CN101918447B

CN101918447B - 人ox40受体的结合分子

Info

Publication number: CN101918447B
Application number: CN200880120734.6A
Authority: CN
Inventors: 闵静; 邬艳丽; R·F·芬; B·R·蒂勒; 廖伟; R·P·格拉杜; A·拉吉帕尔; T·J·帕拉迪斯; P·布拉姆斯; B·德沃克斯; 吴艺; K·托伊; H·N·莱布兰克; H·黄
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; Bristol Myers Squibb Co; Pfizer Inc; ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2028-12-11
Also published as: ES2628093T3; KR101577843B1; US20090214560A1; AR109355A2; ES2425269T3; UY31533A1; PT2242771E; SG10201604770VA; US8236930B2; US10196452B2; WO2009079335A1; BRPI0820875A2; AU2008338591B8; DK2242771T3; IL206297A0; PL2242771T3; SI2851374T1; PA8807601A1; PE20091269A1; US20110206681A1

Abstract

本公开内容提供了结合人OX40R的分离的结合分子、编码所述结合分子的氨基酸序列的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞、制备所述结合分子、包含所述结合分子的药物组合物的方法和使用所述结合分子或组合物的方法。

Description

人OX40受体的结合分子

本申请要求2007年12月14日提交的美国临时申请61/013947的权益，其以其全文通过引用合并入本文。

联合研究协议

由于研究活动在Pfizer Inc.和Medarex，Inc之间的联合研究协议(所述协议在所请求保护的发明进行之时或之前生效)的范围内进行，产生本文中的公开内容和权利要求。

背景

本公开内容涉及抗体，特别地涉及结合OX40受体的抗体。

增强抗肿瘤T细胞功能代表了用于癌症治疗的有效的新型方法。产生有效的抗肿瘤T细胞应答所牵涉的至关重要的组成部分包括增强CD4+辅助T细胞活性以促进抗肿瘤溶细胞性T细胞的产生，和为记忆和效应T细胞提供存活信号。已显示介导此类应答的关键受体是OX40受体。Sugamura，K.，Ishii，N.，Weinberg，A.Therapeutictargeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40.Nature Rev.Imm.4：420-431(2004)；Hori，T.Roles of OX40 inthe pathogenesis and control of diseases.Intn.J.Hematology.83：17-22(2006)。

OX40受体(OX40R)(也称为CD134、TNFRSF4、ACT-4、ACT35和TXGP1L)是TNF受体超家族的成员。已发现OX40R在活化的CD4+ T细胞上表达。已证实大量的OX40R+T细胞存在于癌症患者的肿瘤(肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes))中和引流淋巴结中(Vetto，J.T.等人1997.Presence of the T-cell activationmarker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draininglymph nodes cells from patients with melanoma and head and neckcancers.Am.J.Surg.174：258-265；Weinberg，A.D.等人Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumorimmunity.J.Immunol.164：2160-69(2000)；Petty，J.K.，等人Survival in human colorectal cancer correlates with expressionof the T-cell costimulatory molecule OX-40(CD134).Am.J.Surg.183：512-518(2002))。在小鼠肿瘤模型中显示，与对照处理的小鼠相比较，在肿瘤引发过程中OX40R的体内占用明显延迟和防止了肿瘤的出现(Weinberg等人，2000)。因此，已预期通过使用OX40R结合剂占用OX40R来增强哺乳动物对抗原的免疫应答(WO 99/42585；Weinberg等人，2000)。

概述

本公开内容提供了结合人OX40R的分离的结合分子，包括OX40R抗体、OX40R抗体的抗原结合片段和OX40R抗体的衍生物。在一些实施方案中，结合分子以1x10^-7M或更小的K_D结合人OX40R并且对人0X40R具有激动剂活性。在一些另外的实施方案中，结合分子是以100nM或更小的K_D特异性结合人OX40R的人单克隆抗体。

本公开内容还提供了包含一种或多种结合分子和可药用的载体的组合物。在一些实施方案中，结合分子是人单克隆OX40R抗体或其抗原结合片段。组合物还可包含另外的药剂，例如化疗剂、免疫治疗剂和激素治疗剂(homornal therepeutic agent)。

本发明公开内容还提供了使用结合分子的治疗和诊断方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗或预防哺乳动物中癌症的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的结合分子或包含结合分子的组合物。在一些其他实施方案中，本公开内容提供了增强哺乳动物中免疫应答的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的结合分子或包含结合分子的组合物。在一些特定的实施方案中，用于该方法的结合分子是人单克隆OX40R抗体或其抗原结合片段。

本公开内容还提供了编码结合分子的氨基酸序列的核酸分子、包含此类核酸的载体、包含载体的宿主细胞和制备结合分子的方法。

本公开内容还提供了其他方面，其根据全部公开内容(包括权利要求)将变得显然。

附图概述

图1a和1b是显示抗体11D4特异性结合OX40R的图；

图2是显示交联抗体11D4对OX40R刺激的萤光素酶活性的作用的图；

图3是显示抗体11D4对同种抗原致敏的T细胞产生IL-2的作用的图；

图4是显示抗体11D4对抗CD3诱导的原代T细胞产生IL-2的作用的图；

图5是显示抗体11D4对抗CD3诱导的短尾猴(cynomolgus)原代T细胞产生IL-2的作用的图；

图6显示使用来自14个用抗CD3和抗CD28刺激的供体的短尾猴PBMC产生的关于抗体11D4的饱和结合曲线；

图7显示使用来自17个用抗CD3和抗CD28刺激的供体的人PBMC产生的关于抗体11D4的饱和结合曲线；

图8是显示抗体11D4对SCID小鼠中B细胞淋巴瘤Raji的生长的作用的图；

图9是显示在肿瘤注射后21天抗体11D4对B细胞淋巴瘤Raji的生长的作用的图；

图10是显示抗体11D4的单次注射对SCID小鼠中前列腺肿瘤PC-3的生长的作用的图；

图11是显示在肿瘤注射后27天抗体11D4对SCID小鼠中前列腺肿瘤PC-3的生长的作用的图；

图12是显示抗体11D4对SCID小鼠中结肠癌LOVO的生长的作用的图；

图13是显示在肿瘤注射后25天抗体11D4对SCID小鼠中结肠癌LOVO的生长的作用的图；

图14是显示抗体11D4对SCID小鼠中乳腺肿瘤BT474的生长的作用的图；和

图15是显示抗体11D4对SCID小鼠中乳腺肿瘤BT474的生长的作用的图。

详述

定义

术语“激动剂”是指结合分子，如本文中定义的，其与OX40R结合后，(1)刺激或激活OX40R，(2)增强、增加、促进、诱导或延长OX40R的活性、功能或存在，或(3)增强、增加、促进或诱导OX40R的表达。

术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(各对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。人轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。V_H和V_L区还可被细分为其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域的具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对(V_H和V_L)的可变区分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteinsof Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：878-883的定义。术语“抗体”包括作为抗体多聚体(抗体的多聚形式)例如单体抗体的二聚体、三聚体或更高级多聚体的部分的抗体。其还包括连接至或附着至非抗体部分或在物理上或功能上与非抗体部分结合的抗体。此外，术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。

术语“抗体衍生物”或抗体的“衍生物”是指能够结合抗体所结合的相同抗原(例如，OX40R)的分子，其包括与另外的分子实体连接的抗体的氨基酸序列。抗体衍生物中包含的抗体氨基酸序列可以是全长抗体，或可以是全长抗体的任何部分。另外的分子实体可以是化学或生物分子。另外的分子实体的实例包括化学基团、氨基酸、肽、蛋白质(例如酶、抗体)和化合物。另外的分子实体可具有任何功用，例如用作检测试剂、标记、标志物、药物或治疗剂。可通过化学偶联、基因融合、非共价结合等将抗体的氨基酸序列附着至或连接至另外的实体。术语“抗体衍生物”还包括嵌合抗体、人源化抗体和通过OX40R抗体的氨基酸序列的修饰，例如保守氨基酸置换、添加和插入衍生的分子。

术语抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，OX40R)的能力。术语“抗原结合片段”还包括这样的抗体部分，其为通过抗体部分与一个或多个另外的分子实体的共价或非共价结合形成的更大的分子的一部分。另外的分子实体的实例包括氨基酸、肽或蛋白质，例如链霉抗生物素蛋白核心区，其可用于产生四聚体scFv分子(Kipriyanov等人，(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)，半胱氨酸残基，标志物肽(marker peptide)或C末端多组氨酸标签，其可用于产生二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人，(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。

术语“结合分子”包括(1)抗体、(2)抗体的抗原结合片段，和(3)抗体的衍生物，各自如本文中所定义的。

术语“结合OX40R”或“与OX40R结合”是指在体外测定，例如BIAcore测定中本文中定义的结合分子与OX40R的结合。结合意指1x10^-6M或更小的结合亲和力(K_D)。

术语“嵌合抗体”是指包含来源于两个或更多个不同抗体的氨基酸序列的抗体。两个或更多个不同抗体可来自相同物种或来自两个或更多个不同物种。

术语“保守氨基酸置换”是指氨基酸残基被另一个氨基酸残基置换，其中两个氨基酸残基的侧链R基具有相似的化学性质(例如，电荷或疏水性)。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组可以是例如，缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

术语“表位”是指能够特异性结合抗体或T细胞受体或与分子相互作用的抗原的部分。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位通常由分子例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。当抗原上期望的表位被确定后，可以例如使用本文中描述的技术来产生针对该表位的抗体。抗体的产生和表征还可阐明关于期望的表位的信息。根据该信息，可以竞争性筛选结合相同表位的抗体。实现此的方法是进行交叉竞争研究以发现彼此竞争结合的抗体，即抗体竞争对抗原的结合。用于基于它们的交叉竞争“面元划分(binning)”抗体的高通量方法描述于PCT公开案WO 03/48731中。

术语“种系”是指它们通过生殖细胞从亲代传递至子代时的抗体基因和基因区段的核苷酸序列。种系序列与成熟B细胞中编码抗体的核苷酸序列不同，所述核苷酸序列已在B细胞成熟过程中通过重组和超突变事件发生了改变。

术语“宿主细胞”是指已向其中导入了表达载体的细胞。该术语不仅包括特定的受试细胞而且还包括这样的细胞的后代。因为某些修饰可在连续世代中发生(由于突变或环境影响)，所以这样的后代可能与亲本细胞不完全相同，但其仍然包括在术语“宿主细胞”的范围内。术语“人抗体”是指只由人免疫球蛋白序列的氨基酸序列组成的抗体。人抗体，如果在小鼠，在小鼠细胞或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则可包含鼠类碳水化合物链。人抗体可以用本领域内已知的许多方法制备。

术语“人源化抗体”是指包含来源于人抗体序列的氨基酸残基的嵌合抗体。人源化抗体包含的一些或所有CDR可来自非人动物抗体，同时抗体的构架区和恒定区包含来源于人抗体序列的氨基酸残基。

术语“哺乳动物”是指哺乳纲的任何动物物种。哺乳动物的实例包括：人；实验动物例如大鼠、小鼠、猿和豚鼠；家养动物例如猫、狗、兔子、牛、绵羊、山羊、马和猪；以及捕获的野生动物例如狮子、老虎、大象等。

术语“分离的核酸”是指基因组、cDNA或合成来源的核酸分子或其组合，其与存在于所述核酸的天然来源中的其他核酸分子相分离。例如，对于基因组DNA，术语“分离的”包括从与所述基因组DNA天然结合的染色体分离的核酸分子。优选，“分离的”核酸不含在所述核酸所源自的生物的基因组DNA中天然侧翼于所述核酸的序列(即，位于目的核酸的5′和3′末端的序列)。

术语“分离的抗体”或“分离的结合分子”是指这样的抗体或结合分子，其：(1)不与在其天然状态中与其相伴的天然结合组分结合；(2)不含来自相同物种的其他蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或(4)非天然产生。分离的抗体的实例包括使用OX40R亲和纯化的OX40R抗体、通过杂交瘤或其他细胞系体外产生的OX40R抗体和来源于转基因动物的人OX40R抗体。

术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述配体(例如抗体)与蛋白质(例如OX40R)之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，配体结合越紧密，或配体与蛋白质之间的亲和力越高。K_D可通过表面等离子体共振，例如使用BIACORE^TM系统来测量。使用BIACORE^TM系统的测定方法(BIAcore测定)描述于本公开内容的实施例部分。

术语“解离速率(off rate)”或“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。解离速率常数可利用表面等离子体共振，例如使用BIACORE^TM来测量。

术语“OX40R抗体”是指本文中定义的能够结合人OX40R的抗体。

术语“OX40受体”和“OX40R”在本申请中可互换使用，其包括人OX40R以及其变体、同种型和物种同源物。因此，本文中公开的人结合分子，在某些情况下，也可结合来自除了人以外的物种的OX40R。在其他情况下，结合分子可以完全特异于人OX40R并且可以不展示物种或其他类型的交叉反应性。

关于结合分子例如抗体与其结合伴侣例如抗原的相互作用，术语“特异性结合人OX40R”意指结合分子结合CD40、CD137或CD271的K_D大于其结合人OX40R的K_D 100倍，如在体外测定中所确定的。

术语“载体”是指能够将另一个核酸分子转运入宿主细胞的核酸分子。载体的实例包括质粒、病毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、粘粒或噬菌体载体。一些载体能够在已将它们导入其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。一些载体可在导入宿主细胞后被整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组复制而复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达，从而可称为“表达载体”。

如本文中所使用的，20种常规氨基酸和它们的缩写遵照习惯用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1991))。

结合人OX40R的结合分子

本公开内容提供结合人OX40R的分离的结合分子，包括OX40R抗体、OX40R抗体的抗原结合片段和OX40R抗体的衍生物。结合分子由至少一个下列功能特性表征：(a)以1x10^-6M或更小的K_D结合人OX40R；(b)对人OX40R具有激动剂活性；(c)在高至500nM的浓度下不结合CD40受体；(d)在高至500nM的浓度下不结合CD137受体；(e)在高至500nM的浓度下不结合CD271受体；(f)能够增强分离的人T细胞产生IL-2；(g)能够增强免疫应答；(h)能够抑制肿瘤细胞生长；和(i)对癌症具有治疗作用。在一些实施方案中，结合分子以1x10^-7M或更小、或1x10^-8M或更小或5x1x10^-9M或更小的K_D结合人OX40R。

人OX40R抗体

在一些第一方面，本公开内容提供了结合人OX40R的人抗体。在一些实施方案中，人抗体是以100nM或更小，优选10nM或更小的K_D特异性结合人OX40R并且对人OX40R具有激动剂活性的单克隆抗体。此类人抗体的一个实例是人单克隆抗体11D4。抗体11D4的重链的氨基酸序列和重链可变区(V_H)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOs：9和7。抗体11D4的轻链的氨基酸序列和轻链可变区(V_L)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOS：10和8。抗体11D4的同种型是IgG2(对于重链)和κ(对于轻链)。抗体11D4的同种异型是G2(n-)(对于重链)和Km3(对于轻链)。成熟重链和轻链氨基酸序列来源于表达构建体中DNA序列的概念上的翻译。抗体11D4在重链或轻链中不含构架突变，但在重链CDR2中含有一个突变。

本公开内容的另一个示例性抗体是人单克隆抗体18D8。抗体18D8的V_H区和V_L区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOs：19和20中。重链和轻链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOS：21和22中。

鉴于11D4和18D8结合OX40R，因此可将它们各自的V_H和V_L序列与其他OX40R抗体“混合和匹配”来产生另外的抗体。可使用本领域内已知的结合测定法(包括实施例中描述的测定法)检测此类“混合和匹配的”抗体与OX40R的结合。在一个情况下，当将V_H和V_L区混合和匹配时，用结构相似的V_H序列替代来自特定V_H/V_L对的V_H序列。同样，在另一个情况下，用结构相似的V_L序列替代来自特定V_H/V_L对的V_L序列。

因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了分离的OX40R抗体，其包含：(1)抗体11D4或18D8的重链可变区，(2)包含SEQ ID NOs：7或19的氨基酸序列的重链可变区，或(3)包含由SEQ ID NOs：11或23的核酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区。在一些其他实施方案中，本公开内容提供了分离的OX40R抗体，其包含：(1)抗体11D4或18D8的轻链可变区，(2)包含SEQ ID NOs：8或20的氨基酸序列的轻链可变区，或(3)包含由SEQ ID NOs：12或24的核酸序列编码的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一个方面，本公开内容提供了包含11D4或11D8的重链可变区(V_H)的CDR1、CDR2和CDR3和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的抗体。11D4的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOs：1、2和3。抗体11D4的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOs：4、5和6。抗体18D8的V_H CDR1、V_H CDR2和V_H CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOs：13、14和15。抗体18D8的V_L CDR1、V_L CDR2和V_L CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOs：16、17和18。使用Kabat系统(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)描述CDR区。

鉴于11D4和18D8结合人OX40R并且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区提供，因此可将V_H CDR1、CDR2和CDR3序列与V_L CDR1、CDR2和CDR3序列“混合和匹配”来产生另外的OX40R抗体。例如，可将来自不同的OX40R抗体的CDR混合和匹配，尽管各抗体通常将包含V_H CDR1、CDR2和CDR3以及V_L CDR1、CDR2和CDR3。可使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如，ELISA、Biacore分析)检测此类“混合和匹配的”抗体与OX40R的结合。在一个情况下，当将V_H CDR序列混合和匹配时，用结构相似的CDR序列替代来自特定V_H序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。同样，当将V_L CDR序列混合和匹配时，通常用结构相似的CDR序列替代来自特定V_L序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。对于本领域技术人员将很显然的是，可通过用来自本文中公开的CDR序列的结构相似的序列置换一个或多个V_H和/或V_L CDR区序列来产生新型V_H和V_L序列。

因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了(1)包含至少一个选自抗体11D4或18D8的V_H CDR1、V_H CDR2或V_H CDR3的CDR的分离的单克隆抗体。在一些其他实施方案中，本公开内容提供了包含至少一个选自抗体11D4或18D8的V_L CDR1、V_L CDR2或V_L CDR3的CDR的分离的单克隆抗体。在一些另外的实施方案中，本公开内容提供了包含至少一个选自下述的CDR的分离的单克隆抗体：包含SEQ ID NOs：1或13的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：1或3相异于1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列的V_H CDR1；包含SEQ ID NOs：2或14的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：2或14相异于1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列的V_H CDR2；和包含SEQ ID NOs：3或15的氨基酸序列或与SEQID NOs：3或15相异于1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列的V_H CDR3。

在一些另外的实施方案中，本公开内容提供了包含至少一个选自下述的CDR的分离的单克隆抗体：包含SEQ ID NOs：4或16的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：4或16相异于1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列的V_L CDR1；包含SEQ ID NOs：5或17的氨基酸序列或与SEQ IDNOs：5或17相异于1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列的V_L CDR2；和包含SEQ ID NOs：6或18的氨基酸序列或与SEQ ID NOs：6或18相异于1、2、3或4个保守氨基酸置换的序列的V_L CDR3。

在一些情况下，切割OX40R抗体的重链的C末端赖氨酸(Harris R.J.，J.of Chromotography，705：129-134(1995))。OX40R抗体的重链和/或轻链可任选地包括信号序列。

OX40R抗体的种类(例如，IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)和亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)可通过任何合适的方法确定。通常，抗体的种类和亚类可使用特异于抗体的特定种类和亚类的抗体来确定。此类抗体可商购获得。种类和亚类可通过ELISA或Western印迹以及其他技术来确定。备选地，种类和亚类可通过对抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的全部或部分进行测序，将它们的氨基酸序列与免疫球蛋白的不同种类和亚类的已知氨基酸序列相比较，然后确定抗体的种类和亚类来进行确定。OX40R抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。例如，OX40R抗体可以是为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类的IgG。因此，本公开内容的另一方面提供了用于将OX40R抗体的种类或亚类转换成另一个种类或亚类的方法。在一些情况下，使用本领域内熟知的方法分离不包含编码C_L或C_H的序列的编码V_L或V_H的核酸分子。然后将核酸分子与编码来自期望的免疫球蛋白种类或亚类的C_L或C_H的核酸序列有效连接。这可使用包含C_L或C_H链的载体或核酸分子(如上所述)来实现。例如，可将原本为IgM的OX40R抗体类别转换为IgG。此外，可将类别转换用于将一个IgG亚类转换成另一亚类，例如从IgG1转换成IgG2。用于产生包括期望的同种型的抗体的另一个方法包括步骤：分离编码OX40R抗体的重链的核酸和编码OX40R抗体的轻链的核酸，分离编码V_H区的序列，将V_H序列连接至编码期望的同种型的重链恒定结构域的序列，在细胞中表达轻链基因和重链构建体，和收集具有期望的同种型的OX40R抗体。

抗原结合片段

在另一个方面，本公开内容提供了上文描述的任一人OX40R抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自：(1)OX40R抗体的轻链；(2)OX40R抗体的重链；(3)来自OX40R抗体的轻链的可变区；(4)来自OX40R抗体的重链的可变区；(5)OX40R抗体的一个或多个CDR(2、3、4、5或6个CDR)；或(6)来自OX40R抗体的轻链的3个CDR和来自重链的3个CDR。在一些特定的实施方案中，本公开内容提供了抗体11D4或18D8的抗原结合片段。在一些其他特定的实施方案中，OX40R抗体的抗原结合片段包括：(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由V_H结构域组成；(vi)分离的CDR，和(vii)单链抗体(scFv)，其为包含与抗体的VH区连接的抗体的VL区的多肽。Bird等人，(1988)Science 242：423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。抗原结合片段还可包括两个或更多个更短的片段，所述片段来自相同重链或相同轻链，或来自不同链。抗原结合片段，例如Fab和F(ab′)₂片段，可使用常规技术(例如分别地完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶降解)从完整抗体制备。它们还可使用本文中描述的重组DNA技术获得。

抗体衍生物

在一些另外的方面，本公开内容提供了上文描述的任何OX40R抗体的衍生物。

在一个特定的方面，抗体衍生物来源于11D4或18D8的氨基酸序列的修饰。可对抗体链的任何区域例如构架区、CDR区或恒定区的氨基酸序列进行修饰。可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和随机PCR介导的诱变导入修饰，并且所述修饰可包括天然和非天然氨基酸。

修饰的类型包括OX40R抗体的一个或多个氨基酸的置换、插入、缺失或其组合。在一些实施方案中，抗体衍生物在重链CDR包含1、2、3或4个氨基酸置换和/或在轻链CDR中包含1个氨基酸置换。在一些实施方案中，相对于人基因的种系氨基酸序列，OX40R抗体的衍生物包含一个或多个氨基酸置换。在特定的实施方案中，来自种系的一个或多个此类置换位于重链的CDR2区。在另一个特定的实施方案中，相对于种系的氨基酸置换在一个或多个与抗体11D4或18D8中相对于种系的置换相同的位点上。在另一个实施方案中，氨基酸置换将抗体中的一个或多个半胱氨酸变成另一种残基例如但不限于丙氨酸或丝氨酸。半胱氨酸可以是规范(canonical)或非规范半胱氨酸。可在抗体的可变结构域的CDR或构架区中或在恒定结构域中产生置换。另一个类型的氨基酸置换通过改变天冬酰胺-甘氨酸对中的一个或两个残基来消除形成潜在脱酰胺位点的天冬酰胺-甘氨酸对。在其他实施方案中，氨基酸置换是保守氨基酸置换。在一个实施方案中，抗体衍生物相对于11D4或18D8的氨基酸序列在重链CDR区中具有1、2、3或4个保守氨基酸置换。

OX40R抗体的另一种类型的修饰是抗体的原始糖基化模式的改变。术语“改变”是指在抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分的缺失和/或一个或多个不存在于抗体中的糖基化位点的添加。抗体的糖基化通常是N连接的。N连接的是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。糖基化位点至抗体的添加可方便地通过改变氨基酸序列(以使其包含一个或多个上述三肽序列(以用于N连接的糖基化位点))来实现。

另一个类型的修饰包括存在于抗体上的任何碳水化合物部分的去除，这可通过化学或酶促方法来实现。化学去糖基化需要将抗体暴露于化合物例如三氟甲磺酸或等价化合物。该处理导致除了连接糖(linking sugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖的切割，同时保持抗体完整。化学去糖基化由Sojahr，H.T.，和Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57和由Edge，A.S.，等人Anal.Biochem.118(1981)131-137进行了描述。抗体上的碳水化合物部分的酶促切割可通过使用多种内切和外切糖苷酶(如Thotakura，N.R.，和Bahl，O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359描述的)来实现。

其他修饰的实例包括乙酰化、酰化、酰胺化、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、甲酰化、羟化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化和硫酸化。

在另外的方面，提供了包含本文中描述的连接至另外的分子实体的OX40R抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物。另外的分子实体的实例包括药物试剂、肽或蛋白质以及检测试剂或标记。可连接至OX40R抗体的药物试剂的特定实例包括细胞毒性剂或其他癌症治疗剂以及放射性同位素。可连接至OX40R抗体的肽或蛋白质的特定实例包括可以是相同OX40R抗体或不同抗体的抗体。可连接至OX40R抗体的检测试剂或标记的特定实例包括(1)荧光化合物，例如荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白和镧系元素磷光体；(2)酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶和葡糖氧化酶；(3)生物素；(4)由第二报告分子识别的预先确定的多肽表位，例如亮氨酸拉链对序列，二抗的结合位点、金属结合结构域和表位标签。在特定实施方案中，抗体衍生物是OX40R抗体多聚体，其是OX40R抗体的多聚形式，例如抗体二聚体、三聚体或单体抗体的更高级多聚体。抗体多聚体内的个体单体可以是相同的或不同的，即，它们可以是杂聚(heteromeric)或同聚(homomeric)抗体多聚体。多聚体中的个体抗体可具有相同或不同的结合特异性。抗体的多聚化可通过抗体的天然聚集获得。例如，一定百分比的纯化的抗体制剂(例如，纯化的IgG1分子)自发地形成含有抗体同二聚体和其他更高级抗体多聚体的蛋白质聚集体。备选地，抗体同二聚体可通过本领域内已知的化学连接技术形成，例如通过使用异双功能交联剂来形成。合适的交联剂包括具有两个通过合适的间隔子分隔的不同反应基团的异双功能交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸和N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯)或同双功能交联剂(例如双琥珀亚胺基辛二酯)。此类连接剂可从Pierce Chemical Company，Rockford，IL商购获得。还可通过本领域内已知的重组DNA技术使抗体多聚化。

在另一个方面，抗体衍生物是嵌合抗体，其包含上文描述的人OX40R抗体的氨基酸序列。在一个实例中，将一个或多个来自人OX40R抗体的CDR与来自非人动物例如小鼠或大鼠的抗体的CDR组合。在另一个实例中，嵌合抗体的所有CDR来源于人OX40R抗体。在另一个实例中，在嵌合抗体中组合来自多于一个的人OX40R抗体的CDR。此外，嵌合抗体可包含来源于一个人OX40R抗体的构架区和来自一个或多个不同人抗体的一个或多个CDR。可使用本领域内已知的常规方法产生嵌合抗体。在一些特定的实施方案中，嵌合抗体包含来自选自抗体11D4或18D8的抗体的重链可变区或轻链可变区的1、2或3个CDR。

本公开内容提供的其他抗体衍生物的实例包括单链抗体、二价抗体(diabody)、结构域抗体、纳米抗体(nanobody)和unibody。“单链抗体”(scFv)由包含与V_H结构域连接的V_L结构域的单个多肽链组成，其中V_L结构域和V_H结构域配对形成单价分子。可按照本领域内已知的方法(参见，例如，Bird等人，(1988)Science 242：423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)来制备单链抗体。“二价抗体”由两条链组成，各条链包含通过短肽连接体连接至相同多肽链上的轻链可变区的重链可变区，其中相同链上的两个区域相互不配对但与另一条链上的互补结构域配对，从而形成双特异性分子。制备二价抗体的方法在本领域内是已知的(参见，例如，Holliger P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，和Poljak R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。结构域抗体(dAb)是抗体的小的功能性结合单位，其相应于抗体的重链或轻链的可变区。结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好表达。结构域抗体和其产生方法的更详细内容在本领域内是已知的(参见，例如，美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；欧洲专利0368684和0616640；WO05/035572，WO04/101790，WO04/081026，WO04/058821，WO04/003019和WO03/002609)。纳米抗体来源于抗体的重链。纳米抗体通常包含单个可变结构域和两个恒定结构域(CH2和CH3)并且保持原始抗体的抗原结合能力。纳米抗体可利用本领域内已知的方法(参见例如，美国专利6,765,087、美国专利6,838,254、WO 06/079372)来制备。unibody由IgG4抗体的一条轻链和一条重链组成。unibody可通过除去IgG4抗体的铰链区来制备。unibody和制备它们的方法的更详细的内容可见于WO2007/059782。

产生结合分子的方法

本文中公开的结合分子可通过本领域内已知的技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术(Nature 256：495，(1975))以及其他技术例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。

非人动物的免疫

本公开内容还提供了制备OX40R抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括用OX40R抗原免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物，和从免疫的动物或从来源于免疫的动物的细胞分离抗体。

合适的非人动物的实例包括转基因或转染色体动物例如HuMAb

“TC小鼠”和Xenomouse^TM。HuMAb(Medarex，Inc.)包含人免疫球蛋白微小基因座(miniloci)，所述基因座编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，并具有使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如，Lonberg等人(1994)Nature368：856-859)。因此，小鼠展示减少的小鼠IgM或κ的表达，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，从而产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(参见，例如，Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb的制备和用途以及这样的小鼠携带的基因组修饰在本领域内是熟知的(参见，例如，Fishwild，D.等人(1996)Nature Biotechnology14：845-851)。KM mice^TM含有人重链转基因和人轻链转染色体并且详细描述于WO 02/43478。Xenomouse^TM(Abgenix，Inc.)包含人免疫球蛋白基因座大片段并且在小鼠抗体产生上具有缺陷。该动物模型在本领域内是熟知的(参见，例如，美国专利：5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584；和6,162,963)。“TC小鼠”也是携带人重链转染色体和人轻链转染色体的基因工程小鼠。这样的小鼠描述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。

用于免疫动物的OX40R抗原可以是分离和/或纯化的OX40R，且优选是人OX40R。在一个实施方案中，OX40R抗原是人OX40R的片段，优选OX40R的细胞外结构域。在另一个实施方案中，OX40R抗原是包含人OX40R的至少一个表位的片段。在另一个实施方案中，OX40R抗原是在其细胞表面上表达OX40R的细胞，更特别地在其细胞表面上过表达OX40R的细胞。动物的免疫可通过本领域内已知的任何合适的方法来进行(参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，New York：Cold Spring Harbor Press，1990)。用于免疫非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的特定方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Harlow和Lane(1990)；美国专利5,994,619)。实施例1提供了免疫HuMab小鼠的方法。

在用OX40R抗原免疫动物后，可从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。在一个实施方案中，从动物获得血清，然后可从血清获得免疫球蛋白级分，或可从血清纯化OX40R抗体。

还可使用由分离自免疫的动物的细胞制备的产生抗体的永生化细胞来产生OX40R抗体。在免疫后，从动物收集淋巴结和/或脾B细胞，然后通过合适的方法永生化所述细胞。永生化细胞的方法包括但不限于用癌基因转染它们，用致癌病毒感染它们并且在选择用于永生化细胞的条件下培养它们，将它们经历致癌或突变化合物，将它们与永生化细胞例如骨髓瘤细胞融合，以及使肿瘤抑制基因失活(参见，例如，Harlow和Lane，同上)。在特定的实施方案中，将从免疫的动物收集的脾B细胞融合至永生化的骨髓瘤细胞以形成产生抗体的永生化杂交瘤。骨髓瘤细胞优选不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。使用OX40抗原(例如OX40R、其部分或表达OX40R的细胞)筛选永生化的杂交瘤。可以例如使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定来进行初步筛选。ELISA筛选的实例描述于WO 00/37504。

选择和克隆产生OX40R抗体的细胞，例如杂交瘤，并且就期望的特征，包括强健的生长、高抗体产量和期望的抗体特征(如下面进一步论述的)对其进行进一步的筛选。可在同系(syngeneic)动物中，在缺乏免疫系统的动物例如裸小鼠中体内扩增或在细胞培养物中体外扩增杂交瘤。

因此，提供了用于制备产生人单克隆OX40R抗体或其抗原结合片段的细胞的方法，其包括：(a)用OX40R抗原免疫非人转基因动物；(b)让动物发动(mount)抗OX40R抗原的免疫应答；(c)从动物分离产生抗体的细胞；和(d)永生化产生抗体的细胞。在一个实施方案中，该方法还包括(e)产生永生化的产生抗体的细胞的单独的单克隆群体；和(f)筛选产生期望的OX40R抗体的永生化的产生抗体的细胞。

产生OX40R抗体的核酸、载体、宿主细胞和重组方法

本公开内容的另一个方面提供了编码结合人OX40R的结合分子的氨基酸序列的分离的核酸分子。由核酸分子编码的氨基酸序列可以是完整抗体的任何部分，例如CDR，包含1个、2个或3个CDR的序列或重链或轻链的可变区，或可以是全长重链或轻链。在一些实施方案中，核酸分子编码这样的氨基酸序列，其包含(1)抗体11D4或18D8的CDR3区，特别地重链CDR3区；(2)抗体11D4或18D8的重链可变区或轻链可变区；或(3)抗体11D4或18D8的重链或轻链。在其他实施方案中，核酸分子编码包含选自SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列的多肽。在其他实施方案中，核酸分子选自SEQ ID NOs：11、12、23和24。

本公开内容提供的核酸分子可从产生OX40R抗体的任何来源获得。来自产生OX40R抗体的细胞的mRNA可通过标准技术进行分离，使用PCR和文库构建技术进行克隆和/或扩增，并使用标准方案进行筛选以获得编码OX40R抗体的氨基酸序列的核酸分子。mRNA可用于产生用于抗体基因的聚合酶链式反应(PCR)或cDNA克隆的cDNA。在一个实施方案中，从上述表达OX40R抗体的杂交瘤，优选将表达人免疫球蛋白基因的非人转基因动物细胞作为其的一个融合伴侣的杂交瘤获得核酸分子。在另一个实施方案中，杂交瘤来源于非人、非转基因动物。

可通过将编码重链可变区的核酸分子与编码重链的恒定区的核酸分子融合来构建编码OX40R抗体的重链的核酸分子。类似地，可通过将编码轻链可变区的核酸分子与编码轻链的恒定区的核酸分子融合来构建编码OX40R抗体的轻链的核酸分子。可通过将编码VH和VL链的核酸分子分别插入已编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体(以使VH区段与载体内的重链恒定区(CH)区段有效连接以及使VL区段与载体内的轻链恒定区(CL)区段有效连接)来将它们转换成全长抗体基因。备选地，通过连接，例如使用标准分子生物学技术将编码VH链的核酸分子连接至编码CH链的核酸分子来将编码VH或VL链的核酸分子转换成全长抗体基因。可使用编码VL和CL链的核酸分子来获得全长抗体基因。人重链和轻链恒定区基因的序列在本领域内是已知的。参见，例如，Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH Publ.No.91-3242，1991。然后可从已向其中导入了编码全长重链和/或轻链的核酸分子的细胞表达所述核酸分子，并分离OX40R抗体。

核酸分子可用于重组表达大量的OX40R抗体，如下面所描述的。核酸分子还可用于产生本公开内容提供的其他结合分子，例如嵌合抗体、单链抗体、免疫粘附素(immunoadhesin)、二价抗体、突变的抗体和抗体衍生物，如本文中其他地方所描述的。在一个实施方案中，核酸分子用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可用于诊断方法或核酸分子PCR引物可用于扩增DNA区域，所述DNA区域可用于，特别地，分离用于产生OX40R抗体的可变区的核酸序列。

在获得编码OX40R抗体的V_H和V_L区段的DNA分子后，可利用重组DNA技术进一步操作此类DNA分子，例如以将可变区基因转换成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在此类操作中，将编码V_L或V_H的DNA分子与编码另一个多肽例如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA分子有效连接。术语“有效连接的”，如本说明书中所使用的，意指连接两个DNA分子以使由这两个DNA分子编码的氨基酸序列保持符合读框。

可通过将编码V_H的DNA分子有效连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一个DNA分子来将编码V_H区的分离的DNA分子转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域内是已知的(参见，例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可利用标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区，但最优选是IgG1或IgG2的恒定区。IgG1的恒定区序列可以是已知在不同个体中存在的不同等位基因或同种异型中的任一个，例如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。此类同种异型代表IgG1恒定区中天然发生的氨基酸置换。对于Fab片段重链基因，可将编码V_H的DNA有效连接至只编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。CH1重链恒定区可来源于任一重链基因。

可通过将编码V_L的DNA分子有效连接至编码轻链恒定区C_L的另一个DNA分子来将编码V_L区的分离的DNA分子转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域内是已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。κ恒定区可以是已知在不同个体中存在的不同等位基因中的任一个，例如Inv(1)、Inv(2)和Inv(3)。λ恒定区可以来源于3个λ基因中的任一个。

为了产生scFv基因，将编码V_H和V_L的DNA片段与编码柔性连接体，例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的另一个片段有效连接，以使V_H和V_L序列可以表达为连续的单链蛋白，其中V_L和V_H区通过柔性连接体连接(参见例如，Bird等人，(1988)Science 242：423-426；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554)。如果只使用单个V_H和V_L，则单链抗体可以是单价的，如果使用两个V_H和V_L，则单链抗体可以是二价的，或如果使用两个以上的V_H和V_L，则单链抗体可以是多价的。可产生特异性结合OX40R和另一分子的双特异性或多价抗体。

在另一个方面，本公开内容提供了包含上文描述的核酸分子的载体。核酸分子可编码轻链或重链的部分(例如CDR或可变区)、全长轻链或重链、包含重链或轻链的部分或全长的多肽、或抗体衍生物或抗原结合片段的氨基酸序列。为了表达结合分子，将编码部分或全长结合分子的DNA分子插入表达载体以使DNA分子有效连接至转录和翻译控制序列。在本说明书中，术语“有效连接的”意指将DNA分子连接入载体以使载体中的转录和翻译控制序列发挥它们的期望的调控DNA分子的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以与使用的表达宿主细胞相容。表达载体包括例如质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒(AAV)、植物病毒例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、和EBV来源的附加体。可将编码轻链的氨基酸序列的DNA分子和编码重链的氨基酸序列的DNA分子插入分开的载体或相同的载体。可通过任何合适的方法(例如，抗体基因片段与载体上的互补限制性位点的连接，或如果不存在限制性位点，则平端连接)将DNA分子插入表达载体。

合适的表达载体的实例是编码功能上完整的人C_H或C_L免疫球蛋白序列的表达载体，其具有合适的工程改造的限制性位点，以便可插入和表达任何V_H或V_L序列。表达载体还可编码促进抗体链的氨基酸序列从宿主细胞分泌的信号肽。可将编码抗体链的氨基酸序列的DNA克隆入载体以使信号肽符合读框地连接至抗体链的氨基酸序列的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。

除了编码OX40R抗体的氨基酸序列的核酸序列(抗体链基因)外，表达载体具有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于这样的因素，如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))的启动子和/或增强子、多瘤和强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调控元件和其序列的进一步描述，参见例如，美国专利5,168,062、4,510,245和4,968,615。

除了抗体链核酸序列和调控序列外，重组表达载体可具有另外的序列，例如调控载体在宿主细胞中的复制的序列和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已向其中导入了载体的宿主细胞(参见例如，美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，使用氨甲蝶呤选择/扩增)、新霉素磷酸转移酶基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于许多因素，例如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质的表达水平等。编码结合分子的核酸分子和包含此类核酸分子的载体可用于转化合适的宿主细胞以用于重组产生结合分子。用一个或多个表达载体转化合适的宿主细胞，所述表达载体具有编码结合分子的氨基酸序列的核酸分子，从而氨基酸序列可在宿主细胞中表达并且，通常分泌入在其中培养宿主细胞的培养基中，并且可从该培养基回收氨基酸序列。可利用本领域内已知的任何合适的方法，例如美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455中公开的方法进行宿主细胞的转化。

宿主细胞可以是哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、细菌细胞或酵母细胞。适合用作宿主细胞的哺乳动物细胞系的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞和许多其他细胞系。昆虫细胞系的实例包括Sf9或Sf21细胞。植物宿主细胞的实例包括烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌(Streptomyces)的种。酵母宿主细胞的实例包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。

由不同细胞系或在转基因动物中表达的结合分子的氨基酸序列可具有不同的糖基化。然而，由本文中提供的核酸分子编码的或包含本文中提供的氨基酸序列的所有结合分子是本发明的一部分，无论结合分子的糖基化如何。

在另一个方面，本公开内容提供了使用噬菌体展示产生OX40R抗体或其抗原结合片段的方法。该方法包括(a)在噬菌体上合成人抗体的文库，(b)用OX40R或其部分筛选文库，(c)分离结合OX40R或其部分的噬菌体，和(d)从噬菌体获得抗体。用于制备抗体文库的一个示例性方法包括步骤：(a)用OX40R或其抗原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答；(b)从免疫的动物中提取产生抗体的细胞；(c)从提取的细胞中分离编码OX40R抗体的重链和轻链的RNA；(d)逆转录RNA以产生cDNA；(e)扩增cDNA；和(f)将cDNA插入噬菌体展示载体以使抗体在噬菌体上表达。可通过筛选重组组合抗体文库来分离重组人OX40R抗体或其抗原结合片段。文库可以是使用从mRNA(分离自B细胞)制备的人V_L和V_H cDNA产生的scFv噬菌体展示文库。用于制备和筛选此类文库的方法在本领域内是已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，Pharmacia Recombinant PhageAntibody System，catalog no.27-9400-01；和Stratagene SurfZAP^TMphage display kit，catalog no.240612)。

在一个情况下，为了分离和产生具有期望的特征的人OX40R抗体，首先使用本领域内已知的方法(例如WO 93/06213中描述的表位印迹法)将本文中描述的人OX40R抗体用于选择具有相似的对OX40R的结合活性的人重链和轻链序列。用于该方法的抗体文库可以是如WO92/01047，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；和Griffiths等人，EMBO J.12：725-734(1993)中所述制备和筛选的scFv文库。可使用人CCR2作为抗原来筛选scFv抗体文库。

在选择初始人V_L和V_H区域后，立即进行“混合和匹配”实验，其中就OX40R结合筛选不同对的初步选择的V_L和V_H区段以选择V_L/V_H对组合。此外，为了进一步提高抗体的质量，可在类似于体内体细胞突变过程(其在天然免疫应答过程中负责抗体的亲和力成熟)的过程中在V_H和/或V_L的CDR3区域内随机突变V_L/V_H对的V_L和V_H区段。该体外亲和力成熟可通过分别使用与V_H CDR3或V_L CDR3互补的PCR引物扩增V_H和V_L结构域来完成，所述引物已用4种核苷酸碱基的随机混合物在某些位点进行“加标(spiked)”，从而所得的PCR产物编码其中已将随机突变导入V_H和/或V_L CDR3区的V_H和V_L区段。可就与OX40R的结合再次筛选此类随机突变的V_H和V_L区段。

在从重组免疫球蛋白展示文库中筛选和分离OX40R抗体或抗原结合部分后，可从展示包装(display package)(例如，从噬菌体基因组)回收编码所选择的结合分子的核酸，然后通过重组DNA技术将其亚克隆入其它表达载体。需要时，可进一步操作核酸以产生其他抗体形式，如下文中所述的。为了表达通过筛选组合文库分离的重组人抗体，将编码抗体的DNA克隆入重组表达载体，然后导入哺乳动物宿主细胞，如上文中所描述的。

药物组合物

在另一个方面，本公开内容提供了组合物，例如药物组合物，其包含本公内容提供的结合分子中的一种或其组合，以及任选地可药用的载体。可利用本领域内已知的常规方法制备组合物。

在一些实施方案中，组合物包含OX40R抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，组合物包含抗体11D4或抗体18D8，或任一抗体的抗原结合片段。在其他实施方案中，组合物包含抗体11D4或抗体18D8的衍生物。

术语“可药用的载体”是指适合用于制剂(其用于递送结合分子)中的任何惰性物质。载体可以是抗粘剂、粘合剂、包衣、崩解剂、填充剂或稀释剂、防腐剂(例如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、甜味剂、吸收延迟剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的可药用的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、葡萄糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲剂、缓冲盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨醇和氯化钠。

组合物可以以任何合适的形式例如液体、半固体和固体剂型存在。液体剂型的实例包括溶液(例如，可注射的和可输注的溶液)、微乳剂、脂质体、分散体或悬浮液。固体剂型的实例包括片剂、丸剂、胶囊、微胶囊和粉剂。适合用于递送结合分子的组合物的特定形式是用于注射或输注的无菌液体例如溶液、悬浮液或分散体。无菌溶液可通过将抗体以需要的量掺入合适的载体，然后进行无菌微过滤来制备。通常，通过将抗体掺入包含基本分散介质和其他载体的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌液体的无菌粉剂的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥(冻干)以从其之前的无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外的期望的成分的粉剂。可通过本领域内已知的常规技术制备组合物的不同剂型。

组合物中包含的结合分子的相对量将视许多因素而变化，所述因素例如所使用的特定结合分子和载体、剂型和期望的释放和药效特征。单个剂型中结合分子的量通常是产生治疗效果的量，但也可以是更少的量。通常，该量的范围，相对于剂型的总重量，在大约0.01％至大约99％之间，大约0.1％至大约70％之间，或大约1％至大约30％之间。

除了结合分子外，组合物中还可包含一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂的实例描述于下文中。组合物中包含的另外的治疗剂的合适的量可容易地由本领域技术人员选择，并且可视许多因素而变化，例如所使用的特定试剂和载体、剂型以及期望的释放和药效特征。单个剂型中包含的另外的治疗剂的量通常是产生治疗效果的药剂的量，但也可以是更少的量。

结合分子和药物组合物的用途

结合分子和包含本公开内容提供的结合分子的药物组合物可用于治疗、诊断或其他目的，例如增强免疫应答、治疗癌症、增强其他癌症疗法的功效或增强疫苗功效，并且具有许多用途，例如用作药物或诊断剂。因此，在另一个方面，本公开内容提供了使用结合分子或药物组合物的方法。

在一个特定方面，提供了用于增强哺乳动物中免疫应答的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的本公开内容提供的结合分子。在一些实施方案中，结合分子是OX40R抗体或其抗原结合片段，哺乳动物是人。在另外的实施方案中，结合分子是抗体11D4或抗体18D8或任一抗体的抗原结合片段。术语“增强免疫应答”或其语法变型，意指刺激、激起、增加、提高或增强哺乳动物的免疫系统的任何应答。免疫应答可以是细胞应答(即，细胞介导的，例如细胞毒性T淋巴细胞介导的)或体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是初次免疫应答或再次免疫应答。免疫应答的增强的实例包括增加的CD4+辅助T细胞活性和溶细胞性T细胞的产生。免疫应答的增强可使用许多对于本领域技术人员来说是已知的体外或体内测量来估量，所述测量包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定、细胞因子的释放(例如IL-2的产生)、肿瘤的消退、荷瘤动物的存活、抗体的产生、免疫细胞的增殖、细胞表面标记的表达和细胞毒性。通常，当与未处理的哺乳动物或未使用所请求保护的方法进行处理的动物的免疫应答相比较时，本公开内容的方法增强哺乳动物的免疫应答。在一个实施方案中，该方法增强细胞免疫应答，特别地细胞毒性T细胞应答。在另一个实施方案中，细胞免疫应答是T辅助细胞应答。在另一个实施方案中，免疫应答是细胞因子的产生，特别地IL-2的产生。

在另一个特定方面，本公开内容提供了治疗哺乳动物中的癌症的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的本公开内容提供的结合分子。术语“治疗癌症”或“癌症的治疗”是指在经诊断患有癌症的哺乳动物中引起期望的或有益的效果。期望的或有益的效果可包括癌细胞的进一步生长或扩散的抑制、癌细胞的死亡、癌症复发的抑制、与癌症相关的疼痛的减轻或提高的动物存活率。癌症复发的抑制涉及之前已用辐射、化学疗法、手术或其他技术进行治疗的癌症部位和周围组织。效果可以是主观的或客观的。例如，如果动物是人，则人可将提高的活力或生命力或减小的疼痛记录为主观的症状改善或对治疗的响应。备选地，临床医师可基于体检、实验室参数、肿瘤标志物或放射影像表现(radiographic finding)注意到肿瘤大小或肿瘤负荷的减小。临床医师可观察到的对治疗的响应的一些实验室指标(sign)包括检测例如白细胞计数、红细胞计数、血小板计数、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate)和各种酶水平的正常化。此外，临床医师可观察到可检测的肿瘤标志物的减少。备选地，可使用其他检测例如超声图、核磁共振检测和正电子发射检测评估客观改善。在一些实施方案中，结合分子是本公开内容提供的OX40R抗体或其抗原结合片段。在另外的实施方案中，结合分子是抗体11D4或18D8或任一抗体的抗原结合片段。在另外的实施方案中，哺乳动物是人。

在另一个特定方面，本公开内容提供了预防哺乳动物中的癌症的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的本公开内容提供的结合分子。术语“预防癌症”或“癌症的预防”是指延迟、抑制或预防哺乳动物中癌症的发作，在所述哺乳动物中，癌发生或肿瘤发生的起始未得到证实，但已鉴定了对癌症的易感性(predisposition)(通过例如遗传筛查或其他方法确定)。该术语还包括治疗患有恶化前病状的哺乳动物以终止恶化前病状向恶性肿瘤进展或引起恶化前病状的消退。恶化前病状的实例包括增生、发育异常和化生(metaplasia)。在一些实施方案中，结合分子是本公开内容提供的OX40R抗体或其片段。在另外的实施方案中，结合分子是抗体11D4或18D8，或任一抗体的抗原结合片段。在另外的实施方案中，哺乳动物是人。

许多癌症，无论是恶性的还是良性的以及无论是原发性的还是继发性的，都可用本公开内容提供的方法来治疗或预防。此类癌症的实例包括肺癌例如例如支气管肺癌(例如，鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌和腺癌)、肺泡细胞癌、支气管腺瘤、软骨瘤样错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌症(heart cancer)例如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤、软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、尤文氏肿瘤(Ewing′s tumor)(尤文氏肉瘤)和网状细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如，多形性胶质母细胞瘤)、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脊索瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、松果体瘤、骨瘤、血管母细胞瘤、颅咽管瘤、脊索瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、皮样囊肿和血管瘤；消化系统癌症例如平滑肌瘤、表皮样癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、肠脂肪瘤、肠神经纤维瘤、肠纤维瘤、大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌例如肝细胞腺瘤、血管瘤、肝细胞癌、纤维板层癌、胆管癌、肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌例如肾腺癌、肾细胞癌、肾上腺瘤(hypernephroma)和肾盂移行细胞癌；膀胱癌；血液学癌症例如急性淋巴细胞性(淋巴母细胞性)白血病、急性髓性(髓细胞性、骨髓性、成髓细胞性、骨髓单核细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病(例如塞扎里综合征(Sezary syndrome)和毛细胞白血病)、慢性髓细胞性(髓性、骨髓性、粒细胞性)白血病、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin′slymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿和骨髓增殖性病症(包括骨髓增殖性病症例如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、血小板增多症和慢性髓细胞性白血病)；皮肤癌例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)和佩吉特病(Paget′s disease)；头颈癌；眼相关癌症例如视网膜母细胞瘤和眼内黑素癌(intraoccular melanocarcinoma)；男性生殖系统癌症例如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症例如子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌(子宫颈癌)、卵巢癌症(卵巢癌)、外阴癌、阴道癌、输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌或髓质癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病、骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤。

在实施治疗方法时，可将结合分子以单一疗法的方式单独施用，或与一种或多种另外的治疗剂或疗法联合施用。因此，在另一个方面，本公开内容提供了联合治疗，其包括与一种或多种另外的疗法或治疗剂组合的本公开内容提供的结合分子。术语“另外的疗法”是指不使用本公开内容提供的结合分子作为治疗剂的疗法。术语“另外的治疗剂”是指除了本公开内容提供的结合分子外的任何治疗剂。在一些实施方案中，结合分子是抗体11D4或18D8，或任一抗体的抗原结合片段。在一个特定的方面，本公开内容提供了用于治疗哺乳动物中的癌症的联合疗法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的本公开内容提供的结合分子和一种或多种另外的治疗剂。在另外的实施方案中，哺乳动物是人。

可将许多癌症治疗剂与结合分子组合使用。本领域技术人员公认其他癌症疗法的存在和发展，所述癌症疗法可以与本公开内容的方法和结合分子组合使用，并且不限于本文中所示的治疗形式。可在用于治疗癌症的联合疗法中使用的另外的治疗剂的类别的实例包括(1)化疗剂，(2)免疫治疗剂和(3)激素治疗剂。

术语“化疗剂”是指可引起癌细胞死亡或干扰癌细胞的生长、分裂、修复和/或功能的化学或生物学物质。化疗剂的实例包括WO2006/088639、WO 2006/129163和US 20060153808(其公开内容通过引用合并入本文)中公开的化疗剂。特定的化疗剂的实例包括：(1)烷化剂，例如苯丁酸氮芥(Leukeran)、环磷酰胺(mcyclophosphamide)(CYTOXAN)、异环磷酰胺(IFEX)、盐酸氮芥(MUSTARGEN)、塞替派(THIOPLEX)、链脲佐菌素(ZANOSAR)、卡莫司汀(BICNU，GLIADELWAFER)、洛莫司汀(CEENU)和达卡巴嗪(DTIC-DOME)；(2)生物碱或植物长春花生物碱，包括细胞毒性抗生素，例如多柔比星(ADRIAMYCIN)、表柔比星(ELLENCE，PHARMORUBICIN)、柔红霉素(CERUBIDINE，DAUNOXOME)、奈莫柔比星、伊达比星(IDAMYCIN PFS，ZAVEDOS)、米托蒽醌(DHAD，NOVANTRONE)、放线菌素D(放线菌素D，COSMEGEN)、普卡霉素(MITHRACIN)、丝裂霉素(MUTAMYCIN)和博来霉素(BLENOXANE)、酒石酸长春瑞滨(NAVELBINE)、长春碱(VELBAN)、长春新碱(ONCOVIN)和长春地辛(ELDISINE)；(3)抗代谢药例如卡培他滨(XELODA)、阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、氟达拉滨(FLUDARA)、吉西他滨(GEMZAR)、羟基脲(HYDRA)、甲氨蝶呤(FOLEX，MEXATE，TREXALL)、奈拉滨(ARRANON)、三甲曲沙(NEUTREXIN)和培美曲塞(ALIMTA)；(4)嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(XELODA)、雷替曲塞(TOMUDEX)、替加氟-尿嘧啶(UFTORAL)和吉西他滨(GEMZAR)；(5)紫杉烷(taxane)，例如多西他赛(TAXOTERE)、紫杉醇(TAXOL)；(6)铂类药物(platinum drugs)，例如顺铂(PLATINOL)和卡铂(PARAPLATIN)和奥沙利铂(ELOXATIN)；(7)拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康(CAMPTOSAR)、托泊替康(HYCAMTIN)、依托泊苷(ETOPOPHOS，VEPESSID，TOPOSAR)和替尼泊苷(VUMON)；(8)表鬼臼毒素(鬼臼毒素衍生物)，例如依托泊苷(ETOPOPHOS，VEPESSID，TOPOSAR)；(9)叶酸衍生物，例如亚叶酸(WELLCOVORIN)；(10)亚硝基脲例如卡莫司汀(BiCNU)、洛莫司汀(CeeNU)；(11)受体酪氨酸激酶，包括表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子(IGFR)、肝细胞生长因子受体(HGFR)和血小板源性生长因子受体(PDGFR)的抑制剂，例如吉非替尼(IRESSA)、厄洛替尼(TARCEVA)、硼替佐米(VELCADE)、甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)、吉非替尼(genefitinib)、拉帕替尼、索拉非尼、沙利度胺、舒尼替尼(SUTENT)、阿西替尼、利妥昔单抗、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、西妥昔单抗(ERBITUX)、贝伐珠单抗(AVASTIN)和来尼珠单抗(ranibizumab，LUCENTIS)、lym-1(ONCOLYM)、WO2002/053596中公开的抗胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)抗体；(12)血管生成抑制剂，例如贝伐珠单抗(AVASTIN)、苏拉明(GERMANIN)、血管抑素、SU5416、沙利度胺和基质金属蛋白酶抑制剂(例如巴马司他和马立马司他)，和WO2002055106中公开的那些；和(13)蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米(VELCADE)。

术语“免疫治疗剂”是指可增强哺乳动物的免疫应答的化学或生物学物质。免疫治疗剂的实例包括：卡介苗(BCG)；细胞因子例如干扰素；疫苗例如MyVax个性化免疫疗法、Onyvax-P、Oncophage、GRNVAC1、FavId、Provenge、GVAX、Lovaxin C、BiovaxID、GMXX和NeuVax；以及抗体例如阿仑珠单抗(CAMPATH)、贝伐珠单抗(AVASTIN)、西妥昔单抗(ERBITUX)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzunab ozogamicin)(MYLOTARG)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan，ZEVALIN)、帕尼单抗(VECTIBIX)、利妥昔单抗(RITUXAN，MABTHERA)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、托西莫单抗(BEXXAR)、tremelimumab、CAT-3888和WO2003/040170中公开的抗CD40受体的激动剂抗体。

术语“激素治疗剂”是指抑制或消除激素的产生，或抑制或抵消激素对癌细胞的生长和/或存活的作用的化学或生物学物质。适合用于本文中的方法的此类试剂的实例包括US20070117809中公开的那些。特定激素治疗剂的实例包括他莫昔芬(NOLVADEX)、托瑞米芬(Fareston)、氟维司群(Faslodex)、阿那曲唑(Arimidex)、依西美坦(Aromasin)、来曲唑(Femara)、醋酸甲地孕酮(Megace)、戈舍瑞林(Zoladex)和亮丙立德(Lupron)。本公内容的结合分子还可以与非药物激素疗法组合使用，所述非药物激素疗法例如(1)除去全部或部分的参与激素产生的器官或腺体例如卵巢、睾丸、肾上腺和垂体的手术方法，和(2)放射疗法，其中使患者的器官或腺体经历足以抑制或消除靶向的激素的产生的量的辐射。

用于治疗癌症的联合疗法还包括本公开内容提供的结合分子与除去肿瘤的手术的组合。可在手术之前、期间或之后对哺乳动物施用结合分子。

用于治疗癌症的联合疗法还包括本公开内容提供的结合分子与放射疗法例如电离(电磁)放射疗法(例如，X射线或γ射线)和粒子束放射疗法(例如，高线性能量辐射(high linear energy radiation))的组合。辐射源对于哺乳动物可以是外部的或内部的。可在放射疗法之前、期间或之后对哺乳动物施用结合分子。

结合分子和组合物的施用

可通过任何合适的施用的肠途径或胃肠外途径施用本公开内容提供的结合分子和组合物。术语施用的“肠途径”是指经由胃肠道的任何部分的施用。肠途径的实例包括口服、粘膜、口腔和直肠途径或胃内途径。施用的“胃肠外途径”是指除了肠途径以外的施用途径。施用的胃肠外途径的实例包括静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、瘤内、膀胱内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、经气管、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内、皮下或局部施用。可使用任何合适的方法施用本公开内容的抗体和组合物，例如通过口服摄取、鼻胃管、胃造口管(gastrostomy tube)、注射、输注、可植入的输注泵、和渗透泵。合适的施用途径和方法可取决于许多因素例如所使用的特定抗体、期望的吸收速率、所使用的特定制剂或剂型、待治疗的病症的类型或严重度、特定的作用部位和患者的状况，并且可由本领域技术人员容易地选择。

术语结合分子的“治疗有效量”是指对于期望的治疗目的是有效的量。例如，在增强免疫应答的背景中，“治疗有效量”是在刺激、激起、增加、提高或增强哺乳动物免疫系统的任何应答中有效的任何量。在治疗癌症的背景中，“治疗有效量”是足以在待治疗的哺乳动物中引起任何期望的或有益的效应的任何量，所述效应例如癌细胞的进一步生长或扩散的抑制、癌细胞的死亡、癌症复发的抑制、与癌症相关的疼痛的减轻或哺乳动物的提高的存活率。在预防癌症的方法中，“治疗有效量”是在对其施用了结合分子的哺乳动物中在延迟、抑制或预防癌症的起始中有效的任何量。结合分子的治疗有效量的范围通常为大约0.001至大约500mg/kg，更通常地为大约0.05至大约100mg/kg的哺乳动物体重。例如，所述量可以是大约0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg或100mg/kg的哺乳动物体重。在一些实施方案中，OX40R抗体的治疗有效量在大约0.1至30mg/kg的哺乳动物体重的范围内。待施用的精确剂量水平可由本领域技术人员容易地确定，其取决于许多因素，例如待治疗的病症的类型和严重度、所使用的特定结合分子、施用途径、施用时间、治疗的持续时间、所使用的特定的另外的疗法、待治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前的医疗史以及医学领域中熟知的类似因素。

通常在多个情况下施用结合分子或组合物。单个剂量之间的间隔可以是例如，每周1次、每月1次、每3个月1次或每年1次。示例性治疗方案使施用为每周1次，每2周1次，每3周1次，每4周1次，每月1次，每3个月1次或每3至6个月1次。OX40R抗体的典型给药方案包括静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用下列给药时间安排之一：(i)每4周1次，进行6个剂量，然后每3个月1次；(ii)每3周1次；(iii)3mg/kg体重1次，然后每3周1次，1mg/kg体重。

实施例

实施例1：OX40R抗体的制备

如下制备、选择和测定根据本公开内容的示例性抗体：

使用OX40R抗原的免疫和产生OX40R单克隆抗体的小鼠的选择：

使用人Ig转基因小鼠品系HCo7、HCo12、Hco17和Hco27以及人转染色体/转基因品系KM(Medarex，Inc.)制备抗人OX40R的完全人单克隆抗体。这些品系全都表达与从人分离的抗体无差别的完全人抗体。

在转基因品系中，分别如Chen等人(1993)EMBO J.12：821-830和WO 01/09187的实施例1中所述，纯合地破坏内源小鼠κ轻链基因和内源小鼠重链基因。此外，它们具有人κ轻链转基因，KCo5，如Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中所描述的。相反地，转基因品系在它们的人重链基因方面是独特的。HCo7品系具有美国专利：5,545,806、5,625,825和5,545,807中描述的HCo7人重链转基因；HCo12品系具有WO 01/09187的实施例2中描述的HCo12人重链转基因；Hco17品系具有Deshpande等人，US 2005/0191293A1的实施例8中描述的Hco17人重链转基因；Hco27品系具有2008年8月8日提交的PCT/US2008/072640的实施例5中描述的Hco27人重链转基因。KM品系具有Ishida等人，(2002)，Cloning and Stem Cells，4：91-102中描述的人微型染色体。

在Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；和PCT公开案WO98/24884中描述了HuMab小鼠的一般免疫接种方案。

从6-16周龄开始，用在Ribi佐剂中的15-25μg的纯化的人重组OX40R-Ig蛋白和经转染表达人OX40R的鼠前B细胞系300-19(Reth，M.G.等人，Nature 312 29：418-42，1984；Alt，F.等人，Cell 27：381-390，1981)免疫HCo7、HCo12、Hco17、Hco27和KM品系的HuMab小鼠。纯化的人重组OX40R-Ig蛋白是融合至人IgG1的恒定区的人OX40R的细胞外结构域(氨基酸1至220)的构建体。以3至28天的间隔通过腹膜内、皮下或至足垫(footpad)内的注射进行施用，进行多至总共10次的免疫。通过下述ELISA和FACS筛选监控免疫应答。

产生OX40R抗体的HuMab小鼠的选择：

为了选择产生结合OX40R的抗体的HuMab小鼠，获得免疫的小鼠的血液，然后就对纯化的人OX40R重组蛋白的特异性结合通过ELISA和就对表达全长人OX40R的细胞系的结合(但不与不表达OX40R的对照细胞系结合)通过FACS分析所述血液。

ELISA结合测定由Fishwild等人(1996)，Nature Biotechnology14：845-851进行了描述。简而言之，使用50μl/孔的纯化的重组OX40R-Ig溶液(含有1μg/ml，于PBS中)包被微量滴定板，在4℃下温育过夜。使用200μl/孔的PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清封闭孔。向各孔中加入来自OX40R免疫的小鼠的血浆的稀释物，在环境温度下温育1小时。用PBS/Tween清洗板，然后用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体在室温下温育1小时。在清洗后，用ABTS底物(Moss Inc.，product#：ABTS-1000mg/ml)对板进行显色，并在OD 405处用分光光度计进行分析。

按照常规方法进行FACS测定。简而言之，将表达OX40R的300-19细胞与以1∶20稀释的来自免疫的小鼠的血清一起温育。清洗细胞，然后用FITC-标记的抗人IgG Ab检测特异性抗体结合。在FACS流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)上进行流式细胞术分析。

将产生最高OX40R抗体滴度的小鼠用于融合。按下文所述进行融合，并通过ELISA和FACS就抗OX40R活性检测杂交瘤上清液。

产生抗OX40R的人单克隆抗体的杂交瘤的产生：

在杀死并且取出脾和/或淋巴结之前3天，用OX40R-Ig静脉内加强上文选择的小鼠，并在之前2天再次加强。

按照标准或厂商推荐的方案，使用电融合(E-fusion，CytoPulse^TM technology，Cyto Pulse^TM Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)将从免疫的HuMab或KM小鼠分离的脾细胞和/或淋巴结淋巴细胞与SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL-1581)融合。简而言之，制备来自免疫的小鼠的脾细胞和/或淋巴结淋巴细胞的单细胞悬浮液，然后将其与等数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞混合；然后进行E-fusion。

然后将细胞以2x10⁴个细胞/孔涂板在平底微量滴定板中，并在含有10％胎牛血清、10％ P388D1(ATCC，CRL-TIB-63)条件培养基、DMEM中的3-5％(IGEN)(Mediatech，Herndon，VA，Cat.No.CRL 10013，具有高葡萄糖、L谷氨酰胺和丙酮酸钠)、7mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、0.1IU/mL青霉素-0.1mg/mL链霉素和1x HAT(Sigma，Cat.No.CRL-P-7185)的选择培养基中温育10至14天。

在1至2周后，在其中用HT替代HAT的培养基中培养细胞。在细胞涂板后大约10至14天，就人γ、κ抗体的存在筛选来自单个孔的上清液。然后就人OX40R单克隆IgG抗体，通过ELISA和FACS(使用上述方案)筛选评定为人γ、κ阳性的上清液。将分泌抗体的杂交瘤转移至24孔板，再次进行筛选，并且如果对于人OX40R IgG单克隆抗体确认为阳性，则通过有限稀释将其亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。

实施例2：生物学/药理学实施例

A.体外研究方法：

与OX40R的细胞外结构域的结合：将在BupH^TM Carbonate缓冲液，pH 9.4(Pierce，Rockford，IL)中稀释的人OX40-Ig融合蛋白以100μl/孔(0.25μg/ml)包被在96孔Maxisorb板(Nunc，Roskilde，Denmark)上，并在4℃下温育过夜。用含有于PBS(Sigma，St Louis，MO)中稀释的0.05％的Tween 20(Sigma，St Louis，MO)的清洗缓冲液清洗板3次，并用300μl/孔的PBS中的0.5％ BSA(Sigma，St Louis，MO)在室温下封闭1小时。然后，清洗板，用不同浓度的于封闭缓冲液中稀释的抗人OX40反应性抗体(100μl/孔)进行温育，并在室温下温育1小时。然后清洗板，用封闭缓冲液中的25ng/ml的辣根过氧化物酶标记的抗人κ链抗体(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)在室温下温育1小时。最后，清洗测定板，加入100μl/孔的1-StepTurbo-TMB底物(Pierce，Rockford，IL)，于室温下进行30分钟。通过加入等体积的2M H₂SO₄终止反应，在Molecular Devices Spectra Max340(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上于450nm处读取吸光度。

基于FACS的对细胞表面OX40R的结合：将表达OX40R的细胞系(参见下文)或活化的原代外周血单核细胞(参见下文)用于估量人和短尾猴OX40受体上的结合。收获细胞，并使用清洗缓冲液在室温下进行清洗(5x10⁵/管)。清洗缓冲液由PBS、2％热灭活的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)和0.02％叠氮化钠(Sigma，St.Louis，MO)组成。然后，向于含有0.005mg/ml细胞松弛素B(Sigma，St.Louis，MO)的清洗缓冲液中稀释的细胞中加入100μl不同浓度的抗体(始于30ug/ml，使用3倍的滴定)。在室温下轻轻摇动细胞3小时。然后，清洗细胞2次，并重悬浮于装有冷清洗缓冲液的0.5ml/管中，然后收集10,000个事件，并使用Becton Dickinson FACSCalibur和CellQuest软件(San Jose，CA)进行分析。

Biacore测定：生物传感器生物特异性相互作用分析仪(BIAcore2000)使用表面等离子共振来测量CM5传感器芯片上的分子相互作用。测量由分子与传感器芯片的葡聚糖侧的相互作用引起的两种介质(玻璃与羧甲基化的葡聚糖)之间的折射率的变化并且报告为任意反射比单位(reflectance unit，RU)的变化，如厂商的使用注释中所详述的。

通过用0.05M N-羟基琥珀酰亚胺衍生化(由0.2M N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺介导)来活化CM5传感器芯片上的羧甲基化葡聚糖表面，进行7分钟。将浓度为500μg/ml的于10mM醋酸钠，pH 4.5中的链霉抗生物素蛋白(Sigma S-4762)以5μl/分钟的速率注射至3个表面(流动池-2、3和4)上，并且以大约2500RU共价固定至流动池表面。在固定过程中将35μl 10mM醋酸钠缓冲液注射至流动池-1上方以替代抗原，从而产生活化的空白表面(用于测量非特异性结合)。使用1M乙醇胺盐酸盐，pH 8.5进行所有4个流动池上的未反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯的灭活。在固定后，通过再生注射5μl的50mM NaOH 5次来清洗流动池以除去任何未反应或微弱结合的材料直至获得稳定的基线。

以5μl/分钟的流速将10μg/ml浓度的生物素化的CD134-muIg(Ancell 513-030)手工注射至流动池-2、3和4上方以获得3个表面密度：Fc-2＝150RU、Fc-3＝375RU和Fc-4＝580RU。制备不同的密度表面以监测结合期中质量运输(mass transport)限制的结合和解离过程中再结合的概率，这两个假象都受表面密度影响，必需避免。

在电泳缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨醇20(v/v))中在666nM至66pM的浓度范围内半对数制备OX40R抗体的系列稀释物。将流速设置为5μl/分钟，在传感器芯片上方注射25μl各浓度点的样品，在各注射抗体浓度之间进行5μl的50mM NaOH的再生注射。解离时间为5分钟。使用BIAevaluation3.0 global fit软件分析数据(单独分析各浓度点)。

表位表征：将表达相应于OX40的1-235氨基酸序列(细胞外和跨膜结构域)和CD40的216-278氨基酸序列(细胞内结构域)的重组人OX40-CD40融合构建体的300-19细胞用于抗体表位分析。将表达OX40-CD40的细胞系培养在补充有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、10mM hepes、1％青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和0.05mM 2-巯基乙醇(Gibco，Grand Island，NY)的RPMI培养基(Gibco，Grand Island，NY)中。在3ml的冷清洗缓冲液(PBS、2％ FBS和0.02％叠氮化钠)中清洗300-19.hCD134.2细胞(5x10⁵/管)1次。吸除细胞上清液，向细胞沉淀中加入100μl含有300μg/ml第一未缀合的OX40反应性抗体的清洗缓冲液，混合并且在4℃下温育30分钟。然后，向管中加入荧光染料标记的第二抗体，混合并且在4℃下再温育30分钟。OX40反应性荧光染料标记的抗体包括10μl藻红蛋白(PE)标记的Ber Act 35(Caltag Laboratories，Burlingame，CA.)、PE-标记的L106(BD Pharmingen，San Jose，CA)或Alexa Fluor647缀合的OX40R抗体。如厂商(Molecular Probes，Eugene，OR)所描述的，使用Alex Fluor 647蛋白标记试剂盒用荧光染料标记OX40R抗体。然后在染色后，将细胞用清洗缓冲液清洗3次，重悬浮于冷清洗缓冲液中，收集10,000个事件，使用Becton Dickinson FACSCalibur和CellQuest软件(San Jose，CA)进行分析。当第一抗体阻断第二荧光染料标记的抗体的染色80％以上时，抗体被确定为结合相同的表位。

抗体OX40配体-OX40R抑制测定：就它们阻断表达300-19人-OX40配体(L)的细胞与OX40-人IgG1融合蛋白包被的板的结合的能力检测抗体。将300-19-OX40L细胞系培养在补充有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、10mM HEPES、1％青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.05mM 2-巯基乙醇和0.5mg/ml遗传霉素(Gibco，Grand Island，NY)的RPMI培养基(Gibco，Grand Island，NY)中。OX40-人IgG1融合蛋白包含细胞外OX40蛋白的前220个氨基酸。将融合蛋白以100μl/孔(5μg/ml)于包被缓冲液(BupH，Carbonate-Bicarbonate缓冲液，Pierce，Rockford，IL)中包被至Nunc Maxisorb板(Nunc，Roskilde，Denmark)上，然后在4℃下温育过夜。然后，将板于纸巾上吸干以除去液体，使用封闭缓冲液(5％的于PBS中稀释的Carnation Milk)以200μl/孔进行封闭，在室温下温育2小时。用PBS清洗板，然后向测定板中加入(50μl/孔)不同稀释度的于PBS中稀释的抗体，在室温下温育30分钟。然后，以6x10⁵/孔向含有抗体的孔中加入50μl/孔的细胞(于PBS中)，在5％ CO₂的潮湿培养室中于37℃下再温育60分钟。用PBS轻轻地清洗板2次以除去非贴壁细胞，通过向各孔中加入200μl的20ug/ml荧光素二醋酸酯(Fluorescein Diacetate)(Sigma，St.Louis，MO)PBS溶液来测量孔中的细胞活性。将板在5％ CO₂潮湿培养室中于37℃下温育90分钟，然后在490nm处使用分光光度计(Spectra Max 340，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读板。

OX40R抗体的选择性测定(ELISA)：用100μl的0.25μg/ml的于BupH^TM Carbonate缓冲液，pH 9.4(Pierce，Rockford，IL)中稀释的人TNFα受体家族成员融合蛋白包被Maxisorb 96孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)，然后在4℃下温育过夜。检测的选择性受体融合蛋白包括CD40-Ig(Alexis Biochemicals，San Diego，CA)、CD137-Ig(R&D Systems，Minneapolis，MN)和CD271-Ig(AlexisBiochemicals，San Diego，CA)。每一个测定还包括作为阳性对照的OX40-Ig融合蛋白(内部构建体，Bioexpress，97/2117)。然后将板用含有0.05％的于PBS中稀释的Tween 20(Sigma，St Louis，MO)的清洗缓冲液清洗3次，用300μl 0.5％的于PBS(Sigma，St Louis，MO)中的BSA(Sigma，St Louis，MO)在室温下封闭1小时。然后，清洗板，以不同的浓度向板中加入100μl/孔的抗人OX40反应性抗体，在室温下温育1小时。充分清洗板3次，在室温下用25ng/ml的辣根过氧化物酶标记的抗人κ链抗体(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)检测OX40R抗体结合，进行1小时。然后将板清洗3次，之后加入100μl/孔的1-Step Turbo-TMB底物(Pierce，Rockford，IL)，在室温下进行30分钟。通过加入等体积的2M H₂SO₄终止反应。在Molecular Devices Spectra Max 340(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上于450nm处读取吸光度。

物种交叉反应性：表达OX40R的细胞系：300-19细胞系表达相应于OX40R的1-235(细胞外和跨膜结构域)和CD40的216-278(细胞内结构域)的重组人OX40-CD40融合构建体或完整的短尾猴OX40R蛋白。

人T淋巴细胞的制备：将人全血收集入肝素化的注射器(Baxter；Deerfield，IL)，然后立即转移至Sigma Accuspin管(Sigma，St.Louis，MO)中以分离外周血单核细胞(PBMC)，如厂商所描述的。用DPBS清洗PBMC 2次，如厂商(R & D Systems，Minneapolis，MN)所描述的，使用T细胞纯化柱分离T淋巴细胞。简而言之，将PBMC重悬浮于2ml的柱缓冲液中，然后装载至预清洗的T细胞分离柱中。将PBMC在室温下温育10分钟并用柱缓冲液洗脱T细胞，清洗1次，以2x10⁶/ml重悬浮于由补充有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640(Sigma，St Louis，MO)和L-谷氨酰胺(2mM)、Hepes(10mM)、青霉素(100U/ml)、链霉素(50ug/ml)(Gibco，Grand Island，NY)组成的TCM中。向用5μg/ml的于PBS中的抗人CD3抗体克隆UCTH1(R&D Systems，Minneapolis，MN)预包被的24孔板(Costar，Corning，NY)的孔中加入2ml体积的含有1ug/ml的抗人CD28抗体(克隆37407，R&D Systems，Minneapolis，MN)的T细胞。在通过流式细胞术就人OX40交叉反应性进行检测之前刺激T细胞培养物3天。

短尾猴PBMC的制备：使用肝素化的vacutainer管(BD；FranklinLakes，NJ)获得短尾猴全血，将其以1∶4稀释于PBS中。混合稀释的全血，小心地将15ml铺在等体积的Histopaque 1077(Sigma，StLouis，MO)上。在室温下以1000xg将管离心45分钟，收获单核PBMC界面，在PBS中清洗一次，并在室温下用ACK裂解缓冲液(Biosource，Rockville，MD)将其重悬浮2分钟以除去任何RBC。在PBS清洗后，计数PBMC，并将其在组织培养基(TCM)中再调整至1x10⁶/ml。TCM由补充有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640(Sigma，StLouis，MO)和L-谷氨酰胺(2mM)、Hepes(10mM)、青霉素(100u/ml)、链霉素(50ug/ml)(购自Gibco(Grand Island，NY))组成。然后，向用10μg/ml的于PBS中的抗猴CD3抗体(克隆FN18，Biosource，Camarillo，CA)预包被的24孔板(Costar，Corning，NY)的孔中加入2ml的含有抗人CD28交叉反应性抗体(克隆CD28.2，BD Biosciences，San Diego，CA)的PBMC制剂。在通过流式细胞术就人OX40交叉反应性进行检测之前刺激PBMC培养物4天。

兔PBMC的制备：将兔全血抽入肝素化的vacutainer管(BD；Franklin Lakes，NJ)中，然后立即用温HBSS(Gibco，Grand Island，NY)以1∶3稀释。在混合后，小心地将5ml稀释的血液铺在等体积的Lympholyte-Rabbit(Cedarlane Laboratories，Westbury，NY)上，并在25℃下离心30分钟。收集PBMC界面，用PBS清洗2次，然后在含有10ng/ml的PHA的TCM(Remel，Lenexa，KS)中重悬浮至2x10⁶/ml。将细胞培养24至48小时。

狗PBMC的制备：使用肝素化的vacutainer管(BD；FranklinLakes，NJ)收集狗的全血。然后，将血液与等体积的温HBSS(Gibco，Grand Island，NY)混合。将4ml稀释的血液缓慢地在15ml圆锥形管中铺在3ml Lympholyte-M(Cedarlane Laboratories，Westbury，NY)上。以800xg将试管离心20分钟，收集PBMC界面，将其用HBSS清洗2次，以2x10⁶/ml重悬浮于TCM中。向24孔板的孔中加入PBMC(2ml/孔)，用2μg/ml的ConA(Sigma，St.Louis，MO)刺激细胞48小时。

鼠和大鼠PBMC的制备：将收集在肝素化的注射器中的大鼠全血以1∶3稀释于温HBSS中。然后，小心地将5ml铺在等体积的Lympholyte-Rat(Cedarlane Laboratories，Westbury，NY)上。以1500RPM将管离心20分钟。收集PBMC界面，清洗2次，将细胞沉淀在TCM中重新调整至2x10⁶/ml。向24孔板的各孔中加入2ml细胞，并在进行流式细胞术染色之前用10ng/ml的PHA(Remel，Lenexa，KS)刺激24-48小时。

物种交叉反应性的流式细胞术染色：将经刺激的小鼠、大鼠、兔、狗和短尾猴PBMC以及表达短尾猴OX40受体的300-19细胞系用于检测人OX40抗体的物种交叉反应性。将表达人OX40的活化的T淋巴细胞和OX40转导的300-19细胞用作阳性对照。在冷清洗缓冲液(PBS、2％FBS和0.02％叠氮化钠)中清洗细胞(5.0x10⁵/管)一次，向各管中加入100μl/管的5ug/ml的Alexa Fluor 647缀合的对照或OX40反应性抗体。如厂商所描述的，使用Alex Fluor 647蛋白标记试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)标记抗体。将细胞与荧光染料抗体一起于冰上在黑暗中温育30分钟，清洗3次，并重悬浮于0.5ml清洗缓冲液中以用于分析。使用Becton Dickinson FACSCalibur和CellQuest软件(San Jose，CA)测量和分析抗体染色。

萤光素酶活性测定：制备含有OX40的细胞外结构域和CD40的细胞内结构域(融合至含有萤光素酶的NfkB受体)的293T细胞。收获细胞，清洗细胞，然后将其以0.5X10⁶个细胞/ml的密度重悬浮入不含酚红的完全培养基(含有10％胎牛血清、HEPES缓冲液、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺的DMEM)中。将80ul的细胞铺板至96孔板(PerkinElmer，部件编号6005680)的各测定孔内。单独地或在交联抗体Fab′山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)存在的情况下向各孔中加入测试抗体。将板在37℃下温育过夜。第二天加入100ul萤光素酶(Promega，Bright-glo luciferassay system，Cat. # E2620)，使用闪烁计数器(TopCount，Packard-NXT)测量萤光素活性的量。

人αCD3 IL-2测定：在肝素化的(Baxter；Deerfield，IL)注射器中收集人全血，将其铺在Accuspin管(Sigma；St.Louis，MO)上，以2000rpm离心15分钟。收集血沉棕黄层，用PBS(Sigma，St.Louis，MO)清洗，然后用水裂解红细胞。利用人CD3⁺富集柱(R&D；Minneapolis，MN)分离出T细胞，计数并且将其在RPMI培养基(Gibco；Grand Island，NY)(含有：10％胎牛血清(Hyclone；Logan，UT)、10mM hepes、1％青霉素-链霉素、2mM L-谷氨酰胺和0.1mM非必需氨基酸(全部来自Gibco))中调整至1x10⁶/ml。同时，将2.5μg/ml的在PBS中的人抗CD3ε克隆#UCHT1(R&D systems，Minneapolis，MN)置于24孔板(Costar；Corning，NY)中，并在37℃下温育2小时。用PBS清洗板3次，然后向孔中加入下列物质：1x10⁶/孔的T细胞、OX40抗体(或IgG₂ KLH对照)的系列稀释物和F(ab′)₂山羊抗人IgG Fcγ(以2.5ug/mL加入)以进行交联。在第48和72小时吸取上清液，利用ELISA(R&D)估量IL-2的水平。

短尾猴αCD3 IL-2测定：将短尾猴全血收集在肝素化的管(BD；Franklin Lakes，NJ)中，以1∶4稀释于PBS中，铺在Histopaque 1077(Sigma，St Louis，MO)上，以2200rpm离心45分钟。收集血沉棕黄层，用PBS清洗，用水裂解红细胞。将细胞调整至1x10⁶/ml并加入至已用不同浓度的猴抗CD3，克隆FN-18(Biosource；Camarillo，CA)在37℃下预包被2小时的24孔板。将OX40抗体(或IgG₂ KLH对照)的系列稀释物以及2.5ug/mL的F(ab′)₂山羊抗人IgG Fcγ加至孔中。在第24和48小时收集上清液，并利用ELISA(Biosource，Camarillo，CA)估量IL-2的水平。

同种抗原引发的T细胞的测定：将新分离的人T细胞(参见上文)与丝裂霉素c处理的同种异体肿瘤细胞(Raji)一起温育3-4天。然后收获、清洗T细胞，并在用11D4刺激之前让其在新鲜培养基中静息1天。24小时后利用ELISA(R&D systems，Minneapolis，MN)估量IL-2的水平。

B.体内研究方法

使用植入了人T细胞和树突细胞的小鼠的SCID-米色人肿瘤模型：在到达后在使用之前，使SCID-米色小鼠(Taconic #CBSBG-MM)适应5至7天。使用下列肿瘤细胞系：RAJI，ATCC #CCL-86；BT-474，ATCC#HTB-20；PC-3，ATCC#-1435；和LoVo，ATCC# CCL-229。

如下从人血制备纯化的T淋巴细胞(T细胞)和单核细胞来源的树突细胞：使用Sigma Accuspin管#A7054从肝素化的血液中收集人单核细胞。收集细胞，将其置于T75烧瓶中，在37℃于5％ CO₂下在潮湿培养箱中温育3小时。收集并且保存非贴壁细胞(参见下文)。用20ml补充有10ng/ml IL-4(R&D)和100ng/ml GM-CSF(R&D)的RPMI完全培养基(含有10％胎牛血清)温育含有贴壁细胞的烧瓶。然后将培养物在37℃于5％ CO₂下在潮湿的培养箱中温育6至7天。然后通过倒出(decanting)和用RPMI完全培养基漂洗烧瓶数次来收集非贴壁单核细胞衍生的树突细胞。

按照厂商的说明书，使用T细胞富集柱(R&D)，通过高亲和力负选择将原始非贴壁单核细胞用于纯化T细胞。将纯化的T细胞以10⁷/ml冷藏保存在Recovery-Cell Culture Medium中，并且贮存在液氮中直至使用。肿瘤细胞(1x10⁷)与来自相同供体的T细胞(1x10⁶)和单核细胞来源的树突细胞(5x10⁵)一起进行皮下(SC)注射，以0.2mL/小鼠。在一段时间内使用测径器监测肿瘤生长。

C.关于抗体11D4的结果

(1)体外研究：

来自体外研究的抗体11D4的某些特性概述于表3中。

抗体11D4以高亲和力结合OX40R。

这可通过使用包含OX40R的细胞外结构域的IgG1融合蛋白和在完整细胞(OX40R+转染的细胞和活化的原代T细胞)上来证明。在使用IgG1融合蛋白的实例中，11D4以0.5+/-0.18μg/mL(3.5nM)的EC₅₀结合OX40R的细胞外结构域。该结合在表达OX40R的全长细胞外结构域的300-19前B细胞上得到验证(在亲本300-19细胞上未观察到结合)。与OX40R转染的细胞的结合的EC₅₀是0.2+/-0.16μg/mL(1.7nM)。为了确认在原代T细胞上观察到结合，从多个人供体分离外周血T细胞，用抗CD3和抗CD28刺激2天以上调OX40R的表达。此类T细胞的饱和结合数据显示11D4以0.6+/-1.0μg/mL(4.0nM，N＝17个供体)的EC₅₀结合。这些数据证明11D4强烈地结合OX40R。

为了进一步表征该结合，收集数据以评估OX40R的细胞外结构域上的11D4与其相互作用的区域，并确定受体在结合后是否被内化。针对OX40R IgG1融合蛋白的竞争结合数据显示11D4与表达OX40配体的细胞竞争结合，这提供了11D4在受体的配体结合区相互作用的证据。此外，11D4不与两种可商购获得的OX40R抗体BerAct35和L106交叉竞争与T细胞的结合，如通过FACS分析评估的。使用非竞争性检测抗体进行的FACS分析显示OX40R在用11D4预温育原代活化的T细胞30分钟后未发生内化。其结合亲和力(使用OX40R细胞外结构域融合蛋白作为固定的配体，利用Biacore分析确定)显示11D4对于结合的平衡解离常数(KD)为0.48nM。这些分析还估量11D4的解离速率常数(kd)为5.72E-051/s。因此，11D4以高亲和力结合OX40R的配体结合区域，具有缓慢的解离速率常数，并且在结合后不内化受体。

抗体11D4选择性结合OX40R。

使用与包含相关受体的各自细胞外结构域的IgG1融合蛋白构建体相关的数据估量11D4对OX40R(与TNFR超家族的其他成员相比)的选择性。此类受体包括CD40受体、4-1BB受体(CD137)和神经生长因子受体(CD271)。在所有情况下，在高至100μg/mL(700nM)的浓度下在此类受体上没有观察到显著的结合。当与观察到的与OX40R融合蛋白的结合(EC₅₀＝0.5ug/ml)相比较时，这些数据显示11D4对OX40R的选择性比测试的其他相关家族成员高100倍。(参见图1a和1b)。

抗体11D4的功能活性：

在OX40R+转染的细胞上和在原代T细胞上都显示了11D4的功能活性。在这些测定中，当在二抗F(ab′)₂山羊抗人IgG Fcγ存在或不存在的情况下加入至细胞时，11D4显示激动剂活性。

在第一组实验中，使用用融合至CD40的细胞内结构域的OX40R的细胞外和跨膜结构域(具有NFkB萤光素酶报告分子)转染的293细胞就激动剂活性估量11D4。在该测定中，11D4通过OX40R增强信号转导，平均EC₅₀为0.33μg/mL(2.2nM，N＝4)。11D4诱导萤光素酶的代表性浓度响应曲线示于图2中。在F(ab′)₂二抗不存在的情况下，萤光素酶活性的量值连同EC₅₀一起减少4倍。

作为11D4的激动剂活性的另外证据，产生抗原特异性T细胞。将新分离的人T细胞与丝裂霉素c处理的同种异体肿瘤细胞(Raji)一起温育3至4天。然后收获、清洗T细胞，并在用11D4刺激之前让其在新鲜培养基中静息1天。FACS分析显示即使在静息后在这些细胞上仍然存在高水平的OX40R表达。11D4诱导此类细胞产生高水平的IL-2，在一些情况下超过100ng/mL(图3)。来自2个分开的实例的该响应的平均EC₅₀为0.008+/-0.006μg/mL。在11D4不存在的情况下，此类细胞只分泌最低水平的IL-2。

11D4还增强抗CD3刺激的原代人T细胞产生IL-2。虽然该测定中的信噪比由于单独的抗CD3对IL-2的诱导而在一些测定中较低，但当与F(ab′)₂山羊抗人IgG Fcγ一起加入时，11D4增加IL-2的产量。在抗CD3不存在的情况下未观察到11D4对新分离的T细胞的活性。取决于供体和由抗CD3产生的IL-2的量，与单独的抗CD3相比，11D4产生的IL-2增加的量的范围在2.3至57倍之间。11D4对用2.5μg/mL抗CD3刺激的原代T细胞产生IL-2的作用示于图4(使用8点浓度曲线，1∶3稀释度)。根据使用8点浓度响应曲线的数据计算的平均EC₅₀为0.042+/-0.01μg/mL(参见表4)。

还使用用抗CD3和11D4(与F(ab′)₂二抗一起)刺激的猴细胞测定11D4对IL-2产生的功能活性。结果示于图5和表5中。这些数据表明11D4的EC₅₀在猴与人细胞(0.022对0.042μg/mL(对于人细胞))之间相似，但使用短尾猴T细胞产生的诱导的IL-2高于单独的抗CD3诱导的IL-2的量值显著较低(大约35倍，5762+/-4748pg/mL IL-2(对于人细胞，N＝21)对261+/-294pg/mL IL-2(对于猴细胞，N＝9)

物种交叉反应性：

就其结合来自多个物种的T细胞的能力估量11D4。从小鼠、大鼠、兔、狗和猴分离T细胞，并且用抗CD3加抗CD28或促有丝分裂原进行活化。没有观察到与小鼠、大鼠、兔或狗细胞的结合，如FACS分析所显示的。对小鼠OX40R的结合的缺乏还可使用可商购获得的包含鼠OX40R的细胞外结构域的融合蛋白，通过ELISA来验证。相反地，11D4结合短尾猴T细胞，如通过FACS在饱和结合测定中所确定的。使用不同猴子获得的EC₅₀值的范围示于图6。为了进行比较，将使用人细胞获得的EC₅₀值的范围示于图7中。虽然是可变的，但EC₅₀值的范围在猴与人细胞之间是相似的(平均值为0.354μg/mL(对于猴子)对0.566μg/mL(对于人细胞))。

(2)体外研究：

11D4与鼠OX40R的交叉反应性的缺乏需要发展使用严重联合免疫缺陷(SCID)米色小鼠的异种肿瘤模型。SCID米色小鼠缺乏鼠T和B淋巴细胞以及NK细胞，从而使得它们成为人免疫细胞植入和人肿瘤生长的理想受体。在体内模型中检测代表不同肿瘤类型的4个肿瘤细胞系。没有一个肿瘤系表达OX40R。在所有情况下，肿瘤细胞(1x10⁷)与来自相同供体的T细胞(1x10⁶)和单核细胞来源的树突细胞(5x10⁵)一起进行皮下(SC)注射。如表6中所概述的，通过腹膜内(IP)注射施用的11D4在这些模型中抑制肿瘤生长多至98％。由于其施用的容易性和至外周血内的快速散布，选择IP施用途径用于11D4。

SCID米色小鼠中11D4抗B细胞淋巴瘤的功效：

用Burkitt′s B细胞淋巴瘤Raji与人T细胞和单核细胞来源的树突细胞一起皮下注射SCID米色小鼠。小鼠在肿瘤注射的同时接受11D4或同种型对照抗体(IgG2抗-KLH)的单次IP注射。如图8中所示，11D4减小了处理的动物中肿瘤生长的速度。在攻击后第21天，各个体动物(N＝10)中肿瘤的大小示于图9，其说明了10mg/kg的剂量水平导致64％的肿瘤生长的抑制。在T细胞和树突细胞不存在的情况下未观察到活性。

11D4在前列腺肿瘤模型中的功效：

将前列腺腺癌PC-3与人T细胞和单核细胞来源的树突细胞一起皮下注射SCID米色小鼠。在肿瘤注射的同时，小鼠接受11D4或同种型对照抗体(IgG2抗KLH)的单次IP注射。示于图10中的结果显示11D4处理导致肿瘤生长的剂量依赖性抑制。在攻击后第27天，来自本研究的各个体动物(N＝10)的肿瘤大小示于图11中，其说明当对动物施用1.0mg/kg 11D4的单次注射时产生70％的肿瘤生长抑制，在10mg/kg的剂量上产生90％的抑制。在此类动物中在第27天测定的11D4的血浆水平为6.2μg/mL(以1.0mg/kg的剂量水平施用时)。

11D4在结肠癌肿瘤模型中的功效：

将结肠直肠腺癌LoVo与人T淋巴细胞和自体单核细胞来源的树突细胞一起皮下注射SCID米色小鼠。在肿瘤注射的同时，小鼠接受11D4或对照抗体(IgG2抗KLH)的单次IP注射。示于图12中的结果显示11D4剂量依赖性地减少此类动物中肿瘤的生长。在攻击后第27天，来自本研究的各个体动物(N＝10)的肿瘤大小示于图13中，其说明了使用1.0mg/kg的单次剂量产生64％的肿瘤生长的抑制，在10.0mg/kg的剂量水平上产生87％的肿瘤生长的抑制。

11D4在乳腺癌肿瘤模型中的功效

将乳腺癌BT474与人T淋巴细胞和自体单核细胞来源的树突细胞一起皮下注射SCID米色小鼠。小鼠在肿瘤注射的同时和在之后30天2次接受11D4或对照抗体(IgG2抗KLH)的注射(IP)。示于图14中的结果显示11D4减少此类动物中肿瘤的生长。在攻击后第85天，来自本研究的各个体动物(N＝10)的肿瘤大小示于图15中，其说明在10.0mg/kg的剂量水平上产生98％的肿瘤生长的抑制，在1mg/kg的剂量上产生85％的抑制。

D.关于抗体18D8的结果

(1)体外研究：

来自抗体18D8的体外研究的结果概述于表7中。

抗体18D8对抗CD3诱导的来自不同供体的原代人T细胞产生IL-2的作用也示于表8中。

(2)体内研究：

SCID-米色小鼠模型中18D8抗B细胞淋巴瘤的功效

用Burkitt′s B细胞淋巴瘤Raji与人T淋巴细胞和自体单核细胞来源的树突细胞一起皮下注射SCID-米色小鼠。小鼠在肿瘤注射时接受18D8或同种型对照抗体(IgG2抗KLH)的单次腹膜内(IP)注射。在各研究中使用每组10只动物。来自两个研究的结果示于表9中。结果显示18D8在1.0mg/kg和10mg/kg的剂量上产生显著的抗肿瘤功效。在T细胞和树突细胞不存在的情况下未观察到活性，这表明该抗肿瘤效应可能是免疫介导的。

SCID-米色小鼠模型中18D8抗前列腺肿瘤的功效

用前列腺腺癌PC-3与人T淋巴细胞和自体单核细胞来源的树突细胞一起皮下注射SCID-米色小鼠。小鼠在肿瘤注射时接受18D8或同种型对照抗体(IgG2抗KLH)的单次腹膜内注射。在研究中使用每组10只动物。结果示于表9中。结果显示18D8处理在0.1mg/kg、1.0mg/kg和10mg/kg的剂量上分别产生42％、90％和88％的肿瘤生长的抑制。

保藏信息

申请人已在2007年7月10日将含有编码抗体11D4的重链的质粒的大肠杆菌DHα5的培养物和含有编码抗体11D4的轻链的质粒的大肠杆菌DHα5的培养物保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，所述培养物分别被分配保藏号PTA-8524和PTA-8525。在布达佩斯条约的关于国际承认用于专利程序的微生物保藏的条款和其下细则(布达佩斯条约)下进行这些保藏。这些保藏物将在ATCC保藏单位无限制地维持30年，或在收到最新请求后5年，或专利的有效期(无论哪个更长)，并且如果保藏物在该时期内变得无活力，那么其将被替换。保藏材料的可获得性不应解释为对在违背任何政府根据其专利法授予的权利的情况下实施本发明的许可。

本说明书中引用的所有参考文献，包括但不限于所有论文、公开案、专利、专利申请、书、期刊论文以其全文通过引用合并入本说明书。本文中参考文献的论述意欲只概述由它们的作者所作的论断，而不承认任何参考文献构成现有技术。

虽然为了清楚地理解，通过举例说明和实施例较详细地描述了上述发明，但根据本文中的教导，对于本领域技术人员来说很显然的是可对本发明进行某些变化和改动而不背离所附权利要求的精神或范围。

表1.抗体11D4和18D8的序列标识符

SEQ ID NO：	抗体	序列
			1	11D4	V_H CDR1氨基酸
2	11D4	V_H CDR2氨基酸
			3	11D4	V_H CDR3氨基酸
4	11D4	V_L CDR1氨基酸
			5	11D4	V_L CDR2氨基酸
6	11D4	V_L CDR3氨基酸
			7	11D4	V_H氨基酸
8	11D4	V_L氨基酸
			9	11D4	重链氨基酸
10	11D4	轻链氨基酸
			11	11D4	V_H核酸
12	11D4	V_L核酸
			13	18D8	V_H CDR1氨基酸
14	18D8	V_H CDR2氨基酸
			15	18D8	V_H CDR3氨基酸
16	18D8	V_L CDR1氨基酸
			17	18D8	V_L CDR2氨基酸
18	18D8	V_L CDR3氨基酸
			19	18D8	V_H氨基酸
20	18D8	V_L氨基酸
			21	18D8	重链氨基酸
22	18D8	轻链氨基酸
			23	18D8	V_H核酸
24	18D8	V_L核酸

表2A.抗体11D4的氨基酸序列

描述	序列(可变区以大写字母表示，恒定区以小写字母表示，CDR以下划线表示)
		重链	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
轻链	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

表2B.抗体18D8的氨基酸序列

描述	序列(可变区以大写字母表示，恒定区以小写字母表示，CDR以下划线表示)
		重链	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDOSTADYYFYYGMDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclVkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsffiyskltvdksrvqqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
轻链	EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASOSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

表3.抗体11D4的某些体外特性的概述

值表示平均值+/-1个SD。

表4.抗体11D4对抗CD3诱导的原代人T细胞产生IL-2的作用

EC₅₀(μg/mL)	Max IL-2(pg/mL)	ECmax(μg/mL)	刺激指数	供体
					0.008	4831	0.05	3.8	1
0.011	5450	0.05	2.6	2
					0.014	6571	0.5	2.3	3
0.014	7271	0.05	5.9	4
					0.011	6313	0.05	9.1	5
ND	ND	ND	7.0	6
					0.010	1006	0.05	4.8	7
ND	ND	ND	5.9	8
					ND	ND	ND	25.4	9
ND	ND	ND	57.0	10
					ND	ND	ND	8.3	11
ND	ND	ND	5.1	12
					ND	ND	ND	2.7	13
ND	ND	ND	4.6	14
					0.014	4687	0.05	6.0	15
0.014	3012	0.05	35.2	16
					ND	ND	ND	21.4	17
0.029	2796	0.125	3.8	18
					0.052	1718	0.125	5.5	19
0.020	14190	0.56	16.8	20
					0.068	1611	1.67	7.9	21

Max IL-2：用在ECmax上的11D4产生的高于单独的抗CD3的IL-2的量。ECmax：产生高于单独的抗CD3的最高水平的IL-2的11D4的浓度。刺激指数：用11D4产生的IL-2的最高水平对用单独的抗CD3产生的IL-2的量的比。

ND＝未确定的。

最后4个供体(18-21)的值来自以8点1∶3或1∶4稀释度产生的剂量响应曲线；所有其他值代表对数稀释曲线。来自1∶3和1∶4浓度曲线的EC₅₀为0.042+/-0.01ug/mL，N＝4。

表5.抗体11D4对抗CD3诱导的短尾猴T细胞产生IL-2的作用。

EC₅₀(μg/mL)	Max IL-2诱导的(pg/mL)	ECmax(μg/mL)	刺激指数	供体
					0.007	376	0.05	3.5x	32750
0.002	116	0.05	2.2x	2325
					ND	ND	ND	2.0x	32405
0.007	167	0.05	34.4	32081
					0.011	978	0.005	5.6x	32842
ND	ND	ND	6.3x	2325
					0.008	40	0.021	2.7x	33081
0.031	168	0.062	5.0x	33080
					0.028	128	0.062	3.8x	33062

Max IL-2：用在ECmax上的11D4产生的高于单独的抗CD3的IL-2的量。ECmax：产生高于单独的抗CD3的最高水平的IL-2的11D4的浓度。

刺激指数：用11D4产生的最高IL-2对用单独的抗CD3产生的量的比。ND＝未确定的。

表6中最后3个供体(33081、33080和33062)的值来自以8点1∶3稀释度产生的剂量响应曲线；所有其他值代表对数稀释曲线。来自使用1∶3稀释度的曲线的EC₅₀为0.022+/-0.01；N＝3。

表6.植入了人T细胞和树突细胞的SCID-米色小鼠中由抗体11D4产生的人肿瘤生长的抑制

肿瘤类型

用11D4给药

研究持续时间

10mg/kg

1.0mg/kg

0.1mg/kg

0.01mg/kg

Raji：B细胞淋巴瘤

第1天

21天

64％

42％

27％

nd

Raji：B细胞淋巴瘤

第1天

21天

nd

75％

42％

8％

Lovo：结肠癌

第1天

25天

76％

44％

20％

nd

Lovo：结肠癌

第1天

25天

87％

64％

15％

nd

PC3：前列腺

第1天

27天

90％

77％

45％

nd

PC3：前列腺

第1天

27天

90％

70％

50％

nd

BT474：乳腺

第1天和第30天

85天

98％

85％

46％

nd

值＝研究结束时测定的肿瘤生长的抑制％

nd＝未检测到

表7.使用抗体18D8的体外研究的结果

以μg/ml表示的活性值表示平均值+/-1个SD。

表8.抗体18D8对抗CD3诱导的原代人T细胞产生IL-2的作用

EC₅₀(μg/mL)	Max IL-2(pg/mL)	ECmax(μg/mL)	刺激指数	供体
					0.013	1120	0.05	13.7	LC
0.024	4334	0.5	5.1	TH
					0.024	2280	0.5	5.4	KO
0.135	1356	0.5	2.4	RN

Max IL-2：用在ECmax上的18D8产生的高于单独的抗CD3的IL-2的量。ECmax：产生高于单独的抗CD3的最高水平的IL-2的18D8的浓度。刺激指数：用18D8产生的最高IL-2对用单独的抗CD3产生的量的比。值代表对数稀释曲线。

表9.SCID-米色小鼠中抗体18D8对人肿瘤生长的抑制

值＝研究结束时测定的肿瘤生长的抑制％

nd＝未确定的

序列表

<110>Pfizer Inc.and Medarex Inc.

<120>人0X40受体的结合分子

<130>PC33601

<160>24

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>1

Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>2

Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>3

Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr

1 5

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>4

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>5

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>6

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210>7

<211>118

<212>PRT

<213>人

<400>7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>9

<211>444

<212>PRT

<213>人

<400>9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210>10

<211>214

<212>PRT

<213>人

<400>10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>11

<211>354

<212>DNA

<213>人

<400>11

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catagactac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attattgtgc gagagaaagc 300

ggctggtacc tctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354

<210>12

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>12

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120

gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210>13

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>13

Asp Tyr Ala Met His

1 5

<210>14

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>14

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>15

Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210>16

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>16

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210>17

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>17

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210>18

<211>8

<212>PRT

<213>人

<400>18

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

1 5

<210>19

<211>124

<212>PRT

<213>人

<400>19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>20

<211>106

<212>PRT

<213>人

<400>20

Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210>21

<211>450

<212>PRT

<213>人

<400>21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gln Ser Thr Ala Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn

195 200 205

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg

210 215 220

Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210>22

<211>213

<212>PRT

<213>人

<400>22

Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>23

<211>372

<212>DNA

<213>人

<400>23

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatcag 300

agtacagctg attactactt ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210>24

<211>318

<212>DNA

<213>人

<400>24

gaaattgtgg tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgacgtt cggccaaggg 300

accaaggtgg aaatcaaa 318

Claims

1.结合人OX40R的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的重链CDR1；

(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的重链CDR2；

(c)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的重链CDR3；

(d)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的轻链CDR1；

(e)由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和

(f)由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

2.结合人OX40R的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)由SEQ I D NO：7的氨基酸序列组成的重链可变区；和

(b)由SEQ I D NO：8的氨基酸序列组成的轻链可变区。

3.权利要求1-2任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其：

(a)以1x10^-6M或更小的K_D结合人OX40R；和

(b)对人OX40R具有激动剂活性。

4.权利要求1-2的任一项的抗体或其抗原结合片段，其为人抗体。

5.权利要求1-2的任一项的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体或人源化抗体。

6.权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以100nM或更少的K_D结合人OX40R。

7.结合人OX40R的分离的人单克隆抗体，其包含由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的轻链。

8.一种组合物，其包含权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段，以及任选地可药用的载体。

9.权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗人或猴中的癌症，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌或B细胞淋巴瘤。

10.权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防人或猴中的癌症，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌或B细胞淋巴瘤。

11.权利要求1-5的任一项的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于增强人或猴中的T细胞活性。

12.权利要求9-11任一项的用途，其中所述抗体是人抗体。

13.权利要求12的用途，其中所述抗体是权利要求7的人抗体。

14.由编码权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列组成的分离的核酸分子。

15.权利要求14的核酸分子，其包含选自SEQ ID Nos：11或12的核苷酸序列。

16.包含权利要求14或权利要求15的核酸分子的载体。

17.权利要求16的载体，其还包含与所述核酸分子有效连接的表达控制序列。

18.包含权利要求16或权利要求17的载体的宿主细胞。

19.权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段或包含权利要求1-5任一项的抗体或其抗原结合片段的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制肿瘤细胞的生长，其中所述肿瘤细胞选自乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌或B细胞淋巴瘤的细胞。