MXPA02000962A

MXPA02000962A - Anticuerpos monoclonales humanos para her2/neu.

Info

Publication number: MXPA02000962A
Application number: MXPA02000962A
Authority: MX
Inventors: Deo Yashwant
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2002-07-02
Also published as: NZ517372A; IL147765A0; WO2001009187A9; DE60037896D1; AU6375000A; KR20020047098A; WO2001009187A3; JP2003516718A; CN1399645A; CA2380813A1; EP1210372B1; WO2001009187A2; ATE384744T1; EP1210372A2; HK1049014A1

Abstract

Se describen los anticuerpos monoclonales humanos, aislados, y las porciones para union al antigeno de estos que se unen especificamente a HER2/neu. Tambien se describen las moleculas bi- y multiespecificas que incluyen los anticuerpos monoclonales humanos y las porciones para union al antigeno de estos que se unen especificamente a HER2/neu. Los anticuerpos humanos se pueden producir en un animal transgenico no humano, por ejemplo, un raton transgenico, capaz de producir multiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos por recombinacion V-D-J e intercambio del isotipo. Tambien se describen las composiciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos humanos, los animales transgenicos no humanos e hibridomas que producen los anticuerpos humanos, y los metodos terapeuticos y de diagnostico para utilizar los anticuerpos humanos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA HER2/neu Antecedentes de la invención Los factores de crecimiento y sus receptores cognados regulan la proliferación y diferenciación celular, y las alteraciones en la estructura, función y expresión del receptor del factor de crecimiento han sido implicadas en la transformación y oncogénesis celular. Algunos proto-oncógenos conocidos codifican un factor de crecimiento o un receptor del factor de crecimiento, como puede ser c-sis que codifica la cadena B del factor de crecimiento proveniente de plaquetas (PDGF) y el c-erbB que codifica el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) . El oncógeno neu también conocido como ERBB2 ó HER-2, esta implicado en la malignidad de algunos adenocarcinomas humanos, en especial tumores de mama y ovario. (1,2) el pl85 HFR? (HER2/neu) , el producto proteinico del gen de c-erbB-2, es un receptor proteina tirosina cinasa de transmembrana que es homólogo al receptor de EGF, y se considera que desempeña una función importante en la regulación del crecimiento y diferenciación celular. Algunos modelos sugieren que la forma oncogénica de pl85 HFR? tiene una mutación transmembranal con creciente capacidad para dimerizar e internalizar, asi como actividad incrementada de la tirosina cinasa (3,4,5).

El HER2/neu es un objetivo terapéutico candidato 5 para el tratamiento de cáncer humano, en especial cáncer de mama (ß) . Los anticuerpos que se unen y modulan la función del receptor del factor de • crecimiento tienen uso potencial en inmunoterapia, asi como en el diagnóstico y pronóstico de tumores humanos. 10 Se han desarrollado los anticuerpos monoclonales para HER2 y se ha demostrado que tienen un efecto antitumoral y para inhibir el crecimiento de células tumorales en cultivo y en modelos animales (2,7,8). Por ejemplo, en células transformadas con neu, se requiere 15 la expresión en la superficie celular de pl85neu para el mantenimiento del fenotipo transformado, y el tratamiento in vivo con anticuerpos anti-pl85neu da origen a la inhibición del crecimiento tumoral en ratones inoculados con células transformadas con neu 20 (9) . Más aún, el tratamiento de las células de cáncer • de mama humano positivas para HER2/neu, positivas para el receptor de estrógenos (ER) con una combinación de tomoxifen y el anticuerpo contra HER2/neu mejoró en comparación con el agente solo (8). 25 Í í-^AL.;,-.; tt . «. . . . ,- _ .i • ._*sk¡? _ -¿t-iá-a-,, Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar estrategias mejoradas para elegir el HER2/neu y para proporcionar alternativas más seguras y menos tóxicas a la terapia actual para cáncer humano.

Compendio de la invención La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen específicamente al receptor de HER2/neu, asi como a las composiciones que contiene uno o una combinación de estos anticuerpos. En ciertas modalidades, el anticuerpo humano también se caracteriza por unirse al receptor de HER2/neu con alta afinidad, y por inhibir el crecimiento y/o mediar la muerte celular de células que expresen HER2/neu ( in vi tro e in vivo) en presencia de células efectoras humanas. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden utilizarse como agentes de diagnóstico o terapéuticos in vivo e in vi tro .

Los anticuerpos humanos aislados de la invención comprenden los diferentes isotipos de anticuerpos, como pueden ser IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM. IgAl, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Por lo regular, estos incluyen los isotipos IgGl (por ejemplo el IgGlk) el IgM. Los - % c t-->i _¿.s..ét ,, -¿-_^iíi^1 ^ji^^^^& ^aáí?ti anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgGl o IgG4) y pueden incluir solo una porción de unión al antigeno (por ejemplo un fragmento Fab, F(ab')2. Fv o un fragmento Fv monocatenario). En una modalidad, los anticuerpos humanos son anticuerpos humanos recombinantes. En otra modalidad, los anticuerpos humanos se producen mediante un hibridoma que incluye células B obtenidas de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, teniendo un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana fusionados a una célula inmortalizada. En las modalidades particulares, los anticuerpos se producen mediante hibridomas conocidos en la presente como 3.F2, 1.D2, 2.E8, 1.B10 y 3. B4.

En otra modalidad, los anticuerpos anti-HER2/neu humanos de la presente invención pueden ser caracterizados por una o más de las siguientes propiedades : especificidad para el receptor de HER2/neu; b) una afinidad de unión para HER2/neu con una constante de afinidad de cuando menos aproximadamente 10 7M-1, de preferencia aproximadamente 109M-1 y de mayor preferencia aproximadamente 10 M a 10 M o mayor; c) una constante de asociación (Kasoc) con HER2/neu de cuando menos aproximadamente 10 , de mayor preferencia 5 aproximadamente 10 y de mayor preferencia aproximadamente 10 5 M-1S-1; d) constante de disociación (Kdls) a partir de HER2/neu de aproximadamente 10 -3s-1, de preferencia 10 aproximadamente 10 -4s-1 , de mayor preferencia 10-5s-1, y de mayor preferencia 10 s ; e) la capacidad para opsonizar una célula que exprese HER2/neu; 15 f) la capacidad para inhibir el crecimiento y/o mediar fagocitosis y muerte de células que expresen HER2/neu (por ejemplo, una célula tumoral) en presencia de células efectoras humanas en una concentración de 20 aproximadamente 10 µg/mL o menos (por ejemplo, in vi tro) ; o g) la capacidad para ser internalizados por células que expresen HER2/neu después de la unión a 25 HER2/neu.

Los ejemplos de las células tumorales que pueden ser elegidos por los anticuerpos humanos de la invención incluyen, pero no se limitan a, célula de adenocarcinoma, por ejemplo, glándula salival, estómago y riñon, célula 5 de carcinoma de glándula mamaria, célula de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de células escamosas y células de cáncer de ovario.

En una modalidad, los anticuerpos humanos aislados 10 de la invención se unen al antigeno HER2/neu con una constante de afinidad de cuando menos aproximadamente 10 7M—1, de preferencia cerca de 10fiM—1 , más • preferentemente, cerca de 109M-1, y de mayor preferencia aproximadamente 10 has 10 M o más fuerte, y son 15 capaces de inhibir el crecimiento y/o mediar fagocitosis y muerte de células que expresen HER2/neu por las células efectoras humanas, por ejemplo por células polimorfonucleares (PMN) o macrofagos inducidos por IFN- _7 ?, con una CI50 de aproximadamente 1 x 10 M o menos, o 20 una concentración de aproximadamente 10 µg/mL o menos ín fl vi tro. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti- HER2/neu humano de la invención se caracteriza por inhibir el crecimiento y/o mediar citólisis y muerte de células que expresen HER2/neu en una concentración de 25 aproximadamente 5-10 µg/mL, de preferencia cerca de 1-5 µg/mL, y de mayor preferencia cerca de 0.5-1 µg/mL in vitro.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones que se unan al antígeno, de la invención. Por consiguiente, los vectores de expresión recombinantes que • incluyen ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de la invención, y las células hospederas transfectadas con 10 estos vectores, también están comprendidos por la invención, como también los métodos para preparar los anticuerpos de la invención cultivando estas células • hospederas . 15 En todavía otro aspecto, la invención proporciona células B aisladas a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo de un ratón transgénico, que sea capaz de expresar los diferentes isotipos (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) de los anticuerpos monoclonales humanos 20 que se unen específicamente a HER2/neu. De preferencia, • las células B aisladas se obtienen de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que haya sido inmunizado con una preparación purificada o enriquecida del antígeno HER2/neu y/o células que 25 expresen el receptor de HER2/neu. De preferencia, el animal transgénico no humano, por ejemplo el ratón transgénico, tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana. Las células B aisladas entonces se inmortalizan para proporcionar una fuente (por ejemplo un hibridoma) de los anticuerpos monoclonales humanos para HER2/neu.

• Por consiguiente, la presente invención también proporciona un hibridoma capaz de producir anticuerpos 10 monoclonales humanos que se unen específicamente a HER2/neu. En una modalidad, el hibridoma incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, teniendo un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un 15 transgen de la cadena ligera humana fusionados a una célula inmortalizada. El animal transgénico no humano puede ser inmunizado con una preparación purificada o enriquecida del antígeno HER2/neu y/o células que expresen el receptor de HER2/neu para generar hibridomas 20 productores de anticuerpos. Los hibridomas particulares A de la invención incluyen 3.F2, 1.D2, 2.E8, 1.B10 y 3. B4.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un animal transgénico no humano, como puede ser un ratón 25 transgénico (también mencionado en la presente como £..*.£* "HuMab"), que exprese los anticuerpos monoclonales humanos que se unan específicamente a HER2/neu. En una modalidad particular, el animal transgénico no humano es un ratón transgénico teniendo un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana. El animal transgénico no humano puede ser inmunizado con una preparación purificada enriquecida del antigeno HER2/neu y/o células que expresen el receptor de HER2/neu. De preferencia, el animal transgénico no humano, por ejemplo, el ratón transgénico, es capaz de producir múltiples isotipos de los anticuerpos monoclonales humanos para el receptor de HER2/neu (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) sometiéndose a recombinación V-D-J e intercambio del isotipo. El intercambio del isotipo puede ocurrir por, por ejemplo, intercambio de isotipo clásico o no clásico.

En otro aspecto, la presente invención propone los métodos para producir los anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan específicamente con HER2/neu. En una modalidad, el método incluye inmunizar un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, teniendo un genoma que comprenda un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana, con una preparación purificada o enriquecida del antigeno HER2/neu y/o células que expresen el receptor para HER2/neu. Las células B (por ejemplo, células B esplénicas) del animal entonces se obtienen y fusionan con células de mieloma para formar células de hibridoma, 5 inmortales, que secretan los anticuerpos monoclonales humanos contra HER2/neu.

Los anticuerpos monoclonales humanos anti-HER2/neu, aislados, de la invención o porciones que se unan al 10 antígeno de éstos, pueden ser derivados o ligados a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab' o anticuerpo ScFv, o un ligando de tumor) . Por ejemplo, un anticuerpo o porción que se una al antígeno de la invención puede estar 15 funcionalmente ligado (por ejemplo por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, como puede ser otro a anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o uno multiespecífico) . Por consiguiente, en 20 otro aspecto, la presente invención incorpora una fl§ molécula biespecífica o multiespecífica que comprende cuando menos una primera especificidad de unión para HER2/neu y una segundad especificidad de unión para un receptor de Fe, por ejemplo, el Fc?RI humano (CD64) o un 25 receptor para Fc? humano (CD89) . En una modalidad, estas moléculas bi- y multiespecíficas además incluyen un ligando de tumor, como puede ser EGF. Por consiguiente, las moléculas multiespecíficas de la invención también incluyen moléculas triespecíficas, tetraespecíficas y 5 otras multiespecíficas .

En una modalidad particular, las moléculas • biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden cuando menos un anticuerpo humano, o un 10 fragmento de éste (por ejemplo un Fab, Fab', F(ab') , Fv o un Fv monocatenario) . Tales moléculas bi- y triespecíficas pueden incluir múltiples porciones de ?k anticuerpos humanos, o fragmentos de estos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv monocatenario), y/o 15 también puede incluir porciones o fragmentos de anticuerpos "quiméricos" o "humanizados" (por ejemplo un anticuerpo "humanizado" que tenga una región variable, o cuando menos una región determinante de la complementariedad (CDR) , proveniente de un anticuerpo no 20 humano (por ejemplo murino) con la porción (es) restante fl siendo de origen humano) .

En general, las moléculas bi- y multiespecíficas de la invención incluyen cuando menos un anticuerpo o 25 fragmento de éste que se une a un receptor de Fe, como kt*?¿,íé*4 .tótf^i!~ á»M"'Jtál>- ?____r.,_ __****_. , puede ser un receptor de IgG humana, es decir, un receptor de Fc-gamma (Fc?R) , como puede ser Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32) y Fc?RIII (CDlß), o un FcaR humano (CD89) . Los receptores de Fe preferidos incluyen el 5 receptor Fc?RI y el receptor FcaR (CD89) de alta afinidad. FcaRI y Fc?RI son receptores activadores preferidos para uso en la invención por que estos: (1) se expresan principalmente en las células efectoras inmunes, por ejemplo, en monocitos, PMN, macrofagos y 10 células dendríticas; (2) se expresan en concentraciones altas (por ejemplo, 5,000-100,000 por célula); (3) son mediadores de las actividades citotóxicas (por ejemplo ADCC, fagocitosis); (4) median la presentación del antígeno mejorada de los antígenos, incluidos los 15 autoantigenos, dirigidos a estos. En una modalidad preferida, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas se unen a un receptor para Fe en un sitio que es distinto del sitio de unión de la inmunoglobulina (por ejemplo IgG o IgA) del receptor. 20 Por tanto, la unión de las moléculas biespecíficas y fl multiespecíficas no se bloquea por las concentraciones fisiológicas de las inmunoglobulinas.

En otro aspecto, la presente invención incorpora un 25 anticuerpo anti-HER2/neu humano, o un fragmento de este, conjugado a una porción terapéutica, por ejemplo a un medicamento citotóxico, una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de esta, un radioisótopo o un medicamento anti-cáncer molécula pequeña. 5 En otro aspecto, la presente invención proporciona las células efectoras específicas del objetivo que comprenden una célula efectora que expresa un receptor para Fe, por ejemplo, un macrofago o una célula PMN 10 activada, y una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención. ?k En otro aspecto, la presente invención proporciona las composiciones, por ejemplo, las composiciones 15 farmacéuticas y de diagnóstico, que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y cuando menos un anticuerpo monoclonal humano de la invención, o una porción que se una al antígeno de este, que se una específicamente a HER2/neu. En una modalidad. La 20 composición comprende una combinación de los anticuerpos fl humanos o porciones que se unen al antigeno de estos, de preferencia cada uno de los cuales se une a un epitope distinto. Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo monoclonal humano que medie la 25 muerte altamente eficaz de las células objetivo en presencia de células efectoras puede estar combinado con otro anticuerpo monoclonal humano que inhiba el crecimiento de las células que expresan HER2/neu. Así pues, la combinación proporciona tratamientos múltiples diseñados para proporcionar el efecto terapéutico máximo. Las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de cuando menos un anticuerpo monoclonal humano de la invención o porciones que se unan al antígeno de éste, y cuando menos una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención, también están dentro del alcance de la invención.

En todavía otro aspecto, la invención propone un método para inhibir la proliferación y/o diferenciación de una célula que expresa HER2/neu inhibiendo el crecimiento y/o induciendo fagocitosis y/o muerte de células diana mediante las células efectoras humanas, como pueden ser células polimorfonucleares humanas (PMN), utilizando un anticuerpo, o porción que se una al antígeno de éste (o un anticuerpo biespecífico o multiespecífico) de la invención. En una modalidad, el método comprende poner en contacto una célula que exprese el receptor de HER2/neu in vi tro o in vivo con uno o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos de la invención, o una porción que se una al antígeno de estos, en presencia de una célula efectora humana. El método puede emplearse en cultivo, por ejemplo, in vi tro o ex vivo (por ejemplo cultivos que comprendan células que 5 expresen el receptor de HER2/neu y células efectoras.) . Por ejemplo, una muestra que contenga células que expresen el receptor de HER2/neu y células efectoras • puede ser cultivado in vi tro, y combinado con un anticuerpo de la invención, o una porción que se una al 10 antígeno de éste (o una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención) . De otro modo, el método puede realizarse en un individuo, por ejemplo, como parte ?k de un protocolo in vivo (por ejemplo, terapéutico o profiláctico) . 15 Para los métodos in vivo, el anticuerpo, o la porción que se una al antígeno de éste (o una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención) , puede ser administrado a un humano que sufra de una enfermedad 20 relacionada con HER2/neu de modo que se induzca la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o muerte de células que expresan el receptor de HER2/neu. En una modalidad, el individuo puede además ser tratado con un agente que module, por ejemplo que mejore o inhiba, la 25 expresión o actividad del receptor para Fe, por ejemplo, un receptor de Fca o un receptor de Fc?, por ejemplo, tratando al individuo con una citocina. Las citocinas preferidas para la administración durante el tratamiento con la molécula biespecífica y multiespecífica incluye el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G- CSF) , el factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF), interferón-? (IFN-?) y PF factor de necrosis tumoral (TNF) . 10 Las composiciones de los anticuerpos monoclonales humanos aislados de la invención también pueden ser administradas en combinación con otros tratamientos wt conocidos, por ejemplo un tratamiento contra el cáncer. 15 Las enfermedades ejemplares que puede tratarse (por ejemplo aminorarse) o prevenirse utilizando los métodos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades tumorigénicas . Estas enfermedades tumorigénicas incluyen un adenocarcinoma, por ejemplo de 20 glándula salival, estomago y riñon, carcinoma de glándula ^ < mamaria, carcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas y cáncer de ovario.

En todavía otro aspecto, la presente invención 25 propone un método para detectar in vivo o in vi tro la presencia del antígeno HER2/neu en una muestra, por ejemplo para diagnosticar una enfermedad relacionada con HER2/neu. En una modalidad, esto se logra poniendo en contacto la muestra que va a ser probada, junto con una 5 muestra control, con un anticuerpo monoclonal humano de la invención o una porción que se una al antígeno de éste (una molécula biespecífica o multiespecífica) , en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y el HER2/neu. Entonces se detecta la 10 formación del complejo (por ejemplo utilizando ELISA) en ambas muestras, y cualquier diferencia estadísticamente importante en la formación de los complejos entre las fl muestras es un indicio de la presencia del antígeno HER2/neu en la muestra de prueba. 15 Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las cláusulas. 20 Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un diagrama esquemático de la inserción dirigida de un cásete neo en el sitio Smal del exon µl . La Sección A representa la estructura 25 genómica del locus µ, donde los cuadros oscuros representan los exones µ. La Sección B es un diagrama esquemático del vector orientador CmD. La Sección C representa el locus µ elegido en el que ha sido insertado el cásete neo en µl. 5 La Figura 2, Sección A es una gráfica de barras representando la unión de los anticuerpos anti-HER2/neu a partir de tres cultivos de hibridomas, 1.D2, 2.E8 y 3.F2, al HER2/neu recombinante, según se midió por ELISA; la 10 Sección B es una gráfica representando la unión de los anticuerpos anti-HER2/neu purificados 3.F2, 2E8, 1.D2, 1.B10 y 3.24 para el antígeno HER2/neu vertido de las ?k. células tumorales, según se midió por ELISA. 15 La Figura 3, Secciones A-C, son gráficas que comparan la unión de los anticuerpos monoclonales anti- HER2/neu humanos (1.D2, 2.E8, 3.F2, 1.B10 y 3.B4) a células tumorales SKBR-3 (A y B) y BT-474 (C) , según se detecto por citometría de flujo. 20 La Figura 4 es una gráfica en donde se comparan la unión de los fragmentos F(ab')2 del anticuerpo monoclonal humano anti-HER2/neu (3.F2 y 2.E8) purificados a células tumorales (SKBR-3, BT474 y A431), según se detectó por 25 citometría de flujo.

La Figura 5, Secciones A y B son gráficas que representan la inhibición del crecimiento de las células tumorales SKBR-3 mediante los anticuerpos (1.D2, 2.E8, 3.F2, 1.B10 y 3.B4) monoclonales anti-HER2/neu humanos, purificados, según se midió por la densidad celular.

La Figura 6 es una gráfica que representa la inhibición del crecimiento de las células tumorales SKBR- 3 mediante los fragmentos F(ab')2 (3.F2 y 2.E8), del anticuerpo monoclonal humano anti-HER2/neu purificado según se midió por densidad celular.

La Figura 7, Secciones A y B, son gráficas que representan la inhibición del crecimiento de las células tumorales BT474 mediante los anticuerpos (1.D2, 1.B10, 3.B4, ' 3. F2 y 2.E8) monoclonales humanos anti-HER2/neu purificados y sus fragmentos F(ab')2. según se midió por densidad celular.

La Figura 8, Secciones A y B, son gráficas que representan la citólisis dependiente de los anticuerpos de células tumorales SKBR mediante las células mononucleares mediada por los anticuerpos (1.D2, 2.E8 y 3.F2) monoclonales humanos anti-HER2/neu purificados (A); o por macrofagos inducidos por IFN-? en presencia de anticuerpos (3.2F, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4) anti- HER2/neu humanos, purificados (B) según se midió por la liberación de Cr. 5 La Figura 9 es una gráfica que representa la citólisis dependiente de los anticuerpos de las células tumorales SKBR-3 y BT474 mediante las células • polimorfonucleares mediadas por una modalidad biespecífica anti-HER2/neu x anti-CD89 (14.1 x 3. F2 ) 10 humana, como se midió por liberación del Cr.

La Figura 10 es una gráfica que representa la fl citólisis dependiente de los anticuerpos de células tumorales SKBR-3 y BT474 por monocitos mediada por una 15 molécula biespecífica anti-HER2/neu x anti-CD89 humana (14.1 x 3. F2 ) , según se midió por liberación 51Cr.

La Figura 11 es una gráfica que representa la citólisis dependiente de los anticuerpos de células 20 tumorales BT474, por sangre completa mediada por una molécula biespecífica anti-HER2/neu x anti-CD89, humana (14.1 x 3.F2), según se midió por liberación 51Cr.

La Figura 12 es una representación esquemática de 25 las moléculas de fusión monocatenaria biespecíficas, 931 y 934, y sus HuMabs precursores. Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de 14.1 y 3F2 fueron utilizadas para generar las construcciones 931 y 934 ( /EGF) .

La Figura 13 es una representación esquemática de una molécula biespecífica químicamente conjugada, constituida de los fragmentos Fab' del 14.1 y 3F2 (anti- HER2/neu) , utilizada como control positivo. 10 La Figura 14 (a) es una gráfica de barras que muestra los ensayos de escrutinio (unión) para las proteínas de fusión 931 y 934 expresadas en sobrenadantes de transfectoma según se midió por análisis con citometría 15 de flujo. El sobrenadante transfectado (931 y 934) y el no transfectado (NSO) fue incubado con líneas de células tumorales SKBR-3 ó A431. La unión de la proteína de fusión se detectó por tinción con Fab-2 de anti-IgG humana de cabra conjugada con ficoeritrina. La Figura 20 14 (b) es una gráfica de barras que muestra el análisis ^j. ADCC de las proteínas de fusión 931 y 934. Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del efector (monocitos, PMN) al objetivo (SKBR-3, A431) de 100:1. La 25 muerte de las células tumorales se detectó utilizando sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) para mediar lisis específica.

La Figura 15 (a) es una gráfica que muestra la unión 5 (según se midió por citometría de flujo) de las proteínas de fusión monocatenarias 931 y 934 a células U937. Como control negativo se utilizó un fragmento Fab' de 425, un • mAb anti-EGF-R que no se une a las células U937. La molécula biespecífica (14.1 x 3F2) ligada químicamente, 10 que se muestra en la Figura 13, se utilizó como control positivo. La Figura 15 (a) es una gráfica que muestra la unión (medida por citometría de flujo) de las proteínas de fusión monocatenarias 931 y 934 a células SKBR-3. Se utilizó como control negativo el fragmento Fab-2 de 14.1. 15 La molécula biespecífica (14.1 x 3F2) químicamente ligada como se muestra en la Figura 13 se utilizó nuevamente como control positivo.

La Figura 1 6 es una gráfica que muestra la unión 20 (medida por citometría de flujo) de la proteína de fusión monocatenaria 934 a células A431. Este experimento se realizo en la misma forma como se muestra en la Figura 15, excepto que se utilizaron células tumorales A431 que sobreexpresan el EGF-R. Como control positivo se utilizó 25 una proteína de fusión consistente en el fragmento sFv de í H. J_ii___é___Í___. £.. Aíteife,- ...„ __________ „-, „ „ ^ .--..,., ^.;.,^^.^,.^>¡g¡la^^^^^-^ ^.«^fe.J^t¿.jJl.^^tti 14. z fusionado a EGF, y como control negativo se utilizó el Fab-2 de 14.1.

La Figura 1 1 es una gráfica que muestra la citotoxicidad mediada por PMN (células efectoras) de células tumorales SKBR-3 (Figura 17 (a) ) y BT474 (Figura 17 (b) ) mediante la proteína de fusión monocatenaria 931.

• Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del 10 efector al objetivo de 100:1. Como control negativo se utilizó el Fab-2 de 14.1 en cada experimento.

• La Figura 18 es una gráfica que muestra la citotoxicidad mediada por monocitos (células efectoras) 15 de las células tumorales SKBR-3 (Figura 18 (a) ) y BT474 (Figura 18 (b) ) mediante la proteína de fusión monocatenaria 931. Los ensayos de liberación de cromo se realizaron con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del efector al objetivo de 100:1. Se 20 utilizó como control negativo en cada experimento el Fab-2 de 14.1.

Descripción detallada de la invención 25 La presente invención ofrece los tratamientos novedosos a base de anticuerpos para tratar y diagnosticar enfermedades caracterizadas por la expresión, particularmente la sobre expresión, del receptor del factor de crecimiento HER2/neu (mencionado 5 en la presente como "HER2/neu") y/o receptores relacionados. Los tratamientos de la invención emplean anticuerpos monoclonales humanos aislados, o porciones que se unan al antígeno de estos, que se unen a un epítope presente en HER2/neu. En una modalidad, los 10 anticuerpos humanos se producen en un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, capaz de producir múltiples isotipos de fl los anticuerpos monoclonales humanos para HER2/neu (por ejemplo IgG, IgA y/o IgE) sufriendo recombinación V-D-J 15 e intercambio del isotipo. Por consiguiente, algunos aspectos de la invención incluyen los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y las composiciones farmacéuticas de estos, así como los animales transgénicos no humanos y células B e hibridomas para 20 preparar tales anticuerpos monoclonales. Los métodos fl para utilizar los anticuerpos de la invención a fin de detectar células que expresen HER2/neu o un receptor del factor de crecimiento con reacción cruzada, relacionado, o para inhibir el crecimiento, 25 diferenciación y/o motilidad de una célula que exprese HER2/neu, in vi tro o in vivo, también están comprendidos por la invención.

A fin de que la presente invención pueda ser 5 comprendida con mayor facilidad, primero se definirán ciertos términos. Las definiciones adicionales se establecen a lo largo de la descripción detallada. • Los términos "HER2/neu", "HER2", "antígeno HER2/neu" 10 y "receptor de HER2/neu" se utilizan de cualquier modo en la presente, e incluyen cualquiera de las variantes o isoformas del receptor de HER2/neu humano, codificadas fl) por el gen erbB-2 humano también conocido como el gen HER) que se encuentra en la naturaleza sobre la 15 superficie de las células, por ejemplo de una célula de tumor humano. Cuando se utiliza en la presente, el término "neu" , "antígeno neu" , y "receptor de neu" se refiere al equivalente en rata de HER2/neu humano, codificado por el gen erbB-2 de rata (también conocido 20 como el gen neu de rata) . En una modalidad preferida, la fl} unión de un anticuerpo de la invención al antigeno HER2/neu inhibe el crecimiento de las células que expresan HER2/neu (por ejemplo una célula tumoral) . En otra modalidad preferida, la unión de un anticuerpo de la 25 invención al antígeno HER2/neu media la fagocitosis de iil& É.áTllAlirfo lfi& uin ifalüAllifilin. -_. L.. í¡rtk ¡¡j^__^^^¡2rt¡jj¡¡ß^ células efectoras y/o la muerte de células que expresan HER2/neu.

Cuando se utiliza en la presente, el término 5 "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que comprende cuando menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces • disulfuro. Cada cadena pesada esta compuesta de una región variable de la cadena pesada (abreviado en la 10 presente como HCVR ó VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada esta compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta de una región variable de • la cadena ligera (abreviado en la presente como LCVR ó 15 VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera esta compuesta de un dominio, CL . Las regiones VH y VL además pueden estar subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la 20 complementariedad (CDR) , interpuestas con regiones que • son más conservadas, denominadas regiones entramado (FR) . Cada VH y VL esta compuesta de tres CDR y de cuatro FR arreglados desde al amino terminal hasta el carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDRl, 25 FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de ttÍJt<a-«J«l?iiMÍ-Í?iffltHfc»JM..«».. - ..*«*., . _.^ íiii ___Vj_. !lU_^&_¡_ ^t¿l3^^^^ las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos hospederos o factores, 5 incluyendo las diferentes células del sistema inmunitario (por ejemplo las células efectoras) y el ^^ primer componente (Clq) del sistema de complemento tradicional . 10 El término "porción que se une al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción del anticuerpo", cuando se utiliza en la presente se refiere a uno o más fl fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo 15 HER2/neu) . Se ha mostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse por los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción que se une al antígeno" de un 20 anticuerpo incluye: (i) un fragmento Fab, un fragmento fl} monovalente consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd 25 consistente en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento Fab (Ward y col., (1989) Na ture 341 : 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la 5 complementariedad, aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están ^^ codificados por genes separados, estos pueden estar unidos, utilizando métodos recombinantes, por un ligador sintético que les permita hacerse como una sola 10 cadena proteínica en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (ScFv) ; véase por ejemplo, Bird y f col., (1988) Science 242: 423-426; y Huston y col., (1988) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 85: 5879-5883). Tales 15 anticuerpos monocatenarios también están propuestos para estar comprendidos dentro del término "porción que se une al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando las técnicas tradicionales conocidas para el trabajador experto, y 20 los fragmentos se detectan para la utilidad en la misma fl forma como se hace en los anticuerpos intactos.

El término "molécula biespecífica" se propone para incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteína, 25 péptido, complejo proteico o peptídico, que tenga dos i.?.ít .i . ._,. ... r¡. .a. diferentes especificidades de unión que se unan, o interactúen con: (a) un antígeno de la superficie celular y (b) un receptor de Fe sobre la superficie de una célula efectora. El término "molécula multiespecífica" o 5 "molécula heteroespecífica" se propone para incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido, o un complejo proteínico o peptídico, que tenga más de dos • especificidades de unión diferentes que se unan a, o interactúen con: (a) un antígeno de la superficie 10 celular, (b) un receptor de Fe sobre la superficie de una célula efectora y (c) cuando menos otro componente. Por consiguiente, la invención incluye, pero no se limita a, fl} moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras multiespecíficas que se dirijan a los antígenos 15 de la superficie celular, como pueden ser HER2/neu, y a los receptores de Fe en las células efectoras. El término "anticuerpos biespecíficos" además incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan sobre una 20 sola cadena polipeptídica, pero utilizando un ligador que fj es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, forzando de este modo los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de 25 unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y t _á?._á.? .- *- *.*^* *L**. M?*~t__^.. _________ j, __. . , ... __..-*. ... .~_¿~_~._.t¿.__~_^._______ i___?'S^. - -^» atatJL t col., (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90_: 6444-6448; Poljak, R. J. y col., (1994) Structure 2: 1121-1123).

Cuando se utiliza en la presente, el término 5 "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, fragmentos de unión al anticuerpo [sic] (por ejemplo, Fab) , derivados de estos, o regiones de unión al antígeno • ligadas entre sí, cuando menos dos de las cuales tienen diferentes especificidades. Estas diferentes 10 especificidades incluyen una especificidad de unión para un receptor de Fe sobre una célula efectora, y una especificidad de unión para un antígeno o epítope sobre fl} una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral. El término "anticuerpo humano" cuando se utiliza en la 15 presente se propone para incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes provenientes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las 20 secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana w? (por ejemplo, mutaciones introducidas al azar o por mutagénesis específica del sitio in vi tro o por mutación somático in vivo) . No obstante, el término "anticuerpo humano", cuando se utiliza en la presente no se propone 25 para incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de ísá?_Í?__L'i-- * •***•* ^_¡ ..?___*t?_i. .. .. _ „_______*__, , ~.?.. __-__.? ___^ j_____?_____. ?.t»? las CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, como de ratón, han sido injertadas sobre secuencias del entramado humano. 5 Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" cuando se utilizan en la presente se refieren a una preparación de moléculas y • anticuerpos de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpos monoclonales muestra una sola 10 especificidad de unión y afinidad para un epítope específico. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a los anticuerpos que muestran una sola especificidad de unión que tiene regiones variables y constantes provenientes de las 15 secuencias de la inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, teniendo un genoma que 20 comprende un transgen de la cadena pesada humana y un ^ transgen de la cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada .

El término "anticuerpo humano recombinante", cuando 25 se utiliza en la presente, se propone para incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, como pueden ser anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, de un ratón) que es transgénico para los genes de la 5 inmunoglobulina humana (descritos con mayor detalle en la sección I, siguiente); anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una • célula hospedera, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante, combinatoria, o 10 anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que incluya el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras fl} secuencias de DNA. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes 15 provenientes de las secuencias de la inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, estos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vi tro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de la Ig humana, 20 mutagénesis somática in vi tro) y de este modo las tPP secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque provienen de y están relacionadas con las secuencias de la VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir 25 en la naturaleza dentro del repertorio de la linea ^É^^M ***** germinal de anticuerpo humano in vivo.

Cuando se utiliza en la presente, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con el organismo no 5 humano, transgénico, que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido • nucleico codificante correspondiente a la que se encuentra en un organismo que no consiste en el animal 10 transgénico no humano, y generalmente de una especie diferente de la del animal transgénico no humano. fl Cuando se utiliza en la presente, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene 15 cadenas ligera y pesada de organismos de diferente origen. Por ejemplo, un anticuerpo que tenga una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido. Los ejemplos de los anticuerpos heterohíbridos incluyen anticuerpos quiméricos y 20 humanizados, como se describe supra.

Un "anticuerpo aislado", cuando se utiliza en la presente se propone para referirse a un anticuerpo que esta prácticamente libre de cualquiera de otros 25 anticuerpos que tengan diferentes especificidades antigénicas, (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se una específicamente a HER2/neu esta prácticamente libre de anticuerpos que se unan específicamente a antígenos que no sean HER2/neu) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítope, isoforma o variante de HER2/neu humano puede, no obstante, tener reactividad cruzada con otros receptores de factores de crecimiento relacionados. Por ejemplo, de otras especies (por ejemplo homólogos de especies de HER2/neu) . Más aún, un anticuerpo aislado de estar prácticamente libre de otro material celular y/o sustancias químicas. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" teniendo diferentes especificidades se combinan en una composición bien definida.

Cuando se utiliza en la presente, "unión específica" se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. Por lo regular, el anticuerpo se une con una afinidad de cuando menos aproximadamente 1 x 10 7M-1, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es cuando menos dos veces mayor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) que no sea el antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases ("un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de manera indistinta en la presente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". 5 Cuando se utiliza en la presente, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a la afinidad • 7 -1 de unión de cuando menos aproximadamente 10 M , de preferencia cuando menos aproximadamente 10 9M-1, de mayor 10 preferencia cuando menos cerca de 10 10M-1, 1011M-1 , 1012M-1 , o mayor, por ejemplo hasta de 10 13M-1 o mayor. No obstante, la unión con "alta afinidad" puede variar para fl otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión con "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a una 15 afinidad de unión de cuando menos aproximadamente 1 x El término "Kasoc", cuando se utiliza en la presente se propone para referirse a la constante de asociación de 20 una interacción anticuerpo-antígeno específica.

El término "Kdls", cuando se utiliza en la presente se propone para referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno específica. 25 Cuando se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo IgM ó IgGl) que es codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Cuando se utiliza en la presente, "intercambio del isotipo" se refiere al fenómeno mediante el cual la w? clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a otra de las clases de Ig. 10 Cuando se utiliza en la presente, "isotipo no intercambiado" se refiere a la clase de isotipo de la cadena pesada que se produce cuando no se lleva a cabo ningún intercambiado del isotipo; el gen de la CH que 15 codifica el isotipo no intercambiado por lo regular es el primer gen de la CH inmediatamente corriente abajo del gen VDJ funcionalmente re-ordenado. El intercambio de isotipo ha sido clasificado como intercambio de isotipo clásico o no clásico. El intercambio del 20 isotipo clásico ocurre por sucesos de recombinación que incluyen cuando menos una región de la secuencia del intercambio en el transgen. El intercambio del isotipo no clásico puede ocurrir, por ejemplo, por recombinación homologa entre sµ humano y ?µ humano 25 (deleción d asociada) . Los mecanismos de intercambio no clásico alternativos, como puede ser la recombinación inter-transgen y/o inter-cromosomal, entre otras, pueden ocurrir y efectuar el intercambio del isotipo. 5 Cuando se utiliza en la presente, el término "secuencia de intercambio" se refiere a aquellas secuencias de DNA responsables de la recombinación por intercambio (switch) . Una secuencia "donadora del 10 intercambio", por lo regular una región de intercambio µ, será 5' (es decir, corriente arriba) de la región de la construcción para ser delecionada durante la fl^ recombinación por intercambio. La región "aceptor del intercambio" estará entre la región de la construcción 15 para ser delecionada y la región constante del reemplazo (por ejemplo, ?, e, etcétera) . Cuando no exista un sitio específico donde ocurra siempre la recombinación, la secuencia génica final por lo regular no será predecible a partir de la construcción. 20 Cuando se utiliza en la presente, "patrón de glucosilación" se define como el modo en que las unidades de carbohidratos se unen covalentemente a una proteína, más específicamente, a una proteína inmunoglobulina. El 25 patrón de glucosilación de un anticuerpo heterólogo puede ser caracterizado como substancialmente similar a los patrones de glucosilación que ocurren en la naturaleza en los anticuerpos producidos por las especies del animal transgénico no humano, cuando un experto en la técnica se dará cuenta que el patrón de glucosilación del anticuerpo heterólogo como siendo más similar al patrón de glucosilación en las especies del animal transgénico no humano que en la especie del cual fueron obtenidos los genes de la CH del transgen. 10 El término "que se encuentra en la naturaleza" cuando se utiliza en la presente aplicado a un objeto se fl} refiere al hecho de que un objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o 15 polinucleotídica que esté presente en un organismo (incluido virus) que puede ser aislada de una fuente en la naturaleza y que no haya sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio se dice que se encuentra en la naturaleza. 20 fl} El término "re-ordenado" o reordenado cuando se utiliza en la presente se refiere a una configuración de un locus de la cadena pesada o cadena ligera de la inmunoglobulina en donde el segmento V esta ubicado 25 inmediatamente junto a un segmento D-J o J en una conformación que codifica prácticamente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus de gen de inmunoglobulina reordenado puede ser identificado por comparación con el DNA de la linea germinal; un locus 5 reordenado tendrá cuando menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado.

El término "no reordenado" o "configuración de la línea germinal" cuando se utiliza en la presente en 10 referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no esta recombinado de modo que puede estar inmediatamente adyacente a un segmento D ó J.

^ El término "molécula de ácido nucleico", cuando se 15 utiliza en la presente, se propone para incluir moléculas de DNA y moléculas de RNA. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero de preferencia es DNA bicatenario. 20 El término "molécula de ácido nucleico aislada" cuando se utiliza en la presente en referencia a los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos (por ejemplo VH, VL, CDR3) que se unen a HER2/neu, se propone para referirse a una molécula de 25 ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o la porción del anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos o porciones de anticuerpos que se unen a antígenos distintos de HER2/neu, cuyas otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el DNA genómico humano. Las SEQ ID NOS: 1-12 corresponden a las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos que comprenden las regiones variables de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de los anticuerpos monoclonales humanos anti-HER2/neu 3.F2, 1. D2 y 2.E8 de la invención. En particular, la SEQ ID NO: 1 y 2 corresponden a la VH del anticuerpo 3.F2, la SEQ ID NO: 3 y 4 corresponden a la VL del anticuerpo 3.F2, la SEQ ID NO: 5 y 6 corresponden a la VH del anticuerpo 1.D2, la SEQ ID NO: 7 y 8 corresponden a la VL del anticuerpo 1.D2, la SEQ ID NO: 9 y 10 corresponden a la VH del anticuerpo 2.E8 y la SEQ ID NO: 11 y 12 corresponde a la VL del anticuerpo 2.E8.

Para los ácidos nucleicos, el término "homología substancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de estos, cuando se alinean y comparan óptimamente, son idénticas, con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas, en cuando menos aproximadamente 80% de los nucleótidos, por lo regular cuando menos aproximadamente 90 a 95% y de mayor preferencia cuando menos aproximadamente 98 a 99.5% de los nucleótidos. De otro modo, existe homología substancial cuando los segmentos hibridarán en condiciones de hibridación selectiva, al complemento de la hebra.

• El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas 10 compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de fl cada espacio, que necesitan ser introducidos para alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación 15 de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden llevarse a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes más adelante. 20 El porcentaje de identidad entre dos secuencias de fl} nucleótidos puede ser determinado utilizando un programa GAP en el paquete del software GCG (disponible en la http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso el espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de 25 longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. El porcentaje de identidad '_._i .t_i__í j__ ~*. >. *i*_**ia~ J^u..^ .?_u. ^¡ _&fc^¡a¡^^ ?¡^g^^^ í- 42 entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), 5 utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, un castigo de la longitud del espacio de 12 y un castigo del espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre • dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo Needleman y Wunsh (J. Mol. Biol. 10 (48): 444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 jfl o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. 15 Las secuencias de ácidos nucleicos y de proteínas de la presente invención además pueden ser utilizadas como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, 20 identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas ? pueden realizarse utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y col., (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, 25 longitud de palabras = 12 para obtener homólogos de las secuencias de nucleótidos para las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST puede realizarse con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener los homólogos de 5 las secuencias de aminoácidos para las moléculas proteínicas de la invención. Para obtener alineamientos con espacios para propósitos de comparación, es posible utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res . 25 (17): 3389-3402. 10 Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, es posible utilizar parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo XBLAST y NBLAST) . Véase en http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 15 Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en forma parcialmente purificada o substancialmente pura. Un ácido nucleico esta "aislado" o "se volvió substancialmente puro" cuando se purificó de otros componentes celulares u 20 otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o fl proteínas celulares, por las técnicas normales, incluyendo el tratamiento alcalino/SDS, la formación de bandas con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. 25 Véase, F. Ausubel y col., ed. Current Protocols in ^isé Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Cork (1987).

Las composiciones de ácidos nucleicos de la 5 invención, aunque con frecuencia en una secuencia nativa (excepto para los sitios de restricción modificados y similares) de cDNA, genómico o mezclas pueden ser • mutadas, de acuerdo con las técnicas normales para proporcionar secuencias génicas. Para las secuencias 10 codificantes, estas mutaciones pueden afectar la secuencia de aminoácidos, según se requiera. En particular, las secuencias de DNA substancialmente homologas a o provenientes de las secuencias V, D, J nativas, constantes, con intercambios y otras descritas 15 en la presente están contempladas (donde "derivadas" o "provenientes de" indica que una secuencia es idéntica o modificada a partir de otra secuencia) .

Un ácido está "ligado de manera operante" cuando se 20 coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está ligado de manera operante a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la 25 transcripción, ligado de manera operante significa que las secuencias de DNA que están ligadas, están adyacentes y, donde es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, adyacentes y en marco de lectura. Para las secuencias de intercambio (switch) ligado de manera 5 operante indica que las secuencias pueden efectuar recombinación por intercambio.

El término "vector" cuando se utiliza en la presente, se propone para referirse a una molécula de 10 ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", lo cual se refiere a un bucle de DNA fl} bicatenario, circular en el cual pueden estar ligados otros segmentos de DNA. Otro tipo de vector es un vector 15 viral, en donde los otros segmentos de DNA pueden estar ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera en la que estos están introducidos (por ejemplo vectores bacterianos teniendo origen de replicación bacteriano y 20 vectores episomales de mamífero) . Otros vectores (por ^p ejemplo vectores no episomales de mamífero) pueden estar integrados en el genoma de una célula hospedera con la introducción en la célula hospedera, y por este medio se replican junto con el genoma del hospedero. Más aún, 25 ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los cuales están ligados de manera operante. Tales vectores se mencionan en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de 5 utilidad en las técnicas del DNA recombinante suelen estar en forma de plásmidos. En la presente especificación "plásmidos" y "vector" pueden utilizarse de manera indistinta en vista de que el plásmido es la forma de vector que se utiliza con mayor frecuencia. No 10 obstante, se propone que la invención incluya estas otras formas de vectores de expresión, como pueden ser los vectores virales (por ejemplo retrovirus defectivo de fl} replicación, adenovirus y virus adenoasociados) , que tienen funciones equivalentes. 15 El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera") , cuando se utiliza en la presente, se propone para referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión 20 recombinante. Se debe entender que estos términos se ^ proponen para referirse no solo a la célula objeto particular sino a la progenie de esta célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones subsiguientes debido a mutación o 25 influencias ambientales, de hecho, tal progenie puede no ser idéntica a la célula precursora, pero incluso está incluida dentro del alcance del término "célula hospedera" como se utiliza en la presente. 5 En las siguientes subsecciones se describen con mayor detalle algunos aspectos de la invención.

I . Producción de anticuerpos humanos para HER2/neu 10 Los anticuerpos monoclonales (Mabs) de la invención pueden producirse por una variedad de técnicas, que incluye la metodología tradicional de los anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas habitual de Kohier y Milstein, Nature 15 256: 495 (1975) . Aunque se prefieren los procesos de hibridación de células somáticas, en principio, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales pueden emplearse, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de los linfocitos B. 20 fl El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento 25 de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la técnica. Las contrapartes de fusión (por ejemplo células de mieloma murinas) y los procedimientos de fusión también son conocidos. 5 En una modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra HER2/neu pueden ser generados utilizando ratones transgénicos portadores de • partes del sistema inmune humano en lugar del sistema ratón. Estos ratones transgénicos, mencionados en la 10 presente como ratones "HuMab" contienen un miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y de cadena fl} pesada K no re-arregladas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de las cadenas µ y K endógenas 15 (Lonberg, N, y col., (1994), Na ture 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben expresión reducida de la IgM ó K de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanas introducidas sufren intercambio de clase y mutación 20 somática para generar la IgG? monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. y col., (1994), supra ; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmocology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern . Rev. Immunol . Vol. 13: 65-93, y Harding. F. y Lonberg. N. 25 (1995) Ann . N. Y. Acad Sci 764: 536-546). La preparación de ratones HuMab esta descrita con detalle en la Sección II más adelante y en Taylor, L. y col., (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J y col., (1993) Interna tional Immunology 5: 647-656; Tuaillon y col., 5 (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90: 3720-3724; Choi y col., (1993) Na ture Genetics 4: 117-123; Chen J. y col., (1993) EMBO J 12: 821-830; Tuaillon y col., (1994) J. Immunol . 152: 2912-2920; Lonberg y col., (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of 10 Experimen tal Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. y col., (1994) Interna tional Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern . Rev. Immunol . Vol. 13: 65-93; fl Harding, F. y Lonberg, N (1995) Ann N. Y. Acad Sci 764: 536-546; Fishwild, D. y col., (1996) Na ture Biotechnology 15 14: 845-851, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su entereza. Véase además, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 y 5,770,429; todas de 20 Londberg y Kay, y Genpharm International; Patente fl} Estadounidense No. 5,545,807 de Surani y col.; Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/24884, publicada el 11 de junio de 1998; WO 94/25585, publicada el 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el 24 de junio 25 de 1993; WO 92/22645, publicada el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de marzo de 1992, las descripciones de todas las cuales se incorporan en la presente como referencia en sus enterezas. De otro modo, los ratones transgénicos HC012 descritos en el Ejemplo 2, 5 pueden utilizarse para generar anticuerpos anti-HER2/neu humanos .

• Inmunizaciones de HuMab 10 Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para HER2/neu, es posible inmunizar ratones HuMab con una preparación purificada o enriquecida del antígeno fl} HER2/neu y/o células que expresen HER2/neu, según se describe por Lonberg, N y col., (1994) Na ture 368 (6474) 15 856-859; Fishwild, D. y col., (1996) Na ture Biotechnology 14: 845-851 y WO 98/24884. De preferencia, los ratones serán de 6 a 16 semanas de nacidos en la primera infusión. Por ejemplo, la preparación purificada o enriquecida (5-20 µg) del antígeno HER2/neu pueden 20 utilizarse para inmunizar los ratones HuMab por vía fl intraperitoneal. En el caso en que las inmunizaciones con una preparación purificada o enriquecida del antígeno HER2/neu no conduzcan a los anticuerpos, los ratones también pueden ser inmunizados con células que expresen 25 HER2/neu, por ejemplo, una línea de células de tumor, para favorecer respuestas inmunes.

La experiencia acumulativa con diferentes antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos HuMab responden 5 mejor cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal (IP) con antígeno en coadyuvante de ^^ Freund completo. Seguido por inmunizaciones IP cada dos semanas (hasta un total de 6) con antígeno en coadyuvante de Freund incompleto. La respuesta inmune puede ser 10 supervisada durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas por sangrados retroorbitales . El plasma puede ser detectado fl por ELISA (como se describe más adelante) , y los ratones con títulos suficientes de la inmunoglobulina humana 15 anti-HER2/neu puede utilizarse para fusiones. Los ratones pueden ser reforzados por vía intravenosa con antígeno 3 días antes del sacrificio y de retirar el bazo. Se espera que solo sea necesario realizar 2-3 fusiones para cada antígeno. Seis ratones serán inmunizados para cada 20 antígeno. Por ejemplo, es posible inmunizar un total de f 12 ratones HuMab de las cepas HC07 y HC012.

Generación de hibridomas produciendo anticuerpos monoclonales humanos para HER2/neu 25 Í? *iUÍAl a JaJAn-dt. t ha-^-» ttfal-l»fc--to^A.^.¿ Es posible aislar los esplenocitos de ratón y fusionarlos con PEG a una línea de células de mieloma de ratón con base en los protocolos normales (8, 13). Los hibridomas resultantes entonces se detectan para la 5 producción de anticuerpos específicos del antígeno. Por ejemplo, suspensiones de células individuales de los linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionan a una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 10 50% de PEG. Las células se plaquean a aproximadamente 2 x 10 en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación en dos semanas en medio fl} selectivo conteniendo 20% de suero de clon fetal, 18% de medio acondicionado "653", 5% del origen (IGEN), L- 15 glutamina 4 mM, L-glutamina 1 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 unidades/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 50 mg/mL de gentamicina y IX HAT (Sigma; el HAT se adiciona 24 horas después de la fusión) . Después de dos semanas, las 20 células se cultivan en medio en el que se sustituye el «P HAT con HT. Los pozos individuales entonces se detectan por ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales anti- HER2/neu, humanos. Una vez que ocurre crecimiento de hibridoma extenso, el medio se observa normalmente 25 después de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se vuelven a plaquear, se detectan otra vez y si todavía son positivos para IgG humana, anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu, pueden ser subclonados cuando menos dos veces por dilución limitante. Los subclones 5 estables entonces se cultivan in vi tro para generar cantidades pequeñas de anticuerpos en el medio de cultivo tisular para su caracterización. • Caracterización de la unión de los antígeno monoclonales 10 humanos a HER2/neu Para caracterizar la unión de los anticuerpos fl monoclonales humanos a HER2/neu de la invención, pueden probarse sueros de ratones inmunizados, por ejemplo, por 15 ELISA. En resumen, placas de microtitulación se recubren con HER2/neu purificado a 0.25 µg/mL de PBS, y luego se bloquean con 5% de albúmina sérica de bovino en PBS. Diluciones de plasma provenientes de ratones inmunizados con HER2/neu se adicionan a cada pozo e incuban durante 20 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y fl} luego se incuban con un reactivo policlonal específico de Fe anti-IgG humana de cabra conjugado a fosfatasa alcalina durante una hora a 37°C. Después del lavado, las placas se desarrollan con sustrato pNPP (1 mg/mL) y se 25 analizan a una DO de 405-650. De preferencia, los ratones . . A _. *.Mf_ii.--íAHaíi .ík.i<¿? . ^ :.,*.?íití__*___.^^ ___-_<^.-^.*.^.r>.r?i._S!_¿^^ que desarrollan los títulos más altos serán utilizados para las fusiones.

De otro modo, se cubren placas de microtitulación con anticuerpo anti-HER2/neu de ratón, bloqueados en BSA al5%, y se incuban con el sobrenadante del cultivo de las células que presentaron crecimiento en exceso y que expresaban HER2/neu, por ejemplo, células tumorales SKBR-3, capturando así el antígeno HER2/neu secretado por las células. A cada pozo se adicionan diluciones de los anticuerpos humanos ant?-HER2/neu purificados, se incuban y se detecta la unión como ya se describió.

Un ensayo ELISA como se describe en lo anterior puede también utilizarse para detectar anticuerpos y, de este modo, hibridomas que produzcan los anticuerpos que muestren reactividad positiva con el inmunógeno HER2/neu.

Los hibridomas que se unen con alta avidez al HER2/neu serán subclonados y además caracterizados. Un clon de cada hibridoma, que conserve la reactividad de las células precursoras (por ELISA) , puede ser elegido para preparar un banco de células en 5-10 viales almacenados a -140°C, y para purificación de los anticuerpos.

Para purificar anticuerpos anti-HER2/neu humanos, los hibridomas seleccionados pueden ser crecidos en matraces de dos litros con agitador para purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden ser 5 filtrados y concentrados antes de la cromatografía por afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . La IgG eluida puede ser comprobada por el electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para garantizar la pureza. La solución 10 amortiguadora puede ser intercambiada en PBS, y la concentración se puede determinar por DO280 utilizando un coeficiente de extinción de 1.43. Se pueden tomar alícuotas de los anticuerpos monoclonales y almacenarlas a -80°C. 15 Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu humanos seleccionados se unen a epítopes únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilinado utilizando los reactivos disponibles en el comercio 20 (Pierce, Rockford, IL) . Es posible realizar estudios de fl competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados utilizando las placas de ELISA recubiertas con HER2/neu como ya se describió. La unión de Mab biotinilado puede 25 ser detectada con una sonda de strep-avidina fosfatasa í_Á i,... ri ,i.L:______ .í___. í''1-r"--~- -•- ¡,,^:. . __ , -J^í_^_¿___¿^.^ji¡^_~r*..l.-M¿__r, ,-:<_;,_..^,^. ,?..r¿__.?^_iá:¿a.j alcalina .

Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, es posible realizar análisis ELISA del 5 isotipo. Los pozos de las placas de microtitulación pueden ser recubiertos con 10 µg/mL de Ig antihumana durante la noche a 4°C. Después de bloqueo con BSA al 5%, • las placas reaccionan con 10 µg/mL de los anticuerpos monoclonales o los controles isotipo purificados, a 10 temperatura ambiente durante 2 horas. Luego los pozos pueden reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específica de IgG 1 humana o IgM humana. Las fl} placas se desarrollan y analizan como ya se describió. 15 Para demostrar la unión de los anticuerpos monoclonales a las células vivas que expresan HER2/neu, es posible utilizar citometría de flujo. En resumen, las líneas celulares que expresan HER2/neu (crecidas bajo condiciones de crecimiento normales) se mezclan con 20 diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales en fl} PBS conteniendo 0.1% de Tween 80 y 20% de suero de ratón, y se incuban a 37 °C durante una hora. Después del lavado, las células reaccionan con un anticuerpo anti-IgG humano marcado con fluoresceína bajo las mismas condiciones como 25 la tinción primaria del anticuerpo. Las muestras pueden •M^?*«É^*r--"-*t'?lH? ft?t*» "**-*»*- •*»-*" «*—»•* •** ser analizadas por el instrumento FACScan utilizando dispersor de luz y lateral apropiados sobre las células individuales. Un ensayo alternativo utilizando microscopia de fluorescencia puede utilizarse (además de 5 o en lugar de) del ensayo de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas exactamente como se describe en lo anterior y examinadas por microscopia de • fluorescencia. Este método permite la visualización en células individuales, pero puede tener sensibilidad 10 disminuida dependiendo de la densidad del antígeno.

Las IgG humanas anti-HER2/neu además pueden ser fl probadas para reactividad con antígeno HER2/neu por Western blot. En resumen, extractos de células de células 15 que expresan HER2/neu pueden ser preparados y sometidos a electroforesis en gel de poliacrilamida dodeciisulfato de sodio (SDS) . Después de la electroforesis, los antígenos separados serán transferidos a membrana de nitrocelulosa, bloqueados son suero de ratón al 20%, y sondeados con 20 anticuerpos monoclonales para ser probados. La unión de ^P la IgG humana puede ser detectada utilizando fosfatasa alcalina anti-IgG humana y desarrollados con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St Louis, MO) . 25 Actividades fagocí ticas y de muerte celular de los anticuerpos monoclonales humanos para HER2/neu Además de unirse específicamente al HER2/neu, los 5 anticuerpos anti-HER2/neu monoclonales humanos pueden ser probados para su capacidad para mediar fagocitosis y la muerte de células que expresan HER2/neu. Las pruebas de • la actividad de los anticuerpos monoclonales in vi tro proporcionará una detección inicial antes de probar los 10 modelos in vivo . En resumen, células polimorfonucleares (PMN) , u otras células efectoras, de donadores sanos pueden ser purificadas por centrifugación por densidad fl Ficoll Hypaque, seguido por lisis de los eritrocitos contaminantes. Las PMN lavadas pueden ser suspendidas en 15 RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y mezclados con células etiquetadas con 51Cr que expresen HER2/neu, en diferentes proporciones de las células efectoras a las células tumorales (E:T). Las IgG anti-HER2/neu humanas, 20 purificadas entonces pueden ser adicionadas a diferentes « concentraciones. Las IgG humanas irrelevantes pueden ser utilizadas como control negativo. Los ensayos pueden realizarse durante 4-16 horas minutos a 37 °C. Las muestras pueden ser ensayadas para citólisis midiendo la 25 liberación de Cr en el sobrenadante del cultivo. Los monoclonales anti-HER2/neu pueden también ser probados en combinaciones entre sí para determinar si mejora la citólisis con múltiples anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales humanos que se unen a HER2/neu también pueden ser probados en un modelo in vivo (por ejemplo en ratones) para determinar su eficacia mediando fagocitosis y la muerte de células que expresan HER2/neu, por ejemplo, células tumorales. Estos anticuerpos pueden ser seleccionados, por ejemplo, con base en los siguientes criterios, que no se proponen para ser exclusivos: 1.) la unión a células vivas que expresan HER2/neu; 2.) alta afinidad de unión para HER2/neu; 3.) la unión a un epítope único en el HER2/neu (para eliminar la posibilidad que los anticuerpos monoclonales con actividades complementarias cuando se utilizan en combinación compitan por la unión al mismo epitope) ; 4.) la opsonización de células que expresan HER2/neu; 5.) la mediación de la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o muerte de células que expresan HER2/neu en presencia de células efectoras humanas 6.) internalización por las células que expresan HER2/neu después de unirse a HER2/neu.

Los anticuerpos monoclonales humanos preferidos de 5 la invención cumplen con uno o más, y de preferencia todos estos criterios. En una modalidad particular, los anticuerpos monoclonales humanos se utilizan en 9 combinación, por ejemplo como una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos 10 monoclonales anti-HER2/neu o fragmentos de éstos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu humanos que tienen diferentes, pero complementarias, fl actividades pueden ser combinados en un solo tratamiento para lograr un efecto terapéutico o de diagnóstico 15 deseado. Un ejemplo de esto sería una composición que contenga un anticuerpo monoclonal humano anti-HER2/neu que medie la muerte altamente eficaz de las células blanco en presencia de células efectoras, combinado con otro anticuerpo monoclonal anti-HER2/neu humano que 20 inhiba el crecimiento de las células que expresan HER2/neu.

II . Producción de animales transgénicos no humanos que generen anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu humanos 25 .¿^A.&r ,ÁAl?*t ,.Í&avá_¿*_..?,_ _ ?ts -S¥í_ nlTUf HlItó tinaJt ttfcaihfcuÉjijftfcA * 61 En todavía otro aspecto, la invención propone los animales transgénicos no humanos, por ejemplo, un ratón transgénico, que sea capaz de expresar anticuerpos monoclonales humanos que se unan específicamente a 5 HER2/neu, de preferencia con alta afinidad. En una modalidad preferida, los animales transgénicos no humanos, por ejemplo, los ratones transgénicos (ratones HuMab) , tienen un genoma que comprende un transgen de cadena pesada y un transgen de cadena ligera humanos. En 10 una modalidad, los animales transgénicos no humanos, por ejemplo, los ratones transgénicos, han sido inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de antígeno fl HER2/neu y/o células que expresen HER2/neu. De preferencia, los animales transgénicos no humanos, por 15 ejemplo, los ratones transgénicos pueden producir isotipos múltiples de anticuerpos monoclonales humanos para HER2/neu (por ejemplo IgG, IgA y/o IgE) por recombinación V-D-J e intercambio de isotipos. El intercambio de isotipos puede ocurrir, por ejemplo, por 20 intercambio de isotipos clásico o no clásico.

El diseño de un animal transgénico no humano que responda a la estimulación con antígeno extraño con un repertorio de anticuerpos heterólogos, requiere que el 25 contenido de transgenes de inmunoglobulina heterólogos dentro del animal transgénicos funcione correctamente a lo" largo de la vía del desarrollo de células B. En una modalidad preferida, la función correcta de un transgen de cadena pesada heterólogo incluye el intercambio de isotipos. Por consiguiente, los transgenes de la invención se construyen para producir intercambios de isotipos y uno o más de lo siguiente (1) expresión de alto nivel y específico del tipo de célula, (2) rearreglo del gen funcional, (3) activación de y respuesta a la expresión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señales, (6) hipermutación somática y (7) dominación del locus del anticuerpo transgénico durante la respuesta inmune.

No es necesario que se cumplan todos los criterios anteriores. Por ejemplo, en aquellas modalidades en donde los loci de inmunoglobulina endógena del animal transgénico han sufrido disrupción funcional, el transgen no necesita activar la exclusión alélica. Además, en aquellas modalidades en donde el transgen comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera re- ordenado funcionalmente, es innecesario el segundo criterio de re-arreglo del gen funcional, cuando menos para este transgen que ya esta re-ordenado. Para los antecedentes sobre la inmunología molecular véase, Fundamental Immunology, 2a edición, (1989), Paul William E., ed., Raven Press, N. Y. la cual se incorpora en la presente como referencia. 5 En ciertas modalidades, los animales transgénicos no humanos utilizados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención contienen transgenes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina heteróloga re-arreglada, no re-arreglada o una 10 combinación de re-arreglada y no re-arreglada en la línea germinal del animal transgénico. Cada uno de los transgenes de la cadena pesada comprende cuando menos un fl} gen CH. Además, el transgen de la cadena pesada puede contener secuencias de intercambio del isotipo funcional, 15 las cuales son capaces de soportar intercambio del isotipo de un transgen heterólogo que codifica múltiples genes de la CH en las células B del animal transgénico. Tales secuencias de intercambio pueden ser aquellas que ocurran en la naturaleza en el locus de la 20 inmunoglobulina de la línea germinal proveniente de las fl) especies que sirven como la fuente de los genes de CH transgénicos, o tales secuencias de intercambio pueden ser provenientes de aquellas que ocurren en las especies que van a recibir la construcción transgen (el animal 25 transgénico) por ejemplo, una construcción transgénica humana que se utiliza para producir un ratón transgénico puede producir una mayor frecuencia de sucesos de intercambio de isotipo si incorpora secuencias de intercambio similares a aquellas que ocurren en la 5 naturaleza en el locus de las cadenas pesadas del ratón, en vista de que tal vez las secuencias de intercambio del ratón se optimizan para funcionar con el sistema 9 enzimático switch recombinasa de ratón, no así las secuencias de intercambio (switch) humanas. Las 10 secuencias de intercambio pueden ser aisladas y clonadas por los métodos de clonación tradicionales, o pueden ser sintetizadas de novo) a partir de oligonucleótidos fl} sintéticos traslapantes diseñados con base en la información de las secuencias publicadas relacionadas con 15 Las secuencias de las regiones de intercambio de la inmunoglobulina (Mills y col., Nucí . Acids . Res . 15: 7305-7316 (1991); Sideras y col., Intl . Immunol . 1: 631- 642 (1989), las cuales se incorporan en la presente como referencia) . Para cada uno de los animales transgénicos 20 antes mencionados, los transgenes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera heterólogos funcionalmente re- ordenados se encuentran en una fracción importante de las células B del animal transgénico (cuando menos 10 por ciento) . 25 .i ?__k _____^______sa______i____,té^^ _t?__^' ,^ - . ... ¿-»*—» .*___ ____?si?tt__>_mk_fai?____- __ Los transgenes que se utilizan para generar los animales transgénicos de la invención incluyen un DNA que comprende el transgen de cadena pesada que codifica cuando menos un segmento de gen variable, un segmento del 5 gen de diversidad, un segmento del gen de unión y cuando menos un segmento del gen de la región constante. El transgen de la cadena ligera de la inmunoglobulina • comprende DNA que codifica cuando menos un segmento del gen variable, un segmento de gen de unión y cuando menos 10 un segmento de gen de la región constante. Los segmentos de gen que codifican los segmentos del gen de la cadena ligera y pesada son heterólogos para el animal transgénico no humano en cuanto a que estos provienen de, o corresponden a, DNA que codifica segmentos de gen de la 15 cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina proveniente de una especie no consistente en el animal transgénico no humano. En un aspecto de la invención, el transgen se construye de modo que los segmentos individuales del gen estén no re-ordenados, es decir, no re-ordenados para 20 codificar una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (J funcional. Tales transgenes no re-ordenados soportan recombinación de los segmentos de gen V, D y J (rearreglo funcional) y de preferencia soportan la incorporación de todo o una parte de un segmento de gen 25 de la región D en la cadena pesada de la inmunoglobulina re-arreglada resultante dentro del animal transgénico no humano cuando se exponen a un antígeno HER2/neu.

En una modalidad alternativa, los transgenes 5 comprenden un "mini locus" no re-ordenado. Estos transgenes por lo regular comprende una porción substancial de los segmentos C, D y J así como un • subconjunto de los segmento del gen V. en construcciones de transgen así, las diferentes secuencias reguladoras, 10 por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones de intercambio de clase, secuencias donadoras del empalme y secuencias aceptoras del empalme para procesar RNA, fl} señales de recombinación y similares, comprenden las secuencias correspondientes provenientes del DNA 15 heterólogo. Tales secuencias reguladoras pueden ser incorporadas en el transgen de la misma o una especie relacionada del animal no humano utilizado en la invención. Por ejemplo, los segmentos del gen de inmunoglobulina humana pueden ser combinados en un 20 transgen con una secuencia mejoradora de la inmunoglobulma de roedor para uso en un ratón transgénico. De otro modo, las secuencias reguladoras sintéticas pueden ser incorporadas en el transgen, en donde tales secuencias reguladoras sintéticas no sean 25 homologas para una secuencia de DNA funcional que ocurra en la naturaleza en los genomas de los mamíferos. Las secuencias reguladoras sintéticas están diseñadas de acuerdo con las reglas del consenso como puede ser, por ejemplo, aquellas que especifican las secuencias 5 permisibles de un sitio aceptor del empalme o un motivo promotor/mej orador . Por ejemplo, un minilocus comprende una porción del locus de inmunoglobulina genómica • teniendo cuando menos una deleción interna (es decir, sin un término de la porción) de una porción de DNA no 10 esencial (por ejemplo, una secuencia intervinente; intron o porción de este) en comparación con el locus Ig de la línea germinal que ocurre en la naturaleza.

• En una modalidad preferida de la invención, el 15 animal transgénico que se utiliza para generar anticuerpos humanos para HER2/neu contiene cuando menos 1, por lo regular 2-10, y en ocasiones 25-50 o más copias del transgen descrito en el Ejemplo 12 de WO 98/24884 (por ejemplo pHCl ó pCH2) reproducido con un animal que 20 contenga una sola copia de un transgen de la cadena <P ligera descrito en los Ejemplos 5, 6, 8 ó 14 de WO 98/24884, y de la progenie reproducida con el animal delecionado JH descrito en el Ejemplo 10 de WO 98/24884, los contenidos de las cuales se incorporan expresamente 25 en la presente como referencia. Los animales se ^«*-^^J reproducen para hacer homocigoto cada uno de estos tres rasgos. Estos animales tienen el siguiente genotipo: una sola copia (por serie de cromosomas haploides) de un mini locus no re-ordenado de la cadena pesada humana (descrito 5 en el Ejemplo 12 de WO 98/24884), una sola copia (por serie de cromosomas haploides) de una construcción de cadena ligera K humana re-arreglada (descrita en el Ejemplo 14 de WO 98/24884) y una deleción de cada locus de cadena pesada de ratón endógena que elimine todos los 10 segmentos funcionales JH (descritos en el Ejemplo 10 de WO 98/24884). Tales animales se reproducen con ratones que sean homocigotos para la deleción de los segmentos JH fl} (Ejemplos 10 de WO 98/24884) para producir progenie que sea homocigoto para la deleción JH y hemicigoto para las 15 construcciones de la cadena pesada y ligera humanas. Los animales resultantes son inyectados con antígenos y utilizados para la producción de anticuerpos monoclonales humanos contra estos antígenos. 20 Las células B aisladas de un animal así son monoespecíficas con respecto a las cadenas pesada y ligera humanas debido a que contienen solo una copia de cada gen. Además, estas serán monoespecíficas con respecto a las cadenas pesadas humanas o de ratón porque 25 las copias del gen de la cadena pesada de ratón endógenas son no funcionales en virtud de la deleción que abarca la región JH introducida como se describe en el Ejemplo 9 y 12 de WO 98/24884. Además una fracción substancial de las células B será monoespecífica con respecto a las cadenas ligeras humanas de ratón debido a que la expresión de la única copia del gen de la cadena ligera K humana re- arreglada excluirá de manera alélica o isotípica el rearreglo de los genes de la cadena K y lambda de ratón endógena en una fracción importante de las células B.

El ratón transgénico de la modalidad preferida presentará producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo, en teoría substancialmente similar al de un ratón natural. Así pues, por ejemplo, en modalidades donde los genes de Ig endógenos han sido inactivados, los niveles totales de inmunoglobulina serán en el intervalo desde aproximadamente 0.1 hasta 10 mg/mL del suero, de preferencia 0.5 a 5 mg/mL, en teoría cuando menos aproximadamente 1.0 mg/mL. Cuando un transgen capaz de efectuar un intercambio a IgG a partir de IgE ha sido introducido en el ratón transgénico, la relación en el ratón adulto de IgG a IgM en suero es de preferencia aproximadamente 10:1. La relación de IgG a IgM será mucho menor en ratones inmaduros. En general, más de aproximadamente 10%, de preferencia de 40 a 80% de las t. Ait J ^JB?m células B esplénicas y de ganglios linfáticos expresa exclusivamente la proteína IgG humana.

En teoría, el repertorio se aproximará al mostrado en un ratón no transgénico, por lo regular cuando menos aproximadamente 10% tan alto, de preferencia 25% a 50% o más. En general, cuando menos aproximadamente 1000 • inmunoglobulinas diferentes (en teoría IgG) , de preferencia 10 a 10 o más, serán producidas, 10 dependiendo principalmente del número de regiones V, J y D diferentes introducidas en el genoma del ratón. Estas inmunoglobulinas por lo regular reconocerán fl aproximadamente la mitad o más de las proteínas altamente antigénicas, por ejemplo, la proteína A de 15 staphylococcus . Por lo regular, las inmunoglobulinas presentarán una afinidad para antígenos preseleccionados de cuando menos aproximadamente 10 7M-1, de preferencia cuando menos aproximadamente 10 9M-1, de mayor preferencia cuando menos aproximadamente 10 10M-1, 1011M-1, 1012M-1 o 20 mayor, por ejemplo, hasta 10 13M-1 o mayor.

En algunas modalidades, puede ser preferible generar ratones con repertorios predeterminados para limitar la selección de los genes V representados en la respuesta 25 del anticuerpo a un tipo de antígeno predeterminado. Un transgen de la cadena pesada teniendo un repertorio predeterminado puede comprender, por ejemplo, genes de VH humanos que utilizan preferentemente en respuestas de anticuerpos al tipo de antígeno predeterminado en 5 humanos. De otro modo, algunos genes de VH pueden ser excluidos de un repertorio definido por diversas razones (por ejemplo tener una baja probabilidad de codificar • regiones V de alta afinidad para el antígeno predeterminado; tener una baja propensión a sufrir 10 mutación somática y conformación de la afinidad; o son inmunogénicos a ciertos humanos). Así pues, antes del rearreglo de un transgen que contenga diferentes segmentos fl de genes de cadena pesada o ligera, estos segmentos de genes pueden ser fácilmente identificados, por ejemplo, 15 por hibridación o secuenciación del DNA, como siendo de una especie de organismo diferente del animal transgénico.

Los ratones transgénicos de la presente invención 20 pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida del antígeno HER2/neu y/o células que expresen HER2/neu según se describe en lo anterior. Los ratones producirán células B que sufren intercambio de clase a través de la recombinación por intercambio 25 intratransgen (intercambio cis) y expresan .t. ?i__&xt__*r* * .. j> inmunoglobulinas reactivas con HER2/neu. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos de secuencia humana, en donde los polipéptidos de la cadena pesada y ligera están codificados por secuencias de transgen 5 humano, que pueden incluir secuencias obtenidas por mutación somática y uniones recombinatorias de la región V, así como secuencias codificadas por la línea germinal; • estas inmunoglobulinas de secuencias humanas pueden ser mencionadas como siendo substancialmente idénticas a una 10 secuencia polipéptido codificada por un segmento de gen VL ó VH humano y un segmento JL ó JL [sic] humano, aunque otras secuencias no de la línea germinal pueden estar (jfl presentes como resultado de la mutación somática y uniones por recombinación V-J y V-D-J diferenciales. Con 15 respecto a tales anticuerpos con secuencias humanas, las regiones variables de cada cadena son por lo regular cuando menos 80% codificadas por V, J de la línea germinal humana y, en el caso de cadenas pesadas, los segmentos del gen D; con frecuencia cuando menos 85% de 20 las regiones variables son codificadas por secuencias de fl la línea germinal humana presentes en el transgen; con frecuencia 90 a 95% o más de las secuencias de la región variable están codificadas por secuencias de la línea germinal humana presentes en el transgen. No obstante, 25 dado que se introducen secuencias no de la línea germinal -t'*"" ?._____íi_. Í . ,¿___íl_¡___,?Í%__>il_,_l_.,_ _, 73 por mutación somática y unión VJ y VDJ, los anticuerpos de la secuencia humana con frecuencia tendrán algunas secuencias de región variable (y con menor frecuencia secuencias de región constante) que no estén codificadas 5 por los segmentos del gen V, D ó J humano como se encuentran en el (los) transgen (es) humano (s) en la línea germinal del ratón. Por lo regular, las secuencias no de la línea germinal como estas (o porciones de nucleótidos individuales) formarán agrupamientos en o cerca de las 10 CDR, o en regiones donde se sabe que las mutaciones somáticas forman agrupamiento. flfe Los anticuerpos de las secuencias humanas que se unen al antígeno predeterminado pueden resultar de 15 intercambio del isotipo, de modo que los anticuerpos humanos que comprenden una cadena ? de la secuencia humana (como puede ser ?l, ?2a, ?2B ó ?3) y una cadena ligera de la secuencia humana (como puede ser K) son producidas. Tales anticuerpos con secuencias humanas con 20 intercambio de isotipo suelen contener una o más ^ mutaciones somáticas, por lo regular en la región variable y con frecuencia en o dentro de aproximadamente 10 residuos de una CDR) como resultado de una maduración de afinidad y selección de células B por el antígeno, 25 particularmente ulterior al desafió secundario del antígeno (o subsiguiente) . Estos anticuerpos de secuencias humanas con alta afinidad pueden tener afinidades de unión de cuando menos 1 x 10 9M-1, por lo regular cuando menos 5 x 10 9M—1, con frecuencia más de 1 x 1010M_1, y en ocasiones 5 x 1010M_1 hasta 1 x 1010M_1 o mayor.

• Otro aspecto de la invención pertenece a las células B provenientes de tales ratones los cuales pueden ser 10 utilizados para generar hibridomas que expresen anticuerpos monoclonales humanos que se unan con alta afinidad (por ejemplo más de 2 x 10 M~ ) a HER2/neu. Así fl pues, en otra modalidad de la invención, estos hibpdomas se utilizan para generar una composición que contenga una 15 inmunoglobulina que tenga una constante de afinidad (Ka) de cuando menos 2 x 10 M , para la unión a HER2/neu, en donde la inmunoglobulina comprende: una cadena ligera de la secuencia humana compuesta 20 de: (1) una región variable de la cadena ligera teniendo una secuencia polipeptídica que es substancialmente idéntica a una secuencia polipéptido codificada por un segmento de gen VL humano y un segmento JL humano, y (2) una región constante de la cadena ligera teniendo una 25 secuencia de polipéptido que es substancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen CL humano; y una cadena pesada de la secuencia humana compuesta de: (1) una región variable de la cadena pesada teniendo una secuencia de polipéptido que es substancialmente idéntica a una secuencia de polipéptido codificada por un segmento de gen VH humano, opcionalmente una región D, y un segmento JH humano, y (2) una región constante teniendo una secuencia de polipéptido que es substancialmente idéntica a una secuencia de polipéptido codificada por un segmento de gen de CH humano.

El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos con alta afinidad contra HER2/neu se facilita por un método para extender el repertorio de los segmentos del gen de la región variable humanos en un ratón transgénico que tenga un genoma que comprenda un transgen de inmunoglobulina humana integrado, el método comprende introducir en el genoma un transgen del gen V que comprenda segmentos del gen de la región V que no están presentes en el transgen de la inmunoglobulina humana integrado. Con frecuencia, el transgen de la región V es un cromosoma artificial de levadura que comprenden una porción de un arreglo del segmento de gen VH ó VL (V?) humano, como puede ocurrir en la naturaleza en un genoma humano o como puede estar empalmado junto [sic] por separado por los métodos recombinantes, que puede incluir segmentos de gen V fuera de orden u omitidos. Con frecuencia cuando menos 5 o más segmentos del gen V funcionales están contenidos en el YAC. En esta variación es posible hacer un ratón transgénico producido por el método de expansión del repertorio V, en donde el ratón expresa una cadena inmunoglobulina que comprende una secuencia de la región variable codificada por un segmento del gen de la región V presente en el transgen de la región V y una región C codificada en el transgen de la Ig humana. Por medio del método de expansión del repertorio V, los ratones transgénicos que tienen cuando menos 5 genes V distintos pueden ser generados; como también los ratones que contienen cuando menos aproximadamente 24 genes V o más. Algunos segmentos de genes V pueden ser no funcionales (por ejemplo pseudo genes y similares) ; estos genes pueden ser retenidos o pueden ser selectivamente delecionados por los métodos recombinantes disponibles para el experto, si se desea.

Una vez que se ha manipulado la línea germinal del ratón para contener un YAC funcional teniendo un repertorio de segmentos V expandidos, substancialmente no presentes en el transgen de la Ig humana contenido los segmentos del gen JIC, el rasgo puede ser propagado y reproducido en otros fondos genéticos, incluidos los fondos donde el YAC funcional teniendo un repertorio de segmento V expandido se reproduce en una línea germinal de ratón teniendo un transgen de Ig humana diferente. Múltiples YAC funcionales teniendo un repertorio del segmento V expandido pueden ser reproducidos en una línea germinal para funcionar con un transgen de Ig humana (o múltiples transgenes de Ig humana) . Aunque se mencionan en la presente como transgenes YAC, estos transgenes cuando se integran en el genoma pueden carecer substancialmente de secuencias de levadura, como las secuencias necesarias para replicación autónoma en levadura; esta secuencias pueden opcionalmente ser retiradas por manipulación genética (por ejemplo digestión de restricción y electroforesis en gel de campo pulsado u otro método conveniente) después la replicación en levadura ya no es necesaria (es decir, antes de la introducción en una célula ES de ratón o procigoto de ratón) . Los métodos de propagación de los rasgos de expresión de la inmunoglobulina de secuencia humana incluye reproducir un ratón transgénico que tenga el (los) transgen (es) de la Ig humana, y opcionalmente también que tenga un YAC funcional con un repertorio de segmentos V l_J_f ±?._L____k 78 expandido. Ambos segmentos de gen VH y VL pueden estar presentes en el YAC. El ratón transgénico puede ser reproducido en cualquier fondo deseado por el técnico, incluidos los fondos que albergan otros transgenes humanos, incluidos los transgenes de Ig humana y/o transgenes que codifican otras proteínas linfocitos humanos. La invención también proporciona una F inmunoglobulina con secuencia humana de alta afinidad producida por un ratón transgénico que tenga un transgen 10 YAC con repertorio de la región V extendida. Aunque lo anterior describe una modalidad preferida del animal transgénico de la invención, están contempladas otras modalidades que han sido clasificadas en cuatro categorías : 15 I. animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesada no re-arreglada y ligera re- arreglada; 20 II. animales transgénicos que contiene un transgen ^P de inmunoglobulina pesada no re-arreglada y ligera no re- arreglada; III. animal transgénico que contiene transgen de inmunoglobulina pesada re-arreglada y ligera no re- 25 arreglada; y -..-^¿-^---te.. _ £ k_j IV. animales transgénicos que contienen transgenes de inmunoglobulina pesada re-arreglada y ligera re- arreglada; De estas categorías de animales transgénicos, el orden de preferencia es como sigue II > I > III > IV, donde los genes de la cadena ligera endógena (o cuando menos el gen K) ha sido knock out por recombinación homologa (u otro método) y I > II > III > IV donde los genes de la cadena ligera endógenos no han sido knock out y deben ser dominados por exclusión alélica.

III . Moléculas biespecíficas/multiespecíficas que se unen a HER2/neu En todavía otra modalidad de la invención, los anticuerpos monoclonales humanos para HER2/neu (o porciones que se unen a antígeno de éstos, o anticuerpos monocatenarios de estos) se derivan o ligan a otra molécula funcional, por ejemplo otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo (incluidos los anticuerpos monocatenarios y los fragmentos de anticuerpos Fab' ) o un ligando proteínico, para generar una molécula biespecífica o multiespecífica que se una a múltiples sitios de unión o epítopes blanco. ÍA.J_._? __.. aá¡> En una modalidad particular, la invención propone una molécula biespecífica que incluye una primera porción que comprende un anticuerpo anti-HER2/neu monoclonal humano (o porción que se una al antígeno de este o 5 anticuerpo monocatenario de este) ligado funcionalmente (o por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a un segundo anticuerpo (o • porción que se una al antígeno de este o anticuerpo monocatenario de este) que se una a un receptor de Fe, 10 por lo regular FcdRI o FcaR (Figura 12) . La invención además proporciona moléculas multiespecíficas que además incluyen una tercera porción que se une a un antígeno de {Wk células tumorales diferentes de HER2/neu, como puede ser EGF-R. En una modalidad particular, la tercera porción es 15 EGF. Así pues, las moléculas multiespecíficas particulares de la invención contienen un anticuerpo anti-HER2/neu humano (o porción que se una al antígeno de este o anticuerpo monocatenario de este) ligado a un anticuerpo anti-FcR (o porción que se una al antígeno de 20 este o anticuerpo monocatenario de este) ligado a EGF (Figura 12) .

Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que comprenden 25 cuando menos una primera especificidad de unión para HER2/neu y una segunda especificidad de unión para un segundo epítope blanco. En una modalidad particular de la invención, el segundo epítope blanco es un receptor Fe, por ejemplo, Fc?RI humano o un receptor Fca humano. Por tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas capaces de unirse a células efectoras que expresan Fc?R, FcaR ó FceR (por ejemplo monocitos, macrofagos o células polimorfonucleares (PMN)), y a células blanco que expresen HER2/neu. Estas moléculas biespecíficas y multiespecíficas dirigen las células que expresan HER2/neu a las células efectoras y activan las actividades de la célula efectora mediada por el receptor Fe, como puede ser la fagocitosis de una células que expresan HER2/neu, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) , liberación de citosina o generación del anión superóxido.

Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención además pueden incluir una tercera especificidad de unión, para un objetivo distinto de HER2/neu, también conocido como un "anti-factor de mejoramiento (EF) ", además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-HER2/neu. Por ejemplo, la tercera especificidad de unión puede unirse a una proteína de la superficie celular involucrada en la actividad citotóxica y por este medio aumenta la respuesta inmune contra la célula blanco. La tercera especificidad de unión puede ser un anticuerpo (incluido ScFv) , fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que 5 se una a una molécula determinada, por ejemplo, a un antígeno o un receptor, y por este medio origina un mejoramiento del efecto de los determinantes de unión para el receptor Fc o el antígeno de las células blanco. La tercera especificidad de unión o "porción anti-factor 10 de mejoramiento" también puede unirse a un receptor de Fc o a un antígeno de la célula blanco. De otro modo, la porción anti-factor de mejoramiento puede unirse a una fl entidad que sea diferente de la entidad a la cual se unen la primera y segunda especificidades de unión. Por 15 ejemplo, la porción anti-factor de mejoramiento puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que origine una respuesta inmune incrementada contra la célula blanco) . 20 En una modalidad, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de unión cuando menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpos, que incluye, por ejemplo, Fab, 25 Fab', F(ab')2 Fv o un Fv monocatenario. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento minimo de este como puede ser un Fv o una construcción monocatenaria como esta descrito en Ladner y col., Patente Estadounidense No. 4,946,778, publicada el 7 de agosto de 1990, el contenido de la cual se incorpora expresamente como referencia.

• En otra modalidad, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden (a) un 10 anticuerpo monoclonal humano contra HER2/neu (por ejemplo el anticuerpo 3. F2 descrito en la presente) o un fragmento de anticuerpo de éste que incluye, por ejemplo, fl} Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv monocatenario, y (b) un anticuerpo monoclonal humano contra Fc?R o un FcaR (por 15 ejemplo el anticuerpo 14.1 descrito en la presente) presente en la superficie de una célula efectora, o un fragmento de anticuerpo de éste que incluye, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab') , Fv o un Fv monocatenario. De preferencia, el anticuerpo anti-Fc humano no se bloquea 20 por la IgG ó IgA humana cuando se une a las células efectoras .

Cuando se utiliza en la presente, el término "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los genes de 25 ocho cadenas ? ubicado en el cromosoma 1. Estos genes -^1-^---- _ . * . codifican un total de 12 isoformas de receptores de transmembrana o solubles que se agrupan en tres clases de receptores para Fc?R: Fc?RI(CD64), Fc?RII(CD32) y Fc?RIII (CD16) . En una modalidad preferida, el receptor Fc?, un Fc?RI de alta afinidad, humano. El Fc?RI humano es una molécula de 72 kDa que muestra alta afinidad para IgG monomérica (10 8-109M—1 ) .

La producción y caracterización de estos anticuerpos 10 monoclonales preferidos esta descrito por Fanger y col., en la Solicitud del PCT WO 88/00052 y en la Patente Estadounidense No. 4,954,617, las enseñanzas de las fl} cuales se incorporan completamente como referencia en la presente. Estos anticuerpos se unen a un epítope de 15 Fc?RI, Fc?RII ó Fc?RIII en un sitio que es distinto del sitio de unión a Fc? del receptor y, así, su unión no se bloquea substancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-Fc?R y específicos útiles en esta invención son Mab 22, Mab34, Mab44, Mab 62 y Mab 197. Los 20 hibridomas que producen Mab 32 están disponibles del American Type Culture Collection, ATCC acceso No. HB9469. Los fragmentos anti-Fc?RI Mab 22, F(ab')2 del Mab 22 pueden obtenerse de Medarex, Inc. (Annandale, N. J) . En otras modalidades, el anticuerpo anti-receptor Fc? es una 25 forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22. La producción y caracterización del anticuerpo HB22 esta descrito en Graziano, R. F. y col., (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y PCT/US93/10384. La línea celular que produce anticuerpos H22 fue depositada en la American Type Culture Collection el 4 de noviembre de 1992 con la designación HA 022CL1 y tiene el número de acceso CRL 11177.

En todavía otras modalidades preferidas, la especificidad de unión para un receptor Fc es proporcionada por un anticuerpo que se une a un receptor para IgA humana, por ejemplo, un receptor Fc-a (FcaRI (CD89)). De preferencia, el anticuerpo se une a un receptor de IgA humana en un sitio que no se bloquea por IgA endógena. El término "receptor para IgA" se propone para incluir el producto génico de un gen a (FcaRI) ubicado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica algunas isoformas de transmembrana alternativamente empalmadas de 55 a 110 kDa. El FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrofagos, granulocitos eosinófilos y neutrófilos, pero no en poblaciones de células no efectoras. El FcaRI tiene afinidad por el medio (~ 5 x 10 7M-1) tanto para IgAl como para IgA2, lo cual se incrementa con la exposición a las citocinas como G-CSF o GM-CSF (Morton, H. C. y col., (1996) Critical aA?___________is1^'*' *-M3b*a*-- - . ___ _.....*, _ . ._. ?^iii^^?i^''^'-a-Aa''^j'-<ii-t'"'-»áÉlAtl? Reviews in Imunology 16: 423-440). Cuatro anticuerpos monoclonales específicos para FcaRI identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de unión del ligando IgA, han sido descritos (Monteiro, R. C. y col., 1992, J. Immunol . 148: 1764). También se describe en la presente un anticuerpo monoclonal completamente humano contra FcaRI conocido como 14.1. • El FcaRI y el Fc?RI son los receptores activadores 10 preferidos para uso en la invención debido a que éstos: (1) se expresan principalmente en células efectoras inmunes, por ejemplo, en monocitos, PMN, macrofagos y (J células dendríticas; (2) se expresan a altas concentraciones (por ejemplo 5000-100,000 por célula); 15 (3) son mediadores de las actividades citotóxicas (por ejemplo ADCC, fagocitosis); (4) median la presentación de antígeno mejorada de antígenos, incluidos auto-antígenos, dirigidos a éstos. 20 En otras modalidades, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención además comprenden una especificidad de unión que reconoce, por ejemplo, se une a, un antígeno de células blanco, por ejemplo HER2/neu. En una modalidad preferida, se proporciona especificidad 25 de unión mediante un anticuerpo monoclonal humano de la ?t!É*1 .^ jAii presente invención.

Un "anticuerpo específico de células efectoras" cuando se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional del anticuerpo que se une a un receptor Fc de las células efectoras. Los anticuerpos preferidos para uso en la presente invención se unen al receptor Fc de las células efectoras en un sitio en el que no se une inmunoglobulina endógena. 10 Cuando se utiliza en la presente, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune que esta (fl involucrada en la fase efectora de una respuesta inmune, contrario a las fases cognitiva y de activación de una 15 respuesta inmune. Las células inmunes ejemplares incluyen una célula de origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo células B y células T que incluyen las células T citolíticas (CTL) ) , células asesinas, células asesinas naturales, macrofagos, 20 monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células !JP polimorfonucleares, granulocitos, mastocitos y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fc específicos y realizan funciones inmunes específicas. En las modalidades preferidas, una célula efectora es capaz 25 de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente __t.Jt ii_,íí._íí í^í¿_?__i: - ^ ^•i^-s--í^_^. _.. .... .,r._ ... ^ . ..... .. . ... _r_.^_ .^^__¿i_é*? _____mí___ J?__m de anticuerpos (ADCC) , por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrofagos que expresan FcR están involucrados en la muerte específica de las células blanco y presentan antígenos a 5 otros componentes del sistema inmune, o se unen a las células que presentan antígenos. En otras modalidades, una célula efectora puede fagocitar un antígeno blanco, célula blanco o microorganismo. La expresión de un FcR particular sobre una célula efectora puede ser regulada 10 por factores humorales como las citocinas. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de Fc?RI es activada por interferón gamma (IFN-?) . Esta expresión mejorada fl} aumenta la actividad citotóxica de las células portadoras de Fc?RI contra blancos. Una célula efectora puede 15 fagocitar o lisar un antígeno blanco o una célula blanco.

"Célula blanco" debe significar cualquier célula no deseada en un individuo (por ejemplo, un humano o animal, que puede ser blanco de una composición (por ejemplo un 20 anticuerpo monoclonal humano, una molécula biespecífica o fl} una multiespecífica) de la invención. En las modalidades preferidas, la célula blanco es una células que expresa o sobreexpresa HER2/neu. Las células que expresan HER2/neu por lo regular incluyen células tumorales, incluidas las 25 células de adenocarcinoma, por ejemplo de la glándula .t,?L_í s__ Aíi___i__M__L?M?l____,i*'?ií'-s_f- ?_. salival, estómago y riñon, células de carcinoma de glándula mamaria, células de carcinoma de pulmón, células de carcinoma de células escamosas y células de cáncer de ovario.

Aunque se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, es posible emplear otros anticuerpos en las moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la invención como los anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.

Los anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón- humano, (es decir, anticuerpos quiméricos) pueden ser producidos por las técnicas conocidas del DNA recombinante. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal murino (o de otras especies) se digiere con enzimas de restricción para retirar la región que codifica el Fc murino, y se sustituye la porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fc humana. (véase Robinson y col., Publicación de la Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, y col., Solicitud de Patente Europea 184, 187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171, 496; Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173, 494; Neuberger y col., Solicitud »».»«AML«t •- *»-¿<^ » •"•—•^--"-^^m Internacional WO 86/01533; Cabilly y col., Patente Estadounidense No. 4,816,567; Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125, 023; Better y col., (1988 Science 240: 1041-1043); Liu y col., (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu y col., 1987, J. Immunol. 139: 3521-526; Sun y col., (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura y col., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood y col., (1985) Nature 314: 446- 449; y Shaw y col., 1988, J. Nati. Cáncer Inst. 80: 1553- 1559) . 10 El anticuerpo quimérico además puede ser humanizado sustituyendo las secuencias de la región variable Fv que no estén directamente involucradas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de las regiones 15 variables Fv humanas. Revisiones generales de los antígeno quiméricos humanizados se proporcionan en Morrison, S. L. 1985, Science 299: 1202-1207 y en Oi y col., 1986, BioTechniques 4: 214. Estos métodos incluyen el aislamiento, manipulación y expresión de las 20 secuencias de ácidos nucleicos que codifican toda o parte (fl de las regiones variables Fv de la inmunoglobulina a partir de cuando menos una cadena pesada o ligera. Las fuentes de estos ácidos nucleicos son bien conocidas para los expertos en la técnica y, por ejemplo, pueden 25 obtenerse de 7E3, un hibridoma productor de anticuerpo anti-GPIIbIIIa- El DNA recombinante que codifica el anticuerpo quimérico, o fragmento de éste, entonces se puede clonar en un vector de expresión adecuado. Los anticuerpos humanizados adecuados pueden de otro modo ser 5 producidos por sustitución de la CDR, Patente Estadounidense No. 5,225,539; Jones y col., 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan y col., 1988, Science 239: 1534; y Beidler y col., 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060. 10 Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden ser sustituidas con cuando menos una porción de una CDR no humana o solo algunas de las CDR pueden ser • sustituidas con CDR no humanas. Sólo es necesario sustituir el número de las CDR necesarias para la unión 15 del anticuerpo humanizado al receptor Fc .

Un anticuerpo puede ser humanizado por cualquier método que sea capaz de sustituir cuando menos una porción de una CDR de un anticuerpo humano con una CDR 20 proveniente de un anticuerpo no humano. Winter describe • un método que puede utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987), el contenido de la 25 cual se incorpora expresamente como referencia. Las CDR humanas pueden ser sustituidas con las CDR no humanas utilizando mutagénesis dirigida al sitio oligonucleótido como se describe en la Solicitud Internacional WO 94/10332 titulada Anticuerpos humanizados para receptores Fc para inmunoglobulina G en fagoci tos mononucleares humanos .

• También dentro del alcance de la invención están los anticuerpos quiméricos y humanizados en los que han sido 10 sustituidos, delecionados o adicionados aminoácidos específicos. En particular, los anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la fl región del entramado, para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, en un anticuerpo humanizado que tenga CDR de 15 ratón, los aminoácidos ubicados en la región del entramado humano pueden ser sustituidos con los aminoácidos ubicados en las posiciones correspondientes en el anticuerpo de ratón. Tales sustituciones son conocidas por mejorar la unión de los anticuerpos 20 humanizados al antigeno en algunos casos. Los anticuerpos J en los que se ha adicionado, delecionado o sustituido amino ácidos se conocen en la presente como anticuerpos modificados o anticuerpos alterados. 25 El término anticuerpo modificado también se propone para incluir anticuerpos como los anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que hayan sido modificados por, por ejemplo, deleción, adición o sustitución de porciones del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser modificado por deleción de la región constante y la • sustitución de esta con una región constante significa aumentar la vida media, por ejemplo, la vida media en 10 suero, estabilidad o afinidad del anticuerpo. Cualquier modificación esta dentro del alcance de la invención siempre que la molécula biespecífica y multiespecífica • tenga cuando menos una región de unión al antígeno específica para un Fc?R y active cuando menos una función 15 efectora .

Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención pueden hacerse utilizando las técnicas químicas (por ejemplo véase D. M. Kranz y col., (1981) Proc . Na ti . 20 Acad. Sci . USA 78: 5807), técnicas de "polidoma" (véase • la Patente Estadounidense 4,474,893, de Reading), o las técnicas del DNA recombinante.

En particular, las moléculas biespecíficas y 25 multiespecificas de la presente invención pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FCR y anti-HER2/neu, utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos proporcionados en la presente. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica y multiespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, es posible utilizar una variedad de agentes copulantes o reticuladores para la conjugación covalente. Los ejemplos de los agentes reticuladores incluyen la proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S- acetiltioacetato (SATA), N-succinimidil-3- (2- piridilditio) propionato (SPDP) y sulfosuccinimidil 4-(N- maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo Karpovsky y col., 81984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu MA y col., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 8648). Otros métodos incluyen los descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt . (1985) No. 78. 118-132); Brennan y col., (Science (1985) 229: 81-83), y Glennie y col., (J. Im unol. (1987) 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos (dos anticuerpos humanizados) , estos pueden estar conjugados por enlaces sulfhidrilo de las regiones bisagra C terminales de las dos cadenas pesadas. En una 5 modalidad particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, de preferencia uno, antes de la conjugación.

• De otro modo, ambas especificidades de unión pueden 10 estar codificadas en el mismo vector y expresadas y ensambladas en la misma célula hospedera. Este método es particularmente útil donde la molécula biespecífica y multiespecífica es un Mab x Mab, Mab x Fab, Fab x F(ab')2 ó ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula 15 biespecífica y multiespecífica de la invención, por ejemplo, una molécula biespecífica puede ser una molécula monocatenaria, como puede ser un anticuerpo biespecífico monocatenario, una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda un anticuerpo monocatenario y una 20 determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas también pueden ser moléculas monocatenarias o pueden comprender cuando menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos 25 para preparar moléculas bi- y multiespecíficas están l._*_.k?._*..£.± it?.á ....^ __ ** , _ _ _ _ ^ , . M t. «^^Ama.^^J^^A^^-^----A^^^^^^'a?e«a-^ J¿afe* descritos por ejemplo en la Patente Estadounidense No. 5,260,203; la Patente Estadounidense No. 5,455,030; la Patente Estadounidense No. 4,881,175; Patente Estadounidense No. 5,132,405; Patente Estadounidense No. 5,091,513; Patente Estadounidense No. 5,476,786; Patente Estadounidense No. 5,013,653; Patente Estadounidense No. 5,258,498; y Patente Estadounidense No. 5,482,858.

La unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas a sus blancos específicos puede ser confirmada por el ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) , un radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo Western blot. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo un anticuerpo) específico para el complejo que interese. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo pueden ser detectados utilizando por ejemplo un anticuerpo ligado a enzimas o fragmento de anticuerpo que reconozca y específicamente se una a los complejos anticuerpo-FCR. De otro modo, los complejos pueden ser detectados utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo el anticuerpo puede ser marcado radiactivamente y utilizado en un radioinmunoensayo (RÍA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo, 1986, las cuales se incorporan como referencia en la presente) . El isótopo radiactivo puede ser detectado por medio del uso de un contador gama o un contador de centelleo o por auto-radiografía.

• IV. Conjugados de anticuerpos/inmunotoxinas 10 En otro aspecto, la presente invención caracteriza un anticuerpo monoclonal anti-HER2/neu humano, o un fragmento de éste, conjugado a una porción terapéutica, flf como puede ser una citotoxina, un fármaco o un radioisótopo. Cuando se conjugan a una citotoxina, estos 15 anticuerpos conjugados se conocen como "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que mate) las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasin B, gramicidin D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, 20 etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina 25 y análogos u homólogos de éstos. Los agentes terapéuticos 98 incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabma, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo mecloretamma, tioepa 5 clorambucil, melfalan, carmustine (BSNU) y lomustine (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis- • diclorodiammplatino (II) (DDP) cisplatino), antraciclina (por ejemplo daunorubicina (anteriormente daunomicina) y 10 doxorubicina), antibióticos (por ejemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina (AMCC) ) , y agentes antimitóticos (por ejemplo fl} vmcristina y vmblastina) . Un anticuerpo de la presente invención puede estar conjugado a un radioisótopo, por 15 ejemplo yodo radioactivo, para generar radio farmacéuticos citotóxicos para tratar un trastorno relacionado con HER2/neu, como puede ser un cáncer.

Los conjugados de anticuerpos de la invención pueden 20 utilizarse para modificar una respuesta biológica JP determinada, y la porción del medicamento no debe ser considerada como limitada a los agentes terapéuticos químicos normales. Por ejemplo, la porción del medicamento puede ser una proteína o polipéptido que 25 posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas JrilS__i_l_M___í-l_WV____l_i^rii__iífi_íMi . r.. . r µ. ,^ Jt _^„^_^_-pueden incluir, por ejemplo, una toxina con actividad enzimática, o fragmento de esta, como puede ser abrin, ricin A, pseudomonas exotoxina o toxina difteria; una proteína como el factor de necrosis tumoral o interferón gamma; o modificadores de la respuesta biológica como puede ser, por ejemplo, linfocinas, interleucina 1 ("IL-1") interleucina-2 ("IL-2") , interleucina-6 ("IL-6") , el factor estimulante de la colonia de granulocitos macrofagos ("GM-CSF") , factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar una porción terapéutica así a los anticuerpos son bien conocidas, véase por ejemplo Arnon y col., "Monoclonal Antibodies for Inmmunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld y col., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., "Antibodies for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed. ) , Robinson y col., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications. Pinchera y col., (eds.), pp. 475-506 (1985); "Análisis. Results. And Future Prospective of the Therapeutic Use Of Radiolabeld Antibody in Cáncer Therapy" in Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and therapy, Baldwin y col., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe y col., "The Preparation and Cytotoxic Propierties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).

V. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos o porción (es) de unión al antígeno de éstos, de la presente invención, formulados junto con un portador aceptable para uso farmacéutico. En una modalidad preferida, las composiciones incluyen una combinación de múltiples anticuerpos humanos aislados (por ejemplo dos o más) o porciones de unión al antígeno de éstos de la invención. De preferencia, cada uno de los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de éstos de la composición se une a un epítope de HER2/neu distinto, preseleccionado. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu humanos que tienen actividades complementarias se utilizan en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica, que contiene dos o más anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu humanos. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano que media la muerte altamente eficaz de las células blanco en presencia de células efectoras puede combinarse con otro anticuerpo monoclonal humano que inhiba el crecimiento de las células que expresan HER2/neu.

En otra modalidad, la composición comprende una o una combinación de moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la invención (por ejemplo, que contienen cuando menos una especificidad de unión para un receptor Fc y cuando menos una especificidad de unión para HER2/neu) .

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser administradas en tratamientos en combinación, es decir, combinados con otros agentes. Por ejemplo, el tratamiento en combinación puede incluir una composición de la presente invención con cuando menos un agente antitumoral u otro tratamiento habitual.

Cuando se utiliza en la presente, "portador aceptable para uso farmacéutico" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. De preferencia, el portador es conveniente para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo por inyección o infusión) . Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, el • anticuerpo, la molécula biespecífica y multiespecífica, pueden ser recubiertos en un material para proteger el 10 compuesto de la acción de los ácidos y otros estados naturales que puedan inactivar el compuesto.

• Una "sal aceptable para uso farmacéutico" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del 15 compuesto precursor y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S. M. y col., (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Los ejemplos de estas sales incluyen sales de adición acida y sales de adición básica. Las sales de adición acida incluyen 20 aquellos que se obtienen de ácidos inorgánicos no • tóxicos, como puede ser los ácidos clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos como los ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos 25 alcanóicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición básica incluyen aquellas provenientes de metales alcalinotérreos como sodio [sic] , potasio [sic] , 5 magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas como N, ' -dibenciletilendiamina, N- metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, • etilendiamina, procaína y similares. 10 Una composición de la presente invención puede ser administrada por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciarán los expertos, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden prepararse con 15 portadores que protegerán el compuesto contra liberación rápida, como pueden ser una formulación para liberación controlada, incluidos implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados . Los polímeros biodegradables, biocompatibles pueden utilizarse, como 20 puede ser etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglucólico, colágena, poliortoésteres y ácido • poliláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por 25 ejemplo, Sustained and Con trolled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker Inc., New York, 1978.

Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un individuo a un portador adecuado, por ejemplo liposomas, o un diluyente, los diluyentes aceptables para uso farmacéutico incluyen soluciones salinas y amortiguadas acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones agua en aceite en agua (CGF así como los liposomas habituales (Strejan y col., (1984) J. Neuroimmunol . 7: 27).

Los portadores aceptables o uso farmacéutico incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es conocido en la técnica. Excepto en tanto que cualquier medio o agente habitual sea incompatible con el compuesto activo, el uso de éstos en las composiciones farmacéuticas de la invención esta contemplado. Los compuestos activos complementarios también pueden estar incorporados en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas por lo regular deben ser estériles y estables en condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada conveniente para alta concentración del medicamento. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de éstos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de la dispersión y por el uso de surfactantes. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes como los antes mencionados, según se requiera, seguido por la microfiltración para la esterilización. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los antes enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacio y secado por congelamiento (liofilización) que producen un polvo de ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución anteriormente filtrada para ser estéril.

Los esquemas de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, es posible administrar un solo bolo, varias dosis divididas pueden ser administradas con el tiempo o la dosis puede ser reducida o aumentada en proporción según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis.

La forma unitaria de dosificación cuando se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente pequeñas adecuadas como dosificaciones unitarias para los individuos que van a ser tratados; cada unidad contiene 5 una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico necesario. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y directamente 10 dependientes de: (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se quiera obtener, y (b) las limitaciones propias de la técnica de la composición de tal compuesto activo para el • tratamiento de la sensibilidad en individuos. 15 Los ejemplos de los antioxidantes farmacéuticos aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y 20 similares; (2) antioxidantes solubles en aceite como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propilgalato, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, como puede ser el ácido cítrico, ácido 25 etilendiaminotetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido .»,»^¿L ..,¿.¿..1 i: tartárico, ácido fosfórico y similares.

Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones de la presente invención incluyen las convenientes para la administración oral, nasal, tópica (incluida la bucal y sublingual), recta, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden ser presentadas, convenientemente, en una forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas por cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad del ingrediente activo que puede estar combinada con un material portador para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del individuo que este siendo tratado y el modo de administración particular. La cantidad del ingrediente activo que puede estar combinado con un material portador para producir una forma de dosificación individual, generalmente, será aquella cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En general, de entre el 100%, esta cantidad abarcara desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 99% del ingrediente activo, de preferencia desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 70%, de mayor preferencia desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 30%.

Las formulaciones de la presente invención que son convenientes para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones para rocío que contengan portadores como 5 los conocidos en la técnica por ser adecuados. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de las composiciones de esta invención incluyen: polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas lociones, geles soluciones, parches e inhalantes. El 10 compuesto activo puede mezclarse en condiciones estériles con un portador aceptable para uso farmacéutico y con cualquier preservador, soluciones amortiguadoras o propelentes que puedan ser necesarios. 15 Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" cuando se utilizan en la presente significa los modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, por lo regular por inyección, e incluye sin limitación, la inyección 20 intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, flfc intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, e infusión. 25 Los ejemplos de los portadores acuosos y no acuosos convenientes que pueden empelarse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (como glicerol, polietilen glicol, propilen 5 glicol y similares) y mezclas convenientes de éstos, aceites vegetales como aceite de olivo, y esteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Es posible • mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento como lecitina, 10 mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones, y mediante el uso de surfactantes.

Estas composiciones también pueden contener 15 coadyuvantes como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificadores y agentes dispersantes. La prevención de presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización, supra , y por la inclusión de algunos agentes 20 antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol ácido sórbico y similares. También • puede ser deseable incluir en las composiciones agentes isotónicos como azúcares, cloruro de sodio y similares. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica 25 inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, como monoestearato de aluminio y gelatina.

Cuando los compuestos de la presente invención se administran como farmacéuticos a humanos y animales, éstos pueden ser proporcionados solos o como una composición farmacéutica que contenga, por ejemplo, 0.01 hasta 99.5% (de mayor preferencia, 0.1 hasta 90%) del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéutico aceptable.

Sin importar la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada conveniente, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéutica aceptable mediante los métodos habituales conocidos para los expertos en la técnica. Las concentraciones de dosificación real de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para obtener la respuesta terapéutica deseada para el paciente específico, la composición y el modo de administración, sin ser tóxica para el paciente. La concentración de la dosis seleccionada dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluye la actividad de las composiciones específicas de la presente invención que se emplean, o el éster, sal o amida de éste, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales que se utilicen en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y antecedentes médicos anteriores del paciente que este siendo tratado, y factores similares bien conocidos en la técnica médica.

Un médico o veterinario que tenga las habilidades ordinarias en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composición farmacéutica necesaria. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica en concentraciones menores que la necesaria para obtener el efecto terapéutico deseado y aumentar progresivamente la dosis hasta obtener el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de las composiciones de la invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis eficaz más baja para producir un efecto . _?_ ^_ _í. terapéutico. Una dosis eficaz así, generalmente dependerá de los factores descritos antes. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, de preferencia administrada próxima al sitio del objetivo. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición terapéutica puede ser administrada como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado en intervalos adecuados durante el día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. Aunque es posible que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición) .

Las composiciones terapéuticas pueden ser administradas con los dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, como los dispositivos que se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ó 4,596,556. Los ejemplos de los implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: la Patente Estadounidense No. 4,487,603, que describe una bomba para .¿ - L.? .i _. microinfusión implantable para dosificar el medicamento a una tasa controlada; la Patente Estadounidense No. 4,486,194 que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente 5 Estadounidense No. 4,447,233 que describe una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la Patente Estadounidense No. 4,447,224 que describe un aparato para infusión que puede ser implantado, de flujo variable, 10 para el suministro continuo del medicamento; la Patente Estadounidense No. 4,439,196 que describe un sistema de suministro de medicamentos por vía osmótica, teniendo compartimientos de múltiples cámaras; y la Patente • Estadounidense No. 4,475,196 que describe un sistema de 15 suministro osmótico de medicamentos. Estas patentes se incorporan en la presente como referencia. Muchos otros de estos implantes, sistemas de suministro y módulos son conocidos para los expertos en la técnica. 20 En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales ^P humanos de la invención pueden ser formulados para garantizar la distribución adecuada in vivo . Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye múltiples compuestos altamente hidrofílicos. Para garantizar que 25 los compuestos terapéuticos de la invención atraviesan la -.. -., __.._,. __.. ,__^ ^a», .--j, iit > BBB (si se desea) , estos pueden ser formulados, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses 4,522,811, 5,374,548 y 5,399,331. Los 5 liposomas pueden comprender una o más porciones que sean selectivamente transportadas a células u órganos específicos, de este modo mejoran el suministro del medicamento al sitio elegido (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Las porciones 10 que se dirigen al objetivo, ejemplares, incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,416,016 de Low y col.); manósidos (Umezawa y col., (1988) Biochem. Biophys. Res. Común. 153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman y col. (1995) FEBS Lett. 357: 15 140; M. Owais y col., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor para la proteína A surfactante (Briscoe y col., (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); diferentes especies de las cuales pueden comprender las formulaciones de las invenciones, así como los 20 componentes de las moléculas inventadas; pl20 (Sreller y col., (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273. En una modalidad de la invención, los compuestos 25 terapéuticos de la invención se formulan en liposomas; en *..~....__»_ú__^í&i~._ .. ]ia¡lltM? . t ? ^ ? ^^¿^ „ . . „. _^___. _._... „______a . _., __. ___. ^_^_ ______,, ^___ ¿__,__, a . íXJ una modalidad más preferida, los liposomas incluyen una porción orientadora. En una modalidad más preferida, los compuestos terapéuticos en los liposomas se suministran por inyección en bolo a un sitio próximo al tumor o infección. La composición debe ser fluida hasta el grado de que sea fácil su suministro por inyección. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos.

Una "dosis terapéutica eficaz" de preferencia inhibe el crecimiento del tumor en cuando menos aproximadamente 20%, de mayor preferencia cuando menos aproximadamente 40%, e incluso de mayor preferencia, cuando menos aproximadamente 60%, y todavía de mayor preferencia cuando menos aproximadamente 80%, con relación a los individuos no tratados. La posibilidad de un compuesto para inhibir el cáncer puede evaluarse en un sistema de modelo animal que pueda predecir la eficacia en tumores humanos. De otro modo, esta propiedad de una composición puede ser evaluada examinando la propiedad del compuesto para inhibir, tal inhibición in vi tro por ensayos conocidos por el técnico experto. Una cantidad terapéutica eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de otro modo, aminorar los síntomas en un individuo. Un experto con conocimientos ordinarios en la técnica podrá determinar tales cantidades con base en factores como la talla del individuo, la gravedad de los síntomas del individuo y la composición específica o vía de administración seleccionada.

La composición debe ser estéril y fluida hasta el grado de que la composición se pueda suministrar con jeringa. Además de agua, el portador puede ser una solución salina amortiguada isotónica, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares) , y mezclas convenientes de éstos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de revestimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de surfactantes. En muchos casos, se prefiere incluir agentes isotónicos como azúcares, polialcoholes como manitol o sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción de largo plazo de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoesterato de aluminio o gelatina .

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Cuando el compuesto activo está adecuadamente protegido, como ya se describió, el compuesto puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible, asimilable.

VI . Usos y métodos de la invención Las composiciones (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos para HER2/neu) y derivados/conjugados de éstos) de la presente invención tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vi tro e in vivo . Por ejemplo, estas moléculas pueden ser administradas a células en cultivo, por ejemplo, in vi tro o ex vivo, o a un individuo, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar diversos trastornos. Cuando se utiliza en la presente invención, el término "individuo" se entiende que incluye animales humanos y no humanos. Los animales humanos preferidos incluyen un paciente humano que tenga un trastorno caracterizado por la expresión, por lo regular expresión aberrante (por ejemplo sobre expresión) de HER2/neu. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención pueden utilizarse para tratar a un individuo con un trastorno tumorigénico, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresen HER2/neu -_,,¿»i :í. que incluye, por ejemplo, células de un adenocarcinoma, por ejemplo de la glándula salival, estómago y riñon, carcinoma de glándula mamaria, carcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas y células de cáncer de ovario. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados como los mamíferos y no mamíferos, como pueden ser primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etcétera.

Las composiciones (por ejemplo, los anticuerpos humanos, las moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención inicialmente pueden ser probadas para la actividad de unión asociada con el uso terapéutico o de diagnostico, in vi tro . Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden ser probadas utilizando los ensayos ELISA y citometría de flujo, descritos más adelante en los ejemplos. Además, la actividad de estas moléculas en la activación de cuando menos una actividad de las células efectoras mediadas por el efector, incluida la citólisis de las célula que expresan HER2/neu puede ser evaluada. Los protocolos para evaluar la fagocitosis mediada por células efectoras están descritos más adelante en los ejemplos. ^ ^?j^^fe^ ^i^ Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención tienen utilidad adicional en tratamientos y diagnostico de enfermedades relacionadas con HER2/neu. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas multiespecíficas o biespecíficas pueden utilizarse, por ejemplo, para elucidar in vivo o in vi tro una o más de las siguientes actividades biológicas: para opsonizar una célula que exprese HER2/neu; para mediar fagocitosis o citólisis de una célula que exprese HER2/neu en presencia de células efectoras humanas; o para inhibir el crecimiento de una célula que exprese HER2/neu.

En una modalidad particular, los anticuerpos humanos y derivados de éstos se utilizan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con HER2/neu. Los ejemplos de las enfermedades relacionadas con el HER2/neu incluyen algunos cánceres como adenocarcinoma, por ejemplo de la glándula salival, estómago y riñon, células de carcinoma de glándula mamaria, carcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas y cáncer de ovario.

Los métodos de administración de las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención son conocidos en la técnica. Las dosificaciones adecuadas de 5 las moléculas utilizadas dependerán de la edad y peso del individuo del medicamento particular que se utilice. Las moléculas pueden ser acopladas a los radionúclidos como 1311, 90Y, 105Rh, etcétera, como se describe en Goldenber, D. M. y col., (1981) Cáncer Res. 41: 4354- 10 4360, y en EP 0365 997. Las composiciones (por ejemplo, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden ser acopladas a agentes anti-infecciosos . 15 Las células efectoras específicas del blanco, por ejemplo, las células efectoras ligadas a las composiciones (por ejemplo a los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden utilizarse como agentes 20 terapéuticos. Las células efectoras para orientación pueden ser leucocitos humanos como macrofagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen [lacuna] y otras células portadoras de receptores para IgG o IgA. Si se desea, las células efectoras pueden obtenerse del 25 individuo que va a ser tratado. Las células efectoras específicas del blanco pueden ser administradas como una suspensión de células en una solución fisiológica aceptable. El número de células que se administre puede 8 9 ser en el orden de 10 -10 , pero variará dependiendo del 5 propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula blanco, por ejemplo, una célula tumoral que exprese • HER2/neu, y para efectuar la muerte celular mediante, por ejemplo, fagocitosis. Las vías de administración también 10 pueden variar.

El tratamiento con células efectoras específicas del blanco puede realizarse junto con otras técnicas para eliminar las células elegidas. Por ejemplo, el 15 tratamiento antitumoral utilizando las composiciones (por ejemplo anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención y/o células efectoras armadas con estas composiciones puede utilizarse junto con quimioterapia. Además, la inmunoterapia en 20 combinación puede utilizarse para dirigir dos poblaciones (fl efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos anti- HER2/neu ligados a anti-Fc-gamma Rl o anti-T3 pueden utilizarse junto con agentes de unión específicos del 25 receptor para IgG o IgA. _ "_ ¿¿t¿ Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención pueden utilizarse también para modular las concentraciones de Fc?R o FcaR en las células efectoras, como puede ser por formación de casquetes y eliminación de receptores sobre la superficie celular. Las mezclas de anti-receptores Fc también puede utilizarse para este propósito.

Las composiciones (por ejemplo anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención que tienen sitios para la unión al complemento, como las porciones de IgGl, -2 ó -3 o IgM que se unen al complemento, también pueden utilizarse en presencia de complemento. En una modalidad, el tratamiento ex vivo de una población de células que contiene células objetivo con un agente de unión de la invención y las células efectoras adecuadas pueden ser complementadas mediante la adición de complemento o suero que contenga complemento. La fagocitosis de las células objetivo recubiertas con un agente de unión de la invención puede mejorarse mediante la unión de las proteínas del complemento. En otra modalidad las células objetivo recubiertas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden ser usadas por el complemento. • .-fei-,-* «jLI Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden ser administradas junto con complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de la 5 invención están las composiciones que contienen anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones • son convenientes en cuanto a que el complemento se ubica en proximidad cercana a los anticuerpos humanos, las 10 moléculas multiespecíficas o biespecíficas. De otro modo, los anticuerpos humanos, las moléculas multiespecíficas o biespecíficas de la invención y el complemento o suero pueden administrarse por separado. 15 También dentro del alcance de la invención están los kits o equipos que contienen las composiciones (por ejemplo los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención y las instrucciones para su uso. El kit además puede contener 20 cuando menos un reactivo adicional, como puede ser el complemento, o uno o más de otros anticuerpos humanos de • la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano que tenga una actividad complementaria que se una a un epítope en una antígeno HER2/neu distinto del primer anticuerpo 25 humano) . ÍBa:MI"tfe--~ '-'• "'- -- r*.-É. *~l-l. . -. . , ,„.. . . _ . - .. . ^^„,^.»»^.^A, «*> .. „„¿- __* . Ufc * .* A- 1 En otras modalidades, el individuo además puede ser tratado con un agente que module, por ejemplo, que mejore o inhiba, la expresión o actividad de los receptores Fc? o Fca, por ejemplo, tratando al individuo con una citocina (citokine) . Las citocinas preferidas para la administración durante el tratamiento con la molécula multiespecífica incluyen: el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) , interferón-? (IFN-?) y el factor de necrosis tumoral (TNF) .

Las composiciones (por ejemplo, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden utilizarse para elegir células que expresen Fc-?R o HER2/neu, por ejemplo para el etiquetado de estas células. Para tal uso, el agente de unión puede ser ligado a una molécula que pueda ser detectada. Así pues, la invención propone los métodos para localizar ex vivo o in vi tro células que expresen los receptores Fc, como pueden ser Fc?R, o HER2/neu. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático.

En una modalidad, la invención proporciona los métodos para detectar la presencia del antígeno HER2/neu en una muestra, o para medir la cantidad del antígeno HER2/neu, que consiste en poner en contacto la muestra, y una muestra control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción para unión al antígeno de éste, que se una específicamente a HER2/neu, en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo o una porción de éste y el HER2/neu. Entonces se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra, comparada con la muestra control, es indicio de presencia de antígeno HER2/neu en la muestra.

En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia o para cuantificar la cantidad de células que expresan Fc in vivo o in vi tro. El método consiste en: (i) administrar a un individuo una composición (por ejemplo una molécula multi- o biespecífica) de la invención a un fragmento de ésta, conjugada a un marcador detectable; (ii) exponer al individuo a un medio para detectar el marcador detectable a fin de identificar las áreas que contienen células que expresan Fc . -^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^__^¡^^^^^^? Otras modalidades de la presente invención se describen en los siguientes ejemplos. La presente invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no deben ser considerados como limitantes. Los contenidos del listado de secuencias, figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas mencionadas a lo largo de esta solicitud se incorporan en la presente expresamente como referencia .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Generación de ratones con Cmu objetivo (targeted) Construcción de un vector orientador CMD El plásmido pICEmu contiene un fragmento EcoRI/Xhol del locus de la cadena pesada de Ig murina, abarcando el gen mu, que se obtuvo de una biblioteca genómica de un fago lambda Balb/C (Marcu y col., Cell 22: 187, 1980). Este fragmento genómico fue subclonado en los sitios Xhol/EcoRI del plásmido pICEMI9H (Marsh y col., Gene 32, 481-485, 1984). Las secuencias de la cadena pesada incluidas en pICEmu se extienden corriente abajo del sitio EcoRI ubicado justo 3' del mejorador intrónico mu, al sitio Xhol ubicado aproximadamente 1 kb corriente abajo del último exon de transmembrana del gen mu; no obstante, una gran parte de la región de repetición de 5 intercambio mu ha sido delecionada por el paso en E. Coli .

• El vector orientador fue construido como sigue (véase la Figura 1). Un fragmento de HindIII/Smal de 1.3 10 kb fue escindido de pICEmu y subclonado en pBluescript digerido con HindIII/Smal (Stratagene, la Jolla, CA) . Este fragmento pICEmu se extiende desde el sitio HindIII ubicado aproximadamente 1 Kb 5' del sitio Cmul al Smal ubicado dentro de Cmul. El plásmido resultante fue 15 digerido con Smal/Spel y se insertó el fragmento Smal/Xbal de aproximadamente 4 kb proveniente de pICEmu, extendiéndose desde el sitio Smal en Cmul 3' al sitio Xbal ubicado corriente abajo del último exon Cmu. El plásmido resultante, pTARl, fue linealizado en el sitio 20 Smal, y se insertó un cásete de expresión neo.

• Este cásete consiste en el gen neo bajo el control del promotor fosfoglicerato cinasa (pgk) de ratón (fragmento Xbal/Taql; Adra y col., (1987) Gene 60: 65-74) 25 y conteniendo el sitio de poliadenilación pgk (fragmento _a^___á^_É_^A ^_.,__i__i?s¡_. . *__, __. . i _t, i .,A_,_. „, , ^ ___ _._.. _. . . . _ __. . _. . _. ___. _________ j»<.^.i»?¿ ¡.l.t?Í PvuII/HindlII; Boer y col., (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308). Este cásete se obtuvo del plásmido pKJl (descrito por Tybulewicz y col., (1991) Cell 65: 1153-1163) del cual se escindió el cásete neo como un fragmento EcoRI/HindIII y se subclonó en pGEM-7Zf(+) digerido con EcoRI/HindIII para generar pGEM-7(KJl). El cásete neo fue escindido de pGEM-7(KJl) por digestión con EcoRI/SalI, se hicieron las puntas romas y se subclonó en el sitio Smal del plásmido pTARl, en la orientación contraria a las secuencias genómicas de Cmu. El plásmido resultante fue linealizado con Notl, y se insertó un cásete timidina cinasa (tk) del virus de herpes simple para permitir enriquecimiento de los clones ES portando recombinantes homólogos, como está descrito por Mansour y col., (1988) Nature 336: 348-352. Este cásete consiste en las secuencias codificantes del gen tk flanqueado (bracketed) por el promotor pgk de ratón y el sitio de poliadenilación, como esta descrito por Tybulewicz y col., (1991) Cell 65: 1153-1163. El vector orientador CMD resultante contiene un total de aproximadamente 5.3 kb de homología para el locus de la cadena pesada y está diseñado para generar un gen mu mutante en el que se ha insertado un cásete de expresión neo en el único sitio Smal del primer exón Cmu. El vector orientador fue linealizado con Pvul, que corta dentro de las secuencias del plásmido, antes de la electroporación en células ES.

Generación y análisis de células ES elegidas Células AB-1 ES (McMahon, A. P. y Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085) fueron crecidas en estratificadores alimentadores de células SNL76/7 sin actividad mitótica (ibid) prácticamente como está descrito (Robertson, E.J. (1987) en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J Robertson, ed.), Oxford: IRL Press, p. 71-112). El vector orientador CMD linealizado fue electroporado en células AB-1 por los métodos descritos Hasty y col., (Hasty, P. R. y col., (1991) Nature 350: 243-246). Las células electroporadas fueron plaqueadas en cajas de 10 mm a una densidad de 1-2 x 10 células/caja. Cada 24 horas, se adicionó G418 (200 microgramos/ml del componente activo) y FIAU (5 x 10~ M) al medio, y se dejó que se desarrollaran los clones resistentes a medicamentos durante 8-9 días. Los clones fueron recolectados, tripsinizados, divididos en dos porciones y además extendidos. La mitad de las células provenientes de cada clon fueron entonces congeladas y otra mitad analizada para recombinación homologa entre secuencias de vectores y objetivo.

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El análisis del DNA se realizó por hibridación Southern blot. El DNA se aisló de los clones como se describe por Laird y col., (Laird, P. W. y col., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293) . El DNA genómico aislado fue 5 digerido con Spel y como sonda se utilizó un fragmento Sacl de 915 pb, sonda A (véase la Figura 1), que hibrida a una secuencia entre el mejorador intrónico mu y la • región de intercambio mu. La sonda A detecta un fragmento Spel de 9.9 kb proveniente del locus de tipo nativo, y 10 una banda de 7.6 kb, para el diagnóstico, proveniente de un locus mu que sea recombinado de manera homologa con el vector orientador CMD (el cásete de expresión neo contiene un sitio Spel) . De los 1132 clones resistentes G418 y FIAU detectados por análisis Southern blot, 3 15 mostraron la banda Spel de 7.6 kb indicativa de recombinación homologa en el locus mu. Estos 3 clones fueron además digeridos con las enzimas Bgll, BstXI y EcoRI para verificar que el vector se integró homólogamente en el gen mu. Cuando se hibrida con la 20 sonda A, los Southern blot del DNA tipo nativo, digerido con Bgll, BstXI o EcoRI producen fragmentos de 15.7, 7.3, • y 12.5 kb, respectivamente, mientras que la presencia del alelo mu elegido está indicada por fragmentos de 7.7, 6.6, y 14.3 kb, respectivamente. Todos los 3 clones 25 positivos detectados por la digestión con Spel mostraron - _i ü_.ra *_ _í.. _ú___?&_. *. ^._. _ _ _ .^.^_____..~? .. -_.- - uw^aé .._^^^_£t^ ^^__^k¿?^^i^^..-^?^^-«?m^?. ^_i%^tí.¡ los fragmentos de restricción esperados Bgll, BstXI y EcoRI, diagnostico de inserción del cásete neo en el exon Cmul. 5 Generación de ratones portadores del gen mu mutado Los tres clones ES elegidos, designados con el • número 264, 272 y 408, fueron descongelados e inyectados en blastocistos C57BL/6J como se describe por Bradley 10 (Bradley, A. (1987) en Teratocarcinomas and Embryonics Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed. ) Oxford: IRL Press, p. 113-151) . Los blastocistos inyectados fueron transferidos en el los úteros de • hembras seudo preñadas para generar ratones quiméricos 15 representando una mezcla de células provenientes de las células ES de entrada y el blastocisto hospedero. El grado de contribución de las células ES a la quimera puede estimarse visualmente por la cantidad de coloración de la capa agutí, proveniente de la línea de células ES, 20 sobre el fondo negro C57BL/6J. Los clones 272 y 408 sólo produjeron bajo porcentaje de quimeras (es decir, bajo porcentaje de pigmentación agutí), pero el clon 264 produjo alto porcentaje de quimeras macho. Estas quimeras fueron reproducidas con hembras C57BL/6J y se generó 25 progenie agutí, indicativa de la transmisión de la línea _„ __. t_u___^.. .. . . . . -..»>...»„.-.-.M»«-fc.-i, -,»-.*«...----»..-'.-. .fe- -^iill. germinal del genoma de células ES. La detección para el gen mu objetivo se realizó por análisis Southern blot de DNA digerido con Bgll proveniente de biopsias de la cola (como se describe en lo anterior para el análisis del DNA de las células ES) . Aproximadamente 50% de la progenie agutí mostró una banda Bgll hibridante de 7.7 kb, además de la banda tipo nativa de 15.7 kb, demostrando una transmisión de la línea germinal del gen mu objetivo.

Análisis de ratones transgénicos para la inactivación funcional del gen mu Para determinar si la inserción del cásete neo en Cmul ha inactivado el gen de la cadena pesada de Ig, un clon 264 quimera fue reproducido con un ratón homocigoto para mutación JHD, la cual inactiva la expresión de la cadena pesada como resultado de la deleción de los segmentos del-, gen JH (Chen y col (1993) Immunol. 5: 647-656). Se generaron cuatro progenies agutí. Se obtuvo el suero de estos animales a la edad de un mes y se ensayaron por ELISA para la presencia de IgM murina. Dos de los cuatros descendientes fueron completamente carentes de IgM (véase la Tabla 1) . La determinación del genoma de los cuatro animales por análisis Southern blot del DNA, a partir de biopsias de la cola, por digestión con Bgll y la hibridación con la sonda A (véase la Figura 1) , y por digestión con Stul y la hibridación con un fragmento EcoRI/Stul de 475 pb (ibid) demostró que los animales que no expresan la IgM sérica son aquellos en los que un alelo del locus de la cadena pesada lleva la mutación JHD, los demás alelos llevan la mutación Cmul. Los ratones heterocigotos para la mutación JHD muestran niveles de tipo nativo de la Ig sérica. Estos datos demuestran que la mutación Cmul inactiva la expresión del gen mu.

TABLA 1 La Tabla 1 muestra los niveles de IgM sérica, detectados por ELISA, para ratones que llevan las mutaciones CMD y JHD (CMD/JHD) , para ratones heterocigotos para la mutación JHD (+/JHD) , para ratones (+/+) tipo nativo (129Sv x C57BL/6J.F1, y para ratones deficientes de células B, homocigotos para la mutación JHD (JHD/JHD) .

Ejemplo 2 Generación de ratones transgénicos HC012 Transgen de la cadena pesada humana HC012 El transgen HC012 fue generado mediante la co-inyección del inserto de 80 kb de pHC2 (Taylor y col., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591) y el inserto de 25 kb del pVxd. El plásmido pVxd fue construido como se describe a continuación.

Un fragmento HindIII/SalI DNA de 8.5 kb, comprendiendo el gen VH1-18 (DP-14) humano de la línea germinal, junto con la secuencia genómica de aproximadamente 2.5 kb del flanqueo 5' y de 5 kb del flanqueo 3' fue subclonado en el vector plasmídico pSP72 (Promega, Madison, Wl) para generar el plásmido p343.7.16. Un fragmento BamHI/HindIII DNA de 7 kb comprendiendo el gen VH5-51 (DP-73) humano de la línea germinal, junto con la secuencia genómica de aproximadamente 5 kb flanqueando 5' y de 1 kb flanqueando 3', fue clonado en el vector de clonación pGPlf del plásmido base pBR322 (Taylor y col., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295), para generar el plásmido p251f. Un nuevo vector de clonación proveniente de pGPlf, pGPlk (SEQ ID NO: 13), fue digerido con EcoRV/BamHI, y ligado a 5 un fragmento EcoRV/BamHI DNA de 10 kb, comprendiendo el gen VH3-23 (DP47) humano de la línea germinal, junto con la secuencia genómica flanqueadora 5' de aproximadamente • 4 kb y flanqueadora 3' de aproximadamente 5 kb. El plásmido resultante, pll2.2RR.7, fue digerido con 10 BamHI/SalI y ligado con el inserto BamHI/SalI purificado, de 7 kb, del p251f. El plásmido resultante, pVx4, fue digerido con Xhol y ligado con el inserto Xhol/Sall de 8.5 kb de p343.7.16. 15 Se obtuvo un clon con el gen VH1-18 en la misma orientación como los otros dos genes V. Este clon, denominado pVx6, entonces fue digerido con Notl y el inserto purificado de 25 kb fue co-inyectado, junto con el inserto Notl de 80 kb, purificado, del pHC2 en una 20 relación molar 1:1, en los pronúcleos de embriones fl} (C57BL/6J x DBA/2J)F2 de medio día, como se describe en Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual 2a edición, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY) . Tres líneas independientes de 25 ratones transgénicos comprendiendo las secuencias Vx6 y HC2 fueron establecidas a partir de los ratones que se desarrollaron de los embriones inyectados. Estas líneas están denominadas (HC012) 14881, (HC012) 15083 y (HC012) 15087. Cada una de las tres líneas entonces fue reproducida con ratones comprendiendo la mutación CMD descrita en el Ejemplo 1, la mutación JKD (Chen y col., 1993, EMBO J. 12:811-820) y el transgen (Kco5)9272 (Fishwild y col., 1996, Nature Biotechnology 14: 845- 851) . Los ratones resultantes expresan los transgenes de las cadenas pesada y ligera kappa humana en un fondo homocigoto para la disrupción de los loci de la cadena pesada y la cadena ligera kappa de ratones endógenos.

Ejemplo 3 Producción de anticuerpos monoclonales humanos y biespecificos contra HER2/neu Se generaron anticuerpos monoclonales humanos anti-HER2/neu inmunizando ratones HuMab de las cepas HC07 y HC012, con antígeno HER2/neu obtenido de tres fuentes: 1) células de carcinoma de mama humana que expresa altos niveles de HER2/neu, SKBR-3 y BT-474, crecidas en condiciones normales, cosechadas y lavadas con PBS; 2) lisados de las células SKBR-3 inmunoprecipitadas con un anticuerpo monoclonal murino anti- HER2/neu y sepharose anti-IgG de murino; y 3) HER2/neu vertido de células SKBR-3 y purificado por cromatografía de afinidad utilizando un anticuerpo monoclonal murino anti-HER2/neu. Los ratones HuMab HC07 fueron generados como se describe en la Patente Estadounidense No. 5, 545,806, 5,625,825 y 5,545,807, las descripciones completas de las cuales se incorporan por este medio como referencia.

En particular, los ratones HC07 y HC012 inicialmente fueron inmunizados con antígenos emulsificados en adyuvante completo de Freund. En inmunizaciones ulteriores, los antígenos fueron mezclados con adyuvante incompleto de Freund. Por último, se realizó administración intravenosa del antígeno antes de la esplenectomia con antígeno purificado, y sin adyuvante. Los ratones fueron inmunizados cada 2-3 semanas, después de la tercera e inmunizaciones siguientes, se determinó por ELISA (como ya se describió) el título anti-HER2/neu de la IgG humana. Los ratones que desarrollaron una respuesta IgG anti-HER2/neu fueron administrados con antígeno purificado i.v. durante 3 días o 3 y 4 días antes de la esplenectomia. Los bazos de los ratones que respondieron fueron cosechados y dispersados en células individuales .

Para generar hibridomas que produzcan anticuerpos anti-HER2/neu, los esplenocitos de los ratones con plasma conteniendo anticuerpos anti-HER2/neu fueron fusionados con células P3X63-Ag8.653 (depositadas con el ATCC bajo la denominación ATCC CRL 1580 células de mieloma de ratón no secretoras) y PEG. Después de que los hibridomas crecieron (aproximadamente 10-14 días) cada pozo conteniendo hibridomas fue detectado para la producción de IgG humana utilizando un ensayo ELISA anti-IgG humana. Los hibridomas positivos además fueron probados para especificidad del antígeno utilizando un ensayo ELISA para HER2/neu.

En resumen, las placas de microtitulación fueron cubiertas con HER2/neu purificado en una concentración de 0.25 µg/mL en PBS, y luego bloqueadas con albúmina de suero bovino al 5% en PBS. Los sobrenadantes de los hibridomas que producían anti-HER2/neu fueron adicionados a cada pozo e incubados durante 1-2 horas a 37 °C. se lavaron las placas con PBS/Tween y luego se incubaron con un reactivo policlonal específico de la Fc anti-IgG humana de cabra conjugado con fosfatasa alcalina durante una hora a 37 °C. Después del lavado, se expusieron las placas a pNPP y las muestras fueron leídas con un lector de microplacas a una longitud de onda de 405 nm. La ka.. . ? j .i . i.--¡--A -d-H-k- « Bl .-t Figura 2A representa la unión de tres sobrenadantes a partir de cultivos de hibridomas denominados 3.F2, 2.E8 y 1. D2 a HER2/neu recombinante según se midió por ELISA. La unión significativa se detectó con los tres sobrenadantes de hibridoma del anti-HER2/neu mostrados comparados con un medio control.

• Algunos hibridomas que secretaron anticuerpos IgG humana con especificidad para HER2/neu fueron subclonados 10 y extendidos para purificación de los anticuerpos monoclonales humanos. Los anticuerpos monoclonales se aislaron de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma crecidos en matraces con agitación en un incubador humidificado conteniendo C02 al 5%. Se 15 purificaron los anticuerpos por cromatografía sobre una columna de proteína A-agarosa de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Pierce, Rockford IL) .

Las placas de microtitulación fueron recubiertas con 20 el anticuerpo anti-HER2/neu de ratón, se bloquearon con f BSA al 5% y luego se incubaron con el sobrenadante de las células SKBR-3 crecidas en exceso, capturando así el HER2/neu vertido por las células. Luego se incubaron las placas con diferentes concentraciones de los anticuerpos 25 monoclonales anti-HER2/neu humanos o un control isotipo (IgGl humano) . Los anticuerpos anti-HER2/neu humanos que se unieron a HER2/neu inmovilizado fueron detectados como ya se describió. En particular, la Figura 2B muestra la unión de los anticuerpos 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10, 3.B4 a HER2/neu recombinante según se midió por ELISA.

Los hibridomas que produjeron la IgG humana y que se unieron a HER2/neu por ELISA fueron además caracterizados por ELISA y citometría de flujo para el isotipo, la unión a células tumorales que expresaban HER2/neu y la falta de unión a células negativas de HER2/neu según se describe más adelante. Los hibridomas con sobrenadantes que presentaban estas propiedades fueron subclonados, y sus anticuerpos además caracterizados después de purificación por cromatografía de afinidad-proteína A.

Doce hibridomas que fueron detectados producen anticuerpos IgG 1 K humana que se unen específicamente a HER2/neu según se evaluó por ELISA y citometría de flujo (3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10, 3.B4, 1.F11, 3.D11, 3.D6, 1.H9, 2.G7, 3.E8 y 2. Eli). Cinco de estos anticuerpos monoclonales (3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4) fueron purificados y se encontró que se unen a HER2/neu purificado y células tumorales humanas que expresaban HER2/neu. Estos cinco anticuerpos, según se demostró, &._.__. _*.___.. .._ median la muerte citolítica de células tumorales humanas que expresan HER2/neu e inhiben el crecimiento de las células tumorales humanas in vi tro .

Además, una molécula biespecífica, conocida como 14.1 x 3.F2, se preparó por conjugación química de los fragmentos Fab' 2 a partir del anticuerpo anti-CD89 humano 14.1 y el anticuerpo anti-HER2/neu humano 3.F2, a través de enlaces disulfuro utilizando los procedimientos de reticulación normales (Figura 13) .

Ejemplo 4 Caracterización de anticuerpos monoclonales humanos y biespecificos contra HER2/neu Unión de los anticuerpos anti-HER2/neu humanos y biespecíficos a células tumorales Los anticuerpos monoclonales purificados a partir de cinco sobrenadantes de hibridoma que mostraron unión significativa a HER2/neu según se detectó por ELISA (3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4) además fueron probados para la capacidad para unirse a las células tumorales que expresan altos niveles de HER2/neu. En resumen, las células tumorales (por ejemplo SKBR-3 o BT-474) fueron incubadas con anticuerpos o fragmentos de anticuerpo F(ab')2 y se lavaron para eliminar el anticuerpo no unido. El anticuerpo anti-HER2/neu humano unido a las células se detectó utilizando un anti F(ab')2 humano de cabra etiquetado con fluorocromo y la intensidad promedio de la fluorescencia de las muestras se determinó utilizando citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, los anticuerpos anti-HER2/neu, 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4 presentan unión significativa a las células SKBR-3 que expresan HER2/neu, en comparación con el anticuerpo humano control. Del mismo modo, la Figura 3C muestra la unión de los anticuerpos 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4 a células tumorales BT-474 que expresan HER2/neu sobre su superficie. La Figura 4 muestra la especificidad de los anticuerpos 3. F2 y 2.E8 para HER2/neu. Los anticuerpos anti-HER2/neu 3. F2 y 2.E8 presentan unión significativa, específica para las líneas de células tumorales que expresan HER2/neu, SKBR-3 y BT474, mientras que no se unen significativamente a la línea de células tumorales A431 que expresan altos niveles del receptor de EGF (c-erbBl) que está en la misma familia que la del receptor HER2/neu (c-erbB2) . Las moléculas biespecíficas que incluyen los anticuerpos anti-HER2/neu humanos o fragmentos de anticuerpos pueden ser probados para la unión en esta misma forma.

Inhibición del crecimiento de las células tumorales humanas utilizando anticuerpos anticuerpos anti-HER2/neu humanos y biespecificos 5 Los anticuerpos que mostraron unión específica a HER2/neu, como se demostró en lo anterior, fueron luego probados para la capacidad para inhibir el crecimiento de • las células tumorales humanas expresando HER2/neu en la superficie celular. En resumen, los anticuerpos 10 purificados fueron incubados con las células tumorales durante 6 días en condiciones normales de crecimiento, y se midió la densidad celular con tinción con violeta cristal. Según se demostró en las Figuras 5A y 5B, el tratamiento con anticuerpos anti-HER2/neu purificados, 15 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4 dan origen a una disminución dependiente de la dosis en la densidad celular de las células tumorales SKBR-3, según se comparó con un anticuerpo humano control. Los fragmentos F(ab')2 de los anticuerpos monoclonales anti-HER2/neu, 3. F2 y 20 2.E8, también inhiben el crecimiento de las células fl tumorales SKBR-3 en un modo dependiente de la dosis (véase la Figura 6) . Más aún, como se muestra en la Figura 7A, los anticuerpos anti-HER2/neu, 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4 mostraron una reducción dependiente de 25 la dosis en la densidad celular de las células tumorales BT-474 según se comparó con un anticuerpo humano control. La Figura 7B muestra que ei tratamiento de las células tumorales BT-474 con 10 µg de los anticuerpos anti-HER2/neu, 3. F2 y 2.E8, así como sus fragmentos F(ab')2, inhiben el crecimiento de las células tumorales, en comparación con un anticuerpo control. Las moléculas biespecíficas que incluyen los anticuerpos anti-HER2/neu humanos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, como se muestra en la Figura 13) pueden ser probados para inhibición del crecimiento de las células tumorales del mismo modo.

Actividad de los anticuerpos anti-HER2/neu humanos en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) La capacidad de los anticuerpos monoclonales humanos anti-HER2/neu seleccionados para mediar ADCC de las células tumorales diana que expresan HER2/neu en la superficie celular in vi tro también fue probada. En resumen, las células mononucleares fueron aisladas de donadores sanos e incubadas con células tumorales SKBR-3 etiquetadas con 51Cr en presencia de anticuerpos anti-HER2/neu purificados 3.F2, 2.E8 y 1. D2. Después de 4 horas, el sobrenadante del cultivo a partir de los pozos ¿- ,i_ % t i se cosechó y se midió el 51Cr liberado en un contador gamma. Se determinó el porcentaje de lisis específica de acuerdo con la siguiente fórmula: (CPM experimental - CPM fugado del objetivo) / (CPM de la lisis con detergente -CPM de la fuga del objetivo) x 100%. La Figura 8A demuestra que los anticuerpos anti-HER2/neu median lisis dependiente de la dosis de células tumorales SKBR-3 en comparación con un anticuerpo humano control. En otro estudio, macrofagos inducidos por IFN-? se incubaron con células SKBR-3 etiquetadas con 51Cr en presencia de 5 µg/mL de los anticuerpos anti-HER2/neu 3.F2, 2.E8, 1. D2 , 1.B10 y 3.B4. Después de 4 horas, el sobrenadante del cultivo se cosechó y se midió la liberación de 51Cr según se describió antes. Como se muestra en la Figura 8B, los anticuerpos anti-HER2/neu mediaron la lisis dependiente de la dosis de células tumorales que sobreexpresan HER2/neu en comparación con un anticuerpo humano control.

Además, se probó una molécula biespecífica purificada 14.1 x 3.F2 (Figura 13) para muerte ADCC con células polimorfonucleares de células tumorales humanas SKBR-3 o BT-474 etiquetadas con 51Cr. Después de la incubación durante la noche a 37 °C, se determinó la cantidad de la muerte de las células tumorales por análisis del 51Cr liberado en los sobrenadantes del cultivo. La lisis específica reportada es la cantidad de lisis de las células tumorales en presencia de la molécula biespecífica —lisis de células tumorales con células polimorfonucleares solamente. Como se muestra en la Figura 9, la molécula biespecífica 14.1 x 3. F2 fue mediadora de la muerte celular mediante PMN de las células tumorales SKBR-3 y BT-474 que expresaban HER2/neu en un modo dependiente de la dosis. Además, como se muestra en la Figura 10, la molécula biespecífica 14.1 x 3. F2 medió la muerte celular por monocitos de células tumorales SKBR-3 y BT-474 que expresaban HER2/neu, en un modo dependiente de la dosis. En ambos casos, la adición de 10 µg/mL del Fab'2 de 14.1 bloqueó completamente la ADCC de las células tumorales con 1 µg/mL de la molécula biespecífica 14.1 x 3.F2, demostrando que la muerte de las células objetivo fue mediada exclusivamente por la unión del CD89 a las células efectoras. La Figura 11 muestra que la molécula biespecífica 14.1 x 3.F2 también fue mediadora de la muerte celular mediante sangre completa de las células tumorales BT-474 que expresaban HER2/neu, en un modo dependiente de la dosis.

Los ejemplos antes mencionados describen la generación de los anticuerpos monoclonales humanos y las biespecíficas que reaccionan específicamente con alta afinidad para HER2/neu. Además, estos ejemplos demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos anti-HER2/neu inhiben eficazmente el crecimiento de las células tumorales humanas que expresan HER2/neu. Además, los anticuerpos humanos anti-HER2/neu y las moléculas biespecíficas median la actividad de la muerte celular en presencia de células efectoras contra células tumorales humanas que expresan altos niveles de HER2/neu. Estos resultados dan soporte a la conclusión de que los anticuerpos monoclonales completamente humanos contra HER2/neu (así como los fragmentos de estos) y las moléculas biespecíficas que incluyen estos anticuerpos de la presente invención son útiles para el tratamiento de trastornos relacionados con HER2/neu.

Ejemplo 5 Moléculas biespecificas y triespecificas que contienen porciones que se unen a los anticuerpos humanos dirigidos a HER2/neu y CD89 (FcaR) favorecen la citotoxicidad mediada por las células de las células tumorales Los siguientes estudios incluyen la producción y caracterización de moléculas biespecíficas y triespecíficas que inducen la muerte mediada por células efectoras de las células tumorales que expresan el _¿¿ ^_i_.£. . - t&íi ír l_L. receptor de EGF (EGF-R) y/o HER2/neu (también conocido como HER2). Las construcciones biespecíficas incluyen un anticuerpo anti-CD89 (anti-FcaR) (ScFv ó Fab' ) ligado a un anticuerpo anti-HER2 (SvFv o Fab' ) . La construcción triespecífica incluyó la construcción biespecífica anti-CD89 (ScFv) x anti-HER2 (ScFv), fusionada a EGF. Por tanto, las construcciones activan las funciones efectoras de las células que expresan CD89 que han sido dirigidas a las células tumorales.

Generación de las construcciones por fusión Las Figuras 12 y 13 muestran cada una de las moléculas bi- y triespecíficas y sus anticuerpos humanos precursores (HuMab) . La Figura 12 muestra las moléculas de fusión biespecíficas monocatenarias (ScFv), 931 y 934, que son las mismas excepto que 934 incluye EGF, mientras que 931 no lo incluye. Las regiones de la cadena ligera y pesada variables de 14.1 (anti-CD89) y 3. F2 (anti-HER2) se utilizaron para generar las construcciones. La Figura 13 muestra una molécula biespecífica anti-CD89 x anti-HER2 Fab' químicamente conjugada (como se describe en el Ejemplo 4 anterior) utilizada como control positivo. Los fragmentos Fab' de 14.1 y 3F2 fueron utilizados para generar esta BsAb.

Se produjeron las moléculas bi- y triespecíficas monocatenarias (931 y 934) transfectando células NSO con plásmidos (por ejemplo pJZ934) y se seleccionaron en medio conteniendo G418. Se exploraron las líneas de células para la expresión de la proteína de fusión y se subclonaron por clonación con dilución limitada. Por último, se purificó la proteína de fusión corriendo el sobrenadante de las líneas celulares que expresaban la proteína de fusión sobre una columna proteína L y luego cargando aproximadamente 2 µg de la proteína purificada sobre un gel tris-glicina al 4-15% en condiciones no reductoras y reductoras. La construcción 934 se purificó principalmente como una especie trimérica, la cual se disoció en los monómeros en condiciones reductoras.

Caracterización de la molécula bi- y triespecífica que se une a las células tumorales Se utilizó citometría de flujo para caracterizar la unión de las moléculas bi- y triespecíficas . La Figura 14 (A) muestra la unión a las células tumorales de las proteínas de fusión en sobrenadantes de transfectoma. El sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) se incubó con líneas de células tumorales SKBR-3 o A431. Luego se detectó la unión de la proteína de fusión mediante tinción con el Fab-2 del anti-IgG humana de cabra conjugado con ficoeritrina. Como se muestra en la Figura 14 (B) , los sobrenadantes de las células transfectadas (931 y 934) también mediaron la lisis celular (ADCC) . En estos estudios, se realizaron ensayos de liberación de cromo con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del efector (monocitos, PMN) al objetivo (SKBR-3, A431) de 100:1. Se detectó la muerte de las células tumorales utilizando el sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) para mediar lisis específica.

La Figura 15 (A) muestra la actividad de unión de moléculas bi- y triespecíficas purificadas (931 y 934) a células U937 (a través del receptor de CD89) . El fragmento Fab-2 del anticuerpo 425 (anti-EGF-R mAb) que no se une a las células U937, se utilizó como control negativo. Se utilizó como control positivo la molécula biespecífica químicamente acoplada anti-CD89 (Fab') x anti-HER2 (Fab') (mostrada en la Figura 13). La Figura 15 (B) es igual a la Figura 15 (A) , excepto que se probó la unión a las células SKBR-3 (a través del receptor de HER2). El fragmento Fab-2 del anticuerpo anti-CD89, 14.1, se utilizó como un control negativo. La Figura 16 muestra la unión de la construcción triespecífica 934 a las células A431. Este experimento se realizó en la misma forma como se muestra en la Figura 15, excepto que se utilizaron las células tumorales A431 que sobreexpresan EGF-R. Se utilizó como control positivo una proteína de fusión consistente en el fragmento sFv de 14.1 fusionado a EGF, y se utilizó como control negativo el fragmento Fab-2 del anticuerpo anti-CD89, 14.1.

Lisis mediada por células efectoras de las células tumorales que expresan HER2/neu y EGF-R Moléculas bi- y triespecíficas monocatenarias (931 y 934) también fueron probadas para su capacidad para mediar lisis celular (ADCC) de las células tumorales que expresan HER2/neu y EGF-R en presencia de células efectoras. Se realizaron ensayos de liberación de cromo con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del efector (monocitos, PMN) al objetivo (SKBR-3, A431) de 100:1. Se detectó la muerte de las células tumorales utilizando el sobrenadante transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) para mediar la lisis específica. Como se muestra en la Figura 14 (B) , los sobrenadantes de las células transfectadas (931 y 934) mediaron lisis celular (ADCC) de los monocitos y PMN y sangre completa. En estos estudios se realizaron ensayos -X-Í¡ S ,Í-?: de liberación de cromo con un periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del efector (monocitos, PMN) al objetivo (SKBR-3, A431) de 100:1. Se detectó la muerte de las células tumorales utilizando el sobrenadante 5 transfectado (931 y 934) y no transfectado (NSO) para mediar lisis específica.

• La Figura 17 y 18 muestran lisis mediada por células efectoras de células SKBR-3 (Figura 17 (A) y Figura 18 (A) ) 10 y de células BT474 (Figura 17 (B) y Figura 18 (B) ) mediante la construcción biespecífica monocatenaria purificada, 931, en presencia de PMN y monocitos, respectivamente. Se realizaron los ensayos de liberación de cromo con un • periodo de incubación de 16-18 horas y una relación del 15 efector al objetivo de 100:1. Se utilizó como control negativo en cada experimento el fragmento Fab-2 del anticuerpo anti-CD89, 14.1.

En general, los estudios anteriores describen la 20 generación de moléculas bi- y triespecíficas monocatenarias que dirigen e inducen la muerte de células tumorales mediada por células efectoras. Los estudios anteriores también demuestran que estas moléculas bi y triespecíficas son capaces de unirse a células que 25 expresan CD89, EGF-R y HER2. Es importante señalar que Li .i -t-Jh-faJUM -... _. ..*^,^..... los estudios además demuestran que, en presencia de células efectoras inmunes que expresan CD89, estas moléculas bi- y triespecíficas median la muerte de células que sobreexpresan EGF-R y HER2 en un modo dependiente de la dosis, y que la muerte celular es mediada por la unión a CD89 sobre las células efectoras. • ...i _--. -----..-_-_--..-^--..----.---¿-.. ^^ Referencias 1. Devilee, P. et al. (1994) Recent developments in the molecular genetic understanding of breast cáncer. Critical Reviews Oncogenesis 5:247-270. 2. Stancovski. I. et al [ . (1991) Mechanistic aspects of the opposing effects of monoclonal antibodies to the ERBB2 receptor on tumor growth. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8691-8695. 3. Bargmann, C. I. et al. (1986) Múltiple independent activation of the neu oncogene by a point mutation altering the transmembrane domain of pl85. Cell 45:649657. 4. Weiner, D. B. et al. (1989) A point mutation in the neu oncogene mimics ligand induction of receptor aggregation. Nature 339:230-231. 5. Stern, D. F. et al. (1988) Oncogenic activation of pl85neu stimulates tyrosine phosphorylation in vivo. Mol. Cell. Biol. 8:3969-3973. 6. Ross, J. S. el al. (1998) The HER2/neu oncogene in breast cáncer: prognostic factor, predictive factor, and target for therapy. Stem Cells 16:413-428. 7. Kern, J. A. et al. (1993) Inhibition of human lung cáncer cell line growth by an anti-pl85HER2 antibody. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9:448-454. 8. Witters, L. M. er al. (1997) Enhanced anti-proliferative activity of the combination of tamoxifen plus HER-2-neu antibody. Breast Cáncer Res. Treatment 42:1-5. 9. Myers, J. N el al. (1991) Biological effects of monoclonal antireceptor antibodies reactive with neu oncogene product, pl85neu. Methods Enzymol. 198: 277-290. 10. Fendly, B. M. el al. (1990) Characterization of murine monoclonal antibodies reactive to either the human epidermal growth factor receptor or Her2/neu gene product. Cáncer Res. 50:1550-1558. 11. G. Kobler y Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497. h ___&Á*^ *t-*<&>* _ - 12. G. L. Boulianne. Hozum N., y Shulman M. J. (1984) Production of functional chimeric mouse/human antibody. Nature 312: 643-646. 13. P. T. Jones. Dear P. H., Foote J. , Neuberger M. S., y Winter G. (1989) Replacing the complementarity- determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321. 522-525. 14. J. D. Marks et al. (1991) By-passing Immunization Human antibodies from V-gene librarles displayed on phage. J. Mol. Biol. 222: 581-597. 15. N. Lonberg, et al. 1994. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368(6474): 856-859. 16. G. Gafie, Howe S. C, Butcher M. C. C. W., y Howard H. C. (1997) Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature 266:550- 552.

Equivalentes Los expertos en la técnica se darán cuenta, o podrán averiguar utilizando no más que la experimentación habitual, múltiples equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Estos equivalentes están propuestos para ser comprendidos por las siguientes cláusulas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Medarex, Inc . <i2o> ANT ICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA HER2 /neu <130> MXI-160PC 10 <140> <141> <150> USSN 60/146,313 • <151> 1999-07-29 15 <150> USSN 60/188,539 <151> 1999-03-10 <160> 13 20 <170> Patentln Ver. 2.0 • <210> 1 25 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> 30 <221> CDS <222> (1) .. (372) <400>' 1 gag gtg cag ctg ttg gag tet ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 35 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttt age age tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 40 20 25 30 gcc atg acc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45 35 40 45 tea gct ate agt ggt agt ggt tat age acá tac tac gca gac tcc gag 192 Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Glu 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 10 ctg caá atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 • 15 gcg aaa ggg ttt cag tat ggt teg ggg agt tat tat acc cac ttt gac 336 Ala Lys Gly Phe Gln Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Thr His Phe Asp 100 105 110 20 tac tg-J ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tea 372 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 25 <210> 2 <211> 124 <212> PRT 30 <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 35 40 45 • Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Glu 50 55 60 45 Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Phe Gln Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Thr His Phe Asp 100 105 110 Tyr Tr Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (321) <400> 3 gac ate cag atg acc cag tet cca tcc tea ctg tet gca tet gta gga 48 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att age age tgg 96 Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly He Ser Ser Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu He 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caá agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg acá gat ttc act ctc acc ate age age ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caá cag tat aat agt tac ceg tac 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> "4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly He Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu He 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 5 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) . (366) <400> 5 cag gtg cag ctg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tet gga ttc acc ttc agt age tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gac ata cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Asp He His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 10 gca gta ata tgg tat gat ggc agt aat aaa tac cat gca gac tcc gtg 192 Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60 15 aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 20 ctg caá atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 25 gcg aga aac tat ggt ttg ggg agt tat tat aac tac ttt gac ttc tgg 336 Ala Arg Asn Tyr Gly Leu Gly Ser Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 30 ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tea 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 35 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens 40 <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 45 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 f^fa^ Asp He His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Gly Leu Gly Ser Tyr Tyr Asn Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) . (321) <400> 7 gac ate cag atg acc cag tet cca tcc tea ctg tet gca tet gta gga 48 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cat ggt att age age tgg 96 Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser His Gly He Ser Ser Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu He 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caá agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 i^ agt gga tet ggg acá gat ttc act ctc acc ate age age ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caá cag tat aat agt tac ceg tac 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser His Gly He Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu He 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 9 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) . 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Á, <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 10 Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 15 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 20 Ala Leu Met Val Arg Gly Leu He He Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 25 <210> 11 <211> 324 <212> DNA 30 <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (324) 35 <400> 11 gaa att gtg ttg acá cag tet cca gcc acc ctg tet ttg tet cca ggg 48 Glu He Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 40 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 45 tta gcc tgg tac caá cag aaa cct ggc cag gct ecc agg ctc ctc ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45 g|^^ tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tet ggg acá gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt age aac tgg cct ceg 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa 324 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 12 <211> 108 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gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 2820 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 2880 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 2940 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 3000 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 3060 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 3120 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaag 3159

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a HER2/neu y que inhibe el crecimiento de las células que expresan HER2/neu, producido a partir de un animal transgénico no humano.

2. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a HER2/neu humano con una constante de asociación en equilibrio (Ka) de cuando menos 108 M"1.

3. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a HER2/neu humano con una constante de asociación en equilibrio (Ka) de cuando menos 109 M"1.

4. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en cuando menos aproximadamente 40%.

5. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en cuando menos aproximadamente 60%.

6. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo no se une a EGFR.

7. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde la cadena pesada del anticuerpo es una cadena pesada de IgGl ó IgG3.

8. Un anticuerpo monoclonal humano aislado codificado por ácidos nucleicos de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa del IgG humana que comprende las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

9. Un anticuerpo monoclonal humano aislado codificado teniendo regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG que comprende las secuencias de aminoácidos mostrados en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente, y modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

10. Un anticuerpo monoclonal aislado codificado por los ácidos nucleicos de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG humana que comprenden las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 7, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

11. Un anticuerpo monoclonal humano aislado teniendo regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente, y modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

12. Un anticuerpo monoclonal humano aislado codificado por los ácidos nucleicos de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG humana que comprenden las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 11, respectivamente, y modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

13. Un anticuerpo monoclonal humano aislado teniendo regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente, y modificaciones de secuencias fcfcí , & s¿ tfe- X.J*~&.^&£... __Jb _ ,.t i conservativas de estas.

14. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo tiene cuando menos una de las 5 características seleccionadas del grupo que consiste en: a) constante de afinidad de unión de cuando" menos aproximadamente 108 M"1 ^^ b) una constante de asociación (KaSoc) de cuando menos aproximadamente 104, y 10 c) la capacidad para opsonizar una célula que expresa HER2/neu; o d) la capacidad para mediar citólisis de una ^ célula que expresa HER2/neu en presencia de células efectoras humanas en una concentración de aproximadamente 15 10 µg/mL o menos in vi tro .

15. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde la célula que expresa HER2/neu es una célula tumoral . 20 ^

16. El anticuerpo humano de la reivindicación 15, en donde la célula que expresa HER2/neu se selecciona del grupo que consiste en una célula de adenocarcinoma, por ejemplo glándula salival, estómago y riñon, una célula de 25 carcinoma de glándula mamaria, una célula de carcinoma de ? ?i-.i .. :k ma _.^___^i____j__i_s_______j__É___ pulmón, una célula de carcinoma de células escamosas y una célula de cáncer de ovario.

17. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, producido por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano teniendo un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana fusionados en una célula inmortalizada.

18. Un anticuerpo monoclonal humano aislado producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4.

19. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a HER2/neu y media citólisis de las células que expresan HER2/neu en presencia de células efectoras humanas, en donde el anticuerpo se produce a partir de un animal transgénico no humano.

20. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 8, o una porción que se une al antigeno de este, que es capaz de mediar citólisis de las células que expresan HER2/neu por células efectoras humanas en una CI50 de 1 x 10~7 M o menos in vi tro . _*_m ¡ t?&i igy^y^j^ . as. ___ &. &. a

21. Un hibridoma que comprende una célula B obtenida de un animal transgénico no humano teniendo un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera, fusionados a una célula inmortalizada, en donde el hibridoma produce un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a HER2/neu.

22. El hibridoma de la reivindicación 21 que produce un anticuerpo monoclonal humano codificado por los ácidos nucleicos de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG humana que comprenden las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y las modificaciones de secuencias conservativas de estas.

23. El hibridoma de la reivindicación 21 que produce un [lacuna] monoclonal humano teniendo las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG las cuales comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

^.- - ^-Arf,i. -fea¿---fe-, 24. El hibridoma de la reivindicación 21 el cual produce un anticuerpo monoclonal humano codificado por los ácidos nucleicos de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG humana que comprenden las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 7, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de estas .

25. El hibridoma de la reivindicación 21, que produce un [lacuna] monoclonal humano teniendo las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG las cuales comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

26. El hibridoma de la reivindicación 21, el cual produce un anticuerpo monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos de la cadena pesada de la IgG humana y de la cadena ligera kappa humana que comprenden las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 11, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de estas. ^»^j^1;^^^t ^?ff»Jitt^-.|jrit.a. . .._^.fr.....,J&i _iíáaÉá___É¡l/t__l&*. * .,..._. . ....... --. _.. .. .. «. .. .^a,.., .¿Á,i ?. ___i

27. El hibridoma de la reivindicación 21, el cual produce un anticuerpo monoclonal humano que tiene regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de la IgG, las cuales comprenden las 5 secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de estas.

28. El hibridoma de la reivindicación 21, seleccionado 10 del grupo que consiste en 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 y 3.B4

29. Un animal transgénico no humano que expresa un A anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a HER2/neu, en donde el animal transgénico no humano tiene 15 un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana.

30. Un método para producir un anticuerpo monoclonal humano que se una específicamente a HER2/neu, el cual 20 consiste en: ^fc inmunizar un animal transgénico no humano que tenga un genoma que comprenda un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana con HER2/neu o una célula que expresa HER2/neu, de modo que 25 los anticuerpos se produzcan por las células B del animal aislar las células B del animal, y fusionar las células B con células de mieloma para formar células inmortales de hibridoma que secreten anticuerpos monoclonales humanos específicos para HER2/neu.

31. Una molécula biespecifica que contiene una primera especificidad de unión la cual es un anticuerpo monoclonal humano, o una porción que se une al antigeno 10 de este, se une específicamente a HER2/neu, y una segunda especificidad de unión para un receptor de Fc.

32. La molécula biespecifica de la reivindicación 31, en donde el receptor de Fc es un Fc?RI humano o un receptor 15 de Fca humano.

33. La molécula biespecifica de la reivindicación 31, la cual se une al receptor de Fc en un sitio distinto del sitio de unión de la inmunoglobulina del receptor. 20

34. La molécula biespecifica de la reivindicación 31, en donde la segunda especificidad de unión que se une a un receptor de Fc es un anticuerpo monoclonal humano o una porción que se une al antigeno de éste. 25

35. La molécula biespecifica de la reivindicación 31, la cual es una proteina de fusión monocatenaria o Fab' .

36. Una molécula multiespecifica que contiene una primera especificidad de unión la cual es un anticuerpo monoclonal humano, o una porción que se une al antigeno de este, que se une específicamente a HER2/neu, una segunda especificidad de unión para un receptor de Fc y una tercera especificidad de unión para un antigeno tumoral diferente de HER2/neu.

37. La molécula multiespecifica de la reivindicación 36, en donde la tercera especificidad de unión es EGF.

38. Una composición que contiene un anticuerpo monoclonal humano aislado el cual se une específicamente a HER2/neu, y un portador aceptable para uso farmacéutico, en donde el anticuerpo se produce a partir de un animal transgénico no humano.

39. La composición de la reivindicación 38, que consiste en una combinación de dos o más anticuerpos humanos aislados que se unen específicamente a HER2/neu, en donde cada uno de los anticuerpos se une a un epitope distinto de HER2/neu. ??.j~i.tá _ _t*.¿ ujf..».>»afc... .. -m áiip--- , -¿--L-.Í ¿ ..

40. La composición de la reivindicación 38 además comprende un agente quimioterapéutico.

41. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa HER2/neu, consiste en poner en contacto una célula que expresa HER2/neu con un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a HER2/neu, de modo que se inhiba el crecimiento de la célula, en donde el anticuerpo se produce a partir de un animal transgénico no humano.

42. Un método para inducir citólisis de una célula que expresa HER2/neu, consiste en poner en contacto una célula que expresa HER2/neu con un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a HER2/neu, en presencia de una célula efectora, de modo que ocurra citólisis de la célula que expresa HER2/neu, en donde el anticuerpo se produce de un animal transgénico no humano.

43. Un método de tratamiento o prevención de una enfermedad caracterizada por expresión aberrante de HER2/neu, consiste en administrar a un individuo un anticuerpo monoclonal humano aislado que se una específicamente a HER2/neu en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad mediada por HER2/neu, en ?___?J ___. ?_.A- ?áa?.i?. ____. -"•*»"** g¡|2g^^£^^ donde el anticuerpo se produce de un animal transgénico no humano.

44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 41- 43, en donde el anticuerpo monoclonal humano se conjuga a una especificidad de unión para un receptor de Fc .

45. El método de la reivindicación 44, en donde el anticuerpo monoclonal humano se conjuga a una citotoxina.

46. El método de la reivindicación 44, en donde la enfermedad es un cáncer.

47. El método de la reivindicación 46, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un adenocarcinoma, por ejemplo de glándula salival, estómago y riñon, carcinoma de glándula mamaria, carcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas y cáncer de ovario.

48. Un método para detectar la presencia del antigeno HER2/neu, o una célula que exprese HER2/neu, en una muestra consiste en: poner en contacto la muestra, y una muestra control, con un anticuerpo monoclonal humano que se una -H tf -iií-t. tí JÜÉ Éi hl ..„•«*., , , , __. ,„-_.. .....^^^. ~~~ .- . AAÍ-AA específicamente a HER2/neu, en donde el anticuerpo se produce de un animal transgénico no humano, en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción de éste y HER2/neu; y detectar la formación de un complejo, en donde una diferencia de la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra control es indicativa de la presencia de HER2/neu en la muestra.

49. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a HER2/neu, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11.

50. Una inmunotoxina que comprende un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a HER2/neu ligado a un agente citotóxico, en donde el anticuerpo se produce de un animal transgénico no humano. titíí l HiTttiltilifir- - . ._^_^_*kt___í_____^ ~ T*? ___~. .