KR20190072485A

KR20190072485A - Trail 수용체에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190072485A
Application number: KR1020180163095A
Authority: KR
Inventors: 이병헌; 소인섭; 김청운
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2019-06-25
Also published as: KR102194026B1

Abstract

본 발명은 TRAIL 수용체에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 사람의 DR5 (TRAIL R2) 수용체가 높게 발현하는 세포를 대상으로 이와 잘 결합하는 펩타이드들(CGKIRMRKC, CVALRKTKC, CTKSTMRKC 및 CNKPAMKRC)을 선별하였고, 상기 펩타이드들은 DR5 또는 TRAIL R2와 특이적으로 결합하는 효과를 보여, TRAIL 수용체에 대한 추적 혹은 표적 치료제로 이용 가능하며, 향후 항암 면역치료제로서 높은 가능성을 확인하였다.

Description

TRAIL 수용체에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides that specifically bind to TRAIL receptor and use thereof}

본 발명은 TRAIL 수용체(TRAIL-R2, DR5)에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.

TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)은 TRAIL 수용체와 결합하여 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 단백질이다. TRAIL 수용체는 TRAIL-R1 (DR3), TRAIL-R2 (DR5), DcR1, 및 DcR2 등이 있다. 이 중, DcR1과 DcR2는 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2와 달리 세포 내 부위(intracellular domain)가 없기 때문에 TRAIL과 결합은 하지만 세포 내로 세포사멸을 유도하는 신호를 전달하지 못한다. 암세포에는 주로 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2가 많이 존재하나, 정상세포에는 암세포와는 달리 DcR1 및 DcR2도 함께 많이 존재하기 때문에 결과적으로 TRAIL은 정상세포 대비 암세포에 선택적으로 세포사멸을 잘 유도하게 된다. 이러한 특성으로 인하여, 여러 제약회사에서는 TRAIL 또는 TRAIL 작용제(agonist)를 암치료제의 목적으로 개발되고 있다.

전세계적으로 암은 가장 일반적인 질환 중에 하나이며, 현재 일반적으로 수행되어지고 있는 치료법으로는 수술요법, 방사선요법, 화학요법이 있으며, 암의 분자적인 메커니즘이 연구가 활발히 진행되고 있지만, 현재 개발된 치료법들의 상당수가 외과적인 수술에 의존하고 있다. 하지만 최근에는 소분자 저해제(small molecule nihibitor), 단일항체(monoclonal antibody), 암세포를 표적으로 하는 짧은 펩타이드(short targeting peptide) 등과 같은 다양한 표적치료제(targeted therapeutic agents)가 개발되어 치료제로서 활용되고 있다. 특히 짧은 표적 펩타이드(short targeting peptide)는 조직 투과성이 높으며, 독성과 면역반응이 작아 효과적인 항암제로서 높은 가능성을 가지고 있다.

펩타이드 및 단백질의 파지 디스플레이(phage display)는 타겟 세포에 대한 특이적인 리간드(ligand)를 확인하는데 매우 유용한 방법이며, 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo)상에서 암세포를 표적으로 하는 펩타이드 및 단백질을 발굴하는데 널리 사용되어지고 있다. 대표적으로 쥐모델의 파지 라이브러리(phage library)에서 인비보 파지 스크리닝(in vivo phage screening)을 이용하여 RGD, GSL 및 NGR 모티프가 혈관신생이 활성화된 상피세포 종양에서 활성화되는 인테그린(integrin), VGF 수용체, MMP 등에 특이적으로 결합하며, 전립선 혈관의 IL11 수용체 및 유방암의 미소혈관에서 발현되는 것을 확인하였다. 하지만, 이러한 연구결과들은 초기 종양이 악성종양으로 진행되는 단계에서 일시적으로 나타나는 패턴들을 선택적으로 확인 가능한 파지를 제공하지 못하였다. 따라서 암세포의 각 단계에서 특이적으로 발현되는 표적을 타겟으로 하는 펩타이드 및 단백질의 개발이 필요한 상황이다.

미국공개특허 US 2009/0131317 (2009.05.21 공개)

본 발명은 TRAIL 수용체(TRAIL-R2, DR5)에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것으로, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 TRAIL-R2에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물, 약물전달용 조성물 및 항암 면역 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 TRAIL-R2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 면역 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5) 표적용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 사람의 DR5 (TRAIL R2) 수용체가 높게 발현하는 세포를 대상으로 이와 잘 결합하는 펩타이드들(CGKIRMRKC, CVALRKTKC, CTKSTMRKC 및 CNKPAMKRC)을 선별하였고, 상기 펩타이드들은 DR5 또는 TRAIL R2와 특이적으로 결합하여 이의 작용을 억제하므로, 세포 표면 수용체에 대한 추적 혹은 표적 치료제로 이용 가능하며, 향후 암 면역치료제 및 항암 치료제로서 높은 가능성을 확인하였다.

도 1은 파지 라이브러리 스크리닝을 위해 본 발명에서 사용된 스크리닝 과정을 나타낸다.
도 2는 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 대상으로 스크리닝한 결과, 각 라운드(R1 ~ R4)에서 회수된 파지 역가를 나타낸다.
도 3은 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 대상으로 한 스크리닝을 통해 선별한 파지 클론에 삽입된 펩타이드 코딩 유전자 서열을 읽은 다음, 이를 아미노산 서열로 전환 및 유사 아미노산 서열끼리 배열한 결과의 일부를 나타낸다.
도 4는 스크리닝을 통해 선별된 12개의 파지 클론을 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 결합능을 ELISA 에세이를 통해 평가한 결과를 나타낸다. 이를 바탕으로 높은 결합 능력을 보인 4개의 파지 클론 (#2(1R21):CVALRKTKC, #9(4R01):CTKSTMRKC, #10(4R08):CNKPAMKRC, #12(4R29):CGKIRMRKC)을 선별하여 각각의 아미노산 서열에 대한 펩타이드 CVALRKTKC(서열번호 1), CTKSTMRKC(서열번호 2), CNKPAMKRC(서열번호 3), CGKIRMRKC(서열번호 4)를 합성하였다.
도 5는 스크리닝을 통해 선별된 12개의 파지 클론 중 ELISA 에세이에서 특이적 결합 능력을 보인 4개의 파지 클론을 선별하여 각각의 아미노산 서열에 해당하는 펩타이드 CVALRKTKC(서열번호 1), CTKSTMRKC(서열번호 2), CNKPAMKRC(서열번호 3), CGKIRMRKC(서열번호 4)를 합성하고, 이를 유세포분석기 (FACS) 분석을 통해 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 HCT 116 세포에서 특이적 결합능을 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 대상으로 한 스크리닝을 통해 선별해 낸 네 가지 펩타이드중 가장 높은 결합능력을 보인 펩타이드 (CGKIRMRKC)의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 HCT 116 세포에 대한 결합능을 공초점 형광현미경을 통해 조사한 결과를 나타낸다.
도 7은 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 siRNA를 처리하여 TRAIL 수용체의 발현을 억제하여 결합 펩타이드 (CGKIRMRKC)의 TRAIL 수용체에 대한 특이적 결합을 유세포분석기 (FACS) 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 A549, MCF7, MDA-MB-231 세포에 대한 결합 펩타이드 (CGKIRMRKC)의 친화도를 리간드 추적기 (LigandTracer) 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 TRAIL-R2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되지만(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989), 이들로 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 합성한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 합성할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에서 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. “기능적 변이체”란 TRAIL-R2에 특이적으로 결합하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 않는 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

상기 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.

또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 있어서,“벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서, “재조합벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 재조합벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.

바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

바람직하게는, 상기 암은 TRAIL-R2가 과발현되는 암일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 TRAIL-R2가 과발현되는 암은 폐암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 또는 편평상피세포암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.

본 발명의 펩타이드를 이용한 암의 진단은 혈액, 소변이나 바이옵시(biopsy)에 의해 직접 얻은 해당 조직 또는 세포에 본 발명의 펩타이드를 반응시켜 이들의 결합을 검출함으로써 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드가 암 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ⁹⁹mTc, ³²P, ³⁵S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.

유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 암으로 진단된다.

본 발명에 따른 펩타이드는 약물을 암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 공지의 약물과 연결하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 약물이 암 조직 및 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.

상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea) 등이 있다. 항암제와 본 발명의 펩타이드 간의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.

바람직하게는, 상기 약학조성물은 T 세포의 세포사멸을 억제시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg 용량으로 투여할 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 특이적으로 표적하는 펩타이드의 발굴

<1-1> TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 특이적으로 결합하는 파지 라이브러리의 스크리닝

파지 스크리닝은 T7 파지 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid) 라이브러리 (1.3 × 10¹⁰ pfu)를 이용하여 수행하였다. 본 라이브러리는 양 말단에 시스테인과 중간에 7 개의 무작위 아미노산으로 구성된 CXXXXXXXC (X = random sequence)의 아미노산 서열을 가지면서, 7 개의 무작위 아미노산 중 최소 한 개 이상에서 소수성 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하고 있다. 스크리닝에 쓰인 단백질은 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)의 Ala54-Glu82 부위가 사람 IgG₁의 Pro100-Lys330 부위와 6-His Tag에 융합된 형태로 발현되는 단백질이며, 회수를 위하여 protein A가 magnetic bead에 결합된 시료를 사용하였다. 스크리닝의 과정은 도 1에서 간단하게 도시하였다. TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 결합하지 않고 protein A-magnetic bead에 결합하는 비특이적 결합을 제거하기 위하여, 먼저 1.3 × 10¹⁰ pfu의 T7 파지를 protein A-magnetic bead가 들어있는 시험관에 넣고 4 ℃에서 1시간 동안 결합시킨 후 protein A-magnetic bead에 결합하지 않은 파지가 있는 상층액을 회수하였다. 이 상층액을 TRAIL R2-hIgG₁Fc-6-His Tag가 결합된 protein A-magnetic bead가 들어있는 시험관에 옮겨 4 ℃에서 1시간 동안 결합시켰다. TRAIL R2-hIgG₁Fc-6-His Tag에 결합하지 않는 파지를 제거하기 위해 상층액은 버리고 특이적으로 파지가 결합된 TRAIL R2-hIgG₁Fc-6-His Tag / protein A-magnetic bead을 회수하였다. 파지가 특이적으로 결합된 TRAIL R2-hIgG₁Fc-6-His Tag / protein A-magnetic bead를 PBST 완충용액으로 10회 씻어준 뒤, O.D 값이 1.0 까지 배양된 BL21 호스트 대장균을 1 ml 넣고 4 ℃에서 5분간 반응시켰다. 반응시킨 혼탁액을 10배씩 연속 희석하고 각 희석액 1 ml 중 100 ul를 이용해 플라크 어세이(plaque assay)를 수행하여 그 수(titer)를 계산하였다. 나머지 용출액은 호스트 대장균을 이용해 파지 증폭을 수행함으로써 그 다음 라운드에 사용할 파지를 확보하였다. 이와 같은 과정을 4 라운드까지 반복하여 수행하였다.

그 결과, 각 라운드 별 회수된 파지의 수를 계산하여 도 2에 나타내었다. 라운드가 진행함에 따라, 용출해 낸 파지의 수가가 점진적으로 증가함을 볼 수 있었다. 1 라운드를 수행했을 때, 용출된 파지의 수는 약 1.9 × 10² 개였고, 최종적으로 4라운드를 진행한 이후, 2.2 × 10⁶ 개의 파지가 용출되었음을 알 수 있었다. 즉, 1라운드에서 4라운드까지 진행한 결과, 약 10,000배의 파지 수의 증가를 볼 수 있었다. 아미노산 서열분석을 위해, 1, 2, 3, 4 라운드의 역가 측정에 쓰인 플라크 어세이의 결과물로부터, 각각 50개 (총 200개)의 클론들을 취합하여 10ul Tris-buffered saline 완충액에 보관하였으며, PCR을 통해 이들 파지에 삽입된 펩타이드를 코딩하는 유전자를 증폭하고 염기서열 파악과 이에 따른 아미노산 서열분석을 수행하였다.

<1-2> 파지 클론의 유전자 및 번역된 아미노산의 서열 분석

실시예 1-1에서 각각 수집한 200개의 파지 클론에 삽입된 펩타이드 코딩 유전자의 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열을 그에 상응하는 아미노산 서열로 변환하였으며, 유사한 서열 또는 모티프를 분석하기 위하여 Clustal X 프로그램을 이용하여 서열을 정렬하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 각 라운드 내 혹은 라운드 사이에서 유사하거나 반복되는 아미노산 서열을 가진 클론들이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 펩타이드의 아미노산 서열상 높은 빈도로 반복되는 서열을 가진 12 가지의 펩타이드를 다음 단계의 실험 후보로 선별하였다.

< 실시예 2> 펩타이드의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 선택적 결합능 평가

<2-1> ELISA 분석을 통한 파지 클론의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 선택적 결합능 평가

스크리닝을 통해 선별된 12개의 파지 클론의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 결합능을 ELISA 에세이를 통해 측정함으로써 평가하였다.

이를 위해 Ni²⁺ 이 코팅된 ELISA 플레이트에 사람 TralR2-IgG Fc-His6 융합 단백질을 웰 (well)당 100 ng을 결합 시켰다. 스크리닝을 통해 선별된 12개의 파지 클론을 사람 TralR2-IgG Fc-His6 융합 단백질이 결합된 웰 (well)당 1.7 × 10⁹ PFU 씩 넣고 상온에서 6시간 결합시켰다. 0.01% BSA, 0.01% Tween 20이 들어있는 PBS 완충용액으로 5회 씻어주어 결합 되지 않은 파지 클론을 제거하였다. 이후 일차 항체로 T7 꼬리섬유 (T7 Tail Fiber)에 대한 생쥐 단일항체를 1:5000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시키고, 2차 항체로 생쥐 IgG에 대한 염소 항체-HRP 결합체를 1:10000 으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 발색을 위하여 TMB 용액을 첨가하고 30분 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 보듯이, 스크리닝으로부터 선별해 낸 12개 후보군 중 4개의 클론 (#2(1R21):CVALRKTKC, #9(4R01):CTKSTMRKC, #10(4R08):CNKPAMKRC, #12(4R29):CGKIRMRKC)이 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 높은 결합능력을 보였다. 이를 바탕으로 하여 각각의 아미노산 서열에 대한 펩타이드 CVALRKTKC(서열번호 1), CTKSTMRKC(서열번호 2), CNKPAMKRC(서열번호 3), CGKIRMRKC(서열번호 4)를 합성하였다.

<2-2> 펩타이드의 합성

(주) 펩트론(Peptron Co, Daegeon, Korea.)에 의뢰하여 카복시말단에 형광물질인 fluorescein isothiocyanate(FITC)가 접합된 펩타이드를 합성하였다. 각 펩타이드들은 표준 Fmoc 방법에 의하여 합성되었고 질량분석기에 의하여 정제되었다.

<2-3> 유세포분석기법 ( FACS )을 이용한 펩타이드의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 결합능 평가

ELISA 분석을 통해 파지 클론 상태에서 높은 결합능을 보인 4가지 클론으로부터 펩타이드 CVALRKTKC(서열번호 1), CTKSTMRKC(서열번호 2), CNKPAMKRC(서열번호 3), CGKIRMRKC(서열번호 4)를 합성하고 이들 펩타이드의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 선택적 결합력을 유세포분석기법 (FACS)을 이용하여 평가하였다. 이를 위해, TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 HCT116 세포주를 배양하고 세포 표면의 수용체가 다치지 않도록 세포를 50 mM EDTA가 든 PBS 완충용액으로 4 ℃에서 10분간 처리하여 배양접시에서 떼어낸 후 2% FPA가 든 PBS 완충용액으로 상온에서 30분간 처리하여 고정하였다. 세포를 각각 1.5mL 튜브에 1 × 10⁵ cells/tube로 준비한 후, 0.5% 소혈청알부민이 포함된 PBS 완충용액으로 4 ℃에서 30분간 전처리를 거친 다음, FITC 형광이 표지된 1 μM 펩타이드와 4 ℃에서 한 시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후, 유세포분석기 (FACS)를 이용하여 세포에 대한 펩타이드의 결합을 분석하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, 대조 펩타이드에 비해 상기 4개의 펩타이드 CVALRKTKC(서열번호 1), CTKSTMRKC(서열번호 2), CNKPAMKRC(서열번호 3), CGKIRMRKC(서열번호 4) 모두 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 HCT116 세포주에 더욱 잘 결합하였음을 알 수 있었다. 이중 CGKIRMRKC 펩타이드가 가장 높은 결합력을 보여주었다.

<2-4> 공초점형광현미경법을 이용한 펩타이드의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 결합능 평가

스크리닝에서 선별한 12가지 클론 중 ELISA 분석으로 파지상에서 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 높은 결합능을 보인 4가지를 다시 선별하여 펩타이드 CVALRKTKC(서열번호 1), CTKSTMRKC(서열번호 2), CNKPAMKRC(서열번호 3), CGKIRMRKC(서열번호 4)로 합성하였으며, 이들은 펩타이드 상태에서 유세포분석기법 (FACS)으로 높은 결합력을 보여주었다.

이중 가장 높은 결합력을 보여준 CGKIRMRKC 펩타이드의 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 결합을 확인하기 위해 공초점형광현미경법을 수행하였다. 이를 위해 TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 HCT116 세포주를 8-well 배양용기에 배양하고, 2% FPA가 든 PBS 완충용액으로 상온에서 30분간 처리하여 고정하였다. 이후 0.5% 소혈청알부민이 포함된 PBS 완충용액으로 4 ℃에서 30분간 전처리한 후, 1 μM의 펩타이드를 4 ℃ 에서 한 시간 동안 결합시켰다. 이후 핵을 카운터염색한 후 공초점형광현미경을 통해 촬영하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, CGKIRMRKC 펩타이드는 대조 펩타이드와 비교해 HCT116 세포주에 더 높은 결합 및 FITC 형광 신호를 보였다.

<2-5> TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)에 대한 siRNA를 이용하여 펩타이드의 TRAIL 수용체에 대한 특이적 결합능 평가

TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 HCT116 세포주에 TRAIL 수용체 에 대한 siRNA를 처리하여 TRAIL 수용체의 발현을 억제하여, 결합 펩타이드 CGKIRMRKC의 TRAIL 수용체에 대한 특이적 결합을 확인하였으며, 도 7에서 보듯이 siRNA를 처리하여 TRAIL 수용체의 발현이 억제된 경우 결합 펩타이드 CGKIRMRKC의 결합이 현저히 줄어든 것을 확인하였다.

<2-6> TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 세포들에 대한 펩타이드 의 친화도 평가

TRAIL 수용체 (TRAIL R2, DR5)를 과발현하는 A549, MCF7, MDA-MB-231 세포에 대한 결합 펩타이드 (CGKIRMRKC)의 친화도를 측정하기 위하여 이들 세포를 10 mm 배양용기에 배양하였다. 리간드 추적기 (LigandTracer)를 이용하여 세포가 배양된 배양용기에 FITC 형광이 표지된 펩타이드를 각각, 1 μM, 3 μM의 농도로 반응시켜 결합속도를 측정하고, FITC 형광이 표지된 펩타이드를 포함하지 않은 배양액으로 대체하여 해리 속도를 측정하였다. 도 8은 리간드 추적기 (LigandTracer) 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸다. 각 세포에 대한 펩타이드의 결합 속도 상수 (Ka), 해리 속도 상수 (Kd), 평형해리상수 (KD)가 도표에 나타나 있다.

<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Peptides that specifically bind to TRAIL receptor and use thereof <130> ADP-2018-0540 <150> KR 10-2017-0173306 <151> 2017-12-15 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Cys Val Ala Leu Arg Lys Thr Lys Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Cys Thr Lys Ser Thr Met Arg Lys Cys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Cys Asn Lys Pro Ala Met Lys Arg Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Cys Gly Lys Ile Arg Met Arg Lys Cys 1 5

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 TRAIL-R2에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제3항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터.
제4항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 TRAIL-R2가 과발현되는 암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 TRAIL-R2가 과발현되는 암은 폐암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 및 편평상피세포암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 면역 치료용 약학조성물.
제11항에 있어서, 상기 약학조성물은 T 세포의 세포사멸을 억제시키는 것을 특징으로 하는 항암 면역 치료용 약학조성물.