KR101141466B1

KR101141466B1 - 항 ｄｒ4 인간화 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101141466B1
Application number: KR1020090098611A
Authority: KR
Inventors: 김용성; 권명희; 이승현; 성은실
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2012-05-04
Also published as: KR20110041672A

Abstract

본 발명은 항 ＤＲ4 인간화 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항 ＤＲ4 인간화 항체는 항 ＤＲ4 마우스 항체의 면역거부반응을 최소화하기 위한 인간화 항체로서, 가변중쇄 부위에 16개의 아미노산과 가변경쇄 부위에 14개의 아미노산으로 이루어진 전체 30개의 베르니에 구역의 아미노산 중 가변중쇄 부위의 3개(49번 알라닌, 93번 트레오닌, 94번 아르기닌)와 가변경쇄 부위의 5개(2번 트레오닌, 4번 발린, 46번 알라닌, 49번 세린, 64번 세린)를 추가로 보존하여 구축된 것을 특징으로 한다.

Description

항 ＤＲ4 인간화 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Anti-death receptor 4 humanized antibody, and composition for preventing or treating cancer comprising the same}

본 발명은 항 ＤＲ4 인간화 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

TNF-관련 아폽토시스 유도 리간드(TNF-related apoptosis inducing ligand; TRAIL)에 의해서 활성화되는 세포사멸 수용체 4(DR4)와 세포사멸 수용체 5(DR5)의 경로를 통한 세포사멸 기작은 정상세포에는 부작용이 적으면서 암세포에는 특이적으로 세포사멸을 유도하므로 암 치료제 개발의 중요 표적으로 여겨져 왔다 (Ashkenazi 등 Nat Rev Drug Discov., 7:1001-1012, 2008; Papenfuss 등, J Cell Mol Med., 12:2566-2585, 2008). 그러나, 재조합 TRAIL에 의한 세포사멸은 용액상에서 다분자 형태(soluble oligomer)를 보이는 경우가 많아 세포사멸 능력이 현저히 떨어지며, 또한 면역작용에 의한 부작용이 크다고 알려져 있다(Jo 등 Nat. Med., 6:564-567, 2000). 따라서, 기존의 리간드인 TRAIL을 대신하여 세포사멸 수용체들에 특이적인 친화도를 갖는 항체를 개발하여 세포사멸을 유도하는 연구가 다 수 진행중이며(Walczak 등, Nat. Med., 5:157-161, 1999; 및 Guo 등, J. Biol. Chem., 280:41940-41952, 2005; 및 Georgakis 등, Br. J. Haematol., 130:501-510, 2005), 개발이 활발히 진행중인 DR4에 특이적인 항체로는 Human Genome Sciences사 (HGS, Rockville MD, 미국)의 HGS-ETR1이 대표적이다(Pukac 등, Br J Cancer., 25:1430-1441, 2005). 이 항체는 현재 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's lympoma, NHL), 대장암(Colorectal cancer), 비소세포성 폐암(Non-small cell lung cancer, NSCLC)에서 임상 2상이 완료되었다(Papenfuss 등, J Cell Mol Med., 12:2566-2585, 2008).

항 DR4 마우스 항체인 AY4는 항원 DR4에 대하여 TRAIL과는 다른 부위에 특이적으로 결합하여 TRAIL-민감성 세포주인 H460(NSCLC), HCT116(Colon carcinoma), Ramos(B cell lympoma) 등에서 효과적인 세포 독성을 보이며, 정상 간세포에서는 세포독성을 보이지 않는다. 중요한 것은 항 DR4 마우스 항체인 AY4는, 위에서 언급한 HGS-ETR1 항체가 세포독성을 보이지 못하는 Jurkat 세포주(Acute T cell leukemia)에서 효과적인 세포독성을 보인다는 점이다(Sung 등, Mol Cancer Ther., 8:2276-2285, 2009).

인간화 항체의 구축은 면역거부반응의 최소화를 통한 임상 시험의 적용 (clinical application)에 필수적이다. 전통적인 인간화 항체의 구축 방법은 항체의 가변부위(variable region) 중 항원 결합에 중요한 역할을 하는 부위인 CDR들을 유전자 은행(Gene Data Bank) 등을 통하여 조사된 아미노산의 상동성 (homology)이 가장 높은 인간 항체 골격으로 이식(grafting)하는 'CDR 이식법'에서 출발한다. 그 러나, CDR 이식법에 의한 인간화 항체의 구축은 항체의 친화도, 특이성, 항원결합부위 등이 완벽하게 보존되지 못하는 경우가 빈번하게 존재한다 (Presta 등, Cancer Res., 57:4593-4599, 1997; Ewert 등, Methods., 34:184-199, 2004). 이러한 단점을 보완하기 위하여 CDR 이외에도 항체 골격에 위치하는 아미노산 중 항원 결합에 중요한 역할을 할 수 있는 부위를 고려하는 방법(Makabe 등, J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2008), 가변중쇄(VH)와 가변경쇄(VL)의 접촉면 (interface)을 고려하는 방법(Chothia 등, J. Mol. Biol., 186:651-663, 1985), CDR 표준 구조(CDR canonical structure)를 포함한 CDR의 상동성을 고려하는 방법 (Hwang 등, Methods., 36:35-42, 2005) 등이 널리 적용되어 왔다.

따라서, 인간화 항체 구축시 인간화 항체의 항원에 대한 친화도 및 특이성이 감소되는 것을 보완하기 위한 연구의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명자들은 인간화 항체 구축 방법 중 단순한 CDR 이식법만으로 구축된 인간화 항체의 항원에 대한 친화도가 감소되는 경우를 보완하기 위하여 연구하던 중, 항 DR4 마우스 항체와 인간 항체 골격으로서 항 Bcl2 항체의 아미노산 서열분석을 통하여 가변중쇄 부위에 16개의 아미노산과 가변경쇄 부위에 14개의 아미노산으로 이루어진 전체 30개의 베르니에 구역의 아미노산 중 가변중쇄 부위의 3개(49번 알라닌, 93번 트레오닌, 94번 아르기닌)와 가변경쇄 부위의 5개(2번 트레오닌, 4번 발린, 46번 알라닌, 49번 세린, 64번 세린)를 추가로 보존하여 항 DR4 인간화 항체를 제조하였으며, 상기 항 DR4 인간화 항체가 항원 DR4에만 특이적으로 결합하고, 항 DR4 마우스 항체와 비슷한 수준에서 항원결합부위 및 친화도가 보존되며, 기존의 TRAIL 또는 항 DR5 항체가 죽이지 못했던 DR4 발현 암세포주에 대해 세포사멸을 유도함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 DR4에 특이적으로 결합하는 항 ＤＲ4 인간화 항체로서, 상기 항체는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 항 ＤＲ4 인간화 항체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DR4에 특이적으로 결합하는 항 ＤＲ4 인간화 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 항 ＤＲ4 인간화 항체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 항 ＤＲ4 인간화 항체는 항 ＤＲ4 마우스 항체의 면역거부반응을 최소화하기 위한 인간화 항체로서, 가변중쇄 부위에 16개의 아미노산과 가변경쇄 부위에 14개의 아미노산으로 이루어진 전체 30개의 베르니에 구역의 아미노산 중 가변중쇄 부위의 3개(49번 알라닌, 93번 트레오닌, 94번 아르기닌)와 가변경쇄 부위의 5개(2번 트레오닌, 4번 발린, 46번 알라닌, 49번 세린, 64번 세린)를 추가로 보존하여 구축된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항 ＤＲ4 인간화 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역과 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함한다.

본 발명에 있어서, "DR4"(세포사멸수용체-4; TRAIL-receptor 1(TR1))는 TNF 수용체 패밀리의 일원으로서 TRAIL에 결합하고, C-말단에 세포 내 죽음 도메인 (death domain)을 갖는 수용체이다(Pan 등, Science 276:111-113, 1997). DR4는 TRAIL에 결합하는 경우 타입-I 암세포에서 아폽토시스를 유도하고, 또한 DR4가 과발현되는 경우 아폽토시스가 증가된다(Pan 등, Science 276:111-113, 1997). 본 발명에 있어서, "DR4"란 상기한 바와 같은 특성을 갖는 단백질이면 어느 것이나 포함되며, 예를 들어 원용에 의하여 그 전체 내용이 국제특허 제 W099/02653호의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이나 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "항체"는 전체 형태의 항체("전항체") 또는 그의 기능적인 단편일 수 있다. 상기 전항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있다. 상기 항체의 기능적인 단편은 전항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체로서, 실질적으로 전항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위 (epitope)를 인식하는 것을 의미한다. 상기 항체의 기능적인 단편에는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 등이 포함되나 이에 한정되지 않으며, 본 발명에서는 scFv가 바람직하다. 상기 단일쇄 가변영역 (scFv)은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통하여 연결되어 단일쇄 폴리펩티드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.

본 발명에 따른 항 ＤＲ4 인간화 항체는 가변중쇄 부위에 16개의 아미노산과 가변경쇄 부위에 14개의 아미노산으로 이루어진 전체 30개의 베르니에 구역의 아미노산 중 가변중쇄 부위의 3개(49번 알라닌, 93번 트레오닌, 94번 아르기닌)와 가변경쇄 부위의 5개(2번 트레오닌, 4번 발린, 46번 알라닌, 49번 세린, 64번 세린)를 추가로 보존함으로써, 항 ＤＲ4 마우스 항체와 마찬가지로 항원 DR4에만 특이적으로 결합하고, 항 ＤＲ4 마우스 항체와 비슷한 수준에서 항원결합부위 및 친화도가 보존되며, 다른 상동 유사 항원(DR5, DcR1, DcR2)과는 실질적으로 교차반응을 하지 않아 결합하지 않으며, TRAIL 결합부위와는 다른 DR4 부위에 결합하여 기존의 TRAIL 또는 항 DR5 항체가 죽이지 못했던 DR4 발현 암세포주에 대해 아폽토시스에 의한 세포사멸을 유도한다.

따라서, 본 발명에 따른 항 ＤＲ4 인간화 항체는 ＤＲ4 발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 ＤＲ4 발현에 의해 야기되는 암은 인체의 각종 암, 부인과 종양, 내분비계 암, 중추신경계 종양, 수뇨관 암 등이 있으며, 구체적으로는 혈액암, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 항 ＤＲ4 인간화 항체와 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정 제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 항 ＤＲ4 인간화 항체의 일일 투여량은 약 1~10㎎/㎏, 바람직하게는 약 3~5㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 항 DR4 마우스 항체인 AY4의 인간화 항체 구축

1-1. 인간화 항체 구축을 위한 적합한 인간 항체 골격의 선정 및 AY4 항체 CDR 부위의 이식

항 DR4 마우스 항체인 AY4의 인간화 항체 구축을 위한 전략으로서, 항체 부 위 중 항원과의 결합에 중요한 영향을 미치는 CDR(complementarity determining region)을 최적화된 인간 항체 골격(framework)에 이식하는 CDR 이식법을 이용하였다. AY4 항체의 CDR 부위의 이식을 위하여, 우선 AY4 항체의 가변중쇄(VH) 및 가변경쇄(VL) 부위의 아미노산을 Kabat 정의법(Kabat numbering)에 따라 골격들과 CDR들로 구분하였다(도 1 참조). 그리고, 이렇게 정의된 CDR 부위를 이식하기 위한 적절한 인간 항체 골격으로서 VH3 및 Vk1 아류형에 속하는 항 Bcl2 항체(Cohen-Saidon 등, Blood 102:2506-2512 2003)를 선정하였다. VH3 및 Vk1 아류형은 그 열역학적 안정성 및 발현 수율이 기존 연구 결과들에 의해 충분히 증명되었으며, 특히 다양한 마우스 항체의 인간화에 성공적으로 사용되어 왔다(Carter 등, Proc Natl Acad Sci U S A 89:4285-4289 1992; Presta 등, Cancer Res 57:4593-4599 1997; Presta 등, J Immunol 151:2623-2632 1993; Werther 등, J Immunol 157:4986-4995 1996).

1-2. 친화도의 유지를 위한 추가적인 보존 아미노산의 선정

단순한 CDR 이식법에 의한 인간화 항체의 구축은 항원에 대한 친화도가 감소되는 경우가 다수 존재하므로(Presta 등, Cancer Res., 57:4593-4599, 1997; Ewert 등, Methods., 34:184-199, 2004), 이를 보완하기 위하여 항체 골격에 위치하면서 CDR과 근접하여 CDR 루프의 구조에 영향을 미치는 소위 '베르니에 구역 (Vernier Zone)'에 위치하는 아미노산을 추가로 보존하는 전략을 취하였다. 베르니에 구역에 위치하는 아미노산은 가변중쇄 부위에 16개, 가변경쇄 부위에 14개가 각각 존재하며(Foote 등, J. Mol. Biol., 224:487-499, 1992), 마우스 항체와 선정된 인간 항 체의 아미노산 서열 분석을 통하여 전체 30개의 베르니에 구역의 아미노산 중 가변중쇄 부위의 3개(49번 알라닌, 93번 트레오닌, 94번 아르기닌)와 가변경쇄 부위의 5개(2번 트레오닌, 4번 발린, 46번 알라닌, 49번 세린, 64번 세린)를 추가로 보존하였다(도 1 참조). 항 DR4 인간화 항체의 중쇄 가변영역의 염기서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2로 나타내었으며, 경쇄 가변영역의 염기서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 4로 나타내었다.

1-3. scFv 형태의 인간화 항체 유전자 제작

위에서 언급한 인간화 항체 구축 전략을 바탕으로 하여 인간화 항체 제작을 위한 프라이머를 제작하였다. 이미 단일쇄 가변영역(single-chain variable fragment, scFv) 형태로 제작된 AY4를 주형으로 하여, 첫 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-CCA GCT AGC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC T-3'(서열번호 5)를, 역방향 프라이머로 5'-CCC TGG AGC CTG GCG GAC CCA AGA CAT GGC AAA GCT ACT GAA AGT GAA TCC AGA GG-3'(서열번호 6)을 사용하였고, 두 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-CCG CCA GGC TCC AGG GAA GGG GCT GGA GTG GGT CGC ATC CAT TAG TAG TGG TGG TAT CAC CTA CTA TCC AGA CTC CGT GAA GGG CC-3'(서열번호 7)을, 역방향 프라이머로 5'-GCC CCA GTA GTC AAA GTC ACC AAT TTT TCT TGT ACA GTA ATA TAC GGC CGT GTC CT-3'(서열번호 8)을 사용하였으며, 세 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GGT GAC TTT GAC TAC TGG GGC-3'(서열번호 9)를, 역방향 프라이머로 5'-CTG AAC CTT GAT GGG ACC CCA GGA CGA AGA GTA TTG CCT TCT GAA ATA AGG GCC TTA GGG GCT TTC CCT GGT TTC TGC TGG TAC CAG GTC AAA TCA CCA TCA ATA TCA GTG CTG GAT ATG CAA GTG ATG GTG ACT CTG TCT-3'(서열번호 10)을 사용하였고, 네 번째 단편은 정방향 프라이머로 5'-GGG GTC CCA TCA AGG TTC AG-3'(서열번호 11)을, 역방향 프라이머로 5'-CCA GGA TCC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CGT GAG AGG CAA GTT ATC ACT TTG CAA ACA GTA GTA AGT TGC AAA ATC TTC AGG-3'(서열번호 12)를 사용하였으며, 모든 프라이머는 IDT사(미국)에서 제작하였다. 각 단편은 pfu 중합효소(인트론, 한국)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 제작하였고, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 40초의 반응을 30회 반복하였다. 각각 제작된 네 개의 단편들은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 아가로스 겔 정제 키트 (인트론, 한국)를 이용하여 정제되었다. 정제된 네 개의 단편을 각 10μM씩 동량으로 혼합한 다음, 서열번호 5와 서열번호 12의 프라이머를 각각 200nM씩 첨가한 후, 중첩 연장 PCR(overlap extension PCR)을 수행하여 최종적으로 인간화 항체 scFv 유전자 산물을 제조하였으며, hAY4로 명명하였다. hAY4 scFv 항체의 염기서열과 아미노산 서열은 각각 서열번호 13 및 14로 나타내었다. 상기 PCR은 pfu 중합효소(인트론, 한국)를 이용하여 수행하였고, 94℃에서 40초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분의 반응을 30회 반복하였다.

실시예 2 : hAY4 scFv 항체의 발현 및 정제

항 DR4 인간화 항체인 hAY4의 scFv 형태로의 발현 및 정제를 위하여, 대장균 발현벡터인 pKJ1에 Nhe I/BamH I을 이용하여 인 프레임(in-frame)으로 도입하였다. 이때, 대장균 발현벡터는 T7 프로모터 - pelB 유도서열(leader sequence) - hAY4 scFv - Flag tag - 6X his tag을 가지도록 설계되었다. 상기 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후, 항생제 암피실린(ampicillin)이 50㎍/㎖ 첨가된 LB [5g/L yeast extract(BD사, 미국), 10g/L tryptone(BD사, 미국), 10g/L NaCl(Sigma사, 미국)] 배지에서 37℃, 200rpm으로 OD₆₀₀가 0.8이 될 때 까지 배양한 후, 0.5mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Calbiochem사, 독일)를 첨가하고, 23℃, 160rpm으로 16시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 원심분리하여 상등액만을 취한 후, Talon Resin(Clontech사, 미국)을 사용하여 발현된 항체를 정제한 다음, 정제된 항체의 크기 및 순도를 환원성 SDS-PAGE로 분석하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항 DR4 인간화 항체인 hAY4 scFv는 약 29 kDa의 분자량을 가지며, 99% 이상의 순도로 정제됨을 확인하였다.

실시예 3 : hAY4 scFv 항체의 DR4 항원에 대한 친화도 측정

DR4 항원에 대한 hAY4 scFv 항체의 결합 친화도를 Biacore 2000 SPR(surface plasmon resonance) 바이오센서(GE사, 미국)를 이용하여 측정하였다. 약 0.5㎎/㎖의 DR4 항원과 음성대조군인 BSA(bovine serum albumin)를 CM5 칩 (carboxymethylated dextran surface chip)에 약 1,000 반응단위(response unit)로 고정화시킨 후, 50~800 nM 범위로 희석된 hAY4 scFv를 30㎕/분의 속도로 2분간 칩에 주입하여 항원과의 상호작용을 정량하였다. 칩의 표면은 1M NaCl /20mM NaOH로 재생하였으며, BIAevaluation ver. 3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동속도상수(k _on 및 k _off)와 평형해리상수(K_D)로 얻었다. 비교군으로는 항 DR4 마우스 항체 (mAY4 scFv)와 순수하게 CDR만을 이식한 인간화 항체(hAY4.0 scFv)를 사용하였다.

hAY4 scFv 항체의 DR4에 대한 친화도를 SPR을 이용하여 정량한 결과는 도 3에 나타내었으며, hAY4 scFv 항체의 DR4에 대한 친화도를 운동속도상수(k _on 및 k _off)와 평형해리상수(K_D)로 나타낸 결과는 표 1에 나타내었다.

항체	운동속도상수		평형해리상수 (K_D)(M)
항체	k_on(M^-1S^-1)	k_off(S^-1)	평형해리상수 (K_D)(M)
mAY4 scFv	3.68×10⁴	7.62×10^-3	2.07×10^-7
hAY4.0 scFv	6.14×10³	9.83×10^-3	1.61×10^-6
hAY4 scFv	(1.96±0.12)×10⁴	(5.67±0.23)×10^-3	(2.89±0.21)×10^-7

도 3 및 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 항 DR4 인간화 항체(hAY4 scFv)의 DR4 항원에 대한 친화도는 289nM이고, 항 DR4 마우스 항체(mAY4 scFv)의 DR4 항원에 대한 친화도는 207nM이며, 순수하게 CDR만을 이식한 인간화 항체 (hAY4.0 scFv)의 DR4 항원에 대한 친화도는 1610nM로 나타났다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 항 DR4 인간화 항체(hAY4 scFv)는 순수하게 CDR만을 이식한 인간화 항체(hAY4.0 scFv)에 비해 DR4 항원에 대한 친화도가 약 5.57배 증가하였으며, 항 DR4 마우스 항체(mAY4 scFv)와는 비슷한 수준에서 친화도가 보존됨을 확인하였다.

실시예 4 : hAY4 scFv 항체의 DR4 항원 및 유사 항원에 대한 교차반응성 측정

hAY4 scFv 항체의 DR4 항원 및 유사항원(DR5, DcR1 및 DcR2)에 대한 교차반응성을 ELISA를 통하여 규명하였다. ELISA용 96-웰 플레이트에 각 항원 DR4, DR5, DcR1, DcR2를 50㎕(10㎍/㎖) 코팅한 후 37℃에서 1시간 배양하였다. PBST(pH 7.4 with 0.1% Tween 20) 300㎕로 3회 세척한 후 5% 탈지우유(skim milk)가 함유된 PBST(pH 7.4 with 0.1% Tween 20) 200㎕를 넣어 상온에서 1시간 배양하고, hAY4 scFv 50㎕(30 ㎍/㎖) 및 양성대조군인 TRAIL 50㎕(0.001㎍/㎖)를 넣어 37℃에서 1시간 배양하였다. PBST 200㎕로 3번 세척한 후, 쥐 유래의 항 FLAG-TAG(mouse anti-FLAG tag antibody, sigma) 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하고, 다시 PBST 200㎕로 3번 세척한 다음 토끼 유래의 항-mouse mAb AP conjugated(pierce사) 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. PBST 200㎕로 3번 세척한 이후 기질로 pNPP(Sigma사)를 50㎕ 첨가하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, hAY4 scFv는 mAY4 항체와 마찬가지로 유사항원인 DR5, DcR1, DcR2에는 결합하지 않고 DR4에만 특이적으로 결합하였다. 따라서, 본 발명의 hAY4 scFv는 DR4 항원에 특이적으로 결합하는 항체임을 알 수 있다.

실시예 5 : AY4 항체와 hAY4 항체 간의 DR4 항원에 대한 항원결합부위의 보존 여부 규명

항 DR4 인간화 항체인 hAY4 항체 구축 후에 AY4와 동일한 항원결합부위 (epitope)를 가지는지, 즉, 항원결합부위가 보존되었는지의 여부를 규명하기 위하여 hAY4 항체와 AY4 항체간의 경쟁적 ELISA(competitive ELISA)를 수행하였다. ELISA용 96-웰 플레이트에 항원 DR4를 50㎕(10 ㎍/㎖) 코팅한 후 37℃에서 1시간 배양하였다. PBST(pH 7.4, with 0.05% Tween20 및 0.02% sodium azide)로 3회 세척한 후 5% 탈지우유가 함유된 PBS로 37℃에서 1시간 배양하였다. 그 후, hAY4 scFv를 30㎍/㎖로 처리하고, AY4 scFv 및 TRAIL(양성대조군)의 농도를 0.9~650 nM로 하여 각 웰에 혼합하여 첨가한 후 37℃에서 1시간 배양하고, 플레이트를 세척한 후, 항-Flag M2 항체(simga.)를 처리하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 이 후, 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase)가 접합된 항-마우스 항체(anti-mouse mAb AP conjugated, Sigma)를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 3회 세척한 후 기질로 pNPP(Sigma.)를 50㎕ 첨가하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, AY4 scFv의 농도가 증가할수록 양성대조군인 TRAIL과는 달리 hAY4 scFv의 항원에 대한 결합력이 약해짐을 볼 수 있다. 이는 인간화 항체(hAY4 scFv) 구축 후에도 AY4 scFv의 항원결합부위는 보존되었음을 의미한다.

실시예 6 : 인간 IgG 형태(human IgG form)로의 hAY4-IgG 항체의 발현 및 정제

hAY4-IgG 항체의 발현을 위하여, hAY4 가변중쇄 유전자는 항체 중쇄 발현벡터(대한민국 등록특허번호 제 10-0604038호)에, hAY4 가변경쇄 유전자는 항체 경쇄 카파 발현벡터(대한민국 등록특허번호 제 10-0604037호)에 각각 도입하였다. 이렇게 hAY4 유전자가 포함된 두 벡터는 CHO 세포에 공동 도입(co-transfection)되어 배양되었다. 배양이 끝난 후 배양액을 수집하고, rProtein A resin(GE healthcre, 미국)에 분당 1㎖의 속도로 흘려주어 발현된 항체를 정제하고, 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 비환원성 SDS-PAGE에서는 완전한 IgG 형태로서 약 150kDa의 크기를 가지는 단백질이 99% 이상의 순도로 발견되었고, 환원성 SDS-PAGE에서는 IgG의 경쇄와 중쇄가 각각 분리되어 약 50kDa(중쇄) 및 약 25kDa(경쇄)의 두 종류의 단백질이 발견되었다.

실시예 7 : hAY4-IgG 항체의 DR4 항원에 대한 친화도 측정

DR4 항원에 대한 hAY4-IgG 항체의 결합 친화도를 Biacore 2000 SPR(surface plasmon resonance) 바이오센서(GE사, 미국)를 이용하여 측정하였다. 약 0.5㎎/㎖의 DR4 항원과 음성대조군인 BSA(bovine serum albumin)를 CM5 칩 (carboxymethylated dextran surface chip)에 약 1,000 반응단위(response unit)로 고정화시킨 후, 6.25~100 nM 범위로 희석된 hAY4-IgG 항체를 30㎕/분의 속도로 2분간 칩에 주입하여 항원과의 상호작용을 정량하였다. 칩의 표면은 1M NaCl /20mM NaOH로 재생하였으며, BIAevaluation ver. 3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동속도상수(k _on 및 k _off)와 평형해리상수(K_D)로 얻었다.

hAY4-IgG 항체의 DR4에 대한 친화도를 SPR을 이용하여 정량한 결과는 도 7에 나타내었으며, hAY4 scFv 항체의 DR4에 대한 친화도를 운동속도상수(k _on 및 k _off)와 평형해리상수(K_D)로 나타낸 결과는 표 2에 나타내었다.

항체	운동속도상수		평형해리상수 (K_D)(M)
	k_on(M^-1S^-1)	k_off(S^-1)
hAY4-IgG	(1.49±0.09)×10⁵	(8.79±0.13)×10^-3	(5.90±0.11)×10^-8

도 7 및 표 2에 나타난 바와 같이, hAY4-IgG 항체의 평형해리상수(K_D)는 (5.90±0.11)×10^-8 M로 DR4 항원에 대한 친화도가 59nM임을 알 수 있다.

실시예 8 : hAY4-IgG 항체의 암세포에서의 세포사멸 유도 확인

AY4 항체가 효과적으로 세포사멸을 유도하였던 세포주들인 인간 대장암 세포주(human colon cancer cell line)인 HCT116 및 인간 폐암 세포주(human lung cancer cell line)인 H460에서 hAY4-IgG 항체의 세포사멸 능력을 평가하였다. 액체 질소에 보관되어 있는 세포주들을 꺼내어 37℃에서 빠르게 녹인 후 원심분리하여 냉동보관 배지를 제거하고, 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 배양 배지인 10% FBS, 100unit/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지 (WELGENE 사)를 사용하여 배양 플라스크에 넣고 배양하였다. 2~3일 후 세포가 안정적으로 배양되면, TE 완충액 1㎖를 처리하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 5㎖로 TE 완충액의 반응을 정지시킨 후, 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포들은 동일한 배양배지로 각각 재현탁한 후 96-웰 플레이트에 웰당 세포를 10,000(100 ㎕)씩 분주하고 hAY4-IgG 항체의 농도를 0.001~10 ㎍/㎖로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTT 분석을 통하여 세포사멸 능력을 평가하였다.

결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, HCT116 및 H460 세포주에서 hAY4-IgG 항체의 농도가 증가할수록 세포사멸능력이 증가하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 산제의 제조

항 DR4 인간화 항체 0.1 g

유당 1.5 g

탈크 0.5 g

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2 : 정제의 제조

항 DR4 인간화 항체 0.1 g

락토오스 7.9 g

결정성 셀룰로오스 1.5 g

마그네슘 스테아레이트 0.5 g

상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.

제제예 3 : 캡슐제의 제조

항 DR4 인간화 항체 0.1 g

옥수수전분 5 g

카복시 셀룰로오스 4.9 g

상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4 : 주사제의 제조

항 DR4 인간화 항체 0.02~0.2 g

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

안정화제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5 : 액제의 제조

항 DR4 인간화 항체 0.1 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

본 발명에 따른 항 ＤＲ4 인간화 항체는 가변중쇄 부위에 16개의 아미노산과 가변경쇄 부위에 14개의 아미노산으로 이루어진 전체 30개의 베르니에 구역의 아미노산 중 가변중쇄 부위의 3개(49번 알라닌, 93번 트레오닌, 94번 아르기닌)와 가변경쇄 부위의 5개(2번 트레오닌, 4번 발린, 46번 알라닌, 49번 세린, 64번 세린)를 추가로 보존함으로써, 항 ＤＲ4 마우스 항체와 마찬가지로 항원 DR4에만 특이적으로 결합하고, 항 ＤＲ4 마우스 항체와 비슷한 수준에서 항원결합부위 및 친화도가 보존되며, 다른 상동 유사 항원(DR5, DcR1, DcR2)과는 실질적으로 교차반응을 하지 않아 결합하지 않으며, TRAIL 결합부위와는 다른 DR4 부위에 결합하여 기존의 TRAIL 또는 항 DR5 항체가 죽이지 못했던 DR4 발현 암세포주에 대해 아폽토시스에 의한 세포사멸을 유도한다. 따라서, 본 발명에 따른 항 ＤＲ4 인간화 항체는 ＤＲ4 발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 항 DR4 마우스 항체인 AY4 항체, 인간화 항체 구축에 사용된 항 Bcl2 항체, 및 본 발명의 항 DR4 인간화 항체인 hAY4의 아미노산 서열을 가변중쇄와 가변경쇄로 나누어 정렬한 도이다[대괄호 ([])는 각각 CDR을 나타내고, 밑줄은 베르니에 구역에 해당하는 아미노산을 나타내며, 별표(*)는 친화도의 유지를 위하여 AY4 항체에서 유래한 아미노산으로 보존한 부분을 나타낸다.].

도 2는 정제된 항 DR4 인간화 항체인 hAY4 scFv 항체의 크기 및 순도를 환원성 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 3은 hAY4 scFv 항체의 DR4에 대한 친화도를 SPR을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 hAY4 scFv 항체의 DR4 항원 및 유사항원(DR5, DcR1 및 DcR2)에 대한 교차반응성을 ELISA를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명의 항 DR4 인간화 항체인 hAY4의 항원결합부위가 보존되었는지의 여부를 경쟁적 ELISA를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 6은 hAY4-IgG 항체를 정제한 후 환원성 SDS-PAGE 및 비환원성 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 7은 hAY4-IgG 항체의 DR4에 대한 친화도를 SPR을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 도이다.

도 8은 hAY4-IgG 항체의 세포사멸능력을 MTT 분석을 통하여 평가한 결과를 나타낸 도이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Anti-death receptor 4 humanized antibody, and composition for preventing or treating cancer comprising the same <130> P09-07194 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH nucleotide sequence of hAY4 <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttgcca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtatcac ctactatcca 180 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtacaag aaaaattggt 300 gactttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cgagc 345 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH amino acid sequence of hAY4 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Lys Ile Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL nucleotide sequence of hAY4 <400> 3 gacacccagg tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca tatccagcac tgatattgat ggtgatttga cctggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggccct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg ggtcccatca 180 aggttcagta gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtttgcaa agtgataact tgcctctcac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgt 324 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL amino acid sequence of hAY4 <400> 4 Asp Thr Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Ser Ser Thr Asp Ile Asp Gly Asp 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ccagctagcg aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct 40 <210> 6 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 ccctggagcc tggcggaccc aagacatggc aaagctactg aaagtgaatc cagagg 56 <210> 7 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtatcac 60 ctactatcca gactccgtga agggcc 86 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 gccccagtag tcaaagtcac caatttttct tgtacagtaa tatacggccg tgtcct 56 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 ggtgactttg actactgggg c 21 <210> 10 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 ctgaaccttg atgggacccc aggacgaaga gtattgcctt ctgaaataag ggccttaggg 60 gctttccctg gtttctgctg gtaccaggtc aaatcaccat caatatcagt gctggatatg 120 caagtgatgg tgactctgtc t 141 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 ggggtcccat caaggttcag 20 <210> 12 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 ccaggatcca cgtttgattt ccaccttggt cccttggccg aacgtgagag gcaagttatc 60 actttgcaaa cagtagtaag ttgcaaaatc ttcagg 96 <210> 13 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hAY4 scFv <400> 13 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttgcca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtatcac ctactatcca 180 gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtacaag aaaaattggt 300 gactttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cgagcggtgg aggcggttca 360 ggcggaggtg gcagcggcgg tggcgggtcg gacacccagg tgacccagtc tccatcctcc 420 ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca tatccagcac tgatattgat 480 ggtgatttga cctggtacca gcagaaacca gggaaagccc ctaaggccct tatttcagaa 540 ggcaatactc ttcgtcctgg ggtcccatca aggttcagta gcagtggatc tgggacagat 600 ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg caacttacta ctgtttgcaa 660 agtgataact tgcctctcac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa acgt 714 <210> 14 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hAY4 scFv <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Lys Ile Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Thr Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Ser Ser Thr Asp Ile Asp 145 150 155 160 Gly Asp Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe 180 185 190 Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 195 200 205 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu 210 215 220 Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 225 230 235

Claims

DR4에 특이적으로 결합하는 항 ＤＲ4 인간화 항체로서, 상기 항체는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체.
제 1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 13의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체.
제 1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역과 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체.
제 3항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체.
제 3항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 cDNA 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체.
제 1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체.
제 1항에 있어서, 상기 항체는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항 ＤＲ4 인간화 항체.
서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는, 제 1항의 항 ＤＲ4 인간화 항체 중 중쇄 가변영역.
서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는, 제 1항의 항 ＤＲ4 인간화 항체 중 경쇄 가변영역.
제 1항의 항 ＤＲ4 인간화 항체를 유효성분으로 함유하는 ＤＲ4 발현에 의해 야기되는 암 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 10항에 있어서, 상기 암은 혈액암, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.