CZ200438A3 - Název neuveden - Google Patents
Název neuveden Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200438A3 CZ200438A3 CZ200438A CZ200438A CZ200438A3 CZ 200438 A3 CZ200438 A3 CZ 200438A3 CZ 200438 A CZ200438 A CZ 200438A CZ 200438 A CZ200438 A CZ 200438A CZ 200438 A3 CZ200438 A3 CZ 200438A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- human
- cells
- antibody
- egfr
- antibodies
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 441
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 77
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 58
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 47
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 392
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 167
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 115
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 112
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 112
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 61
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 46
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 43
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 28
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 28
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 27
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 27
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 23
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 23
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 17
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 14
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 14
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 13
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 12
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 10
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 claims description 9
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 claims description 9
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 9
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 9
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 8
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims description 6
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 claims description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 6
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 claims description 5
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 claims description 5
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 claims description 5
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- MWWSFMDVAYGXBV-MYPASOLCSA-N (7r,9s)-7-[(2r,4s,5s,6s)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-4-methoxy-8,10-dihydro-7h-tetracene-5,12-dione;hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-MYPASOLCSA-N 0.000 claims description 4
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 4
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960004395 bleomycin sulfate Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims description 4
- VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N Hydroxyurea Chemical compound NC(=O)NO VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 3
- 229960001330 hydroxycarbamide Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 claims description 3
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 claims description 3
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims 21
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 21
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 21
- 210000003443 bladder cell Anatomy 0.000 claims 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims 3
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 claims 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 claims 2
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 claims 2
- WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-O 3-[[2-[2-[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3s,4r)-4-[[(2s,3r)-2-[[6-amino-2-[(1s)-3-amino-1-[[(2s)-2,3-diamino-3-oxopropyl]amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2r,3s,4s,5r,6r)-4-carbamoyloxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)ox Chemical compound OS(O)(=O)=O.N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-O 0.000 claims 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 abstract description 38
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 33
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 18
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 16
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 16
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 10
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 288
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 288
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 104
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 72
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 62
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 51
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 47
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 39
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 38
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical group P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 36
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 34
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 31
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 27
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 23
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 22
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 16
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 16
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 15
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 13
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 12
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 12
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 11
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 9
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 9
- -1 radiation Substances 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 8
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 7
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 6
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 6
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 6
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 6
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 6
- 238000012450 HuMAb Mouse Methods 0.000 description 6
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 6
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 6
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 5
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 5
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 5
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 5
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 5
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 4
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 4
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 3-[[2-[2-[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3s,4r)-4-[[(2s,3r)-2-[[6-amino-2-[(1s)-3-amino-1-[[(2s)-2,3-diamino-3-oxopropyl]amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2r,3s,4s,5r,6r)-4-carbamoyloxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)ox Chemical compound OS([O-])(=O)=O.N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1NC=NC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 3
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 3
- 101100297421 Homarus americanus phc-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IPVFGAYTKQKGBM-BYPJNBLXSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound F[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 IPVFGAYTKQKGBM-BYPJNBLXSA-N 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 102000007299 Amphiregulin Human genes 0.000 description 2
- 108010033760 Amphiregulin Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 2
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102400001329 Epiregulin Human genes 0.000 description 2
- 101800000155 Epiregulin Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N UNPD55612 Natural products N1C(O)C2CC(C=CC(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 2
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 2
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000049265 human CDR1 Human genes 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 2
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 2
- 230000015286 negative regulation of phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N (R)-alpha-Tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJNLYGOUHDJHMG-UHFFFAOYSA-N 1-n,4-n-bis(5-methylhexan-2-yl)benzene-1,4-diamine Chemical compound CC(C)CCC(C)NC1=CC=C(NC(C)CCC(C)C)C=C1 ZJNLYGOUHDJHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- WONYMNWUJVKVII-UHFFFAOYSA-N 3,5-diiodothyropropionic acid Chemical compound IC1=CC(CCC(=O)O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C=C1 WONYMNWUJVKVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXPSQDAMFATNNG-UHFFFAOYSA-N 3-[2-(2,5-dioxopyrrol-3-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C=2C(=CC=CC=2)C=2C(NC(=O)C=2)=O)=C1 VXPSQDAMFATNNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 6-Mercaptoguanine Natural products N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100012887 Drosophila melanogaster btl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012878 Drosophila melanogaster htl gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N Emetamine Natural products O(C)c1c(OC)cc2c(c(C[C@@H]3[C@H](CC)CN4[C@H](c5c(cc(OC)c(OC)c5)CC4)C3)ncc2)c1 MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100030385 Granzyme B Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030500 Heparin cofactor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001009603 Homo sapiens Granzyme B Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 101150042441 K gene Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N Mitobronitol Chemical compound BrC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CBr VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N SJ000285215 Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C1CC1CC2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2CC1CC AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 208000006981 Skin Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101001057322 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) Methionine aminopeptidase C Proteins 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000007720 allelic exclusion Effects 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 238000011230 antibody-based therapy Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000032 aromatic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010385 ascorbyl palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N chembl557217 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002023 chloroprocaine Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011220 combination immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940043237 diethanolamine Drugs 0.000 description 1
- 229940079920 digestives acid preparations Drugs 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 1
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N emetine Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229940012017 ethylenediamine Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000044888 human CDR2 Human genes 0.000 description 1
- 102000056549 human Fv Human genes 0.000 description 1
- 108700005872 human Fv Proteins 0.000 description 1
- 229940096329 human immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 108010023260 immunoglobulin Fv Proteins 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 230000003426 interchromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 150000008146 mannosides Chemical class 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005485 mitobronitol Drugs 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 101150006061 neur gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000005892 protein maturation Effects 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011125 single therapy Methods 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940100996 sodium bisulfate Drugs 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940001482 sodium sulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-OUBTZVSYSA-N sodium-24 Chemical compound [24Na] KEAYESYHFKHZAL-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- XXUZFRDUEGQHOV-UHFFFAOYSA-J strontium ranelate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)C=1SC(C([O-])=O)=C(CC([O-])=O)C=1C#N XXUZFRDUEGQHOV-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 108010033090 surfactant protein A receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=NC=N[C]21 MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N tocofersolan Chemical compound OCCOC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Lidské monoklonální protilátky k receptoru epidermálního ' růstového faktoru (EGFR)
Související přihlášky
Předkládaný vynález uplatňuje prioritu z U.S. prozatímní přihlášky č.: 60/298,172, podané 13.6.2001, která je zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti.
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká izolovaných lidských monoklonálních protilátek, které se specificky váží na lidský EGFR, a souvisejících kompozic a molekul na bázi protilátek. Lidské protilátky mohou být produkovány transgenními myšmi, které jsou schopné produkovat mnoho izotypů lidských monoklonálních protilátek díky V-D-J rekombinaci a přesmyku izotypů. Vynález také popisuje farmaceutické prostředky obsahující tyto protilátky, non-lidská transgenní zvířata a hybridomy, které produkují lidské protilátky, a terapeutické a diagnostické metody pro použití lidských protilátek.
Dosavadní stav techniky
EGF receptor (EGFR) je 170 kDa transmembránová molekula typu 1. Bylo zjištěno, že její exprese je zvýšena u mnoha lidských nádorů, včetně karcinomů hlavy a krku, prsu, tlustého střeva, prostaty, plic a vaječníků. Stupeň nadměrné exprese koreluje se špatnou klinickou prognosou (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology 4:277-296) . Kromě toho je její exprese často doprovázena produkcí EGFR ligandů, například TGF-α a EGF, buňkami exprimujícími EGFR, což ukazuje na podíl • · autokrinní zpětnovazebně smyčky při progresi těchto nádorů (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology. 4:277-296). Blokování interakce mezi takovými EGFR ligandy a EGFR může tedy inhibovat růst a přežívání nádorů (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154).
Monoklonální protilátky (MAb) namířené proti vazebné doméně EGFR pro ligand mohou blokovat interakci s EGF a TGF-a a tím současně intracelulární signální dráhu. Bylo připraveno několi myších monoklonálních protilátek, které dosahují takového blokování in vitro a tyto protilátky byly hodnoceny na svou schopnost ovlivňovat růst nádorů v modelech myších xenotransplantátů (Masui, et at. (1986) Cancer Res. 46: 55925598; Masui, et al. (1984) Cancer Res. 44: 1002-1007; Goldstein, et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318). Při podání jeden den po aplikaci lidských nádorových buněk byla většina těchto anti-EGFR MAb schopna účinně bránit tvorbě nádorů u athymických myší (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154). Nicméně, při injekci myším s již vzrostlými xenotransplantáty způsobovaly tyto myší MAb (např. MAb 225s a 528) pouze parciální regresi nádorů. Pro eradikaci nádorů bylo potřebné současné podání chemoterapeutických léků (Baselga, et al. (1994) Pharmac. Therapeut. 64:127-154; Fan, et al. (1993) Cancer Res. 53: 4322-4328; Baselga, et al.
(1993) J. Nati. Cancer Inst. 85: 1327-1333).
Ačkoliv tedy dosud získané výsledky jasně určují EGFR jako cíl pro imunoterapii, ukazují zároveň, že myší protilátky nejsou ideálními terapeutickými činidly. Kromě toho léčba myšími protilátkami obvykle spouští těžkou imunitní reakci u pacienta. Pro překonání imunogenicity myších protilátek by měla být terapeutická činidla v ideální situaci plně lidská.
• · · · • ·
I · · · · • · · · · · ·
Krokem směrem k tomuto cíli je chimérická verze 225 MAb (C225) , ve které jsou variabilní regiony myší protilátky navázány na lidské konstantní regiony. Ačkoliv má C225 lepší protinádorovou aktivitu při léčbě již uchycených xenotransplantovaných nádorů in vivo, je tohoto účinku dosaženo pouze při použití vysokých dávek (Goldstein, et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1:1311-1318). V současnosti se C225 hodnotí v klinických pokusech v léčbě růszných typů solidních nádorů (Baselga, J. (2000) J. Clin. Oncol. 18: 54S-59S; Baselga, J. (2000) Ann. Oncol. 11 Suppl 3: 187-190, 2000).
Proto existuje potřeba lepší terapeutické protilátky proti EGFR, která by byla účinná v léčbě a/nebo prevenci onemocnění souvisejících s nadměrnou expresí EGFR při podání v nízkých dávkách a která by nevyvolávala imunitní reakci u pacienta. Jak bylo popsáno výše, monoklonální protilátky (MAb) mají významnou úlohu v mnoha diagnostických a terapeutických způsobech a staly se ještě atraktivnějšími činidly poté, co nedávné pokroky umožnily přípravu plně lidských protilátek. Protilátky a deriváty protilátek tvoří 25% v současnosti vyvíjených biologických léčiv a mnoho z nich je určeno pro protinádorovou léčbu. Protilátky kombinují specificitu pro cíl s kapacitou účinně aktivovat imunitní systém. Kombinace těchto vlastností společně s jejich dlouhým biologickým poločasem upozorňují výzkumníky na terapeutický potenciál protilátek. Toto nedávno kulminovalo ve schválení několika protilátek v protinádorové léčbě v U.S. Food and Drug Administration (FDA).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje vylepšená protilátková terapeutická činidla pro léčbu a prevenci onemocnění souvisejících s, expresí EGFR, konkrétně nádorů exprimujících • · φ φφφ » φφφ φ · φ · ·φ · · ···· φφφ φφφ φφ φ φφ φ φ · φ φ
EGFR a autoimunitních onemocnění. Protilátky jsou vylepšené tak, že jsou plně lidské (zde dále označováno jakoHUMAb™) a proto jsou u pacientů méně imunogenní. Protilátky jsou také terapeuticky efektivní (např. v prevenci růstu a/nebo funkce buněk exprimuj ících EGFR) v nižších dávkách než jiné anti-EGFR protilátky. Dále, v některých provedení mají protilátky další výhodu v tom, že neaktivují komplement (například neindukují komplementem zprostředkovanou lýzu cílových buněk, což snižuje nežádoucí účinky související s léčbou.
V j ednom provedení předkládaný vynález poskytuje izolované lidské monoklonálni protilátky, které se specificky váží na lidský receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR), stejně jako prostředky obsahující jednu nebo více kombinací takových protilátek. Lidské protilátky inhibují (např. blokují) vazbu EGFR ligandů, jako je EGF a TGF-α, na EGFR. Například, vazba EGFR ligandů na EGFR může být inhibována o alespoň přibližně 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, nebo 100% a výhodně je výsledkem prevence EGFR buněčné signalizace.
Výhodné lidské protilátky podle předkládaného vynálezu inhibují růst a/nebo zprostředkují usmrcování (například lýzou nebo fagocytosou) buněk exprimujících EGFR (in vitro nebo in vivo) za přítomnosti lidských efektorových buněk (např., polymorfonukleárních buněk, monocytů, makrofágů a dendritických buněk), ale neaktivují komplementem zprostředkovanou lýzu buněk, které exprimuj i EGFR. Proto mohou být lidské monoklonálni protilátky podle předkládaného vynálezu použity jako diagnostická nebo terapeutická činidla in vivo a in vitro.
V jednom provedení jsou lidské protilátky podle předkládaného vynálezu IgGl (např. IgGlk) protilátky tvořené • · s »······ · ·
IgGl těžkým řetězcem a kappa lehkým řetězcem. Nicméně, protilátky jiných izotypů také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, včetně IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, a IgE. Protilátkami mohou být celé protilátky nebo antigen-vazebné fragmenty protilátky, včetně Fab, F(ab')2, Fv a řetězce Fv fragmentů.
V konkrétním provedení je lidská protilátka kódována nukleovými kyselinami kódujícími lidský IgG těžký řetězec a lidský kappa lehký řetězec, kde uvedené nukleové kyseliny obsahují ve variabilních regionech nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:3, v příslušném pořadí, a jejich konzervativní modifikace. V jiném provedení lidské protilátky obsahují variabilní regiony IgG těžkého řetězce a kappa lehkého řetězce, které jsou tvořeny aminokyselinovými sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4, v příslušném pořadí, a sekvencemi s konzervativní modifikací těchto sekvencí.
V jiném konkrétním provedení lidské protilátky odpovídají protilátce 2F8 nebo protilátce, která se váže na stejný epitop jako (např. kompetuje s) nebo má stejné funkční vazebné charakteristiky jako protilátka 2F8.
Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány rekombinantně v hostitelských buňkách, jako je transfektom (např. transfektom skládající se imortalizovaných CHO buněk nebo lymfocytárních buněk) obsahující nukleové kyseliny kódující těžký a lehký řetězec protilátky, nebo mohou být získány přímo z hybridomu, který exprimuje protilátky (například který je tvořen B-lymfocyty získanými z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, majícími genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a • 9 transgen pro lidský lehký řetězec, které kódují protilátky, fúzovanými na imortalizované buňky). V konkrétním provedení jsou protilátky produkovány hybridomem označeným jako 2F8 nebo transfektovanou hostitelskou buňkou (např. CHO buňkou) obsahující nukleovou kyselinu pro lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec, která obsahuje ve svých variabilních regionech nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3, v příslušném pořadí, a jejich konzervativní modifikace.
V jiném provedení mohou být lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu charakterizovány jednou nebo více z následujících vlastností:
a) specificitou pro EGFR;
b) vazebnou afinitou k EGFR s rovnovážnou asociační konstantou (KA) alespoň přibližně 107 M_1, výhodně přibližně, ΙΟ8 Μ-1, 109 M_1, a výhodněji přibližně ΙΟ10 M“1 až 1011 M’1 nebo vyšší;
c) disociační konstantou (KD) z EGFR přibližně 10~3s_1, výhodně přibližně 10_4s_1, výhodněji 10_5s_1, a nejvýhodněji 10”6s_1;
d) schopností opsonizovat buňky exprimující EGFR; nebo
e) schopností inhibovat růst a/nebo zprostředkovat fagocytosu a zabíjení buněk exprimujících EGFR (např. nádorových buněk) za přítomnosti lidských efektorových buněk v koncentraci přibližně 10 μς/ιηΐ nebo menší (např. in vitro) .
Příklady nádorových buněk exprimujících EGFR, které mohou být zacíleny (např. opsonizovány) lidskými protilátkami podle předkládaného vynálezu jsou například buňky nádorů močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, spinocelulárních karcinomů, nádorů plic (nemalobuněčných) a nádorů hlavy a krku. Mezi další buňky exprimující EGFR patří synoviální fibroblasty a keratinocyty, které mohou být použity jako cílové buňky například při léčbě artritidy a psoriasy, v příslušném pořadí.
«· 4 • 4 4
4 4 · 4 4 4
4 4 44444
4 4 4 «4 4
V jiném provedení se lidské protilátky podle předkládaného vynálezu váží na EGFR antigen s afinitní konstantou alespoň přibližně 108 M’1, výhodněji alespoň přibližně 109 M'1 nebo 1O10 M'1, a jsou schopné inhibovat růst a/nebo zprostředkovat fagocytosu a zabíjení buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk, např. polymorfonukleárních buněk (PMN) , monocytů a makrofágů, s IC50 přibližně 1 x 107 M nebo menší, nebo v koncentraci přibližně 10 μρ/ιηΐ nebo menší (in vitro).
V ještě jiném provedení lidské protilátky podle předkládaného vynálezu inhibují EGFR-zprostředkovanou buněčnou signalizaci. Například mohou protilátky inhibovat EGFR ligandem (např., EGF nebo TGF-α) indukovanou autofosforylaci EGFR. Protilátky mohou také inhibovat autokrinní EGF nebo TGF-α indukovanou aktivaci buněk nebo mohou indukovat lýzu (ADCC) EGFR exprimujících buněk za přítomnosti lidských polymorfonukleárních buněk. Mezi buňky exprimující EGFR patří například buňky močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, ledvin, spinocelulární buňky, nemalobuněčné plicní buňky, synoviální fibroblasty a keratinocyty.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje molekuly nukleové kyseliny kódující protilátky, nebo jejich antigen-vazebné části, podle předkládaného vynálezu. Rekombinantní expresní vektory, které obsahují nukleové kyseliny kódující protilátky podle předkládaného vynálezu, a hostitelské buňky transfektované takovými vektory, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu, stejně jako způsoby přípravy protilátek podle předkládaného vynálezu kultivováním takových hostitelských buněk, např. expresní vektory obsahující ·· «· φφφ φφφ φ φφ φφφ φφφ φ φφφφ φ φφφ » φφφ φ φφ φφφ φφφφφφφ φφφφφ *#φφφ *» · ·· · nukleotidovou sekvenci kódující variabilní a konstantní regiony těžkých a lehkých řetězců protilátky 2F8 produkované hybridomem.
V dalším aspektu předkládaný vynález také poskytuje izolované B-lymfocyty z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, které exprimují lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu. Výhodně jsou izolované B-lymfocyty získány z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, která byla imunizována přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR. Výhodně má transgenní non-lidské zvíře, např. transgenní myš, genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu. Izolované B-lymfocyty jsou potom imortalizovány a tvoří zdroj (např. hybridom) lidské anti-EGFR protilátky.
V souladu s tím předkládaný vynález také poskytuje hybridom schopný produkovat lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu, které se specificky váží na EGFR. V jednom provedení je hybridomem B lymfocyt získaný z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu, fúzovaný s imortalizovanou buňkou. Konkrétní hybridomy podle předkládaného vynálezu jsou 2F8.
V dalším aspektu vynález poskytuje transgenní non-lidské zvíře, jako je transgenní myš (zde též označovaná jako HuMAb), která exprimuje lidské monoklonální protilátky, které se specificky váží na EGFR. V konkrétním provedení je
000
0
0 • ·
0 0 0 0
0 0 ·
0 0000 0 0 0 ·
transgenním non-lidským zvířetem transgenní myš mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu. Transgenní non-lidské zvíře může být imunizováno přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR. Výhodně je transgenní non-lidské zvíře, např. transgenní myš, schopná produkovat více izotypů lidské monoklonální protilátky k EGFR (např., IgG, IgA a/nebo IgM) pomocí V-D-J rekombinace a přesmyku izotypů. Přesmyk izotypů může být klasický nebo neklasický přesmyk izotypů.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsoby pro produkci lidských monoklonálních protilátek, které specificky reagují s EGFR. V jednom provedení způsob zahrnuje imunizaci a transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec kódující celou nebo část protilátky podle předkládaného vynálezu, přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR. B-lymfocyty (např. splenické B-lymfocyty) zvířete se potom odeberou a fúzují se s myelomovými buňkami za zisku imortalizovaných, hybridních buněk, které secernují lidské monoklonální protilátky proti EGFR.
V dalším aspektu jsou lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu derivatizovány, navázány nebo současně exprimovány s jinou funkční molekulou, např. jiným peptidem nebo proteinem (např. Fab' fragmentem). Například mohou být protilátky nebo jejich vazebné části pro antigen podle předkládaného vynálezu funkčně navázány (např. chemickou vazbou, genetickou fúzí, nekovalentní vazbou nebo jinak) na jednu nebo více jiných molekul, jako je jiná protilátka (např.
·· • · 9
9 9 99 · · · • · · · • · · ·
9 99 9
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9 9999 · · · ·«···
9 9 9 9 ·
9» 9 99 9 za vzniku bispecifické nebo a multispecifické protilátky), cytoxin, buněčný ligand nebo antigen. Předkládaný vynález tedy zahrnuje velké množství protilátkových konjugátů, bi- a multispecifických molekul, fúzních proteinů, které se všechny váží na buňky exprimující EGFR a které jsou zacílené jinými molekulami na buňky, nebo které se váží na EGFR a na jiné molekuly nebo buňky.
V konkrétním provedení vynález zahrnuje bispecifické nebo multispecifické molekuly obsahující alespoň jednu první vazebnou specificitu pro EGFR (např. lidskou anti-EGFR protilátku nebo její fragment nebo mimetikum), a druhou vazebnou specificitu pro Fc receptor, např. lidský FcyRI nebo lidský Fca receptor, nebo jiný antigen na buňkách prezentujících antigen (APE). Obvykle bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu protilátku, nebo její fragment (např. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, nebo jednořetězcový Fv), výhodně lidskou protilátku nebo její část, nebo chimérickou nebo humanizovanou protilátku nebo její část (např. mají variabilní region, nebo alespoň komplementaritu určující region (CDR), odvozený od non-lidské protilátky (např. myší) se zbývajícími částmi z lidské protilátky.
V souladu s tím předkládaný vynález zahrnuje bispecifické a multispecifické molekuly, které se váží na lidský EGFR i na Fc receptor, např. lidský IgG receptor, např. Fc-gamma receptor (FcyR), jako je FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), a FcyRIII (CD16). Mohou být zaměřeny i další Fc receptory, jako jsou lidské IgA receptory (např. FcaRI). Fc receptor je výhodně lokalizován na povrchu efektorových buněk, např. monocytů, makrofág nebo aktivovaných polymorfonukleárních buněk. Ve výhodném provedení se bispecifické a multispecifické molekuly • · ·· ·· « · · « 9 999
9 9
9 9
9 9 9
9 9999
9 9 9
9 9 9 9
Π
váží na Fc receptor v místě, které je odlišné od imunoglobulinového Fc (např., IgG nebo IgA) vazebného místa receptoru. Tak není vazba bispecifických a multispecifických molekul blokována fyziologickými koncentracemi imunoglobulinu.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje konjugát obsahující lidskou anti-EGFR protilátku podle předkládaného vynálezu navázanou na terapeutickou skupinu, např. cytotoxický lék, enzymaticky aktivní toxin, nebo jeho fragment, radioizotop, nebo malou protinádorovou molekulu.
Alternativně mohou být lidské protilátky podle předkládaného vynálezu podány současně s takovými terapeutickými a cytotoxickými činidly, ale ne navázané na tato činidla. Mohou být podány současně s takovými činidly (například v jednom prostředku nebo samostatně) nebo mohou být podány před nebo po takových činidlech. Mezi taková činidla patří chemoterapeutika, jako je doxorubicin (adriamycin), cisplatina, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil, cyklofosfamid, hydroxyurea. Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také aplikovány současně s radioterapií.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje prostředky, např. farmaceutické a diagnostické prostředky/kity, obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a alespoň jednu lidskou monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu, nebo její vazebnou část pro antigen, která se specificky váže na EGFR. V jednom provedení prostředek obsahuje kombinaci lidských protilátek nebo jejich vazebných částí pro antigen, které se výhodně každá váže na jiný epitop. Například, farmaceutický prostředek obsahující lidskou monoklonální protilátku, která zprostředkuje vysoce účinné zabíjení φφ φ • Φ φφ • φ φ φ φφφφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ φ φφ φ φ φ · φ φφφ φ ΦΦΦΦΦ φφφ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφφφ φφφ cílových buněk za přítomnosti efektorových buněk může být kombinován s jinou lidskou monoklonální protilátkou, která inhibuje růst buněk exprimujících EGFR. Tak kombinace poskytuje různé typy terapie, které jsou specificky upraveny tak, aby bylo dosaženo maximálního terapeutického přínosu. Prostředky, např. farmaceutické prostředky, obsahující kombinaci alespoň jedné lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu, nebo její vazebné části pro antigen, a alespoň jedné bispecifické nebo multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu.
V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro inhibování proliferace a/nebo růstu buněk exprimujících EGFR, a/nebo indukování zabíjení buněk exprimujících EGFR, za použití lidské protilátky podle předkládaného vynálezu a s ní souvisejících prostředků, jak byly popsány výše. V jednom provedení způsob zahrnuje kontaktování buněk exprimujících EGFR in vitro nebo in vivo s jednou nebo s kombinací lidských monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu za přítomnosti lidských efektorových buněk. Způsob může být použit v kultuře, např. in vitro nebo ex vivo (např. v kulturách buněk exprimujících EGFR a efektorových buněk). Například, vzorek obsahující buňky exprimující EGFR a efektorové buňky může být kultivován in vitro a může být smísen s protilátkou podle předkládaného vynálezu, nebo její vazebnou částí pro antigen (nebo s bispecifickou nebo multispecifickou molekulou podle předkládaného vynálezu). Alternativně může být způsob proveden u jedince,' například jako součást in vivo (např. terapeutického nebo profylaktického) protokolu.
Pro použití v léčbě in vivo a v prevenci onemocnění
99
9 9
9 999
9 9 9
9 9 9
9 9
9
9 9
9 9 9
9 9919
9 9
9
9
9 9 9 9
9999 9 9
9 souvisejících s expresí EGFR (např. s nadměrnou expresí) jsou lidské protilátky podle předkládaného vynálezu podány pacientům (např., lidským jedincům) terapeuticky účinných dávkách (např. v dávkách, které vedou k inhibici růstu, k fagocytose a/nebo k usmrcení nádorových buněk exprimujících EGFR), za použití jakéhokoliv vhodného způsobu podání, jako je injekční podání nebo jakékoliv jiné způsoby podání známé v oboru pro podávání protilátek.
Typickými onemocněními souvisejícími s EGFR, která mohou být léčeně terapeuticky a/nebo preventivně za použití lidské protilátky podle předkládaného vynálezu jsou, například, autoimunitní onemocnění a nádorová onemocnění. Mezi nádory, které mohou být terapeuticky a/nebo preventivně léčeny, patří karcinom močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, spinocelulární karcinomy, karcinomy plic (nemalobuněčné) a karcinomy hlavy a krku. Mezi autoimunitní onemocnění, která mohou být léčena, patří například psoriasa a zánětlivá artritida, např. revmatoidní artritida, artritida asociovaná se systémovým lupus erythematodes a psoriatická artritida.
V jednom provedení je pacient dále léčen chemoterapeutickým léčivem, radiací nebo činidlem, které moduluje, například inhibuje nebo zesiluje, expresi nebo aktivitu Fc receptoru, např. Fca receptoru nebo Fcy receptoru, jako je cytokin. Typickými cytokiny pro podání během léčby jsou granulocytární kolonie-stimulační faktor (G-CSF), granulocytární-makrofágové kolonie-stimulační faktor (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ), tumor nekrosis faktor (TNF). Mezi typická terapeutická činidla patří, například, anti-neoplastická činidla, jako je doxorubicin (adriamycin), cisplatina, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil a cyklofosfamid, ·« · • 9 9 *· ·« • · · • · ··· * · • · ·
9 9 9
9 999
9 9
9
9 9 9 9
999 9 9999 9 9
9 9 9 9 hydroxyurea.
Pro zvýšení terapeutické účinnosti lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu proti nádorovým buňkám, které neexprimují vysoké koncentrace EGFR mohou být protilátky podány současně s činidlem, které zvyšuje expresi EGFR, jako je lymfokinový přípravek, který zvyšuje a způsobuje více homogenní expresi RGFR na nádorových buňkách. Mezi lymfokinové přípravky vhodné pro podání patří interferongamma, tumor nekrosis faktor a jejich kombinace. Tyto přípravky mohou být podány intravenosně. Vhodné dávky lymfokinu jsou obvykle v rozmezí od 10000 do 1000000 jednotek/pacienta.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro detekování in vitro nebo in vivo přítomnosti EGFR antigenu ve vzorku, např. pro diagnosu onemocnění souvisejícího s EGFR. V jednom provedení je tohoto dosaženo kontaktováním testovaného vzorku, volitelně spolu s kontrolním vzorkem, s lidskou monoklonální protilátkou podle předkládaného vynálezu (nebo její vazebnou část pro antigen) za podmínek umožňujících tvorbu komplexu mezi protilátkou a EGFR. Potom je detekována tvorba komplexu (např. za použití ELISA). Při použití kontrolního vzorku s testovaným vzorkem je komplex detekován v obou vzorcích a jakýkoliv statisticky významný rozdíl ve tvorbě komplexů mezi vzorky ukazuje na přítomnost EGFR antigenu v testovaném vzorku.
Další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou jasné z následujícího podrobného popisu a připojených patentových nároků.
• ·
• φφ 4 4 · 4 4444 4 4
4444 44 4 · • 4 · · ·· ·
4
4 4
4··· • 4
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 je graf ukazující kompetitivní ELISA se supernatanty hybridomů od myší 20241 versus myší monoklonální anti-EGFR MAb 225, 528 a AB5.
Obr. 2 je graf ukazující kompetitivní ELISA se supernatanty lidské protilátky od myší 20242 a 20243 versus myší monoklonální anti-EGFR MAb 225, 528 a AB5.
Obr. 3 je graf ukazující kompetitivní ELISA s přečištěnou lidskou protilátkou versus myší monoklonální anti-EGFR MAb 225 a 528.
Obr. 4A, 4B, 4C a 4D jsou grafy ukazující kompetitivní ELISA s HuMAb (A) 6B3, (B) SF12, (C) 2F8, a (D) 2A2.
Obr. 5A a 5B jsou grafy ukazující inhibici vazby EGF-biotinu na EGFR způsobenou anti-EGFR HuMAb a myší MAb (ELISA formát).
Obr. 6 je graf ukazující inhibici vazby EGF-biotinu na EGFR na A431 buňkách způsobenou anti-EGFR HuMAb a myší MAb.
Obr. 7 je graf ukazující titraci anti-EGFR HuMAb na A431 buňkách.
Obr. 8 je graf ukazující schopnost 2F8 inhibovat vazbu EGF na přečištěný a nativní EGFR. Efekt 2F8 (kosočtverce), myší 225 (čtverečky), EGF (trojúhelníčky) nebo lidské IgGl kappa izotypové kontroly (plná kolečka) se měří podle vazby EGFbiotinu na imobilizovaný EGFR. Jak je uvedeno na obr. 8, je 2F8 schopna inhibovat vazbu EGF-biotinu s IC50 17 nM, signifikantně nižší než pro 225 (IC50 30 nM) .
···· • · • ♦ · • · · * • ····♦ • · · ♦ · ·
Obr. 9 je sloupcový graf ukazující schopnost 2F8 inhibovat vazbu EGF a TGF-α na A431 buňky. A431 buňky jsou odvozeny od ovariálního epidermoidního karcinomu a exprimují nadměrně lxlO6 EGFR molekul na svém povrchu. Inhibice vazby 2F8 na A431 buňky se stanovila pomocí průtokové cytometrie. Buňky se preinkubovaly s buď 5 (prázdné sloupce) nebo 50 pg/ml (plné sloupce) ligandu před tím, než se přidala 2F8. Vazba protilátky bez ligand (PBS skupina) se brala jako 100%. Jak je patrné, je vazba EGF a TGF-α na A431 buňky účinně blokována 2F8. Tyto výsledky ukazují, že 2F8 se váže na EGFR těsně vedle nebo ve stejném místě jako ligandy.
Obr. 10A a 10B ukazují efekt monoklonální anti-EGFR na autofosforylaci A431 buněk. Sérově-deprivované subkonfluentní A431 buňky se ošetřily různými protilátkami, jak je popsáno v metodách (10 pg/ml), stimulovaly se buď EGF (A) nebo TGF-a (B), a extrahovaly se. Fosforylace EGFR se analyzovala SDSPAGE a imunohybridizací ta použití antifosfotyrosinové protilátky.
Obr. 11A, 11B a 11C jsou grafy ukazující inhibici růstu EGFR-exprimujících nádorových buněčných linií anti-EGFR lidskými protilátkami. EGFR-exprimující nádorové buněčné linie A431 (A), HN5 (B) a MDA-MB-468 (C) se inkubovaly s různými koncentracemi HuMAb 2F8 (čtverečky), 5C5 (trojúhelníčky), 6E9 (křížky), 2A2 (kosočtverečky), negativními kontrolními protilátkami anti-CTLA4 (prázdná kolečka), protilátkovou pozitivní kontrolou 225 (plná kolečka) nebo pouze s mediem (kontrola) po dobu sedmi (7) dnů. Potom se hodnotil růst buněk za použití barvení fixovaných buněk krystalovou violetí. Procentuální inhibice růstu se vypočetla jako množství proteinu zbývajícího po sedmi (7) denní inkubaci ve srovnání φφ · φφφ φ φφφφ φ • φ φφφφ φ · φφφ φ φφφ
Φ · φ * φ φ φφφφ φ φφ · s množstvím proteinu přítomného ve skupině s kontrolním mediem pouze. Data představují tři měření a jsou ze tří pokus. Provedených v různé dny.
Obr. 12 je graf ukazující lidskou PMN zprostředkovanou na protilátkách závislou buněčnou cytotoxicitu. PMN se izolovaly popsaným způsobem. A431 buňky značené 51Cr se umístily do 96jamkových ploten s plochým dnem. PMN se přidaly v poměru efektorové:cílové buňky 100:1 a protilátky se přidaly v různých koncentracích. Po inkubaci přes noc se měřilo uvolňování 51Cr.
Obr. 13 je graf ukazující prevenci tvorby nádorů dosaženou HuMAb 2F8 v modelu athymických myší. Skupinám šesti (6) myší se podkožní injekcí na boku podalo 3 x 106 nádorových buněk v 200 μΐ PBS v den 0. Potom se myším aplikovala i.p. injekcí ve dny 1 (75 μg/200 μΐ) , 3 (25 μg/200 μΐ), a 5 (25 μg/200 μί) (šipky) HuMAb 2F8 (plné čtverečky) i.p. lidská IgGl-κ Mab, jako kontrola (prázdná kolečka. Data jsou prezentována jako průměrný objem nádorů + SEM, a jsou reprezentativní pro 3 jednotlivé pokusy, které vedly k podobným výsledkům.
Obr. 14 je graf ukazující eradikaci vzrostlých A431 nádorových xenotransplantátů HuMAb 2F8 ve srovnání s myší anti-EGFR MAb (m225). Myším se podkožní injekcí naboku aplikovalo 3xl06 nádorových buněk ve 200 μΐ PBS v den nula (0). V den 10 se myši náhodně rozdělily do léčebných skupin a aplikovalo se jim v dny 12 (75 μρ/200 μΐ) , 14 (25 μς/200 μΐ) , a 16 (25 μg/200 μΐ) (šipky) HuMAb 2F8 (plné čtverečky, 2F8 zkráceně) nebo myší anti-EGFR MAb 225 (plné trojúhelníčky, m225 zkráceně). Dále se skupinám aplikovalo 75 μg/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 v den 12, a potom 25 pg/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 ve dny 14, 16, 19, 22, φφ » φ φ φ» φ φ φ φ φ φφφ φ
φ φφ φφ φ ♦ φ • φφφφ • · · φ • φ · · • φ · φφφφ φφφφφ φ φ φφφ « φφφφ Φ 9
ΦΦ ΦΦ
26, 29, 33, 36, a 40 (prázdné čtverečky, 2F8 dlouhodobě; prázdné trojúhelníčky, m225 dlouhodobě). Data jsou prezentována jako průměrný objem nádorů + SEM, a jsou reprezentativní pro 3 jednotlivé pokusy, které vedly k podobným výsledkům. Černé šipky ukazují termíny aplikace pro zkrácenou léčbu, prázdné šipky ukazují termíny aplikace pro dlouhodobou léčbu.
Obr. 15A a 15B ukazují sekvence VH- a VL-regionů 2F8 s označenými CDR regiony.
Podrobný popis předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nové na protilátkách založené terapie pro léčbu a diagnostiku onemocnění charakterizovaných expresí, zejména nadměrnou expresí receptoru pro epidermální růstový faktor (který je zde dále označován jako EGFR). Terapie podle předkládaného vynálezu využívají izolované lidské IgG monoklonálni protilátky, nebo jejich vazebné části pro antigen, které se váží na epitop přítomný na EGFR. Další izolované lidské monoklonálni protilátky zahrnuté v v předkládaném vynálezu jsou IgA, IgGl4, IgE, IgM, a IgD protilátky. V jednom provedení jsou lidské protilátky produkovány non-lidským transgenním zvířetem, např. transgenní myší, které je schopno produkovat více izotypů lidské monoklonálni protilátky k EGFR (např., IgG, IgA a/nebo IgE) pomocí V-D-J rekombinace a přesmyku izotypů. V souladu s tím další předkládaného vynálezu zahrnují nejen protilátky, protilátkové fragmenty a jejich farmaceutické prostředky, ale též non-lidská transgenní zvířata, B-lymfocyty, transfektované hostitelské buňky a hybridomy, které produkují monoklonálni protilátky. Vynález také zahrnuje způsoby použití protilátek podle předkládaného vynálezu pro detekci buněk exprimujících ·» ·· ·· · • · 4 · · · • · »·· · · · β · 4 · 4 4 4 4444 4
4 4 4 4 4 4
44 44 4
4 » 4 4 • 4 4 4 • · ··· • 4 4
4
EGFR nebo příbuzný, zkříženě reaktivní receptor pro růstový faktor, nebo pro inhibici růstu, diferenciace a/nebo motility buněk exprimujících EGFR, in vitro nebo in vivo.
Pro lepší pochopení předkládaného vynálezu jsou definovány některé termíny. Další definice jsou uvedeny v průběhu celého podrobného popisu.
Termíny receptor pro epidermální růstový faktor EGFR a EGFR antigen jsou zaměnitelné a označují varianty, isoformy a druhové homology lidského EGFR. Ve výhodném provedení inhibuje vazba protilátky podle předkládaného vynálezu na EGFR-antigen růst buněk exprimujících EGFR (např., a nádorových buněk) prostřednictvím inhibice nebo blokování vazby EGFR ligandu na EGFR. Termín EGFR ligand označuje všechny (např. fysiologické) ligandy pro EGFR, včetně EGF, TGF-α, heparin vážící EGF (HB-EGF), amfiregulin (AR) a epiregulin (EPI). V jiném výhodném provedení vazba protilátky podle předkládaného vynálezu na EGFR antigen indukuje fagocytosu efektorových buněk a/nebo usmrcení buněk exprimujících EGFR.
Termín inhibuje růst (např. v souvislosti s buňkami) označuje jakékoliv měřitelné snížení růstu buněk při jejich kontaktu s anti-EGFR protilátkou ve srovnání s růstem stejných buněk nekontaktovaných s anti-EGFR protilátkou, např. inhibici růstu buněk o alespoň přibližně 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,
60%,70%, 80%, 90%, 99% nebo 100%.
Termíny inhibuje vazbu a blokuje vazbu (např. v souvislosti s inhibici/blokováním vazby EGFR ligandu na EGFR) jsou zaměnitelné a označují částečnou nebo úplnou inhibici/blokování. Inhibice/blokování EGFR ligandu na EGFR • · ·
Ofi ········ ζ,υ · · · · · · · výhodně redukuje nebo alteruje normální úroveň nebo typ buněčné signalizace, která se vyskytuje tehdy, když se EGFR ligand naváže na EGFR bez inhibice nebo blokování. Inhibice a blokování také zahrnuje jakékoliv měřitelné snížení vazebné afinity EGFR ligandu k EGFR při kontaktu s anti-EGFR protilátkou ve srovnání s ligandem nekontaktovaným s anti-EGFR protilátkou, např. blokování vazby EGFR ligandů na EGFR o alespoň přibližně 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% nebo 100%.
Termín protilátky označuje celé protilátky a jakékoliv jejich vazebné fragmenty pro antigen (tj. antigen-vazebné části) nebo jejich jednotlivé řetězce. Protilátka je glykoprotein obsahující alespoň dva těžké (H)řetězce a dva lehké (L) řetězce spojené disulfidovými vazbami, nebo jeich vazebné části pro antigen. Každý těžký řetězec se skládá z variabilního regionu těžkého řetězce (VH) a konstantního regionu těžkého řetězce. Konstantní region těžkého řetězce se skládá ze tří domén, CH1, CH2 a CH3. Každý lehký řetězec se skládá z variabilního regionu lehkého řetězce (VL) a konstantního regionu lehkého řetězce. Konstantní region lehkého řetězce se skládá z jedné domény, CL. VH a VL regiony mohou být dále děleny na regiony hypervariability, označované jako regiony určující komplementaritu (CDR), které jsou odděleny více konzervovanými regiony, které se označují jako pracovní regiony (FR). Každý VH a VL se skládá ze tří CDR a čtyř FR, které jsou uspořádány od amino-konce ke karboxy-konci v následujícím pořadí: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahují vazebnou doménu, která interaguje s antigenem. Konstantní regiony protilátky mohou zprostředkovat vazbu imunoglobulinu na tkáně nebo faktory, včetně různých buněk imunitního systému (např. efektorových buněk) a prvních složek (Clq) klasické dráhy • · • · · ··· ··· • ···· · ··· · ··· • · · · · · · ···· · · · ··· • · · · ·· · ·· · • · · · ·· · ·· e komplementu.
Termín vazebná část pro antigen protilátky (nebo jednoduše část protilátky), jak je zde použit, označuje jeden nebo více fragmentů protilátky, které si zachovávají schopnost specifické vazby na antigen (např. EGFR). Bylo prokázáno, že funkce vazby protilátky na antigen může být provedena fragmenty kompletní protilátky. Příklady vazebných fragmentů zahrnutých v termínu vazebná část pro antigen protilátky jsou (i) Fab fragment, monovalentní fragment skládající se z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) F(ab')2 fragment, bivalentní fragment skládající se ze dvou Fab fragmentů navázaných na sebe disulfidovým můstkem v pantovém regionu; (iii) Fd fragment skládající se z VH a CH1 domény; (iv) Fv fragment skládající se z VL a VH domény jednoho ramena protilátky, (v) dAb fragment (Ward et al·., (1989) Nátuře 341:544-546), který se skládá z VH domény; a (vi) izolovaný komplementaritu určující region (CDR). Dále, ačkoliv jsou dvě domény Fv fragmentu, VL a VH, kódované samostatnými geny, mohou být navázány, za použití rekombinantních metod, přes syntetickou spojovací skupinu, což umožňuje jejich výrobu ve formě jediného proteinového řetězce, ve kterém se párují VL a VH regiony za vzniku monovalentních molekul (které jsou též známé jako jednořetězcové Fv (scFv); viz např., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; a Huston et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takové jednořetězcové protilátky také spadají pod termín vazebná část pro antigen protilátky. Tyto protilátkové fragmenty jsou získány za použití běžných technik známých odborníkům v oboru, a tyto fragmenty jsou testovány na použitelnost stejně jako intaktní protilátky.
Termín epitop označuje proteinovou determinantu schopnou specifické vazby na protilátku. Epitopy se obvykle skládají • · • · • ·· ··· ··· • ···· · ··· · ··· • ·· · · · ······· · ··· *··* *··* *·· · ·· · z chemicky aktivních povrchových skupin molekul, jako jsou aminokyselinové nebo sacharidové postraní řetězce a obvykle mají specifické trojrozměrné strukturální charakteristiky, stejně jako specifický náboj. Konformační a nekonformační epitopy se liší v tom, že vazba na nekonformační epitopy je ztracena za přítomnosti denaturačních rozpouštědel.
Termín bispecifická molekula označuje jakékoliv činidlo, např. protein, peptid, nebo proteinový nebo peptidý komplex, které má dvě různé vazebné specificity. Například se molekula může vázat na nebo interagovat s (a) a buněčným povrchovým antigen; a (b) Fc receptorem na povrchu efektorových buněk.
Termín 'multispecifická molekula nebo heterospecifická molekula označuje jakékoliv činidlo, např. protein, peptid, nebo proteinový nebo peptidový komplex, které má více než dvě vazebné specificity. Například se molekula může vázat na nebo interagovat s (a) a buněčným povrchovým antigen; a (b) Fc receptorem na povrchu efektorových buněk; a (c) alespoň na jednu další složku. V souladu s tím vynález zahrnuje bispecifické, trispecifické, tetraspecifické a jiné multispecifické molekuly, které jsou zaměřeny na povrchové buněčné antigeny, jako je EGFR, a na jiné cíle, jako je Fc receptor na efektorových buňkách.
Termín bispecifické protilátky též zahrnuje diprotilátky. Diprotilátky jsou bivalentní, bispecifické protilátky, ve kterých jsou VH a VL domény exprimovány na jednom polypeptidovém řetězci, ale za použití.spoj ovací sekvence, která je příliš krátká pro to, aby umožnila párování mezi dvěma doménami na stejném řetězci, což posiluje párování domény s komplementární doménou v jiném řetězci a vznikají tak dvě vazebná místa pro antigen (viz např., Holliger, P., et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, • ···· ·
R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Termín heteroprotilátky označuje dvě nebo více protilátek, vazebných fragmentů protilátek (např., Fab), jejich derivátů, nebo vazebných regionů pro antigen, navázaných na sebe, kde alespoň dvě z nich mají různé specificity. Tyto různé specificity zahrnují vazebnou specificitu pro Fc receptor na efektorových buňkách a vazebnou specificitu pro antigen nebo epitop na cílových buňkách, např. nádorových buňkách.
Termín lidské protilátky, jak je zde použit, označuje protilátky mající variabilní a konstantní regiony odvozené z lidské zárodečné imunoglobulinové sekvence. Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat aminokyselinové zbytky nekódované lidskou zárodečnou imunoglobulinovou sekvencí (např. mutace vložené náhodnou nebo místně cílenou mutagenesí in vitro nebo somatickou mutací in vivo). Nicméně, termín lidské protilátky, jak je zde použit, nezahrnuje protilátky, ve kterých jsou CDR sekvence odvozené ze zárodečné linie jiných savčích druhů, jako jsou myši, a které byly přeneseny na lidské sekvence pracovního regionu.
Termíny monoklonální protilátky nebo přípravek monoklonální protilátky jak jsou zde použity, označují protilátkové molekuly stejného molekulového složení. Přípravek monoklonální protilátky vykazuje jedinou vazebnou specificitu a afinitu pro konkrétní epitop. Proto termín lidské monoklonální protilátky označuje protilátky mající jedinou vazebnou specificitu, které mají variabilní a konstantní regiony odvozené z lidské zárodečné imunoglobulinové sekvence. V jednom provedení jsou lidské monoklonální protilátky produkovány hybridomem, který je tvořen B lymfocytem získaným • 4 • 44 · 4 · ··· • >··· 4 444 4 444 • 44 444 4444444 44444
0/1 4444 44 4 · · ·
Z 4 44 44 44 4 44 4 z transgenního non-lidského zvířete, např. transgenní myši, mající genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lehký řetězec, fúzovaným na imortalizovanou buňku.
Termín rekombinantní lidské protilátky, jak je zde použit, označuje všechny lidské protilátky, které jsou připraveny, exprimovány, vytvořeny nebo izolovány rekombinantně, jako jsou (a) protilátky izolované ze zvířete (např. myši), která je transgenní pro lidské imunoglobulinové geny, nebo z hybridomu připraveného z takového zvířete (jak je podrobněji popsáno v oddíle I, dále); (b) protilátky izolované z hostitelské buňky transformované k expresi protilátky, např. z transfektomu; (c) protilátky izolované z rekombinantní, kombinatoriální lidské protilátkové knihovny; a (d) protilátky připravené, exprimované, vytvořené nebo izolované jakýmkoliv jiným způsobem, který zahrnuje sestřižení sekvence genu lidského imunoglobulinu a jiné DNA sekvence. Takové rekombinantní lidské protilátky mají variabilní a konstantní regiony odvozené od lidské zárodečné imunoglobulinové sekvence. V některých provedeních mohou být takové rekombinantní lidské protilátky zpracovány in vitro mutagenesí (nebo - pokud je použito zvíře transgenní lidskou Ig sekvenci - in vivo somatickou mutagenesí) a tak jsou aminokyselinové sekvence VH a VL regionů rekombinantní protilátky sekvencemi, které, ačkoliv jsou odvozené od lidské zárodečné VH a VL sekvence, za přirozeného stavu neexistují v lidském protilátkové zárodečném repertoáru in vivo.
Termín heterologní protilátky je definován v souvislosti s transgenním non-lidským organismem produkujícím takové protilátky. Tento termín označuje protilátky mající aminokyselinové sekvence nebo kódující sekvence nukleové ··♦· • · · · · · • · · · · • · · ·· · · • · · · · · « ······· · · · •· ·· ·· · ·· * kyseliny odpovídající sekvencím v organismech jiných než je transgenní non-lidské zvíře, a obvykle v druzích jiných než je transgenní non-lidské zvíře.
Termín heterohybridní protilátky, jak je zde použit, označuje protilátky mající lehký a těžký řetězec z různých organismů. Například, protilátka mající lidský těžký řetězec asociovaný s myším lehkým řetězcem je heterohybridní protilátka. Příklady heterohybridních protilátek jsou chimérické a humanizované protilátky, jak byly popsány výše.
Termín izolované protilátky, jak je zde použit, označuje protilátky, které v podstatě neobsahují jiné protilátky mající jiné antigenní specificity (např. izolované protilátky, které se specificky váží na EGFR v podstatě neobsahují protilátky, které se specificky váží na antigeny jiné než EGFR). Izolované protilátky, které se specificky váží na epitop, isoformu nebo variantu lidského EGFR mohou však mít zkříženou reaktivitu s jinými příbuznými antigeny, např. z jiných druhů (např. druhové homology EGFR). Dále, izolované protilátky by neměly obsahovat jiný buněčný materiál a/nebo chemická činidla. V jednom provedení předkládaného vynálezu se v dobře definovaném přípravku kombinují izolované monoklonální protilátky mající různé specificity.
Jak je zde použit, označuje termín specifická vazba ve vztahu k protilátce to, že se váže na předem určený antigen. Obvykle se protilátky váží s afinitou alespoň přibližně 1 x 107 M”1, a váží se na předem definovaný antigen s afinitou, která je alespoň dvakrát vyšší než je jejich afinita pro vazbu na nespecifický antigen (např. BSA, kasein) jiný než je předem určený antigen nebo blízce příbuzný antigen. Výrazy protilátky rozpoznávající antigen a „protilátky specifické ···· ·· · • · 4 4 4 4 • · · · · 4 4 4
4 4444 4 4 · ···
4 4 4 4 4
4 44 · pro antigen jsou zaměnitelné s termínem protilátky, které se specificky váží na antigen.
Jak je zde použit, označuje termín vysoká afinita pro IgG protilátky vazebnou afinitu alespoň přibližně 107 M_1, výhodně alespoň přibližně 108 M”1, výhodněji alespoň přibližně 109 M-1, a ještě výhodněji alespoň přibližně ΙΟ10 Μ-1, 1011 M”1, 1012 M-1' nebo vyšší, např. až 1013 nebo vyšší. Nicméně, „vysoká afinita vazby může být různá pro jiné protilátkové izotypy. Například, vysoká afinita vazby pro IgM izotyp označuje vazebnou afinitu alespoň přibližně 1 x 107M_1.
Termín KA, jak je zde použit, označuje asociační konstantu konkrétní interakce protilátky-antigenu.
Termín KD, jak je zde použit, označuje disociační konstantu konkrétní interakce protilátky-antigenu.
Jak je zde použit, označuje izotyp třídu protilátky (např., IgM nebo IgGl), která je kódovaná geny pro konstantní region těžkého řetězce.
Jak je zde použit, označuje přesmyk izotypů fenomén, při kterém se třída nebo izotyp protilátky změní z jedné Ig třídy na jinou Ig třídu.
Jak je zde použit, označuje termín nepřesmyknutý izotyp izotypovou třídu těžkého řetězce, která vzniká bez přesmyku izotypů; CH gen kódující nepřesmyknutý izotyp je obvykle první CH gen bezprostředně za funkčně rearanžovaným VDJ genem. Přesmyk izotypů se klasifikuje jako klasický nebo neklasický přesmyk izotypů. Klasický přesmyk izotypů probíhá rekombinací, která zahrnuje alespoň jeden přesmyk sekvence v transgenu.
·· · » ··· ··· ··· ··· ··· • · ··· · ··· * · · · • · · · · · · ···· » · · ·»·* ···<· ··♦ · · · ·· ·· ·· · ·· ·
Neklasický přesmyk izotypů může proběhnout, například homologní rekombinací mezi lidský», σμ a lidským Σμ (δ-asociovaná delece. Alternativní mechanismy non-klasického přesmyku, jako je intertransgenová a/nebo interchromosomální rekombinace, mohou také vést k přesmyku izotypů.
Jak je zde použit, označuje termín přesmyková sekvence tu DNA sekvenci, která je odpověná za přesmykovou rekombinací. Přesmyková donorová sekvence, typicky μ přesmykový region, bude 5' (tj. před) regionem konstruktu, který má být deletován během přesmykové rekombinace. Přesmykový akceptorový region bude mezi regionem konstruktu, který má být deletován, a konstantním regionem (např. γ, ε, atd.). Protože není přítomné místo, ve kterém rekombinace vždy proběhne, nelze konečnou sekvenci genu předvídat z konstruktu.
Jak je zde použit, je termín charakter glykosylace definován jak charakter sacharidových jednotek, které jsou kovalentně navázány na protein, přesněji na imunoglobulinový protein. Charakter glykosylace heterologní protilátky může být charakterizován jako v podstatě stejný jako je charakter glykosylace, který se vyskytuje na přirozené protilátkce druhem transgenního zvířete, když odborník v oboru určí charakter glykosylace heterologní protilátky jako podobnější charakteru glykosylace u non-lidského transgenní zvíře než jako charakter glykosylace u druhu, ze kterého byly získány CH geny transgenu.
Termín přirozený, jak je zde použit, označuje skutečnost, že se objekt vyskytuje v přírodě. Například se jedná o polypeptidové nebo polynukleotidové sekvence, které jsou přítomné v organismu (včetně virů), které mohou být izolovány ze zdroje vyskytujícího se v přírodě a které nebyly
4
9 4
4 4 4 < 4 4 4444
4 4 «
• 4 44 • 4 4 • 4 444 • 4 » 4 4 • · · 4
44 ·· · • 4 4
4 4 4 · 4444 · 4 ·
záměrně modifikovány člověkem v laboratoři.
Termín rearanžovaný, jak je zde použit, označuje konfiguraci těžkého řetězce nebo lehkého řetězce imunoglobulinového lokusu, kde V segment je umístěn bezprostředně v sousedství D-J nebo J segmentu v konformaci kódující v podstatě celou VH nebo VL doménu, v příslušném pořadí. Rearanžovaný imunoglobulinový genový lokus může být identifikován srovnáním se zárodečnou DNA; a rearanžovaný lokus bude obsahovat alespoň jeden rekombinovaný heptamerový/nonamerový homologický element.
Termíny nerearanžovaný nebo zárodečná konfigurace, jak jsou zde použity s ohledem na V segment, označují konfiguraci, kdy V segment není rekombinován tak, aby byl v bezprostředním sousedství D nebo J segmentu.
Termín molekula nukleové kyseliny, jak je zde použit, označuje DNA molekuly a RNA molekuly. Molekula nukleové kyseliny může být jednořetězcová nebo dvouřetězcová, ale výhodně se jedná o dvouřetězcovou DNA.
Termín izolovaná molekula nukleové kyseliny, jak je zde použit s ohledem na nukleové kyseliny kódující protilátky nebo části protilátek (např. VH, VL, CDR3), které se váží na EGFR, označuje molekulu nukleové kyseliny, ve které nukleotidové sekvence kódující protilátky nebo části protilátek neobsahují jiné nukleotidové sekvence kódující protilátky nebo části protilátek, které se váží na antigeny jiné než EGFR, kde tyto jiné sekvence mohou sousedit s nukleovou kyselinou v lidské genomové DNA. V jednom provedení lidské anti-EGFR protilátky, nebo jejich části, obsahují nukleotidovou nebo aminokyselinovou sekvenci 2F8, stejně jako variabilní regiony ·· ·· φφφ ·· · • φ · φφφ Φ·· φ φφφφ φ φφφ φ φφφ • · · φφφ ΦΦΦΦΦΦΦ φφφφ
9Q φφφφφφ· ·· · ·· ·· φφ φ φ* · těžkého řetězce (VH) a lehkého řetězce (VL) mající sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3, a 2 a 4, v příslušném pořadí.
Jak je zde popsáno, obsahují sekvence uvedené v SEQ ID NO:
1-4 konzervativní modifikace sekvence, tj. modifikace nukleotidové a aminokyselinové sekvence, které neovlivňují významným způsobem vazebné charakteristiky protilátky kódované nukleotidovou sekvencí nebo aminokyselinové sekvence. Mezi takové konzervativní modifikace sekvence patří nukleotidové a aminokyselinové substituce, adice a delece. Modifikace mohou být vloženy do SEQ ID NO: 1-4 za použití standardních technik známých v oboru, jako je místně-cílená mutagenese a PCRzprostředkovaná mutagenese. Mezi konzervativní aminokyselinové substituce patří takové substituce, při kterých je aminokyselinový zbytek nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem, který má podobný vedlejší řetězec. Rodiny aminokyselinových zbytků majících podobné vedlejší řetězce byly v oboru definovány. Mezi tyto rodiny patří aminokyseliny s bazickými vedlejšími řetězci (např., lysin, arginin, histidin), acidickými vedlejšími řetězci (např. kyselina asparagová, kyselina glutamová), polárními vedlejšími řetězci bez náboje (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein, tryptofan), nepolárními vedlejšími řetězci (např. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin), beta-rozvětvenými vedlejšími řetězci (např. threonin, valin, isoleucin) a aromatickými vedlejšími řetězci (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Tak je předpokládané nesenciální aminokyselinový zbytek v lidské anti-EGFR protilátce výhodně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem ze stejné rodiny postranních řetězců.
Alternativně, v jiném provedení, mohou být mutace vloženy náhodně v celé délce nebo v části sekvence kódující anti-EGFR • · · ·
I · · » · · · · protilátku, za použití například saturační mutagenese, a vzniklé modifikované anti-EGFR protilátky mohou být testovány na vazebnou aktivitu.
V souladu s tím protilátky kódované (variabilní region lehkého a těžkého řetězce) nukleotidovou sekvencí podle předkládaného vynálezu a/nebo obsahující (variabilní region lehkého a těžkého řetězce) aminokyselinovou sekvenci podle předkládaného vynálezu (t.j., SEQ ID NO: 1-4) jsou významně podobné protilátky kódované nebo obsahující podobné sekvence, které byly konzervativně modifikované. Další popis toho, jak mohou být takové významně podobné protilátky generovány (tj. variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce) na základě částečné sekvence (SEQ ID NO: 1-4)je uveden dále.
Pro nukleové kyseliny termín v podstatě homologní udává, že dvě nukleové kyseliny, nebo jejich označené sekvence, jsou - při optimálním seřazení a srovnání - identické, s vhodnými nukleotidovými insercemi nebo delecemi, v alespoň přibližně 80% nukleotidů, obvykle v alespoň přibližně 90% až 95%, a výhodněji alespoň v přibližně 98% až 99,5% nukleotidů. Alternativně, významná homologie existuje tehdy, když dva segmenty hybridizují za selektivních hybridizačních podmínek na komplementární řetězec.
Procento identity mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu identických pozic mezi sekvencemi (t.j., % homologie = počet identických pozic/celkový počet pozic x 100), s tím, že se bere v úvahu počet mezer a délka každé mezery, které jsou nutné pro optimální seřazení dvou sekvencí. Srovnání sekvencí a stanovení identity mezi dvěma sekvencemi může být provedeno za použití matematických algoritmů, jak je popsáno v následujících příkladech.
• ·
Procento identity mezi dvěma nukleotidovými sekvencemi může být určeno za použití GAP programu v GCG softwaru (dostupný na http://www.gcg.com), za použití NWSgapdna.CMP matrice a váhy mezery 40, 50, 60, 70, nebo 80 a váhy délky mezery 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6. Procento identity mezi dvěma nukleotidovými nebo aminokyselinovými sekvencemi může být také určeno za použití algoritmu podle E. Meyers a W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), který byl inkorporován do ALIGN programu (verze 2.0), za použití PAM 120 tabulky váhy zbytků a penále za délku mezery 12 a penále za mezeru 4. Dále může být procento identity mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi určeno za použití algoritmu podle Needleman a Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), který byl inkorporován do GAP programu v GCG softwaru (dostupný na http://www.gcg.com), za použití buď Blossum 62 matrice nebo PAM250 matrice, a váhy mezery 16, 14, 12, 10, 8, 6 4 a váhy délky mezery 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6.
Nukleové kyseliny a proteinové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být dále použity jako 'dotazové sekvence' pro prohledávání veřejných databází, například za účelem identifikace příbuzných sekvencí. Takové prohledávání může být provedeno za použití NBLAST a XBLAST programů (verze 2.0) podle Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST nukleotidové prohledávání může být provedeno za použití NBLAST programu, skoré - 100, délka slova = 12, pro získání nukleotidové sekvence homologní k molekule nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. BLAST proteinové prohledávání může být provedeno pomocí XBLAST programu, skoré = 50, délka slova - 3, pro získání aminokyselinové sekvence homologní k proteinovým molekulám podle předkládaného vynálezu. Pro seřazení sekvencí s mezeremi pro srovnání může být použito • · • · · • · · · · • · · ·
Gapped BLAST, jak je popsán v Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. při použití BLAST a Gapped BLAST programů mohou být použity chybové parametry příslušných programů (např., XBLAST a NBLAST). Viz http://www.nebi.nim.nih.gov.
Nukleové kyseliny mohou být přítomny v celých buňkách, v buněčných iyzátech nebo v částečně nebo plně přečištěné formě. Nukleová kyselina je izolovaná nebo významně přečištěná tehdy, když je přečištěná od jiných buněčných složek nebo jiných kontaminujících složek, napřílad jiných buněčných nukleových kyselin nebo proteinů, za použití standardních technik, včetně zpracování alkalickým činidlem/SDS, CsCl proužkování, chromatografie na koloně, elektroforesy na agarosovém gelu a jiných technik dobře známých v oboru. Viz F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
Přípravky nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, ačkoliv často mají nativní sekvence (kromě modifikovaných restrikčních míst a podobně), ať cDNA, genomové nebo směsi, mohou být mutované, za použití standardních technik pro získání genových sekvencí. Pro kódující sekvence mohou tyto mutace ovlivňovat aminokyselinové sekvence, pokud je to žádoucí. Konkrétně mohou být mutované DNA sekvence významně homologní s nebo odvozené z nativní V, D, J, konstantní, přesmykové nebo jiné takové sekvence (kde odvozené znamená, že sekvence jsou identické nebo modifikované ve vztahu k jiné sekvenci).
Nukleové kyseliny jsou operativně navázané, když jsou ve funkčním vztahu s dalšími sekvencemi nukleové kyseliny.
• · • · · ·
·..··..· ·..* :
Například promotor nebo zesilovač transkripce je operativně navázaný na kódující sekvenci tehdy, když ovlivňuje transkripci sekvence. Pro transkripční regulační sekvence termín operativně navázaný znamená, že navázané DNA sekvence na sebe navazují a - když je potřeba spojit dvě proteinkódující sekvence - jsou ve čtecím rámci. Pro přesmykové sekvence termín operativně navázaný ukazuje, že sekvence jsou schopné přesmykové rekombinace.
Termín vektor jak je zde použit, označuje molekulu nukleové kyseliny schopnou transportovat jinou nukleovou kyselinu, na kterou je navázaná. Jedním typem vektoru je plasmid, což je cirkulární dvouřetězcová DNA smyčka, do které mohou být ligovány další DNA segmenty. Jiným typem vektoru je virový vektor, ve kterém mohou být další DNA segmenty ligovány do virového genomu. Některé vektory jsou schopné autonomní replikace v hostitelské buňce, do které jsou vloženy (např., bakteriální vektory mající bakteriální sekvenci rozpoznávající počátek replikace a episomální savčí vektory). Jiné vektory (např., non-episomální savčí vektory) mohou být integrovány do genomu hostitelské buňky po vloženi do hostitelské buňky, a potom jsou replikovány společně s genomem hostitelské buňky. D81e, některé vektory jsou schopné řídit expresi genů, na které jsou operativně navázány. Takové vektory jsou zde označovány jako rekombinantní expresní vektory (nebo jednoduše expresní vektory). Obecně, expresní vektory použitelné v technologiích rekombinantní DNA jsou často ve formě plasmidů. V předkládaném vynálezu jsou termíny plasmid a vektor zaměnitelné, protože plasmid je nej častěji používanou formou vektoru. Vynález však zahrnuje i další formy expresních vektorů, jako jsou virové vektory (např. replikace defektní retroviry, adenoviry a adenoasociované viry), které mají ekvivalentní funkce.
9 449 4 4 4 · · ··· • 94 ··· «······ ····· ·· · · ·· * ·· *
Termín rekombinantní hostitelské buňky (nebo pouze hostitelské buňky), jak je zde použit, označuje buňky, do kterých byly vloženy rekombinantní expresní vektory. Je třeba si uvědomit, že tento termín označuje nejen jednotlivé buňky, ale též potomstvo takových buněk. V důsledku toho, že v následných generacích mohou nastat různé modifikace, v důsledku mutací nebo vlivem prostředí, nemusí být takové potomstvo ve skutečnosti identické s původními buňkami, ale stále ještě spadá pod termín hostitelské buňky, jak je zde použit. Mezi rekombinantní hostitelské buňky patří, například,
CHO buňky a lymfocytární buňky.
Různé aspekty předkládaného vynálezu jsou dále podrobně popsány v následujících oddílech.
I. Produkce lidských protilátek k EGFR
Monoklonální protilátky (MAb) podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány různými technikami, včetně konvenčních technik produkce monoklonálních protilátek, např. standardní techniky hybridizace somatických buněk podle Kohler and Milstein (1975) Nátuře 256: 495. Ačkoliv je hybridizace somatických buněk preferována, mohou být použity i další techniky pro produkce monoklonálních protilátek, například virová nebo onkogenní transformace B-lymfocytů.
Výhodným zvířecím systémem pro přípravu hybridomů je myší systém. Produkce hybridomů u myší je zavedeným postupem.
V oboru jsou známé imunizační protokoly a techniky pro izolování imunizovaných splenocytů pro fúzi. Partnery pro fúzi (např. myší myelomové buňky) a fúzní postupy jsou také známé.
• · • · ·· · · • · · • · · · · • ···· · · · • · · · · ·· · ·· ·
Ve výhodném provedení mohou být lidské monoklonální protilátky namířené proti EGFR generovány za použití transgenní myši nesoucí části lidského imunitního systému místo myšího systému. Tyto transgenní myši, označované zde jako HuMAb myši, obsahují lidské imunoglobulinové genové minilokusy, které kódují nerearanžovanou lidskou imunoglobulinovou sekvenci pro těžký (μ a γ) a κ lehký řetězec, společně s cílenými mutacemi, které inaktivují endogenní lokusy μ a κ řetězce (Lonberg, et al. (1994) Nátuře 368(6474): 856-859). Proto mají myši sníženou expresi myšího IgM nebo κ, a v reakci na imunizaci probíhá v transgenech pro lidský těžký a lehký řetězec přesmyk tříd a somatické mutace, které generují lidské IgGK monoklonální protilátky s vysokou afinitou (Lonberg, N. et al. (1994), výše; přehled v Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Imunol. Vol. 13: 65-93, a Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. K. Acad. Sci. 764:536-546). Příprava HuMAb myši je podrobně popsána v oddíle II, dále, a v Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Imunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proč. Nati. Acad Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nátuře Genetics 4:117-123;
Chen, J. et al. (1993) EMBOJ. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Imunol. 152:2912-2920; Lonberg et al, (1994) Nátuře 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Imunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Imunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. NY. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild,
D. et al. (1996) Nátuře Biotechnology 14: 845-851, jejichž obsahy jsou zde ve své úplnosti uvedeny jako odkazy. Dále viz U.S. Patenty č. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; a • · ···· ·· · ·«·· ···
5,770,429; všechny Lonberg a Kay, a GenPharm International;
U.S. Patent č. 5,545,807, Surani et al.; Mezinárodní přihlášky č. WO 98/24884, publikovaná 11.6.1998; WO 94/25585, publikovaná 10.11.1994; WO 93/1227, publikovaná 24.6.1993; WO 92/22645, publikovaná 23.12.1992; WO 92/03918, publikovaná 19.3.1992, jejichž objevy jsou zde uvedeny ve své úplnosti uvedeny jako odkazy. Alternativně mohou být HCO12 transgenní myši popsané v příkladu 2 použity pro generování lidské antiEGFR protilátky.
Imunizace pro lidské protilátky
Pro získání plně lidské monoklonální protilátky k EGFR mohou být HuMAb myši imunizované přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR, jak je popsáno v Lonberg, N. et al. (1994) Nátuře 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nátuře Biotechnology 14: 845-851 a WO 98/24884. Výhodně jsou myši při první infusi stáří 6-16 týdnů. Pro intraperitoneální imunizaci HuMAb myší může být použit například přečištěný nebo obohacený přípravek (5-20 μg) EGFR antigenu (např. přečištěný z EGFR-exprimujících LNCaP buněk). V případě, že imunizace za použití přečištěného nebo obohaceného přípravku EGFR antigenu nevede k indukci protilátky mohou být myši také imunizované buňkami exprimujícími EGFR, např. nádorovou buněčnou linií, což vede k indukci imunitní reakce.
Zkušenosti s různými antigeny ukazují, že HuMAb transgenní myši odpovídají nejlépe tehdy, když jsou nejprve imunizované intraperitoneálně (IP) antigenem v kompletním Freundovu adjuvans, a potom následuje každý druhý týden i.p. imunizace (celkem 6-krát) antigenem v inkompletním Freundově adjuvans. Imunitní reakce může být sledována během imunizačního ·· 9
• · 9
9 9 9 · 9···
9 9 protokolu pomocí vzorků plasmy získaných z retroorbitální žíly. Plasma může být testována ELISA (jak je popsáno dále), a myši s dostatečnými titry anti-EGPR lidského imunoglobulinu mohou být použity pro fúze. Myší mohou být dosyceny intravenosně antigenem 3 dny před utracením a odstraněním sleziny. Předpokládá se, že pro každý antigen bude potřeba provést 2-3 fúze. Několik myší bude imunizováno pro každý antigen. Například může být imunizováno celkem 12 HuMAb myší HCO7 a HCO12 kmenů.
Příprava hybridomů produkujících lidské monoklonální protilátky k EGFR
Myší splenocyty mohou být izolovány a fúzovány s PEG na myší myelomovou buněčnou linii za použití standardních protokolů. Získané hybridomy se potom testují na produkci antigen-specifické protilátky. Například, jednobuněčné suspenze slezinných lymfocytů od immunizovaných myší se fúzují na jednu šestinu počtu P3X63-Ag8.653 nesecernujících myších myelomových buněk (ATCC, CR1.1580) s 50% PEG. Buňky se umístí na mikrotitrační plotny s plochým dnem v koncentraci přibližně 2xl05 a potom se provede dvoutýdenní inkubace v selektivním mediu obsahujícím 20% fetální Cloně Sérum, 18% 653 kondicionované medium, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutaminu, 1 mM L—glutaminu, 1 mM natrium-pyruvátu, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2merkaptoethanolu, 50 jednotek/ml penicilinu, 50 mg/ml streptomycinu, 50 mg/ml gentamycinu a 1XHAT (Sigma; HAT se přidá 24 hodin po fúzi). Po dvou týdnech se buňky kultivují v mediu, ve kterém je HAT nahrazeno HT. Jednotlivé jamky se potom testují ELISA na lidské anti-EGFR monoklonální IgM a IgG protilátky. Pokud dojde k významnému růstu hybridomů, tak se medium testuje obvykle po 10-14 dnech. Hybridomy secernující protilátky se přenesou na jiné plotny, opět se testují a pokud • 9 99 99 9 ·· ·
9 9 9 9 9 9··
9 999 · · 9 · · ···
99 9 9 · 9999999 99999
OO 9999999999
JO 99 99 99 9 99 9 jsou stále pozitivní na lidské IgG, anti-EGFR monoklonální l protilátky, tak mohou být alespoň dvakrát subklonovány . limitním ředěním. Stabilní subklony se potom kultivují in vitro za zisku malých množství protilátky v tkáňovém kultivačním mediu pro charakterizaci.
Příprava transfektomů produkujících lidské monoklonální protilátky k EGFR
Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také produkovány v transfektovaných hostitelských buňkách za použití, například, kombinace technik rekombinantní DNA a metod genové transfekce, které jsou dobře známé v oboru.
(Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Například, v jednom provedení může být požadovaný gen, např. gen pro lidské protilátky, ligován do expresního vektoru, jako je plasmid eukaryotické buňky. Plasmid může být potom vložen do hostitelské buňky, jako je bakteriální buňka (např. E. coli) a buňka může být kultivována. Hostitelská buňka obsahující plasmid s integrovanou DNA může být selektována a ošetřena lysozymem za účelem odstranění buněčné stěny. Vzniklé sféroplasty mohou být fúzovány s imortalizovanou buňkou, jako je myelomová buňka (což se označuje jako transfekce). Po fúzi mohou být identifikovány stabilní buňky (transfektanty) a ty mohou být selektovány.
Tyto buňky představují transfektomy, které mohou být potom amplifikovány jejich kultivací v ascitu nebo ve tkáňové kultuře a které mohou být použity pro produkci rekombinantních lidských protilátek.
Použití části protilátkové sekvence pro expresi intaktní protilátky φφ φφ • · · • · • · · φ φφφφ φ φ
Φ Φ · φφφφ φ ·
Protilátky interagují s cílovými antigeny především prostřednictvím aminokyselinových zbytků, které jsou lokalizovány v šesti komplementaritu určujících regionech těžkého a lehkého řetězce (CDR). Z tohoto důvodu jsou aminokyselinové sekvence v CDR více odlišné mezi jednotlivými protilátkami než sekvence mimo CDR. Protože jsou CDR sekvence odpovědné za většinu interakcí protilátka-antigen, je možné exprimovat rekombinantní protilátky, které napodobují vlastnosti specifické přirozené protilátky tak, že se konstruují expresní vektory, které obsahují CDR sekvence ze specifické přirozeně se vyskytující protilátky přenesené na pracovní sekvence z jiné protilátky s jinými vlastnostmi (viz např. Riechmann, L. et al., 1998, Nátuře 332:323-327; Jones,
P. et al., 1986, Nátuře 321:522-525; a Queen, C. et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033). Takové pracovní sekvence mohou být získány z veřejných DNA databází, které obsahují zárodečné sekvence genů pro protilátky. Tyto zárodečné sekvence se liší od sekvencí genů pro zralé protilátky, protože neobsahují plně sestavené variabilní geny, které jsou tvořeny V(D)J vazbami během zrání B lymfocytu. Zárodečné genové sekvence se také liší od sekvencí vysoceafinitních sekundárních protilátek rovnoměrně v celém variabilním regionu. Například, somatické mutace jsou relativně málo časté v amino-koncové části regionu pracovního rámce. Například, somatické mutace jsou relativně málo časté v amino-koncové části regionu pracovního rámce 1 a v karboxykoncové části regionu pracovního rámce 4. Dále, mnoho somatických mutací významnějším způsobem nemění vazebné vlastnosti protilátky. Proto není nutné získat celou DNA sekvenci konkrétní protilátky pro vytvoření intaktní rekombinantní protilátky mající vazebné vlastnosti podobné jako původní protilátka (viz PCT/US99/05535, podaná 12.3.1999,
44 • · · • 4 4 4· • 4 4
4 4
44
4 44 4
4 4 4 4 4
444 4 444
4444444 44444 • 44 · 4 4
4 44 4 která je zde uvedena jako odkaz). Pro tento účel je obvykle dostačující část sekvence lehkého a těžkého řetězce zahrnující CDR regiony. Č8st sekvence se použije pro určení toho, které zárodečné variabilní a spojovací genové segmenty přispívají k variabilním genům rekombinované protilátky. Zárodečné sekvence se potom použijí pro doplnění chybějících částí variabilních regionů. Vedoucí sekvence těžkého a lehkého řetězce se potom štěpí během zrání proteinu a nepřispívají k vlastnostem konečné protilátky. Pro tento účel je pro expresní konstrukty nutné použít odpovídající zárodečné vedoucí sekvence. Pro přidání chybějících sekvencí mohou být klonované cDNA sekvence kombinovány se syntetickými oligonukleotidy ligací nebo PCR amplifikaci. Alternativně, celý variabilní region může být syntetizován jak sada krátkých, překrývajících se oligonukleotidů, které mohou být kombinovány PCR amplifikaci za zisku zcela syntetického klonu variabilního regionu. Tento postup má určité výhody, jako je eliminace nebo zahrnují konkrétních restrikčních míst, nebo optimalizace konkrétních kodonů.
Nukleotidové sekvence transkriptů těžkého a lehkého řetězce z hybridomů se použijí pro navržení sady překrývajících se syntetických oligonukleotidů pro vytvoření syntetických V sekvencí s identickou kapacitou pro kódování aminokyselin jako přirozená sekvence. Syntetické sekvence těžkého a kappa řetězce se mohou lišit od přirozených sekvencí třemi způsoby: řetězce opakovaných nukleotidových baží jsou přerušeny, aby se usnadnila syntéza oligonukleotidů a PCR amplifikace; optimální místa pro iniciaci translace jsou inkorporována podle Kozákových pravidel (Kozák, 1991, J. Biol. Chem. 266L19867019870); a HindlII jsou vložena před místa pro iniciaci translace.
·· ·9 ·· · ·· • · · · · · · 9 • 9 ··· 9 · · · · · • · · *99 9 ···· · « ·
9 9 9 ·· · ·· ·· ·· ·· · ·►
Pro variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce jsou optimalizované sekvence kódujícího a nekódujícícho řetězce rozštěpeny na úseky délky 30-50 nukleotidů, přibližně ve střední části nekódujícího oligonukleotídu. Tak mohou být pro každý řetězec oligonukleotidy sestaveny do překrývajících se dvouřetězcových sad, které pokrývají segmenty délky 150—400 nukleotidů. Tyto sady se potom použijí jako templáty pro produkci PCR amplifikačních produktů délky 150—400 nukleotidů. Obvykle se jedna sada oligonukleotidů pro variabilní region rozštěpí na dvě sady, které se samostatně amplifikují za vzniku dvou překrývajících se PCV produktů. Tyto překrývající se produkty se potom kombinují PCT amplifikaci za vzniku kompletního variabilního regionu. Může být žádoucí zahrnout překrývající se fragment konstantního regionu těžkého nebo lehkého řetězce (včetně Bbsl místa kappa lehkého řetězce, nebo Agel místa gamma těžkého řetězce) do PCR amplifikace pro generování fragmentů, které mohou být snadno klonovány do konstruktů expresních vektorů.
Rekonstruované variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce se potom kombinují s klonovaným promotorem, místem pro iniciaci translace, konstantním regionem, 3' netranslatovanými sekvencemi, polyadenylačním místem a místem pro ukončení translace, za vzniku konstruktu expresního vektoru. Konstrukty exprimující těžký a lehký řetězec mohou být kombinovány do jediného vektoru, mohou být transfektovány současně nebo sériově, nebo mohou být samostatně transfektovány do hostitelských buně, které se potom fúzují za zisku hostitelské buňky exprimující oba řetězce.
Plasmidy pro použití při konstrukci expresních vektorů pro lidský IgGK jsou popsány dále. Plasmidy byly konstruovány tak, že PCR amplifikované cDNA sekvence pro V těžký a V kappa lehký ···· ·· ·· ·· · ·* · »·· ··· · »· • · ·*· · ··♦ · ··· • «· · « · · ···· » · · ·«·* ···« ··· ··· ·· ·· ·» · ·· » řetězec mohly být použity pro rekonstrukci minigenů pro kompletní těžký a lehký řetězec. Tyto plasmidy mohly být použity pro expresi kompletně lidských nebo chimérických IgGiK nebo IgG4K protilátek. Podobné plasmidy mohly být konstruovány pro expresi jiných izotypů těžkého řetězce, nebo pro expresi protilátky obsahující lambda lehké řetězce.
V dalším aspektu předkládaného vynálezu jsou strukturální vlastnosti lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu, např., 2F8, použity pro přípravu strukturálně příbuzné lidské anti-EGFR protilátky, která si zachovává alespoň jednu funkční vlastnost protilátky podle předkládaného vynálezu, jako je vazba na EGFR. Přesněji, jeden nebo více CDR regionů 2F8 může být kombinován rekombinantně se známým lidským regionem pracovního rámce a CDR za vytvoření další, rekombinantně upravené lidské anti-EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu.
V jiném provedení tedy vynález poskytuje způsob pro přípravu anti-EGFR protilátky, který zahrnuje:
Přípravu protilátky obsahující (I) lidský region pracovního rámce těžkého řetězce a lidský CDR těžkého řetězce, kde alespoň jeden lidský CDR těžkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou z aminokyselinových sekvencí CDR uvedených na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích SEQ ID NO: 2); a (2) lidský region pracovního rámce lehkého řetězce a lidský CDR lehkého řetězce, kde alespoň jeden lidský CDR lehkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou z aminokyselinových sekvencí CDR uvedených na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích SEQ ID NO: 4); kde protilátka si zachovává schopnost vazby na EGFR.
• · • · · ·
Schopnost protilátky vázat se na EGFR může být určena za použití standardních vazebných testů, jako jsou testy uvedené v příkladech provedení vynálezu (např. ELISA). Protože je v oboru dobře známo, že CDR3 domény těžkého a lehkého řetězce mají významnou úlohu ve vazebné specificitě/afinitě protilátky pro antigen, obsahují rekombinantní protilátky podle předkládaného vynálezu připravené způsobem uvedeným výše CDR3 těžkého a lehkého řetězce 2F8. Protilátky mohou dále obsahovat CDR2 2F8. Protilátky mohou dále obsahovat CDRl 2F8. V souladu s tím vynález poskytuje anti-EGFR protilátky obsahující: (1) lidský region pracovního rámce těžkého řetězce a lidský CDRl region těžkého řetězce, a lidský CDR2 region těžkého řetězce CDR2 region, a lidský CDR3 region těžkého řetězce , kde lidský CDR3 region těžkého řetězce je CDR3 2F8, jak je uveden na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích v SEQ ID NO: 2); a (2) lidský region pracovního rámce lehkého řetězce, a lidský CDRl region lehkého řetězce, a lidský CDR2 region lehkého řetězce CDR2 region, a lidský CDR3 region lehkého řetězce, kde lidský CDR3 region lehkého řetězce je CDR3 2F8, jak je uveden na Obr. 15 (nebo v příslušných aminokyselinových zbytcích v SEQ ID NO: 4), kde protilátka se váže na EGFR. Protilátka může dále obsahovat CDR2 těžkého řetězce a/nebo CDR2 lehkého řetězce 2F8. Protilátka může dále obshaovat CDRl těžkého řetězce a/nebo CDRl lehkého řetězce 2F8.
Výhodně mají CDRl, 2, a/nebo 3 upravené protilátky popsané výše přesně stejnou aminokyselinovou sekvenci jako 2F8 popsaná výše. Nicméně, odborníkům v oboru bude jasné, že mohou existovat odchylky od přesné CDR sekvence 2F8, a protilátky si mohou přesto zachovat schopnost účinné vazby na EGFR (například se může jednat o konzervativní substituce). Proto může být - v jiném provedení - upravená protilátka složena • · • · z jednoho nebo více CDR, které jsou, například, z 90%, 95%,
98% nebo 99,5% identické s jedním nebo více CDR 2F8. Kromě prosté vazby na EGFR mohou být upravené protilátky, jako jsou protilátky popsané výše, selektovány tak, aby si zachovávaly další funkční charakteristiky protilátek podle předkládaného vynálezu, jako je:
(1) vazba na živé buňky exprimující EGFR;
(2) vysoká afinita vazba na EGFR;
(3) vazba na jedinečný epitop na EGFR (pro eliminaci možnosti, že budou monoklonální protilátky s komplementárními aktivitami, budou-li použity v kombinaci, soutěžit o vazbu na stejný epitop;
(4) opsonizace buněk exprimujících EGFR; a/nebo (5) zprostředkování inhibice růstu, fagocytosy a/nebo usmrcení buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk.
Charakterizace vazby lidských monoklonálních protilátek na EGFR
Pro charakterizování vazby lidské monoklonální EGFR protilátky podle předkládaného vynálezu může být testováno sérum od imunizovaných myší, například pomocí ELISA. Stručně, mikrotitrační plotny se potáhnou přečištěným EGFR v koncentraci 0,25 gg/ml v PBS a potom se blokují 5% hovězím sérovým albuminem v PBS. Ředění plasmy od EGFR-imunizovaných myší se přidají do každé jamky a provede se inkubace po dobu 1-2 hodin při 37 °C. Plotny se promyjí PBS/Tween a potom se inkubují kozí-anti-lidský IgG Fc-specifřekou polyklonální protilátkou konjugovanou na alkalickou fosfatasu po dobu 1 hodiny při 37°C. Po promytí se plotny vyvíjejí s pNPP substrátem (1 mg/ml), a analyzují se při OD 405-650. Výhodně se pro fúze použijí myši, u kterých jsou nejvyšší titry.
• · • · • · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · ··· · • ·· · · · ······· ···· ··· · ·· · · ·· · ··
ELISA test, jak je popsán výše, může být také použit pro testování hybridomů, které vykazují pozitivní reaktivitu s EGFR imunogenem. Hybridomy, které se váží s vysokou aviditou na EGFR, se sublonují a dále se charakterizují. Jeden klon z každého hybridomů, který si zachovává reaktivitu původních buněk (podle ELISA) může být vybrán pro přípravu 5-10 zkumavek buněčné banky, a pro přečištění protilátky.
Pro přečištění lidské anti-EGFR protilátky mohou být vybrané hybridomy kultivovány ve 2 litrových centrifugačních baňkách za účelem přečištění monoklonální protilátky. Supernatanty mohou být přefiltrovány a zahuštěny před afinitni chromatografii s protein A-sepharosou (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluovaný IgG může být testován gelovou elektroforesou a vysoce účinnou kapalinovou chromatografii pro zajištění čistoty. Pufrovací roztok může být vyměněn do PBS, a koncentrace může být určena podle OD28o za použití 1,43 extinkčního koeficientu. Monoklonální protilátky mohou být rozděleny do podílů a mohou být uskladněny při -80 °C.
Pro stanovení toho, zda se vybraná lidská anti-EGFR monoklonální protilátky váže na jedinečné epitopy může být každá protilátka biotinylována za použití komerčně dostupných reagens (Pierce, Rockford, IL). Kompetitivní testy za použití neznačené monoklonální protilátky a biotinylované monoklonální protilátky mohou být provedeny za použití EGFR potaženýchELISA ploten způsobem popsaným výše. Vazba biotinylované MAb může být detekována za použití streptavidinu-alkalické fosfatasy.
Pro určení izotypů přečištěné protilátky může být provedena izotypová ELISA. Jamky mikrotitračních ploten mohou • · · • · ··· ·«· ···· · · · · · ··· •· · · · · ··♦* · · · 9999 být potaženy 10 gg/ml anti-lidského Ig, přes noc při 4°C. Po blokování 5% BSA plotny reagují s 10 gg/ml monoklonální protilátky nebo přečištěné izotypové kontroly, při teplotě místnosti po dobu dvou hodin. Jamky mohou potom reagovat se sondami alkalická fosfatasa-konjugát specifickými pro lidský IgGl nebo IgM. Plotny se vyvíjejí a analyzují způsobem popsaným výše.
Pro demonstrování vazby monoklonální protilátky na živé buňky exprimující EGFR může být použita průtoková cytometrie. Stručně, buněčné linie exprimující EGFR (kultivované za standardních kultivačních podmínek) se smísí s různými koncentracemi monoklonální protilátky v PBS obsahujícím 0,1% Tween 80 a 20% myší sérum, a provede se inkubace při 37°C po dobu 1 hodiny. Po promytí buňky reagují s Fluoresceinen značenou anti-lidský IgG protilátkou za stejných podmínek, jako primární protilátka. Vzorky mohou být analyzovány FACScan přístrojem za použití světelných a rozptylových charakteristik pro jednotlivé buňky. Může být alternativně použito fluorescenční mikroskopie (kromě nebo místo) průtokové cytometrie. Buňky mohou být barveny stejným způsobem a mohou být vyšetřeny na fluorescenčním mikroskopu. Tento způsob umožňuje vizualizaci jednotlivých buněk, ale může mít nižší sensitivitu, v závislosti na hustotě antigenu.
Anti-EGFR lidské IgG mohou být dále testovány na reaktivitu s EGFR antigenem pomocí Western hybridizace. Stručně, mohou být připraveny buněčné extrakty z buněk exprimujících EGFR a tyto extrakty mohou být zpracovány elektroforesou na natrium-dodecylsulfátových (SDS) polyakrylamidových gelech. Po elektroforese mohou být separované antigeny přeneseny na nitrocelulosové membrány, blokovány 20% myším sérem, a sondovány monoklonální • · ··· · · · • · · · · ··· * ··· •· ··· ·····«· ····· «· ·· · ·· · protilátkou, která je testována. Vazba lidského IgG může být detekována za použití anti-lidského IgG-alkalické fosfatasy a vyvíjení s BCIP/NBT substrátovými tabletami (Sigma Chem. Co.,
St. Louis, MO).
Aktivity lidských monoklonálních protilátek k EGFR ve fagocytose a usmrcování buněk
Kromě specifické vazby na EGFR mohou být lidské monoklonální anti-EGFR protilátky testovány na schopnost indukovat fagocytosu a usmrcování buněk exprimujících EGFR. Testování aktivity monoklonální protilátky in vitro bude prvotním skríningem před testování na modelech in vivo.
Stručně, polymorfonukleární buňky (PMN), nebo jiné efektorové buňky, od zdravých dárců mohou být přečištěny Ficoll Hypaque densitním odstředěním, po kterém následuje lýza kontaminujících erytrocytů. Promyté PMN mohou být suspendovány v RPMI.doplněném 10% teplem inaktivovaným fetálním telecím sérem a mohou být smíseny s buňkami exprimujícími EGFR značenými 51Cr v různých poměrech efektorových buněk a nádorových buněk (efektorové buňky:nádorové buňky). Přečištěný lidský anti-EGFR IgG může být potom přidáván v různých koncentracích. Irelevantní lidský IgG může být použit jako negativní kontrola. Testy mohou být provedeny během 0-120 minut při 37°C. Vzorky mohou být testovány na cytolýzu měřením uvolňování 51Cr do supernatantu kultury. Anti-EGFR monoklonální protilátky mohou být také testovány ve vzájemných kombinacích pro stanovení toho, zda je cytolýza zvýšena při použití více monoklonálních protilátek.
Lidské monoklonální protilátky, které se váží na EGFR, mohou být také testovány na modelu in vivo (např. na myších) pro stanovení jejich účinnosti ve zprostředkování fagocytosy a usmrcování buněk exprimujících EGFR, např. nádorových buněk. Tyto protilátky mohou být vybrány, například podle následujících kriterií, ktersá nejsou míněný jako kriteria vylučovací:
(1) vazby na živé buňky exprimující EGFR;
(2) vysoké afinity vazby na EGFR;
(3) vazby na jedinečný epitop na EGFR (pro eliminaci možnosti, že budou monoklonální protilátky s komplementárními aktivitami, budou-li použity v kombinaci, soutěžit o vazbu na stejný epitop;
(4) opsonizace buněk exprimujících EGFR;
(5) zprostředkování inhibice růstu, fagocytosy a/nebo usmrcení buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk.
Výhodné lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu splňují jedno nebo více, nejlépe všechna uvedená kriteria. V konkrétním provedení jsou lidské monoklonální protilátky použity v kombinaci, např. jako farmaceutický prostředek obsahující dvě nebo více anti-EGFR monoklonálních protilátek nebo jejich fragmentů. Například, lidské anti-EGFR monoklonální protilátky mající různé, ale komplementární aktivity, mohou být kombinovány v jedné terapii za účelem dosažení terapeutického nebo diagnostického efektu. Příkladem je prostředek obsahující anti-EGFR lidské monoklonální protilátky, které zprostředkují vysoce účinné zabíjení cílových buněk za přítomnosti efektorových buněk, kombinované s jinými lidskými anti-EGFR monoklonálními protilátkami, které inhibují růst buněk exprimujících EGFR.
II. Produkce transgenních non-lidských zvířat, která generují lidské monoklonální anti-EGFR protilátky • · « · · ··· ··· • · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ”í* *i ·*;
•· ·· 99 · 99 9
V dalším aspektu vynález poskytuje transgenní non-lidská zvířata, např. transgenní myši, které jsou schopné exprimovat lidské monoklonálni protilátky, které se specificky váží na EGFR, výhodně s vysokou afinitou. Ve výhodném provedení mají transgenní non-lidská zvířata, např. transgenní myši (HuMAb myši), genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lehký řetězec. V jednom provedení je transgenní non-lidské zvíře, např. transgenní myši, imunizována přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenů a/nebo buněk exprimujících EGFR. Výhodně jsou transgenní non-lidská zvířata, např. transgenní myší, schopná produkovat více izotypů lidské monoklonálni protilátky k EGFR (např. IgG, IgA a/nebo IgE) pomocí V-D-J rekombinace a přesmyku izotypů.
Přesmykem izotypů může být, například, klasický nebo nonklasický přesmyk izotypů.
Charakter transgenních non-lidských zvířat, která reagují na stimulaci cizorodým antigenem repertoárem heterologních protilátek vyžaduje, aby transgeny pro heterologní imunoglobuliny obsažené v transgenním zvířeti fungovaly správně v celé dráze vývoje B-lymfocytů. Ve výhodném provedení zahrnuje správná funkce transgenu heterologního těžkého řetězce přesmyk izotypů. Proto jsou transgeny podle předkládaného vynálezu konstruovány tak, aby produkovaly přesmyk izotypů a jednu nebo více z následujících vlastností:
(1) vysokou úroveň exprese ve specifickém typu buněk; (2) funkční přeskupování genů; (3) aktivaci a reakci na vyloučení alely, (4) expresi dostatečného primárního repertoáru; (5) přenos signálu; (6) somatické hypermutace; a (7) dominaci transgenového lokusu protilátky během imunitní reakce.
Ne všechna uvedená kriteria musí být splněna. Například v těch provedeních, kde jsou endogenní imunoglobulinové lokusy
4
4 • 4
4 • 4
4
4 4 4
4 « transgenního zvířata funkčně narušeny, nemusí transgen aktivovat vyloučení alely. Dále, v těch provedeních, kde transgen obsahuje funkčně rearanžovaný gen pro imunoglobulinový těžký a/nebo lehký řetězec, je další kriterium funkčního přeskupování genů zbytečné, alespoň pro ten transgen, který je již rearanžovaný. Pro základy molekulární imunologie viz Fundamental Imunology, 2. vydání (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.,který je zde uveden jako odkaz.
V některých provedeních obsahují transgenní non-lidská zvířata použitá pro generování lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu rearanžovaný, nerearanžovaný nebo kombinaci rearanžovaného a nerearanžovaného transgenu pro heterologní imunoglobulinové těžký a lehký řetězec zárodečné linii transgenního zvířete. Každý transgen pro těžký řetězec obsahuje alespoň jeden CH gen. Dále, transgen pro těžký řetězec může obsahovat funkční sekvence pro přesmyk izotypů, které podporují přesmyk izotypů heterologního transgenu kódujícího více CH genů v B-lymfocytech transgenního zvířete. Takové přesmykové sekvence mohou být sekvence, které se přirozeně vyskytují v zárodečném imunoglobulinovém lokusu druhu, který slouží jako zdroj transgenních CH genů, nebo mohou být takové přesmykové sekvence odvozeny od sekvencí, které se vyskytují u druhu, kterému má být podán transgenový konstrukt (transgenního zvířete). Například, lidský transgenový konstrukt, který je použit pro přípravu transgenní myši, může produkovat vyšší frekvenci přesmyku izotypů, pokud obsahuje přesmykové sekvence podobné sekvencím, které se přirozeně vyskytují v myším lokusu těžkého řetězce, protože jsou myší přesmykové sekvence pravděpodobně optimalizovány tak, aby fungovaly s myším přesmykovým rekombinasovým enzymovým systémem, zatímco lidské sekvence nikoliv. Přesmykové ·· ·· ··· ·· · • · · · · · · · · • · · · 4 · · · · · · · · • · · · · · · ···· 4 9 · ····
4 9 · · · · · · · • · ·· ·· · ·· · sekvence mohou být izolovány a klonovány za použití běžných klonovacích metod, nebo mohou být syntetizovány de novo z překrývajících se syntetických oligonukleotidů navržených podle publikovaných sekvencí týkajících se imunoglobulinového přesmykového regionu (Mills et at., Nucl. Acids Res. 15:73057316 (1991); Sideras et al., Intl. Imunol. 1:631-642 (1989), které jsou zde uvedeny jako odkazy). Pro každé z uvedených transgenních zvířat jsou funkčně rearanžované transgeny pro heterologní těžký a lehký řetězec imunoglobulinu přítomny ve významné frakci B-lymfocytů na transgenním zvířeti (alespoň 10%) .
Transgeny použití pro generování transgenních zvířat podle předkládaného vynálezu zahrnují transgen pro těžký řetězec obsahující DNA kódující alespoň jeden variabilní genový segment, jeden diversitní genové segment, jeden spojovací genový segment a alespoň jeden genový segment pro konstantní region. Transgen pro imunoglobulinový lehký řetězec obsahuje DNA kódující alespoň jeden variabilní genový segment, jeden spojovací genový segment a alespoň jeden genový segment pro konstantní region. Genové segmenty kódující genové segmenty pro lehký a těžký řetězec jsou heterologní pro transgenní non-lidské zvíře v tom, že jsou odvozeny od - nebo odpovídají - DNA kódující genové segmenty pro imunoglobulinový těžký a lehký řetězec z druhu jiného než je transgenní non-lidské zvíře. V jednom aspektu předkládaného vynálezu je transgen konstruován tak, že jednotlivé genové segmenty jsou nerearanžované, t.j., nejsou uspořádané tak, aby kódovaly funkční imunoglobulinový lehký nebo těžký řetězec. Takové nerearanžované transgeny podporují rekombinaci V, D a S genových segmentů (funkční přeskupení) a výhodně podporují inkorporaci všech nebo části genového segmentu pro D region do vzniklého rearanžovaného imunoglobulinového těžkého řetězce v • · ·
«00 0 0 · 0 0 0 • 00·· 0 000 0 000 • 0 0 0 0 0 0 ···· 0 0 0 000 ·· ·· ·* · a· · transgenním non-lidském zvířeti, po setkání s EGFR antigenem.
V alternativním provedení transgeny obsahují nerearanžovaný mini-lokus. Takové transgeny obvykle obsahují významnou část C, D a J segmentů, stejně jako podskupinu V genových segmentů.
V takových transgenových konstruktech obsahují různé regulační sekvence, například promotory, zesilovače transkripce, regiony pro přesmyk tříd, sestřihová donorová a akceptorová místa pro zpracování RNA, rekombinační signály a podobně příslušné sekvence odvozené od heterologní DNA. Takové regulační sekvence mohou být vloženy do transgenu ze stejného nebo z jiného druhu non-lidského zvířete použitého v předkládaném vynálezu. Například, lidské imunoglobulinové genové segmenty mohou být v transgenu v transgenní myši kombinovány s imunoglobulinovou zesilovací sekvencí od hlodavce.
Alternativně mohou být do transgenu vloženy syntetické regulační sekvence, kde takové syntetické regulační sekvence nejsou homologní s funkčními DNA sekvencemi, které se přirozeně vyskytují v genomech savců. Syntetické regulační sekvence jsou navrženy podle konvenčních pravidel, jako jsou například pravidla specifikující permisibilní sekvence sestřihových akceptorových míst nebo promotor/enhancerový motiv. Například, minilokus obsahuje část genomového imunoglobulinového lokusu majícího alespoň jednu interní (t.j. ne koncovou) deleci neesenciální části DNA (např., vmezeřené sekvence; intronu nebo jeho části) ve srovnání s přirozeným zárodečným Ig lokusem.
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu se transgenní zvíře použité pro generování lidské protilátky k EGFR obsahující alespoň jednu, typicky 2-10, a někdy 25-50 nebo více kopií transgenu popsaného v příkladu 12 WO 98/24884 (např. pHCl nebo pHC2) kříží se zvířetem obsahujícím jedinou
9
9··
99
9 9
9 9 9 9
9 9
9999 99 9 «9 9
9999 99 9 99 9 kopii transgenu pro lehký řetězec popsaného v příkladech 5, 6, nebo 14 WO 98/24884, a potomstvo se kříží s JH deletovaným zvířetem popsaným v příkladu 10 WO 98/248 84, který je zde uveden jako odkaz. Zvířata se kříží do dosažení homozygotnosti pro každý z těchto tří rysů. Taková zvířata mají následující genotyp: jednu kopii (na haploidní sadu chromosomů) lidského nerearanžovaného mini-lokusu pro těžký řetězec (popsaného v příkladu 12 WO 98/24884), a jednu kopii (na haploidní sadu chromosomů) lidského rearanžovaného konstruktu pro lidský κ lehký řetězec (popsaného v příkladu 14 WO 98/24884), a deleci v každém endogenním lokusu pro myší lehký řetězec, která odstraňuje všechny funkční JH segmenty (jak je popsáno v příkladu 10 WO 98/24884). Taková zvířata se kříží s myšmi, které jsou homozygotní pro deleci JH segmentů (příklad 10 WO 98/24884) za zisku potomstva, které je homozygotní pro JH deleci a hemizygotní pro konstrukty pro lidské těžké a lehké řetězce. Získaným zvířatům se injekčně podají antigeny a použijí se pro produkci lidské monoklonální protilátky proti těmto antigenům.
B-lymfocyty izolované od takových zvířat jsou monospecifické s ohledem na lidské těžké a lehké řetězce, protože obsahují pouze jedinou kopii každého genu. Dále jsou monospecifické s ohledem na lidský nebo myší těžký řetězec, protože obě kopie endogenního genu pro myší těžký řetězec jsou nefunkční v důsledku delece v rozsahu JH regionu, která je vložena způsobem popsaným v příkladech 9 a 12 WO 98/24884.
Dále, významná frakce B-lymfocytů bude monospecifická s ohledem na lidské nebo myší lehké řetězce, protože exprese jediné kopie rearanžovaného lidského genu κ lehkého řetězce bude alelicky a izotypově vylučovat rearanžování endogenních myších genů pro κ a lambda řetězce ve významné frakci Blymfocytů.
4
4 4«
4
4
4 · 4 • 4 · 4 • 4 4 4444
4 4
4
Transgenní myši výhodného provedení vykazují produkci imunoglobulinu se signifikantním repertoárem, ideálně v podstatě stejným, jako mají nativní myši. Například v provedeních, kde byly endogenní Ig geny inaktivovány, je celková hladina imunoglobulinu v rozmezí od přibližně 0,1 do 10 mg/ml séra, výhodně od 0,5 do 5 mg/ml, ideálně alespoň přibližně 1,0 mg/ml. Když je do transgenní myši vložen transgen umožňující přesmyk z IgM na IgG, tak je u dospělých myší poměr sérového IgG k IgM výhodně přibližně 10:1. Poměr IgG k IgM bude u nezralých myší mnohem nižší. Obecně, více než přibližně 10%, výhodně 40 až 80% B-lymfocytů sleziny a mízních uzlin exprimuje výlučně lidský IgG protein.
Repertoár se výhodně bude blížit repertoáru non-transgenní myši, obvykle alespoň z přibližně 10%, výhodně z 25 až 50% nebo více. Obecně bude produkováno alespoň přibližně tisíc různých imunoglobulinů (ideálně IgG), výhodně 104 až 106 nebo více, v závislosti primárně na počtu různých V, J a D regionů vložených do myšího genomu. Tyto imunoglobuliny budou obvykle rozpoznávat přibližně polovinu nebo více vysoce antigenních proteinů, např. staphylokokový protein A. Obvykle budou imunoglobuliny vykazovat afinitu pro předem vybrané antigeny alespoň přibližně 107M_1, výhodně alespoň přibližně 109 M_1, výhodněji alespoň přibližně ΙΟ10 Μ-1 , 1011 M_1, 1012M_1 nebo vyšší, například až do 1013M_1 nebo vyšší.
V některých provedeních může být může být výhodné připravit myši s předem určeným repertoárem, aby se limitovala selekce V genů podílejících se na protilátkové reakci k předem určenému typu antigenu. Transgen pro těžký řetězec mající předem určený repertoár může obsahovat, například lidské VH geny, které jsou přednostně použity v protilátkové reakci na ·« *· • · · • · · · · • 4 9
4444
9
994 4 4444 4 9 předem určený typ antigenu u člověka. Alternativně mohou být některé VH geny z různých důvodů vyloučeny z definovaného repertoáru (např. mohou mít nízkou pravděpodobnost kódování V regionů s vysokou afinitou pro předem určený antigen; mají nízkou pravděpodobnost toho, že by v nich proběhly somatické mutace a zvýšení afinity; nebo jsou imunogenní pro některé lidi). Před přeskupením transgenu obsahujícího různé genové segmenty těžkého a lehkého řetězce mohou být takové genové segmenty snadno identifikovány, například hybridizací nebo DNA sekvenováním, jako sekvence z jiného organismu než je transgenní zvíře.
Transgenní myš podle předkládaného vynálezu může být imunizována přečištěným nebo obohaceným přípravkem EGFR antigenu a/nebo buněk exprimujících EGFR, jak bylo popsáno výše. Myš bude produkovat B-lymfocyty, u kterých bude docházet k přesmyku tříd díky intratransgenové přesmykové rekombinaci (cis-přesmyku) a bude exprimovat imunoglobuliny reaktivní s EGFR. Imunoglobuliny mohou být lidské sekvence, ve kterých jsou polypeptidy těžkého a lehkého řetězce kódované lidskými transgenovými sekvencemi, které mohou zahrnovat sekvence vzniklé somatickou mutací a rekombinatní spojení V regionu, stejně jako zárodečné sekvence; tyto lidské sekvence imunoglobulinů mohou být označovány jako v podstatě identické s polypeptidovými sekvencemi kódovanými lidskými VL nebo VH genovými segmenty a lidskými JL nebo JL segmenty, i když mohou být přítomny další non-zárodečné sekvence, v důsledku somatických mutací a různých rekombinačních spojení V-J a V-DJ. Pro takové lidské sekvence protilátek platí, že variabilní regiony každého řetězce jsou typicky alespoň z 80% kódované lidskými zárodečnými V, J, a, v případě těžkých řetězců, D genovými segmenty; často je alespoň 85% variabilních regionů kódováno lidskou zárodečnou sekvencí přítomnou na transgenu;
44 ·♦ · 44 f
4 4 4 4 4 4 4 4 • · · ·· · · · 4 4 4 4 4 • 4 4 · · · 4444444 4 44 4 4
4444 44 4 4 4 4
44 44 4 44 4 často je alespoň 90-95% variabilních regionů kódováno lidskou zárodečnou sekvencí přítomnou na transgenu. Nicméně, protože jsou non-zárodečné sekvence vloženy somatickými mutacemi a VJ a VDJ spojením, obsahují lidské sekvence protilátky často určité variabilní regiony (a méně často konstantní regiony), které nejsou kódované lidskými V, D nebo J genovými segmenty, jak se vyskytují v lidských transgenech u zárodečných myší. Typicky se takové non-zárodečné sekvence (nebo jednotlivé nukleotidové pozice) seskupují v nebo poblíž CDR, nebo v regionech, o kterých je známo, že se somatické mutace seskupuj i.
Lidské sekvence protilátky, které se váží na předem určený antigen, mohou vznikat v důsledku přesmyku izotypů, při kterém jsou produkovány lidské protilátky obsahující lidský γ řetězec (jako je yl, y2a, γ2Β nebo γ3) a lidský lehký řetězec (jako je K). Takové lidské protilátky s přesmykem izotypu často obsahují jednu nebo více somatických mutací, obvykle ve variabilním regionu a často v nebo v rámci 10 zbytků CDR, jako výsledek afinitní maturace a selekce B-lymfocytů antigenem, zejména po sekundární (nebo následné) imunizaci antigenem.
Tyto vysoce-afinitní lidské sekvence protilátky mohou mít vazebné afinity alespoň lxlO9 M_1, typicky alespoň 5xlO10 M”1, často více než lxlO10 M_1, a někdy 5xlO10 M”1 až 1x101:lM_1 nebo vyšší.
Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká B-lymfocytů od takových myší, které mohou být použity pro generování hybridomů exprimujících lidské monoklonální protilátky, které se váží s vysokou afinitou (např. vyšší než 2xl09 M-1) na EGFR. V jiném provedení předkládaného vynálezu jsou tyto hybridomy použity pro přípravu prostředku obsahujícího imunoglobulin mající afinitní konstantu (KA) alespoň 2xlO9M_1 pro vazbu na ·· 00 00 0 00 0 » » » 000 000
0 000 0 000 0 000 • 9 9 999 »000000 00000
C7 0000 00 0 00 0
JI 9999 999 999
EGFR, kde uvedený imunoglobulin obsahuje:
lidskou sekvenci pro lehký řetězec složenou z (1) variabilního regionu lehkého řetězce majícího polypeptidovou sekvenci, která jev podstatě identická jako polypeptidová sekvence kódovaná lidským VL genovým segmentem a lidským JL segmentem, a (2) konstantního regionu lehkého řetězce majícího polypeptidovou sekvenci, která je v podstatě identická s polypeptidovou sekvencí kódovanou lidským CL genovým segmentem; a lidskou sekvenci pro těžký řetězec složenou z (1) variabilního regionu těžkého řetězce majícího polypeptidovou sekvenci, která jev podstatě identická jako polypeptidová sekvence kódovaná lidským VH genovým segmentem, volitelně D regionem a lidským JH segmentem, a (2) konstantního regionu majícího polypeptidovou sekvenci, která je v podstatě identická s polypeptidovou sekvencí kódovanou lidským CH genovým segmentem.
Vývoj lidské monoklonální protilátky proti EGFR s vysokou afinitou je usnadněn způsobem pro expandování repertoáru genových segmentů pro lidský variabilní region v transgenních myších majících genom obsahující integrovaný lidský imunoglobulinový transgen, kde uvedený vývoj zahrnuje vložení (dp genomu) V genového transgenu obsahujícího genové segmenty pro V region, které nejsou přítomny v uvedeném integrovaném lidském imunoglobulinovém transgenu. Často je transgen pro V region kvasinkový artificiální chromosom obsahující část sestavy genových segmentů pro lidský VH nebo VL (VK), jak se přirozeně vyskytují v lidském genomu nebo jak mohou být sestřiženy pomocí rekombinantních metod, které mohou zahrnovat mimořádné nebo vynechané V segmenty. Často je v YAC obsaženo alespoň pět nebo více V genových segmentů. V této variantě je možné připravit transgenní myš produkovanou metodou expanze • 9
V repertoáru, kde myš exprimuje imunoglobulinový řetězec obsahující sekvenci variabilního regionu kódovanou genovými segmenty V regionu přítomnými na transgenu pro V region a C region kódovaný transgenem pro lidský Ig. Za použití metody expanze V repertoáru mohou být připraveny myši mající alespoň pět odlišných V genů; stejně tak mohou myši obsahovat alespoň 24 V genů nebo více. Některé V genové segmenty mohou být nefunkční (například pseudogeny a podobně); tyto segmenty mohou být zachovány nebo mohou být selektivně deletovány rekombinantními způsoby známými v oboru, pokud je to žádoucí.
Jakmile se myší zárodky upraví tak, aby obsahovaly funkční YAC mající expandovaný repertoár pro V segment, který v podstatě není přítomen v lidském Ig transgenu obsahujícím J a C genové segmenty, může být tento rys propagován a křížen do jiného genetického pozadí, včetně takového pozadí, kde je funkční YAC s expandovaným repertoárem V segmentu křížen do zárodků myší majících jiný lidský Ig transgen. Více funkčních YAC majících expandovaný repertoár pro V segment může být kříženo do zárodků tak, aby spolupracovaly s lidským Ig transgenem (nebo s více lidskými Ig transgeny). Ačkoliv jsou zde označovány jako YAC transgeny, mohou takové transgeny, jsou-li integrovány do genomu, v podstatě neobsahovat kvasinkové sekvence, jako jsou sekvence nutné pro autonomní replikaci ve kvasinkách; takové sekvence mohou být případně odstraněny metodami genetického inženýrství (například restrikčním trávením a gelovou elektroforesou v pulsním poli nebo jinou vhodnou metodou) poté, co není replikace ve kvasinkách nadále nutná (tj. před vnesením do myších ES buněk nebo myších prozygotů). Mezi způsoby pro propagování rysu exprese lidské imunoglobulinové sekvence zahrnují křížení transgenní myši mající lidský Ig transgen, a případně také mající funkční YAC s expandovaným repertoárem pro V segment.
4· *
94 »·
4*9 94 • 4 494 4 4
4 4 4 4 · 4
4 4 4 9 4
94 9«
4 4 • 4 4 4
4 4449«
4 9 9
44 9 • 4 • 44 4
Na YAC mohou být přítomny jak VH, tak VL. Transgenní myši mohou být kříženy do jakéhokoliv pozadí požadovaného výzkumníkem, včetně genetického pozadí nesoucího jiné lidské transgeny, včetně lidských Ig transgenů a/nebo transgenů kódujících jiné lidské lymfocytární proteiny. Vynález také poskytuje lidské imunoglobulinové sekvence s vysokou afinitou produkované transgenní myší mající YAC transgen s expandovaným repertoárem pro V region. Ačkoliv byl uveden popsV výhodných transgenních zvířat podle předkládaného vynálezu, existují i další provedení, která lze rozdělit do čtyř kategorií:
I. Transgenní zvířata obsahující nerearanžovaný těžký a rearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen;
II. Transgenní zvířata obsahující nerearanžovaný těžký a nerearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen;
III. Transgenní zvířata obsahující rearanžovaný těžký a nerearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen; a
IV. Transgenní zvířata obsahující rearanžovaný těžký a rearanžovaný lehký imunoglobulinový transgen.
Z těchto kategorií jsou transgenní zvířata výhodná v následujícím pořadí: II > I > III > IV, když jsou endogenní geny pro lehký řetězec (nebo alespoň K gen) vyřazené homologní rekombinací (nebo jinou metodou) a I > II > III >
IV, když nejsou endogenní geny pro lehký řetězec vyřazeny a musí být dominovány alelickým vyloučením.
III. Bispecifické/ Multispecifické molekuly, které se váží na EGFR
V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu mohou být lidské monoklonálni protilátky k EGFR, nebo jejich vazebné části pro antigen, derivatizovány nebo navázány na jinou funkční molekulu, např. jiný peptid nebo protein (např. Fab' • ft ftft ft · ♦ » · ··· ft · · · ft · · ft • ft ·· ·* ft ·· ft r · ft · · · ft ··· * · · · ft · · ··«· ft ft · «··« • · · · 9 · • ft ft ftft ft fragment) za zisku bispecifické nebo multispecifické molekuly, které se váže na více vazebných míst nebo cílových epitopů. Například, protilátky nebo vazebná část pro antigen podle předkládaného vynálezu mohou být funkčně navázány (např. chemickou vazbou, genetickou fúzí, nekovalentní asociací nebo jinak) na jednu nebo více jiných vazebných molekul, jako je jiná protilátka, fragment protilátky, peptid nebo vazebné mimetikům.
V souladu s tím vynález zahrnuje bispecifické a multispecifické molekuly obsahující alespoň jednu první vazebnou specificitu pro EGFR a druhou vazebnou specificitu pro druhý cílový epitop. V konkrétním provedení podle předkládaného vynálezu je druhým cílovým epitopem Fc receptor, např. lidský FcyRI (CD64) nebo lidský Fca receptor (CD89).
Proto vynález zahrnuje bispecifické a multispecifické molekuly schopné vazby na efektorové buňky exprimující FcyR, FcaR nebo FceR (např. monocyty, makrofágy nebo polymorfonukleární buňky (PMN)), a na cílové buňky exprimující EGFR. Tyto bispecifické a multispecifické molekuly cílí efektorové buňky na EGFR exprimující buňky a - jako lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu - spouští Fc receptorem zprostředkované aktivity efektorových buněk, jako je fagocytosa EGFR exprimujících buněk, buněčná cytotoxicita zprostředkovaná protilátkami (ADCC), uvolňování cytokinů nebo generování superoxidového aniontu.
Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat třetí vazebnou specificitu, kromě anti-Fc vazebné specificity a anti-EGFR vazebné specificity. V jednom provedení je třetí skupinou se specifickou vazbou „anti-enhancement faktor (EF), např. molekula, která se váže na povrchový protein podílející se na ·· · · φφφ ··· • · · φφφ · · · • φφφφ φ ··· φ ··· • · · φ · φ φ φφφφ φ φ φ φφφφ £1 φφφφ······
D1 ΦΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ cytotoxické aktivitě, a tak se zvyšuje imunitní reakce proti cílovým buňkám. „Anti-enhancement faktorem může být protilátka, funkční protilátkový fragment nebo ligand, který se váže na danou molekulu, např. antigen nebo receptor, což vede k zesíleni účinku vazebných determinant pro Fc receptori nebo antigen cílových buněk. „Anti-enhancement faktor se může vázat na Fc receptor nebo antigen cílové buňky. Alternativně se „anti-enhancement faktor může vázat na entitu jinou než je entita, na kterou se váží první a druhá skupina určující vazebnou specificitu. Například se „anti-enhancement faktor může vázat na cytotoxické T-lymfocyty (např. cestou CD2, CD3,
CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1; nebo na jiné buňky imunitního systému, které vedou k vyšší imunitní reakci proti cílovým buňkám).
i
V jednom provedení obsahují bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu jako vazebnou specificitu alespoň jednu protilátku nebo fragment protilátky, včetně např. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, nebo a jednořetězcových Fv. Protilátkou může být také dimer lehkých řetězců nebo těžkých řetězců, nebo jakýkoliv jejich minimální fragment, jako je Fv nebo jednořetězcový konstrukt, jak je popsán v Ladner et al.^U.S. patent č. 4,946,778, udělený 7.8.1990, jehož obsj//) je zde uveden jako odkaz.
V jednom provedení obsahují bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu vazebnou specificitu pro FcyR nebo FcaR přítomný na povrchu efektorových buněk, a druhou vazebnou specificitu pro antigen cílových buněk, např. EGFR.
V jednom provedení je vazebná specificita pro Fc receptor dodána lidskou monoklonální protilátkou, jejíž vazba není blokována lidským imunoglobulinem G (IgG). Jak je zde použit, • · • · · · ···· ·· · · Ο Z 99 9 9 9 9 9 4 označuje termín IgG receptor jakýkoliv z osmi genů pro yřetězec umístěný na chromosomu 1. Tyto geny kódují celkem dvanáct isoforem transmembránových nebo solubilních receptorů, které se dělí do tří tříd Fcy receptoru: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) a FcyRIII (CD16). V jednom výhodném provedení je Fcy receptorem a lidský vysoce afinitní FcyRI. Lidský FcyRI je 72 kDa molekula, která vykazuje vysokou afinitu pro monomerní IgG (108-109 M'1) .
Produkce a charakterizace těchto výhodných monoklonálních Protilátek je popsána v Fanger et al., PCT přihláška WO 88/00052 a U.S. Patent č. 4,954,617, které jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti. Tyto protilátky se váží na epitop FcyRI, FcyRII nebo FcyRIII v místě, které je odlišné od Fcy vazebného místa receptoru a proto není jejich vazba blokována fyziologickými koncentracemi IgG. Specifické anti-FcyRI protilátky použitelné v předkládaném vynálezu jsou MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 a MAb 197. Hybridom produkující MAb 32 je dostupný z American Type Culture Collection, ATCC přírůstkové č. HB94 69. Anti-FcyRI MAb 22, F(ab')2 fragmenty MAb 22, mohou být získány od Medarex, lne. (Annandale, N.J.). V jiných provedeních je protilátkou k Fcy receptoru humanizovaná forma monoklonální protilátky 22 (H22). Produkce a charakterizace H22 protilátky je popsána v Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 a PCT/US93/10384. Buněčné linie produkující H22 protilátky byly uloženy v American Type Culture Collection 4.11.1992 pod číslem HA022CL1 a mají přírůstkové č. CRL 11177.
V jiných výhodných provedeních je vazebná specificita pro Fc receptor dodána protilátkou, která se váže na lidský IgA receptor, např. Fc-alfa receptor (FcaRI (CD89)), kde tato • · • · · • φφφφ · φφφ · φφφ • · · · · · · ···· φ · φ φφφφ «· ·· ·· · ·· · vazba výhodně není blokována lidským imunoglobulinem A (IgA).
Termín IgA receptor označuje genový produkt jednoho a-genu (FcaRI) umístěného na chromosomu 19. Je známo, že tento gen kóduje několik alternativně sestřižených transmembránových isoforem velikosti 55 až 110 kDa. FcaRI (CD89) je konstitutivně exprimován na monocytech/makrofágách, eosinofilních a neutrofilních granulocytech, ale ne na nonefektorových buňkách. FcaRI má střední afinitu (5 x 107 M“1) pro IgAl a IgA2, která se zvyšuje po expozici cytokinům, jako je G-CSF nebo GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical
Reviews in Imunology 16:423-440). Byly popsány čtyři FcaRIspecifické monoklonální protilátky, označované jako A3, A59, A62 a A77, které se váží na FcaRI mimo IgA ligandovou vazebnou doménu (Monteiro, R.C. et al., 1992, J. Imunol.
148:1764).
FcaRI a FcyRI jsou výhodnými spouštěcími receptory pro použití v předkládaném vynálezu, protože jsou (1) exprimovány primárně na imunitních efektorových buňkách, např. monocytech,
PMN, makrofágách a dendritických buňkách; (2) exprimovány ve vysokých koncentracích (např., 5,000-100,000 na buňku); (3) mediátory cytotoxických aktivit (např., ADCC, fagocytosy); (4) zprostředkují zvýšenou antigenní prezentaci antigenu, včetně vlastních antigenu, které jsou s nimy spojeny.
V dalších provedeních bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu dále obsahují vazebnou specificitu, která rozpoznává, například váže se na, antigen cílových buněk, např. EGFR. Ve výhodném provedení je vazebná specificita dodána lidskou monoklonální protilátkou podle předkládaného vynálezu.
• · • · ··· · · · · · · • ···· · ··· · · · · • ·· · · · ·····♦· ···· *··*·· ·· · ·· ·
Protilátky specifické pro efektorové buňky jsou protilátky nebo funkční protilátkové fragmenty, které se váží na Fc receptor efektorových buněk. Výhodné protilátky pro použití v předkládaném vynálezu se váží na Fc receptor efektorových buněk v místě, ve kterém se neváže endogenní imunoglobulin.
Jak je zde použit, označuje termín efektorová buňka buňku imunitního systému, která se podílý na efektorové fázi imunitní reakce, a nikoliv na rozpoznávací a aktivační fázi imunitní reakce. Příklady imunitních buněk jsou buňky myeloidního nebo lymfoidního původu, např. lymfocyty (např., B-lymfocyty a T-lymfocyty, včetně cytolytických T lymfocytů (CTL)), zabíječské buňky, přirození zabíječi, makrofágy, monocyty, eosinofily, neutrofily, polymorfonukleární buňky, granulocyty, žírné buňky a basofily. Některé efektorové buňky exprimují specifické Fc receptory a provádějí specifické imunitní funkce. Ve výhodném provedení je efektorová buňka schopna indukovat buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC), např. se jedná o neutrofil schopný indukovat ADCC. Například, monocyty, makrofágy, které exprimují FcR, se podílejí na specifickém zabíjení cílových buněk a na prezentování antigenů dalším složkám imunitního systému, nebo na vazbě na buňky, které prezentují antigeny. Ve výhodném provedení může efektorová buňka fagocytovat cílový antigen, cílovou buňku nebo mikroorganismus. Exprese konkrétního FcR na efektorové buňce může být regulována humorálními faktory, jako jsou cytokiny. Například bylo zjištěno, že exprese FcyRI je zvyšována interferonem gamma (IFN-γ) . Tato zvýšená exprese zvyšuje cytotoxickou aktivitu Buněk nesoucích FcyRI proti cílům. Efektorová buňka může fagocytovat nebo lyžovat cílový antigen nebo cílovou buňku.
• ·
Cílová buňka by měla být jakákoliv nežádoucí buňka u jedince (např. člověka nebo zvířete), která může být cíleně ovlivněna prostředkem (např. lidskou monoklonální protilátkou, bispecifickou nebo multispecifickou molekulou) podle předkládaného vynálezu. Ve výhodných provedeních je cílovou buňkou buňka exprimující nebo nadměrně exprimující EGFR. Mezi buňky exprimující EGFR typicky patří nádorové buňky, jako jsou buňka nádorů močového měchýře, prsu, střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, ledvin, spinocelulárních karcinomů, plic (nemalobuněčných) a nádorů hlavy a krku. Dalšími EGFRexprimujícími buňkami jsou synoviální fibroblasty a keratinocyty, které mohou být použity jako cíle při léčbě artritidy a psoriasy, v příslušném pořadí.
Ačkoliv jsou lidské monoklonální protilátky preferovány, jsou dalšími protilátkami, které mohou být použity v bispecifických nebo multispecifických molekulách podle předkládaného vynálezu myší, chimérické a humanizované monoklonální protilátky.
Chimérické myší-lidské monoklonální protilátky (t.j ., chimérické protilátky) mohou být produkovány rekombinantními DNA technikami známými v oboru. Například, gen kódující Fc konstantní region myší (nebo jiného druhu) monoklonální protilátky se tráví restrikčními enzymy pro odstranění regionu kódujícího myší Fc, a substituuje se ekvivalentní část genu kódující lidský Fc konstantní region. (Viz Robinson et al., Mezinárodní patentová přihláška PCT/US86/02269; Akira, et al., Evropská patentová přihláška 184,187; Taniguchi, Μ., Evropská patentová přihláška 171,496; Morrison et al., Evropská patentová přihláška 173,494; Neuberger et al., Mezinárodní patentová přihláška WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent č. 4,816,567; Cabilly et al., Evropská patentová přihláška • · • A • A A • · · A · A A · · ·
AAA A AAAA A A A AAA* 66 ···· ·· · ·· ·
125,023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Imunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nátuře 3 14:446-449; a Shaw et al., 1988, J. Nati. Cancer Inst.
80:1553-1559).
Chimérické protilátky mohou být dále humanizované nahrazením sekvence Fv variabilního regionu, které se přímo nepodílejí na vazbě antigenu, ekvivalentními sekvencemi z lidských Fv variabilních regionů. Obecný přehled humanizovaných chimérických protilátek je uveden v Morrison,
S. L., 1985, Science 229:1202-1207 a v Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214. Mezi takové metody patří izolování, manipulace a exprese sekvencí nukleové kyseliny, které kódují celé nebo části imunoglobulinových Fv variabilních regionů z alespoň jednoho těžkého nebo lehkého řetězce. Zdroje takové nukleové kyseliny jsou dobře známé odborníkům v oboru a mohou být získány například ze 7E3, hybridomu produkujícího antiGPIIbIIIa protilátky. Rekombinantní DNA kódující chimérické protilátky, nebo její fragment, může být potom klonována do vhodných expresních vektorů. Vhodné humanizované protilátky mohou být alternativně produkovány CDR substitucí podle U.S.
Patentu 5,225,539; Jones et al. 1986 Nátuře 321:552-525;
Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; a Beidler et al. 1988 J. Imunol. 141:4053-4060.
Všechny CDR konkrétní lidské protilátky mohou být nahrazeny alespoň částí non-lidského CDR nebo mohou být pouze některé CDR nahrazeny non-lidskými CDR. Je nezbytné nahradit ty CDR. Které jsou nutné pro vazbu humanizované protilátky na Fc receptor.
• ·
Protilátky mohou být humanizované jakýmkoliv způsobem,který nahrazuje alespoň část CDR lidské protilátky CDR z non-lidské protilátky. Winter popisuje způsob, který může být použit pro přípravu humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu (UK Patentová přihláška GB 2188638A, podaná 26.3.1987), jejíž obsah je zde uveden jako odkaz.
Lidské CDR mohou být nahrazeny non-lidskými CDR za použití oligonukleotídy místně cílené mutagenese, jak je popsána v Mezinárodní přihlášce WO 94/10332 nazvané Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes.
Předkládaný vynález také zahrnuje chimérické a humanizované protilátky, ve kterých byly specifické aminokyseliny substituovány, deletovány nebo přidány. Konkrétně, výhodné humanizované protilátky mají aminokyselinové substituce v regionu pracovního rámce, například za účelem zlepšení vazby na antigen. Například v humanizované protilátce mající myší CDR mohou být aminokyseliny umístěné v lidském regionu pracovního rámce nahrazeny aminokyselinami umístěnými v příslušných pozicích myší protilátky. Je známo, že takové substituce zlepšují v některých případech vazbu humanizovaných protilátek na antigen. Protilátky, ve kterých byly aminokyseliny přidány, deletovány nebo substituovány, jsou zde označované jako modifikované protilátky nebo alterované protilátky.
Termín modifikované protilátky také zahrnuje protilátky, jako jsou monoklonální protilátky, chimérické protilátky a humanizované protilátky, které byly modifikovány např. delecí, přidáním nebo substitucí částí protilátky. Například může být protilátka modifikovaná deletováním konstantního regionu a jeho nahrazením konstantním regionem určeným ke zvýšení φφ φφ • · · φ φφφφ • φ · φ · φφφ • · · φ φ · »
ΦΦΦΦ· · · poločasu, například sérového poločasu, stability nebo afinity protilátky. Jakákoliv modifikace spadá do rozsahu předkládaného vynálezu, pokud má bispecifická a multispecifická molekula alespoň jeden region vážící antigen specifický pro FcyR a spouští alespoň jednu efektorovou funkci.
Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny za použití chemických technik (viz např., D. M. Kranz et al. (1981) Proč. Nati. Acad Sci. USA 78:5807), polydoma technik (viz U.S. Patent 4,474,893, Reading), nebo rekombinantních DNA technik.
Konkrétně, bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny konjugací skupin určujících vazebnou specificitu, například anti-FcR a antiEGFR vazebnou specificitu, za použití metod dobře známých v oboru a popsaných v příkladech provedení vynálezu.
Například, každá vazebnou specificitu určující skupina bispecifické a multispecifické molekuly může být připravena samostatně a potom mohou být tyto skupiny konjugovány na sebe navzájem. Když jsou skupinami určujícími vazebné specificity proteiny nebo peptidy, zak mohou být různá kondenzační nebo zesíťovací činidla použita pro kovalentní konjugaci. Příklady takových zesíťovacích činidel jsou protein A, karbodiimid, Nsukcinimidyl-S-acetylthioacetát (ŠATA), 5,5'dithiobis(kyselina 2-nitrobenzoová) (DTNB), ofenylendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát (SPDP), a sulfosukcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylát (sulfoSMCC) (viz např., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:8648). Dalšími metodami jsou metody popsané v Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83), a Glennie et al. (J. Immunol.
0 00 000 000
000 000 000
0000 0 000 0 000
0 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 000 rn 0000000 <0 0
00 00 0 0· · (1987) 139: 2367-2375). Výhodnými konjugačními činidly je
ŠATA a sulfo-SMCC, kde obě tato činidla jsou dostupná od
Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Když jsou skupinami určujícími vazebnou specificitu protilátky (např. dvě humanizované protilátky), tak mohou být konjugovány přes sulfhydrylovou vazbu C-konců pantových regionů dvou těžkých řetězců. V konkrétním výhodném provedení je pantový region modifikovaný tak, aby obsahoval náhodný počet sulfhydrylových zbytků, výhodně jeden, a tato modifikace je provedena před konjugací.
Alternativně mohou být skupiny určující vazebné specificity kódované stejným vektorem a mohou být exprimovány a sestavovány ve stejné hostitelské buňce. Tento způsob je zejména vhodná tehdy, když je bispecifickou a multispecifickou molekulou MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')2 nebo ligand x Fab fúzní protein. Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu, např. bispecifické molekuly, mohou být jednořetězcové molekuly, jako jsou jednořetězcové bispecifické protilátky, jednořetězcové bispecifické molekuly obsahující jednu jednořetězcovou protilátku a skupinu určující vazbu, nebo jednořetězcové bispecifické molekuly obsahující dvě skupiny určující vazbu. Bispecifické a multispecifické molekuly mohou také být jednořetězcové molekuly nebo mohou obsahovat alespoň dvě jednořetězcové molekuly. Způsoby pro přípravu bi- a multspecifických molekul jsou popsány například v U.S. Patentu č. 5,260,203; U.S. Patentu č. 5,455,030; U.S. Patentu č. 4,881,175; U.S. Patentu č. 5,132,405; U.S. Patentu č. 5,091,513; U.S. Patentu č. 5,476,786; U.S. Patentu č.
5,013,653; U.S. Patentu č. 5,258,498; a U.S. Patentu č.
5,482,858.
4 • · 4
• · · 4 ·· 4 • · · · 444 • · 4 · ····· 4 4 44444
Vazby bispecifických a multispecifických molekul na jejich specifické cíle mohou být potvrzeny enzymovým imunosorbentním testem (ELISA), radioimunotestem (RIA), FACS analýzou a biotesty (např., inhibici růstu), nebo Western Blot testem. Každý z těchto testů obecně detekuje přítomnost komplexů protein-protilátka pomocí značeného činidla (např. protilátky) specifického pro daný komplex. Například, komplexy FcRprotilátka mohou být detekovány za použití např. protilátky nebo protilátkového fragmentu s navázaným enzymem, která rozpoznává a specificky se váže na komplexy protilátka-FcR. Alternativně mohou být komplexy detekovány za použití různých dalších imunotestů. Například mohou být protilátky radioaktivně značeny a potom použity v radioimunotestu (RIA) (viz, například, Weintraub, B., Principles of
Radioimunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, zde uvedeno jako odkaz). Radioaktivní izotop může být detekován za použití γ kamery nebo scintilačního počítače nebo autoradiograficky.
IV. Protilátkové konjugáty/imunotoxiny
V dalším aspektu se předkládaný vynález týká lidské antiEGFR monoklonální protilátky, nebo jejího fragmentu, konjugované na terapeutickou skupinu, jako je cytotoxin, léčivo nebo a radioizotop. Při konjugování na cytotoxin jsou tyto protilátkové konjugáty označovány jako imunotoxiny. Cytotoxin nebo cytotoxické činidlo je jakékoliv činidlo, které je škodlivé pro buňky (např. zabíjí buňky). Příklady takových činidel jsou taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidiumbromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vincristin, vinblastin, kolchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracin-dion, mitoxantron, mithramycin, aktinomycin D, 1dehydrotestosteron, glukokortikoidy, prokain, tetrakain,
· • · lidokain, propranolol, puromycin a jejich analogy nebo homology. Mezi terapeutická činidla patří například antimetabolity (např.. methotrexát, 6-merkaptopurin, 6thioguanin, cytarabin, 5-fluorouracil, dakarbazin), alkylační činidla (např., mechlorethamin, thiotepa, chlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) a lomustin (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C a cisdichlorodiamin-platina(II) (DDP) cisplatina), anthracykliny (např. daunorubicin (dříve daunomycin) a doxorubicin), antibiotika (např. daktinomycin (dříve aktinomycin), bieomycin, mithramycin a anthramycin (AMC)), a antimitotická činidla (např. vincristin a vinblastin). Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou konjugovány na radioizotop, např. radioaktivní jód, za vzniku cytotoxických radiofarmak pro léčbu onemocnění souvisejících s EGFR, jako jsou nádory.
Protilátkové konjugáty podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro modifikování dané biologické reakce, a terapeutická skupina není omezena na klasické chemické terapeutické skupiny. Například může být terapeutickou skupinou protein nebo polypeptid mající požadovanou biologickou aktivitu. Mezi takové proteiny patří, například, enzymaticky aktivní toxiny, nebo jejich aktivní fragmenty, jako je abrin, ricin A, pseudomonadový exotoxin nebo difterický toxin; a proteiny, jako je tumor nekrosis faktor nebo interferon-γ; nebo modulátory biologické reakce, jako jsou například lymfokiny, interleukin-1 (IL—1), interleukin-2 (IL—2), interleukin-6 (IL—6), granulocytární-makrofágové kolonie stimulující faktor (GM-CSF), granulocytární kolonie stimulující faktor (G-CSF), nebo jiné růstové faktory.
Techniky pro konjugování takových terapeutických skupin na protilátky jsou dobře známé, viz např. Arnon et al., • · • · · ·
99 99 9 99
9 9 9 9 9 9 9
9999 9 999 9 9
99 999 9 9999 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 9 99 9
Monoclonal Antibodies For Imunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), str. 243-56 (Alan R. Liss, lne. 1985);
Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, v Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), str. 623.-53 (Marcel Dekker, lne. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, v Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et at. (eds.), str. 475-506 (1985); Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), str. 303-16 (Academie Press 1985), a Thorpe et al., The
Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
V. Farmaceutické prostředky
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje prostředek, např. farmaceutický prostředek, obsahující jednu nebo kombinaci lidských monoklonálních protilátek, nebo jejich vazebných částí pro antigen, podle předkládaného vynálezu, které jsou formulovány společně s farmaceuticky přijatelným nosičem. Ve výhodném provedení prostředek obsahuje kombinaci více (například dvou nebo více) izolovaných lidských protilátek nebo jejich vazebných částí pro antigen podle předkládaného vynálezu. Výhodně se každá protilátka nebo její vazebná část pro antigen v prostředku váže na jiný, předem vybraný epitop EGFR.
V jednom provedení jsou lidské anti-EGFR monoklonální protilátky mající komplementární aktivity použity v kombinaci, např. ve formě farmaceutického prostředku obsahujícího dvě
4« 4
9 4
44
4 9
4 444
4
9 4
4 4 4
49444 4 9
4 4 4
4 4 4
4 4 44
4 4 nebo více lidské anti-EGFR monoklonální protilátky. Například, lidská monoklonální protilátka, která zprostředkuje vysoce účinné zabíjení cílových buněk za přítomnosti efektorových buněk, může být kombinována s jinou lidskou monoklonální protilátkou, která inhibuje růst buněk exprimujících EGFR.
V jiném provedení prostředek obsahuje jednu nebo více bispecifických nebo multispecifických molekul podle předkládaného vynálezu (např. které obsahují alespoň jednu vazebnou specificitu pro Fc receptor a alespoň jednu vazebnou specificitu pro EGFR).
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být také podány v kombinované terapii, tj. v kombinaci s jinými činidly. Například může kombinovaná terapie zahrnovat prostředek podle předkládaného vynálezu s alespoň jedním protinádorovým léčivem nebo jinou běžnou terapií.
Jak je zde použit, označuje termín farmaceuticky přijatelný nosič jakékoliv rozpouštědlo, disperzní medium, potah, antibakteriální a antimykotické činidlo, činidlo upravující izotonicitu a zpomalující absorpci, a podobně, které je fyziologicky kompatibilní. Výhodně je nosič vhodný pro intravenosní, intramuskulární, podkožní, parenterální, spinální nebo epidermální podání (např. injekcí nebo infusí). Podle způsobu podání může být aktivní sloučenina, t.j. protilátka, bispecifická a multispecifická molekula, potažena materiálem, který jí chrání před působením kyselin a jiných vlivů, které by mohly inaktivovat sloučeninu.
Farmaceuticky přijatelná sůl je sůl, která si zachovává požadovanou biologickou aktivitu a která nemá žádné nežádoucí toxické účinky (viz např. Berge, S.M., et al. (1977) J.
·« «» « » · · · • · ··· · · • · · · · · 9
9 9 9 9 4
4^ 94
4
4 4
4 4 4 ···· • · · · • ·· * • · ·· ··
Pharm. Sci. 66:1-19). Příklady takových solí jsou adiční soli s kyselinami a bázemi. Mezi adiční soli s kyselinami patří ty soli, které jsou získány z netoxickýxh anorganických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, dusičná, fosforečná, sírová, bromovodíková, jodovodíková, fosforitá a podobně, stejně jako z netoxických organických kyselin, jako jsou alifatické monoa dikarboxylové kyseliny, fenyl-substituované alkanové kyseliny, hydroxy alkanové kyseliny, aromatické kyseliny, alifatické a aromatické sulfonové kyseliny a podobně. Adiční soli s bázemi jsou soli získané z kovů alkalických zemin, jako je sodík, draslík, vápník a podobně, stejně jako soli z netoxických organických aminů, jako je N,N'dibenzylethylendiamin, N-methylglukamin, chlorprokain, cholin, diethanolamin, ethylen diamin, prokain a podobně.
Prostředek podle předkládaného vynálezu může být podán různými způsoby známými v oboru. Jak bude odborníkům v oboru jasné, způsob podání závisí na požadovaném výsledku. Aktivní sloučenina může být připravena s nosiči, které chrání sloučeninu před rychlým uvolněním, jak je tomu v přípravcích s řízeným uvolňováním, včetně implantátů, transdermálních náplastí a mikrokapslí. Biodegradovatelné, biokompatibilní polymery, jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná, mohou být také použity. Mnoho způsoby pro přípravu takových prostředků je známo v oboru a je patentováno. Viz, např., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, lne., New York, 1978.
Pro podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu některými způsoby podání může být nutné potáhnout sloučeninu nebo podat sloučeninu současně s materiálem, který brání inaktivaci sloučeniny. Například mohou být sloučeniny podány • · • 44 4 4 4 4 4 4
44·· · 4 4 · 4 44 • · · 4 4 4 4 ···· ·· 4 4 ······· · · ' J *··4 44 4 44 jedinci ve vhodném nosiči, například v liposomech nebo v ředidle. Mezi farmaceuticky přijatelná ředidla patří vodné pufrované roztoky. Mezi liposomy patří CGF emulze voda-voleji-ve-vodě, stejně jako běžné liposomy (Strejan et al.
(1984) J. Ne.ur o immunol. 7:27).
Mezi farmaceuticky přijatelné nosiče patří sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro okamžitou přípravu sterilních injekčních roztoků nebo disperzí. Použití takových medií a činidel pro farmaceuticky aktivní substance je známé v oboru. Pokud není běžné medium inkompatibilní s farmaceutickým činidlem, je jeho použití ve farmaceutickém prostředku podle předkládaného vynálezu možné. Prostředky mohou také obsahovat doplňkové aktivní sloučeniny.
Terapeutické prostředky musí být sterilní a stabilní při výrobě a skladování. Prostředek může být formulován jako roztok, mikroemulze, liposom, nebo jiná forma vhodná pro vysokou konctraci léku. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní medium obsahující, například, vodu, ethanol, polyol (například, glycerol, propylenglykol, kapalný polyethylenglykol a podobně), a jejich vhodné směsi. Vhodná tekutost může být dosažena pomocí použití potahovacích činidel, jako je lecitin, zachováním vhodné velikosti částic, v případě disperzí a pomocí použití surfaktantů. V mnoha případech může být výhodné v prostředcích použít činidla upravující isotonicitu, například sacharidy, polyalkoholy, jako je mannitol, sorbitol, nebo chlorid sodný. Prodloužené absorpce může být dosaženo tak, že se v prostředku použije činidlo oddalující absorpci, , například, monostearátové soli a želatina.
Sterilní injekční roztoky mohou být připraveny tak, že se ·· ·· · · · ·' • · · · · · · • * ··· · · · · · • ·· ··· ······· ···· ·· · ·
7o ·· ·· ·· * · aktivní sloučenina smísí v požadovaném množství s vhodným rozpouštědlem, společně s jedním nebo kombinací složek uvedených výše, a potom se provede sterilizace mikrofiltrací. Obecně, disperze se připraví inkorporaci aktivní sloučeniny do sterilního vehikula, které obsahuje základní disperzní medium a další přísady, jak byly uvedeny výše. V případě sterilních prášků pro přípravu sterilních injekčních roztoků je výhodným způsobem přípravy vakuové sušení a lyofilizace, které vedou k zisku práškové aktivní složky a dalších přísad ze sterilně přefiltrovaného roztoku.
Dávkovači protokoly jsou upraveny tak, aby vedly k optimální požadované odpovědi (například terapeutické odpovědi). Může být podána například jediná dávka, několik dávek za určitý čas, nebo může být dávka zvyšována a snižována podle aktuální klinické situace. Výhodné je připravit parenterální prostředky ve formě dávkových jednotek, čímž je podání snadné a jednotné. Termín dávková jednotka označuje fyzikálně diskrétní jednotku vhodnou pro podání jako jedna dávka jedinci; každá dávková jednotka obsahuje předem určené množství aktivní sloučeniny vypočtené pro produkci požadovaného terapeutického efektu, společně s vybraným farmaceutickým nosičem. Přesné parametry dávkových jednotek podle předkládaného vynálezu jsou určovány a přímo závisejí na (a) jedinečných charakteristikách aktivní sloučeniny a konkrétním terapeutickém efektu, který má být dosažen, a (b) omezeních souvisejících s přípravou lékových forem takové sloučeniny pro léčbu.
Příklady farmaceuticky přijatelných antioxidačních činidel jsou: (1) antioxidační činidla rozpustná ve vodě, jako je kyselina askorbová, cystein-hydrochlorid, natrium-bisulfát, natrium-metabisulfit, natrium-sulfit a podobně; (2) • · « ·
antioxidační činidla rozpustná v oleji, jako je ascorbylpalmitát, butylovaný hydroxyanisol (BHA), butylovaný hydroxytoluen (BHT), lecitin, propyl-gallát, α-tokoferol, a podobně; a (3) činidla chelatující kovy, jako je kyselina citrónová, kyselina ethylenediamintetraoctová (EDTA), sorbitol, kyselina vinná, kyselina fosforečná a podobně.
Pro terapeutické prostředky podle předkládaného vynálezu zahrnují ty prostředky, které jsou vhodné pro orální, nasální, lokální (včetně bukkálního a sublinguálního), rektální, vaginální a/nebo parenterální podání. Prostředky jsou výhodně ve formě dávkových jednotek a mohou být připraveny jakýmikoliv způsoby známými v oboru farmacie. Množství aktivní složky, které je kombinováno s nosičem pro jednu dávku, závisí na léčeném jedinci a konkrétním způsobu podání. Množství aktivní složky, které je kombinováno s nosičem pro jednu dávku, závisí na množství prostředku, které vede k dosažení terapeutického efektu. Obecně, v rozmezí 100% bude toto množství v rozsahu od přibližně 0,01% do přibližně 99% aktivní složky, výhodně od přibližně 0,1% do přibližně 70%, nejlépe od přibližně 1% do přibližně 30%.
Prostředky podle předkládaného vynálezu, které jsou vhodné pro vaginální podání, také zahrnují pesary, tampony, krémy, gely, pasty, pěny nebo spraye obsahující běžné v oboru používané nosiče. Dávkové formy pro lokální nebo transdermální podání prostředků podle předkládaného vynálezu zahrnují prášky, spraye, masti, pasty, krémy, lotia, gely, roztoky, náplasti a inhalační přípravky. Aktivní složka může být smísena za sterilních podmínek s farmaceuticky přijatelným nosičem a jakýmkoliv konzervačním činidlem, pufrem nebo hnacím plynem, který fuj?
• · ·· ♦·· ··· • · · · · · ··· • ···· · ··· 4 ··· « ·· · · · · · 4 4 4 4 « · · · · · ···· ··· ··*
Výraz parenterální podání a podán parenterálně, jak je zde použit, označuje způsoby podání jiné než enterální a lokální podání, obvykle podání injekcí, a označuje se takto intravenosní, intramuskulární, intraarteriální, intrathekální, intrakapsulární, intraorbitální, intrakardiální, intradermální, intraperitoneální, transtracheální, subkutánní, subkutikulární, intraartikulární, subkapsulární, subarachnoidální, intraspinální, epidurální a intrasternální injekci a infusi.
Příklady vhodných vodných a non-vodných nosičů, které mohou být použity ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou voda, ethanol, polyoly (jako je glycerol, propylenglykol, polyethylenglykol, a podobně), a jejich vhodné směsi, rostlinné oleje, jako je olivový olej, injekční organické estery, jako je ethyloleát. Správná tekutost může být dosažena pomocí použití potahových materiálů, jako je lecitin, dodržením správné velikosti částic v případě disperzí, a použitím surfaktantů.
Tyto prostředky mohou také obsahovat pomocná činidla, jako jsou konzervační činidla, smáčivá činidla, emulgační činidla a disperzní činidla. Prevence přítomnosti mikroorganismů může být zajištěna jak sterilizací, jak byla uvedena výše, tak použitím různých antibakteriálních a antimykotických činidel, například parabenu, chlorbutanolu, kyseliny fenol-sorbové, a podobně. Může být také žádoucí použít činidla upravující izotonicitu, jako jsou sacharidy, chlorid sodný a podobně. Prodloužené absorpce injekčních farmaceutických forem může být dosaženo pomocí činidel zpomalujících absorpci, jako je aluminium-monostearát a želatina.
Když jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu podány • · • ·
jako farmaceutická činidla člověku nebo zvířeti, tak mohou být podány samostatně nebo ve formě farmaceutického prostředku obsahujícího, například, 0,01 až 99,5% (výhodněji, 0,1 až 90%) aktivního činidla v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
Bez ohledu na vybraný způsob podání jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které mohou být použity ve vhodně hydratované formě, a/nebo farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu, formulovány do farmaceuticky přijatelných dávkových forem za použití běžných způsobů známých odborníkům v oboru.
Skutečná množství aktivních složek ve farmaceutických prostředcích podle předkládaného vynálezu může být různé a je takové, aby se dosáhlo dávky aktivní složky, která je dostatečná pro dosažení terapeutické odpovědi pro konkrétního pacienta, prostředek, a způsob podání, bez toxických účinků pro pacienta. Vybraná dávka závisí na různých farmakokinetických faktorech, včetně aktivity konkrétního prostředku podle předkládaného vynálezu nebo jeho esteru, soli nebo amidu, způsobu podání, doby podání, rychlosti vylučování konkrétní použité sloučeniny, trvání léčby, dalších léčiv, sloučenin a/nebo materiálů použitých v kombinaci s použitým prostředkem, věku, pohlaví, stavu a předchozí anamnesy léčeného pacienta, a na podobných faktorech dobře známých v oboru.
Lékař nebo veterinář zkušený v oboru snadno určí a předepíše vhodnou dávku farmaceutického prostředku. Například může lékař nebo veterinář začít s dávkami sloučeniny podle předkládaného vynálezu ve farmaceutickém prostředku, které jsou nižší než dávky nutné pro dosažení požadovaného e · • * · · · · · · ·
4 · · · · · · · · 4 · · • 44 · · · 4444444 »«444 *··**·«’ *·» · ·» · terapeutického efektu a potom může postupně zvyšovat dávku, dokud není dosaženo terapeutického efektu. Obecně, vhodné denní dávky prostředku podle předkládaného vynálezu jsou takové dávky sloučeniny, které jsou nej nižšími dávkami vedoucími k dosažení terapeutického efektu. Takové účinné dávky obvykle závisí na faktorech popsaných výše. Je výhodné, aby bylo podání intravenosní, intramuskulární, intraperitoneální nebo podkožní, a výhodně se provede proximálně k cílovému místu. Pokud je to žádoucí, může být účinná denní dávka terapeutického prostředku podána ve formě dvou, tří, čtyř, pěti, šesti nebo více nižších dávek, které jsou podány samostatně ve vhodných intervalech během dne, volitelně ve formě dávkových jednotek. Ačkoliv je možné, aby byla sloučenina podle předkládaného vynálezu podána samostatně, je výhodné, aby byla podána ve formě farmaceutického prostředku.
Terapeutické prostředky mohou být podány za použití lékařských prostředků známých v oboru. Například, ve výhodném provedení může být terapeutický prostředek podle předkládaného vynálezu podán bezjehlovým přístrojem pro hypodermickou injekci, jako je prostředek popsaný v U.S. Patentech č.
5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880;
4,790,824; nebo 4,596,556. Příklady implantátů a modulů použitelných v předkládaném vynálezu jsou: U.S. Patent č.
4,487,603, který popisuje implantovatelné mikroinfusní pumpy pro podání léčiv řízeným způsobem; U.S. Patent č. 4,486,194, který popisuje terapeutický přístroj pro podání léčiv skrz kůži; U.S. Patent č. 4,447,233, který popisuje infusní pumpu pro podání léčiv přesnou rychlostí infuse; U.S. Patent č.
4,447,224, který popisuje implantovatelný infusní přístroj s variabilní rychlostí infuse pro kontinuální podávání léčiv;
U.S. Patent č. 4,439,196, který popisuje systém pro osmotické a · • · · · · * · · * • · · a· · · · · » · · · » · ··· ·····»· · ···* ”··*’<·’ a · ·♦ * podávání léčiv mající multi-komůrkové kompartmenty; a U.S.
Patent č. 4,475,196, který popisuje systém pro osmotické podání léčiv. Tyto patenty jsou zde uvedeny jako odkazy.
V oboru je známo mnoho dalších takových implantátů, systému pro aplikaci a modulů.
V některých provedeních mohou být lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu připraveny tak, aby byla zajištěna jejich správná distribuce in vivo. Například, hematoencephalická bariéra nepropouští mnoho hydrofilních sloučenin. Pro zajištění toho, aby terapeutické sloučeniny podle předkládaného vynálezu procházely hematoencephalickou bariérou (pokud je to žádoucí), mohou být formulovány například v liposomech. Pro způsoby přípravy liposomů viz např. U.S. Patenty 4,522,811; 5,374,548; a 5,399,331. Liposomy mohou obsahovat jednu nebo více skupin, které jsou selektivně transportovány do specifických buněk nebo orgánů, což může zlepšit cílené podání léků (viz, např., V.V. Ranade (1989) J.
Clin. Pharmacol. 29:685). Příklady skupin určujících specificitu jsou například folát nebo biotin (viz, např., U.S. Patent 5,416,016; Low et al.); mannosidy (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); protilátky (P.O. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180);
surfaktantový protein A receptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), a prostředky podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat různé typy těchto skupin, stejně jako je mohou obsahovat molekuly podle předkládaného vynálezu; pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); viz též K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Left. 346:123; J.J.
Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. V jednom provedení předkládaného vynálezu, jsou terapeutické sloučeniny podle předkládaného vynálezu formulovány v liposomech; ve • · ·· · · · · * ♦ • · · · · · · · · • ft · · · · ··· · ··· • 9 · ··· »······ ftftftftft
·..··..· ·..· : ·..* :
výhodnějším provedení liposomy obsahují skupinu způsobující cílené podání. V nejvýhodnějším provedení jsou terapeutické sloučeniny v liposomech podány bolusovou injekcí do místa proximálně od nádoru nebo od infekce. Prostředek musí být dostatečné tekutý, aby ho bylo možno snadno podat injekcí.
Musí být také stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněn před kontaminujícími účinky mikroorganismů, jako jsou bakterie a houby.
Terapeuticky účinná dávka výhodně inhibuje růst nádorů o alespoň přibližně 20%, výhodněji o alespoň přibližně 40%, ještě výhodněji o alespoň přibližně 60%, a nejvýhodněji o alespoň přibližně 80%, ve srovnání s neléčeným jedincem.
Schopnost sloučeniny inhibovat nádory může být hodnocena na zvířecím modelu určujícím účinnost na lidské nádory.
Alternativně může být tato vlastnost prostředku hodnocena testováním schopnosti sloučeniny inhibovat růst nádorů, kde takové in vitro testy jsou známé odborníkům v oboru.
Terapeuticky účinné množství terapeutické sloučeniny může zmenšovat velikost nádoru nebo může jinak zlepšovat příznaky u jedince. Odborník v oboru bude schopen určit taková množství na základě faktorů jako je velikost jedince, závažnost příznaků u jedince a konkrétní typ prostředku nebo způsobu podání.
Prostředek musí být sterilní a dostatečně tekutý, aby bylo možno podat prostředek injekční stříkačkou. Kromě vody může být nosičem isotonický pufrovaný salinický roztok, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyetheylenglykol, a podobně), a jejich vhodné směsi. Správná tekutost může být dosažena pomocí použití potahů, jako je například lecithin, dodržováním požadované velikosti částic v případě disperzí a použitím surfaktantů. V mnoha případech • 9 ·
• · · ***** je vhodné použít činidlo upravující izotonicitu, jako jsou například sacharidy, polyalkoholy, jako je mannitol nebo sorbitol, a chlorid sodný. Prodloužené absorpce injekčního prostředku může být dosaženo tak, že se v prostředku použijí činidla prodlužující absorpci, například monostearát hlinitý nebo želatina.
Když je aktivní sloučenina vhodně chráněná, například způsobem popsaným výše, může být podána orálně, například v inertním ředidle nebo v jedlém nosiči.
VI. Použití a způsoby podle předkládaného vynálezu
Prostředky (např. lidské monoklonální protilátky k EGFR a jejich deriváty/konjugáty) podle předkládaného vynálezu mají in vitro a in vivo diagnostické a terapeutické použití. Například mohou být tyto molekuly podány buňkám v kultuře, např. in vitro nebo ex vivo, nebo jedinci, např. in vivo, pro léčbu, prevenci nebo diagnostiku různých onemocnění. Jak je zde použit, označuje termín jei^dnec člověka a zvířata jiná člověk. Výhodnými lidksými jedinci jsou pacienti s onemocněním charakterizovaným expresí, typicky aberantní expresí (např. nadměrnou expresí) EGFR. Například mohou být způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu použity pro léčbu jedince s nádorovým onemocněním, například onemocněním charakterizovaným přítomností nádorových buněk exprimujících EGFR, včetně buněk nádorů močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníků, prostaty, spinocelulárních nádorů, nádorů plic (nemalobuněčných karcinomů) a nádorů hlavy a krku. Způsoby a prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro léčbu jiných onemocnění, např. autoimunitních onemocnění, nádorů, psoriasy nebo zánětlivých artritid, například revmatoidní artritidy, artritidy spojené se
I φ φ · φ φ · · φφ φ ·· · • · φ · φ · φ φ « « · φ · φ φ * φ · φ φ φ φ φ φ · φ φ · φ · ♦ φ φ · systémovým lupus erythematodes nebo psoriatické artritidy.
Termín zvíře jiné než člověk podle předkládaného vynálezu označuje všechny obratlovce, například savce a ostatní obratlovce, jako jsou primáti, ovce, psi, krávy, kuřata, t
obojživelníci, plazi a podobně.
Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu mohou být nejprve testovány na vazebnou aktivitu asociovanou s terapeutickým nebo diagnostickým použitím in vitro. Například mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu testovány za použití ELISA a průtokové cytometrie, jak je popsáno v příkladech provedení vynálezu. Dále může být testována aktivita těchto molekul ve spouštění alespoň jedné aktivity efektorové buňky, včetně cytolýzy buněk exprimujících EGFR. Protokoly pro testování fagocytosy zprostředkované efektorovými buňkami jsou popsány dále v příkladech provedení vynálezu.
Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu jsou dále použitelné v terapii a diagnostice onemocnění souvisejících s EGFR. Například, lidské monoklonální protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly mohou být použity in vivo nebo in vitro pro vyvolání jedné nebo více z následujících biologických aktivit: opsonizace buněk exprimujících EGFR; zprostředkování fagocytosy nebo cytolýzy buněk exprimujících EGFR za přítomnosti lidských efektorových buněk; inhibice EGF nebo TGF-α indukované autofosforylace v buňkách exprimujících EGFR; inhibice autokrinní EGF nebo TGF-a-indukované aktivace buněk exprimujících EGFR; nebo inhibice růstu buněk exprimujících EGFR, např. při použití • ♦ • · • · » « · «» ·· 4 4-4 · • 49 949
9 9 4 4 9 9 4 « ····· · · · · · ·
4 4 4 9 4 · ·· ♦ nízkých dávek.
V jiném provedení jsou lidské monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu neschopné indukovat komplementem zprostředkovanou lýzu buněk a proto mají méně nežádoucích účinků způsobených aktivací komplementu, jako je například akné. Primární příčinou akné je porucha keratinizace ve folikulu, který produkuje maz. Jelikož keratinocyty exprimují EGFR, může interference se EGFR signálnímy procesy v kůži alterovat růst a diferenciaci keratinocytů ve folikulech, což vede ke vzniku akné. Přímé imunofluorescenční testy prokázaly, že v časných zánětlivých a nezánětlivých lézích u akné je přítomná aktivace klasické a alternativní komplementové dráhy.
V konkrétním provedení jsou lidské protilátky a jejich deriváty použity in vivo pro léčbu, prevenci nebo diagnostiku různých onemocnění souvisejících s EGFR. Příklady onemocnění souvisejících s EGFR jsou různé nádory, včetně buněk nádorů močového měchýře, prsu, tlustého střeva, ledvin, vaječníku, prostaty, spinocelulárních nádorů, nádorů plic (nemalobuněčných karcinomů) a nádorů hlavy a krku. Mezi další onemocnění související s EGFR patří autoimunitní onemocnění, psoriasa a zánětlivé artritidy.
Způsoby pro podání prostředků (např. lidských protilátek, multispecifických a bispecifických molekul) podle předkládaného vynálezu jsou známé v oboru. Vhodná dávka molekul závisí na věku a hmotnosti jedince, stejně jako na konkrétním použitém léku. Molekuly mohou být navázány na radionuklidy, jako je 1311, 90Y, 105Rh, atd., jak je popsáno v Goldenberg, D.M. et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360, a v EP 0365 997. Prostředky (např., lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného
4» • 4 4 • · ··· »4 4
4 4 4 4
4 4 4 4 4 4
4*44444 4444 «4 vynálezu mohou být navázány také na antiinfekční činidla.
V jiném provedení mohou být lidské anti-EGFR protilátky, nebo jejich antigen-vazebné fragmenty, podány současně s terapeutickým činidle, např. chemoterapeutickým činidlem, nebo mohou být podány současně s jinými známými technikami, např. protinádorové terapie, například s radioterapií. Mezi taková terapeutická činidla patří, například, antineoplastická činidla, jako je doxorubicin (adriamycin), cisplatina, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil, cyklofosfamid, hydroxyurea, které jsou při samostatném podání účinné pouze v dávkách, při kterých jsou toxická nebo subtoxická pro pacienta. Cisplatina se intravenosně podává v dávce 100 mg/m2 jednou za čtyři týdny a adriamycin se intravenosně podává v dávce 60-75 mg/m2 jednou za 21 dnů. Současné podání lidských anti-EGFR protilátek, nebo jejich antigen-vazebných fragmentů, podle předkládaného vynálezu, s chemoterapeutickými činidly, je podáním dvou protinádorových činidel, která působí různými mechanismy majícími cytotoxický efekt na lidské nádorové buňky. Takové současné podání řeší problémy vzniku resistence na léky nebo změny antigenicity nádorových buněk, které mohou způsobit nereaktivitu buněk s protilátkami.
Pro cíl specifické efektorové buňky, např. efektorové buňky navázané na prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu, mohou být také použity jako terapeutická činidla. Efektorovou buňkou může být lidský leukocyt, jako je makrofág, neutrofil nebo monocyt. Mezi další buňky patří eosinofily, přirození zabiječi a jiné buňky nesoucí IgG- nebo IgAreceptor. Pokud je to žádoucí, mohou být efektorové buňky získány od jedince, který je léčen. Pro cíl specifické efektorové buňky mohou být podány jako suspenze buněk ve
·· *
9 9 9
9 999
9 9
9 9 fyziologicky přijatelné roztoku. Počet podaných buněk je
9 999 9 9 9 9 · v rozmezí 108-109, ale liší se podle terapeutického účelu.
Obecně, množství bude dostatečné pro lokalizaci na cílových buňkách, např. nádorových buňkách exprimující EGFR, a pro dosažení účinného zabíjení buněk, např. fagocytosou. Způsoby podání mohou být také různé.
Terapie pro cíl specifickými efektorovými buňkami může být provedena současně s dalšími technikami pro odstranění cílových buněk. Například může být protinádorové terapie za použití prostředků (např.- lidských protilátek, multispecifických a bispecifických molekul) podle předkládaného vynálezu a/nebo efektorových buněk aktivovaných těmito prostředky použita společně s chemoterapií. Kombinovaná imunoterapie může být použita pro nasměrování dvou odlišných cytotoxickýxh efektorových populací na nádorové buňky. Například anti-EGFR protilátky navázané na anti-Fc-gammaRl nebo anti-CD3 mohou být použity společně s IgG- nebo IgAreceptor-specifickými vazebnými činidly.
Bispecifické a multispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro modulování FcaR nebo konctrací Fca na efektorových buňkách, například vazbou na nebo eliminací receptorů na povrchu buněk. Pro tento účel mohou být použity směsi anti-Fc receptorů.
Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu, které byly doplněny vazebnými místy, jako jsou části z IgGl, -2, nebo -3 nebo IgM, které váží komplement, mohou být použity za přítomnosti komplementu. V jednom provedení může být ex vivo ošetření populace buněk obsahující cílové buňky vazebným činidle podle předkládaného vynálezu a vhodnými efektorovými i: .
• 4 4 4 ♦
• * · • 4 ·4* • · · · 4 buňkami doplněno přidáním komplementu nebo séra obsahujícího komplement. Fagocytosa cílových buněk potažených vazebným činidlem podle předkládaného vynálezu může být zlepšena vazbou proteinů komplementu. V jiném provedení mohou být cílové buňky potažené prostředky (např. lidskými protilátkami, multispecifickými a bispecifickými molekulami) podle předkládaného vynálezu také lyžovány komplementem. V ještě jiném provedení neaktivují prostředky podle předkládaného vynálezu komplement.
Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu mohou být podány také s komplementem. V souladu s tím předkládaný vynález zahrnuje prostředky obsahující lidské protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly a sérum nebo komplement. Tyto prostředky jsou výhodné v tom, že komplement je přítomen v těsné blízkosti lidské protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly. Alternativně mohou být lidské protilátky, multispecifické nebo bispecifické molekuly podle předkládaného vynálezu a komplement nebo sérum podány samostatně.
Předkládaný vynález také zahrnuje kity obsahující prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu a návod pro použití. Kit může dále obsahovat alespoň jedno další činidlo, jako je komplement, nebo jednu nebo více dalších lidských protilátek podle předkládaného vynálezu (např. lidské protilátky mající komplementární aktivity, které se váží na epitop EGFR antigenu, který je jiný než pro první lidskou protilátku).
V jiných provedeních může být jedinec dále léčen činidlem, • · • · · ·· ♦· ·· * • · · · · · • · ··# · · ♦ » • · · · · · · 4» · · • · · » · · « • · · # · · · které moduluje, např. zesiluje nebo inhibuje, expresi nebo aktivity Fcy nebo Fca receptorů, například může být jedinec léčen cytokinem. Výhodnými cytokiny pro podání během léčby multispecifickou molekulou je granulocytární koloniestimulující faktor (G-CSF), granulocytární-makrofágové kolonie-stimulující faktor (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) , a tumor nekrosis faktor (TNF).
V jiných provedeních může být jedinec dále léčen lymfokinovým přípravkem. Nádorové buňky, které nemají vysokou expresi EGFR, mohou být k expresi indukovány za použití lymfokinových přípravků. Lymfokinové přípravky mohou způsobit homogenější expresi EGFR v nádorvých buňkách, což může vést k účinnější terapii. Lymfokinové přípravky vhodné pro podání jsou například interferon-gamma, tumor nekrosis faktor, a jejich kombinace. Tyto přípravky mohou být podány intravenosně. Vhodné dávky lymfokinů jsou 10,000 až 1,000,000 j ednotek/pacienta.
Prostředky (např. lidské protilátky, multispecifické a bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro zaměření buněk exprimujících FcyR nebo EGFR, například za účelem značení takových buněk. Pro tento účel může být vazebné činidlo navázáno na molekulu, která může být detekována. Tak vynález poskytuje způsoby pro lokalizaci ex vivo nebo in vitro buněk exprimujících Fc receptory, jako je FcyR, nebo EGFR. Detekovatelným značkovacím činidlem může být například radioizotop, fluorescentní sloučenina, enzym nebo enzymový kofaktor.
V jednom provedení vynález poskytuje způsoby pro detekování přítomnosti EGFR antigenů ve vzorku, nebo pro měření množství EGFR antigenů, kde tyto způsoby zahrnují φφφφ φφφ φφ φ φφφ ♦ · φ φφφ φ φ φφφ φ φφ* φ φφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ * φ φ φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ · φφ · kontaktování vzorku s lidskou monoklonálni protilátkou, nebo jejími antigen-vazebnými částmi, které se specificky váží na EGFR, za podmínek umožňujících tvorbu komplexu mezi protilátkou nebo její částí a EGFR. Potom se detekuje tvorba komplexu a rozdíl ve tvorbě komplexu ve vzorku a v kontrolním vzorku ukazuje na přítomnost EGFR antigenů ve vzorku.
V jiném provedení vynález poskytuje způsob pro detekci přítomnosti nebo kvantifikování množství Fc-exprimujících buněk in vivo nebo in vitro. Způsob zahrnuje (i) podání prostředku (např. multi- nebo bispecifické molekuly) podle předkládaného vynálezu nebo jejího fragmentu, konjugovaného na detekovatelný markér; (ii) exponování jedince na zařízení umožňující detekování uvedeného detekovatelného markéru za účelem identifikace oblastí obsahujících Fc-exprimující buňky.
Předkládaný vynález bude dále ilustrován následujícími příklady, které nijak neomezují rozsah vynálezu. Obsahy všech obrázků a všech odkazů, patentů a publikovaných patentových přihlášek citovaných v předkládaném vynálezu jsou zde uvedeny jako odkazy.
Příklady provedení vynálezu
Materiály a metody
Antigen: Transgenní myší se imunizovaly A431 buněčnou linií lidského epidermoidního karcinomu (CRL-1555, Lot 203945, ATCC Manassas, Virginia) a solubilním receptorem pro epidermální růstový faktor (EGFR) od Sigma Chemical Co (produkt E 3641, šarže 109H4108 a 20K4079). Solubilní EGFR se skladoval při -20 °C až -80 °C do použití.
4
4 4 4 4 4
444 4 444
4444444 4 444
4 4 4 4 4
4· 4 4» ·
4· 44
4 4
4 4 44
4 4 4
Složení medií: (A) DMEM s vysokou koncentrací glukosy (Mediatech Cellgro # 10013) obsahující 10% FBS, PenicillinStreptomycin (Sigma P-7539) a 2-merkaptoethanol (GibcoBRL 21985-023) se použilo pro kultivování A431 buněk a myelomových buněk. Další doplňková media se přidala do hybridomového kultivačního media, které obsahovalo: Origin-Hybridoma Cloning Factor (Igen 21001), OPI doplněk (Sigma 0-5003), HAT nebo HT (Sigma H 0262, H 0137). (B) Bezsérové medium obsahovalo pouze
DMEM, antibiotika a 2- merkaptoethanol.
Buňky pro imunizaci: Buňky pro imunizaci se kultivovaly v DMEM (viz výše) do konfluence v T-75 tkáňových kultivačních nádobách a odebíraly se pomocí přidání Trypsin EDTA (Cellgrow, kat. č. 25-053-C1) roztoku, 5-10 ml na baňku. Buňky získané z baněk se resuspendovaly v 50 ml kompletního media a promyly se třemi cykly odstředění (1000 G) a resuspendovaly se v 50 ml sterilního PBS. Myším se injikovalo lxlO7buněk suspendovaných v 0,5 ml sterilního PBS.
EGFR: Solubilní EGFR se smísil s Ribi adjuvans (Sigma, M 6536) ve sterilním PBS v koncentraci 25 μς EGFR/100 μΐ. Konečné imunizace do ocasní žíly se provedly za použití solubilního EGFR ve sterilním PBS.
Transgenní myši: Myši se chovaly v boxech s filtry a v den infuse se rozhodlo, zda jsou v dobrém stavu. Myši, které produkovaly požadované hybridomy, byly samci stáří 6-8 týdnů genotypu (CMD)++; (HCo7)11952+; (JKD)++; (KCo5)9272+ genotypu (viz tabulka 1).
0« 00 00 0 00 0 • 0 000 000 0 000 0 000 0 000 0 0 0 * 0 0 0000 · 0 0 0000 0 0 0 0 0 0 00 0 •« 00 00 0 00 *
Tabulka 1
Data pro genotyp* | ||||||
Myš | Pohlaví | Narození | Genotyp | |||
20241 | Samec | 21.9.1999 | CMD++ | (Hco7)11952+ | (JKD)++ | (Kco5)9272 |
20242 | Samec | 21.9.1999 | CMD++ | (Hco7)11952+ | (JKD)++ | (Kco5)9272 |
20243 | Samec | 21.9.1999 | CMD++ | (Hco7)11952+ | (JKD)++ | (Kco5)9272 |
* Označení jednotlivých transgenu jsou v závorkách a potom následuje řada čísel pro náhodně integrované transgeny.
Symboly ++ a + ukazují homozygoty nebo hemozygoty; nicméně, protože jsou myši rutinně testovány za použití PCR testů, které neumožňují odlišení mezi heterozygotností a homozygotnostní pro náhodně integrované lidské Ig transgeny, je označení + uvedeno u myší, které jsou skutečně homozygotní pro tyto elementy.
Protilátky: Následující anti-EGFR MAb se použily in vitro a in vivo: 2F8 (též označovaná jako Humax-EGFR), lidská IgGl anti-EGFR protilátka (Genmab, Utrecht, The Netherlands); hybridom produkující m225, myší IgG2a anti-EGFR protilátku, se získal od American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, HB8508); irelevantní lidská IgG izotypová kontrola (Genmab), která se použila jako irelevantní IgGl protilátka; a F(ab')2 fragment kozího anti-myšího IgG (H+L) konjugovaný na fluorescein-isothiokyanatan (FITC) se použil jako sekundární protilátka pro nepřímou imunofluorescenci (Protos, San Francisco, CA), FITC-konjugovaný F(ab')2 králičí-a-lidský IgG (DAKO, Glostrup, Denmark).
2F8 hybridom se kultivoval v DMEM (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Scotland) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS) (Hyclone, Logan, Utah) a 1,00 U/ml
99 • 99 *
9999 9
9 9 9 9 9
9 9 9 9 • 9 9 9
9 9 9 9
9999 « 9
9 9
9 9 9
9 9999
9 9 9
9· ♦ penicilinu a 100 U/ml streptomycinu (oba Gibco BRL) (pen/strep). m225 hybridom se kultivoval v RPMI1640 (Gibco BRL) doplněném 15% FBS (Hyclone) a pen/strep (oba Gibco BRL). Všechny buněčné linie se uchovávaly při 37°C ve zvlhčované atmosféře obsahující 5% oxid uhličitý. Humax protilátky se přečistily za použití protein-A afinitní chromatografie, po které se provedlo vylučování podle velikosti na HR200 koloně (Pharmacia, New Jersey). Myší protilátky se přečistily za použití protein-G chromatografie, po které se provedlo vylučování podle velikosti na HR200 koloně. Čistota všech protilátke byla >95%, jak se určilo elektroforesou na dodecyl sulfát-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). F(ab') fragmenty se připravily trávením pepsinem nebo β-merkaptoethanolem a potom protein-A/G přečištěním. Izolované E(ab') fragmenty měly více než 95% čistotu podle SDS-PAGE.
Buněčné linie: A431, epidermoidní karcinom, který nadměrně exprimuje EGFR, se získala z ATCC (Rockville, MD, CRL-155). Buňky se kultivovaly v RPMI 1640 mediu (Gibco BRL), doplněném 10% teplem inaktivovaným FBS (Hyclone), 50 gg/ml streptomycinu, 50 IU/ml penicilinu a 4 mM L-glutaminu (vše Gibco BRL).
Protože buňky rostly adherentně, uvolnily se pomocí trypsinEDTA v PBS (Life Technologies, Paisley, Scotland).
V nádorových modelech jsou buňky vždy použity v log fázi. Před každým pokusem se buňky testovaly na stabilní expresi EGFR a na kontaminaci mykoplasmaty.
Postup pro fúzi: Z utracených myší se asepticky odebraly sleziny a umístily se do 20-30 ml chladného bezsérového media (SFM) v Petriho misce. Odstranila se okolní tkáň a sleziny se dvakrát propláchly v SFM. Buňky sleziny se opatrně odebraly homogenizací ve tkáňovém mlýnku v SFM.
99 ··
9 9 9
9 99« 9
9 9 9 9 9 • 9 9 9 ·9 9
9 • 99 ·· ·
9
9 9
9· 9
Buňky se odstředily při 1000 g během 10 minut a erytrocyty v buněčné peletě se lyžovaly suspendováním pelety buněk sleziny v 5 ml ledově chladného 0,17 M NH4CI po dobu 2-5 minut. Směs buněk se potom naředila 20 ml SFM a odstředila se při 1000 g během 10 minut. Myelomové buňky se odebraly do 50 ml centrifugačních zkumavek. Buňky sleziny a myelomové buňky se potom promyly třemi cykly odstředění při 1000 g a resuspendovaly se v 30-40 ml SFM.
Po spočítání buněk se slezinné a myelomové buňky smísily v poměru 1:1 až 4:1. Směs buněk sleziny/myelomových buněk se peletovala odstředěním a supernatant se odstranil aspirací. Fúze se provedla přidáním 1-2 ml PEG roztoku (Sigma # P-7181), po kapkách, k buněčné peletě během 45 sekund, a opatrným míšením roztoku po dobu 75 sekund. PEG se pomalu naředil přidáním 2 ml SFM po kapkách během jedné minuty. Toto se opakovalo s dalšími 2 ml SFM a potom se roztok nechal odstát 1 minutu.
Roztok se potom pomalu naředil dalšími 30 ml SFM během 90 sekund. Buňky se odstředily při 1000 g během 10 minut a resuspendovaly se v 30 ml HAT media. Fúzní směs se naředila do 200-300 ml HAT doplněného media obsahujícího 3% Origin Hybridoma Cloning Factor, a dispergovala se do 96-jamkových ploten v dávce >200 μΙ/jamku (10-15 ploten/slezinu). Hybridomové plotny se testovaly za dobu 3-7 dnů na hybridomy. Plotny se doplnily v den 7 nahrazením poloviny media v každé jamce čerstvím HT mediem doplněným 3% Origin. Plotny se potom každé 3-4 dny doplňovaly HT Mediem.
ELISA činidla:
1. Fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS), D-PBS bez Ca a Mg, Hyclone D-PBS #SH30013.03, nebo Sigma P 3813.
♦ · 4 ·· • · · • · · ·· • · · · · • 4 4 4 • · · · • 44
4 4 4
44444
4 4 • · 4 ·
• 4 4
4 4 4
4 444
4 4
4
2. PBS-T (promývací pufr), PBS obsahující 0,05% Tween 20, Sigma P-1379.
3. PBS-T plus 1% BSA (Sigma A 9647). Slouží jako blokovací pufr a vzorkový pufr.
4. ELISA plotny, Nunc Imuno-plate F96 Maxisorp 442404.
5. Protilátka specifická pro lidský IgG γ-řetězec, Jackson ImunoRresearch #109-006-098.
6. Alkalickou fosfatasou značené kozí IgG specifické pro lidský γ-řetězec IgG, Jackson Imuno Research #109-056-098.
Alternativně je možno použít alkalickou fosfatasou značený anti-lidský k, Sigma A 3813.
7. Alkalickou fosfatasou značený anti-lidský IgGl, nebo IgG3, Southern Biotechnology # 9050-04 & 9210-04, pro použití v izotypově specifické ELISA.
8. p-nitrofenyl (pNPP),Sigma N2765, nebo Sigma Fast tablet kit N-2770.
9. pNPP substrát a pufr - dvě možnosti:
A. Diethanolaminový pufr: Směs 97 ml diethanolaminu, Sigma 0-2286, plus 0,1 g MgCl2.6H20 a 800 ml Di vody. pH upraveno na 9,8 a konečný objem 1,0 1 pomocí Di vody. Přidá se jedna 20 mg tableta pNPP, Sigma N-2765, na 20 ml diethanolaminového pufru.
B. Sigma Fast pNPP Tablet Set, Sigma N-2770: Rozpustí se 1 tableta pufru a 1 tableta pNPP ve 20 ml H20.
10. ELISA čtečka ploten s 405 nm filtrem.
11. Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR), Sigma E 3641, Biotinem značený EGF (EGF-B), Molecular Probes E-3477.
12. Biotinem značená anti EGFR MAb nebo lidská protilátka.
13. Nespecifické lidské protilátky pro negativní kontroly, nebo přečištěný lidský IgGl k, Sigma 1-13889.
14. Automatizované promývací zařízení pro ELISA plotny: Titertek MAP C.
Anti-lidský IgG κ ELISA: Pro testování hybridomových ploten na • 9 9 • 9 4 4 4 4 • ··· 4 444 • 4 ···· 44 4··· • 4 4 4 4 4
4 49 4 produkci lidských IgG, κ Mab se ELISA plotny potáhly 1 pg/ml protilátky specifické pro lidský IgG γ-řetězec, Jackson ImunoResesarch #109-006-098, přes noc nebo déle, při 4 °C.
Plotny se promyly v promývacím zařízení a přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T plus 1% BSA. Plotny se inkubovaiy alespoň 15 minut a 10-50 μΐ supernatantu buněčné kultury se přidalo do jamek ELISA plotny, kdy několik jamek v plotně obsahovalo IgG jako pozitivní kontrolu a buněčné kultivační medium jako negativní kontrolu. Plotny se inkubovaiy 1-2 hodiny při těplotě místnosti, promyly se a přidala se alkalickou fosfatasou značená protilátka proti lidskému κ (Sigma A-3813) v ředění 1:5000 v PBS-T plus 1% BSA. Plotny se inkubovaiy po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, promyly se 4-krát ve vymývacím zařízení a přidal se pNPP substrát. Plotny se inkubovaiy 10-60 minut a absorbance se odečítala při 405 nm na ELISA čtečce ploten.
ELISA postup pro testování specificity anti-EGFR lidských protilátek - přímá vazba protilátky na ELISA plotny potažené EGFR: Pro ověření toho, že se anti-EGFR protilátky specificky váží na EGFR, se Nunc Maxisorp plotny potáhly 100 μΙ/jamku EGFR v koncentraci 0,4 pg/ml v PBS přes noc při 4°C nebo během 2 h při teplotě místnosti. Plotny se promyly 3-krát v PBS-T, 100 μΙ/jamku PBS-T plus 1% BSA se přidalo pro blokování nespecifických míst na plastovém povrchu a před vnesemím vzorku se provedla inkubace po dobu alěspoň 15 minut. Ředění testovaného vzorku se provedla v PBS-T plus 1% BSA.
Supernatanty se naředily pro přidání do ELISA ploten minimálně 1:3 v PBS-T + 1% BSA. Vzorky a standardy se přidaly v koncentraci 100 μΐ na jamku, provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a plotny se promyly 3-krát v PBST. Přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T 1% BSA obsahujícího alkalickou ·· * · • · • · « · · • · · * • · ·
fosfatasou značené kozí protilátky specifické pro lidský γ v ředění 1:3000 až 1:5000. Alternativně se mohlo použít alkalickou fosfatasou značeného anti-lidského κ. Plotny se inkubovaly 1 hodinu při teplotě místnosti, promyly se 4-krát a přidal se pNPP substrát. Absorbance se odečítala při 405 nm.
ELISA postup pro testování specificity anti-EGFR lidských protilátek - ELISA EGF/EGFR blokovací test: Pro ověření toho, že se anti-EGFR protilátky váží na EGFR a dále blokují vazbu biotinem značeného epidermálního růstového faktoru na receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) se Nunc Maxisorp plotny potáhly 100 μΙ/jamku EGFR v koncentraci 0,4 pg/ml v PBS přes noc při 4°C nebo během 2 h při teplotě místnosti. Plotny se 3krát promyly v PBS-T, přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T plus 1% BSA pro blokování nespecifických míst na plastovém povrchu a před vnesením vzorku se provedla inkubace po dobu alespoň 15 minut. Ředění testovaného vzorku se provedla v PBS-T plus 1% BSA. Supernatanty se naředily pro přidání do ELISA ploten minimálně 1:3 v PBS-T + 1% BSA. Vzorky a standardy se přidaly v koncentraci 100 μΐ na jamku, provedla se inkubace po dobu 30 minut při teplotě místnosti, přidalo se 20 μΙ/jamku biotinem značeného EGF v koncentraci 0,5 μg/ml a plotny se inkubovaly po dobu 1 hodiny (toto se přidalo k roztoku vzorku, který byl již přítomen na plotně. Alternativně se vzorky inkubovaly po dobu 1 hodiny, promyly se, přidalo se 100 μί/jamku EGF-biotinu v koncentraci 0,1 pg/ml a provedla se inkubace pod obu 1 hodiny. Plotny se promyly 3-krát, přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T 1% BSA obsahujícího streptavidin-alkalickou fosfatasu v ředění 1:2000 a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny. Plotny se 4-krát promyly, přidal se pNPP substrát a absorbance se odečetla při 405 nm.
44 ·· • « 4 4 4 • 4999 » ·
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4
4 4 44 β
4 4
4 4 4
4 44444
4 4 4
44 4
Kompetitivní ELISA pro stanovení epitopové specificity antiEGFR lidských protilátek - Kompetice s komerčními myšími MAb 225, 528, AB5 a 29.1:
Tento test se provedl pro stanovení toho, které Mab jsou nejpodobnější protilátkám 225, 528, ABS a 29.1. MAb 225, 528, a ABS blokují EGF vazbu na receptor a inhibují in-vivo aktivitu endogenní tyrosin-kinasy EGFR. MAb 29.1 je neblokovací Mab, která se váže na sacharidový zbytek EGFR. Plotny se potáhly během alespoň 2 hodin při teplotě místnosti, nebo přes noc při 4°C, 0,4 pg/ml EGFR v PBS, promyly se a blokovaly se 100 μί/jamku PBS-T 1% BSA. Blokovací roztok se odstranil a přidalo se 100 μΙ/jamku PBS-T-1% BSA do kolon 1-6 na levé straně plotny, a do kolon 7-12 na pravé straně plotny se přidala neznačená myší MAb v koncentraci 1 μρ/πιΐ (100 μΙ/jamku). Plotny se inkubovaly při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a 25 μί supernatantu buněčné kultury se přidalo do ekvivalentních pozic každé poloviny plotny tak, že každý supernatant se přidal do jedné jamky s PBS-T-1% BSA a jedné jamky s myší MAb. Plotny se inkubovaly 1 hodinu, promyly se a přidala se alkalickou fosfatasou značená protilátka proti lidskému IgG Fc. Plotny se inkubovaly po dobu jedné hodiny. Plotny se promyly a přidal se substrát. Absorbance se odečítala při 405 nm. % kompetice MAb se vypočetlo podle následujícího vzorce: (OD supernatantu bez kompetice - OD supernatantu MAb kompeticí/OD supernatantu bez kompetice) x 100.
Kompetitivní ELISA pro stanovení epitopové specificity antiEGFR lidských protilátek - Kompetitivní ELISA s lidskými protilátkami značenými biotinem: Kompetitivní ELISA testy se provedly také pro stanovení specificity anti-EGFR lidských protilátek. Plotny se potáhly během alespoň 2 hodin při • ft · · · · • ··· · ·· · • · ft ft··· · · · ···· • · · · ft · •ft · ·· ft
EGFR v PBS.
1% BSA. 50 ·· ·· • · · • · ··· • · · · • · · · • ft ·· teplotě místnosti, nebo přes noc při 4°C, 0,4 gg/ml Plotny se promyly a blokovaly se 100 μΙ/jamku PBS-T μΐ (10-30 μΙ/ml) neznačené lidské protilátky nebo myší MAb se přidalo do první jamky každého sloupce plotny 50 μΐ se postupně přeneslo a sériově ředilo v jamkách každého sloupce plotny za vzniku trojnásobných sériových ředění každé protilátky. 50 μΐ se po smísení odstranilo z dolní jamky. Plotny se inkubovály po dobu 1 hodiny a do ploten se přidalo 20 μΐ/jamku biotinylované anti-EGFR lidské protilátky nebo neznačené myší anti-lidský EGFR protilátky tak, že konečná koncentrace kompetující protilátky byla přibližně 0,1-0,2 pg/ml. Plotny se inkubovály po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, promyly se a přidalo se 100 μΙ/jamku streptavidinu-alkalické fosfatasy (1:2000 v PBS-T-BSA) nebo alkalickou fosfatasou značené kozí anti-myší IgG protilátky. Plotny se inkubovály 1 hodinu, promyly se a přidal se substrát. Absorbance se odečítala při 405 nm.
FACS postuppojr testování specificity anti-EGFR lidských protilátek - EGF/EGFR blokování: Tento test se použil pro ověření toho, že anti-EGFR protilátky se váží na EGFR na povrchu buněk; a že touto vazbou se blokuje vazba značeného epidermálního růstového faktoru (EGF-B) na receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR). Tato metoda na bázi FACS využívá lidské buněčné linie epidermálního karcinomu A431, která exprimuje přibližně 106 EGFR molekul/buňku.
Materiály pro EGFR FACS testy:
1. A431 buňky (ATCC CRL 1555) konfluentní v jedné nebo více T175 baňkách. A431 buňky se kultivovaly v DMEM plus 10% FCS.
2. Trypsin-EDTA roztok, Sigma T-3924.
3. Biotinem značený EGF. Zásobní roztok přibližně 5 μg/ml, • ·
100 použije se 10 μΙ/jamku.
4. 96-jamkové plotny s kulatým dnem.
5. PBS, sterilní.
6. PBS plus 1% BSA plus 0,02 % azid sodný (FACS pufr).
7. PE-značený streptavidin, Sigma S 3402. Ředění 1:20 ve FACS pufru.
8. PE-značený nebo FITC-značený anti-lidský IgG, FC γ specifický, Pharminigen 34164X, 34165X.
9. Nízkorychlostní odstředivka se swinging buckets a adaptérem pro 96-jamkové plotny (Beckman).
10. FACS
11. BD FACS zkumavky.
Postup: A431 buňky se získají ošetřením trypsinem-EDTA. Medium ze tkáňových kultivačních nádob se odstraní a baňky se krátce promyjí 10-20 ml sterilního PBS nebo HBSS. Přidá se 5-10 ml trypsinu-EDTA a baňky se vrátí do inkubátoru na dobu několika minut. Když se buňky začnou odlučovat od plastového povrchu, tak se 10 ml pipeta použije pro odloučení buněk od plastového povrchu a pro přípravu suspenze obsahující jednotlivé buňky s mnoha shluky buněk. Buňky se přenesly do 50 ml zkumavky s 20-30 ml buněčného kultivačního media (s FBS), provedlo se odstředění během 10 minut při 1000 g a promytí dvojím odstředěním a resuspendováním buněk ve FACS pufru. Roztok buněk se přefiltroval skrz nylonové síto pro odstranění shluků buněk (horní konec BD FACS zkumavek je určen pro tento účel). Buňky se spočítaly a objem se upravil tak, aby bylo dosaženo koncentrace mezi 1 a 5 x 106 buněk na ml. Buňky se přenesly do 96-jamkové plotny s kulatým dnem v koncentraci přibližně 200,000 buněk/jamku a provedlo se odstředění po dobu 1 minuty při 1000 g a potom se odsála tekutina (buňky zůstaly na dně jamky) . Plotny se ponechaly na ledu nebo při 4°C. V samostatné 96-jamkové plotně se připravily ředění protilátky ve FACS
101 • · « · ·
pufru a získaly se trojnásobná ředění protilátky od 10 μΙ/ml a do 4,5 ng/ml. 100 μΐ každého ředění protilátky, izotypových kontrol a kontrol tvořených pufrem se přidalo do plotny se kulatým dnem. Vzorky protilátky a kontroly se smísily s buňkami a provedla se inkubace po dobu 30 minut na ledu. 10 μΐ biotinem značeného EGF se přidalo k roztoku buněk a protilátky a provedla se inkubace po dobu dalších 30 minut.Buňky se promyly třikrát odstředěním a resuspendováním ve FACS pufru. Přidalo se 50 μΐ/jamku streptavadinu PE, směs se promísila a inkubovala se po dobu 30 minut na ledu. Buňky se 3-krát promyly a resuspendovaly se v 50 μΐ FACS pufru. Obsah každé jamky se přenesl do zkumavky obsahující 300-400 μΐ FACS pufru. 5000-10000 buněk se analyzovalo v každém vzorku FACS v FL-2 kanálu. MCF versus koncentrace protilátky se zanesla do grafu.
Lidské nebo zvířecí materiály: A431 Lidská buněčná linie epidermoidního karcinomu (CRL-1555, šarže 203945, ATCC Manassas, Virginia). Trypsin EDTA (Cellgrow Cat # 25-053-C1). P3 X63 ag8.653 myelomová buněčná linie: ATCC CRL 1580, šarže F-15183 Origin-Hybridoma Cloning Factor (Igen 21001). OPI doplněk (Sigma 0-5003). Fetální hovězí sérum (SH3 0071 šarže #s ALE 10321, a AGH6 843) od Hyclone, Logan, Utah. Origen Freeze Medium (Igen, # 210002).
ELISA: Pro stanovení vazby lidských protilátek na EGFR se použilo ELISA testu s EGFR (Sigma, St Louis, M) potaženým přes noc v koncentraci 1 μg/ml v PBS na 96-jamkové mikrotitrační plotny (Greiner, Frickenhausen, Germany). Po blokování plotny ELISA pufrem (PBS/0,05% Tween 20 a 1% kuřecí sérum (Gibco BRL)) v koncentraci 100 μΙ/jamku se přidaly monoklonální protilátky naředěné v ELISA pufru a provedla se inkubapo dobu • ·
102 ·« · ·· ·
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999999 99999
9 99 hodiny při 37 °C. Plotny se potom promyly 3-krát a provedla se inkubace s peroxidasou značenou kozí protilátkou proti lidskému IgG Fc (Jackson, West Grace, P) po 1 hodiny při 37°C. est se vyvíjel za použití ABTS (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) po dobu 30 minut. Absorbance se měřila za použití čtečky mikroploten (Biotek, Winooski, Canada) při 415 nm. Pro blokovací testy se plotny preinkubovaly po dobu 10 minut s 50 μΐ blokovacího činidla v ELISA pufru před tím, než se přidalo 50 μΐ plně lidské protilátky. Pro stanovení lidského IgG v myší séru se ELISA plotny potáhly králičí protilátkou proti lidského kappa lehkému řetězci (DAKO) přes noc v PBS v 96jamkové mikrotitrační plotně (Greiner). Po blokování plotny ELISA pufrem (PBS/0,05% Tween 20 a 1% kuřecí sérum) 100 μΐ/jamku se přidalo myší sérum naředěné v ELISA pufru a provedla se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Plotny se potom promyly 3-krát a inkubovaly se s peroxidasou značenými králičími F(ab')2 fragmenty proti lidskému IgG (DAKO) po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Test se vyvíjel za použití ABTS (Roche) po dobu 30 minut. Absorbance se měřila za použití čtečky mikroploten (Biotek) při 415 nm.
Průtoková cytometrie: Nádorové buňky nadměrně exprimující EGFR se inkubovaly s MAb po dobu 30 minut při 4°C. Buňky se promyly 3-krát ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku doplněném 1% hovězím sérovým albuminem (Roche) a 0,01% azidem. Kontrastní barvení se provedlo FITC-konjugovanými F(ab')2 fragmenty kozí anti-myší protilátky nebo FITC-konjugovanými F(ab')2 fragmenty králičí anti-lidské IgG protilátky. Pro inhibiční pokusy se buňky preinkubovaly s EGF nebo TGF-α po dobu 10 minut při 4°C. Všechny vzorky se analyzovaly na FACScan průtokovém cytometru (Becton-Dickinson, San Jose, CA).
Fosforylační pokusy: Sub-konfluentní kultury A431 buněk ve 24• · v · • 4 4 · · 4 4 4 4 · 4 4 4
AQ · · · 4 4 4 4 4444 4 4 4444
I UJ «444 44 4 4 4 « •· ·· 44 « 44 · jamkových plotnách (NUNC, Kamstrup, Denmark) se přes noc vystavily působení nízkých koncetrací séra (0,5%). Do jamek se přidaly různá ředění protilátek a provedla se inkubace po dobu 30 minut při 37°C a 5% oxidu uhličitém. Buňky se stimulovaly s nebo bez 5 ng/ml EGF (Prepotech, Rocky Hill, NJ) po dobu 5 minut při 37°C a 5% oxidu uhličitém. Buněčné extrakty se připravily způsobem popsaným v Tomic et al. (Tomic et al,
1995) za použití 100 μΐ lyzačního pufru na jamku. 50 μΐ extraktu A431 buněk se analyzovalo natrium-SDS-PAGE a imunohybridizací s anti-fosfo-tyrosinovými protilátkami (PY20, Transduction Laboratories, Kentucky), kozími protilátkami proti myšímu IgG-HRP (Transduction Laboratories), a ECL detekcí. Pro stimulaci s TGF-α (Prepotech, Rocky Hill, NJ) se sub-konfluentní kultury A4 31 buněk ve 24 jamkových plotnách (Nunc) zpracovaly přes noc nízkosérovým mediem (0,5%).
Protilátky se přidaly ve fixní dávce 10 nebo 0 μς/ml a provedla inkubace způsobem popsaným výše. Buňky se stimulovaly stoupajícím množstvím TGF-α. Buňky se zpracovaly způsobem popsaným výše.
Inhibice růstu buněk in vitro: Inhibice růstu buněk plně lidskými protilátkami se hodnotila za použití neradioaktivního inhibičního test. Stručně, 100 μΐ 2 x 104/ml A431 buněk se přidalo do tkáňových kultivačních ploten s plochým dnem a plotny se umístily do inkubátoru pro buněčné kultury. Po 2 hodinách se přidalo 100 μΐ ředění protilátek a plotny se vrátily do inkubátoru pro buněčné kultury. Buňky se inkubovaly po dobu 6-7 dnů, odebraly se supernatanty a do každé jamky se přidalo 100 μΐ 0,25% glutaraldehydu v PBS. Po inkubaci po dobu 45 minut při teplotě místnosti se jamky promyly 2-krát demivodou. Přidalo se 50 μΐ 1% krystalické violeti v demi-vodě a provedla se inkubace po dobu 15 minut při teplotě místnosti.
·· ♦ • ·
I · · ♦ · • · · ·
104 • ··*· · · • · *
Po dvojím promytí ploten demi-vodou se plotny vyvíjely za použití 100% methanolu během 30 minut na třepačce ploten. Absorbance se měřila za použití čtečky mikroploten a 550 nm filtru s 650 nm referenčním filtrem. Inhibice se měřila třikrát. Procento relativní proliferace buněk se stanovila dělením průměrné absorbance z trojího stanovení pro konkrétní koncentraci protilátky průměrnou absorbanci z jamek, do kterých nebyla přidána žádná protilátka, a potom vynásobením 100.
Izolace efektorových buněk: Leukocyty periferní krve se izolovaly způsobem vycházejícím ze způsobu popsaného v Repp, et al. (1991) Blood 78: 885-889. Stručně, heparinemantikoagulovaná krev se převrstvila přes ficoll gradient. Po odstředění se efektorové buňky odebraly z interfáze a zbývající erytrocyty se odstranily hypotonickou lýzou. Cytospinové přípravky se použily pro hodnocení čistoty izolovaných buněk, která byla vyšší než 95%. Životaschopnost buněk, určená podle vylučování trypanové modři, byla vyšší než 95%.
ADCC testy: Kapacita plně lidských protilátek lyžovat nádorové buňky se hodnotila v testu uvolňování 51Chromu (Valerius, et al. (1993) Blood, 82: 931-939). Izolované lidské leukocyty se použily jako zdroj efektorových buněk. Stručně, nádorové cíle se inkubovaly s 100 pCi 51Cr po dobu 2 hodin. Po trojím promytí kultury mediem se 5xl03 cílových buněk přidalo do tkáňových kultivačních ploten s kulatým dnem obsahujících 50 μΐ izolovaných efektorových buněk a senzibilizující Mab v různých koncentracích a naředěné v kultivačním mediu. Konečný objem byl 200 μΐ a poměr efektorových a cílových buněk (E:T) 80:1. Plotny se inkubovaly přes noc při 37°C a na závěr se provedlo odstředění. Uvolněný chrom se stanovil v supernatantech
105 ♦ ΦΦ φφφ φφφ φ φφφφ φ φφφ φφφφ « φ φ φφφ · φφφφ φ · φ φφφ «φφφ φφφ · φ φ φφ φφ «φ φ φφ · trojmo. Procento buněčné cytotoxity se vypočetlo za použití vzorce:
Pokusné cpm - spontánní cpm %specifické lýzy =-------------------------------x 100 maximální cpm - spontánní cpm kde maximální uvolnění 51Cr se určilo přidáním ZAP-oglobinu® (10% konečná konctrace) k cílovým buňkám a spontánní cpm se určilo měřením za absence sensitizující protilátky a efektorových buněk. Při těchto podmínkách byla pozorována pouze velmi slabá protilátkami zprostředkovaná, nebuněčná cytotoxicita (nezpůsobená efektorovými buňkami) (< 5% specifické lýzy).
Měření afinity za použití SPR technologie: Vazebná afinita anti-EGFR protilátek se určila za použití BIAcore 300 (Biacore, Upsula, Sweden). EGFR přečištěný z A431 buněk zakoupený od Sigma se imobilizoval na CM5 čipu podle návodu výrobce. Měření se provedla s protilátkovými F(ab') fragmenty v různých koncentracích. Asociační a disociační konstanty se stanovily za použití BIA evaluation softwaru (verze 3.1).
Myší a nádorové modely: Holé Balb/c myši (NuNu) se zakoupily od Harlan (Horst, The Netherlands). Všechny popsané pokusy se provedly se samicemi myší stáří 8-12 týdnů. Myši se chovaly v Transgenic Mouše Facility v Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, The Netherlands) a pokusy byly schváleny etickou komisí Utrecht University. Když byly zařazeny do pokusu, tak se myši třikrát týdně kontrolovaly na známky toxicity a diskomfortu, včetně aktivity, kožních abnormalit, průjmu a celkového vzhledu. Použily se rozvinuté podkožní (s.c.) nádorové modely. Stručně, A431 buňky vysoce exprimující EGFR se naočkovaly, na pravém boku myší, v dávce 3xl06 buněk. Nádory rostly rovnoměrně a mohly být snadno měřeny Vernierovými
AAA AAA AAA
A AAAA A AAA A AAA • AA AAA AAAAAAA AAA·
106 \.··..· ·· A AA A kalipery. Objem nádorů se udával jako délka x šířka x výška (v mm3). Monoklonální protilátky se injikovaly intraperitoneálně (i.p.) podle protokolu pokusu. Nádorové buňky se testovaly na stabiní expresi EGFR po in vivo pasáži průtokovou cytometrií a imunohistochemicky. Pro stanovení farmakokinetiky se myším s a bez nádorů injekčně i.p. aplikovala 2F8 protilátka. Šest týdnů před a šest týdnů po injekci se jednou týdně odebíraly vzorky krve z ocasní žíly. Vzorky se analyzovaly ELISA s lidským IgG.
Statistická analýza: Data pro skupiny jsou uvedena jako průměr + standardní odchylka od průměru (SEM). Rozdíly mezi skupinami se analyzovaly nepárovými (nebo - když to bylo vhodné párovými) Student's t-testy. Jsou uvedeny hladiny statistické významnosti. Významnou byla akceptována při p<0,05.
Příklad 1: Příprava Cmu cílených myší pro produkci anti-EGFR lidských protilátek, též označovaných jakoHuMAb
Konstrukce CMD cíleného vektoru
Plasmid pICEmu obsahuje EcoRI/Xhol fragment lokusu pro těžký řetězec myšího Ig, který zahrnuje mugen, a který byl získán z Balb/C genomové lambda fágové knihovny (Marcu et al.
Cell 22: 187, 1980). Tento genomový fragment se subklonoval do Xhol/EcoRI míst plasmidu pICEMl9H (Marsh et al; Gene 32, 481485, 1984) . Sekvence pro těžký řetězec obsažená v pICEmu je umístěna od EcoRI místa umístěného těsně 3' k mu intronovému zesilovači, do Xhol místa umístěného přibližně 1 kb za posledním transmembránovým exonem mu genu; velká část přesmykového repetítivního regionu byla deletována pasáží v E. coli. Cílící vektor byl konstruován následujícím způsobem. 1,3 kb HindlII/Smal fragment se excidoval z pICEmu a subklonoval se do HindlII/Smal tráveného pBluescript (Stratagene, La •· · ·· · • · · · · · • « · · · · · · • ······· · ··· • » · · · · «· · «· ·
107
Jolla, CA). Tento pICEmu fragment je v rozsahu od HindlII místa umístěného přibližně 1 kb 5' k Cmul do Smál místa umístěného v Cmul. Vzniklý plasmid se trávil Smal/Spel a insertoval se přibližně 4 kb Smal/Xbal fragment z pICEmu, který měl rozsah od Smál místa v Cmul 3' do Xbal místa umístěného těsně za posledním Cmu exonem. Vzniklý plasmid, pTARl, se linearizovam v Smál místě a insertovala se neo expresní kazeta. Tato kazeta se skládá z neo genu pod transkripční kontrolou promotoru myšího genu pro fosfoglycerát-kinasu (pgk) (Xbal/Taql fragment; Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74) a obsahuje pgk polyadenylační místo (PvuII/HindlII fragment; Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308). Tato kazeta se získala z plasmidu pKil (jak je popsán v Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163), ze kterého se neo kazeta excidovala jako EcoRI/HindlII fragment a subklonovala se do EcoRI/HindlII tráveného pGEM-7Zf (+) za zisku pGEM-7 (KJl). Neo kazeta se excidovala z pGEM-7 (KJl) trávením EcoRI/SalI, tupě se zakončila a subklonovala se do Smál místa plasmidu pTARl, v opačné orientaci vzhledem ke genomové Cmu sekvenci. Vzniklý plasmid se linearizoval Notl a insertovala se thymidin-kinasová (tk) kazeta herpes simplex viru, aby se umožnilo obohacení ES klonů nesoucích homologní rekombinanty, jak je popsáno v Mansour et al. (1988) Nátuře 336: 348-352. Tato kazeta se skládá z kódující sekvence tk genu a myšího pgk promotoru a polyadenylačního místa, jak je popsáno v Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163.
Výsledný CMD zaměřovači vektor obsahuje celkem přibližně 5,3 kb homologie s lokusem pro těžký řetězec a je navržen tak, aby generoval mutantní mu gen, do kterého byla vložena neo expresní kazeta v jedinečném Smál místě prvního Cmu exonu. Cílící vektor se před elektroporací do ES buněk linearizoval Pvul, který štěpí vektor v plasmidových sekvencích.
• ·
108
Příprava a analyzování cílených ES buněk
AB-1 ES buňky (McMahon, A. P. a Bradley, A., (1990) Cell
62:1073-1085) se kultivovaly na mitoticky inaktivní vrstvě podpůrných SNL76/7 buněk (ibid.), za použití popsané techniky (Robertson, E. J. (1987), v Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.)
Oxford: IRL Press str. 71-112). Linearizovaný CMD zaměřovači vektor se elektroporoval do AB-1 buněk způsobem popsaným v Hasty et al. (Hasty, P. R. et al. (1991) Nátuře 350: 243-246). Elektroporované buňky se umístily na 100 mm disky v hustotě 12xl06 buněk/disk. Po 24 hodinách se do media přidalo G418 (200 gg/ml aktivní složky) a FIAU (5xl0-7 M) a klony resistencní na léčiva se vyvíjely po dobu 8-9 dnů. Klony se seškrábly, trypsinizovaly se, rozdělily se na dvě poloviny a dále se expandovaly. Polovina buněk z každého klonu se potom zmrazila a druhá polovina se analyzovala na homologní rekombinaci mezi vektorem a cílovými sekvencemi.
DNA analýza se provedla Southernovou hybridizací. DNA se izolovala z klonů způsobem popsaným v Laird et al. (Laird, P. W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4293). Izolovaná genomová DNA se trávila Spěl a sondovala se 915 bp Sad fragmentem, sondou A, která hybridizuje na sekvenci mezi mu intronovým zesilovačem a přesmykovým regionem. Sonda A detekuje 9,9 kb Spěl fragment z přirozeného lokusu, a diagnostický 7,6 kb proužek z mu lokusu, který homologně rekombinuje s CMD zaměřovacím vektorem (neo expresní kazeta obsahuje Spěl místo). Z 1132 G418 a FIAU resistěntních klonů testovaných Southernovou hybridizací 3 vykazovaly 7,6 kb Spěl proužek, který ukazuje na homologní rekombinaci v mu lokusu. Tyto 3 klony se dále trávily enzymy BglI, BstXI a EcoRI, pro ověření toho, že se vektor homologně integroval do mu genu.
109 ·..··..· ·.»· :
Při hybridizací sondou A jsou při Southernově hybridizací přirozené DNA trávené BglI, BstXI, nebo EcoRI, patrné fragmenty velikosti 15,7, 7,3 a 12,5 kb, v příslušném pořadí, zatímco přítomnost cílící mu alely se projeví fragmenty 7,7,
6,6 a 14,3 kb, v příslušném pořadí. Všechny 3 pozitivní klony detekované Spěl trávením vykazovaly předpokládané BglI, BstXI, a EcoRI restrikční fragmenty diagnostické pro inserci neo kazety do Cmul exonu.
Příprava myší nesoucích mutovaný mu gen
Tři cílené ES klony, označené čísly 264, 272 a 408, se rozmrazily a injikovaly se do C57BL/6J blastocyst, jak popisuje Bradley (Bradley, A. (1987), v Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, str. 113-151). Injikované blastocysty se přenesly do děloh pseudopregnantních samic pro přípravu chimérických myší reprezentujících směs buněk získaných z aplikovaných ES buněk a buněk blastocysty. Příspěvek ES buněk v chiméře může být vizuálně hodnocen podle množství zbarvení agouti, které pochází z ES buněčné linie, na černém C57BL/6J pozadí. Klony 272 a 408 produkovaly pouze chiméry s nízkým podílem (tj. nízkým procentem agouti pigmentace), ale klon 264 produkoval samčí chiméry s vysokým podílem. Tyto chiméry se křížily s C57BL/6J samicemi a získalo se agouti potomstvo, což ukazuje na zárodečný přenos genomu ES buněk. Skríning na cílený mu gen se provedl Southernovou hybridizací BglI trávené DNA z biopsií z ocasu (jak je popsáno výše pro analýzu ES buněčné DNA). Přibližně 50% agouti potomstva mělo patrný hybridizační BglI proužek velikosti 7,7 kb, kromě normálního 15,7 kb, což ukazuje na zárodečný přenos cíleného mu genu.
• 4
4*
4 4 4 4
Β
110
Analýza transgenních myší na funkční inaktivaci mu genu
Pro stanovení toho, zda inserce nec kazety do Cmul inaktivovala gen pro těžký řetězec Ig, se chimérický klon 264 křížil s myší homozygotní pro JHD mutaci, která inaktivuje expresi těžkého řetězce v důsledku delece JH genových segmentů (Chen et al., (1993) Immunol. 5: 647-656). Získaly se čtyři agouti potomci. Sérum se odebralo od těchto zvířat ve stáří 1 měsíce a testovalo se ELISA na přítomnost myšího IgM. Dva ze čtyř potomků vůbec neměly IgM (viz Tabulka 2). Genotypování čtyř zvířat Southernovou analýzou DNA z biopsií z ocasu za použití BglI trávení hybridizace sondou A (viz obr. 1), a Stul trávením a hybridizaci 475 bp EcoRI/StuI fragmentem (ibid.) ukázalo, že zvířata, která neexprimují sérový IgM, jsou ta zvířata, u kterých jedna alela lokusu těžkého řetězce nese JHD mutaci a druhá alela Cmul mutaci. Myši heterozygotní pro JHD mutaci mají přirozené hladiny sérového Ig. Tato data ukazují, že Cmul mutace inaktivuje expresi mu genu.
Tabulka 2
Myš | Sérový IgM ^g/ml) | Genotyp Ig H řetězce |
42 | <0,002 | CMD/JHD |
43 | 196 | + /JHD |
44 | <0,002 | CMD/JHD |
45 | 174 | + /JHD |
129xBL6Fl | 153 | + / + |
JHD | <0,002 | JHD/JHD |
Tabuka 2 ukazuje koncentrace sérového IgM, detekované ELISA, pro myši nesoucí CMD a JHD mutace (CMD/JHD), pro myši heterozygotní pro JHD mutace (+/JHD), pro normální (129Sv x C57BL/6J)F1 myši (+/+), a myši deficitní pro B lymfocyty * · «· ·« · «· · ··· 9 · · · * ·
9 « «· 9 9 · · 9 » 9 ♦ φ · · 9 9 9 9 9999 4 9 · ···
111 »··»··· · * · lil «··« »· · · 9 9
Homozygotní pro JHD mutaci (JHD/JHD).
Příklad 2: Příprava HCO12 transgenních myší pro produkci antiEGFR lidských protilátek
HCO12 transgen pro lidský těžký řetězec
HCO12 transgen se připravil současnou injekcí 80 kb insertu pHC2 (Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591) a 25 kb insertu pVx6. Plasmid pVx6 se připravil způsobem popsaným výše.
8,5 kb HindlII/SalI DNA fragment, obsahující zárodečný lidský VHl-18 (DP-14) gen spolu s přibližně 2,5 kb 5' sousední sekvencí, a 5 kb 3' sousední genomové sekvence, se subklonoval do plasmidového vektoru pSP72 (Promega, Madison, WI), za zisku plasmidů p343.7.16. 7 kb BamHI/HindlII DNA fragment, obsahující zárodečný lidský VH5-51 (DP-73) gen, spolu s přibližně 5 kb 5' sousední sekvence a 1 kb 3' sousední genomové sekvence, se klonoval do klonovacího vektoru pGPlf na bázi plasmidů pBR322 (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res.
20: 6287-6295), za zisku plasmidů p251f. Nový klonovací vektor odvozený z pGPlf, pGPlk (SEQ ID NO:13), se trávil EcoRV/BamHI, a ligoval se do 10 kb EcoRV/BamHI DNA fragmentu, obsahujícího zárodečný lidský VH3-23 (DP47) gen, spolu s přibližně 4 kb 5' sousední a 5 kb 3' sousední genomové sekvence. Získaný plasmid, pll2.2RR.7, se trávil BamHI/SalI a ligoval se s 7 kb přečištěným BamHI/SalI insertem p251f. Získaný plasmid, pVx4, se trávil Xhol a ligoval se s 8,5 kb Xhol/Sall insertem p343.7.16. Získal se klon s VHl-18 genem v stejné orientaci jako další dva V geny. Tento klon, označený jako pVx6, se potom trávil Notl a přečištěný 26 kb insert se injikoval současně s přečištěným 80 kb Notl insertem pHC2 v molárním
112
4 44 • 4 ( 44 4 • 4 « 4 9 4
4 A 4 9 999 • · 4 4 4444 44 4 9944 • 4 4 4 4 4 poměru 1:1 do pronukleu embryí (C57BL/6J x DBA/2J)F2 stáří půl dne, jak je popsáno v Hogan et al. (B. Hogan et al.,
Manipulating the Mouše Embryo, A Laboratory Manual, 2.vydání,
1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY).
Z myší, u kterých se vyvinula embrya, se získaly tři nezávislé linie transgenních myší obsahujících sekvence z Vx6 i HC2.
Tyto linie se označily jako (HCO12)14881, (HCO12)15083 a (HCO12)15087. Každá ze tří linií se potom křížila s myší mající CMD mutaci popsanou v příkladu 1, JKD mutaci (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820), a (KC05)9272 transgen (Fishwild et al. 1996, Nátuře Biotechnology 14: 845-851).
Získané myši exprimovaly transgeny pro lidský imunoglobulinový těžký a kappa lehký řetězec na genetickém základě homozygotním pro narušení endogenních myších lokusů pro těžký a kappa lehký řetězec.
Příklad 3: Produkce lidské monoklonálni protilátky proti EGFR
Dva různé kmeny myší se použily pro generování EGFR reaktivní lidské monoklonálni protilátky. Kmen ((CMD)++;
(JKD)++; (HCo7)l 1952+/++; (KCo5)9272+/++) (zde označený jako HCO7 myši, a kmen ((CMD)++; (JKD)++; (HCol2)15087+/++;
(KCo5)9272+/++) (zde označený jako HCO12 myš). Oba tyto kmeny jsou homozygotní pro narušení endogenních lokusů pro těžký řetězec (CMD) a kappa lehký řetězec (J7KD). Oba kmeny také obsahují transgen pro lidský kappa lehký řetězec (HCo7), a jednotlivá zvířata jsou hemizygotní nebo homozygotní pro inserci #11952. Dva kmeny se liší v použitém transgenů pro lidský těžký řetězec. Myši jsou hemizygotní nebo homozygotní pro HCo7 nebo HCol2 transgen. CMD mutace byla popsána výše v příkladu 1. Příprava (Hcol2)15087 myší je popsána v příkladu 2. JKD mutace (Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820) a (KCo5)9272 (Fishwild et al. 1996, Nátuře Biotechnology 14:
113
ΦΦ ·· φφ φ φφφ φφφ φφφ φφφ φ φ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ · φ φ φφφ φφφφ φφ φ φφ *
ΦΦΦ· φφ φ φφ ·
845-851) a (HC07)11952 myši jsou popsány v US patentech č. 5,770,429 a 5,545,806 (Lonberg & Kay, 6/23/98).
Použitý imunizační protokol je popsán v následující Tabulce 3. Myši byly imunizované dvakrát A431 buňkami a potom solubilním antigenem v Ribi Adjuvans. Titr EGFR specifického séra se určil ELISA po třetí imunizaci. Provedly se tři různé imunizace za účelem dosycení před tím, než se provedla fůze. Těmito imunizacemi byly dva nebo tři následné intravenosní (iv) injekce do ocasní žíly za použití 10 gg antigenu v 50 μΐ PBS nebo dvě postupné intraperitoneální (i.p.) dosycovací injekce 25 μρ solubilního EGFR v Ribi adjuvans (viz tabulka 3). Tři myši, které se použily ve fúzi, byly součástí větší skupiny myší, které měly HCo7 a HCol2 genotypy.
Tabulka 3: Imunizační protokol
Imunizační protokol | ||||||||
ELISA | EGFR | ELISA | EGFR | |||||
A431 buňky | A431 buňky | Titr | V Ribi ÍP | Titr | Fúze | V Ribi ÍP | Fúze | |
Myš | Den 1 | Den 20 | Den 30 | Den 33 | Den 43 | Den 4 6 | Den 50 | Den 53 |
20241 | 2xl06 | lxlO7 | 0 | 25 μg | 4050 | 25 μg | Ribi 2x25 μρ*** | |
20242 | 2xl06 | lxlO7 | 0 | 25 μg | 4050 | 25 μg | 2 iv x 10 μg* | |
20243 | 2xl06 | lxlO7 | 450 | 25 μς | 12125 | 3 iv x 10 μg* |
* EGFR v PBS (10 μ9) iv v den -4, -3 a -2 ** EGFR v PBS (10 μρ) iv v den -4 a -3 *** EGFR v Ribi (25 μg) ip v den -4 a -3 • ·
444
114 ·· ·· «· 4 44
4 4 444 44
4444 4 444 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4444 4 · 4 • 4 4 · 4· · 44 4 · 4 44 4 44 4
Imunizační strategie použitá pro první dvě injekce, 2-10 xlO6 živých A431 buněk ip, vedla k indukci nízkých titrů antiEGFR protilátek (viz Tabulka 2). Nicméně, když byla těmto myším podána třetí imunizace 25 pg/myš solubilního EGFR v Ribi adjuvans, tak se sérové titry zvýšily více než 30-krát. Tyto výsledky jasně demonstrují, že buňky exprimující mnoho EGFR na povrchu buněk jsou velmi efektivní v iniciaci primární imunitní reakce, která byla potom významně zesílena jedinou dávkou přečištěného antigenu v adjuvans.
Poslední dosycovací imunizace před fúzí pro myš 20243 se provedla jako i.v. injekce do ocasní žíly za použití 10 pg solubilního EGFR v PBS ve dny -4, -3 a -2. Triton X-100 v solubilním EGFR podráždění ocasu myši. Proto se pro snížení podráždění myši 20242 podaly pouze dvě dosycovací injekce solubilního EGFR do ocasní žíly ve dny -4 a -3, a myš 20241 dostala dvě i.p. imunizace ve dny -4 a -3, za použití 25 pg EGFR v Ribi adjuvans. Ze tří fúzí vzniklo 46 hybridomů pozitivních na lidský γ, κ-antigen (viz tabulka 4). Myš 20241 samotná, které se podaly i.p. dosycovací injekce s adjuvans, produkovala 35 antigen specifických lidských gamma kappa protilátek.
Tabulka 4
Myš | γκ+ | γ/κ+ EGFR + | γ1κ+ EGFR + | γ3κ+ EGFR + |
20243 | 120 | 14 | 13 | 1 |
20242 | 35 | 2 | 2 | 0 |
20241 | * | 30 | 28 | 2 |
Příklad 4: Příprava hybridomů
Pro fúze se použila P3 X63 ag8.653 myelomová buněčná linie
• · · • · ♦« ♦ • · · · · • · » 9
115 (ATCC CRL 1580, šarže F-15183). Původní ATCC fiola se rozmrazila a expandovala se v kultuře. Z této kultury se připravily očkovací zásobní zmrazené přípravky. Jeden týden před fúzí se rozmrazil čerstvý zásobní roztok buněk.
DMEM s vysokým obsahem glukosy (Mediatech, Cellgro #
10013) obsahující 10% FBS, Pennicillin-Streptomycin (Sigma, P7539), a 5,5 xlO5 M 2-merkaptoethanolu (GibcoBRL, 21985-023) se použilo pro kultivaci A431 buněk a myelomových buněk. Další doplňky se přidaly do Hybridomového kultivačního media, konkrétně: 3% Origin-Hybridoma Cloning Factor (Igen, 21001),
OPT doplněk (Sigma, 0-5003), 1,1x103 M kyseliny oxalooctové, 4,5x10 M natrium-pyruvátu, a 24 mězinárodních jednotek /L hovězího insulinu, HAT (Sigma, H 0262), Ι,ΟχΙΟ-4 M hypoxantinu, 4,0xl0-7 M aminopterinu, 1,6χ105 M thymidinu, nebo HT (Sigma, H0137), Ι,ΟχΙΟ-4 M hypoxanthine, 1,6χ10-4 M thymidinu.
Charakterizované fetální hovězí sérum (SH30071 šarže #s AJE10321 a AGH6843) se získalo od Hyclone, Logan, Utah. Bezsérové medium obsahovalo DMEM, antibiotika a 2merkaptoethanol.
Sleziny od všech tří myší měly normální velikost a získalo se z nich od 2xl07 do lxlO8 splenocytů. Splenocyty se fúzovaly.
Prvotní ELISA test na lidské IgG κ protilátky se provedlo 710 dnů po fúzi. Jamky pozitivní na lidský IgG, K, s etestovaly na ELISA plotnách potažených solubilním EGFR. Antigen pozitivní hybridomy se přenesly na 24-jamkvé plotny a případně do tkáňových kultivačních baněk. EGFR specifické hybridomy se subklonovaly limitním ředěním pro zajištění monoklonálity. Antigen-pozitivní hybridomy se uskladnily v několika stádiích vývoje zmrazením buněk v DMEM 10% FBS plus 10% DMSO (Sigma, ·· ·φ Φ· φφφ φ · φ φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ φ φ φφφ φ
116 • · φ φφφφ · φ
D2650) nebo v Origen Freeze Medium (Igen, #210002). Buňky se skladovaly při -80 °C nebo v LN2.
Původní EGFR specifické hybridomy se potom hodnotily na epitopovou specificitu a na schopnost blokovat vazbu EGF na EGFR receptor. O myších monoklonálních anti-EGFR protilátkách 225 a 528 bylo již dříve známo, že se váží na EGFR, blokují vazbu EGF na EGFR a že jsou protinádorovými imunoterapeutickými činidly ve studiích na zvířatech i člověku. Proto se tyto protilátky použily, společně s neblokující protilátkou, v kompetitivním ELISA formátu pro identifikaci lidských protilátek majících imunoterapeutické charakteristiky.
Příklad 5: Vazebná afinita
Vazebná afinita pro hybridom 2F8 se stanovila za použití BlAcore 3000 (Biacore, Upsula, Sweden). EGFR přečištěný z A431 buněk se zakoupil od Sigma a imobilizoval se na CM5 čipu podle návodu výrobce. Protilátka 2F8 má rovnovážnou asociační konstantu (KA) 147 (± 0,52) x 108 M-1.
Příklad 6: Kompetitivní ELISA testy
Kompetitivní ELISA testy se použily jako prvotní testy ihned potom, co ve 24-jamkových plotnách vznikly první antigen pozitivní hybridomy. Obecně, silná kompetice (80-100%) ukazuje na to, že se protilátka váže váže na stejný epitop nebo na region antigenů v blízkosti kompetující protilátky. Kompetice menší než 50% ukazuje, že se protilátka a její kompetitor váží na regiony antigenů, které nejsou v těsné blízkosti. Iniciální testy se provedly se supernatanty z neklonovaných hybridomů, z nichž mnohé obshaovaly více než jeden hybridom na jamku.
9
9 9
9 9 9
9 9999
9 9 9 • 99 9 • 9 9 9 ·
9999 9 9
9 · 9 9 9 9
9 9 9 9 9
9· ·9
117 • · 9999
Další testy se provedly se subklony původních jamek. Obr. 1 a 2 ukazují (data na Obr. 1 a 2 jsou uspořádána podle stupně kompetice s MAb 225), že i za použití surových supernatantu buněčné kultury mohou být identifikovány protilátky, které se váží na podobné nebo identické epitopy jako 225 a 528 protilátky. Z tohoto pokusu je také zřejmá odlišná distribuce charakteru kompetitivní vazby pro protilátky získané od myši 20241 a od myší 20242 a 20243. Například, prvních sedm protilátek od #20241 myši (Obr. 1) kompetují silně s MAb 225 i 528. Zbývající protilátky od 20241 kompetují středně nebo slabě s 225 a 528 protilátkami. 5 protilátek (1H6, 2F8, 1A8, 5C5 a 8E1) od 20242 a 20243 myší má silnou kompetici s protilátkou 225 a žádnou nebo slabou kompetici s MAb 528 (Obr. 2). Protilátky 2F6, 8A12, SF12, 6B3 a 6D9 od myší 20242 a 20243 kompetují s MAb 225 i 528, ačkoliv silnější kompetice je s protilátkou 225. Další protilátky od těchto myší nekompetují nebo kompetují slabě s komerčními MAb.
Tyto výsledky prvotních kompetitivních ELISA se potvrdily za použití přečištěných protilátek produkovaných subklonovanými buňkami. Obr. 3 a 4 ukazují, že protilátky SF12 a 6B3 silně kompetují s MAb 225 i 528 a také ukazují na jejich vzájemnou kompetici. Tato data naznačují, že se protilátky váží na stejný epitop nebo region EGFR molekuly jako 225 nebo 528 protilátky. Protilátka 2F8 středně silně kompetuje s MAb 225 a nekompetuje významnějším způsobem s protilátkou 528 (Obr. 3 a 4). Nicméně, protilátky 2F8, 6B3 a SF12 vykazují silnou vzájemnou zkříženou kompetici. Tato data naznačují, že protilátka 2F8 se váže na jiný epitop než 225 a 528 protilátky a že se váže na region EGFR receptoru, který sousedí s nebo se překrývá s epitopem, na který se váží HuMAb 6B3 a SF12. Protilátky 2A2 a 6E9 nekompetují s žádnou MAb a váží se na EGFR epitopy nesouvisející s vazebnými místy 225 a 528 MAb ·# 00
0 0 0
0 000 0
0 0 * 0 0
0 0 0 0
0 0 0
0 0
0 0 0
0 0··
0 0 »
0 0
0000
0
118 (Obr. 3 a 4) .
Příklad 7: EGF/EGFR blokovací testy
Antigen-pozitivní subklony se dále hodnotily v EGF/EGFR blokovacích testech. V těchto testech se použily subklony protilátek, které silně kompetují s MAb 225 a/nebo 528, stejně jako subklony protilátek, které jsou slabými kompetitory nebo nekompetují s 225 nebo 528. několik protilátek se expandovalo v kultivačním mediu a přečistily se protein A chromatografií. Obr. 5 a 6 ukazují, že protilátky 2F8, SF12, a 6B3, které jsou středními ažsilnými kompetitory 225 protilátky v ELISA, jsou silnými blokátory vazby EGF na EGFR. Toto je evidentní v testech provedených v ELISA formátu nebo FACS na buňkách lidského A431 epidermoidního karcinomu. V obou testech byly lidské protilátky stejně dobré nebo lepší než MAb 225. Protilátky 2F8, SF12, 6B3 a 6E9 mají také potobné vazebné charakteristiky na povrchu A431 buněk (obr. 7).
In vitro EGF/EGFR blokovací a ELISA kompetitivní testy prokázaly, že 2F8, SF12 a 6B3 protilátky mají podobné vlastnosti jako jiné anti-EGFR myší a lidské protilátky, o kterých bylo prokázáno, že jsou imunoterapeutickými činidly (Sáto, et al. (1983) Mol. Biol. Med. 511-529; Gill, et al. (1984) J. of Biol. Chem. 259(12):7755-7760). 2F8 protilátka byla celkově v různých testech stejná nebo lepší než 6B3 a SF12 protilátky.
Příklad 8: Inhibice EGF/TGF-α vazby na EGF receptor pomocí lidské monoklonální protilátky k EGF receptoru
Inhibiční testy se provedly na A431 buňkách za použití průtokové cytometrie, ELISA a inhibice ligandem indukované ·· • v
119
ΦΦΦ φφφ φφφ φ φφφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φ φφφ φ φφφφ « φ φ φφφφ φφφφ φφφ φφφ φφφφ φφ φ φφ φ autofosforylace. Myší MAb 225 nebo 525 se použily jako pozitivní kontroly. Irelevantní lidský IgG se použil jako izotypová kontrola. Jediná lidská protilátka, 2F8, se vybrala pro všechny další pokusy. Tato protilátka je zde dále označována též jako Humax-EGFR™. Obr. 8 ukazuje EGF blokovací kapacitu 2F8, která je závislá na koncentraci. 2F8 a m225 blokují stejně, zatímco blokovací kapacita EGF je menší.
Obr. 9 dále ukazuje blokovací kapacitu 2F8 v tom, že účinně inhibuje vazbu EGF a TGF-α na A431 buňky (buňky získané z ovariálního epidermoidního karcinomu a exprimující na svém povrchu lxlO6 EGFR molekul). Inhibice 2F8-vazby na A431 buňky se stanovila analýzou na průtokovém cytometru. Buňky se preinkubovaly buď s 5 (prázdné sloupce) nebo 50 pg/ml (plné sloupce) ligandů před tím, než se přidala 2F8. Vazba protilátky bez ligandů (PBS skupina) se stanovila jako 100%. Tyto výsledky ukazují, že 2F8 se váže na EGFR blízko nebo ve stejném místě jako jeho ligandy.
Příklad 9: Inhibice aktivace nádorových buněk za použití lidské monoklonálni protilátky k EGF receptoru
Pro hodnocení schopnosti 2F8 inhibovat aktivaci nádorových buněk se zkoumal vliv 2F8 na EGF-spouštěné reakce buněk, jako je aktivace vlastní tyrosin-kinasové aktivity a současná proliferace buněk. Jednou z prvních událostí po vazbě EGF nebo TGF-α na EGFR je indukce autofosforylace receptoru. Inkubace EGF s A431 buňkami vede k fosforylaci tyrosinu EGFR (Mr 170,000) (Obr. 10A). Zatíco 2F8 sama neaktivuje kinasovou aktivitu receptoru, blokuje protilátka fosforylaci tyrosinu EGFR spouštěnou EGF způsobem závislým na dávce s kompletní inhibici při koncentraci 16,6 nM (molárnípoměr protilátka:EGF 20:1, Obr. 10A). Buňky ošetřené protilátkou a TGF-α ukázaly,
4
4444
120 » 4 4 » 4 4 44 ft 4 4 «
I 4 4 «
4 4 4 • · · 4 4
4 4 4 4
4 4 4 4 4
4444444 4
4 * 4 4 4
4 44 · že fosforylace tyrosinu je zcela blokovaná 2F8 v koncentraci 66 nM (molární poměr protilátka: TGF-a. 7,3:1, Obr. 10B) .
Vazba EGF/TGF-α s receptorem vede k aktivaci buněk, která se odráží v proliferaci buněk. Proto se hodnotil inhibiční efekt 2F8 na růst nádorových buněk (A431, MDA-MD-468 a HN5 buněk). Pokus se provedl za nepřítomnosti exogenního EGF. Myší protilátky se použily ro srovnání. Humax-EGFR inhibovala růst A431 buněk v závislosti na koncentraci s maximální inhibici 50%, což je hodnota podobné hodnotě získané pro myší protilátku 225 (Obr. 14). Kontrolní protilátka neměla žádný vliv na proliferaci buněk (obr. 14). Podobná inhibice růstu byla dosažena při použití dalších dvou buněčných linií (HN5 a MDA-MB468, panely B a C). Protože nebyl do kultury přidán žádný exogenní EGF, ukazují tyto výsledky na schopnost 2F8 blokovat autokrinní stimulaci a tak inhibovat autokrinním EGF/TGF-α indukovanou aktivaci nádorových buněk.
Příklad 10: Lidské monoklonální protilátky k EGF receptoru indukují ADCC
ADCC je účinným imunitním efektorovým mechanismem spouštěným rozpoznáním nádorových buněk protilátkami. Pro hodnocení schopnosti lidských PMN buněk zabíjet A431 buňky za přítomnosti 2F8 se A431 buňky označily 51Cr a potom se inkubovaly s protilátkou a efektorovými buňkami (PMN) přes noc. Po inkubaci se měřilo uvolňování chrómu. Jak je uvedeno na Obr. 14, je 2F8 schopna indukovat ADCC proti A431 buňkám při použití lidských PMN. 2F8 je schopna zprostředkovat PMNindukovanou lýzu 45% A431 cílových buněk, což vyšší hodnota než pro MAb 425 (Obr. 14).
Důležité je to, že ačkoliv je 2F8 schopna aktivovat ·· ·
121 φ φφφ φ φφφφ φφφ φφ φ φφφφ φ φφφ ΦΦΦΦΦΦΦ φφφφ φ imunitní efektorové buňky a indukovat ADCC, není schopna indukovat lýzu nádorových buněk zprostředkovanou komplementem.
Příklad 11: Lidské monoklonální protilátky k EGF receptoru brání tvorbě nádorů
Pro průkaz schopnosti HuMAb 2F8 bránit tvorbě nádorů u athymických myší se skupinám šesti (6) myší podkožně do kožního záhybu ijikovalo 3xl06 nádorových buněk v 200 μΐ PBS v den nula (0). Potom se myším injikovala i.p. ve dny 1 (75 μ9/200 μΐ), 3 (25 μς/200 μΐ) a 5 (25 μς/200 μΐ) (šipky) buď HuMAb 2F8 (plné čtverečky) nebo Mab proti lidskému IgGl-κ jako kontrola (prázdná kolečka) (Obr. 14). Data jsou uvedena jako průměrné objemy nádorů + SEM, a představují 3 samostatné pokusy, které měly podobné výsledky.
Eradikace vzrostlých A431 nádorových xenotransplantátů HuMAb 2F8 ve srovnání s m225 je uvedena na Obr. 14. Myším se podkožně do kožního záhybu injikovalo 3xl06 nádorových buněk v 200 μΐ PBS ov den nula (0). V de 10 se myši náhodně rozdělily do skupin a léčily se v den 12 (75 pg/200 μΐ) , 14 (25 μg/200 μΐ) a 16 (25 pg/200 μΐ) (šipky) HuMAb 2F8 (plné čtverečky, 2F8 krátkodobě) nebo myší anti-EGFR MAb m225 (plné trojúhelníčky, m225 krátkodobě). Dále se zahrnuly skupiny léčené 75 μρ/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 v den 12, a potom 25 μρ/200 μΐ HuMAb 2F8 nebo m225 ve dny 14, 16, 19,22, 26, 29, 33, 36 a 40 (prázdné čtverečky, 2F8 dlouhodobě; prázdné trojúhelníčky, m225 dlouhodobě). Data jsou uvedena jako průměrné objemy nádorů + SEM, a představují 3 samostatné pokusy, které měly podobné výsledky. Černé šipky ukazují dny léčby pro krátkodobou léčbu a prázdné šipky ukazují dny léčby pro dlouhodobou léčbu.
»· 99 · · 9 9
9 999 9 9
9 9 9 9 9 · • · · · 9 9
9 · 9 99 • · ····
122 «
9 9
9 9 9
9 9999
9 9 9
99 9
Ekvivalenty
Odborníkům v oboru budou zřejmá mnohá ekvivalentní provedení předkládaného vynálezu. Taková ekvivalentní provedení spadají do rozsahu připojených patentových nároků.
Odkazy
Všechny patenty, patentové přihlášky a další citované publikace jsou zde ve své úplnosti uvedeny jako odkazy.
Claims (50)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Izolovaná lidská monoklonální protilátka, která se váže na lidský EGFR, kde protilátka je vybrána ze skupiny zahrnují protilátky IgGl, IgA, IgE, IgM, IgG4 a IgD.
- 2 . Izolovaná lidská monoklonální protilátka podle nároku 1, kde protilátkou je IgGl protilátka.
- 3. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka inhibuje vazbu EGFR ligandu na lidský EGFR.
- 4. Lidská protilátka podle nároku 1, kde EGFR ligandem je EGF nebo TGF-a.
- 5. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka se váže na lidský EGFR s rovnovážnou asociační konstantou (KA) alespoň asi108 M'1.
- 6. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka se váže na lidský EGFR s rovnovážnou asociační konstantou (KA) alespoň asi109 M1.
- 7. Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka blokuje vazbu EGFR ligandu na lidský EGFR o alespoň asi 50%.
- 8. Lidská protilátka podle nároku 2, která obsahuje variabilní region z IgGl těžkého řetězce a variabilní region z kappa lehkého řetězce.
- 9. Lidská protilátka podle nároku 1, kódovaná nukleovými kyselinami pro lidský těžký řetězec, resp. lidský kappa lehký řetězec, obsahujících ve variabilních regionech nukleotidové ·· · ··· · · · · · · • · · · · · ··· · ··· sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, resp. SEQ ID NO:3 a konzervativní modifikace těchto sekvencí.
- 10. Lidská protilátka podle nároku 1, mající variabilní regiony těžkého řetězce, resp. kappa lehkého řetězce, které obsahují aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2, resp. SEQ ID NO:4 a konzervativní modifikace těchto sekvencí.
- 11. Izolovaná lidská monoklonální protilátka, která se váže na epitop EGFR definovaný protilátkou 2F8.
- 12. Izolovaná lidská monoklonální protilátka, která má vazebné charakteristiky protilátky 2F8.
- 13 . Lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka neaktivuje komplement.
- 14. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na EGFR s afinitní asociační konstantou (KA) alespoň asi 108 M'1.
- 15. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na EGFR a inhibuje EGF nebo TGF-ct indukovanou autofosforylaci EGFR.
- 16. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na buňky exprimující EGFR a inhibuje jejich růst.
- 17. Lidská protilátka podle nároku 16, kde buňkou je nádorová buňka vybraná ze skupiny zahrnující buňky močového měchýře, buňky prsu, buňky tlustého střeva, buňky ledvin, buňky vaječníků, buňky prostaty, renální buňky, spinocelulární buňky a nemalobuněčné plicní buňky.
- 18. Lidská protilátka podle nároku 16, kde buňka je vybrána ze • ·125 skupiny zahrnující synoviální fibroblasty a keratinocyty.
- 19. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na buňky exprimující EGFR a indukuje lýzu (ADCC) buněk za přítomnosti lidských efektorových buněk.
- 20. Lidská protilátka podle nároku 1, která se váže na buňky exprimující EGFR, ale neindukuje komplementem zprostředkovanou lýzu buněk.
- 21. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1, kde protilátka je Fab fragment nebo jednořetězcová protilátka.
- 22. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1, produkovaná hybridomem, který zahrnuje B lymfocyt získaný od transgenního non-lidského zvířete majícího genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec, fúzovaný na imortalizovanou buňku.
- 23. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1, produkovaná transfektomem obsahujícím nukleové kyseliny kódující lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec.
- 24. Hybridom, zahrnující B lymfocyt získaný od transgenního non-lidského zvířete majícího genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lehký řetězec, fúzovaný na imortalizovanou buňku, kde hybridom produkuje detekovatelná množství monoklonální protilátky podle nároku 1, nebo její vazebné části pro antigen.
- 25. Transfektom, zahrnující nukleové kyseliny kódující lidský těžký řetězec a lidský lehký řetězec, kde transf ektom produkuje detekovatelná množství monoklonální protilátky podle nároku 1, • · ··· · · · · · · • ···· · ··· · · · · • · · · · · · ···· · · ft ···· ι?6 ·····♦· · · · nebo její vazebné části pro antigen.
- 26. Transfektom podle nároku 25, zahrnující nukleové kyseliny kódující lidský těžký řetězec, resp. lidský lehký řetězec obsahující ve variabilních regionech nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, resp. SEQ ID NO:3 nebo jejich konzervativní modifikace.
- 27. Transgenní non-lidské zvíře, které exprimuje protilátky podle nároku 1, kde transgenní non-lidské zvíře má genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec.
- 28. Způsob produkce protilátky podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje:imunizování transgenního non-lidského zvířete majícího genom obsahující transgen pro lidský těžký řetězec a transgen pro lidský lehký řetězec pomocí EGFR nebo buňkami exprimujícími EGFR tak, že B-lymfocyty zvířete jsou produkovány protilátky;izolování B-lymfocytů zvířete; a fúzování B-lymfocytů s myelomovými buňkami za zisku imortalizovaných hybridomových buněk secernujících protilátky.
- 29. Bispecifická molekula, zahrnující lidskou protilátku podle nároku 1 a skupinu s vazebnou spécificitou pro lidské buňky prezentující antigen (APC).
- 30. Bispecifická molekula, zahrnuj ící lidskou protilátku podle nároku 1 a vazebnou specificitu pro lidský Fc receptor.
- 31. Bispecifická molekula podle nároku 30, kde Fc receptorem je lidský FeyRI nebo lidský Fca receptor.• · • «12799 99 99 9 99 9
- 32. Bispecifická molekula podle nároku 30, která se váže na Fc receptor v místě, které je odlišné od místa receptore, na které se váže imunoglobulin.
- 33. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou protilátku podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
- 34. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci dvou nebo více lidských protilátek nebo jejich vazebných částí pro antigen podle nároku 1, kde každá uvedená protilátka nebo její vazebná část pro antigen se váže na jiný epitop EGFR.
- 35. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje lidskou protilátku podle nároku 1 a chemoterapeutické činidlo.
- 36. Imunotoxin, zahrnující lidskou protilátku podle nároku 1 navázanou na cytotoxické činidlo.
- 37. Způsob inhibice růstu buněk exprimujících EGFR, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování buněk s účinným množstvím protilátky podle nároku 1 tak, že dojde k inhibici růstu buněk exprimujících EGFR, kde protilátka inhibuje vazbu EGFR ligandu na lidský EGFR.
- 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že buňkou je buňka vybraná ze skupiny zahrnující buňky močového měchýře, buňky prsu, buňky tlustého střeva, buňky ledvin, buňky vaječníků, buňky prostaty, renální buňky, spinocelulární buňky, nemalobuněčné plicní buňky, synoviální fibroblasty a keratinocyty.♦♦2 ·· · • * · · · • · · 0 0 0 000000 0 0 00000 0 0 0 000 00 00 « 00 ·128
- 39. Způsob indukce cytolýzy buněk exprimujících EGFR, vyznačující se tím, žeže zahrnuje kontaktování buněk exprimuj ících EGFR s protilátkou podle nároku 1 za přítomnosti efektorové buňky tak, že dojde k cytolýze buněk exprimujících EGFR.
- 40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že buňkou je buňka vybraná ze skupiny zahrnující buňky močového měchýře, buňky prsu, buňky tlustého střeva, buňky ledvin, buňky vaječníků, buňky prostaty, renální buňky, spinocelulární buňky, nemalobuněčné plicní buňky, synoviální fibroblasty a keratinocyty.
- 41. Způsob léčby nebo prevence onemocnění zprostředkovaného expresí EGFR, vyznačující se tím, že zahrnuje podání lidské protilátky podle nároku 1 v množství účinném pro léčbu nebo prevenci onemocnění zprostředkovaného EGFR jedinci.
- 42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že onemocnění je zhoubný nádor.
- 43. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že onemocněním je autoimunitní onemocnění,
- 44. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že lidská protilátka je konjugována na skupinu, která se specificky váže na Fc receptor.
- 45. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že lidská protilátka je konjugována na cytotoxin.
- 46. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, • A ·· A ·· · • A · · AAA • · A · ··· A A A · • A A A AAAAAAA A ·A A že dále zahrnuje současné podání terapeutického činidla.
- 47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující doxorubicin (adriamycin), cisplatinu, bleomycin-sulfát, carmustin, chlorambucil, cyklofosfamid a hydroxymočovinu.
- 48. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že nádor je vybrán ze skupiny zahrnující nádor močového měchýře, nádor prsu, nádor tlustého střeva, nádor ledvin, nádor vaječníků, nádor prostaty, renální nádory a nádory hlavy a krku.
- 49. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že na onemocnění se podílí hyperproliferace epítelu.
- 50. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že onemocněním je zánětlivá arthritida.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US29817201P | 2001-06-13 | 2001-06-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ200438A3 true CZ200438A3 (cs) | 2004-06-16 |
Family
ID=23149369
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ200438A CZ200438A3 (cs) | 2001-06-13 | 2002-06-13 | Název neuveden |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7247301B2 (cs) |
EP (1) | EP1417232B1 (cs) |
JP (2) | JP4298498B2 (cs) |
KR (2) | KR20090125840A (cs) |
CN (2) | CN1966525A (cs) |
AU (1) | AU2002345673B2 (cs) |
BR (1) | BRPI0210405B8 (cs) |
CA (1) | CA2450285C (cs) |
CZ (1) | CZ200438A3 (cs) |
HK (1) | HK1064685A1 (cs) |
HU (1) | HUP0600225A3 (cs) |
IL (2) | IL159225A0 (cs) |
MX (1) | MXPA03011365A (cs) |
NZ (1) | NZ530212A (cs) |
RU (1) | RU2335507C2 (cs) |
WO (1) | WO2002100348A2 (cs) |
Families Citing this family (261)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7060808B1 (en) * | 1995-06-07 | 2006-06-13 | Imclone Systems Incorporated | Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody |
US20030224001A1 (en) * | 1998-03-19 | 2003-12-04 | Goldstein Neil I. | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors |
ZA200007412B (en) * | 1998-05-15 | 2002-03-12 | Imclone Systems Inc | Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases. |
EE200100603A (et) * | 1999-05-14 | 2003-02-17 | Imclone Systems Incorporated | Inimese refraktaarsete kasvajate ravi epidermaalse kasvufaktori retseptori antagonistidega |
AU9500201A (en) * | 2000-08-09 | 2002-02-18 | Imclone Systems Inc | Treatment of hyperproliferative diseases with epidermal growth factor receptor antagonists |
US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US20080008704A1 (en) * | 2001-03-16 | 2008-01-10 | Mark Rubin | Methods of treating colorectal cancer with anti-epidermal growth factor antibodies |
CA2447139C (en) | 2001-05-11 | 2013-11-19 | Ludwig Institute For Cancer Research | Specific binding proteins and uses thereof |
US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
US7595378B2 (en) | 2001-06-13 | 2009-09-29 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR) |
US20050271663A1 (en) * | 2001-06-28 | 2005-12-08 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
DE60237282D1 (de) * | 2001-06-28 | 2010-09-23 | Domantis Ltd | Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung |
EP1463512B1 (en) | 2002-01-11 | 2014-05-28 | biOasis Technologies Inc. | Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes |
US7662925B2 (en) * | 2002-03-01 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US20090042291A1 (en) * | 2002-03-01 | 2009-02-12 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
US9321832B2 (en) * | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
DK1517921T3 (da) * | 2002-06-28 | 2006-10-09 | Domantis Ltd | Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf |
USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
CA2965865C (en) * | 2002-07-18 | 2021-10-19 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
CA2511910A1 (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
US20090010920A1 (en) * | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
US8388955B2 (en) * | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
CA2450289A1 (en) * | 2003-03-20 | 2005-05-19 | Imclone Systems Incorporated | Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor |
EP1622941A2 (en) * | 2003-03-20 | 2006-02-08 | ImClone Systems Incorporated | Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor |
US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
EP2395016A3 (en) | 2003-05-30 | 2012-12-19 | Merus B.V. | Design and use of paired variable regions of specific binding molecules |
US8101720B2 (en) | 2004-10-21 | 2012-01-24 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions |
US9714282B2 (en) | 2003-09-26 | 2017-07-25 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants and methods for their generation |
GB0324368D0 (en) * | 2003-10-17 | 2003-11-19 | Univ Cambridge Tech | Polypeptides including modified constant regions |
DK1737971T3 (da) * | 2004-01-20 | 2017-11-13 | Merus Nv | Blandinger af bindingsproteiner |
US7767792B2 (en) * | 2004-02-20 | 2010-08-03 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Antibodies to EGF receptor epitope peptides |
EP1735348B1 (en) * | 2004-03-19 | 2012-06-20 | Imclone LLC | Human anti-epidermal growth factor receptor antibody |
JP2008512352A (ja) * | 2004-07-17 | 2008-04-24 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | 新規な四価の二重特異性抗体 |
JP2008512987A (ja) | 2004-07-22 | 2008-05-01 | エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム | 結合分子 |
US8546543B2 (en) | 2004-11-12 | 2013-10-01 | Xencor, Inc. | Fc variants that extend antibody half-life |
EP2845865A1 (en) | 2004-11-12 | 2015-03-11 | Xencor Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US8367805B2 (en) * | 2004-11-12 | 2013-02-05 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
US8802820B2 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
AU2006211037B2 (en) * | 2005-02-07 | 2012-05-24 | Roche Glycart Ag | Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof |
CN100362018C (zh) * | 2005-03-02 | 2008-01-16 | 上海张江生物技术有限公司 | 重组抗egfr单克隆抗体 |
CN107033243B (zh) | 2005-03-23 | 2020-12-15 | 根马布股份公司 | 用于治疗多发性骨髓瘤的cd38抗体 |
US20060257317A1 (en) * | 2005-05-04 | 2006-11-16 | Duke University | Combination therapy in the treatment of cancer |
EP1888649A2 (en) * | 2005-05-09 | 2008-02-20 | GlycArt Biotechnology AG | Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors |
EP1899379B1 (en) * | 2005-06-20 | 2018-04-11 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Cd19 antibodies and their uses |
US7449442B2 (en) * | 2005-07-12 | 2008-11-11 | Children's Medical Center Corporation | EGFR inhibitors promote axon regeneration |
JP2009501913A (ja) | 2005-07-21 | 2009-01-22 | ゲンマブ エー/エス | Fc受容体と結合する抗体原薬に関する効力アッセイ |
SI1912675T1 (sl) | 2005-07-25 | 2014-07-31 | Emergent Product Development Seattle, Llc | zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20 |
US20090215992A1 (en) * | 2005-08-19 | 2009-08-27 | Chengbin Wu | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
US7612181B2 (en) * | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
ES2543341T3 (es) * | 2005-09-13 | 2015-08-18 | National Research Council Of Canada | Métodos y composiciones para modular la actividad de células tumorales |
CA2624189A1 (en) | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with optimized fc receptor binding properties |
DK1976877T4 (en) | 2005-11-30 | 2017-01-16 | Abbvie Inc | Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof |
PT1954718E (pt) | 2005-11-30 | 2014-12-16 | Abbvie Inc | Anticorpos anti-globulómeros aβ, suas porções de ligação ao antigénio, correspondentes hibridomas, ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras, métodos de produção dos ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos para uso dos ditos anticorpos |
KR20080077238A (ko) * | 2005-12-01 | 2008-08-21 | 도만티스 리미티드 | 인터루킨 1 수용체 타입 1에 결합하는 비경쟁적 도메인항체 포맷 |
KR101373464B1 (ko) | 2005-12-08 | 2014-03-14 | 메다렉스, 엘.엘.시. | 단백질 티로신 키나제 7(ptk7)에 대한 인간 단일클론항체 및 그의 용도 |
CN101058609B (zh) * | 2006-05-26 | 2011-04-13 | 神州细胞工程有限公司 | 人源抗体及其表达 |
CA2654317A1 (en) | 2006-06-12 | 2007-12-21 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Single-chain multivalent binding proteins with effector function |
WO2008003319A1 (en) | 2006-07-04 | 2008-01-10 | Genmab A/S | Cd20 binding molecules for the treatment of copd |
AR062223A1 (es) * | 2006-08-09 | 2008-10-22 | Glycart Biotechnology Ag | Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas |
PL2081595T3 (pl) | 2006-09-26 | 2019-11-29 | Genmab As | Anty-cd38 wraz z kortykosteroidami wraz ze środkiem chemioterapeutycznym niebędącym kortykosteroidem, do leczenia guzów nowotworowych |
EP2081553B1 (en) * | 2006-10-06 | 2020-08-12 | Amgen Inc. | Stable antibody formulations |
EP2094247B1 (en) * | 2006-10-20 | 2022-06-29 | Amgen Inc. | Stable polypeptide formulations |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
CN104013956B (zh) | 2007-01-25 | 2018-12-18 | 达娜-法勃肿瘤研究所公司 | 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途 |
WO2008104386A2 (en) | 2007-02-27 | 2008-09-04 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Method for the treatment of amyloidoses |
CA2676049C (en) * | 2007-03-01 | 2018-04-10 | Symphogen A/S | Recombinant anti-epidermal growth factor receptor antibody compositions |
JP5618549B2 (ja) | 2007-03-15 | 2014-11-05 | ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサーリサーチ リミテッド | Egfr抗体及びsrc阻害剤を用いる治療方法及び関連製剤 |
EP2626372B1 (en) * | 2007-03-29 | 2018-03-21 | Genmab A/S | Bispecific antibodies and methods for production thereof |
CA2683370C (en) * | 2007-04-03 | 2022-12-13 | Micromet Ag | Cross-species-specific binding domain |
PL2155788T3 (pl) * | 2007-04-03 | 2013-02-28 | Amgen Res Munich Gmbh | Swoiste międzygatunkowe bispecyficzne czynniki wiążące |
AU2008255350B2 (en) | 2007-05-31 | 2014-07-10 | Genmab A/S | Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals |
WO2008145142A1 (en) | 2007-05-31 | 2008-12-04 | Genmab A/S | Stable igg4 antibodies |
CA2683801A1 (en) * | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Domantis Limited | Polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
US20100322939A1 (en) * | 2007-06-21 | 2010-12-23 | Genmab A/S | Novel methods for treating egfr-associated tumors |
ES2609915T3 (es) | 2007-08-14 | 2017-04-25 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Anticuerpo monoclonal 175 direccionado al receptor de EGF y derivados y usos del mismo |
US20110256142A1 (en) * | 2007-09-06 | 2011-10-20 | Genmab A/S | Novel methods and antibodies for treating cancer |
EP3825329A1 (en) | 2007-12-26 | 2021-05-26 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to fcrn |
JP6014706B2 (ja) * | 2008-02-14 | 2016-10-25 | 株式会社イーベック | hGM−CSFに結合するモノクローナル抗体および前記抗体を含む医薬組成物 |
AU2009234389B2 (en) * | 2008-04-10 | 2014-08-21 | Cell Signaling Technology, Inc. | Compositions and methods for detecting EGFR mutations in cancer |
PT2132228E (pt) | 2008-04-11 | 2011-10-11 | Emergent Product Dev Seattle | Imunoterapia de cd37 e sua combinação com um quimioterápico bifuncional |
CA2722466A1 (en) | 2008-04-29 | 2009-11-05 | Tariq Ghayur | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
US20100260668A1 (en) * | 2008-04-29 | 2010-10-14 | Abbott Laboratories | Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof |
UY31861A (es) * | 2008-06-03 | 2010-01-05 | Abbott Lab | Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma |
EP2297209A4 (en) * | 2008-06-03 | 2012-08-01 | Abbott Lab | IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF |
CN101602808B (zh) * | 2008-06-12 | 2012-06-20 | 上海市肿瘤研究所 | 特异性结合蛋白及其使用 |
WO2010006060A2 (en) | 2008-07-08 | 2010-01-14 | Abbott Laboratories | Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
AU2013202410B2 (en) * | 2008-07-16 | 2014-10-09 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus neautralizing antibodies and use thereof |
RU2540146C2 (ru) | 2008-08-29 | 2015-02-10 | Симфоген А/С | Композиции рекомбинантных антител против рецептора эпидермального фактора роста |
PT2365828E (pt) * | 2008-11-07 | 2014-12-12 | Galaxy Biotech Llc | Anticorpos monoclonais para o receptor 2 do factor de crescimento de fibroblastos |
US20100233079A1 (en) * | 2008-12-04 | 2010-09-16 | Abbott Laboratories | Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof |
BRPI1013688A8 (pt) | 2009-03-05 | 2017-02-14 | Abbott Lab | Proteínas de ligação de il-17. |
GB0905023D0 (en) | 2009-03-24 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Binding molecules |
TW201109438A (en) * | 2009-07-29 | 2011-03-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
NZ598929A (en) | 2009-09-01 | 2014-05-30 | Abbvie Inc | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
AR078161A1 (es) | 2009-09-11 | 2011-10-19 | Hoffmann La Roche | Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento. |
KR101108642B1 (ko) * | 2009-09-29 | 2012-02-09 | 주식회사 녹십자 | 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 |
TW201119676A (en) | 2009-10-15 | 2011-06-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
UY32979A (es) * | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
CN101875696B (zh) * | 2009-11-11 | 2012-02-08 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗体及其制备方法与应用 |
CN101875695B (zh) * | 2009-11-11 | 2012-07-04 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种抗体及其编码基因与应用 |
DK2504363T3 (da) | 2009-11-24 | 2019-07-29 | Alethia Biotherapeutics Inc | Anti-clusterin-antistoffer og antigenbindende fragmenter og deres anvendelse til reducering af tumorvolumen |
US20110189178A1 (en) * | 2010-02-04 | 2011-08-04 | Xencor, Inc. | Immunoprotection of Therapeutic Moieties Using Enhanced Fc Regions |
WO2011123813A2 (en) | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Amunix Operating Inc. | Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same |
MX360403B (es) | 2010-04-15 | 2018-10-31 | Abbvie Inc | Proteinas de union a amiloide beta. |
PT2560993T (pt) | 2010-04-20 | 2024-09-16 | Genmab As | Proteínas contendo anticorpo heterodimérico fc e métodos para a produção das mesmas |
CA2796633C (en) † | 2010-04-23 | 2020-10-27 | Genentech, Inc. | Production of heteromultimeric proteins |
MY161302A (en) | 2010-05-14 | 2017-04-14 | Abbvie Inc | IL-1 binding proteins |
US20120087860A1 (en) * | 2010-05-24 | 2012-04-12 | Marek Malecki | Methods for in vivo cancer detection, diagnosis and therapy using multidomain biotags |
CN107253992B (zh) | 2010-05-27 | 2022-03-11 | 根马布股份公司 | 针对her2的单克隆抗体 |
WO2011156617A2 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-egfr antibodies |
JP6093696B2 (ja) | 2010-06-09 | 2017-03-08 | ゲンマブ エー/エス | ヒトcd38に対する抗体 |
AU2011283694B2 (en) | 2010-07-29 | 2017-04-13 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points |
JP2013537415A (ja) | 2010-08-03 | 2013-10-03 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
EP2603524A1 (en) | 2010-08-14 | 2013-06-19 | AbbVie Inc. | Amyloid-beta binding proteins |
AU2011293253B2 (en) | 2010-08-26 | 2014-12-11 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
KR101273918B1 (ko) * | 2010-09-17 | 2013-06-13 | 강원대학교산학협력단 | 인간 항-상피세포성 성장인자수용체 Fab 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물 |
CN103327978A (zh) * | 2010-10-08 | 2013-09-25 | 总医院公司 | 用表皮生长因子受体抑制剂治疗肝纤维化和前肝硬化的方法 |
EA201390472A1 (ru) | 2010-10-29 | 2014-02-28 | Иммьюноджен, Инк. | Новые молекулы, связывающиеся с egfr, и их иммуноконъюгаты |
AU2011320318B9 (en) * | 2010-10-29 | 2015-11-19 | Immunogen, Inc. | Non-antagonistic EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof |
PE20141060A1 (es) | 2010-12-21 | 2014-09-26 | Abbvie Inc | Inmunoglobulinas de dominio variable dual biespecificas de il-1 alfa y beta y su uso |
MX2013011706A (es) * | 2011-04-07 | 2014-04-25 | Amgen Inc | Proteinas novedosas de enlace a antigeno. |
CN102262155B (zh) * | 2011-04-12 | 2013-10-09 | 百泰生物药业有限公司 | 重组人表皮生长因子生物学活性测定方法及其应用 |
CA2832387A1 (en) | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Genmab A/S | Bispecifc antibodies against her2 |
CA2832389A1 (en) | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Genmab A/S | Bispecific antibodies against her2 and cd3 |
RU2610336C2 (ru) | 2011-04-21 | 2017-02-09 | Сиэтл Дженетикс, Инк. | Новые конъюгаты связывающее соединение - активное соединение (adc) и их применение |
WO2013006706A1 (en) | 2011-07-05 | 2013-01-10 | Bioasis Technologies Inc. | P97-antibody conjugates and methods of use |
UA117901C2 (uk) | 2011-07-06 | 2018-10-25 | Ґенмаб Б.В. | Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування |
US8722019B2 (en) | 2011-08-05 | 2014-05-13 | Bioasis Technologies, Inc. | P97 fragments with transfer activity |
US9273143B2 (en) | 2011-09-30 | 2016-03-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody |
KR20140069331A (ko) | 2011-09-30 | 2014-06-09 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 항-ErbB3 항체 및 이의 용도 |
US10851178B2 (en) | 2011-10-10 | 2020-12-01 | Xencor, Inc. | Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications |
EP3674320A3 (en) | 2011-10-27 | 2020-08-12 | Genmab A/S | Production of heterodimeric proteins |
JP6149042B2 (ja) * | 2011-11-09 | 2017-06-14 | ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション | Her3抗体およびその使用 |
CN104066481A (zh) | 2011-11-21 | 2014-09-24 | 伊缪诺金公司 | 利用egfr抗体细胞毒性剂缀合物治疗抗egfr疗法的肿瘤的方法 |
KR102080535B1 (ko) | 2011-11-23 | 2020-02-24 | 메디뮨 엘엘씨 | Her3에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도 |
KR102024066B1 (ko) * | 2011-11-23 | 2019-09-24 | 비오벤 쓰리 리미티드 | 재조합 단백질 및 그들의 치료적 용도 |
CN103172741B (zh) * | 2011-12-20 | 2018-04-27 | 智翔(上海)医药科技有限公司 | 全人源抗egfr抗体 |
CA2861610A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17 |
JP6209206B2 (ja) * | 2012-03-27 | 2017-10-04 | グリーン・クロス・コーポレイションGreen Cross Corp. | 上皮成長因子受容体の表面抗原上のエピトープおよびその用途 |
AU2013249985B2 (en) | 2012-04-20 | 2017-11-23 | Merus N.V. | Methods and means for the production of Ig-like molecules |
US9944707B2 (en) | 2012-05-17 | 2018-04-17 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Antibodies that bind epidermal growth factor receptor (EGFR) |
US9844582B2 (en) | 2012-05-22 | 2017-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Synergistic tumor treatment with extended-PK IL-2 and therapeutic agents |
DK2859017T3 (da) | 2012-06-08 | 2019-05-13 | Sutro Biopharma Inc | Antistoffer omfattrende stedsspecifikke ikke-naturlige aminosyrerester, fremgangsmåder til fremstilling heraf og fremgangsmåder til anvendelse heraf |
TW201843172A (zh) | 2012-06-25 | 2018-12-16 | 美商再生元醫藥公司 | 抗-egfr抗體及其用途 |
DK2869845T3 (da) * | 2012-07-06 | 2019-12-09 | Genmab Bv | Dimert protein med tredobbelte mutationer |
UY34905A (es) | 2012-07-12 | 2014-01-31 | Abbvie Inc | Proteínas de unión a il-1 |
AU2013296557B2 (en) | 2012-07-31 | 2019-04-18 | Bioasis Technologies Inc. | Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof |
ES2728864T3 (es) | 2012-08-31 | 2019-10-29 | Sutro Biopharma Inc | Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido |
US20150266970A1 (en) * | 2012-10-24 | 2015-09-24 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Combinations of epidermal growth factor receptor targeting antibodies for treating cancer |
NZ707641A (en) | 2012-11-01 | 2016-09-30 | Abbvie Inc | Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
CN102993305B (zh) * | 2012-11-16 | 2015-05-13 | 上海赛伦生物技术有限公司 | 人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用 |
US9695228B2 (en) * | 2012-11-21 | 2017-07-04 | Janssen Biotech, Inc. | EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules |
CA3182876A1 (en) * | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Janssen Biotech, Inc. | Bispecific egfr/c-met antibodies |
WO2014108198A1 (en) | 2013-01-10 | 2014-07-17 | Genmab B.V. | Human igg1 fc region variants and uses thereof |
US10487155B2 (en) | 2013-01-14 | 2019-11-26 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10738132B2 (en) | 2013-01-14 | 2020-08-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US11053316B2 (en) | 2013-01-14 | 2021-07-06 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US9701759B2 (en) | 2013-01-14 | 2017-07-11 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10131710B2 (en) | 2013-01-14 | 2018-11-20 | Xencor, Inc. | Optimized antibody variable regions |
US10968276B2 (en) | 2013-03-12 | 2021-04-06 | Xencor, Inc. | Optimized anti-CD3 variable regions |
US9605084B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-28 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
WO2014113510A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Xencor, Inc. | Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies |
RU2528414C1 (ru) | 2013-01-25 | 2014-09-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Циклический октапептид, радиофармацевтическое средство на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для лечения новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы |
EP2970433B1 (en) | 2013-03-13 | 2019-09-18 | Bioasis Technologies Inc. | Fragments of p97 and uses thereof |
US10519242B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-12-31 | Xencor, Inc. | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins |
TW201512219A (zh) | 2013-03-15 | 2015-04-01 | Abbvie Inc | 針對IL-1β及/或IL-17之雙特異性結合蛋白 |
US10106624B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-10-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
EP3421495A3 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-15 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
US10858417B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-12-08 | Xencor, Inc. | Heterodimeric proteins |
US10993420B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-05-04 | Erasmus University Medical Center | Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals |
WO2014166029A1 (zh) | 2013-04-07 | 2014-10-16 | 永卓博济(上海)生物医药技术有限公司 | 针对表皮生长因子受体的抗体 |
ES2658039T3 (es) | 2013-07-10 | 2018-03-08 | Sutro Biopharma, Inc. | Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso |
US20150093399A1 (en) | 2013-08-28 | 2015-04-02 | Bioasis Technologies, Inc. | Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof |
JP6282745B2 (ja) | 2013-09-12 | 2018-02-21 | ハロザイム インコーポレイテッド | 修飾抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法 |
US11305012B2 (en) | 2013-09-24 | 2022-04-19 | Medimmune, Llc | Binding molecules specific for HER3 and uses thereof |
US9840493B2 (en) | 2013-10-11 | 2017-12-12 | Sutro Biopharma, Inc. | Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use |
CA2934617A1 (en) | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindle protein (ksp) |
EP3102608B1 (en) | 2014-02-03 | 2019-09-18 | Bioasis Technologies Inc. | P97 fusion proteins |
US10392605B2 (en) | 2014-02-19 | 2019-08-27 | Bioasis Technologies Inc. | P97-IDS fusion proteins |
BR112016022385A2 (pt) | 2014-03-28 | 2018-06-19 | Xencor, Inc | anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3 |
US10745490B2 (en) | 2014-04-11 | 2020-08-18 | Celldex Therapeutics, Inc. | Anti-ErbB antibodies and methods of use thereof |
CN106413757B (zh) | 2014-05-01 | 2022-01-14 | 比奥阿赛斯技术有限公司 | p97-多核苷酸结合物 |
CN106471117A (zh) | 2014-05-06 | 2017-03-01 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 使用哺乳动物细胞产生异多聚体蛋白 |
US20170224777A1 (en) | 2014-08-12 | 2017-08-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine |
EP3659625A1 (en) | 2014-10-23 | 2020-06-03 | Innate Pharma | Treatment of cancers using anti-nkg2a agents |
AU2015353416C1 (en) | 2014-11-26 | 2022-01-27 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38 |
CN110894240B (zh) | 2014-11-26 | 2022-04-15 | 森科股份有限公司 | 结合cd3和肿瘤抗原的异二聚体抗体 |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
WO2016094881A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Abbvie Inc. | Lrp-8 binding proteins |
EP3233907B1 (en) | 2014-12-19 | 2021-03-03 | Genmab A/S | Rodent bispecific heterodimeric proteins |
WO2016105450A2 (en) | 2014-12-22 | 2016-06-30 | Xencor, Inc. | Trispecific antibodies |
WO2016141387A1 (en) | 2015-03-05 | 2016-09-09 | Xencor, Inc. | Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions |
WO2016171365A1 (ko) * | 2015-04-23 | 2016-10-27 | 신일제약주식회사 | Egfr에 특이적으로 결합하는 fab단편 |
EP3297672B1 (en) | 2015-05-21 | 2021-09-01 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Trispecific binding proteins and methods of use |
TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗vegf、pdgf及/或其受體之結合蛋白 |
JP6971858B2 (ja) | 2015-06-22 | 2021-11-24 | バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | 酵素開裂性基を有する抗体薬物複合体(adc)および抗体プロドラッグ複合体(apdc) |
JOP20200312A1 (ar) | 2015-06-26 | 2017-06-16 | Novartis Ag | الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام |
WO2017005649A1 (en) | 2015-07-09 | 2017-01-12 | Genmab A/S | Bispecific and multispecific antibodies and method for isolation of such |
TWI744247B (zh) | 2015-08-28 | 2021-11-01 | 美商亞穆尼克斯製藥公司 | 嵌合多肽組合體以及其製備及使用方法 |
EP3352760A4 (en) | 2015-09-21 | 2019-03-06 | Aptevo Research and Development LLC | CD3 BINDING POLYPEPTIDES |
WO2017060322A2 (en) | 2015-10-10 | 2017-04-13 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Ptefb-inhibitor-adc |
WO2017087789A1 (en) * | 2015-11-19 | 2017-05-26 | Revitope Limited | Functional antibody fragment complementation for a two-components system for redirected killing of unwanted cells |
JP7058219B2 (ja) | 2015-12-07 | 2022-04-21 | ゼンコア インコーポレイテッド | Cd3及びpsmaに結合するヘテロ二量体抗体 |
WO2017161206A1 (en) | 2016-03-16 | 2017-09-21 | Halozyme, Inc. | Conjugates containing conditionally active antibodies or antigen-binding fragments thereof, and methods of use |
MX2018011627A (es) | 2016-03-24 | 2019-01-10 | Bayer Pharma AG | Profarmacos de farmacos citotoxicos que tienen grupos enzimaticamente escindibles. |
US11623958B2 (en) | 2016-05-20 | 2023-04-11 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
SG11201810327XA (en) | 2016-05-20 | 2018-12-28 | Harpoon Therapeutics Inc | Single domain serum albumin binding protein |
TW201802121A (zh) | 2016-05-25 | 2018-01-16 | 諾華公司 | 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途 |
CA3026151A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-21 | Xencor, Inc. | Bispecific checkpoint inhibitor antibodies |
CN109310781B (zh) | 2016-06-15 | 2024-06-18 | 拜耳制药股份公司 | 具有ksp抑制剂和抗-cd123-抗体的特异性抗体-药物-缀合物(adc) |
EP3472197A1 (en) | 2016-06-15 | 2019-04-24 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies with engineered ch2 domains, compositions thereof and methods of using the same |
EP3475304B1 (en) | 2016-06-28 | 2022-03-23 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2 |
US10793632B2 (en) | 2016-08-30 | 2020-10-06 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
PE20191034A1 (es) | 2016-10-14 | 2019-08-05 | Xencor Inc | Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15r y fragmentos de anticuerpo pd-1 |
JP7066714B2 (ja) | 2016-12-21 | 2022-05-13 | バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト | 酵素的に切断可能な基を有する抗体薬物コンジュゲート(adc) |
EP3558387B1 (de) | 2016-12-21 | 2021-10-20 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren |
CA3047491A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups |
IL308980A (en) | 2016-12-23 | 2024-01-01 | Novartis Ag | Antibodies against factor XI and methods of their use |
SG11201906961UA (en) | 2017-02-10 | 2019-08-27 | Genmab Bv | Polypeptide variants and uses thereof |
WO2018160754A2 (en) | 2017-02-28 | 2018-09-07 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Inducible monovalent antigen binding protein |
CA3063359A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Mesothelin binding proteins |
WO2018218633A1 (en) | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Beijing Percans Oncology Co. Ltd. | Combination therapies for treating cancers |
AU2018291497A1 (en) | 2017-06-30 | 2020-01-16 | Xencor, Inc. | Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains |
JP7066837B2 (ja) | 2017-10-13 | 2022-05-13 | ハープーン セラピューティクス,インク. | B細胞成熟抗原結合タンパク質 |
US10981992B2 (en) | 2017-11-08 | 2021-04-20 | Xencor, Inc. | Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors |
EP3706793A1 (en) | 2017-11-08 | 2020-09-16 | Xencor, Inc. | Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences |
JP2021506291A (ja) | 2017-12-19 | 2021-02-22 | ゼンコア インコーポレイテッド | 改変されたil−2 fc融合タンパク質 |
CA3096052A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein |
WO2019195959A1 (en) | 2018-04-08 | 2019-10-17 | Cothera Biosciences, Inc. | Combination therapy for cancers with braf mutation |
US11524991B2 (en) | 2018-04-18 | 2022-12-13 | Xencor, Inc. | PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof |
CA3097741A1 (en) | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Xencor, Inc. | Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains |
EP3810649A1 (en) | 2018-06-22 | 2021-04-28 | Genmab A/S | Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies |
WO2020069028A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-02 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Dll3 binding proteins and methods of use |
CN112771071A (zh) | 2018-09-28 | 2021-05-07 | 麻省理工学院 | 胶原蛋白定位的免疫调节分子及其方法 |
SG11202103192RA (en) | 2018-10-03 | 2021-04-29 | Xencor Inc | Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins |
US20220025045A1 (en) | 2018-12-26 | 2022-01-27 | Innate Pharma | Compounds and methods for treatment of head and neck cancer |
US11235032B2 (en) | 2019-01-23 | 2022-02-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Combination immunotherapy dosing regimen for immune checkpoint blockade |
JP2022523946A (ja) | 2019-03-01 | 2022-04-27 | ゼンコア インコーポレイテッド | Enpp3およびcd3に結合するヘテロ二量体抗体 |
JP2022536490A (ja) | 2019-06-10 | 2022-08-17 | ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド | 5H-ピロロ[3,2-d]ピリミジン-2,4-ジアミノ化合物およびその抗体コンジュゲート |
US20210038684A1 (en) | 2019-06-11 | 2021-02-11 | Alkermes Pharma Ireland Limited | Compositions and Methods for Cancer Immunotherapy |
JP2022536800A (ja) | 2019-06-17 | 2022-08-18 | ストロ バイオファーマ インコーポレーテッド | Toll様受容体(tlr)7/8アゴニストとしての1-(4-(アミノメチル)ベンジル)-2-ブチル-2h-ピラゾロ[3,4-c]キノリン-4-アミン誘導体および関連化合物、ならびにがん療法および診断に使用するためのその抗体薬物コンジュゲート |
JP2022538974A (ja) | 2019-06-26 | 2022-09-07 | マサチューセッツ インスチテュート オブ テクノロジー | 免疫調節融合タンパク質-金属水酸化物錯体およびその方法 |
AU2020329881A1 (en) * | 2019-08-09 | 2022-03-24 | A2 Biotherapeutics, Inc. | Cell-surface receptors responsive to loss of heterozygosity |
KR20220110243A (ko) | 2019-12-02 | 2022-08-05 | 셀진 코포레이션 | 암의 치료를 위한 요법 |
EP4114852A1 (en) | 2020-03-03 | 2023-01-11 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use |
AU2021264838A1 (en) | 2020-04-26 | 2022-10-27 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Modified immunoglobulins |
WO2021231976A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3 |
EP3954393A1 (en) | 2020-08-13 | 2022-02-16 | Bioasis Technologies Inc. | Combination therapies for delivery across the blood brain barrier |
EP4100028A4 (en) | 2020-08-20 | 2023-07-26 | A2 Biotherapeutics, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF MESOTHELIN-POSITIVE CANCERS |
AU2021329375A1 (en) | 2020-08-20 | 2023-04-20 | A2 Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating ceacam positive cancers |
WO2022103983A2 (en) | 2020-11-11 | 2022-05-19 | Sutro Biopharma, Inc. | Fluorenylmethyloxycarbonyl and fluorenylmethylaminocarbonyl compounds, protein conjugates thereof, and methods for their use |
AU2022232375A1 (en) | 2021-03-09 | 2023-09-21 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6 |
KR20230154311A (ko) | 2021-03-10 | 2023-11-07 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체 |
TW202308689A (zh) * | 2021-04-21 | 2023-03-01 | 美商健生生物科技公司 | 高濃度的雙特異性抗體調配物 |
KR102415292B1 (ko) | 2022-04-04 | 2022-07-01 | (주)청수 | 고농도 복합 악취 처리시스템 |
US20240091365A1 (en) | 2022-06-27 | 2024-03-21 | Sutro Biopharma, Inc. | Beta-glucuronide linker-payloads, protein conjugates thereof, and methods thereof |
WO2024015229A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Sutro Biopharma, Inc. | Protease/enzyme cleavable linker-payloads and protein conjugates |
US20240165112A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Therapy for the treatment of cancer |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4943533A (en) | 1984-03-01 | 1990-07-24 | The Regents Of The University Of California | Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
US4954617A (en) * | 1986-07-07 | 1990-09-04 | Trustees Of Dartmouth College | Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes |
WO1989006692A1 (en) * | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genentech, Inc. | Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function |
US5470571A (en) * | 1988-01-27 | 1995-11-28 | The Wistar Institute | Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425 |
AU4128089A (en) * | 1988-09-15 | 1990-03-22 | Rorer International (Overseas) Inc. | Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same |
US5705157A (en) * | 1989-07-27 | 1998-01-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of treating cancerous cells with anti-receptor antibodies |
US5459061A (en) * | 1990-01-26 | 1995-10-17 | W. Alton Jones Cell Science Center, Inc. | Hybridomas producing monoclonal antibodies which specifically bind to continuous epitope on the human EGF receptor and compete with EGF for binding to the EGF receptor |
US5218090A (en) * | 1990-06-12 | 1993-06-08 | Warner-Lambert Company | EGF receptor truncates |
US5874299A (en) | 1990-08-29 | 1999-02-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
JPH06509563A (ja) * | 1991-07-05 | 1994-10-27 | セラゲン・インコーポレイテッド | 炎症性関節炎の治療用の表皮細胞成長因子受容体を標的とする分子 |
DE69327620T2 (de) * | 1992-08-18 | 2000-08-03 | Centro De Immunologia Molecular, Ciudad De La Habana | Monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor, Zellen und Verfahren zur ihrer Herstellung und sie erhaltende Zusammensetzungen |
DE4337197C1 (de) | 1993-10-30 | 1994-08-25 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore |
IT1271461B (it) * | 1993-12-01 | 1997-05-28 | Menarini Ricerche Sud Spa | Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso. |
GB9401182D0 (en) | 1994-01-21 | 1994-03-16 | Inst Of Cancer The Research | Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect |
DE69529649T2 (de) * | 1994-03-17 | 2003-12-18 | Merck Patent Gmbh | Anti-egfr einkettige fvs und anti-egfr antikoerper |
ATE208633T1 (de) | 1994-09-16 | 2001-11-15 | Merck Patent Gmbh | Immunokonjugate |
US6538114B1 (en) * | 1996-04-19 | 2003-03-25 | Karolina Innovations Ab | Human monoclonal antibodies specific for hepatitis C virus (HCV) E2 antigen |
US5708156A (en) * | 1996-05-31 | 1998-01-13 | Ilekis; John V. | Epidermal growth factor receptor-like gene product and its uses |
US6235883B1 (en) * | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
PT1140175E (pt) * | 1998-12-21 | 2006-06-30 | Ludwig Inst Cancer Res | Anticorpos para o vegf-d truncado e suas utilizacoes |
DE60037896D1 (de) * | 1999-07-29 | 2008-03-13 | Medarex Inc | Menschliche antikörper gegen her2/neu |
US6794132B2 (en) | 1999-10-02 | 2004-09-21 | Biosite, Inc. | Human antibodies |
US6680209B1 (en) * | 1999-12-06 | 2004-01-20 | Biosite, Incorporated | Human antibodies as diagnostic reagents |
EP1272647B1 (en) * | 2000-04-11 | 2014-11-12 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
KR100480985B1 (ko) | 2000-05-19 | 2005-04-07 | 이수화학 주식회사 | 표피 성장 인자 수용체에 대한 사람화된 항체 |
EP1170011A1 (en) | 2000-07-06 | 2002-01-09 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Novel use of inhibitors of the epidermal growth factor receptor |
AU9500201A (en) | 2000-08-09 | 2002-02-18 | Imclone Systems Inc | Treatment of hyperproliferative diseases with epidermal growth factor receptor antagonists |
-
2002
- 2002-06-13 CN CNA2006101484159A patent/CN1966525A/zh active Pending
- 2002-06-13 EP EP02744320.9A patent/EP1417232B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-13 MX MXPA03011365A patent/MXPA03011365A/es active IP Right Grant
- 2002-06-13 CN CNB02815939XA patent/CN100497389C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-13 WO PCT/US2002/018748 patent/WO2002100348A2/en active Application Filing
- 2002-06-13 CZ CZ200438A patent/CZ200438A3/cs unknown
- 2002-06-13 BR BR0210405-9 patent/BRPI0210405B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-06-13 AU AU2002345673A patent/AU2002345673B2/en not_active Expired
- 2002-06-13 KR KR1020097022335A patent/KR20090125840A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-06-13 IL IL15922502A patent/IL159225A0/xx unknown
- 2002-06-13 CA CA2450285A patent/CA2450285C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-13 KR KR1020037016294A patent/KR100945108B1/ko active IP Right Grant
- 2002-06-13 US US10/172,317 patent/US7247301B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-13 JP JP2003503174A patent/JP4298498B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-13 HU HU0600225A patent/HUP0600225A3/hu unknown
- 2002-06-13 NZ NZ530212A patent/NZ530212A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-13 RU RU2004100834/13A patent/RU2335507C2/ru not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-12-07 IL IL159225A patent/IL159225A/en active IP Right Revival
-
2004
- 2004-10-06 HK HK04107653.9A patent/HK1064685A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-02-18 JP JP2009035895A patent/JP2009148282A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MXPA03011365A (es) | 2005-03-07 |
BRPI0210405B1 (pt) | 2018-11-27 |
BR0210405A (pt) | 2005-04-19 |
BRPI0210405B8 (pt) | 2021-05-25 |
KR20090125840A (ko) | 2009-12-07 |
HUP0600225A2 (hu) | 2006-06-28 |
RU2335507C2 (ru) | 2008-10-10 |
US7247301B2 (en) | 2007-07-24 |
HK1064685A1 (en) | 2005-02-04 |
JP4298498B2 (ja) | 2009-07-22 |
JP2005501529A (ja) | 2005-01-20 |
CA2450285A1 (en) | 2002-12-19 |
RU2004100834A (ru) | 2005-03-27 |
NZ530212A (en) | 2006-09-29 |
EP1417232A2 (en) | 2004-05-12 |
IL159225A (en) | 2009-09-01 |
IL159225A0 (en) | 2004-06-01 |
JP2009148282A (ja) | 2009-07-09 |
KR100945108B1 (ko) | 2010-03-02 |
CN1610695A (zh) | 2005-04-27 |
CN1966525A (zh) | 2007-05-23 |
CN100497389C (zh) | 2009-06-10 |
EP1417232B1 (en) | 2014-12-03 |
HUP0600225A3 (en) | 2010-01-28 |
WO2002100348A8 (en) | 2003-04-10 |
EP1417232A4 (en) | 2005-04-27 |
CA2450285C (en) | 2016-08-02 |
WO2002100348A3 (en) | 2003-02-27 |
US20030091561A1 (en) | 2003-05-15 |
AU2002345673B2 (en) | 2007-04-26 |
KR20040016883A (ko) | 2004-02-25 |
WO2002100348A2 (en) | 2002-12-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2002345673B2 (en) | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR) | |
US9458236B2 (en) | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR) | |
EP1210372B1 (en) | Human monoclonal antibodies to her2/neu | |
JP4562395B2 (ja) | Cd30に対するヒトモノクローナル抗体 | |
AU2003205055B8 (en) | Human monoclonal antibodies against CD30 | |
AU2002345673A1 (en) | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR) | |
JP2005518789A (ja) | 前立腺特異性膜抗原(psma)に対するヒトモノクローナル抗体 | |
JP2010004888A (ja) | Fcα受容体(CD89)に対するヒトモノクローナル抗体 | |
JP2003508029A (ja) | 前立腺特異性膜抗原に対するヒトモノクローナル抗体 | |
AU2006201671A1 (en) | Human monoclonal antibodies to HER2/neu |