CN109963621A - Gitr和ctla-4的双特异性多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多特异性多肽，例如双特异性抗体，其包含能够特异性结合GITR的第一结合结构域，和能够特异性结合CTLA‑4的第二结合结构域。本发明进一步提供所述双特异性多肽的组合物，及其方法和用途。

Description

GITR和CTLA-4的双特异性多肽
技术领域
本发明涉及多特异性(例如双特异性)多肽，其特异性地结合到GITR和CTLA-4，及其在治疗和预防癌症中的用途。
背景技术
癌症是发达国家过早死亡的主要原因。癌症的免疫疗法旨在对肿瘤细胞产生有效的免疫应答。这可以通过例如破坏对肿瘤抗原的耐受性、增强抗肿瘤免疫应答和刺激肿瘤部位的局部细胞因子应答来实现。长效抗肿瘤免疫应答的关键效应细胞是活化的肿瘤特异性效应T细胞(T eff)。活化的效应T细胞的有效扩增可以将免疫应答重定向到肿瘤。在这种情况下，调节性T细胞(T reg)在抑制抗肿瘤免疫中起作用。因此，消耗、抑制/恢复或灭活Tregs可以提供抗肿瘤作用并恢复肿瘤微环境中的免疫抑制。此外，通过例如树突细胞不完全激活效应T细胞可导致T细胞无反应性，这导致抗肿瘤反应效率低，而树突细胞的充分诱导可产生活化效应T细胞的有效扩增，重定向对肿瘤的免疫反应。此外，自然杀伤(NK)细胞通过攻击具有下调的人白细胞抗原(HLA)表达的肿瘤细胞和通过诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)在肿瘤免疫学中发挥重要作用。因此，NK细胞的刺激也可以减少肿瘤生长。
糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR、CD357或TNFRSF18)是T细胞的重要共刺激受体，可在T细胞致敏幼稚CD4+和CD8+T细胞、T细胞效应子(Teff)分化和记忆T细胞反应的期间时加强T细胞受体(TCR)信号传导。在人类中，幼稚CD4+和CD8+T细胞的GITR表达通常较低，并且仅限于活化的T细胞和调节性T细胞(Tregs)。GITR上调在TCR活化后6h发生并且在24h内出现峰值(Kanamuru,2004)。GITR激活由其配体GITRL触发，主要在抗原呈递细胞(APC)和内皮细胞上表达。类似于其他TNFR家族成员，GITR共刺激与TCR信号传导一起诱导NFκB途径的激活，导致增强的细胞因子释放，如IL-2、IFNγ、IL-4，但也有IL-10(Kanamuru,2004)，抑制CD3诱导的细胞凋亡(Nocentini,1997)和促进T细胞存活、增殖和扩展。因此，GITR刺激有利于CD4效应T细胞扩增、成熟和分化为记忆表型和CD8T细胞活化。重要的是，GITR高表达于外周和胸腺Treg上，特别是激活的Treg上，其中它在其调节功能中起着重要的但也是矛盾的作用(Ronchetti,2015)：
1)在小鼠模型中，GITR对于Treg分化和扩增至关重要。
2)相反地，GITR刺激可以例如经由FOXP3的降解废除Treg免疫抑制功能，例如(Shimizu,2002)(McHugh,2002)(Cohen,2010)。这可部分地通过由于在非生理条件下过度刺激GITR而引起的瞬时药理学效应来解释。
3)GITR诱导的信号传导也可以促使T细胞对Treg诱导的免疫抑制更具抗性；增强T细胞对弱免疫原性肿瘤相关抗原的反应性，导致肿瘤定向免疫和肿瘤排斥。
4)GITR抗体对Treg的另一种抑制作用取决于特异性Treg的消耗，其由GITR抗体Fc部分与激活Fcγ受体(FcγR)的结合和Treg上GITR的表达高于对幼稚T细胞或Teff的表达引起。已经表明，这种效果被限制在肿瘤区域，这是由于FcγR表达自然杀伤细胞(NK细胞)的高浸润和骨髓细胞浸润肿瘤(Bulliard,2013)。
这些机制对GITR抗体的治疗效果的相对重要性可能取决于背景。
目前在I期临床开发中有8种GITR mAb。这些包括传统的二价单克隆抗体，但也有MEDI-1873(MedImmune/AstraZeneca)，与Fc结构域偶联的多价(六聚体)GITRL融合蛋白，以最大化GITR多聚化，用于最佳T细胞活化和/或Treg消耗。TRX-518(Leap Therapeutics)是人源化的非糖基化IgG1 GITR抗体，是一种非消耗性抗体，在2010年首次进入临床治疗黑色素瘤。第一次单剂量递增研究显示低效或毒性。2015年开始进行新的剂量递增研究，重复给予TRX-518。INCAGN01876(Agenus/Incyte)和GWN323(Novartis)都是IgG1抗体，其能够结合并激活FcγR并诱导靶细胞例如Treg的ADCC。至少还有四种GITR抗体已从BMS、Amgen和Merck进入临床开发阶段。抗体的同种型及其诱导ADCC的能力可能影响Treg缺失和T细胞效应功能作为不同GITR靶向化合物的作用模式的平衡。
T细胞受体CTLA-4充当T细胞活化的负调节物，并且在初始活化后在T细胞表面上调。由抗原呈递细胞表达的CTLA-4受体的配体是B7蛋白、CD80和CD86。负责T细胞活化上调的相应配体受体对是CD28-B7。通过识别由MHC复合物呈递的抗原肽的T细胞受体，经由CD28的信号传导构成共刺激途径，并且随后T细胞活化。通过阻断CTLA-4与CD80/CD86的相互作用，可以去除免疫应答的正常检查点之一。最终结果是效应T细胞的活性增强，这可能有助于抗肿瘤免疫。这可能是由于效应T细胞的直接激活，但也可能是由于Treg细胞的活性和/或数量的减少，例如通过ADCC或ADCP。
CTLA-4的检查点阻断导致T细胞活化和抗肿瘤作用的改善，但抗CTLA-4抗体的施用与毒副作用有关。CTLA-4在许多实体瘤例如黑素瘤肺癌、肾癌和头颈癌中的调节性T细胞上过表达(Kwiecien，2017)(Montler，2016)(Ross，Clin Science，2017)。
黑色素瘤的CTLA-4抗体治疗(伊匹单抗(Ipilimumab))的临床研究已经证明具有生存优势(Hodi等人,2010)。作为IgG1抗体的伊匹单抗的作用机制尚未完全阐明。当前数据支持CTLA-4抗体的双重活性，激活外围的Teff和消耗肿瘤内的Treg(Bulliard,2013)(Furness,2014)。
通过阻断CTLA-4-CD80/CD86相互作用，免疫应答中的一个正常检查点被移除。这有可能导致不希望的免疫激活，并且即使它导致抗肿瘤作用，它也与毒副作用有关。其他人已经表明，局部产生抗CTLA-4抗体(通过肿瘤细胞)导致抗肿瘤效果，而没有与全身给药相关的自身免疫反应(Fransen,2013)。
伊匹单抗(BMS)，一种IgG1形式的抗CTLA-4mAb，被批准用于治疗黑色素瘤，目前处于临床III期，例如用于非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱和前列腺癌。此外，BMS在临床I期具有非岩藻糖基化形式的伊匹单抗。曲美替尼(Tremelimumab)(MedImmune/Astra Zeneca)是临床III期的抗-CTLA-4IgG2mAb，例如用于间皮瘤、NSCLC和膀胱癌。AGEN-1884(Agenus Inc.)是最近登记的针对晚期实体瘤的I期抗-CTLA-4抗体。
靶向GITR或CTLA-4的单特异性抗体通常依赖于通过例如其他细胞上的Fcγ受体的交联以诱导向表达相应受体的细胞的强信号传导。因此，当没有提供这种交联时，它们不能有效地发出信号。
需要仅靶向一种T细胞靶标例如GITR或CTLA-4的现有单特异性药物的替代物。
发明内容
本发明的第一方面提供了多特异性多肽，其包含第一结合结构域，命名为B1，其能够特异性结合CTLA-4，和第二结合结构域，命名为B2，其能够特异性结合GITR。
关于“多特异性”多肽，我们包括能够结合通常在不同抗原上的多于一个靶表位的多肽。此类多肽的实例包括双特异性抗体和三特异性抗体及其多肽衍生物(参见下文)。
因此，双特异性抗体是能够结合相同或不同抗原上的两个不同表位的分子。开发双特异性抗体以实现两个细胞表面受体的同时抑制，或两个配体的阻断，两种受体的交联或T细胞的募集至肿瘤细胞的接近度(Fournier,2013)。
靶向两种或更多种不同T细胞靶标例如CTLA-4和GITR的多特异性抗体具有在所有靶标过表达的位置特异性激活免疫系统的潜力。例如，CTLA-4在肿瘤微环境中的调节性T细胞(Treg)上过表达，而其在效应T细胞上的表达较低。因此，本发明的多特异性抗体具有选择性靶向肿瘤微环境中的调节性T细胞的潜力。
GITR表达与已知渗透到肿瘤微环境中的在活化的Treg上的CTLA-4的表达相关联，并且它们的抑制活性与GITR和CTLA-4表达相关(Ronchetti,2015)(Furness,2014)(Bulliard,2013)(Leving,2002)。因此，双特异性抗体具有选择性靶向肿瘤中的抑制性Treg并且特异性地消耗Treg或逆转Treg的免疫抑制的潜力。这种效果可以经由双特异性抗体的Fc部分通过ADCC或ADCP诱导(Furness,2014)或通过GITR刺激诱导的信号传导和/或通过阻断CTLA-4信号传导途径(Walker,2011)介导。在Teff上，双特异性抗体具有通过GITR刺激和通过CTLA-4检查点阻断诱导活化和增加效应子功能的潜力。癌症患者的离体分离的Treg的GITR刺激和CTLA-4阻断的组合研究表明，免疫抑制可以废止并恢复T细胞的抗肿瘤免疫(Gonzales,2015)。此外，当结合GITR刺激和CTLA-4阻断时，小鼠模型研究表明了有益的抗肿瘤作用(Pruitt,2011)。
总之，并且不希望受理论束缚，据信本发明的多特异性(例如双特异性)抗体多肽的主要作用模式是消耗和抑制肿瘤浸润性Treg，与单特异性GITR抗体相比提供增强的作用，同时与CTL-4抗体如伊匹单抗相比，具有更可耐受的安全性。
作为多特异性抗体，与单特异性抗体的组合相比，本发明的GITR-CTLA-4抗体提供潜在增加的治疗功效，并且有机会降低药物开发、生产、临床测试和监管批准的成本。形式本身也可以通过物理连接两个细胞或两种不同的细胞受体得到协同效应(2012年5月)。这些特征使得诸如这些的多特异性抗体作为治疗癌症的治疗剂非常有吸引力。
特别地，靶向GITR和CTLA-4的多特异性(例如双特异性)抗体具有在肿瘤中局部激活免疫系统的潜力。如前所述，GITR和CTLA-4表达与已知渗入肿瘤的活化Treg有关。因此，多特异性(例如双特异性)抗体具有选择性靶向并特异性抑制或消除肿瘤中的Treg(通过ADCC)的潜力。因此，与单特异性GITR或CTLA-4抗体的二价结合相比，通过与GITR和CTLA-4的双重结合增强了治疗功效，从而提供了多特异性(例如双特异性)抗体与其单特异性竞争者比较的有益抗肿瘤作用。此外，多特异性(例如双特异性)抗体的全身剂量可低于单特异性抗体，其可降低毒性并增加患者的安全性，同时降低成本。
GITR和CTLA-4的细胞表面表达模式部分重叠。因此，靶向GITR和CTLA-4的多特异性(例如双特异性)抗体具有以顺式和反式两者结合两种靶标的潜力。这种双特异性抗体可能具有以不依赖FcγR交联的方式通过GITR和CTLA-4刺激的能力，这通过增加同一细胞上顺式受体聚集的水平，或通过在两个细胞之间产生人工免疫突触，这反过来可导致增强的受体聚集和两个细胞中增加的信号传导。这种细胞-细胞相互作用导致免疫激活增加，这不是通过单独的单特异性抗体的组合实现的。
因此，在示例性实施方案中，本发明的多特异性(例如双特异性)多肽能够特异性结合GITR和CTLA-4，从而诱导：
1.与单特异性抗体相比，更高程度的免疫激活。免疫激活显著高于CTLA-4和GITR单特异性抗体的组合。
2.除了GITR和CTLA-4结合实体提供的交联外，在没有任何交联的情况下活化，与仅在交联剂存在下活化的单特异性抗体相反，例如其他细胞表达Fcγ受体，通过将抗体粘附于表面(例如孔表面)或与单特异性抗体的Fc部分结合的交联抗体进行物理交联。
3.更有针对性/局部化的免疫激活。免疫激活仅发生在包含高GITR表达和CTLA-4表达的环境中。
肿瘤微环境就是这样一种环境。这有可能增加效果并最小化毒副作用。因此，可以增加治疗窗。
本文以其最广泛的含义使用“多肽”以指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或其他肽模拟物的化合物。因此，术语“多肽”包括短肽序列以及更长的多肽和蛋白质。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体，和氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文所用的术语“多特异性”是指多肽能够特异性结合至少两种不同的靶实体，在本情况下为GITR和CTLA-4。有利地，本发明的多特异性(例如双特异性)多肽能够结合GITR的细胞外结构域和CTLA-4的细胞外结构域。应当理解，这种结合特异性在体内应该是明显的，即在向患者施用双特异性多肽之后。
在一个实施方案中，第一和/或第二结合结构域可以选自：抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“抗体”或“多个抗体”是指含有抗原结合位点的分子，例如免疫球蛋白分子和含有抗原结合位点的免疫球蛋白分子的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、单结构域抗体、单链抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、scFv(例如包括单特异性和双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体和以上任何一种的表位结合片段。
术语“涉及”或“针对”的抗体在本文中可互换使用，并且是指构建用于指向其在特定靶标/标记/表位/抗原上的结合特异性的抗体，即免疫特异性结合靶标/标记/表位/抗原的抗体。此外，可以使用“对某种靶标/标记/表位具有选择性”的表达抗体，其具有与“涉及”或“针对”相同的定义。涉及至少两种不同的靶标/标记/表位/抗原(具有选择性)的多特异性(例如双特异性)抗体免疫特异性结合两种靶标/标记/表位/抗原。如果抗体针对某种靶抗原，例如GITR，则因此假定所述抗体可以针对存在于所述靶抗原结构上的任何合适的表位。
如本文所用，术语“抗体片段”是抗体例如F(ab').sub.2、F(ab).sub.2、Fab'、Fab、Fv、scFv等的一部分。无论结构如何，抗体片段都与完整抗体识别的相同抗原结合。例如，抗GITR抗体片段与GITR结合。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻和重可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。如本文所用，术语“抗体片段”不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如Fc片段或单个氨基酸残基。
ScFv结构域特别优选包含在本发明的多特异性(例如双特异性)抗体中。
因此，在一个实施方案中，多肽是多特异性(例如双特异性)抗体。
本领域的技术人员将理解，本发明的多特异性(例如双特异性)的多肽可以是若干不同结构形式(例如，参见Chan&Carter,2016,Nature Reviews Immunology 10,301-316，其公开内容通过引用并入本文)。
在示例性的实施方案中，多特异性(例如双特异性)抗体选自：
i)二价双特异性抗体，例如IgG-scFv双特异性抗体(例如，其中B1是完整IgG，B2是在IgG轻链的N末端和/或轻链的C末端和/或在IgG重链的N-末端和/或重链的C-末端与B1连接的scFv，或反之亦然)；
ii)单价双特异性抗体，诸如(丹麦哥本哈根Genmab AS)或‘杵在臼中(knob-in-hole)’双特异性抗体(例如scFv-KIH、scFv-KIHr、BiTE-KIH或BiTE-KIHr(参见Xu等，2015，mAbs 7(1)：231-242)；
iii)scFv2-Fc双特异性抗体(例如来自Emergent Biosolutions Inc的ADAPTIRTM双特异性抗体)；
iv)BiTE/scFv2双特异性抗体；
v)DVD-Ig双特异性抗体；
vi)基于DART的双特异性抗体(例如DART2-Fc、DART2-Fc或DART)；
vii)DNL-Fab3双特异性抗体；和
viii)scFv-HSA-scFv双特异性抗体。
因此，在本发明的多特异性(例如双特异性)抗体的示例性实施方案中：
(a)结合结构域B1和/或结合结构域B2是完整的IgG抗体(或者，一起形成完整的IgG抗体)；
(b)结合结构域B1和/或结合结构域B2是Fv片段(例如scFv)；
(c)结合结构域B1和/或结合结构域B2是Fab片段；和/或
(d)结合结构域B1和/或结合结构域B2是单结构域抗体(例如结构域抗体和纳米抗体)。
例如，多特异性(例如双特异性)抗体可以是IgG-scFv抗体。IgG-scFv抗体可以是VH-VL或VL-VH方向。在一个实施方案中，scFv可以通过VH和VL之间的S-S桥稳定。
在一个替代实施方案中，本发明的多特异性(例如双特异性)多肽可以包含包含或由抗体可变结构域或其部分组成的第一结合结构域和不是抗体可变结构域或部分的第二结合结构域。因此，第一和/或第二结合结构域可以是非抗体多肽。例如，B1可以包含IgG1抗体或由IgG1抗体组成，B2可以包含非免疫球蛋白多肽或由非免疫球蛋白多肽组成，反之亦然。
在一个实施方案中，B2包含能够结合CTLA-4的CD86结构域或其变体或由其组成。
本领域技术人员将理解，结合结构域B1和结合结构域B2彼此直接融合。
在另一个实施方案中，结合结构域B1和结合结构域B2通过多肽接头连接。例如，多肽接头可以是约10至约25个氨基酸之间的短接头肽。接头通常富含甘氨酸以获得柔韧性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以连接VH的N-末端和VL的C-末端，反之亦然。示例性接头包括如SEQ ID NOs.47-51中任一个所示的氨基酸序列的肽。
本发明的多特异性(例如双特异性)多肽可以通过本领域中使用的任何已知的合适的方法制造。制备本发明的双特异性抗体的方法包括BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-star)、Fc工程IgG1(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。可用于制备双特异性抗体的其他平台的实例包括但不限于WO 2008/119353(Genmab)、WO 2011/131746(Genmab)和van der Neut-Kolfschoten等报道的那些(2007，Science 317(5844)：1554-7)。也可以使用传统方法，例如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin和Zhu(2005)Acta Pharmacol Sin 26：649)。在宿主细胞中共表达由不同的重链和轻链组成的两种抗体，除了所需的双特异性抗体之外，还产生可能的抗体产物的混合物，然后可以通过例如亲和层析或类似方法分离。
本领域技术人员将理解多特异性(例如双特异性)抗体可以包含人Fc区，或所述区的变体，其中该区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选地IgG1或IgG4区。
抗体的恒定(Fc)区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。Fc区优选为人Fc区，或所述区域的变体。Fc区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选IgG1或IgG4区。Fc区的变体通常与Fc受体结合，如FcγR和/或新生Fc受体(FcRn)，其具有改变的亲和力，实现多肽的改良功能和/或半衰期。生物功能和/或半衰期可以相对于包含天然Fc区的多肽的半衰期增加或减少。可通过变体Fc区的存在调节的此类生物功能的实例包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞凋亡。
因此，Fc区可以是天然存在的(例如内源产生的人类抗体的一部分)或可以是人工的(例如包含相对于天然存在的人类Fc区的一个或多个点突变)。
如本领域充分记载的，抗体的Fc区介导其血清半衰期和效应功能，例如CDC、ADCC和ADCP。
工程化治疗性单克隆抗体的Fc区或Fc融合蛋白允许产生更适合于其所需的药理学活性的分子(Strohl,2009,《生物技术当前观点(Curr Opin Biotechnol)》20(6):685-91，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
(a)工程化Fc区以便延长半衰期
改善治疗性抗体功效的一种方法是增加其血清持久性，从而允许更高的循环水平、更低频率的施用和减少的剂量。
IgG的半衰期取决于其与新生受体FcRn的pH依赖性结合。在内皮细胞表面上表达的FcRn以pH依赖性方式结合IgG并且保护其免于降解。
在pH 6.0而非pH 7.4下选择性结合FcRn的一些抗体在各种动物模型中展现更高的半衰期。
位于CH2和CH3结构域如T250Q/M428L之间界面的几个突变(Hinton等人,2004,《生物化学杂志(J Biol Chem)》.279(8):6213-6，其公开内容以引用的方式并入本文中)和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro等人,2005,《自然·生物技术》23(10):1283-8，其公开内容以引用的方式并入本文中)已展示在体内增加与FcRn的结合亲和力和IgG1的半衰期。
(b)工程化Fc区以便改变效应功能
取决于治疗性抗体或Fc融合蛋白应用，可能需要降低或增加效应功能(如ADCC)。
对于靶向细胞表面分子，尤其免疫细胞上的那些分子的抗体，消除效应功能对于某些临床适应症可能是必需的。
相反，对于用于肿瘤学用途的抗体(例如在白血病和实体瘤的治疗中；参见下文)，增加的效应子功能可以改善治疗活性。
四种人类IgG同种型以不同亲和力结合激活Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性FcγRIIb受体和补体的第一组分(C1q)，产生非常不同的效应功能(Bruhns等人,2009,《血液》113(16):3716-25，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域的残基。CH2结构域的两个区对于FcγR和C1q结合至关重要，并且在IgG2和IgG4中具有独特的序列。展示处于位置233-236处的IgG2残基和处于位置327、330和331处的IgG4残基的取代人类IgG1极大降低ADCC和CDC(Armour等人,1999,《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》29(8):2613-24；Shields等人,2001,《生物化学杂志》276(9):6591-604，其公开内容以引用的方式并入本文中)。此外，Idusogie等人证明包括K322的不同位置的丙氨酸取代显著降低了补体激活(Idusogie等人,2000,《免疫学杂志》164(8):4178-84，其公开内容以引用的方式并入本文中)。类似地，展示鼠IgG2A的CH2结构域中的突变降低了与FcγRI和C1q的结合(Steurer等人,1995.《免疫学杂志》155(3):1165-74，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
已在人类IgG1的CH2结构域中进行了大量突变，并且在体外测试了其对ADCC和CDC的效果(参见上面引用的参考文献)。值得注意的是，据报导，处于333位置处的丙氨酸取代增加了ADCC和CDC两者(Shields等人,2001,同上；Steurer等人,1995,同上)。Lazar等人描述了对FcγRIIIa具有更高亲和力和对FcγRIIb具有更低亲和力的三重突变体(S239D/I332E/A330L)，导致ADCC增强(Lazar等人,2006,《美国国家科学院院刊》103(11):4005-4010，其公开内容以引用的方式并入本文中)。相同突变用于产生具有增加的ADCC的抗体(Ryan等人,2007,《癌症分子疗法(Mol.Cancer Ther)》6:3009-3018，其公开内容以引用的方式并入本文中)。Richards等人研究了具有提高的FcγRIIIa亲和力和FcγRIIa/FcγRIIb比率的略微不同的三重突变体(S239D/I332E/G236A)，其介导巨噬细胞对靶细胞的增强的吞噬作用(Richards等人,2008.《癌症分子疗法》7(8):2517-27，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
由于其缺乏效应功能，IgG4抗体代表用于在没有细胞耗尽的情况下进行受体调节的优选IgG亚类。IgG4分子可以在称为Fab臂交换的动态过程中交换半分子。这种现象也可以在治疗性抗体与内源性IgG4之间在体内发生。
已展示S228P突变防止这种重组过程，允许设计较少不可预测的治疗性IgG4抗体(Labrijn等人,2009,《自然·生物技术》27(8):767-71，其公开内容以引用的方式并入本文中)。
工程化Fc区的实例显示在下表I中。
表I
*使用Eu编号方案定义Fc氨基酸突变的位置，其与上文SEQ ID NO：18和19中的编号不同；参见Edelman等，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63:78–85)
表I的参考文献
1.Hinton等人2004 J.Biol.Chem.279(8)：6213-6)
2.Vaccaro等人2005 Nat Biotechnol.23(10):1283-8)
3.Zalevsky等人2010 Nat.Biotechnology 28(2):157-159
4.Armour KL.等人,1999.Eur J Immunol.29(8)：2613-24
5.Shields RL.等人,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604
6.Masuda等人2007,Mol Immunol.44(12)：3122-31
7.Bushfield等人2014,Leukemia 28(11)：2213-21
8.Okazaki等人2004,J Mol Biol.；336(5)：1239-49
9.Idusogie等人,2000.J Immunol.164(8)：4178-84
10.Datta-Mannan A.等人,2007.Drug Metab.Dispos.35：86-94
11.Steurer W.等人,1995.J Immunol.155(3)：1165-74
12.Richards等人2008Mol Cancer There.7(8)：2517-27
13.US 7,960,512B2
14.EP 2 213 683
15.Labrijn AF.等人,2009.Nat Biotechnol.27(8):767-71
在另一实施例中，Fc区的效应功能可以通过修饰其中CH2结构域内的碳水化合物部分来改变，例如通过在生产期间修改岩藻糖、半乳糖、等分N-乙酰氨基葡萄糖和/或唾液酸的相对水平。(参见Jefferis,2009,《自然评论：药物发现》8(3):226-34和Raju,2008,《免疫学当前观点(Curr Opin Immunol.)》,20(4):471-8；其公开内容以引用的方式并入本文中)
因此，已知Fc区中缺乏岩藻糖残基或岩藻糖残基含量低的治疗性抗体可以在人体内展现增强的ADCC活性(例如，参见Peipp等人,2008,《血液》112(6):2390-9,Yamane-Ohnuki和Satoh,2009,《单抗(MAbs)》1(3):230-26,Iida等人,2009,《BMC癌症(BMCCancer)》9；58(其公开内容以引用的方式并入本文中)。低岩藻糖抗体多肽可以通过在含有甘露糖苷酶抑制剂(如几夫碱)的培养基中培养的细胞中表达而产生。低岩藻糖抗体多肽表现出与Fc受体的结合增加，包括FcγR，如FcγRIIIA。
将抗体糖基化修饰成低岩藻糖形式的其它方法包括在细胞中使用细菌酶GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖将GDP-甘露糖(GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖)转化为GDP-鼠李糖而不是GDP-岩藻糖(例如使用德国柏林ProBioGen AG的技术)。
产生低岩藻糖的抗体的另一方法是通过抑制或耗尽产生抗体的细胞中的α-(1,6)-岩藻糖基转移酶(例如，使用瑞士巴塞尔龙沙有限公司(Lonza Ltd,Basel,Switzerland)和BioWa,Princeton,NJ,USA的CHOK1SV技术)。
因此，在一个实施方案中，与天然人抗体相比，本发明的多肽的Fc区具有降低的岩藻糖。
在一个实施方案中，本发明的多肽具有非岩藻糖基化(或去岩藻糖基化)的Fc区。
“非岩藻糖基化的”、“去岩藻糖基化的”或“非岩藻糖化的”抗体是指抗体的Fc区不具有任何附着的岩藻糖单元，或具有降低的岩藻糖单元含量。降低的含量可以通过与岩藻糖基化的“野生型”抗体相比的修饰抗体上的岩藻糖的相对量来定义，例如，与在不存在甘露糖苷酶的抑制剂和/或在存在GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶下表示的等效抗体相比，每免疫球蛋白分子的岩藻糖糖单元更少。
可以与本文公开的任何VH区序列组合(以形成完整重链)的示例性重链恒定区氨基酸序列是复制在此的IgG1重链恒定区序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：97)
其它重链恒定区序列是所属领域中已知的，并且还可以与本文公开的任何VH区组合。例如，优选的恒定区是如在此再现的修饰的IgG4恒定区：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO：99)
这一修饰的IgG4序列展现降低的FcRn结合，并且因此导致相对于野生型IgG4缩短的血清半衰期。此外，其展现IgG4核心铰链的稳定化，使IgG4更稳定，防止Fab臂交换。
另一优选的恒定区是如在此复制的修饰的IgG4恒定区：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO：101)
这一修饰的IgG4序列引起IgG4核心铰链的稳定化，使IgG4更稳定，防止Fab臂交换。
还优选的是野生型IgG4恒定区，例如在此复制的：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO：100)
可以与本文公开的任何VL区序列组合(以形成完整轻链)的示例性轻链恒定区氨基酸序列是在此复制的κ链恒定区序列：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO：98)
其它轻链恒定区序列是所属领域中已知的，并且还可以与本文公开的任何VL区组合。
抗体或其抗原结合片段具有某些优选的结合特征和功能效应，这将在下面更详细地解释。当作为本发明的双特异性多肽的一部分掺入时，所述抗体或其抗原结合片段优选保留这些结合特征和功能效应。
在一个实施方案中，抗原结合片段可以选自：Fv片段(如单链Fv片段，或二硫化物键合的Fv片段)、Fab样片段(如Fab片段；Fab’片段或F(ab)2片段)和结构域抗体。
在一个实施方案中，双特异性多肽可以是IgG1抗体，其具有稠合至κ链的C末端部分的非免疫球蛋白多肽(如CTLA-4结合结构域，如CD86或其这样的突变形式如SEQ ID NO:17；见下文)。
在一个实施方案中，多特异性(例如双特异性)多肽可以是IgG1抗体，其具有与重γ1链的C末端融合的scFv片段。
在一个实施方案中，多特异性(例如双特异性)多肽可以含有2-4个scFv与两个不同靶标结合(在这种情况下，GITR和CTLA-4)。
关于靶标，我们包括位于激活或非活化状态的CD3+T细胞的细胞膜中的多肽受体。这种膜结合受体可以在细胞外暴露，以便在给药后它们被本发明的双特异性多肽接近。
本领域技术人员将理解，靶标(GITR和CTLA-4)可以位于细胞表面上。“定位在细胞表面上”是指靶与细胞结合，使得靶的一个或多个区域存在于细胞表面的外表面上。举例来说，靶标可以插入到细胞质膜中(即定向为跨膜蛋白)，胞外表面上存在一个或多个区。这可能发生在细胞表达靶标的过程中。因此，在一个实施例中，“定位在细胞表面上”可以意指“在细胞表面上表达”。或者，靶标可以在细胞外，共价和/或离子相互作用将其定位到细胞表面的一个或多个特定区。
本领域技术人员应理解，本发明的多特异性(例如双特异性)抗体可能能够诱导ADCC、ADCP、CDC和/或细胞凋亡。
在本发明的一个实施方案中，多肽能够靶向表达GITR的肿瘤细胞并激活免疫系统。
例如，多肽可能能够(任选地通过ADCC)杀死表达GITR的肿瘤细胞。
应理解，免疫系统的激活可包括激活效应T细胞。
在进一步的实施方案中，多肽能够诱导肿瘤免疫。这可以在T细胞活化测定中体外测试，例如通过测量。IL-2和IFNγ的产生。效应T细胞的活化意味着可以在体内实现肿瘤特异性T细胞应答。此外，体内模型(例如小鼠模型)中的抗肿瘤反应意味着已经实现了对肿瘤的成功免疫应答。
多特异性(例如双特异性)抗体可以调节表达T细胞靶标的细胞的活性，其中所述调节是所述细胞活性的增加或降低。细胞通常是T细胞。抗体可以增加CD4+或CD8+效应细胞的活性，或者可以降低调节性T细胞(Treg)的活性。在任一情况下，抗体的净效应将是效应T细胞活性的增加。确定效应T细胞活性变化的方法是众所周知的，包括例如相对于对照存在下T细胞IFNγ或IL-2产生和/或T细胞增殖的水平，测量在抗体存在下T细胞IFNγ或IL-2产生水平的增加或T细胞增殖的增加。细胞增殖和/或IFNγ或IL-2产生的测定是公知的，并在实施例中举例说明。
用于评估配体对靶标的结合能力的标准测定法是本领域熟知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术分析。多肽的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过表面等离子体共振分析(SPR)或BioLayer干涉测定法(BLI)。
术语“结合活性”和“结合亲和力”旨在表示多肽分子结合或不结合靶标的趋势。可通过测定多肽及其靶标的解离常数(Kd)来定量结合亲和力。较低的Kd表示对靶标的较高亲和力。类似地，多肽与其靶标结合的特异性可以根据多肽对其靶标的比较解离常数(Kd)与相对于多肽和另一种非靶标分子的解离常数进行比较来定义。
该解离常数的值可以通过众所周知的方法直接确定，并且甚至可以通过诸如Caceci等人(Byte 9:340-362,1984；其公开内容通过引用并入本文)所述的方法甚至针对复杂混合物计算。例如，可以使用双滤膜硝酸纤维素滤膜结合试验建立Kd，例如Wong&Lohman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432,1993)所公开的试验。用于评估配体(例如抗体)对靶标的结合能力的其他标准测定法是本领域已知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过BiacoreTM或OctetTM系统分析。
可以进行竞争性结合测定，其中将抗体与靶标的结合与靶标与另一种已知配体(例如另一种抗体)的结合进行比较。发生50％抑制的浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等于Kd。Ki值永远不会小于Kd，因此可以方便地替换Ki的测量值以提供Kd的上限。
结合亲和力的替代测量包括EC50或IC50。在该上下文中，EC50表示多肽达到其与固定量靶标的最大结合的50％时的浓度。IC50表示多肽抑制固定量竞争者与固定量靶标的最大结合的50％时的浓度。在两种情况下，较低水平的EC50或IC50表明对靶标的亲和力较高。配体对其靶标的EC50和IC50值均可通过众所周知的方法测定，例如ELISA。用于评估EC50和IC50的合适测定法是本领域已知的。
本发明的多特异性(例如双特异性)多肽优选地能够与其靶标的每一种以比其结合另一种非靶标分子的亲和力至少2倍、10倍、50倍、100倍或更大的亲和力结合。
本发明的多特异性(例如双特异性)多肽可以通过任何合适的方法产生。例如，全部或部分多肽可以通过包含编码所述多肽的核苷酸的细胞表达为融合蛋白。
或者，部件B1和B2可以单独生产，然后连接在一起。连接可以通过任何合适的方法实现，例如使用上面概述的化学缀合方法和接头。部件B1和B2的单独生产可以通过任何合适的方式实现。例如，通过任选地在分开的细胞中从单独的核苷酸表达，如下文更详细解释的。
本领域技术人员应理解，本发明的多特异性抗体还可与除GITR和CTLA-4外的靶抗原结合；换句话说，本发明包括结合三种或更多种靶标的多特异性抗体。
例如，多特异性多肽可以是能够结合GITR、CTLA-4和另外的靶抗原的三特异性抗体。因此，另外的靶抗原可以是另外的T细胞靶标。
在一个实施方案中，进一步的T细胞靶标是检查点分子，例如共刺激或共抑制分子。关于“共刺激”，我们包括能够促进T细胞活化的共信号传导分子。关于“共抑制”，我们包括能够抑制T细胞活化的共信号传导分子。
因此，进一步的T细胞靶标可以是刺激性检查点分子(如CD27、CD137、CD28、ICOS和OX40)。有利地，本发明的多特异性多肽是刺激性检查点分子的激动剂。
或者/另外，另外的T细胞靶标可以是抑制性检查点分子(例如PD-1、Tim3、Lag3、Tigit或VISTA)。有利地，本发明的多特异性多肽是抑制性检查点分子的拮抗剂。
在一个实施方案中，另外的T细胞靶标是TNFR(肿瘤坏死因子受体)超家族成员。关于TNFR超家族成员，我们包括细胞因子受体，其特征在于通过胞外富含半胱氨酸结构域结合肿瘤坏死因子(TNF)的能力。TNFR的实例包括OX40和CD137。
在进一步的实施方案中，另外的T细胞靶标可以选自：OX40、CTLA-4、CD137、CD40和CD28。例如，第一和/或第二T细胞靶标可选自OX40、CTLA-4和CD137。
因此，多肽可以是能够结合GITR、CTLA-4和OX40的三特异性抗体。
变体
本文所述的多特异性(例如双特异性)多肽或其组成结构域(例如GITR和CTLA-4结合结构域)可包含本文所述的任何特定氨基酸序列的变体或片段，条件是该多肽或结合结构域保留与其目标的结合。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段的变体可以保留本文所述序列的CDR序列。例如，抗GITR抗体可包含表C中列举的任何特定氨基酸序列的变体或片段，条件是抗体保留与其靶标的结合。此类变体或片段通常可保留表C的所述序列的CDR序列。CTLA-4结合结构域可包含表A的任何序列的变体，条件是结合结构域保留与其靶标的结合。
本文所述的任何一个重链或轻链氨基酸序列的片段可包含至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少15个、至少18个、至少20个、至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个来自所述氨基酸序列的连续氨基酸。
本文所述的任何一种重链或轻链氨基酸序列的变体可以是所述序列的取代、缺失或添加变体。变体可以包含来自所述序列的1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30或更多个氨基酸取代和/或缺失。“缺失”变体可包括缺失单个氨基酸，缺失小的氨基酸组，例如2、3、4或5个氨基酸，或缺失较大的氨基酸区域，例如缺失特定氨基酸结构域或其他特征。“取代”变体优选包括用相同数量的氨基酸取代一个或多个氨基酸并进行保守氨基酸取代。例如，氨基酸可以被具有相似性质的替代氨基酸取代，例如，另一种碱性氨基酸、另一种酸性氨基酸、另一种中性氨基酸、另一种带电荷的氨基酸、另一种亲水性氨基酸、另一种疏水性氨基酸、另一种极性氨基酸、另一种芳香族氨基酸或另一种脂肪族氨基酸。可用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下：
本文中的氨基酸可以通过全名、三字母代码或单字母代码来指代。
优选的“衍生物”或“变体”包括其中代替天然存在的氨基酸，序列中出现的氨基酸是其结构类似物的那些。序列中使用的氨基酸也可以被衍生化或修饰，例如被标记，提供抗体的功能不会受到显著的不利影响。
如上所述的衍生物和变体可以在抗体合成期间或通过生产后修饰制备，或者当抗体是重组形式时使用已知的定点诱变、随机诱变或核酸的酶促切割和/或连接的技术制备。
优选地，变体具有的氨基酸序列与本文公开的序列中所示的序列具有超过60％、或超过70％，例如75或80％，优选超过85％，例如超过90或95％的氨基酸同一性。在相关的SEQ ID NO序列的整个长度上或在序列的一部分上可以看到这种水平的氨基酸同一性，例如跨越20、30、50、75、100、150、200或更多个氨基酸，这取决于全长多肽的大小。
与氨基酸序列相关的“序列同一性”是指使用ClustalW(Thompson等人，1994，Nucleic Acids Res.22(22):4673-80；其公开内容通过引用并入本文)以以下参数评估时具有所述值的序列：
成对比对参数-方法：准确，矩阵：PAM，空隙开口罚分(gap open penalty)：10.00，空隙扩展罚分(gap extension penalty)：0.10；
多个比对参数-矩阵：PAM，空隙开口罚分：10.00，延迟的同一性％：30，罚分末端空隙：打开，空隙分离距离：0，负矩阵：无，空隙扩展罚分：0.20，残基特异性空隙罚分：打开，亲水性空隙罚分：打开，亲水性残基：GPSNDQEKR。特定残基处的序列同一性旨在包括简单衍生化的相同残基。
多核苷酸、载体和细胞
本发明还涉及编码本发明多肽的全部或部分的多核苷酸。因此，本发明的多核苷酸可编码如本文所述的任何多肽，或B1的全部或部分或B2的全部或部分。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离的或基本上分离的形式提供。基本上分离，意味着可以从任何周围介质中分离出大量但不是完全的多肽。多核苷酸可以与载体或稀释剂混合，这些载体或稀释剂不会干扰它们的预期用途，并且仍然被认为是基本上分离的。
“编码”所选多肽的核酸序列是在适当的调节序列控制下在体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。出于本发明的目的，此类核酸序列可包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA或RNA的基因组序列，甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3'。
编码抗体的重链或轻链氨基酸序列的实例的代表性多核苷酸可包含本文公开的任何一种核苷酸序列或由其组成，例如表C中列出的序列。编码表C所示多肽的代表性多核苷酸可包含相应的核苷酸序列或由其组成，其也显示在表C中(内含子序列以小写字母显示)。编码CTLA-4结合结构域的实例的代表性多核苷酸可包含SEQ ID NO：25至43中的任一个或由其组成，如表B中所示。
或者，合适的多核苷酸序列可以是这些特定多核苷酸序列之一的变体。例如，变体可以是任何上述核酸序列的取代、缺失或添加变体。变体多核苷酸可包含在序列表中给出的序列的1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多75或更多个核酸取代和/或缺失。
合适的变体可以与本文公开的任何一种核酸序列的多核苷酸至少70％同源，优选与其至少80或90％，更优选至少95％、97％或99％同源。优选地，至少就多核苷酸的编码区而言存在这些水平的同源性和同一性。测量同源性的方法是本领域熟知的，并且本领域技术人员将理解，在本文中，基于核酸同一性计算同源性。这种同源性可以存在于至少15个，优选至少30个，例如至少40、60、100、200或更多个连续核苷酸的区域上。这种同源性可以存在于未修饰的多核苷酸序列的整个长度上。
测量多核苷酸同源性或同一性的方法是本领域已知的。例如，UWGCG包提供BESTFIT程序，其可用于计算同源性(例如，在其默认设置下使用)(Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12：387-395；其公开内容通过引用并入本文)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或排列序列(通常在其默认设置下)，例如Altschul,1993,J Mol Evol 36:290-300；Altschul等人,1990,J Mol Biol 215:403-10中描述的，其公开内容通过引用并入本文。
用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Centre forBiotechnology Information)公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中的相同长度的字对齐时匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻域字命中作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的HSP。只要可以增加累积对准分数，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。当以下情况时，停止每个方向上的字命中的扩展：由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积比对得分变为零或更低；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定对准的灵敏度和速度。BLAST程序使用以下作为默认值：字长(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；其公开内容通过引用并入本文)，比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；见例如Karlin&Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787；其公开内容通过引用并入本文。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为序列与另一序列相似。
同源物可以与相关多核苷酸中的序列相差少于3个、5个、10个、15个、20个或更多个突变(每个突变可以是取代、缺失或插入)。可以在同源物的至少30个，例如至少40、60或100个或更多个连续核苷酸的区域上测量这些突变。
在一个实施方案中，由于遗传密码的冗余，变体序列可以与序列表中给出的特定序列不同。DNA代码具有4个主要核酸残基(A、T、C和G)，并使用这些“拼写”三字母密码子，其代表生物体基因中编码的蛋白质的氨基酸。沿着DNA分子的密码子的线性序列被翻译成由这些基因编码的蛋白质中的氨基酸的线性序列。该代码是高度简并的，其中61个密码子编码20个天然氨基酸，3个密码子代表“停止”信号。因此，大多数氨基酸由多于一个密码子编码-实际上几个由四个或更多个不同密码子编码。因此，本发明的变体多核苷酸可以编码与本发明的另一种多核苷酸相同的多肽序列，但由于使用不同的密码子编码相同的氨基酸，因此可以具有不同的核酸序列。
因此，本发明的多肽可以以编码并能够表达它的多核苷酸的形式产生或以其递送。
本发明的多核苷酸可以根据本领域熟知的方法合成，如Green&Sambrook中举例所述(2012,Molecular Cloning-a laboratory manual,4th edition；Cold Spring HarborPress；其公开内容为通过引用并入本文)。
本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，所述表达盒包括与插入序列可操作地连接的控制序列，从而允许在体内表达本发明的多肽。这些表达盒又通常在载体(例如，质粒或重组病毒载体)内提供。这种表达盒可以直接给予宿主受试者。或者，可以将包含本发明多核苷酸的载体给予宿主受试者。优选地，使用遗传载体制备和/或施用多核苷酸。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息并允许表达本发明多肽的任何载体。
因此，本发明包括含有此类多核苷酸序列的表达载体。这种表达载体通常在分子生物学领域中构建，并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的引发剂、启动子、增强子和其他元件，例如可能是必需的多腺苷酸化信号，并且位于正确的方向，以允许表达本发明的肽。其他合适的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的(参见Green&Sambrook，同上)。
本发明还包括经过修饰以表达本发明多肽的细胞。此类细胞包括瞬时的或优选稳定的高等真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低等真核细胞，例如酵母或原核细胞，例如细菌细胞。可通过插入编码本发明多肽的载体或表达盒修饰的细胞的具体实例包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、NS0和COS细胞。优选地，选择的细胞系不仅是稳定的，而且还允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达。
本发明的这些细胞系可以使用常规方法培养以产生本发明的多肽，或者可以治疗性或预防性地用于将本发明的抗体递送至受试者。或者，可以将本发明的多核苷酸、表达盒或载体离体给予受试者的细胞，然后将细胞返回受试者的身体。
药物制剂、治疗用途和患者组
另一方面，本发明提供了组合物，其包含本发明分子，例如本文所述的抗体、多特异性(例如双特异性)多肽、多核苷酸、载体和细胞。例如，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明分子，例如本发明的一种或多种抗体和/或双特异性多肽，和至少一种药学上可接受的载体。
如本文使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于肠胃外给药，例如静脉内、肌肉内或皮下给药(如通过注射或输注)。取决于施用途径，可以将多肽包被在材料中以保护多肽免受酸和其它可能使多肽失活或变性的天然条件的作用。
优选的药学上可接受的载体包括含水载体或稀释剂可用于本发明组合物的合适含水载体的实例包括水、缓冲水和盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用例如卵磷脂的包衣材料，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中将包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。
本发明的组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。还可能期望在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
治疗性组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。组合物可调配为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。
根据需要通过将所需量的活性剂(例如多肽)掺入具有上面列举的成分的一种或组合的适当溶剂中，然后灭菌微过滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性剂掺入无菌介质中来制备分散体，所述无菌介质含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。在用无菌粉末制备无菌可注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性剂加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉末。
配制特别优选的组合物用于全身给药或局部给药。局部给药可以在肿瘤部位或到肿瘤引流淋巴结中。优选将组合物配制成在一段时间内持续释放。因此，组合物可以在促进持续释放的基质中提供或作为基质的一部分提供。优选的持续释放基质可包含montanide或γ-聚谷氨酸(PGA)纳米颗粒。任选地在持续的一段时间内局部释放本发明的多肽可以减少与施用CTLA-4拮抗剂相关的潜在的自身免疫副作用。
本发明的组合物可包含其他活性成分以及本发明的多肽。如上所述，本发明的组合物可包含一种或多种本发明的多肽。它们还可包含其他治疗剂或预防剂。
包含本发明的多肽或其他组合物和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可以进一步含有一种或多种另外的试剂，例如上面讨论的另外的治疗剂或预防剂。
根据本发明的多肽可用于治疗或预防。在治疗应用中，将多肽或组合物给予已经患有疾病或病症的受试者，其量足以治愈、缓解或部分阻止病症或其一种或多种症状。这种治疗性治疗可导致疾病症状的严重性的降低，或无症状期的频率或持续时间的增加。足以实现此的量被定义为“治疗有效量”。在预防性应用中，将多肽或组合物以足以预防或延缓症状发展的量给予尚未表现出病症或病症症状的受试者。这样的量被定义为“预防有效量”。可能已经通过任何合适的方式鉴定受试者有发展疾病或病症的风险。
特别地，本发明的抗体和双特异性多肽可用于治疗或预防癌症。因此，本发明提供了用于治疗或预防癌症的本发明的抗体或双特异性多肽。本发明还提供了治疗或预防癌症的方法，包括向个体施用本发明的多肽。本发明还提供了本发明的抗体或双特异性多肽，其用于制备用于治疗或预防癌症的药物。
癌症可能是前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、皮肤癌、淋巴瘤或胶质母细胞瘤。
本发明的抗体或双特异性多肽，或包含所述抗体或所述多肽的组合物，可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种给药途径给药。如本领域技术人员所理解的，给药途径和/或方式将根据所需结果而变化。优选全身给药或局部给药。局部给药可以在肿瘤部位或肿瘤引流淋巴结中。本发明的多肽或组合物的优选给药方式包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药方式，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射给药。或者，本发明的多肽或组合物可以通过非肠胃外模式给药，例如局部、表皮或粘膜给药方式。
合适剂量的本发明抗体或多肽可由熟练的医师确定。可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用特定多肽的活性，给药途径，给药时间，多肽的排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的相似因素。
合适剂量的本发明抗体或多肽可以是例如待治疗患者体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg。例如，合适的剂量可以是每天约1μg/kg至约10mg/kg体重或每天约10g/kg至约5mg/kg体重。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于给药和剂量均匀是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，其经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。
抗体或多肽可以以单剂量或多剂量施用。多剂量可以通过相同或不同的途径给予相同或不同的位置。或者，抗体或多肽可以如上所述作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率可以根据患者中多肽的半衰期和所需的治疗持续时间而变化。给药的剂量和频率也可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，可以在相对不频繁的间隔内长时间施用相对低的剂量。在治疗应用中，可以施用相对高的剂量，例如直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。
可以以多种不同方式实现两种或更多种药剂的组合施用。在一个实施方案中，抗体或多肽和其他药剂可以在单一组合物中一起施用。在另一个实施方案中，抗体或多肽和其他药剂可以作为组合疗法的一部分在单独的组合物中施用。例如，调节剂可以在其他药剂之前、之后或与其同时给药。
本发明的抗体、多肽或组合物还可以用于增加表达GITR和CTLA-4的细胞群的活化的方法中，该方法包括在适合于允许所述细胞和本发明多肽之间相互作用的条件下向所述细胞群施用本发明的多肽或组合物。细胞群通常包含至少一些表达GITR的细胞，通常是T细胞，和至少一些表达CTLA-4的细胞。该方法通常离体进行。
GITR的结合结构域
本发明的双特异性多肽包含对糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR；也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18[TNFRSF18]和活化诱导型TNFR家族受体[AITR])具有特异性的结合结构域。
与GITR特异性结合的抗体或其抗原结合片段具有某些优选的结合特征和功能效果，这将在下面更详细地解释。当作为本发明的双特异性抗体的一部分掺入时，所述抗体或其抗原结合片段优选保留这些结合特征和功能效应。本发明还提供了所述抗体作为分离形式的抗体或其抗原结合片段，即独立于本发明的双特异性抗体。
抗GITR结构域(B1)优选特异性结合GITR，即它与GITR结合，但与其他分子不结合或以较低的亲和力结合。如本文所用的术语“GITR”通常是指人GITR。人GITR的氨基酸序列示于SEQ ID NO：111(对应于GenBank：AAI52382.1)。B1结构域可以具有一些对来自其它哺乳动物的GITR，如来自非人类灵长类动物，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(食蟹猴(cynomolgus monkey))的GITR的结合亲和力。B1结构域优选不与鼠GITR结合和/或不与其他人TNFR超家族成员结合，例如人CD137、OX40或CD40。
B1结构域具有以其天然状态结合GITR的能力，特别是定位于细胞表面的GITR。“定位于细胞表面”如先前所定义。优选地，B1结构域将特异性结合GITR。也就是说，B1结构域优选地与GITR结合的结合亲和力高于其与另一分子结合的结合亲和力。
优选地，B1结构域的上述结合特性基本上保持在本发明的双特异性抗体中。
因此，双特异性抗体可以调节表达GITR的细胞的活性，其中所述调节是所述细胞活性的增加或减少。细胞通常是T细胞。抗体可以增加CD4+或CD8+效应T细胞的活性，或者可以降低Treg细胞的活性或消耗Treg细胞。在任一情况下，抗体的净效果将是Teff细胞，尤其CD4+、CD8+或NK效应T细胞活性增加。测定效应T细胞活性变化的方法是众所周知的，并且如早先所描述。
抗体优选在体外引起CD8+ T细胞活性增加，任选地，其中所述活性增加是T细胞增殖、IFN-γ产生和/或IL-2产生的增加。增加优选比在相同检定中测量的同种型对照抗体引起的活性变化高至少2倍，更优选至少10倍，并且甚至更优选至少25倍。
抗体优选以小于10×10-9M或小于7×10-9M、更优选小于4或2×10-9M、最优选小于1×10-9M的Kd值结合到人类GITR。
例如，抗体优选不与鼠GITR或任何其他TNFR超家族成员结合，例如OX40或CD40。因此，通常，抗体相对于人类GITR的Kd将比相对于另一非靶分子，如鼠GITR、其它TNFR超家族成员或环境中任何其它不相关材料或伴随材料的Kd低2倍、优选5倍、更优选10倍。更优选地，Kd将低50倍，甚至更优选低100倍，并且还更优选低200倍。
如前所述，该解离常数的值可以通过众所周知的方法直接确定。如前所述，还可以进行竞争性结合测定。
本发明的抗体优选地能够与其靶标以比其结合另一种非靶标分子的亲和力至少2倍、10倍、50倍、100倍或更大的亲和力结合。
因此，总之，抗GITR抗体优选表现出以下功能特征中的至少一种：
I.结合人GITR的KD值小于10×10-9M，更优选小于1.2×10-9M；和
II.能够在体外引起CD3+ T细胞活性增加，任选地，其中所述活性增加是T细胞增殖、IFN-γ产生和/或IL-2产生的增加。增加优选比在相同检定中测量的同种型对照抗体引起的活性变化高至少2倍，更优选至少10倍，并且甚至更优选至少25倍。
抗体对GITR具有特异性，通常为人GITR，并且可包含表D(1)和D(2)中任何相应行对的任何一个、两个、三个、四个、五个或所有六个示例性CDR序列。
例如，抗体可包含表D(1)和表D(2)的第一行的示例性CDR序列中的任何一个、两个、三个、四个、五个或所有六个(SEQ ID NO：76、77、78、88、89、90)。
或者，抗体可包含表D(1)和D(2)的第二、第三或第四行的示例性CDR序列中的任何一个、两个、三个、四个、五个或所有六个。
优选的抗GITR抗体可以至少包含如表D(1)的任何单独行中所定义的重链CDR3和/或如表D(2)的任何单独行中所定义的轻链CDR3。抗体可包含表D(1)的单独行中所示的所有三个重链CDR序列(即，给定“VH编号”的所有三个重链CDR)和/或表D(2)的单独行所示的所有三个轻链CDR序列(即，给定“VL编号”的所有三个轻链CDR)。
表C中显示了抗GITR抗体的完整重链和轻链可变区氨基酸序列的实例。还显示了编码每个氨基酸序列的示例性核酸序列。SEQ ID NOs 52至67涉及抗GITR抗体的相关氨基酸和核苷酸序列。表C中所述VH和VL区的编号对应于表D(1)和(2)中使用的编号系统。因此，例如，“2349，轻链VL”的氨基酸序列是包含表D(2)中所示的VL编号2349的所有三个CDR的完整VL区序列的实例，“2348，重链VH”的氨基酸序列是包含表D(1)中所示的VH编号2348的所有三个CDR的完整VH区序列的实例。
本发明优选的抗GITR抗体包括VH区，其包含特定VH编号的所有三个CDR，和包含特定VL编号的所有三个CDR的VL区。例如：抗体可包含VH编号2348的所有三个CDR和VL编号2349的所有三个CDR。这种抗体可以优选地包含2348和2349的相应的完整VH和VL序列(mAb-没有CTLA-4结合结构域)，如表C所示(SEQ ID NOs：52和61)。
或者，抗体可包含VH编号2372的所有三个CDR和VL编号2373的所有三个CDR。这种抗体可以优选包含2372和2373的相应的完整VH和VL序列(mAb-没有CTLA-4结合结构域)，如表C所示(SEQ ID NOs：54和63)。
或者，抗体可包含VH编号2396的所有三个CDR和VL编号2397的所有三个CDR。这种抗体可以优选地包含2396和2397的相应的完整VH和VL序列(mAb-没有CTLA-4结合结构域)，如表C所示(SEQ ID NO：56和65)。
或者，抗体可包含VH编号2404的所有三个CDR和VL编号2405的所有三个CDR。这种抗体可以优选地包含2404和2405的相应的完整VH和VL序列(mAb-没有CTLA-4结合结构域)，如表C所示(SEQ ID NOs：58和67)。
抗GITR抗体可以与本文所述的任何特异性抗GITR抗体结合相同的表位。
在一个替代实施方案中，结合结构域(B1)可以能够竞争性地抑制一种或多种本文描述的示例性GITR结合结构域与人GITR的结合，所述示例性GITR结合结构域例如包含选自SEQ ID NO：61、63、65和67的轻链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO：52、54、56和58的重链可变区氨基酸序列的抗体或其片段或变体。
通常产生竞争性结合，因为测试抗体在抗原上的表位或在至少非常接近抗原上表位的位置与参考抗体(在本情况下1630/1631)结合。然而，所属领域的技术人员应了解，由于空间干扰也可能产生竞争性结合；因此，测试抗体可以在与参考抗体结合的表位不同的表位处结合，但仍可以具有足够的大小或构型以阻碍参考抗体与抗原的结合。
用于鉴定能够竞争性抑制参考多肽与靶标结合的多肽的方法是本领域熟知的，例如ELISA、BLI或SPR。
CTLA-4的结合结构域
本发明的多特异性(例如双特异性)多肽还包含对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4；也称为CD152)特异的结合结构域。
人CTLA-4的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中提供。
CD86和CD80在本文中可称为B7蛋白(分别为B7-2和B7-1)。这些蛋白质在抗原呈递细胞的表面上表达，并与T细胞受体CD28和CTLA-4相互作用。B7分子与CD28的结合促进T细胞活化，而B7分子与CTLA-4的结合则阻断T细胞的活化。B7蛋白与CD28和/或CTLA-4之间的相互作用构成共刺激信号传导途径，其在免疫激活和调节中起重要作用。因此，B7分子是通路的一部分，易于操作以解除免疫抑制，从而增强患者的免疫力。
CD86蛋白是单体，由两个细胞外免疫球蛋白超家族结构域组成。CD86的受体结合结构域具有典型的IgV-组结构，而膜近端结构域具有C1-组样结构。CD80和CD86的结构已经单独测定或与CTLA-4复合测定。CD80和CD86分子上的接触残基位于可溶性细胞外结构域中，并且大部分位于β-折叠中而不是在(CDR样)环中。
SEQ ID NO：3是人野生型CD86的单体可溶性细胞外结构域的氨基酸序列。该野生型序列可任选地在N末端缺少丙氨酸和脯氨酸，即位置24和25。这些氨基酸在本文中可分别称为A24和P25。
本发明的双特异性多肽可以作为多肽结合结构域掺入对CTLA-4特异的结构域，即“CTLA-4结合结构域”。这种结合结构域的合适实例公开在WO2014/207063中，其内容通过引用并入本文。对CTLA-4特异的结合结构域也可以与CD28结合。如本文所用的术语CTLA-4通常是指人CTLA-4，本文使用的术语CD28通常是指人CD28。人CTLA-4和人CD28的序列分别在SEQ ID NO：1和2中列出。本发明多肽的CTLA-4结合结构域可以对来自其他哺乳动物的CTLA-4或CD28例如灵长类动物或鼠CTLA-4或CD28具有一些结合亲和力。
CTLA-4结合结构域具有以天然状态结合CTLA-4的能力，特别是结合于定位于细胞表面的CTLA-4。“定位于细胞表面”如以上所定义。
本发明多肽的CTLA-4结合结构域部分可包含或由以下组成：
(i)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或
(ii)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比时其中至少一个氨基酸发生改变的氨基酸序列，条件是所述结合结构域以比野生型人CD86更高的亲和力结合人CTLA-4。
换句话说，CTLA-4结合结构域是对人CTLA-4特异的多肽结合结构域，其包含或由(i)人野生型CD86的单体可溶性细胞外结构域，或(ii)所述可溶性细胞外结构域的多肽变体组成，条件是所述多肽变体以比野生型人CD86更高的亲和力结合人CTLA-4。
因此，本发明多肽的CTLA-4结合结构域可以具有与人野生型CD86相同的靶结合特性，或者与人野生型CD86的靶结合特性相比可以具有不同的靶结合特性。为了比较这些性质，“人野生型CD86”通常是指如前一节所述的人野生型CD86的单体可溶性细胞外结构域。
人野生型CD86特异性结合两种靶标CTLA-4和CD28。因此，本发明多肽的CTLA-4结合结构域的结合特性可以表示为多肽结合这些靶标中每一个的能力的单独量度。例如，人野生型CD86的单体细胞外结构域的多肽变体优选以比野生型人CD86对CTLA-4更高的结合亲和力结合CTLA-4。这种多肽还可任选地与CD28结合，其结合亲和力低于野生型人CD86对CD28的结合亲和力。
本发明多肽的CTLA-4结合结构域是对CTLA-4特异的多肽结合结构域。这意味着它与CTLA-4结合的结合亲和力优于其与另一分子结合的结合亲和力。CTLA-4结合结构域优选与CTLA-4结合，具有与野生型人CD86对于CTLA-4相同或更高的亲和力。
优选地，本发明多肽的CTLA-4结合结构域对于人CTLA-4的Kd与野生型人CD86对于人CTLA-4的Kd相比小至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少8倍或至少10倍。最优选地，CTLA-4结合结构域对于人CTLA-4的Kd比野生型人CD86对于人CTLA-4的Kd小至少5倍或至少10倍。确定多肽对于CTLA-4的Kd的优选方法是SPR分析，例如使用BiacoreTM系统。用于多肽SPR分析的合适方案是本领域已知的。
优选地，本发明的多肽的CTLA-4结合结构域对人CTLA-4的EC50比野生型人CD86对于人CTLA-4的在相同条件下的EC50小至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少15倍、至少17倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。最优选地，在相同条件下，CTLA-4结合结构域对于人CTLA-4的EC50比野生型人CD86对人CTLA-4的EC50小至少10倍或至少25倍。确定多肽对CTLA-4的EC50的优选方法是通过ELISA。用于评估多肽的EC50的合适的ELISA测定是本领域已知的。
优选地，当与野生型人CD86竞争结合人CTLA-4时，本发明多肽的CTLA-4结合结构域的IC50在相同条件下比野生型人CD86的IC50小至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少13倍、至少15倍、至少50倍、至少100倍或至少300倍。最优选地，CTLA-4结合结构域的IC50在相同条件下比野生型人CD86的IC50低至少10倍或至少300倍。用于测定本发明多肽的IC50的优选方法是通过ELISA。用于评估本发明多肽的IC50的合适的ELISA测定是本领域已知的。
本发明多肽的CTLA-4结合结构域也可以特异性结合CD28。也就是说，CTLA-4结合结构域可以以比结合另一分子的结合亲和力更高的结合亲和力结合CD28，CTLA-4例外。CTLA-4结合结构域可以与人CD28结合，其亲和力低于野生型人CD86对人CD28的亲和力。优选地，CTLA-4结合结构域对人CD28的Kd比野生型人CD86对人CD28的Kd高至少2倍，优选至少5倍，更优选至少10倍。
本发明多肽的CTLA-4结合结构域的结合特性也可以表示为多肽结合两种靶CTLA-4和CD28的能力的相对量度。也就是说，CTLA-4结合结构域的结合特性可以表示为多肽结合CTLA-4的能力与其结合CD28的能力的相对量度。优选地，当与人野生型CD86结合CTLA-4相对于CD28的相应相对能力相比时，CTLA-4结合结构域具有增加的相对于CD28与CTLA-4结合的相对能力。
当使用相同参数(例如Kd、EC50)评估多肽对CTLA-4和CD28二者的结合亲和力时，则多肽对每个靶标的相对结合能力可以表示为对于每个靶标的参数的值的简单比率。该比率可以称为多肽的结合率或结合强度比。对于用于评估结合亲和力的许多参数(例如Kd、EC50)，较低的值表示较高的亲和力。在这种情况下，CTLA-4相对于CD28的结合亲和力的比率优选表示为根据下式计算的单个数值：
结合比率＝[对CD28的结合亲和力]÷[对CTLA-4的结合亲和力]
或者，如果使用较高值表示较高亲和力的参数评估结合亲和力，则优选上式的倒数。在任一情况中，本发明多肽的CTLA-4结合结构域优选具有比人野生型CD86更高的结合比率。应当理解，给定多肽的结合比率与另一多肽的结合比率的直接比较通常需要使用相同的参数来评估结合亲和力并计算两种多肽的结合比率。
优选地，通过测定每种靶标的多肽的Kd，然后根据式[CD28的Kd]÷[CTLA-4的Kd]计算比率，计算多肽的结合比率。该比率可以称为多肽的Kd结合比率。用于确定多肽对于靶标的Kd的优选方法是SPR分析，例如使用BiacoreTM系统。用于本发明多肽的SPR分析的合适方案列于实施例中。根据该方法计算的本发明多肽的CTLA-4结合结构域的结合比率优选比根据相同方法计算的野生型人CD86的结合比率高至少2倍或至少4倍。
或者，可以通过测定多肽对每个靶标的EC50，然后根据公式[CD28的EC50]÷[CTLA-4的EC50]计算比率来计算多肽的结合比率。该比率可以称为多肽的EC50结合比率。确定多肽对靶标的EC50的优选方法是通过ELISA。用于评估本发明多肽的EC50的合适的ELISA测定法是本领域已知的。根据该方法计算的本发明多肽的CTLA-4结合结构域的结合比率比根据相同方法计算的野生型人CD86的结合比率高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
本发明多肽的CTLA-4结合结构域可以具有与另一种多肽交叉竞争结合CTLA-4的能力。例如，CTLA-4结合结构域可以与具有SEQ ID NO：6至24中任一个的氨基酸序列的多肽交叉竞争结合CTLA-4。可以在标准结合测定中鉴定此类交叉竞争多肽。例如，SPR分析(例如使用BiacoreTM系统)，ELISA测定或流式细胞术可用于证明交叉竞争。
除了上述功能特征外，本发明多肽的CTLA-4结合结构域具有某些优选的结构特征。CTLA-4结合结构域包含或由(i)人野生型CD86的单体可溶性细胞外结构域，或(ii)所述可溶性细胞外结构域的多肽变体组成，条件是所述多肽变体以比野生型人CD86更高的亲和力结合人CTLA-4。
人野生型CD86的单体可溶性细胞外结构域的多肽变体包含或由衍生自人野生型CD86的氨基酸序列组成，特别是人野生型CD86(SEQ ID NO：3)的可溶性细胞外结构域的氨基酸序列，任选地缺少A24和P25。特别地，变体包含这样的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，其中至少一个氨基酸被改变。“改变”是指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，缺失、插入或取代至少一个氨基酸。“缺失”是指去除SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)中存在的至少一个氨基酸，使得氨基酸序列缩短一个氨基酸。“插入”是指将至少一个另外的氨基酸引入SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)，使得氨基酸序列被延长一个氨基酸。“被取代”是指SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)中的至少一个氨基酸被替代性氨基酸替换。
通常，与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，改变了至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。通常，与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，改变不超过10、9、8、7、6、5、4、2或1个氨基酸。应当理解，这些下限中的任何一个可以与这些上限中的任何一个组合以限定与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比改变的允许数量的范围。因此，例如，本发明的多肽可包含这样的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，氨基酸改变的允许数目在2至3、2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、3至4、3至5、3至6等范围内。
当与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比时，特别优选的是改变至少2个氨基酸。优选地，与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，允许的氨基酸改变数量在2至9、2至8或2至7的范围内。
与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，可以通过缺失、插入或取代的任何组合实现上述数字和范围。例如，与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比，可能存在仅缺失、仅插入或仅取代，或缺失、插入或取代的任何混合。优选地，变体包含这样的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，所有改变都是取代。即，与SEQ ID NO：3的序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，没有缺失或插入氨基酸的序列。在优选变体的氨基酸序列中，当与SEQ IDNO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比时，取代了1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，并且与SEQ ID NO：3的序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，没有氨基酸缺失或插入。
优选地，与SEQ ID NO：3的序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比的变化在SEQID NO：3的FG环区域(位置114至121)和/或β折叠区域中。β折叠区域的链在SEQ ID NO：3中具有以下位置：A：27-31，B：36-37，C：54-58，C′：64-69，C″：72-74，D：86-88，E：95-97，F：107-113，G：122-133。
最优选地，与SEQ ID NO：3的序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比的变化在选自32、48、49、54、74、77、79、103、107、111、118、120、121、122、125、127或134的一个或多个位置。本文中所有氨基酸位置的编号基于从N末端开始计数SEQ ID NO：4中的氨基酸。因此，SEQ ID NO：3的N末端的第一个位置编号为24(参见图23中的示意图)。
特别优选的插入包括插入位置116和117之间的单个额外氨基酸和/或插入位置118和119之间的单个额外氨基酸。插入的氨基酸优选为酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)或天冬氨酸(D)。
特别优选的取代在122位，即精氨酸(R)。本发明的多肽优选包括这样的氨基酸序列，其中与SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或所述缺乏A24和P25的序列)相比，至少位置122被取代。位置122最优选的取代是用赖氨酸(K)或天冬酰胺(N)代替精氨酸，按优先顺序排列。该取代可称为R122K/N。
其他优选的取代位于107、121和125位，分别是亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和谷氨酸(Q)。除了在第122位的取代之外，本发明的多肽优选包括这样的氨基酸序列，其中与SEQ IDNO：3的氨基酸序列(或缺少A24和P25的所述序列)相比，第107、121和125位的至少一个氨基酸也被取代。本发明多肽的氨基酸序列也可以在32、48、49、54、64、74、77、79、103、111、118、120、127和134位中的一个或多个处取代。
107位最优选的取代是用异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或精氨酸(R)代替亮氨酸(L)，按优先顺序排列。该取代可称为L107I/F/R。类似的符号用于本文描述的其他取代。121位最优选的取代是用缬氨酸(V)代替异亮氨酸(I)。该取代可以称为I121V。
125位最优选的取代是用谷氨酸(E)代替谷氨酰胺(Q)。该取代可以称为Q125E。
在本发明多肽的氨基酸序列中可能优选的其他取代包括：F32I、Q48L、S49T、V54I、V64I、K74I/R、S77A、H79D/S/A、K103E、I111V、T118S、M120L、N127S/D和A134T。
人野生型CD86的所述可溶性细胞外结构域的特别优选的变体包含SEQ ID NO：6至24的任一氨基酸序列或由其组成，如表A中所示。
SEQ ID NO：6至14中所示的氨基酸序列可任选地在N末端包含额外的残基AP。SEQID NO：15至24中所示的氨基酸序列可任选地在N-末端缺少残基AP。在任一种情况下，这些残基对应于SEQ ID NO：3的A24和P25。
本发明多肽的CTLA-4结合结构域可包含人野生型CD86的所述可溶性细胞外结构域的任何上述变体或由其组成。也就是说，本发明多肽的CTLA-4结合结构域可包含SEQ IDNO：6至24中任一个的氨基酸序列或由其组成，如表A中所示。
结合结构域可以调节来自CTLA-4的信号传导，例如当施用至表达CTLA-4的细胞时，例如T细胞。优选地，结合结构域减少，即抑制或阻断所述信号传导，从而增加所述细胞的活化。施用测试剂(例如结合结构域)导致的CTLA-4信号传导和细胞活化的变化可以通过任何合适的方法确定。合适的方法包括当存在测试剂时或在合适的对照存在下，测定膜结合的CD86(例如在Raji细胞上)结合并通过T细胞表面上表达的CTLA-4发信号的能力。相对于在对照存在下T细胞IL-2产生和/或T细胞增殖的水平，在测试试剂存在下T细胞IL-2产生水平增加或T细胞增殖增加表明通过CTLA-4减少信号传导并增加细胞活化。在US20080233122的实施例9中公开了这种类型的典型测定。
其他T细胞靶标的结合结构域
本发明的多特异性(例如双特异性)多肽还包含对除GITR和CTLA-4之外的T细胞靶标特异性的结合结构域(参见上文)。
(a)OX40结合结构域
在一个实施方案中，多特异性(例如双特异性)多肽还包含对OX40特异的结合结构域。
OX40结合结构域的示例性VH和VL区在WO 2016/185016中公开，其公开内容通过引用并入本文。
(b)CD40-结合结构域
在一个实施方案中，多特异性(例如双特异性)多肽还包含对CD40特异的结合结构域。
CD40结合结构域的示例性VH和VL区显示于WO2015/091853和WO2013/034904中，其公开内容通过引用并入本文。
本发明的多特异性(例如双特异性)多肽的实施方案
在本发明第一方面的一个实施方案中，双特异性多肽具有对GITR和CTLA-4特异的结合结构域，例如B1对GITR具有特异性，B2对CTLA-4具有特异性。
这些结合结构域如上所定义。
所述实施方案的双特异性多肽部分B1-对GITR特异的结合结构域
对GITR特异性的结合结构域如上所定义。
所述实施方案的双特异性多肽部分B2-对CTLA-4特异的结合结构域
对CTLA-4特异的结合结构域如上所定义。
所述实施方案的双特异性多肽
本发明的双特异性多肽能够特异性结合人GITR和人CTLA-4。“能够特异性结合GITR和CTLA-4”是指根据上面各部分提供的定义，抗-CTLA-4部分特异性结合CTLA-4，而抗GITR部分特异性结合GITR。双特异性多肽可包含与本文所述的任何CTLA-4结合结构域连接的如本文所述的任何GITR结合结构域。当与作为单独实体存在的各个部分的结合特征相比时，当它们作为本发明的双特异性抗体的一部分存在时，不同部分对于它们各自靶标的所述特征优选地不变或基本不变。
通常，这意味着双特异性分子具有CTLA-4的Kd，当单独存在时，其优选与CTLA-4结合结构域的CTLA-4的Kd值基本相同。或者，如果双特异性分子的CTLA-4的Kd相对于CTLA-4结合结构域的CTLA-4的Kd在单独存在时增加，则增加不超过10倍，优选不超过9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍。另外，双特异性分子将独立地具有GITR的Kd，当单独存在时，其优选与GITR结合结构域的GITR的Kd值基本相同。或者，如果双特异性分子的GITR的Kd相对于抗-GITR抗体的GITR的Kd在单独存在时增加，则增加不超过10倍，优选不超过9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍。各个结合结构域的优选Kd值如上所述。
应当理解，CTLA-4结合的任何倍数变化可以独立地与GITR结合中任何所述的倍数变化组合，以描述给定双特异性分子的结合特征。
可以通过任何合适的测定评估本发明的任何双特异性多肽的GITR或CTLA-4的结合特征。特别地，上文针对每个单独部分所述的测定也可以应用于双特异性抗体或可以使用组合测定以评估同时结合两种靶标。用于评估本发明双特异性多肽的结合特征的合适测定法也在实施例中列出，并且是本领域已知的。
所述实施方案的双特异性多肽能够比单独的GITR或CTLA-4的单个激动剂或者这些单独的激动剂的组合更大程度地调节免疫系统细胞的活性。特别地，双特异性多肽的施用产生更高水平的T细胞活性，特别是效应T细胞活性，例如CD4+效应T细胞活性。效应T细胞活性的增加也比单独施用单独的GITR或CTLA-4激动剂(或其组合)产生的更加局部化，因为双特异性多肽仅在CTLA-4和GITR都是高度表达的微环境中发挥最大作用。肿瘤就是这样一种微环境。GITR在CD8T细胞中以升高的水平表达，因此可特别激活它们。CD8T细胞是有效肿瘤反应的主要效应成分之一。
效应T细胞活性的增加可直接来自通过激活GITR途径或通过阻断CTLA-4抑制途径刺激效应T细胞，或可间接来自Tregs的消耗或下调，从而减少它们的免疫抑制作用。Tregs的消耗/下调可以通过ADCP或ADCC机制介导。总的来说，结果将是非常强大的局部免疫激活，以立即产生肿瘤杀灭活性。
CTLA-4和GITR的细胞表面表达模式部分重叠，因此，本发明的双特异性抗体可以顺式和反式结合两种靶标。这可导致以不依赖FcγR交联的方式通过GITR和CTLA-4刺激的能力，这通过增加同一细胞上顺式受体聚集的水平，或通过在两个细胞之间产生人工免疫突触，这反过来可导致增强的受体聚集和两个细胞中增加的信号传导。总之，结果将是非常强大的肿瘤定向免疫激活，用于产生肿瘤杀灭活性。
可以使用任何合适的测定来测量本发明的双特异性多肽对免疫系统细胞的影响。例如，增加的效应T细胞的活性可以通过如以上关于双特异性多肽的单个组分B1和B2描述的测定，并且包括测量在双特异性多肽存在下相对于对照的通过CD4+和/或CD8+ T细胞的增殖或IFNγ或IL-2产生。相对于对照增殖或IFNγ或IL-2生产的增加指示增加的细胞活化。在US20080233122的实施例9中公开了这种类型的典型测定。细胞增殖和/或IFNγ或IL-2产生的测定是公知的，并在实施例中也举例说明。当在相同测定中评估时，双特异性分子通常将诱导效应T细胞活性的增加，该增加与由结合相同靶标的单特异性试剂的组合诱导的效应T细胞活性的增加相比至少高1.5倍或至少高2倍，更优选高3倍，最优选高5倍。
当在GITR和CTLA-4都高度表达的微环境中时，双特异性分子有效地激活免疫系统。通常，双特异性分子将增加CD4+或CD8+效应细胞的活性，或可降低Treg细胞的活性。在任一情况下，抗体的净效应将是效应T细胞活性的增加。当在相同测定中评估时，双特异性分子通常将诱导效应T细胞活性的增加，该增加与由结合相同靶标的单特异性试剂的组合诱导的效应T细胞活性的增加相比至少高1.5倍或至少高1.7倍，更优选高4.5倍，最优选高7倍。
测定效应T细胞活性变化的方法是众所周知的，并且如早先所描述。细胞增殖和/或IFNγ或IL-2产生的测定是公知的，并在实施例中举例说明。
例如，多肽可以能够特异性结合CTLA-4和GITR，B1可以是对GITR特异的抗体或其抗原结合片段；B2可以是对CTLA-4特异的多肽结合结构域，其包含或由以下组成：
i)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或
ii)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比时其中至少一个氨基酸发生改变的氨基酸序列，条件是所述结合结构域以比野生型人CD86更高的亲和力结合人CTLA-4。
由多肽特异性结合的CTLA-4可以是灵长类动物或鼠类的，优选人类的CTLA-4，和/或由多肽特异性结合的GITR可以是灵长类动物的，优选人类的GITR。
本发明多肽的部分B1是抗体或其抗原结合片段，其通常包含至少一个重链(H)和/或至少一个轻链(L)。本发明多肽的部分B2可以连接到B1的任何部分，但通常可以连接到所述至少一条重链(H)或至少一条轻链(L)，优选连接在N或C末端。本发明多肽的部分B2可以通过任何合适的连接分子(接头)直接或间接连接。
部分B1优选包含至少一个重链(H)和至少一个轻链(L)，部分B2优选连接至所述重链(H)或所述轻链(L)的N或C末端。B1的示例性抗体由两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)组成。这种抗体通常排列成两个臂，每个臂具有作为异二聚体连接的一个H和一个L，并且这两个臂通过H链之间的二硫键连接。因此，抗体实际上是由两个H-L异二聚体形成的同型二聚体。本发明多肽的部分B2可以连接到这种抗体的两条H链或两条L链，或仅连接到一条H链，或仅连接一条L链。
因此，本发明的多肽可以替代地描述为抗GITR抗体或其抗原结合片段，其附着有至少一个对CTLA-4特异的多肽结合结构域，其包含人野生型CD86或其变体的单体可溶性细胞外结构域或由其组成。B1和B2的结合结构域可以是本发明多肽中唯一的结合结构域。
本发明的多肽可包含根据下列任一式排列的多肽，以N-C方向书写：
(A)L-(X)n-B2；
(B)B2-(X)n-L；
(C)B2-(X)n-H；
(D)H-(X)n-B2；
其中H是抗体(即B1)的重链，L是抗体(即B1)的轻链，X是接头，n是0或1。当接头(X)是肽时，其通常具有氨基酸序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)、SGGGGSGGGGSAP(SEQ ID NO:48)、NFSQP(SEQ ID NO:49)、KRTVA(SEQ ID NO:50)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:51)或(SG)m，其中m＝1至7。式(A)至(D)的示意图如图24所示。
本发明还提供了一种多肽，其由根据式(A)至(D)中任一个排列的多肽组成。所述多肽可以作为单体提供，或者可以作为多聚体蛋白质的组分存在，例如抗体。可以分离所述多肽。这些多肽的氨基酸序列的实例显示在表C中。还显示了编码每种氨基酸序列的示例性核酸序列。示例性的氨基酸和核苷酸序列在SEQ ID NOs 68-75中列出。
部分B2可以通过任何合适的方式与本发明多肽的任何部分连接，或与接头连接。例如，多肽的各个部分可以通过化学缀合连接，例如通过肽键连接。因此，本发明的多肽可包含融合蛋白或由其组成，所述融合蛋白包含B1(或其组成部分)和B2，任选地通过肽接头连接。在这种融合蛋白中，B1的一个或多个GITR结合结构域或B2的一个或多个CTLA-4结合结构域可以是唯一的结合结构域。
用于将分子与多肽缀合的其他方法是本领域已知的。例如，碳二亚胺缀合(参见Bauminger&Wilchek，1980，Methods Enzymol.70：151-159；其公开内容通过引用并入本文)可用于将多种药剂(包括多柔比星)与抗体或肽缀合。水溶性碳二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)特别适用于将功能部分与结合部分缀合。作为另一个实例，可以通过高碘酸钠氧化，然后适当反应物的还原烷基化，或通过戊二醛交联来实现缀合。然而，应认识到，无论选择哪种方法，优选应当确定当作为本发明多肽的部分存在时，部分B1和B2保留或基本保留其靶结合特性。
可以使用相同的技术将本发明的多肽(直接或间接)与另一分子连接。另一种分子可以是治疗剂或可检测的标记。合适的治疗剂包括细胞毒性部分或药物。
本发明的多肽可以以分离的或基本上分离的形式提供。基本上分离，意味着可以从任何周围介质中分离出大量但不是完全的多肽。多肽可以与载体或稀释剂混合，这些载体或稀释剂不会干扰它们的预期用途，并且仍然被认为是基本上分离的。
本发明的示例性多肽可包含表C中所示的任何一种氨基酸序列或由其组成。
编码抗体的重链或轻链氨基酸序列的实例的代表性多核苷酸可包含表C中列出的任何一种核苷酸序列或由其组成，如SEQ ID NOs 53、55、57、59、60、62、64或66。编码表C中所示多肽的代表性多核苷酸可包含相应的核苷酸序列或由其组成，其也显示在表C中(内含子序列以小写字母显示)(例如，SEQ ID NOs 68、70、72和74)。编码部分B2的实例的代表性多核苷酸可包含SEQ ID NO：25至43中的任一个或由其组成，如表B中所示。
本发明的其他方面
本发明的第二方面包括根据本发明第一方面的多特异性(例如双特异性)多肽，其用于治疗或预防个体疾病或病症的方法中，如上所述。
本发明的第三方面是治疗或预防个体的疾病或病症的方法，该方法包括向个体施用根据本发明的第一或第二方面的多特异性(例如双特异性)多肽，如上所述。
本发明的一个实施方案是根据本发明第二方面的多特异性(例如双特异性)多肽或根据本发明第三方面的方法，其中所述疾病或病症是癌症，并且任选地其中所述个体是人。
在进一步的实施方案中，该方法包括全身或局部施用多特异性(例如双特异性)抗体，例如在肿瘤部位或肿瘤引流淋巴结中，如上所述。
癌症可能是前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、皮肤癌、淋巴瘤或胶质母细胞瘤。
本发明的第四方面是如上所述的编码根据本发明第一或第二方面的多特异性(例如双特异性)多肽的至少一条多肽链的多核苷酸。
本发明的第五方面是包含根据本发明第一或第二方面的多特异性(例如双特异性)多肽和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体的组合物。
在本发明的一个实施方案中，根据实施方案的第一或第二方面的多肽与另外的治疗部分缀合。
还将由本领域的技术人员理解的，本发明的药物组合物可以单独或与用于治疗癌症的其它治疗剂组合施用，其它治疗剂如抗代谢物、烷化剂、蒽环霉素和其它细胞毒性抗生素、长春花碱、依托泊苷、铂化合物、紫杉烷、拓扑异构酶I抑制剂、抗增殖免疫抑制剂、皮质类固醇、性激素和激素拮抗剂，以及其它免疫治疗性抗体(如曲妥珠单抗(trastuzumab))。
本发明的组合疗法可另外包含有效治疗癌症的其他免疫治疗剂，其特异性结合除GITR和/或CTLA-4之外的免疫检查点分子。应当理解，另外的免疫治疗剂的治疗益处可以通过减弱抑制性免疫检查点分子的功能和/或通过激活刺激性免疫检查点分子的功能来介导。
在另一个实施方案中，另外的治疗部分是选自下组的免疫治疗剂：
(a)结合PD-1的免疫治疗剂；
(b)结合OX40的免疫治疗剂；和
(c)结合CD137的免疫治疗剂。
因此，另外的免疫治疗剂可以是PD1抑制剂，例如抗PD1抗体，或其能够抑制PD1功能的抗原结合片段(例如，纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、Lambrolizumab、Pidilzumab和AMP-224)。或者，PD1抑制剂可包含抗PD-L1抗体或其能够抑制PD1功能的抗原结合片段或由其组成(例如，MEDI-4736和MPDL3280A)。
本发明的第六方面是对GITR特异的抗体，其如前所述。
附图说明
现在将参考以下附图描述体现本发明的某些方面的优选、非限制性实施例：
图1显示了一系列不同双特异性抗体的双抗原结合。将人GITR包被在ELISA板中，并以不同浓度添加双特异性抗体。加入生物素化的CTLA-4作为第二抗原，并使用链霉抗生物素蛋白-HRP作为检测试剂。
图2显示野生型和非岩藻糖基化形式的GITR/CTLA-4双特异性抗体2372/2373的双抗原结合。将人GITR包被在ELISA板中，并以不同浓度添加抗体。加入生物素化的CTLA-4作为第二抗原，并使用链霉抗生物素蛋白-HRP作为检测试剂。
图3显示了与人GITR相互作用的双特异性抗体的动力学曲线。针对固定在传感器尖端表面上的浓度范围为1.25至80nM的GITR测定双特异性抗体(300秒缔合和900秒解离)。
图4显示了与人CTLA-4相互作用的双特异性抗体2372/2373的动力学曲线。将双特异性抗体固定在传感器尖端上，并以10至80nM的浓度针对hCTLA-4测定(180秒缔合和600秒解离)。
图5示出双特异性抗体阻断GITR-GITR配体相互作用的能力。上部四个子图显示了用于每种双特异性抗体的两个传感器尖端(测定传感器和参考传感器)的传感图，而下部子图显示了不存在任何双特异性抗体下GITR配体与GITR的结合。图中包括的不同步骤是a)双特异性抗体与固定化GITR的结合，b)GITR配体与固定GITR(测定传感器)的结合或动力学缓冲液(参考传感器)中结合的双特异性抗体的解离和c)形成的GITR-GITR配体复合物的解离。
图6显示双特异性抗体2372/2373阻断二抗(双特异性或单特异性)与GITR相互作用的能力。上部四个子图显示了用于每个双特异性二抗的两个传感器尖端(测定传感器和参考传感器)的传感图，左下方子图显示了用于对照mAb的传感器尖端，右下方子图显示了没有任何二抗下2372/2373的缔合和解离曲线。图中包括的不同步骤是a)双特异性抗体2372/2373与固定化GITR的结合，b)二抗与固定GITR的结合，具有(测定传感器，顶部传感器)或没有(参考传感器，底部传感器)之前的2372/2373阻断。
图7显示了通过流式细胞术测定的野生型和非岩藻糖基化形式的GITR/CTLA-4双特异性抗体2372/2373与表达靶标的细胞的结合。CHO-GITRhi-CTLA-4hi细胞用连续稀释的抗体染色，然后用二级PE缀合的抗hFc抗体染色。
图8显示通过流式细胞术测定野生型和非岩藻糖基化形式的GITR/CTLA-4双特异性抗体2372/2373与表达FcγRIIIa的细胞的结合。用连续稀释的抗体染色CHO-FcγRIIIa细胞，然后用二级PE缀合的抗hFc抗体染色。
图9显示了使用ELISA评估的与野生型和非岩藻糖基化的2372/2373 GITR/CTLA-4双特异性抗体的C1q的结合。将人C1q包被在平板上，并以不同浓度添加抗体。使用绵羊抗人C1q-HRP作为检测抗体，然后使用过氧化物酶底物。包括利妥昔单抗作为阳性对照，并且IgG1和IgG4同种型对照作为阴性对照。
图10示出了用可溶性GITR/CTLA-4双特异性抗体或可溶性单特异性对照的组合(Miltenyi的GITR mAb和同种型对照与CTLA-4结合部分，iso/CTLA-4)刺激人CD3阳性T细胞的体外刺激后的IFNγ生产。在具有或不具有CTLA-4的CD3包被的平板中进行实验。A)GITR/CTLA-4双特异性抗体的完整剂量-反应曲线：2372/2373。B)双特异性抗体的单一抗体浓度(16nM)：2348/2349、2372/2373、2396/2397和2404/2405或单特异性对照。在总共4个供体中进行两次测定。显示了一个代表性实验(2个供体的平均值)。
图11显示野生型和非岩藻糖化的2372/2373变体的激动作用。在包被有αCD3和CTLA-4的平板中用野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体刺激CD3+ T细胞72小时。通过ELISA测量上清液中(A)IFN-γ和(B)IL-2的分泌。显示了一个代表性实验(4个供体的平均值)。
图12显示在A)不存在表达FcγRIIIa的细胞和B)在存在表达FcγRIIIa的CHO细胞(100,000个细胞/孔)的情况下响应于野生型和非岩藻糖基化GITR/CTLA-4双特异性抗体2372/2373和同种型对照的GITR活化。表达GITR的Jurkat细胞用作报告细胞。数据表示为相对于培养基对照的诱导倍数。
图13显示响应于GITR/CTLA-4双特异性抗体2372/2373、单特异性对应物(iso/CTLA-4+αGITRmAb)和同种型对照的组合的FcγRIIIa(V158)效应细胞的活化。GITRhi-CTLA4lo CHO细胞用作靶细胞。数据表示为相对于培养基对照的诱导倍数。显示了两个实验中的一个。
图14显示响应野生型和非岩藻糖基化的2372/2373 GITR/CTLA-4双特异性抗体和同种型对照的FcγRIIIa(V158)效应细胞的活化。作为靶细胞，使用A)CHO-GITRhi-CTLA4lo细胞和B)CHO-GITRhi-CTLA4hi细胞。数据表示为相对于培养基对照的诱导倍数。显示了两个实验中的一个。
图15显示响应野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体2372/2373和同种型对照的ADCC。将PBMC效应细胞和作为靶细胞的CHO-GITRhi-CTLA4hi细胞与测试化合物以50：1的比例共培养4小时，然后测量上清液中的LDH。显示了4个供体的平均值。
图16显示响应野生型和非岩藻糖基化的2372/2373 GITR/CTLA-4双特异性抗体对FcγRIIIa(V158)效应细胞的活化。作为靶细胞，使用(A)新鲜分离的Tregs(CD4+CD25+CD127lo)和(B)用αCD3/αCD28珠子活化48小时的Tregs。数据表示为相对于培养基对照的诱导倍数。(C)GITR和CTLA-4的表达通过在活化前后PBMC和Tregs上的流式细胞术测定。显示了两个供体的平均值。
图17显示了替代双特异性抗体在脾细胞测定中的激动作用。在包被有αCD3或CTLA-4的平板中用野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体刺激CD3+ T细胞48小时，并通过ELISA测量IFN-γ分泌形式的T细胞活化。
图18显示了mFcγRIV报道细胞的激活，作为替代野生型或非岩藻糖基化GITR/CTLA-4双特异性抗体对ADCC反应的指示。数据表示为相对于培养基对照的诱导倍数。
图19显示了双特异性替代GITR/CTLA-4抗体在CT26结肠癌模型中的抗肿瘤作用。在第7、10和13天进行腹膜内治疗。(A)与载体和DTA-1相比，2776/2777抑制肿瘤体积。(B)与载体相比，2776/2777 AF的存活率增加。图表显示了示例性图表，平均肿瘤体积+/-SEM或Kaplan-Meyer存活，n＝10/实验。
图20显示了双特异性替代GITR/CTLA-4抗体在MC38结肠癌模型中的抗肿瘤作用。在第7、10和13天，对携带已建立的皮下肿瘤的小鼠腹膜内进行治疗。(A)2776/2777抑制肿瘤体积，(B)与载体相比，2776/2777 AF治疗的小鼠的存活率增加。图表显示了示例性图表，平均肿瘤体积+/-SEM或Kaplan-Meyer存活，n＝10/实验。
图21显示了双特异性替代抗体对Tregs的抗肿瘤作用。携带皮下MC38结肠癌的小鼠在第10、13和16天用2776/2777或2776/2777 AF(200μg)腹膜内注射进行治疗。最后一次注射后24小时，收获肿瘤和脾脏，并对Tregs和效应细胞进行染色。(A)肿瘤中的Treg百分比(B)肿瘤内CD8/Treg比率和(C)脾脏中的CD8/Treg比率。图表显示平均值+SD。
图22显示了双特异性GITR/CTLA-4双特异性抗体的抗肿瘤功效。在第0天将RPMI-8226浆细胞瘤(10×106)皮下接种到右后腹侧/背部。在第5天腹膜内施用人PBMC细胞(5×106)。在第5、11和18天通过腹膜内注射(app 500nmol/剂量)进行治疗。(A)在hPBMC存在下的肿瘤体积抑制，n＝5/供体，n(供体)＝2(B)没有hPBMC的肿瘤体积抑制，n＝10/组。图表显示平均值+/-SEM。
图23提供本文公开的人野生型CD86氨基酸序列的示意性表示。(A)是没有N末端信号序列的人CD86的单体可溶性细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)；(B)是人野生型CD86的单体细胞外和跨膜结构域的氨基酸序列，包括N-末端信号序列(SEQ ID NO：4)；(C)是人CD86的全长氨基酸序列(Genbank ABK41931.1；SEQ ID NO：44)。A中的序列可任选地在N末端缺少丙氨酸和脯氨酸，即位置24和25，以粗体显示。B和C中的信号序列加下划线。氨基酸位置的编号基于SEQ ID NO：4和44，从N末端开始。
图24显示了本发明双特异性多肽的示例性排列结构的示意图。抗GITR抗体可变结构域用黑色填充；恒定域用白色。CTLA-A结合结构域用斜线阴影。
具体实施方式
序列说明
SEQ ID NO：1是人CTLA-4的氨基酸序列(对应于GenBank：AAD00698.1)
SEQ ID NO：2是人CD28的氨基酸序列(对应于GenBank：AAA51944.1)
SEQ ID NO：3是人野生型CD86的单体细胞外结构域的氨基酸序列，不包括来自N末端的23个氨基酸的信号序列。
SEQ ID NO：4是人野生型CD86的单体细胞外和跨膜结构域的氨基酸序列，包括N-末端信号序列(参见图23)。本文中所有氨基酸位置的编号基于从N末端开始的SEQ ID NO：4中的位置。因此，SEQ ID NO：3的N末端的丙氨酸编号为24。
SEQ ID NO：5是Peach等人(Journal of Biological Chemistry 1995，vol 270(36)，21181-21187)中公开的人CD86细胞外结构域的突变形式的氨基酸序列。野生型序列的第79位的H在SEQ ID NO：5的序列的相应位置被A取代。这种变化在本文中称为H79A。对于本文提及的其他氨基酸取代，始终使用等同的命名法。位置编号基于如上所述的SEQ IDNO：4。
SEQ ID NO：6至24是本发明特定蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25至43分别是编码SEQ ID NOs 6至24的氨基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：44是人CD86的全长氨基酸序列(对应于GenBank：ABK41931.1)
SEQ ID NO：45是鼠CTLA-4的氨基酸序列(对应于UniProtKB/Swiss-Prot：P09793.1)。
SEQ ID NO：46是鼠CD28的氨基酸序列(对应于GenBank：AAA37395.1)。
SEQ ID NO：47至51是可以用于本发明的双特异性多肽的各种接头。
SEQ ID NO：52至75是本发明的示例性序列。
SEQ ID NO：76至96是本发明的示例性CDR序列。
SEQ ID NO：97是示例性重链恒定区氨基酸序列。
SEQ ID NO：98是示例性轻链恒定区氨基酸序列。
SEQ ID NO：99是示例性修饰的人重链IgG4恒定区序列，其在铰链区(位置108)具有从Ser到Pro的突变，在CH3区(位置315)具有从His到Arg的突变。突变导致血清半衰期降低和IgG4核心铰链的稳定化，使IgG4更稳定，从而阻止Fab臂交换。
SEQ ID NO：100是示例性野生型人重链IgG4恒定区序列。这是缺少SEQ ID NO：99的突变的序列。
SEQ ID NO：101是示例性修饰的人重链IgG4恒定区序列，其在铰链区具有从Ser到Pro的单突变(位置108)。突变导致IgG4核心铰链的稳定化，使IgG4更稳定，阻止Fab臂交换。
SEQ ID NO：102是编码SEQ ID NO：99的IgG4恒定区的示例性cDNA序列(即缺少内含子)。
SEQ ID NO：103是编码SEQ ID NO：99的IgG4恒定区的示例性基因组DNA序列(即包括内含子)。
SEQ ID NO：104是编码SEQ ID NO：100的IgG4恒定区的示例性cDNA序列(即缺少内含子)。
SEQ ID NO：105是编码SEQ ID NO：100的IgG4恒定区的示例性基因组DNA序列(即包括内含子)。
SEQ ID NO：106和107分别是编码SEQ ID NO：97的IgG1恒定区的示例性cDNA和基因组DNA序列。
SEQ ID NO：108是编码SEQ ID NO：98的轻链κ区的示例性DNA序列。
SEQ ID NO：109是编码SEQ ID NO：101的IgG4区的示例性cDNA序列(即缺少内含子)。
SEQ ID NO：110是编码SEQ ID NO：101的IgG4区的示例性基因组DNA序列(即包括内含子)。
SEQ ID NO：111是人GITR的氨基酸序列(对应于GenBank：AAD00698.1)
SEQ ID NO：112至143是OX40结合结构域的VL和VH区的示例性氨基酸和核苷酸序列
表格(序列)
表A-人CD86结构域的示例性变体
表B-编码B2-CTLA-4的示例性多核苷酸
表C-示例性序列
表D(1)-根据IMGT编号的CDR序列
表D(2)-根据IMGT编号的CDR序列
其他序列
SEQ ID NO：1(人CTLA-4)
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIAKEKKPSYNRGLCENAPNRARM
SEQ ID NO：2(人CD28)
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO：3
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
SEQ ID NO：4
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIP
SEQ ID NO：5
APLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVASKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLA
SEQ ID NO：44(人CD86)
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF
SEQ ID NO：45(鼠CTLA-4)
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILVAVSLGLFFYSFLVSAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
SEQ ID NO：46(鼠CD28)
MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLCHTQSSPKLFWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWTNSRRNRLLQVTTMNMTPRRPGLTRKPYQPYAPARDFAAYRP
SEQ ID NO：47(接头序列)
SGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：48(接头序列)
SGGGGSGGGGSAP
SEQ ID NO：49(接头序列)
NFSQP
SEQ ID NO：50(接头序列)
KRTVA
SEQ ID NO：51(接头序列)
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：97(IgG1重链恒定区)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：98(κ链恒定区)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：99(修饰的IgG4恒定区)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：100(IgG4恒定区)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：101(修饰的IgG4恒定区)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：102
SEQ ID NO：103
SEQ ID NO：104
SEQ ID NO：105
SEQ ID NO：106
SEQ ID NO：107
SEQ ID NO：108
SEQ ID NO：109
SEQ ID NO：110
SEQ ID NO：111
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例1-双特异性抗体GITR/CTLA-4的双重ELISA
材料和方法
用50μl/孔的GITR-hFc(0.5μg/ml)(R&D Systems，#689-GR)包被ELISA板。然后将板用PBST(PBS+0.05％聚山梨醇酯20)洗涤3次，并在室温下用PBST和1％BSA封闭1小时。用PBST洗涤3次后，加入不同浓度(最高浓度66.7nM)的双特异性抗体，并在室温下温育1小时。如上洗涤平板并加入0.1μg/ml生物素化的CTLA-4-mFc(Ancell，#501-030)并在室温下温育1小时。用PBST洗涤三次后，加入HRP标记的链霉抗生物素蛋白并在室温下温育1小时。将板用PBST洗涤6次，并根据制造商的方案加入SuperSignal Pico发光底物(ThermoScientific，#37069)，并在Fluorostar Optima(BMG labtech)中测量发光。
结果和结论
双特异性抗体可以剂量依赖性方式同时与两种靶标结合(图1)，这对于所提出的作用模式很重要。非岩藻糖化双特异性抗体形式未见与靶结合的差异(图2)。野生型和非岩藻糖基化抗体的EC50值分别为0.64和0.54nM。
实施例2-双特异性抗体与GITR相互作用的动力学
材料和方法
使用配备有AR2G(Amine Reactive 2nd Gen)传感器尖端(ForteBio)的OctetRED96平台进行动力学测量。将人GITR(Acro Biosystems，#GIR-H5228)与10mM乙酸钠(pH5.0)中的生物传感器表面偶联，这使用标准胺偶联，用20mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、10mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1M乙醇胺-HCl(pH8.5)。将双特异性抗体在1x动力学缓冲液(ForteBio)中稀释至80nM、40nM、20nM、10nM、5nM、2.5nM和1.25nM。在1x动力学缓冲液中研究结合动力学，其中允许缔合300秒，然后解离900秒。使用pH 1.7的10mM甘氨酸再生传感器尖端。通过减去平行缓冲液空白来参考产生的数据，基线与y轴对齐，通过对解离进行的步骤间相关性进行，并且数据通过数据分析软件(v.9.0.0.14)中的萨维茨基-戈莱滤波进行平滑。使用1:1朗缪尔结合模型拟合处理的数据，X2为拟合精度的测量。
结果和结论
如下表1和图3中总结的，使用上述测定装置，双特异性抗体与KD在低nM至亚nM范围内结合GITR。X2值证实了良好的曲线拟合。
表1.与GITR的双特异性抗体相互作用的动力学曲线的总结。
双特异性抗体 k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M) X<sup>2</sup>(nm)
2348/2349 1.53×10<sup>5</sup> 5.28×10<sup>-5</sup> 3.46×10<sup>-10</sup> 0.0245
2372/2373 3.51×10<sup>5</sup> 2.14×10<sup>-4</sup> 6.08×10<sup>-10</sup> 0.4943
2396/2397 2.17×10<sup>5</sup> 1.46×10<sup>-4</sup> 6.73×10<sup>-10</sup> 0.0891
2404/2405 2.54×10<sup>5</sup> 4.23×10<sup>-4</sup> 1.67×10<sup>-9</sup> 0.2305
实施例3-双特异性抗体与CTLA-4相互作用的动力学
材料和方法
使用配备有抗hIgG Fc捕获(AHC)传感器尖端(ForteBio)的Octet RED96平台进行动力学测量。将双特异性抗体在1X动力学缓冲液(ForteBio)中稀释至2μg/ml，并加载至传感器尖端300秒。然后对4个2倍稀释的人CTLA-4(ACRO Biosystems，#CT4-H5229)测定固定的双特异性抗体。在1x动力学缓冲液中研究结合动力学，其中允许缔合180秒，然后解离600秒。使用pH 1.7的10mM甘氨酸再生传感器尖端。通过减去平行缓冲液空白来参考产生的数据，基线与y轴对齐，通过对解离进行的步骤间相关性进行，并且数据通过数据分析软件(v.9.0.0.14)中的萨维茨基-戈莱滤波进行平滑。使用1:1朗缪尔结合模型拟合处理的数据，X2为拟合精度的测量。
结果和结论
如下表2和图4中总结的，CTLA-4结合物2372/2373使用上述测定装置与具有nM范围内的KD的CTLA-4相互作用。X2值证实了良好的曲线拟合。
表2-2372/2373与CTLA-4相互作用的动力学概况汇总。
k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M) X<sup>2</sup>(nm)
1.90×10<sup>5</sup> 5.51×10<sup>-4</sup> 2.9×10<sup>-9</sup> 0.0754
实施例4-GITR/CTLA-4双特异性抗体阻断GITR和GITR配体之间相互作用的能力。
材料和方法
使用配备有AR2G(Amine Reactive 2nd Gen)传感器尖端(ForteBio)的OctetRED96平台进行配体阻断实验。将人GITR(Acro Biosystems，#GIR-H5228)与10mM乙酸钠(pH5.0)中的生物传感器表面偶联，这使用标准胺偶联，用20mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、10mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1M乙醇胺-HCl(pH8.5)。将双特异性抗体在1x动力学缓冲液(ForteBio)中稀释至80nM和GITR配体(Acro Biosystems，#GIL-H526a)至5μg/ml。在将一个传感器浸入GITR配体溶液(测定传感器)和一个传感器在1x动力学缓冲液(参比传感器)中300秒之前，允许每种双特异性抗体与两个平行的生物传感器尖端结合600秒。在没有任何双特异性抗体的1x动力学缓冲液中运行一对生物传感器以证明GITR配体结合而没有抑制。最后，在使用10mM甘氨酸(pH 1.7)进行传感器尖端再生之前，对形成的GITR-GITR配体复合物在1x动力学缓冲液中的解离进行120秒。
结果和结论
如图5所示，双特异性抗体以完全或部分阻断GITR与GITR配体相互作用的能力的方式结合GITR。2372/2373和2404/2405几乎完全阻断GITR配体。
实施例5-GITR/CTLA-4双特异性抗体阻断彼此与GITR的相互作用的能力。
材料和方法
使用配备有AR2G(Amine Reactive 2nd Gen)传感器尖端(ForteBio)的OctetRED96平台进行阻断实验。将人GITR(Acro Biosystems，#GIR-H5228)与10mM乙酸钠(pH5.0)中的生物传感器表面偶联，这使用标准胺偶联，用20mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、10mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1M乙醇胺-HCl(pH8.5)。在1x动力学缓冲液(ForteBio)中将双特异性抗体稀释至80nM(双特异性一抗)或20nM(双特异性二抗和对照mAb)。作为对照，使用市售的GITR特异性单特异性mAb(DT5D3，Miltenyi Biotec)。每个测定使用两个生物传感器尖端。使双特异性一抗与这些传感器之一(测定传感器)结合600秒，而另一个传感器在1x动力学缓冲液(参考传感器)中孵育。接下来，将两个传感器在含有二抗的孔中温育，并且在使用pH 1.7的10mM甘氨酸再生传感器之前研究结合180秒。
结果和结论
如图6所示，双特异性抗体具有至少部分抑制所有分析的二抗(双特异性以及对照mAb)与GITR结合的能力。使用所有四种双特异性抗体作为一抗重复该测定，在所有设置中具有类似的结果(数据未显示)。这表明该测定法中包括的所有抗体与重叠或至少非常接近的表位结合，使得它们阻断彼此与GITR的结合，或通过空间位阻或通过诱导GITR的构象变化干扰与受体的结合。
实施例6-与GITR/CTLA-4双特异性抗体的靶表达细胞结合
通过流式细胞术评估GITR/CTLA-4双特异性抗体与靶表达细胞的结合。将非岩藻糖基化形式与野生型IgG1进行比较。预期靶标结合能力没有差异。
材料和方法
使用稳定表达高水平GITR和CTLA-4的转染CHO细胞(CHO-GITRhi-CTLA-4hi细胞)。将250,000个细胞/孔用FACS缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)中的连续稀释的GITR/CTLA-4双特异性抗体在4℃下染色1小时。将细胞在FACS缓冲液中洗涤，然后加入在FACS缓冲液中1：100稀释的PE缀合的抗-hFc二抗(Jackson，#109-115-098)。在4℃温育30分钟后，将细胞洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中并在FACS Verse上分析。
结果和结论
如图7所示，没有看到靶标结合的差异。野生型和非岩藻糖基化抗体的EC50值分别为11.7和9.9nM。
实施例7-GITR/CTLA-4双特异性抗体与非岩藻糖基化Fc结构域的Fc受体结合
除抗原结合外，抗体还可通过与恒定结构域的相互作用而与Fc-γ受体(FcγR)结合。这些相互作用介导效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。效应子功能活性对于IgG1同种型是高的，但对于IgG2和IgG4是低的。有时需要增强IgG1抗体，特别是ADCC的效应子功能。这可以通过例如引入突变或通过非岩藻糖基化来实现。在这里，我们比较了野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体与人和小鼠FcγR的结合。预期用非岩藻糖基化形式增强与人FcγRIIIa的结合。
材料和方法
使用配备有抗人Fab-CH1(FAB2G)传感器尖端(ForteBio)的Octet RED96平台测定FcγR亲和力。将双特异性抗体在1×动力学缓冲液(ForteBio)中稀释至200nM，并且加载到一组8个平行传感器中300秒，以达到>1.5nm的固定化响应。然后针对7个2倍稀释的FcγR测定固定的双特异性抗体，对于人FcγRI，在100nM开始，对于所有其他测定的FcγR，从1μM开始。针对1×动力学缓冲液测定一个固定的传感器用于参考，并且在不固定双特异性抗体的情况下重复整个检定以允许双重参考。包括的FcγR获自安迪生物公司(人类FcγRI，编号1257-FC-050；人类FcγRIIa，编号1330-CD-050；人类FcγRIIb，编号1460-CD-050；人类FcγRIIIa(V158)，编号4325-FC-050；人类FcγRIIIa(F158)，编号8894-FC-050；小鼠FcγRI，编号2074-FC-050)；小鼠FcγRIIb，编号1875-CD-050；小鼠FcγRIII,编号1960-FC-050)和Sino Biologicals(小鼠FcγRIV，编号50036-M27H-50)。与FcγR结合进行60秒，然后在1×动力学缓冲液中解离60秒并且使用pH 1.7的10mM甘氨酸再生传感器尖端。生成的数据通过标准双重参考引用，基线与y轴对齐，通过对解离进行的步骤间相关性进行，并且数据通过数据分析软件(v.9.0.0.14)中的萨维茨基-戈莱滤波进行平滑。使用1:1朗缪尔结合模型拟合处理的数据，X2为拟合精度的测量。为了提高以非常快的解离速率针对FcγR产生的解离曲线的曲线拟合质量，在曲线拟合中仅包括解离曲线的最初10秒。
结果和结论
获得的针对该组FcγR评估的双特异性抗体的亲和常数(KD)总结在表3和表4中。如所预期的，2372/2373的非岩藻糖基化导致对人FcγRIIIa(V158和F158变体)的亲和力增加。除此之外，与这些双特异性抗体的野生型形式相比，非岩藻糖化形式的2372/2373和双特异性替代抗体结合小鼠FcγRIV的亲和力增加2.1-2.5倍。
表3-野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体对人Fcγ受体的亲和常数(KD，nM)的总结。
1形成的复合物的非常慢的解离速率降低了确定的解离速率常数的准确度，并因此降低了亲和常数
2由于这些相互作用的低亲和力引起的低响应显著降低了曲线拟合质量
3倍数＝KD 2372/2373 WT/KD 2372/2373 AF
表4-野生型和非岩藻糖化的2372/2373和替代GITR/CTLA-4双特异性抗体对小鼠Fcγ受体的亲和常数(KD,nM)的总结
1由于这些相互作用的低亲和力引起的低响应显著降低了曲线拟合质量
2倍数＝KD 2372/2373 WT/KD 2372/2373 AF
实施例8-与非岩藻糖基化Fc结构域的GITR/CTLA-4双特异性抗体的表达FcγRIIIa的细胞的结合
为了证实与非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体的FcγRIIIa的结合增强，通过流式细胞术评估了与表达FcγRIIIa的细胞的结合。
材料和方法
使用稳定表达高水平FcγRIIIa(V158)的转染CHO细胞(CHO-FcγRIIIa细胞)。将250,000个细胞/孔用FACS缓冲液(含有0.5％BSA的PBS)中的连续稀释的GITR/CTLA-4双特异性抗体在4℃下染色1小时。将细胞在FACS缓冲液中洗涤，然后加入在FACS缓冲液中1：100稀释的PE缀合的抗-hFc二抗(Jackson，#109-115-098)。在4℃温育30分钟后，将细胞洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中并在FACS Verse上分析。
结果和结论
如所预期的，与野生型IgG1变体相比，用非岩藻糖基化的双特异性抗体观察到与FcγRIIIa表达细胞的增强的结合(图8)。
实施例9-GITR/CTLA-4双特异性抗体与人补体的C1q组分的结合
在该实施例中，使用具有野生型和非岩藻糖基化IgG1形式的GITR/CTLA-4双特异性抗体评估与人补体系统的C1q组分的结合。
材料和方法
用人C1q蛋白(2μg/ml)、50μl/孔(Calbiochem，#204876)包被ELISA板。然后将板用PBST(PBS+0.05％聚山梨醇酯20)洗涤3次，并在室温下用PBST和1％BSA封闭1小时。用PBST洗涤3次后，加入不同浓度的单克隆或双特异性抗体，并在室温下温育2小时。如上洗涤平板，并以1：400稀释度添加50μl绵羊抗人C1q-HRP(BioRad，#2221-5004P)。在室温下孵育1小时后，将板在PBST中洗涤6次，然后加入50μl过氧化物酶(Pierce，#37069)。在FluorostarOptima(BMG Labtech)中测量发光。
结果和结论
如图9所示，用野生型和非岩藻糖基化的2372/2373观察到与C1q类似的剂量依赖性结合，并且该水平与IgG1同种型对照相当。如所预期的，IgG4同种型对照未见结合。另一方面，利妥昔单抗由于其结合C1q和介导补体介导的裂解的能力而被包括作为阳性对照，产生强烈信号。
实施例10-双特异性GITR/CTLA-4抗体的激动功能
测定了双特异性GITR/CTLA-4抗体在CTLA-4存在下活化表达GITR的T细胞的能力。通过双特异性抗体结合CTLA-4包被的孔，在GITR的交联存在下，预期T细胞激活增加IFNγ生产。目的是当CTLA-4存在时，实现双特异性抗体的更高功效和效力，以及比GITR单特异性抗体(GITR mAb)和与CTLA-4结合部分偶联的同种型对照组合(iso/CTLA-4)更高的功效。此外，比较野生型和非岩藻糖基化形式的双特异性抗体2372/2373。用非岩藻糖基化的双特异性抗体形式，预期激动功能没有变化。
材料和方法
使用阴性选择(Pan T细胞分离试剂盒，人，Miltenyi，130-096-535)从Ficoll分离的PBMC(从Lund大学医院的血库获得的白细胞过滤器)中纯化人CD3阳性T细胞。将在PBS中稀释的带或不带CTLA-4(Orencia,5μg/ml)的50μl的α-CD3(克隆:OKT3,BD,浓度:3μg/ml)在4℃下涂布至非组织培养处理的U形96孔板(Nunc，VWR#738-0147)的表面过夜。洗涤后，加入T细胞(100,000个细胞/孔)。将双特异性GITR/CTLA-4抗体以连续稀释加入孔中，并在相同的摩尔浓度下与2种单特异性对照的组合进行比较：1)GITR mAb，市售的单特异性GITR抗体(DT5D3，Miltenyi Biotec)和2)iso/CTLA-4，与CTLA-4结合部分偶联的同种型对照。将CTLA-4包被的孔与非CTLA-4包被的孔进行比较。在湿气室内于37℃、5％CO2孵育72个小时后，通过ELISA在上清液中测定IFNγ和/或IL-2水平。
结果和结论
图10中的结果表明了可溶性双特异性抗体的剂量依赖性激动作用，其仅在包被有α-CD3和CTLA-4的板中培养时诱导T细胞IFNγ产生的增加，而单特异性GITR抗体和具有CTLA-4结合部分的同种型对照的组合没有诱导。体外测定代表GITR和CTLA-4在肿瘤微环境中相对过表达的情况的实验模型。因此，结果表明，与单特异性抗体相比，双特异性抗体具有增加的激动作用，其依赖于存在于具有高水平活化T细胞或Treg(例如肿瘤微环境)的环境中的CTLA-4。此外，如图11所示，未观察到野生型和非岩藻糖化的2372/2373变体的激动作用的差异。
实施例11-GITR/CTLA-4双特异性抗体对FcγRIIIa交联的激动功能
对于许多免疫调节抗体，FcγR参与对其功效至关重要。在该实施例中，在FcγRIIIa交联存在下检查双特异性GITR/CTLA-4抗体的激动活性。由于非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体与FcγRIIIa的结合增强，与野生型IgG1相比，预期该变体的活化增加。
材料和方法
在含有稳定表达GITR的Jurkat细胞和响应元件下游的荧光素酶的GITR活化测定(GITR Bioassay，Promega，#CS184006)中测试双特异性GITR/CTLA-4抗体的激动功能。通过产生的荧光素酶定量测试抗体诱导的活化并测量为发光性。在不存在或存在稳定表达FcγRIIIa(V158)的转染CHO细胞(100,000个细胞/孔)的情况下，响应于连续稀释的GITR/CTLA-4双特异性抗体和同种型对照，测定GITR活化的诱导。孵育6小时后，加入Bio-Glo荧光素酶测定试剂，测量发光性。
结果和结论
如图12A所示，用野生型和非岩藻糖基化的2372/2373抗体观察到类似的活化。然而，在FcγRIIIa交联的存在下，非岩藻糖基化的双特异性抗体的GITR活化更高(图12B)。
实施例12-在ADCC报告基因测定法中GITR/CTLA-4双特异性抗体诱导靶细胞耗竭的能力
GITR/CTLA-4双特异性抗体的一种作用模式是诱导靶表达细胞的ADCC。在肿瘤环境中，这些构成了具有GITR和CTLA-4二者高表达的Tregs。为了模拟这种环境，已生成转染CHO细胞，其稳定表达高水平的GITR和CTLA-4(CHO-GITRhi-CTLA4hi细胞)以及高水平的GITR和低水平的CTLA-4(CHO-GITRhi-CTLA4lo细胞)。使用ADCC报告基因测定法测试野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体诱导靶表达细胞的ADCC的能力。由于非岩藻糖基化抗体对FcγRIIIa具有更高的亲和力，因此预期该形式的增强的ADCC。
材料和方法
使用来自Promega的基于报告基因的系统(ADCC报告生物测定试剂盒，#G7010)，其含有稳定表达FcγRIIIa(V158)受体的Jurkat效应细胞和驱动萤火虫荧光素酶表达的NFAT反应元件。通过产生的荧光素酶定量测试抗体诱导的效应子细胞活化并测量为发光性。使用CHO-GITRhi-CTLA4hi和CHO-GITRhi-CTLA4lo细胞作为靶细胞，测定响应于连续稀释的GITR/CTLA-4双特异性抗体、单克隆对应物(iso/CTLA-4+αGITRmAb)和同种型对照的混合物的ADCC的诱导。效应细胞：靶细胞比例为5：1。孵育6小时后，加入Bio-Glo荧光素酶测定试剂，测量发光性。
结果和结论
如图13所示，使用CHO-GITRhi-CTLA4lo细胞作为靶细胞，与等摩尔浓度的两种单克隆对应物的组合相比，观察到GITR/CTLA-4双特异性抗体的优异效果。同种型对照未见效果。此外，使用CHO-GITRhi-CTLA4lo细胞(图14A)和CHO-GITRhi-CTLA4hi细胞作为靶细胞(图14B)，对非岩藻糖基化的双特异性抗体观察到作为ADCC模型的优异FcγRIIIa活化。
实施例13-GITR/CTLA-4双特异性抗体诱导靶表达细胞的PBMC介导的细胞裂解的能力
材料和方法
为了确定GITR/CTLA-4双特异性抗体诱导靶表达细胞耗尽的能力，研究了作为效应细胞的原代PBMC介导的ADCC水平。使用稳定表达高水平GITR和CTLA-4的转染CHO细胞(CHO-GITRhi-CTLA-4hi细胞)作为靶细胞。LDH细胞毒性测定(Pierce，#88953)用于评估细胞裂解。从健康供体的白细胞过滤器中纯化PBMC。将效应细胞和靶细胞以50：1的效应细胞：靶细胞比例与连续稀释的GITR/CTLA-4双特异性抗体或同种型对照孵育4小时。此后，测量上清液中的LDH水平。
结果和结论
如图15所示，与野生型IgG1变体相比，非岩藻糖基化的双特异性抗体观察到靶表达细胞的优异消耗。
实施例14-GITR/CTLA-4双特异性抗体消耗原发性Tregs的能力
使用表达作为靶细胞的GITR和CTLA-4的Tregs的ADCC报告基因测定法评估GITR/CTLA-4双特异性抗体的体外ADCC活性。
材料和方法
使用ADCC报告基因测定法(Promega，#G7010)，其含有稳定表达FcγRIIIa(V158)受体的效应细胞。使用EasySepTM人CD4+CD127lowCD25+调节性T细胞分离试剂盒(StemcellTechnologies，#18063)通过阴性选择分离CD4+CD25+CD127lowTreg，并用作靶细胞。Tregs在ADCC报告基因测定法中新鲜使用，或在人T-活化剂CD3/CD28 Dynabeads(Gibco，#11131D)存在下活化48小时以上调GITR和CTLA-4的表达后使用。响应于连续稀释的GITR/CTLA-4双特异性抗体评估ADCC的诱导。将效应细胞和靶细胞以5：1的比例培养6或18小时。通过流式细胞术测定培养前后GITR和CTLA-4的表达。
结果和结论
GITR/CTLA-4双特异性抗体不在新鲜Treg中介导ADCC(图16A)。然而，在用αCD3/CD28珠粒活化48小时后，诱导ADCC。与野生型IgG1形式相比，非岩藻糖基化变体的诱导显著更高(图16B)。结果与GITR和CTLA-4的表达水平相关。新鲜PBMC和Tregs表达低水平的GITR和CTLA-4，而在体外活化后水平明显上调(图16C)。
实施例15-GITR/CTLA-4双特异性抗体诱导细胞因子释放的能力
细胞因子释放综合征是可能危及生命的毒性，已在抗体的癌症免疫治疗中观察到。在这里，我们比较了野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-双特异性抗体在全血和基于PBMC的细胞因子释放测定中诱导细胞因子释放的能力。
材料和方法
在KWS Biotest(Bristol，UK)的全血和PBMC细胞因子释放测定(CRA)中测试野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-双特异性抗体2372/2373诱导细胞因子释放的能力。包括阿仑单抗(Alemtuzumab)、莫罗单抗(Muromonab)和Ancell抗CD28(ANC28.1)作为阳性对照，非特异性IgG1、IgG4和IgG2a作为阴性对照。以0.1、1和10μg/孔测试所有抗体。
全血取自4名健康供体。将测试抗体和对照一式两份加入血液中。培养48小时后评估细胞因子的产生。将PBMC与从3个健康供体收集的全血样品分离。在加入PBMC之前，将测试抗体和对照固定在孔中。未涂覆的孔充当阴性对照，并且每种条件一式两份进行测试。在72小时的培养期后评估细胞因子的产生。对于这两种测定，促炎组1(人)用于使用Luminex平台定量测定培养上清液中的IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13和TNFα。
使用线性回归进行数据分析，然后使用Tukey's事后检验的单向ANOVA来比较每种细胞因子的不同治疗组之间的斜率。对于一些不允许我们进行单向ANOVA的细胞因子，线性回归分析给出等于0的斜率。使用双向ANOVA，然后使用Tukey的事后检验来比较不同浓度的处理对全血和湿涂测定的每种细胞因子的影响。
结果和结论
对于所有测试的供体，未刺激的细胞显示两种CRA形式的背景细胞因子释放的预期水平。阳性对照抗体导致强烈的细胞因子反应，在每种细胞因子释放测定形式中具有预期的水平。与固定的CRA形式相比，全血CRA通常导致更高的供体可变性。
两种GITR/CTLA-4双特异性抗体均未诱导IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、TNFα和IFNγ水平高于任一种测定中的IgG1同种型对照诱导的水平。在两种测定中，在不存在抗体的情况下诱导高水平的IL-8，这对于该细胞因子而言并不出乎意料。阳性对照培养物中IL-8水平的轻微升高表明刺激能够使IL-8产生水平高于背景。
在两种测定中，野生型和非岩藻糖基化的GITR/CTLA-4双特异性抗体均未诱导细胞因子分泌高于IgG1同种型对照诱导的水平。
实施例16-鼠替代双特异性GITR/CTLA-4抗体的激动功能
为了在体内模型中研究双特异性抗体，使用野生型(2776/2777)和非岩藻糖基化变体(2776/2777 AF)中的人IgG1形式产生靶向鼠GITR/CTLA-4的替代双特异性抗体。为了评估替代双特异性GITR/CTLA-4抗体对激活小鼠T细胞的能力，脾细胞测定法用于确定IFN-γ生产的形式的T细胞活化。两种双特异性变体均能够活化T细胞，并且如所预期的，在野生型和非岩藻糖基化变体之间未观察到活化水平的差异。
材料和方法
将从C57BL6小鼠脾脏中分离的鼠CD3+ T细胞(Miltenyi，Pan-T分离试剂盒II)加入到涂有αCD3(BD，0.8μg/mL)和CTLA-4(Orencia，5μg/ml)的96孔板中。以连续稀释添加双特异性GITR/CTLA-4抗体，并与同种型或同种型/CTLA-4对照进行比较。通过ELISA在48小时后测定IFN-γ释放的形式的T细胞活化。
结果和结论
在脾细胞测定中研究了替代双特异性抗体的激动作用。野生型和非岩藻糖化变体均表明激动T细胞活化和剂量依赖性IFN-γ释放的诱导(图17)。在没有CTLA-4包被的孔中或在含有同种型对照的孔中未观察到这种T细胞活化。如所预期的，在野生型和非岩藻糖基化的2776/2777变体之间没有观察到激动作用的差异。
实施例17-小鼠替代GITR/CTLA-4双特异性抗体在报告基因测定中诱导ADCC的能力
在肿瘤环境中Tregs具有GITR和CTLA-4二者的高表达。预期GITR/CTLA-4双特异性抗体诱导靶表达细胞的ADCC，特别是在肿瘤环境中。使用对鼠FcγRIV特异的ADCC报告基因测定法检查了鼠双特异性替代物作为野生型和非岩藻糖基化变体诱导ADCC的能力。两种双特异性抗体的变体均显示出报告细胞的活化。然而，由于非岩藻糖基化抗体对鼠FcγRIV的亲和力高于野生型抗体，因此非岩藻糖基化变体显示出增强的ADCC诱导。
材料和方法
使用mGITR包被的孔，使用mFcγRIV受体的基于报告基因的系统(Promega ADCC报告基因生物测定试剂盒)来确定响应于GITR/CTLA-4双特异性抗体或同种型对照的ADCC。以固定浓度添加效应细胞，诱导ADCC 6小时。
结果和结论
使用ADCC报告基因测定研究了GITR/CTLA-4双特异性替代抗体的野生型和非岩藻糖基化变体诱导ADCC的能力。两种变体都能够激活鼠特异性FcγRIV报告细胞，其作为ADCC诱导的指示(图18)。与对于鼠FcγRIV具有比野生型抗体更高亲和力的非岩藻糖基化抗体一致，用非岩藻糖化双特异性抗体变体检测到优于野生型的ADCC诱导。这些发现证明了与人类相比的鼠系统的相关模拟，提供了研究ADCC效应和作用模式的模型，尽管小鼠和人的Fc受体功能不同。
实施例18-小鼠替代GITR/CTLA-4双特异性抗体在CT26结肠癌模型中的抗肿瘤功效
使用BalbC小鼠针对CT26结肠癌模型检查替代双特异性抗体的抗肿瘤作用。野生型和非岩藻糖基化抗体变体均以肿瘤体积抑制和增加的存活形式显示出统计学上显著的抗肿瘤功效。
材料和方法
来自法国Janvier的7-8周龄雌性BalbC小鼠用于实验。所有实验均经Malmo/Lund伦理委员会批准。
在第0天皮下注射生长在对数期的CT26结肠癌(0.1×106个细胞)，并在第7、10和13天腹膜内用2776/2777或2776/2777AF(200μg)治疗小鼠。使用大鼠抗小鼠GITR抗体DTA-1(摩尔当量计，BioXcell，US)作为阳性对照。用卡尺每周测量肿瘤三次，并使用公式((宽度/2)×(长度/2)×(高度/2)×π×(4/3))计算肿瘤体积。使用GraphPad Prism程序、用于肿瘤生长的Mann-Whitney非参数双尾测试和用于存活的Kaplan-Meyer存活，log-rank检验(Mantel-Cox)进行统计分析。
结果和结论
使用CT26结肠癌模型在BalbC小鼠中研究双特异性GITR/CTLA-4替代物2776/2777的抗肿瘤功效。与肿瘤体积抑制形式的载体相比，野生型变体2776/2777表现出统计学上显著的抗肿瘤功效，p＝0.0002(图19A)。该抗肿瘤效力优于阳性对照抗体DTA-1。
类似地，与载体治疗相比，用非岩藻糖化变体2776/2777AF治疗显著增加小鼠的存活率(p＝0.0029)，并且小鼠的约30％是从由所述治疗建立的肿瘤治愈(图19B)。
实施例19-小鼠替代GITR/CTLA-4双特异性抗体在MC38结肠癌模型中的抗肿瘤功效
使用C57BL6小鼠针对MC38结肠癌模型检查替代双特异性抗体的抗肿瘤作用。野生型和非岩藻糖基化双特异性抗体均以肿瘤体积抑制和增加的存活形式显示出统计学上显著的抗肿瘤功效。
材料和方法
来自法国Janvier的7-8周龄雌性C57BL6小鼠用于实验。所有实验均经Malmo/Lund伦理委员会批准。
在第0天皮下注射生长在对数期的MC38结肠癌(1×106个细胞)，并在肿瘤建立后在第7、10和13天腹膜内用2776/2777或2776/2777AF(200μg)治疗小鼠。用卡尺每周测量肿瘤三次，并使用公式((w/2)×(1/2)×(h/2)×π×(4/3))计算肿瘤体积。使用GraphPadPrism程序、用于肿瘤生长的Mann-Whitney非参数双尾测试和用于存活的Kaplan-Meyer存活，log-rank检验(Mantel-Cox)进行统计分析。
结果和结论
使用MC38结肠癌模型在C57BL6小鼠中研究双特异性GITR/CTLA-4替代物2776/2777作为野生型或非岩藻糖基化变体的抗肿瘤功效。与肿瘤体积抑制形式的载体相比，2776/2777表现出统计学上显著的抗肿瘤功效，p＝0.0006(图20A)。类似地，非岩藻糖化的2776/2777 AF治疗显著增加小鼠的存活率(p＝0.001)，并且约30％的小鼠是完全应答者(图20B)。
实施例20-在MC38结肠癌模型中用鼠替代GITR/CTLA-4双特异性抗体治疗后CD8/Treg比率形式的抗肿瘤功效
使用C57BL6小鼠在MC38结肠癌模型中检查替代双特异性抗体以瘤内CD8/Treg比率形式的抗肿瘤作用。野生型2776/2777和非岩藻糖基化的2776/2777 AF双特异性抗体均显示出调节性T细胞的消耗，并且如所预期的，非岩藻糖基化变体显示出优于野生型变体的消耗。
材料和方法
来自法国Janvier的雌性C57BL6小鼠(7-8周龄)用于实验。所有实验均经Malmo/Lund伦理委员会批准。
在第0天皮下注射生长在对数期的MC38结肠癌(1×106个细胞)，并在第10、13和16天腹膜内用2776/2777或2776/2777AF(200μg)治疗小鼠。最后一次注射后24小时，收集肿瘤和脾脏，染色活力标记物以及谱系标记物(CD11b、CD19、MHCII和NK1.1)、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3，并使用流式细胞术分析。将调节性T细胞门控为活细胞/单细胞/CD45/CD3/CD4/Foxp3/CD25。
结果
使用MC38结肠癌模型在C57BL6小鼠中研究了双特异性GITR/CTLA-4抗体的药效学效应。图21中的结果证明了两种双特异性抗体变体的瘤内Treg消耗，然而如所预期的，非岩藻糖化变体显示出优于野生型的活性(图21A)。在CD8/Treg比率中进一步观察到这种效应(图21B)。在脾中没有看到CD8/Treg比率的变化，表明双特异性抗体的作用主要针对肿瘤微环境(图21C)。
实施例21-人GITR/CTLA-4双特异性抗体在人浆细胞瘤模型中的抗肿瘤功效
使用通过在RPMI-8226浆细胞瘤的皮下肿瘤模型中施用hPBMC而人源化的免疫缺陷小鼠，研究人双特异性GITR/CTLA-4双特异性抗体作为野生型和非岩藻糖基化变体的抗肿瘤作用。两种双特异性变体(2372/2373和2372/2373AF)均表现出具有和不具有人PBMC作为效应细胞的统计学显著的抗肿瘤作用，表明双特异性抗体具有直接和间接抗肿瘤功效的潜力。此外，在该模型中，非岩藻糖基化抗体显示出优于野生型变体的抗肿瘤效力。
材料和方法
来自Taconic's Denmark的雌性SCID-米色小鼠(7-8w)用于实验。所有实验均经Malmo/Lund伦理委员会批准。
从Lund大学医院获得白细胞过滤器，并通过Ficoll离心分离hPBMC。在第0天皮下注射在对数期生长的RPMI-8226浆细胞瘤(10×106个细胞)，在第5天腹膜内注射hPBMC(5×106个细胞)以及第5、11和18天进行抗体治疗(app 500nmol)。用卡尺每周测量肿瘤体积三次，并使用公式((w/2)×(1/2)×(h/2)×π×(4/3))计算肿瘤体积。使用GraphPad Prism程序、用于肿瘤生长的Mann-Whitney非参数双尾测试进行统计分析。
结果
使用RPMI-8226浆细胞瘤模型在hPBMC人源化小鼠模型中研究GITR/CTLA-4抗体的抗肿瘤功效。图22和表5中的结果显示双特异性抗体的野生型和非岩藻糖基化变体在hPBMC存在下(图22A)和没有hPBMC(图22B)时以肿瘤生长抑制形式显示出统计学上显著的抗肿瘤功效。非岩藻糖基化变体(2372/2373AF)以肿瘤体积抑制的形式表现出相对于野生型变体(2372/2373)的统计学显著优势。与载体相比，肿瘤体积抑制的百分比可以在表5中找到。
表5-在GITR/CTLA-4治疗的肿瘤中的抗肿瘤活性
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Claims (54)

1.一种多特异性多肽，其包含第一结合结构域，命名为B1，其能够特异性结合GITR，和第二结合结构域，命名为B2，其能够特异性结合CTLA-4。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中第一和/或第二结合结构域选自：抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中抗原结合片段选自：Fv片段(如单链Fv片段，或二硫化物键合的Fv片段)、Fab样片段(如Fab片段；Fab’片段或F(ab)2片段)和结构域抗体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是双特异性抗体。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中：
(a)B1包含IgG1抗体或由IgG1抗体组成，B2包含scFv或由scFv组成，反之亦然；或者
(b)B1包含至少一种scFv或由至少一种scFv组成，B2包含至少一种scFv或由至少一种scFv组成。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中第一和/或第二结合结构域是非抗体多肽。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中B1包含IgG1抗体或由IgG1抗体组成，B2包含非免疫球蛋白多肽或由非免疫球蛋白多肽组成，反之亦然。
8.根据权利要求6或7所述的多肽，其中B2包含能够结合CTLA-4的CD86结构域或其变体或由其组成。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1包含至少一条重链(H)和/或至少一条轻链(L)，B2连接至所述至少一条重链(H)或至少一条轻链(L)。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中B1包含：
(a)至少一条重链(H)和至少一条轻链(L)并且B2与所述重链或所述轻链连接；或者
(b)两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)并且B2连接于两条重链或两条轻链。
11.根据权利要求9或10所述的多肽，其包含在N-C方向上书写的根据下式中任一个排列的多肽链或由其组成：
(a)L-(X)n-B2；
(b)B2-(X)n-L；
(c)B2-(X)n-H；或
(d)H-(X)n-B2；
其中X是接头，n是0或1。
12.根据权利要求12所述的多肽，其中X是肽，其具有氨基酸序列SGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:47)、SGGGGSGGGGSAP(SEQ ID NO:48)、NFSQP(SEQ ID NO:49)、KRTVA(SEQ ID NO:50)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:51)或(SG)m，其中m＝1至7。
13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含人Fc区，或所述区的变体，其中所述区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选地IgG1或IgG4区。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中Fc区是天然存在的(即野生型)人Fc区。
15.根据权利要求13所述的多肽，其中Fc区是非天然存在的(例如突变的)人Fc区。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的多肽，其中Fc区是非岩藻糖基化的。
17.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞凋亡。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够诱导肿瘤免疫。
19.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其结合人GITR，其中Kd小于10×10-9M、4×10-9M或1×10-9M，和/或结合人CTLA-4，其中Kd值小于60×10-9M、25×10-9M或10×10-9M。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其诱导效应T细胞活性的增加，任选地其中所述增加比作为单独分子给予T细胞的第一和第二结合结构域的组合诱导的效应T细胞的活性的增加高至少1.5倍、4.5倍或7倍。
21.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够：
i)杀死表达GITR的肿瘤细胞；和
ii)通过激活效应T细胞激活免疫系统。
22.根据权利要求20所述的多肽，其中T细胞活性的所述增加是通过T细胞的增殖和/或IFNγ或IL-2产生的增加。
23.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中B1是对GITR特异的抗体或其抗原结合片段；B2是对CTLA-4特异的多肽结合结构域，其包含或由以下组成：
(a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比时其中至少一个氨基酸发生改变的氨基酸序列，条件是所述结合结构域以比野生型人CD86更高的亲和力结合人CTLA-4。
24.根据权利要求13-20中任一项所述的多肽，其中当与SEQ ID NO：3的氨基酸序列比较时所述B2(ii)的氨基酸序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸被取代；任选地其中与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比没有插入或缺失。
25.根据权利要求23所述的多肽，其中B2的所述氨基酸序列中的至少一个所述氨基酸取代位于122位，并且任选地其中所述氨基酸序列也在107、121和125位中的至少一个中被取代。
26.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述B2的氨基酸序列包含选自SEQID NOs 6至24中任一个的氨基酸序列或由其组成。
27.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述GITR结合结构域(B1)能够竞争性地抑制抗体与人GITR的结合，所述抗体包含选自SEQ ID NO：61、63、65和67的轻链可变区氨基酸序列和选自SEQ ID NO：52、54、56和58的重链可变区氨基酸序列。
28.根据权利要求26所述的多肽，其中B1包括包含SEQ ID NOs：88、89和90的CDR的轻链可变区氨基酸序列和/或包含SEQ ID NOs：76、77和78的CDR的重链可变区氨基酸序列。
29.根据权利要求26所述的多肽，其中B1包括包含SEQ ID NOs：91、92和93的CDR的轻链可变区氨基酸序列和/或包含SEQ ID NOs：79、80和81的CDR的重链可变区氨基酸序列。
30.根据权利要求26所述的多肽，其中B1包括包含SEQ ID NOs：94、89和95的CDR的轻链可变区氨基酸序列和/或包含SEQ ID NOs：82、83和84的CDR的重链可变区氨基酸序列。
31.根据权利要求26所述的多肽，其中B1包括包含SEQ ID NOs：94、89和96的CDR的轻链可变区氨基酸序列和/或包含SEQ ID NOs：85、86和87的CDR的重链可变区氨基酸序列。
32.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述GITR结合结构域(B1)包含选自SEQ ID NO：61、63、65和67的轻链可变区氨基酸序列和/或选自SEQ ID NO：52、54、56和58的重链可变区氨基酸序列。
33.根据权利要求31所述的多肽，其中B1包含SEQ ID NO：61的轻链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO：52的重链可变区氨基酸序列。
34.根据权利要求31所述的多肽，其中B1包含SEQ ID NO：63的轻链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO：54的重链可变区氨基酸序列。
35.根据权利要求31所述的多肽，其中B1包含SEQ ID NO：65的轻链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO：56的重链可变区氨基酸序列。
36.根据权利要求31所述的多肽，其中B1包含SEQ ID NO：67的轻链可变区氨基酸序列和/或SEQ ID NO：58的重链可变区氨基酸序列。
37.根据权利要求31-35中任一项所述的多肽，其中B1包含或由以下组成：
(a)SEQ ID NO：61的轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：52的重链可变区氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：63的轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：54的重链可变区氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：65的轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：56的重链可变区氨基酸序列；或
(d)SEQ ID NO：67的轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：58的重链可变区氨基酸序列。
38.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述GITR结合结构域包含人Fc区，或所述区的变体，其中所述区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4区，优选地IgG1或IgG4区。
39.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含或由以下组成：
(a)选自SEQ ID NOs：69、71、73和75的轻链氨基酸序列；和
(b)选自52、54、56和58的重链可变区氨基酸序列。
40.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含或由以下氨基酸序列组成：
(a)SEQ ID NOs:52和69；或
(b)SEQ ID NOs:54和71；或
(c)SEQ ID NO:56和73；或
(d)SEQ ID NOs:58和75。
41.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其进一步包含至少一个另外的结合结构域。
42.根据权利要求40所述的多肽，其中所述至少一个另外的结合结构域是选自以下的抗原结合片段：Fv片段(如单链Fv片段，或二硫化物键合的Fv片段)、Fab样片段(如Fab片段；Fab’片段或F(ab)2片段)和结构域抗体。
43.根据权利要求40或41所述的多肽，其中所述至少一个另外的结合结构域。
44.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，进一步包含另外的治疗部分。
45.一种组合物，其包含根据权利要求1至38中任一项所述的双特异性多肽和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。
46.一种对GITR特异的抗体，其如权利要求26至37中任一项所定义。
47.一种多核苷酸，其编码权利要求1-42中任一项所述的双特异性多肽，或其组分多肽链。
48.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性多肽，其用于治疗或预防个体中的肿瘤疾病或病症的方法中。
49.根据权利要求48所述的双特异性多肽，其中所述疾病或病症是癌症。
50.根据权利要求49所述的双特异性多肽，其中所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、皮肤癌、淋巴瘤和胶质母细胞瘤。
51.根据权利要求1至43中任一项所述的双特异性多肽在制备用于治疗或预防个体中的肿瘤疾病或病症的药物中的用途。
52.一种治疗或预防个体中的肿瘤疾病或病症的方法，所述方法包括给个体施用权利要求1至43中任一项所述的双特异性多肽。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述方法包括全身或局部施用所述双特异性抗体，例如在肿瘤部位或肿瘤引流淋巴结中。
54.一种基本上如本文参考说明书所述的双特异性多肽。
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