CN103172741B

CN103172741B - 全人源抗egfr抗体

Info

Publication number: CN103172741B
Application number: CN201110430381.3A
Authority: CN
Inventors: 刘颉; 张卓兵; 单继宽; 索伟
Original assignee: YONGZHUO BOJI (SHANGHAI) BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Netstar (shanghai) Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Bioex Therapeutics Inc
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2031-12-20
Also published as: CN103172741A

Abstract

本发明涉及全人源抗体，其包含经改造的重链和轻链。具体而言，本发明所述的全人源抗体为经改造的全人源单克隆抗体，具体为针对已经上市的全人源抗体帕尼单抗，利用抗体工程技术平台，改变抗体亚型，形成全新序列的抗EGFR全人源抗体分子，从而提高抗体ADCC及抗肿瘤活力。本发明还涉及制备所述全人源抗体的方法以及所述抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

Description

全人源抗EGFR抗体

技术领域

本发明涉及全人源抗体，其包含经改造的重链和轻链。具体而言，本发明所述的全人源抗体为经改造的全人源单克隆抗体，具体为针对已经上市的全人源抗体帕尼单抗，利用抗体工程技术平台，改变抗体亚型，形成全新序列的抗 EGFR全人源抗体分子，从而提高抗体ADCC及抗肿瘤活力。本发明还涉及制备所述全人源抗体的方法以及所述抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR，HER1，c- ErbB1)是由1186个氨基酸残基构成，分子量为170kD的一种跨膜糖蛋白。 EGFR分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分(Jorissen RN，Walker F，Pouliot N，等人，Epidermal growth factorreceptor：mechanisms of activation and signaling. Exp Cell Res，2003；284：31-53)。EGFR属于I型酪氨酸激酶受体亚族(ErbB 1-4)，具有酪氨酸激酶的活性。EGFR稳定的表达于许多上皮组织，以及间质和神经源性组织。不同器官发生的实体瘤也高表达EGFR，如头颈部癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌等(Mendelsohn J，Baselga J.Status ofepidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment ofcancer.J Clin Oncol， 2003；21：2787-2799)。转化生长因子α(transforming growthfactorα，TGFα) 和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等生长因子是EGFR的配体。这些配体与EGFR的结合导致EGFR二聚化，激活了受体胞内酪氨酸蛋白激酶的活性，使C末端特异的酪氨酸残基磷酸化，为细胞内信号转导因子提供结合位点，由此启动Shc，Grb2，Ras/MAPK，PI3K及JAKs/STATs等多条信号转导途径(Mendelsohn J，Baselga J.Status ofepidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment ofcancer.J Clin Oncol，2003； 21：2787-2799；以及Olayioye MA，Neve RM，Lane HA，等人.The EerbB Signaling network：receptor heterodimerzation in development andcancer.The EMBO J，2000； 19：3159-3167)。EGFR通过介导这些通路调节正常细胞的生长和分化，增加肿瘤细胞的侵袭力、促进血管生成、抑制肿瘤细胞的凋亡(Castillo L，Etienne-Grimaldi MC，Fischel JL，et al.Pharmacological background of EGFRtargeting.Ann Oncol，2004；15：1007-1012)。EGFR在肿瘤中的高度表达及其在肿瘤细胞生长、分化中起着重要作用的这些特点，使EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断和治疗的靶点。

近年来有越来越多证据表明表皮生长因子受体(epithelial growth factorreceptor，EGFR)与许多肿瘤的发生和发展有关。在各种实体肿瘤中EGFR表达率最高的是头颈部肿瘤，达95％-100％。结直肠癌则为第2位，表达率高达 72％-89％。EGFR表达阳性的肿瘤具有恶性度高、侵袭力强的特点，而且EGFR 表达水平的高低与预后相关。因而同样成为当前肿瘤分子靶向治疗的一个重要靶点。有依据证实HER1/EGFR在实体肿瘤中表达异常，其临床体现为转移，生存期缩短，预后差，对化疗及激素治疗耐受。阻断HER1/EGFR后能抑制肿瘤的形成，同时改善上述状况。

目前用于EGFR靶向性治疗肿瘤的药物主要分为两类：EGFR单克隆抗体和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂。酪氨酸激酶拮抗剂主要为小分子喹啉类化合物，能够竞争性抑制ATP与EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基磷酸化，抑制EGFR下游的信号转导。

EGFR单克隆抗体是与内源性配体竞争结合EGFR，通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作用产生抗肿瘤效应。目前国内外已有3种抗 EGFR单克隆抗体上市，与其他化疗药相比，这些抗体作用特异性强，副作用小，在临床上取得了较好的疗效。EGFR是抗体药物开发的成熟靶点，作为抗肿瘤抗体药物开发的三个最大的成熟靶点(HER2，EGFR，VEGF)之一， EGFR靶点相关的靶向治疗药物包括抗体药物在肿瘤治疗中地位非常重要。由于目前已经上市的抗EGFR抗体药物的局限性，研究开发高效低毒的新型抗 EGFR抗体药物一直是国际医药界研究的热点。

体外分析和动物体内试验表明，EGFR单克隆抗体爱必妥(cetuximab) 一方面与EGFR结合阻断磷酸化，抑制配体激活EGFR的酪氨酸激酶活性，并促进EGFR的内吞和降解，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡；另一方面，爱必妥(cetuximab)通过招募自然杀伤(NK)等细胞至肿瘤表面，进一步通过细胞毒作用抑制肿瘤细胞生长(Bleeker WK，Lammerts vanBueren JJ，van Ojik HH，Gerritsen AF，Pluyter M，Houtkamp M，Halk E，Goldstein J，Schuurman J，van Dijk MA，van de Winkel JG，Parren PW.Dual mode of action of ahuman anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for cancertherapy.J Immunol.2004；173：4699-707.)。

通过对抗体药物分子及其在疾病治疗过程中作用机制研究结果的总结，可以发现，各种抗EGFR单克隆抗体在体内发挥治疗作用不但与其与EGFR的亲和力相关，同时还与ADCC活性相关。实验证据表明，与IgG2相比，IgG1ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)等生物学活性明显更强(Patel D，Guo X， Ng S，Melchior M，Balderes P，Burtrum D，Persaud K，Luna X，Ludwig DL， Kang X.IgG isotype，glycosylation，and EGFRexpression determine the induction of antibody-dependent cellularcytotoxicity in Vitro by cetuximab. Hum Antibodies.2010；19：89-99)。

目前，治疗性单克隆抗体随着技术的发展分成约70％人源序列的嵌合抗体、 90-94％人源序列的人源化抗体，以及100％人源序列的全人源抗体三个种类。人源序列比例的多少意味抗体用于人体治疗时潜在产生免疫原性可能性的高低，所以，全人源抗体产生免疫原性的可能性低于嵌合抗体，用作治疗性药物时全人源抗体优于嵌合和人源化抗体。

ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用)是指表达IgG-Fc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀伤这些靶细胞的作用。IgG抗体可介导这些细胞发挥ADCC作用，其中NK细胞是能发挥ADCC作用的主要细胞。在抗体介导的ADCC作用的发生过程中，抗体只能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，而NK细胞等效应细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，故抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，NK细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。

已经上市的几种抗EGFR单克隆抗体药物都有一定的局限性，爱必妥为人鼠嵌合IgG1抗体，其有免疫原性，容易产生人抗鼠抗体反应，进而产生副作用，降低药效；帕尼单抗为全人源IgG2亚型抗体，缺乏ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)相关的生物学活性，只能依靠阻断EGFR信号通路来抑制肿瘤生长，缺乏另一种ADCC的肿瘤抑制作用机制，相比爱必妥的两种机制，抗肿瘤效应减弱。

帕尼单抗是IgG2亚型抗体，而爱必妥是IgG1亚型抗体，研究数据表明爱必妥有更强的ADCC活力。在不改变抗体三维立体结构的基础上，可以通过抗体工程技术，针对IgG2抗体铰链区进行氨基酸替换，可以将IgG2 抗体改变成为IgG1亚型(Z Steplewski，L K Sun，CW Shearman，J Ghrayeb，P Daddona，and H Koprowski.Biological activity of human-mouse IgG1，IgG2， IgG3，and IgG4 chimeric monoclonal antibodies with antitumorspecificity. PNAS 1988；85：4852-4856)。

本发明针对已经上市的全人源抗体帕尼单抗，利用抗体工程技术平台，改变抗体亚型，由IgG2亚型改变成为IgG1亚型，形成全新序列的抗EGFR全人源抗体分子，该抗体分子具有与帕尼单抗相同的靶点结合特性，同时由于抗体亚型不同，该抗体分子有更强的ADCC生物学活性，与帕尼单抗相比抗肿瘤作用更强。此外，由于该抗体为完全人源的抗体分子，其免疫原性低于嵌合抗体爱必妥，潜在的临床应用副作用更低。

发明内容

针对现有上市EGFR抗体的优缺点，基于抗体工程和抗体结构理论知识，本发明提供一种新的全人源EGFR抗体，一方面减少嵌合抗体的免疫原性副作用，另一方面通过改变IgG抗体的亚型，提高抗体的抑制肿瘤效应。

为了保持全人源抗体低免疫原性、以及已证明的抑制EGFR信号通路的优点，本发明选择通过对全人源EGFR抗体帕尼单抗进行结构改造，提高ADCC 活力，进一步优化帕尼单抗的抗肿瘤疗效。

本发明提供了以下方案：

1.一种改造的全人源抗体及其片段，其包含如SEQ ID No.：1或SEQ ID No.：2所示的重链序列。

2.改造的全人源抗体及其片段，其含如SEQ ID No.：1或SEQ ID No.：2所示的重链序列以及SEQ ID No.：3或SEQ ID No.：4所示的轻链序列。

3.在本发明的一个实施方式中，提供了一种全人源抗体，其包含如SEQ ID No.：1所示的重链序列和SEQ ID No.：3所示的轻链序列。

4.在本发明的另一实施方式中，提供了一种全人源抗体，其包含如SEQ ID No.：2所示的重链序列和SEQ ID No.：4所示的轻链序列。

5.在本发明的另一实施方式中，提供了一种DNA分子，它编码如上方案 1-4所述的全人源抗体。

6.在本发明的另一实施方式中，提供了一种用于哺乳细胞转录表达的表达载体，其为病毒的或非病毒的，并含有上述方案5所述的序列的DNA分子。

7.在本发明的另一实施方式中，提供了一种宿主细胞，它含有上述方案 6中所述的载体。

8.本发明还提供了本发明的全人源抗体在制备用于提高全人源抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活力的药物中的用途。

9.在本发明的另一实施方式中，提供了一种提高全人源抗体ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活力的方法，其特征在于采用上述方案1-4 中任一项所述的全人源抗体序列。10.在本发明的另一实施方式中，提供了上述方案1-4任一项所述的全人源抗体，其用于提高全人源抗体ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活力。

在本发明的又一实施方式中，提供了一种组合物，所述的组合物含有：

(i)如上所述的本发明的全人源抗体；和/或

(ii)药学上可接受的载体。

本发明还提供了本发明所述的全人源抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了制备本发明所述全人源抗体的方法，其包括如下步骤：

1)根据SEQ ID No.：1-4的抗体序列，设计应的DNA序列；

2)合成DNA序列，可以通过分成几个片断合成后再连接成完整片断，或采用不同的引物，通过PCR方法合成；

3)将合成的抗体DNA片段克隆至表达质粒中；

4)转染至宿主细胞；

5)培养转染后的宿主细胞，获得细胞培养上清，纯化获得目的抗体。

附图说明

图1所示为确定重链和轻链可变区序列的PCR产物结果。

图2所示为SDS-PAGE凝胶确定所述抗体的蛋白电泳图。

图3所示为ELISA测定永卓EGFR抗体与EGFR-Fc结合的示意图。其结果表明永卓EGFR抗体1和2都与帕尼单抗(SY-puni)一样，有一致的EGFR 直接结合活力。说明永卓EGFR抗体1和2识别EGFR且亲和力与帕尼单抗相似。

图4所示为ADCC活力测定示意图。其结果表明永卓EGFR抗体1和2都与爱必妥(cetuximab)有相似的ADCC活力，都显著高于帕尼单抗。

图5所示为EGFR抗体对EGFR下游磷酸化的抑制作用的示意图，本实验通过WesternBlot的方法检测总(Total)EGFR和磷酸化后EGFR。下图Total EGFR显示总EGFR含量，包括磷酸化和磷酸后EGFR。上图pEGFR显示磷酸化后的EGFR含量。泳道1：为分子量标记；2：PBS加EGF；3：PBS未加EGF(2，3为PBS阴性对照)；4：爱必妥(erbitux)未加EGF；5：爱必妥加EGF；6：加永卓EGFR抗体1；7：加永卓EGFR抗体2；8：加帕尼单抗 (SY-puni)。结果说明总EGFR不变的情况下(下图)，永卓EGFR抗体1 和2、爱必妥(erbitux)及帕尼单抗(SY-puni)都能够显著抑制EGFR下游磷酸化，从而阻止信号途径，进一步证明永卓EGFR抗体1和2具有EGFR 结合、抑制下游信号通路以及潜在的肿瘤细胞抑制作用。总抗体的阳性对照和PBS的阴性对照说明本实验的有效性。

具体实施方式

提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。

实施例1：YZ-EGFR V1和YZ-EGFR V2抗体序列的设计和表达

本发明可采用本领域普通技术人员熟知的基因工程的方法制备目的全人源抗体，本实施例中仅描述采用通过293-F细胞瞬时表达、获得分析检定用抗体样品的方法，然而，本领域技术人员将理解，也可以通过细菌、酵母、病毒和其它真核细胞表达系统来制备目的抗体，其中最优化的的制备系统是采用中华卵巢仓鼠细胞(CHO)稳定细胞系，来制备、生产本全人源抗体。

1.以下为帕尼单抗的重链可变区的序列(SEQ ID No：5)，下划线部分为框架序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDR VTGAFDIWGQGTMVTVSS

以下为IgG2的重链恒定区序列(SEQ ID No：7)：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

以下为IgG1的重链恒定区序列(SEQ ID No：8)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

将其原有的重链IgG2恒定区序列改换成IgG1恒定区序列，形成YZ-EGFR v1重链序列(SEQ ID No：1)。

将其原有的重链可变区的未优化框架序列改换成优化框架序列(SEQ ID No：6)，

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGSVSSGDYYWTWIRQAPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRDRVTGAFDIWGQGTLVTVSS

再与重链IgG1序列结合，形成YZ-EGFR v2重链序列(SEQ ID No：2)。

2.以下为帕尼单抗的轻链可变区的序列(SEQ ID No：9)，下划线部分为框架序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLA FGGGTKVEIK

以下为轻链恒定区CL(k)序列(SEQ ID No：11)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC

将其与轻链恒定区CL(k)序列结合，即形成YZ-EGFR v1轻链序列(SEQ ID No：3)。

将其原有的轻链可变区的未优化框架序列改换成优化框架序列(SEQ ID No：10)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQHFDHLPLAFGQGT KVEIK

将其与轻链恒定区CL(k)序列结合，即形成YZ-EGFR v2的轻链序列(SEQ ID No：4)。

3.抗EGFR抗体YZ-EGFR V1和YZ-EGFR V2的制备

本实施例描述采用通过293-F细胞瞬时表达、获得分析检定用抗体样品的方法，也可以通过细菌、酵母、病毒和其它真核细胞表达系统来制备目的抗体，其中最优化的的制备系统是采用中华卵巢仓鼠细胞(CHO)稳定细胞系，来制备、生产本全人源抗体。

根据抗体YZ-EGFR V1和YZ-EGFR V2重链可变区序列和轻链可变区序列，设计并合成编码重链和轻链可变区序列的PCR引物寡核苷酸片段。相邻寡核苷酸片段约有18个碱基重叠，PCR引物寡核苷酸片段一般长约54个碱基。混合同等量的各个PCR引物片段，进行重叠延伸PCR反应。

引物片段的核酸序列：

每个抗体序列有8个(4对)引物序列，每对引物序列用来制备YZ-EGFR V1和YZ-EGFR V2抗体的VH和VL小外显子(mini-exon)。

YZ-EGFR V1重链(V1-HC)：

引物A5’：

CAGGTGCAGTTGCAGGAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCCTCCG AGACGTTG

引物B5’：

GCGGCGACTACTACTGGACGTGGATCAGGCAAAGCCCCGGCAA GGGCCTGGAGTGG

引物C5’：

TACAACCCCAGCCTGAAATCCAGGTTGACCATCTCCATCGACAC GAGCAAGACGCAGT

引物D5’：

ACACCGCCATCTATTACTGCGTGAGGGACAGGGTGACAGGCGCCTT CGACATCTGCT

引物A3’：

TGGATACGCTGCCGCCGCTCACGGTACAGGTCAGGCTCAACGTCTCG GAGGGCT

引物B3’：

GTTCGTGTTGCCTGAGTAATAGATGTGGCCGATCCACTCCAGGC CCTTGCCGGGG

引物C3’：

AGTCACGCTGGACAGTTTCAGGCTGAACTGCGTCTTGCTCGTGT CGATGGAGATG

引物D3’：

GCTGGACACGGTCACCATCGTTCCCTGGCCCAGCAGATGTCGAA GGCGCCTGTCA

YZ-EGFR V2重链(V2-HC)：

引物A5’：

GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAG GCTCCCTGA

引物B5’：

TGGCGATTACTATTGGACCTGGATCAGGCAGGCTCCAGGGAAGGGC CTGGAGTG

引物C5’：

TATAACCCCTCCCTCAAGAGCAGACTGACCATCTCCAGAGACAACA GCAAGAAC

引物D5’：

ACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAGATCGAGTGACTGGTGCTTTT GACATCT

引物A3’：

CTGCTGACGGAGCCTCCAGAGGCAGCACAGGAGAGTCTCAGGG AGCCTCCAGGC

引物B3’：

GTGTTCCCACTGTAATAGATGTGGCCGATCCACTCCAGGCCCTT CCCTGGAGCC

引物C3’：

CCTCGGCTCCAGGCTGTTCATTTGCAAATACAGGGTGTTCTTGC TGTTGTCTC

引物D3’：

TGAGGAGACCGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGATGTCAAAA GCACCAGTCAC

YZ-EGFR V1轻链(V1-LC)：

引物A5’：

GACATCCAGATGACTCAGAGCCCCAGTTCCCTGAGCGCCTCTGTGGG AGACCGG

引物B5’：

TACTTGAACTGGTATCAACAGAAGCCTGGAAAGGCCCCAAAGCTCC TGATCTAC

引物C5’：

AGGTTCAGCGGGTCCGGAAGCGGCACCGACTTCACGTTCACCAT CAGCTCCCTG

引物D5’：

ATCACTTGCCCCTGGCATTCGGAGGCGGCACAAAGGTGGAGAT TAAG

引物A3’：

GTTGGAAATGTCCTGGCTTGCCTGGCACGTAATGGTCACCCGGT CTCCCACAG

引物B3’：

GCTAGGCACGCCCGTCTCCAGGTTGGAAGCGTCGTAGATCAGG AGCTTTGGGG

引物C3’：

CGAAGTGCTGGCAAAAATACGTGGCGATGTCCTCAGGTTGCAG GGAGCTGATG

引物D3’：

AGTGATCTTAATCTCCACCTTTGTGCCGCCTCCGAATGCCAGGG GCAAGTGAT

YZ-EGFR V2轻链(V2-LC)：

引物A5’：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGG AGACAGA

引物B5’：

TACTTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCC TGATCTAT

引物C5’：

GGTTCAGTGGCAGCGGAAGTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGCTTGC

引物D5’：

ACCATCTCCCGCTCGCTTTCGGACAAGGAACGAAGGTGGAAAT CAAA

引物A3’：

GTTGCTGATGTCCTGGCTCGCCTGGCAAGTGATGGTGACTCTGT CTCCTACAG

引物B3’：

TGATGGCACCCCTGTTTCCAAATTGGAGGCATCATAGATVAGGA GCTTAGGGG

引物C3’：

CAAAGTGTTGACAGAAGTAGGTTGCAAAATCTTVAGGCTGCAA GVTGCTGATG

引物D3’：

TTTGATTTCCACCTTCGTTCCTTCGTTCCTTGTCCGAAAGCGAGC GGGAGATGGT

PCR反应体系：dNTPs 0.2μM(最终浓度)；每个PCR引物片段1μl；10×缓冲液3μl；克隆的pfu(Invitrogen)1μl；加水至30μl。

PCR反应条件：94℃预变性3分钟后，设定94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后72℃再延伸10分钟。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段，经EcoRI酶切后，克隆到pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)载体中，转化到大肠杆菌TOPO10 (Invitrogen)后在LB/Kanamycin平板上进行筛选，取10个白色菌斑接种于含有Kanamycin的LB液体培养液中培养，用QIAGEN质粒提取试剂盒(QIAquick PCR purification kit)提取质粒并进行测序，确定重链和轻链可变区序列。PCR 产物见图1。

3.构建表达载体

从正常人B细胞分离RNA，用PCR方法获得人IgG1重链恒定区Fc片段和轻链恒定区κ片段，并将其预先构建到pcDNA3.1(Invitrogen)表达载体中，经DH5α细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。YZ-EGFR V1和YZ-EGFR V2的重链可变区由Eco47III/NheI(来自Invitrogen)从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-Fc表达载体中。YZ-EGFR V1和YZ-EGFR V2的轻链可变区由AscI/BsiWI(来自Invitrogen)从pCR-BluntII-TOPO的阳性克隆切下，克隆连入pcDNA3.1-κ表达载体中。再次经过DH5α细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。测序结果与记录的抗体的编码序列一致。

4.抗体表达

为表达重组YZ-EGFR V1和YZ-EGFR V2，分别将YZ-EGFR V1和 YZ-EGFR V2轻链和重链质粒共转染至293-F细胞(293fectin，购自Invitrogen 公司)中，采用FreeStyle^TM293Expression培养基(购自Invitrogen公司)、100 ml培养瓶培养转染后的细胞5天，离心、0.22um膜过滤后收集培养上清，采用Protein A柱(5ml MabSelect预装柱，购自GEBiosciences公司)纯化，具体步骤如下：用10个柱体积(10CV)平衡缓冲(20mM磷酸缓冲，150mM NaCl，pH7.0)后，2ml/分钟的流速将过滤后上清上柱，采用平衡缓冲(20mM 磷酸缓冲，150mM NaCl，pH7.0)冲洗10个柱体积(10CV)后，用洗脱缓冲 (10mM柠檬酸钠，pH3.5)洗脱5个柱体积，将洗脱的抗体采用1M TrisHCl， pH8.0中和pH至6.5，然后透析纯化后的抗体至PBS中，用紫外法(280nm波长)测定抗体浓度，SDS-PAGE法(图2)测定抗体纯度。收集细胞培养上清分两次Protein A纯化完成，透析至PBS的纯化后抗体经0.22um膜过滤，用于各项研究工作。

实施例2：ELISA检测对EGFR的结合

材料：

永卓EGFR抗体-1(YZ-EGFR V1)；永卓EGFR抗体-2(YZ-EGFR V2)；帕尼单抗(SY-puni，来自Amgen公司)；EGFR-Fc(来自Thermo Fisher公司)

方法：使用直接法ELISA按如下步骤测定

1、用1μg/ml EGFR-Fc包被ELISA板，50μl/孔，4口过夜(约16小时)。

2、用含1％BSA的TBS封闭ELISA板上的非特异性位点，37℃，1 小时。

3、除去ELISA板水分，用2x TBST洗脱缓冲液洗涤。

4、用1％BSA/TBS溶液封闭一个转移盘，200μl/孔，37℃，1小时。

5、以3μg/ml的初始浓度开始，在1％BSA/TBS预封闭的转移盘里准备一系列以1∶3稀释的抗体测试实验。每个抗体准备8个浓度梯度，终体积180μl/孔。

6、在包被了EGFR-Fc的ELISA板(见1-3步)中加不同浓度(按第 5步方法加)抗体，50μl/孔，37℃孵育1小时，重复测定样品一次。

7、去除ELISA板水分，用4xTBST洗涤。

8、用1％BSA/TBS 1∶1000稀释驴抗人IgG-AP二抗，50μl/孔，37℃孵育1小时。

9、使ELISA板干燥后，用5xTBST洗涤。

10、加50μl/孔含0.1％PNPP底物的PNPP缓冲液，37℃孵育15分钟。加入50μl/孔的在PNPP缓冲液中的0.1％PNPP底物。在37℃孵育15分钟。

11、加50ul/孔1N氢氧化钠终止反应。

12、在ELISA酶标仪上405nm处读取吸光度。

13、记录并分析数据。

此测定结果见图3。图3表明永卓EGFR抗体1和2都与帕尼单抗(SY-puni) 一样，有一致的EGFR直接结合活力，说明永卓EGFR抗体1和2识别EGFR 且亲和力与帕尼单抗相似。

实施例3：体外抗EGFR抗体的ADCC反应

材料：

永卓EGFR抗体-1(YZ-EGFR V1)；永卓EGFR抗体-2(YZ-EGFR V2)；帕尼单抗(SY-puni，来自Amgen公司)；爱必妥(cetuximab，来自Imclone 公司；钙黄绿素-AM(Invitrogen公司)；圆底96孔盘(BD科学)，外周血单核细胞(PBMC)购自AllCells公司(健康捐赠者)。

方法：按如下步骤利用钙黄绿素-AM释放法测定ADCC

1.用钙黄绿素-AM标记A431(人表皮癌细胞)细胞(15μM/10⁶细胞)，洗涤，在圆底96孔盘里加5x10³细胞/孔，一式三份。

2.加抗EGFR抗体(0.1和1μg/ml)，与标记过的A431在4℃预共孵育30分钟。

3.第2步后，加从健康捐献来源的PBMC效应细胞，最终效应为：在 200ul/孔的终体积中，靶标细胞(标记的A431)与效应细胞(PBMC)比率为40∶1。

4.特异性裂解率＝(AFU平均实验释放-AFU平均自发释放)/(AFU 平均最大释放-AFU平均自发释放)。

此测定结果见图4。图4结果表明永卓EGFR抗体1和2都与爱必妥 (cetuximab)有相似的ADCC活力，且都显著高于帕尼单抗。

实施例4：EGFR的磷酸化

材料：

永卓EGFR抗体-1(YZ-EGFR V1)；永卓EGFR抗体-2(YZ-EGFR V2)；帕尼单抗(SY-puni，来自Amgen公司)；爱必妥(erbitux，cetuximab，来自Imclone 公司)；A431细胞(ATCC号：CRL-2592^TM)；重组人表皮生长因子(来自 R&D公司)；细胞裂解缓冲液(10X)(来自CellSignalling)；BCA试剂盒(来自Pierce)；抗-pEGFR(pY1068)和泛抗EGFR(来自CST公司)。

方法，步骤如下：

1.每块6孔板接种5x10⁵个A431细胞，用完全培养基培养过夜 (DMEM+10％FBS)。

2.换用2ml DMEM中培养，使细胞缺乏营养16-18小时。以2ml DMEM使细胞饥饿16-18小时。

3.再换用1ml预热新鲜的培养基(不含10％FBS)培养，孵化器中孵育1-2小时。

4.在用重组EGF(表皮生长因子)刺激前30分钟，加10μg/ml抗EGFR 抗体(终浓度)到A431细胞。

5.用溶解于PBS+0.01％BSA的终浓度为0.5ng/ml的EGF刺激细胞 5分钟。

6.把盘放在冰上，用预冷的1xPBS洗3遍。

7.加250μl裂解液裂解后直接刮下来，涡旋或在冰上孵育30分钟。

8.离心，14000rpm，4℃，15分钟。

9.蛋白定量，用BCA试剂盒。

10.用合适体积的荷载缓冲液(loading buffr)调整每个蛋白裂解液的体积，煮5分钟。

11.倒10孔的凝胶做Westem Blot，每个孔载入20微克裂解液。

本实验通过Westem Blot的方法检测总(Total)EGFR和磷酸化后EGFR。图5中下图Total EGFR显示总EGFR含量，包括磷酸化和磷酸后EGFR。上图 pEGFR显示磷酸化后的EGFR含量。

图5说明总EGFR不变的情况下(下图)，永卓EGFR抗体1和2、爱必妥(erbitux)及帕尼单抗(SY-puni)都能够显著抑制EGFR下游磷酸化，从而阻止信号途径，进一步证明永卓EGFR抗体1和2具有EGFR结合、抑制下游信号通路以及潜在的肿瘤细胞抑制作用。总抗体的阳性对照和PBS的阴性对照说明本实验的有效性。

本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。

Claims

1.全人源抗体，其由如SEQ ID No:2所示的重链序列和SEQ ID No:4所示的轻链序列组成。

2.DNA分子，其编码如权利要求1所述的全人源抗体。

3.用于哺乳细胞转录表达的表达载体，其为病毒的或非病毒的，并含有编码权利要求1所述的全人源抗体的DNA分子。

4.宿主细胞，其含有如权利要求3所述的表达载体。

5.如权利要求1所述的全人源抗体在制备用于提高全人源抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活力的药物中的用途。

6.组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

(i)权利要求1所述的全人源抗体；和

(ii)药学上可接受的载体。

7.如权利要求1所述的全人源抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

8.制备如权利要求1所述的全人源抗体的方法，其包括以下步骤:

1)根据权利要求1的全人源抗体，设计相应的DNA序列；

2)合成DNA序列；

3)将合成的抗体DNA片段克隆至表达质粒中；

4)转染至宿主细胞；