CZ200438A3 - Název neuveden - Google Patents

Description

Lidské monoklonální protilátky k receptoru epidermálního ' růstového faktoru (EGFR)

Související přihlášky

Předkládaný vynález uplatňuje prioritu z U.S. prozatímní přihlášky č.: 60/298,172, podané 13.6.2001, která je zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká izolovaných lidských monoklonálních protilátek, které se specificky váží na lidský EGFR, a souvisejících kompozic a molekul na bázi protilátek. Lidské protilátky mohou být produkovány transgenními myšmi, které jsou schopné produkovat mnoho izotypů lidských monoklonálních protilátek díky V-D-J rekombinaci a přesmyku izotypů. Vynález také popisuje farmaceutické prostředky obsahující tyto protilátky, non-lidská transgenní zvířata a hybridomy, které produkují lidské protilátky, a terapeutické a diagnostické metody pro použití lidských protilátek.

Dosavadní stav techniky

EGF receptor (EGFR) je 170 kDa transmembránová molekula typu 1. Bylo zjištěno, že její exprese je zvýšena u mnoha lidských nádorů, včetně karcinomů hlavy a krku, prsu, tlustého střeva, prostaty, plic a vaječníků. Stupeň nadměrné exprese koreluje se špatnou klinickou prognosou (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology 4:277-296) . Kromě toho je její exprese často doprovázena produkcí EGFR ligandů, například TGF-α a EGF, buňkami exprimujícími EGFR, což ukazuje na podíl • · autokrinní zpětnovazebně smyčky při progresi těchto nádorů (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology. 4:277-296). Blokování interakce mezi takovými EGFR ligandy a EGFR může tedy inhibovat růst a přežívání nádorů (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154).

Monoklonální protilátky (MAb) namířené proti vazebné doméně EGFR pro ligand mohou blokovat interakci s EGF a TGF-a a tím současně intracelulární signální dráhu. Bylo připraveno několi myších monoklonálních protilátek, které dosahují takového blokování in vitro a tyto protilátky byly hodnoceny na svou schopnost ovlivňovat růst nádorů v modelech myších xenotransplantátů (Masui, et at. (1986) Cancer Res. 46: 55925598; Masui, et al. (1984) Cancer Res. 44: 1002-1007; Goldstein, et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318). Při podání jeden den po aplikaci lidských nádorových buněk byla většina těchto anti-EGFR MAb schopna účinně bránit tvorbě nádorů u athymických myší (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154). Nicméně, při injekci myším s již vzrostlými xenotransplantáty způsobovaly tyto myší MAb (např. MAb 225s a 528) pouze parciální regresi nádorů. Pro eradikaci nádorů bylo potřebné současné podání chemoterapeutických léků (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Fan, et al. (1993) Cancer Res. 53: 4322-4328; Baselga, et al.

(1993) J. Nati. Cancer Inst. 85: 1327-1333).

Ačkoliv tedy dosud získané výsledky jasně určují EGFR jako cíl pro imunoterapii, ukazují zároveň, že myší protilátky nejsou ideálními terapeutickými činidly. Kromě toho léčba myšími protilátkami obvykle spouští těžkou imunitní reakci u pacienta. Pro překonání imunogenicity myších protilátek by měla být terapeutická činidla v ideální situaci plně lidská.

• · · · • ·

I · · · · • · · · · · ·

Krokem směrem k tomuto cíli je chimérická verze 225 MAb (C225) , ve které jsou variabilní regiony myší protilátky navázány na lidské konstantní regiony. Ačkoliv má C225 lepší protinádorovou aktivitu při léčbě již uchycených xenotransplantovaných nádorů in vivo, je tohoto účinku dosaženo pouze při použití vysokých dávek (Goldstein, et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:1311-1318). V současnosti se C225 hodnotí v klinických pokusech v léčbě růszných typů solidních nádorů (Baselga, J. (2000) J. Clin. Oncol. 18: 54S-59S; Baselga, J. (2000) Ann. Oncol. 11 Suppl 3: 187-190, 2000).

Proto existuje potřeba lepší terapeutické protilátky proti EGFR, která by byla účinná v léčbě a/nebo prevenci onemocnění souvisejících s nadměrnou expresí EGFR při podání v nízkých dávkách a která by nevyvolávala imunitní reakci u pacienta. Jak bylo popsáno výše, monoklonální protilátky (MAb) mají významnou úlohu v mnoha diagnostických a terapeutických způsobech a staly se ještě atraktivnějšími činidly poté, co nedávné pokroky umožnily přípravu plně lidských protilátek. Protilátky a deriváty protilátek tvoří 25% v současnosti vyvíjených biologických léčiv a mnoho z nich je určeno pro protinádorovou léčbu. Protilátky kombinují specificitu pro cíl s kapacitou účinně aktivovat imunitní systém. Kombinace těchto vlastností společně s jejich dlouhým biologickým poločasem upozorňují výzkumníky na terapeutický potenciál protilátek. Toto nedávno kulminovalo ve schválení několika protilátek v protinádorové léčbě v U.S. Food and Drug Administration (FDA).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje vylepšená protilátková terapeutická činidla pro léčbu a prevenci onemocnění souvisejících s, expresí EGFR, konkrétně nádorů exprimujících • · φ φφφ » φφφ φ · φ · ·φ · · ···· φφφ φφφ φφ φ φφ φ φ · φ φ

EGFR a autoimunitních onemocnění. Protilátky jsou vylepšené tak, že jsou plně lidské (zde dále označováno jakoHUMAb™) a proto jsou u pacientů méně imunogenní. Protilátky jsou také terapeuticky efektivní (např. v prevenci růstu a/nebo funkce buněk exprimuj ících EGFR) v nižších dávkách než jiné anti-EGFR protilátky. Dále, v některých provedení mají protilátky další výhodu v tom, že neaktivují komplement (například neindukují komplementem zprostředkovanou lýzu cílových buněk, což snižuje nežádoucí účinky související s léčbou.

V j ednom provedení předkládaný vynález poskytuje izolované lidské monoklonálni protilátky, které se specificky váží na lidský receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR), stejně jako prostředky obsahující jednu nebo více kombinací takových protilátek. Lidské protilátky inhibují (např. blokují) vazbu EGFR ligandů, jako je EGF a TGF-α, na EGFR. Například, vazba EGFR ligandů na EGFR může být inhibována o alespoň přibližně 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, nebo 100% a výhodně je výsledkem prevence EGFR buněčné signalizace.

Výhodné lidské protilátky podle předkládaného vynálezu inhibují růst a/nebo zprostředkují usmrcování (například lýzou nebo fagocytosou) buněk exprimujících EGFR (in vitro nebo in vivo) za přítomnosti lidských efektorových buněk (např., polymorfonukleárních buněk, monocytů, makrofágů a dendritických buněk), ale neaktivují komplementem zprostředkovanou lýzu buněk, které exprimuj i EGFR. Proto mohou být lidské monoklonálni protilátky podle předkládaného vynálezu použity jako diagnostická nebo terapeutická činidla in vivo a in vitro.

V jednom provedení jsou lidské protilátky podle předkládaného vynálezu IgGl (např. IgGlk) protilátky tvořené • · s »······ · ·

IgGl těžkým řetězcem a kappa lehkým řetězcem. Nicméně, protilátky jiných izotypů také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, včetně IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, a IgE. Protilátkami mohou být celé protilátky nebo antigen-vazebné fragmenty protilátky, včetně Fab, F(ab')2, Fv a řetězce Fv fragmentů.

V konkrétním provedení je lidská protilátka kódována nukleovými kyselinami kódujícími lidský IgG těžký řetězec a lidský kappa lehký řetězec, kde uvedené nukleové kyseliny obsahují ve variabilních regionech nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:3, v příslušném pořadí, a jejich konzervativní modifikace. V jiném provedení lidské protilátky obsahují variabilní regiony IgG těžkého řetězce a kappa lehkého řetězce, které jsou tvořeny aminokyselinovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4, v příslušném pořadí, a sekvencemi s konzervativní modifikací těchto sekvencí.

V jiném konkrétním provedení lidské protilátky odpovídají protilátce 2F8 nebo protilátce, která se váže na stejný epitop jako (např. kompetuje s) nebo má stejné funkční vazebné charakteristiky jako protilátka 2F8.

Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány rekombinantně v hostitelských buňkách, jako je transfektom (např. transfektom skládající se imortalizovaných CHO buněk nebo lymfocytárních buněk) obsahující nukleové kyseliny kódující těžký a lehký řetězec protilátky, nebo mohou být získány přímo z hybridomu, který exprimuje protilátky (například který je tvořen B-lymfocyty získanými z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, majícími genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a • 9 transgen pro lidský lehký řetězec, které kódují protilátky, fúzovanými na imortalizované buňky). V konkrétním provedení jsou protilátky produkovány hybridomem označeným jako 2F8 nebo transfektovanou hostitelskou buňkou (např. CHO buňkou) obsahující nukleovou kyselinu pro lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec, která obsahuje ve svých variabilních regionech nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3, v příslušném pořadí, a jejich konzervativní modifikace.

V jiném provedení mohou být lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu charakterizovány jednou nebo více z následujících vlastností:

a) specificitou pro EGFR;

b) vazebnou afinitou k EGFR s rovnovážnou asociační konstantou (KA) alespoň přibližně 10⁷ M^_1, výhodně přibližně, ΙΟ⁸ Μ^-1, 10⁹ M^_1, a výhodněji přibližně ΙΟ¹⁰ M“¹ až 10¹¹ M’¹ nebo vyšší;

c) disociační konstantou (K_D) z EGFR přibližně 10~³s^_1, výhodně přibližně 10^_4s^_1, výhodněji 10^_5s^_1, a nejvýhodněji 10”⁶s^_1;

d) schopností opsonizovat buňky exprimující EGFR; nebo

e) schopností inhibovat růst a/nebo zprostředkovat fagocytosu a zabíjení buněk exprimujících EGFR (např. nádorových buněk) za přítomnosti lidských efektorových buněk v koncentraci přibližně 10 μς/ιηΐ nebo menší (např. in vitro) .

Příklady nádorových buněk exprimujících EGFR, které mohou být zacíleny (např. opsonizovány) lidskými protilátkami podle předkládaného vynálezu jsou například buňky nádorů močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, spinocelulárních karcinomů, nádorů plic (nemalobuněčných) a nádorů hlavy a krku. Mezi další buňky exprimující EGFR patří synoviální fibroblasty a keratinocyty, které mohou být použity jako cílové buňky například při léčbě artritidy a psoriasy, v příslušném pořadí.

«· 4 • 4 4

4 4 · 4 4 4

4 4 44444

4 4 4 «4 4

V jiném provedení se lidské protilátky podle předkládaného vynálezu váží na EGFR antigen s afinitní konstantou alespoň přibližně 10⁸ M’¹, výhodněji alespoň přibližně 10⁹ M'¹ nebo 1O¹⁰ M'¹, a jsou schopné inhibovat růst a/nebo zprostředkovat fagocytosu a zabíjení buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk, např. polymorfonukleárních buněk (PMN) , monocytů a makrofágů, s IC50 přibližně 1 x 10⁷ M nebo menší, nebo v koncentraci přibližně 10 μρ/ιηΐ nebo menší (in vitro).

V ještě jiném provedení lidské protilátky podle předkládaného vynálezu inhibují EGFR-zprostředkovanou buněčnou signalizaci. Například mohou protilátky inhibovat EGFR ligandem (např., EGF nebo TGF-α) indukovanou autofosforylaci EGFR. Protilátky mohou také inhibovat autokrinní EGF nebo TGF-α indukovanou aktivaci buněk nebo mohou indukovat lýzu (ADCC) EGFR exprimujících buněk za přítomnosti lidských polymorfonukleárních buněk. Mezi buňky exprimující EGFR patří například buňky močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, ledvin, spinocelulární buňky, nemalobuněčné plicní buňky, synoviální fibroblasty a keratinocyty.

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje molekuly nukleové kyseliny kódující protilátky, nebo jejich antigen-vazebné části, podle předkládaného vynálezu. Rekombinantní expresní vektory, které obsahují nukleové kyseliny kódující protilátky podle předkládaného vynálezu, a hostitelské buňky transfektované takovými vektory, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu, stejně jako způsoby přípravy protilátek podle předkládaného vynálezu kultivováním takových hostitelských buněk, např. expresní vektory obsahující ·· «· φφφ φφφ φ φφ φφφ φφφ φ φφφφ φ φφφ » φφφ φ φφ φφφ φφφφφφφ φφφφφ *#φφφ *» · ·· · nukleotidovou sekvenci kódující variabilní a konstantní regiony těžkých a lehkých řetězců protilátky 2F8 produkované hybridomem.

V dalším aspektu předkládaný vynález také poskytuje izolované B-lymfocyty z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, které exprimují lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu. Výhodně jsou izolované B-lymfocyty získány z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, která byla imunizována přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR. Výhodně má transgenní non-lidské zvíře, např. transgenní myš, genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu. Izolované B-lymfocyty jsou potom imortalizovány a tvoří zdroj (např. hybridom) lidské anti-EGFR protilátky.

V souladu s tím předkládaný vynález také poskytuje hybridom schopný produkovat lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu, které se specificky váží na EGFR. V jednom provedení je hybridomem B lymfocyt získaný z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu, fúzovaný s imortalizovanou buňkou. Konkrétní hybridomy podle předkládaného vynálezu jsou 2F8.

V dalším aspektu vynález poskytuje transgenní non-lidské zvíře, jako je transgenní myš (zde též označovaná jako HuMAb), která exprimuje lidské monoklonální protilátky, které se specificky váží na EGFR. V konkrétním provedení je

000

0

0 • ·

0 0 0 0

0 0 ·

0 0000 0 0 0 ·

transgenním non-lidským zvířetem transgenní myš mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu. Transgenní non-lidské zvíře může být imunizováno přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR. Výhodně je transgenní non-lidské zvíře, např. transgenní myš, schopná produkovat více izotypů lidské monoklonální protilátky k EGFR (např., IgG, IgA a/nebo IgM) pomocí V-D-J rekombinace a přesmyku izotypů. Přesmyk izotypů může být klasický nebo neklasický přesmyk izotypů.

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsoby pro produkci lidských monoklonálních protilátek, které specificky reagují s EGFR. V jednom provedení způsob zahrnuje imunizaci a transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu, přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR. B-lymfocyty (např. splenické B-lymfocyty) zvířete se potom odeberou a fúzují se s myelomovými buňkami za zisku imortalizovaných, hybridních buněk, které secernují lidské monoklonální protilátky proti EGFR.

V dalším aspektu jsou lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu derivatizovány, navázány nebo současně exprimovány s jinou funkční molekulou, např. jiným peptidem nebo proteinem (např. Fab' fragmentem). Například mohou být protilátky nebo jejich vazebné části pro antigen podle předkládaného vynálezu funkčně navázány (např. chemickou vazbou, genetickou fúzí, nekovalentní vazbou nebo jinak) na jednu nebo více jiných molekul, jako je jiná protilátka (např.

·· • · 9

9 9 99 · · · • · · · • · · ·

9 99 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9999 · · · ·«···

9 9 9 9 ·

9» 9 99 9 za vzniku bispecifické nebo a multispecifické protilátky), cytoxin, buněčný ligand nebo antigen. Předkládaný vynález tedy zahrnuje velké množství protilátkových konjugátů, bi- a multispecifických molekul, fúzních proteinů, které se všechny váží na buňky exprimující EGFR a které jsou zacílené jinými molekulami na buňky, nebo které se váží na EGFR a na jiné molekuly nebo buňky.

V konkrétním provedení vynález zahrnuje bispecifické nebo multispecifické molekuly obsahující alespoň jednu první vazebnou specificitu pro EGFR (např. lidskou anti-EGFR protilátku nebo její fragment nebo mimetikum), a druhou vazebnou specificitu pro Fc receptor, např. lidský FcyRI nebo lidský Fca receptor, nebo jiný antigen na buňkách prezentujících antigen (APE). Obvykle bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu protilátku, nebo její fragment (např. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, nebo jednořetězcový Fv), výhodně lidskou protilátku nebo její část, nebo chimérickou nebo humanizovanou protilátku nebo její část (např. mají variabilní region, nebo alespoň komplementaritu určující region (CDR), odvozený od non-lidské protilátky (např. myší) se zbývajícími částmi z lidské protilátky.

V souladu s tím předkládaný vynález zahrnuje bispecifické a multispecifické molekuly, které se váží na lidský EGFR i na Fc receptor, např. lidský IgG receptor, např. Fc-gamma receptor (FcyR), jako je FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), a FcyRIII (CD16). Mohou být zaměřeny i další Fc receptory, jako jsou lidské IgA receptory (např. FcaRI). Fc receptor je výhodně lokalizován na povrchu efektorových buněk, např. monocytů, makrofág nebo aktivovaných polymorfonukleárních buněk. Ve výhodném provedení se bispecifické a multispecifické molekuly • · ·· ·· « · · « 9 999

9 9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9 9

9 9 9 9

Π

váží na Fc receptor v místě, které je odlišné od imunoglobulinového Fc (např., IgG nebo IgA) vazebného místa receptoru. Tak není vazba bispecifických a multispecifických molekul blokována fyziologickými koncentracemi imunoglobulinu.

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje konjugát obsahující lidskou anti-EGFR protilátku podle předkládaného vynálezu navázanou na terapeutickou skupinu, např. cytotoxický lék, enzymaticky aktivní toxin, nebo jeho fragment, radioizotop, nebo malou protinádorovou molekulu.

Alternativně mohou být lidské protilátky podle předkládaného vynálezu podány současně s takovými terapeutickými a cytotoxickými činidly, ale ne navázané na tato činidla. Mohou být podány současně s takovými činidly (například v jednom prostředku nebo samostatně) nebo mohou být podány před nebo po takových činidlech. Mezi taková činidla patří chemoterapeutika, jako je doxorubicin (adriamycin), cisplatina, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil, cyklofosfamid, hydroxyurea. Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také aplikovány současně s radioterapií.

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje prostředky, např. farmaceutické a diagnostické prostředky/kity, obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a alespoň jednu lidskou monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu, nebo její vazebnou část pro antigen, která se specificky váže na EGFR. V jednom provedení prostředek obsahuje kombinaci lidských protilátek nebo jejich vazebných částí pro antigen, které se výhodně každá váže na jiný epitop. Například, farmaceutický prostředek obsahující lidskou monoklonální protilátku, která zprostředkuje vysoce účinné zabíjení φφ φ • Φ φφ • φ φ φ φφφφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ φ φφ φ φ φ · φ φφφ φ ΦΦΦΦΦ φφφ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφφφ φφφ cílových buněk za přítomnosti efektorových buněk může být kombinován s jinou lidskou monoklonální protilátkou, která inhibuje růst buněk exprimujících EGFR. Tak kombinace poskytuje různé typy terapie, které jsou specificky upraveny tak, aby bylo dosaženo maximálního terapeutického přínosu. Prostředky, např. farmaceutické prostředky, obsahující kombinaci alespoň jedné lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu, nebo její vazebné části pro antigen, a alespoň jedné bispecifické nebo multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro inhibování proliferace a/nebo růstu buněk exprimujících EGFR, a/nebo indukování zabíjení buněk exprimujících EGFR, za použití lidské protilátky podle předkládaného vynálezu a s ní souvisejících prostředků, jak byly popsány výše. V jednom provedení způsob zahrnuje kontaktování buněk exprimujících EGFR in vitro nebo in vivo s jednou nebo s kombinací lidských monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu za přítomnosti lidských efektorových buněk. Způsob může být použit v kultuře, např. in vitro nebo ex vivo (např. v kulturách buněk exprimujících EGFR a efektorových buněk). Například, vzorek obsahující buňky exprimující EGFR a efektorové buňky může být kultivován in vitro a může být smísen s protilátkou podle předkládaného vynálezu, nebo její vazebnou částí pro antigen (nebo s bispecifickou nebo multispecifickou molekulou podle předkládaného vynálezu). Alternativně může být způsob proveden u jedince,' například jako součást in vivo (např. terapeutického nebo profylaktického) protokolu.

Pro použití v léčbě in vivo a v prevenci onemocnění

99

9 9

9 999

9 9 9

9 9 9

9 9

9

9 9

9 9 9

9 9919

9 9

9

9

9 9 9 9

9999 9 9

9 souvisejících s expresí EGFR (např. s nadměrnou expresí) jsou lidské protilátky podle předkládaného vynálezu podány pacientům (např., lidským jedincům) terapeuticky účinných dávkách (např. v dávkách, které vedou k inhibici růstu, k fagocytose a/nebo k usmrcení nádorových buněk exprimujících EGFR), za použití jakéhokoliv vhodného způsobu podání, jako je injekční podání nebo jakékoliv jiné způsoby podání známé v oboru pro podávání protilátek.

Typickými onemocněními souvisejícími s EGFR, která mohou být léčeně terapeuticky a/nebo preventivně za použití lidské protilátky podle předkládaného vynálezu jsou, například, autoimunitní onemocnění a nádorová onemocnění. Mezi nádory, které mohou být terapeuticky a/nebo preventivně léčeny, patří karcinom močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, spinocelulární karcinomy, karcinomy plic (nemalobuněčné) a karcinomy hlavy a krku. Mezi autoimunitní onemocnění, která mohou být léčena, patří například psoriasa a zánětlivá artritida, např. revmatoidní artritida, artritida asociovaná se systémovým lupus erythematodes a psoriatická artritida.

V jednom provedení je pacient dále léčen chemoterapeutickým léčivem, radiací nebo činidlem, které moduluje, například inhibuje nebo zesiluje, expresi nebo aktivitu Fc receptoru, např. Fca receptoru nebo Fcy receptoru, jako je cytokin. Typickými cytokiny pro podání během léčby jsou granulocytární kolonie-stimulační faktor (G-CSF), granulocytární-makrofágové kolonie-stimulační faktor (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ), tumor nekrosis faktor (TNF). Mezi typická terapeutická činidla patří, například, anti-neoplastická činidla, jako je doxorubicin (adriamycin), cisplatina, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil a cyklofosfamid, ·« · • 9 9 *· ·« • · · • · ··· * · • · ·

9 9 9

9 999

9 9

9

9 9 9 9

999 9 9999 9 9

9 9 9 9 hydroxyurea.

Pro zvýšení terapeutické účinnosti lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu proti nádorovým buňkám, které neexprimují vysoké koncentrace EGFR mohou být protilátky podány současně s činidlem, které zvyšuje expresi EGFR, jako je lymfokinový přípravek, který zvyšuje a způsobuje více homogenní expresi RGFR na nádorových buňkách. Mezi lymfokinové přípravky vhodné pro podání patří interferongamma, tumor nekrosis faktor a jejich kombinace. Tyto přípravky mohou být podány intravenosně. Vhodné dávky lymfokinu jsou obvykle v rozmezí od 10000 do 1000000 jednotek/pacienta.

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro detekování in vitro nebo in vivo přítomnosti EGFR antigenu ve vzorku, např. pro diagnosu onemocnění souvisejícího s EGFR. V jednom provedení je tohoto dosaženo kontaktováním testovaného vzorku, volitelně spolu s kontrolním vzorkem, s lidskou monoklonální protilátkou podle předkládaného vynálezu (nebo její vazebnou část pro antigen) za podmínek umožňujících tvorbu komplexu mezi protilátkou a EGFR. Potom je detekována tvorba komplexu (např. za použití ELISA). Při použití kontrolního vzorku s testovaným vzorkem je komplex detekován v obou vzorcích a jakýkoliv statisticky významný rozdíl ve tvorbě komplexů mezi vzorky ukazuje na přítomnost EGFR antigenu v testovaném vzorku.

Další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou jasné z následujícího podrobného popisu a připojených patentových nároků.

• ·

• φφ 4 4 · 4 4444 4 4

4444 44 4 · • 4 · · ·· ·

4

4 4

4··· • 4

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je graf ukazující kompetitivní ELISA se supernatanty hybridomů od myší 20241 versus myší monoklonální anti-EGFR MAb 225, 528 a AB5.

Obr. 2 je graf ukazující kompetitivní ELISA se supernatanty lidské protilátky od myší 20242 a 20243 versus myší monoklonální anti-EGFR MAb 225, 528 a AB5.

Obr. 3 je graf ukazující kompetitivní ELISA s přečištěnou lidskou protilátkou versus myší monoklonální anti-EGFR MAb 225 a 528.

Obr. 4A, 4B, 4C a 4D jsou grafy ukazující kompetitivní ELISA s HuMAb (A) 6B3, (B) SF12, (C) 2F8, a (D) 2A2.

Obr. 5A a 5B jsou grafy ukazující inhibici vazby EGF-biotinu na EGFR způsobenou anti-EGFR HuMAb a myší MAb (ELISA formát).

Obr. 6 je graf ukazující inhibici vazby EGF-biotinu na EGFR na A431 buňkách způsobenou anti-EGFR HuMAb a myší MAb.

Obr. 7 je graf ukazující titraci anti-EGFR HuMAb na A431 buňkách.

Obr. 8 je graf ukazující schopnost 2F8 inhibovat vazbu EGF na přečištěný a nativní EGFR. Efekt 2F8 (kosočtverce), myší 225 (čtverečky), EGF (trojúhelníčky) nebo lidské IgGl kappa izotypové kontroly (plná kolečka) se měří podle vazby EGFbiotinu na imobilizovaný EGFR. Jak je uvedeno na obr. 8, je 2F8 schopna inhibovat vazbu EGF-biotinu s IC50 17 nM, signifikantně nižší než pro 225 (IC₅₀ 30 nM) .

···· • · • ♦ · • · · * • ····♦ • · · ♦ · ·

Obr. 9 je sloupcový graf ukazující schopnost 2F8 inhibovat vazbu EGF a TGF-α na A431 buňky. A431 buňky jsou odvozeny od ovariálního epidermoidního karcinomu a exprimují nadměrně lxlO⁶ EGFR molekul na svém povrchu. Inhibice vazby 2F8 na A431 buňky se stanovila pomocí průtokové cytometrie. Buňky se preinkubovaly s buď 5 (prázdné sloupce) nebo 50 pg/ml (plné sloupce) ligandu před tím, než se přidala 2F8. Vazba protilátky bez ligand (PBS skupina) se brala jako 100%. Jak je patrné, je vazba EGF a TGF-α na A431 buňky účinně blokována 2F8. Tyto výsledky ukazují, že 2F8 se váže na EGFR těsně vedle nebo ve stejném místě jako ligandy.

Obr. 10A a 10B ukazují efekt monoklonální anti-EGFR na autofosforylaci A431 buněk. Sérově-deprivované subkonfluentní A431 buňky se ošetřily různými protilátkami, jak je popsáno v metodách (10 pg/ml), stimulovaly se buď EGF (A) nebo TGF-a (B), a extrahovaly se. Fosforylace EGFR se analyzovala SDSPAGE a imunohybridizací ta použití antifosfotyrosinové protilátky.

Obr. 11A, 11B a 11C jsou grafy ukazující inhibici růstu EGFR-exprimujících nádorových buněčných linií anti-EGFR lidskými protilátkami. EGFR-exprimující nádorové buněčné linie A431 (A), HN5 (B) a MDA-MB-468 (C) se inkubovaly s různými koncentracemi HuMAb 2F8 (čtverečky), 5C5 (trojúhelníčky), 6E9 (křížky), 2A2 (kosočtverečky), negativními kontrolními protilátkami anti-CTLA4 (prázdná kolečka), protilátkovou pozitivní kontrolou 225 (plná kolečka) nebo pouze s mediem (kontrola) po dobu sedmi (7) dnů. Potom se hodnotil růst buněk za použití barvení fixovaných buněk krystalovou violetí. Procentuální inhibice růstu se vypočetla jako množství proteinu zbývajícího po sedmi (7) denní inkubaci ve srovnání φφ · φφφ φ φφφφ φ • φ φφφφ φ · φφφ φ φφφ

Φ · φ * φ φ φφφφ φ φφ · s množstvím proteinu přítomného ve skupině s kontrolním mediem pouze. Data představují tři měření a jsou ze tří pokus. Provedených v různé dny.

Obr. 12 je graf ukazující lidskou PMN zprostředkovanou na protilátkách závislou buněčnou cytotoxicitu. PMN se izolovaly popsaným způsobem. A431 buňky značené ⁵¹Cr se umístily do 96jamkových ploten s plochým dnem. PMN se přidaly v poměru efektorové:cílové buňky 100:1 a protilátky se přidaly v různých koncentracích. Po inkubaci přes noc se měřilo uvolňování ⁵¹Cr.

Obr. 13 je graf ukazující prevenci tvorby nádorů dosaženou HuMAb 2F8 v modelu athymických myší. Skupinám šesti (6) myší se podkožní injekcí na boku podalo 3 x 10⁶ nádorových buněk v 200 μΐ PBS v den 0. Potom se myším aplikovala i.p. injekcí ve dny 1 (75 μg/200 μΐ) , 3 (25 μg/200 μΐ), a 5 (25 μg/200 μί) (šipky) HuMAb 2F8 (plné čtverečky) i.p. lidská IgGl-κ Mab, jako kontrola (prázdná kolečka. Data jsou prezentována jako průměrný objem nádorů + SEM, a jsou reprezentativní pro 3 jednotlivé pokusy, které vedly k podobným výsledkům.

Obr. 14 je graf ukazující eradikaci vzrostlých A431 nádorových xenotransplantátů HuMAb 2F8 ve srovnání s myší anti-EGFR MAb (m225). Myším se podkožní injekcí naboku aplikovalo 3xl0⁶ nádorových buněk ve 200 μΐ PBS v den nula (0). V den 10 se myši náhodně rozdělily do léčebných skupin a aplikovalo se jim v dny 12 (75 μρ/200 μΐ) , 14 (25 μς/200 μΐ) , a 16 (25 μg/200 μΐ) (šipky) HuMAb 2F8 (plné čtverečky, 2F8 zkráceně) nebo myší anti-EGFR MAb 225 (plné trojúhelníčky, m225 zkráceně). Dále se skupinám aplikovalo 75 μg/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 v den 12, a potom 25 pg/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 ve dny 14, 16, 19, 22, φφ » φ φ φ» φ φ φ φ φ φφφ φ

φ φφ φφ φ ♦ φ • φφφφ • · · φ • φ · · • φ · φφφφ φφφφφ φ φ φφφ « φφφφ Φ 9

ΦΦ ΦΦ

26, 29, 33, 36, a 40 (prázdné čtverečky, 2F8 dlouhodobě; prázdné trojúhelníčky, m225 dlouhodobě). Data jsou prezentována jako průměrný objem nádorů + SEM, a jsou reprezentativní pro 3 jednotlivé pokusy, které vedly k podobným výsledkům. Černé šipky ukazují termíny aplikace pro zkrácenou léčbu, prázdné šipky ukazují termíny aplikace pro dlouhodobou léčbu.

Obr. 15A a 15B ukazují sekvence VH- a VL-regionů 2F8 s označenými CDR regiony.

Podrobný popis předkládaného vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nové na protilátkách založené terapie pro léčbu a diagnostiku onemocnění charakterizovaných expresí, zejména nadměrnou expresí receptoru pro epidermální růstový faktor (který je zde dále označován jako EGFR). Terapie podle předkládaného vynálezu využívají izolované lidské IgG monoklonálni protilátky, nebo jejich vazebné části pro antigen, které se váží na epitop přítomný na EGFR. Další izolované lidské monoklonálni protilátky zahrnuté v v předkládaném vynálezu jsou IgA, IgGl4, IgE, IgM, a IgD protilátky. V jednom provedení jsou lidské protilátky produkovány non-lidským transgenním zvířetem, např. transgenní myší, které je schopno produkovat více izotypů lidské monoklonálni protilátky k EGFR (např., IgG, IgA a/nebo IgE) pomocí V-D-J rekombinace a přesmyku izotypů. V souladu s tím další předkládaného vynálezu zahrnují nejen protilátky, protilátkové fragmenty a jejich farmaceutické prostředky, ale též non-lidská transgenní zvířata, B-lymfocyty, transfektované hostitelské buňky a hybridomy, které produkují monoklonálni protilátky. Vynález také zahrnuje způsoby použití protilátek podle předkládaného vynálezu pro detekci buněk exprimujících ·» ·· ·· · • · 4 · · · • · »·· · · · β · 4 · 4 4 4 4444 4

4 4 4 4 4 4

44 44 4

4 » 4 4 • 4 4 4 • · ··· • 4 4

4

EGFR nebo příbuzný, zkříženě reaktivní receptor pro růstový faktor, nebo pro inhibici růstu, diferenciace a/nebo motility buněk exprimujících EGFR, in vitro nebo in vivo.

Pro lepší pochopení předkládaného vynálezu jsou definovány některé termíny. Další definice jsou uvedeny v průběhu celého podrobného popisu.

Termíny receptor pro epidermální růstový faktor EGFR a EGFR antigen jsou zaměnitelné a označují varianty, isoformy a druhové homology lidského EGFR. Ve výhodném provedení inhibuje vazba protilátky podle předkládaného vynálezu na EGFR-antigen růst buněk exprimujících EGFR (např., a nádorových buněk) prostřednictvím inhibice nebo blokování vazby EGFR ligandu na EGFR. Termín EGFR ligand označuje všechny (např. fysiologické) ligandy pro EGFR, včetně EGF, TGF-α, heparin vážící EGF (HB-EGF), amfiregulin (AR) a epiregulin (EPI). V jiném výhodném provedení vazba protilátky podle předkládaného vynálezu na EGFR antigen indukuje fagocytosu efektorových buněk a/nebo usmrcení buněk exprimujících EGFR.

Termín inhibuje růst (např. v souvislosti s buňkami) označuje jakékoliv měřitelné snížení růstu buněk při jejich kontaktu s anti-EGFR protilátkou ve srovnání s růstem stejných buněk nekontaktovaných s anti-EGFR protilátkou, např. inhibici růstu buněk o alespoň přibližně 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,

60%,70%, 80%, 90%, 99% nebo 100%.

Termíny inhibuje vazbu a blokuje vazbu (např. v souvislosti s inhibici/blokováním vazby EGFR ligandu na EGFR) jsou zaměnitelné a označují částečnou nebo úplnou inhibici/blokování. Inhibice/blokování EGFR ligandu na EGFR • · ·

Ofi ········ ζ,υ · · · · · · · výhodně redukuje nebo alteruje normální úroveň nebo typ buněčné signalizace, která se vyskytuje tehdy, když se EGFR ligand naváže na EGFR bez inhibice nebo blokování. Inhibice a blokování také zahrnuje jakékoliv měřitelné snížení vazebné afinity EGFR ligandu k EGFR při kontaktu s anti-EGFR protilátkou ve srovnání s ligandem nekontaktovaným s anti-EGFR protilátkou, např. blokování vazby EGFR ligandů na EGFR o alespoň přibližně 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% nebo 100%.

Termín protilátky označuje celé protilátky a jakékoliv jejich vazebné fragmenty pro antigen (tj. antigen-vazebné části) nebo jejich jednotlivé řetězce. Protilátka je glykoprotein obsahující alespoň dva těžké (H)řetězce a dva lehké (L) řetězce spojené disulfidovými vazbami, nebo jeich vazebné části pro antigen. Každý těžký řetězec se skládá z variabilního regionu těžkého řetězce (VH) a konstantního regionu těžkého řetězce. Konstantní region těžkého řetězce se skládá ze tří domén, CH1, CH2 a CH3. Každý lehký řetězec se skládá z variabilního regionu lehkého řetězce (VL) a konstantního regionu lehkého řetězce. Konstantní region lehkého řetězce se skládá z jedné domény, CL. VH a VL regiony mohou být dále děleny na regiony hypervariability, označované jako regiony určující komplementaritu (CDR), které jsou odděleny více konzervovanými regiony, které se označují jako pracovní regiony (FR). Každý VH a VL se skládá ze tří CDR a čtyř FR, které jsou uspořádány od amino-konce ke karboxy-konci v následujícím pořadí: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahují vazebnou doménu, která interaguje s antigenem. Konstantní regiony protilátky mohou zprostředkovat vazbu imunoglobulinu na tkáně nebo faktory, včetně různých buněk imunitního systému (např. efektorových buněk) a prvních složek (Clq) klasické dráhy • · • · · ··· ··· • ···· · ··· · ··· • · · · · · · ···· · · · ··· • · · · ·· · ·· · • · · · ·· · ·· ^e komplementu.

Termín vazebná část pro antigen protilátky (nebo jednoduše část protilátky), jak je zde použit, označuje jeden nebo více fragmentů protilátky, které si zachovávají schopnost specifické vazby na antigen (např. EGFR). Bylo prokázáno, že funkce vazby protilátky na antigen může být provedena fragmenty kompletní protilátky. Příklady vazebných fragmentů zahrnutých v termínu vazebná část pro antigen protilátky jsou (i) Fab fragment, monovalentní fragment skládající se z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) F(ab')₂ fragment, bivalentní fragment skládající se ze dvou Fab fragmentů navázaných na sebe disulfidovým můstkem v pantovém regionu; (iii) Fd fragment skládající se z VH a CH1 domény; (iv) Fv fragment skládající se z VL a VH domény jednoho ramena protilátky, (v) dAb fragment (Ward et al·., (1989) Nátuře 341:544-546), který se skládá z VH domény; a (vi) izolovaný komplementaritu určující region (CDR). Dále, ačkoliv jsou dvě domény Fv fragmentu, VL a VH, kódované samostatnými geny, mohou být navázány, za použití rekombinantních metod, přes syntetickou spojovací skupinu, což umožňuje jejich výrobu ve formě jediného proteinového řetězce, ve kterém se párují VL a VH regiony za vzniku monovalentních molekul (které jsou též známé jako jednořetězcové Fv (scFv); viz např., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; a Huston et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takové jednořetězcové protilátky také spadají pod termín vazebná část pro antigen protilátky. Tyto protilátkové fragmenty jsou získány za použití běžných technik známých odborníkům v oboru, a tyto fragmenty jsou testovány na použitelnost stejně jako intaktní protilátky.

Termín epitop označuje proteinovou determinantu schopnou specifické vazby na protilátku. Epitopy se obvykle skládají • · • · • ·· ··· ··· • ···· · ··· · ··· • ·· · · · ······· · ··· *··* *··* *·· · ·· · z chemicky aktivních povrchových skupin molekul, jako jsou aminokyselinové nebo sacharidové postraní řetězce a obvykle mají specifické trojrozměrné strukturální charakteristiky, stejně jako specifický náboj. Konformační a nekonformační epitopy se liší v tom, že vazba na nekonformační epitopy je ztracena za přítomnosti denaturačních rozpouštědel.

Termín bispecifická molekula označuje jakékoliv činidlo, např. protein, peptid, nebo proteinový nebo peptidý komplex, které má dvě různé vazebné specificity. Například se molekula může vázat na nebo interagovat s (a) a buněčným povrchovým antigen; a (b) Fc receptorem na povrchu efektorových buněk.

Termín 'multispecifická molekula nebo heterospecifická molekula označuje jakékoliv činidlo, např. protein, peptid, nebo proteinový nebo peptidový komplex, které má více než dvě vazebné specificity. Například se molekula může vázat na nebo interagovat s (a) a buněčným povrchovým antigen; a (b) Fc receptorem na povrchu efektorových buněk; a (c) alespoň na jednu další složku. V souladu s tím vynález zahrnuje bispecifické, trispecifické, tetraspecifické a jiné multispecifické molekuly, které jsou zaměřeny na povrchové buněčné antigeny, jako je EGFR, a na jiné cíle, jako je Fc receptor na efektorových buňkách.

Termín bispecifické protilátky též zahrnuje diprotilátky. Diprotilátky jsou bivalentní, bispecifické protilátky, ve kterých jsou VH a VL domény exprimovány na jednom polypeptidovém řetězci, ale za použití.spoj ovací sekvence, která je příliš krátká pro to, aby umožnila párování mezi dvěma doménami na stejném řetězci, což posiluje párování domény s komplementární doménou v jiném řetězci a vznikají tak dvě vazebná místa pro antigen (viz např., Holliger, P., et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, • ···· ·

R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Termín heteroprotilátky označuje dvě nebo více protilátek, vazebných fragmentů protilátek (např., Fab), jejich derivátů, nebo vazebných regionů pro antigen, navázaných na sebe, kde alespoň dvě z nich mají různé specificity. Tyto různé specificity zahrnují vazebnou specificitu pro Fc receptor na efektorových buňkách a vazebnou specificitu pro antigen nebo epitop na cílových buňkách, např. nádorových buňkách.

Termín lidské protilátky, jak je zde použit, označuje protilátky mající variabilní a konstantní regiony odvozené z lidské zárodečné imunoglobulinové sekvence. Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat aminokyselinové zbytky nekódované lidskou zárodečnou imunoglobulinovou sekvencí (např. mutace vložené náhodnou nebo místně cílenou mutagenesí in vitro nebo somatickou mutací in vivo). Nicméně, termín lidské protilátky, jak je zde použit, nezahrnuje protilátky, ve kterých jsou CDR sekvence odvozené ze zárodečné linie jiných savčích druhů, jako jsou myši, a které byly přeneseny na lidské sekvence pracovního regionu.

Termíny monoklonální protilátky nebo přípravek monoklonální protilátky jak jsou zde použity, označují protilátkové molekuly stejného molekulového složení. Přípravek monoklonální protilátky vykazuje jedinou vazebnou specificitu a afinitu pro konkrétní epitop. Proto termín lidské monoklonální protilátky označuje protilátky mající jedinou vazebnou specificitu, které mají variabilní a konstantní regiony odvozené z lidské zárodečné imunoglobulinové sekvence. V jednom provedení jsou lidské monoklonální protilátky produkovány hybridomem, který je tvořen B lymfocytem získaným • 4 • 44 · 4 · ··· • >··· 4 444 4 444 • 44 444 4444444 44444

0/1 4444 44 4 · · ·

Z 4 44 44 44 4 44 4 z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lehký řetězec, fúzovaným na imortalizovanou buňku.

Termín rekombinantní lidské protilátky, jak je zde použit, označuje všechny lidské protilátky, které jsou připraveny, exprimovány, vytvořeny nebo izolovány rekombinantně, jako jsou (a) protilátky izolované ze zvířete (např. myši), která je transgenní pro lidské imunoglobulinové geny, nebo z hybridomu připraveného z takového zvířete (jak je podrobněji popsáno v oddíle I, dále); (b) protilátky izolované z hostitelské buňky transformované k expresi protilátky, např. z transfektomu; (c) protilátky izolované z rekombinantní, kombinatoriální lidské protilátkové knihovny; a (d) protilátky připravené, exprimované, vytvořené nebo izolované jakýmkoliv jiným způsobem, který zahrnuje sestřižení sekvence genu lidského imunoglobulinu a jiné DNA sekvence. Takové rekombinantní lidské protilátky mají variabilní a konstantní regiony odvozené od lidské zárodečné imunoglobulinové sekvence. V některých provedeních mohou být takové rekombinantní lidské protilátky zpracovány in vitro mutagenesí (nebo - pokud je použito zvíře transgenní lidskou Ig sekvenci - in vivo somatickou mutagenesí) a tak jsou aminokyselinové sekvence VH a VL regionů rekombinantní protilátky sekvencemi, které, ačkoliv jsou odvozené od lidské zárodečné VH a VL sekvence, za přirozeného stavu neexistují v lidském protilátkové zárodečném repertoáru in vivo.

Termín heterologní protilátky je definován v souvislosti s transgenním non-lidským organismem produkujícím takové protilátky. Tento termín označuje protilátky mající aminokyselinové sekvence nebo kódující sekvence nukleové ··♦· • · · · · · • · · · · • · · ·· · · • · · · · · « ······· · · · •· ·· ·· · ·· * kyseliny odpovídající sekvencím v organismech jiných než je transgenní non-lidské zvíře, a obvykle v druzích jiných než je transgenní non-lidské zvíře.

Termín heterohybridní protilátky, jak je zde použit, označuje protilátky mající lehký a těžký řetězec z různých organismů. Například, protilátka mající lidský těžký řetězec asociovaný s myším lehkým řetězcem je heterohybridní protilátka. Příklady heterohybridních protilátek jsou chimérické a humanizované protilátky, jak byly popsány výše.

Termín izolované protilátky, jak je zde použit, označuje protilátky, které v podstatě neobsahují jiné protilátky mající jiné antigenní specificity (např. izolované protilátky, které se specificky váží na EGFR v podstatě neobsahují protilátky, které se specificky váží na antigeny jiné než EGFR). Izolované protilátky, které se specificky váží na epitop, isoformu nebo variantu lidského EGFR mohou však mít zkříženou reaktivitu s jinými příbuznými antigeny, např. z jiných druhů (např. druhové homology EGFR). Dále, izolované protilátky by neměly obsahovat jiný buněčný materiál a/nebo chemická činidla. V jednom provedení předkládaného vynálezu se v dobře definovaném přípravku kombinují izolované monoklonální protilátky mající různé specificity.

Jak je zde použit, označuje termín specifická vazba ve vztahu k protilátce to, že se váže na předem určený antigen. Obvykle se protilátky váží s afinitou alespoň přibližně 1 x 10⁷ M”¹, a váží se na předem definovaný antigen s afinitou, která je alespoň dvakrát vyšší než je jejich afinita pro vazbu na nespecifický antigen (např. BSA, kasein) jiný než je předem určený antigen nebo blízce příbuzný antigen. Výrazy protilátky rozpoznávající antigen a „protilátky specifické ···· ·· · • · 4 4 4 4 • · · · · 4 4 4

4 4444 4 4 · ···

4 4 4 4 4

4 44 · pro antigen jsou zaměnitelné s termínem protilátky, které se specificky váží na antigen.

Jak je zde použit, označuje termín vysoká afinita pro IgG protilátky vazebnou afinitu alespoň přibližně 10⁷ M^_1, výhodně alespoň přibližně 10⁸ M”¹, výhodněji alespoň přibližně 10⁹ M^-1, a ještě výhodněji alespoň přibližně ΙΟ¹⁰ Μ^-1, 10¹¹ M”¹, 10¹² M^-1' nebo vyšší, např. až 10¹³ nebo vyšší. Nicméně, „vysoká afinita vazby může být různá pro jiné protilátkové izotypy. Například, vysoká afinita vazby pro IgM izotyp označuje vazebnou afinitu alespoň přibližně 1 x 10⁷M^_1.

Termín K_A, jak je zde použit, označuje asociační konstantu konkrétní interakce protilátky-antigenu.

Termín K_D, jak je zde použit, označuje disociační konstantu konkrétní interakce protilátky-antigenu.

Jak je zde použit, označuje izotyp třídu protilátky (např., IgM nebo IgGl), která je kódovaná geny pro konstantní region těžkého řetězce.

Jak je zde použit, označuje přesmyk izotypů fenomén, při kterém se třída nebo izotyp protilátky změní z jedné Ig třídy na jinou Ig třídu.

Jak je zde použit, označuje termín nepřesmyknutý izotyp izotypovou třídu těžkého řetězce, která vzniká bez přesmyku izotypů; CH gen kódující nepřesmyknutý izotyp je obvykle první CH gen bezprostředně za funkčně rearanžovaným VDJ genem. Přesmyk izotypů se klasifikuje jako klasický nebo neklasický přesmyk izotypů. Klasický přesmyk izotypů probíhá rekombinací, která zahrnuje alespoň jeden přesmyk sekvence v transgenu.

·· · » ··· ··· ··· ··· ··· • · ··· · ··· * · · · • · · · · · · ···· » · · ·»·* ···<· ··♦ · · · ·· ·· ·· · ·· ·

Neklasický přesmyk izotypů může proběhnout, například homologní rekombinací mezi lidský», σ_μ a lidským Σ_μ (δ-asociovaná delece. Alternativní mechanismy non-klasického přesmyku, jako je intertransgenová a/nebo interchromosomální rekombinace, mohou také vést k přesmyku izotypů.

Jak je zde použit, označuje termín přesmyková sekvence tu DNA sekvenci, která je odpověná za přesmykovou rekombinací. Přesmyková donorová sekvence, typicky μ přesmykový region, bude 5' (tj. před) regionem konstruktu, který má být deletován během přesmykové rekombinace. Přesmykový akceptorový region bude mezi regionem konstruktu, který má být deletován, a konstantním regionem (např. γ, ε, atd.). Protože není přítomné místo, ve kterém rekombinace vždy proběhne, nelze konečnou sekvenci genu předvídat z konstruktu.

Jak je zde použit, je termín charakter glykosylace definován jak charakter sacharidových jednotek, které jsou kovalentně navázány na protein, přesněji na imunoglobulinový protein. Charakter glykosylace heterologní protilátky může být charakterizován jako v podstatě stejný jako je charakter glykosylace, který se vyskytuje na přirozené protilátkce druhem transgenního zvířete, když odborník v oboru určí charakter glykosylace heterologní protilátky jako podobnější charakteru glykosylace u non-lidského transgenní zvíře než jako charakter glykosylace u druhu, ze kterého byly získány CH geny transgenu.

Termín přirozený, jak je zde použit, označuje skutečnost, že se objekt vyskytuje v přírodě. Například se jedná o polypeptidové nebo polynukleotidové sekvence, které jsou přítomné v organismu (včetně virů), které mohou být izolovány ze zdroje vyskytujícího se v přírodě a které nebyly

4

9 4

4 4 4 < 4 4 4444

4 4 «

• 4 44 • 4 4 • 4 444 • 4 » 4 4 • · · 4

44 ·· · • 4 4

4 4 4 · 4444 · 4 ·

záměrně modifikovány člověkem v laboratoři.

Termín rearanžovaný, jak je zde použit, označuje konfiguraci těžkého řetězce nebo lehkého řetězce imunoglobulinového lokusu, kde V segment je umístěn bezprostředně v sousedství D-J nebo J segmentu v konformaci kódující v podstatě celou VH nebo VL doménu, v příslušném pořadí. Rearanžovaný imunoglobulinový genový lokus může být identifikován srovnáním se zárodečnou DNA; a rearanžovaný lokus bude obsahovat alespoň jeden rekombinovaný heptamerový/nonamerový homologický element.

Termíny nerearanžovaný nebo zárodečná konfigurace, jak jsou zde použity s ohledem na V segment, označují konfiguraci, kdy V segment není rekombinován tak, aby byl v bezprostředním sousedství D nebo J segmentu.

Termín molekula nukleové kyseliny, jak je zde použit, označuje DNA molekuly a RNA molekuly. Molekula nukleové kyseliny může být jednořetězcová nebo dvouřetězcová, ale výhodně se jedná o dvouřetězcovou DNA.

Termín izolovaná molekula nukleové kyseliny, jak je zde použit s ohledem na nukleové kyseliny kódující protilátky nebo části protilátek (např. VH, VL, CDR3), které se váží na EGFR, označuje molekulu nukleové kyseliny, ve které nukleotidové sekvence kódující protilátky nebo části protilátek neobsahují jiné nukleotidové sekvence kódující protilátky nebo části protilátek, které se váží na antigeny jiné než EGFR, kde tyto jiné sekvence mohou sousedit s nukleovou kyselinou v lidské genomové DNA. V jednom provedení lidské anti-EGFR protilátky, nebo jejich části, obsahují nukleotidovou nebo aminokyselinovou sekvenci 2F8, stejně jako variabilní regiony ·· ·· φφφ ·· · • φ · φφφ Φ·· φ φφφφ φ φφφ φ φφφ • · · φφφ ΦΦΦΦΦΦΦ φφφφ

9Q φφφφφφ· ·· · ·· ·· φφ φ φ* · těžkého řetězce (VH) a lehkého řetězce (VL) mající sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3, a 2 a 4, v příslušném pořadí.

Jak je zde popsáno, obsahují sekvence uvedené v SEQ ID NO:

1-4 konzervativní modifikace sekvence, tj. modifikace nukleotidové a aminokyselinové sekvence, které neovlivňují významným způsobem vazebné charakteristiky protilátky kódované nukleotidovou sekvencí nebo aminokyselinové sekvence. Mezi takové konzervativní modifikace sekvence patří nukleotidové a aminokyselinové substituce, adice a delece. Modifikace mohou být vloženy do SEQ ID NO: 1-4 za použití standardních technik známých v oboru, jako je místně-cílená mutagenese a PCRzprostředkovaná mutagenese. Mezi konzervativní aminokyselinové substituce patří takové substituce, při kterých je aminokyselinový zbytek nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem, který má podobný vedlejší řetězec. Rodiny aminokyselinových zbytků majících podobné vedlejší řetězce byly v oboru definovány. Mezi tyto rodiny patří aminokyseliny s bazickými vedlejšími řetězci (např., lysin, arginin, histidin), acidickými vedlejšími řetězci (např. kyselina asparagová, kyselina glutamová), polárními vedlejšími řetězci bez náboje (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein, tryptofan), nepolárními vedlejšími řetězci (např. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin), beta-rozvětvenými vedlejšími řetězci (např. threonin, valin, isoleucin) a aromatickými vedlejšími řetězci (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Tak je předpokládané nesenciální aminokyselinový zbytek v lidské anti-EGFR protilátce výhodně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem ze stejné rodiny postranních řetězců.

Alternativně, v jiném provedení, mohou být mutace vloženy náhodně v celé délce nebo v části sekvence kódující anti-EGFR • · · ·

I · · » · · · · protilátku, za použití například saturační mutagenese, a vzniklé modifikované anti-EGFR protilátky mohou být testovány na vazebnou aktivitu.

V souladu s tím protilátky kódované (variabilní region lehkého a těžkého řetězce) nukleotidovou sekvencí podle předkládaného vynálezu a/nebo obsahující (variabilní region lehkého a těžkého řetězce) aminokyselinovou sekvenci podle předkládaného vynálezu (t.j., SEQ ID NO: 1-4) jsou významně podobné protilátky kódované nebo obsahující podobné sekvence, které byly konzervativně modifikované. Další popis toho, jak mohou být takové významně podobné protilátky generovány (tj. variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce) na základě částečné sekvence (SEQ ID NO: 1-4)je uveden dále.

Pro nukleové kyseliny termín v podstatě homologní udává, že dvě nukleové kyseliny, nebo jejich označené sekvence, jsou - při optimálním seřazení a srovnání - identické, s vhodnými nukleotidovými insercemi nebo delecemi, v alespoň přibližně 80% nukleotidů, obvykle v alespoň přibližně 90% až 95%, a výhodněji alespoň v přibližně 98% až 99,5% nukleotidů. Alternativně, významná homologie existuje tehdy, když dva segmenty hybridizují za selektivních hybridizačních podmínek na komplementární řetězec.

Procento identity mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu identických pozic mezi sekvencemi (t.j., % homologie = počet identických pozic/celkový počet pozic x 100), s tím, že se bere v úvahu počet mezer a délka každé mezery, které jsou nutné pro optimální seřazení dvou sekvencí. Srovnání sekvencí a stanovení identity mezi dvěma sekvencemi může být provedeno za použití matematických algoritmů, jak je popsáno v následujících příkladech.

• ·

Procento identity mezi dvěma nukleotidovými sekvencemi může být určeno za použití GAP programu v GCG softwaru (dostupný na http://www.gcg.com), za použití NWSgapdna.CMP matrice a váhy mezery 40, 50, 60, 70, nebo 80 a váhy délky mezery 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6. Procento identity mezi dvěma nukleotidovými nebo aminokyselinovými sekvencemi může být také určeno za použití algoritmu podle E. Meyers a W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), který byl inkorporován do ALIGN programu (verze 2.0), za použití PAM 120 tabulky váhy zbytků a penále za délku mezery 12 a penále za mezeru 4. Dále může být procento identity mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi určeno za použití algoritmu podle Needleman a Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), který byl inkorporován do GAP programu v GCG softwaru (dostupný na http://www.gcg.com), za použití buď Blossum 62 matrice nebo PAM250 matrice, a váhy mezery 16, 14, 12, 10, 8, 6 4 a váhy délky mezery 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6.

Nukleové kyseliny a proteinové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být dále použity jako 'dotazové sekvence' pro prohledávání veřejných databází, například za účelem identifikace příbuzných sekvencí. Takové prohledávání může být provedeno za použití NBLAST a XBLAST programů (verze 2.0) podle Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST nukleotidové prohledávání může být provedeno za použití NBLAST programu, skoré - 100, délka slova = 12, pro získání nukleotidové sekvence homologní k molekule nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. BLAST proteinové prohledávání může být provedeno pomocí XBLAST programu, skoré = 50, délka slova - 3, pro získání aminokyselinové sekvence homologní k proteinovým molekulám podle předkládaného vynálezu. Pro seřazení sekvencí s mezeremi pro srovnání může být použito • · • · · • · · · · • · · ·

Gapped BLAST, jak je popsán v Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. při použití BLAST a Gapped BLAST programů mohou být použity chybové parametry příslušných programů (např., XBLAST a NBLAST). Viz http://www.nebi.nim.nih.gov.

Nukleové kyseliny mohou být přítomny v celých buňkách, v buněčných iyzátech nebo v částečně nebo plně přečištěné formě. Nukleová kyselina je izolovaná nebo významně přečištěná tehdy, když je přečištěná od jiných buněčných složek nebo jiných kontaminujících složek, napřílad jiných buněčných nukleových kyselin nebo proteinů, za použití standardních technik, včetně zpracování alkalickým činidlem/SDS, CsCl proužkování, chromatografie na koloně, elektroforesy na agarosovém gelu a jiných technik dobře známých v oboru. Viz F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

Přípravky nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, ačkoliv často mají nativní sekvence (kromě modifikovaných restrikčních míst a podobně), ať cDNA, genomové nebo směsi, mohou být mutované, za použití standardních technik pro získání genových sekvencí. Pro kódující sekvence mohou tyto mutace ovlivňovat aminokyselinové sekvence, pokud je to žádoucí. Konkrétně mohou být mutované DNA sekvence významně homologní s nebo odvozené z nativní V, D, J, konstantní, přesmykové nebo jiné takové sekvence (kde odvozené znamená, že sekvence jsou identické nebo modifikované ve vztahu k jiné sekvenci).

Nukleové kyseliny jsou operativně navázané, když jsou ve funkčním vztahu s dalšími sekvencemi nukleové kyseliny.

• · • · · ·

·..··..· ·..* :

Například promotor nebo zesilovač transkripce je operativně navázaný na kódující sekvenci tehdy, když ovlivňuje transkripci sekvence. Pro transkripční regulační sekvence termín operativně navázaný znamená, že navázané DNA sekvence na sebe navazují a - když je potřeba spojit dvě proteinkódující sekvence - jsou ve čtecím rámci. Pro přesmykové sekvence termín operativně navázaný ukazuje, že sekvence jsou schopné přesmykové rekombinace.

Termín vektor jak je zde použit, označuje molekulu nukleové kyseliny schopnou transportovat jinou nukleovou kyselinu, na kterou je navázaná. Jedním typem vektoru je plasmid, což je cirkulární dvouřetězcová DNA smyčka, do které mohou být ligovány další DNA segmenty. Jiným typem vektoru je virový vektor, ve kterém mohou být další DNA segmenty ligovány do virového genomu. Některé vektory jsou schopné autonomní replikace v hostitelské buňce, do které jsou vloženy (např., bakteriální vektory mající bakteriální sekvenci rozpoznávající počátek replikace a episomální savčí vektory). Jiné vektory (např., non-episomální savčí vektory) mohou být integrovány do genomu hostitelské buňky po vloženi do hostitelské buňky, a potom jsou replikovány společně s genomem hostitelské buňky. D81e, některé vektory jsou schopné řídit expresi genů, na které jsou operativně navázány. Takové vektory jsou zde označovány jako rekombinantní expresní vektory (nebo jednoduše expresní vektory). Obecně, expresní vektory použitelné v technologiích rekombinantní DNA jsou často ve formě plasmidů. V předkládaném vynálezu jsou termíny plasmid a vektor zaměnitelné, protože plasmid je nej častěji používanou formou vektoru. Vynález však zahrnuje i další formy expresních vektorů, jako jsou virové vektory (např. replikace defektní retroviry, adenoviry a adenoasociované viry), které mají ekvivalentní funkce.

9 449 4 4 4 · · ··· • 94 ··· «······ ····· ·· · · ·· * ·· *

Termín rekombinantní hostitelské buňky (nebo pouze hostitelské buňky), jak je zde použit, označuje buňky, do kterých byly vloženy rekombinantní expresní vektory. Je třeba si uvědomit, že tento termín označuje nejen jednotlivé buňky, ale též potomstvo takových buněk. V důsledku toho, že v následných generacích mohou nastat různé modifikace, v důsledku mutací nebo vlivem prostředí, nemusí být takové potomstvo ve skutečnosti identické s původními buňkami, ale stále ještě spadá pod termín hostitelské buňky, jak je zde použit. Mezi rekombinantní hostitelské buňky patří, například,

CHO buňky a lymfocytární buňky.

Různé aspekty předkládaného vynálezu jsou dále podrobně popsány v následujících oddílech.

I. Produkce lidských protilátek k EGFR

Monoklonální protilátky (MAb) podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány různými technikami, včetně konvenčních technik produkce monoklonálních protilátek, např. standardní techniky hybridizace somatických buněk podle Kohler and Milstein (1975) Nátuře 256: 495. Ačkoliv je hybridizace somatických buněk preferována, mohou být použity i další techniky pro produkce monoklonálních protilátek, například virová nebo onkogenní transformace B-lymfocytů.

Výhodným zvířecím systémem pro přípravu hybridomů je myší systém. Produkce hybridomů u myší je zavedeným postupem.

V oboru jsou známé imunizační protokoly a techniky pro izolování imunizovaných splenocytů pro fúzi. Partnery pro fúzi (např. myší myelomové buňky) a fúzní postupy jsou také známé.

• · • · ·· · · • · · • · · · · • ···· · · · • · · · · ·· · ·· ·

Ve výhodném provedení mohou být lidské monoklonální protilátky namířené proti EGFR generovány za použití transgenní myši nesoucí části lidského imunitního systému místo myšího systému. Tyto transgenní myši, označované zde jako HuMAb myši, obsahují lidské imunoglobulinové genové minilokusy, které kódují nerearanžovanou lidskou imunoglobulinovou sekvenci pro těžký (μ a γ) a κ lehký řetězec, společně s cílenými mutacemi, které inaktivují endogenní lokusy μ a κ řetězce (Lonberg, et al. (1994) Nátuře 368(6474): 856-859). Proto mají myši sníženou expresi myšího IgM nebo κ, a v reakci na imunizaci probíhá v transgenech pro lidský těžký a lehký řetězec přesmyk tříd a somatické mutace, které generují lidské IgGK monoklonální protilátky s vysokou afinitou (Lonberg, N. et al. (1994), výše; přehled v Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Imunol. Vol. 13: 65-93, a Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. K. Acad. Sci. 764:536-546). Příprava HuMAb myši je podrobně popsána v oddíle II, dále, a v Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Imunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proč. Nati. Acad Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nátuře Genetics 4:117-123;

Chen, J. et al. (1993) EMBOJ. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Imunol. 152:2912-2920; Lonberg et al, (1994) Nátuře 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Imunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Imunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. NY. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild,

D. et al. (1996) Nátuře Biotechnology 14: 845-851, jejichž obsahy jsou zde ve své úplnosti uvedeny jako odkazy. Dále viz U.S. Patenty č. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; a • · ···· ·· · ·«·· ···

5,770,429; všechny Lonberg a Kay, a GenPharm International;

U.S. Patent č. 5,545,807, Surani et al.; Mezinárodní přihlášky č. WO 98/24884, publikovaná 11.6.1998; WO 94/25585, publikovaná 10.11.1994; WO 93/1227, publikovaná 24.6.1993; WO 92/22645, publikovaná 23.12.1992; WO 92/03918, publikovaná 19.3.1992, jejichž objevy jsou zde uvedeny ve své úplnosti uvedeny jako odkazy. Alternativně mohou být HCO12 transgenní myši popsané v příkladu 2 použity pro generování lidské antiEGFR protilátky.

Imunizace pro lidské protilátky

Pro získání plně lidské monoklonální protilátky k EGFR mohou být HuMAb myši imunizované přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR, jak je popsáno v Lonberg, N. et al. (1994) Nátuře 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nátuře Biotechnology 14: 845-851 a WO 98/24884. Výhodně jsou myši při první infusi stáří 6-16 týdnů. Pro intraperitoneální imunizaci HuMAb myší může být použit například přečištěný nebo obohacený přípravek (5-20 μg) EGFR antigenu (např. přečištěný z EGFR-exprimujících LNCaP buněk). V případě, že imunizace za použití přečištěného nebo obohaceného přípravku EGFR antigenu nevede k indukci protilátky mohou být myši také imunizované buňkami exprimujícími EGFR, např. nádorovou buněčnou linií, což vede k indukci imunitní reakce.

Zkušenosti s různými antigeny ukazují, že HuMAb transgenní myši odpovídají nejlépe tehdy, když jsou nejprve imunizované intraperitoneálně (IP) antigenem v kompletním Freundovu adjuvans, a potom následuje každý druhý týden i.p. imunizace (celkem 6-krát) antigenem v inkompletním Freundově adjuvans. Imunitní reakce může být sledována během imunizačního ·· 9

• · 9

9 9 9 · 9···

9 9 protokolu pomocí vzorků plasmy získaných z retroorbitální žíly. Plasma může být testována ELISA (jak je popsáno dále), a myši s dostatečnými titry anti-EGPR lidského imunoglobulinu mohou být použity pro fúze. Myší mohou být dosyceny intravenosně antigenem 3 dny před utracením a odstraněním sleziny. Předpokládá se, že pro každý antigen bude potřeba provést 2-3 fúze. Několik myší bude imunizováno pro každý antigen. Například může být imunizováno celkem 12 HuMAb myší HCO7 a HCO12 kmenů.

Příprava hybridomů produkujících lidské monoklonální protilátky k EGFR

Myší splenocyty mohou být izolovány a fúzovány s PEG na myší myelomovou buněčnou linii za použití standardních protokolů. Získané hybridomy se potom testují na produkci antigen-specifické protilátky. Například, jednobuněčné suspenze slezinných lymfocytů od immunizovaných myší se fúzují na jednu šestinu počtu P3X63-Ag8.653 nesecernujících myších myelomových buněk (ATCC, CR1.1580) s 50% PEG. Buňky se umístí na mikrotitrační plotny s plochým dnem v koncentraci přibližně 2xl0⁵ a potom se provede dvoutýdenní inkubace v selektivním mediu obsahujícím 20% fetální Cloně Sérum, 18% 653 kondicionované medium, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutaminu, 1 mM L—glutaminu, 1 mM natrium-pyruvátu, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2merkaptoethanolu, 50 jednotek/ml penicilinu, 50 mg/ml streptomycinu, 50 mg/ml gentamycinu a 1XHAT (Sigma; HAT se přidá 24 hodin po fúzi). Po dvou týdnech se buňky kultivují v mediu, ve kterém je HAT nahrazeno HT. Jednotlivé jamky se potom testují ELISA na lidské anti-EGFR monoklonální IgM a IgG protilátky. Pokud dojde k významnému růstu hybridomů, tak se medium testuje obvykle po 10-14 dnech. Hybridomy secernující protilátky se přenesou na jiné plotny, opět se testují a pokud • 9 99 99 9 ·· ·

9 9 9 9 9 9··

9 999 · · 9 · · ···

99 9 9 · 9999999 99999

OO 9999999999

JO 99 99 99 9 99 9 jsou stále pozitivní na lidské IgG, anti-EGFR monoklonální l protilátky, tak mohou být alespoň dvakrát subklonovány . limitním ředěním. Stabilní subklony se potom kultivují in vitro za zisku malých množství protilátky v tkáňovém kultivačním mediu pro charakterizaci.

Příprava transfektomů produkujících lidské monoklonální protilátky k EGFR

Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také produkovány v transfektovaných hostitelských buňkách za použití, například, kombinace technik rekombinantní DNA a metod genové transfekce, které jsou dobře známé v oboru.

(Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Například, v jednom provedení může být požadovaný gen, např. gen pro lidské protilátky, ligován do expresního vektoru, jako je plasmid eukaryotické buňky. Plasmid může být potom vložen do hostitelské buňky, jako je bakteriální buňka (např. E. coli) a buňka může být kultivována. Hostitelská buňka obsahující plasmid s integrovanou DNA může být selektována a ošetřena lysozymem za účelem odstranění buněčné stěny. Vzniklé sféroplasty mohou být fúzovány s imortalizovanou buňkou, jako je myelomová buňka (což se označuje jako transfekce). Po fúzi mohou být identifikovány stabilní buňky (transfektanty) a ty mohou být selektovány.

Tyto buňky představují transfektomy, které mohou být potom amplifikovány jejich kultivací v ascitu nebo ve tkáňové kultuře a které mohou být použity pro produkci rekombinantních lidských protilátek.

Použití části protilátkové sekvence pro expresi intaktní protilátky φφ φφ • · · • · • · · φ φφφφ φ φ

Φ Φ · φφφφ φ ·

Protilátky interagují s cílovými antigeny především prostřednictvím aminokyselinových zbytků, které jsou lokalizovány v šesti komplementaritu určujících regionech těžkého a lehkého řetězce (CDR). Z tohoto důvodu jsou aminokyselinové sekvence v CDR více odlišné mezi jednotlivými protilátkami než sekvence mimo CDR. Protože jsou CDR sekvence odpovědné za většinu interakcí protilátka-antigen, je možné exprimovat rekombinantní protilátky, které napodobují vlastnosti specifické přirozené protilátky tak, že se konstruují expresní vektory, které obsahují CDR sekvence ze specifické přirozeně se vyskytující protilátky přenesené na pracovní sekvence z jiné protilátky s jinými vlastnostmi (viz např. Riechmann, L. et al., 1998, Nátuře 332:323-327; Jones,

P. et al., 1986, Nátuře 321:522-525; a Queen, C. et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033). Takové pracovní sekvence mohou být získány z veřejných DNA databází, které obsahují zárodečné sekvence genů pro protilátky. Tyto zárodečné sekvence se liší od sekvencí genů pro zralé protilátky, protože neobsahují plně sestavené variabilní geny, které jsou tvořeny V(D)J vazbami během zrání B lymfocytu. Zárodečné genové sekvence se také liší od sekvencí vysoceafinitních sekundárních protilátek rovnoměrně v celém variabilním regionu. Například, somatické mutace jsou relativně málo časté v amino-koncové části regionu pracovního rámce. Například, somatické mutace jsou relativně málo časté v amino-koncové části regionu pracovního rámce 1 a v karboxykoncové části regionu pracovního rámce 4. Dále, mnoho somatických mutací významnějším způsobem nemění vazebné vlastnosti protilátky. Proto není nutné získat celou DNA sekvenci konkrétní protilátky pro vytvoření intaktní rekombinantní protilátky mající vazebné vlastnosti podobné jako původní protilátka (viz PCT/US99/05535, podaná 12.3.1999,

44 • · · • 4 4 4· • 4 4

4 4

44

4 44 4

4 4 4 4 4

444 4 444

4444444 44444 • 44 · 4 4

4 44 4 která je zde uvedena jako odkaz). Pro tento účel je obvykle dostačující část sekvence lehkého a těžkého řetězce zahrnující CDR regiony. Č8st sekvence se použije pro určení toho, které zárodečné variabilní a spojovací genové segmenty přispívají k variabilním genům rekombinované protilátky. Zárodečné sekvence se potom použijí pro doplnění chybějících částí variabilních regionů. Vedoucí sekvence těžkého a lehkého řetězce se potom štěpí během zrání proteinu a nepřispívají k vlastnostem konečné protilátky. Pro tento účel je pro expresní konstrukty nutné použít odpovídající zárodečné vedoucí sekvence. Pro přidání chybějících sekvencí mohou být klonované cDNA sekvence kombinovány se syntetickými oligonukleotidy ligací nebo PCR amplifikaci. Alternativně, celý variabilní region může být syntetizován jak sada krátkých, překrývajících se oligonukleotidů, které mohou být kombinovány PCR amplifikaci za zisku zcela syntetického klonu variabilního regionu. Tento postup má určité výhody, jako je eliminace nebo zahrnují konkrétních restrikčních míst, nebo optimalizace konkrétních kodonů.

Nukleotidové sekvence transkriptů těžkého a lehkého řetězce z hybridomů se použijí pro navržení sady překrývajících se syntetických oligonukleotidů pro vytvoření syntetických V sekvencí s identickou kapacitou pro kódování aminokyselin jako přirozená sekvence. Syntetické sekvence těžkého a kappa řetězce se mohou lišit od přirozených sekvencí třemi způsoby: řetězce opakovaných nukleotidových baží jsou přerušeny, aby se usnadnila syntéza oligonukleotidů a PCR amplifikace; optimální místa pro iniciaci translace jsou inkorporována podle Kozákových pravidel (Kozák, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870); a HindlII jsou vložena před místa pro iniciaci translace.

·· ·9 ·· · ·· • · · · · · · 9 • 9 ··· 9 · · · · · • · · *99 9 ···· · « ·

9 9 9 ·· · ·· ·· ·· ·· · ·►

Pro variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce jsou optimalizované sekvence kódujícího a nekódujícícho řetězce rozštěpeny na úseky délky 30-50 nukleotidů, přibližně ve střední části nekódujícího oligonukleotídu. Tak mohou být pro každý řetězec oligonukleotidy sestaveny do překrývajících se dvouřetězcových sad, které pokrývají segmenty délky 150—400 nukleotidů. Tyto sady se potom použijí jako templáty pro produkci PCR amplifikačních produktů délky 150—400 nukleotidů. Obvykle se jedna sada oligonukleotidů pro variabilní region rozštěpí na dvě sady, které se samostatně amplifikují za vzniku dvou překrývajících se PCV produktů. Tyto překrývající se produkty se potom kombinují PCT amplifikaci za vzniku kompletního variabilního regionu. Může být žádoucí zahrnout překrývající se fragment konstantního regionu těžkého nebo lehkého řetězce (včetně Bbsl místa kappa lehkého řetězce, nebo Agel místa gamma těžkého řetězce) do PCR amplifikace pro generování fragmentů, které mohou být snadno klonovány do konstruktů expresních vektorů.

Rekonstruované variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce se potom kombinují s klonovaným promotorem, místem pro iniciaci translace, konstantním regionem, 3' netranslatovanými sekvencemi, polyadenylačním místem a místem pro ukončení translace, za vzniku konstruktu expresního vektoru. Konstrukty exprimující těžký a lehký řetězec mohou být kombinovány do jediného vektoru, mohou být transfektovány současně nebo sériově, nebo mohou být samostatně transfektovány do hostitelských buně, které se potom fúzují za zisku hostitelské buňky exprimující oba řetězce.

Plasmidy pro použití při konstrukci expresních vektorů pro lidský IgGK jsou popsány dále. Plasmidy byly konstruovány tak, že PCR amplifikované cDNA sekvence pro V těžký a V kappa lehký ···· ·· ·· ·· · ·* · »·· ··· · »· • · ·*· · ··♦ · ··· • «· · « · · ···· » · · ·«·* ···« ··· ··· ·· ·· ·» · ·· » řetězec mohly být použity pro rekonstrukci minigenů pro kompletní těžký a lehký řetězec. Tyto plasmidy mohly být použity pro expresi kompletně lidských nebo chimérických IgGiK nebo IgG₄K protilátek. Podobné plasmidy mohly být konstruovány pro expresi jiných izotypů těžkého řetězce, nebo pro expresi protilátky obsahující lambda lehké řetězce.

V dalším aspektu předkládaného vynálezu jsou strukturální vlastnosti lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu, např., 2F8, použity pro přípravu strukturálně příbuzné lidské anti-EGFR protilátky, která si zachovává alespoň jednu funkční vlastnost protilátky podle předkládaného vynálezu, jako je vazba na EGFR. Přesněji, jeden nebo více CDR regionů 2F8 může být kombinován rekombinantně se známým lidským regionem pracovního rámce a CDR za vytvoření další, rekombinantně upravené lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu.

V jiném provedení tedy vynález poskytuje způsob pro přípravu anti-EGFR protilátky, který zahrnuje:

Přípravu protilátky obsahující (I) lidský region pracovního rámce těžkého řetězce a lidský CDR těžkého řetězce, kde alespoň jeden lidský CDR těžkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou z aminokyselinových sekvencí CDR uvedených na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích SEQ ID NO: 2); a (2) lidský region pracovního rámce lehkého řetězce a lidský CDR lehkého řetězce, kde alespoň jeden lidský CDR lehkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou z aminokyselinových sekvencí CDR uvedených na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích SEQ ID NO: 4); kde protilátka si zachovává schopnost vazby na EGFR.

• · • · · ·

Schopnost protilátky vázat se na EGFR může být určena za použití standardních vazebných testů, jako jsou testy uvedené v příkladech provedení vynálezu (např. ELISA). Protože je v oboru dobře známo, že CDR3 domény těžkého a lehkého řetězce mají významnou úlohu ve vazebné specificitě/afinitě protilátky pro antigen, obsahují rekombinantní protilátky podle předkládaného vynálezu připravené způsobem uvedeným výše CDR3 těžkého a lehkého řetězce 2F8. Protilátky mohou dále obsahovat CDR2 2F8. Protilátky mohou dále obsahovat CDRl 2F8. V souladu s tím vynález poskytuje anti-EGFR protilátky obsahující: (1) lidský region pracovního rámce těžkého řetězce a lidský CDRl region těžkého řetězce, a lidský CDR2 region těžkého řetězce CDR2 region, a lidský CDR3 region těžkého řetězce , kde lidský CDR3 region těžkého řetězce je CDR3 2F8, jak je uveden na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích v SEQ ID NO: 2); a (2) lidský region pracovního rámce lehkého řetězce, a lidský CDRl region lehkého řetězce, a lidský CDR2 region lehkého řetězce CDR2 region, a lidský CDR3 region lehkého řetězce, kde lidský CDR3 region lehkého řetězce je CDR3 2F8, jak je uveden na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích v SEQ ID NO: 4), kde protilátka se váže na EGFR. Protilátka může dále obsahovat CDR2 těžkého řetězce a/nebo CDR2 lehkého řetězce 2F8. Protilátka může dále obshaovat CDRl těžkého řetězce a/nebo CDRl lehkého řetězce 2F8.

Výhodně mají CDRl, 2, a/nebo 3 upravené protilátky popsané výše přesně stejnou aminokyselinovou sekvenci jako 2F8 popsaná výše. Nicméně, odborníkům v oboru bude jasné, že mohou existovat odchylky od přesné CDR sekvence 2F8, a protilátky si mohou přesto zachovat schopnost účinné vazby na EGFR (například se může jednat o konzervativní substituce). Proto může být - v jiném provedení - upravená protilátka složena • · • · z jednoho nebo více CDR, které jsou, například, z 90%, 95%,

98% nebo 99,5% identické s jedním nebo více CDR 2F8. Kromě prosté vazby na EGFR mohou být upravené protilátky, jako jsou protilátky popsané výše, selektovány tak, aby si zachovávaly další funkční charakteristiky protilátek podle předkládaného vynálezu, jako je:

(1) vazba na živé buňky exprimující EGFR;

(2) vysoká afinita vazba na EGFR;

(3) vazba na jedinečný epitop na EGFR (pro eliminaci možnosti, že budou monoklonální protilátky s komplementárními aktivitami, budou-li použity v kombinaci, soutěžit o vazbu na stejný epitop;

(4) opsonizace buněk exprimujících EGFR; a/nebo (5) zprostředkování inhibice růstu, fagocytosy a/nebo usmrcení buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk.

Charakterizace vazby lidských monoklonálních protilátek na EGFR

Pro charakterizování vazby lidské monoklonální EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu může být testováno sérum od imunizovaných myší, například pomocí ELISA. Stručně, mikrotitrační plotny se potáhnou přečištěným EGFR v koncentraci 0,25 gg/ml v PBS a potom se blokují 5% hovězím sérovým albuminem v PBS. Ředění plasmy od EGFR-imunizovaných myší se přidají do každé jamky a provede se inkubace po dobu 1-2 hodin při 37 °C. Plotny se promyjí PBS/Tween a potom se inkubují kozí-anti-lidský IgG Fc-specifřekou polyklonální protilátkou konjugovanou na alkalickou fosfatasu po dobu 1 hodiny při 37°C. Po promytí se plotny vyvíjejí s pNPP substrátem (1 mg/ml), a analyzují se při OD 405-650. Výhodně se pro fúze použijí myši, u kterých jsou nejvyšší titry.

• · • · • · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · ··· · • ·· · · · ······· ···· ··· · ·· · · ·· · ··

ELISA test, jak je popsán výše, může být také použit pro testování hybridomů, které vykazují pozitivní reaktivitu s EGFR imunogenem. Hybridomy, které se váží s vysokou aviditou na EGFR, se sublonují a dále se charakterizují. Jeden klon z každého hybridomů, který si zachovává reaktivitu původních buněk (podle ELISA) může být vybrán pro přípravu 5-10 zkumavek buněčné banky, a pro přečištění protilátky.

Pro přečištění lidské anti-EGFR protilátky mohou být vybrané hybridomy kultivovány ve 2 litrových centrifugačních baňkách za účelem přečištění monoklonální protilátky. Supernatanty mohou být přefiltrovány a zahuštěny před afinitni chromatografii s protein A-sepharosou (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluovaný IgG může být testován gelovou elektroforesou a vysoce účinnou kapalinovou chromatografii pro zajištění čistoty. Pufrovací roztok může být vyměněn do PBS, a koncentrace může být určena podle OD₂8o za použití 1,43 extinkčního koeficientu. Monoklonální protilátky mohou být rozděleny do podílů a mohou být uskladněny při -80 °C.

Pro stanovení toho, zda se vybraná lidská anti-EGFR monoklonální protilátky váže na jedinečné epitopy může být každá protilátka biotinylována za použití komerčně dostupných reagens (Pierce, Rockford, IL). Kompetitivní testy za použití neznačené monoklonální protilátky a biotinylované monoklonální protilátky mohou být provedeny za použití EGFR potaženýchELISA ploten způsobem popsaným výše. Vazba biotinylované MAb může být detekována za použití streptavidinu-alkalické fosfatasy.

Pro určení izotypů přečištěné protilátky může být provedena izotypová ELISA. Jamky mikrotitračních ploten mohou • · · • · ··· ·«· ···· · · · · · ··· •· · · · · ··♦* · · · 9999 být potaženy 10 gg/ml anti-lidského Ig, přes noc při 4°C. Po blokování 5% BSA plotny reagují s 10 gg/ml monoklonální protilátky nebo přečištěné izotypové kontroly, při teplotě místnosti po dobu dvou hodin. Jamky mohou potom reagovat se sondami alkalická fosfatasa-konjugát specifickými pro lidský IgGl nebo IgM. Plotny se vyvíjejí a analyzují způsobem popsaným výše.

Pro demonstrování vazby monoklonální protilátky na živé buňky exprimující EGFR může být použita průtoková cytometrie. Stručně, buněčné linie exprimující EGFR (kultivované za standardních kultivačních podmínek) se smísí s různými koncentracemi monoklonální protilátky v PBS obsahujícím 0,1% Tween 80 a 20% myší sérum, a provede se inkubace při 37°C po dobu 1 hodiny. Po promytí buňky reagují s Fluoresceinen značenou anti-lidský IgG protilátkou za stejných podmínek, jako primární protilátka. Vzorky mohou být analyzovány FACScan přístrojem za použití světelných a rozptylových charakteristik pro jednotlivé buňky. Může být alternativně použito fluorescenční mikroskopie (kromě nebo místo) průtokové cytometrie. Buňky mohou být barveny stejným způsobem a mohou být vyšetřeny na fluorescenčním mikroskopu. Tento způsob umožňuje vizualizaci jednotlivých buněk, ale může mít nižší sensitivitu, v závislosti na hustotě antigenu.

Anti-EGFR lidské IgG mohou být dále testovány na reaktivitu s EGFR antigenem pomocí Western hybridizace. Stručně, mohou být připraveny buněčné extrakty z buněk exprimujících EGFR a tyto extrakty mohou být zpracovány elektroforesou na natrium-dodecylsulfátových (SDS) polyakrylamidových gelech. Po elektroforese mohou být separované antigeny přeneseny na nitrocelulosové membrány, blokovány 20% myším sérem, a sondovány monoklonální • · ··· · · · • · · · · ··· * ··· •· ··· ·····«· ····· «· ·· · ·· · protilátkou, která je testována. Vazba lidského IgG může být detekována za použití anti-lidského IgG-alkalické fosfatasy a vyvíjení s BCIP/NBT substrátovými tabletami (Sigma Chem. Co.,

St. Louis, MO).

Aktivity lidských monoklonálních protilátek k EGFR ve fagocytose a usmrcování buněk

Kromě specifické vazby na EGFR mohou být lidské monoklonální anti-EGFR protilátky testovány na schopnost indukovat fagocytosu a usmrcování buněk exprimujících EGFR. Testování aktivity monoklonální protilátky in vitro bude prvotním skríningem před testování na modelech in vivo.

Stručně, polymorfonukleární buňky (PMN), nebo jiné efektorové buňky, od zdravých dárců mohou být přečištěny Ficoll Hypaque densitním odstředěním, po kterém následuje lýza kontaminujících erytrocytů. Promyté PMN mohou být suspendovány v RPMI.doplněném 10% teplem inaktivovaným fetálním telecím sérem a mohou být smíseny s buňkami exprimujícími EGFR značenými ⁵¹Cr v různých poměrech efektorových buněk a nádorových buněk (efektorové buňky:nádorové buňky). Přečištěný lidský anti-EGFR IgG může být potom přidáván v různých koncentracích. Irelevantní lidský IgG může být použit jako negativní kontrola. Testy mohou být provedeny během 0-120 minut při 37°C. Vzorky mohou být testovány na cytolýzu měřením uvolňování ⁵¹Cr do supernatantu kultury. Anti-EGFR monoklonální protilátky mohou být také testovány ve vzájemných kombinacích pro stanovení toho, zda je cytolýza zvýšena při použití více monoklonálních protilátek.

Lidské monoklonální protilátky, které se váží na EGFR, mohou být také testovány na modelu in vivo (např. na myších) pro stanovení jejich účinnosti ve zprostředkování fagocytosy a usmrcování buněk exprimujících EGFR, např. nádorových buněk. Tyto protilátky mohou být vybrány, například podle následujících kriterií, ktersá nejsou míněný jako kriteria vylučovací:

(1) vazby na živé buňky exprimující EGFR;

(2) vysoké afinity vazby na EGFR;

(3) vazby na jedinečný epitop na EGFR (pro eliminaci možnosti, že budou monoklonální protilátky s komplementárními aktivitami, budou-li použity v kombinaci, soutěžit o vazbu na stejný epitop;

(4) opsonizace buněk exprimujících EGFR;

(5) zprostředkování inhibice růstu, fagocytosy a/nebo usmrcení buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk.

Výhodné lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu splňují jedno nebo více, nejlépe všechna uvedená kriteria. V konkrétním provedení jsou lidské monoklonální protilátky použity v kombinaci, např. jako farmaceutický prostředek obsahující dvě nebo více anti-EGFR monoklonálních protilátek nebo jejich fragmentů. Například, lidské anti-EGFR monoklonální protilátky mající různé, ale komplementární aktivity, mohou být kombinovány v jedné terapii za účelem dosažení terapeutického nebo diagnostického efektu. Příkladem je prostředek obsahující anti-EGFR lidské monoklonální protilátky, které zprostředkují vysoce účinné zabíjení cílových buněk za přítomnosti efektorových buněk, kombinované s jinými lidskými anti-EGFR monoklonálními protilátkami, které inhibují růst buněk exprimujících EGFR.

II. Produkce transgenních non-lidských zvířat, která generují lidské monoklonální anti-EGFR protilátky • · « · · ··· ··· • · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ”í* *i ·*;

•· ·· 99 · 99 9

V dalším aspektu vynález poskytuje transgenní non-lidská zvířata, např. transgenní myši, které jsou schopné exprimovat lidské monoklonálni protilátky, které se specificky váží na EGFR, výhodně s vysokou afinitou. Ve výhodném provedení mají transgenní non-lidská zvířata, např. transgenní myši (HuMAb myši), genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lehký řetězec. V jednom provedení je transgenní non-lidské zvíře, např. transgenní myši, imunizována přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenů a/nebo buněk exprimujících EGFR. Výhodně jsou transgenní non-lidská zvířata, např. transgenní myší, schopná produkovat více izotypů lidské monoklonálni protilátky k EGFR (např. IgG, IgA a/nebo IgE) pomocí V-D-J rekombinace a přesmyku izotypů.

Přesmykem izotypů může být, například, klasický nebo nonklasický přesmyk izotypů.

Charakter transgenních non-lidských zvířat, která reagují na stimulaci cizorodým antigenem repertoárem heterologních protilátek vyžaduje, aby transgeny pro heterologní imunoglobuliny obsažené v transgenním zvířeti fungovaly správně v celé dráze vývoje B-lymfocytů. Ve výhodném provedení zahrnuje správná funkce transgenu heterologního těžkého řetězce přesmyk izotypů. Proto jsou transgeny podle předkládaného vynálezu konstruovány tak, aby produkovaly přesmyk izotypů a jednu nebo více z následujících vlastností:

(1) vysokou úroveň exprese ve specifickém typu buněk; (2) funkční přeskupování genů; (3) aktivaci a reakci na vyloučení alely, (4) expresi dostatečného primárního repertoáru; (5) přenos signálu; (6) somatické hypermutace; a (7) dominaci transgenového lokusu protilátky během imunitní reakce.

Ne všechna uvedená kriteria musí být splněna. Například v těch provedeních, kde jsou endogenní imunoglobulinové lokusy

4

4 • 4

4 • 4

4

4 4 4

4 « transgenního zvířata funkčně narušeny, nemusí transgen aktivovat vyloučení alely. Dále, v těch provedeních, kde transgen obsahuje funkčně rearanžovaný gen pro imunoglobulinový těžký a/nebo lehký řetězec, je další kriterium funkčního přeskupování genů zbytečné, alespoň pro ten transgen, který je již rearanžovaný. Pro základy molekulární imunologie viz Fundamental Imunology, 2. vydání (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.,který je zde uveden jako odkaz.

V některých provedeních obsahují transgenní non-lidská zvířata použitá pro generování lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu rearanžovaný, nerearanžovaný nebo kombinaci rearanžovaného a nerearanžovaného transgenu pro heterologní imunoglobulinové těžký a lehký řetězec zárodečné linii transgenního zvířete. Každý transgen pro těžký řetězec obsahuje alespoň jeden C_H gen. Dále, transgen pro těžký řetězec může obsahovat funkční sekvence pro přesmyk izotypů, které podporují přesmyk izotypů heterologního transgenu kódujícího více C_H genů v B-lymfocytech transgenního zvířete. Takové přesmykové sekvence mohou být sekvence, které se přirozeně vyskytují v zárodečném imunoglobulinovém lokusu druhu, který slouží jako zdroj transgenních C_H genů, nebo mohou být takové přesmykové sekvence odvozeny od sekvencí, které se vyskytují u druhu, kterému má být podán transgenový konstrukt (transgenního zvířete). Například, lidský transgenový konstrukt, který je použit pro přípravu transgenní myši, může produkovat vyšší frekvenci přesmyku izotypů, pokud obsahuje přesmykové sekvence podobné sekvencím, které se přirozeně vyskytují v myším lokusu těžkého řetězce, protože jsou myší přesmykové sekvence pravděpodobně optimalizovány tak, aby fungovaly s myším přesmykovým rekombinasovým enzymovým systémem, zatímco lidské sekvence nikoliv. Přesmykové ·· ·· ··· ·· · • · · · · · · · · • · · · 4 · · · · · · · · • · · · · · · ···· 4 9 · ····

4 9 · · · · · · · • · ·· ·· · ·· · sekvence mohou být izolovány a klonovány za použití běžných klonovacích metod, nebo mohou být syntetizovány de novo z překrývajících se syntetických oligonukleotidů navržených podle publikovaných sekvencí týkajících se imunoglobulinového přesmykového regionu (Mills et at., Nucl. Acids Res. 15:73057316 (1991); Sideras et al., Intl. Imunol. 1:631-642 (1989), které jsou zde uvedeny jako odkazy). Pro každé z uvedených transgenních zvířat jsou funkčně rearanžované transgeny pro heterologní těžký a lehký řetězec imunoglobulinu přítomny ve významné frakci B-lymfocytů na transgenním zvířeti (alespoň 10%) .

Transgeny použití pro generování transgenních zvířat podle předkládaného vynálezu zahrnují transgen pro těžký řetězec obsahující DNA kódující alespoň jeden variabilní genový segment, jeden diversitní genové segment, jeden spojovací genový segment a alespoň jeden genový segment pro konstantní region. Transgen pro imunoglobulinový lehký řetězec obsahuje DNA kódující alespoň jeden variabilní genový segment, jeden spojovací genový segment a alespoň jeden genový segment pro konstantní region. Genové segmenty kódující genové segmenty pro lehký a těžký řetězec jsou heterologní pro transgenní non-lidské zvíře v tom, že jsou odvozeny od - nebo odpovídají - DNA kódující genové segmenty pro imunoglobulinový těžký a lehký řetězec z druhu jiného než je transgenní non-lidské zvíře. V jednom aspektu předkládaného vynálezu je transgen konstruován tak, že jednotlivé genové segmenty jsou nerearanžované, t.j., nejsou uspořádané tak, aby kódovaly funkční imunoglobulinový lehký nebo těžký řetězec. Takové nerearanžované transgeny podporují rekombinaci V, D a S genových segmentů (funkční přeskupení) a výhodně podporují inkorporaci všech nebo části genového segmentu pro D region do vzniklého rearanžovaného imunoglobulinového těžkého řetězce v • · ·

«00 0 0 · 0 0 0 • 00·· 0 000 0 000 • 0 0 0 0 0 0 ···· 0 0 0 000 ·· ·· ·* · a· · transgenním non-lidském zvířeti, po setkání s EGFR antigenem.

V alternativním provedení transgeny obsahují nerearanžovaný mini-lokus. Takové transgeny obvykle obsahují významnou část C, D a J segmentů, stejně jako podskupinu V genových segmentů.

V takových transgenových konstruktech obsahují různé regulační sekvence, například promotory, zesilovače transkripce, regiony pro přesmyk tříd, sestřihová donorová a akceptorová místa pro zpracování RNA, rekombinační signály a podobně příslušné sekvence odvozené od heterologní DNA. Takové regulační sekvence mohou být vloženy do transgenu ze stejného nebo z jiného druhu non-lidského zvířete použitého v předkládaném vynálezu. Například, lidské imunoglobulinové genové segmenty mohou být v transgenu v transgenní myši kombinovány s imunoglobulinovou zesilovací sekvencí od hlodavce.

Alternativně mohou být do transgenu vloženy syntetické regulační sekvence, kde takové syntetické regulační sekvence nejsou homologní s funkčními DNA sekvencemi, které se přirozeně vyskytují v genomech savců. Syntetické regulační sekvence jsou navrženy podle konvenčních pravidel, jako jsou například pravidla specifikující permisibilní sekvence sestřihových akceptorových míst nebo promotor/enhancerový motiv. Například, minilokus obsahuje část genomového imunoglobulinového lokusu majícího alespoň jednu interní (t.j. ne koncovou) deleci neesenciální části DNA (např., vmezeřené sekvence; intronu nebo jeho části) ve srovnání s přirozeným zárodečným Ig lokusem.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu se transgenní zvíře použité pro generování lidské protilátky k EGFR obsahující alespoň jednu, typicky 2-10, a někdy 25-50 nebo více kopií transgenu popsaného v příkladu 12 WO 98/24884 (např. pHCl nebo pHC2) kříží se zvířetem obsahujícím jedinou

9

9··

99

9 9

9 9 9 9

9 9

9999 99 9 «9 9

9999 99 9 99 9 kopii transgenu pro lehký řetězec popsaného v příkladech 5, 6, nebo 14 WO 98/24884, a potomstvo se kříží s J_H deletovaným zvířetem popsaným v příkladu 10 WO 98/248 84, který je zde uveden jako odkaz. Zvířata se kříží do dosažení homozygotnosti pro každý z těchto tří rysů. Taková zvířata mají následující genotyp: jednu kopii (na haploidní sadu chromosomů) lidského nerearanžovaného mini-lokusu pro těžký řetězec (popsaného v příkladu 12 WO 98/24884), a jednu kopii (na haploidní sadu chromosomů) lidského rearanžovaného konstruktu pro lidský κ lehký řetězec (popsaného v příkladu 14 WO 98/24884), a deleci v každém endogenním lokusu pro myší lehký řetězec, která odstraňuje všechny funkční J_H segmenty (jak je popsáno v příkladu 10 WO 98/24884). Taková zvířata se kříží s myšmi, které jsou homozygotní pro deleci J_H segmentů (příklad 10 WO 98/24884) za zisku potomstva, které je homozygotní pro J_H deleci a hemizygotní pro konstrukty pro lidské těžké a lehké řetězce. Získaným zvířatům se injekčně podají antigeny a použijí se pro produkci lidské monoklonální protilátky proti těmto antigenům.

B-lymfocyty izolované od takových zvířat jsou monospecifické s ohledem na lidské těžké a lehké řetězce, protože obsahují pouze jedinou kopii každého genu. Dále jsou monospecifické s ohledem na lidský nebo myší těžký řetězec, protože obě kopie endogenního genu pro myší těžký řetězec jsou nefunkční v důsledku delece v rozsahu J_H regionu, která je vložena způsobem popsaným v příkladech 9 a 12 WO 98/24884.

Dále, významná frakce B-lymfocytů bude monospecifická s ohledem na lidské nebo myší lehké řetězce, protože exprese jediné kopie rearanžovaného lidského genu κ lehkého řetězce bude alelicky a izotypově vylučovat rearanžování endogenních myších genů pro κ a lambda řetězce ve významné frakci Blymfocytů.

4

4 4«

4

4

4 · 4 • 4 · 4 • 4 4 4444

4 4

4

Transgenní myši výhodného provedení vykazují produkci imunoglobulinu se signifikantním repertoárem, ideálně v podstatě stejným, jako mají nativní myši. Například v provedeních, kde byly endogenní Ig geny inaktivovány, je celková hladina imunoglobulinu v rozmezí od přibližně 0,1 do 10 mg/ml séra, výhodně od 0,5 do 5 mg/ml, ideálně alespoň přibližně 1,0 mg/ml. Když je do transgenní myši vložen transgen umožňující přesmyk z IgM na IgG, tak je u dospělých myší poměr sérového IgG k IgM výhodně přibližně 10:1. Poměr IgG k IgM bude u nezralých myší mnohem nižší. Obecně, více než přibližně 10%, výhodně 40 až 80% B-lymfocytů sleziny a mízních uzlin exprimuje výlučně lidský IgG protein.

Repertoár se výhodně bude blížit repertoáru non-transgenní myši, obvykle alespoň z přibližně 10%, výhodně z 25 až 50% nebo více. Obecně bude produkováno alespoň přibližně tisíc různých imunoglobulinů (ideálně IgG), výhodně 10⁴ až 10⁶ nebo více, v závislosti primárně na počtu různých V, J a D regionů vložených do myšího genomu. Tyto imunoglobuliny budou obvykle rozpoznávat přibližně polovinu nebo více vysoce antigenních proteinů, např. staphylokokový protein A. Obvykle budou imunoglobuliny vykazovat afinitu pro předem vybrané antigeny alespoň přibližně 10⁷M^_1, výhodně alespoň přibližně 10⁹ M^_1, výhodněji alespoň přibližně ΙΟ¹⁰ Μ^-1 , 10¹¹ M^_1, 10¹²M^_1 nebo vyšší, například až do 10¹³M^_1 nebo vyšší.

V některých provedeních může být může být výhodné připravit myši s předem určeným repertoárem, aby se limitovala selekce V genů podílejících se na protilátkové reakci k předem určenému typu antigenu. Transgen pro těžký řetězec mající předem určený repertoár může obsahovat, například lidské VH geny, které jsou přednostně použity v protilátkové reakci na ·« *· • · · • · · · · • 4 9

4444

9

994 4 4444 4 9 předem určený typ antigenu u člověka. Alternativně mohou být některé VH geny z různých důvodů vyloučeny z definovaného repertoáru (např. mohou mít nízkou pravděpodobnost kódování V regionů s vysokou afinitou pro předem určený antigen; mají nízkou pravděpodobnost toho, že by v nich proběhly somatické mutace a zvýšení afinity; nebo jsou imunogenní pro některé lidi). Před přeskupením transgenu obsahujícího různé genové segmenty těžkého a lehkého řetězce mohou být takové genové segmenty snadno identifikovány, například hybridizací nebo DNA sekvenováním, jako sekvence z jiného organismu než je transgenní zvíře.

Transgenní myš podle předkládaného vynálezu může být imunizována přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR, jak bylo popsáno výše. Myš bude produkovat B-lymfocyty, u kterých bude docházet k přesmyku tříd díky intratransgenové přesmykové rekombinaci (cis-přesmyku) a bude exprimovat imunoglobuliny reaktivní s EGFR. Imunoglobuliny mohou být lidské sekvence, ve kterých jsou polypeptidy těžkého a lehkého řetězce kódované lidskými transgenovými sekvencemi, které mohou zahrnovat sekvence vzniklé somatickou mutací a rekombinatní spojení V regionu, stejně jako zárodečné sekvence; tyto lidské sekvence imunoglobulinů mohou být označovány jako v podstatě identické s polypeptidovými sekvencemi kódovanými lidskými V_L nebo V_H genovými segmenty a lidskými J_L nebo J_L segmenty, i když mohou být přítomny další non-zárodečné sekvence, v důsledku somatických mutací a různých rekombinačních spojení V-J a V-DJ. Pro takové lidské sekvence protilátek platí, že variabilní regiony každého řetězce jsou typicky alespoň z 80% kódované lidskými zárodečnými V, J, a, v případě těžkých řetězců, D genovými segmenty; často je alespoň 85% variabilních regionů kódováno lidskou zárodečnou sekvencí přítomnou na transgenu;

44 ·♦ · 44 f

4 4 4 4 4 4 4 4 • · · ·· · · · 4 4 4 4 4 • 4 4 · · · 4444444 4 44 4 4

4444 44 4 4 4 4

44 44 4 44 4 často je alespoň 90-95% variabilních regionů kódováno lidskou zárodečnou sekvencí přítomnou na transgenu. Nicméně, protože jsou non-zárodečné sekvence vloženy somatickými mutacemi a VJ a VDJ spojením, obsahují lidské sekvence protilátky často určité variabilní regiony (a méně často konstantní regiony), které nejsou kódované lidskými V, D nebo J genovými segmenty, jak se vyskytují v lidských transgenech u zárodečných myší. Typicky se takové non-zárodečné sekvence (nebo jednotlivé nukleotidové pozice) seskupují v nebo poblíž CDR, nebo v regionech, o kterých je známo, že se somatické mutace seskupuj i.

Lidské sekvence protilátky, které se váží na předem určený antigen, mohou vznikat v důsledku přesmyku izotypů, při kterém jsou produkovány lidské protilátky obsahující lidský γ řetězec (jako je yl, y2a, γ2Β nebo γ3) a lidský lehký řetězec (jako je K). Takové lidské protilátky s přesmykem izotypu často obsahují jednu nebo více somatických mutací, obvykle ve variabilním regionu a často v nebo v rámci 10 zbytků CDR, jako výsledek afinitní maturace a selekce B-lymfocytů antigenem, zejména po sekundární (nebo následné) imunizaci antigenem.

Tyto vysoce-afinitní lidské sekvence protilátky mohou mít vazebné afinity alespoň lxlO⁹ M^_1, typicky alespoň 5xlO¹⁰ M”¹, často více než lxlO¹⁰ M^_1, a někdy 5xlO¹⁰ M”¹ až 1x10^1:lM^_1 nebo vyšší.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká B-lymfocytů od takových myší, které mohou být použity pro generování hybridomů exprimujících lidské monoklonální protilátky, které se váží s vysokou afinitou (např. vyšší než 2xl0⁹ M^-1) na EGFR. V jiném provedení předkládaného vynálezu jsou tyto hybridomy použity pro přípravu prostředku obsahujícího imunoglobulin mající afinitní konstantu (K_A) alespoň 2xlO⁹M^_1 pro vazbu na ·· 00 00 0 00 0 » » » 000 000

0 000 0 000 0 000 • 9 9 999 »000000 00000

C7 0000 00 0 00 0

JI 9999 999 999

EGFR, kde uvedený imunoglobulin obsahuje:

lidskou sekvenci pro lehký řetězec složenou z (1) variabilního regionu lehkého řetězce majícího polypeptidovou sekvenci, která jev podstatě identická jako polypeptidová sekvence kódovaná lidským V_L genovým segmentem a lidským J_L segmentem, a (2) konstantního regionu lehkého řetězce majícího polypeptidovou sekvenci, která je v podstatě identická s polypeptidovou sekvencí kódovanou lidským C_L genovým segmentem; a lidskou sekvenci pro těžký řetězec složenou z (1) variabilního regionu těžkého řetězce majícího polypeptidovou sekvenci, která jev podstatě identická jako polypeptidová sekvence kódovaná lidským V_H genovým segmentem, volitelně D regionem a lidským J_H segmentem, a (2) konstantního regionu majícího polypeptidovou sekvenci, která je v podstatě identická s polypeptidovou sekvencí kódovanou lidským C_H genovým segmentem.

Vývoj lidské monoklonální protilátky proti EGFR s vysokou afinitou je usnadněn způsobem pro expandování repertoáru genových segmentů pro lidský variabilní region v transgenních myších majících genom obsahující integrovaný lidský imunoglobulinový transgen, kde uvedený vývoj zahrnuje vložení (dp genomu) V genového transgenu obsahujícího genové segmenty pro V region, které nejsou přítomny v uvedeném integrovaném lidském imunoglobulinovém transgenu. Často je transgen pro V region kvasinkový artificiální chromosom obsahující část sestavy genových segmentů pro lidský V_H nebo V_L (V_K), jak se přirozeně vyskytují v lidském genomu nebo jak mohou být sestřiženy pomocí rekombinantních metod, které mohou zahrnovat mimořádné nebo vynechané V segmenty. Často je v YAC obsaženo alespoň pět nebo více V genových segmentů. V této variantě je možné připravit transgenní myš produkovanou metodou expanze • 9

V repertoáru, kde myš exprimuje imunoglobulinový řetězec obsahující sekvenci variabilního regionu kódovanou genovými segmenty V regionu přítomnými na transgenu pro V region a C region kódovaný transgenem pro lidský Ig. Za použití metody expanze V repertoáru mohou být připraveny myši mající alespoň pět odlišných V genů; stejně tak mohou myši obsahovat alespoň 24 V genů nebo více. Některé V genové segmenty mohou být nefunkční (například pseudogeny a podobně); tyto segmenty mohou být zachovány nebo mohou být selektivně deletovány rekombinantními způsoby známými v oboru, pokud je to žádoucí.

Jakmile se myší zárodky upraví tak, aby obsahovaly funkční YAC mající expandovaný repertoár pro V segment, který v podstatě není přítomen v lidském Ig transgenu obsahujícím J a C genové segmenty, může být tento rys propagován a křížen do jiného genetického pozadí, včetně takového pozadí, kde je funkční YAC s expandovaným repertoárem V segmentu křížen do zárodků myší majících jiný lidský Ig transgen. Více funkčních YAC majících expandovaný repertoár pro V segment může být kříženo do zárodků tak, aby spolupracovaly s lidským Ig transgenem (nebo s více lidskými Ig transgeny). Ačkoliv jsou zde označovány jako YAC transgeny, mohou takové transgeny, jsou-li integrovány do genomu, v podstatě neobsahovat kvasinkové sekvence, jako jsou sekvence nutné pro autonomní replikaci ve kvasinkách; takové sekvence mohou být případně odstraněny metodami genetického inženýrství (například restrikčním trávením a gelovou elektroforesou v pulsním poli nebo jinou vhodnou metodou) poté, co není replikace ve kvasinkách nadále nutná (tj. před vnesením do myších ES buněk nebo myších prozygotů). Mezi způsoby pro propagování rysu exprese lidské imunoglobulinové sekvence zahrnují křížení transgenní myši mající lidský Ig transgen, a případně také mající funkční YAC s expandovaným repertoárem pro V segment.

4· *

94 »·

4*9 94 • 4 494 4 4

4 4 4 4 · 4

4 4 4 9 4

94 9«

4 4 • 4 4 4

4 4449«

4 9 9

44 9 • 4 • 44 4

Na YAC mohou být přítomny jak V_H, tak V_L. Transgenní myši mohou být kříženy do jakéhokoliv pozadí požadovaného výzkumníkem, včetně genetického pozadí nesoucího jiné lidské transgeny, včetně lidských Ig transgenů a/nebo transgenů kódujících jiné lidské lymfocytární proteiny. Vynález také poskytuje lidské imunoglobulinové sekvence s vysokou afinitou produkované transgenní myší mající YAC transgen s expandovaným repertoárem pro V region. Ačkoliv byl uveden popsV výhodných transgenních zvířat podle předkládaného vynálezu, existují i další provedení, která lze rozdělit do čtyř kategorií:

I. Transgenní zvířata obsahující nerearanžovaný těžký a rearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen;

II. Transgenní zvířata obsahující nerearanžovaný těžký a nerearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen;

III. Transgenní zvířata obsahující rearanžovaný těžký a nerearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen; a

IV. Transgenní zvířata obsahující rearanžovaný těžký a rearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen.

Z těchto kategorií jsou transgenní zvířata výhodná v následujícím pořadí: II > I > III > IV, když jsou endogenní geny pro lehký řetězec (nebo alespoň K gen) vyřazené homologní rekombinací (nebo jinou metodou) a I > II > III >

IV, když nejsou endogenní geny pro lehký řetězec vyřazeny a musí být dominovány alelickým vyloučením.

III. Bispecifické/ Multispecifické molekuly, které se váží na EGFR

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu mohou být lidské monoklonálni protilátky k EGFR, nebo jejich vazebné části pro antigen, derivatizovány nebo navázány na jinou funkční molekulu, např. jiný peptid nebo protein (např. Fab' • ft ftft ft · ♦ » · ··· ft · · · ft · · ft • ft ·· ·* ft ·· ft r · ft · · · ft ··· * · · · ft · · ··«· ft ft · «··« • · · · 9 · • ft ft ftft ft fragment) za zisku bispecifické nebo multispecifické molekuly, které se váže na více vazebných míst nebo cílových epitopů. Například, protilátky nebo vazebná část pro antigen podle předkládaného vynálezu mohou být funkčně navázány (např. chemickou vazbou, genetickou fúzí, nekovalentní asociací nebo jinak) na jednu nebo více jiných vazebných molekul, jako je jiná protilátka, fragment protilátky, peptid nebo vazebné mimetikům.

V souladu s tím vynález zahrnuje bispecifické a multispecifické molekuly obsahující alespoň jednu první vazebnou specificitu pro EGFR a druhou vazebnou specificitu pro druhý cílový epitop. V konkrétním provedení podle předkládaného vynálezu je druhým cílovým epitopem Fc receptor, např. lidský FcyRI (CD64) nebo lidský Fca receptor (CD89).

Proto vynález zahrnuje bispecifické a multispecifické molekuly schopné vazby na efektorové buňky exprimující FcyR, FcaR nebo FceR (např. monocyty, makrofágy nebo polymorfonukleární buňky (PMN)), a na cílové buňky exprimující EGFR. Tyto bispecifické a multispecifické molekuly cílí efektorové buňky na EGFR exprimující buňky a - jako lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu - spouští Fc receptorem zprostředkované aktivity efektorových buněk, jako je fagocytosa EGFR exprimujících buněk, buněčná cytotoxicita zprostředkovaná protilátkami (ADCC), uvolňování cytokinů nebo generování superoxidového aniontu.

Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat třetí vazebnou specificitu, kromě anti-Fc vazebné specificity a anti-EGFR vazebné specificity. V jednom provedení je třetí skupinou se specifickou vazbou „anti-enhancement faktor (EF), např. molekula, která se váže na povrchový protein podílející se na ·· · · φφφ ··· • · · φφφ · · · • φφφφ φ ··· φ ··· • · · φ · φ φ φφφφ φ φ φ φφφφ £1 φφφφ······

D1 ΦΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ cytotoxické aktivitě, a tak se zvyšuje imunitní reakce proti cílovým buňkám. „Anti-enhancement faktorem může být protilátka, funkční protilátkový fragment nebo ligand, který se váže na danou molekulu, např. antigen nebo receptor, což vede k zesíleni účinku vazebných determinant pro Fc receptori nebo antigen cílových buněk. „Anti-enhancement faktor se může vázat na Fc receptor nebo antigen cílové buňky. Alternativně se „anti-enhancement faktor může vázat na entitu jinou než je entita, na kterou se váží první a druhá skupina určující vazebnou specificitu. Například se „anti-enhancement faktor může vázat na cytotoxické T-lymfocyty (např. cestou CD2, CD3,

CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1; nebo na jiné buňky imunitního systému, které vedou k vyšší imunitní reakci proti cílovým buňkám).

i

V jednom provedení obsahují bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu jako vazebnou specificitu alespoň jednu protilátku nebo fragment protilátky, včetně např. Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, nebo a jednořetězcových Fv. Protilátkou může být také dimer lehkých řetězců nebo těžkých řetězců, nebo jakýkoliv jejich minimální fragment, jako je Fv nebo jednořetězcový konstrukt, jak je popsán v Ladner et al.^U.S. patent č. 4,946,778, udělený 7.8.1990, jehož obsj//) je zde uveden jako odkaz.

V jednom provedení obsahují bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu vazebnou specificitu pro FcyR nebo FcaR přítomný na povrchu efektorových buněk, a druhou vazebnou specificitu pro antigen cílových buněk, např. EGFR.

V jednom provedení je vazebná specificita pro Fc receptor dodána lidskou monoklonální protilátkou, jejíž vazba není blokována lidským imunoglobulinem G (IgG). Jak je zde použit, • · • · · · ···· ·· · · Ο Z 99 9 9 9 9 9 4 označuje termín IgG receptor jakýkoliv z osmi genů pro yřetězec umístěný na chromosomu 1. Tyto geny kódují celkem dvanáct isoforem transmembránových nebo solubilních receptorů, které se dělí do tří tříd Fcy receptoru: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) a FcyRIII (CD16). V jednom výhodném provedení je Fcy receptorem a lidský vysoce afinitní FcyRI. Lidský FcyRI je 72 kDa molekula, která vykazuje vysokou afinitu pro monomerní IgG (10⁸-10⁹ M'¹) .

Produkce a charakterizace těchto výhodných monoklonálních Protilátek je popsána v Fanger et al., PCT přihláška WO 88/00052 a U.S. Patent č. 4,954,617, které jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti. Tyto protilátky se váží na epitop FcyRI, FcyRII nebo FcyRIII v místě, které je odlišné od Fcy vazebného místa receptoru a proto není jejich vazba blokována fyziologickými koncentracemi IgG. Specifické anti-FcyRI protilátky použitelné v předkládaném vynálezu jsou MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 a MAb 197. Hybridom produkující MAb 32 je dostupný z American Type Culture Collection, ATCC přírůstkové č. HB94 69. Anti-FcyRI MAb 22, F(ab')₂ fragmenty MAb 22, mohou být získány od Medarex, lne. (Annandale, N.J.). V jiných provedeních je protilátkou k Fcy receptoru humanizovaná forma monoklonální protilátky 22 (H22). Produkce a charakterizace H22 protilátky je popsána v Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 a PCT/US93/10384. Buněčné linie produkující H22 protilátky byly uloženy v American Type Culture Collection 4.11.1992 pod číslem HA022CL1 a mají přírůstkové č. CRL 11177.

V jiných výhodných provedeních je vazebná specificita pro Fc receptor dodána protilátkou, která se váže na lidský IgA receptor, např. Fc-alfa receptor (FcaRI (CD89)), kde tato • · • · · • φφφφ · φφφ · φφφ • · · · · · · ···· φ · φ φφφφ «· ·· ·· · ·· · vazba výhodně není blokována lidským imunoglobulinem A (IgA).

Termín IgA receptor označuje genový produkt jednoho a-genu (FcaRI) umístěného na chromosomu 19. Je známo, že tento gen kóduje několik alternativně sestřižených transmembránových isoforem velikosti 55 až 110 kDa. FcaRI (CD89) je konstitutivně exprimován na monocytech/makrofágách, eosinofilních a neutrofilních granulocytech, ale ne na nonefektorových buňkách. FcaRI má střední afinitu (5 x 10⁷ M“¹) pro IgAl a IgA2, která se zvyšuje po expozici cytokinům, jako je G-CSF nebo GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical

Reviews in Imunology 16:423-440). Byly popsány čtyři FcaRIspecifické monoklonální protilátky, označované jako A3, A59, A62 a A77, které se váží na FcaRI mimo IgA ligandovou vazebnou doménu (Monteiro, R.C. et al., 1992, J. Imunol.

148:1764).

FcaRI a FcyRI jsou výhodnými spouštěcími receptory pro použití v předkládaném vynálezu, protože jsou (1) exprimovány primárně na imunitních efektorových buňkách, např. monocytech,

PMN, makrofágách a dendritických buňkách; (2) exprimovány ve vysokých koncentracích (např., 5,000-100,000 na buňku); (3) mediátory cytotoxických aktivit (např., ADCC, fagocytosy); (4) zprostředkují zvýšenou antigenní prezentaci antigenu, včetně vlastních antigenu, které jsou s nimy spojeny.

V dalších provedeních bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu dále obsahují vazebnou specificitu, která rozpoznává, například váže se na, antigen cílových buněk, např. EGFR. Ve výhodném provedení je vazebná specificita dodána lidskou monoklonální protilátkou podle předkládaného vynálezu.

• · • · ··· · · · · · · • ···· · ··· · · · · • ·· · · · ·····♦· ···· *··*·· ·· · ·· ·

Protilátky specifické pro efektorové buňky jsou protilátky nebo funkční protilátkové fragmenty, které se váží na Fc receptor efektorových buněk. Výhodné protilátky pro použití v předkládaném vynálezu se váží na Fc receptor efektorových buněk v místě, ve kterém se neváže endogenní imunoglobulin.

Jak je zde použit, označuje termín efektorová buňka buňku imunitního systému, která se podílý na efektorové fázi imunitní reakce, a nikoliv na rozpoznávací a aktivační fázi imunitní reakce. Příklady imunitních buněk jsou buňky myeloidního nebo lymfoidního původu, např. lymfocyty (např., B-lymfocyty a T-lymfocyty, včetně cytolytických T lymfocytů (CTL)), zabíječské buňky, přirození zabíječi, makrofágy, monocyty, eosinofily, neutrofily, polymorfonukleární buňky, granulocyty, žírné buňky a basofily. Některé efektorové buňky exprimují specifické Fc receptory a provádějí specifické imunitní funkce. Ve výhodném provedení je efektorová buňka schopna indukovat buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC), např. se jedná o neutrofil schopný indukovat ADCC. Například, monocyty, makrofágy, které exprimují FcR, se podílejí na specifickém zabíjení cílových buněk a na prezentování antigenů dalším složkám imunitního systému, nebo na vazbě na buňky, které prezentují antigeny. Ve výhodném provedení může efektorová buňka fagocytovat cílový antigen, cílovou buňku nebo mikroorganismus. Exprese konkrétního FcR na efektorové buňce může být regulována humorálními faktory, jako jsou cytokiny. Například bylo zjištěno, že exprese FcyRI je zvyšována interferonem gamma (IFN-γ) . Tato zvýšená exprese zvyšuje cytotoxickou aktivitu Buněk nesoucích FcyRI proti cílům. Efektorová buňka může fagocytovat nebo lyžovat cílový antigen nebo cílovou buňku.

• ·

Cílová buňka by měla být jakákoliv nežádoucí buňka u jedince (např. člověka nebo zvířete), která může být cíleně ovlivněna prostředkem (např. lidskou monoklonální protilátkou, bispecifickou nebo multispecifickou molekulou) podle předkládaného vynálezu. Ve výhodných provedeních je cílovou buňkou buňka exprimující nebo nadměrně exprimující EGFR. Mezi buňky exprimující EGFR typicky patří nádorové buňky, jako jsou buňka nádorů močového měchýře, prsu, střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, ledvin, spinocelulárních karcinomů, plic (nemalobuněčných) a nádorů hlavy a krku. Dalšími EGFRexprimujícími buňkami jsou synoviální fibroblasty a keratinocyty, které mohou být použity jako cíle při léčbě artritidy a psoriasy, v příslušném pořadí.

Ačkoliv jsou lidské monoklonální protilátky preferovány, jsou dalšími protilátkami, které mohou být použity v bispecifických nebo multispecifických molekulách podle předkládaného vynálezu myší, chimérické a humanizované monoklonální protilátky.

Chimérické myší-lidské monoklonální protilátky (t.j ., chimérické protilátky) mohou být produkovány rekombinantními DNA technikami známými v oboru. Například, gen kódující Fc konstantní region myší (nebo jiného druhu) monoklonální protilátky se tráví restrikčními enzymy pro odstranění regionu kódujícího myší Fc, a substituuje se ekvivalentní část genu kódující lidský Fc konstantní region. (Viz Robinson et al., Mezinárodní patentová přihláška PCT/US86/02269; Akira, et al., Evropská patentová přihláška 184,187; Taniguchi, Μ., Evropská patentová přihláška 171,496; Morrison et al., Evropská patentová přihláška 173,494; Neuberger et al., Mezinárodní patentová přihláška WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent č. 4,816,567; Cabilly et al., Evropská patentová přihláška • · • A • A A • · · A · A A · · ·

AAA A AAAA A A A AAA* 66 ···· ·· · ·· ·

125,023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Imunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nátuře 3 14:446-449; a Shaw et al., 1988, J. Nati. Cancer Inst.

80:1553-1559).

Chimérické protilátky mohou být dále humanizované nahrazením sekvence Fv variabilního regionu, které se přímo nepodílejí na vazbě antigenu, ekvivalentními sekvencemi z lidských Fv variabilních regionů. Obecný přehled humanizovaných chimérických protilátek je uveden v Morrison,

S. L., 1985, Science 229:1202-1207 a v Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214. Mezi takové metody patří izolování, manipulace a exprese sekvencí nukleové kyseliny, které kódují celé nebo části imunoglobulinových Fv variabilních regionů z alespoň jednoho těžkého nebo lehkého řetězce. Zdroje takové nukleové kyseliny jsou dobře známé odborníkům v oboru a mohou být získány například ze 7E3, hybridomu produkujícího antiGPII_bIII_a protilátky. Rekombinantní DNA kódující chimérické protilátky, nebo její fragment, může být potom klonována do vhodných expresních vektorů. Vhodné humanizované protilátky mohou být alternativně produkovány CDR substitucí podle U.S.

Patentu 5,225,539; Jones et al. 1986 Nátuře 321:552-525;

Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; a Beidler et al. 1988 J. Imunol. 141:4053-4060.

Všechny CDR konkrétní lidské protilátky mohou být nahrazeny alespoň částí non-lidského CDR nebo mohou být pouze některé CDR nahrazeny non-lidskými CDR. Je nezbytné nahradit ty CDR. Které jsou nutné pro vazbu humanizované protilátky na Fc receptor.

• ·

Protilátky mohou být humanizované jakýmkoliv způsobem,který nahrazuje alespoň část CDR lidské protilátky CDR z non-lidské protilátky. Winter popisuje způsob, který může být použit pro přípravu humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu (UK Patentová přihláška GB 2188638A, podaná 26.3.1987), jejíž obsah je zde uveden jako odkaz.

Lidské CDR mohou být nahrazeny non-lidskými CDR za použití oligonukleotídy místně cílené mutagenese, jak je popsána v Mezinárodní přihlášce WO 94/10332 nazvané Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes.

Předkládaný vynález také zahrnuje chimérické a humanizované protilátky, ve kterých byly specifické aminokyseliny substituovány, deletovány nebo přidány. Konkrétně, výhodné humanizované protilátky mají aminokyselinové substituce v regionu pracovního rámce, například za účelem zlepšení vazby na antigen. Například v humanizované protilátce mající myší CDR mohou být aminokyseliny umístěné v lidském regionu pracovního rámce nahrazeny aminokyselinami umístěnými v příslušných pozicích myší protilátky. Je známo, že takové substituce zlepšují v některých případech vazbu humanizovaných protilátek na antigen. Protilátky, ve kterých byly aminokyseliny přidány, deletovány nebo substituovány, jsou zde označované jako modifikované protilátky nebo alterované protilátky.

Termín modifikované protilátky také zahrnuje protilátky, jako jsou monoklonální protilátky, chimérické protilátky a humanizované protilátky, které byly modifikovány např. delecí, přidáním nebo substitucí částí protilátky. Například může být protilátka modifikovaná deletováním konstantního regionu a jeho nahrazením konstantním regionem určeným ke zvýšení φφ φφ • · · φ φφφφ • φ · φ · φφφ • · · φ φ · »

ΦΦΦΦ· · · poločasu, například sérového poločasu, stability nebo afinity protilátky. Jakákoliv modifikace spadá do rozsahu předkládaného vynálezu, pokud má bispecifická a multispecifická molekula alespoň jeden region vážící antigen specifický pro FcyR a spouští alespoň jednu efektorovou funkci.

Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny za použití chemických technik (viz např., D. M. Kranz et al. (1981) Proč. Nati. Acad Sci. USA 78:5807), polydoma technik (viz U.S. Patent 4,474,893, Reading), nebo rekombinantních DNA technik.

Konkrétně, bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny konjugací skupin určujících vazebnou specificitu, například anti-FcR a antiEGFR vazebnou specificitu, za použití metod dobře známých v oboru a popsaných v příkladech provedení vynálezu.

Například, každá vazebnou specificitu určující skupina bispecifické a multispecifické molekuly může být připravena samostatně a potom mohou být tyto skupiny konjugovány na sebe navzájem. Když jsou skupinami určujícími vazebné specificity proteiny nebo peptidy, zak mohou být různá kondenzační nebo zesíťovací činidla použita pro kovalentní konjugaci. Příklady takových zesíťovacích činidel jsou protein A, karbodiimid, Nsukcinimidyl-S-acetylthioacetát (ŠATA), 5,5'dithiobis(kyselina 2-nitrobenzoová) (DTNB), ofenylendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát (SPDP), a sulfosukcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylát (sulfoSMCC) (viz např., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:8648). Dalšími metodami jsou metody popsané v Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83), a Glennie et al. (J. Immunol.

0 00 000 000

000 000 000

0000 0 000 0 000

0 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 000 rn 0000000 <0 0

00 00 0 0· · (1987) 139: 2367-2375). Výhodnými konjugačními činidly je

ŠATA a sulfo-SMCC, kde obě tato činidla jsou dostupná od

Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Když jsou skupinami určujícími vazebnou specificitu protilátky (např. dvě humanizované protilátky), tak mohou být konjugovány přes sulfhydrylovou vazbu C-konců pantových regionů dvou těžkých řetězců. V konkrétním výhodném provedení je pantový region modifikovaný tak, aby obsahoval náhodný počet sulfhydrylových zbytků, výhodně jeden, a tato modifikace je provedena před konjugací.

Alternativně mohou být skupiny určující vazebné specificity kódované stejným vektorem a mohou být exprimovány a sestavovány ve stejné hostitelské buňce. Tento způsob je zejména vhodná tehdy, když je bispecifickou a multispecifickou molekulou MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')₂ nebo ligand x Fab fúzní protein. Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu, např. bispecifické molekuly, mohou být jednořetězcové molekuly, jako jsou jednořetězcové bispecifické protilátky, jednořetězcové bispecifické molekuly obsahující jednu jednořetězcovou protilátku a skupinu určující vazbu, nebo jednořetězcové bispecifické molekuly obsahující dvě skupiny určující vazbu. Bispecifické a multispecifické molekuly mohou také být jednořetězcové molekuly nebo mohou obsahovat alespoň dvě jednořetězcové molekuly. Způsoby pro přípravu bi- a multspecifických molekul jsou popsány například v U.S. Patentu č. 5,260,203; U.S. Patentu č. 5,455,030; U.S. Patentu č. 4,881,175; U.S. Patentu č. 5,132,405; U.S. Patentu č. 5,091,513; U.S. Patentu č. 5,476,786; U.S. Patentu č.

5,013,653; U.S. Patentu č. 5,258,498; a U.S. Patentu č.

5,482,858.

4 • · 4

• · · 4 ·· 4 • · · · 444 • · 4 · ····· 4 4 44444

Vazby bispecifických a multispecifických molekul na jejich specifické cíle mohou být potvrzeny enzymovým imunosorbentním testem (ELISA), radioimunotestem (RIA), FACS analýzou a biotesty (např., inhibici růstu), nebo Western Blot testem. Každý z těchto testů obecně detekuje přítomnost komplexů protein-protilátka pomocí značeného činidla (např. protilátky) specifického pro daný komplex. Například, komplexy FcRprotilátka mohou být detekovány za použití např. protilátky nebo protilátkového fragmentu s navázaným enzymem, která rozpoznává a specificky se váže na komplexy protilátka-FcR. Alternativně mohou být komplexy detekovány za použití různých dalších imunotestů. Například mohou být protilátky radioaktivně značeny a potom použity v radioimunotestu (RIA) (viz, například, Weintraub, B., Principles of

Radioimunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, zde uvedeno jako odkaz). Radioaktivní izotop může být detekován za použití γ kamery nebo scintilačního počítače nebo autoradiograficky.

IV. Protilátkové konjugáty/imunotoxiny

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká lidské antiEGFR monoklonální protilátky, nebo jejího fragmentu, konjugované na terapeutickou skupinu, jako je cytotoxin, léčivo nebo a radioizotop. Při konjugování na cytotoxin jsou tyto protilátkové konjugáty označovány jako imunotoxiny. Cytotoxin nebo cytotoxické činidlo je jakékoliv činidlo, které je škodlivé pro buňky (např. zabíjí buňky). Příklady takových činidel jsou taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidiumbromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vincristin, vinblastin, kolchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracin-dion, mitoxantron, mithramycin, aktinomycin D, 1dehydrotestosteron, glukokortikoidy, prokain, tetrakain,

· • · lidokain, propranolol, puromycin a jejich analogy nebo homology. Mezi terapeutická činidla patří například antimetabolity (např.. methotrexát, 6-merkaptopurin, 6thioguanin, cytarabin, 5-fluorouracil, dakarbazin), alkylační činidla (např., mechlorethamin, thiotepa, chlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) a lomustin (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C a cisdichlorodiamin-platina(II) (DDP) cisplatina), anthracykliny (např. daunorubicin (dříve daunomycin) a doxorubicin), antibiotika (např. daktinomycin (dříve aktinomycin), bieomycin, mithramycin a anthramycin (AMC)), a antimitotická činidla (např. vincristin a vinblastin). Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou konjugovány na radioizotop, např. radioaktivní jód, za vzniku cytotoxických radiofarmak pro léčbu onemocnění souvisejících s EGFR, jako jsou nádory.

Protilátkové konjugáty podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro modifikování dané biologické reakce, a terapeutická skupina není omezena na klasické chemické terapeutické skupiny. Například může být terapeutickou skupinou protein nebo polypeptid mající požadovanou biologickou aktivitu. Mezi takové proteiny patří, například, enzymaticky aktivní toxiny, nebo jejich aktivní fragmenty, jako je abrin, ricin A, pseudomonadový exotoxin nebo difterický toxin; a proteiny, jako je tumor nekrosis faktor nebo interferon-γ; nebo modulátory biologické reakce, jako jsou například lymfokiny, interleukin-1 (IL—1), interleukin-2 (IL—2), interleukin-6 (IL—6), granulocytární-makrofágové kolonie stimulující faktor (GM-CSF), granulocytární kolonie stimulující faktor (G-CSF), nebo jiné růstové faktory.

Techniky pro konjugování takových terapeutických skupin na protilátky jsou dobře známé, viz např. Arnon et al., • · • · · ·

99 99 9 99

9 9 9 9 9 9 9

9999 9 999 9 9

99 999 9 9999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 9 99 9

Monoclonal Antibodies For Imunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), str. 243-56 (Alan R. Liss, lne. 1985);

Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, v Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), str. 623.-53 (Marcel Dekker, lne. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, v Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et at. (eds.), str. 475-506 (1985); Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), str. 303-16 (Academie Press 1985), a Thorpe et al., The

Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

V. Farmaceutické prostředky

V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje prostředek, např. farmaceutický prostředek, obsahující jednu nebo kombinaci lidských monoklonálních protilátek, nebo jejich vazebných částí pro antigen, podle předkládaného vynálezu, které jsou formulovány společně s farmaceuticky přijatelným nosičem. Ve výhodném provedení prostředek obsahuje kombinaci více (například dvou nebo více) izolovaných lidských protilátek nebo jejich vazebných částí pro antigen podle předkládaného vynálezu. Výhodně se každá protilátka nebo její vazebná část pro antigen v prostředku váže na jiný, předem vybraný epitop EGFR.

V jednom provedení jsou lidské anti-EGFR monoklonální protilátky mající komplementární aktivity použity v kombinaci, např. ve formě farmaceutického prostředku obsahujícího dvě

4« 4

9 4

44

4 9

4 444

4

9 4

4 4 4

49444 4 9

4 4 4

4 4 4

4 4 44

4 4 nebo více lidské anti-EGFR monoklonální protilátky. Například, lidská monoklonální protilátka, která zprostředkuje vysoce účinné zabíjení cílových buněk za přítomnosti efektorových buněk, může být kombinována s jinou lidskou monoklonální protilátkou, která inhibuje růst buněk exprimujících EGFR.

V jiném provedení prostředek obsahuje jednu nebo více bispecifických nebo multispecifických molekul podle předkládaného vynálezu (např. které obsahují alespoň jednu vazebnou specificitu pro Fc receptor a alespoň jednu vazebnou specificitu pro EGFR).

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být také podány v kombinované terapii, tj. v kombinaci s jinými činidly. Například může kombinovaná terapie zahrnovat prostředek podle předkládaného vynálezu s alespoň jedním protinádorovým léčivem nebo jinou běžnou terapií.

Jak je zde použit, označuje termín farmaceuticky přijatelný nosič jakékoliv rozpouštědlo, disperzní medium, potah, antibakteriální a antimykotické činidlo, činidlo upravující izotonicitu a zpomalující absorpci, a podobně, které je fyziologicky kompatibilní. Výhodně je nosič vhodný pro intravenosní, intramuskulární, podkožní, parenterální, spinální nebo epidermální podání (např. injekcí nebo infusí). Podle způsobu podání může být aktivní sloučenina, t.j. protilátka, bispecifická a multispecifická molekula, potažena materiálem, který jí chrání před působením kyselin a jiných vlivů, které by mohly inaktivovat sloučeninu.

Farmaceuticky přijatelná sůl je sůl, která si zachovává požadovanou biologickou aktivitu a která nemá žádné nežádoucí toxické účinky (viz např. Berge, S.M., et al. (1977) J.

·« «» « » · · · • · ··· · · • · · · · · 9

9 9 9 9 4

4^ 94

4

4 4

4 4 4 ···· • · · · • ·· * • · ·· ··

Pharm. Sci. 66:1-19). Příklady takových solí jsou adiční soli s kyselinami a bázemi. Mezi adiční soli s kyselinami patří ty soli, které jsou získány z netoxickýxh anorganických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, dusičná, fosforečná, sírová, bromovodíková, jodovodíková, fosforitá a podobně, stejně jako z netoxických organických kyselin, jako jsou alifatické monoa dikarboxylové kyseliny, fenyl-substituované alkanové kyseliny, hydroxy alkanové kyseliny, aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny a podobně. Adiční soli s bázemi jsou soli získané z kovů alkalických zemin, jako je sodík, draslík, vápník a podobně, stejně jako soli z netoxických organických aminů, jako je N,N'dibenzylethylendiamin, N-methylglukamin, chlorprokain, cholin, diethanolamin, ethylen diamin, prokain a podobně.

Prostředek podle předkládaného vynálezu může být podán různými způsoby známými v oboru. Jak bude odborníkům v oboru jasné, způsob podání závisí na požadovaném výsledku. Aktivní sloučenina může být připravena s nosiči, které chrání sloučeninu před rychlým uvolněním, jak je tomu v přípravcích s řízeným uvolňováním, včetně implantátů, transdermálních náplastí a mikrokapslí. Biodegradovatelné, biokompatibilní polymery, jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná, mohou být také použity. Mnoho způsoby pro přípravu takových prostředků je známo v oboru a je patentováno. Viz, např., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, lne., New York, 1978.

Pro podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu některými způsoby podání může být nutné potáhnout sloučeninu nebo podat sloučeninu současně s materiálem, který brání inaktivaci sloučeniny. Například mohou být sloučeniny podány • · • 44 4 4 4 4 4 4

44·· · 4 4 · 4 44 • · · 4 4 4 4 ···· ·· 4 4 ······· · · ' J *··4 44 4 44 jedinci ve vhodném nosiči, například v liposomech nebo v ředidle. Mezi farmaceuticky přijatelná ředidla patří vodné pufrované roztoky. Mezi liposomy patří CGF emulze voda-voleji-ve-vodě, stejně jako běžné liposomy (Strejan et al.

(1984) J. Ne.ur o immunol. 7:27).

Mezi farmaceuticky přijatelné nosiče patří sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro okamžitou přípravu sterilních injekčních roztoků nebo disperzí. Použití takových medií a činidel pro farmaceuticky aktivní substance je známé v oboru. Pokud není běžné medium inkompatibilní s farmaceutickým činidlem, je jeho použití ve farmaceutickém prostředku podle předkládaného vynálezu možné. Prostředky mohou také obsahovat doplňkové aktivní sloučeniny.

Terapeutické prostředky musí být sterilní a stabilní při výrobě a skladování. Prostředek může být formulován jako roztok, mikroemulze, liposom, nebo jiná forma vhodná pro vysokou konctraci léku. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní medium obsahující, například, vodu, ethanol, polyol (například, glycerol, propylenglykol, kapalný polyethylenglykol a podobně), a jejich vhodné směsi. Vhodná tekutost může být dosažena pomocí použití potahovacích činidel, jako je lecitin, zachováním vhodné velikosti částic, v případě disperzí a pomocí použití surfaktantů. V mnoha případech může být výhodné v prostředcích použít činidla upravující isotonicitu, například sacharidy, polyalkoholy, jako je mannitol, sorbitol, nebo chlorid sodný. Prodloužené absorpce může být dosaženo tak, že se v prostředku použije činidlo oddalující absorpci, , například, monostearátové soli a želatina.

Sterilní injekční roztoky mohou být připraveny tak, že se ·· ·· · · · ·' • · · · · · · • * ··· · · · · · • ·· ··· ······· ···· ·· · ·

7o ·· ·· ·· * · aktivní sloučenina smísí v požadovaném množství s vhodným rozpouštědlem, společně s jedním nebo kombinací složek uvedených výše, a potom se provede sterilizace mikrofiltrací. Obecně, disperze se připraví inkorporaci aktivní sloučeniny do sterilního vehikula, které obsahuje základní disperzní medium a další přísady, jak byly uvedeny výše. V případě sterilních prášků pro přípravu sterilních injekčních roztoků je výhodným způsobem přípravy vakuové sušení a lyofilizace, které vedou k zisku práškové aktivní složky a dalších přísad ze sterilně přefiltrovaného roztoku.

Dávkovači protokoly jsou upraveny tak, aby vedly k optimální požadované odpovědi (například terapeutické odpovědi). Může být podána například jediná dávka, několik dávek za určitý čas, nebo může být dávka zvyšována a snižována podle aktuální klinické situace. Výhodné je připravit parenterální prostředky ve formě dávkových jednotek, čímž je podání snadné a jednotné. Termín dávková jednotka označuje fyzikálně diskrétní jednotku vhodnou pro podání jako jedna dávka jedinci; každá dávková jednotka obsahuje předem určené množství aktivní sloučeniny vypočtené pro produkci požadovaného terapeutického efektu, společně s vybraným farmaceutickým nosičem. Přesné parametry dávkových jednotek podle předkládaného vynálezu jsou určovány a přímo závisejí na (a) jedinečných charakteristikách aktivní sloučeniny a konkrétním terapeutickém efektu, který má být dosažen, a (b) omezeních souvisejících s přípravou lékových forem takové sloučeniny pro léčbu.

Příklady farmaceuticky přijatelných antioxidačních činidel jsou: (1) antioxidační činidla rozpustná ve vodě, jako je kyselina askorbová, cystein-hydrochlorid, natrium-bisulfát, natrium-metabisulfit, natrium-sulfit a podobně; (2) • · « ·

antioxidační činidla rozpustná v oleji, jako je ascorbylpalmitát, butylovaný hydroxyanisol (BHA), butylovaný hydroxytoluen (BHT), lecitin, propyl-gallát, α-tokoferol, a podobně; a (3) činidla chelatující kovy, jako je kyselina citrónová, kyselina ethylenediamintetraoctová (EDTA), sorbitol, kyselina vinná, kyselina fosforečná a podobně.

Pro terapeutické prostředky podle předkládaného vynálezu zahrnují ty prostředky, které jsou vhodné pro orální, nasální, lokální (včetně bukkálního a sublinguálního), rektální, vaginální a/nebo parenterální podání. Prostředky jsou výhodně ve formě dávkových jednotek a mohou být připraveny jakýmikoliv způsoby známými v oboru farmacie. Množství aktivní složky, které je kombinováno s nosičem pro jednu dávku, závisí na léčeném jedinci a konkrétním způsobu podání. Množství aktivní složky, které je kombinováno s nosičem pro jednu dávku, závisí na množství prostředku, které vede k dosažení terapeutického efektu. Obecně, v rozmezí 100% bude toto množství v rozsahu od přibližně 0,01% do přibližně 99% aktivní složky, výhodně od přibližně 0,1% do přibližně 70%, nejlépe od přibližně 1% do přibližně 30%.

Prostředky podle předkládaného vynálezu, které jsou vhodné pro vaginální podání, také zahrnují pesary, tampony, krémy, gely, pasty, pěny nebo spraye obsahující běžné v oboru používané nosiče. Dávkové formy pro lokální nebo transdermální podání prostředků podle předkládaného vynálezu zahrnují prášky, spraye, masti, pasty, krémy, lotia, gely, roztoky, náplasti a inhalační přípravky. Aktivní složka může být smísena za sterilních podmínek s farmaceuticky přijatelným nosičem a jakýmkoliv konzervačním činidlem, pufrem nebo hnacím plynem, který fuj?

• · ·· ♦·· ··· • · · · · · ··· • ···· · ··· 4 ··· « ·· · · · · · 4 4 4 4 « · · · · · ···· ··· ··*

Výraz parenterální podání a podán parenterálně, jak je zde použit, označuje způsoby podání jiné než enterální a lokální podání, obvykle podání injekcí, a označuje se takto intravenosní, intramuskulární, intraarteriální, intrathekální, intrakapsulární, intraorbitální, intrakardiální, intradermální, intraperitoneální, transtracheální, subkutánní, subkutikulární, intraartikulární, subkapsulární, subarachnoidální, intraspinální, epidurální a intrasternální injekci a infusi.

Příklady vhodných vodných a non-vodných nosičů, které mohou být použity ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou voda, ethanol, polyoly (jako je glycerol, propylenglykol, polyethylenglykol, a podobně), a jejich vhodné směsi, rostlinné oleje, jako je olivový olej, injekční organické estery, jako je ethyloleát. Správná tekutost může být dosažena pomocí použití potahových materiálů, jako je lecitin, dodržením správné velikosti částic v případě disperzí, a použitím surfaktantů.

Tyto prostředky mohou také obsahovat pomocná činidla, jako jsou konzervační činidla, smáčivá činidla, emulgační činidla a disperzní činidla. Prevence přítomnosti mikroorganismů může být zajištěna jak sterilizací, jak byla uvedena výše, tak použitím různých antibakteriálních a antimykotických činidel, například parabenu, chlorbutanolu, kyseliny fenol-sorbové, a podobně. Může být také žádoucí použít činidla upravující izotonicitu, jako jsou sacharidy, chlorid sodný a podobně. Prodloužené absorpce injekčních farmaceutických forem může být dosaženo pomocí činidel zpomalujících absorpci, jako je aluminium-monostearát a želatina.

Když jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu podány • · • ·

jako farmaceutická činidla člověku nebo zvířeti, tak mohou být podány samostatně nebo ve formě farmaceutického prostředku obsahujícího, například, 0,01 až 99,5% (výhodněji, 0,1 až 90%) aktivního činidla v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Bez ohledu na vybraný způsob podání jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které mohou být použity ve vhodně hydratované formě, a/nebo farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu, formulovány do farmaceuticky přijatelných dávkových forem za použití běžných způsobů známých odborníkům v oboru.

Skutečná množství aktivních složek ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu může být různé a je takové, aby se dosáhlo dávky aktivní složky, která je dostatečná pro dosažení terapeutické odpovědi pro konkrétního pacienta, prostředek, a způsob podání, bez toxických účinků pro pacienta. Vybraná dávka závisí na různých farmakokinetických faktorech, včetně aktivity konkrétního prostředku podle předkládaného vynálezu nebo jeho esteru, soli nebo amidu, způsobu podání, doby podání, rychlosti vylučování konkrétní použité sloučeniny, trvání léčby, dalších léčiv, sloučenin a/nebo materiálů použitých v kombinaci s použitým prostředkem, věku, pohlaví, stavu a předchozí anamnesy léčeného pacienta, a na podobných faktorech dobře známých v oboru.

Lékař nebo veterinář zkušený v oboru snadno určí a předepíše vhodnou dávku farmaceutického prostředku. Například může lékař nebo veterinář začít s dávkami sloučeniny podle předkládaného vynálezu ve farmaceutickém prostředku, které jsou nižší než dávky nutné pro dosažení požadovaného e · • * · · · · · · ·

4 · · · · · · · · 4 · · • 44 · · · 4444444 »«444 *··**·«’ *·» · ·» · terapeutického efektu a potom může postupně zvyšovat dávku, dokud není dosaženo terapeutického efektu. Obecně, vhodné denní dávky prostředku podle předkládaného vynálezu jsou takové dávky sloučeniny, které jsou nej nižšími dávkami vedoucími k dosažení terapeutického efektu. Takové účinné dávky obvykle závisí na faktorech popsaných výše. Je výhodné, aby bylo podání intravenosní, intramuskulární, intraperitoneální nebo podkožní, a výhodně se provede proximálně k cílovému místu. Pokud je to žádoucí, může být účinná denní dávka terapeutického prostředku podána ve formě dvou, tří, čtyř, pěti, šesti nebo více nižších dávek, které jsou podány samostatně ve vhodných intervalech během dne, volitelně ve formě dávkových jednotek. Ačkoliv je možné, aby byla sloučenina podle předkládaného vynálezu podána samostatně, je výhodné, aby byla podána ve formě farmaceutického prostředku.

Terapeutické prostředky mohou být podány za použití lékařských prostředků známých v oboru. Například, ve výhodném provedení může být terapeutický prostředek podle předkládaného vynálezu podán bezjehlovým přístrojem pro hypodermickou injekci, jako je prostředek popsaný v U.S. Patentech č.

5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880;

4,790,824; nebo 4,596,556. Příklady implantátů a modulů použitelných v předkládaném vynálezu jsou: U.S. Patent č.

4,487,603, který popisuje implantovatelné mikroinfusní pumpy pro podání léčiv řízeným způsobem; U.S. Patent č. 4,486,194, který popisuje terapeutický přístroj pro podání léčiv skrz kůži; U.S. Patent č. 4,447,233, který popisuje infusní pumpu pro podání léčiv přesnou rychlostí infuse; U.S. Patent č.

4,447,224, který popisuje implantovatelný infusní přístroj s variabilní rychlostí infuse pro kontinuální podávání léčiv;

U.S. Patent č. 4,439,196, který popisuje systém pro osmotické a · • · · · · * · · * • · · a· · · · · » · · · » · ··· ·····»· · ···* ”··*’<·’ a · ·♦ * podávání léčiv mající multi-komůrkové kompartmenty; a U.S.

Patent č. 4,475,196, který popisuje systém pro osmotické podání léčiv. Tyto patenty jsou zde uvedeny jako odkazy.

V oboru je známo mnoho dalších takových implantátů, systému pro aplikaci a modulů.

V některých provedeních mohou být lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu připraveny tak, aby byla zajištěna jejich správná distribuce in vivo. Například, hematoencephalická bariéra nepropouští mnoho hydrofilních sloučenin. Pro zajištění toho, aby terapeutické sloučeniny podle předkládaného vynálezu procházely hematoencephalickou bariérou (pokud je to žádoucí), mohou být formulovány například v liposomech. Pro způsoby přípravy liposomů viz např. U.S. Patenty 4,522,811; 5,374,548; a 5,399,331. Liposomy mohou obsahovat jednu nebo více skupin, které jsou selektivně transportovány do specifických buněk nebo orgánů, což může zlepšit cílené podání léků (viz, např., V.V. Ranade (1989) J.

Clin. Pharmacol. 29:685). Příklady skupin určujících specificitu jsou například folát nebo biotin (viz, např., U.S. Patent 5,416,016; Low et al.); mannosidy (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); protilátky (P.O. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180);

surfaktantový protein A receptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), a prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat různé typy těchto skupin, stejně jako je mohou obsahovat molekuly podle předkládaného vynálezu; pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); viz též K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Left. 346:123; J.J.

Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. V jednom provedení předkládaného vynálezu, jsou terapeutické sloučeniny podle předkládaného vynálezu formulovány v liposomech; ve • · ·· · · · · * ♦ • · · · · · · · · • ft · · · · ··· · ··· • 9 · ··· »······ ftftftftft

·..··..· ·..· : ·..* :

výhodnějším provedení liposomy obsahují skupinu způsobující cílené podání. V nejvýhodnějším provedení jsou terapeutické sloučeniny v liposomech podány bolusovou injekcí do místa proximálně od nádoru nebo od infekce. Prostředek musí být dostatečné tekutý, aby ho bylo možno snadno podat injekcí.

Musí být také stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněn před kontaminujícími účinky mikroorganismů, jako jsou bakterie a houby.

Terapeuticky účinná dávka výhodně inhibuje růst nádorů o alespoň přibližně 20%, výhodněji o alespoň přibližně 40%, ještě výhodněji o alespoň přibližně 60%, a nejvýhodněji o alespoň přibližně 80%, ve srovnání s neléčeným jedincem.

Schopnost sloučeniny inhibovat nádory může být hodnocena na zvířecím modelu určujícím účinnost na lidské nádory.

Alternativně může být tato vlastnost prostředku hodnocena testováním schopnosti sloučeniny inhibovat růst nádorů, kde takové in vitro testy jsou známé odborníkům v oboru.

Terapeuticky účinné množství terapeutické sloučeniny může zmenšovat velikost nádoru nebo může jinak zlepšovat příznaky u jedince. Odborník v oboru bude schopen určit taková množství na základě faktorů jako je velikost jedince, závažnost příznaků u jedince a konkrétní typ prostředku nebo způsobu podání.

Prostředek musí být sterilní a dostatečně tekutý, aby bylo možno podat prostředek injekční stříkačkou. Kromě vody může být nosičem isotonický pufrovaný salinický roztok, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyetheylenglykol, a podobně), a jejich vhodné směsi. Správná tekutost může být dosažena pomocí použití potahů, jako je například lecithin, dodržováním požadované velikosti částic v případě disperzí a použitím surfaktantů. V mnoha případech • 9 ·

• · · ***** je vhodné použít činidlo upravující izotonicitu, jako jsou například sacharidy, polyalkoholy, jako je mannitol nebo sorbitol, a chlorid sodný. Prodloužené absorpce injekčního prostředku může být dosaženo tak, že se v prostředku použijí činidla prodlužující absorpci, například monostearát hlinitý nebo želatina.

Když je aktivní sloučenina vhodně chráněná, například způsobem popsaným výše, může být podána orálně, například v inertním ředidle nebo v jedlém nosiči.

VI. Použití a způsoby podle předkládaného vynálezu

Prostředky (např. lidské monoklonální protilátky k EGFR a jejich deriváty/konjugáty) podle předkládaného vynálezu mají in vitro a in vivo diagnostické a terapeutické použití. Například mohou být tyto molekuly podány buňkám v kultuře, např. in vitro nebo ex vivo, nebo jedinci, např. in vivo, pro léčbu, prevenci nebo diagnostiku různých onemocnění. Jak je zde použit, označuje termín jei^dnec člověka a zvířata jiná člověk. Výhodnými lidksými jedinci jsou pacienti s onemocněním charakterizovaným expresí, typicky aberantní expresí (např. nadměrnou expresí) EGFR. Například mohou být způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu použity pro léčbu jedince s nádorovým onemocněním, například onemocněním charakterizovaným přítomností nádorových buněk exprimujících EGFR, včetně buněk nádorů močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, spinocelulárních nádorů, nádorů plic (nemalobuněčných karcinomů) a nádorů hlavy a krku. Způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro léčbu jiných onemocnění, např. autoimunitních onemocnění, nádorů, psoriasy nebo zánětlivých artritid, například revmatoidní artritidy, artritidy spojené se

I φ φ · φ φ · · φφ φ ·· · • · φ · φ · φ φ « « · φ · φ φ * φ · φ φ φ φ φ φ · φ φ · φ · ♦ φ φ · systémovým lupus erythematodes nebo psoriatické artritidy.

Termín zvíře jiné než člověk podle předkládaného vynálezu označuje všechny obratlovce, například savce a ostatní obratlovce, jako jsou primáti, ovce, psi, krávy, kuřata, t

obojživelníci, plazi a podobně.

Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu mohou být nejprve testovány na vazebnou aktivitu asociovanou s terapeutickým nebo diagnostickým použitím in vitro. Například mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu testovány za použití ELISA a průtokové cytometrie, jak je popsáno v příkladech provedení vynálezu. Dále může být testována aktivita těchto molekul ve spouštění alespoň jedné aktivity efektorové buňky, včetně cytolýzy buněk exprimujících EGFR. Protokoly pro testování fagocytosy zprostředkované efektorovými buňkami jsou popsány dále v příkladech provedení vynálezu.

Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu jsou dále použitelné v terapii a diagnostice onemocnění souvisejících s EGFR. Například, lidské monoklonální protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly mohou být použity in vivo nebo in vitro pro vyvolání jedné nebo více z následujících biologických aktivit: opsonizace buněk exprimujících EGFR; zprostředkování fagocytosy nebo cytolýzy buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk; inhibice EGF nebo TGF-α indukované autofosforylace v buňkách exprimujících EGFR; inhibice autokrinní EGF nebo TGF-a-indukované aktivace buněk exprimujících EGFR; nebo inhibice růstu buněk exprimujících EGFR, např. při použití • ♦ • · • · » « · «» ·· 4 4-4 · • 49 949

9 9 4 4 9 9 4 « ····· · · · · · ·

4 4 4 9 4 · ·· ♦ nízkých dávek.

V jiném provedení jsou lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu neschopné indukovat komplementem zprostředkovanou lýzu buněk a proto mají méně nežádoucích účinků způsobených aktivací komplementu, jako je například akné. Primární příčinou akné je porucha keratinizace ve folikulu, který produkuje maz. Jelikož keratinocyty exprimují EGFR, může interference se EGFR signálnímy procesy v kůži alterovat růst a diferenciaci keratinocytů ve folikulech, což vede ke vzniku akné. Přímé imunofluorescenční testy prokázaly, že v časných zánětlivých a nezánětlivých lézích u akné je přítomná aktivace klasické a alternativní komplementové dráhy.

V konkrétním provedení jsou lidské protilátky a jejich deriváty použity in vivo pro léčbu, prevenci nebo diagnostiku různých onemocnění souvisejících s EGFR. Příklady onemocnění souvisejících s EGFR jsou různé nádory, včetně buněk nádorů močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníku, prostaty, spinocelulárních nádorů, nádorů plic (nemalobuněčných karcinomů) a nádorů hlavy a krku. Mezi další onemocnění související s EGFR patří autoimunitní onemocnění, psoriasa a zánětlivé artritidy.

Způsoby pro podání prostředků (např. lidských protilátek, multispecifických a bispecifických molekul) podle předkládaného vynálezu jsou známé v oboru. Vhodná dávka molekul závisí na věku a hmotnosti jedince, stejně jako na konkrétním použitém léku. Molekuly mohou být navázány na radionuklidy, jako je 1311, 90Y, 105Rh, atd., jak je popsáno v Goldenberg, D.M. et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360, a v EP 0365 997. Prostředky (např., lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného

4» • 4 4 • · ··· »4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4*44444 4444 «4 vynálezu mohou být navázány také na antiinfekční činidla.

V jiném provedení mohou být lidské anti-EGFR protilátky, nebo jejich antigen-vazebné fragmenty, podány současně s terapeutickým činidle, např. chemoterapeutickým činidlem, nebo mohou být podány současně s jinými známými technikami, např. protinádorové terapie, například s radioterapií. Mezi taková terapeutická činidla patří, například, antineoplastická činidla, jako je doxorubicin (adriamycin), cisplatina, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil, cyklofosfamid, hydroxyurea, které jsou při samostatném podání účinné pouze v dávkách, při kterých jsou toxická nebo subtoxická pro pacienta. Cisplatina se intravenosně podává v dávce 100 mg/m² jednou za čtyři týdny a adriamycin se intravenosně podává v dávce 60-75 mg/m² jednou za 21 dnů. Současné podání lidských anti-EGFR protilátek, nebo jejich antigen-vazebných fragmentů, podle předkládaného vynálezu, s chemoterapeutickými činidly, je podáním dvou protinádorových činidel, která působí různými mechanismy majícími cytotoxický efekt na lidské nádorové buňky. Takové současné podání řeší problémy vzniku resistence na léky nebo změny antigenicity nádorových buněk, které mohou způsobit nereaktivitu buněk s protilátkami.

Pro cíl specifické efektorové buňky, např. efektorové buňky navázané na prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu, mohou být také použity jako terapeutická činidla. Efektorovou buňkou může být lidský leukocyt, jako je makrofág, neutrofil nebo monocyt. Mezi další buňky patří eosinofily, přirození zabiječi a jiné buňky nesoucí IgG- nebo IgAreceptor. Pokud je to žádoucí, mohou být efektorové buňky získány od jedince, který je léčen. Pro cíl specifické efektorové buňky mohou být podány jako suspenze buněk ve

·· *

9 9 9

9 999

9 9

9 9 fyziologicky přijatelné roztoku. Počet podaných buněk je

9 999 9 9 9 9 · v rozmezí 10⁸-10⁹, ale liší se podle terapeutického účelu.

Obecně, množství bude dostatečné pro lokalizaci na cílových buňkách, např. nádorových buňkách exprimující EGFR, a pro dosažení účinného zabíjení buněk, např. fagocytosou. Způsoby podání mohou být také různé.

Terapie pro cíl specifickými efektorovými buňkami může být provedena současně s dalšími technikami pro odstranění cílových buněk. Například může být protinádorové terapie za použití prostředků (např.- lidských protilátek, multispecifických a bispecifických molekul) podle předkládaného vynálezu a/nebo efektorových buněk aktivovaných těmito prostředky použita společně s chemoterapií. Kombinovaná imunoterapie může být použita pro nasměrování dvou odlišných cytotoxickýxh efektorových populací na nádorové buňky. Například anti-EGFR protilátky navázané na anti-Fc-gammaRl nebo anti-CD3 mohou být použity společně s IgG- nebo IgAreceptor-specifickými vazebnými činidly.

Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro modulování FcaR nebo konctrací Fca na efektorových buňkách, například vazbou na nebo eliminací receptorů na povrchu buněk. Pro tento účel mohou být použity směsi anti-Fc receptorů.

Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu, které byly doplněny vazebnými místy, jako jsou části z IgGl, -2, nebo -3 nebo IgM, které váží komplement, mohou být použity za přítomnosti komplementu. V jednom provedení může být ex vivo ošetření populace buněk obsahující cílové buňky vazebným činidle podle předkládaného vynálezu a vhodnými efektorovými i: .

• 4 4 4 ♦

• * · • 4 ·4* • · · · 4 buňkami doplněno přidáním komplementu nebo séra obsahujícího komplement. Fagocytosa cílových buněk potažených vazebným činidlem podle předkládaného vynálezu může být zlepšena vazbou proteinů komplementu. V jiném provedení mohou být cílové buňky potažené prostředky (např. lidskými protilátkami, multispecifickými a bispecifickými molekulami) podle předkládaného vynálezu také lyžovány komplementem. V ještě jiném provedení neaktivují prostředky podle předkládaného vynálezu komplement.

Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu mohou být podány také s komplementem. V souladu s tím předkládaný vynález zahrnuje prostředky obsahující lidské protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly a sérum nebo komplement. Tyto prostředky jsou výhodné v tom, že komplement je přítomen v těsné blízkosti lidské protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly. Alternativně mohou být lidské protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu a komplement nebo sérum podány samostatně.

Předkládaný vynález také zahrnuje kity obsahující prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu a návod pro použití. Kit může dále obsahovat alespoň jedno další činidlo, jako je komplement, nebo jednu nebo více dalších lidských protilátek podle předkládaného vynálezu (např. lidské protilátky mající komplementární aktivity, které se váží na epitop EGFR antigenu, který je jiný než pro první lidskou protilátku).

V jiných provedeních může být jedinec dále léčen činidlem, • · • · · ·· ♦· ·· * • · · · · · • · ··# · · ♦ » • · · · · · · 4» · · • · · » · · « • · · # · · · které moduluje, např. zesiluje nebo inhibuje, expresi nebo aktivity Fcy nebo Fca receptorů, například může být jedinec léčen cytokinem. Výhodnými cytokiny pro podání během léčby multispecifickou molekulou je granulocytární koloniestimulující faktor (G-CSF), granulocytární-makrofágové kolonie-stimulující faktor (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) , a tumor nekrosis faktor (TNF).

V jiných provedeních může být jedinec dále léčen lymfokinovým přípravkem. Nádorové buňky, které nemají vysokou expresi EGFR, mohou být k expresi indukovány za použití lymfokinových přípravků. Lymfokinové přípravky mohou způsobit homogenější expresi EGFR v nádorvých buňkách, což může vést k účinnější terapii. Lymfokinové přípravky vhodné pro podání jsou například interferon-gamma, tumor nekrosis faktor, a jejich kombinace. Tyto přípravky mohou být podány intravenosně. Vhodné dávky lymfokinů jsou 10,000 až 1,000,000 j ednotek/pacienta.

Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro zaměření buněk exprimujících FcyR nebo EGFR, například za účelem značení takových buněk. Pro tento účel může být vazebné činidlo navázáno na molekulu, která může být detekována. Tak vynález poskytuje způsoby pro lokalizaci ex vivo nebo in vitro buněk exprimujících Fc receptory, jako je FcyR, nebo EGFR. Detekovatelným značkovacím činidlem může být například radioizotop, fluorescentní sloučenina, enzym nebo enzymový kofaktor.

V jednom provedení vynález poskytuje způsoby pro detekování přítomnosti EGFR antigenů ve vzorku, nebo pro měření množství EGFR antigenů, kde tyto způsoby zahrnují φφφφ φφφ φφ φ φφφ ♦ · φ φφφ φ φ φφφ φ φφ* φ φφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ * φ φ φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ · φφ · kontaktování vzorku s lidskou monoklonálni protilátkou, nebo jejími antigen-vazebnými částmi, které se specificky váží na EGFR, za podmínek umožňujících tvorbu komplexu mezi protilátkou nebo její částí a EGFR. Potom se detekuje tvorba komplexu a rozdíl ve tvorbě komplexu ve vzorku a v kontrolním vzorku ukazuje na přítomnost EGFR antigenů ve vzorku.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob pro detekci přítomnosti nebo kvantifikování množství Fc-exprimujících buněk in vivo nebo in vitro. Způsob zahrnuje (i) podání prostředku (např. multi- nebo bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu nebo jejího fragmentu, konjugovaného na detekovatelný markér; (ii) exponování jedince na zařízení umožňující detekování uvedeného detekovatelného markéru za účelem identifikace oblastí obsahujících Fc-exprimující buňky.

Předkládaný vynález bude dále ilustrován následujícími příklady, které nijak neomezují rozsah vynálezu. Obsahy všech obrázků a všech odkazů, patentů a publikovaných patentových přihlášek citovaných v předkládaném vynálezu jsou zde uvedeny jako odkazy.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Antigen: Transgenní myší se imunizovaly A431 buněčnou linií lidského epidermoidního karcinomu (CRL-1555, Lot 203945, ATCC Manassas, Virginia) a solubilním receptorem pro epidermální růstový faktor (EGFR) od Sigma Chemical Co (produkt E 3641, šarže 109H4108 a 20K4079). Solubilní EGFR se skladoval při -20 °C až -80 °C do použití.

4

4 4 4 4 4

444 4 444

4444444 4 444

4 4 4 4 4

4· 4 4» ·

4· 44

4 4

4 4 44

4 4 4

Složení medií: (A) DMEM s vysokou koncentrací glukosy (Mediatech Cellgro # 10013) obsahující 10% FBS, PenicillinStreptomycin (Sigma P-7539) a 2-merkaptoethanol (GibcoBRL 21985-023) se použilo pro kultivování A431 buněk a myelomových buněk. Další doplňková media se přidala do hybridomového kultivačního media, které obsahovalo: Origin-Hybridoma Cloning Factor (Igen 21001), OPI doplněk (Sigma 0-5003), HAT nebo HT (Sigma H 0262, H 0137). (B) Bezsérové medium obsahovalo pouze

DMEM, antibiotika a 2- merkaptoethanol.

Buňky pro imunizaci: Buňky pro imunizaci se kultivovaly v DMEM (viz výše) do konfluence v T-75 tkáňových kultivačních nádobách a odebíraly se pomocí přidání Trypsin EDTA (Cellgrow, kat. č. 25-053-C1) roztoku, 5-10 ml na baňku. Buňky získané z baněk se resuspendovaly v 50 ml kompletního media a promyly se třemi cykly odstředění (1000 G) a resuspendovaly se v 50 ml sterilního PBS. Myším se injikovalo lxlO⁷buněk suspendovaných v 0,5 ml sterilního PBS.

EGFR: Solubilní EGFR se smísil s Ribi adjuvans (Sigma, M 6536) ve sterilním PBS v koncentraci 25 μς EGFR/100 μΐ. Konečné imunizace do ocasní žíly se provedly za použití solubilního EGFR ve sterilním PBS.

Transgenní myši: Myši se chovaly v boxech s filtry a v den infuse se rozhodlo, zda jsou v dobrém stavu. Myši, které produkovaly požadované hybridomy, byly samci stáří 6-8 týdnů genotypu (CMD)++; (HCo7)11952+; (JKD)++; (KCo5)9272+ genotypu (viz tabulka 1).

0« 00 00 0 00 0 • 0 000 000 0 000 0 000 0 000 0 0 0 * 0 0 0000 · 0 0 0000 0 0 0 0 0 0 00 0 •« 00 00 0 00 *

Tabulka 1

Data pro genotyp*
Myš	Pohlaví	Narození	Genotyp
20241	Samec	21.9.1999	CMD++	(Hco7)11952+	(JKD)++	(Kco5)9272
20242	Samec	21.9.1999	CMD++	(Hco7)11952+	(JKD)++	(Kco5)9272
20243	Samec	21.9.1999	CMD++	(Hco7)11952+	(JKD)++	(Kco5)9272

* Označení jednotlivých transgenu jsou v závorkách a potom následuje řada čísel pro náhodně integrované transgeny.

Symboly ++ a + ukazují homozygoty nebo hemozygoty; nicméně, protože jsou myši rutinně testovány za použití PCR testů, které neumožňují odlišení mezi heterozygotností a homozygotnostní pro náhodně integrované lidské Ig transgeny, je označení + uvedeno u myší, které jsou skutečně homozygotní pro tyto elementy.

Protilátky: Následující anti-EGFR MAb se použily in vitro a in vivo: 2F8 (též označovaná jako Humax-EGFR), lidská IgGl anti-EGFR protilátka (Genmab, Utrecht, The Netherlands); hybridom produkující m225, myší IgG2a anti-EGFR protilátku, se získal od American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, HB8508); irelevantní lidská IgG izotypová kontrola (Genmab), která se použila jako irelevantní IgGl protilátka; a F(ab')2 fragment kozího anti-myšího IgG (H+L) konjugovaný na fluorescein-isothiokyanatan (FITC) se použil jako sekundární protilátka pro nepřímou imunofluorescenci (Protos, San Francisco, CA), FITC-konjugovaný F(ab')₂ králičí-a-lidský IgG (DAKO, Glostrup, Denmark).

2F8 hybridom se kultivoval v DMEM (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Scotland) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS) (Hyclone, Logan, Utah) a 1,00 U/ml

99 • 99 *

9999 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 • 9 9 9

9 9 9 9

9999 « 9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9 9

9· ♦ penicilinu a 100 U/ml streptomycinu (oba Gibco BRL) (pen/strep). m225 hybridom se kultivoval v RPMI1640 (Gibco BRL) doplněném 15% FBS (Hyclone) a pen/strep (oba Gibco BRL). Všechny buněčné linie se uchovávaly při 37°C ve zvlhčované atmosféře obsahující 5% oxid uhličitý. Humax protilátky se přečistily za použití protein-A afinitní chromatografie, po které se provedlo vylučování podle velikosti na HR200 koloně (Pharmacia, New Jersey). Myší protilátky se přečistily za použití protein-G chromatografie, po které se provedlo vylučování podle velikosti na HR200 koloně. Čistota všech protilátke byla >95%, jak se určilo elektroforesou na dodecyl sulfát-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). F(ab') fragmenty se připravily trávením pepsinem nebo β-merkaptoethanolem a potom protein-A/G přečištěním. Izolované E(ab') fragmenty měly více než 95% čistotu podle SDS-PAGE.

Buněčné linie: A431, epidermoidní karcinom, který nadměrně exprimuje EGFR, se získala z ATCC (Rockville, MD, CRL-155). Buňky se kultivovaly v RPMI 1640 mediu (Gibco BRL), doplněném 10% teplem inaktivovaným FBS (Hyclone), 50 gg/ml streptomycinu, 50 IU/ml penicilinu a 4 mM L-glutaminu (vše Gibco BRL).

Protože buňky rostly adherentně, uvolnily se pomocí trypsinEDTA v PBS (Life Technologies, Paisley, Scotland).

V nádorových modelech jsou buňky vždy použity v log fázi. Před každým pokusem se buňky testovaly na stabilní expresi EGFR a na kontaminaci mykoplasmaty.

Postup pro fúzi: Z utracených myší se asepticky odebraly sleziny a umístily se do 20-30 ml chladného bezsérového media (SFM) v Petriho misce. Odstranila se okolní tkáň a sleziny se dvakrát propláchly v SFM. Buňky sleziny se opatrně odebraly homogenizací ve tkáňovém mlýnku v SFM.

99 ··

9 9 9

9 99« 9

9 9 9 9 9 • 9 9 9 ·9 9

9 • 99 ·· ·

9

9 9

9· 9

Buňky se odstředily při 1000 g během 10 minut a erytrocyty v buněčné peletě se lyžovaly suspendováním pelety buněk sleziny v 5 ml ledově chladného 0,17 M NH4CI po dobu 2-5 minut. Směs buněk se potom naředila 20 ml SFM a odstředila se při 1000 g během 10 minut. Myelomové buňky se odebraly do 50 ml centrifugačních zkumavek. Buňky sleziny a myelomové buňky se potom promyly třemi cykly odstředění při 1000 g a resuspendovaly se v 30-40 ml SFM.

Po spočítání buněk se slezinné a myelomové buňky smísily v poměru 1:1 až 4:1. Směs buněk sleziny/myelomových buněk se peletovala odstředěním a supernatant se odstranil aspirací. Fúze se provedla přidáním 1-2 ml PEG roztoku (Sigma # P-7181), po kapkách, k buněčné peletě během 45 sekund, a opatrným míšením roztoku po dobu 75 sekund. PEG se pomalu naředil přidáním 2 ml SFM po kapkách během jedné minuty. Toto se opakovalo s dalšími 2 ml SFM a potom se roztok nechal odstát 1 minutu.

Roztok se potom pomalu naředil dalšími 30 ml SFM během 90 sekund. Buňky se odstředily při 1000 g během 10 minut a resuspendovaly se v 30 ml HAT media. Fúzní směs se naředila do 200-300 ml HAT doplněného media obsahujícího 3% Origin Hybridoma Cloning Factor, a dispergovala se do 96-jamkových ploten v dávce >200 μΙ/jamku (10-15 ploten/slezinu). Hybridomové plotny se testovaly za dobu 3-7 dnů na hybridomy. Plotny se doplnily v den 7 nahrazením poloviny media v každé jamce čerstvím HT mediem doplněným 3% Origin. Plotny se potom každé 3-4 dny doplňovaly HT Mediem.

ELISA činidla:

1. Fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS), D-PBS bez Ca a Mg, Hyclone D-PBS #SH30013.03, nebo Sigma P 3813.

♦ · 4 ·· • · · • · · ·· • · · · · • 4 4 4 • · · · • 44

4 4 4

44444

4 4 • · 4 ·

• 4 4

4 4 4

4 444

4 4

4

2. PBS-T (promývací pufr), PBS obsahující 0,05% Tween 20, Sigma P-1379.

3. PBS-T plus 1% BSA (Sigma A 9647). Slouží jako blokovací pufr a vzorkový pufr.

4. ELISA plotny, Nunc Imuno-plate F96 Maxisorp 442404.

5. Protilátka specifická pro lidský IgG γ-řetězec, Jackson ImunoRresearch #109-006-098.

6. Alkalickou fosfatasou značené kozí IgG specifické pro lidský γ-řetězec IgG, Jackson Imuno Research #109-056-098.

Alternativně je možno použít alkalickou fosfatasou značený anti-lidský k, Sigma A 3813.

7. Alkalickou fosfatasou značený anti-lidský IgGl, nebo IgG3, Southern Biotechnology # 9050-04 & 9210-04, pro použití v izotypově specifické ELISA.

8. p-nitrofenyl (pNPP),Sigma N2765, nebo Sigma Fast tablet kit N-2770.

9. pNPP substrát a pufr - dvě možnosti:

A. Diethanolaminový pufr: Směs 97 ml diethanolaminu, Sigma 0-2286, plus 0,1 g MgCl₂.6H₂0 a 800 ml Di vody. pH upraveno na 9,8 a konečný objem 1,0 1 pomocí Di vody. Přidá se jedna 20 mg tableta pNPP, Sigma N-2765, na 20 ml diethanolaminového pufru.

B. Sigma Fast pNPP Tablet Set, Sigma N-2770: Rozpustí se 1 tableta pufru a 1 tableta pNPP ve 20 ml H₂0.

10. ELISA čtečka ploten s 405 nm filtrem.

11. Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR), Sigma E 3641, Biotinem značený EGF (EGF-B), Molecular Probes E-3477.

12. Biotinem značená anti EGFR MAb nebo lidská protilátka.

13. Nespecifické lidské protilátky pro negativní kontroly, nebo přečištěný lidský IgGl k, Sigma 1-13889.

14. Automatizované promývací zařízení pro ELISA plotny: Titertek MAP C.

Anti-lidský IgG κ ELISA: Pro testování hybridomových ploten na • 9 9 • 9 4 4 4 4 • ··· 4 444 • 4 ···· 44 4··· • 4 4 4 4 4

4 49 4 produkci lidských IgG, κ Mab se ELISA plotny potáhly 1 pg/ml protilátky specifické pro lidský IgG γ-řetězec, Jackson ImunoResesarch #109-006-098, přes noc nebo déle, při 4 °C.

Plotny se promyly v promývacím zařízení a přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T plus 1% BSA. Plotny se inkubovaiy alespoň 15 minut a 10-50 μΐ supernatantu buněčné kultury se přidalo do jamek ELISA plotny, kdy několik jamek v plotně obsahovalo IgG jako pozitivní kontrolu a buněčné kultivační medium jako negativní kontrolu. Plotny se inkubovaiy 1-2 hodiny při těplotě místnosti, promyly se a přidala se alkalickou fosfatasou značená protilátka proti lidskému κ (Sigma A-3813) v ředění 1:5000 v PBS-T plus 1% BSA. Plotny se inkubovaiy po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, promyly se 4-krát ve vymývacím zařízení a přidal se pNPP substrát. Plotny se inkubovaiy 10-60 minut a absorbance se odečítala při 405 nm na ELISA čtečce ploten.

ELISA postup pro testování specificity anti-EGFR lidských protilátek - přímá vazba protilátky na ELISA plotny potažené EGFR: Pro ověření toho, že se anti-EGFR protilátky specificky váží na EGFR, se Nunc Maxisorp plotny potáhly 100 μΙ/jamku EGFR v koncentraci 0,4 pg/ml v PBS přes noc při 4°C nebo během 2 h při teplotě místnosti. Plotny se promyly 3-krát v PBS-T, 100 μΙ/jamku PBS-T plus 1% BSA se přidalo pro blokování nespecifických míst na plastovém povrchu a před vnesemím vzorku se provedla inkubace po dobu alěspoň 15 minut. Ředění testovaného vzorku se provedla v PBS-T plus 1% BSA.

Supernatanty se naředily pro přidání do ELISA ploten minimálně 1:3 v PBS-T + 1% BSA. Vzorky a standardy se přidaly v koncentraci 100 μΐ na jamku, provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a plotny se promyly 3-krát v PBST. Přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T 1% BSA obsahujícího alkalickou ·· * · • · • · « · · • · · * • · ·

fosfatasou značené kozí protilátky specifické pro lidský γ v ředění 1:3000 až 1:5000. Alternativně se mohlo použít alkalickou fosfatasou značeného anti-lidského κ. Plotny se inkubovaly 1 hodinu při teplotě místnosti, promyly se 4-krát a přidal se pNPP substrát. Absorbance se odečítala při 405 nm.

ELISA postup pro testování specificity anti-EGFR lidských protilátek - ELISA EGF/EGFR blokovací test: Pro ověření toho, že se anti-EGFR protilátky váží na EGFR a dále blokují vazbu biotinem značeného epidermálního růstového faktoru na receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) se Nunc Maxisorp plotny potáhly 100 μΙ/jamku EGFR v koncentraci 0,4 pg/ml v PBS přes noc při 4°C nebo během 2 h při teplotě místnosti. Plotny se 3krát promyly v PBS-T, přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T plus 1% BSA pro blokování nespecifických míst na plastovém povrchu a před vnesením vzorku se provedla inkubace po dobu alespoň 15 minut. Ředění testovaného vzorku se provedla v PBS-T plus 1% BSA. Supernatanty se naředily pro přidání do ELISA ploten minimálně 1:3 v PBS-T + 1% BSA. Vzorky a standardy se přidaly v koncentraci 100 μΐ na jamku, provedla se inkubace po dobu 30 minut při teplotě místnosti, přidalo se 20 μΙ/jamku biotinem značeného EGF v koncentraci 0,5 μg/ml a plotny se inkubovaly po dobu 1 hodiny (toto se přidalo k roztoku vzorku, který byl již přítomen na plotně. Alternativně se vzorky inkubovaly po dobu 1 hodiny, promyly se, přidalo se 100 μί/jamku EGF-biotinu v koncentraci 0,1 pg/ml a provedla se inkubace pod obu 1 hodiny. Plotny se promyly 3-krát, přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T 1% BSA obsahujícího streptavidin-alkalickou fosfatasu v ředění 1:2000 a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny. Plotny se 4-krát promyly, přidal se pNPP substrát a absorbance se odečetla při 405 nm.

44 ·· • « 4 4 4 • 4999 » ·

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 44 β

4 4

4 4 4

4 44444

4 4 4

44 4

Kompetitivní ELISA pro stanovení epitopové specificity antiEGFR lidských protilátek - Kompetice s komerčními myšími MAb 225, 528, AB5 a 29.1:

Tento test se provedl pro stanovení toho, které Mab jsou nejpodobnější protilátkám 225, 528, ABS a 29.1. MAb 225, 528, a ABS blokují EGF vazbu na receptor a inhibují in-vivo aktivitu endogenní tyrosin-kinasy EGFR. MAb 29.1 je neblokovací Mab, která se váže na sacharidový zbytek EGFR. Plotny se potáhly během alespoň 2 hodin při teplotě místnosti, nebo přes noc při 4°C, 0,4 pg/ml EGFR v PBS, promyly se a blokovaly se 100 μί/jamku PBS-T 1% BSA. Blokovací roztok se odstranil a přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T-1% BSA do kolon 1-6 na levé straně plotny, a do kolon 7-12 na pravé straně plotny se přidala neznačená myší MAb v koncentraci 1 μρ/πιΐ (100 μΙ/jamku). Plotny se inkubovaly při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a 25 μί supernatantu buněčné kultury se přidalo do ekvivalentních pozic každé poloviny plotny tak, že každý supernatant se přidal do jedné jamky s PBS-T-1% BSA a jedné jamky s myší MAb. Plotny se inkubovaly 1 hodinu, promyly se a přidala se alkalickou fosfatasou značená protilátka proti lidskému IgG Fc. Plotny se inkubovaly po dobu jedné hodiny. Plotny se promyly a přidal se substrát. Absorbance se odečítala při 405 nm. % kompetice MAb se vypočetlo podle následujícího vzorce: (OD supernatantu bez kompetice - OD supernatantu MAb kompeticí/OD supernatantu bez kompetice) x 100.

Kompetitivní ELISA pro stanovení epitopové specificity antiEGFR lidských protilátek - Kompetitivní ELISA s lidskými protilátkami značenými biotinem: Kompetitivní ELISA testy se provedly také pro stanovení specificity anti-EGFR lidských protilátek. Plotny se potáhly během alespoň 2 hodin při • ft · · · · • ··· · ·· · • · ft ft··· · · · ···· • · · · ft · •ft · ·· ft

EGFR v PBS.

1% BSA. 50 ·· ·· • · · • · ··· • · · · • · · · • ft ·· teplotě místnosti, nebo přes noc při 4°C, 0,4 gg/ml Plotny se promyly a blokovaly se 100 μΙ/jamku PBS-T μΐ (10-30 μΙ/ml) neznačené lidské protilátky nebo myší MAb se přidalo do první jamky každého sloupce plotny 50 μΐ se postupně přeneslo a sériově ředilo v jamkách každého sloupce plotny za vzniku trojnásobných sériových ředění každé protilátky. 50 μΐ se po smísení odstranilo z dolní jamky. Plotny se inkubovály po dobu 1 hodiny a do ploten se přidalo 20 μΐ/jamku biotinylované anti-EGFR lidské protilátky nebo neznačené myší anti-lidský EGFR protilátky tak, že konečná koncentrace kompetující protilátky byla přibližně 0,1-0,2 pg/ml. Plotny se inkubovály po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, promyly se a přidalo se 100 μΙ/jamku streptavidinu-alkalické fosfatasy (1:2000 v PBS-T-BSA) nebo alkalickou fosfatasou značené kozí anti-myší IgG protilátky. Plotny se inkubovály 1 hodinu, promyly se a přidal se substrát. Absorbance se odečítala při 405 nm.

FACS postuppojr testování specificity anti-EGFR lidských protilátek - EGF/EGFR blokování: Tento test se použil pro ověření toho, že anti-EGFR protilátky se váží na EGFR na povrchu buněk; a že touto vazbou se blokuje vazba značeného epidermálního růstového faktoru (EGF-B) na receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR). Tato metoda na bázi FACS využívá lidské buněčné linie epidermálního karcinomu A431, která exprimuje přibližně 10⁶ EGFR molekul/buňku.

Materiály pro EGFR FACS testy:

1. A431 buňky (ATCC CRL 1555) konfluentní v jedné nebo více T175 baňkách. A431 buňky se kultivovaly v DMEM plus 10% FCS.

2. Trypsin-EDTA roztok, Sigma T-3924.

3. Biotinem značený EGF. Zásobní roztok přibližně 5 μg/ml, • ·

100 použije se 10 μΙ/jamku.

4. 96-jamkové plotny s kulatým dnem.

5. PBS, sterilní.

6. PBS plus 1% BSA plus 0,02 % azid sodný (FACS pufr).

7. PE-značený streptavidin, Sigma S 3402. Ředění 1:20 ve FACS pufru.

8. PE-značený nebo FITC-značený anti-lidský IgG, FC γ specifický, Pharminigen 34164X, 34165X.

9. Nízkorychlostní odstředivka se swinging buckets a adaptérem pro 96-jamkové plotny (Beckman).

10. FACS

11. BD FACS zkumavky.

Postup: A431 buňky se získají ošetřením trypsinem-EDTA. Medium ze tkáňových kultivačních nádob se odstraní a baňky se krátce promyjí 10-20 ml sterilního PBS nebo HBSS. Přidá se 5-10 ml trypsinu-EDTA a baňky se vrátí do inkubátoru na dobu několika minut. Když se buňky začnou odlučovat od plastového povrchu, tak se 10 ml pipeta použije pro odloučení buněk od plastového povrchu a pro přípravu suspenze obsahující jednotlivé buňky s mnoha shluky buněk. Buňky se přenesly do 50 ml zkumavky s 20-30 ml buněčného kultivačního media (s FBS), provedlo se odstředění během 10 minut při 1000 g a promytí dvojím odstředěním a resuspendováním buněk ve FACS pufru. Roztok buněk se přefiltroval skrz nylonové síto pro odstranění shluků buněk (horní konec BD FACS zkumavek je určen pro tento účel). Buňky se spočítaly a objem se upravil tak, aby bylo dosaženo koncentrace mezi 1 a 5 x 10⁶ buněk na ml. Buňky se přenesly do 96-jamkové plotny s kulatým dnem v koncentraci přibližně 200,000 buněk/jamku a provedlo se odstředění po dobu 1 minuty při 1000 g a potom se odsála tekutina (buňky zůstaly na dně jamky) . Plotny se ponechaly na ledu nebo při 4°C. V samostatné 96-jamkové plotně se připravily ředění protilátky ve FACS

101 • · « · ·

pufru a získaly se trojnásobná ředění protilátky od 10 μΙ/ml a do 4,5 ng/ml. 100 μΐ každého ředění protilátky, izotypových kontrol a kontrol tvořených pufrem se přidalo do plotny se kulatým dnem. Vzorky protilátky a kontroly se smísily s buňkami a provedla se inkubace po dobu 30 minut na ledu. 10 μΐ biotinem značeného EGF se přidalo k roztoku buněk a protilátky a provedla se inkubace po dobu dalších 30 minut.Buňky se promyly třikrát odstředěním a resuspendováním ve FACS pufru. Přidalo se 50 μΐ/jamku streptavadinu PE, směs se promísila a inkubovala se po dobu 30 minut na ledu. Buňky se 3-krát promyly a resuspendovaly se v 50 μΐ FACS pufru. Obsah každé jamky se přenesl do zkumavky obsahující 300-400 μΐ FACS pufru. 5000-10000 buněk se analyzovalo v každém vzorku FACS v FL-2 kanálu. MCF versus koncentrace protilátky se zanesla do grafu.

Lidské nebo zvířecí materiály: A431 Lidská buněčná linie epidermoidního karcinomu (CRL-1555, šarže 203945, ATCC Manassas, Virginia). Trypsin EDTA (Cellgrow Cat # 25-053-C1). P3 X63 ag8.653 myelomová buněčná linie: ATCC CRL 1580, šarže F-15183 Origin-Hybridoma Cloning Factor (Igen 21001). OPI doplněk (Sigma 0-5003). Fetální hovězí sérum (SH3 0071 šarže #s ALE 10321, a AGH6 843) od Hyclone, Logan, Utah. Origen Freeze Medium (Igen, # 210002).

ELISA: Pro stanovení vazby lidských protilátek na EGFR se použilo ELISA testu s EGFR (Sigma, St Louis, M) potaženým přes noc v koncentraci 1 μg/ml v PBS na 96-jamkové mikrotitrační plotny (Greiner, Frickenhausen, Germany). Po blokování plotny ELISA pufrem (PBS/0,05% Tween 20 a 1% kuřecí sérum (Gibco BRL)) v koncentraci 100 μΙ/jamku se přidaly monoklonální protilátky naředěné v ELISA pufru a provedla se inkubapo dobu • ·

102 ·« · ·· ·

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999999 99999

9 99 hodiny při 37 °C. Plotny se potom promyly 3-krát a provedla se inkubace s peroxidasou značenou kozí protilátkou proti lidskému IgG Fc (Jackson, West Grace, P) po 1 hodiny při 37°C. est se vyvíjel za použití ABTS (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) po dobu 30 minut. Absorbance se měřila za použití čtečky mikroploten (Biotek, Winooski, Canada) při 415 nm. Pro blokovací testy se plotny preinkubovaly po dobu 10 minut s 50 μΐ blokovacího činidla v ELISA pufru před tím, než se přidalo 50 μΐ plně lidské protilátky. Pro stanovení lidského IgG v myší séru se ELISA plotny potáhly králičí protilátkou proti lidského kappa lehkému řetězci (DAKO) přes noc v PBS v 96jamkové mikrotitrační plotně (Greiner). Po blokování plotny ELISA pufrem (PBS/0,05% Tween 20 a 1% kuřecí sérum) 100 μΐ/jamku se přidalo myší sérum naředěné v ELISA pufru a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Plotny se potom promyly 3-krát a inkubovaly se s peroxidasou značenými králičími F(ab')₂ fragmenty proti lidskému IgG (DAKO) po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Test se vyvíjel za použití ABTS (Roche) po dobu 30 minut. Absorbance se měřila za použití čtečky mikroploten (Biotek) při 415 nm.

Průtoková cytometrie: Nádorové buňky nadměrně exprimující EGFR se inkubovaly s MAb po dobu 30 minut při 4°C. Buňky se promyly 3-krát ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku doplněném 1% hovězím sérovým albuminem (Roche) a 0,01% azidem. Kontrastní barvení se provedlo FITC-konjugovanými F(ab')₂ fragmenty kozí anti-myší protilátky nebo FITC-konjugovanými F(ab')₂ fragmenty králičí anti-lidské IgG protilátky. Pro inhibiční pokusy se buňky preinkubovaly s EGF nebo TGF-α po dobu 10 minut při 4°C. Všechny vzorky se analyzovaly na FACScan průtokovém cytometru (Becton-Dickinson, San Jose, CA).

Fosforylační pokusy: Sub-konfluentní kultury A431 buněk ve 24• · v · • 4 4 · · 4 4 4 4 · 4 4 4

AQ · · · 4 4 4 4 4444 4 4 4444

I UJ «444 44 4 4 4 « •· ·· 44 « 44 · jamkových plotnách (NUNC, Kamstrup, Denmark) se přes noc vystavily působení nízkých koncetrací séra (0,5%). Do jamek se přidaly různá ředění protilátek a provedla se inkubace po dobu 30 minut při 37°C a 5% oxidu uhličitém. Buňky se stimulovaly s nebo bez 5 ng/ml EGF (Prepotech, Rocky Hill, NJ) po dobu 5 minut při 37°C a 5% oxidu uhličitém. Buněčné extrakty se připravily způsobem popsaným v Tomic et al. (Tomic et al,

1995) za použití 100 μΐ lyzačního pufru na jamku. 50 μΐ extraktu A431 buněk se analyzovalo natrium-SDS-PAGE a imunohybridizací s anti-fosfo-tyrosinovými protilátkami (PY20, Transduction Laboratories, Kentucky), kozími protilátkami proti myšímu IgG-HRP (Transduction Laboratories), a ECL detekcí. Pro stimulaci s TGF-α (Prepotech, Rocky Hill, NJ) se sub-konfluentní kultury A4 31 buněk ve 24 jamkových plotnách (Nunc) zpracovaly přes noc nízkosérovým mediem (0,5%).

Protilátky se přidaly ve fixní dávce 10 nebo 0 μς/ml a provedla inkubace způsobem popsaným výše. Buňky se stimulovaly stoupajícím množstvím TGF-α. Buňky se zpracovaly způsobem popsaným výše.

Inhibice růstu buněk in vitro: Inhibice růstu buněk plně lidskými protilátkami se hodnotila za použití neradioaktivního inhibičního test. Stručně, 100 μΐ 2 x 10⁴/ml A431 buněk se přidalo do tkáňových kultivačních ploten s plochým dnem a plotny se umístily do inkubátoru pro buněčné kultury. Po 2 hodinách se přidalo 100 μΐ ředění protilátek a plotny se vrátily do inkubátoru pro buněčné kultury. Buňky se inkubovaly po dobu 6-7 dnů, odebraly se supernatanty a do každé jamky se přidalo 100 μΐ 0,25% glutaraldehydu v PBS. Po inkubaci po dobu 45 minut při teplotě místnosti se jamky promyly 2-krát demivodou. Přidalo se 50 μΐ 1% krystalické violeti v demi-vodě a provedla se inkubace po dobu 15 minut při teplotě místnosti.

·· ♦ • ·

I · · ♦ · • · · ·

104 • ··*· · · • · *

Po dvojím promytí ploten demi-vodou se plotny vyvíjely za použití 100% methanolu během 30 minut na třepačce ploten. Absorbance se měřila za použití čtečky mikroploten a 550 nm filtru s 650 nm referenčním filtrem. Inhibice se měřila třikrát. Procento relativní proliferace buněk se stanovila dělením průměrné absorbance z trojího stanovení pro konkrétní koncentraci protilátky průměrnou absorbanci z jamek, do kterých nebyla přidána žádná protilátka, a potom vynásobením 100.

Izolace efektorových buněk: Leukocyty periferní krve se izolovaly způsobem vycházejícím ze způsobu popsaného v Repp, et al. (1991) Blood 78: 885-889. Stručně, heparinemantikoagulovaná krev se převrstvila přes ficoll gradient. Po odstředění se efektorové buňky odebraly z interfáze a zbývající erytrocyty se odstranily hypotonickou lýzou. Cytospinové přípravky se použily pro hodnocení čistoty izolovaných buněk, která byla vyšší než 95%. Životaschopnost buněk, určená podle vylučování trypanové modři, byla vyšší než 95%.

ADCC testy: Kapacita plně lidských protilátek lyžovat nádorové buňky se hodnotila v testu uvolňování ⁵¹Chromu (Valerius, et al. (1993) Blood, 82: 931-939). Izolované lidské leukocyty se použily jako zdroj efektorových buněk. Stručně, nádorové cíle se inkubovaly s 100 pCi ⁵¹Cr po dobu 2 hodin. Po trojím promytí kultury mediem se 5xl0³ cílových buněk přidalo do tkáňových kultivačních ploten s kulatým dnem obsahujících 50 μΐ izolovaných efektorových buněk a senzibilizující Mab v různých koncentracích a naředěné v kultivačním mediu. Konečný objem byl 200 μΐ a poměr efektorových a cílových buněk (E:T) 80:1. Plotny se inkubovaly přes noc při 37°C a na závěr se provedlo odstředění. Uvolněný chrom se stanovil v supernatantech

105 ♦ ΦΦ φφφ φφφ φ φφφφ φ φφφ φφφφ « φ φ φφφ · φφφφ φ · φ φφφ «φφφ φφφ · φ φ φφ φφ «φ φ φφ · trojmo. Procento buněčné cytotoxity se vypočetlo za použití vzorce:

Pokusné cpm - spontánní cpm %specifické lýzy =-------------------------------x 100 maximální cpm - spontánní cpm kde maximální uvolnění ⁵¹Cr se určilo přidáním ZAP-oglobinu® (10% konečná konctrace) k cílovým buňkám a spontánní cpm se určilo měřením za absence sensitizující protilátky a efektorových buněk. Při těchto podmínkách byla pozorována pouze velmi slabá protilátkami zprostředkovaná, nebuněčná cytotoxicita (nezpůsobená efektorovými buňkami) (< 5% specifické lýzy).

Měření afinity za použití SPR technologie: Vazebná afinita anti-EGFR protilátek se určila za použití BIAcore 300 (Biacore, Upsula, Sweden). EGFR přečištěný z A431 buněk zakoupený od Sigma se imobilizoval na CM5 čipu podle návodu výrobce. Měření se provedla s protilátkovými F(ab') fragmenty v různých koncentracích. Asociační a disociační konstanty se stanovily za použití BIA evaluation softwaru (verze 3.1).

Myší a nádorové modely: Holé Balb/c myši (NuNu) se zakoupily od Harlan (Horst, The Netherlands). Všechny popsané pokusy se provedly se samicemi myší stáří 8-12 týdnů. Myši se chovaly v Transgenic Mouše Facility v Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, The Netherlands) a pokusy byly schváleny etickou komisí Utrecht University. Když byly zařazeny do pokusu, tak se myši třikrát týdně kontrolovaly na známky toxicity a diskomfortu, včetně aktivity, kožních abnormalit, průjmu a celkového vzhledu. Použily se rozvinuté podkožní (s.c.) nádorové modely. Stručně, A431 buňky vysoce exprimující EGFR se naočkovaly, na pravém boku myší, v dávce 3xl0⁶ buněk. Nádory rostly rovnoměrně a mohly být snadno měřeny Vernierovými

AAA AAA AAA

A AAAA A AAA A AAA • AA AAA AAAAAAA AAA·

106 \.··..· ·· A AA A kalipery. Objem nádorů se udával jako délka x šířka x výška (v mm³). Monoklonální protilátky se injikovaly intraperitoneálně (i.p.) podle protokolu pokusu. Nádorové buňky se testovaly na stabiní expresi EGFR po in vivo pasáži průtokovou cytometrií a imunohistochemicky. Pro stanovení farmakokinetiky se myším s a bez nádorů injekčně i.p. aplikovala 2F8 protilátka. Šest týdnů před a šest týdnů po injekci se jednou týdně odebíraly vzorky krve z ocasní žíly. Vzorky se analyzovaly ELISA s lidským IgG.

Statistická analýza: Data pro skupiny jsou uvedena jako průměr + standardní odchylka od průměru (SEM). Rozdíly mezi skupinami se analyzovaly nepárovými (nebo - když to bylo vhodné párovými) Student's t-testy. Jsou uvedeny hladiny statistické významnosti. Významnou byla akceptována při p<0,05.

Příklad 1: Příprava Cmu cílených myší pro produkci anti-EGFR lidských protilátek, též označovaných jakoHuMAb

Konstrukce CMD cíleného vektoru

Plasmid pICEmu obsahuje EcoRI/Xhol fragment lokusu pro těžký řetězec myšího Ig, který zahrnuje mugen, a který byl získán z Balb/C genomové lambda fágové knihovny (Marcu et al.

Cell 22: 187, 1980). Tento genomový fragment se subklonoval do Xhol/EcoRI míst plasmidu pICEMl9H (Marsh et al; Gene 32, 481485, 1984) . Sekvence pro těžký řetězec obsažená v pICEmu je umístěna od EcoRI místa umístěného těsně 3' k mu intronovému zesilovači, do Xhol místa umístěného přibližně 1 kb za posledním transmembránovým exonem mu genu; velká část přesmykového repetítivního regionu byla deletována pasáží v E. coli. Cílící vektor byl konstruován následujícím způsobem. 1,3 kb HindlII/Smal fragment se excidoval z pICEmu a subklonoval se do HindlII/Smal tráveného pBluescript (Stratagene, La •· · ·· · • · · · · · • « · · · · · · • ······· · ··· • » · · · · «· · «· ·

107

Jolla, CA). Tento pICEmu fragment je v rozsahu od HindlII místa umístěného přibližně 1 kb 5' k Cmul do Smál místa umístěného v Cmul. Vzniklý plasmid se trávil Smal/Spel a insertoval se přibližně 4 kb Smal/Xbal fragment z pICEmu, který měl rozsah od Smál místa v Cmul 3' do Xbal místa umístěného těsně za posledním Cmu exonem. Vzniklý plasmid, pTARl, se linearizovam v Smál místě a insertovala se neo expresní kazeta. Tato kazeta se skládá z neo genu pod transkripční kontrolou promotoru myšího genu pro fosfoglycerát-kinasu (pgk) (Xbal/Taql fragment; Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74) a obsahuje pgk polyadenylační místo (PvuII/HindlII fragment; Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308). Tato kazeta se získala z plasmidu pKil (jak je popsán v Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163), ze kterého se neo kazeta excidovala jako EcoRI/HindlII fragment a subklonovala se do EcoRI/HindlII tráveného pGEM-7Zf (+) za zisku pGEM-7 (KJl). Neo kazeta se excidovala z pGEM-7 (KJl) trávením EcoRI/SalI, tupě se zakončila a subklonovala se do Smál místa plasmidu pTARl, v opačné orientaci vzhledem ke genomové Cmu sekvenci. Vzniklý plasmid se linearizoval Notl a insertovala se thymidin-kinasová (tk) kazeta herpes simplex viru, aby se umožnilo obohacení ES klonů nesoucích homologní rekombinanty, jak je popsáno v Mansour et al. (1988) Nátuře 336: 348-352. Tato kazeta se skládá z kódující sekvence tk genu a myšího pgk promotoru a polyadenylačního místa, jak je popsáno v Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163.

Výsledný CMD zaměřovači vektor obsahuje celkem přibližně 5,3 kb homologie s lokusem pro těžký řetězec a je navržen tak, aby generoval mutantní mu gen, do kterého byla vložena neo expresní kazeta v jedinečném Smál místě prvního Cmu exonu. Cílící vektor se před elektroporací do ES buněk linearizoval Pvul, který štěpí vektor v plasmidových sekvencích.

• ·

108

Příprava a analyzování cílených ES buněk

AB-1 ES buňky (McMahon, A. P. a Bradley, A., (1990) Cell

62:1073-1085) se kultivovaly na mitoticky inaktivní vrstvě podpůrných SNL76/7 buněk (ibid.), za použití popsané techniky (Robertson, E. J. (1987), v Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.)

Oxford: IRL Press str. 71-112). Linearizovaný CMD zaměřovači vektor se elektroporoval do AB-1 buněk způsobem popsaným v Hasty et al. (Hasty, P. R. et al. (1991) Nátuře 350: 243-246). Elektroporované buňky se umístily na 100 mm disky v hustotě 12xl0⁶ buněk/disk. Po 24 hodinách se do media přidalo G418 (200 gg/ml aktivní složky) a FIAU (5xl0^-7 M) a klony resistencní na léčiva se vyvíjely po dobu 8-9 dnů. Klony se seškrábly, trypsinizovaly se, rozdělily se na dvě poloviny a dále se expandovaly. Polovina buněk z každého klonu se potom zmrazila a druhá polovina se analyzovala na homologní rekombinaci mezi vektorem a cílovými sekvencemi.

DNA analýza se provedla Southernovou hybridizací. DNA se izolovala z klonů způsobem popsaným v Laird et al. (Laird, P. W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4293). Izolovaná genomová DNA se trávila Spěl a sondovala se 915 bp Sad fragmentem, sondou A, která hybridizuje na sekvenci mezi mu intronovým zesilovačem a přesmykovým regionem. Sonda A detekuje 9,9 kb Spěl fragment z přirozeného lokusu, a diagnostický 7,6 kb proužek z mu lokusu, který homologně rekombinuje s CMD zaměřovacím vektorem (neo expresní kazeta obsahuje Spěl místo). Z 1132 G418 a FIAU resistěntních klonů testovaných Southernovou hybridizací 3 vykazovaly 7,6 kb Spěl proužek, který ukazuje na homologní rekombinaci v mu lokusu. Tyto 3 klony se dále trávily enzymy BglI, BstXI a EcoRI, pro ověření toho, že se vektor homologně integroval do mu genu.

109 ·..··..· ·.»· :

Při hybridizací sondou A jsou při Southernově hybridizací přirozené DNA trávené BglI, BstXI, nebo EcoRI, patrné fragmenty velikosti 15,7, 7,3 a 12,5 kb, v příslušném pořadí, zatímco přítomnost cílící mu alely se projeví fragmenty 7,7,

6,6 a 14,3 kb, v příslušném pořadí. Všechny 3 pozitivní klony detekované Spěl trávením vykazovaly předpokládané BglI, BstXI, a EcoRI restrikční fragmenty diagnostické pro inserci neo kazety do Cmul exonu.

Příprava myší nesoucích mutovaný mu gen

Tři cílené ES klony, označené čísly 264, 272 a 408, se rozmrazily a injikovaly se do C57BL/6J blastocyst, jak popisuje Bradley (Bradley, A. (1987), v Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, str. 113-151). Injikované blastocysty se přenesly do děloh pseudopregnantních samic pro přípravu chimérických myší reprezentujících směs buněk získaných z aplikovaných ES buněk a buněk blastocysty. Příspěvek ES buněk v chiméře může být vizuálně hodnocen podle množství zbarvení agouti, které pochází z ES buněčné linie, na černém C57BL/6J pozadí. Klony 272 a 408 produkovaly pouze chiméry s nízkým podílem (tj. nízkým procentem agouti pigmentace), ale klon 264 produkoval samčí chiméry s vysokým podílem. Tyto chiméry se křížily s C57BL/6J samicemi a získalo se agouti potomstvo, což ukazuje na zárodečný přenos genomu ES buněk. Skríning na cílený mu gen se provedl Southernovou hybridizací BglI trávené DNA z biopsií z ocasu (jak je popsáno výše pro analýzu ES buněčné DNA). Přibližně 50% agouti potomstva mělo patrný hybridizační BglI proužek velikosti 7,7 kb, kromě normálního 15,7 kb, což ukazuje na zárodečný přenos cíleného mu genu.

• 4

4*

4 4 4 4

Β

110

Analýza transgenních myší na funkční inaktivaci mu genu

Pro stanovení toho, zda inserce nec kazety do Cmul inaktivovala gen pro těžký řetězec Ig, se chimérický klon 264 křížil s myší homozygotní pro JHD mutaci, která inaktivuje expresi těžkého řetězce v důsledku delece JH genových segmentů (Chen et al., (1993) Immunol. 5: 647-656). Získaly se čtyři agouti potomci. Sérum se odebralo od těchto zvířat ve stáří 1 měsíce a testovalo se ELISA na přítomnost myšího IgM. Dva ze čtyř potomků vůbec neměly IgM (viz Tabulka 2). Genotypování čtyř zvířat Southernovou analýzou DNA z biopsií z ocasu za použití BglI trávení hybridizace sondou A (viz obr. 1), a Stul trávením a hybridizaci 475 bp EcoRI/StuI fragmentem (ibid.) ukázalo, že zvířata, která neexprimují sérový IgM, jsou ta zvířata, u kterých jedna alela lokusu těžkého řetězce nese JHD mutaci a druhá alela Cmul mutaci. Myši heterozygotní pro JHD mutaci mají přirozené hladiny sérového Ig. Tato data ukazují, že Cmul mutace inaktivuje expresi mu genu.

Tabulka 2

Myš	Sérový IgM ^g/ml)	Genotyp Ig H řetězce
42	<0,002	CMD/JHD
43	196	+ /JHD
44	<0,002	CMD/JHD
45	174	+ /JHD
129xBL6Fl	153	+ / +
JHD	<0,002	JHD/JHD

Tabuka 2 ukazuje koncentrace sérového IgM, detekované ELISA, pro myši nesoucí CMD a JHD mutace (CMD/JHD), pro myši heterozygotní pro JHD mutace (+/JHD), pro normální (129Sv x C57BL/6J)F1 myši (+/+), a myši deficitní pro B lymfocyty * · «· ·« · «· · ··· 9 · · · * ·

9 « «· 9 9 · · 9 » 9 ♦ φ · · 9 9 9 9 9999 4 9 · ···

111 »··»··· · * · lil «··« »· · · 9 9

Homozygotní pro JHD mutaci (JHD/JHD).

Příklad 2: Příprava HCO12 transgenních myší pro produkci antiEGFR lidských protilátek

HCO12 transgen pro lidský těžký řetězec

HCO12 transgen se připravil současnou injekcí 80 kb insertu pHC2 (Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591) a 25 kb insertu pVx6. Plasmid pVx6 se připravil způsobem popsaným výše.

8,5 kb HindlII/SalI DNA fragment, obsahující zárodečný lidský VHl-18 (DP-14) gen spolu s přibližně 2,5 kb 5' sousední sekvencí, a 5 kb 3' sousední genomové sekvence, se subklonoval do plasmidového vektoru pSP72 (Promega, Madison, WI), za zisku plasmidů p343.7.16. 7 kb BamHI/HindlII DNA fragment, obsahující zárodečný lidský VH5-51 (DP-73) gen, spolu s přibližně 5 kb 5' sousední sekvence a 1 kb 3' sousední genomové sekvence, se klonoval do klonovacího vektoru pGPlf na bázi plasmidů pBR322 (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res.

20: 6287-6295), za zisku plasmidů p251f. Nový klonovací vektor odvozený z pGPlf, pGPlk (SEQ ID NO:13), se trávil EcoRV/BamHI, a ligoval se do 10 kb EcoRV/BamHI DNA fragmentu, obsahujícího zárodečný lidský VH3-23 (DP47) gen, spolu s přibližně 4 kb 5' sousední a 5 kb 3' sousední genomové sekvence. Získaný plasmid, pll2.2RR.7, se trávil BamHI/SalI a ligoval se s 7 kb přečištěným BamHI/SalI insertem p251f. Získaný plasmid, pVx4, se trávil Xhol a ligoval se s 8,5 kb Xhol/Sall insertem p343.7.16. Získal se klon s VHl-18 genem v stejné orientaci jako další dva V geny. Tento klon, označený jako pVx6, se potom trávil Notl a přečištěný 26 kb insert se injikoval současně s přečištěným 80 kb Notl insertem pHC2 v molárním

112

4 44 • 4 ( 44 4 • 4 « 4 9 4

4 A 4 9 999 • · 4 4 4444 44 4 9944 • 4 4 4 4 4 poměru 1:1 do pronukleu embryí (C57BL/6J x DBA/2J)F2 stáří půl dne, jak je popsáno v Hogan et al. (B. Hogan et al.,

Manipulating the Mouše Embryo, A Laboratory Manual, 2.vydání,

1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY).

Z myší, u kterých se vyvinula embrya, se získaly tři nezávislé linie transgenních myší obsahujících sekvence z Vx6 i HC2.

Tyto linie se označily jako (HCO12)14881, (HCO12)15083 a (HCO12)15087. Každá ze tří linií se potom křížila s myší mající CMD mutaci popsanou v příkladu 1, JKD mutaci (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820), a (KC05)9272 transgen (Fishwild et al. 1996, Nátuře Biotechnology 14: 845-851).

Získané myši exprimovaly transgeny pro lidský imunoglobulinový těžký a kappa lehký řetězec na genetickém základě homozygotním pro narušení endogenních myších lokusů pro těžký a kappa lehký řetězec.

Příklad 3: Produkce lidské monoklonálni protilátky proti EGFR

Dva různé kmeny myší se použily pro generování EGFR reaktivní lidské monoklonálni protilátky. Kmen ((CMD)++;

(JKD)++; (HCo7)l 1952+/++; (KCo5)9272+/++) (zde označený jako HCO7 myši, a kmen ((CMD)++; (JKD)++; (HCol2)15087+/++;

(KCo5)9272+/++) (zde označený jako HCO12 myš). Oba tyto kmeny jsou homozygotní pro narušení endogenních lokusů pro těžký řetězec (CMD) a kappa lehký řetězec (J7KD). Oba kmeny také obsahují transgen pro lidský kappa lehký řetězec (HCo7), a jednotlivá zvířata jsou hemizygotní nebo homozygotní pro inserci #11952. Dva kmeny se liší v použitém transgenů pro lidský těžký řetězec. Myši jsou hemizygotní nebo homozygotní pro HCo7 nebo HCol2 transgen. CMD mutace byla popsána výše v příkladu 1. Příprava (Hcol2)15087 myší je popsána v příkladu 2. JKD mutace (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820) a (KCo5)9272 (Fishwild et al. 1996, Nátuře Biotechnology 14:

113

ΦΦ ·· φφ φ φφφ φφφ φφφ φφφ φ φ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ · φ φ φφφ φφφφ φφ φ φφ *

ΦΦΦ· φφ φ φφ ·

845-851) a (HC07)11952 myši jsou popsány v US patentech č. 5,770,429 a 5,545,806 (Lonberg & Kay, 6/23/98).

Použitý imunizační protokol je popsán v následující Tabulce 3. Myši byly imunizované dvakrát A431 buňkami a potom solubilním antigenem v Ribi Adjuvans. Titr EGFR specifického séra se určil ELISA po třetí imunizaci. Provedly se tři různé imunizace za účelem dosycení před tím, než se provedla fůze. Těmito imunizacemi byly dva nebo tři následné intravenosní (iv) injekce do ocasní žíly za použití 10 gg antigenu v 50 μΐ PBS nebo dvě postupné intraperitoneální (i.p.) dosycovací injekce 25 μρ solubilního EGFR v Ribi adjuvans (viz tabulka 3). Tři myši, které se použily ve fúzi, byly součástí větší skupiny myší, které měly HCo7 a HCol2 genotypy.

Tabulka 3: Imunizační protokol

Imunizační protokol
			ELISA	EGFR	ELISA		EGFR
	A431 buňky	A431 buňky	Titr	V Ribi ÍP	Titr	Fúze	V Ribi ÍP	Fúze
Myš	Den 1	Den 20	Den 30	Den 33	Den 43	Den 4 6	Den 50	Den 53
20241	2xl06	lxlO7	0	25 μg	4050		25 μg	Ribi 2x25 μρ***
20242	2xl06	lxlO7	0	25 μg	4050		25 μg	2 iv x 10 μg*
20243	2xl06	lxlO7	450	25 μς	12125	3 iv x 10 μg*

* EGFR v PBS (10 μ₉) iv v den -4, -3 a -2 ** EGFR v PBS (10 μρ) iv v den -4 a -3 *** EGFR v Ribi (25 μg) ip v den -4 a -3 • ·

444

114 ·· ·· «· 4 44

4 4 444 44

4444 4 444 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4444 4 · 4 • 4 4 · 4· · 44 4 · 4 44 4 44 4

Imunizační strategie použitá pro první dvě injekce, 2-10 xlO⁶ živých A431 buněk ip, vedla k indukci nízkých titrů antiEGFR protilátek (viz Tabulka 2). Nicméně, když byla těmto myším podána třetí imunizace 25 pg/myš solubilního EGFR v Ribi adjuvans, tak se sérové titry zvýšily více než 30-krát. Tyto výsledky jasně demonstrují, že buňky exprimující mnoho EGFR na povrchu buněk jsou velmi efektivní v iniciaci primární imunitní reakce, která byla potom významně zesílena jedinou dávkou přečištěného antigenu v adjuvans.

Poslední dosycovací imunizace před fúzí pro myš 20243 se provedla jako i.v. injekce do ocasní žíly za použití 10 pg solubilního EGFR v PBS ve dny -4, -3 a -2. Triton X-100 v solubilním EGFR podráždění ocasu myši. Proto se pro snížení podráždění myši 20242 podaly pouze dvě dosycovací injekce solubilního EGFR do ocasní žíly ve dny -4 a -3, a myš 20241 dostala dvě i.p. imunizace ve dny -4 a -3, za použití 25 pg EGFR v Ribi adjuvans. Ze tří fúzí vzniklo 46 hybridomů pozitivních na lidský γ, κ-antigen (viz tabulka 4). Myš 20241 samotná, které se podaly i.p. dosycovací injekce s adjuvans, produkovala 35 antigen specifických lidských gamma kappa protilátek.

Tabulka 4

Myš	γκ+	γ/κ+ EGFR +	γ1κ+ EGFR +	γ3κ+ EGFR +
20243	120	14	13	1
20242	35	2	2	0
20241	*	30	28	2

Příklad 4: Příprava hybridomů

Pro fúze se použila P3 X63 ag8.653 myelomová buněčná linie

• · · • · ♦« ♦ • · · · · • · » 9

115 (ATCC CRL 1580, šarže F-15183). Původní ATCC fiola se rozmrazila a expandovala se v kultuře. Z této kultury se připravily očkovací zásobní zmrazené přípravky. Jeden týden před fúzí se rozmrazil čerstvý zásobní roztok buněk.

DMEM s vysokým obsahem glukosy (Mediatech, Cellgro #

10013) obsahující 10% FBS, Pennicillin-Streptomycin (Sigma, P7539), a 5,5 xlO⁵ M 2-merkaptoethanolu (GibcoBRL, 21985-023) se použilo pro kultivaci A431 buněk a myelomových buněk. Další doplňky se přidaly do Hybridomového kultivačního media, konkrétně: 3% Origin-Hybridoma Cloning Factor (Igen, 21001),

OPT doplněk (Sigma, 0-5003), 1,1x10³ M kyseliny oxalooctové, 4,5x10 M natrium-pyruvátu, a 24 mězinárodních jednotek /L hovězího insulinu, HAT (Sigma, H 0262), Ι,ΟχΙΟ^-4 M hypoxantinu, 4,0xl0^-7 M aminopterinu, 1,6χ10⁵ M thymidinu, nebo HT (Sigma, H0137), Ι,ΟχΙΟ^-4 M hypoxanthine, 1,6χ10^-4 M thymidinu.

Charakterizované fetální hovězí sérum (SH30071 šarže #s AJE10321 a AGH6843) se získalo od Hyclone, Logan, Utah. Bezsérové medium obsahovalo DMEM, antibiotika a 2merkaptoethanol.

Sleziny od všech tří myší měly normální velikost a získalo se z nich od 2xl0⁷ do lxlO⁸ splenocytů. Splenocyty se fúzovaly.

Prvotní ELISA test na lidské IgG κ protilátky se provedlo 710 dnů po fúzi. Jamky pozitivní na lidský IgG, K, s etestovaly na ELISA plotnách potažených solubilním EGFR. Antigen pozitivní hybridomy se přenesly na 24-jamkvé plotny a případně do tkáňových kultivačních baněk. EGFR specifické hybridomy se subklonovaly limitním ředěním pro zajištění monoklonálity. Antigen-pozitivní hybridomy se uskladnily v několika stádiích vývoje zmrazením buněk v DMEM 10% FBS plus 10% DMSO (Sigma, ·· ·φ Φ· φφφ φ · φ φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ φ φ φφφ φ

116 • · φ φφφφ · φ

D2650) nebo v Origen Freeze Medium (Igen, #210002). Buňky se skladovaly při -80 °C nebo v LN₂.

Původní EGFR specifické hybridomy se potom hodnotily na epitopovou specificitu a na schopnost blokovat vazbu EGF na EGFR receptor. O myších monoklonálních anti-EGFR protilátkách 225 a 528 bylo již dříve známo, že se váží na EGFR, blokují vazbu EGF na EGFR a že jsou protinádorovými imunoterapeutickými činidly ve studiích na zvířatech i člověku. Proto se tyto protilátky použily, společně s neblokující protilátkou, v kompetitivním ELISA formátu pro identifikaci lidských protilátek majících imunoterapeutické charakteristiky.

Příklad 5: Vazebná afinita

Vazebná afinita pro hybridom 2F8 se stanovila za použití BlAcore 3000 (Biacore, Upsula, Sweden). EGFR přečištěný z A431 buněk se zakoupil od Sigma a imobilizoval se na CM5 čipu podle návodu výrobce. Protilátka 2F8 má rovnovážnou asociační konstantu (K^A) 147 (± 0,52) x 10⁸ M^-1.

Příklad 6: Kompetitivní ELISA testy

Kompetitivní ELISA testy se použily jako prvotní testy ihned potom, co ve 24-jamkových plotnách vznikly první antigen pozitivní hybridomy. Obecně, silná kompetice (80-100%) ukazuje na to, že se protilátka váže váže na stejný epitop nebo na region antigenů v blízkosti kompetující protilátky. Kompetice menší než 50% ukazuje, že se protilátka a její kompetitor váží na regiony antigenů, které nejsou v těsné blízkosti. Iniciální testy se provedly se supernatanty z neklonovaných hybridomů, z nichž mnohé obshaovaly více než jeden hybridom na jamku.

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9 9 • 99 9 • 9 9 9 ·

9999 9 9

9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9· ·9

117 • · 9999

Další testy se provedly se subklony původních jamek. Obr. 1 a 2 ukazují (data na Obr. 1 a 2 jsou uspořádána podle stupně kompetice s MAb 225), že i za použití surových supernatantu buněčné kultury mohou být identifikovány protilátky, které se váží na podobné nebo identické epitopy jako 225 a 528 protilátky. Z tohoto pokusu je také zřejmá odlišná distribuce charakteru kompetitivní vazby pro protilátky získané od myši 20241 a od myší 20242 a 20243. Například, prvních sedm protilátek od #20241 myši (Obr. 1) kompetují silně s MAb 225 i 528. Zbývající protilátky od 20241 kompetují středně nebo slabě s 225 a 528 protilátkami. 5 protilátek (1H6, 2F8, 1A8, 5C5 a 8E1) od 20242 a 20243 myší má silnou kompetici s protilátkou 225 a žádnou nebo slabou kompetici s MAb 528 (Obr. 2). Protilátky 2F6, 8A12, SF12, 6B3 a 6D9 od myší 20242 a 20243 kompetují s MAb 225 i 528, ačkoliv silnější kompetice je s protilátkou 225. Další protilátky od těchto myší nekompetují nebo kompetují slabě s komerčními MAb.

Tyto výsledky prvotních kompetitivních ELISA se potvrdily za použití přečištěných protilátek produkovaných subklonovanými buňkami. Obr. 3 a 4 ukazují, že protilátky SF12 a 6B3 silně kompetují s MAb 225 i 528 a také ukazují na jejich vzájemnou kompetici. Tato data naznačují, že se protilátky váží na stejný epitop nebo region EGFR molekuly jako 225 nebo 528 protilátky. Protilátka 2F8 středně silně kompetuje s MAb 225 a nekompetuje významnějším způsobem s protilátkou 528 (Obr. 3 a 4). Nicméně, protilátky 2F8, 6B3 a SF12 vykazují silnou vzájemnou zkříženou kompetici. Tato data naznačují, že protilátka 2F8 se váže na jiný epitop než 225 a 528 protilátky a že se váže na region EGFR receptoru, který sousedí s nebo se překrývá s epitopem, na který se váží HuMAb 6B3 a SF12. Protilátky 2A2 a 6E9 nekompetují s žádnou MAb a váží se na EGFR epitopy nesouvisející s vazebnými místy 225 a 528 MAb ·# 00

0 0 0

0 000 0

0 0 * 0 0

0 0 0 0

0 0 0

0 0

0 0 0

0 0··

0 0 »

0 0

0000

0

118 (Obr. 3 a 4) .

Příklad 7: EGF/EGFR blokovací testy

Antigen-pozitivní subklony se dále hodnotily v EGF/EGFR blokovacích testech. V těchto testech se použily subklony protilátek, které silně kompetují s MAb 225 a/nebo 528, stejně jako subklony protilátek, které jsou slabými kompetitory nebo nekompetují s 225 nebo 528. několik protilátek se expandovalo v kultivačním mediu a přečistily se protein A chromatografií. Obr. 5 a 6 ukazují, že protilátky 2F8, SF12, a 6B3, které jsou středními ažsilnými kompetitory 225 protilátky v ELISA, jsou silnými blokátory vazby EGF na EGFR. Toto je evidentní v testech provedených v ELISA formátu nebo FACS na buňkách lidského A431 epidermoidního karcinomu. V obou testech byly lidské protilátky stejně dobré nebo lepší než MAb 225. Protilátky 2F8, SF12, 6B3 a 6E9 mají také potobné vazebné charakteristiky na povrchu A431 buněk (obr. 7).

In vitro EGF/EGFR blokovací a ELISA kompetitivní testy prokázaly, že 2F8, SF12 a 6B3 protilátky mají podobné vlastnosti jako jiné anti-EGFR myší a lidské protilátky, o kterých bylo prokázáno, že jsou imunoterapeutickými činidly (Sáto, et al. (1983) Mol. Biol. Med. 511-529; Gill, et al. (1984) J. of Biol. Chem. 259(12):7755-7760). 2F8 protilátka byla celkově v různých testech stejná nebo lepší než 6B3 a SF12 protilátky.

Příklad 8: Inhibice EGF/TGF-α vazby na EGF receptor pomocí lidské monoklonální protilátky k EGF receptoru

Inhibiční testy se provedly na A431 buňkách za použití průtokové cytometrie, ELISA a inhibice ligandem indukované ·· • v

119

ΦΦΦ φφφ φφφ φ φφφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ « φ φ φφφφ φφφφ φφφ φφφ φφφφ φφ φ φφ φ autofosforylace. Myší MAb 225 nebo 525 se použily jako pozitivní kontroly. Irelevantní lidský IgG se použil jako izotypová kontrola. Jediná lidská protilátka, 2F8, se vybrala pro všechny další pokusy. Tato protilátka je zde dále označována též jako Humax-EGFR™. Obr. 8 ukazuje EGF blokovací kapacitu 2F8, která je závislá na koncentraci. 2F8 a m225 blokují stejně, zatímco blokovací kapacita EGF je menší.

Obr. 9 dále ukazuje blokovací kapacitu 2F8 v tom, že účinně inhibuje vazbu EGF a TGF-α na A431 buňky (buňky získané z ovariálního epidermoidního karcinomu a exprimující na svém povrchu lxlO⁶ EGFR molekul). Inhibice 2F8-vazby na A431 buňky se stanovila analýzou na průtokovém cytometru. Buňky se preinkubovaly buď s 5 (prázdné sloupce) nebo 50 pg/ml (plné sloupce) ligandů před tím, než se přidala 2F8. Vazba protilátky bez ligandů (PBS skupina) se stanovila jako 100%. Tyto výsledky ukazují, že 2F8 se váže na EGFR blízko nebo ve stejném místě jako jeho ligandy.

Příklad 9: Inhibice aktivace nádorových buněk za použití lidské monoklonálni protilátky k EGF receptoru

Pro hodnocení schopnosti 2F8 inhibovat aktivaci nádorových buněk se zkoumal vliv 2F8 na EGF-spouštěné reakce buněk, jako je aktivace vlastní tyrosin-kinasové aktivity a současná proliferace buněk. Jednou z prvních událostí po vazbě EGF nebo TGF-α na EGFR je indukce autofosforylace receptoru. Inkubace EGF s A431 buňkami vede k fosforylaci tyrosinu EGFR (M_r 170,000) (Obr. 10A). Zatíco 2F8 sama neaktivuje kinasovou aktivitu receptoru, blokuje protilátka fosforylaci tyrosinu EGFR spouštěnou EGF způsobem závislým na dávce s kompletní inhibici při koncentraci 16,6 nM (molárnípoměr protilátka:EGF 20:1, Obr. 10A). Buňky ošetřené protilátkou a TGF-α ukázaly,

4

4444

120 » 4 4 » 4 4 44 ft 4 4 «

I 4 4 «

4 4 4 • · · 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 4

4444444 4

4 * 4 4 4

4 44 · že fosforylace tyrosinu je zcela blokovaná 2F8 v koncentraci 66 nM (molární poměr protilátka: TGF-a. 7,3:1, Obr. 10B) .

Vazba EGF/TGF-α s receptorem vede k aktivaci buněk, která se odráží v proliferaci buněk. Proto se hodnotil inhibiční efekt 2F8 na růst nádorových buněk (A431, MDA-MD-468 a HN5 buněk). Pokus se provedl za nepřítomnosti exogenního EGF. Myší protilátky se použily ro srovnání. Humax-EGFR inhibovala růst A431 buněk v závislosti na koncentraci s maximální inhibici 50%, což je hodnota podobné hodnotě získané pro myší protilátku 225 (Obr. 14). Kontrolní protilátka neměla žádný vliv na proliferaci buněk (obr. 14). Podobná inhibice růstu byla dosažena při použití dalších dvou buněčných linií (HN5 a MDA-MB468, panely B a C). Protože nebyl do kultury přidán žádný exogenní EGF, ukazují tyto výsledky na schopnost 2F8 blokovat autokrinní stimulaci a tak inhibovat autokrinním EGF/TGF-α indukovanou aktivaci nádorových buněk.

Příklad 10: Lidské monoklonální protilátky k EGF receptoru indukují ADCC

ADCC je účinným imunitním efektorovým mechanismem spouštěným rozpoznáním nádorových buněk protilátkami. Pro hodnocení schopnosti lidských PMN buněk zabíjet A431 buňky za přítomnosti 2F8 se A431 buňky označily ⁵¹Cr a potom se inkubovaly s protilátkou a efektorovými buňkami (PMN) přes noc. Po inkubaci se měřilo uvolňování chrómu. Jak je uvedeno na Obr. 14, je 2F8 schopna indukovat ADCC proti A431 buňkám při použití lidských PMN. 2F8 je schopna zprostředkovat PMNindukovanou lýzu 45% A431 cílových buněk, což vyšší hodnota než pro MAb 425 (Obr. 14).

Důležité je to, že ačkoliv je 2F8 schopna aktivovat ·· ·

121 φ φφφ φ φφφφ φφφ φφ φ φφφφ φ φφφ ΦΦΦΦΦΦΦ φφφφ φ imunitní efektorové buňky a indukovat ADCC, není schopna indukovat lýzu nádorových buněk zprostředkovanou komplementem.

Příklad 11: Lidské monoklonální protilátky k EGF receptoru brání tvorbě nádorů

Pro průkaz schopnosti HuMAb 2F8 bránit tvorbě nádorů u athymických myší se skupinám šesti (6) myší podkožně do kožního záhybu ijikovalo 3xl0⁶ nádorových buněk v 200 μΐ PBS v den nula (0). Potom se myším injikovala i.p. ve dny 1 (75 μ9/200 μΐ), 3 (25 μς/200 μΐ) a 5 (25 μς/200 μΐ) (šipky) buď HuMAb 2F8 (plné čtverečky) nebo Mab proti lidskému IgGl-κ jako kontrola (prázdná kolečka) (Obr. 14). Data jsou uvedena jako průměrné objemy nádorů + SEM, a představují 3 samostatné pokusy, které měly podobné výsledky.

Eradikace vzrostlých A431 nádorových xenotransplantátů HuMAb 2F8 ve srovnání s m225 je uvedena na Obr. 14. Myším se podkožně do kožního záhybu injikovalo 3xl0⁶ nádorových buněk v 200 μΐ PBS ov den nula (0). V de 10 se myši náhodně rozdělily do skupin a léčily se v den 12 (75 pg/200 μΐ) , 14 (25 μg/200 μΐ) a 16 (25 pg/200 μΐ) (šipky) HuMAb 2F8 (plné čtverečky, 2F8 krátkodobě) nebo myší anti-EGFR MAb m225 (plné trojúhelníčky, m225 krátkodobě). Dále se zahrnuly skupiny léčené 75 μρ/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 v den 12, a potom 25 μρ/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 ve dny 14, 16, 19,22, 26, 29, 33, 36 a 40 (prázdné čtverečky, 2F8 dlouhodobě; prázdné trojúhelníčky, m225 dlouhodobě). Data jsou uvedena jako průměrné objemy nádorů + SEM, a představují 3 samostatné pokusy, které měly podobné výsledky. Černé šipky ukazují dny léčby pro krátkodobou léčbu a prázdné šipky ukazují dny léčby pro dlouhodobou léčbu.

»· 99 · · 9 9

9 999 9 9

9 9 9 9 9 · • · · · 9 9

9 · 9 99 • · ····

122 «

9 9

9 9 9

9 9999

9 9 9

99 9

Ekvivalenty

Odborníkům v oboru budou zřejmá mnohá ekvivalentní provedení předkládaného vynálezu. Taková ekvivalentní provedení spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Odkazy

Všechny patenty, patentové přihlášky a další citované publikace jsou zde ve své úplnosti uvedeny jako odkazy.

Claims (50)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Izolovaná lidská monoklonální protilátka, která se váže na lidský EGFR, kde protilátka je vybrána ze skupiny zahrnují protilátky IgGl, IgA, IgE, IgM, IgG4 a IgD.
2. 2 . Izolovaná lidská monoklonální protilátka podle nároku 1, kde protilátkou je IgGl protilátka.
3. 3. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka inhibuje vazbu EGFR ligandu na lidský EGFR.
4. 4. Lidská protilátka podle nároku 1, kde EGFR ligandem je EGF nebo TGF-a.
5. 5. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka se váže na lidský EGFR s rovnovážnou asociační konstantou (K_A) alespoň asi

   10⁸ M'¹.
6. 6. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka se váže na lidský EGFR s rovnovážnou asociační konstantou (K_A) alespoň asi

   10⁹ M¹.
7. 7. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka blokuje vazbu EGFR ligandu na lidský EGFR o alespoň asi 50%.
8. 8. Lidská protilátka podle nároku 2, která obsahuje variabilní region z IgGl těžkého řetězce a variabilní region z kappa lehkého řetězce.
9. 9. Lidská protilátka podle nároku 1, kódovaná nukleovými kyselinami pro lidský těžký řetězec, resp. lidský kappa lehký řetězec, obsahujících ve variabilních regionech nukleotidové ·· · ··· · · · · · · • · · · · · ··· · ··· sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, resp. SEQ ID NO:3 a konzervativní modifikace těchto sekvencí.
10. 10. Lidská protilátka podle nároku 1, mající variabilní regiony těžkého řetězce, resp. kappa lehkého řetězce, které obsahují aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2, resp. SEQ ID NO:4 a konzervativní modifikace těchto sekvencí.
11. 11. Izolovaná lidská monoklonální protilátka, která se váže na epitop EGFR definovaný protilátkou 2F8.
12. 12. Izolovaná lidská monoklonální protilátka, která má vazebné charakteristiky protilátky 2F8.
13. 13 . Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka neaktivuje komplement.
14. 14. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na EGFR s afinitní asociační konstantou (K_A) alespoň asi 10⁸ M'¹.
15. 15. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na EGFR a inhibuje EGF nebo TGF-ct indukovanou autofosforylaci EGFR.
16. 16. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na buňky exprimující EGFR a inhibuje jejich růst.
17. 17. Lidská protilátka podle nároku 16, kde buňkou je nádorová buňka vybraná ze skupiny zahrnující buňky močového měchýře, buňky prsu, buňky tlustého střeva, buňky ledvin, buňky vaječníků, buňky prostaty, renální buňky, spinocelulární buňky a nemalobuněčné plicní buňky.
18. 18. Lidská protilátka podle nároku 16, kde buňka je vybrána ze • ·

    125 skupiny zahrnující synoviální fibroblasty a keratinocyty.
19. 19. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na buňky exprimující EGFR a indukuje lýzu (ADCC) buněk za přítomnosti lidských efektorových buněk.
20. 20. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na buňky exprimující EGFR, ale neindukuje komplementem zprostředkovanou lýzu buněk.
21. 21. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka je Fab fragment nebo jednořetězcová protilátka.
22. 22. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1, produkovaná hybridomem, který zahrnuje B lymfocyt získaný od transgenního non-lidského zvířete majícího genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec, fúzovaný na imortalizovanou buňku.
23. 23. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1, produkovaná transfektomem obsahujícím nukleové kyseliny kódující lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec.
24. 24. Hybridom, zahrnující B lymfocyt získaný od transgenního non-lidského zvířete majícího genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lehký řetězec, fúzovaný na imortalizovanou buňku, kde hybridom produkuje detekovatelná množství monoklonální protilátky podle nároku 1, nebo její vazebné části pro antigen.
25. 25. Transfektom, zahrnující nukleové kyseliny kódující lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec, kde transf ektom produkuje detekovatelná množství monoklonální protilátky podle nároku 1, • · ··· · · · · · · • ···· · ··· · · · · • · · · · · · ···· · · ft ···· ι?6 ·····♦· · · · nebo její vazebné části pro antigen.
26. 26. Transfektom podle nároku 25, zahrnující nukleové kyseliny kódující lidský těžký řetězec, resp. lidský lehký řetězec obsahující ve variabilních regionech nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, resp. SEQ ID NO:3 nebo jejich konzervativní modifikace.
27. 27. Transgenní non-lidské zvíře, které exprimuje protilátky podle nároku 1, kde transgenní non-lidské zvíře má genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec.
28. 28. Způsob produkce protilátky podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    imunizování transgenního non-lidského zvířete majícího genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec pomocí EGFR nebo buňkami exprimujícími EGFR tak, že B-lymfocyty zvířete jsou produkovány protilátky;

    izolování B-lymfocytů zvířete; a fúzování B-lymfocytů s myelomovými buňkami za zisku imortalizovaných hybridomových buněk secernujících protilátky.
29. 29. Bispecifická molekula, zahrnující lidskou protilátku podle nároku 1 a skupinu s vazebnou spécificitou pro lidské buňky prezentující antigen (APC).
30. 30. Bispecifická molekula, zahrnuj ící lidskou protilátku podle nároku 1 a vazebnou specificitu pro lidský Fc receptor.
31. 31. Bispecifická molekula podle nároku 30, kde Fc receptorem je lidský FeyRI nebo lidský Fca receptor.

    • · • «

    127

    99 99 99 9 99 9
32. 32. Bispecifická molekula podle nároku 30, která se váže na Fc receptor v místě, které je odlišné od místa receptore, na které se váže imunoglobulin.
33. 33. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou protilátku podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
34. 34. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci dvou nebo více lidských protilátek nebo jejich vazebných částí pro antigen podle nároku 1, kde každá uvedená protilátka nebo její vazebná část pro antigen se váže na jiný epitop EGFR.
35. 35. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou protilátku podle nároku 1 a chemoterapeutické činidlo.
36. 36. Imunotoxin, zahrnující lidskou protilátku podle nároku 1 navázanou na cytotoxické činidlo.
37. 37. Způsob inhibice růstu buněk exprimujících EGFR, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování buněk s účinným množstvím protilátky podle nároku 1 tak, že dojde k inhibici růstu buněk exprimujících EGFR, kde protilátka inhibuje vazbu EGFR ligandu na lidský EGFR.
38. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že buňkou je buňka vybraná ze skupiny zahrnující buňky močového měchýře, buňky prsu, buňky tlustého střeva, buňky ledvin, buňky vaječníků, buňky prostaty, renální buňky, spinocelulární buňky, nemalobuněčné plicní buňky, synoviální fibroblasty a keratinocyty.

    ♦♦2 ·· · • * · · · • · · 0 0 0 0

    00000 0 0 0000

    0 0 0 0 0

    00 00 00 « 00 ·

    128
39. 39. Způsob indukce cytolýzy buněk exprimujících EGFR, vyznačující se tím, žeže zahrnuje kontaktování buněk exprimuj ících EGFR s protilátkou podle nároku 1 za přítomnosti efektorové buňky tak, že dojde k cytolýze buněk exprimujících EGFR.
40. 40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že buňkou je buňka vybraná ze skupiny zahrnující buňky močového měchýře, buňky prsu, buňky tlustého střeva, buňky ledvin, buňky vaječníků, buňky prostaty, renální buňky, spinocelulární buňky, nemalobuněčné plicní buňky, synoviální fibroblasty a keratinocyty.
41. 41. Způsob léčby nebo prevence onemocnění zprostředkovaného expresí EGFR, vyznačující se tím, že zahrnuje podání lidské protilátky podle nároku 1 v množství účinném pro léčbu nebo prevenci onemocnění zprostředkovaného EGFR jedinci.
42. 42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že onemocnění je zhoubný nádor.
43. 43. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že onemocněním je autoimunitní onemocnění,
44. 44. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že lidská protilátka je konjugována na skupinu, která se specificky váže na Fc receptor.
45. 45. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že lidská protilátka je konjugována na cytotoxin.
46. 46. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, • A ·· A ·· · • A · · AAA • · A · ··· A A A · • A A A AAAAAAA A ·A A že dále zahrnuje současné podání terapeutického činidla.
47. 47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující doxorubicin (adriamycin), cisplatinu, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil, cyklofosfamid a hydroxymočovinu.
48. 48. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že nádor je vybrán ze skupiny zahrnující nádor močového měchýře, nádor prsu, nádor tlustého střeva, nádor ledvin, nádor vaječníků, nádor prostaty, renální nádory a nádory hlavy a krku.
49. 49. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že na onemocnění se podílí hyperproliferace epítelu.
50. 50. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že onemocněním je zánětlivá arthritida.