KR20100102657A - 인간 ｏｘ４０ 수용체에 대한 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자, 이러한 결합 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 함유하는 숙주 세포, 이러한 결합 분자의 제조 방법, 이러한 결합 분자를 함유하는 제약 조성물, 및 이러한 결합 분자 또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

인간 ＯＸ４０ 수용체에 대한 결합 분자{BINDING MOLECULES TO THE HUMAN OX40 RECEPTOR}
본 출원은 미국 특허 가출원 번호 61/013947 (2007년 12월 14일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이는 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함된다.
공동 연구 협약
본원의 개시내용 및 청구항은 화이자 인코포레이티드(Pfizer Inc.)와 메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc.) 사이에 청구된 발명이 이루어진 날에 또는 이러한 날 전부터 효력을 지니는 공동 연구 협약의 범주 내에서 착수된 활동들의 결과로서 이루어졌다.
배경기술
본 개시내용은 항체, 특히 OX40 수용체에 결합하는 항체에 관한 것이다.
항-종양 T 세포 기능을 강화시키는 것은 암 치료를 위한 강력한 신규 접근법을 나타낸다. 효과적인 항-종양 T 세포 응답을 생성시키는 것과 관련된 결정적인 구성 요소는 CD4+ 헬퍼(helper) T 세포 활성을 강화시켜 세포용해성 항-종양 T 세포의 생성을 촉진하는 것, 및 메모리(memory) 및 이펙터(effector) T 세포에 생존 신호를 제공하는 것을 포함한다. 이러한 응답을 매개하는 것으로 나타난 주요 수용체는 OX40 수용체이다. [Sugamura, K., Ishii, N., Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev. Imm. 4: 420-431 (2004)]; [Hori, T. Roles of OX40 in the pathogenesis and control of diseases. Intn. J. Hematology. 83: 17-22 (2006)].
OX40 수용체 (OX40R) (CD134, TNFRSF4, ACT-4, ACT35, 및 TXGP1L로 또한 공지됨)는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. OX40R은 활성화된 CD4+ T-세포 상에서 발현되는 것으로 발견되었다. 높은 개수의 OX40R+ T 세포가 암 환자의 종양 (종양 침윤 림프구) 및 배수 림프절에서 증명되었다 ([Vetto, J.T. et al. 1997. Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph nodes cells from patients with melanoma and head and neck cancers. Am. J. Surg. 174: 258-265]; [Weinberg, A. D. et al. Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J. Immunol. 164: 2160-69 (2000)]; [Petty, J.K., et al. Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134). Am. J. Surg. 183: 512-518 (2002)]). 종양 프라이밍(priming) 동안 생체 내에서의 OX40R의 고용이 대조군으로 처리된 마우스에 비교하여 유의하게 종양 출현을 지연시키고 방지하였음이 마우스의 종양 모델에서 나타났다 ([Weinberg et al., 2000]). 따라서, OX40R 결합제의 사용을 통해 OX40R을 고용함으로써 항원에 대한 포유동물의 면역 응답을 강화시키는 것이 고려되었다 (WO 99/42585; [Weinberg et al., 2000]).
개요
본 개시내용은 OX40R 항체, OX40R 항체의 항원-결합 단편, 및 OX40R 항체의 유도체가 포함되는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 1×10-7 M 이하의 KD로 인간 OX40R에 결합하고, 인간 OX40R에 대한 효능제 활성을 갖는다. 일부 추가적인 실시양태에서, 결합 분자는 100 nM 이하의 KD로 인간 OX40R에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날(monoclonal) 항체이다.
본 개시내용은 하나 이상의 이러한 결합 분자, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 인간 모노클로날 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 조성물은 추가적인 제약 작용제, 예컨대 화학요법제, 면역요법제, 및 호르몬 치료제를 더 포함할 수 있다.
본 개시내용은 이러한 결합 분자를 사용하는 치료 및 진단 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물에게 치료상 유효량의 결합 분자 또는 결합 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물에게 치료상 유효량의 결합 분자 또는 결합 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 응답을 강화시키는 방법을 제공한다. 일부 특정 실시양태에서, 이러한 방법에서 사용된 결합 분자는 인간 모노클로날 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
본 개시내용은 결합 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자, 이같은 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 이러한 결합 분자의 제조 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 청구항이 포함되는 전체적인 명세서로부터 명백할 기타 양상들을 또한 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1a 및 1b는 항체 11D4가 OX40R에 특이적으로 결합한다는 것을 나타내는 그래프이다;
도 2는 OX40R-자극 루시퍼레이스 활성에 대한 가교 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 3은 동종항원으로 프라이밍된 T 세포에 의한 IL-2 생산에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 4는 1차 T 세포에 의한 항-CD3으로 유도된 IL-2 생산에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 5는 사이노몰거스(cynomolgus) 1차 T 세포에 의한 항-CD3으로 유도된 IL-2 생산에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 6은 항-CD3 및 항-CD28로 자극된 14마리의 도너(donor)로부터의 사이노몰거스 PBMC를 사용한 항체 11D4로의 포화 결합 곡선을 나타낸다;
도 7은 항-CD3 및 항-CD28로 자극된 17명의 도너로부터의 인간 PBMC를 사용한 항체 11D4로의 포화 결합 곡선을 나타낸다;
도 8은 SCID 마우스에서의 B 세포 림프종 Raji의 성장에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 9는 종양 주사 21일 후 B 세포 림프종 Raji의 성장에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 10은 SCID 마우스에서의 전립선 종양 PC-3의 성장에 대한 항체 11D4의 단일 주사의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 11은 종양 주사 27일 후 SCID 마우스에서의 전립선 종양 PC-3의 성장에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 12는 SCID 마우스에서의 결장 암종 LOVO의 성장에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 13은 종양 주사 25일 후 SCID 마우스에서의 결장 암종 LOVO의 성장에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 14는 SCID 마우스에서의 유방 종양 BT474의 성장에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다;
도 15는 SCID 마우스에서의 유방 종양 BT474의 성장에 대한 항체 11D4의 효과를 나타내는 그래프이다.
상세한 설명
정의
용어 "효능제"는 OX40R과의 결합 시, (1) OX40R을 자극 또는 활성화하거나, (2) OX40R의 활성, 기능 또는 존재를 강화, 증가, 촉진, 유도, 또는 연장하거나, 또는 (3) OX40R의 발현을 강화, 증가, 촉진 또는 유도하는 본원에 정의된 바와 같은 결합 분자를 지칭한다.
용어 "항체"는 각각의 쌍이 하나의 "경쇄" (L) 및 하나의 "중쇄" (H)를 갖는 2개의 동일한 쌍으로 전형적으로 구성되는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입(isotype)을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE으로 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 아미노산 약 12개 이상의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 아미노산 약 3개 이상의 "D" 영역을 또한 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. 항체의 불변 영역들은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 포함되는 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해지는 더욱 보존된 영역들이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 초가변성의 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역 (VH 및 VL)이 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 각각의 영역 또는 도메인에 대한 아미노산들의 할당은 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 [Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]; [Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다. 용어 "항체"는 항체 다량체 (다량체성 형태의 항체), 예컨대 단량체성 항체의 이량체, 삼량체, 또는 더욱 고차의 다량체의 일부인 항체를 포함한다. 비-항체 모이어티(moiety)에 연결 또는 부착되었거나, 또는 다른 방식으로 이러한 모이어티와 물리적 또는 기능적으로 회합된 항체가 또한 포함된다. 또한, 용어 "항체"는 항체를 생산하는 임의의 특정 방법에 의해 한정되지 않는다. 예를 들어, 이는 재조합 항체, 모노클로날 항체, 및 폴리클로날(polyclonal) 항체를 특히 포함한다.
"항체 유도체" 또는 항체의 "유도체"라는 용어는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, OX40R)과 동일한 항원에 결합할 수 있고 추가적인 분자 본체(entity)에 연결된 항체의 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다. 항체 유도체 내에 함유된 항체의 아미노산 서열은 전장 항체일 수 있거나, 또는 전장 항체의 임의의 일부분 또는 일부분들일 수 있다. 추가적인 분자 본체는 화학적 또는 생물학적 물질일 수 있다. 추가적인 분자 본체의 예로는 화학기, 아미노산, 펩티드, 단백질 (예컨대 효소, 항체), 및 화학적 화합물이 포함된다. 추가적인 분자 본체는, 예컨대 검출제, 표지, 마커, 제약 또는 치료 작용제로서 사용하기 위한, 임의의 유용성을 지닐 수 있다. 항체의 아미노산 서열은 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유결합 회합 또는 기타 방식에 의해 추가적인 본체에 부착 또는 연결될 수 있다. 용어 "항체 유도체"는 키메라 항체, 인간화 항체, 및 OX40R 항체의 아미노산 서열의 변형, 예컨대 보존 아미노산 치환, 부가 및 삽입으로부터 유래된 분자를 또한 포함한다.
항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, OX40R)과 동일한 항원에 결합하는 능력을 유지하는, 전장 항체의 하나 이상의 일부분을 지칭한다. 용어 "항원-결합 단편"은 항체의 일부분과 하나 이상의 추가적인 분자 본체의 공유결합 또는 비-공유결합 회합에 의해 형성된 거대 분자의 일부분인 항체의 일부분을 또한 포함한다. 추가적인 분자 본체의 예로는 아미노산, 펩티드, 또는 단백질, 예컨대 사량체성 scFv 분자를 만드는데 사용될 수 있는 스트렙타비딘 코어(core) 영역 ([Kipriyanov et al., (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101]), 시스테인 잔기, 마커 펩티드, 또는 2가의 비오티닐화 scFv 분자를 만드는데 사용될 수 있는 C-말단 폴리히스티딘 태그(tag) ([Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058])가 포함된다.
용어 "결합 분자"는 (1) 항체, (2) 항체의 항원-결합 단편, 및 (3) 항체의 유도체 (각각 본원에서 정의된 바와 같음)를 포함한다.
용어 "OX40R에 결합한다" 또는 "OX40R과의 결합"은 본원에서 정의된 바와 같은 결합 분자가 시험관내 분석법, 예컨대 BIAcore 분석법에서 OX40R에 결합하는 것을 지칭한다. 결합은 1×10-6 M 이하의 결합 친화력 (KD)을 의미한다.
용어 "키메라 항체"는 2가지 이상의 상이한 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 2가지 이상의 상이한 항체는 동일한 종 또는 2가지 이상의 상이한 종으로부터의 것일 수 있다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 2개의 아미노산 잔기의 측쇄 R 기의 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 경우의 한 아미노산 잔기의 또다른 아미노산 잔기로의 치환을 지칭한다. 유사한 화학적 성질의 측쇄가 있는 아미노산들의 군의 예로는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루타삼; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌이 포함된다. 보존적 아미노산 치환 군은, 예를 들어, 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민일 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 다른 방식으로 분자와 상호작용할 수 있는 항원의 일부분을 지칭한다. "에피토프"는 "항원 결정기"로 당업계에 또한 공지되어 있다. 일반적으로 에피토프는 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 군(grouping)으로 구성되고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형"일 수 있다. 일단 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어, 본원에 기술된 기술을 사용하여, 이러한 에피토프에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 항체의 생성 및 특성화가 원하는 에피토프에 대한 정보를 또한 해명할 수 있다. 그후, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에의 결합에 대해 항체들을 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체들, 즉, 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체들을 발견하기 위해 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 교차-경쟁을 기초로 항체들을 "비닝(binning)"하기 위한 고처리량 프로세스가 PCT 공개 번호 WO 03/48731에 기술되어 있다.
용어 "생식계열"은 어버이로부터 자손으로 생식 세포를 통해 계대되는 항체 유전자 및 유전자 절편의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 생식계열 서열은 B 세포 성숙 과정 동안 재조합 및 과다돌연변이 이벤트에 의해 변경된 성숙형 B 세포 내의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 구별된다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 내부로 도입된 세포를 지칭한다. 이 용어는 특정 대상 세포, 뿐만 아니라 이같은 세포의 후손을 또한 포함한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 특정 변형이 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이같은 후손은 어버이 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다. 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열의 아미노산 서열만으로 구성된 항체를 지칭한다. 인간 항체는 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우 뮤린(murine) 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 인간 항체 서열로부터 유래된 아미노산 잔기를 함유하는 키메라 항체를 지칭한다. 인간화 항체는, 항체의 프레임워크 및 불변 영역은 인간 항체 서열로부터 유래된 아미노산 잔기를 함유하는 한편, 비-인간 동물 항체로부터의 CDR의 일부 또는 모두를 함유할 수 있다.
용어 "포유동물"은 포유류 강의 임의의 동물 종을 지칭한다. 포유동물의 예로는 인간; 실험 동물 예컨대 래트, 마우스, 원숭이 및 기니피그; 가축 예컨대 고양이, 개, 토끼, 소, 양, 염소, 말 및 돼지; 및 포로 야생 동물 예컨대 사자, 호랑이, 코끼리 등이 포함된다.
용어 "단리된 핵산"은 핵산의 천연 공급원 내에 존재하는 또다른 핵산 분자로부터 분리된, 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 핵산 분자, 또는 이들의 조합물을 지칭한다. 예를 들어, 게놈 DNA와 관련하여, 용어 "단리된"은 게놈 DNA가 천연적으로 회합된 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, "단리된" 핵산에는 이러한 핵산이 유래되는 생물의 게놈 DNA 내에서 핵산에 천연적으로 플랭킹(flanking)된 서열 (즉, 관심 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)이 없다.
용어 "단리된 항체" 또는 "단리된 결합 분자"는 (1) 천연 상태에서 이에 동반되는 천연적으로 회합되는 성분과 회합되지 않았거나; (2) 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 없거나; (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나; 또는 (4) 천연에서 발생하지 않는 항체 또는 결합 분자를 지칭한다. 단리된 항체의 예로는 OX40R을 사용하여 친화력 정제된 OX40R 항체, 시험관 내에서 하이브리도마 또는 기타 세포주에 의해 생성된 OX40R 항체, 및 트랜스제닉(transgenic) 동물로부터 유래된 인간 OX40R 항체가 포함된다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하고, 리간드 (예컨대 항체)와 단백질 (예컨대 OX40R) 간의 결합 친화력을 기술하도록 사용된다. 평형 해리 상수가 작을수록, 리간드가 더욱 단단하게 결합되거나, 리간드와 단백질 간의 친화력이 더 높다. 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들어, BIACORE™ 시스템을 사용하여 KD를 측정할 수 있다. BIACORE™ 시스템을 사용하는 분석법 절차 (BIAcore 분석법)이 본 개시내용의 실시예 섹션에서 기술된다.
용어 "오프(off) 속도" 또는 "kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들어, BIACORE™을 사용하여해리 속도 상수를 측정할 수 있다.
용어 "OX40R 항체"는 인간 OX40R에 결합할 수 있는, 본원에서 정의된 바와 같은 항체를 지칭한다.
용어 "OX40 수용체" 및 "OX40R"은 본 출원에서 상호교환가능하게 사용되고, 인간 OX40R, 뿐만 아니라 이의 변이체, 이소형(isoform), 및 종 상동체를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 인간 결합 분자는, 특정 경우에, 인간 이외의 종으로부터의 OX40R에 또한 결합할 수 있다. 또다른 경우에, 결합 분자는 인간 OX40R에 대해 완전하게 특이적일 수 있고, 종 또는 또다른 유형의 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다.
결합 분자, 예를 들어, 항체와 이의 결합 파트너, 예를 들어 항원의 상호작용에 관하여, "인간 OX40R에 특이적으로 결합한다"라는 용어는, 시험관내 분석법에서 결정 시, CD40, CD137, 또는 CD271에의 결합에 대한 결합 분자의 KD가 인간 OX40R과의 결합에 대한 KD보다 100배를 초과한다는 것을 의미한다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에서 또다른 핵산 분자를 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 예로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 코스미드 또는 파지 벡터가 포함된다. 일부 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원이 있는 박테리아 벡터 및 에피솜성 포유류 벡터). 일부 벡터는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다 (예를 들어, 비-에피솜성 포유류 벡터). 특정 벡터들은 자신이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있고, 따라서 "발현 벡터"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 20개의 통상적인 아미노산 및 이들의 약칭은 통상적인 용법을 따른다. [Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991))] 참조.
인간 OX40R 에 결합하는 결합 분자
본 개시내용은 OX40R 항체, OX40R 항체의 항원-결합 단편, 및 OX40R 항체의 유도체가 포함되는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자를 제공한다. 이러한 결합 분자는 하기의 기능적 성질들 중 하나 이상에 의해 특성화된다: (a) 1×10-6 M 이하의 KD로 인간 OX40R에 결합함; (b) 인간 OX40R에 대한 효능제 활성을 지님; (c) 500 nM 이하의 농도의 CD40 수용체에 결합하지 않음; (d) 500 nM 이하의 농도의 CD137 수용체에 결합하지 않음; (e) 500 nM 이하의 농도의 CD271 수용체에 결합하지 않음; (f) 단리된 인간 T 세포에 의한 IL-2 생산을 강화시킬 수 있음; (g) 면역 응답을 강화시킬 수 있음; (h) 종양 세포 성장을 억제할 수 있음; 및 (i) 암에 대한 치료 효과가 있음. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 인간 OX40R에 1×10-7 M 이하, 또는 1×10-8 M 이하, 또는 5×1×10-9 M 이하의 KD로 결합한다.
인간 OX40R 항체
첫번째 일부 양상에서, 본 개시내용은 인간 OX40R에 결합하는 인간 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 인간 항체는 인간 OX40R에 100 nM 이하, 바람직하게는 10 nM 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, 인간 OX40R에 대한 효능제 활성을 지닌다. 이같은 인간 항체의 한 예는 인간 모노클로날 항체 11D4이다. 항체 11D4의 중쇄의 아미노산 서열 및 중쇄의 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열이 각각 서열 9 및 7에서 제시된다. 항체 11D4의 경쇄의 아미노산 서열 및 경쇄의 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열이 각각 서열 10 및 8에서 제시된다. 항체 11D4의 이소타입은 중쇄에 대해서는 IgG2, 경쇄에 대해서는 카파이다. 항체 11D4의 동종이형은 중쇄에 대해서는 G2(n-), 경쇄에 대해서는 Km3이다. 성숙형 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열은 발현 구축물 내의 DNA 서열의 개념적인 번역으로부터 유래된다. 항체 11D4는 중쇄 또는 경쇄 내에 프레임워크 돌연변이를 함유하지 않지만, 중쇄 CDR2 내에 하나의 돌연변이를 함유한다.
본 개시내용의 또다른 예시적인 항체는 인간 모노클로날 항체 18D8이다. 항체 18D8의 VH 영역 및 VL 영역의 아미노산 서열이 각각 서열 19 및 20에서 제시된다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 각각 서열 21 및 22에서 제시된다.
11D4 및 18D8이 OX40R에 결합한다는 것을 고려하여, 이들 각각의 VH 및 VL 서열이 또다른 OX40R 항체와 "혼합 및 매칭(matching)"되어 추가적인 항체가 생성될 수 있다. 이같은 "혼합 및 매칭"된 항체의 OX40R에 대한 결합을 실시예에 기술된 분석법이 포함되는 당업계에 공지된 결합 분석법을 사용하여 테스트할 수 있다. 한 경우에, VH 및 VL 영역이 혼합 및 매칭될 때, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열이 구조적으로 유사한 VH 서열로 교체된다. 유사하게, 또다른 경우에, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열이 구조적으로 유사한 VL 서열로 교체된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 항체 11D4 또는 18D8의 중쇄 가변 영역, (2) 서열 7 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는 (3) 서열 11 또는 23의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 OX40R 항체를 제공한다. 일부 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 항체 11D4 또는 18D8의 경쇄 가변 영역, (2) 서열 8 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (3) 서열 12 또는 24의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 OX40R 항체를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 11D4 또는 11D8의 중쇄 가변 영역 (VH)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 11D4의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3의 아미노산 서열이 각각 서열 1, 2, 및 3에서 제시된다. 항체 11D4의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3의 아미노산 서열이 각각 서열 4, 5, 및 6에서 제시된다. 항체 18D8의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3의 아미노산 서열이 각각 서열 13, 14, 및 15에서 제시된다. 항체 18D8의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3의 아미노산 서열이 각각 서열 16, 17, 및 18에서 제시된다. 카밧(Kabat) 시스템 ([Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242])을 사용하여 CDR 영역들이 서술된다.
11D4 및 18D8이 인간 OX40R에 결합하고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에 의해 제공된다는 것을 고려하여, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 "혼합 및 매칭"되어 추가적인 OX40R 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 상이한 OX40R 항체들로부터의 CDR들이 혼합 및 매칭될 수 있지만, 각각의 항체는 전형적으로 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 함유할 것이다. 이같은 "혼합 및 매칭"된 항체의 OX40R에 대한 결합을 상기 및 실시예에 기술된 결합 분석법 (예를 들어, ELISA, Biacore 분석)을 사용하여 테스트할 수 있다. 한 경우에, VH CDR 서열들이 혼합 및 매칭될 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열이 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체된다. 유사하게, VL CDR 서열들이 혼합 및 매칭될 때, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열이 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체된다. 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본원에 개시된 CDR 서열들로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 항체 11D4 또는 18D8의 VH CDR1, VH CDR2, 또는 VH CDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 모노클로날 항체를 제공한다. 일부 또다른 실시양태에서, 본 개시내용은 항체 11D4 또는 18D8의 VL CDR1, VL CDR2 또는 VL CDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 모노클로날 항체를 제공한다. 일부 추가적인 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 1 또는 13의 아미노산 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 1 또는 3과 상이한 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열 2 또는 14의 아미노산 서열 또는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 2 또는 14와 상이한 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 서열 3 또는 15의 아미노산 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 3 또는 15와 상이한 서열을 포함하는 VH CDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 모노클로날 항체를 제공한다.
일부 추가적인 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 4 또는 16의 아미노산 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 4 또는 16과 상이한 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열 5 또는 17의 아미노산 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 5 또는 17과 상이한 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열 6 또는 18의 아미노산 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열 6 또는 18과 상이한 서열을 포함하는 VL CDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 모노클로날 항체를 제공한다.
일부 경우에, OX40R 항체의 중쇄의 C-말단 라이신이 절단된다 ([Harris R. J., J. of Chromatography, 705: 129-134 (1995)]). OX40R 항체의 중쇄 및/또는 경쇄(들)은 신호 서열을 임의적으로 포함할 수 있다.
임의의 적절한 방법에 의해 OX40R 항체의 클래스 (예를 들어, IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD) 및 서브클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)가 결정될 수 있다. 일반적으로, 항체의 특정 클래스 및 서브클래스에 특이적인 항체를 사용하여 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정할 수 있다. 이같은 항체들이 시판된다. ELISA 또는 웨스턴 블롯(Western Blot), 뿐만 아니라 기타 기술에 의해 클래스 및 서브클래스를 결정할 수 있다. 별법적으로, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인 전체 또는 이의 일부를 서열분석하고, 이들의 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스 및 서브클래스의 공지된 아미노산 서열과 비교하고, 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정함으로써 클래스 및 서브클래스가 결정될 수 있다. OX40R 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD 분자일 수 있다. 예를 들어, OX40R 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브클래스인 IgG일 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 또다른 양상은 OX40R 항체의 클래스 또는 서브클래스를 또다른 클래스 또는 서브클래스로 전환시키는 방법을 제공한다. 일부 경우에, CL 또는 CH를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자가 당업계에 주지된 방법을 사용하여 단리된다. 그후, 이러한 핵산 분자가 원하는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스로부터의 CL 또는 CH를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 이는 상기 기술된 바와 같이, CL 또는 CH 사슬을 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 원래는 IgM인 OX40R 항체의 클래스를 IgG으로 전환시킬 수 있다. 또한, IgG 서브클래스를 또다른 IgG 서브클래스로, 예를 들어, IgG1에서 IgG2로 변환시키는데 클래스 전환이 사용될 수 있다. 원하는 이소타입을 포함하는 항체를 생산하기 위한 또다른 방법은 OX40R 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 및 OX40R 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산을 단리하는 단계, VH 영역을 코딩하는 서열을 단리하는 단계, VH 서열을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열에 결찰시키는 단계, 경쇄 유전자 및 중쇄 구축물을 세포에서 발현시키는 단계, 및 원하는 이소타입의 OX40R 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
항원-결합 단편
또다른 양상에서, 본 개시내용은 상기 본원에서 기술된 바와 같은 인간 OX40R 항체들 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단편은 (1) OX40R 항체의 경쇄; (2) OX40R 항체의 중쇄; (3) OX40R 항체의 경쇄로부터의 가변 영역; (4) OX40R 항체의 중쇄로부터의 가변 영역; (5) OX40R 항체의 하나 이상의 CDR (2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); 또는 (6) OX40R 항체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR로부터 선택된다. 일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 항체 11D4 또는 18D8의 항원-결합 단편을 제공한다. 또다른 일부 특정 실시양태에서, OX40R 항체의 항원-결합 단편은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 한쪽 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 ([Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 항체의 VH 영역에 연결된 항체의 VL 영역을 포함하는 폴리펩티드인 단일 사슬 항체 (scFv) ([Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883])를 포함한다. 항원-결합 단편은 동일한 중쇄 또는 동일한 경쇄로부터의 또는 상이한 사슬들로부터의 2개 이상의 더 짧은 단편을 또한 포함할 수 있다. 통상적인 기술, 예컨대 전체 항체의 파파인 또는 펩신 소화를 각각 사용하여 전체 항체로부터 Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항원-결합 단편을 제조할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 재조합 DNA 기술을 사용하여 이들을 또한 수득할 수 있다.
항체 유도체
일부 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 상기 본원에서 기술된 바와 같은 OX40R 항체들 중 임의의 것의 유도체를 제공한다.
한 특정 양상에서, 항체 유도체는 11D4 또는 18D8의 아미노산 서열의 변형으로부터 유래된다. 항체 사슬의 임의의 영역, 예컨대 프레임워크 영역, CDR 영역, 또는 불변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 무작위 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있고, 천연 아미노산, 뿐만 아니라 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다.
변형 유형에는 OX40R 항체의 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체 유도체는 중쇄 CDR 내의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산 치환 및/또는 경쇄 CDR 내의 1개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, OX40R 항체의 유도체는 인간 유전자의 생식계열 아미노산 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생식계열로부터의 이러한 치환 중 하나 이상은 중쇄의 CDR2 영역 내에 있다. 또다른 특정 실시양태에서, 생식계열에 관한 아미노산 치환은 항체 11D4 또는 18D8에서의 생식계열에 관한 치환과 동일한 위치 중 하나 이상에 있다. 또다른 실시양태에서, 아미노산 치환은 항체 내의 하나 이상의 시스테인을 또다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 시스테인은 정규 또는 비-정규 시스테인일 수 있다. 치환은 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 항체의 불변 도메인에서 이루어질 수 있다. 또다른 유형의 아미노산 치환은 잔기들 중 하나 또는 양쪽 모두를 변경시킴으로써, 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 또다른 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 한 실시양태에서, 항체 유도체에는 11D4 또는 18D8의 아미노산 서열에 관하여 중쇄 CDR 영역 내에 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환이 있다.
OX40R 항체의 또다른 유형의 변형은 항체의 원래의 글리코실화 패턴의 변경이다. 용어 "변경"은 항체 내에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 및/또는 항체 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 지칭한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 상기 기술된 트리펩티드 서열들 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우).
또다른 유형의 변형은 항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거를 수반하고, 이는 화학적으로 또는 효소에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 항체를 트리플루오로메탄술폰산 또는 등가의 화합물과 같은 화합물에 노출시키는 것을 필요로 한다. 이러한 처리는, 항체는 무손상으로 남겨두면서, 연결 당 (N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸갈락토스아민)을 제외한 대부분의 당 또는 모든 당의 절단을 초래한다. 화학적 탈글리코실화가 [Sojahr, H. T., and Bahl, O. P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57] 및 [Edge, A. S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137]에 기술되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 절단은 [Thotakura, N. R., and Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359]에 기술된 바와 같이 다양한 엔도(endo)- 및 엑소(exo)-글리코시데이스의 사용에 의해 달성될 수 있다.
기타 변형의 예로는 아세틸화, 아실화, 아미드화, 가교, 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유결합 가교의 형성, 시스틴의 형성, 포르밀화, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, PEG화, 단백질분해성 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 및 황산화가 포함된다.
추가적인 양상에서, 추가적인 분자 본체에 연결된, 본원에 기술된 바와 같은 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체 유도체가 제공된다. 추가적인 분자 본체의 예로는 제약 작용제, 펩티드 또는 단백질, 및 검출 작용제 또는 표지가 포함된다. OX40R 항체에 연결될 수 있는 제약 작용제의 구체적인 예로는 세포독성제 또는 기타 암 치료제, 및 방사성 동위원소가 포함된다. OX40R 항체에 연결될 수 있는 펩티드 또는 단백질의 구체적인 예로는 항체가 포함되고, 이는 동일한 OX40R 항체 또는 상이한 항체일 수 있다. OX40R 항체에 연결될 수 있는 검출 작용제 또는 표지의 구체적인 예로는 (1) 형광 화합물, 예컨대 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 파이코에리트린, 및 란탄계열 인광체; (2) 효소, 예컨대 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시데이스, 루시퍼레이스, 알칼리성 포스파테이스, 및 글루코스 산화효소; (3) 비오틴; (4) 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 정해진 폴리펩티드 에피토프, 예컨대 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 및 에피토프 태그가 포함된다. 특정 실시양태에서, 항체 유도체는 OX40R 항체의 다량체성 형태인 OX40R 항체 다량체, 예컨대 단량체성 항체의 항체 이량체, 삼량체, 또는 더욱 고차의 다량체일 수 있다. 항체 다량체 내의 개별적인 단량체들은 동일하거나 상이할 수 있고, 즉, 이들은 이종체성 또는 동종체성 항체 다량체일 수 있다. 다량체 내의 개별적인 항체들은 결합 특이성이 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 항체들의 천연 회합을 통해 항체들의 다량체화가 달성될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 제제 (예를 들어, 정제된 IgG1 분자)의 일부 백분율은 항체 동종이량체 및 기타 더욱 고차의 항체 다량체를 함유하는 단백질 응집물을 자발적으로 형성한다. 별법적으로, 당업계에 공지된 화학적 연결 기술을 통해, 예컨대 이종이관능성 가교제의 사용을 통해 항체 동종이량체가 형성될 수 있다. 적절한 가교제에는 적합한 스페이서에 의해 분리된 2개의 별도로 반응성인 기를 갖는 이종이관능성인 가교제 (예컨대 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 및 N-숙신이미딜 S-아세틸티오-아세테이트) 또는 동종이관능성인 가교제 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트)가 포함된다. 이같은 링커들이 피어스 케미컬 컴패니(Pierce Chemical Company) (Rockford, IL)로부터 시판된다. 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 통해 다량체화되도록 항체가 또한 제조될 수 있다.
또다른 양상에서, 항체 유도체는 상기 본원에 기술된 인간 OX40R 항체의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 한 예에서, 인간 OX40R 항체로부터의 하나 이상의 CDR이 비-인간 동물, 예컨대 마우스 또는 래트로부터의 항체로부터의 CDR과 조합된다. 또다른 예에서, 키메라 항체의 모든 CDR이 인간 OX40R 항체로부터 유래된다. 또다른 예에서, 하나를 초과하는 인간 OX40R 항체로부터의 CDR들이 키메라 항체에서 조합된다. 또한, 키메라 항체는 하나의 인간 OX40R 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 및 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 키메라 항체가 생성될 수 있다. 일부 특정 실시양태에서, 키메라 항체는 항체 11D4 또는 18D8로부터 선택된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역으로부터의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공되는 또다른 항체 유도체의 예로는 단일 사슬 항체, 디아바디(diabody), 도메인 항체, 나노바디(nanobody), 및 유니바디(unibody)가 포함된다 "단일 사슬 항체" (scFv)는 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되고, 이때 VL 도메인 및 VH 도메인은 1가 분자를 형성하도록 쌍을 이룬다. 당업계에 공지된 방법에 따라 단일 사슬 항체를 제조할 수 있다 (예를 들어, [Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). "디아바디"는 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 경쇄 가변 영역에 연결된 중쇄 가변 영역을 각각의 사슬이 포함하는 2개의 사슬로 구성되고, 이때 동일한 사슬 상의 2개의 영역은 서로 쌍을 이루지 않고, 또다른 사슬 상의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어 이중특이적 분자를 형성한다. 디아바디의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448], 및 [Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 도메인 항체 (dAb)는 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나의 가변 영역에 상응하는, 항체의 소형 기능성 결합 단위이다. 도메인 항체는 박테리아, 효모, 및 포유류 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체 및 이의 제조 방법의 추가적인 상세사항이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 유럽 특허 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609 참조). 나노바디는 항체의 중쇄로부터 유래된다. 전형적으로 나노바디는 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 포함하고, 원래의 항체의 항원-결합능을 유지한다. 당업계에 공지된 방법에 의해 나노바디를 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,765,087, 미국 특허 번호 6,838,254, WO 06/079372 참조). 유니바디는 IgG4 항체의 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄로 구성된다. IgG4 항체의 힌지 영역의 제거에 의해 유니바디를 제조할 수 있다. 유니바디 및 이의 제조 방법의 추가적인 상세사항을 WO2007/059782에서 확인할 수 있다.
결합 분자의 생산 방법
본원에 개시된 바와 같은 결합 분자를 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어, [Kohler and Milstein (Nature 256: 495, (1975))]의 표준 체세포 혼성화 기술, 뿐만 아니라 기타 기술 예컨대 B 림프구의 바이러스성 또는 종양발생성 형질전환이 포함되는 당업계에 공지된 기술에 의해 생산할 수 있다.
비-인간 동물의 면역화
본 개시내용은 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물을 OX40R 항원으로 면역화시키는 단계, 및 면역화된 동물 또는 면역화된 동물로부터 유래된 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법을 또한 제공한다.
적절한 비-인간 동물의 예로는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹(transchromosomic) 동물, 예컨대 HuMAb 마우스®, KM 마우스®, "TC 마우스", 및 제노마우스(Xenomouse)™이 포함된다. HuMAb 마우스® (Medarex, Inc.)는 내인성 μ 및 κ 사슬 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니유전자좌(minilocus)를 함유한다 (예를 들어, [Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 응답하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 진행되어 고친화력 인간 IgGκ 모노클로날 항체가 생성된다 (예를 들어, [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546] 참조). HuMAb 마우스®의 제조 및 사용, 및 이같은 마우스가 보유하는 게놈 변형이 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851] 참조). KM 마우스™은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하고, WO 02/43478에 상세하게 기술되어 있다. 제노마우스™ (Abgenix, Inc.)은 인간 면역글로불린 유전자좌의 대형 단편을 함유하고, 마우스 항체 생산이 부족하다. 이러한 동물 모델이 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584; 및 6,162,963 참조). "TC 마우스" 또한 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 양쪽 모두를 보유하도록 조작된 마우스이다. [Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 이같은 마우스가 기술되어 있다.
동물을 면역화시키는데 사용하기 위한 OX40R 항원은 단리 및/또는 정제된 OX40R일 수 있고, 바람직하게는 인간 OX40R이다. 한 실시양태에서, OX40R 항원은 인간 OX40R의 단편, 바람직하게는 OX40R의 세포외 도메인이다. 또다른 실시양태에서, OX40R 항원은 인간 OX40R의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단편이다. 또다른 실시양태에서, OX40R 항원은 자신의 세포 표면 상에 OX40R을 발현하는 세포, 더욱 특히 자신의 세포 표면 상에 OX40R을 과발현하는 세포이다. 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 동물의 면역화를 수행할 수 있다 (예를 들어, [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990] 참조). 비-인간 동물 예컨대 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말을 면역화시키기 위한 특정 방법들이 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, [Harlow and Lane (1990)]; 미국 특허 번호 5,994,619 참조). HuMab 마우스의 면역화 방법이 실시예 1에서 제공된다.
OX40R 항원으로의 동물의 면역화 후, 항체 및/또는 항체-생산 세포를 동물로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 동물로부터 혈청을 수득하고, 면역글로불린 분획을 혈청으로부터 수득할 수 있거나, 또는 OX40R 항체를 혈청으로부터 정제할 수 있다.
면역화된 동물로부터 단리된 세포로부터 제조된 항체-생산 불멸화 세포를 사용하여 OX40R 항체가 또한 생산될 수 있다. 면역화 후, 림프절 및/또는 지라 B 세포를 동물로부터 수집하고, 적절한 수단에 의해 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법은 이들을 종양유전자로 형질감염시키는 것, 이들을 종양발생성 바이러스로 감염시키고 이들을 불멸화된 세포를 선별하는 조건 하에 배양하는 것, 이들을 발암성 또는 돌연변이 화합물에 적용하는 것, 이들을 불멸화된 세포, 예를 들어, 골수종 세포와 융합하는 것, 및 종양 억제인자 유전자를 불활성화시키는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다 (예를 들어, [Harlow and Lane, 상기 문헌] 참조). 특정 실시양태에서, 면역화된 동물로부터 수집된 지라 B 세포가 불멸화된 골수종 세포에 융합되어, 항체-생산 불멸화 하이브리도마가 형성된다. 바람직하게는 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다 (비-분비성 세포주). 불멸화된 하이브리도마를 OX40 항원(예를 들어, OX40R, 이의 일부분, 또는 OX40R을 발현하는 세포)을 사용하여 스크리닝한다. 예를 들어, 효소-결합 면역분석법 (ELISA) 또는 방사선면역분석법을 사용하여, 초기의 스크리닝을 수행할 수 있다. ELISA 스크리닝의 예가 WO 00/37504에 기술되어 있다.
OX40R 항체-생산 세포, 예를 들어, 하이브리도마를 선별하고, 클로닝하고, 강건한(robust) 성장, 높은 항체 생산, 및 원하는 항체 특성 (하기에 추가로 논의됨)이 포함되는 원하는 특성에 대해 추가로 스크리닝한다. 하이브리도마가 생체 내에서 동계(syngeneic) 동물에서, 면역계가 없는 동물, 예를 들어, 누드(nude) 마우스에서, 또는 시험관 내에서 세포 배양물에서 확장될 수 있다.
따라서, (a) 비-인간 트랜스제닉 동물을 OX40R 항원으로 면역화시키는 단계; (b) 동물이 OX40R 항원에 대한 면역 응답을 개시하도록 하는 단계; (c) 동물로부터 항체-생산 세포를 단리하는 단계; 및 (d) 항체-생산 세포를 불멸화시키는 단계를 포함하는, 인간 모노클로날 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 세포의 생산 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 (e) 불멸화된 항체-생산 세포의 개별적인 모노클로날 집단을 생성시키는 단계; 및 (f) 원하는 OX40R 항체를 생산하는 불멸화된 항체-생산 세포를 스크리닝하는 단계를 더 포함한다.
OX40R 항체의 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 재조합 생산 방법
본 개시내용의 또다른 양상은 인간 OX40R에 결합하는 결합 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 이러한 핵산 분자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 무손상 항체의 임의의 일부분, 예컨대 CDR, 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역일 수 있거나, 또는 전장 중쇄 또는 경쇄일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 (1) 항체 11D4 또는 18D8의 CDR3 영역, 특히 중쇄 CDR3 영역; (2) 항체 11D4 또는 18D8의 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역; 또는 (3) 항체 11D4 또는 18D8의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 또다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 11, 12, 23, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용에 의해 제공되는 핵산 분자는 OX40R 항체를 생산하는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. OX40R 항체-생산 세포로부터의 mRNA를 표준 기술에 의해 단리하고, PCR 및 라이브러리 구축 기술에 의해 클로닝 및/또는 증폭하고, 표준 프로토콜을 사용하여 스크리닝하여, OX40R 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 수득할 수 있다. 이러한 mRNA는 항체 유전자의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 cDNA 클로닝에서 사용하기 위한 cDNA를 생산하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은, OX40R 항체를 발현하는 하이브리도마, 바람직하게는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물 세포를 자신의 융합 파트너 중 하나로서 지니는 하이브리도마로부터 핵산 분자가 수득된다. 또다른 실시양태에서, 비-인간, 비-트랜스제닉 동물로부터 하이브리도마가 유래된다.
OX40R 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 분자가 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 중쇄의 불변 영역을 코딩하는 핵산 분자와 융합함으로써 구축될 수 있다. 유사하게, OX40R 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자가 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 핵산 분자와 융합함으로써 구축될 수 있다. VH 절편이 벡터 내의 중쇄 불변 영역 (CH) 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내의 경쇄 불변 영역 (CL) 절편에 작동가능하게 연결되도록 VH 및 VL 사슬을 코딩하는 핵산 분자를 각각 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써, VH 및 VL 사슬을 코딩하는 핵산 분자들이 전장 항체 유전자로 변환될 수 있다. 별법적으로, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 VH 사슬을 코딩하는 핵산 분자를 CH 사슬을 코딩하는 핵산 분자에 연결, 예를 들어 결찰시킴으로써, VH 또는 VL 사슬을 코딩하는 핵산 분자가 전장 항체 유전자로 변환된다. VL 및 CL 사슬을 코딩하는 핵산 분자들을 사용하여 동일한 결과가 달성될 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991] 참조. 그후, 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자가 이들이 도입된 세포로부터 발현될 수 있고, OX40R 항체가 단리될 수 있다.
하기 기술된 바와 같이, 대량의 OX40R 항체를 재조합적으로 발현시키는데 핵산 분자가 사용될 수 있다. 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 본 개시내용에 의해 제공되는 또다른 결합 분자, 예컨대 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 면역부착소, 디아바디, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생산하는데 핵산 분자가 또한 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 분자가 특정 항체 서열에 대한 프로브 또는 PCR 프라이머로 사용된다. 예를 들어, 진단 방법에서 핵산 분자 프로브가 사용될 수 있거나, 또는 OX40R 항체의 가변 영역을 생산하는데 사용하기 위한 핵산 서열을 단리하기 위해 특히 사용될 수 있는 DNA의 영역을 증폭하는데 핵산 분자 PCR 프라이머가 사용될 수 있다.
일단 OX40R 항체의 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 분자가 수득되면, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자, 또는 scFv 유전자로 변환시키기 위해, 이러한 DNA 분자를 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 분자가 또다른 폴리펩티드, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결된다. 이러한 문맥에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 분자에 의해 코딩되는 아미노산 서열들이 인-프레임(in-frame)이도록 2개의 DNA 분자가 연결되는 것을 의미한다.
VH-코딩 DNA 분자를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA 분자가 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열이 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 불변 영역이다. IgG1 불변 영역 서열은 상이한 개체들 사이에서 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자 또는 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17) 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 동종이형들은 IgG1 불변 영역 내의 천연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩 DNA가 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 중쇄 유전자들 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
VL-코딩 DNA 분자를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA 분자가 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열이 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 상이한 개체들 사이에서 발생하는 것으로 공지된 다양한 대립유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2), 및 Inv(3) 중 임의의 것일 수 있다. 람다 불변 영역은 3개의 람다 유전자 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
scFv 유전자를 생성시키기 위해, VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결되면서 VH 및 VL 서열이 연속된 단일 사슬 단백질로서 발현될 수 있도록 VH- 및 VL-코딩 DNA 단편들이 가요성 링커를 코딩하는 또다른 단편, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결된다 (예를 들어, [Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554] 참조). 단일 사슬 항체는 단일 VH 및 VL만이 사용된 경우 1가일 수 있거나, 2개의 VH 및 VL이 사용된 경우 2가일 수 있거나, 2개를 초과하는 VH 및 VL이 사용된 경우 다가일 수 있다. OX40R 및 또다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 상기 본원에서 기술된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 핵산 분자는 경쇄 또는 중쇄의 일부분 (예컨대 CDR 또는 가변 영역), 전장 경쇄 또는 중쇄, 중쇄 또는 경쇄의 일부분 또는 전장을 포함하는 폴리펩티드, 또는 항체 유도체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 결합 분자를 발현시키기 위해, 부분적인 결합 분자 또는 전장 결합 분자를 코딩하는 DNA 분자를 이러한 DNA 분자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 이러한 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 DNA 분자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록 DNA 분자가 벡터 내로 결찰되는 것을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 혼화성이도록 선택된다. 발현 벡터에는, 예를 들어, 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 식물 바이러스 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러서, 코스미드, YAC, 및 EBV 유래 에피솜이 포함된다. 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 분자 및 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 분자는 분리된 벡터들 내로 삽입될 수 있거나, 동일한 벡터에 삽입될 수 있다. 임의의 적절한 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한 부위들의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활(blunt) 말단 결찰)에 의해 발현 벡터 내로 DNA 분자가 삽입된다.
적절한 발현 벡터의 예는 임의의 VH 또는 VL 서열이 삽입 및 발현될 수 있도록 조작된 적합한 제한 부위와 함께 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 사슬의 아미노산 서열의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 또한 코딩할 수 있다. 신호 펩티드가 항체 사슬의 아미노산 서열의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 항체 사슬의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA가 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
OX40R 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (항체 사슬 유전자)에 더하여, 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 조절 서열의 선택을 포함하는, 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인들에 좌우될 수 있다. 포유류 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열에는 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)), 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서, 및 강력한 포유류 프로모터 예컨대 천연 면역글로불린 및 액틴 프로모터가 포함된다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명을 위해, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,168,062, 4,510,245, 및 4,968,615를 참조한다.
항체 사슬 핵산 서열 및 조절 서열에 더하여, 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 및 선별성 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 선별성 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 사용), 네오마이신 포스포트랜스퍼레이스 유전자 (G418 선별용), 및 글루타메이트 신쎄테이스 유전자가 포함된다. 조절 서열의 선택이 포함되는 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 다수의 요인에 좌우될 수 있다. 결합 분자를 코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산을 포함하는 벡터가 결합 분자의 재조합 생산을 위해 적절한 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 아미노산 서열이 숙주 세포 내에서 발현되고, 전형적으로는 숙주 세포가 배양되는 배지 내로 분비되고, 이러한 배지로부터 아미노산 서열이 회수될 수 있도록, 적절한 숙주 세포가 결합 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 보유하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질전환된다. 숙주 세포의 형질전환은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455에 개시된 것들에 의해 수행될 수 있다.
숙주 세포는 포유류, 곤충, 식물, 박테리아 또는 효모 세포일 수 있다. 숙주 세포로 적절한 포유류 세포주의 예로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 기타 세포주가 포함된다. 곤충 세포주의 예로는 Sf9 또는 Sf21 세포가 포함된다. 식물 숙주 세포의 예로는 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등이 포함된다. 박테리아 숙주 세포에는 대장균 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종이 포함된다. 효모 숙주 세포의 예로는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)가 포함된다.
상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현되는 결합 분자의 아미노산 서열은 글리코실화가 상이할 수 있다. 그러나, 본원에서 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 본원에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 결합 분자는 결합 분자의 글리코실화와 관계 없이 본 발명의 일부이다.
또다른 양상에서, 본 개시내용은 파지 디스플레이를 사용하는 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 파지 상에서 인간 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, (b) 라이브러리를 OX40R 또는 이의 일부분으로 스크리닝하는 단계, (c) OX40R 또는 이의 일부분에 결합하는 파지를 단리하는 단계, 및 (d) 이러한 파지로부터 항체를 수득하는 단계를 포함한다. 항체의 라이브러리를 제조하기 위한 한 예시적인 방법은 (a) 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물을 OX40R 또는 이의 항원성 부분으로 면역화시켜 면역 응답을 생성시키는 단계; (b) 면역화된 동물로부터 항체-생산 세포를 추출하는 단계; (c) 추출된 세포로부터 OX40R 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 RNA를 단리하는 단계; (d) RNA를 역전사시켜 cDNA를 생산하는 단계; (e) cDNA를 증폭시키는 단계; 및 (f) 파지 상에서 항체가 발현되도록 파지 디스플레이 벡터 내로 cDNA를 삽입하는 단계를 포함한다. 조합형 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 재조합 인간 OX40R 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리할 수 있다. 라이브러리는 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성된 scFv 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 이같은 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법이 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리의 생성을 위한 키트가 시판된다 (예를 들어, <Pharmacia Recombinant Phage Antibody System> 카탈로그 번호 27-9400-01>; 및 <Stratagene SurfZAP™> 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612).
한 경우에, 원하는 특성이 있는 인간 OX40R 항체를 단리 및 생산하기 위해, 먼저 본원에 기술된 바와 같은 인간 OX40R 항체를 사용하여, OX40R에 대한 유사한 결합 활성이 있는 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 WO 93/06213에 기술된 에피토프 임프린팅(imprinting) 방법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 선별한다. 이러한 방법에서 사용된 항체 라이브러리는 WO 92/01047, [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]; 및 [Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이 제조 및 스크리닝된 scFv 라이브러리일 수 있다. 인간 CCR2를 항원으로 사용하여 scFv 항체 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
일단 최초의 인간 VL 및 VH 영역이 선택되면, 최초로 선택된 VL 및 VH 절편들의 여러 쌍들을 OX40R 결합에 대해 스크리닝하여 VL/VH 쌍 조합을 선택하는 "믹스 & 매치" 실험이 수행된다. 추가적으로, 항체의 품질을 더 개선하기 위해, VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 절편이 천연 면역 응답 동안 항체의 친화력 성숙을 담당하는 생체내 체세포 돌연변이 프로세스와 유사한 프로세스에서 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역 내에서 무작위로 돌연변이될 수 있다. 이러한 시험관내 친화력 성숙은 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 도메인을 증폭시킴으로써 달성될 수 있고, 이러한 프라이머들은 결과적인 PCR 생성물이 무작위 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 영역 내로 도입된 VH 및 VL 절편을 코딩하도록 특정 위치에서 4개의 뉴클레오티드 염기의 무작위 혼합물로 "스파이킹(spiking)"되어 있다. 이들 무작위 돌연변이된 VH 및 VL 절편은 OX40R과의 결합에 대해 다시 스크리닝될 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터의 OX40R 항체 또는 항원 결합 부분의 스크리닝 및 단리 후, 선택된 결합 분자를 코딩하는 핵산을 디스플레이 패키지로부터 (예를 들어, 파지 게놈으로부터) 회수하여, 재조합 DNA 기술에 의해 또다른 발현 벡터 내로 서브클로닝할 수 있다. 원한다면, 하기 기술된 바와 같이, 이러한 핵산을 추가로 조작하여 또다른 항체 형태를 생성시킬 수 있다. 조합형 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위해, 상기 기술된 바와 같이, 항체를 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터 내로 클로닝하여 포유류 숙주 세포 내로 도입한다.
제약 조성물
또다른 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공된 하나의 결합 분자 또는 결합 분자들의 조합물을 함유하고, 제약상 허용되는 담체를 임의적으로 함유하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 항체 11D4 또는 항체 18D8, 또는 어느 한쪽 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조성물은 항체 11D4 또는 항체 18D8의 유도체를 포함한다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 결합 분자의 전달을 위한 제형에서 사용하기에 적절한 임의의 불활성 물질을 지칭한다. 담체는 부착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 충전제 또는 희석제, 방부제 (예컨대 항산화제, 항균제 또는 항진균제), 감미료, 흡수 지연제, 습윤화제, 유화제, 완충제 등일 수 있다. 적절한 제약상 허용되는 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 덱스트로스, 식물성 오일 (예컨대 올리브 오일), 염수, 완충제, 완충 염수, 및 등장화제 예컨대 당, 폴리알콜, 소르비톨 및 염화나트륨이 포함된다.
조성물은 임의의 적절한 형태, 예컨대 액체, 반고체, 및 고체 투약 제형일 수 있다. 액체 투약 제형의 예로는 용액 (예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 마이크로에멀션, 리포솜, 분산액, 또는 현탁액이 포함된다. 고체 투약 제형의 예로는 정제, 알약, 캡슐, 마이크로캡슐, 및 분말이 포함된다. 결합 분자의 전달에 적절한 조성물의 특정 형태는 주사 또는 주입을 위한 무균성 액체, 예컨대 용액, 현탁액 또는 분산액이다. 필요한 양의 항체를 적합한 담체 내로 혼입한 후 무균성 미세여과함으로써 무균성 용액이 제조될 수 있다. 일반적으로, 항체를 기본적인 분산 매질 및 기타 담체를 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 무균성 액체의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 제조 방법은 이전의 무균성-여과 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 산출되는 진공 건조 및 냉동 건조(동결건조)를 포함한다. 당업계에 공지된 통상적인 기술에 의해 다양한 투약 제형의 조성물을 제조할 수 있다.
조성물 내에 포함되는 결합 분자의 상대적인 양은 사용된 특정 결합 분자 및 담체, 투약 제형, 및 원하는 방출 및 약역학 특성과 같은 다수의 요인들에 따라 변할 것이다. 일반적으로 단일 투약 제형의 결합 분자의 양은 치료 효과를 일으키는 양일 것이지만, 또한 더 적은 양일 수 있다. 일반적으로, 이러한 양은 투약 제형의 총 중량의 약 0.01 ％ 내지 약 99 ％, 약 0.1 ％ 내지 약 70 ％, 또는 약 1 ％ 내지 약 30 ％ 범위일 것이다.
결합 분자에 더하여, 하나 이상의 추가적인 치료제가 조성물 내에 포함될 수 있다. 추가적인 치료제의 예가 본원에서 하기에 기술된다. 조성물에 포함될 추가적인 치료제의 적절한 양은 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있고, 사용된 특정 작용제 및 담체, 투약 제형, 및 원하는 방출 및 약역학 특성과 같은 다수의 요인들에 따라 변할 것이다. 일반적으로 단일 투약 제형 내에 포함된 추가적인 치료제의 양은 작용제가 치료 효과를 일으키는 양일 것이지만, 또한 더 적은 양일 수 있다.
결합 분자 및 제약 조성물의 용도
본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자 및 결합 분자를 포함하는 제약 조성물은 치료, 진단 또는 기타 목적, 예컨대 면역 응답의 강화, 암 치료, 또다른 암 치료법의 효능 강화, 또는 백신 효능 강화에 유용하고, 의약 또는 진단제로서 사용하기 위한 것과 같은 다수의 용도가 있다. 따라서, 또다른 양상에서, 본 개시내용은 결합 분자 또는 제약 조성물의 사용 방법을 제공한다.
한 특정 양상에서, 포유동물에게 치료상 유효량의 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 면역 응답을 강화시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 포유동물은 인간이다. 추가적인 실시양태에서, 결합 분자는 항체 11D4 또는 항체 18D8, 또는 어느 한쪽 항체의 항원-결합 단편이다. 용어 "면역 응답 강화" 또는 이의 문법적인 변형은 포유동물의 면역계의 임의의 응답을 자극하거나, 유발하거나, 증가시키거나, 개선시키거나 증대시키는 것을 의미한다. 면역 응답은 세포성 응답 (즉, 세포-매개, 예컨대 세포독성 T 림프구 매개) 또는 체액성 응답 (즉, 항체 매개 응답)일 수 있고, 1차 또는 2차 면역 응답일 수 있다. 면역 응답의 강화의 예로는 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성 및 세포용해성 T 세포의 생성이 포함된다. 세포독성 T 림프구 분석법, 사이토카인의 방출 (예를 들어 IL-2 생산), 종양 퇴행, 종양이 있는 동물의 생존, 항체 생산, 면역 세포 증식, 세포 표면 마커의 발현, 및 세포독성을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 다수의 시험관내 또는 생체내 측정법을 사용하여 면역 응답의 강화를 평가할 수 있다. 전형적으로, 본 개시내용의 방법은 처치되지 않은 포유동물 또는 청구된 방법을 사용하여 처치되지 않은 동물에 의한 면역 응답과 비교했을 때 포유동물에 의한 면역 응답을 강화시킨다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 세포성 면역 응답, 특히 세포독성 T 세포 응답을 강화시킨다. 또다른 실시양태에서, 세포성 면역 응답은 T 헬퍼 세포 응답이다. 또다른 실시양태에서, 면역 응답은 사이토카인 생산, 특히 IL-2 생산이다.
또다른 특정 양상에서, 본 개시내용은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 용어 "암을 치료하는" 또는 "암의 치료"는 암으로 진단된 포유동물에서 바람직한 또는 이로운 효과를 야기하는 것을 지칭한다. 바람직한 또는 이로운 효과는 암 세포의 추가적인 성장 또는 확산의 억제, 암 세포의 사망, 암 재발의 억제, 암과 관련된 통증의 감소, 또는 동물의 개선된 생존을 포함할 수 있다. 암의 재발의 억제는 방사선, 화학요법, 수술 또는 기타 기술로 기존에 치료된 암 부위 및 주변 조직을 고려한다. 효과는 주관적 또는 객관적일 수 있다. 예를 들어, 동물이 인간인 경우, 인간은 개선된 활력 또는 활기 또는 감소된 통증을 치료법에 대한 응답 또는 개선의 주관적인 증상들로 주지할 수 있다. 별법적으로, 임상의가 신체 검사, 실험 파라메터, 종양 마커 또는 방사선사진 소견을 기초로 종양 크기 또는 종양 부하에서의 감소를 인지할 수 있다. 치료에 대한 응답에 대해 임상의가 관찰할 수 있는 일부 실험 신호는 백혈구 카운트, 적혈구 카운트, 혈소판 카운트, 적혈구 침강 속도, 및 다양한 효소 수준과 같은 테스트들의 표준화를 포함한다. 추가적으로, 임상의는 검출가능한 종양 마커에서의 감소를 관찰할 수 있다. 별법적으로, 또다른 테스트, 예컨대 초음파도, 핵 자기 공명 테스트 및 양성자 방출 테스트를 사용하여 객관적인 개선을 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 본 개시내용에 의해 제공되는 OX40R 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 추가적인 실시양태에서, 결합 분자는 항체 11D4 또는 18D8, 또는 어느 한쪽 항체의 항원-결합 단편이다. 추가적인 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
또다른 특정 양상에서, 본 개시내용은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 예방하는 방법을 제공한다. 용어 "암을 예방하는" 또는 "암의 예방"은 종양발생 또는 종양형성의 개시가 증명되지는 않았지만, 예를 들어 유전자 스크리닝에 의해 또는 다른 방식으로 결정되는지 여부와 관계 없이 암에 대한 소인이 확인된 포유동물에서 암의 발병을 지연시키거나, 억제하거나 또는 예방하는 것을 지칭한다. 이러한 용어는 전암성 용태의 포유동물을 치료하여, 전암성 용태의 악성으로의 진행을 정지시키거나 전암성 용태의 퇴행을 야기하는 것을 또한 포함한다. 전암성 용태의 예로는 과다형성, 형성이상, 및 화생이 포함된다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 본 개시내용에 의해 제공되는 OX40R 항체 또는 이의 단편이다. 추가적인 실시양태에서, 결합 분자는 항체 11D4 또는 18D8, 또는 어느 한쪽 항체의 항원-결합 단편이다. 추가적인 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
다양한 암 (악성 또는 양성, 및 원발성 및 속발성)이 본 개시내용에 의해 제공되는 방법으로 치료 또는 예방될 수 있다. 이같은 암의 예로는 폐암 예컨대 기관지원성 암종 (예를 들어, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 대세포 암종, 및 선암종), 폐포 세포 암종, 기관지 선종, 연골성 과오종 (비-암성), 및 육종 (암성); 심장암 예컨대 점액종, 섬유종, 및 가로무늬근종; 골암 예컨대 뼈연골종, 연골종, 연골모세포종, 연골점액유사 섬유종, 유골 골종, 거대 세포 종양, 연골육종, 다발골수종, 골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 유잉(Ewing) 종양 (유잉 육종), 및 그물 세포 육종; 뇌암 예컨대 신경아교종 (예를 들어, 다형성 아교모세포종), 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 속질모세포종, 척삭종, 신경집종, 뇌실막세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 송과체종, 골종, 혈관모세포종, 두개인두종, 척삭종, 종자세포종, 기형종, 피부모양 기형낭종 및 혈관종; 소화계의 암 예컨대 평활근종, 표피양 암종, 선암종, 평활근육종, 위 선암종, 장 지방종, 장 신경섬유종, 장 섬유종, 대장 폴립, 및 결장직장암; 간암 예컨대 간세포 선종, 혈관종, 간세포 암종, 섬유층판 암종, 담관 암종, 간모세포종 및 혈관육종; 신장암 예컨대 신장 선암종, 신세포 암종, 부신종, 및 신우의 전이성 세포 암종; 방광암; 혈액암 예컨대 급성 림프구성 (림프모구성) 백혈병, 급성 골수성 (골수구성, 골수, 골수모구성, 골수단구성) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (예를 들어, 세자리(Sezary) 증후군) 및 모발상 세포 백혈병), 만성 골수구성 (골수성, 골수, 과립구성) 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 림프종, 비-호지킨 림프종, B 세포 림프종, 균상식육종 및 골수증식성 장애 (진성 적혈구증가증, 골수섬유증, 고혈소판증 및 만성 골수구성 백혈병과 같은 골수증식성 장애가 포함됨); 피부암 예컨대 기저세포 암종, 편평세포 암종, 흑색종, 카포시(Kaposi) 육종 및 파젯(Paget) 질환; 두경부암; 눈-관련 암 예컨대 망막모세포종 및 안내 악성흑색종; 남성 생식계 암 예컨대 양성 전립선 비대증, 전립선암 및 고환암 (예를 들어, 고환종, 기형종, 배아 암종 및 융모막 암종); 유방암; 여성 생식계 암 예컨대 자궁암 (자궁내막 암종), 자궁경부암(자궁경부 암종), 난소의 암 (난소 암종), 외음부 암종, 질 암종, 자궁관 암 및 포상기태; 갑상선암 (유두상, 소포성, 역형성 또는 수질성 암 포함); 크롬친화세포종 (부신); 부갑상선의 비-암성 성장; 췌장암; 및 혈액암 예컨대 백혈병, 골수종, 비-호지킨 림프종, 및 호지킨 림프종이 포함된다.
치료 방법의 실행에서, 결합 분자는 단독요법으로서 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 치료법과 조합되어 투여될 수 있다. 따라서, 또다른 양상에서, 본 개시내용은 하나 이상의 추가적인 치료법 또는 치료제와 조합된 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 포함하는 조합 요법을 제공한다. 용어 "추가적인 치료법"은 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 치료제로서 사용하지 않는 치료법을 지칭한다. 용어 "추가적인 치료제"는 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자 이외의 임의의 치료제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 항체 11D4 또는 18D8, 또는 어느 한쪽 항체의 항원-결합 단편이다. 한 특정 양상에서, 본 개시내용은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하기 위한 조합 요법을 제공한다. 추가적인 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
광범위한 암 치료제가 결합 분자와 조합되어 사용될 수 있다. 당업자는 본 개시내용의 방법 및 결합 분자와 조합되어 사용될 수 있고, 본원에 기재된 치료법 형태에 한정되지 않을 또다른 암 치료법의 존재 및 발달을 인지할 것이다. 암을 치료하기 위해 조합 요법에서 사용될 수 있는 추가적인 치료제의 카테고리의 예로는 (1) 화학요법제, (2) 면역요법제, 및 (3) 호르몬 치료제가 포함된다.
용어 "화학요법제"는 암 세포의 사망을 야기할 수 있거나, 또는 암 세포의 성장, 분열, 복구 및/또는 기능을 방해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 지칭한다. 화학요법제의 예로는 WO 2006/088639, WO 2006/129163, 및 US 20060153808에 개시된 것들이 포함되고, 이들의 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다. 특정 화학요법제의 예로는 (1) 알킬화제, 예컨대 클로람부실 (LEUKERAN), 사이클로포스파미드 (CYTOXAN), 이포스파미드 (IFEX), 메클로레타민 히드로클로라이드 (MUSTARGEN), 티오테파 (THIOPLEX), 스트렙토조토신 (ZANOSAR), 카르무스틴 (BICNU, GLIADEL WAFER), 로무스틴 (CEENU), 및 다카르바진 (DTIC-DOME); (2) 알칼로이드 또는 식물 빈카 알칼로이드 (세포독성 항생제 포함), 예컨대 독소루비신 (ADRIAMYCIN), 에피루비신 (ELLENCE, PHARMORUBICIN), 다우노루비신 (CERUBIDINE, DAUNOXOME), 네모루비신, 이다루비신 (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS), 미톡산트론 (DHAD, N0VANTR0NE), 닥티노마이신 (악티노마이신 D, COSMEGEN), 플리카마이신 (MITHRACIN), 마이토마이신 (MUTAMYCIN), 및 블레오마이신 (BLENOXANE), 비노렐빈 타르트레이트 (NAVELBINE)), 빈블라스틴 (VELBAN), 빈크리스틴 (ONCOVIN), 및 빈데신 (ELDISINE); (3) 항-대사물질, 예컨대 카페시타빈 (XELODA), 사이타라빈 (CYTOSAR-U), 플루다라빈 (FLUDARA), 젬시타빈 (GEMZAR), 수산화요소 (HYDRA), 메토트렉세이트 (FOLEX, MEXATE, TREXALL), 넬라라빈 (ARRANON), 트리메트렉세이트 (NEUTREXIN), 및 페메트렉세드 (ALIMTA); (4) 피리미딘 길항제, 예컨대 5-플루오로우라실 (5-FU); 카페시타빈 (XELODA), 랄티트렉세드 (TOMUDEX), 테가푸르-우라실 (UFTORAL), 및 젬시타빈 (GEMZAR); (5) 탁산, 예컨대 도세탁셀 (TAXOTERE), 파클리탁셀 (TAXOL); (6) 백금 약물, 예컨대 시스플라틴 (PLATINOL) 및 카르보플라틴 (PARAPLATIN), 및 옥살리플라틴 (ELOXATIN); (7) 토포아이소머레이스 억제제, 예컨대 이리노테칸 (CAMPTOSAR), 토포테칸 (HYCAMTIN), 에토포시드 (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR), 및 테니포시드 (VUMON); (8) 에피포도필로톡신 (포도필로톡신 유도체), 예컨대 에토포시드 (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR); (9) 엽산 유도체, 예컨대 류코보린 (WELLCOVORIN); (10) 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴 (BiCNU), 로무스틴 (CeeNU); (11) 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 (IGFR), 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR), 및 혈소판-유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)가 포함되는 수용체 타이로신 카이네이스의 억제제, 예컨대 제피티닙 (IRESSA), 에를로티닙 (TARCEVA), 보르테조밉 (VELCADE), 이매티닙 메실레이트 (GLEEVEC), 제네피티닙, 라파티닙, 소라페닙, 탈리도미드, 수니티닙 (SUTENT), 악시티닙, 리툭시맵, 트라스투주맵 (HERCEPTIN), 세툭시맵 (ERBITUX), 베바시주맵 (AVASTIN), 및 라니비주맵 (LUCENTIS), lym-1 (ONCOLYM), WO2002/053596에 논의된 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)에 대한 항체; (12) 혈관형성 억제제, 예컨대 베바시주맵 (AVASTIN), 수라민 (GERMANIN), 안지오스타틴, SU5416, 탈리도미드, 및 매트릭스 메탈로프로티네이스 억제제 (예컨대 바티마스탯 및 마리마스탯), 및 WO2002055106에 개시된 것들; 및 (13) 프로테오솜 억제제, 예컨대 보르테조밉 (VELCADE)이 포함된다.
용어 "면역요법제"는 포유동물의 면역 응답을 강화할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 지칭한다. 면역요법제의 예로는 바실루스 칼메트-게랭 (BCG: bacillus Calmette-Guerin); 사이토카인 예컨대 인터페론; 백신 예컨대 마이백스(MyVax) 개인화 면역요법, 오니백스(Onyvax)-P, 옹코페이지(Oncophage), GRNVAC1, FavId, 프로벤지(Provenge), GVAX, 로박신(Lovaxin) C, BiovaxID, GMXX, 및 NeuVax; 및 항체 예컨대 알렘투주맵 (CAMPATH), 베바시주맵 (AVASTIN), 세툭시맵 (ERBITUX), 젬투주맵 오조가마이신 (MYLOTARG), 이브리투모맵 티욱세탄 (ZEVALIN), 파니투무맵 (VECTIBIX), 리툭시맵 (RITUXAN, MABTHERA), 트라스투주맵 (HERCEPTIN), 토시투모맵 (BEXXAR), 트레멜리무맵, CAT-3888, 및 WO2003/040170에 개시된 CD40 수용체에 대한 효능제 항체가 포함된다.
용어 "호르몬 치료제"는 호르몬의 생산을 억제 또는 제거하거나, 암성 세포의 성장 및/또는 생존에 대한 호르몬의 효과를 억제 또는 중화하는 화학적 또는 생물학적 물질을 지칭한다. 본원에서의 방법에 적절한 이같은 호르몬 치료제의 예로는 US20070117809에 개시된 것들이 포함된다. 특정 호르몬 치료제의 예로는 타목시펜 (NOLVADEX), 토레미펜 (Fareston), 풀베스트란트 (FASLODEX), 아나스트로졸 (ARIMIDEX), 엑세메스탄 (AROMASIN), 레트로졸 (FEMARA), 메제스트롤 아세테이트 (MEGACE), 고세렐린 (ZOLADEX), 및 류프롤리드 (LUPRON)가 포함된다. 또한 본 개시내용의 결합 분자는 (1) 호르몬의 생산에 참여하는 기관 또는 샘, 예컨대 난소, 고환, 부신, 및 뇌하수체의 전체 또는 일부분을 제거하는 수술 방법 및 (2) 환자의 기관 또는 샘에 표적화된 호르몬의 생산을 억제 또는 제거하는데 충분한 양으로 방사선을 적용하는 방사선 치료와 같은 비-약물 호르몬 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
암을 치료하기 위한 조합 요법은 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자와 종양을 제거하기 위한 수술의 조합을 또한 포함한다. 결합 분자는 수술 전, 수술 동안 또는 수술 후에 포유동물에게 투여될 수 있다.
암을 치료하기 위한 조합 요법은 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자와 방사선 요법, 예컨대 이온화 (전자기) 방사선요법 (예를 들어, X선 또는 감마선) 및 입자 빔 방사선 요법 (예를 들어, 높은 선형 에너지 방사선)의 조합을 또한 포함한다. 방사선의 공급원은 포유동물에 대해 외부 또는 내부일 수 있다. 결합 분자는 방사선 요법 전에, 방사선 요법 동안 또는 방사선 요법 후에 포유동물에게 투여될 수 있다.
결합 분자 및 조성물의 투여
본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자 및 조성물은 임의의 적절한 장 투여 경로 또는 비경구 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 용어 "장 경로" 투여는 위장관의 임의의 부분을 통한 투여를 지칭한다. 장 경로의 예로는 경구, 점막, 볼, 및 직장 경로, 또는 위내 경로가 포함된다. "비경구 경로" 투여는 장 경로 이외의 투여 경로를 지칭한다. 비경구 투여 경로의 예로는 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 종양내, 방광내, 동맥내, 수막강내, 낭내, 안와내, 심장내, 경기관, 관절내, 낭하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉골내, 피하, 또는 국소 투여가 포함된다. 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예컨대 경구 섭취, 코위(nasogastric) 관, 위창냄술 관, 주사, 주입, 이식성 주입 펌프, 및 삼투압 펌프에 의해 본 개시내용의 항체 및 조성물을 투여할 수 있다. 적절한 투여 경로 및 방법은 사용된 특정 항체, 원하는 흡수 속도, 사용된 특정 제형 또는 투약 형태, 치료될 장애의 유형 또는 중증도, 특정 작용 부위, 및 환자의 용태와 같은 다수의 요인에 따라 변할 수 있고, 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
결합 분자의 "치료상 유효량"이라는 용어는 의도된 치료 목적에 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, 면역 응답 강화의 문맥에서, "치료상 유효량"은 포유동물의 면역계의 임의의 응답을 자극하거나, 유발하거나, 증가시키거나, 개선시키거나 증대시키는데 효과적인 임의의 양이다. 암 치료의 문맥에서, "치료상 유효량"은 치료되는 포유동물에서 임의의 바람직한 또는 이로운 효과, 예컨대 암 세포의 추가적인 성장 또는 확산의 억제, 암 세포의 사망, 암 재발의 억제, 암과 관련된 통증의 감소, 또는 포유동물의 개선된 생존을 야기하는데 충분한 임의의 양이다. 암 예방 방법에서, "치료상 유효량"은 결합 분자가 투여되는 포유동물에서 암의 발병을 지연시키거나, 억제하거나, 또는 예방하는데 효과적인 임의의 양이다. 결합 분자의 치료상 유효량은 일반적으로 포유동물의 체중 1 ㎏ 당 약 0.001 내지 약 500 ㎎/㎏, 더욱 일반적으로는 약 0.05 내지 약 100 ㎎/㎏의 범위이다. 예를 들어, 치료상 유효량은 포유동물의 체중 1 ㎏ 당 약 0.3 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 또는 100 ㎎/㎏일 수 있다. 일부 실시양태에서, OX40R 항체의 치료상 유효량은 포유동물의 체중 1 ㎏ 당 약 0.1 - 30 ㎎/㎏의 범위이다. 투여될 정확한 투여량 수준은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 다수의 요인, 예컨대 치료될 장애의 유형 및 중증도, 사용된 특정 결합 분자, 투여 경로, 투여 시간, 치료 기간, 사용된 특정한 추가적인 요법, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 기존의 병력, 및 의학 분야에 주지된 유사한 요인들에 좌우될 것이다.
결합 분자 또는 조성물은 일반적으로 여러 번 투여된다. 단일 투약들 사이의 간격은, 예를 들어, 매주, 매월, 매 3개월 또는 매년일 수 있다. 예시적인 치료 계획은 1주일에 1번, 2주일에 1번, 3주일에 1번, 4주일에 1번, 1개월에 1번, 3개월에 1번, 또는 3개월 내지 6개월에 1번의 투여를 수반한다. OX40R 항체에 대한 전형적인 투여량은 하기의 투약 일정 중 하나를 사용하는, 정맥내 투여를 통한 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎ 또는 체중 1 ㎏ 당 3 ㎎을 포함한다: (i) 6회의 투약은 매 4주, 그후에는 매 3개월; (ii) 매 3주; (iii) 1회의 체중 1 ㎏ 당 3 ㎎에 이어서 매 3주마다 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎.
실시예
실시예 1 : OX40R 항체의 제조
본 개시내용에 따른 예시적인 항체들을 하기와 같이 제조, 선별 및 분석하였따:
OX40R 항원으로의 면역화 및 OX40R 모노클로날 항체를 생산하는 마우스의 선별:
OX40R에 대한 완전히 인간형인 모노클로날 항체를 인간 Ig 트랜스제닉 마우스 품종인 HCo7, HCo12, Hco17, 및 Hco27, 뿐만 아니라 인간 트랜스크로모소멀/트랜스제닉 품종인 KM (Medarex, Inc.)을 사용하여 제조하였다. 이러한 품종들은 모두 인간으로부터 단리된 항체와 구별할 수 없는 완전히 인간형인 항체를 발현한다.
트랜스제닉 품종에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자 및 내인성 마우스 중쇄 유전자 양쪽 모두가 각각 [Chen et al. (1993) EMBO J. 12:821-830] 및 WO 01/09187의 실시예 1에 기술된 바와 같이 동종접합에 의해 파괴되었다. 또한, 이들은 [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기술된 바와 같이 인간 카파 경쇄 트랜스진인 KCo5를 보유한다. 반면에, 트랜스제닉 품종들은 이들의 인간 중쇄 유전자와 관하여 별개이다. HCo7 계통은 미국 특허 번호 5,545,806; 5,625,825; 및 5,545,807에 기술된 바와 같이 HCo7 인간 중쇄 트랜스진을 보유하고, HCo12 품종은 WO 01/09187의 실시예 2에 기술된 바와 같이 HCo12 인간 중쇄 트랜스진을 보유하며, HCo17 품종은 US 2005/0191293A1 (Deshpande 등)의 실시예 8에 기술된 바와 같이 HCo17 인간 중쇄 트랜스진을 보유하고, Hco27 품종은 PCT/US2008/072640 (2008년 8월 8일 출원)의 실시예 5에 기술된 바와 같이 Hco27 인간 중쇄 트랜스진을 보유한다. KM 품종은 [Ishida et al., (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102]에 기술된 바와 같이 인간 미니-염색체를 함유한다.
HuMab 마우스에 관한 일반적인 면역화 계획이 [Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859]; [Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851]; 및 PCT 공보 WO 98/24884에 기술되어 있다.
HCo7, HCo12, Hco17, Hco27 및 KM 품종의 HuMab 마우스들을 6-16주령에 시작하여 15-25 ㎍의 정제된 인간 재조합 OX40R-Ig 단백질 및 리비(Ribi) 애주번트 내의 인간 OX40R을 발현하도록 형질감염된 뮤린 프리(pre)-B 세포주 300-19 ([Reth, M. G. et al., Nature 312 29: 418-42, 1984]; [Alt, F. et al., Cell 27: 381-390, 1981])로 면역화시켰다. 정제된 인간 재조합 OX40R-Ig 단백질은 인간 IgG1의 불변 영역에 융합된 인간 OX40R의 세포외 도메인 (아미노산 1-220)의 구축물이다. 복강내 주사, 피하 주사 또는 발바닥 내로의 주사를 통해 3-28일 간격으로 총 10회 이하의 면역화로 투여하였다. 면역 응답을 하기 기술된 바와 같이 ELISA 및 FACS 스크리닝을 통해 모니터링하였다.
OX40R 항체를 생산하는 HuMab 마우스의 선별:
OX40R에 결합하는 항체를 생산하는 HuMab 마우스를 선별하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 혈액을 수득하고, 정제된 인간 OX40R 재조합 단백질에의 특이적 결합에 대해 ELISA에 의해, 그리고 전장 인간 OX40R을 발현하는 세포주에는 결합하지만 OX40R을 발현하지 않는 대조군 세포주에는 결합하지 않는 것에 대해 FACS에 의해 분석하였다.
ELISA 결합 분석법은 [Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851]에 기술된 바와 같았다. 간략하게, 미량역가 플레이트를 PBS 내의 1 ㎍/㎖의 정제된 재조합 OX40R-Ig 용액으로 50 ㎕/웰로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그후, 200 ㎕/웰의 PBS/트윈(Tween) (0.05％) 내의 5％ 닭 혈청을 사용하여 웰을 차단하였다. OX40R-면역화 마우스로부터의 혈장의 희석물을 각각의 웰에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/트윈으로 세정한 후, 양고추냉이 과산화효소 (HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG Fc 폴리클로날 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세정 후, 플레이트를 ABTS 기질 (Moss Inc., 제품 #: ABTS-1000 ㎎/㎖)로 발색시키고, OD 405에서 분광광도계에 의해 분석하였다.
FACS 분석법을 통상적인 절차에 따라 수행하였다. 간략하게, OX40R-발현 300-19 세포를 1:20으로 희석된 면역화된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 세포들을 세정하고, 특이적 항체 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. FACS 유동 세포측정법 기구 (Becton Dickinson (San Jose, CA)) 상에서 유동 세포측정 분석을 수행하였다.
가장 높은 역가의 OX40R 항체가 발달된 마우스를 융합에 사용하였다. 하기에 기술된 바와 같이 융합을 수행하였고, 하이브리도마 상등액을 ELISA 및 FACS에 의해 항-OX40R 활성에 대해 테스트하였다.
OX40R 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성:
상기에서 선택된 마우스를 OX40R-Ig로 제3일에, 그리고 다시 제2일에 부스팅(boosting)시킨 후, 희생시키고 지라 및/또는 림프절을 제거하였다.
면역화된 HuMab 또는 KM 마우스로부터 단리된 지라세포 및/또는 림프절 림프구를 표준 프로토콜 또는 제조사가 권장하는 프로토콜에 따라 전기융합 (E-fusion, Cyto Pulse™ technology, Cyto Pulse™ Sciences, Inc. (Glen Burnie, MD))을 사용하여 SP2/0 비-분비형 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL-1581)에 융합시켰다. 간략하게, 면역화된 마우스로부터의 지라세포 및/또는 림프절 림프구의 단일 세포 현탁액을 제조한 후, 동일한 개수의 SP2/0 비-분비형 마우스 골수종 세포와 합쳤다; 그후, E-융합을 수행하였다.
그후, 세포를 2×104개의 세포/웰로 편평 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅하고, 10％ 소 태아 혈청, 10％ P388D1 (ATCC, CRL-TIB-63) 컨디셔닝 배지, DMEM 내의 3-5％ (IGEN) (Mediatech (Herndon, VA), 카탈로그 번호 CRL 10013, 고농도의 글루코스, L-글루타민 및 피루브산나트륨이 있음), 7 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 0.1 IU/㎖ 페니실린 - 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 및 1× HAT (Sigma, 카탈로그 번호 CRL-P-7185)를 함유하는 선별 배지에서 10-14일 동안 인큐베이션하였다.
1-2주 후, 세포를 HAT가 HT로 교체된 배지에서 배양하였다. 세포를 플레이팅하고 나서 약 10-14일 후, 개별적인 웰들로부터의 상등액을 인간 감마, 카파 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. 그후, 인간 감마, 카파에 대해 양성으로 채점된 상등액을 ELISA 및 FACS (상기 기술된 프로토콜을 사용함)에 의해 인간 OX40R 모노클로날 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 24웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 인간 OX40R IgG 모노클로날 항체에 대해 양성으로 확인되면, 한계 희석에 의해 2회 이상 서브클로닝하였다. 그후, 안정적인 서브클론을 시험관 내에서 배양하여, 추가적인 특성화를 위한 조직 배양 배지 내의 소량의 항체가 생성되었다.
실시예 2: 생물학적/약리학적 실시예
A. 시험관내 연구 절차:
OX40R 의 세포외 도메인에 대한 결합: 인간 OX40-Ig 융합 단백질을 BupH™ 카르보네이트 완충제, pH 9.4 (Pierce (Rockford, IL))에 희석하고, 96웰 맥시솝(Maxisorb) 플레이트 (Nunc (Roskilde, Denmark)) 상에 100 ㎕/웰 (0.25 ㎍/㎖)로 코팅하고, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS (Sigma (St Louis, MO))에 희석된 0.05％ 트윈 20 (Sigma (St Louis, MO))을 함유하는 세정 완충제로 3회 세정하고, 300 ㎕/웰의 PBS 내의 0.5％ BSA (Sigma (St Louis, MO))로 1시간 동안 RT0에서 차단하였다. 이어서, 플레이트를 세정하고, 다양한 농도의 차단 완충제 내에 희석된 항-인간 OX40 반응성 항체 (100 ㎕/웰)와 함께 1시간 동안 RT0에서 인큐베이션하였다. 그후, 플레이트를 세정하고, 1시간 동안 RT0에서 차단 완충제 내의 25 ng/㎖의 양고추냉이 과산화효소-표지 항-인간 카파 사슬 항체 (Bethyl Laboratories (Montgomery, TX))와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 분석법 플레이트를 세정하고, 100 ㎕/웰의 1-스텝(Step) 터보(Turbo)-TMB 기질 (Pierce (Rockford, IL))을 30분 동안 RT0에서 첨가하였다. 동일한 부피의 2M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 정지시키고, <Molecular Devices Spectra Max 340> (Molecular Devices (Sunnyvale, CA)) 상에서 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
세포 표면 OX40R 에 대한 FACS 를 기반으로 하는 결합: OX40R-발현 세포주 (하기 참조) 또는 활성화된 1차 말초혈 단핵 세포 (하기 참조)를 사용하여 인간 및 사이노몰거스 OX40 수용체 양쪽 모두에 대한 결합을 평가하였다. 세포들을 수확하고, RT0에서 세정 완충제를 사용하여 세정하였다 (5×105개/튜브). 세정 완충제는 PBS, 2％ 열-불활성화 소 태아 혈청 (Hyclone (Logan, UT)) 및 0.02％ 아지드화나트륨 (Sigma (St. Louis, MO))으로 구성되었다. 이어서, 100 ㎕의 다양한 농도의 항체를 0.005 ㎎/㎖의 사이토칼라신 B (Sigma (St. Louis, MO))을 함유하는 세정 완충제에 희석된 세포에 첨가하였다 (30 ㎍/㎖에서 시작하여, 3배 적정을 사용함). 세포를 RT0에서 3시간 동안 부드럽게 진동시켰다. 이어서, 세포를 2회 세정하고, 0.5 ㎖/튜브로 저온 세정 완충제로 재현탁시키고, 10,000개의 이벤트를 수집하고, 벡톤 디킨슨 팩스캘리버(Becton Dickinson FACSCalibur) 및 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다.
Biacore 분석법: 바이오센서(Biosensor) 생체특이적(biospecific) 상호작용 분석 기구 (BIAcore 2000)는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 CM5 센서 칩 상에서의 분자 상호작용을 측정한다. 센서 칩의 덱스트란 측면에 대한 분자의 상호작용에 의해 야기된, 유리 및 카르복시메틸화 덱스트란의 2개의 매질 사이의 굴절 지수에서의 변화가 측정되고, 제조사의 애플리케이션 노트에 상술된 임의의 반사율 단위 (RU)에서의 변화로 보고된다.
CM5 센서 칩 상의 카르복시메틸화 덱스트란 표면이 7분 동안 0.2 M N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필) 카르보디이미드에 의해 매개된 0.05 M N-히드록시숙신이미드로의 유도체화에 의해 활성화되었다. 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5) 내의 500 ㎍/㎖ 농도의 스트렙타비딘 (Sigma S-4762)이 5 ㎕/분의 속도로 3개의 표면 (유동 세포-2, 3 및 4) 상에 주입되었고, 2500 RU로 유동 세포 표면에 공유결합으로 고정되었다. 고정 동안 35 ㎕의 10 mM 아세트산나트륨 완충제를 항원 대신 유동 세포 1에 주입하여, 비-특이적 결합을 측정하기 위한 활성화된 공백 표면을 제조하였다. 모두 4개의 유동 세포 상의 미반응 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 탈활성화를 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드 (pH 8.5)를 사용하여 수행하였다. 고정 후, 안정적인 기준선이 달성될 때까지 5 ㎕의 50 mM NaOH의 5회의 재생 주입으로 유동 세포에서 모든 미반응 물질 또는 불량하게 결합된 물질을 제거하였다.
10 ㎍/㎖ 농도, 5 ㎕/분 유속의 비오티닐화 CD134-muIg (Ancell 513-030)를 유동 세포-2, 3 및 4에 수동으로 주입하여, 3가지 표면 밀도를 달성하였다: Fc-2 = 150 RU, Fc-3 = 375 RU 및 Fc-4 = 580 RU. 상이한 밀도 표면들을 제조하여, 회합 단계 동안의 질량 전달 제한 결합 및 해리 동안의 재결합의 가능성을 모니터링하였고, 이들은 방지되어야 하는 표면 밀도에 의해 영향을 받는 허상들이다.
러닝(running) 완충제 (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ 폴리소르베이트 20 (v/v))에서 하프 로그(half log)에 의해 666 nM 내지 66 pM의 농도 범위에 걸쳐 OX40R 항체의 일련의 희석물을 제조하였다. 유속은 5 ㎕/분으로 설정되었고, 각각의 농도의 항체를 주입하는 사이에 5 ㎕의 50 mM NaOH를 재생 주입하면서 25 ㎕의 각각의 농도 지점의 샘플을 센서 칩 상에 주입하였다. 해리 시간은 5분이었다. BIAevaluation 3.0 글로벌 피트 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다 (각각의 농도 지점의 개별적인 분석).
에피토프 특성화: OX40의 1-235 아미노산 서열 (세포외 및 막횡단 도메인) 및 CD40의 216-278 아미노산 서열 (세포내 도메인)에 상응하는 재조합 인간 OX40-CD40 융합 구축물을 발현하는 300-19 세포가 항체 에피토프 분석에 사용되었다. OX40-CD40 발현 세포주를 10％ 송아지 태아 혈청 (Hyclone (Logan, UT)), 10 mM HEPES, 1％ 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산 및 0.05 mM 2-메르캅토에탄올 (Gibco (Grand Island, NY))이 보충된 RPMI 배지 (Gibco (Grand Island, NY))에서 성장시켰다. 300-19.hCD134.2 세포 (5×105개/튜브)를 3 ㎖의 저온 세정 완충제 (PBS, 2％ FBS 및 0.02％ 아지드화 나트륨)에서 1회 세정하였다. 세포 상등액을 흡인하고, 300 ㎍/㎖의 1차 미접합 OX40 반응성 항체를 함유하는 세정 완충제 100 ㎕를 세포 펠렛에 첨가하고, 혼합하고, 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플루오로크롬-표지 2차 항체를 튜브에 첨가하고, 혼합하고, 추가로 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. OX40 반응성 플루오로크롬-표지 항체는 10 ㎕의 파이코에리트린 (PE)-표지 Ber Act 35 (Caltag Laboratories (Burlingame, CA.)), PE-표지 L106 (BD Pharmingen (San Jose, CA)) 또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647-접합 OX40R 항체를 포함하였다. OX40R 항체를 제조사 (Molecular Probes (Eugene, OR))가 기술한 바와 같이 알렉사 플루오르 647 단백질 표지 키트를 사용하여 플루오로크롬으로 표지하였다. 염색 후, 세포를 세정 완충제로 3회 세정하고, 저온 세정 완충제에 재현탁시키고, 10,000개의 이벤트를 수집하고, 벡톤 디킨슨 팩스캘리버 및 셀퀘스트 소프트웨어 (San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. 1차 항체가 2차 플루오로크롬-표지 항체의 염색을 80％를 초과하여 차단한 경우 항체들이 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주되었다.
항체 OX40 리간드 - OX40R 억제 분석법: 항체들을 인간-OX40 리간드 (L)를 발현하는 300-19 세포가 OX40-인간 IgG1 융합 단백질이 코팅된 플레이트에 결합하는 것을 차단하는 능력에 대해 테스트하였다. 300-19-OX40L 세포주를 10％ 송아지 태아 혈청 (Hyclone (Logan, UT)), 10 mM HEPES, 1％ 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 0.05 mM 2-메르캅토에탄올 및 0.5 ㎎/㎖ 제네티신(Geneticin) (Gibco (Grand Island, NY))이 보충된 RPMI 배지 (Gibco (Grand Island, NY))에서 성장시켰다. OX40-인간 IgG1 융합 단백질은 세포외 OX40 단백질의 처음 220개의 아미노산을 함유한다. 융합 단백질을 코팅 완충제 (BupH, 카르보네이트-바이카르보네이트 완충제, Pierce (Rockford, IL)) 내의 100 μ/웰 (5 ㎍/㎖)로 Nunc 맥시솝 플레이트 (Nunc (Roskilde, Denmark)) 상에 코팅하고, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 종이 타월 상에 블롯팅(blotting)하여 유체를 제거하고, 200 ㎕/웰의 차단 완충제 (PBS에 희석된 5％ 카네이션 밀크(Carnation Milk)로 차단하고, RT0에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 세정한 후, PBS 내에 희석된 항체의 다양한 희석물을 분석 플레이트에 첨가하고 (50 ㎕/웰), RT0에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 6×105개/웰의 PBS 내의 세포 50 ㎕/웰을 항체를 함유하는 웰에 첨가하고, 추가로 60분 동안 37℃에서 5％ CO2 습식 챔버에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 부드럽게 2회 세정하여, 비-부착 세포를 제거하고, 200 ㎕의 20 ㎍/㎖ 플루오레세인 디아세테이트 (Sigma (St. Louis, MO)) PBS 용액을 각각의 웰에 첨가함으로써 웰 내의 세포 활성을 측정하였다. 플레이트를 37℃에서 5％ CO2 습식 챔버에서 90분 동안 인큐베이션하고, 분광광도계 (Spectra Max 340, Molecular Devices (Sunnyvale, CA))를 사용하여 490에서 판독하였다.
OX40R 항체 선택도 분석법 ( ELISA ): 맥시솝 96웰 플레이트 (Nunc (Roskilde, Denmark))를 BupH™ 카르보네이트 완충제 (pH 9.4) (Pierce (Rockford, IL))에 희석된 0.25 ㎍/㎖의 인간 TNFα 수용체 패밀리 구성원 융합 단백질 100 ㎕으로 코팅하고, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 테스트된 선택도 수용체 융합 단백질에는 CD40-Ig (Alexis Biochemicals (San Diego, CA)), CD137-Ig (R&D Systems (Minneapolis, MN)) 및 CD271-Ig (Alexis Biochemicals (San Diego, CA))가 포함되었다. 각각의 분석법의 양성 대조군으로서 OX40-Ig 융합 단백질 (사내 구축물, Bioexpress, 97/2117)이 또한 포함되었다. 그후, 플레이트를 PBS 내에 희석된 0.05％ 트윈 20 (Sigma (St Louis, MO))을 함유하는 세정 완충제로 3회 세정하고, PBS (Sigma (St Louis, MO)) 내의 0.5％ BSA (Sigma (St Louis, MO)) 300 ㎕로 1시간 동안 RT0에서 차단하였다. 이어서, 플레이트를 세정하고, 100 ㎕/웰의 항-인간 OX40 반응성 항체를 플레이트에 다양한 농도로 첨가하고, 1시간 동안 RT0에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 철저하게 3회 세정하고, OX40R 항체 결합을 1시간 동안 RT0에서 25 ng/㎖의 양고추냉이 과산화효소가 표지된 항-인간 카파 사슬 항체 (Bethyl Laboratories (Montgomery, TX))로 검출하였다. 그후, 플레이트를 3회 세정하고 나서, 100 ㎕/웰의 1-단계 터보(Turbo)-TMB 기질 (Pierce (Rockford, IL))을 30분 동안 RT0에서 첨가하였다. 동일한 부피의 2M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 몰레큘러 디바이시스 스펙트라 맥스(Molecular Devices Spectra Max) 340 (Molecular Devices (Sunnyvale, CA)) 상에서 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
종 교차-반응성: OX40R 을 발현하는 세포주: OX40R의 1-235 (세포외 및 막횡단 도메인) 및 CD40의 216-278 (세포내 도메인)에 상응하는 재조합 인간 OX40-CD40 융합 구축물, 또는 전체 사이노몰거스 OX40R 단백질을 발현하는 300-19 세포주.
인간 T 림프구의 제조: 인간 전혈을 헤파린-처리 주사기 (Baxter (Deerfield, IL)) 내로 수집한 후, 시그마(Sigma)의 아쿠스핀(Accuspin) 튜브 (Sigma (St. Louis, MO))로 제조사가 기술한 바와 같이 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 단리하기 위해 즉각적으로 옮겼다. PBMC를 DPBS로 2회 세정하고, 제조사 (R & D Systems (Minneapolis, MN))가 기술한 바와 같이 T 세포 정제 칼럼을 사용하여 T 림프구를 단리하였다. 간략하게, PBMC를 2 ㎖의 칼럼 완충제에 재현탁시키고, 미리 세정된 T 세포 단리 칼럼 내로 로딩(loading)하였다. PBMC를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, T 세포를 칼럼 완충제로 용출시키고, 1회 세정하고, 10％ 소 태아 혈청 (Hyclone (Logan, UT)) 및 L-글루타민 (2 mM), HEPES (10 mM), 페니실린 (100 U/㎖), 스트렙토마이신 (50 ug/㎖) (Gibco (Grand Island, NY))이 보충된 RPMI 1640 (Sigma (St Louis, MO))으로 구성된 TCM에 2×106개/㎖로 재현탁시켰다. 1 ㎍/㎖의 항-인간 CD28 항체 (클론 37407, R & D Systems (Minneapolis, MN))를 함유하는 2 ㎖ 부피의 T 세포를 PBS 내의 5 ㎍/㎖의 항-인간 CD3 항체 클론 UCTH1 (R & D Systems (Minneapolis, MN))으로 미리 코팅된 24웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. T 세포 배양물을 3일 동안 자극한 후, 유동 세포측정법에 의해 인간 OX40 교차-반응성에 대해 테스트하였다.
사이노몰거스 PBMC 의 제조: 사이노몰거스 전혈을 헤파린처리 진공채혈관 (BD (Franklin Lakes, NJ))을 사용하여 수득하고, PBS 내에 1:4로 희석하였다. 희석된 전혈을 혼합하고, 15 ㎖를 동일한 부피의 히스토파크(Histopaque) 1077 (Sigma (St Louis, MO)) 상에 조심스럽게 층상화하였다. 채혈관을 1000×g에서 45분 동안 RT0에서 회전시키고, 단핵성 PBMC 계면을 수확하고, PBS에서 1회 세정하고, 2분동안 RT0에서 ACK 용해 완충제 (Biosource (Rockville, MD))로 재현탁시켜, 모든 RBC를 제거하였다. PBS 세정 후, PBMC를 카운팅하고, 조직 배양 배지 (TCM)에서 1×106개/㎖로 재조정하였다. TCM은 10％ 소 태아 혈청 (Hyclone (Logan, UT)) 및 L-글루타민 (2 mM), HEPES (10 mM), 페니실린 (100 U/㎖), 스트렙토마이신 (50 ug/㎖) (Gibco (Grand Island, NY)로부터 구입)이 보충된 RPMI 1640 (Sigma (St Louis, MO))으로 구성되었다. 이어서, 항-인간 CD28 교차-반응성 항체 (클론 CD28.2, BD Biosciences (San Diego, CA))를 함유하는 PBMC 제제 2 ㎖을 PBS 내의 10 ㎍/㎖의 항-원숭이 CD3 항체 (클론 FN18, Biosource (Camarillo, CA)로 미리 코팅된 24웰 플레이트 (Costar (Corning, NY))의 웰에 첨가하였다. PBMC 세포 배양물을 4일 동안 자극한 후, 유동 세포측정법에 의해 인간 OX40 교차-반응성에 대해 테스트하였다.
토끼 PBMC 의 제조: 토끼 전혈을 헤파린처리 진공채혈관 (BD (Franklin Lakes, NJ)) 내로 수집하고, 즉각적으로 따뜻한 HBSS (Gibco (Grand Island, NY))로 1:3 희석하였다. 혼합 후, 희석된 혈액 5 ㎖을 동일한 부피의 림포라이트(Lympholyte)-토끼 (Cedarlane Laboratories (Westbury, NY)) 상에 조심스럽게 층상화시키고, 30분 동안 25℃에서 원심분리하였다. PBMC 계면을 수집하고, PBS로 2회 세정하고, 10 ng/㎖의 PHA (Remel (Lenexa, KS))를 함유하는 TCM에서 2×106개/㎖로 재현탁시켰다. 세포를 24-48시간 동안 배양하였다.
개 PBMC 의 제조: 개 전혈을 헤파린처리 진공채혈관 (BD (Franklin Lakes, NJ))을 사용하여 수집하였다. 이어서, 혈액을 동일한 부피의 따뜻한 HBSS (Gibco (Grand Island, NY))와 혼합하였다. 4 ㎖의 희석된 혈액을 15 ㎖ 코니컬(conical) 튜브 내의 3 ㎖의 림포라이트-M (Cedarlane Laboratories (Westbury, NY)) 상에 천천히 층상화시켰다. 튜브를 20분 동안 800×g에서 원심분리하고, PBMC 계면을 수집하고, HBSS로 2회 세정하고, TCM에서 2×106개/㎖로 재현탁시켰다. PBMC를 24웰 플레이트의 웰에 첨가하고 (2 ㎖/웰), 세포를 2 ㎍/㎖의 ConA (Sigma (St. Louis, MO))로 48시간 동안 자극하였다.
뮤린 및 래트 PBMC 의 제조: 헤파린처리 주사기 내에 수집된 래트 전혈을 따뜻한 HBSS에서 1:3으로 희석하였다. 이어서, 5 ㎖를 동일한 부피의 림포라이트-래트 (Cedarlane Laboratories (Westbury, NY)) 상에 조심스럽게 층상화하였다. 튜브를 20분 동안 1500 RPM에서 원심분리하였다. PBMC 계면을 수집하고, 2회 세정하고, 세포 펠렛을 TCM에서 2×106개/㎖로 재조정하였다. 2 ㎖의 세포를 24웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 24-48시간 동안 10 ng/㎖의 PHA (Remel (Lenexa, KS))로 자극한 후, 유동 세포측정법 염색을 수행하였다.
종 교차-반응성에 대한 유동 세포측정법 염색: 자극된 마우스, 래트, 토끼, 개 및 사이노몰거스 PBMC, 및 사이노몰거스 OX40 수용체를 발현하는 300-19 세포주를 사용하여, 인간 OX40 항체 종 교차-반응성에 대해 테스트하였다. 인간 OX40을 발현하는 활성화된 T 림프구 및 OX40이 형질도입된 300-19 세포가 양성 대조군으로 사용되었다. 세포 (5.0×105개/튜브)를 저온 세정 완충제 (PBS, 2％ FBS 및 0.02％ 아지드화 나트륨)에서 1회 세정하고, 5 ㎍/㎖의 알렉사 플루오르 647 접합 대조군 또는 OX40 반응성 항체를 100 ㎕/튜브로 각 튜브에 첨가하였다. 항체를 알렉사 플루오르 647 단백질 표지 키트를 사용하여 제조사 (Molecular Probes (Eugene, OR))가 기술한 바와 같이 표지하였다. 세포를 암실에서 플루오로크롬 항체와 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 3회 세정하고, 분석을 위해 0.5 ㎖ 세정 완충제에 재현탁시켰다. 항체 염색을 벡톤 디킨슨 팩스캘리버 및 셀퀘스트 소프트웨어 (San Jose, CA)를 사용하여 측정 및 분석하였다.
루시퍼레이스 활성 분석법: 루시퍼레이스를 함유하는 NfkB 리포터에 융합된 OX40의 세포외 도메인 및 CD40의 세포내 도메인을 함유하는 293T 세포를 제조하였다. 세포들을 수확하고, 세정하고, 페놀 레드가 없는 완전 배지 (10％ 소 태아 혈청, HEPES 완충제, 비-필수 아미노산 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM)에 0.5×106개의 세포/㎖의 밀도로 재현탁하였다. 80 ㎕의 세포를 96웰 플레이트 (PerkinElmer, 파트 번호 6005680)의 각각의 분석 웰 내로 플레이팅하였다. 테스트 항체를 각각의 웰에 단독으로 또는 가교 항체 Fab' 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA))의 존재 하에 첨가하였다. 플레이트를 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 100 ㎕의 루시퍼레이스 (Promega, 브라이트(Bright)-glo 루시퍼레이스 시스템, 카탈로그 번호 E2620)를 다음날 첨가하고, 루시퍼레이스 활성의 양을 섬광 카운터 (TopCount, Packard-NXT)를 사용하여 측정하였다.
인간 α CD3 IL -2 분석법: 인간 전혈을 헤파린처리 주사기 (Baxter (Deerfield, IL)) 내에 수집하고, 아쿠스핀 튜브 (Sigma (St. Louis, MO)) 상에 층상화시키고, 15분 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. 백혈구 연층을 수집하고, PBS (Sigma (St. Louis, MO))로 세정하고, 적혈구를 물로 용해시켰다. T 세포를 인간 CD3+ 강화 칼럼 (R&D (Minneapolis, MN))에 의해 분리하고, 카운팅하고, 10％ 송아지 태아 혈청 (Hyclone (Logan, UT)), 10 mM HEPES, 1％ 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 0.1 mM 비-필수 아미노산 (모두 깁코(Gibco))을 함유하는 RPMI 배지 (Gibco (Grand Island, NY)에서 1×106개/㎖로 조정하였다. 동시에, 인간 항-CD3ε 클론 #UCHT1 (R&D systems (Minneapolis, MN))을 24웰 플레이트 (Costar (Corning, NY)) 내에 PBS 내의 2.5 ㎍/㎖로 놓고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세정하고, 1×106개/웰의 T 세포, OX40 항체 (또는 IgG2 KLH 대조군)의 단계 희석물 및 F(ab')2 염소 항-인간 IgG Fcγ (2.5 ㎍/㎖로 첨가)를 웰에 첨가하여, 가교시켰다. 상등액을 48시 및 72시에 수집하여, IL-2 수준을 ELISA (R&D)에 의해 평가하였다.
사이노몰거스 α CD3 IL -2 분석법: 사이노몰거스 원숭이 전혈을 헤파린처리 튜브 (BD (Franklin Lakes, NJ))에 수집하고, PBS에서 1:4 희석하고, 히스토파크 1077 (Sigma (St Louis, MO)) 상에 층상화시키고, 45분 동안 2200 rpm에서 원심분리하였다. 백혈구 연층을 수집하고, PBS로 세정하고, 적혈구를 물로 용해시켰다. 세포를 1×106개/㎖로 조정하고, 37℃에서 다양한 농도의 원숭이 항-CD3, 클론 FN-18 (Biosource (Camarillo, CA))로 2시간 동안 예비 코팅된 24웰 플레이트에 첨가하였다. OX40 항체 (또는 IgG2 KLH 대조군)의 단계 희석물, 뿐만 아니라 2.5 ㎍/㎖의 F(ab')2 염소 항-인간 IgG Fcγ를 웰에 첨가하였다. 상등액을 24시 및 48시에 수집하여, IL-2 수준을 ELISA (Biosource (Camarillo, CA))에 의해 평가하였다.
동종항원으로 프라이밍된 T 세포 분석법: 신선하게 단리된 인간 T 세포 (상기 참조)를 마이토마이신 c로 처리된 동종이형 종양 세포 (Raji)와 함께 3-4일 동안 인큐베이션하였다. 그후, T 세포를 수확하고, 세정하고, 1일 동안 신선한 배지에서 휴식시킨 후, 11D4로 자극하였다. 24시간 후에 ELISA (R&D systems (Minneapolis, MN))에 의해 IL-2 수준을 평가하였다.
B. 생체내 연구 절차
인간 T 세포 및 수지상 세포가 이식된 마우스를 사용한 SCID -베이지( beige ) 인간 종양 모델: SCID-베이지 마우스 (Taconic #CBSBG-MM)를 도착 후 5-7일 동안 적응시킨 후 사용하였다. 하기의 종양 세포주들이 사용되었다: RAJI, ATCC #CCL-86; BT-474, ATCC #HTB-20; PC-3, ATCC#-1435; 및 LoVo, ATCC# CCL-229.
정제된 T 림프구 (T 세포) 및 단핵구 유래 수지상 세포를 하기와 같이 인간 혈액으로부터 제조하였다: 인간 단핵 세포를 헤파린처리 혈액으로부터 시그마의 아쿠스핀 튜브 #A7054를 사용하여 수집하였다. 세포를 수집하고, T75 플라스크 내에 놓고, 3 시간 동안 37℃에서 5％ CO2 하에 습식 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 비-부착 세포를 수집하고, 따로 보관하였다 (하기 참조). 부착성 세포를 함유하는 플라스크를 10 ng/㎖의 IL-4 (R&D) 및 100 ng/㎖의 GM-CSF (R&D)가 보충된 RPMI 완전 배지 (10％ 송아지 태아 혈청 함유) 20 ㎖와 함께 인큐베이션하였다. 그후, 배양물을 6-7일 동안 37℃에서 5％ CO2 하에 습식 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 그후, 경사분리하고, 플라스크를 RPMI 완전 배지로 여러 번 헹굼으로써 비-부착성 단핵구에서 유래된 수지상 세포를 수집하였다.
최초의 비-부착성 단핵 세포를 제조사의 지침에 따라 T 세포 강화 칼럼 (R&D)을 사용하여 고친화력 음성 선택을 통해 T 세포를 정제하기 위해 사용하였다. 정제된 T 세포를 회수-세포 배양 배지 내에 107개/㎖로 냉동-보존하고, 사용할 때까지 액체 질소에서 보관하였다. 종양 세포 (1×107개)를 동일한 도너로부터의 T 세포 (1×106개) 및 단핵구-유래 수지상 세포 (5×105개)와 함께 0.2 ㎖/마우스로 피하 (SC) 접종하였다. 캘리퍼스로 종양 성장을 경시적으로 모니터링하였다.
C. 항체 11 D4 에 대한 결과
(1) 시험관내 연구:
시험관내 연구로부터의 항체 11D4의 특정 성질들이 표 3에 요약된다.
항체 11 D4 가 높은 친화력으로 OX40R 에 결합한다.
이는 OX40R의 세포외 도메인을 함유하는 IgG1 융합 단백질을 사용함으로써, 그리고 전체 세포 (OX40R+ 형질감염 세포 및 활성화된 1차 T 세포)에 대해 실연되었다. IgG1 융합 단백질을 사용한 예에서, 11D4가 OX40R의 세포외 도메인에 0.5 ± 0.18 ㎍/㎖ (3.5 nM)의 EC50으로 결합하였다. 이러한 결합이 OX40R의 전장 세포외 도메인을 발현하는 300-19 프리-B 세포 상에서 확증되었다 (어버이 300-19 세포 상에서는 결합이 관찰되지 않았다). OX40R로 형질감염된 세포에의 결합에 대한 EC50은 0.2 ± 0.16 ㎍/㎖ (1.7 nM)이었다. 결합이 1차 T 세포 상에서 관찰되었음을 확증하기 위해, 말초혈 T 세포를 여러 인간 도너로부터 단리하고, 항-CD3 및 항-CD28로 2일 동안 자극하여 OX40R의 발현을 상향조절시켰다. 이러한 T 세포에 대한 포화 결합 데이터는 11D4가 0.6 ± 1.0 ㎍/㎖ (4.0 nM, N = 17명의 도너)의 EC50으로 결합한다는 것을 가리켰다. 이러한 데이터는 11D4가 OX40R에 강하게 결합한다는 것을 실연한다.
이러한 결합을 더 특성화하기 위해, 데이터를 수집하여, 11D4가 상호작용하는 OX40R의 세포외 도메인 상의 영역을 평가하고, 또한 수용체가 결합 후 내재화되는지 여부를 결정하였다. OX40R IgG1 융합 단백질에 대한 경쟁 결합 데이터는 11D4가 OX40 리간드를 발현하는 세포와의 결합에 대해 경쟁한다는 것을 가리켜, 11D4가 수용체의 리간드 결합 영역에서 상호작용한다는 증거를 제공하였다. 또한, 11D4는 FACS 분석에 의해 평가 시 T 세포에의 결합에 대해 시판되는 2개의 OX40R 항체인 BerAct35 및 L106과 교차-경쟁하지 않는다. 비-경쟁 검출 항체를 사용하는 FACS 분석은 활성화된 1차 T 세포를 11D4와 함께 30분 동안 예비-인큐베이션한 후 OX40R이 내재화되지 않았음을 가리켰다. OX40R 세포외 도메인 융합 단백질을 고정된 리간드로 사용하는 Biacore 분석에 의해 결정된 이의 결합 친화력은 결합에 대한 11D4의 평형 해리 상수 (KD)가 0.48 nM임을 가리켰다. 이러한 분석에서 11D4의 오프 속도 상수 (kd)가 5.72 E-05 l/s인 것으로 또한 평가되었다. 따라서, 11D4는 OX40R의 리간드 결합 영역에 높은 친화력으로 결합하고, 오프-속도 상수가 느리며, 결합 후 수용체를 내재화하지 않는다.
항체 11 D4 가 선택적으로 OX40R 에 결합한다.
OX40R에 대한 11D4의 선택성을 TNFR 수퍼패밀리의 또다른 구성원들에 대해 관련된 수용체의 각각의 세포외 도메인을 함유하는 IgG1 융합 단백질 구축물에 관한 데이터를 사용하여 평가하였다. 이러한 수용체들에는 CD40 수용체, 4-1BB 수용체 (CD137) 및 신경 성장 인자 수용체 (CD271)가 포함되었다. 모든 경우에, 유의한 결합이 이러한 수용체들에 대해 100 ㎍/㎖ (700 nM) 이하의 농도에서 관찰되지 않았다. OX40R 융합 단백질에 대해 관찰된 결합 (EC50 = 0.5 ㎍/㎖)과 비교하여, 이러한 데이터는 11D4가 테스트된 다른 관련된 패밀리 구성원들에 비해 OX40R에 대해 100배를 초과하여 선택적이라는 것을 실연한다. (도 1a 및 1b 참조).
항체 11 D4 의 기능적 활성:
11D4의 기능적 활성이 OX40R+ 형질감염 세포 및 1차 T 세포 양쪽 모두 상에서 실연되었다. 이러한 분석법에서, 11D4는 2차 항체 F(ab')2 염소 항-인간 IgG Fcγ와 함께 또는 이러한 2차 항체 없이 세포에 첨가되었을 때 효능제 활성을 나타냈다.
첫번째 실험 셋트에서, NFkB 루시퍼레이스 리포터가 있는 CD40의 세포내 도메인에 융합된 OX40R의 세포외 및 막횡단 도메인으로 형질감염된 293 세포를 사용하여 11D4를 효능제 활성에 대해 평가하였다. 이러한 분석법에서, 11D4는 0.33 ㎍/㎖ (2.2 nM, N = 4)의 평균 EC50으로 OX40R을 통한 신호전달을 강화하였다. 11D4에 의한 루시퍼레이스의 유도에 대한 대표적인 농도-응답 곡선이 도 2에서 제시된다. F(ab')2 2차 항체의 부재 하에, 루시퍼레이스 활성의 규모가 EC50에 더하여 4배 감소하였다.
11D4의 효능제 활성에 대한 추가적인 증거로서, 항원-특이적 T 세포가 생성되었다. 신선하게 단리된 인간 T 세포를 마이토마이신 c로 처리된 동종이형 종양 세포 (Raji)와 함께 3-4일 동안 인큐베이션하였다. 그후, T 세포를 수확하고, 세정하고, 신선한 배지에서 1일 동안 휴식시킨 후, 11D4로 자극하였다. FACS 분석은 휴식 후에도 이러한 세포 상에서의 높은 수준의 OX40R 발현을 가리켰다. 11D4는 이러한 세포에 의한 높은 수준의 IL-2를 유도하였고, 일부 경우에는 100 ng/㎖을 초과하였다 (도 3). 2개의 별도의 예로부터의 이러한 응답에 대한 평균 EC50은 0.008 ± 0.006 ㎍/㎖이었다. 11D4의 부재 하에, 미량 수준의 IL-2만이 이러한 세포에 의해 분비되었다.
11D4는 항-CD3으로 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 IL-2 생산을 또한 강화한다. 이러한 분석법에서의 신호 대 잡음 비율이 항-CD3 단독에 의한 IL-2의 유도로 인해 일부 분석법에서 낮았지만, 11D4는 F(ab')2 염소 항-인간 IgG Fcγ와 함께 첨가되었을 때 IL-2 생산을 강화하였다. 항-CD3의 부재 하에서는 신선하게 단리된 T 세포 상에서 11D4에 대해 활성이 관찰되지 않았다. 11D4에 의한 IL-2 증대 규모는 도너 및 항-CD3에 의해 생성된 IL-2의 양에 따라 항-CD3 단독에 비해 2.3 내지 57배 범위였다. 2.5 ㎍/㎖ 항-CD3으로 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 IL-2 생산에 대한 11D4의 효과가 도 4에 나타난다 (1:3 희석에서의 8-지점 농도 곡선이 사용됨). 8-지점 농도 응답 곡선을 사용한 이러한 데이터로부터 계산된 평균 EC50은 0.042 ± 0.01 ㎍/㎖이었다 (표 4 참조).
IL-2 생산에 대한 11D4의 기능적 활성을 항-CD3 및 11D4 (F(ab')2 2차 항체와 함께)로 자극된 원숭이 세포를 사용하여 또한 평가하였다. 결과가 도 5 및 표 5에 제시된다. 이러한 데이터는 11D4에 대한 EC50이 원숭이 세포와 인간 세포 간에 유사하였지만 (0.022 ㎍/㎖ 대 인간 세포에 대한 0.042 ㎍/㎖), 항-CD3 단독으로 유도된 것을 초과하여 유도된 IL-2의 규모가 사이노몰거스 T 세포를 사용했을 때 유의하게 더 낮았음 (약 35배, 인간 세포 (N = 21)에 대한 5762 ± 4748 pg/㎖ IL-2 대 원숭이 세포 (N = 9)에 대한 261 ± 294 pg/㎖ IL-2)을 가리켰다.
종 교차-반응성:
11D4를 여러 종으로부터의 T 세포에 결합하는 이의 능력에 대해 평가하였다. T 세포를 마우스, 래트, 토끼, 개 및 원숭이로부터 단리하고, 항-CD3 + 항-CD28 또는 마이토젠으로 활성화시켰다. FACS 분석에 의해 지시되는 바와 같이, 마우스, 래트, 토끼 또는 개 세포에 대해 결합이 관찰되지 않았다. 마우스 OX40R에 대한 결합 결여가 뮤린 OX40R의 세포외 도메인을 함유하는 시판되는 융합 단백질을 사용하는 ELISA에 의해 또한 확증되었다. 반면에, 11D4는 FACS에 의한 포화 결합 분석법에서 결정된 바와 같이 사이노몰거스 원숭이 T 세포에 결합한다. 여러 원숭이를 사용하여 수득된 EC50 값의 범위가 도 6에서 제시된다. 비교를 위해, 인간 세포를 사용하여 수득된 EC50 값의 범위가 도 7에서 제시된다. 가변적이기는 하지만, EC50 값의 범위가 원숭이 세포와 인간 세포 간에 유사하였다 (평균 값은 원숭이 세포의 0.354 ㎍/㎖ 대 인간 세포의 0.566 ㎍/㎖이다).
(2) 생체내 연구:
뮤린 OX40R와의 11D4 교차-반응성의 결여는 중증 복합형 면역결핍 (SCID: Severe Combined Immunodeficient) 베이지 마우스를 사용하는 이종 종양 모델의 개발을 필요로 하였다. SCID-베이지 마우스에는 뮤린 T 및 B 림프구 및 NK 세포가 없어, 인간 면역 세포의 이식 및 인간 종양의 성장에 대한 이상적인 수용체이다. 다양한 종양 유형을 나타내는 4개의 종양 세포주를 이러한 생체내 모델에서 테스트하였다. 어떠한 종양 세포주도 OX40R을 발현하지 않았다. 모든 경우에, 종양 세포 (1×107개)를 동일한 도너로부터의 T 세포 (1×106개) 및 단핵구 유래 수지상 세포 (5×105개)와 함께 피하 (SC) 주사하였다. 복강내 (IP) 주사에 의해 투여된 11D4는 표 6에 요약된 바와 같이 이러한 모델들에서 종양 성장을 98％까지 억제하였다. 투여가 쉽고 말초혈 내로 신속하게 보급되는 것으로 인해 복강내 투여 경로가 11D4에 대해 선택되었다.
SCID -베이지 마우스에서의 B 세포 림프종에 대한 11 D4 의 효능:
SCID-베이지 마우스에게 버킷(Burkitt) B 세포 림프종인 Raji를 인간 T 세포 및 단핵구-유래 수지상 세포와 함께 피하 주사하였다. 마우스에게 종양 주사 시점에 11D4 또는 이소타입 대조군 항체 (IgG2 항-KLH)의 단일 복강내 주사를 제공하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 처치된 동물에서 11D4가 종양 성장 속도를 감소시켰다. 챌린지(challenge) 후 제21일의 각각의 개별적인 동물 (N = 10)의 종양 크기가 도 9에서 제시되고, 이는 10 ㎎/㎏의 용량 수준에 의한 종양 성장의 64％ 억제를 나타낸다. T 세포 및 수지상 세포의 부재 하에 활성이 관찰되지 않았다.
전립선 종양 모델에서의 11 D4 의 효능:
SCID-베이지 마우스에게 전립선 선암종 PC-3을 인간 T 세포 및 단핵구-유래 수지상 세포와 함께 피하 주사하였다. 마우스에게 종양 주사 시점에 11D4 또는 이소타입 대조군 항체 (IgG2 항-KLH)의 단일 복강내 주사를 제공하였다. 도 10에 제시된 결과는 11D4 처치가 종양 성장의 용량-의존적 억제를 초래하였음을 나타낸다. 챌린지 후 제27일의 이러한 연구로부터의 각각의 개별적인 동물 (N = 10)의 종양 크기가 도 11에서 제시되고, 이는 동물에게 1.0 ㎎/㎏ 11D4가 단일 주사되었을 때는 종양 성장의 70％ 억제를, 10 ㎎/㎏ 용량에서는 90％를 나타낸다. 이러한 동물에서 제27일에 결정된 11D4의 혈장 수준은 1.0 ㎎/㎏ 용량 수준에서 6.2 ㎍/㎖였다.
결장 암종 종양 모델에서의 11 D4 의 효능:
SCID-베이지 마우스에게 결장직장 선암종 LoVo를 인간 T 림프구 및 자가 단핵구-유래 수지상 세포와 함께 피하 주사하였다. 마우스에게 종양 주사 시점에 11D4 또는 대조군 항체 (IgG2 항-KLH)의 단일 복강내 주사를 제공하였다. 도 12에 제시된 결과는 11D4가 이러한 동물에서 종양 성장을 용량 의존적으로 감소시켰음을 나타낸다. 챌린지 후 제27일의 이러한 연구로부터의 각각의 개별적인 동물 (N = 10)의 종양 크기가 도 13에서 제시되고, 이는 1.0 ㎎/㎏의 단일 용량을 사용했을 때의 종양 성장의 64％ 억제, 및 10.0 ㎎/㎏의 용량 수준에서의 종양 성장의 87 ％ 억제를 나타낸다.
유방 암종 종양 모델에서의 11 D4 의 효능:
SCID-베이지 마우스에게 유방 암종 BT474를 인간 T 림프구 및 자가 단핵구-유래 수지상 세포와 함께 피하 주사하였다. 마우스에게 종양 주사 시점 및 30일 후에 11D4 또는 대조군 항체 (IgG2 항-KLH)의 2회 복강내 주사를 제공하였다. 도 14에 제시된 결과는 11D4가 이러한 동물에서 종양 성장을 감소시켰음을 나타낸다. 챌린지 후 제85일의 이러한 연구로부터의 각각의 개별적인 동물 (N = 10)의 종양 크기가 도 15에서 제시되고, 이는 10.0 ㎎/㎏의 용량 수준에서의 종양 성장의 98％ 억제 및 1 ㎎/㎏의 용량에서의 85％ 억제를 나타낸다.
D. 항체 18 D8 에 대한 결과
(1) 시험관내 연구:
항체 18D8에 대한 시험관내 연구의 결과가 표 7에서 요약된다.
여러 도너로부터의 1차 인간 T 세포에 의한 항-CD3으로 유도된 IL-2 생산에 대한 항체 18D8의 효과가 표 8에서 또한 제시된다.
(2) 생체내 연구
SCID -베이지 마우스에서의 B 세포 림프종에 대한 18 D8 의 효능
SCID-베이지 마우스에게 버킷 B 세포 림프종인 Raji를 인간 T 림프구 및 자가 단핵구-유래 수지상 세포와 함께 피하 주사하였다. 마우스에게 종양 주사 시점에 18D8 또는 이소타입 대조군 항체 (IgG2 항-KLH)의 단일 복강내 주사를 제공하였다. 군 당 10마리의 동물이 각각의 연구에서 사용되었다. 2개의 연구로부터의 결과가 표 9에 제시된다. 결과는 18D8이 1.0 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏의 용량에서 유의한 항-종양 효능을 일으켰음을 나타낸다. T 세포 및 수지상 세포의 부재 하에 활성이 관찰되지 않았고, 이는 이러한 항-종양 효과가 면역 매개된 것일 수 있음을 시사한다.
SCID -베이지 마우스 모델에서의 전립선 종양에 대한 18 D8 의 효능
SCID-베이지 마우스에게 전립선 선암종 PC-3을 인간 T 세포 및 자가 단핵구-유래 수지상 세포와 함께 피하 주사하였다. 마우스에게 종양 주사 시점에 18D8 또는 이소타입 대조군 항체 (IgG2 항-KLH)의 단일 복강내 주사를 제공하였다. 군 당 10마리의 동물이 각각의 연구에서 사용되었다. 결과가 표 9에 제시된다. 결과는 18D8 처치가 각각 0.1 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 및 10 ㎎/㎏의 용량에서 종양 성장의 42％, 90％, 및 88％ 억제를 초래하였음을 나타낸다.
기탁 정보
출원인은 항체 11D4의 중쇄를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 대장균 DHα5의 배양물, 및 항체 11D4의 경쇄를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 대장균 DHα5의 배양물을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 2007년 7월 10일에 기탁하였고, 이들에게 기탁 번호 PTA-8524 및 PTA-8525가 각각 할당되었다. 이러한 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이의 규정 (부다페스트 조약)의 조항 하에 이루어졌다. 이러한 기탁물은 제한 없이 ATCC 기탁기관에 30년 동안, 또는 가장 최근의 요청 후 5년 동안, 또는 특허의 유효 기간 동안 (어느 쪽이든 더 긴 것) 유지될 것이고, 기탁물이 이러한 기간 동안 생육성이지 않게 되면 교체될 것이다. 기탁된 물질의 입수가능성은 임의의 정부의 권한 하에 이의 특허법에 따라 수여된 권리를 위반하여 발명을 실행할 권리로 해석되지 않아야 한다.
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상기의 발명이 이해를 명확하게 하려는 목적으로 실례 및 실시예에 의해 일부 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구항의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 특정 변화 및 변형이 본 발명에 이루어질 수 있다는 것이 본원의 교시내용의 견지에서 당업자에게 이의 없이 명백할 것이다.
Figure pct00001
<표 2A>
Figure pct00002
<표 2B>
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
최대 IL-2: 항-CD3 단독에 비해 EC최대에서 11D4로 생산된 IL-2의 양
EC최대: 항-CD3 단독에 비해 최대 수준의 IL-2를 생산하는 11D4의 농도
자극 지수: 11D4로 생산된 IL-2의 최대 수준 대 항-CD3 단독으로 생산된 IL-2의 양의 비율
ND = 결정되지 않음
마지막 4명의 도너 (18-21)에 대한 값들은 8-지점 1:3 또는 1:4 희석에서 수행된 용량 응답 곡선으로부터의 값이고, 다른 모든 값들은 로그 희석 곡선을 나타낸다. 1:3 및 1:4 농도 곡선으로부터의 EC50은 0.042 ± 0.01 ㎍/㎖였다 (N = 4).
Figure pct00006
최대 IL-2: 항-CD3 단독에 비해 EC최대에서 11D4로 생산된 IL-2의 양
EC최대: 항-CD3 단독에 비해 최대 수준의 IL-2를 생산하는 11D4의 농도
자극 지수: 11D4로 생산된 최대 IL-2 대 항-CD3 단독으로 생산된 양의 비율
ND = 결정되지 않음
표 6의 마지막 3마리의 도너 (33081, 33080, 및 33062)에 대한 값들은 8-지점 1:3 희석에서 수행된 용량-응답 곡선으로부터의 값이다. 다른 모든 값들은 로그 희석 곡선을 나타낸다. 1:3 희석을 사용한 이러한 곡선으로부터의 EC50은 0.022 ± 0.01이었다; N = 3.
Figure pct00007
값 = 연구 종결 시에 결정된 종양 성장의 억제 ％
nd = 검출되지 않음
Figure pct00008
㎍/㎖으로 표현된 활성에 대한 값들은 평균 ± 1 SD를 나타낸다.
Figure pct00009
최대 IL-2: 항-CD3 단독에 비해 EC최대에서 18D8로 생산된 IL-2의 양
EC최대: 항-CD3 단독에 비해 최대 수준의 IL-2를 생산하는 18D8의 농도
자극 지수: 18D8로 생산된 최대 IL-2 대 항-CD3 단독으로 생산된 양의 비율
값들은 로그 희석 곡선을 나타낸다.
Figure pct00010
값 = 연구 종결 시에 결정된 종양 성장의 억제 ％
nd = 결정되지 않음
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. and Medarex Inc. <120> BINDING MOLECULES TO THE HUMAN OX40 RECEPTOR <130> PC33601 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 1 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Human <400> 2 Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 3 Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 4 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Human <400> 5 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 6 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Human <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Human <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 444 <212> PRT <213> Human <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 10 <211> 214 <212> PRT <213> Human <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Human <400> 11 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catagactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attattgtgc gagagaaagc 300 ggctggtacc tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Human <400> 12 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 13 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Human <400> 14 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Human <400> 15 Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Human <400> 17 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 18 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 1 5 <210> 19 <211> 124 <212> PRT <213> Human <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 106 <212> PRT <213> Human <400> 20 Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 450 <212> PRT <213> Human <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 210 215 220 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 22 <211> 213 <212> PRT <213> Human <400> 22 Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 23 <211> 372 <212> DNA <213> Human <400> 23 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggaatg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatcag 300 agtacagctg attactactt ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 24 <211> 318 <212> DNA <213> Human <400> 24 gaaattgtgg tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318

Claims (30)

  1. (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항체와 인간 OX40R과의 결합에 대해 경쟁하는 단리된 결합 분자.
  2. (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
    (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  3. (a) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    (b) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  4. (a) 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  5. (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  6. (a) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
    (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  7. (a) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    (b) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (c) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  8. (a) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    (b) 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
    (c) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;
    (d) 서열 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    (e) 서열 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    (f) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  9. (a) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 1×10-6 M 이하의 KD로 인간 OX40R에 결합하고,
    (b) 인간 OX40R에 대한 효능제 활성을 갖는
    단리된 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 또는 인간화 항체인 결합 분자.
  13. 제11항에 있어서, 항체가 인간 OX40R에 100 nM 이하의 KD로 결합하는 것인 항체.
  14. 서열 9 또는 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  15. 서열 10 또는 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  16. 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  17. 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 OX40R에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자, 및 임의로는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  19. 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 포유동물에서 암을 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 암이 유방암, 전립선암, 결장직장암, 폐암 또는 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방을 필요로 하는 포유동물에서 암을 예방하는 방법.
  22. 치료상 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 응답을 강화시키는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자가 인간 항체인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 결합 분자가 제16항 또는 제17항에 따른 인간 항체인 방법.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  26. 제25항에 있어서, 서열 11, 12, 23 또는 24로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  27. 제25항 또는 제26항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 더 포함하는 벡터.
  29. 제27항 또는 제28항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  30. 종양 세포를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자 또는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 결합 분자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 결합 분자는 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적인 양인, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
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