CN105669867A - 抗gitr/ctla-4双特异性抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗GITR/CTLA-4双特异性抗体及其制备方法和用途，所述双特异性抗体的轻链双可变区的氨基酸序列分别为SEQ？ID？NO:6和SEQ？ID？NO:10；重链双可变区的氨基酸序列分别为SEQ？ID？NO:8和SEQ？ID？NO:12。所述双特异性抗体在拮抗T细胞中CTLA-4抑制信号通路的同时，还能够激活Treg细胞中的GITR信号通路，不但解除效应型T细胞自身的抑制信号，增强CD4⁺T细胞和CD⁺8T细胞的活性，并且消除Treg细胞对效应型T细胞的抑制作用，从而最大程度地激活效应型T细胞，增强针对肿瘤细胞的免疫应答反应。

Description

抗GITR/CTLA-4双特异性抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种能同时结合两种抗原的双特异性抗体及其制备方法和用途，具体的，本发明涉及一种能同时结合GITR和CTLA-4的双特异性抗体及其制备方法和用途。

技术背景

T细胞是淋巴细胞的主要组分，在人体的免疫应答中发挥着重要的作用。其产生的免疫应答效应主要包括两个方面：一方面，细胞毒性T细胞(cytotoxicTcell)通过其表面TCR受体与含有特定抗原的靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一方面效应性T细胞(effectorTcell)能够释放各种细胞因子，例如IFNγ，IL4，IL13等，从而增强和扩大免疫效应。但是在肿瘤组织中，由于受到肿瘤微环境的影响，T细胞活性受到显著抑制，并不能发挥其免疫应答的作用。有证据表明，肿瘤组织中侵润的CD8⁺T细胞常表现出细胞因子分泌不足，分化不全以及缺乏穿孔素和颗粒酶的表达等。此外，在多种类型的肿瘤中，肿瘤细胞表达一些抑制性配体，通过与T细胞表面的抑制性受体相结合，通过抑制性配体受体反应来负性调控T细胞的功能。因此，通过重建体内的免疫反应过程，促使特异性识别肿瘤细胞抗原的T细胞增殖与分化，从而杀灭肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的一个热点领域。

T细胞的活化是一个十分复杂的过程，除了需要T细胞表面受体(Tcellreceptor，TCR)与抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，APC)上的MHC-抗原肽复合物结合作为第一信号以外，T细胞的活化还需要T细胞表面的CD28和APC细胞表面的B7结合提供第二信号。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CytotoxicTlymphocyteassociatedantigen4，CTLA-4)与CD28分子都是共刺激分子B7的受体，与CD28起到活化T细胞的作用不同，CTLA-4与B7结合以后能够抑制T细胞的激活，对T细胞的活化起负性调控作用。CTLA-4参与下调T细胞反应以及诱导肿瘤组织中的T细胞耐受，使其成为肿瘤免疫治疗领域具有吸引力的靶点。目前，百时美施贵宝公司开发的针对CTLA-4的特异性单克隆抗体ipilimumab被美国FDA批准用于转移性黑色素瘤患者的治疗。对临床试验中的肿瘤标本进行研究表明，黑色素瘤患者在接受ipilimumab治疗后，肿瘤组织内的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的侵润显著增加，同时T细胞的活性显著增强，因此，ipilimumab主要是通过增强T细胞的活性发挥其抗肿瘤作用。同时也有研究表明，患者经过ipilimumab治疗后，肿瘤组织中CD4⁺T细胞增加的同时，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg)的数目也显著增加，特别是在患者给予低剂量的ipilimumab后，肿瘤组织中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞增加的程度要明显高于CD4⁺T细胞。(CTLA4blockadeexpandsFoxP3+regulatoryandactivatedeffectorCD4⁺Tcellsinadose-dependentfashion)。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞是一类免疫调节细胞，表达IL-10等免疫抑制因子，能通过细胞-细胞接触依赖方式发挥免疫抑制作用。目前有证据表明Treg细胞广泛存在于多种肿瘤组织中，并且起到免疫抑制作用。消除肿瘤微环境中Treg细胞，能够抑制肿瘤的发展。因此，ipilimumab治疗所产生的Treg细胞对于其抗肿瘤疗效具有一定的抑制作用。临床试验中，ipilimumab仅对部分具有较强免疫原性的肿瘤患者，如黑色素瘤等，具有一定的临床疗效，但在其他免疫原性较低的肿瘤病人中并没有取得令人满意的结果。因此，在通过CTLA-4抗体ipilimumab激活CD4⁺T和CD8⁺T细胞活性的同时，消除Treg细胞在肿瘤微环境中的免疫抑制作用，进一步增强CD4⁺T和CD8⁺T细胞的活性，会取得更加令人满意的抗肿瘤效果。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid—inducedtumornecrosisfactorreceptor，GITR)为肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的第18个成员(TNFRSF18)，与其他一些TNFRSF成员(4-1BB、CD27、OX40)的胞质结构域高度同源。GITR组成性高表达在CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg细胞)中，在与其配体(GITRL)结合后发挥相应的生物学作用。研究表明GITR信号通路的活化能够显著地抑制CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的免疫抑制作用。DTA-1作为GITR激活型抗体，发挥生理性GITRL的作用，在小鼠黑色瘤细胞模型中，经DTA-1治疗后，Treg细胞的活性受到显著抑制。因此，可以通过GITR的激动型抗体来活化Treg细胞中的GITR信号通路，达到抑制Treg细胞活性的目的。还有研究表明GITR也在效应型T细胞和NK细胞中表达，GITR信号通路的激活能够诱导效应T细胞的活化，调控T细胞的增殖和分化。

综上所述，构建一种能同时与CTLA-4和GITR相结合的双特异性抗体，是肿瘤免疫治疗领域的研究人员正在努力解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于，提供了一种能同时与GITR和CTLA-4特异性结合的双特异性抗体及其制备方法和用途。该双特异性抗体在拮抗T细胞中CTLA-4抑制信号通路的同时，还能够激活Treg细胞中的GITR信号通路。一方面解除效应型T细胞自身的抑制信号，增强CD4⁺T细胞和CD⁺8T细胞的活性，另一个方面消除Treg细胞对效应型T细胞的抑制作用，从而最大程度地激活效应型T细胞，增强针对肿瘤细胞的免疫应答反应。

本发明的第一方面，提供了一种抗GITR/CTLA-4的双特异性抗体，所述双特异性抗体的轻链双可变区的氨基酸序列分别为SEQIDNO:6(VL1)和SEQIDNO:10(VL2)，重链双可变区的氨基酸序列分别为SEQIDNO:8(VH1)和SEQIDNO:12(VH2)。

较佳的，抗GITR的氨基酸序列为SEQIDNO:6和SEQIDNO:8；抗CTLA-4的氨基酸序列为SEQIDNO:10和SEQIDNO:12。

较佳的，SEQIDNO:6和SEQIDNO:10位于同一条轻链上；SEQIDNO:8和SEQIDNO:12位于同一条重链上。

较佳的，所述双特异性抗体的轻链结构为VL1-连接肽1-VL2-CL，重链结构为VH1-连接肽2-VH2-CH；优选连接肽1的氨基酸序列为SEQIDNO:14，连接肽2的氨基酸序列为SEQIDNO:16；优选CL的氨基酸序列为SEQIDNO:2；优选CH的氨基酸序列为SEQIDNO:4。

本发明的第二方面，提供了一种编码本发明第一方面所述的双特异性抗体可变区氨基酸序列的核苷酸序列，编码氨基酸SEQIDNO:6的核苷酸序列为SEQIDNO:5，编码氨基酸SEQIDNO:8的核苷酸序列为SEQIDNO:7，编码氨基酸序列SEQIDNO:10的核苷酸序列为SEQIDNO:9，编码氨基酸序列SEQIDNO:12的核苷酸序列为SEQIDNO:11，编码氨基酸序列SEQIDNO:14的核苷酸序列为SEQIDNO:13，编码SEQIDNO:16的核苷酸序列为SEQIDNO:15。

本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核苷酸序列。

较佳的，所述载体为pCHO1.0、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)和pDHFR中的至少一种。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的核苷酸序列。

较佳的，所述宿主细胞为真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选CHO细胞。

本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的双特异性抗体的方法，包括以下步骤：

在合适的表达条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，并表达本发明第一方面所述的双特异性抗体。

较佳的，所述方法还包括：分离或纯化表达的双特异性抗体。

本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的双特异性抗体，和药学上可接受的载体或辅料。

本发明的第七方面，提供了本发明所述双特异性抗体用于制备预防或治疗肿瘤药物中的用途。

本发明中，VL1和VH1分别为所述双特异性抗体的轻、重链的第一可变结构域，连接肽1和连接肽2是氨基酸或者多肽，VL2和VH2分别为所述双特异性抗体的轻、重链的第二可变结构域，CL和CH分别为所述双特异性抗体的轻、重链的恒定区。

本发明中，任何能够同时和GITR，CTLA-4特异性相结合的氨基酸序列及编码相应氨基酸序列的DNA序列都适合于本发明。

本发明中，任何合适的载体都可用于GITR/CTLA-4双特异性抗体表达载体的构建，可以为pCHO1.0，pDR1,pcDNA3.1(+),pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR等，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的编码相应氨基酸序列的DNA序列。

表达载体扩增可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3),TG1之一。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明中GITR/CTLA-4双特异性抗体的表达，COS，CHO，NS0，sf9及sf21等均可适用于本发明。

本发明中公开的GITR/CTLA-4双特异性抗体的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达GITR/CTLA-4双特异性抗体，分离或纯化所述的GITR/CTLA-4双特异性抗体。利用上述方法，可以将GITR/CTLA-4双特异性抗体纯化为基本均一的物质，例如在非还原性SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的GITR/CTLA-4双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的GITR/CTLA-4双特异性抗体

本发明中，所述双特异性抗体可以通过以下方法得到的：轻链VL1(抗-GITR，SEQIDNo.5)，VL2(抗-CTLA-4，SEQIDNo.9)，重链VH1(抗-GITR，SEQIDNo.7)，VH2(抗-CTLA-4，SEQIDNo.11)的核苷酸由上海生物工程技术服务有限公司全基因合成。轻链VL1和VL2经过连接肽1(TVAAP)串联后与人抗体轻链恒定区基因以重组PCR(overlapPCR)连接后克隆到pCHO1.0载体的第一个限制性多酶切位点构建真核表达载体pCHO-GITR/CTLA-4DVD-Ig-L，同样，重链VH1和VH2经过连接肽2(ASTKGP)串联后与人抗体重链恒定区基因连接被克隆到已含有双特异性抗体轻链的pCHO-GITR/CTLA-4DVD-Ig-L的表达载体的第二个限制性多酶切位点构建完整的双特异性表达质粒。上述质粒用FreeStyle^TMMAXReagent转染进入CHO-S细胞，并用含50μg/ml嘌呤霉素和1μM的甲氨喋呤的选择培养基筛选稳定表达GITR/CTLA-4双特异性抗体的单细胞克隆.利用ProteinA柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化GITR/CTLA-4双特异性抗体。

本发明中，所述双特异性抗体和药学上可以接受的载体或辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的融合受体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(例如凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的所述双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使上述GITR/CTLA-4双特异抗体的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含上述的GITR/CTLA-4双特异性抗体，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明公开的GITR/CTLA-4双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT－207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤(6－MP)和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素－2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin)；5、其他一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的VEGF/PIGF双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

发明人对上述的GITR/CTLA-4双特异性抗体进行亲和力检测、抑制调节性T细胞(Treg细胞)的功能、免疫反应的影响等实验来验证该双特异性抗体的功能。实验结果表明，本发明公开的GITR/CTLA-4双特异性抗体可以与GITR结合，同时可以结合CTLA-4。该特异性抗体能够能够阻断CD4+CD25+T细胞对于CD4+CD25-T细胞的增殖抑制作用，能够显著地增强猕猴在抗原刺激后的免疫反应。

附图说明

图1是pCHO1.0表达载体结构示意图，PPGK是磷酸甘油酸激酶启动子；PEF2/CMV是EF2/CMV杂合启动子，PCMV/EF1是CMV/EF1杂合启动子，SV40pA表示SV40多腺苷化信号；CMVpA表示CMV多腺苷化信号，DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；pac为嘌呤霉素抗性基因，pMB1ori为质粒复制起点；

图2是GITR/CTLA-4双特异抗体结构示意图；

图3是GITR/CTLA-4双特异抗体与GIRT结合力实验结果图；

图4是GITR/CTLA-4双特异抗体与CTLA-4结合力实验结果图；

图5是GITR/CTLA-4双特异抗体对CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的调节作用图；

图6是GITR/CTLA-4双特异抗体对免疫反应的调节作用图。

具体实施方式

以下实施例和实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建抗体表达质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到相应的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，2^ndedition，ColdspringHarborLaboratoryPress.

实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell,1980,22：197-207)和文献(NucleicAcidsResearch，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分10秒，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:3和SEQIDNO:4分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CL和pGEM-T/CH。

实施例2.GITR/CTLA-4双特异性抗体表达载体的构建

轻链VL1(抗-GITR，SEQIDNo.5)，VL2(抗-CTLA-4，SEQIDNo.9),重链VH1(抗-GITR，SEQIDNo.7)，VH2(抗-CTLA-4，SEQIDNo.SEQIDNo.11)的核苷酸序列由上海生物工程技术服务有限公司全基因合成。轻链VL1与VL2基因通过overlapPCR的方法与连接肽1以串联形式进行连接(连接肽1序列见SEQIDNo.13)，并且被克隆到pGEM-T载体。然后轻链双变区基因(VL1-VL2)与人抗体轻链恒定区(kconstantregion)基因(以引物LC有义:ACTGTGGCTGCACCATCTGT；LC反义:GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG以pGEM-T/CL为模板)以overlapPCR连接被克隆到pGEM-T载体中，挑选阳性克隆，测序正确。以AvrII和BstZ17I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得的酶切片断与同酶切的质粒pCHO1.0(图1)用T4DNA连接酶进行连接，构建成轻链表达载体pCHO(GITR/CTLA-4DVD-IgG-L)。重链VH1与VH2基因通过overlapPCR的方法与连接肽2以串联形式进行连接(连接肽2序列见SEQIDNo.15)，并且被克隆到pGEM-T载体。然后重链双变区基因(VH1-VH2)与人抗体重链恒定区(γconstantregion)基因(以引物HC有义:ACTGTGGCTGCACCATCTGT；HC反义:GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG以pGEM-T/CH为模板)以overlapPCR连接被克隆到pGEM-T载体中，挑选阳性克隆，测序正确。以EcoRV和Pacl酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得的酶切片断与同酶切的轻链表达载体pCHO(GITR/CTLA-4DVD-IgG-L)用T4DNA连接酶进行连接，构建成GITR/CTLA-4双特异性抗体表达载体pCHO(GITR/CTLA-4DVD-IgG)。

于125ml摇瓶中接种5×10⁵/mlCHO-S细胞30ml，细胞培养24小时后进行转染：取pCHO(GITR/CTLA-4DVD-IgG)质粒50μg和50μlFreeStyle^TMMAXReagent[Invitrogen公司产品]分别溶于1.45mlOptiPRO^TMSFM，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育10分钟使形成DNA-脂质体复合物，将DNA-脂质体复合物加入到摇瓶中，再将转染后的CHO-S细胞于37℃，8％CO₂于摇床培养箱中130-150rpm继续培养。转染进行48小时后用含50μg/ml嘌呤霉素和1μM的甲氨喋呤的选择培养基筛选稳定表达GITR/CTLA-4双特异性抗体的单细胞克隆细胞。

取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：小鼠抗人IgG(CH2)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(人骨髓瘤IgG1,κ)，37℃孵育2小时，加入HRP-小鼠抗人IgG(CH3)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测OD₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用ProteinA亲和柱(GE公司产品)分离纯化GITR/CTLA-4双特异性抗体，经测序，和SEQIDNO:8、SEQIDNO:10序列一致，将纯化的双特异性抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。图2为GITR/CTLA-4双特异性抗体结构图。

实验例

实验例1.GITR/CTLA-4双特异抗体与GITR高表达细胞的结合

为了验证GITR/CTLA-4双特异抗体与GITR结合，我们在CHO细胞中转染GIRT全长基因的质粒，构建了稳定高表达GITR的CHO细胞株CHO/GITR。然后用流式细胞术检测该双特异性抗体与CHO/GITR细胞株的结合。收集约2*10⁵个CHO/GITR细胞，PBS洗涤三次，分别与GITR/CTLA-4双特异抗体或阴性对照抗体人IgG1在室温孵育1h，PBS洗涤三次，然后与抗人FC片段的FITC室温孵育1h，PBS洗涤三次后上机进行检测。如图3所示，与阴性抗体人IgG1相比，与GITR/CTLA-4双特异抗体孵育的细胞在流式细胞检测结果上明显地向右偏移，表明该双特异抗体能够和CHO/GITR细胞特异结合。与抗GITRIgG1单克隆抗体相比，GITR/CTLA-4双特异抗体与GITR的结合稍弱。

实验例2.GITR/CTLA-4双特异抗体阻断CTLA-4与B7.1的结合

为了验证GITR/CTLA-4双特异抗体对CTLA-4与B7.1结合的阻断作用，我们在CHO细胞中转染B7.1全长基因的质粒，构建了稳定高表达B7.1的CHO细胞株CHO/B7.1。CTLA-4鼠(mouse)Fc融合蛋白分别与不同浓度的GITR/CTLA-4双特异性抗体室温孵育30-60分钟，然后将所形成的混合物加入到含有2*10⁵个CHO/B7.1细胞的细胞悬液中，室温孵育60分钟，细胞离心后PBS洗涤三次，加入PE标记的羊抗鼠IgG的荧光二抗，孵育30-60分钟，PBS洗涤三次后上机检测与CHO/B7.1细胞结合的CTLA-4鼠Fc，然后根据不同浓度的平均荧光强度进行作图。如图4所示，GITR/CTLA-4双特异抗体能够浓度依赖性地阻断CTLA-4与B7.1的结合，其EC50值与抗-CTLA-4IgG1基本相当。

实验例3.GITR/CTLA-4双特异抗体对CD4+CD25+调节性细胞功能的抑制作用

从人外周血中采用MACS磁珠分选的方法分离CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞，将CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞按照1:1比例进行混合，同时加入GITR/CTLA-4双特异性抗体与对照抗体人IgG1，于37℃培养箱培养72小时，后将CD4+CD25-T细胞采用磁珠分选出来显微镜下进行计数。结果如图5所示，在对照抗体人IgG1处理组，与不加CD4+CD25+T细胞组相比，CD4+CD25-T细胞的增殖受到了显著地抑制，而在GITR/CTLA-4双特异抗体处理组，CD4+CD25-T细胞的增殖显著恢复。与抗-GITRIgG1和抗CTLA-4IgG1单克隆抗体处理组相比，CD4+CD25-T细胞的增殖明显增强。

实验例4.GITR/CTLA-4双特异抗体对免疫反应的调节作用

选取12只健康猕猴，随机分为四组，1.生理盐水组，2.抗GITRIgG1组(10mg/kg)，3.抗CTLA-4IgG1(10mg/kg)，4.GITR/CTLA-4双特异抗体组(10mg/kg)，在实验的第1天，第29天，第57天分别采用静脉给药的方式给予上述药物。在给予药物的同时，采用皮下注射的方式给予各只猕猴人黑色素瘤细胞SKMel-3(5*10⁶/只)。分别在实验的第14,30,43,58,71,85,100天进行取血，采用流式细胞术的方法检测血液中针对SKMel-3的特异性抗体。取2*10⁵个SKMel-3细胞，与血液上清在室温孵育60分钟，离心后用PBS洗涤三次，加入PE标记的羊抗人IgG的荧光二抗，孵育30-60分钟，PBS洗涤三次后采用流式细胞仪检测与SKMel-3细胞结合的抗体强度，用FlowJo软件对细胞表面的几何平均荧光强度(GMFI)进行分析。如图6所示，与对照组(生理盐水)相比，GITR/CTLA-4双特异抗体处理组猕猴的免疫反应显著增强，血清中针对SKMel-3细胞的抗体较对照组明显上升。与抗-CTLA4IgG1和抗GITRIgG1相比，GITR/CTLA-4双特异抗体对于免疫反应的增强作用有明显提升。

Claims (10)

1.一种抗GITR/CTLA-4的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的轻链双可变区的氨基酸序列分别为SEQIDNO:6和SEQIDNO:10；重链双可变区的氨基酸序列分别为SEQIDNO:8和SEQIDNO:12。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中，轻链恒定区氨基酸序列为SEQIDNO:2，重链恒定区氨基酸序列为SEQIDNO:4。

3.如权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中，轻链结构为VL1-连接肽1-VL2-CL，重链结构为VH1-连接肽2-VH2-CH。

4.如权利要求3所述的双特异性抗体，其中，所述连接肽1的氨基酸序列为SEQIDNO:14，所述连接肽2的氨基酸序列为SEQIDNO:16。

5.一种编码权利要求1所述的双特异性抗体可变区氨基酸序列的核苷酸序列，其特征在于，编码氨基酸SEQIDNO:6的核苷酸序列为SEQIDNO:5，编码氨基酸SEQIDNO:8的核苷酸序列为SEQIDNO:7，编码氨基酸序列SEQIDNO:10的核苷酸序列为SEQIDNO:9，编码氨基酸序列SEQIDNO:12的核苷酸序列为SEQIDNO:11。

6.一种表达权利要求1所述的双特异性抗体的载体，其特征在于，所述载体含有权利要求5所述的核苷酸序列。

7.一种表达权利要求1所述的双特异性抗体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体，或其基因组中整合有权利要求5所述的核苷酸序列。

8.一种制备权利要求1所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在合适的表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，并表达权利要求1所述的双特异性抗体。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的双特异性抗体，和药学上可接受的载体或辅料。

10.权利要求1所述双特异性抗体用于制备预防或治疗肿瘤药物。