KR20170105622A

KR20170105622A - Dr5-결합 도메인을 포함하는 다가 분자

Info

Publication number: KR20170105622A
Application number: KR1020177023834A
Authority: KR
Inventors: 폴 에이. 무어; 레슬리 에스. 존슨; 조나단 씨. 리; 칼파나 샤
Original assignee: 마크로제닉스, 인크.
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2017-09-19
Also published as: JP6602875B2; TW201627323A; RU2017129236A3; IL253668A0; SG11201706024YA; AU2015380455A1; CA2974807A1; JP2018507188A; US10501552B2; EP3250601A4; US20180016344A1; RU2017129236A; WO2016122702A1; HK1247215A1; TWI688572B; CN107250161A; EP3250601A1

Abstract

본 발명은 항-DR5 항체의 결합 도메인(들), 특히 항-사람 DR5 항체의 결합 도메인(들)을 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 DR5-결합 분자는, 각각 사람 DR5에 결합할 수 있는 2, 3 또는 4개의 DR5-결합 도메인을 가진 2가 및 4가 분자를 포함한다. 특히, 본 발명은 디아바디, 더 구체적으로 둘 이상의 폴리펩티드 사슬의 공유 결합된 복합체를 포함하는 디아바디를 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 항-DR5 항체 DR5 mAb 1 및/또는 DR5 mAb 2의 단편, 및/또는 이러한 항체의 사람화된 버전 및 키메라 버전을 포함하는 이러한 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다.

Description

DR5-결합 도메인을 포함하는 다가 분자

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 미국 특허출원 제62/149,139호(2015년 4월 17일 제출; 계류중) 및 제62/107,871호(2015년 1월 26일 제출; 계류중)에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원은 각각 그 전체가 여기 참고로 포함된다.

서열목록에 대한 언급

본 출원은 37 C.F.R. 1.821 et seq.에 따라 하나 이상의 서열목록을 포함하며, 이들은 컴퓨터-판독가능한 매체(파일명: 1301_0118PCT_Sequence_Listing_ST25. txt; 2015년 5월 18일 생성, 크기 215,084 바이트)에 개시되고, 이 파일은 그 전체가 여기 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 항-DR5 항체의 결합 도메인(들), 특히 항-사람 DR5 항체의 결합 도메인(들)을 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 DR5-결합 분자는 각각 사람 DR5와 결합할 수 있는 2, 3 또는 4개의 DR5-결합 도메인을 가진 2가 및 4가 분자를 포함한다. 특히, 본 발명은 디아바디, 더 구체적으로는 둘 이상의 폴리펩티드 사슬의 공유 결합된 복합체를 포함하는 디아바디를 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 항-DR5 항체 DR5 mAb 1 및/또는 DR5 mAb 2의 단편을 포함하는 이러한 다가 DR5-결합 분자, 및/또는 이러한 항체의 사람화된 버전 및 키메라 버전에 관한 것이다.

I. 사멸 수용체(death receptor) 5("DR5")

건강한 동물은 종양 세포에 대해 계속된 면역 감시를 유지한다. 다양한 성장 인자, 사이토카인 및 호르몬의 상호작용을 통해서 이러한 동물은 직면한 손상된 세포의 프로그램된 사멸(세포자멸)(apoptosis)을 매개할 수 있다. 이 세포 사멸 과정에 대한 내성을 획득하고 제어되지 않는 방식으로 복제할 수 있는 능력을 획득한 손상된 세포는 종양 세포가 되어 암을 초래할 수 있다(Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics" Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Andera,L.(2009) "Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family," Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180;Carlo-Stella,C.et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy," Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, B.R. et al. (2006) "Following the TRAIL to Apoptosis," Immunologic Res. 35(3):249-262).

세포 사멸 경로를 선택적으로 표적화함으로써 정상 세포는 보호하면서 암 세포를 죽이는데 있어 이러한 경로의 유효성을 증가시킬 수 있는 방법은 암 치료법에서 특히 관심이 있다. Fas 리간드, TNF 및 TNF-관련 세포자멸-유도 리간드(TRAIL)를 포함하는 종양괴사인자(TNF) 수퍼패밀리의 멤버들이 암 생물요법을 위한 표적으로서 확인되었다(Walczak, H.(2013) "Death Receptor - Ligand Systems in Cancer, Cell Death, and Inflammation," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013;5: a008698; pp.1-19; Falschlehner, C. et al. (2007) "TRAIL Signalling : Decisions Between Life And Death," Intl. J. Biochem. Cell Biol. 39:1462-75; Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108). TRAIL은 이펙터 림프구에 의해 발현되는 사이토카인이다. TRAIL은 TRAIL 유전자 프로모터에 있는 반응 요소를 지닌 사이토카인, 특히 인터페론-감마에 반응하여 내츄럴 킬러 세포, 대식세포, 수지상 세포 및 세포독성 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포의 표면에서 발현된다(Allen, J.E. et al. (2012) "Regulation Of The Human TRAIL Gene," Cancer Biol. Ther. 13 (12):1143-1151). 그것의 발현 수준은 금방 분리된 림프구에서는 극히 낮고, 내츄럴 킬러(NK) 세포의 아주 적은 비율만 검출가능한 TRAIL을 발현한다. TRAIL은 인터페론을 수반하는 선천적 면역반응을 조절하고, 종양 세포에 대한 숙주 반응을 증감시키고, 종양 미소환경을 변화시켜 항원 제시를 증진시키고 NK 세포 및 다른 면역 시스템 세포에 의한 조직 침윤을 촉진시키는데 있어 어떤 역할을 한다고 생각된다.

TRAIL-유도 세포자멸과 종래의 화학요법 및 방사선요법에 의해 유도된 세포자멸 사이의 한 중요한 차이는, 후자는, 예를 들어 p53 종양 서프레서 단백질에 의한 세포 손상 인식에 크게 의존한다는 점이다(Dimberg L.Y. et al. (2013) "On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics," Oncogene 32:1341-1350). 세포자멸 반응을 도출하기 위한 p53에 대한 의존성은, 비활성화 돌연변이 때문에 모든 암 세포의 절반 이상에서 p53의 손실이 일어나므로 암 치료법에서 문제를 지닌다(Hollstein, M. et al. (1994) "Database Of p53 Gene Somatic Mutations In Human Tumors And Cell Lines," Nucleic Acids Res. 22:3551-3555).

TRAIL은 281개 아미노산 잔기를 가진 타입 II 단백질이고, TNF-α 및 FasL (CD95L)과 동종성을 가진다(Chaudhari, B.R. et al. (2006) "Following the TRAIL to Apoptosis," Immunologic Res. 35(3):249-262). TRAIL은 세포외 TNF-유사 도메인, 세포외 줄기, 막관통 나선, 및 세포질 도메인으로 구성된다. TRAIL은 두 상이한 종류의 수용체: TRAIL-유도 세포자멸을 촉발하는 사멸 수용체(DR) 및 이 경로를 억제하는 유인 수용체(decoy receptor)와 결합한다. 지금까지 TRAIL에 특이적인 2개의 사람 사멸 수용체: TRAIL-R1(DR4라고도 알려져 있음) 및 TRAIL-R2(DR5라고도 알려져 있음)가 인정되었다. 추가로, 3개의 잠정적 유인 수용체: TRAIL-R3(DcR1), TRAIL-R4(DcR2) 및 오스테오프로테게린이 확인되었다(Chaudhari B.R. et al.(2006) "Following the TRAIL to Apoptosis," Immunologic Res. 35(3):249-262; Carlo-Stella, C. et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy," Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Allen, J.E. et al. (2012) "Regulation Of The Human TRAIL Gene," Cancer Biol. Ther. 13(12):1143-51). TRAIL-R1(DR4)은 비장, 흉선, 간, 말초혈 백혈구, 활성화된 T 세포, 소장 및 일부 종양 셀라인을 포함하는 대부분의 사람 조직에서 매우 낮은 수준으로 발현된다. 반면에, TRAIL-R2(DR5)는 정상 셀라인과 종양 셀라인에는 편재하여 분포되지만, 비장, 말초혈 백혈구, 활성화된 림프구 및 간세포에는 더욱 풍부하다(Abdulghani J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14 (10):1091-1108).

DR4 및 DR5는 단일-통과 타입-I 막 단백질이며, 염색체 8p 상에 위치된 2개의 유전자에 의해 암호화된다. DR4 및 DR5는 각각 시스테인-부화 도메인(CRD), 막관통 도메인, 및 수용체의 세포질 부분 내에 위치된 사멸 도메인을 포함하는 세포외 영역을 함유한다. 긴 DR5(DR5(L))와 짧은 DR5(DR5(S))의 DR5의 두 스플라이스 변이체가 확인되었다. 이들 변이체는 수용체의 CRD와 그것의 막관통 도메인 사이에 위치된 29개 아미노산의 스트레치에 차이가 있다. DR4 및 DR5는 TRAIL 결합 후 세포자멸 신호를 변환할 수 있다(van Roosmalen, I.A.M. et al.(2014) "Two Death-Inducing Human TRAIL Receptors To Target In Cancer: Similar Or Distinct Regulation And Function?," Biochem. Pharamcol. 91:447-456).

TRAIL이 DR4 또는 DR5와 결합할 때 수용체는 호모트라이머화하며, 이것은 수용체의 사멸 도메인이 어댑터 단백질 Fas-회합된 사멸 도메인과 카스파아제 8의 비활성화, 미절단 형태(프로-카스파아제 8) 또는 카스파아제 10의 미절단 형태(프로-카스파아제 10)를 모집하는 것을 가능케한다. 수용체, 사멸 도메인을 가진 Fas-회합된 단백질, 및 프로-카스파아제 8 또는 프로-카스파아제 10은 함께 사멸-유도 신호화 복합체(DISC)를 형성한다. DISC에서 프로-카스파아제 8은 다이머화와 절단에 모두 의존하는 과정에서 활성화된다. 다음에, 활성화된 카스파아제 8은 하류 기질을 절단하고, 궁극적으로 이펙터 카스파아제 3의 절단 및 활성화를 가져온다. 카스파아제 3의 활성화는 분자 활성화 사건의 연쇄반응을 개시하며, 이것은 궁극적으로 사멸 기질의 생성을 초래한다(Schneider-Brachert, W. et al. (2013) "Membrane Trafficking of Death Receptors: Implications on Signalling," Int. J. Mol. Sci. 14:14475-14503; Falschlehner, C. et al. (2009) "TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics," In: Therapeutic Targets of the TNF Superfamily(Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science + Business Media, NY; pp. 195-206; Falschlehner, C. et al. (2007) "TRAIL Signalling: Decisions Between Life And Death," Intl. J. Biochem. Cell Biol. 39:1462-1475; Guicciardi, M.E. et al. (2009) "Life And Death By Death Receptors," FASEB J. 23:1625-1637; Kischkel, F.C. et al. (2000) "Apo2L /TRAIL-Dependent Recruitment of Endogenous FADD and Caspase -8 to Death Receptors 4 and 5," Immunity 12:611-620; Dimberg, L.Y. et al. (2013) "On The TRAIL To Successful Cancer Therapy" Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics," Oncogene 32:1341-1350; Buchsbaum, D.J. et al. (2007) "TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment," Future Oncol. 3(4):405-409; Buchsbaum, D.J. et al. (2006) "TRAIL Receptor-Targeted Therapy," Future Oncol. 2(4):493-508; Andera, L. (2009) "Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family," Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180; Chan, F.K.-M. (2007) "Three is Better Than One: Pre- Ligand Receptor Assembly in the Regulation of TNF Receptor Signaling," Cytokine 37(2):101-107). 3개의 유인 수용체는 유인제로서 작용하거나 세포자멸 신호를 변환한다(Carlo-Stella, C. et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy," Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Mahmood, Z. et al. (2010) "Death Receptors: Targets For Cancer Therapy," Exper. Cell. Res. 316:887-899; Oikonomou, E. et al. (2013) "The TRAIL Of Oncogenes To Apoptosis," Intl. J Union Biochem. Molec. Biol. 39(4):343-354).

이러한 "비선천적" 경로에 더하여, TRAIL은 "선천적" 경로를 통해 세포 사멸을 매개할 수 있다(Carlo-Stella, C. et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy," Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Buchsbaum, D.J. et al. (2006) "TRAIL Receptor-Targeted Therapy," Future Oncol. 2(4):493-508; Buchsbaum, D.J. et al.(2007) "TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment," Future Oncol. 3(4):405-09). 선천적 경로는 전-세포자멸 단백질 Bid의 절단 활성화에 의해 매개되며, 이것은 이후 다른 전-세포자멸 단백질과 결합하여, 미토콘드리아로부터 시토크롬 c의 방출을 매개하는 복합체를 형성한다. 이러한 방출은 세포 사멸을 초래하는 카스파아제 방출 및 활성화의 연쇄반응을 촉발시킨다(Kandasamy, K. et al. (2003) "Involvement Of Proapoptotic Molecules Bax And Bak In Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis -Inducing Ligand (TRAIL)-Induced Mitochondrial Disruption And Apoptosis : Differential Regulation Of Cytochrome C And Smac / DIABLO Release," Cancer Res. 63:1712-1721; Rudner, J. et al.(2005) "Type I And Type II Reactions In TRAIL-Induced Apoptosis -Results From Dose-Response Studies," Oncogene 24:130-140).

그러나, 이 분자 경로는 복잡하다. 세포 타입, 리간드 신호의 상대적 강도와 지속기간, 및 TRAIL 수용체의 하류를 신호화하는 세포내 단백질의 존재, 부재 또는 활성화 상태에 따라서, TRAIL에 의한 처리는 세포자멸을 자극할 수 있거나, 또는 드물게는 세포 증식을 자극할 수 있다(Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Andera, L. (2009) "Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family," Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153 (3):173-180). 더욱이, 특정 암은 세포자멸을 유도하기 위한 DR 선호성을 갖지만(즉, DR4 또는 DR5), 다른 종양 타입은 그렇지 않다(van Roosmalen, I.A.M. et al. (2014) "Two Death-Inducing Human TRAIL Receptors To Target In Cancer: Similar Or Distinct Regulation And Function?," Biochem. Pharamcol. 91:447-456).

II. TRAIL 단백질 및 항-DR 항체의 치료적 사용

TRAIL은 정상 세포를 손상된 세포를 인식하고 죽이는 능력이 매우 선택적이기 때문에, 가용성 재조합 TRAIL은 암의 치료에서 잠재적인 활용을 가진 것으로 언급되었다(예를 들어, 결직장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경모세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 및 직장암)(예를 들어, Micheau, O. et al. (2013) "Death Receptors As Targets In Cancer," Br. J. Pharmacol. 169:1723-1744); Falschlehner, C. et al. (2009) "TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics" In: Therapeutic Targets of the TNF Superfamily (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, NY; pp. 195-206; Buchsbaum, D.J. et al. (2006) "TRAIL Receptor-Targeted Therapy," Future Oncol. 2(4):493-508; Wajant, H. et al. (2013) "Engineering Death Receptor Ligands For Cancer Therapy," Canc. Lett. 332:163-174; Buchsbaum, D.J. et al. (2007) "TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment," Future Oncol. 3(4):405-409; Abdulghani, J. et al. (2010)("TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics" Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Finnberg, N. et al. (2008) "TRAIL Death Receptors As Tumor Suppressors And Drug Targets," Cell Cycle 7(11):1525-1528; Hellwig, C.T. et al. (2012) "TRAIL Signaling and Synergy Mechanisms Used in TRAIL-Based Combination Therapies," Molec. Cancer Ther. 11(1):3-13; Henson, E.S. et al. (2008) "The Role Of TRAIL Death Receptors In The Treatment Of Hematological Malignancies," Leukemia & Lymphoma 49(1):27-35; Huang, Y. et al. (2007) "TRAIL Death Receptors And Cancer Therapeutics," Toxicol. Appl. Pharmacol. 224:284-289; Humphreys, R.C. et al. (2008) "Trail Receptors: Targets for Cancer Therapy," In: Programmed Cell Death in Cancer Progression and Therapy Khosravi-Far, R. and White, E. (Eds.) Springer, NY; pp. 127-158; Koschny, R. et al. (2007) "The Promise Of TRAIL - Potential And Risks Of A Novel Anticancer Therapy," J. Molec. Med. 85:923-935; Kruyt, F.A.E. (2008) "TRAIL and Cancer Therapy," Cancer Lett. 263:14-25; Kuijlen, J.M.A. et al. (2010) "Review: On TRAIL For Malignant Glioma Therapy," Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36:168-182; Mellier, G. et al. (2010)("TRAILing Death in Cancer," Molec. Aspects Med. 31:93-112; Rahman, M. et al. (2009) "The TRAIL To Targeted Therapy Of Breast Cancer," Adv. Cancer Res. 103:43-73; Voelkel-Johnson, C.(2011) "TRAIL-Mediated Signaling In Prostate, Bladder And Renal Cancer," Nat. Rev. Urol. 8:417-427).

TRAIL의 신호화를 의태할 수 있는 항-DR4 및 항-DR5 모노클로날 항체는 더 큰 선택성을 제공하는 것으로 제안되었다(Buchsbaum, D.J. et al. (2006) "TRAIL Receptor-Targeted Therapy," Future Oncol. 2:493-508; Kelley, S.K. et al. (2004) "Targeting Death Receptors In Cancer With Apo2L /TRAIL," Curr. Opin. Pharmacol. 4:333-339; Papenfuss, K. et al. (2008) "Death Receptors As Targets For Anti-Cancer Therapy," J. Cell. Mol. Med. 12:2566-2585; de Bruyn, M. et al. (2013) "Antibody-Based Fusion Proteins To Target Death Receptors In Cancer," Cancer Lett. 332:175-183).

마파투무맙, 항-DR4 작동제 항체(Human Genome Sciences)의 세 II상 임상 연구는 비-호지킨 림프종(NHL), 결직장암(CRC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC)로 고통받는 환자에서 치료 효과를 나타낸다고 보고되었다(Greco, F.A. et al. (2008) "Phase 2 Study Of Mapatumumab , A Fully Human Agonistic Monoclonal Antibody Which Targets And Activates The TRAIL Receptor-1, In Patients With Advanced Non-Small Cell Lung Cancer," Lung Cancer 61:82-90; Trarbach, T. et al. (2010) "Phase II Trial Of Mapatumumab , A Fully Human Agonistic Monoclonal Antibody That Targets And Activates The Tumour Necrosis Factor Apoptosis -Inducing Ligand Receptor-1 (TRAIL-R1), In Patients With Refractory Colorectal Cancer," Br. J. Cancer 102:506-512; Falschlehner, C. et al. (2009) "TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics" In: Therapeutic Targets of the TNF Superfamily (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, NY; pp. 195-206). TRA-8/CS-1008, 사람화된 항-DR5 항체(Daiichi Sankyo(일본 도쿄))는 시험관내 성상세포종 및 백혈병 세포 및 생체내 이식된 유방암 세포에 대해 높은 항종양 활성을 나타낸다고 보고된다(Buchsbaum, D.J. et al. (2003) "Antitumor Efficacy Of TRA -8 Anti-DR5 Monoclonal Antibody Alone Or In Combination With Chemotherapy And/Or Radiation Therapy In A Human Breast Cancer Model," Clin. Cancer Res. 9:3731-3741; Ichikawa, K. et al. (2001) "Tumoricidal Activity Of A Novel Anti-Human DR5 Monoclonal Antibody Without Hepatocyte Cytotoxicity," Nat. Med. 7:954-960; Saleh, M.N. et al. (2008) "A Phase I Study Of CS-1008 (Humanized Monoclonal Antibody Targeting Death Receptor 5 Or DR5), Administered Weekly To Patients With Advanced Solid Tumors Or Lymphomas," 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings, J. Clin. Oncol. 26(20S): Abstract 3537). mDRA-6 (IgG1-k), 뮤린 항-사람 항-DR5 모노클로날 항체(Henan University)는 TRAIL 외부 경로를 통해서 Jurkat 세포의 세포자멸을 유도할 수 있는 것이 보고되었다(Du, Y.-W. et al. (2011) "A Novel Agonistic Anti-Human Death Receptor 5 Monoclonal Antibody With Tumoricidal Activity Induces Caspase- And Mitochondrial -Dependent Apoptosis In Human Leukemia Jurkat Cells," Cancer Biother. Radiopharmaceut. 26(2):143-152). 키메라 DR5-표적화 항체 LBY135(Novartis)는 10nM 이하의 IC50으로 40개 사람 결장암 셀라인의 패널의 50%에서 세포자멸을 유도했고, 마우스의 사람 결직장 이종이식편 모델에서 생체내 항종양 활성을 증명했다는 것이 보고되었다(Li, J. et al. (2008) "LBY135 , A Novel Anti-DR5 Agonistic Antibody Induces Tumor Cell-Specific Cytotoxic Activity In Human Colon Tumor Cell Lines And Xenografts," Drug Dev. Res. 69:69-82; Sharma, S. et al. (2008) "Phase I Trial Of LBY135 , A Monoclonal Antibody Agonist To DR5, Alone And In Combination With Capecitabine In Advanced Solid Tumors," 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings. J. Clin. Oncol. 26(15S):3538). 임상 개발중인 추가의 항-DR 항체들은: ApomAb(Camidge, D. et al. (2007) "A Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of Apomab , A Human DR5 Agonist Antibody, In Patients With Advanced Cancer," 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings(Post-Meeting Edition), J. Clin. Oncol. 25(18S):3582; Johnstone, R.W. et al. (2008) "The TRAIL Apoptotic Pathway In Cancer Onset, Progression And Therapy," Nat. Rev. Cancer 8:782-798); AMG655(LoRusso, P. et al. (2007) "First-In-Human Study Of AMG 655, A Pro- Apoptotic TRAIL Receptor-2 Agonist , In Adult Patients With Advanced Solid Tumors," 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. J. Clin. Oncol. 25(18S):3534); 코나투무맙(Bajaj, M. et al. (2011) "Conatumumab : A Novel Monoclonal Antibody Against Death Receptor 5 For The Treatment Of Advanced Malignancies In Adults," Expert Opin. Biol. Ther. 11(11):1519-24); 렉사투무맙, 항-DR5 작동제 항체(Human Genome Sciences) (Plummer, R. et al. (2007) "Phase 1 And Pharmacokinetic Study Of Lexatumumab In Patients With Advanced Cancers," Clin. Cancer Res. 13:6187-6194); 드로지투맙(Kang, Z. et al. (2011) "Drozitumab , A Human Antibody To Death Receptor 5, Has Potent Antitumor Activity Against Rhabdomyosarcoma With The Expression Of Caspase-8 Predictive Of Response," Clin. Cancer Res. 17(10):3181-3192; Zinonos, I. et al. (2014) "Doxorubicin Overcomes Resistance to Drozitumab by Antagonizing Inhibitor of Apoptosis Proteins ( IAPs )," Anticancer Res. 34(12): 7007-7020; Xiang, H. et al. (2013) "Death Recepto r 5 Agonistic Antibody PRO95780: Preclinical Pharmacokinetics And Concentration-Effect Relationship Support Clinical Dose And Regimen Selection," Cancer Chemother. Pharmacol. 72(2):405-415; Stern, H.M. et al. (2010) "Development Of Immunohistochemistry Assays To Assess GALNT14 And FUT3 /6 In Clinical Trials Of Dulanermin And Drozitumab," Clin. Cancer Res. 16(5):1587-1596) 및 KMTR2(Nagane, M. et al. (2010) "Predominant Antitumor Effects By Fully Human Anti-TRAIL-Receptor 2 (DR5) Monoclonal Antibodies In Human Glioma Cells In Vitro And In Vivo," Neuro. Oncol. 12(7):687-700; Motoki, K. et al. (2005) "Enhanced Apoptosis And Tumor Regression Induced By A Direct Agonist Antibody To Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis -Inducing Ligand Receptor 2," Clin. Cancer Res. 11(8):3126-3135)를 포함한다.

항-DR 항체의 사용은 Falschlehner, C. et al(2009)("TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics," In: Therapeutic Targets of the TNF Superfamily(Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science + Business Media, NY; pp. 195-206); Hellwig, C.T. et al. (2012)("TRAIL Signaling and Synergy Mechanisms Used in TRAIL-Based Combination Therapies," Molec. Cancer Ther. 11(1):3-13); Huang, Y. et al(2007)("TRAIL Death Receptors And Cancer Therapeutics," Toxicol. Appl. Pharmacol. 224:284-289); Humphreys, R.C. et al(2008)("Trail Receptors: Targets for Cancer Therapy," In: Programmed Cell Death in Cancer Progression and Therapy Khosravi-Far, R. and White, E. (Eds.) Springer, NY; pp. 127-158); Kruyt, F.A.E. (2008)("TRAIL and Cancer Therapy," Cancer Lett. 263:14-25); Mellier, G. et al. (2010)("TRAILing Death in Cancer," Molec. Aspects Med. 31:93-112); Oldenhuis, C.N.A.M. et al. (2008)("Targeting TRAIL Death Receptors," Curr. Opin. Pharmacol. 8:433-439); Papenfuss K. et al(2008)("Death Receptors As Targets For Anti-Cancer Therapy" J. Cell. Mol. Med. 12(6B):2566-2585); Micheau O. et al(2013)("Death Receptors As Targets In Cancer," Br. J. Pharmacol. 169:1723-1744; 및 van Roosmalen, I.A.M. et al. (2014)("Two Death-Inducing Human TRAIL Receptors To Target In Cancer: Similar Or Distinct Regulation And Function?," Biochem. Pharamcol. 91:447-456)에서 검토되었다.

제시된 데이터는 이러한 제제가 잘 관용되며 12일 미만의 혈장 반감기를 가진다는 것을 제안하지만, 이 요법의 가능한 용도는 일부 원발성 암세포가 화학요법과의 조합 치료 후에도 TRAIL 세포자멸에 대해 내성이라는 사실에 의해 제한된다(Buchsbaum, D.J. et al. (2007) "TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment," Future Oncol. 3(4):405-409; see also, Dimberg, L.Y. et al. (2013) "On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics," Oncogene 32:1341-1350; Falschlehner, C. et al. (2009) "TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics," In: Therapeutic Targets of the TNF Superfamily (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, NY; pp. 195-206; Maksimovic-Ivanic, D. et al. (2012) "Resistance To TRAIL And How To Surmount It," Immunol. Res. 52:157-168).

이러한 항체 요법의 장래성에도 불구하고, 연구들은 일부 항-DR 모노클로날 항체가 임상 사용에서 충분한 선택성을 나타내지 않았음을 나타냈다. 이것은 9개의 보고된 변이체 중 TRAIL의 단지 1개의 특정 동형만이 이러한 선택성을 나타낸다는 사실을 반영할 수 있다(Allen, J.E. et al. (2012) "Regulation Of The Human TRAIL Gene,? Cancer Biol. Ther. 13(12):1143-1151). 일부 rTRAIL 및 항-DR 모노클로날 항체에 의한 간세포 또는 각질세포와 같은 정상 사람 세포에서 세포자멸의 유도가 시험관내 관찰되었다(Jo, M. et al. (2000) "Apoptosis Induced In Normal Human Hepatocytes By Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis -Inducing Ligand" Nat. Med. 6:564-567; Lawrence, D, et al. (2001) "Differential Hepatocyte Toxicity Of Recombinant Apo2L /TRAIL Versions," Nat. Med. 7:383-385; Mori, E. et al. (2004) "Human Normal Hepatocytes Are Susceptible To Apoptosis Signal Mediated By Both TRAIL-R1 And TRAIL-R2," Cell. Death Differ. 11:203-207; Qin, J. et al. (2001) "Avoiding Premature Apoptosis Of Normal Epidermal Cells," Nat. Med. 7:385-386). 증가된 혈청 알라닌 아미노트랜스페라아제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라아제 및 빌리루빈에 의한 간세포독성이 렉사투무맙 항-DR5 작동제 항체(Human Genome Sciences)의 고 용량(kg당 20mg)으로 치료되었을 때 소수의 환자에서 보고되었다(Plummer, R. et al. (2007) "Phase 1 And Pharmacokinetic Study Of Lexatumumab In Patients With Advanced Cancers," Clin. Cancer Res. 13:6187-6194).

항-DR 항체는 미국특허 No. 8,790,663; 8,715,668; 8,703,712; 8,461,311; 8,409,570; 8,372,396; 8,329,180; 8,173,128; 8,097,704; 8,067,001; 8,030,023; 8,029,783; 7,981,421; 7,897,730; 7,893,216; 7704502 및 7,476,383; 미국 특허공개 No. 2014/0370019; 2014/0308288; 2014/0105898; 2014/0004120; 2014/0010812; 2013/0324433; 2013/0280282; 2013/0243780; 2013/0064838; 2012/0184718; 2012/0087922; 2012/0070432; 2011/0070248; 2010/0080806; 2009/0317384; 2009/0317396; 2009/0208483; 2009/0175854 및 2009/0136503; 유럽 특허공개 No. EP 2021370; EP 1790663; EP 2059533; EP 1506285; EP 1576179; EP 2636736; EP 2684896; EP 2636736; EP 2569336; EP 2046836; EP 2480230; EP 2368910; EP 2350641; EP 2292794; EP 2287285; EP 2292794 및 EP 2021370; 및 WIPO 특허공개 No. WO 2014/159562; WO 2014/161845; WO 2014/050779; WO 2014/035474; WO 2014/ 009358; WO 2013/163229 및 WO 2013/148877에 개시된다.

종양 항원 및 가용성 TRAIL(sTRAIL)에 결합할 수 있는 scFv 도메인 또는 사멸 수용체 또는 Fas에 결합할 수 있는 Fas(CD95) 리간드(FasL) 도메인을 가진 이중특이적 항체 분자가 또한 제안되었다(Wajant, H. et al.(2013) "Engineering Death Receptor Ligands For Cancer Therapy," Canc. Lett. 332:163-174). 종양-선택적 항체 단편과 sTRAIL 및 sFasL의 이러한 유전적 융합체는 호의적인 항암 특징을 가진 매우 선택적인 항암 치료제를 제공했다. 그러나, 이용된 융합 단백질은 비-표적화된 가용성 리간드의 크기의 2배였다. 따라서, 이 접근법은 고상 종양에 침투하기 위해 다수의 세포를 통해 확산하는 것이 융합 단백질은 상대적으로 어렵기 때문에 제한되는 것으로 보인다(de Bruyn, M. et al. (2013) "Antibody-Based Fusion Proteins To Target Death Receptors In Cancer" Cancer Lett. 332:175-183). DR5에 결합할 수 있는 이중특이적 항체 분자는 미국 특허 공개 No. 2014/0370019; 2014/0308288; 2013/0243780; 2012/0184718 및 2009/0175854; 유럽 특허 공개 No. EP 1790663; EP 2059533; EP 2684896 및 EP 2350641; WIPO 공개 No. WO 2014/ 159562; WO 2014/161845; WO 2014/050779; WO 2014/009358 및 WO 2013/148877에 개시되었다.

암의 치료에서 그것의 잠재성에 더하여, TRAIL은 세균성 병원균의 치료를 위한 잠재적인 치료제로서 제안되었다(Benedict, C.A. et al. (2012) "TRAIL: Not Just For Tumors Anymore," J. Exp. Med. 209(11):1903-1906). TRAIL은 또한, 그것이 호산구를 포함하는 다양한 염증성 세포에 의해 발현되기 때문에 천식 기도의 구조 변화에서 어떤 역할을 할 수 있다(Chaudhari, B.R. et al. (2006) "Following the TRAIL to Apoptosis," Immunologic Res. 35(3):249-262). 가용성 TRAIL 제제의 사용한 한 가지 단점은 그것의 상대적으로 짧은 생체내 반감기였다(대략 30분; Walczak, H. et al. (1999) "Tumoricidal Activity Of Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis -Inducing Ligand In Vivo," Nat. Med. 5:157-163). 추가로, 가용성 재조합 TRAIL은 TRAIL 수용체(따라서 암 치료를 촉진) 및 TRAIL 유인 수용체(따라서 추정상 치료 이점을 제공하지 않음)에 결합할 수 있다. TRAIL은 또한 심혈관 질환에서 어떤 역할을 할 수 있다(Martin-Ventura, J.L. et al. (2007) "TRAIL and Vascular Injury," Frontiers in Bioscience 12:3656-3667) and in inflammation (Walczak, H. (2013) "Death Receptor - Ligand Systems in Cancer, Cell Death, and Inflammation," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013;5: a008698; pp. 1-19).

TRAIL 요법을 사용한 임상 시험은 환자에서 낮은 독성을 나타내지만, 실망스럽게도 TRAIL 작동제가 단일요법으로 사용되었을 때는 적은 치료 효과만이 관찰되었다(Dimberg, L.Y. et al. (2013) "On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics," Oncogene 32:1341-1350). 이런 결론은 종양 세포로 발달된 손상된 세포의 실질적인 부분이 TRAIL-내성인 것으로 판명된 관찰을 반영한다. 이러한 경험은 TRAIL 요법이 매우 유익할 수 있지만 적은 하위부류의 환자에게만 그럴 수 있다는 결론을 이끌어 내었다(Dimberg, L.Y. et al. (2013) "On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics," Oncogene 32:1341-1350).

TRAIL 내성의 여러 메커니즘이 확인되었다(Maksimovic-Ivanic, D. et al. (2012) "Resistance To TRAIL And How To Surmount It," Immunol. Res. 52:157-168; Dimberg, L.Y. et al. (2013) "On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics," Oncogene 32:1341-1350; Thorburn, A. et al(2008) "TRAIL Receptor-Targeted The-rapeutics: Resistance Mechanisms And Strategies To Avoid Them," Drug Resist. Updat. 11(1-2):17-24; Whiteside, T. L., (2007) "The Role of Death Receptor Ligands in Shaping Tumor Microenvironment," Immunol. Investig. 36:25-46). 가설된 설명 중, TRAIL-내성 종양 세포에 의한 특정 카스파아제(예를 들어, 카스파아제 8)의 감소된 발현, 또는 이러한 세포에 의한 카스파아제 억제제(예를 들어, XIAP, cIAP)의 증가된 발현, 또는 이러한 세포에 의한 세포자멸 억제제(예를 들어, Bcl-2, Mcl-1 등)의 증가된 발현의 가능성이 있다(Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Buchsbaum, D.J. et al. (2006) "TRAIL Receptor-Targeted Therapy," Future Oncol. 2(4):493-508). 또는 달리, TRAIL 내성은 종양 세포의 TRAIL 수용체에서 결함의 존재, 또는 FLIP와 같은 사멸 수용체 또는 유인 수용체 TRAIL-R3 및 TRAIL-R4에 대해 매우 선택적인 억제제의 증가된 발현을 반영할 수 있다. Abdulghani, J. et al. (2010)을 참조한다("TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108). 이러한 내성의 관점에서, TRAIL-기반 치료는 전형적으로 다른 화학치료제와 협력하여 제공되는 제제로서만 제안되었다(Buchsbaum, D.J. et al. (2006) "TRAIL Receptor-Targeted Therapy," Future Oncol. 2(4):493-508).

따라서, 모든 이전의 진전에도 불구하고, 암 또는 다른 질환 및 상태로 고통받는 환자에게 개선된 치료적 가치를 제공할 수 있는 DR5-결합 도메인을 포함하는 항-DR5 항체 및 분자에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이 목표 및 다른 목표에 관한 것이다.

본 발명은 항-DR5 항체의 결합 도메인(들), 특히 항-사람 DR5 항체의 결합 도메인(들)을 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 DR5-결합 분자는 각각 사람 DR5에 결합할 수 있는 2, 3 또는 4개의 DR5-결합 도메인을 가진 2가 및 4가 분자를 포함한다. 특히, 본 발명은 디아바디, 더 구체적으로 둘 이상의 폴리펩티드 사슬의 공유 결합된 복합체를 포함하는 디아바디를 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 항-DR5 항체 DR5 mAb 1 및/또는 DR5 mAb 2의 단편, 및/또는 이러한 항체의 사람화된 버전 및 키메라 버전을 포함하는 이러한 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다.

상세하게, 본 발명은 사람 사멸 수용체 5(DR5)의 두 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 결합 분자인 다가 DR5-결합 분자를 제공하며, 여기서 다가 DR5-결합 분자는 각각 사람 DR5에 결합할 수 있는 4개의 항원-결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 사람 DR5의 에피토프에 결합할 수 있는 단일특이적 결합 분자인 다가 DR5-결합 분자를 제공하며, 여기서 다가 DR5-결합 분자는 각각 사람 DR5에 결합할 수 있는 4개의 항원-결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 특히 2, 3 또는 4개의 사람 DR5 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 모든 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 다가 DR5-결합 분자는 Fc 영역-함유 디아바디이며, 디아바디는 두 쌍의 폴리펩티드를 포함하는 공유 결합된 복합체이고, 여기서 각 쌍은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함한다.

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서:

(A) 제1 폴리펩티드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로:

(i) 제1 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인(VL1);

(ii) 제1 펩티드 링커(링커 1);

(iii) 제2 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날의 가변 중쇄(VH) 도메인(VH2);

(iv) 제2 펩티드 링커(링커 2);

(v) E-코일 도메인 또는 K-코일 도메인을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인;

(vi) 제3 펩티드 링커(링커 3); 및

(vii) IgG 면역글로불린 Fc 영역의 CH2 및 CH3 도메인을 가진 IgG Fc 영역의 폴리펩티드 부분

을 포함하고;

(B) 제2 폴리펩티드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로:

(i) 제2 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 VL 도메인(VL2);

(ii) 제1 펩티드 링커(링커 1);

(iii) 제1 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날의 VH 도메인(VH1);

(iv) 제2 펩티드 링커(링커 2); 및

(v) E-코일 도메인 또는 K-코일 도메인을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인

을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인 및 제2 폴리펩티드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나, 또는 둘 다 K-코일 도메인이 아니고;

여기서:

(a) 제1 폴리펩티드 사슬의 VL1 도메인과 제2 폴리펩티드 사슬의 VH1 도메인은 DR5의 제1 에피토프에 특이적 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 형성하고;

(b) 제1 폴리펩티드 사슬의 VH2 도메인과 제2 폴리펩티드 사슬의 VL1 도메인은 DR5의 제2 에피토프에 특이적 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 형성하고;

(c) 제1 폴리펩티드 사슬들의 쌍의 CH2-CH3 부분은 IgG Fc 영역을 형성한다.

(i) 링커 1은 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 가지고,

(ii) 링커 1은 SEQ ID NO:47 아미노산 서열을 가지고,

(iii) E-코일 도메인은 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고,

(iv) K-코일 도메인은 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지고,

(v) 링커 3은 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 가지고,

(vi) CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 C-말단 잔기는 선택적으로 포함된다.

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 Fc 영역은 FcγR에 대한 변이 Fc 영역의 친화성을 감소시키거나 Fc 영역을 안정화하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 본 발명은 더 나아가 모든 이러한 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 변형은 L234A; L235A; 또는 L234A와 L235A의 치환을 포함한다.

본 발명은 특히 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 VL1은 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하고, VH1은 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인 및 CDR_H3 도메인을 포함하며, 여기서:

(i) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지고; 또는

(ii) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고; 또는

(iii) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 hDR5 mAb 2 VL-3의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 hDR5 mAb 2 VH-3의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고; 또는

(iv) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, 및 SEQ ID NO:57을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, 및 SEQ ID NO:61을 가지고; 또는

(v) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, 및 SEQ ID NO:65를 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, 및 SEQ ID NO:69를 가지고; 또는

(vi) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, 및 SEQ ID NO:73을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, 및 SEQ ID NO:77을 가지고; 또는

(vii) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, 및 SEQ ID NO:81을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, 및 SEQ ID NO:85를 가지고; 또는

(viii) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, 및 SEQ ID NO:89를 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, 및 SEQ ID NO:93을 가지고; 또는

(ix) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 및 SEQ ID NO:97을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, 및 SEQ ID NO:101을 가진다.

본 발명은 특히 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 VL2는 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하고, VH2는 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인 및 CDR_H3 도메인을 포함하며, 여기서:

(iii) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고; 또는

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 VL1 및 VL2는 동일한 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하고, VH1 및 VH2는 동일한 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인을 포함하며, 구체적으로 본 발명은 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서:

(i) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지거나; 또는

(ii) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지거나; 또는

(iii) CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가진다.

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 VL1 및 VL2는 동일한 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하지 않고, VH1 및 VH2는 동일한 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인을 포함하지 않으며, 구체적으로 본 발명은 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서:

(i) VL1의 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, VH1의 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지고;

VL2의 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, VH2의 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지거나; 또는

(ii) VL1의 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, VH1의 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고;

VL2의 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, VH2의 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가진다.

(A) (i) VL1은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(ii) VL1은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(iii) VL1은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(iv) VL1은 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(vi) VL1은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(vii) VL1은 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(viii) VL1은 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(ix) VL1은 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(x) VL1은 SEQ ID NO:70의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:74의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(xi) VL1은 SEQ ID NO:78의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:82의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(xii) VL1은 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:90의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(xiii) VL1은 SEQ ID NO:94의 아미노산 서열을 가지며, VH1은 SEQ ID NO:98의 아미노산 서열을 가지고;

(B) (i) VL2는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(ii) VL2는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(iii) VL2는 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(iv) VL2는 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(vi) VL2는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(vii) VL2는 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(viii) VL2는 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(ix) VL2는 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(x) VL2는 SEQ ID NO:70의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:74의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(xi) VL2는 SEQ ID NO:78의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:82의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(xii) VL2는 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:90의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(xiii) VL2는 SEQ ID NO:94의 아미노산 서열을 가지며, VH2는 SEQ ID NO:98의 아미노산 서열을 가진다.

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 VL1 및 VL2는 동일한 아미노산 서열을 가지고, VH1 및 VH2는 동일한 아미노산 서열을 가진다.

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 VL1 및 VL2는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않고, VH1 및 VH2는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는다.

본 발명은 더 나아가 이러한 다가 DR5-결합 분자의 구체예에 관한 것으로서, 여기서 다가 DR5-결합 분자는 디아바디를 함유하는 Fc 영역이며, 디아바디는 두 쌍의 폴리펩티드를 포함하는 공유 결합된 복합체이고, 여기서:

(i) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:116 또는 SEQ ID NO:120의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:118의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(ii) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:122 또는 SEQ ID NO:126의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:124의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(iii) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:128 또는 SEQ ID NO:132의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:130의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(iv) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:134 또는 SEQ ID NO:138의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:136의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(v) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:140 또는 SEQ ID NO:144의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:142의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(vi) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:150의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:148의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(vii) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:152 또는 SEQ ID NO:156의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:154의 아미노산 서열을 가지고; 또는

(vi) 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:158 또는 SEQ ID NO:162의 아미노산 서열을 가지며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:160의 아미노산 서열을 가진다.

본 발명은 더 나아가 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것 및 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 히스톤 디아세틸라아제 억제제를 더 포함하는 이러한 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는 세포 사멸을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 세포는 종양 세포이다. 본 발명은 더 나아가 세포를 히스톤 디아세틸라아제 억제제에 노출시키는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 더 나아가 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것이 암의 치료에 사용되는 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것이 암의 치료에서 히스톤 디아세틸라아제 억제제와 조합하여 사용되는 구체예에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것이 검출가능하게 표지되어 암의 진단 또는 예후예측에 사용되는 구체예에 관한 것이다.

본 발명은 특히 암의 치료 또는 진단 또는 예후예측에서 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것의 이러한 사용에 관한 것으로서, 여기서 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상연부육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암, 투명 세포 암종, 결장암, 결직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포 종양, 상의세포종, 유윙 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성불완전섬유원증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선암, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 포진성 포도막 흑색종, 희귀한 조혈 장애, 신장 전이성 암, 간상 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 한다.

본 발명은 특히 암의 치료 또는 진단 또는 예후예측에서 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것의 이러한 사용에 관한 것으로서, 여기서 암은 결직장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경모세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 및 직장암이다.

암의 치료 또는 진단 또는 예후예측에서 상기 설명된 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것의 이러한 사용에 관한 것으로서, 여기서 암은 급성 골수양 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 B 림프모구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프구성 백혈병(CLL), 모양세포 백혈병(HCL), 출아형 형질세포모양 수지상 세포 신생물(BPDCN), 맨틀 세포 백혈병(MCL) 및 소 림프구성 림프종(SLL)을 포함하는 비-호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종, 전신 비만세포증, 또는 버킷 림프종이다.

도 1은 각각 E-코일 또는 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 가진 2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 2개의 에피토프 결합 부위를 가진 대표적인 공유결합된 디아바디 분자의 도해를 제공한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영을 사용하여 표시된다. 특정 구체예에서, 에피토프는 각 에피토프에 대해서는 1가이지만 항원(예를 들어, DR5)과 관련해서는 2가인 이중특이적 분자를 가져오는 동일한 항원의 상이한 에피토프이다. 특정 구체예에서, 에피토프는 2가인 단일특이적 분자를 가져오는 동일한 에피토프이다(예를 들어, 각 사슬에서 동일한 VL 도메인 CDR과 VH 도메인 CDR이 사용된다).
도 2는 각각 CH2 및 CH3 도메인을 가진 2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 2개의 에피토프 결합 부위를 가짐으로써 회합된 사슬들이 자연 발생 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 영역을 형성하는, 대표적인 공유결합된 디아바디 분자의 도해를 제공한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영을 사용하여 표시된다. 특정 구체예에서, 에피토프는 각 에피토프에 대해서는 1가이지만 항원(예를 들어, DR5)과 관련해서는 2가인 이중특이적 분자를 가져오는 동일한 항원의 상이한 에피토프이다. 특정 구체예에서, 에피토프는 2가인 단일특이적 분자를 가져오는 동일한 에피토프이다(예를 들어, 각 사슬에서 동일한 VL 도메인 CDR과 VH 도메인 CDR이 사용된다).
도 2는 각각 CH2 및 CH3 도메인을 가진 2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 2개의 에피토프 결합 부위를 가짐으로써 회합된 사슬들이 자연 발생 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 영역을 형성하는, 대표적인 공유결합된 디아바디 분자의 도해를 제공한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영을 사용하여 표시된다. 특정 구체예에서, 에피토프는 각 에피토프에 대해서는 1가이지만 항원(예를 들어, DR5)과 관련해서는 2가인 이중특이적 분자를 가져오는 동일한 항원의 상이한 에피토프이다. 특정 구체예에서, 에피토프는 2가인 단일특이적 분자를 가져오는 동일한 에피토프이다(예를 들어, 각 사슬에서 동일한 VL 도메인 CDR과 VH 도메인 CDR이 사용된다).
도 3은 두 쌍의 폴리펩티드 사슬(즉, 모두 4개의 폴리펩티드 사슬)로 이루어진 대표적인 4가 디아바디 분자를 도시하는 도해를 제공한다. 각 쌍의 하나의 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인을 지니며, 이로써 회합된 사슬은 자연 발생 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 영역을 형성한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영을 사용하여 표시된다. 두 쌍의 폴리펩티드 사슬은 동일할 수 있다. VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(도시된 대로), 결과의 분자는 각 결합된 에피토프에 대해서 이중특이적이고 2가이다. VL 및 VH 도메인이 동일한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(예를 들어, 동일한 VL 도메인 CDR과 동일한 VH 도메인 CDR이 양쪽 사슬에서 사용된다), 결과의 분자는 단일 에피토프에 대해서 단일특이적이고 4가이다. 또는 달리, 두 쌍의 폴리펩티드는 상이할 수 있다. 폴리펩티드의 각 쌍의 VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(도시된 대로), 결과의 분자는 각 결합된 에피토프에 대해서 4중특이적이고 1가이다. 에피토프가 동일한 항원의 모든 에피토프인 구체예에서, 결과의 분자는 항원(예를 들어, DR5)에 대해서 4가이다. 에피토프들이 동일한 에피토프인 특정 구체예에서(예를 들어, 동일한 3개의 CDR_L과 동일한 3개의 3 CDR_H 도메인이 각 사슬에 사용된다), 결과의 분자는 단일특이적이고 4가이다.
도 4a 및 4b는 두 쌍의 폴리펩티드 사슬(즉, 모두 4개의 폴리펩티드 사슬)로 또한 이루어진 다른 4가 디아바디 분자의 도해를 제공한다. 각 쌍의 하나의 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인을 지니며, 이로써 회합된 사슬은 자연 발생 Fc 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 영역을 형성한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영을 사용하여 표시된다. 두 쌍의 폴리펩티드 사슬은 동일할 수 있다. VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(도시된 대로), 결과의 분자는 각 결합된 에피토프에 대해서 이중특이적이고 2가이다. VL 및 VH 도메인이 동일한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(예를 들어, 동일한 VL 도메인 CDR과 동일한 VH 도메인 CDR이 양쪽 사슬에서 사용된다), 결과의 분자는 단일 에피토프에 대해서 단일특이적이고 4가이다. 또는 달리, 두 쌍의 폴리펩티드는 상이할 수 있다. 폴리펩티드의 각 쌍의 VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(도시된 대로), 결과의 분자는 각 결합된 에피토프에 대해서 4중특이적이고 1가이다. 에피토프가 동일한 항원의 모든 에피토프인 구체예에서, 결과의 분자는 항원(예를 들어, DR5)에 대해서 4가이다. 도 4a의 구성물의 디아바디 부분은 시스테인 잔기를 포함하는 펩티드 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc-함유 디아바디를 도시한다. 도 4b는 시스테인 잔기와 링커(선택적 시스테인 잔기를 가진)를 포함하는 E-코일 및 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc-함유 디아바디를 도시한다.
도 5는 사람 DR5 및 사이노몰거스 원숭이의 DR5에 결합하는 항-사람 DR5 모노클로날 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 능력을 나타낸다.
도 6, 패널 A-H는 사람 DR5(패널 A-D) 및 사이노몰거스 원숭이 DR5(패널 E-H)에 대한 DR5 mAb 1(패널 A 및 E), DR5 mAb 2(패널 B 및 F), DR5 mAb 3(패널 C 및 G) 및 DR5 mAb 4(패널 D 및 H)의 결합의 동력학을 나타낸다.
도 7a-7b는 종양 세포에 차별적으로 결합하는 DR5 mAb 1의 능력을 나타낸다. 도 7a는 정상 결장(패널 A 및 G), 간(패널 B 및 H), 폐(패널 C 및 I), 췌장(패널 D 및 J), 신장(패널 E 및 K) 및 심장(패널 F 및 L) 조직의 조직학적 염색을 나타낸다. 도 7a, 패널 A-F는 표지된 DR5 mAb 1(5μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 7a, 패널 G-L은 표지된 이소타입 대조군 mAb(5μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 7b는 종양성 결장(패널 A 및 C) 및 종양성 폐(패널 B 및 D)의 조직학적 염색을 나타낸다. 도 7b, 패널 A-B는 표지된 DR5 mAb 1(5μg/mL)과 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 7b, 패널 C-D는 표지된 이소타입 대조군 mAb(5μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다.
도 8a-8b는 종양 세포와 차별적으로 결합하는 DR5 mAb 2의 능력을 나타낸다. 도 8a는 표지된 DR5 mAb 2(5μg/mL)와 함께 인큐베이션된 정상 결장(패널 A), 신장(패널 B), 폐(패널 C), 심장(패널 D), 간(패널 E) 및 췌장(패널 F) 조직의 조직학적 염색을 나타낸다. 도 8b는 종양성 결장(패널 A 및 B) 및 종양성 폐(패널 C 및 D)의 조직학적 염색을 도시한다. 도 8b, 패널 A 및 C는 표지된 DR5 mAb 2(5μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 8b, 패널 B 및 D는 표지된 이소타입 대조군 mAb(5μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다.
도 9a-9k는 7860 신장 세포 선암종 세포(도 9a), A498 신장 암종 세포(도 9b), AsPC1 췌장 선암종 세포(도 9c), LNCap 안드로겐-민감성 사람 전립선 선암종 세포(도 9d), SW48 결직장 선암종 세포(도 9e), A549 선암종 사람 폐포 기저 상피세포(도 9f), SKMES 사람 폐암 세포(도 9g), DU145 사람 전립선암 세포(도 9h), A375 사람 악성 흑색종 세포(도 9i), SKBR3 사람 HER2-과발현 유방 암종 세포(도 9j) 및 JIMT 사람 유방 암종 세포(도 9k)의 세포독성을 매개하는 DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디의 능력을 나타낸다. 이러한 표적 세포는 20:1 또는 30:1의 이펙터 대 표적 세포 비에서 24시간 동안 말초혈 단핵세포(PBMC)의 존재하에 인큐베이션되었다. 표적 세포의 세포독성의 퍼센트는 손상된 세포에 의한 매체에 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 방출을 측정함으로써 결정되었다.
도 10a-10f는 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 예상외의 우수성을 나타낸다. 우수성은 종양 세포의 세포독성을 매개하는, DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, DR5 mAb 3, 또는 DR5 mAb 4의 VL 및 VH 도메인을 가진 DR5 x CD3 디아바디의 능력을 비교함으로써 평가되었다. 이용된 표적 종양 세포는 A549 선암종 사람 폐포 기저 상피세포(도 10a), SKMES 사람 폐암 세포(도 10b), DU145 사람 전립선암 세포(도 10c), A375 사람 악성 흑색종 세포(도 10d), 및 SKBR3 사람 HER2-과발현 유방 암종 세포(도 10E) 및 JIMT 사람 유방 암종 세포(도 10f)였다.
도 11은 DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디 및 그것의 사람화된 유도체: hDR5 mAb 2(2.2) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.3) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.4) x CD3 mAb 2, 또는 hDR5 mAb 2(2.5) x CD3 mAb 2의 DR5와 CD3에 동시에 결합하는 능력을 나타낸다.
도 12는 DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디 및 그것의 사람화된 유도체: hDR5 mAb 2(2.2) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.3) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.4) x CD3 mAb 2, 또는 hDR5 mAb 2(2.5) x CD3 mAb 2의 Colo205 결직장 암종 세포의 세포독성을 매개하는 능력을 나타낸다.
도 13은 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, 가교된 DR5 mAb 1, 가교된 DR5 mAb 2, 또는 가교결합이 없는 DR5 mAb 1과 DR5 mAb 2의 조합으로 치료된 COLO205 세포의 성장 억제 곡선을 도시한다. 가교된 DR5 mAb 1, 가교된 DR5 mAb 2, 및 가교결합이 없는 DR5 mAb 1과 DR5 mAb 2의 조합은 COLO205 세포의 성장을 억제할 수 있다.
도 14a-14c는 뉴클레오솜의 증가된 생성(도 14a), 증가된 절단된 PARP(도 14b) 및 증가된 활성 카스파아제 3(도 14c)에 의해 측정되었을 때 가교된 DR5 mAb1과 가교된 DR5 mAb2가 둘 다 세포자멸을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 15a-15b는 대표적인 4가 DR5-결합 분자(DR5에 대해 4가인 이중특이적 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디, "DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디"로 지칭됨)가 정상 조직에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 도 15a는 정상 결장(패널 A 및 G), 간(패널 B 및 H), 폐(패널 C 및 I), 췌장(패널 D 및 J), 신장(패널 E 및 K) 및 심장(패널 F 및 L) 조직의 조직학적 염색을 도시한다. 도 15a, 패널 A-F는 표지된 4가 DR5-결합 분자(DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디, 0.625 μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 15a, 패널 G-L은 표지된 대조군 디아바디(4-4-20 x CD3 mAb 2, 0.625 μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 15b는 추가적인 정상 간 샘플의 대표적인 조직학적 염색을 도시한다. 도 15b, 위 패널은 표지된 4가 DR5-결합 분자(DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디, 0.625 μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 15b, 아래 패널은 표지된 대조군 디아바디(4-4-20 x CD3 mAb 2, 0.625 μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다.
도 16은 대표적인 4가 DR5-결합분자(DR5에 대해 4가인 이중특이적 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디)가 종양성 조직에 강하게 결합한다는 것을 보여준다. 도 16은 종양성 유방(패널 A 및 E), 종양성 결장(패널 B 및 F), 종양성 폐(패널 C 및 G), 및 종양성 전립선 조직(패널 D 및 H)의 조직학적 염색을 도시한다. 도 16, 패널 A-D는 표지된 4가 DR5-결합 분자(DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디, 0.625 μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다. 도 16, 패널 E-H는 표지된 대조군 디아바디(4-4-20 x CD3 mAb 2, 0.625 μg/mL)와 함께 인큐베이션된 조직의 결과를 도시한다.
도 17a-17c는 FcγRs에 대한 감소된 결합 및 감소된 이펙터 기능 활성을 가진 Fc 영역 변이체를 포함하는 2개를 포함하는 6개의 상이한 대표적인 4가 DR5-결합 분자(DR5에 대해 4가인 단일특이적 또는 이중특이적 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디)로 치료된 COLO205(도 17a), A498(도 17b) 및 SKMES(도 17c) 세포의 성장 억제 곡선을 도시한다. 모든 4가 DR5-결합 분자는 이들 세포에서 강력한 세포독성을 가지며, TRAIL-His 양성 대조군보다 더욱 강력했다.
도 18은 뉴클레오솜의 증가된 생성에 의해 측정되었을 때 대표적인 4가 DR5-결합 분자(DR5에 대해 4가인 단일특이적 또는 이중특이적 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디)가 세포자멸을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 19는 3개의 상이한 대표적인 4가 DR5-결합 분자(DR5에 대해 4가인 단일특이적 또는 이중특이적 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디)를 포함하는 상이한 DR5-결합 분자; 및 두 상이한 항-DR5 항체(DR5 mAb 8(KMTR2), 및 DR5 mAb 4(코나투무맙), 가교결합이 있는 것과 없는 것)로 치료된 COLO205 세포의 성장 억제 곡선을 도시한다. 시험된 각 DR5-결합 분자는 FcγRs에 대한 감소된 결합 및 감소된 이펙터 기능 활성을 가진 Fc 영역 변이체를 포함했다. 4가 DR5-결합 분자의 세포독성 활성은 가교결합에 독립적이며, 항-DR5 항체 DR5 mAb 4 및 DR5 mAb 8보다 더욱 강력했다.
도 20은 암 줄기세포-유사(CSLC) RECA0201 세포에 대한 3개의 상이한 대표적인 4가 DR5-결합 분자(DR5에 대해 4가인 단일특이적 또는 이중특이적 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디)를 포함하는 몇몇 상이한 DR5-결합 분자; 및 두 상이한 항-DR5 항체(DR5 mAb 8(KMTR2), 및 DR5 mAb 4(코나투무맙))의 세포독성 활성을 도시한다. 시험된 각 DR5-결합 분자는 FcγRs에 대한 감소된 결합 및 감소된 이펙터 기능 활성을 가진 Fc 영역 변이체를 포함했다. 모든 4가 DR5-결합 분자는 이들 세포에서 강력한 세포독성을 가지며, 항-DR5 항체 DR5 mAb 4 및 DR5 mAb 8보다 더욱 강력했다.
도 21은 COLO205 세포가 이식된 마우스에서 시간에 따른 종양 부피의 변화를 도시한다. 암컷 hCD16A FOX N1 마우스(n = 7/그룹)에 제0일에 COLO205 세포를 피하(SC) 이식했다. 다음에, 마우스를 대표적인 4가 DR5-결합 분자(단일특이적 4가 DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA), 0.5, 0.05, 0.005 mg/kg)로 주 2회 치료했다; 두 상이한 DR5 항체(DR5 mAb 4(AA), 5 mg/kg; DR5 mAb 8(AA), 0.5, 0.05, 0.005 mg/kg), 또는 비히클. 종양 부피는 그룹 평균±SEM으로 표시된다.

본 발명은 항-DR5 항체의 결합 도메인(들), 및 특히 항-사람 DR5 항체의 결합 도메인(들)을 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 DR5-결합 분자는, 각각 사람 DR5에 결합할 수 있는 2, 3 또는 4개의 DR5-결합 도메인을 가진 2가 및 4가 분자를 포함한다. 특히, 본 발명은 디아바디, 더 구체적으로 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 공유결합된 복합체를 포함하는 디아바디를 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 항-DR5 항체 DR5 mAb 1 및/또는 DR5 mAb 2의 단편, 및/또는 이러한 항체의 사람화된 버전 및 키메라 버전을 포함하는 이러한 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다.

I. 항체 및 이들의 결합 도메인

본 발명의 항체는, 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치된, 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해서 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 여기 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 사람 항체, 사람화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 폴리클로날 항체, 카멜화된 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화물-결합된 이중특이적 Fvs(sdFv), 인트라바디 및 상기 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 단편, 즉 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 하위부류를 가질 수 있다. 진단분야에서 이들의 알려진 사용에 더하여, 항체는 치료제로서도 유용한 것으로 나타났다. 최근 수십 년간 항체의 치료적 잠재성에 대한 관심이 부활했으며, 항체는 생명공학기술-유래 약물의 선두 부류 중 하나가 되었다(Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-66). 거의 200개의 항체-기반 약물이 사용 승인되었거나 개발 중이다.

용어 "모노클로날 항체"는 동종성 항체 집단을 말하며, 이때 모노클로날 항체는 항원의 선택적 결합에 수반되는 아미노산(자연 발생 및 비-자연 발생)으로 이루어진다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 에피토프(또는 항원성 부위)에 대해 지정된다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 모노클로날 항체 및 전장 모노클로날 항체는 물론 이들의 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂ Fv), 단쇄(scFv), 이들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 및 필요한 특이성 및 항원과 결합하는 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다. 항원의 출처 또는 그것이 제조되는 방식(예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물 등)과 관련하여 제한되지는 않는다. 이 용어는 전체 면역글로불린은 물론 "항체"의 정의 항목에서 상기 설명된 단편 등을 포함한다. 모노클로날 항체의 제조 방법은 본 분야에 알려져 있다. 이용될 수 있는 한 가지 방법은 Kohler, G. et al. (1975)("Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497)의 방법 또는 그것의 변형이다. 전형적으로, 모노클로날 항체는 마우스, 래트 또는 토끼에서 발생된다. 항체는 원하는 에피토프를 함유하는 세포, 세포 추출물, 또는 단백질 제제의 면역량으로 동물을 면역화함으로써 생성된다. 면역원은, 제한은 없지만, 1차 세포, 배양된 셀라인, 암성 세포, 단백질, 펩티드, 핵산, 또는 조직일 수 있다. 면역화에 사용되는 세포는 면역원으로 사용하기 전에 일정 시간 기간 동안 배양될 수 있다(예를 들어, 적어도 24h). 세포는 단독으로 또는 Ribi와 같은 비-변성 애쥬번트와 조합하여 면역원으로 사용될 수 있다(예를 들어, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3):119-125 참조). 일반적으로, 세포는 면역원으로 사용될 때 손상 없이 그리고 바람직하게 생육 상태로 유지되어야 한다. 무손상 세포는 면역화된 동물에 의해 파열된 세포보다 항원이 더 잘 검출될 수 있도록 할 수 있다. 변성 애쥬번트나 강력 애쥬번트, 예를 들어 Freud's 애쥬번트의 사용은 세포를 파열시킬 수 있고, 따라서 실시가 어렵게 된다. 면원원은 주기적 간격으로, 예컨대 주 2회, 또는 주 1회로 여러 번 투여될 수 있거나, 또는 동물(예를 들어, 조직 재조합체)에서 생육성을 유지할 수 있는 방식으로 투여될 수 있다. 또는 달리, 원하는 병원성 에피토프에 대해 면역특이적인 기존의 모노클로날 항체 및 임의의 다른 등가 항체가 서열화될 수 있고, 본 분야에 알려진 임의의 수단에 의해 재조합 생성될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 항체는 서열화된 다음, 폴리뉴클레오티드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터에 클로닝된다. 관심의 항체를 암호화하는 서열이 숙주 세포에서 벡터에 유지될 수 있고, 다음에 숙주 세포가 확장되고 향후 사용을 위해 냉동될 수 있다. 이러한 항체의 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명의 다중특이적(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 및 4중특이적) 분자는 물론, 친화성 최적화된 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, 또는 캐닌화된 항체를 생성하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있으며, 이로써 친화성, 또는 항체의 다른 특성을 개선할 수 있다. 항체를 사람화하는 일반적인 원리는 항체의 항원-결합 부분의 기본 서열을 보유한 채로 항체의 비-사람 나머지 부분을 사람 항체 서열로 바꾸는 것을 수반한다.

천연 항체(예컨대 IgG 항체)는 2개의 중쇄와 복합체화된 2개의 경쇄로 이루어진다. 각 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 함유한다. 각 중쇄는 가변 도메인(VH), 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3), 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치된 힌지 도메인을 함유한다. 따라서, 자연 발생 면역글로불린(예를 들어, IgG)의 기본 구조 유닛은 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 가진 테트라머이며, 통상 약 150,000 Da의 당단백이라고 표현된다. 각 사슬의 아미노-말단("N") 부분은 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 도메인을 포함하며, 주로 항원 인식을 담당한다. 각 사슬의 카복시-말단("C") 부분은 불변 영역을 한정하며, 경쇄는 단일 불변 도메인을 갖고, 중쇄는 통상 3개의 불변 도메인과 힌지 영역을 가진다. 따라서, IgG 분자의 경쇄의 구조는 n-VL-CL-c이고, IgG 중쇄의 구조는 n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c이다(여기서 H는 힌지 영역이고, n 및 c는 각각 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단을 표시한다). IgG 분자의 가변 도메인은 에피토프와 접촉하는 잔기를 함유하는 상보성 결정 영역(CDR), 및 (특정 프레임워크 잔기가 또한 항원과 접촉할 수 있음에도) 이러한 접촉을 허용하도록 일반적으로 CDR 루프의 구조를 유지하고 위치를 결정하는, 프레임워크 세그먼트(FR)라고 하는 비-CDR 세그먼트로 구성된다. 따라서, V_L 및 VH 도메인은 구조 n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c를 가진다. 항체 경쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인(또는 그것으로 작용할 수 있는) 폴리펩티드는 여기서 각각 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인으로 지칭된다. 유사하게, 항체 중쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인(또는 그것으로 작용할 수 있는) 폴리펩티드는 여기서 각각 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인으로 지칭된다. 따라서, 용어 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, CDR_L3 도메인, CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 단백질에 포함되었을 때 이러한 단백질이 경쇄 및 중쇄를 가진 항체이든 디아바디든 단쇄 결합 분자(예를 들어, scFv, BiTe 등)든, 또는 다른 타입의 단백질이든 해당 단백질이 특이적 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 폴리펩티드를 말한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항-DR5 항체의 단쇄 가변 도메인 단편("scFv")을 포함하는 다가 DR5-결합 분자를 포함한다. 단쇄 가변 도메인 단편은 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인을 연결함으로써 제조된다. Bird et al. (1988)("Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426)은 하나의 가변 도메인의 카복시 말단과 나머지 하나의 가변 도메인의 아미노 말단 사이의 대략 3.5nm의 브릿지인 연결 펩티드의 예를 설명한다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되었다(Bird et al.(1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins" Science 242:423-426). 다음에, 링커는 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 단쇄 변이체는 재조합 또는 합성 방식으로 생성될 수 있다. scFv의 합성 생성을 위해 자동화된 합성장치가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생성을 위해, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵세포, 또는 E. coli와 같은 원핵세포인, 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 관심의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 라이게이션과 같은 통상의 조작에 의해 제조될 수 있다. 결과의 scFv는 본 분야에 알려진 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 분리될 수 있다.

또한, 본 발명은 특히 본 발명의 항-DR5 항체의 사람화된 변이체를 포함하는 다가 DR5-결합 분자를 포함한다. 용어 "사람화된" 항체는, 비-사람 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위와 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가진, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조된, 키메라 분자를 말한다.

본 발명의 항-사람 DR5 항체는 항체 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2의 사람화된, 키메라 또는 캐닌화된 유도체를 포함한다. 이러한 항체의 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 서열은 이러한 유도체를 생성하고 친화성, 또는 이러한 항체의 다른 특성을 개선하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체를 사람화하는 일반적인 원리는 항체의 항원-결합 부분의 기본 서열을 보유한 채로 항체의 비-사람 나머지 부분을 사람 항체 서열로 바꾸는 것을 수반한다. 모노클로날 항체를 사람화하기 위해서는 4개의 일반적인 단계가 있다. 이들은 (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하는 단계, (2) 사람화된 항체를 설계하는, 즉 사람화 과정 동안 사용할 수 있는 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계, (3) 실제 사람화 방법/기술 단계, 및 (4) 사람화된 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계이다. 예를 들어, 미국특허 Nos. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415 참조.

항원-결합 부위는 불변 도메인 위에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나, 또는 단지 가변 도메인에서 적절한 프레임워크 영역 위에 접목된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이것은 사람 개체에서 면역원인 불변 영역을 제거하지만 외부 가변 도메인에 대한 면역 반응의 가능성은 유지한다(LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). 다른 접근법은 사람-유래 불변 영역을 제공하는 것뿐만 아니라 가변 도메인을 변형함으로써 이들을 가능한 사람 형태에 가깝게 재형성하는 것에 중점을 둔다. 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은, 주어진 종에서 상대적으로 보존되며 잠정적으로 CDR에 대한 스캐폴딩을 제공하는 4개의 프레임워크 영역(FR)이 측면에 있는, 문제의 항원에 반응하여 변하며 결합 역량을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다는 것이 알려져 있다. 특정 항원과 관련하여 비-사람 항체가 제조되었을 때, 가변 도메인은 변형될 사람 항체에 존재하는 FR 상에 비-사람 항체로부터 유래된 CDR을 접목함으로써 "재형성" 또는 "사람화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이 접근법의 적용이 Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR -Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4181-85; Tempest, P.R. et al.(1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti- p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 및 Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154에 의해 보고되었다. 일부 구체예에서, 사람화된 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 모든 6개 CDR을 함유하는 사람화된 마우스 항체). 다른 구체예에서, 사람화된 항체는, 원래 항체에 비해서 서열에 차이가 있는, 원래 항체에 대해서 변경된 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 가진다.

사람 불변 도메인에 융합된 설치류 또는 변형된 설치류 V 영역 및 이들의 관련된 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 키메라 항체를 포함하는, 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위를 포함하는 다수의 "사람화된" 항체 분자가 설명되었다(예를 들어, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies," Nature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen," J. Immunol. 138:4534-4538, 및 Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine /Human Chimeric Monoclonal Antibody," Cancer Res. 47:3577-3583 참조). 다른 참고자료는 적절한 사람 항체 불변 도메인과의 융합 전에 사람 지지 프레임워크 영역(FR)에 접목된 설치류 CDR을 설명한다(예를 들어, Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-36; 및 Jones et al.(1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525 참조). 다른 참고자료는 재조합 덧붙임된(veneered) 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들어, 유럽 특허공개 No. 519,596 참조. 이들 "사람화된" 분자는 설치류 항-사람 항체 분자를 향한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계되는데, 이것은 사람 레시피언트에서 이들 부분을 치료적 적용할 때 지속기간 및 유효성을 제한한다. 또한 활용될 수 있는 항체를 사람화하는 다른 방법들은 Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR -Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins" Nucl. Acids Res. 19:2471-76 및 미국특허 Nos. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 및 5,866,692에 개시된다.

II. Fc 수용체( FcγRs )

두 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인은 상호작용하여 Fc 영역을 형성하는데, 이것은 세포성 Fc 수용체(FcγRs)에 의해 인식되는 도메인이다. 여기 사용된 용어 "Fc 영역"은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 한정하기 위해 사용된다. 예시적인 사람 IgG1의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:1)이다:

예시적인 사람 IgG2의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:164)이다:

예시적인 사람 IgG3의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:168)이다:

예시적인 사람 IgG4의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:103)이다:

본 명세서를 통틀어서 IgG 중쇄에서 잔기의 넘버링은 여기 분명히 참고로 포함되는 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, NH1, MD(1991)에서와 같은 EU 인덱스를 따른다. "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 사람 IgG1 EU 항체의 넘버링을 말한다. 면역글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로부터의 아미노산은 사슬에서 아미노산의 위치에 의해 지정된다. Kabat은 항체에 대해 수많은 아미노산 서열을 설명했고, 각 하위그룹에 대해 아미노산 컨센서스 서열을 확인했고, 각 아미노산에 잔기 번호를 배정했다. Kabat's 넘버링 제도는 보존된 아미노산을 참조하여 Kabat에서 컨센서스 서열 중 하나와 문제의 항체를 정렬시킴으로써 그의 개론에 포함되지 않는 항체로 확장될 수 있다. 잔기 번호를 배정하기 위한 이 방법은 본 분야의 표준이 되었으며, 키메라 또는 사람화된 변이체를 포함하는 상이한 항체들에서 동등한 위치에 있는 아미노산을 쉽게 확인한다. 예를 들어, 사람 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산은 마우스 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산과 동등한 위치를 점유한다.

항체 불변 영역 내의 다수의 상이한 위치에서 다형성이 관찰되었고(예를 들어, 제한은 아니지만 Kabat에서 제시된 EU 인덱스에 의해 넘버링된 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하는, Fc 위치들), 따라서 제시된 서열과 선행기술의 서열 사이에 약간의 차이가 존재할 수 있다. 사람 면역글로불린의 다형성 형태는 잘 특성화되었다. 현재 18개의 Gm 알로타입이 알려져 있다: G1m(1, 2, 3, 17) 또는 G1m(a, x, f, z), G2m(23) 또는 G2m(n), G3m(5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m(b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., "The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation," Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet. 50:199-211). 본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 유전자의 임의의 알로타입, 이소알로타입, 또는 하플로타입을 포함할 수 있다고 구체적으로 고려되며, 제한은 없지만 여기 제공된 서열의 알로타입, 이소알로타입 또는 하플로타입이다. 더욱이, 일부 발현 시스템에서 CH3 도메인의 C-말단 아미노산 잔기(상기 볼드체)는 후-번역 제거될 수 있다. 따라서, CH3 도메인의 C-말단 잔기는 본 발명의 다가 DR5-결합 분자에서 선택적인 아미노산 잔기이다. SEQ ID NO:1의 C-말단 잔기를 결여한 예시적인 다가 DR5-결합 분자는 아래 제공된다. 또한, C-말단 잔기를 포함하는 이러한 구성물도 본 발명에 의해 구체적으로 포함된다.

활성화 및 억제성 신호는 Fc 영역에 라이게이션 후 Fc 수용체(FcγRs)를 통해서 변환된다. 이들 전혀 다른 상반된 기능은 상이한 수용체 동형의 구조적 차이로 인한 결과이다. 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프(ITAMs) 또는 면역수용체 티로신-기재 억제성 모티프(ITIMS)라고 칭하는 수용체의 세포질 신호화 도메인 내의 두 상이한 도메인이 상이한 반응을 설명한다. 이들 구조에 상이한 세포질 효소의 모집은 FcγR-매개 세포성 반응의 성과를 좌우한다. ITAM-함유 FcγR 복합체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA를 포함하는 반면, ITIM-함유 복합체는 단지 FcγRIIB만을 포함한다. 사람 호중구가 FcγRIIA 유전자를 발현한다. 면역 복합체 또는 특이적 항체 가교결합을 통한 FcγRIIA 클러스터화는, ITAM 인산화를 촉진하는 수용체-회합된 키나아제와 함께 ITAMs를 응집시키는 작용을 한다. ITAM 인산화는 Syk 키나아제에 대한 도킹 부위로서 작용하며, 이것의 활성화는 하류 기질(예를 들어, PI₃K)의 활성화를 가져온다. 세포성 활성화는 전염증 메디에이터의 방출을 초래한다. FcγRIIB 유전자는 B 림프구에서 발현된다; 그것의 세포외 도메인은 FcγRIIA와 96% 동일하고, 구별할 수 없는 방식으로 IgG 복합체와 결합한다. FcγRIIB의 세포질 도메인에서 ITIM의 존재는 FcγR의 이 억제성 하위부류를 한정한다. 최근에 이 억제의 분자 기반이 확립되었다. 활성화 FcγR과 함께 같이 라이게이션되었을 때, FcγRIIB에서 ITIM은 인산화되어 이노시톨 폴리포스페이트 5'-포스파타아제(SHIP)의 SH2 도메인을 유인하고, 이것은 ITAM-함유 FcγR-매개 티로신 키나아제 활성화의 결과로서 방출된 포스포이노시톨 메신저를 가수분해하며, 결과적으로 세포내 Ca⁺⁺의 유입을 방지한다. 따라서, FcγRIIB의 가교는 FcγR 라이게이션에 대한 활성화 반응을 축소시키고 세포 반응성을 억제한다. 따라서, B 세포 활성화, B 세포 증식 및 항체 분비가 중단된다.

III. 다가 항체, 다가 디아바디 및 DART® 디아바디

항원의 에피토프와 결합하는 항체의 능력은 항체의 VL 및 VH 도메인의 존재 및 아미노산 서열에 의존한다. 항체 경쇄와 항체 중쇄의 상호작용, 및 특히 그것의 VL 및 VH 도메인의 상호작용은 천연 항체의 2개의 에피토프-결합 부위 중 하나를 형성한다. 천연 항체는 단지 하나의 에피토프 종에만 결합할 수 있지만(즉, 이들은 단일특이적이다), 이들은 그 항체의 다수의 카피와도 결합할 수 있다(즉, 2가 또는 다가 성질을 나타낸다).

본 발명의 결합 도메인은 "면역특이적" 방식으로 에피토프와 결합한다. 여기 사용된 항체, 디아바디 또는 다른 에피토프 결합 분자는, 그것이 대용 에피토프에 비해서 해당 에피토프와 더 긴 지속기간 및/또는 더 큰 친화성으로, 더욱 빈번히, 더욱 빠르게 반응하거나 회합한다면, 다른 분자(즉, 에피토프)의 영역에 "면역특이적"으로 결합한다고 한다. 예를 들어, 바이러스성 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는, 그것이 다른 바이러스성 에피토프 또는 비-바이러스성 에피토프와 면역특이적으로 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합활성(avidity), 더욱 빠르게, 및/또는 더 긴 지속기간으로 이 바이러스 에피토프와 결합하는 항체이다. 또한, 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체(또는 부분 또는 에피토프)는 제2 표적과 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것이 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합"은 배타적 결합을 반드시 필요로 하지는 않는다(그것은 배타적 결합을 포함할 수도 있다). 반드시 그렇지는 않지만 일반적으로 결합이란 말은 "특이적" 결합을 의미한다. 2개의 분자는, 이러한 결합이 수용체가 각자의 리간드와 결합하는 특이성을 나타낸다면, "물성특이적"(physiospecific) 방식으로 서로 결합할 수 있다고 한다.

항체의 기능성은 2개의 별개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 항체-기반 분자를 생성함으로써 및/또는 동일한 에피토프 및/또는 항원에 대해 높은 원자가(즉, 2개보다 많은 결합 부위)를 가진 항체-기반 분자를 생성함으로써 증진될 수 있다.

천연 항체보다 더 큰 역량을 가진 분자를 제공하기 위해 광범위한 재조합 이중특이적 항체 포맷이 개발되었으며(예를 들어, PCT 공개 Nos. WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565 참조), 이들 중 대부분은 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)에, 또는 항체 코어 내부에 추가의 결합 단백질(예를 들어, scFv, VL, VH 등)을 융합하기 위해, 또는 다수의 항체 결합 부분, 예를 들어 2개의 Fab 단편 또는 scFvs를 융합하기 위해 링커 펩티드를 사용한다. 대용 포맷은 CH2-CH3 도메인과 같은 다이머화 도메인 또는 대용 폴리펩티드에 결합 단백질(예를 들어, scFv, VL, VH 등)을 융합하기 위해 링커 펩티드를 사용한다(WO 2005/070966, WO 2006/107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). 전형적으로, 이러한 접근법은 타협 및 교환을 수반한다. 예를 들어, PCT 공개 Nos. WO 2013/174873, WO 2011/133886 및 WO 2010/ 136172는 링커의 사용이 치료 환경에 문제를 야기할 수 있다는 것을 개시하며, 2개 이상의 항원과 결합할 수 있도록 CL 및 CH1 도메인이 이들 각자의 천연 위치에서 이동되고 VL과 VH 도메인이 다능화된 삼중특이적 항체를 교시한다(WO 2008/027236; WO 2010/108127). 따라서, 이들 문헌에 개시된 분자는 결합 특이성을 추가의 항원 종들에 결합하는 능력과 맞바꾼다. PCT 공개 Nos. WO 2013/163427 및 WO 2013/ 119903은 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 애덕트를 함유하도록 CH2 도메인을 변형하는 것을 개시한다. 이 문헌은 CH2 도메인이 이펙터 기능을 매개하는데 있어 단지 최소한의 역할만을 할 수 있음을 주지한다. PCT 공개 Nos. WO 2010/028797, WO 2010/028796 및 WO 2010/028795는 3가 결합 분자를 형성하기 위해서 Fc 영역이 추가의 VL 및 VH 도메인으로 치환된 재조합 항체를 개시한다. PCT 공개 Nos. WO 2003/025018 및 WO 2003/012069는 개별 사슬이 scFv 도메인을 함유하는 재조합 디아바디를 개시한다. PCT 공개 No. WO 2013/006544는 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성된 다음 가수분해되어 헤테로다이머 구조를 제공하는 다가 Fab 분자를 개시한다. 따라서, 이들 문헌에 개시된 분자는 이펙터 기능을 매개하는 역량의 전부 또는 일부를 추가의 항원 종들에 결합하는 능력과 맞바꾼다. PCT 공개 Nos. WO 2014/ 022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 및 WO 1991/003493은 항체 또는 항체 부분에 추가 결합 도메인 또는 관능기를 부가하는 것을 개시한다(예를 들어, 항체의 경쇄에 디아바디의 부가, 또는 항체의 경쇄 및 중쇄에 추가의 VL 및 VH 도메인의 부가, 또는 이종성 융합 단백질 또는 사슬화 다중 Fab 도메인을 서로에 부가). 따라서, 이들 문헌에 개시된 분자는 자생 항체 구조를 추가의 항원 종들에 결합하는 능력과 맞바꾼다.

본 분야는 둘 이상의 상이한 에피토프 종들에 결합할 수 있다는데 있어 이러한 천연 항체와 상이한 디아바디를 생성하는 역량을 추가로 주지했다(즉, 2가 또는 다가 성질에 더하여 이중특이성 또는 다중특이성을 나타냄)(예를 들어, Holliger, et al.(1993) "'Diabodies ': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv - Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al.(2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69 (12):4941-4944 참조).

디아바디의 설계는 단쇄 가변 도메인 단편(scFv)으로 알려진 항체 유도체에 기초한다. 이러한 분자는 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인을 연결함으로써 제조된다. Bird, et al.(1988)("Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426)은 하나의 가변 도메인의 카복시 말단과 나머지 하나의 가변 도메인의 아미노 말단 사이의 대략 3.5nm의 브릿지인 연결 펩티드의 예를 설명한다. 다른 서열의 링커가 설계되고 사용되었다(Bird, et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 다음에, 링커는 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 단쇄 변이체는 재조합 또는 합성 방식으로 생성될 수 있다. scFv의 합성 생성을 위해 자동화된 합성장치가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생성을 위해, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵세포, 또는 E. coli와 같은 원핵세포인, 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 관심의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 라이게이션과 같은 통상의 조작에 의해 제조될 수 있다. 결과의 scFv는 본 분야에 알려진 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 분리될 수 있다.

비-단일특이적 디아바디의 제공은, 제한은 없지만 상이한 에피토프를 발현하는 세포들을 함께 라이게이션하고 함께 편재시키는 능력 및 동일한 항원의 상이한 에피토프를 결합시킴으로써 분자내 및/또는 분자간 상호작용을 형성하는 능력을 포함하는, 항체를 능가하는 유의한 이점을 제공한다. 따라서, 2가 디아바디는 치료법 및 면역진단을 포함하는 광범위한 용도를 가진다. 이중특이성은 다양한 용도에서 디아바디의 설계 및 조작에 큰 유연성을 허용하며, 멀티머 항원에 대한 증진된 결합활성, 항원을 차별화시키는 가교결합, 및 양 표적 항원의 존재에 따른 특이적 세포 타입에 대한 통제된 표적화를 제공한다. 이들의 증가된 원자가, 낮은 해리 속도 및 순환으로부터의 빠른 클리어런스(~ 50 kDa 또는 그 아래의 작은 크기의 디아바디에 대해)로 인하여, 본 분야에 알려진 디아바디 분자는 또한 종양 영상화 분야에서 특별한 사용을 보여주었다(Fitzgerald, et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris ," Protein Eng. 10:1221). 세포를 차별화시키는 공-라이게이션, 예를 들어 종양 세포에 세포독성 T 세포의 가교결합이 특히 중요하다(Staerz, et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, 및 Holliger, et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305; Marvin, et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG -Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).

그러나, 상기 이점은 핵심적인 노력을 부가한다. 이러한 비-단일특이적 디아바디의 형성은 둘 이상의 상이한 폴리펩티드의 성공적인 조립을 필요로 한다(즉, 이러한 형성은 상이한 폴리펩티드 사슬 종들의 헤테로다이머화를 통해서 디아바디가 형성되어야 할 필요가 있다). 이 사실은 동일한 폴리펩티드 사슬의 호모다이머화를 통해서 형성되는 단일특이적 디아바디와는 대조적이다. 비-단일특이적 디아바디를 형성하기 위해 적어도 2개의 비유사 폴리펩티드(즉, 2개의 폴리펩티드 종)가 제공되어야 하고, 이러한 폴리펩티드의 호모다이머화는 비활성 분자를 초래하기 때문에(Takemura S. et al.(2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 이러한 폴리펩티드의 생성은 동일한 종들의 폴리펩티드 사이의 공유결합을 방지할 수 있는(즉, 호모다이머화를 방지할 수 있는) 방식으로 달성되어야 한다(Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). 따라서, 본 분야는 이러한 폴리펩티드들의 비-공유 회합을 생각했다(예를 들어, Olafsen, et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).

그러나, 본 분야는 비-공유 회합된 폴리펩티드로 이루어진 이중특이적 디아바디가 불안정하며 비-기능적 모노머로 쉽게 해리한다는 것을 인식했다(예를 들어, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672 참조).

이런 난관에 직면하여, 본 분야는 안정한, 공유결합된 헤테로다이머 비-단일특이적 디아바디를 개발하는데 성공했고, 이것을 DART®(듀얼 어피니티 리-타겟팅 리에이전트) 디아바디로 명명했다; 예를 들어, 미국특허 공개 No. 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽특허 공개 No. EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 No. WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/ 080538; 및 Moore P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb ( CD32B ) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449 참조). 이러한 디아바디는 둘 이상의 공유 복합체화된 폴리펩티드를 포함하고, 이용된 폴리펩티드 종들 각각에 하나 이상의 시스테인 잔기를 조작해 넣는 것을 수반하는데, 이것은 이황화물 결합이 형성되는 것을 허용하여 두 폴리펩티드 사슬을 공유 결합시킨다. 예를 들어, 이러한 구성물의 c-말단에 시스테인 잔기의 부가는 폴리펩티드 사슬 사이의 이황화물 결합을 허용하는 것으로 나타났으며, 이것은 2가 분자의 결합 특성의 방해 없이 결과의 헤테로다이머를 안정화한다.

가장 간단한 이중특이적 DART® 디아바디의 2개의 폴리펩티드의 각각은 3개의 도메인을 포함한다. 제1 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로): (i) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인(VL1), (ii) 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인(VH2), 및 (iii) 시스테인 잔기(또는 시스테인-함유 도메인) 및 디아바디의 제2 폴리펩티드와의 헤테로다이머화를 촉진하고 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드가 서로 공유결합하도록 작용하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 제3 도메인을 포함한다. 제2 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로): (i) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인(VL2), (ii) 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인(VH1), 및 (iii) 시스테인 잔기(또는 시스테인-함유 도메인), 및 제1 폴리펩티드 사슬의 헤테로다이머화-촉진 도메인과 복합체화되어 제1 폴리펩티드 사슬과의 헤테로다이머화를 촉진하는 상보성 헤테로다이머화-촉진 도메인을 함유하는 제3 도메인을 함유한다. 제2 폴리펩티드의 제3 도메인의 시스테인 잔기(또는 시스테인-함유 도메인)은 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬에 제2 폴리펩티드 사슬의 공유결합을 촉진하는 작용을 한다. 이러한 분자는 안정하고, 강력하며, 둘 이상의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 동시에 결합하는 능력을 가진다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 제3 도메인은 각각 시스테인 잔기를 함유하고, 이것은 이황화물 결합을 통해서 폴리펩티드들을 함께 결합시키는 작용을 한다. 도 1은 이러한 디아바디의 도해를 제공하는데, 이것은 공유결합을 위해 E-코일/K-코일 헤테로다이머화 도메인 및 시스테인 함유 링커를 활용한다. 도 2-4에 제공된 대로, 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 다는 추가로 CH2-CH3 도메인의 서열을 지니며, 이로써 두 디아바디 폴리펩티드 사이의 복합체화는 세포(예컨대 B 림프구, 수지상 세포, 내츄럴 킬러 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구 및 비만 세포)의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 영역을 형성한다. 아래 더 상세히 제공된 대로, 이러한 폴리펩티드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일할 필요는 없으며, 유익하게는 두 폴리펩티드 사슬 사이의 복합체화를 촉진하도록 변형된다.

이러한 분자의 많은 변형이 설명되었다(예를 들어, 미국특허 공개 No. 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽특허공개 No. EP2714079; EP2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 No. WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 이들 Fc 영역-함유 DART® 디아바디는 두 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 제1 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로): (i) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인(VL1), (ii) 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인(VH2), (iii) 시스테인 잔기(또는 시스테인-함유 도메인) 및 디아바디의 제2 폴리펩티드와의 헤테로다이머화를 촉진하고 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드가 서로 공유결합하도록 작용하는 헤테로다이머화-촉진 도메인을 함유하는 제3 도메인 및 (iv) CH2-CH3 도메인을 포함한다. 제2 폴리펩티드는 (N-말단에서 C-말단 방향으로): (i) 제2 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인의 결합영역을 포함하는 제1 도메인(VL2), (ii) 제1 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인(VH1), 및 (iii) 시스테인 잔기(또는 시스테인-함유 도메인), 및 제1 폴리펩티드 사슬의 제3 도메인과 상호작용할 수 있어서 두 폴리펩티드 사슬 사이의 헤테로다이머화 및 공유결합을 촉진할 수 있는 헤테로다이머화-촉진 도메인을 함유하는 제3 도메인을 함유한다. 2개의 제1 폴리펩티드가 서로 복합체화되어 Fc 영역을 형성한다. 도 3 및 4a-4b는 상이한 헤테로다이머-촉진 도메인을 활용한 이러한 디아바디들의 3개의 변형의 도해를 제공한다. 다른 Fc 영역-함유 DART® 디아바디는 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 DART® 디아바디의 제1 폴리펩티드는 3개의 도메인: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 이러한 DART® 디아바디의 제2 폴리펩티드는 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유결합을 촉진하는 도메인을 함유한다. 이러한 DART® 디아바디의 제3 폴리펩티드는 CH2-CH3 서열을 포함한다. 따라서, 이러한 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 회합하여 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위, 뿐만 아니라 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위를 형성한다. 이러한 더욱 복잡한 디아바디들은 또한 공유결합된 복합체를 형성하도록 작용하는 시스테인-함유 도메인을 지닌다. 따라서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각자의 제3 도메인에 있는 시스테인 잔기를 수반하는 이황화물 결합을 통해서 서로에 결합된다. 주목할 점은 제1 및 제3 폴리펩티드 사슬이 서로 복합체화되어 이황화물 결합을 통해 안정화되는 Fc 영역을 형성한다는 것이다.

4가 분자가 바람직하지만 Fc는 필요하지 않은 용도를 위한 대용 구성물이 본 분야에 알려져 있으며, 제한은 없지만 각각 VH1, VL2, VH2 및 VL2 도메인을 지닌 2개의 동일한 사슬의 호모다이머화에 의해 형성되는, "TandAbs"(예를 들어, 미국 특허공개 Nos. 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667, 및 2013-0189263; 유럽 특허공개 Nos. EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 및 EP 1293514; PCT 공개 Nos. WO 1999/057150, WO 2003/025018, 및 WO 2013/013700 참조)라고도 하는 4가 텐덤 항체를 포함한다.

IV. 본 발명의 항-사람 DR5-결합 분자

본 발명의 바람직한 다가 DR5-결합 분자는 사람 DR5의 연속 또는 불연속(예를 들어, 입체구조) 부분(에피토프)과 결합할 수 있다. 본 발명의 DR5-결합 분자는 바람직하게는 또한 하나 이상의 비-사람 종들, 특히 뮤린, 설치류, 개 및 영장류 종들의 DR5 분자에 결합하는 능력을 나타낼 것이다. 사람 DR5 전구체의 아미노산 서열(NCBI Sequence NP_003833.4)(SEQ ID NO:2)은 다음과 같다:

DR5(SEQ ID NO:2)의 440개 아미노산 잔기 중에서, 잔기 1-55는 신호 서열이고, 잔기 57-94는 제1 시스테인-부화 도메인(CRD)이고, 잔기 97-137은 제2 시스테인-부화 도메인(CRD)이고, 잔기 138-178은 제3 시스테인-부화 도메인(CRD)이고, 잔기 211-231은 막관통 도메인이고, 잔기 232-440은 세포질 도메인(수용체의 사멸 도메인을 함유하는)이다.

본 발명은 적어도 2개, 바람직하게 적어도 4개의 DR5 결합 부위를 지닌 다가 DR5-결합 분자를 포함한다. DR5 결합 부위는 동일한 DR5 에피토프 또는 상이한 DR5 에피토프에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 단일특이적이어서 DR5의 단지 하나의 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 이들은 다중특이적이어서 DR5의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다.

본 발명의 예시적인 다가 DR5-결합 분자는 "제1 DR5 에피토프"에 결합하는 적어도 하나의 "제1 결합 부위" 및 "제2 DR5 에피토프"에 결합하는 적어도 하나의 "제2 결합 부위"를 지닌 이중특이적 분자(예를 들어, 이중특이적 항체, 비-단일특이적 디아바디 등)를 포함한다. 이러한 분자는 상기 제1 DR5 에피토프 및 제2 DR5 에피토프에 대해서 이중특이적이며, DR5에 대해서 적어도 2가이다. DR5에 대해 높은 원자가를 나타내는 이중특이적 다가 DR5-결합 분자는 하나 이상의 추가의 제1 결합 부위 및/또는 제2 결합 부위의 부가에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 예시적인 다가 DR5-결합 분자는 또한, 각각 상이한 DR5 에피토프에 결합하는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 그 이상의 상이한 결합 부위를 지닌 다중특이적 분자를 포함한다. 이러한 분자는 상기 DR5 에피토프에 대해서 다중특이적이며, DR5에 대해서 다가이다.

본 발명의 한 예시적인 이중특이적 다가 DR5-결합 분자는 제1 DR5 에피토프에 결합하는 2개의 제1 결합 부위, 및 제2 DR5 에피토프에 결합하는 2개의 제2 결합 부위를 지닌다. 이러한 DR5-결합 분자는 상기 제1 및 제2 DR5 에피토프에 대해서 이중특이적이고, DR5에 대해서 4가이다.

바람직하게, 본 발명의 다중특이적 다가(예를 들어, 이중특이적, 2가) DR5-결합 분자는 상이한 DR5 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 분자내(즉, 단일 DR5 폴리펩티드 상의 상이한 DR5 에피토프에) 및/또는 분자간(즉, 분리된 DR5 폴리펩티드 상의 상이한 DR5 에피토프에)일 수 있다.

본 발명의 예시적인 다가 DR5-결합 분자는 또한 동일한 DR5 에피토프에 결합하는 적어도 2개, 바람직하게 적어도 4개의 결합 부위를 지닌 단일특이적 분자(예를 들어, 이중특이적 항체, 단일특이적 디아바디 등)를 포함한다. 이러한 분자는 상기 DR5 에피토프에 대해서 단일특이적이고, DR5에 대해서 적어도 2가, 바람직하게 4가이다. 동일한 DR5 에피토프에 결합하는 2개를 초과하는 결합 부위가 존재하는 경우, 다가 DR-결합 분자는 에피토프에 대해서 그대로 단일특이적이고 DR5에 대해서는 더 높은 원자가를 나타낼 것이라는 점이 주지될 것이다.

본 발명의 한 예시적인 단일특이적 다가 DR5-결합 분자는 동일한 DR5 에피토프에 결합하는 4개의 결합 부위를 지니며, 상기 DR5 에피토프에 대해서 단일특이적이고, DR5에 대해서 4가이다.

바람직하게, 본 발명의 단일특이적 다가(예를 들어, 단일특이적, 2가) DR5-결합 분자는 DR5 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 분자간(즉, 분리된 DR5 폴리펩티드 상의 동일한 DR5 에피토프에)이다.

본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 여기 개시된 항-DR5 항체 중 하나 이상의 VL 및/또는 VH 도메인을 지닐 수 있다. 본 발명의 바람직한 다가 DR5-결합 분자는 항-사람 DR5 모노클로날 항체 "DR5 mAb 1" 및/또는 "DR5 mAb 2", 및/또는 "hDR5 mAb2"의 VL 및/또는 VH 도메인을 지니고, 더 바람직하게는 이러한 항-사람 DR5 모노클로날 항체의 VL 도메인의 CDR_L 중 1개, 2개 또는 3개 모두 및/또는 VH 도메인의 CDR_H 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 지닌다. 특정 항-DR5-결합 분자의 아미노산 서열 및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 아래 제공된다. 본 발명은 또한, 예를 들어 서브클로닝을 용이하게 하기 위해 도입될 수 있는 C-말단 및/또는 N-말단 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하여 이들 서열의 작은 변형을 포함한다.

A. 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1

DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 1의 CDR_L1(SEQ ID NO:4): RASKSVSSSGYSYMH

DR5 mAb 1의 CDR_L2(SEQ ID NO:5): LSSNLDS

DR5 mAb 1의 CDR_L3(SEQ ID NO:6): QHSRDLPPT

DR5 mAb 1의 VL 도메인은 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO:7)에 의해 암호화된다(CDR_L 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)이 아래 제시되며(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다), C-말단 아미노산은 이 VH 도메인의 서브클로닝을 용이하게 하기 위해 알라닌으로 치환될 수 있다:

DR5 mAb 1의 CDR_H1(SEQ ID NO:9): GFDFSRYWMS

DR5 mAb 1의 CDR_H2(SEQ ID NO:10): EINPDSNTINYTPSLKD

DR5 mAb 1의 CDR_H3(SEQ ID NO:11): RAYYGNPAWFAY

DR5 mAb 1의 VH 도메인은 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO:12)에 의해 암호화된다(CDR_H 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시된다):

B. 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2

1. 뮤린 항-사람 항체 DR5 mAb 2

DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산서열(SEQ ID NO:13)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 2의 CDR_L1(SEQ ID NO:14): KASQDVNTAVA

DR5 mAb 2의 CDR_L2(SEQ ID NO:15): WASTRHT

DR5 mAb 2의 CDR_L3(SEQ ID NO:16): QQHYITPWT

DR5 mAb 2의 VL 도메인은 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO:17)에 의해 암호화된다(CDR_L 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산서열(SEQ ID NO:18)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 2의 CDR_H1(SEQ ID NO:19): GYTFTEYILH

DR5 mAb 2의 CDR_H2(SEQ ID NO:20): WFYPGNNNIKYNEKFKD

DR5 mAb 2의 CDR_H3(SEQ ID NO:21): HEQGPGYFDY

DR5 mAb 2의 VH 도메인은 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO:22)에 의해 암호화된다(CDR_H 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 밑줄로 표시된다):

2. "hDR5 mAb 2"를 형성하기 위한 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 사람화

상기 설명된 뮤린 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2는 항-사람 DR5 항체를 사람화하는 역량을 증명함으로써 사람 레시피언트에게 투여시 그것의 항원성을 감소시키기 위해 사람화되었다. 사람화는, 여기서 "hDR5 mAb 2 VL-2", "hDR5 mAb 2 VL-3", "hDR5 mAb 2 VL-4", 및 "hDR5 mAb 2 VL-5"로 지칭되는 4개의 사람화된 VL 도메인, 및 여기서 "hDR5 mAb 2 VH-2"로 지칭되는 하나의 사람화된 VH 도메인을 제공했다. 사람화된 VL 도메인 중 어느 것이라도 사람화된 VH 도메인과 쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 사람화된 VH 도메인과 쌍을 이룬 사람화된 VL 도메인 중 하나를 포함하는 임의의 항체는 일반적으로 "hDR5 mAb 2"라고 언급되고, 참고로 사람화된 VL/VH 도메인의 특정 조합은 VL 도메인이라고 언급된다.

hDR5 mAb 2 VL-2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

hDR5 mAb 2 VL-2는 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:24)에 의해 암호화된다:

hDR5 mAb 2 VL-3의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:25)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

hDR5 mAb 2 VL-3은 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:26)에 의해 암호화된다:

hDR5 mAb 2 VL-4의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:27)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

hDR5 mAb 2 VL-4는 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:28)에 의해 암호화된다:

hDR5 mAb 2 VL-5의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:29)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

hDR5 mAb 2 VL-5는 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:30)에 의해 암호화된다:

hDR5 mAb 2 VL-3, hDR5 mAb 2 VL-4 및 hDR5 mAb VL-5의 VL 도메인의 CDR_L1은 아미노산 서열 RASQDVNTAVA(SEQ ID NO:165)를 가진다.

hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

hDR5 mAb 2 VH-2는 바람직하게 아래 나타낸 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO:32)에 의해 암호화된다:

C. 추가의 항-사람 DR5 항체

신규 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2에 더하여, 다수의 추가의 항-사람 DR5 항체가 본 분야에 알려져 있고, 드로지투맙(여기서 "DR5 mAb 3"으로 지칭됨), 코나투무맙(여기서 "DR5 mAb 4"로 지칭됨), 티가투무맙(여기서 "DR5 mAb 5"로 지칭됨), LBY135-1(여기서 "DR5 mAb 6"으로 지칭됨), LBY135-2(여기서 "DR5 mAb 7"로 지칭됨) 및 KMTR2(여기서 "DR5 mAb 8"로 지칭됨)를 포함한다. 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, hDR5 mAb2, DR5 mAb 3, DR5 mAb 4, DR5 mAb 5, DR5 mAb 6, DR5 mAb 7, 및 DR5 mAb 8 중 하나 이상으로부터의 VL 및/또는 VH 도메인의 CDR을 포함할 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 또는 달리, 또는 선택적으로, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, hDR5 mAb2, DR5 mAb 3, DR5 mAb 4, DR5 mAb 5, DR5 mAb 6, DR5 mAb 7, 및 DR5 mAb 8 중 하나 이상으로부터의 적어도 하나의 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 DR5 mAb 1 및/또는 DR5 mAb 2로부터의 적어도 하나의 항원-결합 부분을 포함한다.

1. 드로지투맙("DR5 mAb 3")

드로지투맙("DR5 mAb 3")의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:54)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 3의 CDR_L1(SEQ ID NO:55): SGDSLRSYYAS

DR5 mAb 3의 CDR_L2(SEQ ID NO:56): GANNRPS

DR5 mAb 3의 CDR_L3(SEQ ID NO:57): NSADSSGNHVV

드로지투맙("DR5 mAb 3")의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:58)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 3의 CDR_H1(SEQ ID NO:59): GFTFDDYAMS

DR5 mAb 3의 CDR_H2(SEQ ID NO:60): INWQGGSTGYADSVKG

DR5 mAb 3의 CDR_H3(SEQ ID NO:61): ILGAGRGWYFDY

2. 코나투무맙("DR5 mAb 4")

코나투무맙("DR5 mAb 4")의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:62)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 4의 CDR_L1(SEQ ID NO:63): RASQGISRSYLA

DR5 mAb 4의 CDR_L2(SEQ ID NO:64): GASSRAT

DR5 mAb 4의 CDR_L3(SEQ ID NO:65): QQFGSSPWT

코나투무맙("DR5 mAb 4")의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:66)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 4의 CDR_H1(SEQ ID NO:67): GGSISSGDYFWS

DR5 mAb 4의 CDR_H2(SEQ ID NO:68): HIHNSGTTYYNPSLKS

DR5 mAb 4의 CDR_H3(SEQ ID NO:69): DRGGDYYYGMDV

3. 티가투무맙("DR5 mAb 5")

티가투무맙("DR5 mAb 5")의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:70)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 5의 CDR_L1(SEQ ID NO:71): KASQDVGTAVA

DR5 mAb 5의 CDR_L2(SEQ ID NO:72): WASTRHT

DR5 mAb 5의 CDR_L3(SEQ ID NO:73): QQYSSYRT

티가투무맙("DR5 mAb 5")의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:74)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 5의 CDR_H1(SEQ ID NO:75): GFTFSSYVMS

DR5 mAb 5의 CDR_H2(SEQ ID NO:76): TISSGGSYTYYPDSVKG

DR5 mAb 5의 CDR_H3(SEQ ID NO:77): RGDSMITTDY

4. LBY135-1("DR5 mAb 6")

LBY135-1("DR5 mAb 6")의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:78)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 6의 CDR_L1(SEQ ID NO:79): QDVNTAIA

DR5 mAb 6의 CDR_L2(SEQ ID NO:80): WASTRHT

DR5 mAb 6의 CDR_L3(SEQ ID NO:81): QQWSSNPLT

LBY135-1("DR5 mAb 6")의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:82)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 6의 CDR_H1(SEQ ID NO:83): GYTFTDYTIH

DR5 mAb 6의 CDR_H2(SEQ ID NO:84): WFYPGGGYIKYNEKFKD

DR5 mAb 6의 CDR_H3(SEQ ID NO:85): HEEGIYFDY

5. LBY135-2("DR5 mAb 7")

LBY135-2("DR5 mAb 7")의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:86)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 7의 CDR_L1(SEQ ID NO:87): KASQDVNTAIA

DR5 mAb 7의 CDR_L2(SEQ ID NO:88): WASTRHT

DR5 mAb 7의 CDR_L3(SEQ ID NO:89): QQHYTTPFT

LBY135-2("DR5 mAb 7")의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:90)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 7의 CDR_H1(SEQ ID NO:91): GYTFTDYTIH

DR5 mAb 7의 CDR_H2(SEQ ID NO:92): WFYPGGGYIKYNEKFKD

DR5 mAb 7의 CDR_H3(SEQ ID NO:93): HEEGIYFDY

6. KMTR2("DR5 mAb 8")

KMTR2("DR5 mAb 8")의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:94)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 8의 CDR_L1(SEQ ID NO:95): RASQSVSSYLA

DR5 mAb 8의 CDR_L2(SEQ ID NO:96): DASNRAT

DR5 mAb 8의 CDR_L3(SEQ ID NO:97): QQRSNWPLT

KMTR2("DR5 mAb 8")의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:98)이 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

DR5 mAb 8의 CDR_H1(SEQ ID NO:99): GYTFTNYKIN

DR5 mAb 8의 CDR_H2(SEQ ID NO:100): WMNPDTDSTGYPQKFQG

DR5 mAb 8의 CDR_H3(SEQ ID NO:101): SYGSGSYYRDYYYGMDV

D. 유전자 조작된 Fc 영역을 가진 다가 DR5-결합 분자

전통적인 면역 기능에서, 면역 시스템의 세포와 항체-항원 복합체의 상호작용은 항체 의존성 세포독성, 비만 세포 탈과립화, 및 포식작용과 같은 이펙터 기능에서부터 림프구 증식 조절 및 항체 분비와 같은 면역조절성 신호에 이르는 범위의 광범한 어레이의 반응을 가져온다. 이들 상호작용은 모두 조혈 세포 상의 특화된 세포 표면 수용체에 항체 또는 면역 복합체의 Fc 영역의 결합을 통해서 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 촉발되는 세포 반응의 다양성은 3개의 Fc 수용체: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)의 구조적 이종성에 따른 결과이다. FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)은 활성화(즉, 면역 시스템 증진) 수용체이고, FcγRIIB(CD32B)는 억제(즉, 면역 시스템 축소) 수용체이다. 예시적인 IgG1 Fc 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)은 상기 제시된다.

Fc 영역의 변형은 통상 변경된 표현형, 예를 들어 변경된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 세포 효소에 대한 변경된 감수성 또는 변경된 이펙터 기능을 가져온다. 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형함으로써, 예를 들어 암의 치료에서 항체의 유효성을 증진시키는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 특정한 경우, 예를 들어 작용 기전이 차단 또는 길항작용(antagonism)을 수반하지만 표적 항원을 지닌 세포를 죽이는 것은 아닌 항체의 경우에 바람직하다. 증가된 이펙터 기능은 일반적으로 FcγRs가 낮은 수준으로 발현되는 종양 및 외래 세포와 같은 바람직하지 않은 세포, 예를 들어 FcγRIIB의 낮은 수준을 가진 종양 특이적 B 세포(예를 들어, 비-호지킨 림프종, CLL 및 버킷 림프종)에 지정되었을 때 바람직하다. 상기 구체예에서, 부여되거나 변경된 이펙터 기능 활성을 가진 본 발명의 분자는 이펙터 기능 활성의 증진된 효능이 바람직한 질환, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

특정 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 야생형 Fc 영역(SEQ ID NO:1)의 아미노산의 서열에 대해 하나 이상의 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 지닌 Fc 영역을 포함하며, 이것은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 Fc 영역 및 그에 따른 본 발명의 분자의 친화성 및 결합활성을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 야생형 Fc 영역의 아미노산에 대해 하나 이상의 변형을 지닌 Fc 영역을 포함하며, 이것은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 Fc 영역 및 그에 따른 본 발명의 분자의 친화성 및 결합활성을 증가시킨다. 다른 구체예에서, 다가 DR5-결합 분자는 변이 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 변이는 Fc 영역을 포함하지 않거나 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해, FcγRIIA에 대한 증가된 결합 및/또는 증가된 ADCC 활성을 부여하거나 매개한다. 다른 구체예에서, 분자는 변이 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 변이는 Fc 영역을 포함하지 않거나 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해, FcγRIIB에 대한 증가된 결합 및/또는 감소된 ADCC 활성(또는 다른 이펙터 기능)을 부여하거나 매개한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 변이 Fc 영역을 포함하는 다가 DR5-결합 분자를 포함하며, 이 변이 Fc 영역은 야생형 Fc 영역을 포함하는 비슷한 분자에 비해, 임의의 FcγR에 대한 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 변이 Fc 영역을 포함하는 다가 DR5-결합 분자를 포함하며, 이 변이 Fc 영역은 단일 FcγR에만, 바람직하게는 FcγRIIA, FcγRIIB, 또는 FcγRIIIA 중 하나에만 결합한다. 또는 달리, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 FcγRs에 대한 감소된 친화성 및/또는 결합활성 및/또는 감소된 ADCC 활성을 생득적으로 나타내는 Fc 영역을 포함한다(야생형 IgG1 Fc 영역에 의해 나타나는 결합에 비해, 이용된다, 예를 들어 IgG2(SEQ ID NO: 154) 또는 IgG4(SEQ ID NO:103)). 친화성 및/또는 결합활성에서 임의의 이러한 변화는 바람직하게 모 분자(변형된 Fc 영역이 없는)의 결합 활성이 세포에서 검출될 수 없을 때 FcγR의 낮은 수준을 발현하는 세포에서 FcγR에 대한 검출가능한 결합 또는 FcγR-관련된 활성의 규모를 시험관내 측정함으로써 평가된다. 다른 구체예에서, 변형된 분자는 30,000 내지 20,000 분자/세포의 밀도, 20,000 내지 10,000 분자/세포의 밀도, 10,000 내지 5,000 분자/세포의 밀도, 5,000 내지 1,000 분자/세포의 밀도, 1,000 내지 200 분자/세포의 밀도 또는 200 분자/세포의 밀도 또는 그 이하(그러나 적어도 10, 50, 100 또는 150 분자/세포)로 비-FcγR 수용체 표적 항원을 발현하는 세포에서 검출가능한 결합을 나타낸다.

본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 활성화 및/또는 억제성 Fcγ 수용체에 대해 변경된 친화성을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 다가 DR5-결합 분자는, 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대한 증가된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 가진 변이 Fc 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는, 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성을 가진 변이 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는, 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 가진 변이 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는, 야생형 Fc 영역을 가진 비슷한 분자에 비해 FcγRIIB에 대한 변하지 않은 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된(또는 증가된) 친화성을 가진 변이 Fc 영역을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 면역글로불린이 증진된 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 갖도록 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대해 변경된 친화성을 가진 변이 Fc 영역을 포함한다. 이펙터 세포 기능의 비제한적 예들은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 포식작용, 포식작용, 옵소닌화, 옵소닌 포식작용, 세포 결합, 로젯화(rosetting), C1q 결합, 및 보체 의존성 세포 매개 세포독성을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 친화성 또는 이펙터 기능의 변경은, 야생형 Fc 영역을 포함하는 비슷한 분자에 비해 적어도 2배, 바람직하게 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 변이 Fc 영역은, 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 적어도 65%, 바람직하게 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 또는 250% 더 큰 친화성으로 하나 이상의 FcRs에 면역특이적으로 결합한다. 이러한 측정은 생체내 또는 시험관내 분석일 수 있고, 바람직한 구체예에서 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 분석과 같은 시험관내 분석이다.

상이한 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 FcγR 수용체의 적어도 하나의 활성을 작동시키거나(agonize), 또는 FcγR 수용체의 적어도 하나의 활성을 길항하는(antagonize) 변이 Fc 영역을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 분자는 FcγRIIB의 하나 이상의 활성, 예를 들어 B 세포 수용체-매개 신호화, B 세포의 활성화, B 세포 증식, 항체 생성, B 세포의 세포내 칼슘 유입, 세포 사이클 진행, FcγRI-신호화의 FcγRIIB-매개 억제, FcγRIIB의 인산화, SHIP 모집, SHIP 인산화 및 Shc와의 회합, 또는 FcγRIIB 신호 변환 경로에서 하나 이상의 하류 분자(예를 들어, MAP 키나아제, JNK, p38, 또는 Akt)의 활성을 길항하는 변이 Fc 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 FcγRI의 하나 이상의 활성, 예를 들어 비만 세포 활성화, 칼슘 가동화, 탈과립화, 사이토카인 생성, 또는 세로토닌 방출을 작동시키는 변이 Fc 영역을 포함한다.

특정 구체예에서, 분자는 2개 이상의 IgG 이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로부터의 영역을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 다양한 IgG 이소타입은, 예를 들어 Flesch and Neppert, (1999), J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel, et al. (1993), J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; 또는 Bruggemann et al. (1987), J. Exp. Med. 166:1351-1361에 설명된 대로, 그것의 힌지 및/또는 Fc 영역의 아미노산 서열에서의 차이로 인하여 혈청 반감기, 보체 고정, FcγR 결합 친화성 및 이펙터 기능 활성(예를 들어, ADCC, CDC 등)을 포함하는 물리적 및 기능적 특성에 차이를 나타낸다. 이 종류의 변이 Fc 영역은 단독으로, 또는 아미노산 변형과 조합하여 사용될 수 있으며, 이로써 Fc-매개 이펙터 기능 및/또는 결합 활성에 영향을 미칠 수 있다. 조합에서, 아미노산 변형 및 IgG 힌지/Fc 영역은 유사한 기능성(예를 들어, FcγRIIA에 대한 증가된 친화성)을 나타낼 수 있고, 야생형 Fc 영역을 포함하는 발명의 분자에 비해 본 발명의 분자에서 이펙터 기능성을 변형하도록 추가로, 또는 더 바람직하게는 상승작용적으로 작용할 수 있다. 다른 구체예에서, 아미노산 변형 및 IgG Fc 영역은 반대 기능성을 나타낼 수 있고(예를 들어, 각각 FcγRIIA에 대한 증가된 및 감소된 친화성), Fc 영역을 포함하지 않거나 또는 동일한 이소타입의 야생형 Fc 영역을 포함하는 발명의 분자에 비해 본 발명의 분자에서 특정 기능성을 선택적으로 경감 또는 감소시키도록 작용할 수 있다.

바람직한 특정 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 변이 Fc 영역을 포함하고, 여기서 상기 변이 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 이로써 상기 분자는 FcR에 대해 변경된 친화성을 갖게 되지만, 단 상기 변이 Fc 영역은 Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73에 의해 개시된 것들과 같은 Fc-FcR 상호작용의 결정학적 및 구조적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접촉하는 위치에는 치환을 갖지 않는다. FcγR과 직접 접촉하는 Fc 영역 내 위치의 예들은 아미노산 잔기 234-239(힌지 영역), 아미노산 잔기 265-269(B/C 루프), 아미노산 잔기 297-299(C'/E 루프), 및 아미노산 잔기 327-332(F/G 루프)이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 분자는 구조적 및 결정학적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접촉하지 않는, 예를 들어 Fc-FcγR 결합 부위 내에 있지 않는 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함한다.

변이 Fc 영역은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 임의의 공지된 Fc 변이체가, 예를 들어 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석에서 기능적으로 분석되었을 때, Fc 영역(또는 그것의 일부)을 포함하는 발명의 분자에 의해 나타난 이펙터 기능을 변형하거나 부여하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 기능을 변경함에 따라 확인된 Fc 영역 변이체가 Antibody Engineering Technology Art에 개시되며, 거기 개시된 임의의 적합한 변이체가 본 분자에서 사용될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 하나 이상의 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 가진 변이 Fc 영역을 포함하며, 이 변형(들)은 억제 FcγR(예컨대 FcγRIIB) 영역에 비해, 활성화 FcγR(예컨대 FcγRIIA 또는 FcγRIIIA)에 대한 변이 Fc 영역의 친화성의 비를 (야생형 Fc 영역에 비해) 변경한다:

Fc 변이체가 1을 초과하는 친화성의 비를 가진 변이 Fc 영역(야생형 Fc 영역에 비해)을 지닌 본 발명의 다가 DR5-결합 분자가 특히 바람직하다. 이러한 분자는 질환, 장애, 또는 감염의 치료적 또는 예방적 치료, 또는 그것의 증상의 완화를 제공하는데 특별히 사용되며, 이 경우 FcγR에 의해 매개된 이펙터 세포 기능(예를 들어, ADCC)의 증진된 효능이 바람직하고, 예를 들어 암 또는 감염성 질환이다. 반대로, 1 미만의 친화성의 비를 가진 Fc 변이체는 이펙터 세포 기능의 감소된 효능을 매개한다. 표 1은 친화성의 비가 1 초과인지 1 미만인지에 따른 예시적인 단일, 이중, 삼중, 4중 및 5중 돌연변이를 열거한다.

친화성의 비에 따라 열거된 예시적인 단일 및 다중 돌연변이

단일	이중	삼중	4중	5중
친화성의 비 > 1
F243L D270E R292G R292P	F243L & R292P F243L & Y300L F243L & P396L D270E & P396L R292P & Y300L R292P & V305I R292P & P396L Y300L & P396L P396L & Q419H	F243L, P247L & N421K F243L, R292P & Y300L F243L, R292P & V305I F243L, R292P & P396L F243L, Y300L & P396L P247L, D270E & N421K R255L, D270E & P396L D270E, G316D & R416G D270E, K392T & P396L D270E, P396L & Q419H V284M, R292L & K370N R292P, Y300L & P396L	L234F, F243L, R292P & Y300L L235I, F243L, R292P & Y300L L235Q, F243L, R292P & Y300L F243L, P247L, D270E & N421K F243L, R255L, D270E & P396L F243L, D270E, G316D & R416G F243L, D270E, K392T & P396L F243L, D270E, P396L & Q419H F243L, R292P, Y300L, & P396L F243L, R292P, V305I & P396L P247L, D270E, Y300L & N421K R255L, D270E, R292G & P396L R255L, D270E, Y300L & P396L D270E, G316D, P396L & R416G	L235V, F243L, R292P, Y300L & P396L L235P, F243L, R292P, Y300L & P396L F243L, R292P, V305I, Y300L & P396L
친화성의 비 < 1
Y300L P396L	F243L & P396L P247L & N421K R255L & P396L R292P & V305I K392T & P396L P396L & Q419H	F243L, R292P & V305I

구체적인 구체예에서, 변이 Fc 영역에서, 위치 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328, 또는 330의 임의의 위치에 임의의 아미노산 변형(예를 들어, 치환), 및 바람직하게 다음의 잔기: A240, I240, L241, L243, H244, N298, I328 또는 V330 중 하나 이상. 상이한 구체적인 구체예에서, 변이 Fc 영역에서, 위치 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439의 임의의 위치에 임의의 아미노산 변형(예를 들어, 치환) 및 바람직하게 다음의 잔기: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 또는 L300 중 하나 이상.

바람직한 구체예에서, 변경된 친화성으로 FcγR에 결합하는 변이 Fc 영역에서, 위치 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439의 임의의 위치에 임의의 아미노산 변형(예를 들어, 치환). 바람직하게, 변이 Fc 영역은 다음의 잔기: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 또는 A430 중 임의의 것을 가진다.

상이한 구체예에서, 감소된 친화성으로 FcγR에 결합하는(그것의 Fc 영역을 통해서) 변이 Fc 영역에서, 위치 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 또는 439의 임의의 위치에 임의의 아미노산 변형(예를 들어, 치환).

상이한 구체예에서, 증진된 친화성으로 FcγR에 결합하는(그것의 Fc 영역을 통해서) 변이 Fc 영역에서, 위치 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, 또는 430의 임의의 위치에 임의의 아미노산 변형(예를 들어, 치환). 상이한 구체예에서, 증진된 친화성으로 FcγRIIA에 결합하는 변이 Fc 영역에서 다음의 잔기: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 또는 A430 중 임의의 것.

바람직한 변이체는 위치 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 또는 332의 임의의 위치에 하나 이상의 변형을 포함한다.

특히 바람직한 변이체는 그룹 A-AI로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:

다른 더욱 특히 바람직한 변이체는 그룹 1-105로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:

한 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 Fc 영역에 적어도 하나의 변형을 가진 변이 Fc 영역을 포함할 것이다. 특정 구체예에서, 변이 Fc 영역은 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하며, 여기서 상기 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 것이다.

구체적인 구체예에서, 변이 Fc 영역은 다음을 포함한다:

A) F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;

(B) (1) F243L 및 P396L;

(2) F243L 및 R292P; 및

(3) R292P 및 V305I

로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;

(C) (1) F243L, R292P 및 Y300L;

(2) F243L, R292P 및 V305I;

(3) F243L, R292P 및 P396L; 및

(4) R292P, V305I 및 P396L

로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;

(D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및

(2) F243L, R292P, V305I 및 P396L

로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는

(E) (1) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L; 및

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L

로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 5개의 치환.

다른 구체적인 구체예에서, 변이 Fc 영역은

(A) F243L, R292P, 및 Y300L;

(B) L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L; 또는

(C) F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L.

의 치환을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 B.J. et al(2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR : Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-490; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166: 2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII , Fc Gamma RIII , And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan , A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164:1925-33; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Armour K.L. et al.(1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29: 2613-2624; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3 -Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-117; Lund, J. et al. (1995) "Oligo -saccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund, et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG" J. Immunol. 147:2657-62; Duncan, A.R., et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; 미국특허 Nos. 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; 7,276,586; 및 7,317,091; 및 PCT 공개 WO 00/42072 및 PCT WO 99/58572에 설명된 것들과 같은, 본 분야에 알려진 임의의 Fc 변이체의 사용을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 분자는 하나 이상의 글리코실화 부위를 더 포함하며, 이로써 하나 이상의 탄수화물 부분에 분자에 공유 부착되게 된다. 바람직하게, 하나 이상의 글리코실화 부위 및/또는 Fc 영역에 하나 이상의 변형을 가진 본 발명의 분자는 미변형 분자와 비교하여 증진된 항체 매개 이펙터 기능, 예를 들어 증진된 ADCC 활성을 가지거나 부여한다. 일부 구체예에서, 본 발명은, 제한은 없지만, 위치 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299, 및 301에 있는 아미노산을 포함하여, Fc 영역의 탄수화물 부분과 상호작용한다고 직간접적으로 알려진 아미노산의 하나 이상의 변형을 포함하는 분자를 더 포함한다. Fc 영역의 탄수화물 부분과 직간접적으로 상호작용하는 아미노산은 본 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 여기 그 전체가 참고로 포함되는 Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44:111-7을 참조한다.

다른 구체예에서, 본 발명은, 바람직하게는 분자의 기능성, 예를 들어 표적 항원 또는 FcγR에 대한 결합 활성의 변경 없이, 분자의 하나 이상의 부위에 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입함으로써 변형된 분자를 포함한다. 글리코실화 부위는 본 발명의 분자의 가변 및/또는 불변 영역에 도입될 수 있다. 여기 사용된 "글리코실화 부위"는 올리고당(즉, 함께 연결된 2개 이상의 단순당을 함유하는 탄수화물)이 특이적으로 공유 부착되는 항체에 있는 임의의 특정한 아미노산 서열을 포함한다. 올리고당 측쇄는 전형적으로 N- 또는 O-결합을 통해서 항체의 백본에 연결된다. N-결합 글리코실화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 올리고당 부분의 부착을 말한다. O-결합 글리코실화는 하이드록시아미노산, 예를 들어 세린, 트레오닌에 올리고당 부분의 부착을 말한다. 본 발명의 분자는 N-결합 및 O-결합 글리코실화 부위를 포함하여 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 본 분야에 알려진 N-결합 또는 O-결합 글리코실화를 위한 임의의 글리코실화 부위가 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라서 유용한 예시적인 N-결합 글리코실화 부위는 아미노산 서열: Asn-X-Thr/Ser이며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있고, Thr/Ser은 트레오닌 또는 세린을 나타낸다. 이러한 부위 또는 부위들은 본 발명이 속하는 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 발명의 분자에 도입될 수 있다(예를 들어, 여기 그 전체가 참고로 포함되는 In vitro Mutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116 참조). 발명의 분자에 글리코실화 부위를 도입하기 위한 예시적인 방법은 원하는 Asn-X-Thr/Ser 서열이 얻어지도록 분자의 아미노산 서열을 변형하거나 돌연변이시키는 것을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명은 글리코실화 부위를 부가하거나 결실시킴으로써 본 발명의 분자의 탄수화물 함량을 변형하는 방법을 포함한다. 항체(및 항체 도메인, 예를 들어 Fc 도메인을 포함하는 분자)의 탄수화물 함량을 변형하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고 본 발명에 포함되며, 예를 들어 미국특허 No. 6,218,149; EP 0 359 096 B1; 미국 출원공개 No. US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 출원공개 No. 2003/0115614; 미국특허 No. 6,218,149; 미국특허 No. 6,472,511을 참조하며, 이들 전부는 그 전체가 참고로 여기 포함된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 분자의 하나 이상의 내인성 탄수화물 부분을 결실시킴으로써 본 발명의 분자의 탄수화물 함량을 변형하는 방법을 포함한다. 구체적인 구체예에서, 본 발명은 297에 인접한 위치를 변형함으로써 항체의 Fc 영역의 글리코실화 부위를 이동시키는 것을 포함한다. 구체적인 구체예에서, 본 발명은 위치 296이 글리코실화되고 위치 297은 되지 않도록 위치 296을 변형하는 것을 포함한다.

Fc 영역에 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입하는 것과 같은 기술에 의해 이펙터 기능이 또한 변형될 수 있으며, 이로써 이 영역에서 사슬간 이황화물 결합 형성이 일어나도록 함으로써 개선된 내제화 역량 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 ADCC를 가질 수 있는 호모다이머 항체의 생성을 가져온다(Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies," J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-22). Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers : Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565에 설명된 헤테로이중기능 가교제를 사용하여 증진된 항종양 활성을 가진 호모다이머 항체가 또한 제조될 수 있다. 또는 달리, 이중 Fc 영역을 가짐으로써 증진된 보체 세포용해 및 ADCC 역량을 가질 수 있는 항체가 유전자 조작될 수 있다(Stevenson, GT. et al.(1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions( bisFabFc ) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge," Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

E. 디아바디를 포함하는 다가 DR5-결합 분자

1. Fc 영역을 결여한 디아바디를 포함하는 다가 DR5-결합 분자

본 발명의 한 구체예는 제1 에피토프("에피토프 1") 및 제2 에피토프("에피토프 2")에 결합할 수 있는 이중특이적 디아바디로 구성되거나 그것을 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이며, 여기서 제1 에피토프는 사람 DR5의 에피토프이고, 제2 에피토프는 DR5의 상이한 에피토프이다. 바람직하게, 이러한 디아바디는, 폴리펩티드 사슬이 서로 공유 결합하여 제1 DR5 에피토프와 제2 DR5 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 공유 회합된 복합체를 형성하도록 하는 서열을 가진, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 및 가장 바람직하게는 이들 사슬로 이루어진다. 따라서, 이러한 디아바디는 단일 DR5 폴리펩티드 상의 제1 및 제2 에피토프를 결합시킬 수 있거나(즉, 분자내 결합), 또는 이들은 하나의 DR5 폴리펩티드 상의 제1 에피토프와 다른 DR5 폴리펩티드 상의 제2 에피토프를 결합시킬 수 있다(즉, 분자간 결합). 바람직하게, 이러한 디아바디는 세포의 표면에 배열된 DR5 분자들을 가교결합시킨다.

한 구체예에서, 이러한 이중특이적 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 N-말단, 제1 또는 제2 에피토프에 결합할 수 있는 제1 모노클로날 항체의 VL 도메인(즉, VL_에피토프 ₁ 또는 VL_에피토프 ₂), 제1 개재 스페이서 펩티드(링커 1), 제2 에피토프(이러한 제1 폴리펩티드 사슬이 VL_에피토프 ₁을 함유하는 경우) 또는 제1 에피토프(이러한 제1 폴리펩티드 사슬이 VL_{에피토프 2}를 함유하는 경우)에 결합할 수 있는 제2 모노클로날 항체의 VH 도메인, 시스테인 잔기를 선택적으로 함유하는 제2 개재 스페이서 펩티드(링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단(도 1)을 포함한다. "VL1" 및 "VH1"의 표기는 각각 제1 모노클로날 항체의 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다. 유사하게, "VL2" 및 "VH2"의 표기는 각각 제2 항체의 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다.

이중특이적 디아바디의 이 구체예의 제2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 N-말단, 제1 또는 제2 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 VL 도메인(즉, VL_에피토프 ₁ 또는 VL_에피토프 ₂, VL 도메인은 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬에 포함시키기 위해 선택되지 않은 것임), 개재 링커 펩티드(링커 1), 제2 에피토프(이러한 제2 폴리펩티드 사슬이 VL_에피토프 ₁을 함유하는 경우) 또는 제1 에피토프(이러한 제2 폴리펩티드 사슬이 VL_에피토프 ₂를 함유하는 경우)에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 VH 도메인, 시스테인 잔기를 선택적으로 함유하는 스페이서 펩티드(링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단(도 1)을 포함한다.

제1 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 제2 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 DR5에 특이적인 제1 기능적 항원-결합 부위를 형성한다(즉, 제1 또는 제2 에피토프). 마찬가지로, 제2 폴리펩티드 사슬의 VL 도메인은 제1 폴리펩티드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 DR5에 또한 특이적인 제2 기능적 항원-결합 부위를 형성한다(즉, 제2 에피토프 또는 제1 에피토프). 따라서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인의 선택은 조화되며, 이로써 디아바디의 두 폴리펩티드 사슬은 종합적으로 DR5의 제1 에피토프와 DR5의 제2 에피토프에 모두 결합할 수 있는 VL 및 VH 도메인을 포함한다(즉, 이들은 VL_{에피토프 1}/VL_에피토프 ₁ 및 VL_에피토프 ₂/VH_에피토 _{프 2}를 포함한다).

가장 바람직하게, 개재 링커 펩티드(링커 1, 이것은 이러한 VL 및 VH 도메인을 분리한다)의 길이는 폴리펩티드 사슬이 서로 결합되는 것을 실질적으로 또는 완전히 방지하도록 선택된다. 따라서, 제1 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 실질적으로 또는 완전히 서로 결합될 수 없다. 마찬가지로, 제2 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 실질적으로 또는 완전히 서로 결합될 수 없다. 바람직한 개재 스페이서 펩티드(링커 1)는 서열(SEQ ID NO:33): GGGSGGGG를 가진다.

제2 개재 스페이서 펩티드(링커 2)는 선택적으로 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인을 함유할 것이다. 바람직한 시스테인-함유 스페이서 펩티드(링커 2)는 서열 SEQ ID NO:34: GGCGGG를 가진다. 또는 달리, 링커 2는 시스테인을 포함하지 않고, 아래 설명된 대로 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 사용된다. 선택적으로, 시스테인-함유 링커 2와 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 둘 다 사용된다.

헤테로다이머-촉진 도메인은 하나의 폴리펩티드 사슬 상의 GVEPKSC(SEQ ID NO:35) VEPKSC(SEQ ID NO:36) 또는 AEPKSC(SEQ ID NO:169), 및 나머지 하나의 폴리펩티드 사슬 상의 GFNRGEC(SEQ ID NO:37) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:38)일 수 있다(US 2007/0004909).

그러나, 더 바람직하게, 이러한 디아바디의 헤테로-촉진 도메인은 적어도 6, 적어도 7 또는 적어도 8개의 하전된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 반대 전하의 1, 2, 3 또는 4개의 텐덤 반복 코일 도메인으로부터 형성된다(Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacro-molecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv ( hsFv ) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain," J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) "Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Hetero -dimeric Coiled Coils," Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) "Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions," Analytical Biochemistry 399:138-40; Cachia, P.J. et al.(2004) "Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy," J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) "Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding," Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al.(2012) "Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag," Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al(2009) "End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures," Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) "Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions," Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) "Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity" J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) "The d'--d--d′' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'--a--a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif," J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface," J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) "Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance" J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies" Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand - Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism," J. Gene Med. 10:355-367).

이러한 반복된 코일 도메인은 정확한 반복부일 수 있거나, 또는 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 8개의 음으로 하전된 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수 있고, 제2 폴리펩티드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 8개의 음으로 하전된 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬에 제공되는 코일은 중요하지 않지만, 단 나머지 폴리펩티드 사슬에는 반대 전하의 코일이 사용된다. 양으로 하전된 아미노산은 리신, 알기닌, 히스티딘 등일 수 있고, 및/또는 음으로 하전된 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 등일 수 있다. 양으로 하전된 아미노산은 바람직하게 리신이고 및/또는 음으로 하전된 아미노산은 바람직하게 글루탐산이다. 단지 하나의 헤테로다이머-촉진 도메인이 이용되는 것이 가능하지만(이러한 도메인은 호모다이머화를 억제함으로써 헤테로다이머화를 촉진할 것이므로), 본 발명의 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬이 둘 다 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 것이 바람직하다.

바람직한 구체예에서, 헤테로다이머-촉진 도메인 중 하나는 글루타메이트 잔기가 pH 7에서 음전하를 형성하는 4개의 텐덤 "E-코일" 나선 도메인을 포함할 것이고(SEQ ID NO:39: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K), 헤테로다이머-촉진 도메인의 나머지 하나는 리신 잔기가 pH 7에서 양전하를 형성하는 4개의 텐덤 "K-코일" 도메인(SEQ ID NO:40: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)을 포함할 것이다. 이러한 하전된 도메인의 존재는 제1 및 제2 폴리펩티드의 회합을 촉진하고, 이로써 헤테로다이머 형성을 조장한다. SEQ ID NO:39의 4개 텐덤 "E-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형된 헤테로다이머-촉진 도메인: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:41)이 특히 바람직하다. 마찬가지로, SEQ ID NO:40의 4개 텐덤 "K-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형된 헤테로다이머-촉진 도메인: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:42)이 특히 바람직하다.

WO 2012/018687에 개시된 대로, 디아바디의 생체내 약동학적 특성을 개선하기 위해, 디아바디는 디아바디의 말단 중 하나 이상에서 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 가장 바람직하게, 혈청-결합 단백질의 이러한 폴리펩티드 부분은 디아바디의 C-말단에 설치될 것이다. 알부민은 혈장에 가장 풍부한 단백질이며, 사람에서 19일의 반감기를 가진다. 알부민은 그것이 다른 단백질에 비공유 결합함으로써 그것의 혈청 반감기를 연장하도록 하는 몇 개의 작은 분자 결합 부위를 지닌다. 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 균주 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3(ABD3)은 안정한 3-나선 번들을 형성하는 46개 아미노산 잔기로 구성되고, 넓은 알부민-결합 특이성을 가진다(Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). 따라서, 디아바디의 생체내 약동학적 특성을 개선하기 위한 혈청-결합 단백질의 특히 바람직한 폴리펩티드 부분은 스트렙토코쿠스의 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인(ABD)이며, 더 바람직하게는 스트렙토코쿠스 균주 G148의 단백질 G의 알부민 결합 도메인 3(ABD3)(SEQ ID NO:43): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP이다.

WO 2012/162068(여기 참고로 포함됨)에 개시된 대로, SEQ ID NO:43의 "탈면역화된" 변이체는 MHC 부류 II 결합을 약화시키거나 제거하는 능력을 가진다. 조합 돌연변이 결과에 기초하여, 다음의 치환 조합이 이러한 탈면역화된 알부민-결합 도메인을 형성하기 위한 바람직한 치환인 것으로 고려된다: 66S/70S+71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A /65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. 변형 L64A, I65A 및 D79A, 또는 변형 N66S, T70S 및 D79A를 가진 변이체 ABD. 아미노산 서열:

또는 아미노산 서열:

을 가진 변이체 탈면역화된 ABD가 특히 바람직하며, 이러한 탈면역화된 알부민-결합 도메인은 약화된 MHC 부류 II 결합을 제공하면서 실질적으로 야생형 결합을 나타낸다. 따라서, 알부민-결합 도메인을 가진 이러한 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬은 바람직하게 이러한 폴리펩티드 사슬의 E-코일(또는 K-코일) 쪽으로 C-말단 위치된 제3 링커(링커 3)를 함유하며, 이로써 E-코일(또는 K-코일) 도메인과 알부민-결합 도메인(이것은 바람직하게 탈면역화된 알부민-결합 도메인이다) 사이에 개재될 수 있다. 이러한 링커 3을 위한 바람직한 서열은 SEQ ID NO:46: GGGS이다.

본 발명의 다른 구체예는 DR5의 하나의 에피토프에 결합할 수 있는 단일특이적 디아바디로 구성되거나 그것을 포함하는 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 바람직하게, 이러한 디아바디는, 폴리펩티드 사슬이 서로 공유 결합하여, 각각 동일한 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 결합 도메인을 가진 공유 회합된 복합체를 형성하도록 하는 서열을 가진, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고, 및 가장 바람직하게는 이들 사슬로 이루어진다. 바람직하게, 이러한 디아바디는 두 별개의 DR5 폴리펩티드 상의 동일한 DR5 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 바람직하게, 이러한 디아바디는 세포의 표면에서 DR5를 가교결합시킨다.

단일특이적 디아바디는 N-말단에서 C-말단 방향으로 N-말단, DR5의 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 VL 도메인, 제1 개재 스페이서 펩티드(링커 1), DR5의 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 호모다이머화로부터 쉽게 생성될 수 있다. 상기 상세히 설명된 대로, 개재 링커 펩티드(링커 1, 이것은 이러한 VL 및 VH 도메인을 분리한다)의 길이는 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인이 서로 결합하는 것을 실질적으로 또는 완전히 방지하도록 선택된다. 폴리펩티드 사슬은 선택적으로 폴리펩티드의 쌍 사이에 공유 이황화물 결합을 형성할 수 있는 시스테인-함유 펩티드를 포함할 수 있다.

또는 달리, 예를 들어 제1 모노클로날 항체와 제2 모노클로날 항체가 동일한 에피토프를 인식하거나, 또는 동일한 VL 및 VH 도메인이 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬에 사용된다면, 단일특이적 2가 디아바디가 상기 상세히 설명된 대로 제1 및 제2 폴리펩티드의 헤테로다이머화에 의해 쉽게 생성될 수 있다.

2. Fc 영역-함유, 다가 DR5-결합 분자

본 발명의 한 구체예는 Fc 영역-함유, 다가 DR5-결합 분자에 관한 것이다. 디아바디 사슬들의 복합체화가 Fc 영역의 형성을 가져오도록 하는, 디아바디 폴리펩티드 사슬 중 하나 또는 둘 다에 IgG CH2-CH3 도메인의 부가는 디아바디의 생물학적 반감기를 증가시키고 및/또는 원자가를 변경한다.

디아바디 폴리펩티드의 모두에 IgG CH2-CH3 도메인을 통합시키는 것은 2-사슬 Fc 영역-함유 디아바디가 형성되는 것을 허용할 것이다(도 2). 상기 주지된 대로, 이러한 디아바디는 VL 및 VH 도메인의 선택에 따라 DR5 에피토프에 대해서 이중특이적 또는 단일특이적일 것이고, DR5 항원에 대해서는 2가일 것이다.

또는 달리, 디아바디 폴리펩티드의 단지 하나에 IgG CH2-CH3 도메인을 통합시키는 것은 4-사슬 Fc 영역-함유 디아바디가 형성되는 것을 허용할 것이다(도 3 및 도 4). 각 디아바디 부분이 상이한 DR5 에피토프에 대해 이중특이적이고 1가인 경우, 결과의 4-사슬 분자는 두 상이한 DR5 에피토프의 각각에 대해서 이중특이적이며 2가일 것이고, DR5 항원에 대해서는 4가일 것이다(도 4). 또는 달리, 두 상이한 이중특이적 1가 디아바디가 조합된다면, 결과의 4-사슬 분자는 4개의 상이한 DR5 에피토프에 대해서 4중특이적이며 1가일 것이고, DR5 항원에 대해서는 4가일 것이다(도 3). 각 디아바디 부분이 하나의 DR5 에피토프에 대해 단일특이적이고 2가인 경우, 결과의 4-사슬 분자는 하나의 DR5 에피토프 및 DR5 항원에 대해서 단일특이적이며 4가일 것이다. 도 3은 불변 경쇄(CL) 도메인과 불변 중쇄-1(CH1) 도메인을 지닌 디아바디를 도시하지만, 이러한 도메인의 단편뿐만 아니라 다른 폴리펩티드들도 도 4에 도식적으로 도시된 대로 헤테로다이머-촉진 도메인으로 이용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허공개 No. 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허공개 No. EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 No. WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 따라서, 예를 들어, CH1 도메인 대신에 사람 IgG의 힌지 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열 GVEPKSC (SEQ ID NO:35) 또는 VEPKSC(SEQ ID NO:36)를 가진 펩티드를 이용할 수 있고, CL 도메인 대신에 사람 카파 경쇄의 C-말단 6개 아미노산, GFNRGEC(SEQ ID NO:37) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:38)를 이용할 수 있다. 4-사슬 디아바디를 함유하는 대표적인 펩티드가 도 4a에 도시된다. 또는 달리, 또는 추가하여, "E-코일" 나선 도메인(SEQ ID NO:39: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K 또는 SEQ ID NO:41: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K); 및 "K-코일" 도메인(SEQ ID NO:40: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E 또는 SEQ ID NO:42: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)과 같은 반대 전하의 텐덤 코일 도메인을 포함하는 펩티드를 이용할 수 있다. 4-사슬 디아바디를 함유하는 대표적인 코일 도메인은 도 4b에 도시된다.

본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디 분자에 이용될 수 있는 추가의 또는 대용 링커는 ASTKG(SEQ ID NO:47), DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:48), LEPKSS(SEQ ID NO:49) 및 APSSSPME(SEQ ID NO:50), GGC, 및 GGG를 포함한다. SEQ ID NO:49는 클로닝의 용이성을 위하여 GGG 또는 GGC 대신에 사용될 수 있다. 추가로, SEQ ID NO:49의 바로 뒤에 SEQ ID NO:47이 이어짐으로써 다른 링커(LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51)를 형성할 수 있다.

도 3, 및 도 4a-4b에 제공된 대로, 본 발명의 디아바디는 4개의 상이한 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 디아바디의 제1 및 제3 폴리펩티드 사슬은 3개 도메인: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인 및 (iv) 도메인 CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제2 및 제4 폴리펩티드 사슬은 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하고, 여기서 헤테로다이머-촉진 도메인은 제1/제3 사슬과 제2/제4 사슬의 다이머화를 촉진한다. 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인, 및 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인은 동일하거나 상이할 수 있으며, 이로써 단일특이적, 이중특이적 또는 4중특이적인 4가 결합을 허용할 수 있다. 본 발명의 대표적인 4-사슬 Fc 영역-함유 디아바디의 폴리펩티드 사슬의 일반적인 구조가 표 2에 제공된다:

이중특이적	2^nd 사슬	NH₂-VL2-VH1-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
	1^st 사슬	NH₂-VL1-VH2-헤테로다이머-촉진 도메인-CH2-CH3-COOH
	1^st 사슬	NH₂-VL1-VH2-헤테로다이머-촉진 도메인-CH2-CH3-COOH
	2^nd 사슬	NH₂-VL2-VH1-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
4중특이적	2^nd 사슬	NH₂-VL2-VH1-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
	1^st 사슬	NH₂-VL1-VH2-헤테로다이머-촉진 도메인-CH2-CH3-COOH
	3^rd 사슬	NH₂-VL3-VH4-헤테로다이머-촉진 도메인-CH2-CH3-COOH
	4^th 사슬	NH₂-VL4-VH3-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH

DR5에 대해 4가인(즉, 각각 사람 DR5와 결합할 수 있는 4개의 항원-결합 도메인을 가진) 본 발명의 대표적인 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬의 구조가 표 3에 제공된다. 각 Fc 영역-함유 디아바디는 공유 결합된 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 두 쌍을 포함하며, 이로써:

(a) 상기 제1 폴리펩티드 사슬의 VL1 도메인과 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 VH1 도메인은 DR5의 제1 에피토프에 특이적 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 형성하고;

(b) 상기 제1 폴리펩티드 사슬의 상기 VH2 도메인과 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 상기 VL1 도메인은 DR5의 제2 에피토프에 특이적 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 형성하고; 및

(c) 제1 폴리펩티드 사슬의 쌍의 CH2-CH3 부분은 IgG Fc 영역을 형성한다.

여기 설명된 대로, Fc 영역(즉, IgG 중쇄의 CH2-CH3 도메인)은 FcγR에 대해 변경된 친화성 및/또는 변경된 이펙터 기능 및/또는 변경된 혈청 반감기를 가진 변이 Fc 영역일 수 있다. 일부 구체예에서, Fc 영역은 C-말단 잔기를 결여한 변이체이다.

E/K 코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 디아바디 DR5 결합 분자
1^st 폴리펩티드 사슬	NH₂―[VL1 도메인]―[링커 1]―[VH2 도메인]―[링커 2] ―[헤테로다이머-촉진 도메인]―[링커 3]―[CH2-CH3 도메인]―COOH 여기서: [VL1 도메인]은 제1 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VL 도메인을 포함하고; [링커 1]은 SEQ ID NO:3이고; [VH2 도메인]은 제2 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VH 도메인을 포함하고; [링커 2]는 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 ASTKG(SEQ ID NO:47) 및 GGCGGG(SEQ ID NO:34)로부터 선택되고; [헤테로다이머-촉진 도메인]은 E-코일 도메인(SEQ ID NO:39 또는 41), 또는 K-코일 도메인(SEQ ID NO:40 또는 42)이고; [링커 3]은 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:48), LEPKSS(SEQ ID NO:49), APSSSPME(SEQ ID NO:50) 및 LEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:51)로부터 선택되고; [CH2-CH3 도메인]은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, EU 넘버링에 따라서 잔기 231로부터 시작하는 IgG의 CH2-CH3 도메인을 포함한다.
2^nd 폴리펩티드 사슬	NH₂―[VL1 도메인]―[링커 1]―[VH2 도메인]―[링커 2] ―[헤테로다이머-촉진 도메인]―COOH 여기서: [VL1 도메인]은 제1 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VL 도메인을 포함하고; [링커 1]은 SEQ ID NO:33이고; [VH2 도메인]은 제2 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VH 도메인을 포함하고; [링커 2]는 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 ASTKG(SEQ ID NO:47) 및 GGCGGG(SEQ ID NO:34)로부터 선택되고; [헤테로다이머-촉진 도메인]은 E-코일 도메인(SEQ ID NO:39 또는 41), 또는 K-코일 도메인(SEQ ID NO:40 또는 42)이며, 여기서 제1 폴리펩티드 사슬의 [헤테로다이머-촉진 도메인]과 제2 폴리펩티드 사슬의 [헤테로다이머-촉진 도메인]은 둘 다 E-코일 도메인이거나 둘 다 K-코일 도메인이 아니다.
펩티드 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 디아바디 DR5 결합 분자
1^st 폴리펩티드 사슬	NH₂―[VL1 도메인]―[링커 1]―[VH2 도메인]―[링커 2] ―[헤테로다이머-촉진 도메인]―[링커 3]―[CH2-CH3 도메인]―COOH 여기서: [VL1 도메인]은 제1 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VL 도메인을 포함하고; [링커 1]은 SEQ ID NO:33이고; [VH2 도메인]은 제2 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VH 도메인을 포함하고; [링커 2]는 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 ASTKG(SEQ ID NO:47) 및 GGCGGG(SEQ ID NO:34)로부터 선택되고; [헤테로다이머-촉진 도메인]은 (i) GVEPKSC(SEQ ID NO:35) 또는 VEPKSC(SEQ ID NO:36); 또는 (ii) GFNRGEC(SEQ ID NO:37) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:38)이고; [링커 3]은 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:48), LEPKSS(SEQ ID NO:49), APSSSPME(SEQ ID NO:50) 및 LEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:51)로부터 선택되고; [CH2-CH3 도메인]은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, EU 넘버링에 따라서 잔기 231로부터 시작하는 IgG의 CH2-CH3 도메인을 포함한다.
2^nd 폴리펩티드 사슬	NH₂―[VL1 도메인]―[링커 1]―[VH2 도메인]―[링커 2] ―[헤테로다이머-촉진 도메인]―COOH 여기서: [VL1 도메인]은 제1 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VL 도메인을 포함하고; [링커 1]은 SEQ ID NO:33이고; [VH2 도메인]은 제2 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VH 도메인을 포함하고; [링커 2]는 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 ASTKG(SEQ ID NO:47) 및 GGCGGG(SEQ ID NO:34)로부터 선택되고; [헤테로다이머-촉진 도메인]은 (i) GVEPKSC(SEQ ID NO:35) 또는 VEPKSC(SEQ ID NO:36); 또는 (ii) GFNRGEC(SEQ ID NO:37) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:38)이며, 여기서 제1 폴리펩티드 사슬의 [헤테로다이머-촉진 도메인]과 제2 폴리펩티드 사슬의 [헤테로다이머-촉진 도메인]은 둘 다 (i) 또는 (ii)로부터 선택되지 않는다.
IgG 불변 도메인을 포함하는 디아바디 DR5 결합 분자
1^st 폴리펩티드 사슬	NH₂―[VL1 도메인]―[링커 1]―[VH2 도메인]―[링커 2] ―[CH1-H-CH2-CH3 도메인]―COOH 여기서: [VL1 도메인]은 제1 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VL 도메인을 포함하고; [링커 1]은 SEQ ID NO:33이고; [VH2 도메인]은 제2 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VH 도메인을 포함하고; [링커 2]는 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 ASTKG(SEQ ID NO:47) 및 GGCGGG(SEQ ID NO:34)로부터 선택되고; [CH1-H-CH2-CH3 도메인]은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, IgG 중쇄의 불변 도메인(CH1 내지 CH3)을 포함한다.
2^nd 폴리펩티드 사슬	NH₂―[VL1 도메인]―[링커 1]―[VH2 도메인]―[링커 2] ―[CL 도메인]―COOH 여기서: [VL1 도메인]은 제1 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VL 도메인을 포함하고; [링커 1]은 SEQ ID NO:33이고; [VH2 도메인]은 제2 DR5 에피토프에 결합하는 항-DR5 항체로부터의 VH 도메인을 포함하고; [링커 2]는 아미노산 "GGG," 또는 "GGC"를 포함하거나, 또는 ASTKG(SEQ ID NO:47) 및 GGCGGG(SEQ ID NO:34)로부터 선택되고; [CL 도메인]은 IgG 경쇄의 CL 도메인을 포함한다.

본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디의 Fc 영역은 완전한 Fc 영역(예를 들어, 완전한 IgG Fc 영역)일 수 있거나, 또는 완전한 Fc 영역의 단지 단편일 수 있다. 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디의 Fc 영역은 하나 이상의 Fc 수용체(예를 들어, FcγR(s))와 결합하는 능력을 지닐 수 있지만, 더 바람직하게 이러한 Fc 영역은 FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대한 변경된 결합을 야기하거나(야생형 Fc 영역에 의해 나타나는 결합에 비해), 또는 이러한 Fc 영역이 억제성 수용체(들)에 결합하는 능력을 실질적으로 제거할 것이다. 따라서, 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디의 Fc 영역은 완전한 Fc 영역의 CH2 도메인의 일부 또는 전부 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있거나, 또는 변이 CH2 및/또는 변이 CH3 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 완전한 Fc 영역의 CH2 또는 CH3 도메인에 대해서 하나 이상의 삽입 및/또는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다). 이러한 Fc 영역은 비-Fc 폴리펩티드 부분을 포함할 수 있거나, 또는 CH2 및/또는 CH3 도메인의 비-자연 발생 배향을 포함할 수 있다(예컨대, 예를 들어 2개의 CH2 도메인 또는 2개의 CH3 도메인, 또는 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인에 연결된 CH3 도메인 등).

특히, 본 발명의 Fc-영역 함유 디아바디의 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대한 감소된(실질적으로 없는) 결합을 나타내는 것이 바람직하다(야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1)에 의해 나타나는 결합에 비해). 이러한 변경된 결합을 매개할 수 있는 Fc 변이체 및 돌연변이 형태는 상기 설명된다. 구체적인 구체예에서, 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디의 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 ADCC 이펙터 기능을 거의 또는 전혀 매개하지 않는 IgG Fc 영역을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 디아바디의 제1 및/또는 제3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 치환: L234A, L235A, D265A, N297Q, 및 N297G 중 임의의 1, 2 또는 3개를 포함한다. 다른 구체예에서, 사람 IgG1 Fc 영역 변이체는 N297Q 치환, N297G 치환, L234A 및 L235A 치환 또는 D265A 치환을 함유하며, 이들 돌연변이는 FcR 결합을 못하게 한다.

L234A/L235A 치환을 포함하는 예시적인 사람 IgG1의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:102)이다:

또는 달리, FcγRIIIA(CD16a)에 대한 감소된(또는 실질적으로 없는) 결합 및/또는 감소된 이펙터 기능(야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1)에 의해 나타나는 결합에 비해)을 생득적으로 나타내는 CH2-CH3 도메인이 이용된다. 구체적인 구체예에서, 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디는, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, IgG2 Fc 영역(SEQ ID NO:164) 또는 IgG4 Fc 영역(SEQ ID NO:103)을 포함한다. IgG4 Fc 영역이 이용되는 경우, 본 발명은 또한 가닥 교환의 발생을 감소시키기 위해 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 의한 넘버링에 따라 S228P와 같은 안정화 돌연변이의 도입을 포함한다(Lu et al. (2008) "The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation," J Pharmaceutical Sciences 97:960-969). 본 분야에 알려진 다른 안정화 돌연변이는 IgG4 Fc 영역에 도입될 수 있다(Peters P et al. (2012) "Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability" J. Biol. Chem. 287:24525-24533; PCT 출원공개 No: WO 2008/145142). N297G, N297Q, L234A, L235A 및 D265A 치환은 이펙터 기능을 못하게 하므로 이펙터 기능이 바람직한 환경에서는 이들 치환이 이용되지 않는 것이 바람직하다. 상기 설명된 대로, 일부 구체예에서, Fc 영역은 C-말단 아미노산 잔기를 결여한다.

이러한 폴리펩티드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일할 필요는 없고, 유익하게는 두 폴리펩티드 사슬 간의 복합체화를 조장하도록 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환(바람직하게 "노브(knob)"를 형성하는 벌크한 측쇄기, 예를 들어 트립토판을 포함하는 아미노산으로의 치환)이 CH2 또는 CH3 도메인에 도입될 수 있으며, 이로써 입체 장해는 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지할 것이고, 돌연변이된 도메인이 상보적인, 또는 수용하는 돌연변이가 유전자 조작된 도메인, 즉 "홀(hole)"(예를 들어, 글리신으로의 치환)과 쌍을 이루도록 강제할 것이다. 이러한 세트의 돌연변이는 Fc 영역을 형성하는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드들의 임의의 쌍에 조작될 수 있다. 호모다이머화에 비해 헤테로다이머화를 선호하도록 단백질을 조작하는 방법은, 특히 면역글로불린-유사 분자의 유전자 조작에 대해서 본 분야에 잘 알려져 있고 여기 포함된다(예를 들어, Ridgway et al., (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization ," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al.(1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library" J. Mol. Biol. 270: 26-35, 및 Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization , Expression And Tumor Cell Lysis ," J. Immunol. Methods 296:95-101 참조; 이들은 각각 그 전체가 여기 참고로 포함된다). 바람직하게, "노브"는 하나의 제1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인에 조작되고, "홀"은 제3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인에 조작된다. 따라서, "노브"는 제1 폴리펩티드 사슬이 그것의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 통해서 호모다이머화하는 것을 방지하는데 도움을 줄 것이다. 제3 폴리펩티드 사슬은 바람직하게 "홀" 치환을 함유하므로, 그것은 "노브"를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬과 헤테로다이머화할 뿐만 아니라 스스로는 호모다이머화할 것이다.

바람직한 노브는 변형 T366W를 함유하도록 자생 IgG Fc 영역을 변형함으로써 생성된다. 바람직한 홀은 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 자생 IgG Fc 영역을 변형함으로써 생성된다. 최종 헤테로다이머 Fc 영역-함유 디아바디로부터 호모다이머를 정제하는데 도움을 주기 위하여 하나의 사슬의 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게 "홀" 치환을 함유하는 제3 폴리펩티드 상의 위치 435(H435R)에서의 아미노산 치환에 의해 돌연변이된다. 따라서, "홀" 치환을 함유하는 제3 폴리펩티드 사슬의 호모다이머는 단백질 A와 결합하지 않는 반면, 헤테로다이머는 제1 폴리펩티드 사슬 상의 단백질 A 결합 부위를 통해서 단백질 A와 결합하는 능력을 보유할 것이다.

본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인의 바람직한 서열은 "노브-보유" 서열(SEQ ID NO:52)을 가질 것이다:

2개의 폴리펩티드 사슬을 가진 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬(또는 3개의 폴리펩티드 사슬을 가진 Fc 영역-함유 디아바디의 제3 폴리펩티드 사슬)의 CH2 및 CH3 도메인의 바람직한 서열은 "홀-보유" 서열(SEQ ID NO:53)을 가질 것이다:

주지된 대로, SEQ ID NO:52 및 SEQ ID NO:53의 CH2-CH3 도메인은 위치 234에서 알라닌으로의 치환 및 위치 235에서 알라닌으로의 치환을 포함하며, 이로써 FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대한 감소된(또는 실질적으로 없는) 결합을 나타내는 Fc 영역을 형성한다(야생형 Fc 영역(SEQ ID NO:1에 의해 나타나는 결합에 비해). C-말단 잔기가 선택적으로 포함된다.

제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:52의 것과 같은, "노브-보유" CH2-CH3 서열을 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 인정되는 대로, "홀-보유" CH2-CH3 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:53)이 제1 폴리펩티드 사슬에 이용될 수 있으며, 이 경우 "노브-보유" CH2-CH3 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:52)은 2개의 폴리펩티드 사슬을 가진 본 발명의 Fc 영역-함유 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬(또는 3개 또는 4개의 폴리펩티드 사슬을 가진 Fc 영역-함유 디아바디의 제3 폴리펩티드 사슬)에 이용될 것이다. SEQ ID NO: 52 및/또는 SEQ ID NO:53의 C-말단 잔기는 선택적으로 포함된다.

V. 기준 항체

A. 기준 항-사람 CD3 항체

CD3는 4개의 분리된 사슬로 이루어진 T 세포 공-수용체이다((Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14). 포유류에서 이 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 및 2개의 CD3ε 사슬을 함유한다. 이들 사슬은 T 세포 수용체(TCR)로 알려진 분자와 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. CD3의 부재하에 TCR은 적절히 조립되지 않고 변성된다(Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer" Immunology 129(2):170-177). CD3는 모든 성숙한 T 세포의 막에 결합하고, 실제로 다른 세포 타입에서는 그렇지 않은 것으로 판명되었다(Janeway, C.A. et al.(2005) In: Immunobiology: "The Immune System In Health And Disease," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An EctoDomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR /CD3 Complex," Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139 참조).

아래 논의된 대로, 본 발명을 예시하기 위해, 이중특이적 항-사람 CD3 x 항-사람 DR5-결합 분자가 생성되었다. 이러한 구성물에 사용된 항-사람 CD3 항체는 여기서 "CD3 mAb 2"로 지칭된다. CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:104)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

CD3 mAb 2의 CDR_L1(SEQ ID NO:105): RSSTGAVTTSNYAN

CD3 mAb 2의 CDR_L2(SEQ ID NO:106): GTNKRAP

CD3 mAb 2의 CDR_L3(SEQ ID NO:107): ALWYSNLWV

CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:108)이 아래 제시된다 (CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

CD3 mAb 2의 CDR_H1(SEQ ID NO:109): TYAMN

CD3 mAb 2의 CDR_H2(SEQ ID NO:110): RIRSKYNNYATYYADSVKD

CD3 mAb 2의 CDR_H3(SEQ ID NO:111): HGNFGNSYVSWFAY

CD3 구성물의 일부에서는 변이 VH 도메인이 CD3 mAb 2에 이용되었다. 변이 VH 도메인은 D65G 치환을 지니며, 따라서 아래 제시된 아미노산 서열(SEQ ID NO: 112)을 가진다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

이 치환은 CDR_H2가 아미노산 서열(SEQ ID NO:113) RIRSKYNNYATYYADSVKG를 갖도록 한다. 치환된 위치(D65G)는 이중 밑줄로 표시된다.

여기 사용된 제2 항-CD3 항체는 항체 뮤로모납-CD3 "OKT3"이다(Xu et al. (2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26); Norman D.J.(1995) "Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3," Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) "Monoclonal Antilymphocyte Antibody ( OKT3 ) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection," Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen, L.J. et al(1993) "OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin -6 And Interleukin -10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Trans-plantation," Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678). OKT3의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:166)이 아래 제시된다(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

OKT3의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:167)은 아래 제시된다(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

B. 기준 항-플루오레세인 항체

항-플루오레세인 항체 4-4-20(Gruber, M. et al. (1994) "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli," J. Immunol. 152(11):5368-5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti- Fluorescein Idiotype Family," J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569)가 대조군 디아바디에 사용되었다. 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다:

항-플루오레세인 항체 4-4-20의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:114)(CDR_L 잔기는 밑줄로 표시된다):

항-플루오레세인 항체 4-4-20의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:115)(CDR_H 잔기는 밑줄로 표시된다):

VI. 예시적인 다가 DR5-결합 분자

상기 설명된 대로, 적어도 2개, 바람직하게 적어도 4개의 DR5 결합 부위를 지닌 다가 DR5-결합 분자는 여러 가지 구조를 가질 수 있다. 특히, 제한은 없지만 IgG-기반 이중특이적 항체를 포함하는 면역글로불린의 항원-결합 부분을 포함하는 구조, 및 디아바디를 포함하는 분자가 바람직하다. 디아바디를 포함하는 다가 DR5-결합 분자의 구체적인 비제한적 예들이 제공된다. 그러나, 상기 개시된 것들(예를 들어, 도 1-4 참조)이나 당업자에게 명백한 것들을 포함하는 대용 구조들도 본 발명에 의해 포함된다.

A. DR5에 대해 4가인 DR5 x DR5 이중특이적 Fc 영역-함유 디아바디

1. DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 이중특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디"로 지칭된 하나의 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO: 116)이다:

SEQ ID NO:116에서, 아미노산 잔기 1-111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)에 상응하고, 잔기 112-119는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 120-238은 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)에 상응하고, 잔기 239-243은 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 244-271은 시스테인-함유 E코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 272-277은 LEPKSS 링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 278-287은 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 288-503은 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:116을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:117이다:

DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:118)이다:

SEQ ID NO:118에서, 아미노산 잔기 1-107은 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-236은 SEQ ID NO:8의 C-말단 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 것을 제외하면 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)에 상응하고, 잔기 237-241은 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 242-269는 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:118을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:119이다:

"DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(밑줄)를 가진 변이체인 것을 제외하면, DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:120)이다:

SEQ ID NO:120을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:121이다:

DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:118(SEQ ID NO:119에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:116 또는 120의 아미노산 잔기 288-504는, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

2. DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 이중특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디"로 지칭된 하나의 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO: 122)이다:

SEQ ID NO:122에서, 아미노산 잔기 1-107은 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-236은 SEQ ID NO:8의 C-말단 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 것을 제외하면 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)에 상응하고, 잔기 237-241은 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 242-269는 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 270-275는 LEPKSS 링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 276-285는 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 286-501은 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:122를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:123이다:

DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:124)이다:

SEQ ID NO:124에서, 아미노산 잔기 1-111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)에 상응하고, 잔기 112-119는 개재 스페이서펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 120-238은 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)에 상응하고, 잔기 239-243은 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 244-271은 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:124를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:125이다:

"DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(볼드체)를 가진 변이체인 것을 제외하면, DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:126)이다:

SEQ ID NO:126을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:127이다:

DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:124(SEQ ID NO:125에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:122 또는 126의 아미노산 잔기 286-502는, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

B. DR5에 2가인 DR5 x DR5 이중특이적 디아바디

1. DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 이중특이적인 예시적인 이중특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:116의 아미노산 잔기 1-271을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:118을 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 포함하는 DR5에 이중특이적인 다른 예시적인 이중특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:116 또는 SEQ ID NO:120을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:118을 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가진다.

1. DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 2가인 예시적인 이중특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:122의 아미노산 잔기 1-269를 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:124를 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 함유하는 DR5에 2가인 다른 예시적인 이중특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:122 또는 SEQ ID NO:126을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:124를 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가진다.

C. DR5에 4가인 DR5 x DR5 단일특이적 Fc 영역-함유 디아바디

1. DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 단일특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디"로 지칭된 하나의 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:128)이다:

SEQ ID NO:128에서, 아미노산 잔기 1-111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)에 상응하고, 잔기 112-119는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 120-240은 SEQ ID NO:8의 C-말단 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 것을 제외하면 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)에 상응하고, 잔기 241-245는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 246-273은 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 274-279는 LEPKSS 링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 280-289는 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 290-505는 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:128을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:129이다:

DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:130)이다:

SEQ ID NO:130에서, 아미노산 잔기 1-111은 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)에 상응하고, 잔기 112-119는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 120-240은 SEQ ID NO:8의 C-말단 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 것을 제외하면 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:8)에 상응하고, 잔기 241-245는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 246-273은 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:130을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:131이다:

"DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(밑줄)를 가진 변이체인 것을 제외하면, DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:132)이다:

SEQ ID NO:132를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:133이다:

DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:130(SEQ ID NO:131에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:128 또는 132의 아미노산 잔기 290-506은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

2. DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 단일특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디"로 지칭된 제1 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:134)이다:

SEQ ID NO:134에서, 아미노산 잔기 1-107은 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 268-273은 LEPKSS링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 274-283은 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 284-499는 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:134를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:135이다:

DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:136)이다:

SEQ ID NO:136에서, 아미노산 잔기 1-107은 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서펩티드 GGGSGGGG (링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:136을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:137이다:

"DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(밑줄)를 가진 변이체인 것을 제외하면, DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:138)이다:

SEQ ID NO:138을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:139이다:

DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:136(SEQ ID NO:137에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:134 또는 138의 아미노산 잔기 284-500은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

3. hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 단일특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VL-2의 VL 도메인 및 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 디아바디"로 지칭된 제1 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:140)이다:

SEQ ID NO:140에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 268-273은 LEPKSS 링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 274-283은 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 284-499는 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:140을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:141이다:

hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:142)이다:

SEQ ID NO:142에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:142를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:143이다:

"hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(밑줄)를 가진 변이체인 것을 제외하면, hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:144)이다:

SEQ ID NO:144를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:145이다:

hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:142(SEQ ID NO:143에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:140 또는 144의 아미노산 잔기 284-500은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

4. hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 단일특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VL-3의 VL 도메인 및 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VH-3의 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 디아바디"로 지칭된 제1 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:146)이다:

SEQ ID NO:146에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-3의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:25)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 268-273은 LEPKSS 링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 274-283은 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 284-499는 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:146을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:147이다:

hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:148)이다:

SEQ ID NO:148에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-3의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:25)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:148을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:149이다:

"hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(밑줄)를 가진 변이체인 것을 제외하면, hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:150)이다:

SEQ ID NO:150을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:151이다:

hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:148(SEQ ID NO:149에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:146 또는 150의 아미노산 잔기 284-500은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

5. hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 단일특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VL-4의 VL 도메인 및 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VH-4의 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc 디아바디"로 지칭된 제1 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:152)이다:

SEQ ID NO:152에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-4의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:27)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 268-273은 LEPKSS 링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 274-283은 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 284-499는 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:152를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:153이다:

hDR5 mAb 2 x hDR5 mAb 2 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:154)이다:

SEQ ID NO:154에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-4의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:17)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:154를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:155이다:

"hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(밑줄)를 가진 변이체인 것을 제외하면, hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:156)이다:

SEQ ID NO:156을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:157이다:

hDR5 mAb 2 x hDR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:154(SEQ ID NO:155에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:152 또는 156의 아미노산 잔기 284-500은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

6. hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc 영역-함유 디아바디

두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 DR5에 대해 4가인 예시적인 단일특이적 Fc 영역-함유 디아바디는 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VL-5의 VL 도메인 및 항-사람 DR5 항체 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인을 갖도록 구성된다. "hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc 디아바디"로 지칭된 제1 Fc 영역-함유 디아바디는 야생형 IgG1 Fc 영역을 함유한다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:158)이다:

SEQ ID NO:158에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-5의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:29)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하고, 잔기 268-273은 LEPKSS 링커(SEQ ID NO:49)에 상응하고, 잔기 274-283은 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 링커(DKTHTCPPCP; SEQ ID NO:48)에 상응하고, 잔기 284-499는 야생형 IgG1 Fc 영역(SEQ ID NO:1, C-말단 아미노산 잔기를 결여함)에 상응한다. SEQ ID NO:158을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:159이다:

hDR5 mAb 2 x hDR5 mAb 2 Fc 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:160)이다:

SEQ ID NO:160에서, 아미노산 잔기 1-107은 hDR5 mAb 2 VL-5의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:29)에 상응하고, 잔기 108-115는 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하고, 잔기 116-237은 hDR5 mAb 2 VH-2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)에 상응하고, 잔기 235-239는 ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하고, 잔기 240-267은 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응한다. SEQ ID NO:160을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:161이다:

"hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc 디아바디(AA)"로 지칭된 다른 Fc 영역-함유 디아바디는, Fc 영역이 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소/제거하고 이펙터 기능을 감소/제거하는 L234A/L235A 이중 돌연변이(밑줄)를 가진 변이체인 것을 제외하면, hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc 디아바디와 동일하다. 이 Fc 영역-함유 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:162)이다:

SEQ ID NO:162를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:163이다:

hDR5 mAb 2 x hDR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)의 제2 폴리펩티드 사슬은 또한 상기 상세히 설명된 SEQ ID NO:160(SEQ ID NO:161에 의해 암호화된)이다.

또는 달리, FcγRIIIA에 대한 감소된/제거된 결합 및/또는 감소된/제거된 이펙터 기능이 바람직한 경우, IgG2 또는 IgG4의 CH2-CH3 영역이 사용될 수 있다. 이러한 Fc 영역-함유 디아바디에서, SEQ ID NO:158 또는 162의 아미노산 잔기 284-500은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:164(IgG2의 CH2-CH3) 또는 SEQ ID NO:103(IgG4의 CH2-CH3)로 치환될 것이다.

D. DR5에 2가인 DR5 x DR5 단일특이적 디아바디

1. DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 2가인 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:128의 아미노산 잔기 1-273을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:130을 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 함유하는 DR5에 2가인 다른 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:128 또는 SEQ ID NO:132를 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:130을 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가진다.

2. DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 2가인 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:134의 아미노산 잔기 1-267을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:136을 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 함유하는 DR5에 2가인 다른 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:134 또는 SEQ ID NO:138을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:136을 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 가진다.

3. DR5 mAb 2.2 x DR5 mAb 2.2 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 2가인 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-2의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:140의 아미노산 잔기 1-267을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:142를 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 함유하는 DR5에 2가인 다른 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-2의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:140 또는 SEQ ID NO:144를 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:142를 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가진다.

4. DR5 mAb 2.3 x DR5 mAb 2.3 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 2가인 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-3의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:146의 아미노산 잔기 1-267을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:148을 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 함유하는 DR5에 2가인 다른 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-3의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:150을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:148을 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가진다.

5. DR5 mAb 2.4 x DR5 mAb 2.4 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 2가인 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-4의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:152의 아미노산 잔기 1-267을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:154를 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 함유하는 DR5에 2가인 다른 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-4의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:152 또는 SEQ ID NO:156을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:154를 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가진다.

6. DR5 mAb 2.5 x DR5 mAb 2.5 디아바디

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 결여하는 DR5에 2가인 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-5의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 1-267을 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 상기 설명된 SEQ ID NO:160을 포함한다.

2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fc 영역을 함유하는 DR5에 2가인 다른 예시적인 단일특이적 디아바디는 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2 VL-5의 VL 및 VH 도메인과 DR5 mAb 2 VH-2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 이 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:158 또는 SEQ ID NO:162를 포함한다. 이 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:160을 포함하고, 아미노산 잔기 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:51을 가진 링커를 더 포함하며, IgG1 Fc 영역은, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여하는, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가진다.

E. 추가의 DR5 x DR5 디아바디

다른 구체예에서, 본 발명의 DR5 x DR5 디아바디는 사람화된 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인 및/또는 사람화된 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성된다. 구체적인 구체예에서, hDR5 mAb2 VL VL-2(SEQ ID NO:23), hDR5 mAb2 VL VL-3(SEQ ID NO:25), hDR5 mAb2 VL VL-4(SEQ ID NO:27), 또는 hDR5 mAb2 VL VL-5(SEQ ID NO:29)의 VL 도메인이 SEQ ID NO:13 대신에 상기 구성물에 통합되고, 및/또는 hDR5 mAb2 VH-2(SEQ ID NO:31)의 VH 도메인이 SEQ ID NO:18 대신에 상기 구성물에 통합된다. 또는 달리, 또는 추가하여, DR5 mAb 1의 사람화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:3 대신에 상기 구성물에 통합되고, 및/또는 사람화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:8 대신에 상기 구성물에 통합된다.

상기 설명된 예시적인 다가 DR5-결합 분자는 각 결합도메인에 대해 경쇄(VL)의 3개 CDR_L과 중쇄(VH)의 3개의 CDR_H를 포함하지만, 본 발명은 또한 다음의 것을 지닌 다가 DR5-결합 분자를 포함한다는 것이 인정될 것이다:

(1) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 하나;

(2) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 2개;

(3) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 3개의 CDR_L;

(4) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 하나;

(5) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 2개;

(6) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 3개의 CDR_H;

(7) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 하나 및 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 하나;

(8) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 2개 및 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 2개;

(9) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 도메인의 3개의 CDR_L 및 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VH 도메인의 3개의 CDR_H;

(10) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 도메인;

(11) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VH 도메인;

(12) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1의 VL 및 VH 도메인;

(13) 또는 사람 DR5에 결합하기 위해 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 1과 경합할 수 있는 것;

또는

(14) 사람 DR5에 결합하기 위해 (1)-(13) 중 어느 것과 경합하는 것.

유사하게, 본 발명은 또한 다음의 것을 지닌 다가 DR5-결합 분자를 포함한다는 것이 인정될 것이다:

(15) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 하나;

(16) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 2개;

(17) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 3개의 CDR_L;

(18) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 하나;

(19) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 2개;

(20) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 3개의 CDR_H;

(21) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 하나 및 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 하나;

(22) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 CDR_L 중 적어도 2개 및 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 CDR_H 중 적어도 2개;

(23) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 3개의 CDR_L 및 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VH 도메인의 3개의 CDR_H;

(24) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 도메인;

(25) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VH 도메인;

(26) 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인;

(27) 사람 DR5에 결합하기 위해 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2와 경합하는 것;

또는

(28) 또는 사람 DR5에 결합하기 위해 (15)-(27) 중 어느 것과 경합하는 것

VII. 제조 방법

다가 DR5-결합 분자, 및 다른 DR5 작동제, 길항제 및 조정제는 본 분야에 알려진 방법에 의해, 예를 들어 합성 또는 재조합 방식으로 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2 항체의 폴리뉴클레오티드 및/또는 서열로부터 생성될 수 있다. 이러한 펩티드 작동제, 길항제 및 조정제를 생성하는 한 방법은 폴리펩티드의 화학적 합성 및 그에 이어서 자생 입체형태, 즉 정확한 이황화물 결합 연결을 얻기 위한 적절한 산화 조건 하의 처리를 수반한다. 이것은 당업자에게 잘 알려진 방법들을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, Kelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL 참조; 또한, 미국특허 No. 4,105,603; 3,972,859; 3,842,067; 및 3,862,925 참조).

본 발명의 폴리펩티드는 고체상 펩티드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다(Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A.(1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82 (15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

또 다른 대안에서, DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2의 CDR 중 하나 이상을 갖거나, 또는 사람 DR5와 결합하기 위해 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2와 경합하는 완전한 사람 항체, 또는 그것의 가용성 형태는 특이적 사람 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 이용가능한 마우스의 사용을 통해서 얻어질 수 있다. 더욱 바람직한(예를 들어, 완전한 사람 항체) 또는 더욱 견고한 면역 반응을 야기하도록 설계된 트랜스제닉 동물이 또한 사람화된 또는 사람 항체의 발생을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예들은 Xenomouse™(Abgenix, Inc., Fremont, CA) 및 HuMAb-Mouse™ 및 TC Mouse™(둘 다 Medarex, Inc., Princeton, NJ)이다.

대안으로서, 항체는 본 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 재조합 방식으로 제조되고 발현될 수 있다. 항체는 먼저 숙주 동물로부터 제조된 항체를 분리하고, 유전자 서열을 획득하고, 이 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에서 항체를 재조합 방식으로 발현시킴으로써 재조합 방식으로 제조될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 방법은 식물(예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 밀크에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 밀크에서 항체를 재조합 방식으로 발현시키기 위한 적합한 방법들이 개시되었다(예를 들어, Peeters et al.(2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; 및 Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157 참조). 항체의 유도체, 예를 들어 사람화된, 단쇄, 등의 유도체를 제조하기 위한 적합한 방법이 본 분야에 알려져 있다. 다른 대안에서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합 방식으로 제조될 수 있다(예를 들어, 미국특허 No. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).

관심의 항체 또는 단백질은 Edman 변성에 의해 서열화될 수 있으며, 이것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 질량분광법 또는 Edman 변성으로부터 생성된 펩티드 정보는 관심의 단백질을 클로닝하기 위해 사용되는 프로브 또는 프라이머를 설계하는데 사용될 수 있다.

관심의 단백질을 클로닝하는 다른 방법은, DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2의 CDR 중 하나 이상을 지니거나, 또는 사람 DR5에 결합하기 위해 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2와 경합하는 관심의 항체 또는 단백질을 발현하는 세포에 대해 정제된 DR5 또는 그것의 일부분을 사용하여 "패닝(panning)"하는 것이다. "패닝" 과정은 DR5를 발현하는 조직이나 세포로부터 cDNA 라이브러리를 획득하고, 제2 세포 타입에서 cDNA를 과발현시키고, DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2의 존재 또는 부재하에 DR5에 대한 특이적 결합에 대해 제2 세포 타입의 트랜스펙션된 세포를 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. "패닝"에 의해 세포 표면 단백질을 코딩하는 포유류 유전자를 클로닝하는데 사용되는 방법의 상세한 설명은 본 분야에서 찾을 수 있다(예를 들어, Aruffo A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 및 Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation," Endocrinol. 140:5841-5854 참조).

관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터가, 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 이용한 트랜스펙션; 미소포물체 폭탄; 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 어느 것에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 선택은 주로 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다.

관심의 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하는 목적을 위해 이종성 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 비제한적 예들은, 제한은 없지만 COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함한다. 바람직하게, 숙주 세포는 숙주 세포에서, 존재한다면 관심의 상응하는 내인성 항체 또는 단백질의 것보다 약 5배 더 높은, 더 바람직하게 10배 더 높은, 더욱더 바람직하게 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. DR5에 대한 특이적 결합에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 면역분석 또는 FACS에 의해 행해진다. 관심의 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포가 확인될 수 있다.

본 발명은 이 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이 발명의 폴리펩티드는 본 분야에 알려진 과정에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질가수분해 또는 다른 변성에 의해, 상기 설명된 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 최대 약 50개 아미노산의 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 항-DR5 폴리펩티드는 고체상 방법을 이용한 자동 폴리펩티드 합성장치에 의해 생성될 수 있다.

본 발명은, 분자의 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 항체 및 융합 폴리펩티드뿐만 아니라 증진된 또는 감소된 활성을 가진 변이체를 포함하여, DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2 항체 및 DR5에 결합하는 이들의 폴리펩티드 단편 및 이러한 분자의 작동제, 길항제, 및 조정제에 대한 변형을 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 본 분야에서 통상적인 관행이므로 여기 상세히 설명될 필요는 없다. 변형된 폴리펩티드의 예들은 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 유의하게 안좋게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 서로 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는, 제한은 없지만 글리신/알라닌; 세린/트레오닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신을 포함한다. 이들 폴리펩티드는 또한 글리코실화된 및 비-글리코실화된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 다른 후-번역 변형, 예컨대 예를 들어 상이한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 가진 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 아미노산 치환은 보존적일 수 있는데, 즉 치환된 아미노산은 원래 아미노산과 유사한 화학적 특성을 지닐 수 있다. 이러한 보존적 치환은 본 분야에 알려져 있으며, 예들은 상기 제공되었다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 변형에서부터 가변 영역과 같은 영역의 완전한 재설계에까지 이르는 범위일 수 있다. 가변 영역의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경할 수 있다. 변형의 다른 방법은, 제한은 없지만 효소적 수단, 산화성 치환 및 킬레이트화를 포함하는 본 분야에 알려진 커플링 기술을 사용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 방사성면역분석을 위한 방사성활성 부분의 부착과 같은, 면역분석을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 본 분야에 확립된 과정을 사용하여 제조되며, 본 분야에 알려진 표준 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.

본 발명은 이 발명의 폴리펩티드 또는 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2 항체 중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄와 중쇄 둘 다를 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 이종성 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 공개적으로 기탁된 하이브리도마로부터 생성된 항체의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 함유한다. 이 발명의 목적을 위해, 항체 융합 단백질은 DR5에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인 및 자생 분자에서는 부착되지 않는 다른 아미노산 서열, 예를 들어 다른 영역으로부터의 이종성 서열이나 상동성 서열을 함유한다.

VIII. 본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 사용

본 발명은, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자(예를 들어, DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2와 같은 항-DR5 항체로부터의 항원-결합 도메인을 포함하는 다가 DR5-결합 분자, 또는 그것의 사람화된 유도체), 이러한 분자로부터 유래된 폴리펩티드, 이러한 분자 또는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 여기 설명된 다른 제제들을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 포함한다.

상기 논의된 대로, TRAIL 사이토카인에 의한 DR5의 활성화는 종양 세포의 매우 선택적인 인식 및 사멸을 가져온다. 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 작동제로서 작용하는 능력을 가지며, TRAIL을 의태하고, 따라서 DR5의 활성화를 초래한다. 이와 같이, DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2와 같은 항-DR5 항체로부터의 항원-결합 도메인을 포함하는 다가 DR5-결합 분자, 및 그것의 사람화된 유도체는 DR5를 발현하는 종양 세포의 사멸을 촉진하기 위해 TRAIL의 대용물로서 사용될 수 있다. DR5는 종양 셀라인에서 도처에 분포되므로, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 암을 위한 일반적인 요법을 제공한다. 이러한 분자에 의해 치료될 수 있는 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상연부육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암, 투명 세포 암종, 결장암, 결직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포 종양, 상의세포종, 유윙 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성불완전섬유원증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선암, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 포진성 포도막 흑색종, 희귀한 조혈 장애, 신장 전이성 암, 간상 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 하는 암을 포함한다.

특히, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 결직장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경모세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 및 직장암의 치료에 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 사람 암 줄기세포인 종양 세포의 사멸을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 암 줄기세포(CSC)는 종양 성장 및 전이에서 역할을 한다는 것이 가설이었다(Ghotra, V.P. et al. (2009) "The Cancer Stem Cell Microenvironment And Anti-Cancer Therapy," Int. J. Radiat. Biol. 85(11):955-962; Gupta, P.B. et al. (2009) "Cancer Stem Cells: Mirage or Reality" Nat. Med. 15(9):1010-1012; Lawson, J.C. et al. (2009) "Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastasis," Breast Cancer Res. Treat. 118(2):241-254; Hermann, P.C. et al. (2009) "Pancreatic Cancer Stem Cells--Insights And Perspectives," Expert Opin. Biol. Ther. 9(10):1271-1278; Schatton, T. et al. (2009) "Identification And Targeting Of Cancer Stem Cells," Bioessays 31(10): 1038-1049; Mittal, S. et al. (2009) "Cancer Stem Cells: The Other Face Of Janus," Amer. J. Med. Sci. 338(2):107-112; Alison, M.R. et al. (2009) "Stem Cells And Lung Cancer: Future Therapeutic Targets?" Expert Opin. Biol. Ther. 9(9):1127-1141; Charafe-Jauffret, E. et al. (2009) "Breast Cancer Stem Cells: Tools And Models To Rely On," BMC Cancer 9:202; Scopelliti, A. et al. (2009) "Therapeutic Implications Of Cancer Initiating Cells," Expert Opin. Biol. Ther. 9(8):1005-1016; PCT 공개 WO 2008/091908). 이 가설하에 CSC는 무한 자기-재생을 할 수 있고 복제 용량이 비교적 제한되는 더 성장한 종양 세포(들)로 발달할 수 있는 각 종양 내에 세포의 작은, 분리된 하위세트를 포함한다. 암 줄기세포는 화학치료제, 방사선 또는 다른 독성 조건에 더욱 내성일 수 있고, 따라서 임상 요법 후에도 지속될 수 있고, 나중에 속발성 종양으로 성장하거나, 전이하거나, 또는 재발을 초래할 수 있다는 것이 가설이었다. CSC는 '정상' 조직 줄기세포로부터 또는 더욱 분화된 조직 선조 세포로부터 발생할 수 있다는 것이 제안되었다. 여기 증명된 대로, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 암 줄기세포처럼 보이는 세포(즉, 암 줄기세포유사(CSCL) 세포)에 대해 세포독성이다. 따라서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 사람 암 줄기세포의 사멸을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

추가하여, 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 억제제, 예컨대 보리노스타트는 종양 세포를 DR5 경로를 통해서 유도된 세포자멸에 민감하게 만드는 것으로 보고되었다(Nakata, et al., (2004) "Histone deacetylase inhibitors upregulate Death Receptor 5/TRAIL-R2 and sensitize apoptosis induced by TRAIL/ APO2 -L in human malignant tumor cells" Oncogene 19:6261-71; Butler et al. (2006) "The histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid, overcomes resistance of human breast cancer cells to Apo2L /TRAIL" Int J Cancer. 15:944-54; Shankar et al. (2009) "Suberoylanilide hydroxamic acid( Zolinza / vorinostat ) sensitizes TRAIL-resistant breast cancer cells orthotopically implanted in BALB /c nude mice," Mol Cancer Ther. 8:1596-605). 여기 증명된 대로, 세포 사멸을 촉진하는 본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 능력은 HDAC 억제제(예를 들어, 보리노스타트)와 조합한 치료에 의해 강화된다. 따라서, 다가 DR5-결합 분자와 조합한 HDAC 억제제의 사용은 단일 제제로서 다가 DR5-결합 분자로의 치료에 감응하지 않는 DR5를 발현하는 암의 치료에 특히 유용하다.

치료에서 이들의 활용에 더하여, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 검출가능하게 표지되어 암의 진단이나 종양 및 종양 세포의 영상화에 사용될 수 있다.

IX. 약학적 조성물

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물(예를 들어, 불순한 또는 비-멸균 조성물 및 단위 제형(dosage form)의 제조에 사용될 수 있는 약학적 조성물(즉, 대상이나 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)을 포함한다. 이러한 조성물은 본 발명의 다가 DR5-결합 분자, 또는 이러한 제제와 약학적으로 허용되는 담체의 조합의 예방적 또는 치료적 유효량을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 예방적 또는 치료적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명은 특히 다가 DR5-결합 분자가 항-DR5 항체, 예컨대 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2 항체, 사람화된 DR5 mAb 1, 사람화된 DR5 mAb 2 항체, 또는 임의의 이러한 항체의 DR5-결합 단편으로부터의 항원-결합 도메인을 포함하는 이러한 약학적 조성물을 포함한다. DR5 mAb 1의 3개 CDR_L 및 3개 CDR_H; DR5 mAb 2의 3개 CDR_L 및 3개 CDR_H; 및/또는 hDR5 mAb 2 VL-3의 3개 CDR_L 및 3개 CDR_H를 포함하는 이러한 분자가 특히 포함된다.

본 발명은 본 발명의 다가 DR5-결합 분자, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명은 특정 암 항원에 특이적인 제2 치료적 항체(예를 들어, 종양 특이적 모노클로날 항체), 및 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 이러한 약학적 조성물을 포함한다.

구체적인 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인된 것, 또는 동물, 더 구체적으로 사람에서의 사용을 위해 미국 약전이나 다른 일반적으로 인정되는 약전에 등록된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 희석제, 애쥬번트(예를 들어, Freund 애쥬번트(완전 및 불완전), 부형제, 또는 치료제와 함께 투여되는 비히클을 말한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있으며, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 피넛 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등을 포함한다. 약학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우는 물이 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사가능한 용액에 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 녹말, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조된 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 바람직하다면, 또한 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 소량 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 조성물의 원료는, 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 샤쉐와 같은 밀폐 밀봉된 용기에, 예를 들어 건조 동결건조 분말 또는 물 무함유 농축물로서, 개별적으로 공급되거나 단위 제형에 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균 약학 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입 보틀에 디스펜스될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있고, 원료들은 투여 전에 혼합될 수 있다.

본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 조제될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 제한은 없지만 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온과 함께 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온과 함께 형성된 것들을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 다가 DR5-결합 분자(더 바람직하게, DR5 mAb 1, 및/또는 DR5 mAb 2 항체, 및/또는 사람화된 DR5 mAb 1, 및/또는 사람화된 DR5 mAb 2 항체의 CDR을 포함하는 4가 Fc 영역-함유 디아바디(특히, 4가 E-코일/K-코일 Fc 영역-함유 디아바디))로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 특히, DR5 mAb 1의 3개 CDR_L 및 3개 3 CDR_H; DR5 mAb 2의 3개 CDR_L 및 3개 3 CDR_H; 및/또는 hDR5 mAb 2 V-3의 3개 CDR_L 및 3개 3 CDR_H를 포함하는 이러한 분자가 단독으로 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함된다. 추가로, 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방적 또는 치료적 제제가 약학적 팩 또는 키트에 또한 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태로 이러한 용기(들)와 결합되는 것이 고시될 수 있으며, 이러한 고시는 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 당국에 의한 승인을 반영한다.

본 발명은 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 다가 DR5-결합 분자 중 어느 것을 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 용기에 암의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방적 및/또는 치료적 제제를 더 포함할 수 있고, 및/또는 키트는 암과 결합된 하나 이상의 암 항원에 결합하는 하나 이상의 세포독성 항체를 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 다른 예방적 또는 치료적 제제는 화학치료이다. 다른 구체예에서, 예방적 또는 치료적 제제는 생물학적 또는 호르몬성 치료이다.

X. 투여 방법

본 발명의 조성물은, 본 발명의 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자, 또는 본 발명의 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자를 포함하는 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여함으로써 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 및 완화하기 위해 제공될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 조성물은 실질적으로 정제된다(즉, 그것의 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 야기하는 물질이 실질적으로 없는 상태). 구체적인 구체예에서, 대상은 동물, 바람직하게 포유류, 예컨대 비-영장류(예를 들어, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이, 예컨대 사이노몰거스 원숭이, 사람 등)이다. 바람직한 구체예에서, 대상은 사람이다.

다양한 송달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들어 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐 내 캡슐화, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 내포작용(예를 들어, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성 등이 있다.

본 발명의 분자를 투여하는 방법은, 제한은 없지만, 비경구 투여(예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외, 및 점막(예를 들어, 비내 및 경구 경로)을 포함한다. 구체적인 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 근육내, 정맥내 또는 피하 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 내피 또는 점막피부 라이닝(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생리학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 추가하여, 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저, 및 에어로졸화제를 가진 제제의 사용에 의한 폐 투여가 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 No. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078; 및 PCT 공개 No. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 여기 참고로 포함된다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자가 분자의 양을 표시한 앰풀 또는 샤쉐와 같은 밀폐 밀봉된 용기에 포장되는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 이러한 분자는 밀폐 밀봉된 용기에 건조 멸균 동결건조된 분말 또는 물-무함유 농축물로서 공급되고, 예를 들어 물 또는 식염수로, 대상에 투여하기 위한 적절한 농도로 복원될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자는 적어도 5 μg, 더 바람직하게 적어도 10 μg, 적어도 15 μg, 적어도 25 μg, 적어도 50 μg, 적어도 100 μg, 또는 적어도 200 μg의 단위 도세지로 밀폐 밀봉된 용기에 건조 멸균 동결건조된 분말로서 공급된다.

본 발명의 동결건조된 다가 DR5-결합 분자는 그것의 원래 용기에서 2 내지 8℃에서 보관되어야 하고, 분자는 복원 후 12시간 이내, 바람직하게 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 또는 1시간 이내에 투여되어야 한다. 다른 구체예에서, 이러한 분자는 분자, 융합 단백질, 또는 콘쥬게이트된 분자의 양 및 농도를 표시한 밀폐 밀봉된 용기에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 액체 형태로 제공되었을 때 이러한 다가 DR5-결합 분자는 밀폐 밀봉된 용기에 공급되며, 여기서 분자는 적어도 1 μg/ml, 더 바람직하게 적어도 2.5 μg/ml, 적어도 5 μg/ml, 적어도 10 μg/ml, 적어도 50 μg/ml, 또는 적어도 100 μg/ml의 농도로 존재한다.

장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 또는 완화에 효과적인 본 발명의 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 제제에 이용되어야 하는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상태의 심각성에 의존할 것이고, 전문의의 판단과 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.

본 발명에 의해 포함되는 다가 DR5-결합 분자에 대해, 환자에게 투여되는 도세지는 바람직하게 레시피언트 대상의 체중(kg)에 기초하여 결정된다. 투여되는 도세지는 전형적으로 적어도 1일당 약 0.3 ng/kg 내지 1일당 약 0.9 ng/kg, 적어도 1일당 약 1 ng/kg 내지 1일당 약 3 ng/kg, 적어도 1일당 약 3 ng/kg 내지 1일당 약 9 ng/kg, 적어도 1일당 약 10 ng/kg 내지 1일당 약 30 ng/kg, 적어도 1일당 약 30 ng/kg 내지 1일당 약 90 ng/kg, 적어도 1일당 약 100 ng/kg 내지 1일당 약 300 ng/kg, 적어도 1일당 약 200 ng/kg 내지 1일당 약 600 ng/kg, 적어도 1일당 약 300 ng/kg 내지 1일당 약 900 ng/kg, 적어도 1일당 약 400 ng/kg 내지 1일당 약 800 ng/kg, 적어도 1일당 약 500 ng/kg 내지 1일당 약 1000 ng/kg, 적어도 1일당 약 600 ng/kg 내지 1일당 약 1000 ng/kg, 적어도 1일당 약 700 ng/kg 내지 1일당 약 1000 ng/kg, 적어도 1일당 약 800 ng/kg 내지 1일당 약 1000 ng/kg, 적어도 1일당 약 900 ng/kg 내지 1일당 약 1000 ng/kg, 또는 적어도 1일당 약 1,000 ng/kg이다. 계산된 용량은 베이스라인에서 환자의 체중에 기초하여 투여될 것이다. 베이스라인 또는 확립된 평탄역 중량으로부터 체중의 유의한(≥10%) 변화는 용량의 재계산을 촉구한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 이러한 예방적 또는 치료적 유효량의 하나 이상의 용량을 포함하는 치료 섭생이 환자에게 투여되며, 여기서 치료 섭생은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일에 걸쳐서 투여된다. 특정 구체예에서, 치료 섭생은 본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 간헐적으로 투여하는 것을 포함한다(예를 들어, 주어진 주의 제1일, 제2일, 제3일 및 제4일에 용량을 투여하고, 다가 DR5-결합 분자(특히, DR5 mAb 1, 및/또는 DR5 mAb 2 항체, 및/또는 사람화된 DR5 mAb 1, 및/또는 사람화된 DR5 mAb 2 항체의 CDR을 포함하는 4가 Fc 영역-함유 디아바디, 특히 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디)의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 투여하지 않음). DR5 mAb 1의 3개의 CDR_L 및 3개의 CDR_H; DR5 mAb 2의 3개의 CDR_L 및 3개의 CDR_H; 및/또는 hDR5 mAb 2 V-3의 3개의 CDR_L 및 3개의 CDR_H를 포함하는 분자의 투여가 특히 포함된다(동일한 주의 제5일, 제6일 및 제7일). 전형적으로, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 치료 코스가 있다. 각 코스는 동일한 섭생 또는 상이한 섭생일 수 있다.

다른 구체예에서, 투여되는 용량은 다가 DR5-결합 분자의 1일당 예방적 또는 치료적 유효량이 달성될 때까지 섭생(들)의 제1 사분기, 전반기 또는 전반기 2/3 또는 3/4에 걸쳐서 상승한다(예를 들어, 4 코스 치료의 제1, 제2 또는 제3 섭생에 걸쳐서). 표 4는 전형적인 치료 코스를 위한 상기 설명된 상이한 투약 섭생의 5가지 예를 제공한다.

섭생	일	디아바디 도세지 (1일당 대상 중량 kg 당 디아바디 ng)
1	1, 2, 3, 4	100	100	100	100	100
1	5, 6, 7	없음	없음	없음	없음	없음
2	1, 2, 3, 4	300	500	700	900	1,000
2	5, 6, 7	없음	없음	없음	없음	없음
3	1, 2, 3, 4	300	500	700	900	1,000
3	5, 6, 7	없음	없음	없음	없음	없음
4	1, 2, 3, 4	300	500	700	900	1,000
4	5, 6, 7	없음	없음	없음	없음	없음

본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 투여 도세지 및 빈도는, 예를 들어 지질화와 같은 변형에 의해 분자의 흡수 및 조직 침투를 증진시킴으로써 감소 또는 변경될 수 있다.

환자에게 투여되는 본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 도세지는 단일 제제 요법으로서 사용하기 위해 계산될 수 있다. 또는 달리, 분자는 다른 치료적 조성물과 조합하여 사용될 수 있으며, 환자에게 투여되는 도세지는 상기 분자가 단일 제제 요법으로서 사용될 때보다 낮다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료가 필요한 영역에 국소 투여될 수 있다; 이것은, 예를 들어 제한은 아니지만, 국소 주입에 의해, 주사에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 실라스틱 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함하는, 다공질, 비-다공질, 또는 젤라틴성 재료이다. 바람직하게, 본 발명의 분자를 투여할 때, 분자가 흡수되지 않는 재료를 사용하도록 주의를 기울여야 한다.

본 발명의 조성물은 비히클, 특히 리포솜에서 송달될 수 있다(Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533; Treat et al. Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327 참조).

본 발명의 조성물은 제어-방출 또는 지속-방출 시스템에서 송달될 수 있다. 본 발명의 다가 DR5-결합 분자(들) 중 하나 이상을 포함하는 지속-방출 제제를 생성하기 위해 당업자에게 알려진 임의의 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 No. 4,526,938; PCT 공개 WO 91/05548; PCT 공개 WO 96/20698; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardio -vascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; Lam et al.(1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 여기 참고로 포함된다. 한 구체예에서, 펌프가 제어-방출 시스템에 사용될 수 있다(Langer, 상동; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980)"Long-Term Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implant-able Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; 및 Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Pro-grammable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579 참조). 다른 구체예에서, 분자의 제어-방출을 달성하기 위해 중합성 재료가 사용될 수 있다(예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.) Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate ," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국특허 No. 5,679,377; 미국특허 No. 5,916,597; 미국특허 No. 5,912,015; 미국특허 No. 5,989,463; 미국특허 No. 5,128,326; PCT 공개 No. WO 99/15154; 및 PCT 공개 No. WO 99/20253 참조). 지속-방출 제제에 사용되는 중합체의 예들은, 제한은 없지만, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(메틸메타크릴레이트)), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리앤하이드라이드, 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜라이드)(PLGA) 및 폴리오쏘에스테르를 포함한다. 제어-방출 시스템은 치료 표적(예를 들어, 폐) 부근에 위치될 수 있고, 따라서 전신 용량의 일부만 필요로 한다(예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 제어-방출 이식물로서 유용한 중합성 조성물은 Dunn et al.(U.S. 5,945,155 참조)에 따라 사용될 수 있다. 이 특정한 방법은 중합체 시스템으로부터의 생물활성(bioactive) 재료의 인시튜 제어-방출의 치료 효과에 기초한다. 이식은 일반적으로 치료적 치료가 필요한 환자의 신체 내의 어느 곳에서도 일어날 수 있다. 비-중합성 지속 송달 시스템이 사용될 수 있으며, 이로써 대상의 체내에서 비-중합성 이식물이 약물 송달 시스템으로 사용된다. 체내 이식시 이식물의 유기 용매는 조성물로부터 주변 조직 유체로 소실, 분산 또는 침출할 것이고, 비-중합성 재료는 점진적으로 응고 또는 침전하여 고체, 미소다공질 매트릭스를 형성할 것이다(U.S. 5,888,533 참조).

제어-방출 시스템은 Langer에 의한 리뷰에서 논의된다(1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지속-방출 제제를 생성하기 위해 당업자에게 알려진 임의의 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 No. 4,526,938; International Publication No. WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel" Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al.(1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions" PDA Journal of Pharmaceutical Science& Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; Lam et al(1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이들 각각은 그 전체가 여기 참고로 포함된다).

본 발명의 조성물이 본 발명의 다가 DR5-결합 분자를 암호화하는 핵산인 경우, 이 핵산은, 그것을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(미국특허 No. 4,980,286 참조)의 사용에 의해, 또는 직접 주사에 의해, 또는 마이크로입자 폭탄(예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont)의 사용에 의해, 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 트랜스펙션 제제로 코팅함으로써 세포내 투여하거나, 또는 핵으로 진입한다고 알려진 호메오박스-유사 펩티드와 연결하여 그것을 투여함으로써, 그것의 암호화된 다가 DR5-결합 분자의 발현을 촉진하기 위해 생체내 투여될 수 있다(예를 들어, Joliot et al(1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis ," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868 참조). 또는 달리, 핵산은 세포내 도입되고 상동성 재조합에 의해 발현을 위한 숙주 세포 DNA 내에 통합될 수 있다.

본 발명의 다가-DR5-결합 분자의 치료적 또는 예방적 유효량으로 대상을 치료하는 것은 1회 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상은 약 1 내지 10주, 바람직하게 2 내지 8주, 더 바람직하게 3 내지 7주, 더욱더 바람직하게 약 4, 5 또는 6주 동안 매주 1회 이러한 디아바디로 치료된다. 본 발명의 약학적 조성물은 하루 1회, 하루 2회, 또는 하루 3회 투여될 수 있다. 또는 달리, 약학적 조성물은 매주 1회, 매주 2회, 2주마다 1회, 매월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 매년 2회 또는 매년 1회 투여될 수 있다. 또한, 치료에 사용되는 분자의 유효 용량은 특정 치료의 과정에서 증가하거나 감소할 수 있다는 것이 인정될 것이다.

XI. 실시예

지금까지 본 발명이 일반적으로 설명되었으며, 예시의 방식으로 제공되며 명시되지 않는 한 본 발명을 제한하지 않는 이후의 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 것이다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 재료 및 방법에 대한 많은 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

A. 실시예 1: 항-사람 DR5 모노클로날 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 특성화

사람 DR5에 면역특이적으로 결합할 수 있는 2개의 모노클로날 항체를 분리했고, "DR5 mAb 1" 및 "DR5 mAb 2"로 명명했다. 상기 논의된 대로, 이들 항체의 CDR은 상이한 것으로 판명되었다. 이 항체들이 상이한 DR5 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 사람 DR5-Fc 융합 단백질을 제조하고 고정된 표면에 코팅했다. DR5 mAb 1(1 μg/mL)을 바이오틴화해서 대조군 IgG 또는 DR5 mAb 2(10 μg/mL)와 함께 인큐베이션했고, 고정된 바이오틴화된 항체의 양을 측정함으로써 DR5 mAb 1과 (사람 DR5-Fc 융합 단백질에 대한) 결합에 대해 경쟁하는 IgG 또는 DR5 mAb 2 항체의 능력을 평가했다. 추가로, 바이오틴화된 DR5 mAb 2와 결합에 대해 경쟁하는 IgG 또는 DR5 mAb 1 항체의 능력을 평가했다. 이 실험의 결과는 표 5에 나타낸다.

1 μg/mL DR5-Fc 융합 코트		10 μg/mL 경쟁자 mAb
1 μg/mL DR5-Fc 융합 코트		mIgG	DR5 mAb 1	DR5 mAb 2
1 μg/mL 바이오틴화된 DR5 mAb	DR5 mAb 1	2.162	자체	0.826
1 μg/mL 바이오틴화된 DR5 mAb	DR5 mAb 2	2.102	2.377	self

이 실험의 결과는, 과량의 비-바이오틴화된 항체의 존재하에서도 바이오틴화된 항체가 DR5 단백질에 결합할 수 있었음을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 DR5 mAb 1과 DR5 mAb 2가 DR5의 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 보여준다.

DR5 mAb 1 및 DR mAb 2 항체를 더 특성화하기 위해, DR5와 TRAIL 리간드 사이의 결합을 차단하는 이들의 능력을 평가했다. 따라서, 바이오틴화된 DR5 mAb 1, 바이오틴화된 DR5 mAb 2 또는 바이오틴화된 DR5-Fc 융합체(각각 2 μg/mL)를 따로따로 버퍼 또는 히스티딘 택 TRAIL(20 μg/mL)의 존재하에 고정된 DR5-Fc 융합체(1 μg/mL)와 함께 인큐베이션했다. 고정된 바이오틴화된 항체의 양을 평가했다. 이 실험의 결과는 표 6에 나타낸다.

2 μg/mL 바이오틴화된 DR5 mAb	1 μg/mL DR5-Fc 융합체 코트		1 μg/mL TRAIL-His 코트
2 μg/mL 바이오틴화된 DR5 mAb	20 μg/mL TRAIL-His	버퍼	1 μg/mL TRAIL-His 코트
DR5 mAb 1	1.939	2.118	0.007
DR5 mAb 2	2.052	2.052	0.008
DR5-Fc 융합체	--	--	0.288

이 결과는, 고정된 DR5-Fc에 결합된 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2의 양은 히스티딘 택 TRAIL의 존재에 영향을 받지 않았음을 보여주며, 따라서 DR5 mAb 1도 DR5 mAb 2도 DR5의 TRAIL 리간드 결합 부위를 차단하지 않는다는 것을 나타낸다. 추가로, 항체는 둘 다 히스티딘 택 TRAIL 리간드에 결합할 수 없었다.

B. 실시예 2: 항-사람 DR5 모노클로날 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 종 특이성

항-사람 DR5 모노클로날 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 종 특이성을 평가하기 위해 사람 DR5에 결합하는 항체의 능력을 사이노몰거스 원숭이(마카카 파스시큘라리스)(Macaca fascicularis) DR5에 결합하는 이들의 능력과 비교했다. 이 실험의 결과는 도 5에 도시된다. 이 결과는 두 항체는 모두 사이노몰거스 원숭이 DR5에는 결합할 수 있지만, 이들은 각각 사람 DR5에 대해 더 높은 결합 친화성을 나타낸다는 것을 보여준다.

도 6에 도시된 대로 Biacore 분석을 사용하여 결합의 반응속도학이 조사되었다. 이중특이적 DR5 x CD3 디아바디를 His-택 DR5와 함께 인큐베이션하고, 결합의 반응속도학을 Biacore 분석을 통해서 결정했다. 이용된 디아바디는 DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2(도 6, 패널 A 및 E), DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2(도 6, 패널 B 및 F), DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2(도 6, 패널 C 및 G), 및 DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2(도 6, 패널 D 및 H)였다. 도 6, 패널 A-D는 사람 DR5에 대한 결과를 도시한다. 도 6, 패널 E-H는 사이노몰거스 원숭이 DR5에 대한 결과를 도시한다. 계산된 ka, kd 및 KD는 표 7에 제시된다.

항-DR 항체	사람			사이노몰거스 원숭이
항-DR 항체	ka	kd	KD (nM)	ka	kd	KD (nM)
DR mAb 1	8.5 x 10⁶	1.2 x 10^-3	0.14	4.0 x 10⁶	1.3 x 10^-1	32.5
DR mAb 2	3.4 x 10⁵	2.1 x 10^-4	0.62	2.4 x 10⁵	1.0 x 10^-4	0.42
DR mAb 3	4.2 x 10⁶	3.7 x 10^-2	8.8	3.3 x 10⁶	4.4 x 10^-2	13.3
DR mAb 4	5.4 x 10⁶	1.7 x 10^-2	3.2	2.5 x 10⁶	4.1 x 10^-2	16.4

이 결과는 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2가 기준 항체 DR5 mAb 3 및 DR5 mAb 4에 비해서 변경된 결합 반응속도학을 나타낸다는 것을 증명한다.

C. 실시예 3: 항-사람 DR5 모노클로날 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 종양 세포 특이성

항-사람 DR5 모노클로날 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 종양 세포 특이성이 조사되었다. 정상 조직을 DR5 mAb 1 또는 이소타입 대조군(5 μg/mL)과 접촉시키고 염색의 범위를 시각화했다. 도 7a, 패널 A-L에 도시된 대로, DR5 mAb 1과 이소타입 대조군은 모두 정상 조직의 세포를 표지하는데 실패했다. 반면, DR5 mAb 1은 결장암 조직(도 7b, 패널 A) 및 폐암 조직(도 7b, 패널 B)의 세포를 강하게 표지하는 것으로 판명되었다. 반면, 이소타입 대조군은 어느 조직도 표지하는데 실패했다(도 7b, 패널 C-D). 따라서, 도 7a-7b에 제시된 결과는 DR5 mAb 1이 암세포에 특이적으로 결합할 수 있었음을 나타낸다.

유사하게, 정상 조직을 DR5 mAb 2(5 μg/mL)와 접촉시키고 염색의 규모를 시각화했다. 도 8a, 패널 A-F에 도시된 대로, DR5 mAb 2는 정상 조직의 세포를 표지하는데 실패했다. 반면, DR5 mAb 2는 결장 암 조직(도 8b, 패널 A) 및 폐암 조직(도 8b, 패널 C)의 세포를 강하게 표지하는 것으로 판명되었다. 반면, 이소타입 대조군은 어느 조직도 표지하는데 실패했다(도 8b, 패널 B 및 D). 따라서, 도 8a-8b에 제시된 결과는 DR5 mAb 2가 암세포에 특이적으로 결합할 수 있었음을 나타낸다.

D. 실시예 4: DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디의 종양 세포 세포독성

30:1 또는 20:1의 이펙터 대 표적 세포 비에서 24시간 동안 표적 종양 세포 및 말초혈 단핵세포(PBMC)의 존재하에 이중특이적 DR5 x CD3 디아바디 또는 대조군 디아바디를 인큐베이션함으로써 세포독성을 매개하는 본 발명의 DR5-결합 분자의 능력을 평가했다. 손상된 세포에 의한 매질에 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 방출을 측정함으로써 세포독성 퍼센트를 결정했다.

이 조사를 위해, 도 1에 도시된 구조를 가진 "DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2"로 명명된 예시적인 이중특이적 디아바디를 항-사람 DR5 항체 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인과 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 갖도록 구성했다(디아바디는 DR5 및 CD3에 대해 1가이다). 이 디아바디는 두 폴리펩티드 사슬로 이루어졌다. 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬은 DR5 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)에 상응하는 아미노산 잔기 1-107, 개재 스페이서 펩티드(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하는 잔기 108-115, D65G 치환을 가진 CD3 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:112)에 상응하는 잔기 116-240, ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하는 잔기 241-245 및 시스테인-함유 E-코일 도메인(SEQ ID NO:41)에 상응하는 잔기 246-273을 포함한다.

DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬은 CD3 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:104)에 상응하는 아미노산 잔기 1-110, 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하는 잔기 111-118, DR5 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)에 상응하는 잔기 119-237, ASTKG 링커(SEQ ID NO:47)에 상응하는 잔기 238-242, 및 시스테인-함유 K-코일 도메인(SEQ ID NO:42)에 상응하는 잔기 243-270을 포함한다.

이용된 대조군 디아바디는 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VL 및 VH 도메인(각각 SEQ ID NO:114 및 115)와 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인(각각 SEQ ID NO:102 및 108)을 함유했고, 항-플루오레세인 x 항-CD3 대조군 디아바디 "4-4-20 x CD3 mAb 2"로 명명되었다. 이 디아바디는 두 폴리펩티드 사슬로 이루어졌다. 디아바디의 제1 폴리펩티드 사슬은 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VL 도메인(SEQ ID NO: 114)에 상응하는 아미노산 잔기 1-112, 개재 스페이서펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하는 잔기 113-120, CD3 mAb 2의 VH 도메인(SEQ ID NO:108)에 상응하는 잔기 121-245, 시스테인-함유 스페이서 펩티드(GGCGGG)(SEQ ID NO:34)에 상응하는 잔기 246-251, 및 E-코일 도메인(SEQ ID NO:39)에 상응하는 잔기 252-280을 포함한다. 4-4-20 x CD3 mAb 2 디아바디의 제2 폴리펩티드 사슬은 CD3 mAb 2의 VL 도메인(SEQ ID NO:114)에 상응하는 아미노산 잔기 1-110, 개재 스페이서 펩티드 GGGSGGGG(링커 1)(SEQ ID NO:33)에 상응하는 잔기 111-118, 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VH 도메인(SEQ ID NO:115)에 상응하는 잔기 119-236, 시스테인-함유 스페이서 펩티드(GGCGGG)(SEQ ID NO:34)에 상응하는 잔기 237-242, 및 K-코일 도메인 (SEQ ID NO:40)에 상응하는 잔기 243-270을 포함한다.

이 조사의 결과는 도 9a-9k에 도시된다. 이용된 표적 종양 세포는 786 O 신장 세포 선암종 세포(도 9a), A498 신장 암종 세포(도 9b), AsPC1 췌장 선암종 세포(도 9c), LNCap 안드로겐-민감성 사람 전립선 선암종 세포(도 9d), SW48 결직장 선암종 세포(도 9e), A549 선암종성 사람 폐포 기저 상피 세포(도 9f), SKMES 사람 폐암 세포(도 9g), DU145 사람 전립선 암세포(도 9h), A375 사람 악성 흑색종 세포(도 9i), SKBR3 사람 HER2-과발현 유방 암종 세포(도 9j) 및 JIMT 사람 유방 암종 세포(도 9k)였다. 이 결과는 DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디가 암세포에 대한 강력한 세포독성 공격을 매개할 수 있었음을 나타낸다.

E. 실시예 5: DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 예상외의 우수성

세포독성을 매개하는 본 발명의 DR5-결합 분자 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 능력을 기준 항-DR5 항체: DR5 mAb 3 및 DR5 mAb 4와 비교했다. 이러한 비교를 위해 이들 항-DR5 항체의 VL 및 VH 도메인과 CD3 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 함유하는 도 1에 도시된 구조를 가진 이중특이적 DR5 x CD3 디아바디를 상기 설명된 대로 제조했다. 제조된 제1 및 제2 디아바디를 "DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2"; "DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2"; "DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2"; 및 "DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2"로 명명했다.

표적 종양 세포를 20:1의 이펙터 대 표적 세포 비에서 24시간 동안 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 표적 종양 세포의 존재하에 이들 디아바디 중 하나 또는 대조군 디아바디(4-4-20 x CD3 mAb 2)와 함께 인큐베이션했다. 손상된 세포에 의한 매질에 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 방출을 측정함으로써 세포독성 퍼센트를 결정했다.

이 조사의 결과는 도 10a-10f에 도시된다. 이용된 표적 종양 세포는 A549 선암종성 사람 폐포 기저 상피세포(도 10a), SKMES 사람 폐암 세포(도 10b), DU145 사람 전립선 암세포(도 10c), A375 사람 악성 흑색종 세포(도 10d), SKBR3 사람 HER2-과발현 유방 암종 세포(도 10e) 및 JIMT 사람 유방 암종 세포(도 10f)였다. 이 결과는 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인이 기준 DR5 mAb보다 세포독성을 유도하는데 있어서 유의하게 예상외로 더욱 강력하다는 것을 나타낸다.

F. 실시예 6: DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 이중 동시 결합

DR5 및 CD3에 동시에 결합하는 본 발명의 DR5 x CD3 디아바디의 능력을 증명하기 위해 가용성 사람 DR5(히스티딘 택)를 지지체 표면에 코팅했다. 다음에, 지지체를 DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디 또는 그것의 사람화된 유도체: hDR5 mAb 2(2.2) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.3) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.4) x CD3 mAb 2, 또는 hDR5 mAb 2(2.5) x CD3 mAb 2 중 하나와 함께 인큐베이션했다. 이후, 바이오틴과 콘쥬게이션된 CD3를 제공하고, 지지체에 고정된 CD3의 양을 측정했다.

이 실험의 결과는 도 11에 도시된다. 모든 디아바디는 DR5와 CD3에 동시에 결합할 수 있는 것으로 판명되었다.

G. 실시예 7: DR5 mAb 2의 사람화된 유도체의 세포독성

세포독성을 매개하는 본 발명의 사람화된 DR5 mAb 2 x CD3 디아바디의 능력을 증명하기 위해 DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 디아바디 또는 그것의 사람화된 유도체: hDR5 mAb 2(2.2) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.3) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2(2.4) x CD3 mAb 2, 또는 hDR5 mAb 2(2.5) x CD3 mAb 2 중 하나를 pan T 세포 및 루시페라아제(luc) 리포터 유전자(Colo205-Luc 세포)를 발현하도록 조작된 표적 Colo206 결직장 암종 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션했다(10:1의 이펙터 대 표적 비). 세포의 세포용해시 루시페라제의 방출에 의해 야기되는 발광의 증가에 의해 세포독성을 측정했다.

이 조사의 결과는 도 12에 도시된다. DR5 mAb 2 x CD3 디아바디는 각각 결직장 암종 세포의 세포독성을 매개할 수 있는 것으로 판명되었다.

H. 실시예 8: DR5 mAb 단독, 가교된 형태 또는 조합의 세포독성

본 발명의 DR5-결합 분자 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 세포독성을 비-방사성활성 세포 증식 분석을 사용하여 다수의 셀라인에서 시험했다. DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2 단독, 가교된 형태 또는 조합의 활성을 시험했다.

ATCC로부터 획득된 셀라인을 표준 조직 배양 조건하에 배양했다. 각 셀라인을 ~2x10⁴ 세포/웰(96-웰 플레이트)로 평판하고, 10% FBS로 보충된 F12/DMEM 배지에서 하룻밤 인큐베이션했다. 별도의 웰(3개 복제)을, DR5 mAb를 가교결합하기 위해 DR5 항체 후 1시간 뒤에 첨가된 0, 또는 1 μg/ml의 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2 ± 10 μg/ml 염소 항-마우스 IgG Fc 항체("αmFc")로, 또는 각각 1 μg/ml의 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2(총 2 μg/ml 항-DR5 항체)로 처리하고 2일 동안 인큐베이션했다. 세포 생육성을, MTS의 세포성 환원에 의해 생성된 가용성 포마잔의 양을 분석하기 위한 제조자의 지시에 설명된 대로 Promega CellTiter 96® AQeous 비-방사성활성 세포 증식 분석(Cat # G5430)을 사용하여 결정했으며, 이것은 배양물에서 생육성 세포의 수의 측정이다. 간단히 말해서, MTS/PMS 시약을 웰에 첨가하고, 490nm(기준 650nm) 흡광도를 Molecular Devices ThermoMax 마이크로플레이트 리더에서 판독했다.

테스트 물품으로 처리된 세포의 세포 생육성을 100%로 설정된 음성 대조군(배지 단독)에 대해 정규화하여 "배지 대조군 %"를 제공했다. 억제 % = 100% - 배지 대조군 %이고 표 8에 제공되며, 여기서 더 큰 값은 테스트 물품의 세포독성을 반영하는 더 큰 성장 억제를 나타낸다. 유사한 연구를 ~10^-3 nM 내지 ~10² nM의 항-DR5 mAb 농도 범위에 걸쳐서 수행했다. COLO205 세포에 대한 데이터가 도 13에 제공되며, 이것은 본 발명의 항체에 민감한 셀라인의 대표이다.

이 결과는 DR5 mAb 1나 DR5 mAb 2 단독으로는 시험된 셀라인 중 어느 것에서도 세포 성장을 억제할 수 없다는 것을 나타내며, 이는 항체 단독은 작동제가 아님을 시사한다. 그러나, DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2는 각각 염소 항-마우스 IgG Fc 항체에 의해 가교되었을 때는 다수의 셀라인에서 강력한 세포독성을 나타냈다. 특히, 본 발명의 가교된 DR5 mAb로 처리되었을 때 COLO205, SW48, SW948, A498 및 SKMES 셀라인의 성장이 극적으로 감소되었다.

놀랍게도, DR5 mAb 1과 DR5 mAb 2의 조합은 또한 가교결합의 부재하에 몇몇 셀라인(예를 들어, COLO205 및 SW948)의 성장을 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, DR5 mAb 1과 DR5 mAb 2의 조합은 항체 단독에서는 볼 수 없는 작동제 활성을 나타낸다. 이들 데이터는 항-DR5 항체의 조합이 단일 항체가 효과적이지 않은 치료 환경에서 DR5를 작동시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

억제 % (평균)		DR5 mAb 1	DR5 mAb 1 +αmFc	DR5 mAb 2	DR5 mAb 2 +αmFc	DR5 mAb 1 + DR5 mAb 2
유방	BT474	2.26	16.13	2.84	12.84	4.98
	MCF7	2.47	12.59	3.98	11.2	2.96
	MDA-MB-175VII	1.6	10.83	1.09	10.99	2.78
	MDA-MB-231	1.79	20.78	4.47	12.59	10.14
	MDA-MB-361	1.54	16.8	1.98	11.51	3.39
	SKBR3	1.97	23.91	2.55	10.98	6.12
위	NCI-N87	1.6	16.99	0.67	10.78	1.46
위	Hs746T	2.83	11.02	1.25	10.6	4.62
췌장	AsPC1	1.73	18.38	0.13	10.65	2.87
	HPAFII	2.86	12.1	2.68	10.63	2.4
	Hs700T	1.21	20.54	0.99	16.12	7.14
결장	COLO205	3.5	89.06	3.61	69.73	29.31
	HT29	0.68	22.47	0.87	14.58	4.15
	SW48	2.65	60.95	2.44	58.12	14.63
	SW948	3.53	79.23	1.76	71.26	50.48
신장	786O	0.91	11.09	1.79	10.54	9.03
	A498	0.89	78.9	1.92	50.35	10.4
	CaKi2	0.55	30.09	2.64	11.08	2.5
폐	A549	2.79	10.89	4.25	10.71	0.79
	Calu3	2.86	12.79	2.06	10.02	5.46
	SKMES	1.75	77.59	1.28	69.93	18.67
난소	ES2	3.31	14.83	1.88	13.7	5.92
난소	SKOV3	3.16	19.28	2.02	15.11	3.35
전립선	22RV1	3.03	10.92	3.89	10.8	1.64
	DU145	1.66	18.77	2.09	15.93	2.75
	LNCap	2.1	20.17	1.72	19.26	10.37
	PC3	2.79	16.1	2.19	13.84	5.16

I. 실시예 9: DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 세포독성은 세포자멸성이다

DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 세포독성 메커니즘이 조사되었다. 구체적으로, 세포자멸의 세 가지 상이한 측정: (i) 뉴클레오솜 부화, (ii) PARP 절단, 및 (iii) 활성 카스파아제 3을, DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2로 단독으로 또는 DR5 mAb를 가교결합시키기 위한 αmFc의 존재하에 처리된 COLO205 세포에서 이용했다.

모든 분석에서 COLO205 세포를 ~10⁴ 세포/웰(96-웰 플레이트에서)로 평판하고, 10% FBS로 보충된 F12/DMEM 배지에서 하룻밤 인큐베이션했다. 별도의 웰을 0, 또는 1 μg/ml의 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2 ± 10 μg/ml αmFc(DR5 항체 후 1시간 뒤에 첨가)로 처리하고 4시간 동안 인큐베이션했다.

뉴클레오솜 부화(도 14a)를 Roche Cell Death Detection ELISA^PLUS 분석(Cat# 1774425)을 사용하여 분석을 위한 제조자의 지시에 설명된 대로 결정했다. 간단히 말해서, 인큐베이션 후, 세포를 세포용해 버퍼에서 용해하고 투명하게 만들었다. 투명해진 세포용해액을 스트렙트아비딘-코팅된 ELISA 플레이트에서 항-히스톤-바이오틴/항-DNA-POD 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하고, 다음에 플레이트를 세척해서 ABTS 시약을 첨가하고, 405nm(기준 490nm) 흡광도를 Molecular Devices ThermoMax 마이크로플레이트 리더에서 판독했다. 식: 부화 인수 = 샘플(염색/사멸된 세포)의 mU/상응하는 음성 대조군(항체 처리가 없는 세포)의 mU(여기서 mU = 흡광도 [10^-3])를 사용하여 계산된 부화 인수(세포질에 방출된 뉴클레오솜의 측정)가 도 14a에 플롯팅된다.

PARP 절단 및 활성 카스파아제3(각각 도 14b 및 14c)을 MILLIPLEX MAP Human Late Apoptosis Magnetic Bead 3-Plex 키트 - 세포 신호화 멀티플렉스 분석(Cat. # 48-670)을 사용하여 분석을 위한 제조자의 지시에 설명된 대로 결정했다. 간단히 말해서, 인큐베이션 후, 세포를 세포용해 버퍼에서 용해하고 투명하게 만들었다. 투명해진 세포용해액을 기준 비드-콘쥬게이트된 1차와 함께 인큐베이션한 후 세척하고, 각각의 바이오틴화된 2차 항체와 함께 인큐베이션했다. 다음에, 플레이트를 스트렙트아비딘-PE(SAPE)와 함께 인큐베이션한 후 세척하고, 분석 버퍼를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 XY 플랫폼을 가진 Luminex LX-100 시스템에서 판독했다. 결과는 도 14b(절단된 PARP) 및 도 14a(활성 카스파아제 3)에 플롯팅된다.

세포자멸의 모든 세 가지 측정은 가교결합된 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2로 처리된 세포 배양물에서 증가하며, 이는 보여진 세포독성이 세포자멸의 결과임을 증명한다.

J. 실시예 10: 4가 DR5-결합 분자

DR5-결합 분자에 대한 원자가의 영향을 시험하기 위해 DR5에 4가인 분자를 생성했다. 이 실시예에서, E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디가 제조되었다. 이들 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디의 몇몇은 다음의 실시예에서 특성화되었다. 이러한 다가 DR5-결합 분자는 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어졌다.

제1 폴리펩티드 사슬은 일반적인 서열: [VL1 도메인]―[GGGSGGGG]―[VH2 도메인]―[ASTKG]―[EVAACEK(EVAALEK)₃]―[LEPKSS]―[DKTHTCPPCP]―Fc 영역(야생형 또는 L234A/L235A 이중 돌연변이)(231 EU 넘버링으로부터 시작함)을 가지며, 여기서 VL1은 항-DR5 항체로부터이고, [GGGSGGGG]는 SEQ ID NO:33이고, VH2는 항-DR5 항체로부터이고, [ASTKG]는 SEQ ID NO:47이고, [EVAACEK(EVAALEK)₃]은 SEQ ID NO:41이고, [LEPKSS]는 SEQ ID NO:49이고, [DKTHTCPPCP]는 SEQ ID NO:48이고, Fc 영역은 SEQ ID NO:1(야생형) 또는 SEQ ID NO:102(L234A/L235L 돌연변이)이며, 선택적으로 C-말단 아미노산 잔기를 결여한다.

제2 폴리펩티드 사슬은 일반적인 서열: [VL2 도메인]―[GGGSGGGG]―[VH1 도메인]―[ASTKG]―[KVAACKE(KVAALKE)₃]을 가지며, 여기서 VL2는 항-DR5 항체로부터이고, [GGGSGGGG]는 SEQ ID NO:33이고, VH1은 항-DR5 항체로부터이고, [ASTKG]는 SEQ ID NO:47이고, [KVAACKE(KVAALKE)₃]은 SEQ ID NO:42이다.

사슬들은 도 4b에 도시된 대로 조립된다. 제1 폴리펩티드 사슬의 VL1 도메인은 제2 폴리펩티드 사슬의 VH1 도메인과 상호작용하여 DR5에 특이적인 제1 기능적 항원-결합 부위를 형성한다. 마찬가지로, 제2 폴리펩티드 사슬의 VL2 도메인은 제1 폴리펩티드 사슬의 VH2 도메인과 상호작용하여 DR5에 또한 특이적인 제2 기능적 항원-결합 부위를 형성한다. 따라서, 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인의 선택은, 디아바디의 두 폴리펩티드 사슬이 종합적으로 DR5의 적어도 하나의 에피토프에 결합할 수 있는 VL 및 VH 도메인을 포함하도록 조화된다. 모든 동일한 VL 및 VH 도메인(예를 들어, 모든 VL 및 VH 도메인이 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2로부터이다)을 가진 분자는 단일특이적이며(즉, DR5의 단일 에피토프에 결합) DR5에 대해 4가이다. DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 가진 분자는 이중특이적이지만(즉, DR5의 두 상이한 에피토프에 결합), DR5에 대해서는 여전히 4가이다. DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 예시적인 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디가 제공된다. 그러나, DR5에 대해 4가인 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디는 임의의 항-DR5 항체의 VL 및 VH 도메인을 사용하여 제조될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 유사하게, 여기 설명된 것들과 같은 하나 이상의 항-DR5 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 상기 설명된 것들과 같은 대용 구성물이 제조될 수 있다.

각 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디에 대한 제1 및 제2 사슬의 VL, VH 및 Fc 영역, 뿐만 아니라 SEQ ID NO: (폴리펩티드)들이 표 9에 요약된다. 또한, 조립된 분자에 대한 독특한 명칭이 제공된다. 폴리펩티드 사슬 및 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 완전한 서열은 상기 제공된다. 표 9에 제공된 분자 중 몇몇은 이중특이적인데, 즉 이들은 2개의 상이한 DR5 에피토프에 결합하며, 모두 DR5에 대해 4가이다.

두 상이한 DR5 에피토프에 결합하는 분자
명칭	부분	제1 사슬	제2 사슬
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디	VL	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]
	VH	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:116]	[SEQ ID NO:118]
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디 (AA)	VL	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]
	VH	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:120]	[SEQ ID NO:118]
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디	VL	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]
	VH	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:122]	[SEQ ID NO:124]
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디 (AA)	VL	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]
	VH	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	SEQ ID NOs:	[SEQ ID NO:126]	[SEQ ID NO:124]
하나의 DR5 에피토프에 결합하는 분자
명칭	부분	제1 사슬	제2 사슬
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디	VL	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]
	VH	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:128]	[SEQ ID NO:130]
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디 (AA)	VL	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:3]
	VH	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]	DR5 mAb 1 [SEQ ID NO:8]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:132]	[SEQ ID NO:130]
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디	VL	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]
	VH	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:134]	[SEQ ID NO:136]
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디 (AA)	VL	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:13]
	VH	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]	DR5 mAb 2 [SEQ ID NO:18]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:138]	[SEQ ID NO:136]
hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 디아바디	VL	hDR5 mAb 2 VL-2 [SEQ ID NO:23]	hDR5 mAb 2 VL-2 [SEQ ID NO:23]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:140]	[SEQ ID NO:142]
hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc 디아바디 (AA)	VL	hDR5 mAb 2 VL-2 [SEQ ID NO:23]	hDR5 mAb 2 VL-2 [SEQ ID NO:23]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:144]	[SEQ ID NO:142]
hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 디아바디	VL	hDR5 mAb 2 VL-3 [SEQ ID NO:25]	hDR5 mAb 2 VL-3 [SEQ ID NO:25]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:146]	[SEQ ID NO:148]
hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc 디아바디 (AA)	VL	hDR5 mAb 2 VL-3 [SEQ ID NO:25]	hDR5 mAb 2 VL-3 [SEQ ID NO:25]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:150]	[SEQ ID NO:148]
hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc 디아바디	VL	hDR5 mAb 2 VL-4 [SEQ ID NO:27]	hDR5 mAb 2 VL-4 [SEQ ID NO:27]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:152]	[SEQ ID NO:154]
hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc 디아바디 (AA)	VL	hDR5 mAb 2 VL-4 [SEQ ID NO:27]	hDR5 mAb 2 VL-4 [SEQ ID NO:27]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:156]	[SEQ ID NO:154]
hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc 디아바디	VL	hDR5 mAb 2 VL-5 [SEQ ID NO:29]	hDR5 mAb 2 VL-5 [SEQ ID NO:29]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	야생형 [SEQ ID NO:1]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:158]	[SEQ ID NO:160]
hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc 디아바디 (AA)	VL	hDR5 mAb 2 VL-5 [SEQ ID NO:29]	hDR5 mAb 2 VL-5 [SEQ ID NO:29]
	VH	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]	hDR5 mAb 2 VH-2 [SEQ ID NO:31]
	Fc	L234A/L235A [SEQ ID NO:102]	n/a
	폴리펩티드 서열	[SEQ ID NO:162]	[SEQ ID NO:160]

K. 실시예 11: DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2를 함유하는 이중특이적 4가 DR5-결합 분자의 종양 세포 특이성

대표적인 이중특이적 4가 DR5-결합 분자(DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디)의 종양 세포 특이성이 조사되었다. 정상 조직을 표지된 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디 또는 표지된 대조군 디아바디(4-4-20 x CD3 mAb 2, 실시예 4에 설명됨)와 0.625 μg/mL로 접촉시키고 염색의 범위를 시각화했다. 도 15a-b에 도시된 대로, DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디와 대조군 디아바디는 모두 정상 조직의 세포를 표지하는데 실패했다. 유사한 결과가 도 15b에 도시된 대로 간을 포함하는 정상 조직의 추가 샘플에서 보였다. 반면, DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디는 유방암 조직(도 16, 패널 A), 결장암 조직(도 16, 패널 B), 폐암 조직(도 16, 패널 C) 및 전립선암 조직(도 16, 패널 D)의 세포를 강하게 표지하는 것으로 판명되었다. 반면, 대조군 디아바디는 어느 조직도 표지하는데 실패했다(도 16, 패널 E-H). 조직학적 관찰의 요약이 표 10에 제공된다. 따라서, 도 15a-15b, 16 및 표 10에 제시된 결과는 4가 DR5-결합 분자(DR5의 2개의 에피토프에 대해 이중특이적)가 암세포에 특이적으로 결합할 수 있었음을 나타낸다.

조직/세포	DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디 0.625 ug/mL	대조군 DART 0.625 ug/mL
결장(6N)	-	±/-
폐(6N)	대식세포 2+ (c) 희귀; 엔도 2+ (c) 매우 희귀; 기타 (-)	-
간(6N)	-	-
신장(6N)	-	-
심장(6N)	-	-
췌장(6N)	선택된 입상 상피 ± (c) 매우 희귀	±/-
COLO205	4+ (m)	-
CHO	-	-
MDA-MB-175VII	1+	-
MDA-MD-231	3+ (c,m)	-
간(3N)	-	-
폐	엔도 1+ (c) 매우 희귀; 기타 (-)	-
폐	대식세포 3+ (c,m) 가끔; 가능한 타입 II 폐세포 2-3+ (c,m) 희귀	-
폐	대식세포 3+ (c) 가끔 타입 II 폐세포와 혼합됨	-

L. 실시예 12: 4가 DR5-결합 분자의 세포독성

본 발명의 4가 DR5-결합 분자의 세포독성이 조사되었다. 2개의 예시적인 이중특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디; 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디), 및 4개의 예시적인 단일특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디; DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA); DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디; 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA), 여기서 "AA"는 L234A/L235A 돌연변이를 말함)의 활성을 다수의 셀라인 상에서, 가교결합 항체가 테스트 샘플 중 어느 것에도 첨가되지 않은 것을 제외하고 상기 설명된 대로 비-방사성활성 세포 증식 분석을 사용하여 시험했다. His-택 TRAIL(R&D systems)을 양성 대조군으로 사용했다.

테스트 물품으로 처리된 세포의 세포 생육성을 100%로 설정된 음성 대조군(배지 단독)에 대해 정규화하여 "배지 대조군 %"를 제공했다. 억제 % = 100% - 배지 대조군 %이고 표 11에 제공되며, 여기서 더 큰 값은 테스트 물품의 세포독성을 반영하는 더 큰 성장 억제를 나타낸다. 유사한 연구를 ~10^-3 nM 내지 ~10² nM의 항-DR5 mAb 농도 범위에 걸쳐서 수행했다. 도 17은 몇몇 반응성 셀라인 COLO205(도 17a), A498(도 17b), 및 SKMES(도 17c)에 대한 데이터를 도시한다.

억제 % (평균)		DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디	DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디
유방	BT474	3.96	2.62
	MCF7	6.03	6.27
	MDA-MB-175VII	3.36	2.96
	MDA-MB-231	15.24	14.03
	MDA-MB-361	5.35	3.61
	SKBR3	13.07	8.47
위	NCI-N87	10.62	5.01
위	Hs746T	5.94	5.09
췌장	AsPC1	15.01	12.7
	HPAFII	10.05	10.1
	Hs700T	17.89	13.38
결장	COLO205	88.89	88.53
	HT29	16.2	11.02
	SW48	39.81	33.53
	SW948	78.33	77.91
신장	786O	5.62	5.13
	A498	81.47	74.27
	CaKi2	36.9	31.66
폐	A549	2.63	2.8
	Calu3	15.18	18.01
	SKMES	75.6	68.97
난소	ES2	8.44	12.25
난소	SKOV3	13.02	9.95
전립선	22RV1	1.83	2.95
	DU145	12.14	12.34
	LNCap	11.82	12.71
	PC3	10.54	10.79

이 결과는 모든 4가 DR5-결합 분자가 다수의 셀라인에서 강력한 세포독성을 가진다는 것을 나타낸다. 실제로, 모든 4가 DR5-결합 분자는 TRAIL 자체보다 더욱 강력했다. 특히, 본 발명의 4가 DR5-결합 분자로 처리되었을 때 COLO205, SW48, SW948, A498, CaKi2 및 SKMES의 성장이 극적으로 감소되었다. L234A/L235A Fc 영역을 지닌 4가 DR5-결합 분자는 야생형 Fc 영역을 지닌 대응 분자와 유사하거나 약간 더 높은 세포독성을 나타냈으며, 이는 FcγR에 대한 감소된 결합 및/또는 감소된 이펙터 기능을 가진 Fc 영역은, FcγR에 대한 결합 및/또는 이펙터 기능이 필요하지 않고 및/또는 바람직하지 않은 경우에 4가 DR5-결합 분자에 통합될 수 있다는 것을 나타낸다.

M. 실시예 13: 4가 DR5-결합 분자는 세포자멸을 유도한다

세포자멸을 유도하는 본 발명의 4가 DR5-결합 분자의 능력이 조사되었다. 2개의 예시적인 이중특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디; 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디), 및 2개의 예시적인 단일특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디; 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디)의 활성을 COLO205, A496, SKMES, LNCap, MDA-MB-231 및 Hs700T 셀라인에서 시험했다. 이 조사는 가교결합 항체가 테스트 샘플에 첨가되지 않은 것을 제외하고 상기 설명된 대로 뉴클레오솜 부화 분석을 사용하여 수행되었다. His-택 TRAIL(R&D systems)을 양성 대조군으로 사용했다. 부화 인수(상기 설명된 대로 계산됨)는 도 18에 플롯팅된다.

이 결과는 모든 4가 DR5-결합 분자가 세포자멸의 강력한 유도제라는 것을 나타낸다. 실제로, 모든 4가 DR5-결합 분자는 동일한 셀라인에서 양성 대조군의 경우에 보이는 것과 유사한 부화 인수를 가졌다.

N. 실시예 14: 4가 DR5-결합 분자의 세포독성

본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 세포독성을 세포 증식 분석에서 이미 보고된 항체 DR5 mAb 8(KMTR2) 및 DR5 mAb 4(코나투무맙)와 비교했다. 1개의 예시적인 이중특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)); 2개의 예시적인 단일특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA); 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)); 항-DR5 항체 DR5 mAb 8(AA)(KMTR2); 및 항-DR5 항체 DR5 mAb 4(AA)(코나투무맙)의 활성을 COLO205 상에서 가교의 존재 및 부재하에("AA"는 L234A/L235A 돌연변이를 말한다), 가교결합 항체가 DR5 mAb 4의 1개의 테스트 샘플에만 첨가된 것을 제외하고 상기 설명된 대로 비-방사성활성 세포 증식 분석을 사용하여 약 10^-3 nM 내지 약 10² nM의 농도 범위에 걸쳐서 시험했다. His-택 TRAIL(R&D systems)을 양성 대조군으로 사용했다.

테스트 물품으로 처리된 세포의 세포 생육성을 100%로 설정된 음성 대조군(배지 단독)에 대해 정규화하여 "배지 대조군 %"를 제공했다. 억제 % = 100% - 배지 대조군 %가 도 19에 플롯팅된다.

이 결과는 시험된 모든 4가 DR5-결합 분자 강력한 세포독성을 가지며, 이것은 가교결합에 독립적이고, 이미 설명된 항-DR5 항체 DR5 mAb 8(KMTR2); 및 DR5 mAb 4(코나투무맙)보다 더욱 강력하다는 것을 나타낸다.

O. 실시예 15: 암 줄기세포-유사(CSCL)세포에 대한 4가 DR5-결합 분자의 세포독성

암 줄기세포-유사(CSLC) 세포에 대한 본 발명의 다가 DR5-결합 분자의 세포독성이 조사되었다. RECA0201은 중간 정도로 분화된 직장 선암종(돌연변이된 APC 및 KRAS; CD44hi, CD133+ 및 A33+)으로부터 분리된 CSCL 세포이다. RECA0201 세포는 종양형성성이며, 생체내 종양 형태 및 다-계통 분화 또는 시험관내 기관모양 형성을 반복할 수 있다.

RECA0201 세포에 대한 1개의 예시적인 이중특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)); 2개의 예시적인 단일특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA); 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디(AA)); 2개의 항-DR5 항체(DR5 mAb 8(AA)(KMTR2); 및 DR5 mAb 4(AA)(코나투무맙))(여기서 "AA"는 L234A/L235A 돌연변이를 말한다)의 세포독성 활성을 비-방사성활성 세포독성 분석을 사용하여 농도 범위에 걸쳐서 시험했다. 간단히 말해서, 구성적으로 발현된 루시페라아제로 안정하게 트랜스펙션된 20,000개 세포 RECA0201 결장암 CSCL 세포를 웰당 평판하고, 테스트 물품의 제시된 농도에 노출한다. 48시간 후, 제조자에 의해 설명된 대로 Victor 플레이트 리더에서 Promega STEADY GLO® 기질 시약을 사용하여 루시페라아제의 측정을 통해서 세포 생육성의 수준을 결정한다. 결과는 도 20에 플롯팅된다.

도 20에 도시된 대로, 4가 DR5-결합 분자는 CSCL RECA0201 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타냈다. 실제로, 이 결과는 모든 4가 DR5-결합 분자가 이미 설명된 항-DR5 항체 DR5 mAb 8(KMTR2); 및 DR5 mAb 4(코나투무맙)보다 더욱 강력하며, TRAIL 자체보다 더욱 강력하다는 것을 나타낸다.

P. 실시예 16: COLO205 종양 세포가 이식된 마우스에서 4가 DR5-결합 분자에 의한 종양 성장의 억제

예시적인 단일특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디(AA)); 및 2개의 항-DR5 항체(DR5 mAb 8 (AA)(KMTR2), 및 DR5 mAb 4(AA)(코나투무맙))(여기서 "AA"는 L234A/L235A 돌연변이를 말한다)의 항-종양 활성을 이종이식편 종양 모델에서 평가했다. 간단히 말해서, Matrigel과 1:1 혼합된 Ham's F12 배지 200μL에 현탁된 5백만 개의 COLO205 세포를 제0일에 암컷 hCD16A FOX N1 마우스(n = 7/그룹)에 피하(SC) 이식했다. 캘리퍼로 3-4일마다 종양을 측정했다. 연구 제3일에 마우스를 종양 크기에 기초하여 무작위화하고, 테스트 물품 또는 비히클(0.5% 소 혈청 알부민을 함유하는 멸균 식염수)의 제시된 용량 수준으로 매주 2회 치료했다(정맥내(IV) 주사). 연구 과정 동안 종양 부피를 모니터했고, 이것은 그룹 평균 ± SEM으로서 도 21에 플롯팅된다. 4가 DR5-결합 분자는 연구 과정 동안 종양 성장을 극적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 종양은 0.5 및 0.05 mg/kg 치료 그룹에서 퇴행한 것으로 나타났다.

Q. 히스톤 디아세틸라아제 억제제는 4가 DR5-결합 분자와 상승작용한다

보리노스타트와 같은 히스톤 디아세틸라아제(HDAC)는 종양 세포를 DR5를 통해서 유도되는 세포자멸에 민감하게 만드는 것으로 보고되었다. HDAC 억제제 보리노스타트와 조합된 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, 및 몇몇 4가 DR5-결합 분자의 세포독성 활성을 비-방사성활성 세포 증식 분석을 사용하여 조사했다.

이들 연구에서 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, 2개의 예시적인 이중특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디; 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디), 및 2개의 예시적인 단일특이적 4가 E-코일/K-코일-Fc 영역-함유 디아바디(DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디; 및 DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디)의 활성이 시험되었다. His-택 TRAIL(R&D systems)이 양성 대조군으로 사용되었다.

1차 연구를 위해, COLO205 세포를 ~2x10⁴ 세포/웰(96-웰 플레이트)로 평판하고, 10% FBS로 보충된 F12/DMEM 배지에서 하룻밤 인큐베이션했다. 별도의 웰(3개 복제)을 0, 또는 1 μg/ml의 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2, 10 ng/ml 4가 DR5-결합 분자(이전 세포독성 연구에서 사용된 것보다 100배 적은 양), 또는 His-택 TRAIL ± 0.1 또는 1 μM 보리노스타트로 처리하고 하루 동안 인큐베이션했다. 존재하는 ATP의 양을 분석하기 위한 제조자의 지시에 설명된 대로 Promega CELLTITER-GLO® 발광 세포 생육성 분석(Cat # G5430)을 사용하여 세포 생육성을 결정했으며, 이것은 배양물에서 생육성 세포의 수의 측정이다. 간단히 말해서, CELLTITER-GLO® 시약을 웰에 첨가하고 2분간 혼합해서 세포용해를 유도하고, PerkinElmer EnVision 멀티라벨 플레이트 리더에서 발광을 판독했다.

테스트 물품으로 처리된 세포의 세포 생육성을 100%로 설정된 상응하는 음성 대조군(배지 ± 보리노스타트)에 대해 정규화하며, 이것은 각 테스트 제제 단독에 대한 대조군의 % 또는 보리노스타트와 조합된 각 테스트 제제에 대한 대조군의 %로서 표 12에 보고된다. 100%보다 적은 대조군의 % 값은 생육성의 감소를 나타내며, 테스트 물품 단독 또는 보리노스타트와 조합된 테스트 물품의 세포독성을 반영한다.

COLO205	보리노스타트
평균 대조군 %	0μM‡	0.1μM§	1μM§
10% FBS	100%	100%	100%
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디	64.4%	52.6%	44.8%
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디	84.1%	70.7%	48.9%
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디	64.2%	49.7%	42.9%
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디	75.0%	50.8%	45.6%
DR5 mAb 1	96.8%	96.4%	93.3%
DR5 mAb 2	96.4%	96.5%	95.5%
R&D TRAIL/His	68.7%	54.1%	44.8%
‡배지 대조군 % (10% FBS) §배지 대조군 % (1/10 μM 보리노스타트)

순 이득(평균 성장 억제 %) = 배지 대조군(10% FBS) % - 배지 대조군(1/10 μM 보리노스타트) %이며, 보리노스타트 단독으로 처리된 세포에 비해 보리노스타트와 조합된 테스트 물품의 증가된 세포독성을 표시한다. 1차 연구에서 순 이득이 표 13에 제공된다.

COLO205	보리노스타트
순 이득 (평균 성장 억제 %)	0.1μM	1μM
10% FBS	0	0
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디	12	20
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디	13	35
DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc 디아바디	15	21
DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc 디아바디	24	29
DR5 mAb 1	0	3
DR5 mAb 2	0	1
R&D TRAIL/His	15	24

이 결과는 HDAC 억제제 보리노스타트가 저 용량의 4가 DR5-결합 분자와 상승작용하여 4가 DR5-결합 분자에 민감한 세포에서 이들의 세포독성을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 그러나, 보리노스타트는 비-가교된 항체 DR5 mAb 1 및 DR5 mAb 2와는 상승작용하지 않았다.

2차 연구에서, 보리노스타트와 조합하여 DR5 mAb 1, DR5 mAb 2, 및 몇몇 4가 DR5-결합 분자를 다가 DR5-결합 분자에 감응하지 않는다고 이전에 알려진 몇 개를 포함하여 다수의 셀라인에서 테스트했다. 이 분석은 세포를 0, 또는 1 μg/ml의 DR5 mAb 1 또는 DR5 mAb 2 또는 4가 DR5-결합 분자, 또는 His-택 TRAIL ± 1 또는 10 μM 보리노스타트로 처리한 것을 제외하고 상기 설명된 대로 수행했다.

이 연구에서, 성장 억제의 순 이득(상기 설명된 대로 계산됨)이 표 14(10 μM 보리노스타트와 조합하여 처리) 및 표 15(1 μM 보리노스타트와 조합하여 처리)에 보고된다.

10 μM 보리노스타트

순 이득 (평균 성장 억제 %)		DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc DART	DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc DART	DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc DART	DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc DART	DR5 mAb 1	DR5 mAb 2	R&D TRAIL/His
유방	BT474	75.26	64.18	71.80	54.94	2.15	2.23	50.24
	MCF7	4.96	4.35	4.00	8.76	4.55	5.00	0.79
	MDA-MB-361	83.21	80.65	87.06	62.67	5.11	5.11	64.85
위	Hs746T	38.78	25.69	49.15	22.05	0.20	0.20	31.81
췌장	HPAFII	49.19	45.01	55.42	37.51	1.75	2.86	46.71
폐	A549	36.34	34.95	30.24	20.29	6.48	6.48	26.71
난소	ES2	87.60	89.61	88.11	74.12	4.17	4.17	79.12
전립선	22RV1	5.36	6.32	6.81	7.45	7.49	7.49	8.91
	DU145	1.32	3.43	2.92	3.88	4.18	4.18	4.57
	LNCap	20.41	16.63	20.96	14.37	3.81	4.49	28.73

1 μM 보리노스타트

순 이득 (평균 성장 억제 %)		DR5 mAb 1 x DR5 mAb 2 Fc DART	DR5 mAb 2 x DR5 mAb 1 Fc DART	DR5 mAb 1 x DR5 mAb 1 Fc DART	DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc DART	DR5 mAb 1	DR5 mAb 2	R&D TRAIL/His
유방	MDA-MB-175VII	10.84	10.63	15.84	15.11	0.95	0.95	24.17
유방	SKBR3	38.50	37.04	42.42	34.85	0.69	0.69	43.10
위	NCI-N87	31.47	25.28	38.47	36.43	0.12	0.36	35.97
췌장	AsPC1	14.27	12.91	10.71	12.30	5.11	5.11	11.86
췌장	Hs700T	46.91	43.04	49.75	48.54	0.22	0.22	15.83
신장	786O	21.12	13.49	27.69	18.24	0.64	2.33	31.16
폐	Calu3	10.13	11.03	10.67	13.22	0.11	0.11	9.96
난소	SKOV3	55.63	55.97	60.65	55.49	1.75	1.75	33.93
전립선	PC3	11.32	10.22	11.22	10.85	1.59	1.59	12.49

이 결과는 HDAC 억제제 보리노스타트가 4가 DR5-결합 분자와 상승작용하여 4가 DR5-결합 분자 단독에는 감응하지 않는 세포를 포함하는 세포에 대해 이들의 세포독성을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 특히, 9개 셀라인(MDA-MB-175VII, SKBR3, NCI-N87, AsPC1, Hs700T, 786O, Calu3, SKOV3 및 PC3)은 단지 1 μM의 보리노스타트와 조합된 4가 DR5-결합 분자에도 반응하는 것으로 나타났다. 다른 3개 셀라인(BT474, MDA-MB-361, Hs746T, HPAFII, A549, ES2 및 LNCap)은 10 μM 보리노스타트와 조합된 4가 DR5-결합 분자에 반응하는 것으로 나타났다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는, 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 그 전체가 참고로 포함된다고 구체적으로 그리고 개별적으로 제시된 것과 동일한 정도로 여기 참고로 포함된다. 본 발명은 그것의 구체적인 구체예와 관련하여 설명되었지만, 추가의 변형이 있을 수 있으며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르며 본 발명이 속하는 분야에서 공지되거나 통상 실시되는 것 내에서 본 개시를 벗어난 것을 포함하여 앞서 제시된 본질적인 특징들에 적용될 수 있는, 발명의 임의의 변형, 사용, 또는 개조를 포함하도록 의도된다는 것이 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics Inc. Moore, Paul A Johnson, Leslie S Li, Jonathan C. Shah, Kalpana <120> Multivalent Molecules Comprising DR5-Binding Domains <130> 1301.0118PCT <150> 62/149,139 <151> 2015-04-17 <150> 62/107,871 <151> 2015-01-26 <160> 168 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(218) <223> Human Wild-Type IgG CH2-CH3 Domain <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 440 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(440) <223> human Death Receptor 5 precursor protein <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(440) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(55) <400> 2 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 440 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(111) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Light Chain Variable Region <400> 3 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Phe Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Asp Gly Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Light Chain Variable Region CDRL1 <400> 4 Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Light Chain Variable Region CDRL2 <400> 5 Leu Ser Ser Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Light Chain Variable Region CDRL3 <400> 6 Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(333) <223> Polynucleotide Encoding Anti-DR5 Antibody mAb 1 Light Chain Variable Region <400> 7 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(121) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Heavy Chain Variable Region <400> 8 Glu Val Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Light Chain Variable Region CDRH1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Heavy Chain Variable Region CDRH1 <400> 9 Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Heavy Chain Variable Region CDRH2 <400> 10 Glu Ile Asn Pro Asp Ser Asn Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Asp <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 1 Heavy Chain Variable Region CDRH3 <400> 11 Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> Polynucleotide Encoding Anti-DR5 Antibody mAb 1 Heavy Chain Variable Region <400> 12 gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60 tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120 ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat 180 acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc 300 tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 tcc 363 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Light Chain Variable Region <400> 13 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Lys Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Light Chain Variable Region CDRL1 <400> 14 Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Light Chain Variable Region CDRL2 <400> 15 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Light Chain Variable Region CDRL3 <400> 16 Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(321) <223> Polynucleotide Encoding Anti-DR5 Antibody mAb 2 Light Chain Variable Region <400> 17 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct 240 gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(119) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Heavy Chain Variable Region <400> 18 Lys Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ile Leu His Trp Val Lys Gln Lys Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Heavy Chain Variable Region CDRH1 <400> 19 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Leu His 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Heavy Chain Variable Region CDRH2 <400> 20 Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(10) <223> Anti-DR5 Antibody mAb 2 Heavy Chain Variable Region CDRH3 <400> 21 His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(357) <223> Polynucleotide Encoding Anti-DR5 Antibody mAb 2 Heavy Chain Variable Region <400> 22 aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt tacactgggt aaagcagaag 120 tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac 180 aatgagaaat tcaaggacaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat 240 atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa 300 caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcc 357 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 2 <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 2 <400> 24 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa a 321 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 3 <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 3 <400> 26 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa a 321 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 4 <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 4 <400> 28 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca 240 gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa a 321 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 5 <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 5 <400> 30 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatatcg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa a 321 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-DR5 mAb 2 Heavy Chain Variable Region Variant 2 <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Humanized Anti-DR5 mAb 2 Heavy Chain Variable Region Variant 2 <400> 32 caggtccagc tggtgcagag tggggcagag gtgaaaaagc caggggcatc agtgaaagtg 60 tcttgtaaag catcaggtta tacatttact gagtacatcc tgcactgggt gcgacaggca 120 ccaggacagg gactggaatg gatggggtgg ttctaccctg gcaacaacaa cattaagtac 180 aacgagaagt ttaaagaccg ggtgaccatc acagcggata agtctaccag tacagtctat 240 atggagctga gctccctgag aagcgaagac accgccgtct actattgcgc tcgccacgaa 300 cagggtccag gttactttga ttattggggg cagggaactc tggtcacagt cagctcc 357 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 33 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing Domain ("Linker 2") <400> 34 Gly Gly Cys Gly Gly Gly 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Cysteine-Containing Portion of Human IgG Hinge Domain <400> 35 Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> Cysteine-Containing Portion of Human IgG Hinge Domain <400> 36 Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Cysteine-Containing Portion of Human CL Domain <400> 37 Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> Cysteine-Containing Portion of Human CL Domain <400> 38 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-Coil Heterodimer-Promoting Domain <400> 39 Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25 <210> 40 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Coil Heterodimer-Promoting Domain <400> 40 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 <210> 41 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing E-Coil Heterodimer-Promoting Domain <400> 41 Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Ala 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker ("Linker 3') <400> 50 Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Cysteine-Containing Linker Peptide ("Linker 3") <400> 51 Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 52 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> "Knob-Bearing" CH2-CH3 Domain <400> 52 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 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Polypeptide Chain of an Exemplary DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc diabody <400> 135 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct 240 gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcaaggt ccagctgcag 360 cagtctggag ctgaactggt gaaacccggg gcatcagtga agctgtcctg caaggcttct 420 gggtacacct tcactgagta tattttacac tgggtaaagc agaagtctgg acagggtctt 480 gagtggattg ggtggtttta tcctggaaat aataatataa agtacaatga gaaattcaag 540 gacaaggcca cactgactgc ggacaaatcc tccagcacag tctatatgga acttagtaga 600 ttgacatctg aagactctgc ggtctatttc tgtgcaagac acgaacaagg accaggttac 660 tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 136 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of an Exemplary DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc diabody <400> 136 Asp Ile Val 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ggtggtttta tcctggaaat aataatataa agtacaatga gaaattcaag 540 gacaaggcca cactgactgc ggacaaatcc tccagcacag tctatatgga acttagtaga 600 ttgacatctg aagactctgc ggtctatttc tgtgcaagac acgaacaagg accaggttac 660 tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ccgcctccac caagggcaaa 720 gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa 780 aaggtcgcag ccctgaaaga g 801 <210> 138 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc diabody L234A/L235A <400> 138 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Lys Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Thr Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 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First Polypeptide Chain of an Exemplary DR5 mAb 2 x DR5 mAb 2 Fc diabody L234A/L235A <400> 139 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca 120 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct 240 gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcaaggt ccagctgcag 360 cagtctggag ctgaactggt gaaacccggg gcatcagtga agctgtcctg caaggcttct 420 gggtacacct tcactgagta tattttacac tgggtaaagc agaagtctgg acagggtctt 480 gagtggattg ggtggtttta tcctggaaat aataatataa agtacaatga gaaattcaag 540 gacaaggcca cactgactgc ggacaaatcc tccagcacag tctatatgga acttagtaga 600 ttgacatctg aagactctgc ggtctatttc tgtgcaagac acgaacaagg accaggttac 660 tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 140 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc diabody 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cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 142 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc diabody <400> 142 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 <210> 143 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Second Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc diabody <400> 143 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcaaa 720 gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa 780 aaggtcgcag ccctgaaaga 800 <210> 144 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc diabody L234A/L235A <400> 144 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly <210> 145 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.2 x hDR5 mAb 2.2 Fc diabody L234A/L235A <400> 145 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 146 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc diabody <400> 146 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly <210> 147 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc diabody <400> 147 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 148 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc diabody <400> 148 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 <210> 149 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Second Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc diabody <400> 149 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcaaa 720 gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa 780 aaggtcgcag ccctgaaaga g 801 <210> 150 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc diabody L234A/L235A <400> 150 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly <210> 151 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.3 x hDR5 mAb 2.3 Fc diabody L234A/L235A <400> 151 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 152 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc diabody <400> 152 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly <210> 153 <211> 1397 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc diabody <400> 153 cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc 60 ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga 120 caattagctc cctgcagcca gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca 180 ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg 240 gaggccaggt ccagctggtg cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga 300 aagtgtcttg taaagcatca ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac 360 aggcaccagg acagggactg gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta 420 agtacaacga gaagtttaaa gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag 480 tctatatgga gctgagctcc ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc 540 acgaacaggg tccaggttac tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct 600 ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg 660 aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg 720 acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct 780 tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat 840 gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg 900 gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc 960 gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt 1020 gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag 1080 ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga 1140 accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 1200 gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 1260 acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 1320 acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc 1380 tctccctgtc tccgggt 1397 <210> 154 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc diabody <400> 154 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 <210> 155 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding Second Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc diabody <400> 155 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca 240 gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcaaa 720 gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa 780 aaggtcgcag ccctgaaaga g 801 <210> 156 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc diabody L234A/L235A <400> 156 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly <210> 157 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.4 x hDR5 mAb 2.4 Fc diabody L234A/L235A <400> 157 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca 240 gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 158 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc diabody <400> 158 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly <210> 159 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc diabody <400> 159 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatatcg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 160 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc diabody <400> 160 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly 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gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcaaa 720 gtggccgcat gtaaggagaa agttgctgct ttgaaagaga aggtcgccgc acttaaggaa 780 aaggtcgcag ccctgaaaga g 801 <210> 162 <211> 499 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc diabody L234A/L235A <400> 162 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 130 135 140 Thr Glu Tyr Ile Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Met Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Asn Ile Lys Tyr Asn 165 170 175 Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 180 185 190 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gln Gly Pro Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 210 215 220 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu 225 230 235 240 Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 245 250 255 Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Leu Glu Pro Lys Ser 260 265 270 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 405 410 415 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 485 490 495 Ser Pro Gly <210> 163 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding First Polypeptide Chain of an Exemplary hDR5 mAb 2.5 x hDR5 mAb 2.5 Fc diabody L234A/L235A <400> 163 gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact 60 attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc 120 ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat 180 aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc 240 gaggatatcg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg 300 ggcacaaaac tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt ccagctggtg 360 cagagtgggg cagaggtgaa aaagccaggg gcatcagtga aagtgtcttg taaagcatca 420 ggttatacat ttactgagta catcctgcac tgggtgcgac aggcaccagg acagggactg 480 gaatggatgg ggtggttcta ccctggcaac aacaacatta agtacaacga gaagtttaaa 540 gaccgggtga ccatcacagc ggataagtct accagtacag tctatatgga gctgagctcc 600 ctgagaagcg aagacaccgc cgtctactat tgcgctcgcc acgaacaggg tccaggttac 660 tttgattatt gggggcaggg aactctggtc acagtcagct ccgcctccac caagggcgaa 720 gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag 780 gaggtcgcag ccctggagaa actggagccc aaatcttctg acaaaactca cacatgccca 840 ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 960 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1497 <210> 164 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(216) <223> Human Wild-Type IgG2 CH2-CH3 Domain <400> 164 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 65 70 75 80 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 85 90 95 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 100 105 110 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140 Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 165 170 175 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Anti-DR5 mAb 2 Light Chain Variable Region Variant 3, 4, 5 CDRL1 <400> 165 Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 166 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(107) <223> OKT3 Anti-CD3 Antibody Light Chain Variable Domain <400> 166 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg 100 105 <210> 167 <211> 192 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(192) <223> OKT3 Anti-CD3 Antibody Heavy Chain Variable Domain <400> 167 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 <210> 168 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> Human Wild-Type IgG3 CH2-CH3 Domain <400> 168 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215

Claims

사람 사멸 수용체 5(DR5)의 두 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 결합 분자인 다가 DR5-결합 분자로서, 상기 다가 DR5-결합 분자는 각각 사람 DR5에 결합할 수 있는 4개의 항원-결합 도메인을 포함하는, 다가 DR5-결합 분자.
사람 DR5의 에피토프에 결합할 수 있는 단일특이적 결합 분자인 다가 DR5-결합 분자로서, 상기 다가 DR5-결합 분자는 각각 사람 DR5에 결합할 수 있는 4개의 항원-결합 도메인을 포함하는, 다가 DR5-결합 분자.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 다가 DR5-결합 분자는 2개, 3개, 또는 4개의 사람 DR5 폴리펩티드에 동시에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다가 DR5-결합 분자는 Fc 영역-함유 디아바디이며, 상기 디아바디는 두 쌍의 폴리펩티드를 포함하는 공유 결합된 복합체이고, 여기서 각 쌍은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제4 항에 있어서,
(A) 제1 폴리펩티드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로:
(i) 제1 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인(VL1);
(ii) 제1 펩티드 링커(링커 1);
(iii) 제2 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날의 가변 중쇄(VH) 도메인(VH2);
(iv) 제2 펩티드 링커(링커 2);
(v) E-코일 도메인 또는 K-코일 도메인을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인;
(vi) 제3 펩티드 링커(링커 3); 및
(vii) IgG 면역글로불린 Fc 영역의 CH2 및 CH3 도메인을 가진 IgG Fc 영역의 폴리펩티드 부분
을 포함하고;
(B) 제2 폴리펩티드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로:
(i) 상기 제2 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 VL 도메인(VL2);
(ii) 제1 펩티드 링커(링커 1);
(iii) 상기 제1 DR5 에피토프에 결합할 수 있는 모노클로날의 VH 도메인(VH1);
(iv) 제2 펩티드 링커(링커 2); 및
(v) E-코일 도메인 또는 K-코일 도메인을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인
을 포함하며, 상기 제1 폴리펩티드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인 및 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 둘 다 E-코일 도메인이 아니거나, 또는 둘 다 K-코일 도메인이 아니고;
여기서:
(a) 상기 제1 폴리펩티드 사슬의 VL1 도메인과 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 VH1 도메인은 DR5의 제1 에피토프에 특이적 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 형성하고;
(b) 상기 제1 폴리펩티드 사슬의 상기 VH2 도메인과 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 상기 VL1 도메인은 DR5의 제2 에피토프에 특이적 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 형성하고;
(c) 제1 폴리펩티드 사슬들의 쌍의 CH2-CH3 부분은 IgG Fc 영역을 형성하는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제5 항에 있어서, 상기 VL1은 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하고, 상기 VH1은 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인 및 CDR_H3 도메인을 포함하며, 여기서:
(i) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지고; 또는
(ii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고; 또는
(iii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 hDR5 mAb 2 VL-3의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 hDR5 mAb 2 VH-3의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고; 또는
(iv) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, 및 SEQ ID NO:57을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, 및 SEQ ID NO:61을 가지고; 또는
(v) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, 및 SEQ ID NO:65를 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, 및 SEQ ID NO:69를 가지고; 또는
(vi) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, 및 SEQ ID NO:73을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, 및 SEQ ID NO:77을 가지고; 또는
(vii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, 및 SEQ ID NO:81을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, 및 SEQ ID NO:85를 가지고; 또는
(viii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, 및 SEQ ID NO:89를 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, 및 SEQ ID NO:93을 가지고; 또는
(ix) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 및 SEQ ID NO:97을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, 및 SEQ ID NO:101을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제5 항 또는 제6 항에 있어서, 상기 VL2는 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하고, 상기 VH2는 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인 및 CDR_H3 도메인을 포함하며, 여기서:
(i) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지고; 또는
(ii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고; 또는
(iii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고; 또는
(iv) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, 및 SEQ ID NO:57을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, 및 SEQ ID NO:61을 가지고; 또는
(v) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, 및 SEQ ID NO:65를 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, 및 SEQ ID NO:69를 가지고; 또는
(vi) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, 및 SEQ ID NO:73을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, 및 SEQ ID NO:77을 가지고; 또는
(vii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, 및 SEQ ID NO:81을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, 및 SEQ ID NO:85를 가지고; 또는
(viii) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, 및 SEQ ID NO:89를 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, 및 SEQ ID NO:93을 가지고; 또는
(ix) 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 및 SEQ ID NO:97을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, 및 SEQ ID NO:101을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제7 항에 있어서, 상기 VL1 및 상기 VL2는 동일한 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하고, 상기 VH1 및 상기 VH2는 동일한 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제8 항에 있어서, 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제8 항에 있어서, 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제8 항에 있어서, 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제7 항에 있어서, 상기 VL1 및 상기 VL2는 동일한 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인을 포함하지 않고, 상기 VH1 및 상기 VH2는 동일한 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제12 항에 있어서,
(i) VL1의 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, VH1의 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지고;
(ii) VL2의 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, VH2의 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제12 항에 있어서,
(i) VL1의 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 2의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16을 가지고, VH1의 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 2의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21을 가지고;
(ii) VL2의 상기 CDR_L1 도메인, CDR_L2 도메인, 및 CDR_L3 도메인은 DR5 mAb 1의 경쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6을 가지고, VH2의 상기 CDR_H1 도메인, CDR_H2 도메인, 및 CDR_H3 도메인은 DR5 mAb 1의 중쇄 CDR이며, 각각 아미노산 서열: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 및 SEQ ID NO:11을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제5 항에 있어서,
(i) 상기 VL1은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(ii) 상기 VL1은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(iii) 상기 VL1은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(iv) 상기 VL1은 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(vi) 상기 VL1은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(vii) 상기 VL1은 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(viii) 상기 VL1은 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(ix) 상기 VL1은 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(x) 상기 VL1은 SEQ ID NO:70의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:74의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(xi) 상기 VL1은 SEQ ID NO:78의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:82의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(xii) 상기 VL1은 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:90의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(xiii) 상기 VL1은 SEQ ID NO:94의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH1은 SEQ ID NO:98의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제5 항 또는 제6 항에 있어서,
(i) 상기 VL2는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(ii) 상기 VL2는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(iii) 상기 VL2는 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(iv) 상기 VL2는 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(vi) 상기 VL2는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(vii) 상기 VL2는 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(viii) 상기 VL2는 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(ix) 상기 VL2는 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:66의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(x) 상기 VL2는 SEQ ID NO:70의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:74의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(xi) 상기 VL2는 SEQ ID NO:78의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:82의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(xii) 상기 VL2는 SEQ ID NO:86의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:90의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(xiii) 상기 VL2는 SEQ ID NO:94의 아미노산 서열을 가지며, 상기 VH2는 SEQ ID NO:98의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제16 항에 있어서, 상기 VL1 및 상기 VL2는 동일한 아미노산 서열을 가지고, 상기 VH1 및 상기 VH2는 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제16 항에 있어서, 상기 VL1 및 상기 VL2는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않고, 상기 VH1 및 상기 VH2는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제5 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 링커 1은 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 가지고,
(ii) 상기 링커 1은 SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 가지고,
(iii) 상기 E-코일 도메인은 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고,
(iv) 상기 K-코일 도메인은 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지고,
(v) 상기 링커 3은 SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 가지고,
(vi) 상기 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:102의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 C-말단 잔기는 선택적으로 포함되는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제4 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 FcγR에 대한 변이 Fc 영역의 친화성을 감소시키거나 상기 Fc 영역을 안정화하는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제20 항에 있어서, 상기 변형은 L234A; L235A; 또는 L234A와 L235A의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제5 항에 있어서,
(i) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:116 또는 SEQ ID NO:120의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:118의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(ii) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:122 또는 SEQ ID NO:126의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:124의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(iii) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:128 또는 SEQ ID NO:132의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:130의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(iv) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:134 또는 SEQ ID NO:138의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:136의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(v) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:140 또는 SEQ ID NO:144의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:142의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(vi) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:150의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:148의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(vii) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:152 또는 SEQ ID NO:156의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:154의 아미노산 서열을 가지고; 또는
(vi) 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:158 또는 SEQ ID NO:162의 아미노산 서열을 가지며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO:160의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제1 항 내지 제22 항 중 어느 한 항의 다가 DR5-결합 분자 및 부형제를 포함하는 조성물.
제23 항에 있어서, 히스톤 디아세틸라아제 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항의 다가 DR5-결합 분자에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는 세포 사멸을 촉진시키는 방법.
제25 항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제25 항에 있어서, 상기 종양 세포는 암 줄기세포-유사 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제25 항, 제26 항 또는 제27 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포를 히스톤 디아세틸라아제 억제제에 노출시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제29 항에 있어서, 히스톤 디아세틸라아제 억제제와 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능하게 표지되고 암의 진단 또는 예후예측에 사용되는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제29 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상연부육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장 세포 암, 투명 세포 암종, 결장암, 결직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포 종양, 상의세포종, 유윙 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성불완전섬유원증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선암, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 포진성 포도막 흑색종, 희귀한 조혈 장애, 신장 전이성 암, 간상 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선 전이성 암, 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제29 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 결직장암, 간세포 암종, 신경교종, 신장암, 유방암, 다발성 골수종, 방광암, 신경모세포종; 육종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암 및 직장암인 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.
제29 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 급성 골수양 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 B 림프모구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프구성 백혈병(CLL), 모양 세포 백혈병(HCL), 출아형 형질세포모양 수지상 세포 신생물(BPDCN), 맨틀 세포 백혈병(MCL) 및 소 림프구성 림프종(SLL)을 포함하는 비-호지킨 림프종(NHL), 호지킨 림프종, 전신 비만세포증, 또는 버킷 림프종인 것을 특징으로 하는 다가 DR5-결합 분자.