些实施方式中，IFN-γ的增加指示用本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ增加了1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了3倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了4倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，IFN-γ的分泌增加了5倍。在一些实施方式中，使用Quantikine ELISA试剂盒检测IFN-γ。在一些实施方式中，使用Quantikine ELISA试剂盒检测IFN-γ。在一些实施方式中，在用本发明的方法产生的TIL治疗的患者离体的TIL中，测量IFN-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法产生的TIL治疗的患者的血液中的IFN-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法产生的TIL治疗的患者的血清中的IFN-γ。
在一些实施方式中，与通过其他方法(包括在图1中未示例说明的那些，例如称为过程1C的方法)产生的TIL相比，通过本发明的方法(包括例如图1中所述那些)制备的TIL显示出增加的多克隆性。在一些实施方式中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示癌症治疗的疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，多克隆性指T细胞谱系多样性。在一些实施方式中，多克隆性的增加可以指示关于施用本发明方法产生的TIL的治疗疗效。在一些实施方式中，与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL相比，多克隆性增加了1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或者1000倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了10倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了100倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了500倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图1所示那些之外的方法)制备的TIL治疗的患者相比，多克隆性增加了1000倍。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗患者癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效剂量的TIL，所述TIL使用由冷冻肿瘤组织扩增TIL的任何前述方法来制备。在一些实施方式中，癌症为实体瘤癌症。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，癌症为血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤选自：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
在一些实施方式中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含TIL和药学上可接受的载体，所述TIL使用由冷冻肿瘤组织扩增TIL的任何前述方法制备。
本发明提供了用于治疗患者癌症的方法的药物组合物，该药物组合物包含TIL和药学上可接受的载体，所述TIL使用由冷冻肿瘤组织扩增TIL的任何前述方法来制备，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的药物组合物。在一些实施方式中，癌症为实体瘤癌症。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，癌症为血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤选自：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
本发明提供了药物组合物在治疗患者癌症的方法中的用途，该药物组合物包含TIL和药学上可接受的载体，所述TIL使用由冷冻肿瘤组织扩增TIL的任何前述方法来制备，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的药物组合物。在一些实施方式中，癌症为实体瘤癌症。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，癌症为血液系统恶性肿瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤选自：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
共同施用的方法
在一些实施方式中，如本文所述产生的TIL(包括例如来自图1的步骤A至F中所述方法的TIL)可与一种以上免疫检查点调节剂(例如下文描述的抗体)组合施用。例如，靶向PD-1并且可与本发明的TIL共同施用的抗体包括例如但不限于：尼沃鲁单抗(BMS-936558，百时美施贵宝；
Figure BDA0003044135750001421
)，帕博利珠单抗(lambrolizumab，MK03475或MK-3475，默克；
Figure BDA0003044135750001422
)，人源化抗PD-1抗体JS001(ShangHai JunShi)，单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro,Inc.)，匹地利珠单抗(pidilizumab)(抗PD-1mAb CT-011,Medivation)，抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(BeiGene)和/或抗PD-1抗体SHR-1210(ShangHai HengRui)，人单克隆抗体REGN2810(Regeneron)，人单克隆抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)，和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(Novartis)。在一些实施方式中，PD-1抗体来自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。适用于根据本文所述步骤A至F产生的TIL的共同施用方法的其它合适的抗体是美国专利号8,008,449中公开的抗PD-1抗体，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-L1并抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。任何本领域已知的与PD-L1结合并破坏PD-1和PD-L1之间相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体，均适合用于根据本文所述步骤A至F产生的TIL的共同施用方法。例如，靶向PD-L1并且处于临床试验中的抗体包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)和MPDL3280A(Genentech)。靶向PD-L1的其他合适的抗体公开于美国专利号7,943,743中，其通过引用并入本文。本领域普通技术人员将理解，任何与PD-1或PD-L1结合、破坏PD-1/PD-L1相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体，均适合用于根据本文所述步骤A至F产生的TIL的共同施用方法。在一些实施方式中，当患者具有难以用单独施用抗PD-1抗体治愈的癌症类型时，施用根据步骤A至F产生的TIL组合的受试者被共同施用抗PD-1抗体。在一些实施方式中，当患者患有难治性黑色素瘤时，给患者施用抗PD-1与TIL的组合。在一些实施方式中，当患者患有非小细胞肺癌(NSCLC)时，给患者施用抗PD-1与TIL的组合。
可选的患者的淋巴细胞耗竭预治疗
在一个实施方式中，本发明包括用TIL群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注TIL之前用非清髓性化疗对患者进行预治疗。在一个实施方式中，本发明包括用于治疗患者的癌症的TIL群，该患者已用非清髓性化疗进行预治疗。在一个实施方式中，TIL群用于通过输注施用。在一个实施方式中，非清髓性化疗是以60mg/kg/天施用环磷酰胺持续2天(TIL输注前第27和26天)和以25mg/m2/天施用氟达拉滨持续5天(TIL输注前第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和TIL输注(在第0天)后，患者以720,000IU/kg每8小时接受一次IL-2(阿地白细胞介素，作为PROLEUKTN市售)的静脉输注，直至生理耐受。在某些实施方式中，TIL群与IL-2组合用于治疗癌症；其中，IL-2在TIL群之后施用。
实验结果表明，过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前的淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争成分(“细胞因子沉降”)而在提高治疗疗效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的TIL之前对患者使用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。
通常，采用施用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)及它们的组合来完成淋巴细胞耗竭。此种方法描述于Gassner等，Cancer I mmunol I mmunother.2011，60，75–85；Muranski等，Nat.Clin.Pract.Oncol.，2006，3，668–681、Dudley等；J.Clin.Oncol.2008，26，5233-5239和Dudley等，J.Clin.Oncol.2005，23，2346–2357，所有这些文献都通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4至5天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4至5天。
在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得0.5μg/mL至10μg/mL浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得1μg/mL浓度的马磷酰胺(活性形式的环磷酰胺)。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方式中，静脉注射(即i.v.)施用环磷酰胺。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉注射施用4至5天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉注射施用4天。
在一些实施方式中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺共同施用于患者来进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方式中，氟达拉滨以25mg/m2/天静脉注射施用且环磷酰胺以250mg/m2/天静脉注射施用，持续4天。
在一个实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天，来进行淋巴细胞耗竭。
IL-2方案
在一个实施方式中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案；其中，高剂量IL-2方案包括：在施用治疗有效份的治疗性TIL群之后的第二天开始静脉内施用阿地白细胞介素或其生物类似物或变体；其中，阿地白细胞介素或其生物类似物或变体以0.037mg/kg或0.044mg/kgIU/kg(患者体重)的剂量每8小时一次静脉推注施用15分钟，直至耐受，最多14剂。休息9天后，可以重复该时间表进行另外14个剂量，总共最多28个剂量。
在一个实施方式中，IL-2方案包括递减型(decrescendo)IL-2方案。递减型IL-2方案已描述于O'Day等，J.Clin.Oncol.1999，17，2752-61和Eton等，Cancer 2000，88，1703-9，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，递减型IL-2方案包括在6小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在12小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在24小时内静脉内施用18×106IU/m2，然后在72小时内静脉内施用4.5×106IU/m2。该治疗循环可每28天重复一次，最多4个循环。在一个实施方式中，递减型IL-2方案包括在第1天18,000,000IU/m2，在第2天9,000,000IU/m2，在第3和4天4,500,000IU/m2。
在一个实施方式中，IL-2方案包括每天、每2天、每4天、每6天、每7天、每14天或每21天，以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化的IL-2。
过继性细胞转移(Adoptive Cell Transfer)
过继性细胞转移(ACT)是一种非常有效的免疫治疗形式，涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移至癌症患者体内。ACT是一种治疗方法，涉及体外识别具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞大量体外扩增，以及将其输注到患癌宿主中。用于过继性转移的淋巴细胞可以来自切除肿瘤的基质(肿瘤浸润淋巴细胞或TIL)。可以如本文TIL制备方法中所述地制备用于ACT的TIL，包括使用肿瘤冷冻保存和解冻步骤。在一些实施方式中，例如根据图1中描述的方法来制备TIL。如果它们经基因工程改造以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，富含混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(MLTC)，或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽克隆，则它们也可来源或来自血液。淋巴细胞来源于待输注的患癌宿主的ACT称为自体ACT。美国公开号2011/0052530涉及用于实施过继性细胞治疗以促进癌症消退的方法，主要用于治疗患有转移性黑色素瘤的患者，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，TIL可以如本文所述施用。在一些实施方式中，TIL可以单剂量施用。此种施用可通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以多剂量施用。剂量可以是每年一次，两次，三次，四次，五次，六次或超过六次。剂量可以是每月一次，每两周一次，每周一次，或隔天一次。只要需要，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的施用可以继续。
与PD-1和PD-L1抑制剂的组合
程序性死亡受体1(PD-1，programmed death 1)是由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)T细胞、激活的单核细胞和树突状细胞表达的288个氨基酸的跨膜免疫检查点受体蛋白。PD-1，也称为CD279，属于CD28家族，人类中的PD-1由染色体2上的Pdcd1基因编码。PD-1由一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域、一个跨膜区和一个细胞内结构域组成，所述细胞内结构域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM，immunoreceptor tyrosine-basedinhibitory motif)和基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM，immunoreceptor tyrosine-based switch motif)。如Keir等，Annu.Rev.Immunol.，2008，26，677-704所述，已知PD-1及其配体(PD-L1和PD-L2)在免疫耐受中起关键作用。PD-1提供负调节T细胞免疫应答的抑制信号。PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(也称为B7-DC或CD273)在肿瘤细胞和基质细胞上表达，它们可能遇到表达PD-1的激活T细胞，导致T细胞的免疫抑制。PD-L1是由人染色体9上的Cd274基因编码的290个氨基酸的跨膜蛋白。如在最近的临床研究中所证明的，例如Topalian等，N.Eng.J.Med.，2012，366，2443-54所述，通过使用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂，阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用可以克服免疫抵抗(immune resistance)。PD-L1在许多肿瘤细胞系中表达，而PD-L2表达主要在树突状细胞和少数肿瘤细胞系中表达。除T细胞(激活后诱导表达PD-1)外，PD-1也在B细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、激活的单核细胞和树突状细胞上表达。
本文所述的TIL和TNFRSF激动剂的方法、组合物和组合还可以进一步与程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)和/或程序性死亡配体2(PD-L2)的结合抗体、拮抗剂或抑制剂(即阻断剂)组合。在TIL扩增的预REP或REP阶段期间，PD-1、PD-L1和/或PD-L2抑制剂可以与本文所述的TNFRSF激动剂一起用于细胞培养。在手术切除肿瘤之前，或者在输注TIL期间或之后，PD-1、PD-L1和/或PD-L2抑制剂也可以与TNFRSF激动剂联合使用。例如，国际专利申请公开号WO2015/026684A1中描述了将PD-1/PD-L1抑制剂与激动性GITR抗体联合使用的合适方法以及包含PD-1/PD-L1拮抗剂和GITR激动剂的组合物，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂可以是本领域已知的任何PD-1抑制剂或PD-1阻断剂。特别地，它是以下段落中更详细描述的PD-1抑制剂或阻断剂之一。本文涉及PD-1抑制剂的术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”可互换使用。为避免疑义，本文提及的作为抗体的PD-1抑制剂可以指化合物或它的抗原结合片段、变体、缀合物或生物仿制药。为避免疑义，本文提及的PD-1抑制剂还可以指小分子化合物或它的药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶或前药。
在一些实施方式中，本文所述的组合物和方法包括PD-1抑制剂。在一些实施方式中，PD-1抑制剂是小分子。在一个优选实施方式中，PD-1抑制剂是抗体(即抗PD-1抗体)、它的片段(包括Fab片段)或它的单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，PD-1抑制剂是多克隆抗体。在一个优选实施方式中，PD-1抑制剂是单克隆抗体。在一些实施方式中，PD-1抑制剂竞争性结合PD-1，和/或结合PD-1上的表位。在一个实施方式中，抗体竞争性结合PD-1，和/或结合PD-1上的表位。
在一些实施方式中，所述组合物和方法包括PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂：与人PD-1结合的KD为约100pM以下；与人PD-1结合的KD为约90pM以下；与人PD-1结合的KD为约80pM以下；与人PD-1结合的KD为约70pM以下；与人PD-1结合的KD为约60pM以下；与人PD-1结合的KD为约50pM以下；与人PD-1结合的KD为约40pM以下；或与人PD-1结合的KD为约30pM以下；与人PD-1结合的KD为约20pM以下；与人PD-1结合的KD为约10pM以下；与人PD-1结合的KD为约1pM以下。
在一些实施方式中，该组合物和方法包括PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂：与人PD-1结合的kassoc为约7×105 1/M·s以上；与人PD-1结合的kassoc为约7.5×105 1/M·s以上；与人PD-1结合的kassoc为约8×105 1/M·s以上；与人PD-1结合的kassoc为约8.5×105 1/M·s以上；与人PD-1结合的kassoc为约9×105 1/M·s以上；与人PD-1结合的kassoc为约9.5×1051/M·s以上；或与人PD-1结合的kassoc为约1×106 1/M·s以上。
在一些实施方式中，该组合物、过程和方法包括结合人PD-1的PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂：与人PD-1结合的kdissoc为约2×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.1×10-51/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.2×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.3×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.4×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.5×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.6×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.7×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.8×10-5 1/s以下；与人PD-1结合的kdissoc为约2.9×10-5 1/s以下；或与人PD-1结合的kdissoc为约3×10-5 1/s以下。
在一些实施方式中，所述组合物、过程和方法包括阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂：阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约10nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约9nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约8nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约7nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约6nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约5nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约4nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约3nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约2nM以下；或阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合的IC50为约1nM以下。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂是尼沃鲁单抗(可从Bristol-Myers Squibb Co.作为OPDIVO商购)或它的生物仿制药、抗原结合片段、缀合物或变体。尼沃鲁单抗是一种阻断PD-1受体的全人IgG4抗体。在一个实施方式中，抗PD-1抗体是免疫球蛋白G4κ抗(人CD274)抗体。尼沃鲁单抗被分配的化学文摘社(CAS，Chemical Abstracts Service)登记号为946414-94-4，尼沃鲁单抗也称为5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。尼沃鲁单抗的制备和性质描述于美国专利号8,008,449和国际专利公开号WO2006/121168中，其公开内容通过引用并入本文。尼沃鲁单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效已被描述于Wang等，Cancer Immunol Res.，2014，2，846-56；Page等，Αnn.Rev.Med.，2014，65，185-202；以及Weber等，J.Clin.Oncology，2013，31，4311-4318，其公开内容通过引用并入本文。尼沃鲁单抗的氨基酸序列列于表16中。尼沃鲁单抗在第22位至第96位、第140位至第196位、第254位至第314位、第360位至第418位、第22”位至第96”位、第140”位至第196”位、第254”位至第314”位和第360”位至第418”位处具有重链链内二硫键；在第23'位至第88'位、第134'位至第194'位、第23”'位至第88”'位和第134”'位至第194”'位处具有轻链链内二硫键；在第127位至第214'位和第127”位至第214”'位处具有重链-轻链链间二硫键；在第219位至第219”位和第222位至第222”位处具有重链-重链链间二硫键；以及在第290位第290”位处的N-糖基化位点(H CH2 84.4)。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：127给出的重链和SEQ ID NO：128给出的轻链。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含尼沃鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：129所示序列，并且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：130所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，其各自与SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130所示序列至少96％相同，分别。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：131、SEQ IDNO：132和SEQ ID NO：133所示的序列及它们的保守性氨基酸取代；所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136所示的序列及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，与上述任何抗体相同，该抗体竞争性结合和/或结合至PD-1上的表位。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂是药物监管机构批准的参考尼沃鲁单抗的抗PD-1生物仿制药单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物仿制药包含抗PD-1抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该抗PD-1抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是尼沃鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物仿制药是经授权或提交待授权的抗PD-1抗体，其中，抗PD-1抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是尼沃鲁单抗。抗PD-1抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是尼沃鲁单抗。在一些实施方式中，该生物仿制剂作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是尼沃鲁单抗。
表16：尼沃鲁单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001491
在另一个实施方式中，PD-1抑制剂包含帕博利珠单抗(可从Merck&Co.，Inc.，Kenilworth，新泽西，美国商购KEYTRUDA)或它的抗原结合片段、缀合物或变体。帕博利珠单抗被分配的CAS登记号为1374853-91-4，它也称为lambrolizumab、MK-3475和SCH-900475。帕博利珠单抗具有免疫球蛋白G4，抗(人蛋白PDCD1(程序性细胞死亡1))(人-小家鼠单克隆重链)，与人-小家鼠单克隆轻链的二硫化物，二聚体结构。帕博利珠单抗的结构也可以描述为免疫球蛋白G4，抗(人程序性细胞死亡1)；人源化小鼠单克隆[228-L-脯氨酸(H10-S>P)]γ4重链(134-218')-二硫化物，具有人源化小鼠单克隆κ轻链二聚体(226-226”：229-229”)-双二硫化物。帕博利珠单抗的性质、用途和制备描述于国际专利公开号WO2008/156712Al、美国专利号8,354,509以及美国专利申请公开号US2010/0266617A1、US2013/0108651A1和US2013/0109843A2，其公开内容通过引用并入本文。帕博利珠单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效描述于Fuerst，Oncology Times，2014，36，35-36；Robert等，Lancet，2014，384，1109-17；以及Thomas等，Exp.Opin.Biol.Ther.，2014，14，1061-1064。帕博利珠单抗的氨基酸序列列于表21中。帕博利珠单抗包括以下二硫键：第22位至第96位、第22”位至第96”位、第23'位至第92'位、第23”'位至第92”'位、第134位至第218'位、第134”位至第218”'位、第138'位至第198'位、第138”'位至第198”'位、第147位至第203位、第147”位至第203”位、第226位至第226”位、第229位至第229”位、第261位至第321位、第261”位至第321”位、第367位至第425位和第367”位至第425”位，以及以下糖基化位点(N)：第297位Asn和第297”位Asn。帕博利珠单抗是IgG4/κ同种型，在Fc区具有稳定的S228P突变；在IgG4铰链区中插入该突变可防止通常在IgG4抗体观察到的半分子的形成。帕博利珠单抗在每条重链的Fc结构域内的第297位Asn处异质糖基化，产生完整抗体约149kDa的分子量。帕博利珠单抗的主要糖型是岩藻糖基化的去半乳糖(agalacto)双触角(diantennary)聚糖形式(G0F)。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：137给出的重链和SEQ ID NO：138给出的轻链。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示序列至少95％相同。代表性序列列于表17。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含帕博利珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：139所示序列，并且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：140所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ IDNO：139和SEQ ID NO：140所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：139和SEQID NO：140所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：141、SEQ IDNO：142和SEQ ID NO：143所示的序列及它们的保守性氨基酸取代；所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145和SEQ ID NO：146所示的序列及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，与上述任何抗体相同，该抗体竞争性结合和/或结合至PD-1上的表位。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂是药物监管机构批准的参考帕博利珠单抗的抗PD-1生物仿制药单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物仿制药包含抗PD-1抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该抗PD-1抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是帕博利珠单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物仿制药是经授权或提交待授权的抗PD-1抗体，其中，抗PD-1抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是帕博利珠单抗。抗PD-1抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是帕博利珠单抗。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是帕博利珠单抗。
表17：帕博利珠单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001521
在一个实施方式中，PD-1抑制剂是市售的抗PD-1单克隆抗体，例如，抗m-PD-1克隆J43(目录号BE0033-2)和RMP1-14(目录号BE0146)(BioXCell，Inc.，西莱巴嫩，新罕布什尔州，美国)。许多市售的抗PD-1抗体是本领域普通技术人员已知的。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂是美国专利号8,354,509或美国专利申请公开号2010/0266617Al、2013/0108651A1、2013/0109843A2公开的抗体，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，PD-1抑制剂是美国专利号8,287,856、8,850,247和8,168,757以及美国专利申请公开号2009/0028857Al、2010/0285013A1、2013/0022600A1和2011/0008369A1所述的抗PD-1抗体，其教导通过引用并入本文。在另一个实施方式中，PD-1抑制剂是美国专利号8,735,553B1中公开的抗PD-1抗体，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，PD-1抑制剂是匹地利珠单抗，也称为CT-011，它被描述于美国专利号8,686,119中，其公开内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，PD-1抑制剂可以为：小分子或肽，或肽衍生物，例如，美国专利号8,907,053、9,096,642和9,044,442，以及美国专利申请公开号US2015/0087581所述的那些；1,2,4-恶二唑化合物和衍生物，例如，美国专利申请公开号2015/0073024所述的那些；环状肽模拟化合物和衍生物，例如，美国专利申请公开号US2015/0073042所述的那些；环状化合物和衍生物，例如，美国专利申请公开号US2015/0125491所述的那些；1,3,4-恶二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物，例如，国际专利申请公开号WO2015/033301所述的那些；基于肽的化合物和衍生物，例如，国际专利申请公开号WO2015/036927和WO2015/04490所述的那些；或基于大环肽的化合物和衍生物，例如，美国专利申请公开号US2014/0294898所述的那些；其各自的公开内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂可以是本领域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂。特别地，它是以下段落中更详细描述的PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂之一。本文涉及PD-L1和PD-L2抑制剂的术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”可互换使用。为避免疑义，本文提及的作为抗体的PD-L1或PD-L2抑制剂可以指化合物或它们的抗原结合片段、变体、缀合物或生物仿制药。为避免疑义，本文提及的PD-L1或PD-L2抑制剂还可以指化合物或它的药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物、共晶或前药。
在一些实施方式中，本文所述的组合物、过程和方法包括PD-L1或PD-L2抑制剂。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂是小分子。在一个优选实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂是抗体(即抗PD-1抗体)，它的片段(包括Fab片段)，或它的单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂是多克隆抗体。在一个优选实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂是单克隆抗体。在一些实施方式中，PD-L1或PD-L2抑制剂竞争性结合PD-L1或PD-L2，和/或结合PD-L1或PD-L2上的表位。在一个实施方式中，抗体竞争性结合PD-L1或PD-L2，和/或结合PD-L1或PD-L2上的表位。
在一些实施方式中，本文提供的PD-L1抑制剂对PD-L1具有选择性，因为该化合物与PD-L1结合或相互作用的浓度显著低于它们与其他受体(包括PD-L2受体)结合或相互作用的浓度。在某些实施方式中，该化合物与PD-L1受体结合的结合常数比与PD-L2受体结合至少高约2倍浓度、至少高约3倍浓度、至少高约5倍浓度、至少高约10倍浓度、至少高约20倍浓度、至少高约30倍浓度、至少高约50倍浓度、至少高约100倍浓度、至少高约200倍浓度、至少高约300倍浓度，或至少高约500倍浓度。
在一些实施方式中，本文提供的PD-L2抑制剂对PD-L2具有选择性，因为该化合物与PD-L2结合或相互作用的浓度显著低于它们与其他受体(包括PD-L1受体)结合或相互作用的浓度。在某些实施方式中，该化合物与PD-L2受体结合的结合常数比与PD-L1受体结合至少高约2倍浓度、至少高约3倍浓度、至少高约5倍浓度、至少高约10倍浓度、至少高约20倍浓度、至少高约30倍浓度、至少高约50倍浓度、至少高约100倍浓度、至少高约200倍浓度、至少高约300倍浓度，或至少高约500倍浓度。
不受任何理论的束缚，据认为肿瘤细胞表达PD-L1，并且T细胞表达PD-1。然而，PD-1或PD-L1抑制剂或阻断剂的功效不需要肿瘤细胞表达PD-L1。在一个实施方式中，肿瘤细胞表达PD-L1。在另一个实施方式中，肿瘤细胞不表达PD-L1。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物包括PD-1和PD-L1抗体的组合(例如本文所述的那些)与TIL组合。PD-1和PD-L1抗体的组合和TIL的施用可以是同时的或顺序的。
在一些实施方式中，所述组合物和方法包括PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂：与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约100pM以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约90pM以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约80pM以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约70pM以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约60pM以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约50pM以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约40pM以下；或与人PD-L1和/或人PD-L2结合的KD为约30pM以下。
在一些实施方式中，所述组合物和方法包括PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂：与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kassoc为约7×105 1/M·s以上；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kassoc为约7.5×105 1/M·s以上；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kassoc为约8×105 1/M·s以上；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kassoc为约8.5×1051/M·s以上；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kassoc为约9×105 1/M·s以上；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kassoc为约9.5×105 1/M·s以上；或与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kassoc为约1×1061/M·s以上。
在一些实施方式中，所述组合物和方法包括PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂：与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.1×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.2×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.3×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.4×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.5×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.6×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.7×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.8×10-5 1/s以下；与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约2.9×10-51/s以下；或与人PD-L1和/或人PD-L2结合的kdissoc为约3×10-5 1/s以下。
在一些实施方式中，所述组合物和方法包括PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂：阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约10nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约9nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约8nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约7nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约6nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约5nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约4nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约3nM以下；阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约2nM以下；或阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，IC50为约1nM以下。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是度伐鲁单抗，也称为MEDI4736(它可从AstraZeneca plc.的子公司Medimmune，LLC，盖瑟斯堡，马里兰商购)，或它的抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是美国专利号8,779,108或美国专利申请公开号2013/0034559中公开的抗体，其公开内容通过引用并入本文。度伐鲁单抗的临床疗效已描述于Page等，Ann.Rev.Med，2014，65，185-202；Brahmer等，J.Clin.Oncol.，2014，32，5s(补充，摘要8021)；以及McDermott等，Cancer Treatment Rev.，2014，40，1056-64。度伐鲁单抗的制备和性质描述于美国专利号8,779,108中，其公开内容通过引用并入本文。度伐鲁单抗的氨基酸序列列于表18中。度伐鲁单抗单克隆抗体包含：在第22位至第96位、第22”位至第96”位、第23'位至第89'位、第23”'位至第89”'位、第135'位至第195'位、第135”'位至第195”'位、第148位至第204位、第148”位至第204”位、第215'位至第224位、第215”'位至第224”位、第230位至第230”位、第233位至第233”位、第265位至第325位、第265”位至第325”位、第371位至第429位和第371”位至第429'位处的二硫键；以及在第301位Asn和第301”位Asn处的N-糖基化位点。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：147给出的重链和SEQ ID NO：148给出的轻链。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：147和SEQ IDNO：148所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含度伐鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：149所示序列，并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：150所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQID NO：149和SEQ ID NO：150所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：151、SEQ IDNO：152和SEQ ID NO：153所示的序列及它们的保守性氨基酸取代；所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156所示的序列及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，与任何上述抗体相同，该抗体竞争性结合和/或结合至PD-L1上的表位。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是药物监管机构批准的参考度伐鲁单抗的抗PD-L1生物仿制药单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物仿制药包含抗PD-L1抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该抗PD-L1抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是度伐鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物仿制药是经授权或提交待授权的抗PD-L1抗体，其中，抗PD-L1抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是度伐鲁单抗。抗PD-L1抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是度伐鲁单抗。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是度伐鲁单抗。
表18：度伐鲁单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001571
Figure BDA0003044135750001581
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C(可从MerckKGaA/EMD Serono商购)，或它的抗原结合片段、缀合物或变体。阿维鲁单抗的制备和性质描述于美国专利申请公开号US2014/0341917A1中，其公开内容通过引用明确地并入本文。阿维鲁单抗的氨基酸序列列于表19中。阿维鲁单抗具有：在第22位至第96位、第147位至第203位、第264位至第324位、第370位至第428位、第22”位至第96”位、第147”位至第203”位、第264”位至第324”位和第370”位至第428”位处的重链链内二硫键(C23-C104)；在第22'位至第90'位、第138'位至第197'位、第22”'位至第90”'位和第138”'位至第197”'位处的轻链链内二硫键(C23-C104)；在第223位至第215'位和第223”位至第215”'位处的重链-轻链链间二硫键(h 5-CL126)；在第229位至第229”位和第232位至第232”位处的重链-重链链间二硫键(h 11、h 14)；在第300位和第300”位处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化的复合双触角CHO型聚糖；在第450位和第450'位处的H CHS K2 C-末端赖氨酸剪切。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：157给出的重链和SEQ ID NO：158给出的轻链。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：157和SEQ IDNO：158所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含阿维鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：159所示序列，并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：160所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQID NO：159和SEQ ID NO：160所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：160所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：161、SEQ IDNO：162和SEQ ID NO：163所示的序列及它们的保守性氨基酸取代；所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：166所示的序列及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，与任何上述抗体相同，该抗体竞争性结合和/或结合至PD-L1上的表位。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是药物监管机构批准的参考阿维鲁单抗的抗PD-L1生物仿制药单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物仿制药包含抗PD-L1抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该抗PD-L1抗体包含与参考的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是阿维鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物仿制药是经授权或提交待授权的抗PD-L1抗体，其中，抗PD-L1抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是阿维鲁单抗。抗PD-L1抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是阿维鲁单抗。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是阿维鲁单抗。
表19：阿维鲁单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001601
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是阿特利珠单抗，也称为MPDL3280A或RG7446(可从Roche Holding AG，巴塞尔，瑞士的子公司Genentech，Inc作为TECENTRIQ商购)，或它的抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是美国专利号8,217,149所公开的抗体，其公开内容通过引用明确地并入本文。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂是美国专利申请公开号2010/0203056Al、2013/0045200A1、2013/0045201A1、2013/0045202A1或2014/0065135A1公开的抗体，其公开内容通过引用明确地并入本文。阿特利珠单抗的制备和性质描述于美国专利号8,217,149中，其公开内容通过引用并入本文。阿特利珠单抗的氨基酸序列列于表20中。阿特利珠单抗具有：在第22位至第96位、第145位至第201位、第262位至第322位、第368位至第426位、第22”位至第96”位、第145”位至第201”位、第262”位至第322”位和第368”位至第426”位处的重链链内二硫键(C23-C104)；在第23'位至第88'位、第134'位至第194'位、第23”'位至第88”'位和第134”'位至第194”'位处的轻链链内二硫键(C23-C104)；在第221位至第214'位和第221”位至第214”'位处的重链-轻链链间二硫键(h5-CL126)；在第227位至第227”位和第230位至第230”位处的重链-重链链间二硫键(h 11、h14)；在第298位和第298'位处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4>A)。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：167给出的重链和SEQ ID NO：168给出的轻链。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：167和SEQ IDNO：168所示序列的重链和轻链，或它们的抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含重链和轻链，它们分别与SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含阿特利珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：169所示序列，并且PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：170所示序列，及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：170所示序列至少99％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQID NO：169和SEQ ID NO：170所示序列至少98％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：170所示序列至少97％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：170所示序列至少96％相同。在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含VH和VL区，它们分别与SEQ ID NO：169和SEQ ID NO：170所示序列至少95％相同。
在一个实施方式中，PD-L1抑制剂包含：重链CDR1、CDR2和CDR3结构域和轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域，所述重链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：171、SEQ IDNO：172和SEQ ID NO：173所示的序列及它们的保守性氨基酸取代；所述轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域分别具有SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：176所示的序列及它们的保守性氨基酸取代。在一个实施方式中，与任何上述抗体相同，该抗体竞争性结合和/或结合至PD-L1上的表位。
在一个实施方式中，抗PD-L1抗体是药物监管机构批准的参考阿特利珠单抗的抗PD-L1生物仿制药单克隆抗体。在一个实施方式中，该生物仿制药包含抗PD-L1抗体，与参考药物产品或参考生物产品相比，该抗PD-L1抗体包含与参考药物产品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性(例如，97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列，并且该氨基酸序列包含一种以上翻译后修饰，其中参考药物产品或参考生物产品是阿特利珠单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物仿制药是经授权或提交待授权的抗PD-L1抗体，其中，抗PD-L1抗体以与参考药物产品或参考生物产品的制剂不同的制剂提供，其中参考药物产品或参考生物产品是阿特利珠单抗。抗PD-L1抗体可以由药物管理机构(例如，美国FDA和/或欧盟的EMA)授权。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是阿特利珠单抗。在一些实施方式中，该生物仿制药作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，该一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中参考药物产品或参考生物产品是阿特利珠单抗。
表20：阿特利珠单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
Figure BDA0003044135750001621
Figure BDA0003044135750001631
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但是这些实施方式仅作为示例提供，并不旨在以其他方式限制本发明的范围。在实施本发明时可以采用本发明所述实施方式的各种替代方案。因此，所附权利要求书的精神和范围不应限于本文所包含的优选版本的描述。
读者的关注涉及在与本说明书同时提交并随本说明书向公众开放的所有论文和文件，并且所有此类论文和文件的内容均通过引用并入本文。除非另有明确说明，否则说明书中公开的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)可以由具有相同、等同或相似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅为一系列等同或相似特征的示例。
实施例
现在参考以下实施例描述本文包括的实施方式。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本文包括的公开内容决不应被解释为限于这些实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例1：制备用于pre-REP和REP过程的培养基
本实施例描述了制备用于方案的组织培养基的方法，所述方案涉及来自各种肿瘤类型的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的培养，肿瘤类型包括但不限于转移性黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三阴性乳腺癌和肺腺癌。该培养基可用于制备本申请和实施例中描述的任何TIL。
CM1的制备
从冷藏库中取出以下试剂，在37℃水浴中加热：RPMI1640、人AB血清、200mM L-谷氨酰胺。根据下表21，将每种成分以适合过滤的体积加入0.2μm过滤器单元的顶部，制备CM1培养基。于4℃储存。
表21：CM1的制备
成分 终浓度 终体积500ml 终体积1L
RPMI1640 NA 450ml 900m1
人AB血清，热灭活10％ 50mL 100ml
200mM L-谷氨酰胺 2 mM 5ml 10m1
55mM BME 55μM 0.5ml 1ml
50mg/mL硫酸庆大霉素 50μg/mL 0.5ml 1ml
在使用当天，将所需量的CM1在37℃水浴中加热，并加入6000IU/m1 IL-2。
根据表22进行补充(视需要)
表24：CM1的额外补充(视需要)
Figure BDA0003044135750001641
CM2的制备
从冰箱中取出制备的CM1或如上所述制备新鲜的CM1。从冰箱中取出
Figure BDA0003044135750001642
将制备的CM1与等体积的
Figure BDA0003044135750001643
在无菌培养基瓶中混合，制备所需量的CM2。使用当天，将3000IU/mL IL-2加入CM2培养基中。使用当天，制备足够量的具有3000IU/mL IL-2的CM2。标记CM2培养基瓶的名称、制备者的首字母、过滤/制备的日期、两周的有效期，并储存在4℃直至组织培养所需。
CM3的制备
在需要使用的当天制备CM3。CM3与
Figure BDA0003044135750001651
培养基相同，使用当天补充3000IU/mLIL-2。通过将IL-2储备溶液直接添加到AIM-V的瓶子或袋子中，制备足够满足实验需要量的CM3。轻轻摇晃混合均匀。加至AIM-V后立即将瓶子标记“3000IU/mL IL-2”。当有过量CM3时，将其在瓶中储存在4℃，标记培养基名称、制备者的首字母、培养基的制备日期及其有效期(制备后7天)。在4℃下储存7天后，丢弃补充有IL-2的培养基。
CM4的制备
CM4与CM3相同，额外补充2mM GlutaMAXTM(终浓度)。对于每1L的CM3，加入10mL的200mM GlutaMAXTM。通过将IL-2储备溶液和GlutaMAXTM储备溶液直接添加到AIM-V的瓶子或袋子中，制备足够满足实验需要量的CM4。轻轻摇晃混合均匀。加入AIM-V后立即将瓶子标记“3000IL/mL IL-2和GlutaMAX”。当有过量CM4时，将其在瓶中储存在4℃，标记培养基名称、“GlutaMAX”、制备者的首字母、培养基的制备日期及其有效期(制备后7天)。在4℃下储存7天后，丢弃补充有IL-2的培养基。
实施例2：IL-2、IL-15和IL-21细胞因子混合物(cocktail)的使用
本实施例描述了与本文任何实施例或实施方式(包括肿瘤组织或肿瘤碎片的冷冻保存的实施例或实施方式)的TIL方法结合使用的IL-2、IL-15和IL-21细胞因子(充当另外的T细胞生长因子)。
使用本文所述的方法，在一只实验臂中，在IL-2存在下，由结直肠癌肿瘤、黑色素瘤肿瘤、宫颈癌肿瘤、三阴性乳腺肿瘤、肺肿瘤和肾肿瘤生长TIL；以及在另一臂中，在开始培养时，用IL-2、IL-15和IL-21替换IL-2。pre-REP完成后，评估培养物的扩增、表型、功能(CD107a+和IFN-γ)和TCRνβ库。IL-15和IL-21在本文其他地方以及Gruijl等的文章中都有描述，IL-21以高细胞毒性潜力促进CD27+CD28+肿瘤浸润淋巴细胞的扩增和调节性T细胞的附带低扩增，Santegoets,S.J.,J Transl Med.,2013,11:37，可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/上找到。
结果显示，相对于仅使用IL-2的情况，在IL-2、IL-15和IL-21处理的条件下在多种组织学类型中观察到CD4+和CD8+细胞的TIL扩增均增强(>20％)。相对于仅IL-2的培养物，从IL-2、IL-15和IL-21处理的培养物获得的TIL向主导的CD8+群(具有偏向的TCRνβ谱系)倾斜。与仅用IL-2处理的TIL相比，在用IL-2、IL-15和IL-21处理的TIL中IFN-γ和CD107a升高。
实施例3：IL-2储备溶液的制备
本实施例描述了将纯化冻干的重组人白细胞介素2溶解于适用于进一步组织培养方案(包括本申请和实施例中描述的所有那些，包括涉及使用rhIL-2的那些)的储备样品中的过程。
程序
制备0.2％乙酸溶液(HAc)。将29mL无菌水加至50mL锥形管中。将1mL1N(1normal)乙酸加至50mL锥形管中。通过倒置管2-3次使其混合均匀。通过使用Steriflip过滤器过滤来灭菌HAc溶液。
制备PBS中的1％HSA。向150mL无菌过滤装置中的96mL PBS中加入4mL的25％HSA储备溶液。过滤溶液。4℃储存。记录制备的每瓶rhIL-2。
制备rhIL-2储备溶液(6×106IU/mL终浓度)。每批rh1L-2不同，要求在制造商的分析证书(COA)中找到信息，例如：1)每瓶rhIL-2的质量(mg)、2)rhIL-2的比活(IU/mg)、3)推荐的0.2％HAc重溶(reconstitution)体积(mL)。
使用下文的等式计算rhIL-2批次所需的1％HSA的体积：
Figure BDA0003044135750001661
例如，根据CellGenix的rhIL-2批次10200121COA，1mg小管的比活为25×106lU/mg。它建议在2mL的0.2％HAc中重溶rhIL-2。
Figure BDA0003044135750001662
用酒精擦拭IL-2小管的橡胶塞。使用连接在3mL注射器上的16G针，将推荐体积的0.2％HAc注入小管中。当撤回针时，注意不要移动塞子。倒置小管3次并旋转直至所有粉末溶解。小心地取下塞子，并放在旁边的酒精擦拭物上。向小管中添加计算体积的1％HSA。
rhIL-2溶液的储存。对于短期储存(<72小时)，将小管储存在4℃。对于长期储存(>72小时)，将小管等分成较小的体积并储存在-20℃的冻存管中直至准备使用。避免反复冻结/解冻。制备日期后6个月过期。Rh-IL-2标签包括供应商和目录号、批次#、有效期、操作员姓名、浓度和等分试样的体积。
实施例4：TIL冷冻保存方法
本实施例描述了使用CryoMed程序降温仪型号7454(Thermo Scientific)的TIL冷冻保存方法，该TIL由实施例5中所述的简化封闭程序制备。
所用设备如下：铝制盒支架(与CS750冻存袋兼容)、用于750mL袋的冷冻储存盒、低压(22psi)液氮罐、冰箱、热电偶传感器(用于包装袋的色带类型)和CryoStore CS750冻存袋(OriGen Scientific)。
冷冻过程提供从成核到-20℃的0.5℃/分钟速率以及冷却到-80℃最终温度的1℃/分钟速率。程序参数如下：步骤1：在4℃下等待；步骤2：1.0℃/分钟(样品温度)至-4℃；步骤3：20.0℃/分钟(腔室温度)至-45℃；步骤4：10.0℃/分钟(腔室温度)至-10.0℃；步骤5：0.5℃/分钟(腔室温度)至-20℃；步骤6：1.0℃/分钟(样品温度)至-80℃。
实施例5：使用封闭系统生产冷冻保存的TIL细胞治疗
本实施例描述了根据现行良好组织操作(Good Tissue Practices)和现行良好生产规范(Good Manufacturing Practices)，在透气容器例如G-Rex烧瓶(Wilson WolfManufacturing Corp.，新布莱顿，明尼苏达州，美国)中，TIL细胞治疗过程的cGMP生产。该材料将根据美国FDA良好生产规范(21CFR第210、211、1270和1271部分)和适用于I期的ICHQ7标准通过商业材料进行生产。此方法可以与本文所述的肿瘤冷冻保存和解冻过程结合。
下表23提供了过程概要。
表23：过程概要
Figure BDA0003044135750001671
在本实施例中，除非另有说明，否则假定1.0mL/L＝1.0g/kg。打开后，将在2℃至8℃下进行以下试验：人类血清，AB型(HI)Gemini，1个月；2-巯基乙醇，1个月。硫酸庆大霉素(50mg/mL储备溶液)可在室温下保存1个月。装有10L AIM-V培养基的袋子只能在室温下加热一次，使用前最多只能放24小时。在第22天收获期间，可使用两个GatherexTM泵，从G-Rex500MCS烧瓶收获TIL。
第0天-制备CM1培养基
制备RPMI 1640培养基。在BSC中，使用适当尺寸的移液器，从1000mL RPMI1640培养基中取出100.0mL，放入适当尺寸的带有“废弃物”标签的容器中。
在BSC中，将试剂添加至RPMI 1640培养基瓶中。如表21所示，向RPMI 1640培养基瓶中添加以下试剂。记录添加的体积。每瓶添加的量：热灭活的人AB血清(100.0mL)；GlutaMax(10.0mL)；硫酸庆大霉素50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)。
给RPMI 1640培养基瓶加盖，旋转旋瓶子以确保试剂充分混合。通过1L 0.22微米过滤器单元过滤RPMI 1640培养基。给经过滤的培养基贴上标签。无菌盖住经过滤的培养基，贴好标签。
解冻一个1.1mL的IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有的冰均熔化。将IL-2储备溶液转移至培养基。在BSC中，将1.0mL IL-2储备溶液转移至如上制备的CM1第0天培养基瓶中。加入CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。盖上盖子，旋转瓶子以混合含有IL-2的培养基。重新标记为“完全CM1第0天培养基”。
使用适当尺寸的移液管取出20.0mL培养基，加到50mL锥形管中。在BSC中，将25.0mL的“完全CM1第0天培养基”转移至50mL锥形管中。将试管贴上标签“组织小块”。无菌地使G-Rex 100MCS(W3013130)进入BSC。在BSC中，关上G-Rex 100MCS上的所有夹子，使排气过滤器夹子保持打开状态。通过鲁尔连接件将G-Rex 100MCS烧瓶的红色管线连接到中继泵流体转运装置(W3009497)的较大直径端。将Baxa泵置于BSC旁边。从BSC卸下中继泵流体转运装置的泵管部分，将其安装在中继泵中。在BSC内，从泵送液体分配系统(PLDS)(W3012720)卸下注射器并丢弃。
通过鲁尔连接件将PLDS移液器连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液器尖端放置在“完全CM1第0天培养基”中以进行抽吸。打开培养基和G-Rex100MCS之间的所有夹子。将完全CM1培养基泵入G-Rex 100MCS烧瓶中。将泵速设置为“高”和“9”，然后将所有完全CM1第0天培养基泵入G-Rex 100MCS烧瓶。一旦转移完所有培养基，清除管线，停止泵送。
从烧瓶上断开泵。确保除通气过滤器外，所有烧瓶上的夹子都已关闭。从红色培养基管线上拆下中继泵流体转运装置，在红色培养基管线上放一个红色盖子(W3012845)。从BSC中取出G-Rex 100MCS烧瓶，热封住终端鲁尔接口附近红色管线上的红色盖子。培养箱参数：温度LED显示屏：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
将50mL锥形管放入培养箱中，加热≥30分钟。
第0天-制备肿瘤洗涤培养基
将庆大霉素添加至HBSS中。在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。记录体积。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素50mg/mL(5.0mL)。彻底混合试剂。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)过滤含庆大霉素的HBSS。无菌地盖上过滤后的培养基，标记以下信息。
第0天-肿瘤处理
由冷冻保存的肿瘤获得肿瘤样品，立即转移到2℃至8℃套件中进行处理，记录肿瘤信息。
在2℃-8℃下洗涤肿瘤样品3次，每次洗涤至少温和搅动3分钟。每次洗涤后，除去洗涤液，用新鲜溶液替换。
使用移液管，将锥形瓶的4滴单独的肿瘤洗涤培养基滴入6孔板(2个盖)的上翻盖上的6个圆圈中的每个圆圈中。将一个额外的液滴放置在两个圆圈上，总计50滴。
肿瘤洗涤3：使用镊子，将肿瘤从“洗涤2”皿中取出，转移至“洗涤3”皿中。用镊子轻轻搅动洗涤肿瘤样品，静置≥3分钟。记录时间。
将尺子放在150mm培养皿盖下方。使用镊子，将肿瘤样品无菌转移至150mm解剖皿盖上。从首尾相连排列所有肿瘤样品，记录大概的总长度和碎片数。评估肿瘤的坏死组织/脂肪组织。评估是否观察到>30％的整个肿瘤区域是坏死组织和/或脂肪组织；如果是，则确保如果这样进行的话肿瘤大小合适。评估是否观察到<30％的整个肿瘤区域是坏死组织或脂肪组织；如果是，则继续。
清理解剖。如果肿瘤较大并且观察到>30％的组织外部为坏死/脂肪，则通过解剖刀和/或镊子的组合，通过切除坏死/脂肪组织进行“清理解剖”，同时保留肿瘤的内部结构。为了维持肿瘤的内部结构，仅使用垂直切割压力。不用解剖刀进行切锯动作。
使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤样品切成均匀的适当尺寸的碎片(最多6个中间碎片)。为了维持肿瘤的内部结构，只使用垂直切割压力。同样，不用解剖刀进行切锯动作。将未解剖的中间碎片完全浸没在“肿瘤洗涤培养基”。将每个中间碎片转移到“保持”皿中。
一次处理一个中间碎片，将解剖皿中的肿瘤中间碎片切成约3mm×3mm×3mm的小块，使每块上的出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的量最小。为了维持肿瘤的内部结构，仅使用垂直切割压力。同样，不用解剖刀进行切锯动作。
选择至多八(8)个无出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的肿瘤块。使用标尺作为参考。继续解剖直至获得8个良好小块，或解剖整个中间碎片。将每个选定的小块转移至“肿瘤洗涤培养基”滴液之一中。
从中间碎片中选择至多八(8)个小块后，将中间碎片的残余物放入“良好中间碎片”6孔板的新的单个孔中。
如果所需组织有剩余，则从“良好中间碎片”6孔板中选择另外的良好肿瘤块以填充液滴，最多50个小块。记录产生的解剖小块总数。
从培养箱中取出“组织小块”50mL锥形管。确保锥形管加热≥30分钟。将50mL锥形管“组织小块”放到BSC中，确保不损害开放处理表面的无菌性。
使用移液器、解剖刀、镊子或组合，将选定的50个最佳肿瘤碎片从合适的培养皿盖转移至“组织小块”50mL锥形管。如果肿瘤块在转移过程中掉落且所需组织保留，则应添加来自良好肿瘤中间碎片孔的其他小块。记录小块数量。
从培养箱中取出含有培养基的G-Rex 100MCS。无菌地使G-Rex 100MCS烧瓶进入BSC。转移烧瓶时，不要握住容器的盖子或底部。通过握住容器的侧面来转移容器。在BSC中，抬起G-Rex 100MCS烧瓶盖子，确保内部管线保持无菌状态。旋转装有肿瘤块的锥形管以使肿瘤块悬浮，将内容物快速倒入G-Rex 100MCS烧瓶。确保肿瘤块均匀地分布在烧瓶的膜上。视需要，轻轻地前后摇动烧瓶以均匀分布肿瘤块。记录容器的底部膜上的肿瘤碎片的数量以及观察到漂浮在容器中的肿瘤碎片的数量。注：如果接种的碎片数量不等于收集的数量，联系区域管理，在第10.0节中记录。
以以下参数孵育G-Rex 100MCS：孵育G-Rex烧瓶：温度LED显示屏：37.0℃±2.0℃；CO2百分比：5.0％±1.5％CO2。进行计算以确定在第11天取出G-Rex 100MCS培养箱的适当时间。计算：孵育时间；下限＝孵育时间+252小时；上限＝孵育时间+276小时。
第11天-制备培养基
监控培养箱。培养箱参数：温度LED显示屏：37.0℃±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。将3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶和3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶在培养箱中加热≥30分钟。记录时间。培养基：RPMI 1640和AIM-V。将另外1×1000ml的AIM-V培养基(W3009501)瓶放置在室温下，以备将来使用。
当到达时间时，取出RPMI 1640培养基。记录上一步中的结束孵育时间。确保将培养基加热≥30分钟。在BSC中，从三个预热的1000mL RPMI 1640培养基瓶中各取100.0mL，放入尺寸合适的标有“废弃物”的容器中。在BSC中，将以下试剂添加至三个RPMI 1640培养基瓶中的每一个中，记录添加至每个瓶中的体积。GemCell人血清，热灭活的AB型(100.0mL)，GlutaMax(10.0mL)，50mg/mL硫酸庆大霉素(1.0mL)，2-巯基乙醇(1.0mL)。
盖上瓶子，旋转以确保试剂充分混合。通过单独的1L 0.22微米过滤器过滤每瓶培养基。无菌地盖上过滤后的培养基，给每个瓶子贴上标签“CM1第11天培养基”。解冻3×1.1mL IL-2的等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰解冻为止。记录IL-2批号和有效期。
从培养箱中取出三瓶AIM-V培养基。记录孵育结束时间。确保培养基已加热≥30分钟。使用微量移液器，将3.0mL解冻的IL-2加入一个1L瓶的预热AIM-V培养基中。加入IL-2后，用培养基冲洗微量移液器吸头。每个等分试样均使用新的无菌微量移液器吸头。记录添加的总体积。给瓶子贴上标签“含AIM-V的IL-2”。无菌地转移10L Labtainer袋和中继泵转运装置到BSC中。关闭10L Labtainer袋上的所有管线。通过鲁尔锁连接将中继泵转运装置的较大直径的管端连接到10L Labtainer袋的中间母端口。
将Baxa泵置于BSC旁边。将转运装置管线通过Baxa泵。将Baxa泵设置为“高”和“9”。从泵送液体分配系统(PLDS)中取出注射器并丢弃。不要损害PLDS移液器的无菌性。
通过鲁尔连接件将PLDS移液管连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液管尖端放入含有IL-2的AIM-V培养基瓶中进行抽吸。打开培养基瓶和10L Labtainer之间的所有夹子。
使用PLDS，将制备的包含IL-2的预热AIM-V培养基以及另外两个AIM-V瓶转移至10L Labtainer袋中。添加3瓶经过滤的CM1第11天培养基。添加最后一瓶后，清除连接袋子的管线。在添加每瓶培养基之间停止泵。从转运装置上取下PLDS，在BSC中管线的鲁尔接口上盖上一个红色的盖子。轻轻揉按袋子以使其混合。在培养基袋上贴上以下信息。到期日期为制备日期起的24小时。
将60mL注射器连接到“完全CM2第11天培养基”袋的可用母端口。取出20.0mL培养基，放入50mL锥形管中。在“完全CM2第11天培养基”袋的母端口上放一个红色盖子。贴上标签，将培养基保留样品储存在2℃至8℃下，直至提交检测。在靠近红色盖子处热封转运装置管线上的红色盖子。将转运装置保留在袋子上。
在BSC中，向4个15mL锥形管中添加4.5mL标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基。用批号和管编号(1至4)标记管。将4个冻存管标上“饲养细胞”和管编号(1至4)。将所有剩余的2-巯基乙醇、GlutaMax和人血清从BSC转移至2℃至8℃。
在BSC外，将1L转运包连接至步骤8.4.22制备的“完全CM2第11天培养基”袋上的转运装置上。转运包标上“饲养细胞CM2培养基”和批号。在距离袋子几英寸的1L转运包管线的管线上做一个标记。将空的转运包放在天平上，使直至标记点的管线在天平上。将天平去皮，将空的转运包留在天平上。
将Baxa泵设置为“中”和“4”。将制备的500.0±5.0mL的“完全CM2第11天”培养基泵入“细胞CM2培养基”转运包中。称重，记录添加至转运包中的完全CM2培养基的体积。
一旦填充，热封管线。将带有转运装置的CM2第11天培养基袋与饲养细胞培养基转运包分开，保持连接至1L转运包。将制备的“完全CM2第11天培养基”放置在培养箱中，直至使用。
第11天-收获TIL
培养箱参数：温度LED显示：37.0℃±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。从培养箱中取出G-Rex 100MCS之前，进行检查以确保符合培养参数。下限与上述相同。
记录从培养箱取出的时间。小心地从培养箱中取出G-Rex 100MCS，确保除大型过滤器管线外，所有夹子均已关闭。记录处理开始时间。
将300mL转运包标记为“TIL悬液”。无菌连接重力血液过滤器的TIL悬液转移(单线)。将300mL转运包放在天平上，记录干重。将1L转移包标记为“上清液”。
将来自G-Rex 100MCS的红色培养基取出管线无菌连接到“上清液”转运包。将G-Rex 100MCS的透明细胞取出管线无菌连接到与“TIL悬液”转运包相连的血液过滤器顶部的两个加标管线(spike line)之一。将G-Rex 100MCS放置在GatheRex的左侧，将“上清液”和“TIL悬液”转运包放置在GatheRex的右侧。
将G-Rex 100MCS的红色培养基取出管线安装到GatheRex上的顶部夹子(标有红色线)和导管。将G-Rex 100MCS的透明收获管线安装到GatheRex上的底部夹子(标有蓝色线)和导管。将来自GatheRex的气体管线连接到G-Rex 100MCS烧瓶的无菌过滤器上。从G-Rex100MCS烧瓶中取出上清液之前，确保关闭细胞取出管线上的所有夹子。将约900mL培养上清液从G-Rex 100MCS转移至1L转运包中。目视检查G-Rex 100MCS烧瓶，以确保烧瓶处于水平状态且培养基已减少至抽吸汲取管的末端。
在取出上清液之后，关闭至红色管线的所有夹子。
用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。将烧瓶向远离收集管倾斜，使肿瘤块沿边缘沉降。向收集管缓慢倾斜烧瓶，使碎片留在烧瓶的另一侧。如果细胞收集吸管不在壁和底部膜的交界处，则以45°倾斜的角度敲击烧瓶通常足以正确放置吸管。
松开所有通往TIL悬液转运包的夹子。使用GatheRex，将细胞悬液通过血液过滤器转移至300mL转运包中。保持倾斜的边缘，直至收集所有细胞和培养基。检查膜上是否有贴壁细胞。冲洗G-Rex 100MCS的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜确保所有夹子均已关闭。在尽可能靠近连接处热封TIL悬液转运包，以使总管长度保持大致相同。热封“上清液”转运包。保持足够的连接线。记录TIL悬液转运包的重量，计算细胞悬液的体积。
将4英寸(4”)血浆转运装置连接到“上清液”转运包上，将鲁尔连接件保持在4英寸血浆转运装置上，然后转移至BSC中。将4英寸血浆转运装置连接到300mL“TIL悬液”转运包上，将鲁尔连接件保持在4英寸血浆转运装置上，然后转移至BSC中。
从1L“上清液”转运包中吸取约20.0mL上清液，然后加到标有“Bac-T”的50mL无菌锥形管中。使用适当尺寸的注射器，从标有BacT的50mL锥形管中取出1.0mL样品，接种厌氧瓶。
用瓶号(1至4)标记4个冻存管。使用单独的3mL注射器，使用鲁尔连接件从TIL悬液转运包中提取4×1.0mL细胞计数样品，放置在各自的冻存管中。在管线上放一个红色盖子(W3012845)。将TIL转运包放在培养箱中直至需要。进行细胞计数和计算。对未稀释的初始细胞进行计数。如果无需稀释，则“样品[μL]”＝200，“稀释[μL]”＝0。
记录细胞计数和TIL数量。如果“活TIL细胞总数”<5×106个细胞，则进行“第11天G-Rex填充和接种”。如果“活TIL细胞总数”>5×106，则进行“流式细胞术计算”。
如果活TIL细胞总数≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样品的1.0×107个细胞的体积。流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度/1.0×107细胞
如果适用：重新计算的活细胞总数和体积流量。计算取出下面的细胞计数样品后的剩余活细胞总数和剩余体积。
如果适用：计算冷冻保存的体积。计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。
表24：TIL冷冻保存计算
Figure BDA0003044135750001741
如果适用：取出样品进行冷冻保存。从“TIL悬液”转运包中取出计算的体积。放入适当尺寸的锥形管中，贴上标记“冷冻保存样品1×107个细胞”、日期和批号。在TIL悬液转运包上放一个红色盖子(W3012845)。
根据以下参数将“冷冻保存样品1×107个细胞”离心：速度：350×g，时间：10：00分钟，温度：环境，制动：全速(9)；加速：全速(9)。
添加CS-10。在BSC中，无菌地吸出上清液。轻轻拍打试管底部，将细胞重悬在剩余液体中。添加CS-10。缓慢加入0.5mL CS10。记录添加的体积。冷冻保存样品小管装入约0.5mL。
第11天-饲养细胞
从LN2冷冻机中获得3袋具有至少两个不同批号的饲养细胞。将细胞保存在干冰上，直至准备解冻。记录饲养细胞信息。确认获得了至少两个不同批次的饲养细胞。根据批号将饲养细胞袋放入单个拉链封口袋中，在37.0℃±2.0℃水浴或低温浴约3至5分钟或直至冰刚刚消失来解冻。
饲养细胞线束准备。将4S-4M60连接到CC2 Cell Connect(W3012820)，用4S-4M60歧管的4个尖嘴端替换Cell Connect装置(B)的单个尖嘴。根据需要连接。
连接培养基转运包。将“饲养细胞CM2培养基”转运包连接到CC2鲁尔接口上。通过无针注射口将袋子连接到线束的侧面。将包含完全CM2第11天培养基的组件转移至BSC中。
合并解冻的饲养细胞。在BSC内，将10mL的空气吸入100mL注射器中。用它来替换CC2上的60mL注射器。在取下盖子之前，先用酒精棉片擦拭饲养细胞袋上的每个端口。使用CC2的三个尖嘴刺入三个饲养细胞袋。保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。不要刺穿端口的侧面。打开旋塞阀，从而使饲养细胞袋的管线打开，关闭通往无针注射口的管线。将饲养细胞袋的内容物吸进注射器。立刻排干全部三个袋子。一旦排干饲养细胞袋后，在保持注射器压力的同时，夹住通往饲养细胞袋的管线。不要将下面的注射器从线束拆掉。记录注射器中饲养细胞的总体积。
将饲养细胞添加至转运包。转动旋塞阀，以关闭通往饲养细胞袋的管线，打开通往培养基转运包的管线。确保未松开通往培养基转运包的管线。将注射器中的饲养细胞加到“饲养细胞CM2培养基”转运包中。夹住通往包含饲养细胞的转运包的管线，将注射器留在线束上。揉按袋子以混合转运包中合并的饲养细胞。将袋子标为“饲养细胞悬液”。
计算饲养细胞悬液的总体积。取出细胞计数样品。对每个样品使用单独的3mL注射器，使用无针注射口从饲养细胞悬液转运包中提取4×1.0mL细胞计数样品。将每个样品等分到标记的冻存管中。
利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。通过将0.5mL细胞悬液添加至标有批号和“用于细胞计数稀释”的4.5mL AIM-V培养基中，稀释细胞计数样品。这将产生1:10的稀释度。
记录细胞计数和样品体积。如果活细胞总数<5×109，则继续。如果活细胞总数≥5×109，则按上述步骤进行操作以获得更多细胞数。根据需要获得另外的饲养细胞，如上所述将其添加到转移包中。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬液的体积。计算要取出的过量饲养细胞的体积。向下舍入到最接近的整数。
取出过量的饲养细胞。在新的100mL注射器中，吸出10mL空气，将注射器连接到线束上。打开通往“饲养细胞悬液”转运包的管线。使用注射器，从转运包中吸取计算出的饲养细胞体积再加另外的10.0mL到100mL注射器中。一旦取出饲养细胞体积后，关闭通往饲养细胞悬液转运包的管线。不要卸下最终注射器。注射器装满后，换上新的注射器。总体积可使用多个注射器取出。每个新注射器都吸入10mL空气。记录取出的饲养细胞的总体积(包括另外的10mL)。
添加OKT3。在BSC中，使用1.0mL注射器和16规格(16G或16Ga)针头吸取0.15mLOKT3。从注射器上无菌地取下针头，将注射器连接到无针注射口上。注入OKT3。打开进入“饲养细胞悬液”转运包的旋塞阀，添加10mL先前取出冲洗OKT3通过管线的饲养细胞。将注射器上下颠倒并推动空气通过，以清除通往饲养细胞悬液转运包的管线。将剩余的饲养细胞悬液留在注射器中。关闭所有夹子，然后从BSC上拆下线束。热封饲养细胞悬液转运包，留下足够的管线进行连接。
第11天-G-Rex填充和接种
设置G-Rex500MCS。从包装中取出G-Rex500MCS，检查烧瓶中是否有任何裂纹或扭结。确保所有鲁尔连接件和密封件都拧紧。关闭除排气过滤器管线之外的所有G-Rex500MCS管线上的夹子。使用记号笔在4.5L刻度处画一条线。从培养箱中取出“完全CM2第11天培养基”。
准备泵送培养基。将G-Rex500MCS的红色管线连接到与完全CM2第11天培养基相连的中继泵转运装置上。将“完全CM2第11天培养基”袋挂在输液架上。通过Baxa泵进料泵管。将培养基泵入G-Rex500MCS。将Baxa泵设置为“高”和“9”。将4.5L培养基泵入G-Rex500MCS，填充至烧瓶在4.5L刻度处标记的线。将连接附近的G-Rex500MCS红色管线热封。在烧瓶上贴上“第11天”标签。将饲养细胞悬液转运包连接到烧瓶。将G-Rex500MCS的红色管线无菌连接到“饲养细胞悬液”转运包。
向G-Rex500MCS添加饲养细胞。打开饲养细胞悬液和G-Rex500MCS之间的所有夹子，通过重力进料将饲养细胞悬液添加至烧瓶中。热封连接附近的红色管线。将TIL悬液转运包连接到烧瓶上。将G-Rex500MCS的红色管线无菌连接到“TIL悬液”转运包。
向G-Rex500MCS添加TIL。打开TIL悬液和G-Rex500MCS之间的所有夹子，通过重力进料将TIL悬液添加至烧瓶中。热封连接附近的红色管线，取出TIL悬液袋。
孵育G-Rex500MCS。检查是否已关闭G-Rex500MCS上除大型过滤器管线之外的所有夹子，放置在培养箱中。培养箱参数：温度LED显示：37.0℃±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
计算孵育窗口。进行计算以确定在第16天从培养箱中取出G-Rex500MCS的合适时间。下限：孵育时间+108小时。上限：孵育时间+132小时。
第11天-冷冻保存过量的TIL
冻结过量的TIL瓶。记录并验证放入“控速冷冻机(CRF)”中的瓶的总数。冷冻完成后，将小管从CRF转移至适当的储存容器中。
第16天-制备培养基
预热AIM-V培养基。至少在使用前12小时从2℃至8℃取出3个CTS AIM V 10L培养基袋，在室温下避光放置。给每个袋子贴上标签。记录预热开始时间和日期。确保已将所有袋子加热12到24小时。
用鲁尔连接件器将流体泵转运装置的较大直径的一端连接到10L Labtainer袋的母端口之一。设置10L Labtainer用于上清液。标为“上清液”。设置10L Labtainer用于上清液。在从BSC上卸下之前，确保所有夹子都已关闭。
每个CTS AIM V培养基袋解冻5×1.1mL的IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰熔化。将100.0mL的Glutamax分装到适当大小的接收容器中。记录添加至每个接收容器的体积，将每个接收容器标记为“GlutaMax”。
将IL-2添加至GlutaMax。用微量移液器向每个GlutaMax接收容器中加入5.0mLIL-2。按照操作冲洗吸头，针对添加的每毫升，使用新的移液器吸头。记录添加至每个Glutamax接收容器的体积。将每个接收容器标记为“GlutaMax+IL-2”和接收容器编号。
准备用于制剂的CTS AIM V培养基袋。确保在使用前在室温下加热CTS AIM V 10L培养基袋(W3012717)并避光放置12至24小时。记录结束孵育时间。在BSC中，关闭4英寸血浆转运装置上的夹子，然后使用尖嘴端口(spike port)将夹子连接到袋子。保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。通过鲁尔接口将中继泵流体转运装置的较大直径端连接到4英寸血浆转运装置。
将Baxa泵安装在BSC旁。从BSC取出中继泵流体转运装置的泵管部分，将其安装在中继泵中。
准备配制培养基。在BSC中，将注射器从泵送液体分配系统(PLDS)中移除并丢弃。确保不损害PLDS移液器的无菌性。通过鲁尔连接件将PLDS移液器连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液器吸头置于如上制备的“GlutaMax+IL-2”中，用于抽吸。打开接收容器和10L袋之间的所有夹子。
将GlutaMax+IL-2泵入袋中。将泵速设为“中”和“3”，将所有“GlutaMax+IL-2”泵入10L CTS AIM V培养基袋中。一旦无溶液残留，清除管线并停止泵。记录添加至下面每个AimV袋中的含IL-2的GlutaMax的体积。
移除PLDS。确保关闭所有夹子，从中继泵流体转运装置上卸下PLDS移液器。卸下中继泵流体转运装置，盖上4英寸血浆转运装置的红色盖子。
标记制备好的每个“完全CM4第16天培养基”袋。
按照样品计划，取出培养基保留。使用30mL注射器，通过将注射器连接到4英寸血浆转运装置上，取出20.0mL的“完全CM4第16天培养基”，然后将样品加到50mL锥形管中。取出注射器后，确保将4英寸血浆转运装置夹紧或盖上红色盖子。
连接新的中继泵流体转运装置。将新的流体泵转运装置的较大直径的一端连接到与“完全CM4第16天培养基”袋连接的4英寸血浆转运装置上。贴上样品计划库存标签，将培养基保留样品储存在2℃至8℃下，直至提交进行检测。
监控培养箱。如果适用，监控准备的其他袋子。培养箱参数：温度LED显示：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
加热完全CM4第16天培养基。在培养箱中将第一袋完全CM4第16天培养基加热≥30分钟，直至可使用。如果适用，加热其他袋子。
制备稀释液。在BSC中，向每个4×15mL锥形管中加入4.5mL标记有“用于细胞计数稀释”的AIM-V培养基。标记锥形管。标记4个冻存管。
第16天-REP分装
监控培养箱。培养箱参数：温度LED显示屏：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
从培养箱中取出G-Rex500MCS。在从培养箱中取出G-Rex500MCS之前，进行以下检查以确保符合培养参数：上限、下限、取出时间。从培养箱中取出G-Rex500MCS。
热封1L转运包(W3006645)，留下约12英寸管线。将1L转运包标为“TIL悬液”。将包括整个管线在内的1L转运包放在天平上，记录干重。
GatheRex设置。将G-Rex500MCS的红色培养基取出管线无菌连接到上述准备的10LLabtainer袋“上清液”上的中继泵转运装置上。将G-Rex500MCS的透明细胞取出管线无菌连接到上述准备的TIL悬液转运包上。将G-Rex500MCS烧瓶放在GatheRex的左侧。将上清液Labtainer袋和TIL悬液转运包放在右侧。从G-Rex500MCS到顶部夹子(标有红色线)安装了红色培养基取出管线，GatheRex上安装了导管。从G-Rex500MCS到底部夹子(标有蓝色线)安装了透明收获管线，在GatheRex上安装了导管。将GatheRex的气体管线连接到G-Rex500MCS的无菌过滤器上。从G-Rex500MCS取出上清液之前，确保已关闭细胞取出管线上的所有夹子。
减少G-Rex500MCS体积。按照SOP-01777，将约4.5L培养上清液从G-Rex500MCS转移至10L Labtainer。目视检查G-Rex500MCS，确保将烧瓶处于水平状态且培养基减小至吸管的末端。
准备烧瓶用于TIL收获。取出上清液后，关闭至红色管线的所有夹子。
开始TIL收获。记录TIL收获的开始时间。用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。倾斜烧瓶以确保软管在烧瓶的边缘。如果细胞收集吸管不在壁和底部膜的交界处，则以45度倾斜的角度敲击烧瓶通常足以正确放置吸管。
收获TIL。松开通往TIL悬液转运包的所有夹子。使用GatheRex将细胞悬液转移至TIL悬液转运包中。确保保持边缘倾斜，直至收集完所有细胞和培养基。检查膜上是否有贴壁细胞。
冲洗烧瓶膜。冲洗G-Rex500MCS的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜。关闭G-Rex500MCS上的夹子。确保G-Rex500MCS上的所有夹子关闭。
在尽可能靠近连接处的位置热封包含TIL的转运包，以使总管长度保持大致相同。热封含有上清液的10L Labtainer，放入BSC用于样品收集。
记录具有细胞悬液的转运包的重量，计算体积悬液。准备好的转运包用于样品取出。将4英寸血浆转运装置连接到TIL悬液转运包，使母鲁尔接口端尽可能靠近袋子。
从细胞上清液中取出检测样品。在BSC中，使用母鲁尔端口和适当尺寸的注射器从10L Labtainer中取出10.0mL上清液。放入15mL锥形管中，标记为“BacT”，保留该管用于BacT样品。使用另一个注射器，取出10.0mL上清液，放入15mL锥形管中。保留用于检测支原体样品的试管。试管标记为“支原体稀释液”。封闭上清液袋。在鲁尔端口上放一个红色盖子，以关闭袋子，从BSC中送出。
取出细胞计数样品。在BSC中，对每个样品使用单独的3mL注射器，使用鲁尔连接件从“TIL悬液”转运包中取出4x1.0 mL细胞计数样品。将样品置于如上制备的冻存管中。
取出支原体样品。使用3mL注射器，从TIL悬液转运包中取出1.0mL，放入上面制备的标有“支原体稀释液”15mL锥形管中。标记并在2℃至8℃下储存支原体样品，直至提交进行检测。
准备用于接种的转运包。在BSC中，将中继泵流体转运装置的大直径管线末端连接到包含TIL的转运包上的鲁尔接口适配器。使用止血钳夹住转运包附近的管线。在转运装置的末端放一个红色盖子。
将TIL放在培养箱中。从BSC中取出细胞悬液，放入培养箱中直至需要。记录时间。
利用NC-200进行细胞计数和计算。最初通过将0.5mL细胞悬液加入上述制备的4.5mL AIM-V培养基中来稀释细胞计数样品。这得到1:10的稀释度。
计算用于传代培养的烧瓶。计算要接种的烧瓶总数。将要接种的G-Rex500MCS烧瓶的数量向上舍入，得到接近的整数。
实施例6：由冷冻保存的肿瘤组织小规模地生产TIL
制备冷冻的肿瘤组织：使用无菌镊子和手术刀和/或剪刀无菌收集、修剪肿瘤，去除无关的非肿瘤或坏死组织。将最小尺寸为1.5cm直径的肿瘤进一步分成6mm大小的碎片。对于冷冻肿瘤，将至多10个直径为6mm的碎片放置在单个装有10mL CryoStor10(美国Biolife)储存培养基的15mL冻存管中(美国Thermo)。如果直径为6mm的碎片超过10个碎片，则使用其他冻存管。拧紧冻存管盖子；然后通过将冻存管反复倒置至少3次、至多约5次，将肿瘤碎片与储存培养基轻轻混合。然后，将冻存管在冰箱中于2℃至8℃孵育15至60分钟。孵育后，将冻存管插入冷冻运输器(cryoshipper)套管中。
冷冻肿瘤组织：将包含冻存管的冷冻运输器套管放入液氮干燥的冷冻运输器中，从而使用充入LN2且平衡温度的干燥LN2冷冻运输器内的蒸汽相液氮温度来速冻小管的内容物。对于短期储存或运输，小管保留在冷冻运输器中。对于长期储存，将小管转移、储存在液氮温度下的液氮冷冻机中。
解冻储存的肿瘤组织：通过将冻存管浸入37℃水浴中5±1分钟来解冻冷冻的肿瘤样品。使用镊子将直径为6mm的碎片取出，用含庆大霉素(美国Gibco)的无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)(美国Gibco)洗涤3次。将庆大霉素以50μg/mL的浓度添加到HBSS中。将每个6mm直径的碎片进一步解剖为约8个单独的1mm至3mm直径的碎片。典型的肿瘤碎片的直径为约1mm至3mm、厚度为约1mm至3mm。
使用1/100比例的过程进行TIL扩增：该程序以1/100比例复制了全规模的过程2ATIL制备方法。研究范围是为使用G-Rex 10M和G-Rex 5M烧瓶的小型化过程2A提供指导。使用G-Rex 10M烧瓶(全规模pre-REP过程的1:10)开始Pre-REP培养。使用在G-Rex 5M中10％的pre-REP产物开始REP，相当于全规模REP过程的1:10。在其余的实验中，这保持了1:100比例。
pre-REP开始于肿瘤处理，将四个碎片置于单个G-Rex 10M烧瓶中，与CM1+IL-2一起培养直至第11天。第11天使用在G-Rex 5M中放入的pre-REP TIL(10％pre-REP产物)、PBMC饲养细胞、OKT-3和IL-2开始REP。第16天将保留适当的TIL量，将使用倍增因子来外推全规模过程。图7总结了此实验规模的TIL生产所采用的程序。
表25列出了用于此实验规模的TIL生产的设备。
表25：设备
Figure BDA0003044135750001821
表26列出了用于此实验规模的TIL生产的软件。
表26：软件
名称 公司 版本
FACSDiva BD Biosciences 7或相同版本/升级版本
FlowJo Flow Jo 10
Cellometer K2 Nexcelom 2.1.4.2
表27列出了用于此实验规模的TIL生产的材料。
表27：材料
Figure BDA0003044135750001831
表28列出了使用的其他材料和试剂。
表28：其他材料和试剂
Figure BDA0003044135750001841
表29列出了用于细胞的流式细胞术(FACS)分析的试剂，用于表征各种标志物表达。
表29：FACS试剂
Figure BDA0003044135750001842
表30列出了用于细胞培养基的试剂。
表30：培养基试剂
Figure BDA0003044135750001851
迷你规模TIL扩增的程序(1/100比例过程2A)
第0天
培养基制备，如果需要，制备IL-2。每3个G-Rex 10M烧瓶准备350mL CM1。向CM1中添加6000IU/mL IL-2。处理肿瘤时，在37℃水浴中加热。
肿瘤处理：向每个G-Rex 10M烧瓶中添加100mL培养基和IL-2，向每个烧瓶中随机加入4个碎片。确保将碎片随机化以增加结果差异化。置于37℃/5％CO2培养箱中11天。
第11天
培养基制备，如果需要，制备IL-2。每3个G-Rex 5M烧瓶准备300mL CM2。向CM2中添加3000IU/mL IL-2，然后在37℃水浴中加热。
由第一培养物制备TIL：小心地从培养箱中取出每个G-Rex 10M烧瓶，不要扰动细胞。吸出培养基，使用10mL移液器轻轻上下混合以从膜中释放细胞。慢慢吸起培养物，记录每个烧瓶的体积，然后转移到50mL锥形瓶中。
获得用于细胞计数的200μL等分试样，然后将3个小管松散地盖上，置于37℃/5％CO2培养箱，直到准备用于接种烧瓶。计数TIL，记录在细胞计数工作表。
制备饲养细胞：获得足够数量的饲养细胞(50×106个细胞/烧瓶)；在37℃水浴中解冻饲养细胞2分钟，然后在CM2+IL-2中以1:10稀释饲养细胞。取出200μL等分试样进行细胞计数。松开瓶盖，放入37℃/5％CO2培养箱中，直至准备好接种烧瓶。1:10稀释20μL PBMC饲养细胞，计数PBMC饲养细胞。记录在细胞计数工作表。根据计数，用CM2+IL-2将饲养细胞稀释至10×106细胞/mL，然后将5mL溶液放入50mL锥形管(每个烧瓶)。对于每个烧瓶，将1.5mL 1:1000稀释的OKT-3稀释液添加到5mL饲养细胞中，孵育15分钟。
通过向每个烧瓶中添加TIL、PBMC饲养细胞、OKT-3和培养基，接种烧瓶。对于TIL，添加约10％的pre-REP产物，通常每个烧瓶最多约2×106个细胞。添加如上制备的5mL PBMC饲养细胞，总共含有50×106个细胞。加入1.5mL的1:1000稀释的OKT-3储备液，然后通过加入CM2培养基使最终体积达到50mL。
第16天
制备分装的培养基：如果需要，制备IL-2；然后每3个烧瓶准备150mL CM4。接下来，向培养基中添加3000IU/mL IL-2。放置在37℃水浴中直至需要。
分装：小心地从培养箱取出G-Rex 5M烧瓶，不要扰动细胞，然后吸出约40mL培养基，注意不要吸出细胞。用10mL移液器轻轻上下混合，从膜中释放细胞；然后，缓慢吸起培养物，记录每个烧瓶的体积，然后转移至50mL锥形瓶。取200μL等分试样进行细胞计数，然后给3个小管松散地盖上盖子，将其置于37℃/5％CO2培养箱，直至准备好接种至烧瓶。计数TIL，记录在细胞计数工作表。从G-Rex 5M烧瓶底部吸出残留液体，确保烧瓶中没有多余TIL残留。
计算每个烧瓶的子代烧瓶数量(TVC/106)，向上舍入(最大5)。用TVC除以子代烧瓶数量，然后将烧瓶调整至计算出的数量。一些实验可能只允许继续一个烧瓶。这也将在收获结束时外推和解释。用CM4+IL2将烧瓶填充至50mL，然后将烧瓶置于37℃/5％CO2下。
第22天
收获：小心地从培养箱中取出G-Rex 5M烧瓶，不要扰动细胞，然后吸出上清液进行代谢物分析(如果需要)。吸出培养基，使用10mL移液器轻轻上下混合以从膜中释放细胞。慢慢吸起培养物，记录每个烧瓶的体积，然后转移到50mL锥形瓶。取出200μL等分试样进行细胞计数；松散地盖上3个小管，放入37℃/5％CO2培养箱，直至准备好接种烧瓶。
将TIL计数记录在细胞计数工作表；外推并记录理论全规模产量(TVC*100)。如果仅一个烧瓶继续分装，也应乘以以上计算的烧瓶数量。然后，为表31所列测定分配细胞。
表31：功能测定
功能测定 细胞数量/培养物上清液
流式表型(DF1/DF2)-WRK LAB-041 ≥10×10<sup>6</sup>
IFN-γ再刺激-WRK LAB-016 ≥5×10<sup>6</sup>
进行冷冻的细胞 所有剩余细胞
用1％HSA/PL-A的1:10稀释液洗涤剩余细胞两次。用含CS10(30×106细胞/mL/管)的1:1制剂将剩余细胞冷冻在隔热容器(例如Mr.Frosty容器)或CRF中，以用于其他研究。
表32总结了TIL生产过程的关键工艺参数。
表32：工艺参数
Figure BDA0003044135750001871
实施例7：用冷冻肿瘤组织TIL进行早期REP
该数据使用实施例5中详述的TIL制备方案的修改版本产生。强调了与实施例5不同的实验方法的方面。
肿瘤组织制备：根据需要，通过向组织中添加Hank平衡盐溶液(HBSS)来保持肿瘤的水分，通过逐滴添加使其保持水分。使用无菌镊子、手术刀和剪刀修剪肿瘤，除去多余的非肿瘤组织。将最小尺寸为1.5cm直径的肿瘤碎片进一步切成6mm直径的碎片。每个碎片的理想厚度为约6mm。
肿瘤组织冷冻：在每个冻存管中放置至多10个肿瘤碎片(标称尺寸6mm×6mm×6mm)。使用15mL冻存管(美国Thermo)。向每个管中加入10mL CryoStor10(美国Biolife)。拧紧冻存管盖子，将试管颠倒5次，轻轻地混合冻存管中的内容物。然后将冻存管在冰箱中于2℃至8℃孵育15分钟、30分钟或60分钟。用储存培养基冷藏孵育后，将冻存管装在套管中，然后使用充入LN2且平衡温度的干燥LN2冷冻运输器(Cryoport)内的蒸汽相液氮温度来速冻小管的内容物。对于储存，将完全冷冻的冻存管转移到液氮细胞储存冷冻器中，将冷冻的肿瘤组织维持在液氮温度。
肿瘤解冻：在TIL制备过程的第0天，将装有肿瘤组织碎片的冻存管从套管中取出，放入可密封的塑料袋中，然后通过将密封的袋浸入37℃水浴中5±1分钟来解冻。
通过使用镊子，将肿瘤碎片小心地移入无菌HBSS(美国Gibco)+庆大霉素(美国Gibco)中，在含有庆大霉素(50μg/mL)的HBSS中连续洗涤3次，每次洗涤≥3分钟。从原始肿瘤样品上切下所有尺寸为约5-6mm的单个碎片，将其放在新的无菌塑料表面上的HBSS单个液滴中。
将至多60个这些碎片放入装有1L细胞培养基1(CM1)的G-Rex 100MCS烧瓶中，培养基中补充有6000IU/mL重组人IL-2，将该烧瓶置于潮湿环境的培养箱(目标37℃、5％CO2的空气)中，开始pre-快速扩增阶段(pre-REP)单元操作。
TIL制备的概述：Pre-REP和REP。小规模GEN 2过程(1/100比例)用于测试“新鲜”对照和几种冷冻肿瘤的条件。以全规模pre-REP过程的1:10规模，使用G-Rex 10M烧瓶开始pre-REP培养。在G-Rex 5M中使用10％pre-REP产物开始REP，相当于全规模REP过程的1:100。
对于“新鲜”对照过程，用无菌HBSS+庆大霉素洗涤新鲜肿瘤，将新鲜肿瘤切成标称6mm×6mm×6mm的碎片。将约4个碎片放入装有含6,000IU/mL rhIL-2的CM1培养基的G-Rex10M烧瓶中。G-Rex培养物在37℃培养箱中培养11天。在培养的第11天，收获pre-REP细胞，通过将10％的Pre-REP TIL与50×106PBMC饲养细胞在含有3,000IU/mL rhIL-2和30ng/mLOKT-3的CM2培养基(在G-Rex 5M烧瓶中)中共培养来开始REP。在共培养的第16天，将培养物分装到G-Rex 5M烧瓶，含有不超过10×106个细胞。分装的“子代”烧瓶的数量的计算如下：TVC/106＝子代烧瓶的数量(向上舍入)。
将分装的培养物在含有3,000IU/mL rhIL-2的CM4培养基中再培养6天。在第22天，收获细胞并使用CryoStor10(Biolife，美国)冷冻。
对于冷冻肿瘤的扩增过程，如上所述，将标称的6mm×6mm×6mm的碎片加工成较小的2mm至3mm的碎片。用于冷冻肿瘤扩增的pre-REP设置、REP开始、分装过程和试剂与“新鲜”对照过程完全相同，但以下除外：
Pre-REP培养的持续时间为7天(“新鲜”对照为11天)。
REP培养的持续时间为14天，在第7天进行分装；而“新鲜”对照为11天，在第5天进行分装。因此，冷冻肿瘤的总持续时间为21天，而“新鲜”对照为22天。
REP TIL的表征：由各肿瘤处理条件(新鲜，用储存培养基冷冻孵育0、30分钟或60分钟)产生的TIL。为表征TIL的纯度、一致性(identity)、记忆亚群、活化和耗竭标志物，使用以下抗体进行流式细胞术：CD3-BUV395、CD62LBV421、CD57-PB、CD11c-BV711、CD28-BB515、CD19-BUV563、CCR7-PE、CD123-BV605、CD27PE-CF594、CD14-BV-650、TCRγ/δ-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD45RA-A700、CD56-BUV737、CD8-BV786、CD4-PE-Cy7AND、CD16-APC-Vio770、TIL-2面板、CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780。根据IFN-γ、端粒酶B和CD107A的分泌进一步确定TIL功能。简而言之，用抗CD3包被的板刺激约105个细胞24小时。收集培养物上清液，使用ELISA检测IFN-γ和端粒酶B。对于CD107A水平，在用或不用PMA/IO刺激TIL 2小时的情况下，对CD107A-APC700进行染色，通过流式细胞仪进一步分析。
遵循制造商的说明，使用用于流式细胞术试剂盒的Dako/Agilent病理学溶液端粒PNA试剂盒/FITC进行Flow-FISH，确定端粒的长度。1301T细胞白血病细胞系(Sigma-Aldrich)被用作内部参考标准。
结果
图8显示了基于肿瘤组织冷冻程序的pre-REP活细胞总数(TVC)。与立即速冻和冷冻前孵育更长时间相比，在冷藏条件下(2℃至8℃)在储存培养基中孵育约30分钟可产生活力最高的细胞。图9显示了第21天的REP TVC结果。冷冻方案会影响pre-REP培养物的早期活力。通过测量IFN-γ分泌来评估其他功能，总结于图10中。首先在储存培养基中孵育30分钟的由冷冻的肿瘤组织扩增的TIL表达最高水平的IFN-γ。细胞表型组中评估的所有标志物(参见表29)证明，由冷冻肿瘤组织产生的TIL具有与由新鲜肿瘤组织产生的TIL相似的表型。
图11和12概述了主要步骤，并突出显示了在此示例性实验中比较的细胞群之间的差异。
图13-23显示了3至5名患者的新鲜肿瘤样品和冷冻肿瘤样品的TIL表型表征的结果。患者M1125测试了速冻以及在2℃至8℃的温度下孵育30分钟和60分钟然后在液氮的蒸汽相中冷冻，所有其他患者均测试了在2℃至8的温度下孵育60分钟然后在液氮蒸汽相中冷冻。总体而言，冷冻肿瘤样品的性能与新鲜肿瘤一样或优于新鲜肿瘤样品。
实施例8：肿瘤冷冻保存过程
根据以下过程，在本发明的示例性实施方式中可将肿瘤冷冻保存。肿瘤组织必须无菌处理，在整个处理过程中保持无污染。
从患者身上取出组织后，应根据需要通过使用移液管逐滴添加汉克平衡盐溶液(HBSS)来保持组织中的水分。将肿瘤无菌地放置在带盖的无菌样品容器中，转移至手术室或层流罩的无菌表面(如果送去病理检查)。使用无菌镊子和无菌手术刀或剪刀，应由指定切除医师或经验丰富的病理学家对肿瘤各个部位进行修剪，除去多余的非肿瘤或坏死组织。尽可能排除出血、液体和坏死组织。医师或病理学家应评估被检样品，确保组织是活的、无出血、无坏死且符合最小尺寸规格。如果可能，组织应具有色素异质性(pigmentheterogeneity)。
如果肿瘤的直径为至少1.5cm，则可以将其切成两半，得到冷冻样品和新鲜样品以进行比较。将修剪后的肿瘤的一半放入Hypothermosol无菌瓶中，该瓶保持在4℃至8℃的温度下，添加有庆大霉素和两性霉素。盖子应拧紧。这提供了新鲜样品。
肿瘤的另一半应被破碎成10mm×6mm的碎片，放入准备好的装有10mL无菌
Figure BDA0003044135750001901
10的15mL无菌冻存管中。如果获得了10个以上的6mm碎片，则使用其他含有10mL无菌CryoStor 10的15mL冻存管。应拧紧盖子，将冷冻样品容器于4℃下放置1小时，然后在液氮上速冻。这提供了冷冻样品。
冷冻肿瘤标本应按照冷冻运输器说明包装在冷冻运输器中。
实施例9：由卵巢癌肿瘤进行16天的冷冻肿瘤扩增过程
使用小规模的TIL扩增过程(1/100比例)检测“新鲜”对照肿瘤样品和冷冻肿瘤样品。冷冻的肿瘤样品根据上文实施例7和8中讨论的冷冻保存方法冷冻。使用G-Rex10M烧瓶以全规模pre-REP过程的1:10开始Pre-REP。在G-Rex 5M烧瓶中使用10％pre-REP产物开始REP，这相当于全规模REP过程的约1:100。本实施例中使用卵巢肿瘤样品。
新鲜肿瘤制备。用补充有庆大霉素的无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤6个直径为3mm的新鲜肿瘤碎片。将碎片置于装有含约6,000IU/mL rhIL-2的CM1培养基的G-Rex 10M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)中。将这些培养物在37℃的培养箱中培养11天。在第11天，收获pre-REP细胞，通过在G-Rex 5M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)中，将10％的pre-REP TIL与50×106个PBMC饲养细胞共培养来开始REP，该G-Rex5M烧瓶装有含3,000IU/mL rhIL-2和30ng/mL的OKT-3的CM2培养基。在第16天，将培养物分装到G-Rex 5M烧瓶，含有不超过10×106个细胞。将分装的培养物在含有3,000IU/mL rhIL-2的CM4培养基中再培养6天。在第22天，收获细胞并使用CryoStor10(Biolife，美国)冷冻。
冷冻肿瘤制备-早期REP方法1(“ER-1”)。将6个2mm至3mm直径的冷冻肿瘤碎片解冻，用补充有庆大霉素的无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)进行洗涤。将碎片置于装有含约6,000IU/mL rhIL-2的CM1培养基的G-Rex 10M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)中。将这些培养物在37℃的培养箱中培养5天。在第5天，收获pre-REP细胞，通过在G-Rex5M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)中，将10％的pre-REP TIL与25×106或50×106个PBMC饲养细胞共培养来开始REP，该G-Rex5M烧瓶装有含3,000IU/mL rhIL-2和30ng/mL的OKT-3的CM2培养基。在第10天，将培养物分装到G-Rex 5M烧瓶，含有不超过10×106个细胞。将分装的培养物在含有3,000IU/mL rhIL-2的CM4培养基中再培养6天。在第16天，收获细胞并使用CryoStor10(Biolife，美国)冷冻。
冷冻肿瘤制备-早期REP方法2(“ER-2”)。将6个2mm至3mm直径的冷冻肿瘤碎片解冻，用补充有庆大霉素的无菌Hank平衡盐溶液(HBSS)进行洗涤。将碎片置于装有含约6,000IU/mL rhIL-2的CM1培养基的G-Rex 10M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)中。将这些培养物在37℃的培养箱中培养3天。在第3天，收获pre-REP细胞，通过在G-Rex5M烧瓶(Wilson Wolf Mfg，新布赖顿，明尼苏达州)中，将10％的pre-REP TIL与25×106或50×106个PBMC饲养细胞共培养来开始REP，该G-Rex5M烧瓶装有含3,000IU/mL rhIL-2和30ng/mL的OKT-3的CM2培养基。在第9天，将培养物分装到G-Rex 5M烧瓶，含有不超过10×106个细胞。将分装的培养物在含有3,000IU/mL rhIL-2的CM4培养基中再培养7天。在第16天，收获细胞并使用CryoStor10(Biolife，美国)冷冻。
图24显示了比较这三种扩增方法的流程图。结果示于下表33。与使用新鲜肿瘤样品方法的GEN2相比，使用ER-1和ER-2方法的TIL扩增产生了大得多的REP倍数扩增。
表33：将实施例9的扩增结果外推至全规模
Figure BDA0003044135750001921
实施例10：用其他肿瘤类型进行16天的冷冻肿瘤扩增过程
用从至少两名癌症患者收集的肿瘤样品进行实施例9中公开的过程，癌症类型如下：黑色素瘤、肺癌、宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。对于每种癌症类型，以与上述ER-1和ER-2方法基本相同的方式进行扩增过程。如上所述收集数据。
实施例11：用成分明确的培养基进行16天的冷冻肿瘤扩增过程
用从至少两名癌症患者收集的肿瘤样品进行实施例9中公开的过程，癌症类型如下：黑色素瘤、肺癌、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和卵巢癌，但是用根据本发明的成分明确的培养基(例如，含有3％CTSTM免疫细胞血清替代品(ThermoFisher Scientific)和55mM 2-巯基乙醇的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM)替换CM1和CM2培养基。
实施例12：用OMNI C3 TM 培养袋和
Figure BDA0003044135750001931
生物容器进行16天的冷冻肿瘤扩增过 程
用从至少两名癌症患者收集的肿瘤样品进行实施例9中公开的过程，癌症类型如下：黑色素瘤、肺癌、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和卵巢癌，但是用OMNI C3TM培养袋(Lampire Biological Laboratories)或
Figure BDA0003044135750001932
细胞扩增生物容器(CharterMedical)替换GRex透气容器。在pre-REP/第一次扩增阶段替换OMNI C3TM培养袋，在REP/第二次扩增阶段替换
Figure BDA0003044135750001933
生物容器。
实施例13：用成分明确的培养基、OMNI C3 TM 培养袋和
Figure BDA0003044135750001934
生物容器进行16 天的冷冻肿瘤扩增过程
用从至少两名癌症患者收集的肿瘤样品进行实施例9中公开的过程，癌症类型如下：黑色素瘤、肺癌、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)和卵巢癌，但是用根据本发明的成分明确的培养基(例如CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM，ThermoFisher)替换CM1和CM2培养基、用OMNI C3TM培养袋(Lampire Biological Laboratories)或
Figure BDA0003044135750001935
细胞扩增生物容器(Charter Medical)替换GRex透气容器。在pre-REP/第一次扩增阶段替换OMNI C3TM培养袋，在REP/第二次扩增阶段替换
Figure BDA0003044135750001936
生物容器。
序列表
<110> 艾欧凡斯生物治疗公司（Iovance Biotherapeutics, Inc.）
<120> 由冷冻保存的肿瘤样品扩增TIL
<130> 116983-5041
<150> US 62/733,937
<151> 2018-09-20
<150> US 62/879,881
<151> 2019-07-29
<160> 176
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗重链
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 莫罗单抗轻链
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-2 (rhIL-2)
<400> 3
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿地白细胞介素
<400> 4
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
20 25 30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
35 40 45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
50 55 60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65 70 75 80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
85 90 95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
100 105 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
115 120 125
Ser Thr Leu Thr
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-4 (rhIL-4)
<400> 5
Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp
20 25 30
Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg
35 40 45
Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr
50 55 60
Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu
65 70 75 80
Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly
85 90 95
Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
100 105 110
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 6
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-7 (rhIL-7)
<400> 6
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
35 40 45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
50 55 60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
85 90 95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
115 120 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
130 135 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-15 (rhIL-15)
<400> 7
Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组人IL-21 (rhIL-21)
<400> 8
Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val
1 5 10 15
Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr
65 70 75 80
Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp
85 90 95
Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly
115 120 125
Ser Glu Asp Ser
130
<210> 9
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人4-1BB, 肿瘤坏死因子受体超家族，成员9
（智人）
<400> 9
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 10
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠4-1BB，肿瘤坏死因子受体超家族，成员9
（小家鼠）
<400> 10
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 11
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链
<400> 12
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链可变区
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链可变区
<400> 14
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链CDR1
<400> 15
Ser Thr Tyr Trp Ile Ser
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链CDR2
<400> 16
Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的重链CDR3
<400> 17
Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR1
<400> 18
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR2
<400> 19
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌托鲁单抗的轻链CDR3
<400> 20
Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val
1 5 10
<210> 21
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 22
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Cys Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链可变区
<400> 23
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Pro
115 120
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链可变区
<400> 24
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR1
<400> 25
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR2
<400> 26
Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的重链CDR3
<400> 27
Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR1
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR2
<400> 29
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 乌瑞鲁单抗的轻链CDR3
<400> 30
Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Pro Ala Leu Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Fc结构域
<400> 31
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 32
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 33
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 33
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 34
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 35
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 35
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 36
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 36
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 37
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 37
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 38
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 38
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 39
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 39
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 40
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 40
Gly Gly Pro Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu
20
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 41
Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
20 25
<210> 42
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Fc结构域
<400> 42
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Ala Gly Asn Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
50 55 60
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
65 70 75 80
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
85 90 95
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
245
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 43
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 44
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 45
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 46
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 47
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BBL的可溶结构域
<400> 47
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
20 25 30
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
35 40 45
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
50 55 60
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
85 90 95
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
100 105 110
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
115 120 125
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
145 150 155 160
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165
<210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本1的重链可变区
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本1的轻链可变区
<400> 49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本2的重链可变区
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4B4-1-1版本2的轻链可变区
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Gln Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H39E3-2的重链可变区
<400> 52
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr
115 120
<210> 53
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H39E3-2的轻链可变区
<400> 53
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105
<210> 54
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人OX40 (智人)
<400> 54
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 55
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠OX40 (小家鼠)
<400> 55
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 56
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链
<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链可变区
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr
115
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链可变区
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链CDR1
<400> 60
Gly Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链CDR2
<400> 61
Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Tyr His
1 5 10
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的重链CDR3
<400> 62
Arg Tyr Lys Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链CDR1
<400> 63
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链CDR2
<400> 64
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 他利昔珠单抗的轻链CDR3
<400> 65
Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Trp
1 5
<210> 66
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 68
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链可变区
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链可变区
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链CDR1
<400> 70
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链CDR2
<400> 71
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的重链CDR3
<400> 72
Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链CDR1
<400> 73
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链CDR2
<400> 74
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 11D4的轻链CDR3
<400> 75
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 76
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 77
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链
<400> 77
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 78
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链可变区
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链可变区
<400> 79
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链CDR1
<400> 80
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链CDR2
<400> 81
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的重链CDR3
<400> 82
Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链CDR1
<400> 83
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链CDR2
<400> 84
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 18D8的轻链CDR3
<400> 85
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
1 5
<210> 86
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链可变区
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链可变区
<400> 87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链CDR1
<400> 88
Ser His Asp Met Ser
1 5
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链CDR2
<400> 89
Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的重链CDR3
<400> 90
His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链CDR1
<400> 91
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链CDR2
<400> 92
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu119-122的轻链CDR3
<400> 93
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链可变区
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链可变区
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链CDR1
<400> 96
Asp Tyr Ser Met His
1 5
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链CDR2
<400> 97
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的重链CDR3
<400> 98
Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链CDR1
<400> 99
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链CDR2
<400> 100
Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu106-222的轻链CDR3
<400> 101
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 102
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L
<400> 102
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 103
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L的可溶结构域
<400> 103
Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu
1 5 10 15
Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu
20 25 30
Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe
35 40 45
Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser
50 55 60
Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val
65 70 75 80
Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys
85 90 95
Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His
100 105 110
Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe
115 120 125
Cys Val Leu
130
<210> 104
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40L的可溶结构域 (替代)
<400> 104
Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys
20 25 30
Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile
35 40 45
Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
50 55 60
Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val
65 70 75 80
Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu
85 90 95
Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly
100 105 110
Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
115 120 125
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 008的重链可变区
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ser Gln Val His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 106
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 008的轻链可变区
<400> 106
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 107
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 011的重链可变区
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Asp Arg Tyr Phe Arg Gln Gln Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 108
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 011的轻链可变区
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Tyr Asn His Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 109
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 021的重链可变区
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Tyr Ile Thr Leu Pro Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120
<210> 110
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 021的轻链可变区
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Lys Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
100 105
<210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 023的重链可变区
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Asp Asn Val Met Gly Leu Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 112
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 023的轻链可变区
<400> 112
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 113
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<400> 113
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 115
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<400> 115
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Pro
115 120
<210> 116
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Thr Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 117
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 117
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 118
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Pro Tyr Tyr Asp Tyr Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 119
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 120
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 121
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的重链可变区
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50 55 60
Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Asp Asp Tyr Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 123
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 124
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化抗体的轻链可变区
<400> 124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 125
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重链可变区
<400> 125
Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ser Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Trp Gly Glu Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 126
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 126
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
100 105 110
Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 127
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的重链
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 128
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的轻链
<400> 128
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 129
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的重链可变区
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的轻链可变区
<400> 130
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的重链CDR1
<400> 131
Asn Ser Gly Met His
1 5
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的重链CDR2
<400> 132
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 133
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的重链CDR3
<400> 133
Asn Asp Asp Tyr
1
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的轻链CDR1
<400> 134
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的轻链CDR2
<400> 135
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 尼沃鲁单抗的轻链CDR3
<400> 136
Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 137
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的重链
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 138
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的轻链
<400> 138
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 139
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的重链可变区
<400> 139
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 140
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的轻链可变区
<400> 140
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的重链CDR1
<400> 141
Asn Tyr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 142
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的重链CDR2
<400> 142
Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的重链CDR3
<400> 143
Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的轻链CDR1
<400> 144
Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的轻链CDR2
<400> 145
Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 帕博利珠单抗的轻链CDR3
<400> 146
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 147
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的重链
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 148
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的轻链
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser
65 70 75 80
Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
85 90 95
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
100 105 110
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
115 120 125
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
130 135 140
Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
145 150 155 160
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
165 170 175
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
180 185 190
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
195 200 205
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
210 215 220
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
225 230 235 240
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
245 250 255
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
260 265
<210> 149
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的重链可变区
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 150
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的轻链可变区
<400> 150
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的重链CDR1
<400> 151
Arg Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的重链CDR2
<400> 152
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的重链CDR3
<400> 153
Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的轻链CDR1
<400> 154
Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的轻链CDR2
<400> 155
Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 度伐鲁单抗的轻链CDR3
<400> 156
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 157
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的重链
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 158
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的轻链
<400> 158
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 159
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的重链可变区
<400> 159
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 160
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的轻链可变区
<400> 160
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的重链CDR1
<400> 161
Ser Tyr Ile Met Met
1 5
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的重链CDR2
<400> 162
Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的重链CDR3
<400> 163
Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 164
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的轻链CDR1
<400> 164
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 165
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的轻链CDR2
<400> 165
Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿维鲁单抗的轻链CDR3
<400> 166
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val
1 5 10
<210> 167
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的重链
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 168
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的轻链
<400> 168
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 169
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的重链可变区
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 170
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的轻链可变区
<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的重链CDR1
<400> 171
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 172
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的重链CDR2
<400> 172
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的重链CDR3
<400> 173
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的轻链CDR1
<400> 174
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的轻链CDR2
<400> 175
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 阿特利珠单抗的轻链CDR3
<400> 176
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5

Claims (75)

1.一种冷冻保存肿瘤组织以生产肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(i)破碎肿瘤组织；
(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，将肿瘤组织破碎成直径为约1.5mm至6mm的近似球形的碎片。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述近似球形的碎片的直径为约6mm。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述近似球形的碎片的直径为约3mm。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，将肿瘤组织破碎成最短边缘长度为至少1.5mm、最长边缘长度为约6mm的大致矩形的碎片。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，将肿瘤组织破碎成边缘长度为约1.5mm至约6mm的大致立方体的碎片。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述大致立方体的碎片的边缘长度为约6mm。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述大致立方体的碎片的边缘长度为约3mm。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤组织来自解剖的肿瘤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述解剖的肿瘤为不到8小时大。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含2％v/v至15％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含约10％v/v DMSO。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含至少一种抗微生物剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述至少一种抗微生物剂是浓度为至少50μg/mL的庆大霉素。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述冷冻保存培养基中孵育所述肿瘤碎片约30分钟至约80分钟。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，在约2℃至8℃的温度下在所述冷冻保存培养基中孵育所述肿瘤碎片。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，在孵育之前，用生理缓冲等渗盐溶液洗涤所述肿瘤组织。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，每次连续洗涤后均更换生理缓冲等渗盐溶液。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冷冻在-125℃至约-196℃的温度下进行。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述冷冻在约-140℃至约-175℃的温度下进行。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述冷冻在约-145℃的温度下进行。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括步骤(iv)：将冷冻的碎片储存在低于至少-130℃下。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，将冷冻的碎片储存在液氮的蒸汽相中。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，将冷冻的碎片浸没在液氮中储存。
25.一种用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：
(i)破碎解剖的肿瘤或肿瘤活检样品；
(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。
26.根据权利要求25所述的通过所述方法制备的用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，其中，步骤(ii)还包括：在约2℃至约8℃下，在包含10％v/v DMSO的冷冻保存培养基中孵育碎片约30分钟至约60分钟。
27.一种用于制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的冷冻保存的肿瘤碎片，所述冷冻保存的肿瘤碎片通过包括以下步骤的方法制备：
(i)破碎解剖的肿瘤，其中，碎片为大致立方体形且每个边缘为约6mm；
(ii)在冷冻保存培养基中孵育碎片，所述冷冻保存培养基包含10％DMSO v/v，其中，所述孵育在约2℃至约8℃的温度下进行约30分钟至约60分钟；以及
(iii)冷冻碎片，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻。
28.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括在包含IL-2的培养基中培养冷冻保存的肿瘤碎片。
29.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基处理冷冻保存的肿瘤碎片，产生TIL；
(b)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL；以及
(c)可选地冷冻保存所述扩大数量的TIL。
30.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟至约60分钟；
(iv)冷冻容器，其中，所述冷冻是使用液氮的蒸汽相进行的速冻；以及
(v)将容器储存在-130℃以下；
(b)解冻容器；
(c)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3的第一细胞培养基处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，将步骤(i)中的肿瘤组织修剪成直径为1.5mm至6mm。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，将步骤(i)中的肿瘤组织修剪成约6mm×6mm×6mm。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中，所述储存培养基还包含抗细菌剂和抗真菌剂。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中，所述储存培养基包含2％v/v至12％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述储存培养基包含10％的DMSO。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中，所述储存培养基包含浓度为至少50μg/mL的庆大霉素。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中，在进行步骤(i)之前，先用Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤肿瘤组织。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述洗涤包括三次连续洗涤、每次洗涤至少三分钟，在每次连续洗涤之后更换HBSS。
39.根据权利要求30至38中任一项所述的方法，其中，步骤(b)包括将所述容器浸入约37℃水浴中约5分钟。
40.根据权利要求1或30所述的方法，其中，所述肿瘤组织选自：黑色素瘤肿瘤组织、头颈肿瘤组织、乳腺肿瘤组织、肾肿瘤组织、胰腺肿瘤组织、胶质母细胞瘤肿瘤组织、肺肿瘤组织、结直肠肿瘤组织、肉瘤肿瘤组织、三阴性乳腺肿瘤组织、宫颈肿瘤组织、卵巢肿瘤组织或HPV阳性肿瘤组织。
41.根据权利要求30所述的方法，其中，所述方法还包括在第一次扩增步骤(c)和第二次扩增步骤(e)之间的分装。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述分装发生在步骤(c)开始后约16天。
43.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中，所述第一次培养步骤为约11天。
44.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中，步骤(c)至步骤(e)进行约22天的时间。
45.根据权利要求30至42中任一项所述的方法，其中，步骤(c)至步骤(e)进行少于20天的时间。
46.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(iv)包括在约-125℃至约-150℃下冷冻容器。
47.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(iv)包括使用液氮的蒸汽相冷冻容器。
48.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(v)包括将容器储存在低于至少约-130℃下。
49.根据权利要求30所述的方法，其中，步骤(v)包括将容器浸没在液氮中储存。
50.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(b)解冻容器；
(c)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3的第一细胞培养基处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
51.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)以冷冻状态储存肿瘤组织，储存肿瘤组织的方法包括：
(i)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(ii)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(iii)在2℃至8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约30分钟；
(iv)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；以及
(v)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)将肿瘤碎片加入封闭系统中；
(d)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；步骤(c)至步骤(d)的转换在不打开系统的情况下发生；
(e)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；步骤(d)至步骤(e)的转换在不打开系统的情况下发生；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(e)至步骤(f)的转换在不打开系统的情况下发生；
(g)将来自步骤(f)的收获的TIL群转移至输液袋；其中，步骤(f)至步骤(g)的转换在不打开系统的情况下发生；
(h)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(g)的包含收获的TIL群的输液袋；以及
(i)向受试者施用来自步骤(h)中输液袋的治疗有效剂量的第三TIL群。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述方法还包括步骤(j)：向受试者同时施用治疗有效剂量的阿地白细胞介素或其生物类似物；以及步骤(k)：向受试者同时施用治疗有效剂量的PD-1/PD-L1抑制剂。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述PD-1/PD-L1抑制剂选自：帕博利珠单抗、尼沃鲁单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、阿特利珠单抗及它们的生物类似物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述癌症选自：黑色素瘤、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌和肉瘤。
55.一种由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(e)从患者获得肿瘤组织；
(f)在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织至少30分钟；
(g)冷冻肿瘤组织；
(h)以冷冻状态储存肿瘤组织；
(b)解冻肿瘤组织；
(c)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(d)取出至少多个TIL；以及
(e)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
56.一种由冷冻的肿瘤组织扩增TIL的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(b)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(c)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(d)冷冻容器；
(e)储存容器，使容器保持冷冻；
(d)解冻容器；
(f)在透气容器中用第一细胞培养基和白细胞介素2(IL-2)处理肿瘤组织，产生TIL；
(g)取出至少多个TIL；以及
(h)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
57.一种治疗有需要的人类受试者的癌症的方法，所述方法包括施用通过包括如下步骤的方法制得的扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)：
(a)从受试者获得肿瘤组织；
(b)修剪肿瘤组织，去除多余的非肿瘤组织；
(c)将肿瘤组织放置在包含储存培养基的可封闭容器中；
(d)在约2℃至约8℃的温度下孵育包含肿瘤组织和储存培养基的容器约20分钟至约70分钟；
(e)使用液氮的蒸汽相冷冻容器；
(f)在液氮温度的蒸汽相下储存容器；
(g)解冻肿瘤组织；
(h)将肿瘤组织加入封闭系统中；
(i)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养来自肿瘤组织的第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；第一次扩增进行约3天至14天，获得第二TIL群；第二TIL群的数量至少比第一TIL群大50倍；步骤(h)至步骤(i)的转换在不打开系统的情况下发生；
(j)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三TIL群；第三TIL群是治疗性TIL群，相对于第二TIL群，所述治疗性TIL群包含增加的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞的亚群；第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；步骤(i)至步骤(j)的转换在不打开系统的情况下发生；
(k)收获从步骤(j)获得的治疗性TIL群；其中，步骤(j)至步骤(k)的转换在不打开系统的情况下发生；
(l)将步骤(k)中收获的治疗性TIL群转移至输液袋；其中，从步骤(k)至步骤(l)的转换在不打开系统的情况下发生；
(m)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(l)的包含治疗性TIL群的输液袋；以及
(n)向受试者施用来自步骤(m)中输液袋的治疗有效剂量的治疗性TIL群。
58.一种由冷冻的肿瘤组织扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得肿瘤组织，其中，所述肿瘤组织包含TIL；
(b)在约2℃至约8℃的温度下，在储存培养基中孵育肿瘤组织约30分钟；
(c)冷冻肿瘤组织；
(d)以冷冻状态储存肿瘤组织：
(e)解冻肿瘤组织；
(f)在透气容器中用包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基处理肿瘤组织，产生TIL；
(g)取出至少多个TIL；以及
(h)在透气容器中用包含细胞培养基、经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基扩增TIL，产生扩大数量的TIL。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，在步骤(f)中培养TIL约3天至约5天的时间；在步骤(h)中培养TIL约11天至约13天的时间。
60.根据权利要求58所述的方法，其中，在步骤(f)中培养TIL约3天的时间；在步骤(h)中培养TIL约13天的时间。
61.根据权利要求58所述的方法，其中，在步骤(f)中培养TIL约5天的时间；在步骤(h)中培养TIL约11天的时间。
62.根据权利要求58所述的方法，其中，所述方法还包括步骤(i)：收获TIL。
63.根据权利要求61所述的方法，其中，收获的TIL的数量至少增加10000倍。
64.一种制备用于过继性T细胞治疗的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)在包含白细胞介素2(IL-2)和可选的OKT-3抗体的第一细胞培养基中培养冷冻保存的肿瘤碎片，产生TIL；
(b)在包含经辐照的饲养细胞、OKT-3抗体和IL-2的第二细胞培养基中扩增TIL，产生扩大数量的TIL；以及
(c)可选地冷冻保存扩大数量的TIL。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述第一培养基是成分明确的培养基。
66.根据权利要求64所述的方法，其中，所述第二培养基是成分明确的培养基。
67.根据权利要求64所述的方法，其中，所述第一培养基和所述第二培养基是相同或不同的成分明确的培养基。
68.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中，步骤(a)进行约11天的时间。
69.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中，步骤(b)进行约11天的时间。
70.根据权利要求64至68中任一项所述的方法，其中，步骤(a)和(b)总共进行约22天的时间。
71.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中，步骤(a)进行约5天的时间。
72.根据权利要求71所述的方法，其中，步骤(b)进行约11天的时间。
73.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中，步骤(a)进行约3天的时间。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，步骤(b)进行约13天的时间。
75.根据权利要求64至67或71至74中任一项所述的方法，其中，步骤(a)和(b)总共进行约16天的时间。
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