PT2594590E - Moléculas de ligação ao recetor humano ox40 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO RECETOR HUMANO 0X40" ANTECEDENTES: A presente descrição refere-se a anticorpos, e particularmente a anticorpos que se ligam ao recetor 0X40. 0 aumento da função de células T antitumorais representa uma abordagem nova e poderosa para o tratamento do cancro. Os componentes cruciais envolvidos na criação de uma resposta de células T antitumorais eficaz incluem o aumento da atividade de células T auxiliares CD4+ para promover a criação de células T citoliticas antitumorais, e proporcionar sinais de sobrevivência para células T de memória e efetoras. Um recetor chave que demonstrou mediar estas respostas no recetor 0X40, Sugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule 0X40. Nature Rev. Imm. 4: 420-431 (2004); Hori, T. Roles of 0X40 in the pathogenesis and control of diseases. Intn. J. Hematology. 83: 17-22 (2006) . O recetor 0X40 (OX40R) (também conhecido como CD134, TNFRSF4, ACT-4, ACT35, e TXGP1L) é um membro da superfamilia do recetor TNF. Verificou-se que o OX40R é expresso em células T CD4+ ativadas. Foram demonstrados números elevados de células T OX40R+ em tumores (linfócitos de infiltração em tumores) e nos nódulos linfáticos de drenagem de doentes com cancro (Vetto, J.T. et al. 1997.

Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph nodes cells from patients with melanoma and head and neck cancers. Am. J. Surg. 174: 258-265; Weinberg, A. D. et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J. Immunol. 164: 2160-69 (2000); Petty, J.K., et al. Survival in human colorectal câncer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD 134). Am. J. Surg. 183: 512-518 (2002)). Foi demonstrado em modelos tumorais em murganhos que a contribuição do OX40R in vivo durante a iniciação do tumor retarda significativamente e previne o surgimento de tumores em comparação com os murganhos tratados de controlo (Weinberg et al., 2000) . Por isso, foi contemplado o aumento da resposta imunitária de um mamífero para um antigénio através da contribuição do OX40R através da utilização de um agente de ligação a OX40R (WO 99/42585; Weinberg et al., 2000).

SUMÁRIO A invenção é definida nas reivindicações em anexo. A presente descrição proporciona moléculas de ligação isoladas que se ligam ao OX40R humano, incluindo anticorpos contra OX40R, fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos contra OX40R, e derivados dos anticorpos contra OX40R. Em algumas formas de realização, a molécula de ligação liga-se ao OX40R humano com uma KD de 1 x IO-7 M ou inferior e possui atividade agonista do OX40R humano. Em algumas outras formas de realização, a molécula de ligação é um anticorpo monoclonal humano que se liga especifi-camente ao OX40R humano com uma KD de 100 nM ou inferior. A presente descrição também proporciona uma composição que compreende uma ou mais das moléculas de ligação e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas formas de realização, a molécula de ligação é um anticorpo monoclonal contra OX40R humano ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. A composição pode ainda compreender agentes farmacêuticos adicionais, tais como agentes quimioterapêuticos, agentes imunoterapêuticos, e agentes terapêuticos hormonais. A presente descrição proporciona ainda métodos terapêuticos e de diagnóstico utilizando moléculas de ligação. Em algumas formas de realização, a revelação proporciona um método de tratamento ou prevenção do cancro num mamífero compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula ou uma composição compreendendo uma molécula de ligação. Em algumas outras formas de realização, a revelação proporciona um método de aumento de uma resposta imunitária num mamífero, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação ou de uma composição compreendendo uma molécula de ligação. Em algumas formas de realização particulares a molécula de ligação utilizada nos métodos é um anticorpo monoclonal contra o OX40R humano ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. A presente descrição proporciona ainda moléculas de ácido nucleico que codificam uma sequência de amino-ácidos de uma molécula de ligação, vetores que compreendem esses ácidos nucleicos, células hospedeiras que compreendem os vetores, e métodos de preparar as moléculas de ligação. A descrição também proporciona outros aspetos, que serão óbvios a partir da descrição total, incluindo as reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGUIRAS

As Figuras la e lb são gráficos que demonstram que o anticorpo 11D4 se liga especificamente ao OX40R; A Figura 2 é um gráfico que apesenta o efeito da ligação reticulada o anticorpo 11D4 sobre a atividade da luciferase estimulada por OX40R; A Figura 3 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 na produção de IL-2 por células T iniciadas por aloantigénio; A Figura 4 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 na produção de IL-2 induzida por anti-CD3 por células T primárias; A Figura 5 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 na produção de IL-2 induzida por anti-CD3 por células T primárias de cinomolgo; A Figura 6 apresenta as curvas de ligação de saturação com o anticorpo 11D4 utilizando PBMCs de cinomolgo de 14 dadores estimulados com anti-CD3 e anti-CD2 8; A Figura 7 apresenta as curvas de ligação de saturação com anticorpo 11D4 utilizando PBMCs humanos de 17 dadores estimulados com anti-CD3 e anti-CD28; A Figura 8 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento de linfoma de células B Ra j i em murganhos SCID; A Figura 9 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 sobre o crescimento de linfoma de células B Ra j i 21 dias após a injeção do tumor; A Figura 10 é um gráfico que apresenta os efeitos de uma única injeção de anticorpo 11D4 no crescimento do tumor da próstata PC-3 em murganhos SCID; A Figura 11 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento do tumor da próstata PC-3 em murganhos SCID 27 dias após a injeção do tumor; A Figura 12 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento do carcinoma do cólon LOVO em murganhos SCID; A Figura 13 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento do carcinoma do cólon LOVO em murganhos SCID 25 dias após a injeção do tumor;

Figura 14 é um gráfico que apresenta o efeito de anticorpo 11D4 no crescimento do tumor da mama BT474 em murganhos SCID; e A Figura 15 é um gráfico que apresenta o efeito do anticorpo 11D4 no crescimento do tumor da mama BT474 em murganhos SCID.

DESCRIÇÃO DETALHADA

DEFINIÇÕES 0 termo "agonista" refere-se a uma molécula de ligação, como aqui definido, que após ligação ao OX40R, (1) estimula ou ativa o OX40R, (2) melhora, aumenta, promove, induz, ou prolonga uma atividade, função, ou presença do OX40R, ou (3) melhora, aumenta, promove, ou induz a expressão do OX40R. 0 termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que é tipicamente composta por dois pares idênticos de cadeias de polipéptido, possuindo cada par uma cadeia "leve" (L) e uma cadeia "pesada" (H) . As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias capa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respetivamente. Nas cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 3 ou mais aminoácidos. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é compreendida por três dominios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada por LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunitário (e.g., células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, organizadas a partir do terminal amino até ao terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis de cada par cadeia pesada/leve (VH e VL) , respetivamente, formam o sitio de ligação ao anticorpo. A atribuição dos aminoácidos a cada região ou dominio está de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et ai. (1989) Nature 342:878-883. O termo "anticorpo" inclui um anticorpo que é parte de um anticorpo multimero (uma forma multimérica dos anticorpos), tais como dimeros, trimeros, ou multimeros de maior ordem de anticorpos monoméricos. Inclui também um anticorpo que está ligado ou fixado a, ou de outro modo fisicamente ou funcionalmente associado com, uma unidade não-anticorpo. Além disso, o termo "anticorpo" não está limitado por qualquer particular método de produção do anticorpo. Por exemplo, inclui, inter alia, anticorpos recombinantes, anticorpos monoclonais, e anticorpos policlonais. O termo "derivado de anticorpo" ou "derivado" de um anticorpo refere-se a uma molécula que é capaz de ligação ao mesmo antigénio (e.g., OX40R) a que o anticorpo se liga e compreende uma sequência de aminoácidos do anticorpo ligado a uma entidade molecular adicional. A sequência de aminoácidos do anticorpo que está contido no derivado de anticorpo pode ser o anticorpo de comprimento total, ou pode ser qualquer porção ou porções de um anticorpo de comprimento total. A entidade molecular adicional pode ser uma molécula química ou biológica. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem grupos quimicos, aminoácidos, péptidos, proteínas (tais como enzimas, anticorpos), e compostos quimicos. A entidade molecular adicional pode ter qualquer utilidade, tal como a utilização como um agente de deteção, marca, marcador, agente farmacêutico ou terapêutico. A sequência de aminoácidos de um anticorpo pode ser fixada ou ligada à entidade adicional por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo. 0 termo "derivado de anticorpo" também inclui anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, e moléculas que são derivadas de modificações das sequências de aminoácidos de um anticorpo contra OX40R, tais como substituições, adições e inserções de aminoácidos conservadoras. 0 termo "fragmento de ligação ao antigénio" de um anticorpo refere-se a uma ou mais porções de um anticorpo de comprimento total que retém a capacidade para se ligar ao mesmo antigénio (e.g., OX40R) a que o anticorpo se liga. 0 termo "fragmento de ligação ao antigénio" também inclui a porção de um anticorpo que é parte de uma molécula maior formada por associação covalente ou não covalente da porção de anticorpo com uma ou mais entidades moleculares adicionais. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem aminoácidos, péptidos, ou proteínas, tais como a região nuclear da estreptavidina, que pode ser utilizada para formar uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et ai., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), um resíduo de cisteína, um péptido marcador, ou uma etiqueta de poli-histidina C-terminal, que pode ser utilizado para preparar moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). O termo "molécula de ligação" inclui (1) anticorpo, (2) fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo, e (3) derivado de um anticorpo, cada como aqui definido. O termo "se liga a OX40R" ou "ligação ao OX40R" refere-se à ligação de uma molécula de ligação, como aqui definido, a OX40R num ensaio in vitro, tal como um ensaio BIAcore. A ligação significa uma afinidade de ligação (KD) de 1 x IO-6 M ou menos. O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo que compreende as sequências de aminoácidos derivadas de dois ou mais anticorpos diferentes. Os dois ou mais anticorpos diferentes podem ser da mesma espécie ou de duas ou mais espécies diferentes. O termo "substituição conservadora de aminoácidos" refere-se a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido, em que os grupos R da cadeia lateral dos dois resíduos de aminoácidos têm propriedades químicas semelhantes (e.g., carga ou hidrofobicidade). Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; 2) cadeias laterais ali-fáticas-hidroxilo: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais acidicas: ácido aspártico e ácido glu-tâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisterna e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conser-vativos podem ser, por exemplo, valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina. 0 termo "epitopo" refere-se à parte de um antigénio que é capaz de ligação especifica a um anticorpo, ou recetor de células T, ou de outra forma interagindo com uma molécula. "Epitopo" é também conhecido na técnica como "determinante antigénico." Um epitopo consiste geralmente de agrupamentos quimicamente ativos à superfície de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de carbo-hidratos ou açúcar e possuem geralmente caraterísticas tridimensionais específicas, assim como caraterísticas de carga específicas. Um epitopo pode ser "linear" ou "conformacional." Uma vez determinado um epitopo desejado num antigénio, os anticorpos para esse epitopo podem ser produzidos, e.g., utilizando as técnicas aqui descritas. A produção e caracterização de anticorpos podem também elucidar a informação acerca dos epitopos desejáveis. A partir desta informação, é então possível rastrear competitivamente anticorpos para ligação ao mesmo epitopo. Uma abordagem para conseguir isto é conduzir estudos de competição cruzada para encontrara anticorpos que se ligam competitivamente com um outro, i.e., os anticorpos competem para ligação ao antigénio. Um processo de levado processamento para "marcar" anticorpos com base na sua competição cruzada é descrito na Publicação PCT N° WO 03/48731. O termo "linha germinal" refere-se às sequências de nucleótidos dos genes do anticorpos e segmentos do gene na medida em que estas são passadas dos pais para a descendências através das células germinais. A sequência da linha germinal distingue-se das sequências de nucleótidos que codificam os anticorpos em células B maduras que foram alteradas por eventos de recombinação e hipermutação durante o decurso da maturação da célula B. O termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula em que um vetor de expressão foi introduzido. O termo inclui não apenas a particular célula individual mas também a descendência dessa célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutação ou influências ambientais, esta descendência não pode ser idêntica à célula parental, mas estão ainda incluídas no âmbito do termo "célula hospedeira." O termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo consistindo em sequências de aminoácidos das sequências da imunoglobulina humana apenas. Um anticorpo humano pode conter cadeias de carbo-hidrato de murino se produzido num murganho, numa célula de murganho ou num hibridoma derivado de uma célula de murganho. Os anticorpos humanos podem ser preparados numa variedade de formas conhecidas na técnica. 0 termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico que contém residuos de aminoácidos derivados de sequências de anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode conter algumas ou todas as CDRs de um anticorpo de animal não humano enquanto as regiões estruturais e constantes do anticorpo contêm residuos de aminoácidos derivados de sequências de anticorpo humano. 0 termo "mamifero" refere-se a qualquer espécie animal da classe Mamalia. Exemplos de mamíferos incluem: humanos; animais de laboratório tais como ratos, murganhos, simios e cobaias; animais domésticos tais como gatos, cães, coelhos, bovinos, ovinos, cabras, cavalos, e porcos; e animais selvagens em cativeiro tais como leões, tigres, elefantes, e semelhantes. 0 termo "ácido nucleico isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico genómico, cDNA, ou de origem sintética, ou uma sua combinação, que é separada de outras moléculas de ácido nucleico presentes na fonte natural do ácido nucleico. Por exemplo, no que respeita ao DNA genómico, o termo "isolado" inclui moléculas de ácido nucleico que são separadas do cromossoma com o qual o DNA genómico está naturalmente associado. De um modo preferido, um ácido nucleico "isolado" é isento de sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (i.e., sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico de interesse) no DNA genómico do organismo a partir do qual o ácido nucleico é derivado. 0 termo "anticorpo isolado" ou "molécula de ligação isolada" refere-se a um anticorpo ou uma molécula de ligação que: (1) não está associada com componentes que ocorrem naturalmente que o acompanham no seu estado nativo; (2) é isento de outras proteínas da mesma espécie; (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente; ou (4) não ocorre na natureza. Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo contra OX40R que foi purificado por afinidade utilizando OX40R, um anticorpo contra OX40R que foi produzido por hibridomas ou outra linha de células in vitro, e um anticorpo humano contra OX40R derivado de um animal transgénico. 0 termo "KD" refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação particular anticorpo-antigénio e é utilizada para descrever a afinidade de ligação entre um ligando (tal como um anticorpo) e uma proteína (tal como o OX40R). Quanto menor for a constante de equilíbrio de dissociação, mais forte é a ligação com o ligando, ou maior é a afinidade entre o ligando e a proteína. Uma KD pode ser medida por ressonância de plasmão de superfície, por exemplo utilizando o sistema BIACORE™. Um procedimento de ensaio utilizando o sistema BIACORE™ (ensaio BIAcore) é descrito na secção dos Exemplos desta revelação. 0 termo "taxa de eliminação" ou "kd" refere-se à constante da taxa de dissociação de uma interação particular anticorpo-antigénio. Uma constante da taxa de dissociação pode ser medida por ressonância de plasmão de superfície, por exemplo utilizando o BIACORE™.

0 termo "anticorpo contra OX40R" refere-se a um anticorpo, como aqui definido, capaz de ligação ao OX40R humano.

Os termos "recetor de 0X40" e "OX40R" são utilizados independentemente no presente pedido, e incluem o OX40R humano, assim como variantes, isoformas, e suas espécies homólogas. De acordo com o exposto, as moléculas de ligação humanas aqui reveladas podem, em certos casos, também ligar-se ao OX40R de outras espécies para além da humana. Em outros casos, as moléculas de ligação podem ser completamente específicas para o OX40R humano e não podem exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada. 0 termo "ligam-se especificamente ao OX40R humano" em referência à interação de uma molécula de ligação, e.g., um anticorpo, com o seu parceiro de ligação, e.g., um antigénio, significa que a KD de uma molécula de ligação para ligação ao CD40, CD137, ou CD271 é superior a 100 vezes a KD para a sua ligação ao OX40R humano, como determinado num ensaio in vitro. 0 termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outra molécula de ácido nucleico numa célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem plasmídeos, vetores virais, vetores de expressão de DNA nu ou RNA, cosmídeo ou vetores fágicos. Alguns vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira em que estes são introduzidos (e.g., vetores bacterianos possuindo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Alguns vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados em conjunto com o genoma hospedeiro (e.g., vetores de mamífero não epissomais). Certos vetores são capazes de dirigir a expressão dos genes aos quais estes estão operativamente ligados, e deste modo podem ser referidos como "vetores de expressão."

Como aqui utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991)).

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO QUE SE LIGAM AO 0X4OR HUMANO A presente descrição proporciona moléculas de ligação isoladas que se ligam ao OX40R humano, incluindo anticorpos contra OX40R, fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos contra OX40R, e derivados dos anticorpos contra OX40R. As moléculas de ligação são caracterizados por pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: (a) ligação ao OX40R humano com uma KD de 1 x IO-6 M ou menos; (b) ter atividade antagonista no OX40R humano; (c) não se ligar ao recetor CD40 a uma concentração até 500 nM; (d) não se ligar ao recetor CD137 a concentrações até 500 nM; (e) não se ligar ao recetor CD271 em concentrações até 500 nM; (f) são capazes de estimular a produção de IL-2 por células T humanas isoladas; (g) são capazes de estimular uma resposta imunitária; (h) são capazes de inibir o crescimento de células de tumor; e (i) ter efeito terapêutico no cancro. Em algumas formas de realização a molécula de ligação liga-se ao OX40R humano com uma KD de 1 x IO-7 M ou inferior, ou 1 x IO-8 M ou inferior, ou 5 x 1 x IO-9 M ou inferior.

Anticorpos contra QX40R humano

Em alguns primeiros aspetos, a presente descrição proporciona um anticorpo humano que se liga ao OX40R humano. Em algumas formas de realização, o anticorpo humano é um anticorpo monoclonal que especificamente se liga ao 0X40R humano com uma KD de 100 nM ou inferior, de um modo preferido 10 nM ou inferior, e possui atividade agonista do OX40R humano. Um exemplo destes anticorpos humanos é o anticorpo monoclonal humano 11D4. A uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo 11D4 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 9 e 7, respetivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia leve e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo 11D4 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 10 e 8, respetivamente. Os isotipos do anticorpo 11D4 são IgG2 para a cadeia pesada e Capa para a cadeia leve. Os alotipos do anticorpo 11D4 são G2(n-) para a cadeia pesada e Km3 para a cadeia leve. As sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve maduras são derivadas da tradução conceptual das sequências de DNA nas construções de expressão. O anticorpo 11D4 não contém mutações estruturais na cadeia pesada ou cadeia leve, mas contém uma mutação na cadeia pesada CDR2.

Outro anticorpo ilustrativo da revelação é o anticorpo monoclonal humano 18D8. A sequência de aminoácidos da região VH e região VL do anticorpo 18D8 é apresentada nas SEQ ID NOs: 19 e 20, respetivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada e cadeia leve é apresentada nas SEQ ID NOS: 21 e 22, respetivamente.

Atendendo a que 11D4 e 18D8 se ligam ao OX40R, as sequências VH e VL de cada um destes podem ser "misturadas e ligadas" com outros anticorpos contra OX40R para criar anticorpos adicionais. A ligação destes anticorpos "misturados e emparelhados" ao OX40R pode ser testada utilizando os ensaios de ligação conhecidos na técnica, incluindo um ensaio descrito nos Exemplos. Num caso, quando as regiões VH e VL são misturadas e emparelhadas, uma sequência VH de um par particular VH/VL é substituída por uma sequência VH estruturalmente semelhante. Do mesmo modo, em outro caso, uma sequência VL de um par particular VH/VL é substituída por uma sequência VL estruturalmente semelhante.

De acordo com o exposto, em algumas formas de realização, a revelação proporciona um anticorpo contra OX40R isolado que compreende: (1) uma região variável da cadeia pesada do anticorpo 11D4 ou 18D8, (2) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 7 ou 19, ou (3) uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico das SEQ ID NOs: 11 ou 23; e (1) uma região variável de cadeia leve do anticorpo 11D4 ou 18D8, (2) uma região

variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 8 ou 20, ou (3) região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico das SEQ ID NOs: 12 ou 24 .

Noutro aspeto, a revelação proporciona anticorpos que compreendem a CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável da cadeia pesada (VH) e CDR1, CDR2, e CDR3 da cadeia leve de 11D4 ou 11D8. A sequência de aminoácidos da VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 de 11D4 é apresentada na SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respetivamente. A sequência de aminoácidos da VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 do anticorpo 11D4 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 4, 5, e 6, respetivamente. As sequências de aminoácidos das VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 do anticorpo 18D8 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 13, 14, e 15, respetivamente. A sequência de aminoácidos das VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 do anticorpo 18D8 é apresentada nas SEQ ID NOs: 16, 17, e 18, respetivamente. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health e Human Services, NIH Publication N° 91-3242).

Atendendo a que 11D4 e 18D8 se ligam ao OX40R humano e que a especificidade de ligação ao antigénio é primariamente proporcionada pelas regiões CDR1, CDR2, e CDR3, as sequências VH CDR1, CDR2, e CDR3 e as sequências VL CDR1, CDR2, e CDR3 podem ser "misturadas e emparelhadas" para criar anticorpos adicionais contra OX40R. Por exemplo, as CDRs de diferentes anticorpos contra OX40R podem ser misturadas e emparelhadas, embora cada anticorpo contenha tipicamente uma VH CDR1, CDR2, e CDR3 e uma VL CDR1, CDR2, e CDR3. A ligação destes anticorpos "misturados e emparelhados" contra o OX40R podem ser testados utilizando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (e.g., ELISA, análise Biacore). Num caso, quando as sequências VH CDR são misturadas e emparelhadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou sequência CDR3 de uma sequência particular VH é substituída por uma sequência(s) CDR estruturalmente semelhantes. Do mesmo modo, quando as sequências VL CDR são misturadas e emparelhadas, a sequência CDR 1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência particular VL é tipicamente substituída por uma sequência(s) CDR estruturalmente semelhante. Será claramente óbvio para um normal especialista da técnica que as novas sequências VH e VL podem ser criadas por substituição de uma ou mais sequências das regiões CDR VH e/ou VL por sequências estruturalmente semelhantes às sequências CDR aqui reveladas.

De acordo com o exposto, em algumas formas de realização, a revelação proporciona (1) um anticorpo monoclonal isolado que compreende VH CDR1, VH CDR2, e VH CDR3 do anticorpo 11D4 ou 18D8; e VL CDRI, VL CDR2 e VL CDR3 do anticorpo 11D4 ou 18D8. Em algumas outras formas de realização, a revelação proporciona um anticorpo monoclonal isolado que compreende uma VH CDRI compreendendo uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 1 ou 13, ou uma sequência que difere das SEQ ID NOs: 1 ou 3 em 1, 2, 3, ou 4 substituições conservadora de aminoácidos; a VH CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 ou 14 ou uma sequência que difere das SEQ ID NOs: 2 ou 14 em 1, 2, 3, ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos; e uma VH CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 3 ou 15 ou uma sequência que difere da SEQ ID NOs: 3 ou 15 em 1, 2, 3, ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos; e o isolado monoclonal isolado também compreende uma VL CDRI compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 4 ou 16 ou uma sequência que difere das SEQ ID NOs: 4 ou 16 em 1, 2, 3, ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos; uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5 ou 17 ou uma sequência que difere das SEQ ID NOs: 5 ou 17 em 1, 2, 3, ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos; e uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6 ou 18 ou uma sequência que difere da SEQ ID NOs: 6 ou 18 em I, 2, 3, ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos.

Ainda em algumas formas de realização, a descrição proporciona um anticorpo monoclonal isolado que compreende pelo menos uma CDR selecionada a partir de: uma VL CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 4 ou 16 ou uma sequência que difere das SEQ ID NOs: 4 ou 16 em 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácidos conservadoras; uma VL CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5 ou 17 ou uma sequência que difere das SEQ ID NOs: 5 ou 17 em 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácidos conservadores; e uma VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6 ou 18 ou uma sequência que difere das SEQ ID NOs: 6 ou 18 em 1, 2, 3, ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos.

Em alguns casos, a lisina C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo contra OX40R é clivada (Harris R. J. , J. of Chromatography, 705: 129-134 (1995)). A cadeia pesada e/ou cadeia leve(s) dos anticorpos contra OX40R pode opcionalmente incluir uma sequência sinal. A classe (e.g., IgG, IgM, IgE, IgA, ou IgD) e subclasse (e.g., IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4) dos anticorpos contra OX40R pode ser determinada através de qualquer método adequado. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo pode ser determinada utilizando anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse particular do anticorpo. Esses anticorpos estão disponíveis comercialmente. A classe e subclasse podem ser determinadas por ELISA, ou Transferência de Western assim como por outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse pode ser determinada através da sequenciação da totalidade ou de uma porção dos domínios constantes das cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos, comparando as suas sequências de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de várias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando a classe e subclasse dos anticorpos. Os anticorpos contra OX40R podem ser uma molécula de IgG, uma molécula de IgM, uma molécula de IgE, uma molécula de IgA, ou uma molécula de IgD molécula. Por exemplo, os anticorpos contra OX40R podem ser uma molécula de IgG que é uma subclasse de IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4. Por isso, outro aspeto da revelação proporciona um método para converter a classe ou subclasse de um anticorpo contra OX40R com outra classe ou subclasse. Em alguns casos, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma VL ou VH que não inclui sequências que codificam CL ou CH é isolado utilizando métodos bem conhecidos na técnica. A molécula de ácido nucleico é então ligada operacionalmente a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CL ou CH a partir de uma classe ou subclasse de imunoglobulina desejada. Isto pode ser alcançado utilizando um vetor ou molécula de ácido nucleico que compreende uma cadeia CL ou CH, como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo contra OX40R que era originalmente IgM pode mudar de classe para uma IgG. Além disso, a troca de classe pode ser utilizada para converter uma subclasse de IgG noutra, e.g., a partir de IgGl até IgG2. Outro método para produzir um anticorpo compreendendo um isotipo desejado compreende os passos de isolar um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo contra OX40R e um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo contra OX40R, isolar a sequência que codifica a região VH, ligar a sequência de VH a uma sequência que codifica um domínio constante da cadeia pesada do isotipo desejado, expressar a construção do gene da cadeia leve e da cadeia pesada numa célula, e recolher o anticorpo contra OX40R com o isotipo desejado.

Fragmentos de ligação ao antigénio

Noutro aspeto, a presente descrição proporciona fragmento de ligação ao antigénio de qualquer anticorpo humano contra OX40Rs como aqui descrito acima. Em algumas formas de realização, o fragmento de ligação ao antigénio é selecionado a partir de: (1) uma cadeia leve de um anticorpo contra OX40R e (2) uma cadeia pesada de um anticorpo contra OX40R; (3) uma região variável da cadeia leve de um anticorpo contra OX40R e (4) uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo contra OX40R; (5) seis CDRs de um anticorpo contra OX40R que compreendem três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada de um anticorpo contra OX40R. Em algumas formas de realização particulares, a revelação proporciona um fragmento de ligação ao antigé-nio do anticorpo 11 D4 ou 18D8. Noutras formas de realização particulares, os fragmentos de ligação ao antigénio de um anticorpo contra OX40R incluem: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos dominios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2/ um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte persulfureto na região da dobra; (iii) um fragmento Fd que consiste nos dominios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv que consiste nos dominios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), que consiste num dominio VH; (vi) uma CDR isolada, e (vii) anticorpo de cadeia simples (scFv), que é um polipéptido compreendendo uma região VL de um anticorpo ligado a uma região VH de um anticorpo. Bird et al., (1988) Science 242:423- 426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:587 9-5883. Um fragmento de ligação ao antigénio também pode compreender dois ou mais fragmentos mais curtos, seja a partir da mesma cadeia pesada ou da mesma cadeia leve, ou de cadeias diferentes. Os fragmentos de ligação ao antigénio, tais como os fragmentos Fab e F(ab')2/ podem ser preparados a partir de anticorpos totais utilizando técnicas convencionais, tais como digestão com papaina ou com pepsina, respetivamente, de anticorpos totais. Eles podem também ser obtidos utilizando técnicas de DNA recombinante, como aqui descrito.

Derivados de anticorpo

Em alguns outros aspetos, a presente descrição proporciona derivados de qualquer um dos anticorpos contra OX40R como aqui descrito acima.

Num aspeto particular, o derivado de anticorpo é derivado das modificações das sequências de aminoácidos de 11 D4 ou 18D8. As sequências de aminoácidos de quaisquer regiões das cadeias de anticorpo podem ser modificadas, tais como regiões de grelha, regiões CDR, ou regiões constantes. As modificações podem ser introduzidas através de técnicas convencionais conhecidas na técnica, tais como mutagénese dirigida a um sitio e mutagénese mediada por PCR aleatório, e podem compreender aminoácidos naturais assim como não naturais.

Tipos de modificações incluem substituições, inserções, deleções, ou combinações destes, de um ou mais aminoácidos de um anticorpo contra OX40R. Em algumas formas de realização, o derivado de anticorpo compreende 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácidos nas CDRs da cadeia pesada e/ou uma substituição de aminoácidos nas CDRs da cadeia leve. Em algumas formas de realização, um derivado de um anticorpo contra OX40R compreende uma ou mais substituições de aminoácidos relativas à linha germinal de uma sequência de aminoácidos do gene humano. Numa forma de realização particular, uma ou mais destas substituições a partir da linha germinal está na região CDR2 da cadeia pesada. Noutra forma de realização particular, as substituições de aminoácidos relativas à linha germinal estão numa ou mais destas posições como as substituições relativas à linha germinal nos anticorpos 11D4 ou 18D8. Noutra forma de realização, a substituição de aminoácidos é trocar uma ou mais cisternas num anticorpo por outro residuo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. A cisterna pode ser uma cisteina canónica ou não canónica. A substituição pode ser realizada numa CDR ou região de grelha de um dominio variável ou no dominio constante de um anticorpo. Outro tipo de substituição de aminoácidos é eliminar os pares asparagina-glicina, que formam sitios de desaminação potencial, por alteração de um ou de ambos os residuos. Ainda noutras formas de realização, a substituição de aminoácidos é uma substituição conservadora de aminoácidos. Numa forma de realização, o derivado de anticorpo possui 1, 2, 3, ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos nas regiões CDR da cadeia pesada em relação a sequências de aminoácidos de 11D4 ou 18D8.

Outro tipo de modificação de um anticorpo contra OX40R é a alteração do padrão de glicosilação original do anticorpo. 0 termo "alteração" refere-se à deleção de uma ou mais unidades de carbo-hidrato que se encontram no anticorpo, e/ou adição de um ou mais sitios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação dos anticorpos está tipicamente ligada a N. Estar ligada a N refere-se à ligação da unidade de carbo-hidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada através da alteração de uma sequência de aminoácidos de modo a que contenha uma ou mais das sequências de tripéptido acima descritas (para sítios de glicosilação ligados a N).

Ainda outro tipo de modificação envolve a remoção de quaisquer unidades de carbo-hidrato presentes no anticorpo que pode ser realizada quimicamente ou enzimati-camente. A desglicosilação química requer exposição do anticorpo a um composto, tais como ácido trifluorometanos-sulfónico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o anticorpo intato. A desglicosilação química é descrita por Sojahr, Η. T., e Bahl, 0. P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 e por Edge, A. S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. A clivagem enzimática de unidades de carbo-hidrato nos anticorpos pode ser realizada através da utilização de uma variedade de endo- e exo-glicosidases, como descrito por Thotakura, N. R., e Bahl, 0. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

Exemplos de outras modificações incluem aceti-lação, acilação, amidação, ligação reticulada, ciclização, formação de ligações persulfureto, desmetilação, formação de ligações reticuladas covalentes, formação de cisterna, formilação, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoila-ção, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, e sulfatação.

Num outro aspeto, é proporcionado um derivado de anticorpo que compreende um anticorpo contra OX40R, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, como aqui descrito, ligado a uma entidade molecular adicional. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem agentes farmacêuticos, péptidos ou proteínas, e agentes de detecção ou marcadores. Exemplos específicos de agentes farmacêuticos que podem ser ligados a um anticorpo contra OX40R incluem agentes citotóxicos ou outros agentes terapêuticos para o cancro, e isótopos radioativos. Exemplos específicos de péptidos ou proteínas que podem ser ligados a um anticorpo contra OX40R incluem anticorpos, que podem ser o mesmo anticorpo contra OX40R ou um anticorpo diferente. Exemplos específicos de agentes de deteção ou marcadores que podem ser ligados a um anticorpo contra OX40R incluem (1) compostos fluorescentes, tais como fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonilo, ficoeritrina, e lantanideos fosforosos; (2) enzimas, tais como peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, e glucose oxidase; (3) biotina; (4) um epitopo de polipéptido predeterminado reconhecido por um repórter secundário, tais como sequências de pares de fechos de correr de leucina, sitios de ligação para anticorpos secundários, dominios de ligação a metal, e marcadores de epitopo. Numa forma de realização particular, o derivado de anticorpo é um anticorpo contra o multimero de OX40R, que é uma forma multimérica de um anticorpo contra OX40R, tais como dimeros de anticorpo, trimeros, ou multimeros de ordem superior de anticorpos monoméricos. Os monómeros individuais num multimero de anticorpo pode ser idêntico ou diferente, i.e., eles podem ser multimeros de anticorpo heteroméricos ou homoméricos. Os anticorpos individuais num multimero podem possuir as mesmas especificidades ou diferentes. A multimerização dos anticorpos pode ser realizada através da agregação natural dos anticorpos. Por exemplo, uma percentagem das preparações de anticorpos purificados (e.g., moléculas de IgGl purificadas) forma espontaneamente agregados de proteina que contêm homodimero de anticorpos, e outros multimeros de anticorpos de ordem superior. Alternativamente, os homodimeros do anticorpo podem ser formados através de técnicas de ligação quimica conhecidas na técnica, tais como através da utilização de agentes de ligação reticulada heterobifuncional. Agentes de ligação reticulada adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, possuindo dois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (tais como éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, succinimidil 4-(maleimidometil)ciclo- hexano-l-carboxilato, e N-succinimidil S-acetiltio-acetato) ou homobifuncionais (tais como suberato de dissuccinimi-dilo) . Esses ligantes estão disponíveis comercialmente em Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Os anticorpos também podem ser preparados por multimerização através de técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica.

Ainda noutro aspeto, o derivado de anticorpo é um anticorpo quimérico, que compreende uma sequência de aminoácidos de um anticorpo humano contra OX40R aqui descrito acima. Num exemplo, uma ou mais CDRs de um anticorpo humano contra OX40R é combinado com CDRs a partir de um anticorpo de um animal não humano, tais como murganho ou rato. Noutro exemplo, todas as CDRs do anticorpo quimérico são derivadas de anticorpos humanos contra OX40R. Noutro exemplo, as CDRs de mais do que um anticorpo humano contra OX40R são combinadas num anticorpo quimérico. Além disso, um anticorpo quimérico pode compreender as regiões de grelha derivadas de um anticorpo humano contra OX40R e uma ou mais CDRs de um ou mais anticorpo humanos diferentes. Os anticorpos quiméricos podem ser criados utilizando métodos convencionais conhecidos na técnica. Em algumas formas de realização particulares, o anticorpo quimérico compreende uma, duas, ou três CDRs da região variável da cadeia pesada ou da região variável de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir do anticorpo 11D4 ou 18D8.

Exemplos de outros derivados de anticorpo fornecidos pela presente descrição incluem anticorpos de cadeia simples, diacorpos, anticorpos de dominio, nanocorpos, e unicorpos. Um "anticorpo de cadeia simples" (scFv) consiste numa cadeia simples de polipéptido compreendendo um dominio VL ligado a um dominio VH em que o dominio VL e o dominio VH são emparelhados para formar uma molécula monovalente. 0 anticorpo de cadeia simples pode ser preparado de acordo com o método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Um "diacorpo" consiste em duas cadeias, compreendendo cada cadeia uma região variável da cadeia pesada ligada a uma região variável de cadeia leve na mesma cadeia de polipéptido ligadas por um péptido ligante curto, em que as duas regiões na mesma cadeia não emparelham uma com a outra mas com domínios complementares na outra cadeia para formar uma molécula biespecífica. São conhecidos na técnica métodos de preparação de diacorpos (ver, e.g., Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448, e Poljak R. J. et al. , (1994) Structure 2:1121-1123). Os anticorpos de domínio (dAbs) são pequenas unidades de ligação funcional de anticorpos, que correspondem às regiões variáveis das cadeias pesadas ou leves de anticorpos. Os anticorpos de domínio são bem expressos em sistemas de células bacterianas, de levedura, e de mamífero. São conhecidos na técnica outros detalhes de anticorpos de domínio e métodos para a sua produção (ver, por exemplo, as Patentes U.S.

Nos. 6 291 158; 6 582 915; 6 593 081; 6 172 197; 6 696 245; as Patentes Europeias 0368684 & 0616640; WO05/035572, W004/101790, W004/081026, W004/058821, W004/003019 e W003/002609. Os nanocorpos são derivados das cadeias pesadas de um anticorpo. Um nanocorpo compreende tipicamente um único domínio variável e dois domínios constantes (CH2 e CH3) e retém: a capacidade de ligação ao antigénio do anticorpo original. Os nanocorpos podem ser preparados através de métodos conhecidos na técnica (Ver e.g., a Patente U.S. No. 6 765 087, a Patente U.S. No. 6 838 254, WO 06/079372). Os unicorpos consistem numa cadeia leve e uma cadeia pesada de um anticorpo IgG4. Os unicorpos podem ser produzidos pela remoção da região da dobra de anticorpos IgG4. Outros detalhes de unicorpos e métodos para os preparar podem ser encontrados em W02007/059782.

MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO

Moléculas de ligação como aqui revelado podem ser produzidas através de técnicas conhecidas na técnica, incluindo a metodologia convencional dos anticorpos monoclonais, e.g., a técnica convencional de hibridação de células somáticas de Kohler e Milstein (Nature 256: 495, (1975)), assim como outras técnicas tais como a transformação virai ou oncogénica de linfócitos B.

Imunização de Animais Não-humanos A revelação também proporciona um método para produzir anticorpos contra OX40R ou fragmento de ligação aos seus antigénios, que compreende imunizar um animal não humano que compreende loci de imunoglobulina humanos com um antigénio, OX40R e isolar o anticorpo a partir do animal imunizado ou a partir das células derivadas do animal imunizado.

Exemplos de animais não humanos adequados incluem um animal transgénico ou transcromossómico, tais como HuMAb Mouse®, KM Mouse®, "murganhos TC", e Xenomouse™. 0 HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.) contém miniloci do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências não reorganizadas de imunoglobulina humana de cadeia pesada (μ e γ) e cadeia leve κ, juntamente com mutações direcionadas que inativam os loci das cadeias leves endógenas μ e κ (ver e.g., Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859). De acordo com o exposto, os murganhos apresentam expressão reduzida de IgM ou κ de murganho, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada ou leve humana introduzidos sofrem uma troca de classe e mutação somática para criar anticorpos monoclonais IgGx humanos de elevada afinidade (ver, e.g., Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei. 764:536-546). A preparação e a utilização de HuMAb Mouse®, e as modificações genómicas realizadas por esses murganhos, são bem conhecidas na técnica (ver, e.g., Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851) . Os KM mice™ comportam um transgene de cadeia pesada humana e a um transcromossoma de cadeia leve humana e são descritos em detalhe em WO 02/43478. The Xenomouse™ (Abgenix, Inc.) contém fragmentos grandes do loci da imunoglobulina humana e é deficiente na produção de anticorpo de murganho. Este modelo animal é bem conhecido na técnica (ver, e.g., Patente U.S. Nos.: 5 939 598; 6 075 181; 6 114 598; 6 150 584; e 6 162 963). Os "murganhos TC" são também murganhos modificados que comportam um transcromossoma de cadeia pesada humana e um transcromossoma de cadeia leve humana. Esses murganhos são descritos em Tomi-zuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727. O antigénio OX40R para utilização na imunização do animal pode ser OX40R isolado e/ou purificado e é de um modo preferido um OX40R humano. Numa forma de realização, o antigénio OX40R é um fragmento o OX40R humano, de um modo preferido o dominio extracelular o OX40R. Noutra forma de realização, o antigénio OX40R é um fragmento que compreende pelo menos um epitopo do OX40R humano. Noutra forma de realização, o antigénio OX40R é uma célula que expressa OX40R na sua superfície celular, mais particularmente uma célula que sobre-expressa o OX40R na sua superfície celular. A imunização dos animais pode ser realizada através de qualquer método adequado conhecido na técnica, (ver, e.g., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990). Métodos particulares para imunizar animais não humanos tais como murganhos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, vacas e cavalos são bem conhecidos na técnica (ver, e.g., Harlow e Lane (1990); Pat. U.S. No. 5 994 619). O Exemplo 1 proporciona um método para imunizar murganhos HuMab.

Após imunização do animal com um antigénio OX40R, os anticorpos e/ou células que produzem o anticorpo podem ser obtidos a partir do animal. Numa forma de realização, o soro é obtido a partir do animal e pode ser obtida uma fração de imunoglobulina a partir do soro, ou os anticorpos contra OX40R podem ser purificados a partir do soro.

Os anticorpos contra OX40R podem também ser produzidos utilizando células imortalizadas que produzem anticorpo preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Após imunização, as células do nódulo linfático e/ou de células de esplenócitos B são recolhidas a partir do animal e imortalizadas por meios adequados. Os métodos de imortalizar células incluem, mas não estão limitados a, transfetá-las com oncogenes, infetá-las com um virus oncogénico e cultiva-las em condições que selecionam as células imortalizadas, sujeitando-as a compostos carcino-génicos ou mutantes, fundindo-as com uma célula imortalizada, e.g., uma célula de mieloma, e inativando um gene supressor tumoral (ver, e.g., Harlow e Lane, supra) . Numa forma de realização particular, as células de esplenócitos B recolhidas do animal imunizado são fundidas com células de mieloma imortalizadas para formar hibridomas imortalizados que produzem anticorpos. As células de mieloma de um modo preferido não segregam polipéptidos de imunoglobulina (uma linha celular não secretora). Os hibridomas imortalizados são rastreados utilizando o antigénio 0X40 (e.g., o OX40R, uma porção deste, ou uma célula que expressa o OX40R). 0 rastreio inicial pode ser realizado, por exemplo, utilizando um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio. Um exemplo de rastreio por ELISA é descrito em WO 00/37504.

As células que produzem anticorpo contra OX40R, e.g., hibridomas, são selecionadas, clonadas, e ainda rastreadas para caraterísticas desejáveis, incluindo crescimento robusto, produção de anticorpo elevada, e caraterísticas de anticorpo desejável, como discutido em maior detalhe abaixo. Os hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singénicos, em animais que não têm um sistema imunitário, e.g., murganhos sem pelo, ou em cultura de células in vitro.

Por isso, são proporcionados métodos para produzir uma célula que produz um anticorpo monoclonal humano contra OX40R ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo: (a) imunizar um animal transgé-nico não humano com um antigénio OX40R; (b) permitir que o animal exerça uma resposta imunitária para o antigénio OX40R; (c) isolar células que produzem anticorpo a partir do animal; e (d) imortalizar as células de produção de anticorpo. Numa forma de realização, o método compreende ainda (e) criar populações monoclonais individuais das células de produção de anticorpo imortalizadas; e (f) rastrear as células de produção de anticorpo imortalizadas que produzem um anticorpo desejado contra OX40R.

ÁCIDOS NUCLEICOS, VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, E MÉTODOS RECOMBINANTES DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA OX40R

Outro aspeto da descrição proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma sequência de aminoácidos de uma molécula que se liga ao OX40R humano. A sequência de aminoácidos codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser qualquer porção de um anticorpo intacto, tal como um CDR, uma sequência compreendendo uma, duas, ou três CDRs, ou uma reqião variável de uma cadeia pesada ou cadeia leve, ou pode ser uma cadeia pesada ou cadeia leve de comprimento total. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos que compreende (1) uma região CDR3, particularmente uma região CDR3 de cadeia pesada, de anticorpos 11D4 ou 18D8; (2) uma região variável de uma cadeia pesada ou região variável de uma cadeia leve de anticorpos 11D4 ou 18D8; ou (3) uma cadeia pesada ou uma cadeia leve dos anticorpos 11D4 ou 18D8. Em outras formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, e 22. Ainda em outras formas de realização, a molécula de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 11, 12, 23, e 24.

As moléculas de ácido nucleico proporcionadas pela descrição podem ser obtidas a partir de qualquer fonte que produz um anticorpo contra OX40R. O mRNA do anticorpo contra células que produzem OX40R pode ser isolado através de técnicas convencionais, clonado e/ou amplificado utilizando PCR e técnicas de construção de bibliotecas, e rastreado utilizando protocolos convencionais para obter moléculas de ácido nucleico que codificam uma sequência de aminoácidos de um anticorpo contra OX40R. 0 mRNA pode ser utilizado para produzir cDNA para utilização na reação em cadeia pela polimerase (PCR) ou clonagem de cDNA de genes de anticorpo. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico é obtida a partir de um hibridoma que expressa um anticorpo contra OX40R, como descrito acima, de um modo preferido um hibridoma que possui como um dos seus parceiros de fusão uma célula de animal transgénico não humano que expressa genes da imunoglobulina humana. Noutra forma de realização, o hibridoma é derivado de um animal não-humano, não-transgénico. A molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo contra OX40R pode ser construída através da fusão de uma molécula de ácido nucleico que codifica a região variável pesada com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região constante de uma cadeia pesada. De um modo semelhante, uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve de um anticorpo contra OX40R pode ser construída através da fusão de uma molécula de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia leve com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região constante de uma cadeia leve. As moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia VH e VL podem ser convertidas nos genes de anticorpo de comprimento total através da sua inserção em vetores de expressão que já codificam a região constante da cadeia pesada e a região constante da cadeia leve, respetivamente, de modo a que o segmento VH esteja ligado operacionalmente aos segmentos da região constante da cadeia pesada (CH) no vetor e o segmento VL esteja ligado operacionalmente ao segmento da região constante de cadeia leve (CL) no vetor. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico que codifica as cadeias VH ou VL são convertidas nos genes de anticorpo de comprimento total por ligação, e.g., ligando, a molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia VH a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia CH utilizando técnicas convencionais de biologia molecular. 0 mesmo pode ser alcançado utilizando moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias VL e CL. As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada e da cadeia leve humanas são conhecidas na técnica. Ver, e.g., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. As moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada e/ou cadeia leve de comprimento total podem ser então expressas a partir de uma célula na qual foram introduzidas e o anticorpo contra OX40R isolado.

As moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas para expressar de forma recombinante grandes quantidades de anticorpos contra OX40R, como descrito abaixo. As moléculas de ácido nucleico podem também ser utilizadas para produzir outras moléculas de ligação fornecidas pela descrição, tais como anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos mutados, e derivados de anticorpo, como aqui descrito noutro local. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico é utilizada como sonda ou iniciador para PCR para sequências de anticorpo especificas. Por exemplo, uma molécula de sonda de ácido nucleico pode ser utilizada em métodos de diagnóstico ou uma molécula de ácido nucleico de iniciador de PCR pode ser utilizada para amplificar regiões de DNA que podem ser utilizadas, inter alia, para isolar sequências de ácido nucleico para utilização na produção de regiões variáveis dos anticorpos contra OX40R.

Uma vez obtidas as moléculas de DNA que codificam os segmentos VH e VL de um anticorpo contra OX40R, estas moléculas de DNA podem ser ainda manipuladas através de técnicas de DNA recombinante, por exemplo para converter os genes da região variável nos genes da cadeia de anticorpo de comprimento total, em genes do fragmento Fab, ou num gene de scFv. Nestas manipulações, uma molécula de DNA que codifica VL- ou VH- está ligada operacionalmente a outra molécula de DNA que codifica outro polipéptido, tal como uma região constante do anticorpo ou um ligante flexivel. 0 termo "ligado operacionalmente", como utilizado neste contexto, significa que as duas moléculas de DNA estão ligadas de modo a que as sequências de aminoácidos codificadas pelas duas moléculas de DNA permanecem em grelha. A molécula de DNA isolada que codifica a região VH pode ser convertida num gene da cadeia pesada de comprimento total ligando operacionalmente a molécula de DNA que codifica VH com outras moléculas de DNA que codificam regiões constantes da cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada humanas são conhecidas na técnica (ver, e.g., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological

Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos de DNA que compreendem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação convencional por PCR. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas de um modo muito preferido é uma região constante de IgGl ou IgG2. A sequência da região constante de IgGl pode ser qualquer um dos vários alelos ou alotipos conhecidos por ocorrer entre diferentes indivíduos, tais como Gm(l), Gm(2), Gm(3), e Gm(17). Estes alotipos representam substituições de aminoácidos que ocorrem naturalmente nas regiões constantes de IgGl. Para um gene da cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA que codifica VH- pode ser ligado operacionalmente a outra molécula de DNA que codifica apenas a região constante CHI da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada CHI pode ser derivada de quaisquer genes da cadeia pesada. A molécula de DNA isolada que codifica a região VL pode ser convertida num gene da cadeia leve de comprimento total (assim como um gene da cadeia leve de Fab) ligando operacionalmente a molécula de DNA que codifica Vf a outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL-. As sequências dos genes da cadeia leve da região constante humanas são conhecidas na técnica (ver e.g., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of

Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos de DNA que compreendem a estas regiões podem ser obtidas através de amplificação por PCR convencional. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda. A região constante capa pode ser qualquer um de vários alelos conhecidos por ocorrerem entre indivíduos diferentes, tais como Inv(I), Inv(2), e Inv(3). A região constante lambda pode ser derivada de qualquer um dos três genes lambda.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH- e VL- são ligados operacionalmente a outro fragmento que codifica um ligante flexivel, e.g., que codifica uma sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo a que as sequências VH e VL possam ser expressos como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH ligadas pelo ligante flexível (ver e.g., Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554). O anticorpo de cadeia simples pode ser monovalente, se apenas são utilizados VH e VL únicos, bivalente, se são utilizados dois VH e VL, ou polivalente, se são utilizados mais do que dois VH e VL. Podem ser criados anticorpos biespecíficos ou polivalentes que se ligam especificamente a OX40R e a outra molécula.

Noutro aspeto, a presente descrição proporciona um vetor, que compreende uma molécula de ácido nucleico, aqui descrita acima. A molécula de ácido nucleico codifica uma molécula de liqação da invenção. Para expressar uma molécula de ligação, uma molécula de DNA que codifica uma molécula de ligação parcial ou de comprimento total é inserida num vetor de expressão de modo a que a molécula de DNA é ligada operacionalmente a sequências de controlo de transcrição e de tradução. Neste contexto, o termo "ligado operacionalmente" pretende significar que a molécula de DNA é ligada a um vetor de modo que as sequências de controlo de transcrição e de tradução no vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução da molécula de DNA. 0 vetor de expressão e as sequências de controlo de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. Os vetores de expressão incluem, por exemplo, plasmideos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-associados (AAV), virus de plantas tais como o virus do mosaico da couve-flor, o virus do mosaico do tabaco, cosmideos, YACs, e epissomas derivados de EBV. A molécula de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia leve e a molécula de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada podem ser inseridas em vetores separados ou no mesmo vetor. A molécula de DNA é inserida no vetor de expressão através de quaisquer métodos adequados (e.g., ligação de sitios de restrição complementares do fragmento do gene do anticorpo e vetor, ou ligação de extremidades rombas se não estiverem presentes sitios de restrição).

Um exemplo de um vetor de expressão adequado é aquele que codifica uma sequência de imunoglobulina humana CH ou Cl funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados modificados de modo a que qualquer sequência de VH ou VL possa ser inserida e expressa. 0 vetor de expressão também pode codificar um péptido sinal que facilita a secreção de uma sequência de aminoácidos da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 DNA que codifica uma sequência de aminoácidos de uma cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de modo a que o péptido sinal seja ligado em grelha ao terminal amino de uma sequência de aminoácidos da cadeia de anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (i.e., um péptido sinal de uma proteína não imunoglobulina).

Adicionalmente à sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de um anticorpo contra OX40R (genes da cadeia de anticorpo), os vetores de expressão comportam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo numa célula hospedeira. A conceção do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, e assim por diante. As sequências reguladoras para expressão em células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem níveis elevados de expressão de proteína em células de mamíferos, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tais como o promotor/intensificador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tais como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus, (e.g., o promotor tardio do adenovírus principal (AdMLP)), polioma e promotores de mamíferos fortes, tais como promotores da imunoglobulina nativa e da actina. Para posterior descrição de elementos reguladores de vírus, e suas sequências, ver e.g., Patente U.S. Nos. 5 168 062, 4 510 245, e 4 968 615.

Adicionalmente às sequências de ácido nucleico da cadeia do anticorpo e às sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes podem comportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor nas células hospedeiras e genes marcadores de seleção. O gene marcador de seleção facilita a seleção das célula hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver e.g., Patente U.S. Nos. 4 399 216, 4 634 665 e 5 179 017). Os genes marcadores de seleção incluem o gene da di-hidrofolato redutase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr“ com seleção/amplificação de metotrexato), o gene da fosfotransferase de neomicina (para seleção de G418), e o gene da glutamato sintetase. A conceção do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de vários fatores, tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, e assim por diante. As moléculas de ácido nucleico que codificam moléculas de ligação e vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucleico podem ser utilizados para transformação de uma célula hospedeira adequada para a produção recombinante de uma molécula de ligação. Uma célula hospedeira adequada é transformada com um ou mais vetores de expressão que comportam moléculas de ácido nucleico que codificam uma sequência de aminoácidos de uma molécula de ligação de modo a que a sequência de aminoácidos seja expressa na célula hospedeira e, tipicamente, segregada para o meio no qual a célula hospedeira é cultivada e a partir desse meio a sequência de aminoácidos podem ser recuperada. A transformação de células hospedeiras pode ser realizada através de qualquer método adequado conhecido na técnica, tais como aqueles revelados nas Patentes U.S. Nos. 4 399 216, 4 912 040, 4 740 461, e 4 959 455. A célula hospedeira pode ser uma célula de mamífero, de inseto, de planta, bacteriana, ou de levedura. Exemplos de linhas de células de mamíferos adequadas como célula hospedeiras incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células do rim de macaco verde africano (COS), células do carcinoma hepatocelular humano (e.g., Hep G2), células A549, e várias outras linhas de células. Exemplos de linhas de células de inseto incluem as células Sf9 ou

Sf21. Exemplos de célula hospedeiras vegetais incluem Nicotiana, Arabidopsis, lentilha d'água, milho, trigo, batata, e assim por diante. Células hospedeiras de bactérias incluem as espécies E. coli e Streptomyces. Exemplos de células hospedeiras de levedura incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, e Pichia pastoris.

Sequências de aminoácidos de uma molécula de ligação expressa em diferentes linhas celulares ou em animais transgénicos podem possuir diferente glicosilação. Contudo, todas as moléculas de ligação codificadas pelas moléculas de ácido nucleico aqui fornecidas, ou compreendendo as sequências de aminoácidos aqui fornecidas, fazem parte da presente invenção, independentemente da glicosilação das moléculas de ligação.

Noutro aspeto, a presente descrição proporciona um método para produzir um anticorpo contra OX40R ou seu fragmento de ligação ao antigénio utilizando apresentação em fagos. 0 método compreende (a) sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos em fagos, (b) rastrear a biblioteca com o OX40R ou uma sua porção, (c) isolar o fago que se liga ao OX40R ou à sua porção, e (d) obter o anticorpo a partir do fago. Um método exemplar para preparar a biblioteca de anticorpos compreende os passos de: (a) imunizar um animal não humano compreendendo os loci da imunoglobulina humana com OX40R ou uma sua porção antigénica para criar uma resposta imunitária; (b) extrair células de produção de anticorpo do animal imunizado; (c) isolar o RNA que codifica as cadeia pesada e leve dos anticorpos contra OX40R a partir das células extraídas; (d) fazer transcrição reversa do RNA para produzir cDNA; (e), amplificar o cDNA; e (f) inserir o cDNA numa apresentação em vetor fágico de modo a que os anticorpos sejam expressos no fago. Os anticorpos humanos recombinantes contra OX40R ou seus fragmentos de ligação ao antigénio podem ser isolados através de rastreio de uma biblioteca de anticorpo combinatório recombinante. A biblioteca pode ser uma biblioteca de apresentação em fagos de scFv, criada utilizando cDNAs VL e VH humanos preparados a partir do mRNA isolado a partir de células B. Os métodos para preparar e rastrear essas bibliotecas são conhecidos na técnica. Estão disponíveis comercialmente kits para criar bibliotecas de apresentação em fagos (e.g., o Recombinant Phage Antibody System, da Pharmacia, n° de catálogo 27-9400-01; e o SurfZAP™, da Stratagene, kit de apresentação em fagos kit, n° de catálogo 240612).

Num caso, para isolar e produzir anticorpos contra OX40R humano com as caracteristicas desejadas, um anticorpo contra OX40R humano, como aqui descrito, é primeiro utilizado para selecionar sequências de cadeia pesada e leve humanas possuindo atividade de ligação semelhante contra OX40R utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como os métodos de os métodos de "impressão" de epitopo descritos em WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpos utilizadas neste método podem ser bibliotecas de scFv preparadas e pesquisadas como descrito em WO 92/01047, McCafferty et ai., Nature 348:552-554 (1990); e Griffiths et ai., EMBO J. 12:725-734 (1993). As bibliotecas de anticorpo scFv podem ser pesquisadas utilizando CCR2 humano como o antigénio.

Uma vez selecionadas as regiões iniciais humanas de VL e VH, são realizadas experiências de "mistura e emparelhamento", em que diferentes pares dos segmentos VL e VH inicialmente selecionados são rastreados para a ligação ao OX40R para selecionar combinações de pares VL/VH. Adicionalmente, para ainda melhorar a qualidade do anticorpo, os segmentos VL e VH dos par(es) VL/NH podem ser aleatoriamente mutadas, na região CDR3 de VH e/ou VL, num processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação da afinidade dos anticorpos durante uma resposta imunitária natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser conseguida por amplificação de

dominios VH e VL utilizando iniciadores de PCR complementares ao VH CDR3 ou VL CDR3, respetivamente, iniciadores estes que foram "misturados" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleótidos em certas posições tais como os produtos de PCR resultantes que codificam segmentos VH e VL nos quais as mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões CDR3 de VH e/ou VL. Estes segmentos VH e VL aleatoriamente mutados podem ser re-rastreados para a ligação a OX40R.

Após o rastreio e o isolamento de um anticorpo contra OX40R ou a porção de ligação ao antigénio a partir de uma biblioteca de apresentação de imunoglobulina recombinante, os ácidos nucleicos que codificam a molécula de ligação selecionada podem ser recuperados a partir do conjunto de apresentação (e.g., a partir do genoma do fago) e subclonados noutros vetores de expressão através de técnicas do DNA recombinante. Se desejado, o ácido nucleico pode ainda ser manipulado para criar outras formas de anticorpo, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado por rastreio de uma biblioteca combinatória, o DNA que codifica o anticorpo é clonado num vetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras de mamífero, como descrito acima.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Noutro aspeto, a presente descrição proporciona uma composição, e.g., uma composição farmacêutica, contendo uma ou uma combinação de moléculas de ligação fornecidas pela descrição, e opcionalmente um veículo farmaceuti-camente aceitável. As composições podem ser preparadas através de métodos convencionais conhecidos na técnica.

Em algumas formas de realização, a composição compreende um anticorpo contra OX40R ou um seu fragmento de ligação ao antigénio. Numa forma de realização particular, a composição compreende o anticorpo 11D4 ou o anticorpo 18D8, ou um fragmento de ligação ao antigénio de qualquer um destes dois anticorpos. Ainda noutras formas de realização, a composição compreende um derivado do anticorpo 11D4 ou do anticorpo 18D8. 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer substância inativa que é adequada para utilização numa formulação para a distribuição de uma molécula de liqação. Um veículo pode ser um aqente antiaderente, ligante, de revestimento, desintegrante, de enchimento ou diluente, conservante (tais como agentes antioxidantes, antibacterianos, ou antifúngicos), adoçante, agentes de retardamento da absorção, agente humidificante, agente emulsificante, tampão, e semelhantes. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e semelhantes) dextrose, óleos vegetais (tais como azeite), solução salina, tampão, solução salina tamponada, e agentes isotónicos tais como açúcares, poliálcoois, sorbitol, e cloreto de sódio.

As composições podem estar em quaisquer formas adequadas, tais como as formas de dosagem líquida, semi-sólida, e sólida. Exemplos de formas de dosagem líquida incluem solução (e.g., soluções injetáveis e de infusão), microemulsão, lipossoma, dispersão, ou suspensão. Exemplos de formas de dosagem sólida incluem comprimidos, pílulas, cápsulas, microcápsulas, e pós. Uma forma particular da composição adequada para distribuir uma molécula de ligação é um líquido estéril, tal como uma solução, suspensão, ou dispersão, para injeção ou infusão. As soluções estéreis podem ser preparadas através da incorporação do anticorpo na quantidade necessária num veículo apropriado, seguido por esterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o anticorpo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros veiculos. No caso de pós esterilizados para a preparação de liquido estéril, os métodos de preparação incluem secagem sob vácuo e secagem sob congelação em vácuo (liofilização) para produzir um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução deste previamente esterilizada por filtração. As várias formas de dosagem das composições podem ser preparadas através de técnicas convencionais conhecidas na técnica. A quantidade relativa de uma molécula de ligação incluida na composição irá variar dependendo de vários fatores, tais como a molécula de ligação especifica e os veiculos utilizados, a forma de dosagem, e a libertação desejada e caraterísticas farmacodinâmicas. A quantidade de uma molécula de ligação numa forma de dosagem única será de um modo geral A quantidade que produz um efeito terapêutico, mas pode também ser uma quantidade inferior. De um modo geral, esta quantidade irá variar desde cerca de 0,01 porcento a cerca de 99 porcento, desde cerca de 0,1 porcento até cerca de 70 porcento, ou desde cerca de 1 porcento até cerca de 30 porcento em relação ao peso total da forma de dosagem.

Adicionalmente à molécula de ligação, um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser incluídos na composição. Exemplos dos agentes terapêuticos adicionais são aqui descritos a seguir. A quantidade adequada do agente terapêutico adicional a ser incluida na composição pode ser prontamente selecionada por uma pessoa especialista na técnica, e variará dependendo de vários fatores, tais como o agente particular e veiculos utilizados, forma de dosagem, e libertação desejada e caracteristicas farmacodinâmicas. A quantidade do agente terapêutico adicional incluida numa forma de dosagem única será geralmente a quantidade do agente que produz um efeito terapêutico, mas pode ser uma também uma quantidade inferior.

UTILIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As moléculas de ligação e composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de ligação proporcionada pela presente descrição são úteis para propósitos terapêuticos, dignósticos, ou outros, tais como estimulação de uma resposta imunitária, tratamento de cancro, melhoramento da eficácia de outra terapia de cancro, ou melhoramento da eficácia de vacina, e têm várias utilidades, tais como a utilização como medicamentos ou agentes de diagnóstico. Deste modo, em outro aspeto, a presente descrição proporciona métodos de utilização das moléculas de ligação ou composições farmacêuticas.

Num aspeto particular, os métodos são proporcionados para estimular a resposta imunitária num mamifero, compreendendo a administração ao mamifero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação proporcionada pela revelação. Em algumas formas de realização, a molécula de ligação é um anticorpo contra OX40R ou seu fragmento de ligação ao antigénio e o mamífero é um humano. Numa outra forma de realização, a molécula de ligação é o anticorpo 11D4 ou anticorpo 18D8, ou um fragmento de ligação ao antigénio de qualquer dos anticorpos. 0 termo "estimulação da resposta imunitária" ou suas variações gramaticais, significa a estimulação, invocação, aumento, melhoria, ou aumento de qualquer resposta de um sistema imunitário de mamifero. A resposta imunitária pode ser uma resposta celular (i.e. medida por célula, tal como mediada por linfócitos T citotóxicos) ou uma resposta humoral (i.e. resposta mediada por anticorpo), e pode ser uma resposta imunitária primária ou secundária. Exemplos da estimulação da resposta imunitária incluem atividade aumentada de células T auxiliares CD4+ e a produção de células T citoliticas. A estimulação da resposta imunitária pode ser avaliada utilizando várias medições in vitro ou in vivo conhecidas dos especialistas na técnica, incluindo, mas não limitada a, ensaios com linfócitos T citotóxicos, libertação de citoquinas (por exemplo produção de IL-2), regressão de tumores, sobrevivência de animais portadores de tumor, produção de anticorpo, proliferação de células imunitárias, expressão de marcadores à superfície da célula, e citotoxicidade. Tipicamente, os métodos de uma revelação estimulam a resposta imunitária por um mamifero quando comparados com a resposta imunitária por um mamifero não tratado ou um animal não tratado utilizando os métodos reivindicados. Em uma forma de realização, o método estimula uma resposta imunitária celular, particularmente uma resposta de células T citotóxica. Em outra forma de realização, a resposta imunitária celular é uma resposta de célula T auxiliar. Ainda em outra forma de realização, a resposta imunitária é uma produção de citoquina, particularmente produção de IL-2.

Em outro aspeto particular, a presente descrição proporciona um método de tratamento de cancro num mamifero, compreendendo a administração ao mamifero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação proporcionada pela revelação. 0 termo "tratamento do cancro" ou "tratamento de cancro" refere-se a causar um efeito desejável ou benéfico num mamifero diagnosticado com um cancro. 0 efeito desejável ou benéfico pode incluir a inibição de crescimento adicional ou disseminação das células do cancro, morte das células de cancro, inibição de recorrência de cancro, redução de dor associada com o cancro, ou sobrevivência melhorada do animal. A inibição de recorrência de cancro contempla sitios de cancro e tecidos circundantes que tinham sido previamente tratados por radiação, quimioterapia, cirurgia, ou outras técnicas. 0 efeito pode ser subjetivo ou objetivo. Por exemplo, se o animal é humano, o humano pode notar vigor ou vitalidade melhorados ou diminuição da dor como sintomas subjetivos de melhoria ou resposta a terapia. Alternativamente, o clinico pode notar um decréscimo no tamanho de tumor ou expansão do tumor com base no exame fisico, parâmetros laboratoriais, marcadores de tumor ou observações radiográficas. Alguns sinais laboratoriais que o clínico pode observar para resposta ao tratamento incluem a normalização de testes, tais como a contagem de glóbulos brancos do sangue, contagem de glóbulos vermelhos do sangue, contagem de plaquetas, taxa de sedimentação de eritrócitos, e vários níveis de enzima. Adicionalmente, o clínico pode observar um decréscimo num marcador de tumor detetável. Alternativamente, outros testes podem ser utilizados para avaliar a melhoria objetiva, tais como sonogramas, testes de ressonância magnética nuclear e teste de emissões de positrão. Em algumas formas de realização, a molécula de ligação é um anticorpo contra OX40R ou um seu fragmento de ligação ao antigénio proporcionado pela revelação. Numa outra forma de realização a molécula de ligação é o anticorpo 11D4 ou 18D8, ou um fragmento de ligação ao antigénio de qualquer dos anticorpos. Numa outra forma de realização, o mamífero é um humano.

Em outro aspeto particular, a presente descrição proporciona um método de prevenção de cancro num mamífero, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação proporcionada pela revelação. 0 termo "prevenir o cancro" ou "prevenção do cancro" refere-se ao retardamento, inibição, ou prevenção do início de um cancro num mamífero em que o início da oncogénese ou tumorogénese não é evidenciado mas uma predisposição para o cancro é identificada se determinada por pesquisa genética, por exemplo, ou de outra forma. 0 termo também inclui o tratamento de um mamífero possuindo estados pré-malignos para interromper a progressão de, ou causar regressão de, estados pré-malignos para a malignidade. Exemplos de estados pré-malignos incluem hiperplasia, displasia, e metaplasia. Em algumas formas de realização, a molécula de ligação é um anticorpo contra OX40R ou um seu fragmento proporcionado pela revelação. Numa outra forma de revelação a molécula de ligação é o anticorpo 11D4 ou 18D8, ou um fragmento de ligação ao antigénio de qualquer dos anticorpos. Numa outra forma de realização, o mamífero é um humano.

Uma variedade de cancros, sejam malignos ou benignos e sejam primários ou secundários, podem ser tratados ou prevenidos com um método proporcionado pela revelação. Exemplos destes cancros incluem cancros do pulmão tais como carcinoma broncogénico (e.g., carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula pequena, carcinoma de célula grande, e adenocarcinoma) , carcinoma célula alveolar, adenoma bronquial, hamartoma condromatoso (não canceroso), e sarcoma (canceroso); cancro cardíaco tal como mixoma, fibromas, e rabdomiomas; cancros do osso tais como osteocondromas, condromas, condroblastomas, fibromas con-dromixóides, osteomas osteóides, tumores de células gigantes, condrossarcoma, mieloma múltiplo, osteossarcoma, fibrossarcomas, histiocitomas fibrosos malignos, tumor de Ewing (sarcoma de Ewing), e sarcoma de células de retículo; cancro do cérebro tal como gliomas (e.g., glioblastoma multiforme), astrocitomas anaplástico, astrocitomas, oligo-dendrogliomas, meduloblastomas, cordoma, Schwanomas, epen-dimomas, meningiomas, adenoma pituitário, pinealoma, oste-omas, hemangioblastomas, craniofaringiomas, cordomas, ger-minomas, teratomas, cistos dermóides, e angiomas; cancros no sistema digestivo tais como leiomioma, carcinoma epi-dermóide, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, adenocarcinomas do estômago, lipomas intestinais, neurofibromas intestinais, fibromas intestinais, pólipos no intestino grosso, e cancros colorretais; cancros do fígado tais como adenomas hepatocelulares, hemangioma, carcinoma hepatocelular, carcinoma fibrolamelar, colangiocarcinoma, hepatoblastoma, e angiossarcoma; cancros do rim tais como adenocarcinoma do rim, carcinoma de célula renal, hipernefroma, e carcinoma de célula transicional da pélvis renal; cancros da bexiga; cancros hematológicos tais como leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), mielóide aguda (mielocítico, mielogenoso, mieloblástico, mielomonocítico) leucemia, leucemia linfocítica crónica (e.g., síndroma de Sezari e leucemia de célula hairi), leucemia mielocítica crónica (mielóide, mielogenoso, granulocítico), linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma de células B, micose fungóide, e distúrbios mieloproliferativos (incluindo distúrbios mieloproliferativos tais como policitemiavera, mielofibro-se, trombocitemia, e leucemia mielocítica crónica) ; cancros da pele tais como carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, melanoma, sarcoma Kaposi, e doença de Paget; cancros da cabeça e pescoço; cancros relacionados com olhos tais como retinoblastoma e melanocarcinoma intraocular; cancros do sistema reprodutivo masculino tais como hiperplasia benigna da próstata, cancro da próstata, e cancros testiculares (e.g., seminoma, teratoma, carcinoma embrionário, e coriocarcinoma) ; cancro da mama; cancros do sistema reprodutivo feminino tais como cancro uterino (carcinoma endometrial) , cancro cervical (carcinoma cervical) , cancro dos ovários (carcinoma dos ovários), carcinoma vulvar, carcinoma vaginal, cancro do tubo falopiano, e hidatidiforme mole; cancro da tiróide (incluindo cancro papilar, folicular, anaplástico, ou medular); feocromo-citomas (glândula adrenal); crescimentos não cancerosos das glândulas paratiróides; cancros pancreáticos; e cancros hematológicos tais como leucemias, mielomas, linfomas não Hodgekin, e linfoma de Hodgekin.

Na prática dos métodos terapêuticos, as moléculas de ligação podem ser administradas isoladas como monoterapia, ou administradas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou terapias. Deste modo, em outro aspeto, a presente descrição proporciona uma terapia de combinação, que compreende uma molécula de ligação proporcionada por uma revelação em combinação com uma ou mais terapias adicionais ou agentes terapêuticos. 0 termo "terapia adicional" refere-se a uma terapia que não emprega uma molécula de ligação proporcionada por uma revelação como um agente terapêutico. 0 termo "agente terapêutico adicional" refere-se a qualquer agente terapêutico para além de uma molécula de ligação proporcionada pela revelação. Em algumas formas de realização, a molécula de ligação é o anticorpo 11D4 ou 18D8, ou um fragmento de ligação ao antigénio de qualquer dos anticorpos. Num aspeto particular, a presente descrição proporciona uma terapia de combinação para tratamento de cancro num mamífero, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação proporcionada por uma revelação em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Numa outra forma de realização, o mamífero é um humano.

Uma vasta variedade de agentes terapêuticos de cancro pode ser utilizada em combinação com uma molécula de ligação. Um normal especialista na técnica reconhecerá a presença e desenvolvimento de outras terapias de cancro que podem ser utilizadas em combinação com os métodos e moléculas de ligação da presente descrição, e não será restrita às formas de terapia aqui apresentadas. Exemplos de categorias de agentes terapêuticos adicionais que podem ser utilizadas na terapia de combinação para tratamento de cancro incluem (1) agentes quimioterapêuticos, (2) agentes imunoterapêuticos, e (3) agentes terapêuticos hormonais. 0 termo "agente quimioterapêutico" refere-se a uma substância química e biológica que pode causar a morte de células de cancro, ou interfere com crescimento, divisão, reparação, e/ou com a função de células de cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem os que são revelados em WO 2006/088639, WO 2006/129163, e US 20060153808, cujas revelações são aqui incorporadas por referência. Exemplos de agentes quimioterapêuticos particulares incluem: (1) agentes alquilantes, tais como clorambucil (LEUKERAN), mciclofosfamida (CYTOXAN), ifosfa-mida (IFEX), cloridrato de mecloretamina (MUSTARGEN), tiotepa (THIOPLEX), estreptozotocina (ZANOSAR), carmustina (BICNU, GLIADEL WAFER), lomustina (CEENU), e dacarbazina (DTIC-DOME); (2) alcaloides ou alcaloides da planta vinca, incluindo antibióticos citotóxicos, tais como doxorrubicina (ADRIAMYCIN), epirrubicina (ELLENCE, PHARMORUBICIN), dau-norrubicina (CERUBIDINE, DAUNOXOME), nemorrubicina, idar-rubicina (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS), mitoxantrona (DHAD, NOVANTRONE). dactinomicina (actinomicina D, COSMEGEN), pli-camicina (MITHRACIN), mitomicina (MUTAMYCIN) , e bleomicina (BLENOXANE), tartarato de vinorelbina (NAVELBINE)), vinblastina (VELBAN), vincristina (ONCOVIN), e vindesina (ELDISINE); (3) antimetabolitos, tais como capecitabina (XELODA), citarabina (CYTOSAR-U), fludarabina (FLUDARA), gemcitabina (GEMZAR), hidroxiureia (HYDRA), metotrexato (FOLEX, MEXATE, TREXALL), nelarabina (ARRANON), trimetre-xato (NEUTREXIN) , e pemetrexed (ALIMTA); (4) Antagonistas da pirimidina, tais como 5-fluorouracilo (5-FU); capecitabina (XELODA), raltitrexed (TOMUDEX), tegafur-uracilo (UFTORAL), e gemcitabina (GEMZAR); (5) taxanos, tais como docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel (TAXOL); (6) fármacos de platina, tais como cisplatina (PLATINOL) e carboplatina (PARAPLATIN), e oxaliplatina (ELOXATIN); (7) inibidores de topoisomerase, tais como irinotecano (CAMPTOSAR), topote-cano (HYCAMTIN), etopósido (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR), e tenipósido (VUMON); (8) epipodofilotoxinas (derivados da podofilotoxina) , tais como etopósido (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR); (9) derivados do ácido fólico, tais como leucovorina (WELLCOVORIN); (10) nitrosoureias, tais como carmustine (BiCNU), lomustine (CeeNU); (11) inibidores do recetor da tirosina quinase, incluindo o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), recetor da insulina, recetor do fator de crescimento tipo insulina (IGFR), recetor do fator de crescimento de hepatócitos (HGFR), e recetor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), tais como gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), bortezomib (VELCADE), mesilato de imatinib (GLEEVEC), genefitinib, lapatinib, sorafenib, talidomida, sunitinib (SUTENT), axitinib, rituximab, trastuzumab (HERCEPTIN), cetuximab (ERBITUX), bevacizumab (AVASTIN), e ranibizumab (LUCENTIS), lym-1 (ONCOLYM), anticorpos contra o recetor do fator-1 do crescimento tipo insulina (IGF-1R) que são revelados em W02002/053596); (12) inibidores de angiogénese, tais como bevacizumab (AVASTIN), suramina (GERMANIN), angiostatina, SU5416, talidomida, e inibidores de metaloproteinase da matriz (tais como batimastat e marimastat) , e os que são revelados em W02002055106; e (13) inibidores de proteassoma, tais como bortezomib (VELCADE). O termo "agentes imunoterapêuticos" refere-se a uma substância quimica e biológica que pode estimular uma resposta imunitária de um mamifero. Exemplos de agentes imunoterapêuticos incluem: bacilos Calmette-Guerin (BCG); citoquinas tais como interferões; vacinas tais como a imunoterapia personalizada MyVax, Onyvax-P, Oncophage, GRNVAC1, Favld, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX, e NeuVax; e anticorpos tais como alemtuzumab (CAMPATH), bevacizumab (AVASTIN), cetuximab (ERBITUX), gemtuzunab ozogamicina (MYLOTARG), ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN), panitumumab (VECTIBIX) , rituximab (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumab (HERCEPTIN), tositumomab (BEXXAR), tremeli-mumab, CAT-3888, e anticorpos agonistas do recetor CD40 que são revelados em W02003/040170. 0 termo "agente terapêutico hormonal" refere-se a uma substância química ou biológica que inibe ou elimina a produção de uma hormona, ou inibe ou contraria o efeito de uma hormona no crescimento e/ou sobrevivência de células cancerosas. Exemplos destes agentes adequados para os métodos incluem aqui os que são revelados em US20070117809. Exemplos de agentes terapêuticos hormonais particulares incluem tamoxifeno (NOLVADEX), toremifeno (Fareston), fulvestrante (FASLODEX), anastrozole (ARIMIDEX), exemestano (AROMASIN), letrozole (FEMARA), acetato de megestrol (MEGACE), goserelina (ZOLADEX), e leuprolide (LUPRON). As moléculas de ligação desta revelação podem também ser utilizadas em combinação com terapias hormonais não fármaco tais como (1) métodos cirúrgicos que removem todo ou parte dos órgãos ou glândulas que participam na produção da hormona, tais como os ovários, os testículos, a glândula adrenal, e a glândula pituitária, e (2) tratamento por radiação, em que os órgãos ou glândulas do doente são sujeitos a radiação numa quantidade suficiente para inibir ou eliminar a produção da hormona alvo. A terapia de combinação para o tratamento de cancro também inclui a combinação de uma molécula de ligação proporcionada por uma revelação com cirurgia para remover um tumor. A molécula de ligação pode ser administrada ao mamifero antes, durante, ou após a cirurgia. A terapia de combinação para tratamento do cancro também inclui a combinação de uma molécula de ligação proporcionada por uma revelação com terapia de radiação, tal como ionizante (electromagnética) , radioterapia (e.g., raios X ou raios gama) e terapia de radiação de feixe de partículas (e.g., radiação de elevada energia linear). A fonte de radiação pode ser externa ou interna para o mamifero. A molécula de ligação pode ser administrada ao mamifero antes, durante, ou após a terapia de radiação.

ADMINISTRAÇÃO DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO E COMPOSIÇÕES

As moléculas de ligação e composições proporcionadas pela presente descrição podem ser administradas via qualquer via entérica adequada ou via parentérica de administração. 0 termo "via entérica" de administração refere-se à administração via qualquer parte do trato gastrointestinal. Os exemplos de vias entéricas incluem a via oral, mucosa, bucal, e retal, ou via intragástrica. "Via parentérica" de administração refere-se a uma outra via de administração para além da via entérica. Exemplos de vias parentérica de administração incluem a administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral, intravesical, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, transtraqueal, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, epidural e intraesternal, subcutânea, ou tópica. Os anticorpos e composições de uma revelação podem ser administrados utilizando qualquer método adequado, tais como ingestão oral, tubo nasogástrico, tubo de gastrostomia, injeção, infusão, bomba de infusão implantável, e bomba osmótica. A via e método de administração adequados podem variar dependendo de vários fatores tais como o anticorpo especifico a ser utilizado, a taxa de absorção desejada, formulação ou forma de dosagem especificas utilizadas, tipo ou gravidade do distúrbio a ser tratado, o sitio especifico da ação, e estados do doente, e podem ser prontamente selecionados por uma pessoa especialista na técnica 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma molécula de ligação refere-se a uma quantidade que é eficaz para um determinado propósito terapêutico. Por exemplo, no contexto do estimulo de uma resposta imunitária, a "quantidade terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade que é eficaz na estimulação, invocando, aumentando, melhorando, ou aumentando qualquer resposta de um sistema imunitário de mamífero. No contexto do tratamento de cancro, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade que é suficiente para causar qualquer efeito desejável ou benéfico no mamífero a ser tratado, tal como a inibição de crescimento adicional ou espalhamento de células de cancro, morte das células de cancro, inibição de recorrência de cancro, redução de dor associada com o cancro, ou sobrevivência melhorada do mamífero. Num método de prevenção de cancro, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade que é eficaz no retardamento, inibição, ou prevenção do início de um cancro no mamífero a que a molécula de ligação é administrada. A quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação varia normalmente de cerca de 0,001 a cerca de 500 mg/kg, e mais normalmente cerca de 0,05 a cerca de 100 mg/kg, do peso corporal do mamífero. Por exemplo, a quantidade pode ser cerca de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg, ou 100 mg/kg de peso corporal do mamífero. Em algumas formas de realização, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contra OX40R está no intervalo de cerca de 0,1 - 30 mg/kg de peso corporal do mamífero. O nível preciso de dosagem a ser administrado pode ser prontamente determinado por uma pessoa especialista na técnica e dependerá de vários fatores, tais como o tipo, e gravidade do distúrbio a ser tratado, a molécula de ligação particular empregue, a via de administração, o tempo de administração, a duração do tratamento, a terapia adicional particular empregue, a idade, sexo, peso, estado, saúde geral e historial médico anterior do doente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos na técnica médica.

Uma molécula de ligação ou composição é normalmente administrada em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre doses únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente.

Um regime de tratamento exemplificativo implica a administração uma vez por semana, uma vez em cada duas semanas, uma vez em cada três semanas, uma vez em cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez em cada 3 meses ou uma vez em cada três a 6 meses. Os regimes de dosagem tipicos durante um anticorpo contra OX40R incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal via administração intravenosa, utilizando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) todas as quatro semanas durante dosagens, depois todos os três meses; (ii) todas as três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal todas as três semanas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA OX40R

Os anticorpos ilustrativos de acordo com a revelação foram preparados, selecionados, e avaliados como se segue:

Imunização com o Antigénio QX40R e Seleção dos Murganhos Produtores de Anticorpos Monoclonais contra QX40R:

Os anticorpos monoclonais humanos completos contra o OX40R humano foram preparados utilizando estirpes de murganho transgénico de Ig humana HCo7, HCol2, Hcol7, e Hco27 assim como a estirpe humana transcromossómica/trans-génica, KM (Medarex, Inc.). Estas estirpes expressam todas anticorpos humanos completos que são indistinguíveis de anticorpos isolados a partir de humanos.

Nas estirpes transgénicas, ambos os genes de cadeia leve capa endógeno de murganho e o gene da cadeia pesada endógena de murganho foram homozigoticamente interrompidos como descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:821-830 e no Exemplo 1 de WO 01/09187, respetivamente. Além disso, estes comportam um transgene cadeia leve capa humana, KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Blotechnology 14:845-851. Em contraste, as estirpes transgénicas são distintas no que respeita aos seus genes de cadeia pesada humana. A estirpe HCo7 comporta o transgene HCo7 de cadeia pesada humana como descrito nas Patentes U.S. N° : 5 545 806, 5 625 825, e 5 545 807; a estirpe HCol2 comporta o transgene HCol2 da cadeia pesada humana como descrito no Exemplo 2 de WO 01/09187; a estirpe Hcol7 comporta o transgene Hcol7 de cadeia pesada humana como descrito no Exemplo 8 de Deshpande et ai., US 2005/0191293A1; a estirpe Hco27 comporta o transgene Hco27 da cadeia pesada humana como descrito no Exemplo 5 da PCT/US2008/072640 de 08 de Agosto de 2008. A estirpe KM comporta um minicromossoma humano como descrito em Ishida et al. , (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102.

Os esquemas gerais de imunização para os murganhos HuMab são descritos em Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Blotechnology 14: 845-851; e Publicação PCT WO 98/24884.

Os murganhos HuMab das estirpes HCo7, HCol2, Hcol7, Hco27 e KM foram imunizados com inicio às 6-16 semanas de idade com 15-25 mgs de proteina OX40R recombinante humana-Ig purificada e linha de células pre-B de murino, 300-19 (Reth, M. G. et al., Nature 312 29: 418-42, 1984; Alt, F. et al., Cell 27: 381-390, 1981), transfetadas para expressar o OX40R humano em adjuvante de Ribi. A proteina OX40R recombinante humano-Ig purificada é uma construção do dominio extracelular (aminoácidos 1-220) de OX40R humano em fusão com a região constante da IgGl humana. A administração foi via injeção intraperitoneal-mente, subcutaneamente ou na almofada da pata a intervalos de 3-28 dias, até um total de 10 imunizações. A resposta imunitária foi monitorizada via rastreio de ELISA e FACS como descrito a seguir.

Seleção de Murganhos HuMab Produtores de Anticorpos contra QX40R:

Para selecionar murganhos HuMab produtores de anticorpos que se ligam ao OX40R, o sangue dos murganhos imunizados foi obtida e analisada por ELISA para ligação especifica à proteina recombinante de OX40R humano purificada, e por FACS para ligação à linha de células que expressa o OX40R humano de comprimento total, e não a uma linha de células de controlo que não expressam OX40R. 0 ensaio de ligação por ELISA foi como descrito por Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845- 851. Resumidamente, as placas de microtitulação foram revestidas utilizando 50 pL/poço de uma solução de OX40R recombinante-Ig purificado contendo 1 mg/mL em PBS, e incubadas durante a noite a 4 °C. Os poços foram então bloqueados utilizando 200 pL/poço de 5% de soro de galinha em PBS/Tween (0,05%). As diluições de plasma de murganhos imunizados com OX40R foram adicionadas a cada poço e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e então incubadas com um anticorpo policlonal anti-Fc de IgG humana conjugado com peroxidase de rábano (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS (Moss Inc., produto #: ABTS-1000 mg/mL) e analisadas por espectrofotómetro a DO 405. O ensaio FACS foi efetuado de acordo com procedimentos convencionais. Resumidamente, as células 300-19 que expressam OX40R foram incubadas com soro de murganhos imunizados diluido a 1:20. As células foram lavadas e a ligação especifica ao anticorpo foi detetada com Anticorpo anti-IgG humana marcada com FITC. As análises

de citometria de fluxo foram efetuadas num instrumento FACS de citometria de fluxo (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Os murganhos que desenvolveram os maiores titulos de anticorpos contra OX40R foram utilizados para as fusões. As fusões foram efetuadas como descrito a seguir e os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto a atividade anti-OX40R por ELISA e FACS.

Produção de Hibridomas Produtores de Anticorpos

Monoclonais Humanos contra QX40R:

Os murganhos selecionados acima foram reforçados intravenosamente com OX40R-Ig aos 3 dias e então de novo aos 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço e dos nódulos linfáticos.

Os esplenócitos e/ou linfócitos de nódulos linfáticos isolados de murganhos imunizados HuMab ou KM foram fundidos com células de mieloma de murganho SP2/0 não segregantes (ATCC, CRL-1581) utilizando electrofusão (E-fusão, Cyto Pulse™ technology, Cyto Pulse™ Sciences, Inc., Glen Burnie, MD), de acordo com os protocolos convencionais ou recomendados pelo fabricante. Resumidamente, as suspensões de célula única de esplenócitos e/ou foram preparados linfócitos de nódulos linfáticos de murganhos imunizados e então combinados com um igual número de SP2/0 células de mieloma de murganho não segregantes; foi então efetuada a E-fusão.

As células foram então plaqueadas a 2xl04 células/poço numa placa de microtitulação de fundo plano, e incubadas durante 10-14 dias em meio seletivo contendo 10% de soro fetal de bovino, 10% de P388D1 (ATCC, CRL-TIB-63) meio condicionado, 3-5% (IGEN) em DMEM (Mediatech, Herndon, VA, N° Cat. CRL 10013, com glucose elevada, L-glutamina e piruvato de sódio), 7 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 0,1 IU/mL de penicilina - 0,1 mg/mL de estreptomicina, e 1 x HAT (Sigma, Cat. No. CRL -P-7185).

Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio em que o HAT foi substituído com HT. Aproximadamente 10-14 dias após plaqueamento das células, os sobrenadantes de poços individuais foram avaliados quanto à presença de anticorpos humanos gama, capa. Os sobrenadantes que foram avaliados como positivos para gama, capa humanos foram então rastreados por ELISA e FACS (utilizando o protocolo descrito acima) para os anticorpos IgG monoclonais para o OX40R humano. Os hibridomas que segregam anticorpo foram transferidos para placas de 24 poços, rastreados de novo e, se confirmados como positivos para os anticorpos monoclonais IgG para o OX40R humano, foram subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis foram então cultivados in vitro para produzir pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização posterior.

EXEMPLO 2: EXEMPLOS BIOLÓGICOS/FARMACOLÓGICOS A. Procedimentos de Estudo In vitro:

Ligação ao Domínio Extracelular de QX40R: Uma proteína de fusão 0X40 humana-Ig foi diluída em tampão Carbonato BupH™, pH 9,4 (Pierce, Rockford, IL) foi revestimento em placas Maxisorb de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a 100 pL/poços (0,25 mg/mL) e incubada durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem contendo 0,05% de Iween 20 (Sigma, St Louis, MO) diluído em PBS (Sigma, St Louis, MO) e bloqueado com 300 pL/poço de 0,5% de BSA (Sigma, St Louis, MO) em PBS durante 1 hora à TA. A seguir, as placas foram lavadas e incubadas com anticorpos reativos com 0X40 anti-humano diluídos em tampão de bloqueamento em várias concentrações (100 pL/poço) e incubadas durante 1 hora à TA. As placas foram então lavadas e incubadas durante uma hora à TA com um anticorpo anti-cadeia capa humana marcado com peroxidase de rábano (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a 25 ng/mL em tampão de bloqueamento. Finalmente, as placas de ensaio foram lavadas e foram adicionados 100 pL/poço de substrato 1-Step Turbo-TMB (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos à TA. A reação foi interrompida por adição de um igual volume de 2 M de H2SO4 e absorvência foi lida a 450 nm num Molecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ligação ao QX40R à Superfície da Célula à Base de FACS: As linhas de células que expressam OX40R (ver a seguir) ou células mononucleares primárias ativadas do sangue periférico (ver a seguir) foram utilizadas para avaliar a ligação em ambos os recetores de 0X40 em humanos e cinomolgos. As células foram recolhidas e lavadas (5 x 105/tubo) utilizando tampão de lavagem à TA. 0 tampão de lavagem consistiu em PBS, 2% de soro fetal de bovino inativado pelo calor (Hyclone, Logan, UT) e 0,02% de azida de sódio (Sigma, St. Louis, MO). A seguir, 100 pL de várias concentrações de anticorpo foram adicionados às células (começando com 30 pg/mL e utilizando uma titulação de 3 vezes) diluídas em tampão de lavagem contendo 0,005 mg/mL de citocolasina B (Sigma, St. Louis, MO) . As células foram suavemente rodadas a TA durante 3 horas. A seguir, as células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em 0,5 mL/tubo com tampão de lavagem frio e 10 000 eventos foram recolhidos e analisados utilizando um Becton Dickinson FACSCalibur e software CellQuest (San Jose, CA).

Ensaio Biacore: O instrumento Biosensor de análise de interação bioespecífica (BIAcore 2000) utiliza ressonância de plasmão de superfície para medir as interações moleculares num chip sensor CM5. As alterações nos índices de refração entre os dois meios, vidro e dextrano carboximetilado, causado pela interação de moléculas com o lado do dextrano do chip sensor, são medidas e reportadas como alterações em unidades arbitrárias de reflectância (RU) como detalhado nas notas do pedido do fabricante.

As superfícies de dextrano carboximetiladas num chip sensor CM5 foram ativados por derivatização com 0,05 M de N-hidroxissuccinimida mediada por 0,2 M de N-etil-N'-(dimetilaminopropilo) carbodiimida durante 7 min. A estreptavidina (Sigma S-4762) a uma concentração de 500 pg/mL, em 10 mM de acetato de Na, pH 4,5, foi injetada nas três superfícies (Célula de Fluxo-2, 3 e 4) a uma taxa de 5 pL/min e covalentemente imobilizado nas superfícies da célula de fluxo com aproximadamente 2500 RU's. Foram injetados 35 pL de 10 mM tampão de acetato de Na na célula de Fluxo 1 durante a imobilização em vez do antigénio para produzir uma superfície branca ativada para medir a ligação não específica. A desativação de ésteres de N-hidroxissuccinimida que não reagiu em todas as quatro células de

Fluxo foi efetuada utilizando 1 M de cloridrato de etanol- amina, pH 8,5. Após imobilização, as células de fluxo são limpas de qualquer material que não reagiu ou fracamente ligado com 5 injeções de regeneração de 5 pL de 50 mM de NaOH até uma linha de base estável foi conseguida. O CD 134-mulg biotinilado (Ancell 513-030), a uma concentração de 10 pg/mL a uma taxa de fluxo de 5 pL/min foi manualmente injetado nas Células de Fluxo-2, 3 e 4 para conseguir 3 densidades de superfície: Fc-2=150RU, Fc-3=375RU e Fc-4=580RU. As diferentes densidades de superfície foram preparadas para monitorizar a possibilidade de ligação limitada de transporte de massa durante a fase de associação e religação durante a dissociação, ambos artefactos que são influenciados pela densidade de superfície que devem ser evitados.

Uma diluição seriada dos anticorpos contra OX40R foram preparadas num intervalo de concentração de 666 nM a 66 pM por semi-logaritmos em tampão de processamento (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de polissorbato 20 (v/v) ) . A taxa de fluxo foi estabelecida a 5 pL/min e 25 pL de cada ponto de concentração de amostra foram injetados num chip sensor com uma injeção de regeneração de 5 μΐ de 50 mM de NaOH entre cada concentração de anticorpo injetado. O tempo de dissociação foi de 5 min. Os dados foram analisados utilizando BIAevaluation 3.0 global fit software (análise separada de cada ponto de concentração).

Caracterização de epitopo: células 300-19 que expressam uma construção de fusão recombinante 0X40 humana-CD40 correspondente a 1-235 da sequência de aminoácidos de 0X40 (dominio extracelular e transmembranar) e 216-278 da sequência de aminoácidos de CD40 (dominio intracelular) foi utilizada para análise de epitopos do anticorpo. A linha de células que expressam OX40-CD40 foi cultivada em meio RPMI (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% soro de vitela fetal (Hyclone, Logan, UT) , 10 mM de hepes, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol (Gibco, Grand Island, NY). As células 300-19.hCD134.2 (5xlOs/tubo) foram lavadas uma vez em 3 mL de tampão de lavagem (PBS, 2% de FBS e 0,02% de azida de sódio) . O sobrenadante de células foi aspirado e 100 pL de tampão de lavagem contendo 300 pg/mL de anticorpo primário reativo com 0X40 não conjugado foi adicionado ao precipitado de células, misturado e incubado durante 30 minutos a 4 °C. A seguir, um anticorpo secundário marcado com fluorocromo foi adicionado ao tubo, misturado e incubado por mais 30 minutos a 4 °C. Os anticorpos marcados com fluocromo reativo com 0X40 incluíam 10 mL de Ber Act 35 marcados com ficoeritrina (PE) (Caltag Laboratories, Burlingame, CA.), L106 marcados com PE (BD Pharmingen, San Jose, CA) ou anticorpo contra OX40R conjugado com Alexa Fluor 647. O anticorpo contra OX40R foi marcado com fluorocromo utilizando o kit de marcação de proteína Alex Fluor 647 como descrito pelo fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR). Após coloração, as células foram então lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, ressuspensas em tampão de lavagem frio e 10 000 eventos foram recolhidos e analisados utilizando um Becton Dickinson FACSCalibur e software

CellQuest (San Jose, CA) . Os anticorpos foram detetados como ligação ao mesmo epitopo quando o anticorpo primário bloqueou a coloração do anticorpo marcado com o fluorocromo secundário em mais de 80%.

Ensaio de Inibição de Anticorpo contra o Ligando QX40-QX40R: Os anticorpos foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a ligação das células 300-19 que expressam o ligando (L) 0X40 humano a placas revestidas com a proteína de fusão OX40-IgGl humana. A linha de células 300-19-OX40L foi cultivada em meio RPMI (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, UT) , 10 mM de HEPES, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 0,05 mM de 2-mercaptoetanol e 0,5 mg/mL de Geneticina (Gibco, Grand Island, NY) . A proteína de fusão OX40-IgGl humana contém os primeiros 220 aminoácidos da proteína extracelular 0X40. A proteína de fusão foi revestida em placas Nunc Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) em 100 pL/poço (5 pg/mL) em tampão de revestimento (BupH, tampão Carbonato-Bicarbonato, Pierce, Rockford, IL) e incubada durante a noite a 4 °C. A seguir, as placas foram transferidas em papel absorvente para remover o fluido, bloqueadas com 200 pL/poço com tampão de bloqueamento (5% de Leite de Cravos diluído em PBS) e incubadas à TA durante duas horas. As placas foram lavadas com PBS e várias diluições do anticorpo diluído em PBS foram então adicionados (50 pL/poço) ao ensaio em placa e incubada à TA durante 30 minutos. A seguir, 50 pL/poço de células em PBS a 6xl05/poço foram adicionadas aos poços contendo anticorpo e incubadas por mais 60 minutos a 37 °C numa câmara de CO2 a 5% humidificada. As placas foram gentilmente lavadas 2 vezes com PBS para remover as células não aderentes e a atividade das células nos poços foi medida por adição de 200 pL de uma solução a 20 pg/mL de Diacetato de Fluoresceína (Sigma, St. Louis, MO) em PBS a cada poço. As placas foram incubadas a 37 °C numa câmara de CO2 a 5% humidificada durante 90 minutos e lidas utilizando um espetrofotómetro a 490 (Spectra Max 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Ensaio de Seletividade do Anticorpo contra QX40R (ELISA): Placas Maxisorb de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 pL de proteínas de fusão do membro da família do recetor do TNFa humano a 0,25 pg/mL diluídas em tampão Carbonato BupH™, pH 9,4 (Pierce, Rockford, IL) e incubadas durante a noite a 4 °C. A seletividade das proteínas de fusão com o recetor testadas incluiu CD40-Ig (Alexis Biochemicals, San Diego, CA) , CD137-Ig (R&D Systems, Minneapolis, MN) e CD271-Ig (Alexis Biochemicals, San Diego, CA). Também incluído como o controlo positivo com cada ensaio foi a proteína de fusão OX40-Ig (construção interna, Bioexpress, 97/2117). As placas foram então lavadas três vezes com tampão de lavagem contendo 0,05% de Tween 20 (Sigma, St Louis, MO) diluído em PBS e bloqueado com 300 pL de 0,5% de BSA (Sigma, St Louis, MO) em PBS (Sigma, St Louis, MO) durante 1 hora à TA. A seguir, as placas foram lavadas e 100 pL/poço de anticorpos anti-humanos reativos com 0X40 foram adicionadas às placas em várias concentrações e incubadas durante 1 hora à TA. As placas foram exaustivamente lavadas três vezes e a ligação do anticorpo contra OX40R foi detetada com um anticorpo anti-cadeia capa humana marcada com peroxidase de rábano (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a 25 ng/mL durante 1 hora à TA. As placas foram então lavadas três vezes ao que se seguiu a adição de 100 pL/poço de substrato 1-Step Turbo-TMB (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos à TA. A reação foi interrompida pela adição de um igual volume de 2 M de H2SO4. A absorvência foi lida a 450 nm num Molecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Reatividade Cruzada das Espécies: Linhas de Células que Expressam QX40R: A linha de células 300-19 que expressa uma construção de fusão recombinante 0X40 humano-CD40 correspondente a 1-235 de OX40R (domínio extracelular e transmembranar) e 216-278 de CD40 (domínio intracelular) ou toda a proteína OX40R de cinomolgo.

Preparação de Linfócitos T Humanos: O sangue total humano foi colhido em seringas heparinizadas (Baxter; Deerfield, IL) e então imediatamente transferidas para tubos Sigma Accuspin (Sigma, St. Louis, MO) para o isolamento de células mononuclear do sangue periférico (PBMC) como descrito pelo fabricante. Os PBMCs foram lavados duas vezes com DPBS e os linfócitos T foram isolados utilizando um coluna de purificação de células T como descrito pelo fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN). Resumidamente, os PBMCs foram ressuspensos em 2 mL de tampão da coluna e aplicados numa coluna de isolamento de células T pré-lavada. Os PBMCs foram incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente e as células T foram eluidas com tampão da coluna, lavadas uma vez e ressuspensas em TCM a 2xlO6/mL consistindo em RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, UT) e L-glutamina (2 mM) , Hepes (10 mM) , penicilina (100 U/mL), estreptomicina (50 pg/mL) (Gibco, Grand Island,

NY . ). Um volume de 2 mL de células T contendo um anticorpo anti-CD28 humano a 1 pg/mL (clone 37407, R & D Systems, Minneapolis, MN) foi adicionado aos poços de uma placa de 24 poços pré-revestida com um clone UCTH1 de anticorpo anti-CD3 humano (R & D Systems, Minneapolis, MN) a 5 pg/mL em PBS. As culturas de células T foram estimuladas durante 3 dias antes de serem testadas para reatividade cruzada com 0X40 humano por citometria de fluxo.

Preparação de PBMCs de Cinomolgo: O sangue total de cinomolgo foi obtido utilizando tubos vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) e foi diluído 1:4 em PBS. O sangue total diluído foi misturado e 15 mL foi cuidadosamente disposto em camada sobre um igual volume de Histopaque 1077 (Sigma, St Louis, MO). Os tubos foram centrifugados a 1000 x g durante 45 minutos à TA e a interface de PBMCs mononucleares foi recolhida, lavada uma vez em PBS e ressuspensa durante 2 minutos à TA com tampão de lise ACK (Biosource, Rockville, MD) para remover quaisquer RBCs. Após uma lavagem com PBS, os PBMCs foram contados e reajustado a lxlO6/mL em meio de cultura de tecidos (TCM) . O TCM consistiu em RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone, Logan, UT) e L-glutamina (2 mM) , Hepes (10 mM) , penicilina (100 U/mL), estreptomicina (50 pg/mL) adquirido a Gibco (Grand Island, NY) . A seguir, 2 mL da preparação dos PBMC contendo anticorpo um anti-CD28 humano de reação cruzada (clone CD28.2, BD Biosciences, San Diego, CA) foram adicionados aos poços de uma placa de 24 poços (Costar,

Corning, NY) pré-revestida com um anticorpo anti-CD3 de macaco (clone FN18, Biosource, Camarillo, CA) a 10 pg/mL em PBS. As culturas de PBMC foram estimuladas durante 4 dias antes de terem sido testadas para reatividade cruzada com a 0X40 humana por citometria de fluxo.

Preparação de PBMCs de Coelho: O sangue total de coelho foi drenado para tubos vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) e imediatamente diluidos 1:3 com HBSS tépido (Gibco, Grand Island, NY) . Após mistura, 5 mL do sangue diluido foi cuidadosamente disposto em camada sobre um igual volume de Lympholyte-Rabbit (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) e centrifugados durante 30 minutos a 25 °C. A interface dos PBMC foi colhida, lavada duas vezes com PBS e ressuspensas a 2xlO6/mL em TCM contendo PHA a 10 ng/mL (Remei, Lenexa, KS). As células foram cultivadas durante 24-48 horas.

Preparação de PBMCs Caninos: Sangue total canino foi colhido utilizando tubos vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) . A seguir, o sangue foi misturado com um igual volume de HBSS tépido (Gibco, Grand Island, NY) . Quatro mL de sangue diluido foram lentamente dispostos em camada sobre 3 mL de Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) em tubos cónicos de 15 mL. Os tubos foram centrifugados durante 20 minutos a 800 x g e a interface de PBMC foi colhida, lavada duas vezes com HBSS e ressuspensa em TCM a 2 x 106/mL. Os PBMCs foram adicionados aos poços de uma placa de 24 poços (2 mL/poço) e as células foram estimuladas com 2 pg/mL de ConA (Sigma, St. Louis, MO) durante 48 horas.

Preparação de PBMCs de Murino e de Rato: 0 sangue total de rato colhido em seringas heparinizadas foi diluido 1:3 em HBSS tépido. A seguir, 5 mL foram cuidadosamente dispostos em camada sobre um volume igual de Linfócito-Rato (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY). Os tubos foram centrifugados durante 20 minutos a 1500 RPM. A interface de PBMCs foi recolhida, lavada duas vezes e o precipitado de células foi reajustado a 2xlO6/mL em TCM. Dois mL de células foram adicionados a cada poço de uma placa de 24 poços e estimulados durante 24-48 horas com PHA (Remei, Lenexa, KS) a 10 ng/mL antes da coloração de citometria de fluxo.

Coloração de citometria de Fluxo para Reatividade Cruzada de Espécies: Os PBMCs estimulados de murganho, rato, coelho, cão e cinomolgos e a linha de células 300-19 que expressa o recetor 0X40 de cinomolgos foram utilizados para testar a reatividade cruzada de espécies com anticorpo contra 0X40 humano. Os linfócitos T ativados que expressam 0X40 humano e as células 300-19 transduzidas com 0X40 foram utilizados como controlos positivos. As células (5,0xl05/tubo) foram lavadas uma vez em tampão de lavagem frio (PBS, 2% de FBS e 0,02% de azida de sódio) e foram adicionados 100 pL/tubo de controlo de conjugado com Alexa Fluor 647 ou anticorpos reativos com 0X40 a 5 pg/mL a cada tubo. Os anticorpos foram marcados utilizando um Alex Fluor 647 protein labeling kit como descrito pelo fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR) . As células foram incubadas no escuro com anticorpos com fluorocromo em gelo durante 30 minutos, lavadas três vezes e ressuspensas em 0,5 mL de tampão de lavagem para análise. A coloração do anticorpo foi medida e analisada utilizando um Becton Dickinson FACSCalibur e o software CellQuest (San Jose, CA).

Ensaio de Atividade de Luciferase: células T 293 contendo o dominio extracelular de 0X40 e o dominio intracelular de CD40 fundido com um repórter NfkB contendo luciferase foram preparadas. As células foram recolhidas, lavadas e ressuspensas em meio completo isento de vermelho de fenol (DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino, tampão HEPES, aminoácidos não essenciais e L-glutamina) a uma densidade de 0,5 X 106 células/mL. 80 pL de células foram plaqueados em cada poço de ensaio de uma placa de 96 poços (PerkinElmer, número de catálogo 6005680). Os anticorpos de teste foram adicionados a cada poço isolados ou na presença de um anticorpo de ligação cruzada Fab'de anti-IgG humano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). A placa foi incubada durante a noite a 37 °C. Foram adicionados 100 pL de luciferase (Promega, Bright-glo luciferassay System, Cat. # E2620) no dia seguinte e a quantidade de atividade de luciferase foi medida utilizando um contador de cintilações (TopCount, Packard -NXT).

Ensaio de IL-2 aCD3 IL-2 Humana: O sangue humano total foi recolhido em seringas heparinizadas (Baxter;

Deerfield, IL), disposto em camadas sobre tubos de Accuspin (Sigma; St. Louis, MO) e centrifugado durante 15 minutos a 2000 rpm's. A camada leucocitária foi recolhida, lavada com PBS (Sigma, St. Louis, MO), e os glóbulos vermelhos do sangue Usados com água. As células T foram separadas por colunas de enriquecimento em CD3+ humano (R&D; Minneapolis, MN) , contadas e ajustadas para 1 x 106/mL em meio RPMI (Gibco; Grand Island, NY) contendo: 10% de soro de vitela fetal (Hyclone; Logan, UT) , 10 mM de hepes, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 0,1 mM de aminoácidos não essenciais (todos da Gibco). Ao mesmo tempo, o clone #UCHT1 anti-CD3s humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi colocado a 2,5 mg/mL em PBS em placas de 24 poços (Costar; Corning, NY) e incubada durante 2 horas a 37 °C. As placas foram lavadas 3x com PBS e depois foram adicionados aos poços: células T a 1 x 106/poço, diluições seriadas de anticorpos contra 0X40 (ou IgG2 KLH de controlo) e F(ab')2 de anti-Fcy de IgG humano de cabra para ligação cruzada (adicionado a 2,5 pg/mL). Os sobrenadantes foram retirados às 48 e 72 horas e os niveis de IL-2 foram avaliados por ELISA (R&D).

Ensaio de IL-2 de aCD3 de Cinomolgo: foi recolhido sangue total de macaco Cinomolgo em tubos heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ), diluido 1:4 em PBS, disposto em camada sobre Histopaque 1077 (Sigma, St Louis, MO) e centrifugado durante 45 minutos a 2200 rpm's. A camada leucocitária foi recolhida, lavada com PBS, e os glóbulos vermelhos do sangue lisados com água. As células foram ajustadas a 1 x 106/ml e adicionadas a placas de 24 poços que tinham sido pré-revestidas durante 2 horas com concentrações variadas de anti-CD3 macaco, clone FN-18 (Biosource; Camarillo, CA) a 37 °C. As diluições seriadas do anticorpo 0X40 (ou IgG2 KLH de controlo) , assim como F(ab')2 anti-FcY de IgG humana de cabra a 2,5 pg/mL foram adicionados aos poços. Os sobrenadantes foram recolhidos às 24 e 48 horas e os niveis de IL-2 foram avaliados por ELISA (Biosource, Camarillo, CA).

Ensaio de Células T Iniciadas com Aloantigénio: As células T humanas isoladas de fresco (ver acima) foram incubadas com células de tumor (Raji) alogénicas tratadas com mitomicina c durante 3-4 dias. As células T foram então recolhidas, lavadas, e deixadas em repouso durante 1 dia em meio fresco antes da estimulação com 11D4. 0 nivel de IL-2 foi avaliado 24 horas depois por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). B.Procedimentos dos Estudos In vivo

Modelos de Tumor Humano SCID-bege Utilizando Murganhos Enxertado com células T e Células Dendriticas Humanas: Murganhos SCID-bege (Taconic #CBSBG-MM) foram aclimatizados durante 5-7 dias após chegada antes da utilização. Foram utilizadas as seguintes linhas de células de tumor: RAJI, ATCC #CCL-86; BT-474, ATCC #HTB-20; PC-3, ATCC#-1435; e LoVo, ATCC# CCL-229.

Os linfócitos T purificados (células T) e células dendriticas derivadas de monócitos foram preparadas a partir de sangue humano como se segue: Foram recolhidas células mononucleares humanas a partir de sangue heparinizado utilizando Tubos Sigma Accuspin #A7054. As células foram recolhidas, colocadas num frasco T75, e incubadas durante 3 h a 37 °C num incubador humidificado em CO2 a 5%. As células não aderentes foram recolhidas e guardadas (ver a seguir). 0 frasco contendo as células aderentes foi incubado com 20 mL de meio RPMI completo (contendo 10% de soro de vitela fetal) suplementado com IL-4 (R&D) a 10 ng/ml e GM-CSF (R&D) a 100 ng/mL. A cultura foi então incubada durante 6-7 dias a 37 °C numa incubadora humidificada em CO2 a 5%. Os monócitos não aderentes derivados de células dendriticas foram então recolhidos por decantação e lavagem do frasco várias vezes com meio RPMI completo.

As células mononucleares iniciais não aderentes foram utilizadas para purificar as células T via seleção negativa por elevada afinidade utilizando colunas de enriquecimento em células T (R&D) conforme instruções do fabricante. As células T purificadas são criopreservadas em Meio de Recuperação de Cultura de Células a 107/mL e armazenadas em azoto liquido até utilização. As células de tumor (1 x 107) foram injetadas subcutaneamente (SC) com células T (1 x 106) e células dendriticas derivadas de monócitos (5 x 105) do mesmo dador, a 0,2 mL/murganho. O crescimento de tumor foi monitorizado ao longo do tempo com craveira. C. Resultados para o anticorpo 11D4 (1) Estudos In Vitro:

Certas propriedades de anticorpo 11D4 de estudos in vitro estão resumidas na Tabela 3.

Anticorpo 11D4 liga-se ao OX40R com elevada afinidade.

Isto foi demonstrado utilizando uma proteina de fusão com IgGl contendo o dominio extracelular do OX40R e em células completas (células transfetadas OX40R+ e células T primárias ativadas). Em exemplos utilizando a proteina de fusão com IgGl, o 11D4 ligado ao dominio extracelular do OX40R com uma EC5o de 0,5 +/- 0,18 pg/mL (3,5 nM) . Esta ligação foi confirmada em células pré-B 300-19 que expressam o dominio extracelular de comprimento total do OX40R (não foi observada ligação nas células parentais 300-19) . A EC50 para a ligação a células transfetadas com OX40R foi de 0,2 +/- 0,16 pg/mL (1,7 nM). De modo a confirmar que a ligação foi observada em células T primárias, células T do sangue periférico foram isoladas a partir de múltiplos dadores humanos e estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 durante 2 dias para regular positivamente a expressão do OX40R. Os dados de saturação da ligação nestas células T indicaram que o 11D4 se liga com uma EC5o de 0,6 +/-1,0 pg/mL (4,0 nM, N = 17 dadores). Estes dados demonstram que o 11D4 se liga avidamente ao OX40R.

De modo ainda a caracterizar esta ligação, os dados foram recolhidos para avaliar a região no dominio extracelular do OX40R em que 11D4 interage e determina também se o recetor foi internalizado após a ligação. Os dados de ligação por competição da proteina de fusão de OX40R com IgGl indicaram que 11D4 compete para a ligação com as células que expressam o ligando 0X40 proporcionando evidência de que o 11D4 interage na região do recetor de ligação ao ligando. Adicionalmente, o 11D4 não compete de forma cruzada com dois anticorpos contra OX40R comercialmente disponíveis, BerAct35 e L106, para ligação a células T conforme avaliado por análise FACS. A análise FACS utilizando anticorpos de deteção não competitivos indicou que o OX40R não foi internalizado após a pré-incubação de células T primárias, ativadas com 11D4 durante 30 minutos. A sua afinidade de ligação, determinada por análise Biacore utilizando a proteina de fusão do dominio extracelular de OX40R como o ligando imobilizado, indicou que a constante de equilíbrio de dissociação (KD) de 11D4 para a ligação foi de 0,48 nM. Estas análises também estimaram uma constante da taxa de eliminação (kd) de 11D4 para ser 5,72 E-05 1/s. Deste modo, 11D4 liga-se com afinidade elevada à região de ligação ao ligando do OX40R, possui uma constante de taxa de eliminação lenta, e não internaliza o recetor após ligação.

Anticorpo 11D4 liga-se seletivamente ao OX40R. A seletividade de 11D4 para o OX40R foi avaliada contra outros membros da superfamilia TNFR utilizando dados relacionados com construções de proteína de fusão com IgGl contendo o respetivo domínio extracelular do recetor relacionado. Estes recetores incluíam o recetor CD40, recetor 4-1BB (CD137) e o recetor do fator de crescimento do nervo (CD271) . Em todos os casos, não foi observada ligação significativa em concentrações até 100 pg/mL (700 nM) nestes recetores. Quando comparada com a ligação observada à proteína de fusão com OX40R (EC5o =0,5 pg/mL), estes dados demonstraram que 11D4 é >100 vezes seletivo para o OX40R vs outros membros da família relacionados testados. (Ver Figuras la e lb).

Atividade Funcional do Anticorpo 11D4: A atividade funcional de 11D4 foi demonstrada em células transfetadas OX40R+ e em células T primárias. Nestes ensaios, 11D4 demonstrou atividade agonista quando adicionado a células com ou sem um anticorpo secundário, F(ab')2 de anti-FcY de IgG humana de cabra.

No primeiro conjunto de experiências, 11D4 foi avaliado quanto à atividade agonista utilizando células 293 transfetadas com o domínio extracelular e transmembranar do OX40R fundido com o domínio intracelular de CD40 com um repórter de luciferase NFkB. Neste ensaio, 11D4 estimulou a sinalização através do OX40R com uma média de EC50 de 0,33 mg/mL (2,2 nM, N = 4). Uma curva de resposta a concentração representativa da indução de luciferase por 11D4 é apresentada na Figura 2. Na ausência do anticorpo secundário F(ab')2z a magnitude da atividade de luciferase foi reduzida 4-vezes em conjunto com a EC50.

Como evidência adicional da atividade agonista de 11D4, as células T especificas do antigénio foram produzidas. As células T humanas isoladas foram incubadas com células de tumor (Raji) alogénicas tratadas com mitomicina c durante 3-4 dias. As células T foram então colhidas, lavadas, e repousaram durante 1 dia em meio fresco antes da estimulação com 11D4. A análise FACS indicou um elevado nivel de expressão de OX40R nestas células mesmo após o repouso. 0 11D4 induziu niveis elevados de IL-2 por estas células, em alguns casos excedendo 100 ng/mL (Figura 3). A EC50 média para esta resposta de 2 exemplos separados foi 0,008 +/- 0,006 pg/mL. Na ausência de 11D4, apenas niveis minimos de IL-2 foram segregados por estas células. O 11D4 também estimula a produção de IL-2 pelas células T primárias humanas estimuladas por anti-CD3. Embora a proporção de sinal para ruido neste ensaio foi baixa em alguns ensaios devido à indução de IL-2 por anti-CD3 isolado, 11D4 estimulou a produção de IL-2 quando adicionado com F(ab')2 de cabra anti-FcY de IgG humana. Não foi observada atividade para 11D4 em células T isoladas de fresco na ausência de anti-CD3. A magnitude do aumento de IL-2 por 11D4 variou entre 2,3 a 57-vezes vs. anti-CD3 isolado dependendo do dador e da quantidade de IL-2 produzida por anti-CD3. 0 efeito de 11D4 na produção de IL-2 por células T primárias humanas estimuladas com 2,5 pg/mL de anti-CD3 é representado na Figura 4 (utilizando uma curva de concentração de 8 pontos com diluições 1:3) . A EC50 média calculada a partir destes dados que utilizou curvas de resposta a concentração de 8 pontos foi 0,042 +/-0,01 pg/mL (ver Tabela 4) . A atividade funcional de 11D4 na produção de IL-2 foi também avaliada utilizando células de macaco estimuladas com anti-CD3 e 11D4 (em conjunto com anticorpo secundário F(ab')2)· Os resultados são representados na Figura 5 e Tabela 5. Estes dados indicaram que o EC50 para 11D4 foi semelhante entre células de macaco e humanas (0,022 vs 0,042 pg/mL para células humanas), mas a magnitude da IL-2 induzida acima da do anti-CD3 isolado foi significativamente inferior utilizando células T de Cinomolgo (aprox. 35-vezes, 5762 +/- 4748 pg/mL IL-2 para células humanas (N = 21) vs 261 +/- 294 pg/mL IL-2 para células de macaco (N = 9).

Reatividade Cruzada entre Espécies: O 11D4 foi avaliado quanto à sua capacidade para se ligar às células T de múltiplas espécies. As células T foram isoladas de murganho, rato, coelho, cão, e macaco e ativado com anti-CD3 mais anti-CD28 ou mitogénio. Não foi observada ligação a células de murganho, rato, coelho ou cão como indicado por análise FACS. A ausência de ligação ao OX40R de murganho foi também confirmada por ELISA utilizando uma proteina de fusão comercialmente disponível contendo o dominio extracelular do OX40R de murino. Em contraste, o 11D4 liga-se a células T de macaco Cinomolgo como determinado num ensaio de saturação de ligação por FACS. 0 intervalo de valores de EC50 valores obtido utilizando diferentes macacos é apresentado na Figura 6. Para comparação, o intervalo de valores de EC50 obtido utilizando células humanas é apresentado na Figura 7. Embora variável, o intervalo de valores de EC50 foi semelhante entre células de macaco e humanas (os valores médios são 0,354 pg/mL para macaco vs 0,566 pg/mL para células humanas). (2) Estudos In Vivo: A ausência de reatividade cruzada de 11D4 com o OX40R de murino necessitou do desenvolvimento de um modelo de tumor xenogénico utilizando murganhos Imunodeficientes Graves Combinados (SCID) beges. Os murganhos SCID-bege não possuem linfócitos T e B de murino e células NK o que os torna recetores ideais para o enxerto de células imunitárias humanas e para o crescimento de tumores humanos. Quatro linhas de células de tumor que representam diversos tipos de tumor foram testadas neste modelo in vivo. Nenhuma das linhas de tumor expressava OX40R. Em todos os casos, as células de tumor (1 x 107) foram injetados subcutaneamente (SC) com células T (1 x 106) e células dendriticas derivadas de monócitos (5 x 105) do mesmo dador. 0 11D4 administrado por injeção intraperi- toneal (IP) inibiu o crescimento de tumor até 98% nestes modelos como resumido na Tabela 6. A via de administração IP foi selecionada para o 11D4 devido à sua facilidade de administração e disseminação rápida no sangue periférico.

Eficácia de 11D4 Contra um Linfoma de Células B em Murganhos SCID-bege:

Os murganhos SCID-bege foram injetados SC com o linfoma de células B de Burkitt, Raji, em conjunto com células T humanas e células dendriticas derivadas de monócitos. Os murganhos receberam uma única injeção IP de 11D4 ou de um isotipo de anticorpo de controlo (IgG2 anti-KLH) na altura da injeção de tumor. Como apresentado na Figura 8, 11D4 diminuiu a taxa de crescimento de tumor em animais tratados. 0 tamanho de tumor em cada animal individual (N = 10) no dia 21 após exposição é apresentado na Figura 9, ilustrando 64% de inibição no crescimento de tumor através de um nivel de dose de 10 mg/kg. Não foi observada atividade na ausência de células T e células dendriticas.

Eficácia de 11D4 num Modelo de Tumor da Próstata:

Os murganhos SCID-bege foram injetados SC com o adenocarcinoma da próstata PC-3 em conjunto com células T humanas e células dendriticas derivadas de monócitos. Os murganhos receberam a única injeção IP de 11D4 ou de um isotipo de anticorpo de controlo (IgG2 anti-KLH) na altura da injeção de tumor. Os resultados, que são representados na Figura 10, mostram que tratamento com 11D4 resultou numa inibição dependente da dose do crescimento do tumor. O tamanho de tumor em cada animal individual (N = 10) neste estudo no dia 27 após exposição é apresentada na Figura 11, ilustrando uma inibição de 70% no crescimento de tumor quando os animais foram administrados numa injeção única de 1,0 mg/kg de 11D4, e 90% de inibição a uma dose de 10 mg/kg. Os niveis no plasma de 11D4 determinados no dia 27 nestes animais foram 6,2 pg/mL ao nivel da dose de 1,0 mg/kg.

Eficácia de 11D4 num Modelo de Tumor de Carcinoma do Cólon:

Os murganhos SCID-bege foram injetados SC com o adenocarcinoma colorretal LoVo em conjunto com linfócitos T humanos e células dendriticas derivadas de monócitos autólogas. Os murganhos receberam a única injeção IP de 11D4 ou de um anticorpo de controlo (IgG2 anti-KLH) na altura da injeção de tumor. Os resultados, que são representados na Figura 12, mostram que 11D4 diminuiu de forma dependente da dose o crescimento de tumor nestes animais. O tamanho de tumor em cada animal individual (N = 10) neste estudo no dia 27 após exposição é apresentada na Figura 13, ilustrando uma inibição de 64% no crescimento de tumor utilizando uma dose única de 1,0 mg/kg e uma inibição de crescimento de tumor de 87% a um nivel de dose de 10,0 mg/kg.

Eficácia de 11D4 num Modelo de Tumor de Carcinoma

Mamário

Os murganhos SCID-bege foram injetados SC com o carcinoma mamário BT474 em conjunto com linfócitos T humanos e células dendriticas derivadas de monócitos autólogas. Os murganhos receberam duas injeções (IP) de 11D4 ou de um anticorpo de controlo (IgG2 anti-KLH) na altura da injeção de tumor e de novo 30 dias depois. Os resultados, que são representados na Figura 14, mostram que

11D4 diminuiu o crescimento de tumor nestes animais. O tamanho de tumor em cada animal individual (N = 10) deste estudo no dia 85 após exposição é apresentada na Figura 15 ilustrando uma inibição de 98% no crescimento de tumor a um nivel de dose de 10,0 mg/kg e inibição de 85% a uma dose de 1 mg/kg. D. Resultados para o anticorpo 18D8 (1) Estudos In Vitro:

Os resultado dos estudos in vitro para o anticorpo 18D8 são resumidos na Tabela 7. O efeito do anticorpo 18D8 na produção de IL-2 induzida por anti-CD3 por células T primárias humanas de diferentes dadores é também apresentado na Tabela 8. (2) Estudos In Vivo:

Eficácia de 18D8 contra Linfoma de Células B num

Modelo de Murganhos SCID-bege

Os murganhos SCID-bege foram injetados SC com o linfoma de células B de Burkitt, Raji, em conjunto com linfócitos T humanos e células dendriticas derivadas de monócitos autólogas. Os murganhos receberam a única injeção IP de 18D8 ou de um isotipo controlo de anticorpo (IgG2 anti-KLH) na altura da injeção de tumor. Foram utilizados dez animais por grupo em cada estudo. Os resultados de dois estudos são apresentados na Tabela 9. Os resultados mostram que 18D8 produziu significativa eficácia anti-tumoral nas doses de 1,0 mg/kg e 10 mg/kg. Não foi observada atividade na ausência de células T e células dendriticas, sugerindo que este efeito anti-tumoral pode ser mediado de forma imunitária.

Eficácia de 18D8 contra Tumor da Próstata em

Modelos de Murganho SCID-bege

Os murganhos SCID-bege foram injetados SC com o adenocarcinoma PC-3 da próstata em conjunto com células T humanas e células dendriticas derivadas de monócitos autólogas. Os murganhos receberam uma única injeção IP de 18D8 ou um isotipo controlo do anticorpo (IgG2 anti-KLH) na altura da injeção de tumor. Foram utilizados no estudo dez animais por grupo. Os resultados são apresentados na Tabela 9. Os resultados mostram que o tratamento com 18D8 resultou numa inibição 42%, 90%, e 88% de crescimento de tumor nas doses de 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg, e 10 mg/kg, respetivamente.

INFORMAÇÃO DE DEPÓSITO

Os requerentes depositaram uma cultura de E. coli DHa5 contendo plasmideo que codifica a cadeia pesada do anticorpo 11D4 e uma cultura de E. coli DHa5 contendo plasmideo que codifica a cadeia leve do anticorpo 11D4 na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University

Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, em 10 de Julho de 2007, às quais foram atribuídos os números de depósito PTA-8524 e PTA-8525, respetivamente. Estes depósitos foram feitos nas condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para o Efeito de Processo de Patente e seus Regulamentos (Tratado de

Budapeste). Estes depósitos serão mantidos sem restrição do depositário ATCC durante um periodo de 30 anos, ou 5 anos após o pedido mais recente, ou durante o tempo efetivo de vida da patente, que é mais longo, e será substituído se os depósitos se tornarem não viáveis durante esse periodo. A disponibilidade dos materiais depositados não deve ser entendida como uma licença para praticar a invenção em contravenção dos direitos garantidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patente.

TABELA 1. Identificadores de Sequência para os Anticorpos 11D4 e 18D8

TABELA 3. Sumário de Certas Propriedades in vitro do

Anti nnmn 1 1 Γ)4

TABELA 4. Efeito do anticorpo 11D4 na Produção de IL-2

Induzida Dor Anti-CD3 Dor Células T Primárias Humanas

ΡΕ2242771 - 103 -

TABELA 5. Efeito do Anticorpo 11D4 na Produção de 11-2 Induzida por Anti-CD3 por Células T de Cinomolqos.

ΡΕ2242771 - 104 - (continuação)

Max IL-2: Quantidade de IL-2 produzida com 11D4 na ECmax sobre anti-CD3

Os valores para os últimos três dadores (33081, 33080, e 33062) na Tabela 6 são da curva de resposta a dose em 8-pontos de diluições 1:3. Todos os outros valores representam o log das curvas de diluição. A EC50 derivada destas curvas utilizando diluições 1:3 foi de 0,022 +/- 0,01; N = 3. TABELA 6. Inibição de Crescimento de Tumor pelo Anticorpo 11D4 em Murganhos SCID-bege Enxertados com Células T Humanas e Células Dendriticas

nd= não detetada

ΡΕ2242771 - 105 - TABELA 7. Resultados dos Estudos in vitro com o Anticorpo 18D8_

TABELA 8. Efeito do anticorpo 18D8 na Produção de IL-2 Induzida por Anti-CD3 por Células T Primárias Humanas.

ΡΕ2242771 - 106 - TABELA 9. Inibição de Crescimento de Tumor Humano pelo anticorpo 18D8 em Murganhos SCID-bege

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Pfizer Inc. e Medarex Inc.

<120> MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO RECETOR 0X40 HUMANO <130> PC33601 <160> 24 <170> Patentln versão 3.5 <210> 1 <211> 5

<212> PRT <213> Humano <400> 1

Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17

<212> PRT <213> Humano <400> 2

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de preparação de uma molécula de ligação isolada que se liga OX40R humano, compreendendo o método a expressão de uma sequência de aminoácidos da molécula de ligação numa célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores de expressão compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam a sequência de aminoácidos da molécula de ligação, em que a molécula de ligação compreende: A. (a) uma cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) uma cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) uma cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) uma cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) uma cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; e (f) uma cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou Β. (a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou C. (a) uma cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) uma cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (c) uma cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (d) uma cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (e) uma cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e (f) uma cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou D. (a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 .
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a molécula de ligação: (a) se liga ao OX40R humano com uma KD de 1 x IO-6 M ou inferior; e (b) possui atividade agonista do OX40R humano.
3. 3. Método de acordo com reivindicação 1 em que a molécula de ligação é um anticorpo humano.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a molécula de ligação é um anticorpo quimérico ou humanizado.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo se liga ao OX40R humano com uma KD de 100 nM ou inferior.
6. 6. Método de preparação de um anticorpo monoclonal humano isolado que se liga ao OX40R humano, compreendendo o método a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo DNA que codifica o anticorpo monoclonal, em que o anticorpo monoclonal compreende: (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; ou que compreende (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Lisboa, 23 de dezembro de 2014