KR20080004339A - 세포사멸 수용체 5 (ｄｒ5)에 특이적으로 결합하는 항체 및이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
세포사멸 수용체 5 (ｄｒ5)에 특이적으로 결합하는 항체 및이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포사멸 수용체 5 (death receptor 5; DR5)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상보성 결정 영역에 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 상보성 결정 영역에 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되고, DR5에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 TRAIL-민감성 암세포뿐만 아니라 TRAIL-저항성 암세포에서도 DR5를 통한 자식작용에 의한 세포사멸 (autophagic cell death)을 유도하므로, 다양한 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
Description
도 1a 및 1b는 각각 DR5에 특이적으로 결합하는 항-DR5 scFv 항체인 HW1 및 HW6의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 DNA를 나타낸 것이다 (여기에서, 밑줄로 표시한 부분은 순서대로 각 항체의 중쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3, 링커 올리고펩타이드 및 경쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3을 나타낸다).
도 2는 DR5에 대해 높은 항체 역가를 나타낸 8명의 혈장내 DR5, DcR1 및 BSA에 대한 항체 역가를 ELISA를 통하여 정량한 결과이다.
도 3은 바이오틴으로 표지된 (biotin-labeled) DR5를 항원으로 사용하여 효모 세포 표면에 발현된 항-DR5 scFv 항체 라이브러리를 FACS (fluorescence activated cell sorting)를 통하여 분리한 결과이다.
도 4는 HW1 및 HW6를 각각 pKJ1 벡터에 클로닝하여 제조된 대장균 발현벡터의 모식도이다.
도 5a 및 5b는 각각 HW1 및 HW6를 대장균에서 발현 및 정제한 후 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 각각 분석한 결과이다.
도 6은 정제된 HW1 및 HW6를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 7a 및 7b는 정제된 HW1 및 HW6를 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE로 각각 분석한 결과이다.
도 8a 내지 8d는 항원인 DR5, 및 DcR1, DcR2, DR4, TNFR1, TNFR2 및 CD95에 대한 HW1 (도 8a 및 8b) 및 HW6 (도 8c 및 8d)의 교차 반응성을 SPR (surface plasmon resonance)를 이용하여 정량한 결과이다.
도 9a 및 9b는 YFP (yellow fluorescence protein)로 표지된 DR5 (DR5ΔCDYFP) 및 DcR2 (DcR2ΔCDYFP)와, Alexa633으로 표지된 HW1 (도 9a) 또는 TRAIL (도 9b)의 결합을 인간 대장암 세포인 HCT116 세포에서 관찰한 결과이다.
도 10a 및 10b는 HW1 및 HW6가 항원인 DR5에 결합하는 부위가 TRAIL과 같은 지를 확인한 경쟁적 ELISA 결과이다.
도 11a 및 11b는 TRAIL-민감성 HCT116, HL60 및 DU145 세포에서 TRAIL (도 11a), 및 HW1 및 HW6 (도 11b)의 농도에 따른 세포사멸 유도 정도를 MTT 분석을 통하여 정량한 결과이다.
도 12a 내지 12d는 TRAIL-저항성 HepG2, U87MG 및 Molt-4 세포에서 TRAIL (도 12a 및 12c), 및 HW1 및 HW6 (도 12b 및 12d)의 농도에 따른 세포사멸 유도 정도를 MTT 분석을 통하여 정량한 결과이다.
도 13a 및 13b는 TRAIL-저항성 HepG2 세포 (도 13a) 및 Huh7 세포 (도 13b)에서 TRAIL, HW1 및 HW6에 의한 세포사멸을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 14a 및 14b는 인간 정상세포인 간세포 (도 14a) 및 유선세포 (도 14b)에 서 TRAIL 및 HW1의 농도에 따른 세포독성이 없음을 보여주는 세포독성 실험 결과이다.
도 15는 인간 정상세포인 뇌 성상세포에서 HW1 및 HW6이 세포독성을 나타내지 않음을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 16은 세포막에 발현된 DR5와 경쟁적인 용액상태의 DR5-Fc를 농도별로 넣어준 후, HW1과 TRAIL의 HCT116 세포에서의 세포독성을 MTT 분석을 통해 정량한 결과이다.
도 17은 설포라판 (sulforaphane)을 처리 또는 처리하지 않은 경우, TRAIL 및 HW1에 의한 TRAIL-민감성 HCT116 세포에서의 세포사멸을 MTT 분석을 통해 정량한 결과이다.
도 18은 가교제 (cross-linker, CL)의 존재 또는 부재 하에서 TRAIL-민감성 HCT116 세포 및 TRAIL-저항성 HepG2 세포에 대한 HW1의 세포독성을 MTT 분석을 통해 정량한 결과이다.
도 19a 내지 19d는 HW1에 의한 다양한 TRAIL-민감성 세포주 (HCT116 및 Du145) 및 TRAIL-저항성 세포주 (HepG2 및 U87MG)의 세포사멸이 자식작용에 의한 세포사멸 (autophagic cell death)임을 현미경으로 확인한 결과이다 (여기에서, 도 19a는 투사전자현미경 사진이고, 도 19b 내지 19d는 각각 여러 겹의 막으로 둘러싸인 자식작용 액포, 이중막으로 둘러싸인 자식작용 액포 및 빈 액포와 세포내 소기관을 포함한 액포가 결합되어 자식작용 액포가 형성되는 단계를 확대한 것이다).
도 20a 및 20b는 HW1에 의한 암세포의 자식작용에 의한 세포사멸을 세포내 자식작용 액포를 특이적으로 표지하는 라이소트랙커 레드 (lysotracker-red DND-99)를 이용하여 TRAIL-민감성 HCT116 세포 (도 20a) 및 TRAIL-저항성 U87MG 세포 (도 20b)에서 관찰한 형광 현미경 사진이다.
본 발명은 세포사멸 수용체 5 (death receptor 5; DR5)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
단백질 p53-비의존적인 (p53-independent) 종양괴사인자 수용체 (tumor necrosis factor receptor; TNFR)를 통한 아폽토시스 (apoptosis) 경로 중, TNF-관련 아폽토시스 유도 리간드 (TNF-related apoptosis inducing ligand; TRAIL)에 의해서 활성화되는 세포사멸 수용체 DR5 또는 DR4의 경로를 통한 세포사멸 기작은 정상세포에는 부작용이 적으면서도 암세포에는 특이적으로 세포사멸을 유도하므로 매우 중요한 암 치료제 개발의 표적으로 여겨져 왔다 (Ashkenazi 등, J. Clin. Invest., 104:155-162, 1999; 및 Ashkenazi, Nat. Rev. Cancer, 2:420-430, 2002).
현재 DR4 또는 DR5를 표적으로 암세포 특이적인 치료제를 개발하려는 노력으로는 상기 세포사멸 수용체들의 리간드인 재조합 TRAIL (예를 들면, TRAIL의 114-281번 아미노산 잔기)을 이용하는 방법과 세포사멸 수용체들에 특이적인 쥐 또는 인간 유래의 완전 항체 (예를 들면, mAb 또는 IgG) 중에서 아고니스트 (agonist) 항체를 개발하는 방법이 있다 (Pollack 등, Clin. Cancer Res., 7:1362-1369, 2001; Jo 등, Nat. Med., 6:564-567, 2000; Ichikawa 등, Nat. Med., 7:954-960, 2001; 및 Walczak 등, Nat. Med., 5:157-161, 1999). 그러나, 상기 재조합 TRAIL은 매우 불안정하여 가용성 올리고머를 형성하므로 아폽토시스 활성 (apoptotic activity)이 20 내지 100배 정도 감소되고, 정상세포인 성상세포 (astrocytes), 간세포 (hepatocytes), 각질세포 (keratinocytes) 등에도 세포독성 (cytotoxicity)과 면역작용을 일으켜 부작용이 크다 (Jo 등, Nat. Med., 6:564-567, 2000). 또한, TRAIL은 50% 이상의 악성 종양세포에는 세포사멸을 유도하지 못한다 (Zhang 등, Cancer Gene Ther., 12:228-237, 2005). 이에, 일반적으로 TRAIL에 의해서 죽는 암세포들을 TRAIL-민감성 (TRAIL-sensitive) 암세포, 죽지 않는 암세포들을 TRAIL-저항성 (TRAIL-resistant) 암세포라 칭하고 있다.
현재까지 DR5와 관련된 세포사멸을 유도하기 위해 개발된 DR5에 특이적인 친화도를 갖는 항체로는, 쥐 유래 단일클론 항체로부터 개발된 인간화 항체인 TRA-8 (쥐 유래 IgG) (Walczak 등, Nat. Med., 5:157-161) 및 AD5-10 (쥐 IgG) (Guo 등, J. Biol. Chem., 280:41940-41952, 2005), 및 인간 유래 단일 클론 항체인 HGS-ETR2 (인간 IgG1) (Georgakis 등, Br. J. Haematol., 130:501-510, 2005) 및 KMTR2 (인간 IgG4) (Motoki 등, Clin. Cancer Res., 11:3126-3135, 2005) 등이 있다.
상기 항체들은 모두 TRAIL-민감성 암세포들에서만 세포사멸을 유도하고, TRAIL-저항성 암세포에서는 세포사멸을 유도하지 못했다. 또한, 단일항원 결합부위 (monovalent)를 갖는 Fab 또는 scFv 형태로는 암세포에서 세포사멸을 유도하지 못하였고 (예: KMTR2), 이중 항원 결합부위를 (divalent) 갖는 IgG 형태로만 세포독성을 보이거나 (예: HGS-ETR2 및 AD5-10) IgG를 가교제 (cross-linker)로 사용해야만 세포사멸을 유도하였다 (Chuntharapai 등, J. Immunol., 166:4891-4898, 2001; Motoki 등, Clin. Cancer Res., 11:3126-3135, 2005; 및 Wajant 등, Oncogene, 20:4101-4106, 2001). 현재까지 항-DR5 단일쇄 가변영역 (scFv) 및 Fab 형태의 항체가 암세포의 세포사멸을 유도한다고 보고된 바는 없다.
현재 자식작용 (autophagy)이 암세포의 세포사멸을 유도하는 기작인지 아닌지는 논쟁의 여지가 많으며 (Kondo 등, Nat. Rev. Cancer, 5:726-734, 2005), 오직 일부 화합물만이 자식작용에 의한 세포사멸 (autophagic cell death)에 의해서 암세포를 죽일 수 있다는 것이 보고된 바가 있다 (Yu 등, Science, 304:1500-1502, 2004).
따라서, 본 발명의 목적은 DR5에 특이적으로 결합하여 TRAIL-민감성 및 -저항성 암세포 모두에 대하여 자식작용에 의한 세포사멸을 유도하는 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 코딩하는 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상보성 결정 영역 (complementarity determining region; CDR)에 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 상보성 결정 영역에 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 인간 세포사멸 수용체 5 단백질 (death receptor 5; DR5)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 DNA를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 용어 "세포사멸 수용체-5 (DR5) 단백질"은 종양괴사인자 (TNF) 수용체 패밀리의 일원이고 TRAIL에 결합하며, C-말단에 세포내 죽음 도메인 (death domain)을 갖는 수용체를 의미한다 (Pan 등, Science, 277:815-818, 1997). DR-5는 TRAIL에 결합하는 경우, TRAIL-민감성 암세포에서 아폽토시스를 유도하고 DR-5가 과발현되는 경우에는 아폽토시스가 증가하지만, 정상세포에서는 아폽토시스를 유도하지 않는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "DR-5"는 상기한 바와 같은 특성을 갖는 단백질이면 어느 것이나 포함되며, 예를 들면 미국특허 제6,872,568호에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 "항체"는 전체 형태의 항체 ("전항체") 또는 그의 기능적인 단편일 수 있다. 상기 전항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있다. 또한, 용어 "항체의 기능적인 단편"은 전항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체로서 실질적으로 전항체가 인식하는 것과 동일한 항원 에피토프를 인식하는 것을 의미한다. 상기 항체의 기능적인 단편에는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니며, scFv가 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서, 용어 "단일쇄 가변영역 (scFv)"은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통하여 연결되어 단일쇄 폴리펩타이드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.
상기 항체는 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들면, 파지 디스플레이 방법 또는 효모 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다.
scFv를 제조하는 방법으로는 예컨대, 미국특허 제4,946,778호 및 미국특허 제5,258,498호에 기재된 방법이 사용될 수 있으며, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 방법으로는, WO 92/22324 등에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 항체일 수 있다. 여기서 "인간 항체"란 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체가 포함된다 (미국특허 제5,939,598호 참조).
본 발명의 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 항체는 DR5 단백질에 특이적으로 결합한다. 본 발명에 있어서, 용어 "특이적으로 결합한다"는 본 발명의 항체가 DR5와 유사한 TNFR 패밀리의 수용체인 DcR1 (death decoy receptor 1), DcR2, DR4, TNFR1, TNFR2 및 CD95에는 실질적 으로 결합하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 항체에서 서열번호 1 내지 3 또는 7 내지 9의 아미노산 서열은 각각 DR5에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 해당하는 서열이고, 서열번호 4 내지 6 또는 10 내지 12의 아미노산 서열은 각각 DR5에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 해당하는 서열이다.
본 발명의 항체의 바람직한 예로는 각각 서열번호 13 및 14의 아미노산 서열을 갖는 scFv 항체인 HW1 및 HW6이며, 이들은 각각 중쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3, 링커 올리고펩타이드 및 경쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3을 차례로 포함한다 (도 1a 및 1b 참조).
HW1 및 HW6는 DR5에 특이적으로 결합하며, 결합 해리 상수 (K D )는 각각 약 4.31× 10-7 M 및 5.45× 10-8 M이다. 또한, 상기 항체들은 단일분자인 scFv 형태로 다중 결합체 가교제 (cross-linker) 없이도 TRAIL-민감성 암세포뿐만 아니라 TRAIL-저항성 암세포에 대해서도 자식작용에 의한 세포사멸을 유도하는 특성을 가지나, 정상세포에 대하여는 세포사멸을 유도하지 않는다.
따라서, 본 발명에 따른 항체는 TRAIL의 결합부위와는 다른 DR5의 부위에 특이적으로 결합하여, TRAIL-저항성 암세포를 포함한 다양한 암세포의 자식작용에 의한 세포사멸을 유도하는 것으로 여겨지지만, 본 발명이 특정한 기작에 한정되는 것 은 아니다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 DNA를 제공한다.
상기 DNA는 바람직하게는 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 scFv를 코딩하는 DNA일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 15 또는 16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA일 수 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열은 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 부위 지향적 돌연변이 발생법 (site-directed mutagenesis) 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 원하는 대로 합성할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 바이러스성 형질감염 또는 비-바이러스 기반 기법 등을 이용하여 적절한 숙주세포에 전달될 수 있다. 이때, DNA 또는 발현벡터의 도입은 아데노바이러스성 형질전환, 유전자 총, 리포좀-매개 형질전환 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질전환, 플라스미드, 아데노-부속 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 세포는 유전자를 장시간에 걸쳐 세포에 방출 또는 전달할 수 있는 적절한 담체 물질과 함께 이식될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 서열 또는 이를 포함하는 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 적절한 조건하에서 배양하여 본 발명의 항체를 발현시키는 단계, 및 상기 항체를 분리하는 단계를 포함하는 항체 분자의 생산방법을 제공한다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지 (supernatant)로 표적화 (targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 당분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩 (refolding)시키고 기능적 형태 (conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다.
상기 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드만을 생산할 필요가 있는 경우에는, 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터를 숙주세포에 형질도입시키고, 중쇄 및 경쇄 모두를 포함하는 항체의 생산을 위해서는, 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제 1 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 제 2 벡터의 2개 벡터를 숙주세포에 도입하거나, 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 모두 포함하는 단일 벡터를 상기 숙주세포에 도입시킬 수도 있다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 DR5 단백질에 특이적으로 결합하여 DR5를 발현하는 TRAIL-민감성 암세포 및 TRAIL-저항성 암세포에 자식작용에 의한 세포사멸을 유도하고, 정상세포에 대하여는 세포사멸을 유도하지 않으므로, 다양한 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 상기 암은 TRAIL-민감성 및 -저항성 암을 포함한 DR5를 발현하는 암이면 어느 것이나 포함되며, 예를 들면 유방암, 결장암, 뇌종양, 신경교종, 난소암, 자궁내막암, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활액암, 췌장암 및 육종암 등이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 역시 제공한다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체로는 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같은 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체; 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이러한 목적에 적합한 제형으로는 정제, 환제, 당제 (dragee), 산제, 캡슐제, 시럽제, 용액제, 겔제, 현탁제, 에멀젼, 마이크로에멀젼 등의 다양한 경구투여용 제제; 및 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입제, 및 하이포스프레이 (hypospray)와 같은 분무제 등과 같은 비경구투여용 제제가 바람직하다. 주사 또는 주입용 제제의 경우에는, 현탁액, 용액 또는 에멀션 등의 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체 분자는 사용 전에 적절한 무균 액체로 재조정하여 사용할 수 있는 건조된 형태로 제제화될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로서 위장관 내에서 분해되기 쉬운 항체 분자를 포함하므로, 상기 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의하여 투여되어야 하는 경우에는 분해로부터 항체를 보호하고, 항체를 방출한 후에는 위장관으로 흡수되는 약제를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 또한 본 발명의 항체를 상기에 기재된 바와 같은 다양한 방법으로 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 암을 예방 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 조성물 또는 약학적 제제는 단독 또는 다른 항암 치료제 예를 들면, TRAIL 또는 기타 당분야에서 통상적으로 사용되는 화학적 항암 치료제 등과 함께 병용 처리될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 유전자 치료법에 의하여 투여될 수도 있다. 이를 위해서는, 본 발명의 항체 분자가 이의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열로부터 발현되어 그 자리에서 (in situ) 조합될 수 있도록 당분야의 통상적인 유전자 치료법에 따라 환자에게 도입되어야 한다.
본 발명의 조성물 또는 약학적 제제의 유효성분으로서 상기 항체는 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.01 내지 50 ㎎/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 20 ㎎/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 예방 또는 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별, 약제 조합, 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: DR5에 대한 항체 역가가 높은 혈청의 선별
세포사멸 수용체 DR5 및 DcR1 (death decoy receptor 1)에 대한 항체 역가가 높은 혈청으로 인간 항체 라이브러리를 구축하기 위하여, 정상인 60여명의 혈액의 혈청의 DR5 및 DcR1 각각에 대한 항체 역가를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 이때, 대조군 항원으로는 소혈청 알부민 (BSA)을 사용하였다.
구체적으로, 96-웰 미세적정 플레이트 (Nunc 사, 미국)의 각 웰을 TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl)에 녹인 상기 각 항원 (10 ㎍/㎖) 100 ㎕로 25℃에서 1시간 동안 코팅한 다음, 각 웰을 TBS에 0.05% 트윈 20이 첨가된 TBST로 3회 세척한 다음, 3% BSA를 포함하는 TBS로 블로킹하였다. 1:100으로 희석한 각 혈장 샘플 100 ㎕씩을 각 웰에 첨가하여 25℃에서 약 1시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 세척하였다. 각 웰에 알칼린 포스파타제가 접합된 항-인간 IgG/IgM (2.5 ㎍/㎖, Pierce 사) 100 ㎕를 가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 세척한 다음, p-NPP (p-nitrophenyl phosphate, 1 ㎎/㎖) 100 ㎕를 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 405 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 각 항원에 대한 항체 역가를 정량하였으며, DR5 및 DcR1 항원에 대해 높은 항체 역가를 나타낸 8개의 혈청에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 선별된 8개의 혈청은 DR5에 대하여 DcR1 및 대조군인 BSA에 대한 것보다 2배 이상 높은 항체 역가를 나타내었다.
실시예 2: scFv 항체 라이브러리의 구축
<2-1> 항체의 중쇄 및 경쇄의 증폭
TRIzol 시약 (Invitrogen 사, 미국)을 이용하여 상기 실시예 1에서 선별된 8개 혈액의 말초 혈액 림프구로부터 전체 RNA를 추출한 후, 올리고텍스 mRNA 키트 (Oligotex mRNA kit, Qiagen 사, 미국)를 이용하여 mRNA를 분리하였다. 이어서, 역전사 효소, 랜덤 헥사머 프라이머 (Amersham pharmacia Bioscience 사, 미국) 및 아큐파워 RT 프리믹스 키트 (AccuPower RT Premix kit, Bioneer 사, 한국)를 사용하여 인간 scFv 항체의 단일가닥 cDNA 라이브러리를 증폭하였다.
인간 항체 IgG (ζ) 및 IgM (μ)의 중쇄 가변영역 (VH)과 인간 항체의 경쇄 가변영역 (Vκ 및 Vλ)을 증폭하기 위하여, 프라이머들의 조합을 이용하여 총 71번의 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하였으며 (VH, Vκ 및 Vλ 유전자에 대해서 각각 28, 16, 및 27번), 상기 PCR은 95℃에서 2분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분의 반응을 30회 반복하였다.
상기 프라이머는 문헌 (Little 등, J. immunol. Methods, 231:3-9, 1999)에서 사용된 프라이머들을 하기와 같이 변경하여 사용하였다.
구체적으로, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역 사이에 링커를 삽입하기 위해, 중쇄 가변영역 역방향 프라이머의 5＇-말단에 5＇-CGA GCC CCC GCC ACC CGA ACC GCC CCC ACC TCT-3＇ (서열번호 17)을 추가하였으며, Vκ 및 Vλ의 정방향 프라이머 의 5＇-말단에 5＇-GGT TCG GGT GGC GGG GGC TCG GGC GGG GGT GGC TCA GAT CT-3＇ (서열번호 18)을 추가하였다.
또한, scFv 항체 라이브러리가 효모 표면 발현벡터와 상동성 재조합 (homologous recombination) 기작에 의해 효모에 형질전환되도록 하기 위해, 중쇄 가변영역 정방향 프라이머의 5＇-말단에 5＇-AGT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GCT AGC-3＇ (서열번호 19)을 추가하였으며, Vκ 및 Vλ의 역방향 프라이머의 5＇-말단에 5＇-TCA GAT CTC GAG CTA TTA CAA GTC CTC TTC AGA AAT AAG CTT TTG TTC GGA TCC-3＇ (서열번호 20)을 추가하였다.
<2-2> scFv 항체 유전자의 증폭
상기 <2-1>과 같이 증폭된 중쇄 및 경쇄 가변영역의 각 PCR 산물들을 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 정제하였다. 상기 정제된 중쇄 및 경쇄 가변영역의 PCR 산물들을 동량 혼합한 다음, 중첩 연장 PCR (overlap extension PCR)을 수행하여 scFv 유전자 산물을 제조하고 상기와 동일한 방법으로 정제하였으며, 상기 PCR은 95℃에서 2분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분의 반응을 30회 반복하였다.
<2-3> scFv 항체 유전자 라이브러리의 구축
scFv 항체 유전자 라이브러리 (10 ㎍/㎕)와 scFv 효모 표면 발현벡터 (pCTCON; Colby 등, Methods Enzymol., 388:348-358, 2004) (1 ㎍/㎕)를 혼합한 후, 전기천공 (electroporation)을 이용하여 효모 EBY 100 균주 (Invitrogen 사)에 형질전환시킨 다음, 선택적인 SD-CAA 배지 (-ura, -trp; 20 g/ℓ 글루코스, 아미노산이 첨가되지 않은 YNB (yeast nitrogen base, Difco 사), 5.4 g/ℓ Na2HPO4, 8.6 g/ℓ Na2HPO4·H2O 및 5 g/ℓ 카사미노산 (casamino acid))에서 접종하여 증식시킨 후, SD-CAA 배지에서 글루코스를 갈락토스로 치환한 SG-CAA 배지에서 scFv의 세포 표면 발현을 유도하는 라이브러리를 선별하였다. 상기 라이브러리를 포함하는 세포를 SD-CAA 배지로 단계적으로 10배씩 희석하여 아가 플레이트에 플레이팅하고 라이브러리 크기를 결정하였다.
그 결과, 약 2 × 106의 scFv 항체 라이브러리를 구축되었음을 확인하였다 (소위, 유사면역 라이브러리 (pseudo-immune library)).
실시예 3: 항-DR5 scFv 항체 라이브러리의 선별
상기 실시예 2에서 선별된 효모 표면에 구축된 scFv 항체 라이브러리에서 DR5에 특이적으로 높은 친화도를 나타내는 scFv 항체를 선별하기 위하여, 상기 라이브러리, 1:100으로 희석된 항-c-myc 9E10 mAb (Ig Therapy 사, 한국) 및 바이오틴 표지 키트 (EZ-LINKTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit, Pierce 사, 미국)를 이용하여 바이오틴이 표지된 DR5 1 μM을 1 ㎎/㎖의 BSA 0.2 ㎖가 첨가된 PBS (PBSB, pH 7.4)에 첨가한 후, 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 세포를 빙냉 PBSB로 세척한 다음, 2차 항체로서 FITC-표지된 항-마우스 IgG (1:25 희석) 및 피코에리쓰린 (PE)이 접합된 스트렙타비딘 (streptavidin-R-phycoerythrin conjugate (SA-PE), Molecular Probes 사, 미국; 1:100 희석)으로 표지하였다. 표지된 세포들을 세척하고 다시 PBSB에 재현탁한 후, MACS (magnetic activated cell sorting)를 이용하여 DR5에 친화도가 있는 scFv 라이브러리를 1차로 부유시킨 후, FACS (fluorescence activated cell sorting)를 순차적으로 수행하여 효모 세포 표면에 구축된 항-DR5 scFv 항체 라이브러리에서 항원에 결합하는 항체인 HW1 및 HW6를 선별하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
선별된 HW1과 HW6의 뉴클레오타이드 서열을 정방향 프라이머 5＇-GTT CCA GAC TAC GCT CTG CAG G-3＇ (서열번호 21) 및 역방향 프라이머 5＇-GAT TTT GTT ACA TCT ACA CTG TTG-3＇ (서열번호 22)을 이용하여 분석한 다음, 아미노산 서열을 결정하였다.
실시예 4: 항-DR5 scFv 항체의 발현 및 정제
상기 실시예 3에서 선별된 항체 HW1 및 HW6를 제한효소 NheI/BamHI을 이용하여 각각 박테리아 발현벡터에 인 프레임 (in-frame)으로 클로닝하였다. 이때, 박테리아 발현벡터는 T7 프로모터-PelB 페리플라즘 표적화 서열-인간 scFv-Flag tag-6X His tag을 가지도록 디자인한 pKJ1 발현벡터를 사용하였으며 (도 4), 상기 벡터는 pET21b 벡터 (Novagen 사)에 근거하여 PelB 염기서열 및 제한효소 사이트 NheI/BamHI을 삽입하고, C-말단에 Flag tag 및 6x His tag가 융합되도록 제조된 것 이다.
상기 발현벡터를 대장균 (E.coli BL21 (DE3), Novagen 사)에 형질전환시킨 다음, 대장균을 37℃에서 OD600=0.6-0.8 정도로 배양한 후, 단백질 발현을 위해 IPTG (0.5 mM)를 첨가하고 25℃에서 20시간 동안 추가로 배양하였다. 상기와 같이 배양된 박테리아의 페리플라즘 분획 또는 상등액으로부터 Talon 수지 (Clontech 사)를 사용하여 발현된 항체를 정제한 다음, 정제된 항체의 크기 및 순도를 각각 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 (western blotting, 항-His tag 이용)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과, 약 29 kDa의 분자량 (도 5a 참조)을 갖는 항체가 98% 이상의 순도 (도 5b 참조)로 정제되었다.
시험예 1: 항-DR5 scFv 항체의 형태 확인
상기 실시예 4에서 정제된 HW1 및 HW6가 용액상태에서 단일분자 형태 (monomeric form)로 존재하는지 아니면 다중분자 형태 (oligomeric form)로 존재하는지를 규명하기 위해 크기 배제 HPLC (SEC), 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE를 수행하였다.
SEC의 경우, 용출 완충액은 PBS (50 mM 포스페이트, pH7.4, 150 mM NaCl)이었으며, 유속은 0.7 ㎖/분, 컬럼은 세파덱스 (Sephadex) 25 크기 배제 컬럼 (Pharmacia 사), 및 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여, 280 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
이때, 환원성 SDS-PAGE는 샘플 완충액에 1 mM DTT가 첨가된 10% 겔을 사용하고, 비환원성 SDS-PAGE는 샘플 완충액에 1 mM DTT가 첨가되지 않은 10% 겔을 사용하여 수행되었으며 (문헌 [Laemmli UK, Nature, 227:680-685, 1970] 참조), 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 항체를 10 ㎎/㎖ 농도로 주입하였을 때 단일분자 형태로 용출되는 것을 볼 수 있었으며, 또한, 환원성 SDS-PAGE (도 7a) 및 비환원성 SDS-PAGE (도 7b)에서도 비천연 다이설파이드 (non-native disulfide) 결합이 있는 다중분자 형태는 없었다.
따라서, 본 발명의 항체는 매우 높은 농도에서도 단일분자 형태로 존재함을 알 수 있다.
시험예 2: 항-DR5 scFv 항체의 친화도 및 교차 반응성 측정
DR5 항원에 대한 HW1 및 HW6의 결합 친화도 및 다른 항원 DcR1, DcR2, DR4, TNFR1, TNFR2 및 CD95와의 교차 반응성을 Biacore 2000 SPR (surface plasmon resonance) 바이오센서 (Pharmacia 사)를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 약 0.5-1.0 ㎎/㎖의 각 항원 (DR5, DcR1, DcR2, DR4, TNFR1, TNFR2 및 CD95 (R&D Systems 사))을 제조사의 설명서에 따라 CM5 칩 (carboxymethylated dextran surface chip, Pharmacia 사)에 약 2,000 내지 4,000 반응 단위 (response unit)로 고정화시킨 후, PBS를 이용하여 다양한 농도로 희석한 항체 HW1 (200-3,200 nM) 및 HW6 (25-1,000 nM) 30 ㎕씩을 25℃에서 30 ㎕/min 의 속도로 칩에 주입하여 항원과의 상호작용을 정량하였다. 칩의 표면은 25 mM NaCl/50 mM NaOH로 재생하였으며, BIA evaluation ver. 3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동 속도 상수 (k on 및 k off)와 평형 해리 상수 (K D)로 얻었으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 교차 반응성을 도 8a 내지 8d에 나타내었다.
도 8a 내지 8d에 나타난 바와 같이, HW1 및 HW6는 DR5에 높은 친화력으로 특이적으로 결합하는 반면 (도 8a 및 8c), 다른 유사 항원, 즉 DcR1, DcR2, DR4, TNFR1, TNFR2 및 CD95에는 매우 높은 농도 (최대 10 μM에서도 친화성이 없었다 (도 8b 및 8d).
따라서, 본 발명의 HW1 및 HW6는 DR5에만 특이적으로 결합하는 항체임을 알 수 있다.
시험예 3: 항-DR5 scFv 항체와 세포에 발현된 DR5의 결합 확인
실제 세포 표면에 발현된 DR5에 HW1 항체가 특이적으로 결합하는지를 조사하기 위하여, DR5의 세포밖 도메인과 YFP (yellow fluorescent protein)가 결합된 단백질 (DR5ΔCDYFP)을 발현하는 벡터 T010, DcR2의 세포밖 도메인과 YFP가 결합된 단백질 (DcR2ΔCDYFP)을 발현하는 벡터 T30을 Chan 교수 (미국 매사츄세스 대학)로부터 얻은 후 (Clancy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:18099-18104, 2005), 대장암 세포인 HCT116 (ATCC (American Type culture collection))에 전기천공을 이용하여 형질전환시켜 각각 단백질이 과발현되도록 하였다.
상기 형질전환된 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 5× 104 세포의 농도로 가한 후, 30 시간 동안 5% CO2 배양기에서 배양하였다. HW1과 TRAIL (KOMA Biotech 사, 한국)을 Alexa633 라벨링 키트 (Molecular Probes 사, 미국)를 이용하여 각각 빨간색 형광으로 표지한 후, 상기에서 배양된 형질전환 세포에 가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 웰을 PBS (2% FCS 및 2% 파라폼알데하이드 포함)로 3회 세척한 후, 형광현미경 (LMS510 model laser scanning confocal fluorescence microscope, Carl Zeiss 사)으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 9a 및 9b에 나타내었다.
도 9a 및 9b에 나타난 바와 같이, HW1 (빨간색)은 DR5ΔCDYFP (녹색)에 특이적으로 결합하여 서로 결합된 색깔 (주황색)을 나타내는 반면, DcR2ΔCDYFP에는 결합하지 않았다 (도 9a). 한편, TRAIL은 DR5 및 DcR2에 모두 잘 결합하는 단백질이므로, DR5ΔCDYFP 및 DcR2ΔCDYFP에 모두 잘 결합하는 양상을 볼 수가 있었다 (도 9b).
따라서, HW1 항체는 용액상태의 DR5뿐만 아니라 세포막에 발현된 DR5에도 교차반응성이 없이 특이적으로 결합함을 알 수 있다.
시험예 4: 항-DR5 scFv 항체의 DR5 에피토프 규명
HW1 및 HW6가 항원인 DR5에 결합하는 부위 (epitope)를 규명하기 위해 TRAIL과의 경쟁적 ELISA (competition ELISA)를 수행하였다.
구체적으로, ELISA용 96-웰 플레이트의 각 웰에 5-20 ㎍/㎖의 DR5 50 ㎕를 코팅한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰을 PBS로 3회 세척한 후 1% BSA가 함유된 PBS를 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 1× 10-4 내지 1× 103 ㎍/㎖의 농도로 HW1, HW1+TRAIL, HW6 및 HW6+TRAIL을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하고 플레이트를 세척한 다음, 일차 항체 (항-M2 mAb (Sigma 사) 및 항 E-tag 항체 (Amersham 사))를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 각 웰을 3회 세척하고 이차 항체 (알칼리 포스파타제가 접합된 항-생쥐 IgG Fc 특이적 항체, Sigma 사)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 각 웰을 3회 세척한 후 기질로 p-NPP 50 ㎕를 첨가하여 100분 동안 반응시킨 후 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, HW1 및 HW6는 모두 TRAIL의 존재 여부에 상관없이 항체 농도가 증가함에 따라 DR5와의 결합이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, DR5가 고정화된 플레이트에 HW1 (5 ㎍/㎖) 및 HW6 (16 ㎍/㎖)을 각각 미리 배양하여 결합시킨 후, TRAIL을 0.01 ㎍/㎖ 내지 1,000 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 결합 여부가 변하는지를 조사하였으며, 그 결과를 도 10b에 나타내었다.
도 10b에 나타난 바와 같이, TRAIL을 매우 높은 고농도 (500 ng/㎖)까지 처리했을 때에도 HW1 및 HW6가 항원에 결합하는 정도는 변함이 없었다.
따라서, HW1 및 HW6는 DR5에 결합할 때 TRAIL과는 전혀 다른 부위에 결합하는 것을 알 수 있다.
시험예 5: 항-DR5 scFv 항체의 다양한 암세포에서의 세포사멸 유도 확인
항-DR5 인간 scFv 항체 HW1 및 HW6의 세포사멸 유도 가능성을 다양한 암세포, 즉 TRAIL-민감성 세포주 (TRAIL-sensitive cell lines)로는 인간 급성 골수성 백혈병 암세포 (human acute myeloid leukemia cell)인 HL60, 인간 대장암 세포 (human colon cancer cell line)인 HCT116 및 인간 전립선 암세포 (human prostate cancer cell)인 Du145를, TRAIL-저항성 세포주 (TRAIL-resistant cell lines)로는 인간 간암 세포인 (human hepatocellular carcinoma cancer cell) HepG2 및 Huh7, 인간 뇌 성상 암세포인 (human astrocyte cancer cell) U87MG, 및 인간 T 세포 백혈병 암세포인 (Human T-lymphoblastoid leukemia) Molt-4 (ATCC)을 모델로 사용하여 평가하였다. 이때, 흡착성 세포인 HCT116, Du145, HepG2, Huh7 및 U87MG 세포의 배양용 배지로는 10% FCS, 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지 (Gibco Invitrogen 사)를, 비흡착성 세포인 HL60 및 Molt-4 세포의 배양용 배지로는 10% FCS, 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며, 모든 배양은 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다.
<5-1> 세포의 준비
액체 질소 탱크에 보관되어 있는 세포주들을 꺼내어 37℃에서 빠르게 녹인 후 원심분리하여 냉동 보관 배지를 제거하였다. 원심분리하여 얻은 세포 펠렛을 배양 배지에 잘 섞어서 배양 플라스크에 넣고 배양하였다. 2 내지 3일 후 세포가 안정적으로 배양되면, HCT116, HepG2, Du145 및 U87MG 세포의 경우에는, TE 완충액 (트립신-EDTA) 1 ㎖를 처리하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 5 ㎖로 TE 완충액의 반응을 중지시키고 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였다. 또한, HL60 및 Molt-4 세포의 경우에는, 배양용기에서 바로 세포를 회수한 다음, 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였다.
그 후, 회수된 세포들은 상기와 동일한 배양배지로 각각 재현탁한 후 96-웰 플레이트에 웰당 세포를 1× 104 (100 ㎕)씩 분주하여 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석에 사용하였다.
<5-2> TRAIL-민감성 암세포주에 대한 세포사멸 유도 분석
각 웰에 정제된 TRAIL (0.001 내지 1.0 ㎍/㎖), 및 HW1 및 HW6 항체 (0.05 내지 50 ㎍/㎖)를 각각 첨가한 후, TRAIL 민감성 HL60, HCT116 및 Du145 세포에 대한 정량적인 세포사멸 유도 효과를 MTT 실험 (Muhlenbeck 등, J Biol Chem., 275:32208-32213, 2000)을 이용하여 확인하였다 (도 11a 및 11b).
구체적으로, 상기 플레이트의 각 웰에 PBS 100 ㎖에 녹인 MTT (Sigma 사) 용액 (5 ㎎/㎖)을 넣고 4 내지 5 시간 동안 배양한 후, 세포 배양액과 MTT 용액을 제거하고 200 ㎖의 DMSO를 첨가하여 MTT-포르마잔 결정 (formazan crytal)을 용해시킨 후, 570 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 이때, HL-60과 같은 비흡착성 세포주 (anchorage-independent cell line)의 경우, 세포 배양액과 MTT 용액을 제거하기 전에 플레이트를 원심분리하여 세포를 침전시킨 후 상청액을 제거한 후 정량하였다.
도 11a 및 11b에 나타난 바와 같이, 암세포만 키운 대조군과 비교하여, TRAIL-민감성 암세포주인 HCT116, HL60 및 DU145 세포에 TRAIL을 처리하면 TRAIL의 농도가 증가함에 따라 효율적으로 세포사멸이 일어나는 것을 확인하였다 (도 11a). 또한, 상기 암세포에 HW1 및 HW6를 처리하면 TRAIL과 마찬가지로 항체 농도가 증가함에 따라 세포사멸이 일어나는 것을 확인하였다 (도 11b). 특히, 상기 시험예 1의 결과와 더불어 본 발명의 항체는 다중 결합체 가교제 (cross-linker) 없이도 단일분자 형태로 암세포 세포사멸 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<5-3> TRAIL-저항성 암세포주에 대한 세포사멸 유도 분석
TRAIL-저항성 암세포주인 HepG2, U87MG, Molt-4 및 Huh7 세포를 사용한 것을 제외하고는 상기 <5-2>와 동일한 방법으로 MTT 분석 및 세포 관찰을 수행하였으며, 그 결과를 도 12a 내지 12d, 및 도 13a 및 13b에 나타내었다.
도 12a 내지 12d에 나타난 바와 같이, TRAIL-저항성 암세포주인 HepG2, U87MG 및 Molt-4 세포에 TRAIL을 처리하면 세포사멸이 전혀 일어나지 않는 반면 (도 12a 및 12c), HW1 및 HW6를 처리하면 농도에 비례하여 효율적으로 세포사멸을 유도함을 확인하였다 (도 12b 및 12d).
최근에 TRAIL-민감성인 암세포에 세포독성을 보이는 항-DR5 IgG 형태의 mAb 항체가 보고된 바는 있지만, TRAIL-저항성 암세포에 세포독성을 나타낸 항체는 현재까지 보고된 바 없다.
또한, 도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, TRAIL-저항성 HepG2 세포 (도 13a) 및 Huh7 세포 (도 13b)에 HW1 (25 ㎍/㎖) 및 HW6 (25 ㎍/㎖)을 처리하면, 20 시간 후에는 세포사멸이 유도되어 세포가 부착되지 못하고 죽어서 배지에 떠 있는 것을 볼 수가 있지만, TRAIL (500 ng/㎖)을 처리하면 세포가 전혀 죽지 않는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 항체는 다중 결합체 없이도 단일분자 형태로 암세포의 세포사멸을 유도하며, 특히 TRAIL-저항성 세포주에서도 세포사멸을 유도함을 알 수 있다.
<5-4> 정상세포에 대한 세포사멸 유도 분석
정상세포에 대한 HW1 및 HW6의 세포 독성을 평가하기 위해, 정상 인간 간세포 (hepatocytes) 및 유선세포 (mammary epithelial cells) (Cambrex BioScience 사), 및 뇌 성상세포 (astrocyte, 문헌 [Kim 등, Oncogene, 24:838-849, 2005])를 이용하여 상기 <5-1> 및 <5-2>와 동일한 방법으로 세포 배양, MTT 분석 및 세포 관찰을 수행하였으며, 그 결과를 도 14a 및 14b, 및 도 15에 나타내었다.
도 14a 및 14b에 나타난 바와 같이, 인간 간세포 (도 14a)와 유선세포 (도 14b)에서 HW1과 TRAIL을 농도별로 처리하고 30시간이 지난 후에는 TRAIL과 마찬가지로 HW1이 가장 높은 농도로 처리했을 때만 약 30% 정도의 세포사멸을 유도하였고, 그 이하의 농도에서는 세포사멸을 거의 유도하지 않았으며, 이는 암세포에 대한 것보다 현저히 낮은 세포독성을 보여주는 결과이다.
또한, 도 15에 나타난 바와 같이, 정상세포인 뇌 성상세포에 HW1 (40 ㎍/㎖) 및 HW6 (40 ㎍/㎖)를 고농도로 처리하고 48시간까지 관찰한 후에도 세포가 전혀 죽지 않는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 항체는 암세포에만 세포사멸을 유도하고, 정상세포에는 세포독성이 없음을 알 수 있다.
시험예 6: 항-DR5 scFv 항체의 DR5를 통한 암세포 세포사멸 유도 확인
<6-1> DR5를 발현하는 HCT116 세포에서의 세포사멸 유도 확인
HW1이 세포 표면에 발현된 DR5를 통해 세포사멸을 유도하는 지를 확인하기 위하여, TRAIL (100 ng/㎖)과 HW1 (5 ㎍/㎖)에 의한 HCT116 암세포의 세포사멸 유도과정에 세포 표면에 발현된 DR5와 경쟁할 수 있는 용액상태의 DR5-Fc (DR5에 항체 불변영역 Fc가 결합된 단백질)을 농도별로 첨가한 후, 30시간 배양하면서 세포사멸 억제 정도를 평가하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, DR5-Fc의 농도가 증가할수록 TRAIL 및 HW1에 의한 세포사멸이 감소하여, 10 ㎍/㎖의 DR5-Fc에서는 세포사멸이 완전히 억제되는 결과를 얻었다. 따라서, HW1이 TRAIL과 마찬가지로 세포 표면에 발현된 DR5에 특이적으로 결합하여 세포사멸을 유도함을 알 수 있다.
<6-2> DR5를 과발현하는 HCT116 세포에서의 세포사멸 유도 확인
HW1이 DR5가 과발현된 암세포에서 세포사멸을 유도하는 지를 확인하기 위해, HCT116 암세포를 키운 후, 설포라판 (10 μM)을 9시간 동안 처리하여 DR5를 과발현시킨 후 (Kim 등, Cancer Res ., 66:1740-1750, 2006), TRAIL 및 HW1을 농도 별 (0.01 내지 10 ㎍/㎖)로 처리하여 30시간 동안 반응시킨 다음, 암세포의 세포사멸 정도를 MTT 방법을 통해 정량하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 설포라판을 처리하지 않은 대조군에 비해 설포라판을 처리한 실험군에서 TRAIL과 HW1 모두 같은 농도에서 세포를 더 잘 죽이는 것을 관찰하였다.
따라서, HW1이 DR5에 특이적으로 결합하여 세포사멸 신호 전달 기작을 통해 암세포에 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있다.
시험예 7: 가교제가 항-DR5 scFv 항체의 암세포 세포사멸 유도에 미치는 영향 평가
기존의 항-DR5 항체가 이중 항원 결합부위를 (divalent) 갖는 IgG 형태로는 세포사멸을 유도하였으나, 단일분자 형태인 Fab형태로는 세포사멸을 유도하지 못하였다 (Motoki 등, Clin. Cancer Res., 11:3126-3135, 2005; Wajant 등, Oncogene, 20:4101-4106, 2001). 이에, 본 발명의 항체가 단일분자 형태 뿐 아니라, 다중분자 형태로도 암세포에 세포사멸을 유도하는지를 확인하기 위해, 6X His가 결합되어 있는 HW1에 마우스 유래 항-His6 IgG를 가교제 (crosslinker)로 사용하여 몰농도 1:1로 4℃에서 1시간 동안 배양하여 다중분자를 형성하였다. 이를 TRAIL-민감성 암세포인 HCT116과 TRAIL-저항성 암세포인 HepG2 세포에 처리하고 30시간 동안 배양한 후, 상기 시험예 5의 <5-2>와 동일한 방법으로 MTT분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, 두 세포 모두에서 가교제의 처리 유무에 상관없이 세포사멸이 유도되었다.
따라서, HW1이 단일분자 형태로 암세포에 세포사멸을 유도함을 알 수 있다.
시험예 8: 항-DR5 scFv 항체의 세포사멸 기작 연구
HW1이 어떠한 세포사멸 경로를 통해 다양한 암세포에 세포사멸을 유도하는지를 다음과 같은 방법을 통하여 수행하였다.
<8-1> 투사전자현미경 관찰
TRAIL-민감성 암세포인 HCT116 및 Du145, 및 TRAIL-저항성 암세포인 HepG2 및 U87MG를 TRAIL (0.2 ㎍/㎖) 및 HW1 (25 ㎍/㎖)과 각각 5시간 및 30시간 동안 배양한 후, 카노브스키 용액 (Karnovsky's solution: 100 mmol/ℓ 소듐 카코딜레이트 버퍼 (cacodylate buffer)에 2% 글루타르알데하이드 및 1% 파라폼알데하이드를 용해시킴, pH 7.4)으로 25℃에서 2시간 동안 고정화시켰다. 이를 2% 글루타르알데하이드 및 1% 파라폼알데하이드를 포함하는 100 mmol/ℓ 소듐 카코딜레이트 완충액 (pH 7.4)으로 세척한 후, 1% 오스뮴 테트록사이드와 1.5% 포타슘 페로사이아나이드로 1시간 동안 고정화시켰다. 이를 연속적인 농도의 에탄올 (50-100%)을 사용하여 탈수시키고, 폴리 베드 (Poly Bed) 812 레진 (Pelco 사, 캐나다) 위에 고정화시킨 다음, 초박절편기 (Reichert Ultracut E 초박절편기)를 이용하여 초박막으로 자른 후, 투사전자현미경 (EM 902A, Carl Zeiss 사, 독일)을 사용하여 세포 모양을 관찰하였으며, 그 결과를 도 19a 내지 19d에 나타내었다.
도 19a 내지 19d에 나타난 바와 같이, TRAIL에 의해 죽는 TRAIL-민감성 암세포에서는 핵응축 및 세포 표면에 수포 (membrane blebbing)를 형성이 관찰되어 전형적인 아폽토시스 경로에 의해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다. 반면, HW1에 의한 TRAIL-민감성 및 TRAIL-저항성 암세포에서는 세포내에 수많은 자식작용 액포 (autophagic vacuoles)들이 관찰되었고, 이 자식작용 액포내에는 미토콘드리아와 같은 세포내 소기관이 파괴되어 있는 것이 관찰되었다 (도 19a).
또한, 더 크게 확대하였을 때, 여러 겹의 막으로 둘러싸인 자식작용 액포 (도 19b), 이중막으로 둘러싸인 자식작용 액포 (도 19c) 및 빈 액포와 세포내 소기관을 포함한 액포가 결합되어 자식작용 액포가 형성되는 단계 (도 19d)가 관찰되었다. 이러한 모양은 아폽토시스와 확연히 구분되는 전형적인 자식작용에 의한 세포사멸을 의미한다 (Kondo등, Nat. Rev. Cancer, 5:726-734, 2005; Tsujimoto 등, Cell Death Differ., 2:1528-1534, 2005).
따라서, 본 발명의 항체에 의한 다양한 암세포의 세포사멸은 자식작용에 의한 것임을 알 수 있다. 이는 항-DR5에 대한 항체에 있어는 최초로 보고되는 것이며, DR5 수용체가 아폽토시스 외에도 자식작용에 의한 세포사멸 경로에 의해, TRAIL-저항성 암세포까지도 죽일 수 있다는 것을 보여주는 결과이다.
<8-2> 라이소트랙커 레드를 이용한 자식작용 액포의 특이적 표지 실험
자식작용에 의한 세포사멸은 세포내 자식작용에 의해 생성된 액포를 특이적으로 표지하는 라이소트랙커 레드 (lysotracker-red DND-99, Molecular probes 사)를 이용하여 확인할 수 있다 (Kondo등, Nat. Rev. Cancer, 5:726-734, 2005; 및 Tsujimoto 등, Cell Death Differ, 2:1528-1534, 2005).
이에, TRAIL-민감성 HCT116 암세포와 TRAIL-저항성 U87MG 암세포를 HW1 (25 ㎍/㎖, 20 시간) 처리한 후 세포를 고정화시키고, 이어서 라이소트랙커 레드로 염색한 후, 형광현미경을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 20a 및 20b에 나타내었다.
도 20a 및 20b에 나타난 바와 같이, HCT116 암세포 (도 20a) 및 U87MG 암세포 (도 20b) 모두에서 HW1을 처리한 세포에서만 특이적으로 염색된 자식작용 액포들이 관찰되었다.
따라서, HW1이 암세포에 자식작용에 의한 세포사멸을 유도함을 알 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 DR5 단백질에 특이적으로 결합하여, 이를 발현하는 TRAIL-민감성 암세포뿐만 아니라 및 기존의 TRAIL 또는 항-DR5 항체가 죽이지 못했던 TRAIL-저항성 암세포에서도 자식작용에 의한 세포사멸을 유도하고, 특히, 가교제 없이 단일쇄 형태의 scFv로도 효과적인 세포사멸을 유도하므로, TRAIL-민감성 및 -저항성 암을 포함하는 다양한 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> ANTIBODY BINDING SPECIFICALLY TO DR5 AND COMPOSITION FOR
PREVENTING OR TREATING A CANCER COMPRISING THE SAME
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<150> KR 2006-63126
<151> 2006-07-05
<160> 22
<170> KopatentIn 1.71
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<211> 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR1 of HW1 heavy chain variable region
<400> 1
Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr Thr Val Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR2 of HW1 heavy chain variable region
<400> 2
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR3 of HW1 heavy chain variable region
<400> 3
Arg Glu Pro Asp Ala Gly Arg Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR1 of HW1 light chain variable region
<400> 4
Gln Ser Val Ser Ser Ser His
1 5
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR2 of HW1 light chain variable region
<400> 5
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR1 of HW1 light chain variable region
<400> 6
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Arg Ala Val
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR1 of HW6 heavy chain variable region
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Gly Asp Ser Val Ser Asn Asn Asn Ala Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR2 of HW6 heavy chain variable region
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1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR3 of HW6 heavy chain variable region
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Arg Arg Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr
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<213> Artificial Sequence
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<223> amino acid sequence of CDR1 of HW6 light chain variable region
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Gln Ser Val Ser Ser Gly Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR2 of HW6 light chain variable region
<400> 11
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 12
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of CDR3 of HW6 light chain variable region
<400> 12
His Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asn Thr
1 5
<210> 13
<211> 248
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of HW1
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Thr Val Ala Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Val Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Ile Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Pro Asp Ala Gly Arg Gly Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Ser Pro Leu Arg Trp Gly Arg Phe
115 120 125
Gly Trp Arg Gly Leu Gly Arg Gly Trp Leu Arg Ser Pro Val Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser His Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser
180 185 190
Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Arg Ala Val Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 14
<211> 248
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of HW6
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Arg Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Asn Asn
20 25 30
Asn Ala Ala Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Asp Gly Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Arg Trp Gly
115 120 125
Arg Phe Gly Trp Arg Gly Leu Gly Arg Gly Trp Leu Glu Ile Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Gly Tyr Val Ser Trp
165 170 175
Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala
180 185 190
Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asn Thr Tyr Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Gly Ile Lys
245
<210> 15
<211> 744
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HW1
<400> 15
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaccactg ttgcctggga ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat attataggtc gaagtggtat 180
aatgaatatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca atgtagacac atccaagaac 240
cagatctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggccgtcta ttactgtgca 300
agagagccag atgccggcag gggggctttt gatatctggg gccaagggac cacggtcacc 360
tctcctctga ggtgggggcg gttcgggtgg cgggggctcg ggcgggggtg gctcagatct 420
ccagttaccc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 480
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagcagc cacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 540
caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg 600
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 660
gattttgcag tttattactg tcagcagcgt agcaactggc ctccgcgggc ggtcttcggc 720
caagggacac gactggagat taaa 744
<210> 16
<211> 744
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HW6
<400> 16
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga cgggtgcagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct aacaacaatg ctgcttggta ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca gcccagacac gtccaagaac 240
cagttctccc tgcagttgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agaagaggag atgggaactc ctactttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctcaggaa ttctaaggtg ggggcggttc gggtggcggg ggctcgggcg ggggtggctc 420
gaaattgtat tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 480
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcggctacg tatcctggta ccggcagaaa 540
cctggccagg ctccccggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcatccca 600
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 660
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcac cagtatggta gctcacccaa cacttatggc 720
caggggacca aggtggggat caaa 744
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of linker peptide for reverse primer of heavy
chain variable region
<400> 17
cgagcccccg ccacccgaac cgcccccacc tct 33
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of linker peptide for forward primer of light
chain variable region
<400> 18
ggttcgggtg gcgggggctc gggcgggggt ggctcagatc t 41
<210> 19
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for homologous recombination for forward
primer of heavy chain variable region
<400> 19
agtggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctgc tagc 54
<210> 20
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for homologous recombination for reverse
primer of light chain variable region
<400> 20
tcagatctcg agctattaca agtcctcttc agaaataagc ttttgttcgg atcc 54
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward sequencing primer of HW1 and HW6
<400> 21
gttccagact acgctctgca gg 22
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse sequencing primer of HW1 and HW6
<400> 22
gattttgtta catctacact gttg 24
Claims (15)
- 상보성 결정 영역 (complementarity determining region; CDR)에 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 상보성 결정 영역에 서열번호 7 내지 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10 내지 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 인간 세포사멸 수용체 5 단백질 (death receptor 5; DR5)에 특이적으로 결합하는 항체.
- 제 1 항에 있어서,DR5를 발현하는 TRAIL-민감성 암세포 및 TRAIL-저항성 암세포 모두에 대하여 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항에 있어서,상기 항체가 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항에 있어서,상기 항체가 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항 체.
- 제 1 항에 있어서,상기 항체가 효소, 형광 물질 및 방사성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 표지 물질과 접합되어 있는 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항에 따른 항체를 코딩하는 DNA.
- 제 6 항에 있어서,상기 DNA가 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA.
- 제 6 항에 있어서,상기 DNA가 서열번호 15 또는 16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA인 것을 특징으로 하는 DNA.
- 제 6 항에 따른 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포.
- 제 9 항에 있어서,상기 세포가 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 1 항에 따른 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 11 항에 있어서,상기 항체가 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 11 항에 있어서,상기 항체가 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 11 항에 있어서,상기 암이 DR5를 발현하는 암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 14 항에 있어서,상기 DR5를 발현하는 암이 유방암, 결장암, 뇌종양, 신경교종, 난소암, 자궁내막암, 골육종, 자궁경부암, 전립선암, 폐암, 활액암, 췌장암 및 육종암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
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