KR101117070B1 - 친화도와 안정성이 향상된 항 ｄｒ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포사멸 수용체 5(death receptor 5; DR5)에 특이적으로 결합하여 다양한 암세포를 효과적으로 사멸하는 친화도와 안정성이 향상된 항 ＤＲ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항 ＤＲ5 항체는 기존의 항 ＤＲ5 항체인 HW1의 중쇄가변영역 내의 VH-CDR2, VH-CDR3의 아미노산 잔기와 경쇄가변영역 내의 VL-CDR3의 아미노산 잔기를 돌연변이화하고, 중쇄가변영역 내의 구조(framework)를 VH6 아류형에서 VH3 아류형으로 치환하고 경쇄가변영역 내의 구조를 Vk1 또는 Vk3의 구조 부분으로 치환함으로써, 기존의 항 ＤＲ5 항체인 HW1보다 친화도와 안정성을 향상시킨 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에 따른 항 ＤＲ5 항체는 DR5를 발현하는 TRAIL-민감성 암세포 또는 DR5를 발현하는 TRAIL-저항성 암세포에 대해 자식작용(autophagy)에 의하여 세포사멸을 효과적으로 유도함으로써, ＤＲ5 발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

친화도와 안정성이 향상된 항 ＤＲ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Anti-death receptor 5 antibody with improved affinity and stability, and composition for preventing or treating cancer comprising the same}
본 발명은 세포사멸 수용체 5(death receptor 5; 이하 "DR5"라고 칭함)에 특이적으로 결합하여 다양한 암세포를 효과적으로 사멸하는 친화도와 안정성이 향상된 항 ＤＲ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
단백질 p53-비의존적인(p53-independent) 종양괴사인자 수용체(tumor necrosis factor receptor; TNFR)를 통한 아폽토시스 경로 중, TNF-관련 아폽토시스 유도 리간드(TNF-related apoptosis inducing ligand; TRAIL)에 의해서 활성화되는 세포사멸 수용체 5(DR5)의 경로를 통한 세포사멸 기작은 정상세포에는 부작용이 적으면서 암세포에는 특이적으로 세포사멸을 유도하므로 암 치료제 개발의 중요 표적으로 여겨져 왔다(Ashkenazi 등 J. Clin. Invest., 104:155-162, 1999; 및 Ashkenazi 등, Nat. Rev. Cancer, 2:420-430, 2002).
현재 DR5를 표적으로 암세포 특이적인 치료제를 개발하려는 연구로는, 상기 세포사멸 수용체들의 리간드인 재조합 TRAIL(예를 들면, TRAIL의 114-281번 아미노산 잔기)을 이용하는 방법과 세포사멸 수용체들에 특이적인 쥐 또는 인간 유래의 완전 항체(예를 들면, mAb 또는 IgG) 중에서 아고니스트(agonist) 항체를 개발하는 방법이 있다(Pollack 등, Clin. Cancer Res., 7:1362-1369, 2001; Jo 등, Nat. Med., 6:564-567, 2000; Ichikawa 등, Nat. Med., 7:954-960, 2001; 및 Walczak 등, Nat. Med., 5:157-161, 1999). 그러나, 재조합 TRAIL은 매우 불안정하여 가용성 올리고머(soluble oligomer)를 형성하므로 아폽토시스 활성이 20 내지 100배 정도 감소되고, 정상세포인 성상세포(astrocytes), 간세포(hepatocytes), 각질세포 (keratinocytes) 등에도 세포독성과 면역작용을 일으켜 부작용이 크다(Jo 등 Nat. Med., 6:564-567, 2000). 또한, TRAIL은 50% 이상의 악성 종양세포에는 세포사멸을 유도하지 못한다(Zhang 등, Cancer Gene Ther., 12:228-237, 2005). 일반적으로 TRAIL에 의해서 죽는 암세포들을 TRAIL-민감성(TRAIL-sensitive) 암세포라 하고, TRAIL에 의해서 죽지 않는 암세포들을 TRAIL-저항성(TRAIL-resistant) 암세포라고 한다.
현재까지 DR5와 관련된 세포사멸을 유도하기 위해 개발된 DR5에 특이적인 친화도를 갖는 항체로는, 쥐 유래 단일클론 항체로부터 개발된 인간화 항체인 TRA-8 (쥐 유래 IgG) (Walczak 등, Nat. Med., 5:157-161) 및 AD5-10(쥐 IgG) (Guo 등, J. Biol. Chem., 280:41940-41952, 2005), 인간 유래 단일 클론 항체인 HGS-ETR2 (인간IgG1) (Georgakis 등, Br. J. Haematol., 130:501-510, 2005) 및 KMTR2 (인간 IgG4) (Motoki 등, Clin. Cancer Res., 11:3126-3135, 2005) 등이 있다.
상기 항체들은 모두 TRAIL-민감성 암세포들에서만 세포사멸을 유도하고, TRAIL-저항성 암세포에서는 세포사멸을 유도하지 못하였다. 또한, 단일항원 결합부위(monovalent)를 갖는 Fab 또는 scFv 형태로는 암세포에서 세포사멸을 유도하지 못하였고(예: KMTR2), 이중 항원 결합부위(divalent)를 갖는 IgG 형태로만 세포독성을 보이거나(예: HGS-ETR2 및 AD5-10) IgG를 가교제(cross-linker)로 사용해야만 세포사멸을 유도할 수 있었다(Chuntharapai 등, J. Immunol., 166:4891-4898, 2001; Motoki 등, Clin. Cancer Res., 11:3126-3135, 2005; 및 Wajant 등, Oncogene, 20:4101-4106, 2001).
따라서, 기존의 리간드인 TRAIL을 대신하여 DR5에 특이적인 친화도를 갖는 항체를 개발하여 세포사멸을 유도하는 방법에 관하여 많은 연구가 진행되고 있다 (Walczak 등, Nat. Med., 5:157-161, 1999; 및 Guo 등, J. Biol. Chem., 280:41940-41952, 2005; 및 Georgakis 등, Br. J. Haematol., 130:501-510, 2005). 상기 연구의 일 예로, DR5에 대한 TRAIL을 대체하여 기존에 개발된 항체들과는 다르게 TRAIL-민감성 세포주는 물론 TRAIL-저항성 세포주도 자식작용(autophagy)에 의한 세포사멸 경로를 통하여 정상세포에 독성없이 효과적으로 세포사멸을 유도하는 항체를 개발하였고(Park 등, Cancer Research, 1;67(15):7237-34, 2007; 대한민국 등록특허 제 10-0847010호에), 이 항체는 다양한 암의 예방 및 치료에 응용될 수 있다.
진핵세포의 세포사멸은 3가지 기작, 즉 형태학적 및 생화학적 특징에 따라 크게 자가사멸(apoptosis), 자식작용(autophagy), 괴사(necrosis)로 나타난다 (Kromer G 등 (2005), Cell Death Differ. 12 Suppl 2:1463-1467). 이 중 자식작용에 의한 세포사멸은 2형 세포사멸(type Ⅱ programmed cell death)로 분류되고, 영양결핍(nutrient starvation)이나 환경적 스트레스, 또는 다양한 화합물들에 의해 증가되며, 그 과정은 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 유래되거나 새롭게 합성되는 이중막 구조가 만들어지고, 여기에 세포 내 소기관(미토콘드리아 등)이나 세포질 내 단백질들을 고립시키면서 오토파고좀(autophagosome)을 형성하여, 궁극적으로 리소좀(lysosome)과 융합하여 파괴시킨다(Kondo Y 등 (2005). Nat. Rev. Cancer. 5:726-734). 자식작용이 일정수준 이상이면 세포사멸을 일으키며, 이러한 자식작용에 의한 세포사멸을 이용한 암치료제 개발이 현재 관심을 받고 있다 (Martinet W 등 (2009), Clinical Science. 116:697-712).
항체의 가변부위 중 V 단편은 항체 서열의 대부분을 차지하는 단편으로서 다양한 아류형(subtype)이 존재하며, 중쇄가변영역(VH)의 경우 VH3가 가장 안정한 아류형이고, VH1a, VH1b 및 VH5가 중간적 위치이며, VH2, VH4 및 VH6는 안정성 면에서 떨어진다. 경쇄가변영역(VL)의 경우 Vk3 및 Vk1이 가장 안정한 형태로 알려져 있다. 따라서, 각 아류형에 대한 열역학적 안정성 및 항체 생산수율 등에 대한 연구가 선행되어져 왔다(Ewert S 등, J. Mol. Biol., 325:531-553, 2003; Ewert S 등, Biochemistry, 42:1517-1528, 2003). 이들 연구 중 CDR 이식(CDR grafting)법은, 안정성이 떨어지는 항체의 CDR을 상대적으로 열역학적 안정성 및 항체 생산수율이 높은 아류형에 이식하여 항체의 열역학적 안정성을 높인 연구 결과를 나타내어 주목할 만 하다(Jung 등, Protein. Eng., 10:959-966, 1997).
또한, 치료용 항체의 친화도 향상은 일회 투여량의 감소효과를 기대할 수 있어, 비용 절감 및 효능 증대, 부작용 감소 등의 종합적인 치료 효율성 증가로 이어질 수 있다. 그러나, 아고니스트(agonist)에 있어서 리간드-수용체 결합친화도의 증가가 반드시 생물학적 활성과 연계되지는 않는다(Jones 등, Trends. Biotechnol., 26:498-505, 2008). 이의 일 예로, 야생형(wild-type) 인간 성장 호르몬(human growth hormone)에 비하여 수용체에 대한 친화도가 약 400배 증가한 변이체를 제작하였으나 정작 세포 성장에 있어서 특별히 향상된 점이 없는 경우 (Pearce 등, Biochemistry, 38:81-89, 1999), 또는 야생형에 비하여 외피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)에 결합력이 강한 외피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)를 개발하였으나 오히려 길항능(antagonistic activity)을 보이는 경우(Coco 등, Nat. Biotechnol., 20:1246-1250, 2002) 등이 보고되었다.
따라서, 항체의 친화도를 향상시키기 위하여 다양한 방법이 연구되어 왔다. 구체적으로는, 1) 우선 전체 항체 서열에 대하여 무작위적으로 변이를 주어 친화도가 향상된 변이체를 선별하는 방법(Boder ET 등, Proc Natl Acad Sci USA, 26;97(20):10701-5, 2000), 2) 항체의 구조 및 선행 연구 성과를 바탕으로 친화도 향상에 영향을 줄 것이라 예상되는 특정 아미노산을 선택하여 변이체를 제작하는 방법(Barderas R 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(26):9029-34, 2008), 및 3) 항원과의 특이적인 결합에 영향을 주는 부위인 상보성 결정 부위(Complementarity Determining Regions, CDRs) 만을 변이시켜 선별하는 방법(Garcia-Rodriguez C 등, Nat Biotechnol, 25(1):107-16, 2007) 등이 있고, 각각의 방법들은 독립적으로 뿐만 아니라 서로 복합적으로 사용되어 친화도 향상에 있어서 더 좋은 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명자들은 기존의 항 ＤＲ5 항체보다 친화도와 안정성이 더 향상된 항 ＤＲ5 항체를 개발하기 위하여 연구하던 중, 기존의 항 DR5 인간 항체인 HW1의 변이체를 제작하였으며, 상기 제작한 HW1의 변이체의 친화도 및 안정성이 기존의 HW1보다 더 향상되고 DR5를 발현하는 TRAIL-민감성 암세포 또는 DR5를 발현하는 TRAIL-저항성 암세포에 대해 자식작용에 의하여 세포사멸을 효과적으로 유도함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 친화도와 안정성이 향상된 항 ＤＲ5 항체를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 항 ＤＲ5 항체를 코딩하는 DNA를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 항 ＤＲ5 항체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 7 또는 39의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DR5에 특이적으로 결합하는 항 ＤＲ5 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항 ＤＲ5 항체를 코딩하는 DNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포 를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항 ＤＲ5 항체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 항 ＤＲ5 항체는, 항-DR5 인간 항체인 HW1(대한민국 등록특허 제 10-0847010호)의 중쇄가변영역(heavy chain variable region) 내의 VH-CDR2, VH-CDR3의 아미노산 잔기와 경쇄가변영역(light chain variable region) 내의 VL-CDR3의 아미노산 잔기를 돌연변이화하여 DR5에 대한 친화도를 향상시키고, 더불어 중쇄가변영역 내의 구조(framework)를 VH6 아류형에서 VH3 아류형으로 치환하고, 경쇄가변영역 내의 구조를 Vk1 또는 Vk3의 구조 부분으로 치환하여 안정성을 향상시킨 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 "세포사멸 수용체-5 (DR5) 단백질"은 종양괴사인자(TNF) 수용체 패밀리의 일원이고 TRAIL에 결합하며, C-말단에 세포내 죽음 도메인(death domain)을 갖는 수용체를 의미한다(Pan 등, Science, 277:815-818, 1997). DR5가 TRAIL에 결합하는 경우 TRAIL-민감성 암세포에서 아폽토시스를 유도하고, DR5가 과발현되는 경우에는 아폽토시스가 증가하지만 정상세포에서는 아폽토시스를 유도하지 않는 것으로 알려져 있다. DR5는 상기한 바와 같은 특성을 갖는 단백질이면 어느 것이나 포함되며, 예를 들어 미국특허 제 6,872,568호에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "항체"는 전체 형태의 항체("전항체") 또는 그의 기능적인 단편 일 수 있다. 상기 전항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있다. 상기 항체의 기능적인 단편은 전항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체로서, 실질적으로 전항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위 (epitope)를 인식하는 것을 의미한다. 상기 항체의 기능적인 단편에는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등이 포함되나 이에 한정되지 않으며, 본 발명에서는 scFv가 바람직하다. 상기 단일쇄 가변영역(scFv)은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통하여 연결되어 단일쇄 폴리펩티드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.
상기 항체는 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 파지 디스플레이 방법 또는 효모 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다.
scFv를 제조하는 방법으로는 미국특허 제 4,946,778호 및 제 5,258,498호에 기재된 방법이 사용될 수 있으며, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 방법으로는 WO 92/22324 등에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 항체일 수 있다. 여기서 인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체가 포함된다(미국 특허 제 5,939,598호 참조).
본 발명의 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 항 ＤＲ5 항체는, 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3가 각각 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역과 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3가 각각 서열번호 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하며, DR5에만 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 "특이적으로 결합한다"는 본 발명의 항체가 DR5 항원에만 결합하고, DR5와 유사한 항원인 DR4(death receptor 4), DcR1(death decoy receptor 1) 및 DcR2에는 실질적으로 결합하지 않는다는 것을 의미한다.
상기 경쇄 가변영역은 서열번호 27 또는 37의 아미노산 서열을 가지며, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 28 또는 38의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항 ＤＲ5 항체는 서열번호 7 또는 39의 아미노산 서열을 갖는 scFv 항체인 AU11 또는 AU12이며, 이들은 각각 중쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3, 링커 올리고펩티드 및 경쇄 가변영역의 CDR1 내지 CDR3을 차례로 포함한다. 상기 항체는 단일클론항체가 바람직하다.
본 발명의 항 ＤＲ5 항체인 AU11 또는 AU12는 HW1에 비하여 DR5에 더 높은 친화도로 결합하며, 평형해리상수(K D)는 각각 1.17×10-8 M 및 9.17×10-9 M 을 나 타낸다. 또한, 상기 항 ＤＲ5 항체인 AU11 또는 AU12는 HW1에 비하여 그 안정성이 상대적으로 더 높게 나타나고, HW1과 마찬가지로 단일분자인 scFv 형태로 자식작용에 의하여 세포사멸을 유도한다.
본 발명은 항 ＤＲ5 항체인 AU11 또는 AU12를 코딩하는 DNA를 제공한다. 상기 DNA는 서열번호 7 또는 39의 아미노산 서열을 갖는 scFv를 코딩하는 DNA일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 8 또는 40의 염기서열을 갖는 DNA일 수 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열은 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오티드 합성기법, 예를 들어 부위 지향적 돌연변이 발생법(site-directed mutagenesis) 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 원하는 대로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 바이러스성 형질감염 또는 비-바이러스 기반 기법 등을 이용하여 적절한 숙주세포에 전달될 수 있다. 이때, DNA 또는 발현벡터의 도입은 아데노바이러스성 형질전환, 유전자 총, 리포좀-매개 형질전환 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질전환, 플라스미드, 아데노-부속 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 세포는 유전자를 장시간에 걸쳐 세포에 방출 또는 전달할 수 있는 적절한 담체 물질과 함께 이식될 수 있다.
상기 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 적절한 조건 하에서 배양하여 항체를 발현시키고 분리하여 항체 분자를 생산할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화될 수 있으며, 이들 중 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 당분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다.
상기 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 생산할 필요가 있는 경우에는, 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터를 숙주세포에 형질도입시키고, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두를 포함하는 항체를 생산하기 위해서는, 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제 1벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제 2벡터의 2개 벡터를 숙주세포에 도입하거나, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 모두 포함하는 단일 벡터를 상기 숙주세포에 도입시킬 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 항 ＤＲ5 항체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항 ＤＲ5 항체(AU11 및 AU12)는 기존의 항 ＤＲ5 항체(HW1)보다 더 높은 친화도로 DR5 항원에 특이적으로 결합하고 안정성이 상대적으로 높으며 DR5를 발현하는 TRAIL-민감성 암세포 또는 DR5를 발현하는 TRAIL-저항성 암세포에 대해 자식작용에 의하여 세포사멸을 효과적으로 유도함으로써, 일회 투여량의 감소에 의한 비용 절감 및 효율성 향상 등의 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항 ＤＲ5 항체는 ＤＲ5 발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 ＤＲ5 발현에 의해 야기되는 암은 TRAIL-민감성 암세포 및 TRAIL-저항성 암세포를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 혈액암, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 항 ＤＲ5 항체와 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약 학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 항 ＤＲ5 항체의 일일 투여량은 약 0.01~50㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.1~20㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : HW1의 친화도 향상을 위한 변이체 라이브러리의 구축
1. HW1의 변이체 라이브러리 구축을 위한 주형과 프라이머의 설계 및 제작
항-DR5 인간 항체인 HW1(대한민국 등록특허 제 10-0847010호)의 친화도를 향상시키기 위하여 항체부위 중 항원과의 결합에 중요하다고 알려진 CDR (Complementarity Determining Region) 부위들, 그 중에서도 중쇄가변 부위의 CDR2를 우선적으로 하여 변이체(mutant) 라이브러리를 설계하였으며, 효모 표면에 변이체를 발현하기 위한 벡터는 효모표면 발현 벡터인 pCTCON을 사용하였고, 도 1과 같이 중쇄가변 부위의 CDR2에 무작위 염기서열을 부여하였다. 이때, 중쇄가변 CDR2를 구성하는 각 야생형(wild-type) 아미노산의 비율을 일정 수준 이상으로 보존하기 위하여, 일반적으로 사용되는 4개의 염기 비율이 각각 25%인 염기 혼합체 대신 야생형 염기 비율이 70%인 염기 혼합체를 사용하였다(예를 들어, 야생형 염기가 아데닌(A)인 부위에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민이 각각 25%씩 함유된 염기 혼합체 대신 아데닌 70%, 구아닌, 시토신, 티민이 각 10%씩 함유된 염기 혼합체를 사용하여 변이체를 구축하였다.). 위와 같은 방법으로 최종적으로 각 아미노산의 보존율이 일정 수준 이상이 되도록 프라이머(단편1 - 서열번호 9, 서열번호 12; 단편2 - 서열번호 11, 서열번호 10)(제노텍, 한국)를 제작하였다. 이후, 중쇄가변 CDR2의 변이체 라이브러리에서 친화도가 향상된 변이체를 선별하였고, 선별된 항체를 주형으로 하여 다시 각각 중쇄가변 CDR3 및 경쇄가변 CDR3 부위에 위에서 기술한 방법 과 동일하게 프라이머(중쇄가변 CDR3: 단편1 - 서열번호 9, 서열번호 14, 단편2 - 서열번호 13, 서열번호 10; 경쇄가변 CDR3: 단편1 - 서열번호 9, 서열번호 16, 단편2: 서열번호 15, 서열번호 10)를 디자인하여 추가적인 친화도 향상을 위한 두 개의 라이브러리를 구축하였다. 친화도 향상을 위한 변이체 구축에 사용된 프라이머 서열번호 및 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 9 5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GCT AGC-3'
서열번호 10 5'-GAT CTC GAG CTA TTA CAA GTC CTC TTC AGA AAT AAG CTT TTG TTC GGA TCC-3'
서열번호 11 5'-GGC CTT GAG TGG CTG GGA AGG 135 415 415 325 435 115 425 415 115 215 TAT GCA GTA TCT GTG AAA AGT-3'
서열번호 12 5'-CCT TCC CAG CCA CTC AAG GCC-3'
서열번호 13 5'-GAC ACG GCC GTC TAT TAC TGT 235 125 215 335 215 235 225 125 225 235 445 215 145 TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC-3'
서열번호 14 5'-ACA GTA ATA GAC GGC CGT GTC-3'
서열번호 15 5'-GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT 315 315 325 125 115 425 335 335 325 235 245 TTC GGC CAA GGG ACA CGA CTG-3'
서열번호 16 5'-ACA GTA ATA AAC TGC AAA ATC-3'
※ 상기 서열 중 서열번호 11, 13, 15 내의 숫자는 다음을 의미한다(1: 70%A+10%G+10%C+10%T, 2: 10%A+70%G+10%C+10%T, 3: 10%A+10%G+70%C+10%T, 4: 10%A+10%G+10%C+70%T, 5: 33%C+33%G+33%T).
2. 항체 유전자 각 단편의 증폭 및 결합
항-DR5 항체의 중쇄가변 CDR2에 돌연변이를 도입하기 위하여, 도 2와 같이 2개의 각 단편을 제작하였다. 첫번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GCT AGC-3'(서열번호 9), 역방향 프라이머로 5'-CCT TCC CAG CCA CTC AAG GCC-3'(서열번호 12)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 제작하였다. 두번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GGC CTT GAG TGG CTG GGA AGG 135 415 415 325 435 115 425 415 115 215 TAT GCA GTA TCT GTG AAA AGT-3'(서열번호 11), 역방향 프라이머로 5'-GAT CTC GAG CTA TTA CAA GTC CTC TTC AGA AAT AAG CTT TTG TTC GGA TCC-3'(서열번호 10)를 사용하여 PCR 방법으로 제작하였다. PCR은 pfu 중합효소(인트론, 한국)를 이용하여 수행하였으며, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초의 반응을 30회 반복하였다.
마찬가지로, 각각 중쇄가변 CDR3 및 경쇄가변 CDR3 부위의 변이체에 대한 단편들도 상기와 같은 방법으로 제작되었다. 중쇄가변 CDR3의 첫번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GCT AGC-3'(서열번호 9), 역방향 프라이머로 5'-ACA GTA ATA GAC GGC CGT GTC-3'(서열번호 14)를 사용하였고, 두번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GAC ACG GCC GTC TAT TAC TGT 235 125 215 335 215 235 225 125 225 235 445 215 145 TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC-3'(서열번호 13), 역방향 프라이머로 5'-GAT CTC GAG CTA TTA CAA GTC CTC TTC AGA AAT AAG CTT TTG TTC GGA TCC-3'(서열번호 10)를 사용하여 PCR 방법으로 제작하였다. 경쇄가변 CDR3의 첫번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GCT AGC-3'(서열번호 9), 역방향 프라이머로 5'-ACA GTA ATA AAC TGC AAA ATC-3'(서열번호 16)을 사용하였고, 두번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT 315 315 325 125 115 425 335 335 325 235 245 TTC GGC CAA GGG ACA CGA CTG-3'(서열번호 15), 역방향 프라이머로 5'-GAT CTC GAG CTA TTA CAA GTC CTC TTC AGA AAT AAG CTT TTG TTC GGA TCC-3'(서열번호 10)를 사용하여 PCR 방법으로 제작하였다.
각각 제작된 두 개의 단편들은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 아가로오스 겔 정제 키트(인트론, 한국)를 이용하여 정제하였다. 정제된 두 개의 단편을 각 10μM씩 동량으로 혼합한 다음, 도 2와 같이 중첩 연장 PCR(overlap extension PCR)을 수행하여 변이된 전체 scFv 유전자 산물을 제조하였다. 상기 PCR은 pfu 중합효소(인트론, 한국)를 이용하여 수행하였고, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30회 반복하였다.
3. 변이된 scFv 항체 유전자 라이브러리의 구축
돌연변이가 삽입된 scFv 항체 유전자 라이브러리(10㎍/㎕)와 scFv 효모 표면 발현벡터인 pCTCON(1㎍/㎕)를 혼합한 후, 전기천공(electroporation)을 이용하여 효모 EBY100 균주(Invitrogen, 미국)에 형질전환시켰다. 형질전환된 효모 EBY100 균주를 선택배지인 SD-CAA(-ura, -trp; 20g/ℓ의 글루코오스, 6.7g/ℓ의 아미노산이 첨가되지 않은 YNB(BD, 미국), 5.4g/ℓ의 Na2HPO4, 8.56g/ℓ의 NaH2PO4H2O 및 5g/ℓ의 카사미노산)에서 접종하여 배양한 후, 글루코오스에서 갈락토오스로 치환한 SG-CAA 배지에서 scFv의 세포 표면 발현을 유도하는 라이브러리를 선별하였다. 상기 라이브러리를 포함하는 세포를 SD-CAA 배지로 단계적으로 10배씩 희석하여 라이브러리 크기를 결정하였다.
그 결과, scFv 항체 라이브러리 크기는 각각 약 2×107 으로 구축되었음을 확인하였다.
실시예 2 : 구축된 HW1의 변이체 라이브러리로부터 친화도가 향상된 변이체들의 선별
상기 실시예 1에서 구축된 HW1의 변이체 라이브러리로부터 DR5에 특이적으로 높은 친화도를 나타내는 scFv 변이체를 선별하기 위하여, 1:100으로 희석된 항-c-myc mAb(Ig therapy, 한국) 및 비오틴 표지 키트(EZ-LINK™ Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit, Pierce, 미국)를 이용하여 비오틴이 표지된 DR5 1μM을 1㎎/㎖의 BSA 0.2㎖가 첨가된 PBS(PBSB, pH 7.4)에 첨가한 후, 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 상기 세포를 냉장된 PBSB로 세척한 후, 2차 항체로서 FITC-표지된 항-마우스 IgG(1:25로 희석) 및 피코에리쓰린이 접합된 스트렙타비딘(streptavidin-R-phycoerythrin conjugate (SA-PE), Molecular probes사, 미국; 1:100으로 희석)으로 표지하였다. 표지된 세포들을 세척하고 다시 PBSB에 재현탁한 후, FACS (fluorescence activated cell sorting)를 순차적으로 수행하여 친화도가 높은 변이체들을 선별하였다. 선별된 변이체들은 선택배지인 SD-CAA에서 배양하고, 위에 기술된 방법과 동일하게 다시 표지한 후, 선별 과정을 4회 반복하였다. 이때, 선별 과정시 사용된 비오틴이 표지된 DR5의 농도를 초기 1μM에서 점점 농도를 낮추어 마지막 4차 선별시에는 10nM의 농도를 사용하였다. 선별된 변이체들의 뉴클레오티드 서열을 정방향 프라이머 5'-GTT CCA GAC TAC GCT CTG CAG G-3'(서열번호 17) 및 역방향 프라이머 5'-GAT TTT GTT ACA TCT ACA CTG TTG-3'(서열번호 18)을 이용하여 분석한 후, 아미노산 서열을 결정하여 야생형의 아미노산 서열과 비교하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 각 선별 단계별로 HW1 변이체의 친화도가 증가하는 경향을 나타내었다.
실시예 3 : 선별된 항체들의 친화도 결합
각각의 라이브러리에서 선별된 변이체들의 아미노산 서열을 결정함과 동시에 선별된 야생형들의 변화된 CDR들을 각각 결합하여 최종적으로 가장 친화도가 향상된 새로운 변이체를 제작하였다. 중쇄가변 CDR3로부터 유래된 변이체를 주형으로 하여, 정방향 프라이머로 5'-GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GCT AGC-3'(서열번호 9), 역방향 프라이머로 5'-ACA GTA ATA AAC TGC AAA ATC-3'(서열번호 16)를 사용하여 PCR 방법으로 단편을 제작하였다. 경쇄가변 CDR3로부터 유래된 변이체를 주형으로 하여, 정방향 프라이머로 5'-GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT-3'(서열번호 19), 역방향 프라이머로 5'-GAT CTC GAG CTA TTA CAA GTC CTC TTC AGA AAT AAG CTT TTG TTC GGA TCC-3'(서열번호 10)를 사용하여 PCR 방법으로 단편을 제작하였으며, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 50초의 반응을 30회 반복하였다. 각각 제작된 두 개의 단편들을 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 아가로오스 겔 정제 키트(인트론, 한국)를 이용하여 정제하고, 정제된 두 개의 단편을 각 10μM씩 동량으로 혼합한 다음, 중첩 연장 PCR을 수행하여 최종적으로 친화도가 향상된 변이체 전체 scFv 유전자 산물을 제조하였다. 상기 PCR은 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30회 반복하였다. 이렇게 제작된 변이체 scFv 산물은 제한효소 Nhe I/BamH I (NEB, 미국)을 이용하여 효모 표면 발현 벡터인 pCTCON(Colby 등, Methods Enzymol., 388:348-358, 2004)에 도입하였고, 구축된 플라스미드를 효모 EBY100 균주(Invitrogen 사)에 형질전환하였다.
선별된 변이체들과 위에서 제작된 최종적으로 친화도가 향상된 변이체를 실시예 2에서 기술된 방법과 동일하게 다시 FACS를 이용하여 친화도를 분석하였다. 대조군으로서 HW1을 동일한 조건으로 표지분석하여 비교하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 각 변이체가 결합된 최종 변이체는 다른 변이체들보다 가장 높은 친화도를 나타내었다.
실시예 4 : 친화도가 향상된 변이체의 항체 안정성 향상
1. 친화도와 안정성이 향상된 항체인 AU11의 제작
항-DR5 인간 항체인 HW1은 인간 항체를 구성하는 중쇄가변 영역에 대하여 VH6 아류형(subtype)으로, 경쇄가변 영역에 대하여 Vk3으로 구성되어 있으며, VH6 아류형은 다른 아류형, 특히 VH3에 비하여 그 안정성이 낮다고 알려져 있다. 따라서, 친화도가 향상된 변이체의 항체 안정성을 향상시키기 위하여, VH6 아류형을 VH3 아류형으로 치환하였다. 먼저, VH3-Vk3 형태의 항체를 제작하기 위하여, 전체 유전자를 크게 3개의 단편으로 나누고 각 단편을 제작하였다. 첫번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-TTC GCT AGC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC CTG GTA CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA GAC AGT GTC TCT AGC ACC ACT GTT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC-3'(서열번호 20), 역방향 프라이머로 5'-ACA GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTC GGC TCT CAG GCT GTT CAT TTG CAG ATA CAG GGT GTT CTT GGA ATT GTC TCT GGA GAT GGT GAA CCG GCC CTT CAC GGA GTC CGC ATA GTA ATT ATA CCA CTT CGA CCT ATA ATA GAT CGC TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT CCC-3'(서열번호 21)을 이용하여 제작하였다. 두번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT-3'(서열번호 22), 역방향 프라이머로 5'-TTC CCC TGG AGA CAA AGA CAG GGT GGC TGG AGA CTG GGT CAA TAC AAT ATC CGA CCC GCC ACC GCC GCT GCC ACC-3'(서열번호 23)을 이용하여 제작하였다. 세번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA-3'(서열번호 24), 역방향 프라이머로 5'-CGT GGA TCC ACG TTT GAT TTC CAC CTT TGT CCC TTG GCC GAA GAC CGC CCG-3'(서열번호 25)을 이용하여 제작하였다. 또한, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 연결하는 링커로서, 글리신(Glycine) 4개와 세린 (Serine) 1개가 3번 반복되는 구조를 가지며, 총 15개의 아미노산으로 구성된 (G4S)3 링커를 이용하였다(서열번호 26). 이렇게 제작된 각 단편은 중첩 연장 PCR을 수행하여 최종적으로 안정성이 향상된 변이체 전체 scFv 유전자 산물을 제조하였다. 상기 PCR은 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30회 반복하였다. 이후, 중쇄가변 영역의 CDR3 지역의 101번 발린(valine), 102번 세린을 다시 아스파라긴산(aspartic acid)과 이소루신(isoleucine)으로 치환하여, 최종적으로 친화도와 안정성이 향상된 항체인 AU11을 제작하였다. 항체 AU11로의 안정성 향상에 사용된 프라이머 서열번호 및 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
항체 AU11의 전체 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도식화한 것은 도 5에 나타내었고(여기에서, 밑줄로 표시한 부분은 차례로 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 링커, VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3를 나타낸 것임), 기존 항체인 HW1과 최종적으로 친화도 및 안정성이 향상된 AU11의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과는 도 6에 나타내었다(*는 CDR에서 친화도 향상에 따라 변이된 아미노산 잔기를 표시한 것임).
서열번호 20 5'-TTC GCT AGC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC CTG GTA CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA GAC AGT GTC TCT AGC ACC ACT GTT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC-3'
서열번호 21 5'-ACA GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTC GGC TCT CAG GCT GTT CAT TTG CAG ATA CAG GGT GTT CTT GGA ATT GTC TCT GGA GAT GGT GAA CCG GCC CTT CAC GGA GTC CGC ATA GTA ATT ATA CCA CTT CGA CCT ATA ATA GAT CGC TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT CCC-3'
서열번호 22 5'-GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT-3'
서열번호 23 5'-TTC CCC TGG AGA CAA AGA CAG GGT GGC TGG AGA CTG GGT CAA TAC AAT ATC CGA CCC GCC ACC GCC GCT GCC ACC-3'
서열번호 24 5'-ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA-3'
서열번호 25 5'-CGT GGA TCC ACG TTT GAT TTC CAC CTT TGT CCC TTG GCC GAA GAC CGC CCG-3'
2. 친화도와 안정성이 향상된 항체인 AU12의 제작
경쇄가변영역은 Vk3 및 Vk1이 가장 안정하다고 알려져 있으며, 미국 FDA의 승인을 받아 시판되고 있는 다양한 쥐 유래의 인간화 항체(humanized antibody)들에서 Vk1 아류형이 다수 존재하고 있다(Carter 등, Proc Natl Acad Sci U S A, 10;89:4285-4289, 1992; Werther 등, J Immunol, 11;157:4986-4995, 1996; Presta 등, J Immunol 5;151:2623-2632, 1993). 또한, 베르니에 구역 잔기들(vernier zone residues)은 항원 결합에 있어서 열역학적 안정성에 공헌하며, 항체의 구조적인 엔트로피 변화를 조절하여 결과적으로 항원과의 결합에 중요한 영향을 미치는 부위로 알려져 있는데(Makabe 등, J Biol Chem, 11;283(2):1156-1166, 2008), Vk1 아류형을 구성하는 아미노산 중에 추가적으로 베르니에 구역에 해당하는 잔기들 및 그 외 항체 구조의 3차원 시뮬레이션 분석(http://antibody.bath.ac.uk)을 검토하여 구조적으로 중요하다고 생각되는 잔기를 추가로 선정하였으며, 가변경쇄의 2번 아미노산인 이소루신을 세린으로 치환하여, VH3-Vk3 형태의 항체인 AU11 이외에 추가적으로 VH3-Vk1 아류형을 가지는 항체를 제작하였다. AU11을 주형으로 하여, 첫 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-TTC GCT AGC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG-3'(서열번호 29), 역방향 프라이머로 5'-TGG AGA CTG GGT CAT CTG AGA GTC-3'(서열번호 30)을 이용하였고, 두 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GAC TCT CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC GTT AGC-3'(서열번호 31), 역방향 프라이머로 5'-CTT AGG GGC TTT CCC TGG TTT CTG CTG ATA CCA GGC TAA GTG GCT-3'(서열번호 32)을 이용하였고, 세 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GGT GCA TCC AGC-3'(서열번호 33), 역방향 프라이머로 5'-GAT GGT GAG AGT GAA ATC TGT CCC AGA TCC ACT GCC ACT GAA CCT TGA TGG GAC CCC AGT GGC CCT-3'(서열번호 34)을 이용하였고, 네 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG CGT GCA AAC GAT TTC CCG CGG GCG GTC-3'(서열번호 35), 역방향 프라이머로 5'-CGT GGA TCC ACG TTT GAT TTC CAC-3'(서열번호 36)을 이용하여 제작하였다. AU11과 마찬가지로, 중쇄가변 영역과 경쇄가변 영역을 연결하는 링커로서 글리신 4개 및 세린 1개가 세 번 반복되는 형태인 (G4S)3 링커를 사용하였다. 이렇게 제작된 각 단편은 중첩 연장 PCR을 수행하여 최종적으로 안정성이 향상된 변이체 전체 scFv 유전자 산물을 제조하였다. 상기 PCR은 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30회 반복하여 최종적으로 AU12를 제작하였다. AU12의 제작에 사용된 프라이머 서열 번호 및 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
항체 AU12의 전체 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도식화한 것은 도 7에 나타내었고(여기에서, 밑줄로 표시한 부분은 차례로 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 링커, VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3를 나타낸 것임), 기존 항체인 HW1과 최종적으로 친화도 및 안정성이 향상된 AU11 및 AU12의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과는 도 8에 나타내었다.
서열번호 29 5'-TTC GCT AGC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG -3'
서열번호 30 5'-TGG AGA CTG GGT CAT CTG AGA GTC-3'
서열번호 31 5'-GAC TCT CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC GTT AGC-3'
서열번호 32 5'-CTT AGG GGC TTT CCC TGG TTT CTG CTG ATA CCA GGC TAA GTG GCT-3'
서열번호 33 5'-AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GGT GCA TCC AGC-3'
서열번호 34 5'-GAT GGT GAG AGT GAA ATC TGT CCC AGA TCC ACT GCC ACT GAA CCT TGA TGG GAC CCC AGT GGC CCT-3'
서열번호 35 5'-TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG CGT GCA AAC GAT TTC CCG CGG GCG GTC-3'
서열번호 36 5'-CGT GGA TCC ACG TTT GAT TTC CAC-3'
실시예 5 : AU11 및 AU12 scFv 항체의 발현 및 정제
친화도와 안정성이 향상된 항체인 AU11 및 AU12를 대장균 발현 벡터인 pKJ1에 Nhe I/BamH I을 이용하여 인 프레임(in-frame)으로 도입하였다. 이때, 대장균 발현 벡터는 T7 프로모터 - pelB 표적화 서열 - AU11 또는 AU12 scFv - flag tag - 6X his tag을 가지도록 설계되었다.
상기 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후, 항생제 암피실린 (ampicillin)이 50㎍/㎖ 첨가된 LB[5g/L yeast extract(BD사, 미국), 10g/L tryptone(BD사, 미국), 10g/L sodium chloride] 배지에서 37℃, 200rpm으로 OD600가 0.8~1.0이 되도록 배양한 후, 0.5mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 16시간 동안 23℃, 150rpm의 조건 하에서 배양하였다. 발현 후 원심분리하여 상등액만을 취한 후 Talon-resin(Clontech사)을 사용하여 발현된 항체를 정제한 다음, 정제된 항체의 크기 및 순도를 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE로 분석하였다.
결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 항체 AU11 및 AU12는 약 29 kDa의 분자량을 가지며. 99% 이상의 순도로 정제됨을 확인하였다.
실험예 1 : AU11 및 AU12 scFv 항체의 용액 상태에서의 형태 확인
정제된 AU11 및 AU12 scFv 항체가 용액 상태에서 단일분자 형태(monomeric form)로 존재하는지 아니면 다중분자 형태(oligomeric form)로 존재하는지 확인하기 위하여, 크기 배제 HPLC, 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE를 수행하였다.
크기 배제 HPLC의 경우, 용출 완충액은 PBS(50mM 포스페이트, pH 7.4, 150mM NaCl)이며, 유속은 0.5㎖/분, 컬럼은 SuperdexTM200 10/300GC (GE사, 미국) 및 Agilent 1100 HPLC 장비를 이용하여 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원성 SDS-PAGE는 샘플 완충액에 1mM DTT가 첨가된 15% 아크릴아미드 겔을 사용하였고, 비환원성 SDS-PAGE는 샘플 완충액에 1mM DTT가 첨가되지 않은 15% 아크릴아미드 겔을 사용하여 수행하였으며, 150 볼트로 로딩하여 분석하였다.
정제된 AU11 및 AU12 scFv 항체를 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE로 분석한 결과 및 크기 배제 HPLC 측정 결과는 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 정제된 AU11 및 AU12 scFv 항체는 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE에서 비천연 이황화 결합(disulfide bond)이 있는 다중분자 형태가 없었다.
또한 도 10에 나타난 바와 같이, 크기 배제 HPLC에서 정제된 AU11 및 AU12 scFv 항체를 500㎍/㎖로 주입하였을 때 HW1과 마찬가지로 순수하게 단일분자로 용출되었다.
실험예 2 : 항체 AU11 및 AU12의 친화도 측정
DR5 항원에 대한 AU11 및 AU12의 결합 친화도를 확인하기 위하여, Biacore 2000 SPR(surface Plasmon resonance) 바이오센서(GE사, 미국)를 이용하여 측정하였다. 약 0.5㎎/㎖의 항원 및 음성대조군인 BSA(bovine serum albumin)를 CM5 칩 (carboxymethylated dextran surface chip)에 약 2,000 반응단위(response unit)로 고정화시킨 후, 다양한 농도로 희석된 항체 AU11 및 AU12를 30㎕/분의 속도로 2분간 칩에 주입하여 항원과의 상호작용을 정량하였다. 또한, HW1과의 친화도 비교를 위하여 HW1은 50nM, AU11 및 AU12는 각각 25nM의 농도로 준비하여 같은 시간으로 주입하였다. 칩의 표면은 1M NaCl/20mM NaOH로 재생하였으며, BIA evaluation ver. 3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동속도상수(kon 및 koff)와 평형해리상수(KD)로 얻었다.
DR5에 대한 AU11 및 AU12의 친화도를 SPR을 이용하여 정량한 결과 및 HW1과의 친화도를 비교한 결과는 도 11에 나타내었으며, DR5에 대한 AU11 및 AU12의 친화도를 운동속도상수(kon 및 koff)와 평형해리상수(KD)로 나타낸 결과는 표 4에 나타내었다.
항체 운동속도상수 평형해리상수(KD)(M)
kon(M-1S-1) koff(S-1)
HW1 (2.33±0.02)×104 (4.71±0.05)×10-3 (2.02±0.07)×10-7
AU11 (3.64±0.08)×104 (4.27±0.15)×10-4 (1.17±0.21)×10-8
AU12 (4.71±0.11)×104 (4.32±0.09)×10-4 (9.17±0.17)×10-9
도 11 및 표 4에 나타난 바와 같이, AU11과 AU12는 HW1(KD: 약 200nM)에 비하여 약 17~22배 정도 높은 친화도를 나타내었다. 또한, 같은 농도에서 HW1과 AU11 및 AU12를 동시에 분석하였을 때, AU11 및 AU12가 HW1보다 해리구간에서 더 강하게 결합하고 있음을 보여주었다.
실험예 3 : 항체 AU11 및 AU12의 안정성 측정
AU11 및 AU12의 HW1에 대한 안정성 향상 여부를 형광 분광광도계 (fluorescence spectrometer, JASCO사, 일본)를 이용하여 측정하였다. HW1, AU11 scFv, 및 AU12 scFv를 대장균에서 발현 및 정제하여 준비하고, 준비된 단백질을 각각 0M부터 4.2M까지 0.3M 단위로 하여 구아니딘?HCl(guanidine?HCl)에 해리하여 최종 10㎍/㎖의 단백질 농도로 상온에서 24시간 반응시킨 후, 여기파장 (excitation wave length) 280㎚, 방출파장(emission wave length) 290~400㎚, 측정속도는 250㎚/분으로 하여 3회 반복 측정하였다. 이렇게 측정된 값 중 각 구아니딘?HCl 농도별로 가장 높은 값을 가질 때의 파장을 표준화(normalization)하여 상대적인 최대 파장(normalized lmax)을 도식화하였다. HW1은 약 1.64 M의 구아니딘?HCl의 농도에서 그 중간값을, AU1과 AU12는 각각 약 2.53M, 2.45M의 구아니딘?HCl의 농도에서 그 중간값을 갖는다. 문헌(Ewert S 등, Biochemistry, 42:1517-1528, 2003)에 의하면, 구아니딘?HCl과 같은 단백질 변성시료에 의해 단백질이 변성될수록 상대적인 최대파장은 커진다고 알려져 있다.
결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, AU11 및 AU12는 HW1에 비해 그 안정성이 상대적으로 높음을 알 수 있다.
실험예 4 : DR5에 대한 HW1과 AU11, AU12 간의 동일한 항원결합부위 (epitope) 여부 규명
DR5에 대하여 AU11 및 AU12가 HW1과 동일한 항원결합부위를 갖는지의 여부를 규명하기 위하여, AU11 또는 AU12와 HW1 간의 경쟁적 ELISA(competition ELISA)를 수행하였다.
구체적으로는, ELISA용 96-웰 플레이트에 항원을 50㎕ (20㎍/㎖) 코팅한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS(pH 7.4, with 0.05% Tween 20 및 0.02% sodium azide)로 3회 세척한 후 1% BSA가 함유된 PBS로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 비오틴을 표지한 HW1을 30㎍/㎖로 고정화하고, AU11 또는 AU12의 농도를 5~300㎍/㎖로 하여 각 웰에 혼합하여 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 플레이트를 세척한 후, 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase)가 접합된 항-비오틴 항체(anti-biotin mAb AP conjugated, Sigma)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 3회 세척한 후 기질로 pNPP(Sigma.)를 50㎕ 첨가하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, AU11 또는 AU12의 농도가 증가할수록 HW1의 항원에 대한 결합력이 약해졌다. 따라서, AU11 또는 AU12는 HW1과 동일한 항원결합부위를 가진다는 것을 알 수 있다.
실험예 5 : DR5 및 유사항원에 대한 AU11과 AU12의 교차반응성 분석
표적항원인 DR5 및 다른 유사항원인 DR4, DcR1, DcR2에 대한 AU11 및 AU12의 교차반응성을 확인하기 위하여, ELISA를 수행하였다.
구체적으로는, ELISA용 96-웰 플레이트에 항원, 즉 DR5, DR4, DcR1 및 DcR2를 50㎕(20㎍/㎖) 씩 코팅한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST(pH 7.4, with 0.1% Tween 20) 300㎕로 3회 세척한 후 5% 탈지우유(skim milk)가 함유된 PBST(pH 7.4, with 0.1% Tween 20) 300㎕를 넣어 상온에서 1시간 동안 배양하고, 각 항체 AU11, AU12, 및 양성대조군으로서 모든 수용체에 결합할 수 있는 리간드인 TRAIL를 각각 50㎕(3㎍/㎖)씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST 300㎕로 3번 세척한 후 쥐 유래의 항 FLAG-TAG(mouse anti-FLAG tag antibody, sigma) 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 다시 PBST 200㎕로 3번 세척한 다음, 토끼 유래의 항-mouse mAb AP conjugated(pierce) 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST 300㎕로 3번 세척한 이후 기질로 pNPP(Sigma.)를 50㎕ 첨가하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, AU11 및 AU12는 표적항원인 DR5에만 특이적으로 결합하였으며, 양성대조군인 TRAIL은 DR5, DR4, DcR1 및 DcR2에 모두 결합함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 항 DR5 항체는 DR5 항원에 특이적으로 결합하는 항체임을 알 수 있다.
실험예 6 : DR5 및 DR5 단편에 대한 TRAIL, HW1, AU11, AU12 간의 결합 여부 규명
DR5는 구조적으로 CRD(cysteine-rich domain)라고 불리는 각각 세 개의 이황화 결합을 가지는 서브도메인(sub-domain)들로 나누어질 수 있다. 이 서브도메인들 중 특히 CRD2(잔기 97~137)와 CRD3(잔기 139~180)는 TRAIL과의 결합에 결정적 역할을 하는 50s loop와 90s loop 지역을 각각 포함하고 있다(Hymowitz 등, Mol. Cell., 4:563-571, 1999). 따라서, CRD2 및 CRD3, 그리고 DR5를 대장균 BL21(DE3)에서 정제하여 TRAIL, HW1, AU11, AU12와의 결합 여부를 ELISA를 통하여 규명하였다. 구체적으로는, ELISA용 96-웰 플레이트에 항원 즉 CRD2, CRD3, DR5를 각각 50㎕(20 ㎍/㎖) 씩 코팅한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST(pH 7.4 with 0.1% Tween 20) 300㎕로 3회 세척한 후 5% 탈지우유가 함유된 PBST(pH 7.4 with 0.1% Tween 20) 200㎕를 넣어 상온에서 1시간 동안 배양하고, 각 항체 HW1, AU11, AU12, TRAIL를 각각 50㎕ (20 ㎍/㎖)씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST 300㎕로 3번 세척한 후 쥐 유래의 항 FLAG-TAG(mouse anti-FLAG tag antibody, sigma) 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 다시 PBST 300㎕로 3번 세척한 다음, 토끼 유래의 항-mouse mAb AP conjugated(pierce) 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST 300㎕로 3번 세척한 이후 기질로 pNPP(Sigma.)를 50㎕ 첨가하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, TRAIL은 CRD3보다 CRD2에 상대적으로 강한 결합력을 보였으나, HW1, AU11 및 AU12는 CRD2, CRD3 모두 유사한 결합력으로 각 항원에 결합하였다. 따라서, TRAIL-DR5 간의 결합 및 HW1, AU11, AU12 - DR5 간의 결합에 있어서 CRD2 및 CRD3가 TRAIL 또는 항체에 미치는 영향 정도가 다르다는 것을 알 수 있다.
실험예 7 : 항체 AU11 및 AU12의 암세포에서의 세포사멸 유도 가능성 확인
항체 AU11 및 AU12의 다양한 암세포에서의 세포사멸 유도 가능성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
암세포로는 인간 대장암 세포주(human colon cancer cell line)인 HCT116과 인간 신경종양 세포주(human glioma cancer cell line)인 U87MG를 사용하였다. 액체 질소에 보관되어 있는 세포주들을 꺼내어 37℃에서 빠르게 녹인 후 원심분리하여 냉동보관 배지를 제거하여 얻은 세포를 배양 배지인 10% FBS, 100unit/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지(Welgene 사)를 사용하여 배양 플라스크에 넣고 배양하였다. 3일 안정화 이후, TE 완충액 1㎖를 3~5분 처리한 후, 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 5㎖로 TE 완충액의 반응을 정지시킨 후, 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포들은 동일한 배양 배지로 각각 재현탁한 후 96-웰 플레이트에 웰당 세포를 1×104 (100 ㎕)씩 분주하여 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석에 사용하였다.
결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 인간 대장암 세포주인 HCT116과 인간 신경종양 세포주인 U87MG에서 AU11, AU12 및 대조군인 HW1을 같은 농도에서 같은 시간 동안 배양하였을 때, AU11과 AU12는 모두 세포사멸효능을 보였으며, HW1의 세포사멸효능과 비교하여 세포사멸이 더 효율적으로 일어남을 확인하였다.
실험예 8 : 항체 AU11 및 AU12의 세포사멸 경로 기작 분석
항체 AU11 및 AU12의 세포사멸 기작을 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
인간 대장암 세포주인 HCT116과 인간 신경종양 세포주인 U87MG를 96-웰 플레이트에 1×104개 첨가하고 10% FBS가 첨가되어 있는 DMEM 배지 100㎕를 넣어 5% CO2, 37℃에서 2일 동안 배양하여 안정화시켰다. 그 다음, Z-VAD(Pan-caspase inhibitor, Santacruz) 10μM, SP600125(JNK inhibitor, calbiochem) 10μM, SB203580(p38 inhibitor, calbiochem) 10μM, 3-MA 100(Autophagic cell death inhibitor, sigma) 10μM, Chloroguine(Autophagic cell death inhibitor, sigma) 10μM을 넣고 1시간 동안 전처리하였다. AU11과 AU12를 각각 30㎍/㎖ 씩 첨가한 후, 5% CO2, 37℃에서 40시간 동안 배양하여 MTT-assay를 통하여 세포사멸 정도를 측정하였다.
결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, AU11 및 AU12는 인간 대장암 세포주인 HCT116과 인간 신경종양 세포주인 U87MG에서 SP600125(JNK inhibitor), 3-MA 및 Chloroquine 존재 하에서는 세포사멸능력이 현저하게 감소하였으며, Z-VAD와 SB203580(p38 inhibitor) 존재 하에서는 세포사멸 정도의 변화가 없었다. 상기 결과는 scFv 항체 HW1과 특성이 동일하다. 따라서, 친화도 및 안정성이 향상된 AU11과 AU12는 자식작용에 의하여 세포사멸을 유도함을 알 수 있다.
실험예 9 : 항체 AU11 및 AU12에 의한 LC3-GFP 결집
자식작용에 의한 세포사멸의 전형적인 특징은 세포 내 LC3 단백질이 자식작용 액포(Vacuole) 막 또는 내부에 모이는 것이다. AU11과 AU12의 처리에 의해서 이러한 자식작용의 특징을 보이는지 확인하기 위하여, LC3-GFP를 발현하는 U87MG 암세포주(TRAIL-resistant, human glioma cell line)를 24-웰 플레이트에 4×104개의 세포와 10% FBS가 포함되어 있는 DMEM 500㎕를 첨가하여 24시간 동안 5% CO2, 37℃에서 2일 동안 배양하여 안정화시켰다. 그 다음 AU11과 AU12를 각각 30㎍/㎖ 씩 첨가하여 30시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하고, 형광현미경(Axiovert 200M, Carl Zeiss 사, 독일)으로 관찰하였다.
결과는 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, AU11과 AU12를 처리한 U87MG 암세포주에서 LC3-GFP가 자식작용 액포막 및 내부에 결집되는 것을 관찰하였다. 따라서, AU11과 AU12는 자식작용에 의하여 세포사멸을 유도함을 알 수 있다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 산제의 제조
항 ＤＲ5 항체 0.1 g
유당 1.5 g
탈크 0.5 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2 : 정제의 제조
항 ＤＲ5 항체 0.1 g
락토오스 7.9 g
결정성 셀룰로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.
제제예 3 : 캡슐제의 제조
항 ＤＲ5 항체 0.1 g
옥수수전분 5 g
카복시 셀룰로오스 4.9 g
상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4 : 주사제의 제조
항 ＤＲ5 항체 0.02~0.2 g
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
안정화제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5 : 액제의 제조
항 ＤＲ5 항체 0.1 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
본 발명에 따른 항 ＤＲ5 항체는 기존의 항 ＤＲ5 항체보다 더 높은 친화도로 DR5 단백질에 특이적으로 결합하고 안정성이 상대적으로 높으며 DR5를 발현하는 TRAIL-민감성 암세포 또는 DR5를 발현하는 TRAIL-저항성 암세포에 대해 자식작용에 의하여 세포사멸을 효과적으로 유도함으로써, ＤＲ5 발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항 ＤＲ5 항체는 일회 투여량의 감소에 의한 비용 절감 및 효율성 향상 등의 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 항-DR5 인간 항체인 HW1의 친화도 향상을 위한 VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR3의 프라이머를 설계한 도이다.
도 2는 항-DR5 인간 항체인 HW1의 친화도 향상을 위한 변이체 라이브러리의 제작 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 HW1의 변이체 라이브러리로부터 선별된 변이체들을 FACS를 이용하여 친화도를 분석한 도이다.
도 4는 HW1 및 HW1의 변이체 라이브러리들로부터 최종 선별된 변이체들을 다시 FACS를 이용하여 친화도를 분석한 도이다.
도 5는 항체 AU11의 전체 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도식화하여 나타낸 도이다(여기에서, 밑줄로 표시한 부분은 차례로 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 링커, VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3를 나타낸 것임).
도 6은 기존 항체인 HW1과 최종적으로 친화도 및 안정성이 향상된 AU11의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다(*는 CDR에서 친화도 향상에 따라 변이된 아미노산 잔기를 표시한 것임).
도 7은 항체 AU12의 전체 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도식화하여 나타낸 도이다(여기에서, 밑줄로 표시한 부분은 차례로 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 링커, VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3를 나타낸 것임).
도 8은 기존 항체인 HW1과 최종적으로 친화도 및 안정성이 향상된 AU11 및 AU12의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 정제된 항체(AU11 및 AU12)의 크기 및 순도를 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 정제된 항체(AU11 및 AU12)를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 DR5에 대한 AU11 및 AU12의 친화도를 SPR을 이용하여 정량한 결과 및 HW1과의 친화도를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 AU11 및 AU12의 안정성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 HW1과 AU11 또는 AU12간의 동일 항원결합부위 여부를 경쟁적 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 표적항원인 DR5 항원 및 다른 유사항원(DR4, DcR1, DcR2)에 대한 AU11 및 AU12의 교차반응성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 전체 DR5와 DR5의 단편들인 CRD2(잔기 97~137) 및 CRD3(잔기 139~180), 그리고 그들에 대한 결합능을 가진 HW1, AU11, AU12, TRAIL 간의 결합 친화도를 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 인간 대장암 세포주인 HCT116과 인간 신경종양 세포주인 U87MG에서 HW1, AU11 및 AU12의 세포사멸 정도를 MTT-assay를 통해 비교 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 인간 대장암 세포주인 HCT116과 인간 신경종양 세포주인 U87MG에서 다양한 저해제(Z-VAD, SP600125, SB203580, 3-MA, Chloroguine) 존재 하에 HW1, AU11 및 AU12의 세포사멸 능력을 MTT-assay로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 LC3-GFP를 발현하는 U87MG 암세포주에 AU11 및 AU12를 처리하여 LC3-GFP 결집을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Anti-death receptor 5 antibody with improved affinity and stability, and composition for preventing or treating cancer comprising the same <130> P09-07023 <150> KR10-2008-0104737 <151> 2008-10-24 <160> 40 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 <400> 1 Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr Thr Val Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 <400> 2 Ile Tyr His Arg Ser Tyr Trp Asp Lys Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 <400> 3 Ala Arg Glu Gly Ser Gly His Tyr Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 <400> 4 Gln Ser Val Ser Ser Ser His 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 <400> 6 Gln Gln Arg Ala Asn Asp Phe Pro Arg Ala Val 1 5 10 <210> 7 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of AU11 scFv <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Thr Val Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ala Ile Tyr His Arg Ser Tyr Trp Asp Lys Tyr Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Gly His Tyr Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser His Leu Ala Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 180 185 190 Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ala Asn Asp Phe Pro Arg Ala Val Phe Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 245 <210> 8 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of AU11 scFv <400> 8 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggaga cagtgtctct agcaccactg ttgccatgag ctgggtccgc 120 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagcgatct atcacaggtc gtattgggac 180 aagtactatg cggactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 240 accctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagagggta gtggccacta tggggctttt gatatctggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtttcttcag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggcagcg gcggtggcgg gtcggatatt 420 gtattgaccc agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 480 tgcagggcca gtcagagtgt tagcagcagc cacttagcct ggtaccagca gaaacctggc 540 caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg 600 ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 660 gattttgcag tttattactg tcagcagcgt gcaaacgatt tcccgcgggc ggtcttcggc 720 caagggacaa aggtggaaat caaacgt 747 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctgctag c 51 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 gatctcgagc tattacaagt cctcttcaga aataagcttt tgttcggatc c 51 <210> 11 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 ggccttgagt ggctgggaag gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntatgcagta 60 tctgtgaaaa gt 72 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 ccttcccagc cactcaaggc c 21 <210> 13 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 gacacggccg tctattactg tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 tggggccaag ggaccacggt c 81 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 acagtaatag acggccgtgt c 21 <210> 15 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 gattttgcag tttattactg tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttcggc 60 caagggacac gactg 75 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 acagtaataa actgcaaaat c 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward sequencing primer <400> 17 gttccagact acgctctgca gg 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse sequencing primer <400> 18 gattttgtta catctacact gttg 24 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 19 gattttgcag tttattactg t 21 <210> 20 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for manufacturing AU11 <400> 20 ttcgctagcg aggtgcagct ggtggagtct gggggaggcc tggtacagcc tggagggtcc 60 ctgagactct cctgtgcagc ctctggagac agtgtctcta gcaccactgt tgccatgagc 120 tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtc 159 <210> 21 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for manufacturing AU11 <400> 21 acagtaatac acagccgtgt cctcggctct caggctgttc atttgcagat acagggtgtt 60 cttggaattg tctctggaga tggtgaaccg gcccttcacg gagtccgcat agtaattata 120 ccacttcgac ctataataga tcgctgagac ccactccagc cccttccc 168 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for manufacturing AU11 <400> 22 gaggacacgg ctgtgtatta ctgt 24 <210> 23 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for manufacturing AU11 <400> 23 ttcccctgga gacaaagaca gggtggctgg agactgggtc aatacaatat ccgacccgcc 60 accgccgctg ccacc 75 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for manufacturing AU11 <400> 24 accctgtctt tgtctccagg ggaa 24 <210> 25 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for manufacturing AU11 <400> 25 cgtggatcca cgtttgattt ccacctttgt cccttggccg aagaccgccc g 51 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of (G4S)3 linker <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of AU11 VL <400> 27 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ala Asn Asp Phe 85 90 95 Pro Arg Ala Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 28 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of AU11 VH <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Thr Val Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ala Ile Tyr His Arg Ser Tyr Trp Asp Lys Tyr Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Gly His Tyr Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for manufacturing AU12 <400> 29 ttcgctagcg aggtgcagct ggtggagtct ggg 33 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for manufacturing AU12 <400> 30 tggagactgg gtcatctgag agtc 24 <210> 31 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for manufacturing AU12 <400> 31 gactctcaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcgttagc 90 <210> 32 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for manufacturing AU12 <400> 32 cttaggggct ttccctggtt tctgctgata ccaggctaag tggct 45 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for manufacturing AU12 <400> 33 aaagccccta agctcctgat ctatggtgca tccagc 36 <210> 34 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for manufacturing AU12 <400> 34 gatggtgaga gtgaaatctg tcccagatcc actgccactg aaccttgatg ggaccccagt 60 ggccct 66 <210> 35 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for manufacturing AU12 <400> 35 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg caacttacta ctgtcaacag 60 cgtgcaaacg atttcccgcg ggcggtc 87 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for manufacturing AU12 <400> 36 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Tyr His Arg Ser Tyr Trp Asp Lys Tyr Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Gly His Tyr Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of AU12 scFv <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Thr Val Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ala Ile Tyr His Arg Ser Tyr Trp Asp Lys Tyr Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Gly His Tyr Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ser Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser His Leu Ala Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser 180 185 190 Arg Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ala Asn Asp Phe Pro Arg Ala Val Phe Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 245 <210> 40 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of AU12 scFv <400> 40 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggaga cagtgtctct agcaccactg ttgccatgag ctgggtccgc 120 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagcgatct atcacaggtc gtattgggac 180 aagtactatg cggactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 240 accctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagagggta gtggccacta tggggctttt gatatctggg gccaagggac cctggtcacc 360 gtttcttcag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggcagcg gcggtggcgg gtcggactct 420 cagatgaccc agtctccatc ctccctgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 480 tgccgggcaa gtcagagcgt tagcagcagc cacttagcct ggtatcagca gaaaccaggg 540 aaagccccta agctcctgat ctatggtgca tccagcaggg ccactggggt cccatcaagg 600 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 660 gattttgcaa cttactactg tcaacagcgt gcaaacgatt tcccgcgggc ggtcttcggc 720 caagggacca aagtggaaat caaacgt 747

Claims (17)

  1. 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DR5에 특이적으로 결합하는 항 ＤＲ5 항체.
  2. 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DR5에 특이적으로 결합하는 항 ＤＲ5 항체.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체는 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3가 각각 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역과 상보성 결정부위 CDR1, CDR2 및 CDR3가 각각 서열번호 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ5 항체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 27 또는 37의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ5 항체.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 28 또는 38의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ5 항체.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체는 DR5를 발현하는 TRAIL-민감성 암 세포 또는 DR5를 발현하는 TRAIL-저항성 암세포에 대해 자식작용에 의한 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ5 항체.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ5 항체.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ5 항체.
  9. 제 1항의 항체의 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 DNA.
  10. 제 2항의 항체의 서열번호 39의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 40의 염기서열을 갖는 DNA.
  11. 제 9항의 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포.
  12. 제 10항의 DNA 또는 이를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포.
  13. 각각 서열번호 1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, CDR3로 구성된, 항 ＤＲ5 항체의 중쇄 가변영역 중 상보성 결정부위 CDR.
  14. 각각 서열번호 4, 5, 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, CDR2, CDR3로 구성된, 항 ＤＲ5 항체의 경쇄 가변영역 중 상보성 결정부위 CDR.
  15. 제 1항 또는 제 2항의 ＤＲ5 항체를 유효성분으로 함유하는 ＤＲ5 발현에 의해 야기되는 암 치료용 약학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 제 15항에 있어서, 상기 ＤＲ5 발현에 의해 야기되는 암은 혈액암, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
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