KR102112969B1 - 높은 차단 활성을 갖는 항-Ｃ5ａ 결합 부분 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 C5a, 특히 인간 C5a의 구조적(conformational) 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 부분에 관한 것이다. 바람직한 결합 부분은 상기 구조적 에피토프에 결합하는 항-C5a 항체이다. 본 발명에 개시된 결합 부분들은 다양한 급성 및 만성 질병, 특히 급성 염증성 질병, 예를 들어 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 및 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크를 비롯한 상이한 정도의 패혈증의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물 중에서 활성제로서 유용하다.

Description

높은 차단 활성을 갖는 항-Ｃ5ａ 결합 부분{ANTI-C5A BINDING MOIETIES WITH HIGH BLOCKING ACTIVITY}
본 발명은 C5a, 특히 인간 C5a의 구조적(conformational) 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 부분에 관한 것이다. 바람직한 결합 부분은 상기 구조적 에피토프에 결합하는 항-C5a 항체이다. 본 발명에 개시된 결합 부분들은 다양한 급성 및 만성 질병, 특히 급성 염증성 질병, 예를 들어 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 및 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크를 비롯한 상이한 정도의 패혈증의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물 중에서 활성제로서 유용하다.
C5a는 보체 활성화 시 C5로부터 절단된다. 상기 보체 활성화 생성물들 중에서, C5a는 가장 강한 염증성 펩타이드 중 하나이며, 넓은 작용 범위를 갖는다(문헌[Guo and Ward 2005]). C5a는 건강한 인간의 혈액 중에 존재하는, 11.2 kDa의 분자량을 갖는 당단백질이다. 상기 C5a의 폴리펩타이드 부분은 8.2 kDa의 분자량을 차지하는 74 개 아미노산을 함유하는 반면, 탄수화물 부분이 대략적으로 3 kDa을 차지한다. C5a는 고-친화성 C5a 수용체들(C5aR 및 C5L2)을 통해 그의 효과를 발휘한다(문헌[Ward 2009]). C5aR은 7 개의 막 관통 구획을 갖는 G-단백질-결합된 수용체의 로돕신-유형 그룹에 속하며; C5L2는 유사하지만 G-단백질-결합되지 않는다. 현재 C5a는, C5a-C5L2 상호작용에 대한 생물학적 반응이 거의 발견되지 않았기 때문에, 주로 C5a-C5aR 상호작용을 통해 그의 생물학적 작용을 발휘하는 것으로 여겨진다. C5aR은 다수의 기관, 특히 폐 및 간 중의 호중구, 호산구, 호염기구, 및 단핵구를 포함한 골수 세포, 및 비골수 세포 상에서 광범위하게 발현되며, 이는 C5a/C5aR 신호전달의 중요성을 가리킨다. C5a는 다양한 생물학적 작용들을 갖는다(문헌[Guo and Ward 2005]). C5a는 호중구에 대한 강한 화학유인물질이며 또한 단핵구 및 대식세포에 대해 화학주성 활성을 갖는다. C5a는 호중구에서 산화물 배출(oxidative burst)(O2 소비)을 일으키며 식작용 및 과립상 효소의 방출을 증진시킨다. C5a는 또한 혈관확장제인 것으로 밝혀졌다. C5a는 다양한 세포 유형들로부터의 사이토킨 발현의 조절에 관여하여 호중구 상의 부착 분자의 발현을 증진시키는 것으로 나타났다. C5a는 염증 반응 연쇄의 상류 부분에서 작용하는 염증 반응에 대한 강한 유도 인자 및 증진 인자이므로, 질병 환경에서 과도하게 생산되는 경우 매우 유해하게 되는 것으로 밝혀졌다. 고 용량의 C5a는 호중구에 대한 비특이적 화학주성 "탈감작"을 유도하여, 광범위한 기능장애를 유발할 수 있다(문헌[Huber-Lang et al. 2001a]).
C5a는 다수의 염증유발 반응을 발휘하는 것으로 보고되었으며, 패혈증인 동안 유해한 것으로 보고되었다. 항체에 의한 C5a 또는 C5a 수용체(C5aR)의 억제는 마우스 및 래트의 다양한 패혈증 모델에서 생존을 대단히 개선시키는 것으로 입증되었다(문헌[Czermak et al. 1999]; [Guo et al. 2000]; [Huber-Lang et al. 2001b]; [Riedemann et al. 2002a]). 또한, 다양한 보고서들이 실험상 패혈증인 동안 본래의 선천적인 면역- 및 기관 작용들에 대한 C5a의 유해 효과를 입증하였다(문헌[Guo et al. 2000]; [Guo et al. 2002]; [Huber-Lang et al. 2001a]; [Huber-Lang et al. 2002]; [Laudes et al. 2002]; [Riedemann et al. 2003]; [Riedemann et al. 2004a]; [Riedemann et al. 2004b]). C5a는 아나필라톡신으로서 작용하며 다수의 염증 유발 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다. 인간 패혈증의 다양한 연구들에서, 높은 수준의 C5a는 현저하게 악화된 결과와 관련되는 것으로 보고되었다(문헌[Bengtson and Heideman 1988]; [Nakae et al. 1994]; [Nakae et al. 1996]).
패혈증의 실험 환경에서, C5a에 대한 호중구의 노출은 호중구 기능장애 및 신호전달 경로의 마비를 도출시켜, NADPH 옥시다제의 불완전한 조립, MAPK 신호전달 캐스케이드의 마비, 크게 낮아진 산화물 배출, 식작용 및 화학주성에 이르게 할 수 있다(문헌[Guo et al. 2006a]; [Huber-Lang et al. 2002]). 흉선 세포 세포사멸 및 지연된 호중구 세포사멸은 패혈증 발병에 중요한 2 개의 병원성 사건이며, 이는 C5a의 존재에 의존한다(문헌[Guo et al. 2000]; [Guo et al. 2006b]). 실험상 패혈증인 동안, C5a는 호중구 상에서의 β2 인테그린 발현을 상향 조절하여, 다기관 부전(MOF)의 주요 원인 중 하나인, 기관으로의 세포 이동을 촉진한다(문헌[Guo et al. 2002]). 또한 C5a는 상기 실험상 패혈증에서 발생하는 응고 경로의 활성화에 기여할 수 있는 것으로 밝혀졌다(문헌[Laudes et al. 2002]). C5a는 염증 유발 사이토킨, 예를 들어 TNF-α, IL-β, IL-6, IL-8, 및 대식세포 이동 억제 인자(MIF)의 합성 및 인간 백혈구로부터의 방출을 자극한다(문헌[Hopken et al. 1996]; [Riedemann et al. 2004a]; [Strieter et al. 1992]). C5a는 폐포 상피 세포에서 TNF-α, 대식세포 염증 단백질(MIP)-2, 사이토킨-유도된 호중구 화학유인물질(CINC)-1, 및 IL-1β의 생산에 있어서 LPS와 강한 상승효과를 생성시킨다(문헌[Riedemann et al. 2002b]; [Rittirsch et al. 2008]). 보체 활성화가 패혈증의 발병 중에 발생하는 사건임을 고려할 때, C5a는 "염증성 사이토킨 습격"의 발생 전에 활동하기 시작할 수도 있다. C5a는 상기 사이토킨 네트워크의 수행성능 및 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 형성을 조직화하는데 주요한 역할을 하는 것으로 보인다. 실험상 패혈증의 환경에서 C5a의 봉쇄는 MOF 및 SIRS를 대단히 약화시킨다. C5aR 발현의 광범위한 상향조절은 패혈증의 발병 동안 발생하며, 항-C5a, 또는 항-C5aR 항체, 또는 C5aR 길항물질에 의한 C5a/C5aR 상호작용의 봉쇄는 패혈증의 설치류 모델에서 고도의 보호 효과를 만든다(문헌[(Czermak et al. 1999]; [Huber-Lang et al. 2001b]; [Riedemann et al. 2002a]).
상기 패혈증 적응증에 더하여, C5a의 봉쇄는 또한 문헌[Klos et al. 2009] 및 [Allegretti et al. 2005]에서 부분적으로 고찰된 바와 같이 다양한 종들에서의 다수의 다른 염증 모델, 예를 들어 허혈/재관류 손상, 신장 질병, 이식편 거부, 말라리아, 류마티스성 관절염, 감염성 장 질병, 염증성 폐 질병, 루푸스형 자가면역 질병, 신경퇴행성 질병 등에서 보호성인 것으로 입증되었다. 더욱이, 최근에 C5a의 봉쇄가 마우스의 종양 모델에서 강한 치료학적 이점을 나타내는 것으로 밝혀졌다(문헌[Markiewski et al. 2008]).
상기 C5a에 특이적으로 결합하지만 C5의 C5b 부분에는 결합하지 않는 항체가 종래 기술로부터 공지되어 있다(문헌[Klos et al. (1998) J. Immunol. Meth. 111: 241-252]; WO 01/15731; WO 03/015819).
그러나, 앞서 생성된 항-C5a 항체들은 단지 C5a에 의해 유발된 생물학적 효과에 대해 보통의 차단 활성만을 나타내었다. 결과적으로, 종래 기술의 항-C5a 항체는 C5a-유발된 생물학적 효과의 완전한 봉쇄를 성취할 수도 없고 C5a 활성의 상당히 높은 봉쇄에 도달하기 위해 초화학량론적인 양으로 사용되어야만 했다.
따라서, 특히 환자에 있어서 잠재적인 임상 용도에 비추어, 종래 기술에서는 C5a에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하면서 C5a-유발된 생물학적 효과에 대해 더 강한 차단 활성을 나타내는 항-C5a 항체 또는 다른 결합 부분들에 대한 필요성이 여전히 남아있다. 또한, 바람직하게는 상기와 같은 항체는 C5b에 결합하지 않아야 하며 결과적으로 C5b의 생물 활성에 영향을 주어서는 안 된다.
매우 놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 상기 언급한 진보된 필요 조건 및 다른 요건들을 충족시키는 상응하는 결합 항체를 갖는 신규의 구조적 결합 에피토프를 확인할 수 있었다. 본 발명에 기초가 되는 끈질긴 실험에서, 2000 개를 넘는 항체들 중에서, 화학량론적 양, 즉 C5a의 몰당 0.5 몰의 2가 항체로 사용될 때 C5a-유발된 생물학적 효과에 대해 전례없는 차단 활성을 나타내는 2 개의 항-C5a 항체를 생성시킬 수 있었다.
상기 개관은 본 발명에 의해 해결된 모든 문제들을 반드시 개시하는 것은 아니다.
발명의 요약
첫 번째 태양에서, 본 발명은 C5a의 아미노산 서열 X1X2ETCEX3RX4(서열번호 18) 및 X5X6KX7X8X9L(서열번호 19)에 의해 형성된 구조적 에피토프에 결합하는 결합 부분에 관한 것이며, 여기에서 X1은 N, H, D, F, K, Y 및 T로 이루어진 군 중에서 선택되고; X2는 D, L, Y 및 H로 이루어진 군 중에서 선택되고; X3은 Q, E 및 K로 이루어진 군 중에서 선택되고; X4는 A, V 및 L로 이루어진 군 중에서 선택되고; X5는 S, H, P 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X6은 H 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X7은 D, N, H, P 및 G로 이루어진 군 중에서 선택되고; X8은 M, L, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택되고; X9는 Q, L 및 I로 이루어진 군 중에서 선택된다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 (i) 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR3 서열; 또는 (ii) 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며; 여기에서 상기 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다.
세 번째 태양에서, 본 발명은 (a) 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분; 또는 (b) 상기 두 번째 태양에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 급성 염증, 예를 들어 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 허혈/재관류 관련된 손상, 예를 들어 허혈성 심장 질병, 급성 폐 손상, 폐렴, 이식 환자의 급성 및 만성 이식편 거부, 이식편 대 숙주 반응을 비롯한 다양한 질병, 및 또한 만성 유형의 염증, 예를 들어 신장 사구체 질병, 예를 들어 사구체신염 및 신부전의 다른 존재, 류마티스성 관절염 및 유사한 자가면역 질병, 예를 들어 베크테레프병, 루푸스형 질병, 염증성 장 질병, 크론병, 종양 성장 또는 고형 기관 암을 비롯한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 (a) 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분; 또는 (b) 상기 두 번째 태양에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
다섯 번째 태양에서, 본 발명은 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 허혈/재관류 관련된 손상, 예를 들어 허혈성 심장 질병, 급성 폐 손상, 폐렴, 이식 환자의 급성 및 만성 이식편 거부, 이식편 대 숙주 반응, 신장 사구체 질병, 예를 들어 사구체신염 및 신부전의 다른 존재, 류마티스성 관절염 및 유사한 자가면역 질병, 예를 들어 베크테레프병, 루푸스형 질병, 염증성 장 질병, 크론병, 종양 성장 또는 고형 기관 암의 치료가 필요한 환자에 있어서 상기 질병의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 (a) 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분; 또는 (b) 상기 두 번째 태양에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함을 포함한다.
본 발명의 상기 요약은 본 발명의 모든 특징들을 반드시 개시하는 것은 아니다.
도 1은 혈액 세포로부터 효소 방출에 대한 C5a 돌연변이체의 효과를 도시한다.
도 2는 C5a 돌연변이체에 대한 INab308의 결합 능력을 도시한다.
도 3은 C5a 돌연변이체에 대한 INab708의 결합 능력을 도시한다.
도 4는 INab308 및 INab708이 인간 혈장 CH50 활성에 영향을 미치지 않음을 도시한다.
도 5는 C5a 생물 활성에 대한 INab308, INab708 및 L2B23의 차단 효과의 비교를 도시한다.
도 6은 인간 전혈에서 에스케리키아 콜라이-유발된 IL-8 생산에 대한 INab308 및 INab708의 억제 효과를 도시한다.
정의
본 발명을 하기에 상세히 개시하기 전에, 본 발명이, 다양할 수 있는 본 발명에 개시된 특정 방법, 프로토콜 및 시약들로 제한되지 않음은 물론이다. 또한 본 발명에 사용된 용어가 단지 특정 실시태양을 개시하기 위한 것이며 오직 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님은 물론이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술, 과학 용어들은 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 용어들을 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 개시된 바와 같이 정의한다.
본 명세서 및 하기 청구의 범위 전체를 통해, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"란 낱말, 및 "포함하는"과 같은 어미 변화는 서술된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 제외를 의미하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 명세서의 본문 전체를 통해 여러 문헌이 인용된다. 본 발명에 인용된 문헌들(모든 특허, 특허 출원, 과학 발행물, 제조사의 명세서, 설명서, 진뱅크(GenBank) 수납 번호 서열 기탁 등을 포함하여)은 각각, 상기의 것이든 하기의 것이든, 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 본 발명의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기와 같은 명세를 추정할 권리가 있음을 승인하는 것으로서 해석되지 않는다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "인간 C5a"는 하기 74 개 아미노산 펩타이드를 지칭한다:
TLQKKIEEIA AKYKHSVVKK CCYDGACVNN DETCEQRAAR ISLGPRCIKA FTECCVVASQ LRANISHKDM QLGR(서열번호 1).
본 발명에 사용된 바와 같이, "결합 부분"이란 용어는 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 본 출원과 관련하여 바람직한 결합 부분은 (a) 항체 또는 그의 항원-결합 단편; (b) 올리고뉴클레오타이드; (c) 항체형 단백질; 또는 (d) 펩타이드 유사물질이다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 "결합 부분"은 2 개의 아미노산 서열 X1X2ETCEX3RX4(서열번호 18) 및 X5X6KX7X8X9L(서열번호 19)에 의해 형성되는 포유동물 C5a의 구조적 에피토프에 결합할 수 있으며, 여기에서 X1은 N, H, D, F, K, Y 및 T로 이루어진 군 중에서 선택되고; X2는 D, L, Y 및 H로 이루어진 군 중에서 선택되고; X3은 Q, E 및 K로 이루어진 군 중에서 선택되고; X4는 A, V 및 L로 이루어진 군 중에서 선택되고; X5는 S, H, P 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X6은 H 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X7은 D, N, H, P 및 G로 이루어진 군 중에서 선택되고; X8은 M, L, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택되고; X9는 Q, L 및 I로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본 발명의 실시에 특히 적합한 "결합 부분"은 2 개의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성되는 인간 C5a의 구조적 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 제 1 화합물(예를 들어, 항체)이 제 2 화합물에 대해 1 mM 이하, 바람직하게는 100 μM 이하, 바람직하게는 50 μM 이하, 바람직하게는 30 μM 이하, 바람직하게는 20 μM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 바람직하게는 5 μM 이하, 보다 바람직하게는 1 μM 이하, 보다 바람직하게는 900 nM 이하, 보다 바람직하게는 800 nM 이하, 보다 바람직하게는 700 nM 이하, 보다 바람직하게는 600 nM 이하, 보다 바람직하게는 500 nM 이하, 보다 바람직하게는 400 nM 이하, 보다 바람직하게는 300 nM 이하, 보다 바람직하게는 200 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 100 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 90 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 80 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 70 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 60 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 50 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 40 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 30 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 20 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 10 nM 이하의 해리 상수 Kd를 갖는 경우, 상기 제 1 화합물을 상기 제 2 화합물(예를 들어, 항원, 예를 들어 표적 단백질)에 "결합"하는 것으로 간주한다.
본 발명에 따른 "결합"이란 용어는 바람직하게는 특이적인 결합에 관한 것이다. "특이적인 결합"은 결합 부분(예를 들어, 항체)이 표적, 예를 들어 에피토프(상기에 대한 결합이 또 다른 표적에 대한 결합에 비해 특이적이다)에 더 강하게 결합함을 의미한다. 결합 부분은 상기 부분이 제 2 표적에 대한 해리 상수보다 더 낮은 해리 상수(Kd)로 제 1 표적에 결합하는 경우 상기 제 2 표적에 비해 상기 제 1 표적에 더 강하게 결합한다. 바람직하게는 상기 결합 부분이 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수(Kd)는 상기 결합 부분이 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수(Kd)보다 10 배 더, 바람직하게는 20 배 더, 보다 바람직하게는 50 배 더, 훨씬 더 바람직하게는 100 배, 200 배, 500 배 또는 1000 배 더 낮다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "Kd"("mol/L"로 측정되고, 때때로 "M"으로서 약기함)란 용어는 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 그의 단편)과 표적 분자(예를 들어, 항원 또는 그의 에피토프) 간의 특정 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하고자 한다.
"에피토프"(또한 항원 결정인자로서 공지됨)는 면역계에 의해, 구체적으로 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 거대분자의 부분이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "에피토프"는 본 발명에 개시된 바와 같이 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)에 결합할 수 있는 거대 분자의 부분이다. 이와 관련하여, "결합"이란 용어는 바람직하게는 특이적인 결합에 관한 것이다. 에피토프는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 무리들로 이루어지며 대개는 특정한 3 차원 구조 특성뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 구조적 및 비-구조적 에피토프는, 비-구조적 에피토프에 대한 결합은 아니고 구조적 에피토프에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 상실된다는 점에서 구별된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "구조적 에피토프"는 선형 거대분자(예를 들어, 폴리펩타이드)의 3 차원 구조에 의해 형성되는 상기 거대 분자의 에피토프를 지칭한다. 본 출원과 관련하여, "구조적 에피토프"는 "불연속적인 에피토프", 즉 거대분자의 1차 서열(예를 들어, 폴리펩타이드의 아미노산 서열) 중의 2 개 이상의 별도의 영역들로부터 형성되는 상기 거대분자(예를 들어, 폴리펩타이드) 상의 구조적 에피토프이다. 즉, 에피토프는 본 발명과 관련하여, 상기 에피토프가, 본 발명의 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)이 동시에 결합하는 상기 1차 서열 중의 2 개 이상의 별도의 영역들로 이루어지는 경우, "구조적 에피토프"인 것으로 간주되며, 여기에서 이들 2 개 이상의 별도의 영역들은 본 발명의 결합 부분이 결합하지 않는 상기 1차 서열 중의 하나 이상의 영역들에 의해 중단된다. 바람직하게는, 상기와 같은 "구조적 에피토프"는 폴리펩타이드 상에 존재하며, 상기 1차 서열 중의 2 개의 별도의 영역들은 본 발명의 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)이 결합하는 2 개의 별도의 아미노산 서열이고, 이들 2 개 이상의 별도의 아미노산 서열들은 본 발명의 결합 부분이 결합하지 않는 상기 1차 서열 중의 하나 이상의 아미노산 서열에 의해 중단된다. 바람직하게는, 상기 중단시키는 아미노산 서열은 상기 결합 부분이 결합하지 않는 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 연속된 아미노산 서열이다. 본 발명의 결합 부분이 결합하는 상기 2 개 이상의 별도의 아미노산 서열은 그들의 길이에 관하여 특별히 제한되지 않는다. 상기와 같은 별도의 아미노산 서열은 상기 2 개 이상의 별도의 아미노산 서열 내 아미노산의 총 수가 상기 결합 부분과 상기 구조적 에피토프 간의 특이적인 결합을 성취할 정도로 충분히 큰 한은 단지 하나의 아미노산으로 이루어질 수도 있다.
"파라토프"는 상기 에피토프를 인식하는 항체의 부분이다. 본 발명과 관련하여, "파라토프"는 상기 에피토프를 인식하는 본 발명에 개시된 바와 같은 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 부분이다.
"항체"란 용어는 전형적으로 다이설파이드 결합에 의해 상호 연결되는 적어도 2 개의 중쇄(H) 및 2 개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원-결합 부분을 지칭한다. "항체"란 용어는 또한 항체들, 특히 본 발명에 개시된 항체들, 예를 들어 원핵생물에서 발현된 항체, 글리코실화되지 않은 항체, 및 하기 개시하는 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체의 모든 재조합 형태들을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 발명에서 VH 또는 VH로서 약기함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL 또는 VL로서 약기함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역을, 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존된 영역들이 삽입된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 고가변성 영역들로 추가로 세분할 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성되며 하기의 순서로 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 단편"(또는 간단히 "결합 부분")이란 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 작용은 완전 길이 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어 내에 포함된 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 결합된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수도 있는 2 개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 더욱 또한, 상기 Fv 단편의 2 개의 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들 도메인을, 재조합 방법을 사용하여, 상기 VL 및 VH 영역이 짝을 지어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 예를 들어 문헌[Bird et al. (1988) Science 242: 423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결할 수 있다. 상기와 같은 단일 쇄 항체를 또한 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어 내에 포함시키고자 한다. 추가의 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합된 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 상기 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) 상기 CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 상기 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 상기 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득하며, 상기 단편을 완전한 항체인 것과 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별한다. "항원-결합 단편"의 추가의 예는 소위 미세항체이며, 이는 단일 CDR로부터 유래한다. 예를 들어, 문헌[Heap et al., 2005]은 HIV-1의 gp120 외막 당단백질에 대한 항체의 중쇄 CDR3으로부터 유래한 17 아미노산 잔기 미세항체를 개시한다. 다른 예는 바람직하게는 동족(cognate) 프레임워크 영역에 의해 서로 융합되는 2 개 이상의 CDR 영역을 포함하는 작은 항체 유사물질을 포함한다. 상기 동족 VH FR2에 의해 결합된 VH CDR1 및 VL CDR3을 포함하는 상기와 같은 작은 항체 유사물질이 문헌[Qiu et al., 2007]에 개시되었다.
따라서, 본 발명에 사용된 바와 같이, "항체 또는 그의 항원-결합 단편"이란 용어는 면역글로불린 분자, 및 면역 글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 또한, 예를 들어 표적 분자 또는 표적 에피토프에, 예를 들어 아미노산 서열 X1X2ETCEX3RX4(서열번호 18) 및 X5X6KX7X8X9L(서열번호 19)(여기에서 X1은 N, H, D, F, K, Y 및 T로 이루어진 군 중에서 선택되고; X2는 D, L, Y 및 H로 이루어진 군 중에서 선택되고; X3은 Q, E 및 K로 이루어진 군 중에서 선택되고; X4는 A, V 및 L로 이루어진 군 중에서 선택되고; X5는 S, H, P 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X6은 H 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X7은 D, N, H, P 및 G로 이루어진 군 중에서 선택되고; X8은 M, L, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택되고; X9는 Q, L 및 I로 이루어진 군 중에서 선택된다)에 의해 형성된 C5a의 구조적 에피토프에; 또는 서열번호 2 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 인간 C5a의 구조적 에피토프; 또는 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 KDM에 의해 형성된 인간 C5a의 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 파지 디스플레이를 포함하는 기법을 통해 선택된 면역글로불린 유사 단백질이 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, 바람직하게는 IgG2a 및 IgG2b, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 아류의 면역글로불린 분자일 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 항체 및 그의 항원-결합 단편은 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원으로부터의 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 단편은 인간, 챔팬지, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 기니 피그, 또는 토끼), 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 기원의 것이다. 상기 항체가 인간 또는 쥐 기원의 것인 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 항체는 또한 하나의 종, 바람직하게는 인간으로부터 유래한 항체 불변 영역이 또 다른 종, 예를 들어 마우스로부터 유래한 항원 결합 부위와 결합된 키메릭 분자를 포함한다. 더욱이 본 발명의 항체는 비-인간 종으로부터(예를 들어, 마우스로부터)의 항체의 항원 결합 부위가 인간 기원의 불변 및 프레임워크 영역과 결합된 인간화된 분자를 포함한다.
본 발명에 예시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 상기 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득되거나, 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포, 또는 림프구 세포)에서 클로닝되고 재조합 발현될 수 있다. 숙주 세포의 추가의 예는 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 및 진균, 예를 들어 효모이다. 한편으로, 상기 숙주 세포를 유전자이식 비-인간 동물 또는 식물에서 재조합에 의해 생산할 수 있다.
"키메릭 항체"란 용어는 중쇄 및 경쇄의 각 아미노산 서열의 일부가 특정 종으로부터 유래하거나 특정 부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 일치하는 반면 상기 쇄의 나머지 구획은 또 다른 종 또는 부류 중의 상응하는 서열과 일치하는 항체들을 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 포유동물의 한 종으로부터 유래한 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 또 다른 것으로부터 유래한 항체의 서열과 일치한다. 상기와 같은 키메릭 형태에 대한 한 가지 분명한 이점은 상기 가변 영역을 편의상, 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래한 불변 영역과 함께 비-인간 숙주 유기체로부터 쉽게 입수할 수 있는 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 유도할 수 있다는 것이다. 상기 가변 영역은 제조 용이성의 이점을 가지며 특이성이 상기 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 인간인 불변 영역은 상기 항체를 주입하는 경우 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역보다는 인간 피실험자로부터 면역반응을 덜 이끌어내는 듯하다. 그러나, 상기 정의는 이러한 특정 예로 제한되지 않는다.
"인간화된 항체"란 용어는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기에서 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 기본으로 한다. 상기 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나, 오직 상기 가변 도메인 중의 적합한 프레임워크 영역 상에 그래프트화된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수도 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수도 있고, 예를 들어 인간 면역글로불린에 더 가깝게 닮도록 변형될 수도 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어, 마우스 항체로부터 6 개의 CDR을 모두 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 형태들은 원래 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
항체 인간화에 대한 상이한 방법들이 문헌[Almagro & Fransson, 2008]에 의해 고찰된 바와 같이, 숙련가에게 공지되어 있으며, 상기 문헌은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 알마그로와 프랜슨(Almagro & Fransson)에 의한 상기 고찰 논문을 하기에 간략히 요약한다. 알마그로와 프랜슨은 이론적인 접근과 실험적인 접근을 구분한다. 이론적인 접근은 조작된(engineered) 항체의 몇몇 변이체를 생성시키고 이들의 결합 또는 임의의 다른 관심 성질을 평가함을 특징으로 한다. 상기 디자인된 변이체가 예상된 결과를 생성시키지 않는 경우, 새로운 주기의 디자인 및 결합 평가를 시작한다. 이론적인 접근은 CDR 그래프트화, 재수면화(Resurfacing), 초인간화, 및 인간 스트링 함량 최적화를 포함한다. 대조적으로, 실험적인 접근은 보강 기술 또는 고속 대량 선별을 사용하는 최상 클론의 선택 및 인간화된 변이체의 큰 라이브러리의 생성을 기본으로 한다. 따라서, 실험적인 접근법은 항체 변이체의 방대한 공간을 파헤칠 수 있는 신뢰성 있는 선택 및/또는 선별 시스템에 의존한다. 시험관 내 디스플레이 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이는 이러한 요건을 충족시키며 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 실험적인 접근법은 FR 라이브러리, 유도된 선택, 프레임워크-셔플링, 및 인간공학(Humaneering)를 포함한다.
CDR 그래프트화
CDR 그래프트화 프로토콜은 전형적으로 3 개의 의사결정 요점, 즉 (1) 공여 항체, 즉 그래프트화를 위한 표적의 특이성을 결정하는 영역의 한정, (2) FR 공여체로서 사용되는 인간 서열 공급원의 확인, 및 (3) 상기 특이성을 한정하는, 즉 상기 인간화된 항체의 친화성을 복원하거나 개선하기 위한 복귀 돌연변이에 대한 표적인 아미노산 위치를 결정하는 영역 밖의 잔기의 선택을 포함한다.
(1) 항체 특이성을 결정하는 영역
항원과 착체된 비-인간 항체의 실험적인 구조는 상기 항원과 접촉하는 잔기들 및 따라서 상기 항체 특이성의 결정을 담당하는 것들의 상세한 지도를 제공한다. 상기 구조 정보는 알라닌 스캐닝 돌연변이 및/또는 조합 돌연변이가 보충되어 상기 결합 에너지 또는 작용성 파라토프에 가장 기여하는 잔기들을 확인할 수 있다. 상기 작용성 파라토프는 접촉 시 상기 잔기의 부분집합이므로, 오직 상기 작용성 파라토프만을 그래프트화하면 상기 인간화된 생성물 중의 비-인간 잔기의 수를 줄일 수 있다. 그러나, 오직 드문 경우에 상기 항원-항체 복합체 및/또는 작용성 파라토프의 실험 구조를 인간화 프로토콜의 시작 시에 입수할 수 있다. 주어진 항체 특이성에 기여하는 잔기들에 대한 정확한 정의의 부재 하에서, CDR이 종종 상기 특이성을 한정하는 영역으로서 사용된다. 그래프트화를 위한 표적으로서 CDR 및 HV 고리의 조합을 또한 사용할 수 있다. 인간 FR 상에 그래프트화되는 잔기들의 수를 줄이기 위해서, SDR 그래프트화, 즉 특이성-결정 잔기(SDR)의 그래프트화가 개시되었다.
(2) 인간 FR의 공급원
전형적인 CDR 그래프트화 프로토콜의 두 번째 단계는 인간 FR 공여체를 확인하는 것이다. 초기 연구들은 비-인간 항체에 대한 상동성과 관계없이, 공지된 구조의 인간 항체의 FR을 사용하였다. 이러한 접근은 "고정된 FR 방법"으로서 공지되어 있다. 나중의 연구들은 상기 비-인간 항체와 최고의 상동성을 갖는 인간 서열들을 사용하였다. 이러한 접근을 "최적합"이라 칭하였다. "최적합" 전략이 보다 높은 친화성을 갖는 항체를 생성시키는 경향이 있지만, 인간화를 위해 FR을 선택하는 경우, 다른 매개변수들, 예를 들어 낮은 면역원성 및 생산 수율도 또한 고려되어야 한다. 따라서, "최적합"과 "고정된 FR"의 조합이 또한 가능하다. 예를 들어, 상기 VL 부분을 상기 고정된 FR 방법에 따라 인간화할 수 있고 상기 VH 부분을 상기 최적합 방법에 따라 인간화할 수 있으며, 이와 역도 가능하다.
인간 서열의 2 가지 공급원, 즉 성숙 서열 및 생식계열 서열을 사용하였다. 면역 반응의 산물인 성숙 서열은 무작위 과정에 의해 발생하는 체세포 돌연변이를 수반하며 종 선택 하에서는 수반하지 않아, 잠재적인 면역원 잔기를 생성시킨다. 따라서, 면역원 잔기를 피하기 위해서, 인간 생식계열 유전자가 FR 공여체의 공급원으로서 점점 더 많이 사용되었다. 인간 생식계열 FR의 뉴클레오타이드 서열들이 예를 들어 문헌[Dall'Acqua et al, 2005]의 부록 A 및 B에 개시되어 있다. 더욱 또한, 생식계열 유전자 기재 항체들은 성숙 항체에 비해 더 융통성이 있는 경향이 있다. 이러한 보다 높은 융통성은 FR로의 복귀 돌연변이가 보다 적거나 전혀 없는 다양한 CDR들을 보다 양호하게 수용하여 상기 인간화된 항체의 친화성을 복원시키는 것으로 생각된다.
(3) 친화성의 복원 또는 향상을 위한 복귀 돌연변이
통상적으로, 친화성은 비-인간 CDR과 인간 FR 간의 상반성의 결과로서 CDR 그래프트화 후에 감소한다. 따라서, 전형적인 CDR 그래프트화 프로토콜의 세 번째 단계는 친화성 상실을 복원하거나 방지하는 돌연변이들을 한정하는 것이다. 복귀 돌연변이는 상기 인간화된 항체의 구조 또는 모델을 기본으로 조심스럽게 디자인되고 실험적으로 시험되어야 한다. WAM이라 지칭되는 자동화된 항체 모델링에 대한 웹 사이트를 URL http://antibody.bath.ac.uk에서 찾을 수 있다. 단백질 구조 모델링을 위한 소프트웨어를 http://salilab.org/modeller/modeller.html(모델러(Modeller) 및 http://spdbv.vital-it.ch(스위스 피디비뷰어(Swiss PdbViewer)) 사이트에서 내려받을 수 있다.
재수면화(resurfacing)
재수면화는 CDR 그래프트화와 유사하며 상기 처음 2 개의 의사결정 요점을 공유한다. CDR 그래프트화와 상반되게, 재수면화는 상기 비-인간 항체의 노출되지 않은 잔기들을 유지한다. 상기 비-인간 항체 중 오직 표면 잔기들만이 인간 잔기로 바뀐다.
초인간화
CDR 그래프트화가 상기 비-인간 서열과 인간 서열 간의 FR 비교에 의존하는 반면, 초인간화는 FR 상동성이 관련 없도록 하는 CDR 비교를 기본으로 한다. 상기 접근법은 상기 비-인간 서열과 작용성 인간 생식계열 유전자 레퍼토리와의 비교를 포함한다. 이어서 쥐 서열과 동일하거나 가깝게 관련된 기본적인 구조를 암호화하는 유전자들을 선택한다. 이어서, 상기 비-인간 항체와 기본 구조를 공유하는 유전자 내에서, 상기 CDR 내에서 상동성이 가장 높은 것들을 FR 공여체로서 선택한다. 최종적으로, 상기 비-인간 CDR을 상기 FR 상에 그래프트화한다.
인간 스트링 함량 최적화
본 접근법은 인간 스트링 함량(HSC)이라 칭하는 항체 "인간성(humanness)"의 계량을 기본으로 한다. 간단히, 본 접근법은 마우스 서열을 인간 생식계열 유전자의 레퍼토리와 비교한다. 차이를 HSC로서 기록한다. 표적 서열을 전반적인 동일성 측정을 사용하기보다는 상기 서열의 HSC를 최대화하여 다수의 다양한 인간화된 변이체들을 생성시킴으로써 인간화한다.
프레임워크 라이브러리(약어: FR 라이브러리)
FR 라이브러리 접근법에서, 잔기 변이체들의 수집물을 FR 중의 특정 위치에 도입시킨 다음 상기 라이브러리를 가려내어 그래프트화된 CDR을 가장 잘 지지하는 FR을 선택한다. 따라서, 본 접근법은 CDR 그래프트화를 닮았지만, 상기 FR 중의 몇몇 복귀 돌연변이를 생성시키는 대신에, 전형적으로는 100 개 초과의 돌연변이 변이체의 조합적인 라이브러리를 작성한다.
유도된 선택
본 접근법은 특정 항원에 특이적인 주어진 비-인간 항체의 VH 또는 VL 도메인을 인간 VH 및 VL 라이브러리와 결합시킴을 포함한다. 후속적으로, 특정한 인간 V 도메인을 관심 항원에 대해 선택한다. 예를 들어, 우선 비-인간 VH를 인간 경쇄의 라이브러리와 결합시킴으로써 비-인간 항체를 인간화할 수 있다. 이어서 상기 라이브러리를 파지 디스플레이에 의해 표적 항원에 대해 선택하고 상기 선택된 VL을 인간 VH 쇄의 라이브러리 내로 클로닝하고 표적 항원에 대해 선택한다. 상기 비-인간 VL을 인간 중쇄의 라이브러리와 결합시켜 출발하는 것도 또한 가능하다. 이어서 상기 라이브러리를 파지 디스플레이에 의해 표적 항원에 대해 선택하고 상기 선택된 VH를 인간 VL 쇄의 라이브러리 내로 클로닝하고 표적 항원에 대해 선택한다. 그 결과, 상기 비-인간 항체와 유사한 친화성을 갖는 완전한 인간 항체를 단리할 수 있다. 에피토프 표류의 발생을 피하기 위해서, 모 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 클론을 선택할 수 있게 하는, 소위 억제 ELISA를 실행할 수 있다. 한편으로, CDR 유지를 적용하여 에피토프 표류를 피할 수 있다. CDR 유지에서, 하나 이상의 비-인간 CDR, 바람직하게는 중쇄 CDR3을 유지하는데, 그 이유는 상기 CDR이 항원 결합 부위의 중심에 있기 때문이다.
프레임워크 셔플링(약기: FR 셔플링)
FR 셔플링 접근법에서, 전체 FR을 비-인간 CDR과 결합시킨다. FR 셔플링을 사용하여, 달라쿠아(Dall'Acqua)와 동료는 쥐 항체를 인간화하였다. 상기 쥐 항체의 6 개 CDR을 모두 인간 생식계열 유전자 FR을 모두 함유하는 라이브러리 내로 클로닝하였다(문헌[Dall'Acqua et al., 2005]). 상기 라이브러리를 2-단계 선택 과정으로, 먼저 VL에 이어서 VH의 인간화에서 결합에 대해 선별하였다. 나중의 연구에서, 1-단계 FR 셔플링 과정이 성공적으로 사용되었다(문헌[Damschroder et al., 2007]). 공지된 모든 인간 생식계열 경쇄(κ) 프레임워크를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 서열이 문헌[Dall'Acqua et al., 2005]에 부록 A로서 개시되어 있다. 공지된 모든 인간 생식계열 중쇄 프레임워크를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 서열이 문헌[Dall'Acqua et al., 2005]에 부록 B로서 개시되어 있다.
인간공학(Humaneering)
인간공학은 인간 생식계열 유전자 항체에 대해 91 내지 96% 상동성인 항체의 단리를 허용한다. 상기 방법은 본질적인 최소 특이성 결정인자(MSD)의 실험적 확인 및 비-인간 단편의 인간 FR의 라이브러리 내로의 연속적인 교체 및 결합의 평가를 기본으로 한다. 상기 방법은 비-인간 VH 및 VL 쇄의 CDR3의 영역들로 시작하고 VH 및 VL 모두의 CDR1 및 CDR2를 포함하여, 인간 FR로 비-인간 항체의 다른 영역들을 점진적으로 대체한다.
상기 설명한 항체 인간화 방법은 본 발명에 개시된 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체의 생성 시에 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명을 상기 언급한 항체의 인간화 방법으로 제한하지 않는다.
상기 언급한 인간화 방법 중 일부, 즉 "고정된 FR 방법"(CDR-그래프트화의 변형), 초인간화, 프레임워크-셔플링, 및 인간공학을 공여 항체 중의 FR 서열에 대한 정보 없이 수행할 수 있다. 상기 "고정된 FR 방법"의 변형은 퀸 등(문헌[Qin et al., 2007]) 및 창 등(문헌[Chang et al., 2007])에 의해 성공적으로 수행되었다. 특히, 퀸 등은 3 개의 CDR 영역이 항원 펩타이드(쥐 항체의 CDR 서열로부터 유래하였다)에 의해 대체된 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 단편을 제작하였다. 창 등은 상기 실험을 계속하였으며 scFv 단편을 제작하였고, 상기 단편에서 VH 부분으로부터의 모든 CDR 및 VL 부분으로부터의 CDR3을 쥐 항체의 CDR 서열로부터 유래한 항원 펩타이드에 의해 대체하였다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이에 의해서 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해서 도입된 돌연변이)를 포함할 수도 있다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 쿠처라파티(Kucherlapati)와 자코보비츠(Jakobovits)의 미국 특허 제 5,939,598 호에 개시된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 유전자이식 동물로부터 단리되고 내생적인 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 단클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된 비-인간 동물, 예를 들어 마우스로부터 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "재조합 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생산되거나 단리된 모든 항체, 예를 들어 (a) 상기 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 유전자이식 또는 염색체 전환(transchromosomal) 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 예를 들어 형질주입종(transfectoma)으로부터 항체를 발현하도록 형질전환시킨 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 재조합형의 조합적인 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 면역글로불린 유전자 서열의 연접을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 단리된 항체를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "형질주입종"이란 용어는 항체를 발현하는 재조합 진핵생물 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함한 진균을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "이종 항체"는 상기와 같은 항체를 생산하는 유전자이식 유기체와 관련하여 정의된다. 상기 용어는 유전자이식 유기체로 이루어지지 않고 일반적으로 상기 유전자이식 유기체 이외의 종들로부터 유래한 유기체에서 발견되는 서열에 상응하는 아미노산 서열 또는 암호화 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "이종하이브리드 항체"는 상이한 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 쥐 경쇄와 회합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 이종하이브리드 항체이다.
따라서, 본 발명에 사용하기에 적합한 "항체 및 그의 항원-결합 단편"은 비 제한적으로 다클론, 단클론, 1가, 이중 특이성, 이종접합체, 다중특이성, 재조합, 이종, 이종하이브리드, 키메릭, 인간화된(특히 CDR-그래프트화된), 탈면역화된, 또는 인간 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, Fd, Fv, 다이설파이드-결합된 Fv(dsFv), 단일 쇄 항체(예를 들어, scFv), 다이아바디 또는 테트라바디(문헌[Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 6444-6448]), 나노바디(또한 단일 도메인 항체로서 공지됨), 항-유전형(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다.
본 발명에 개시된 항체는 바람직하게 단리된다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체(예를 들어, C5a에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 C5a 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다)를 지칭하고자 한다. 그러나, 인간 C5a의 에피토프, 동형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 관련 항원, 예를 들어 다른 종들로부터의 항원(예를 들어, C5a 종 동족체, 예를 들어 래트 C5a)에 대해 교차 반응성을 갖는다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, "단리된" 단클론 항체들의 조합은 상이한 특이성을 갖고 잘 한정된 조성으로 결합된 항체에 관한 것이다.
사물에 적용되는 바와 같이, 본 발명에 사용된 바와 같은 "천연"이란 용어는 사물이 자연에서 발견될 수 있다는 사실에 관한 것이다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함) 중에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 천연이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "핵산 앱타머"란 용어는 반복되는 라운드의 시험관 내 선택 또는 SELEX(급격한 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화)를 통해 표적 분자에 결합하도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다(고찰을 위해서 문헌[Brody E.N. and Gold L. (2000), Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 74(1):5-13] 참조). 상기 핵산 앱타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수도 있다. 상기 앱타머는 변형, 예를 들어 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 2'-불소-치환된 피리미딘을 함유할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "항체형 단백질"이란 용어는 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 조작된(예를 들어, 고리의 돌연변이에 의해) 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 상기와 같은 항체형 단백질은 양쪽 단부에서 단백질 골격에 부착된 하나 이상의 가변 펩타이드 고리를 포함한다. 이러한 이중적인 구조상 구속은 상기 항체형 단백질의 결합 친화성을 항체의 친화성에 필적할만한 수준으로 크게 증가시킨다. 상기 가변 펩타이드 고리의 길이는 전형적으로 10 내지 20 개 아미노산으로 이루어진다. 상기 골격 단백질은 양호한 용해도 성질을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 골격 단백질은 작은 구형 단백질이다. 항체형 단백질은 비 제한적으로 애피바디, 안티칼린, 및 디자인된 안키린 반복 단백질을 포함한다(고찰을 위해 문헌[Binz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10):1257-1268] 참조). 항체형 단백질은 돌연변이체의 큰 라이브러리로부터 유래될 수 있고, 예를 들어 큰 파지 디스플레이 라이브러리로부터 채취될 수 있으며 통상적인 항체와 유사하게 단리될 수 있다. 또한, 항체형 결합 단백질을 구형 단백질 중의 표면-노출된 잔기의 조합적인 돌연변이에 의해 수득할 수 있다. 항체형 단백질을 때때로 "펩타이드 앱타머"라 칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "펩타이드 유사물질"은 펩타이드를 모방하도록 디자인된 작은 단백질형 쇄이다. 펩타이드 유사물질은 전형적으로 분자의 성질을 변경시키기 위해 기존 펩타이드의 변형으로부터 발생한다. 예를 들어, 상기 물질은 분자의 안정성 또는 생물 활성의 변화를 위한 변형으로부터 발생할 수도 있다. 상기 물질은 기존의 펩타이드로부터 약물형 화합물의 개발에 한 역할을 할 수 있다. 이러한 변형은 자연에서는 발생하지 않을 펩타이드에 대한 변화(예를 들어, 비천연 아미노산의 변경된 주쇄 및 통합)를 수반한다.
"보존 치환"은 예를 들어 관련된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친성 성질의 유사성을 근거로 수행될 수 있다. 아미노산을 하기 6 개의 표준 아미노산 그룹으로 분류할 수 있다:
(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중간 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본 발명에 사용된 바와 같이, "보존 치환"은 상기 나타낸 6 개 표준 아미노산 그룹의 동일 그룹 내에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다. 예를 들어, Glu에 의한 Asp의 교환은 그렇게 변형된 폴리펩타이드 중에 하나의 음의 전하를 유지한다. 또한, 글리신 및 프롤린을 α-나선을 붕괴시키는 그들의 능력을 근거로 서로 치환시킬 수도 있다. 상기 6 개 그룹 내에서 일부 바람직한 보존 치환은 하기 하위 그룹들 내의 교환이다: (i) Ala, Val, Leu 및 Ile; (ii) Ser 및 Thr; (ii) Asn 및 Gln; (iv) Lys 및 Arg; 및 (v) Tyr 및 Phe. 공지된 유전자 암호, 및 재조합 및 합성 DNA 기법이 제공되는 경우, 숙련된 과학자는 상기 보존적인 아미노산 변이체를 암호화하는 DNA를 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "비-보존 치환" 또는 "비-보존 아미노산 교환"은 상기 나타낸 6 개 표준 아미노산 그룹 (1) 내지 (6)의 상이한 그룹에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "생물 활성"은 폴리펩타이드가 나타낼 수 있는 임의의 활성, 예를 들어 비 제한적으로 효소 활성; 또 다른 화합물에 대한 결합 활성(예를 들어, 또 다른 폴리펩타이드에의 결합, 특히 수용체에의 결합, 또는 핵산에의 결합); 억제 활성(예를 들어, 효소 억제 활성); 활성화 활성(예를 들어, 효소-활성화 활성); 또는 독성 효과를 지칭한다. 폴리펩타이드의 변이체 및 유도체에 관하여, 상기 변이체 또는 유도체는 모 폴리펩타이드와 동일한 정도로 상기와 같은 활성을 나타낼 필요는 없다. 변이체는 모 폴리펩타이드의 활성의 10% 이상 정도로 관련된 활성을 나타내는 경우, 본 출원과 관련하여 변이체로서 간주된다. 마찬가지로, 유도체는 모 폴리펩타이드의 활성의 10% 이상 정도로 관련된 생물 활성을 나타내는 경우, 본 출원과 관련하여 유도체로서 간주된다. 본 발명과 관련하여 적합한 "생물 활성"은 아미노산 서열 X1X2ETCEX3RX4(서열번호 18) 및 X5X6KX7X8X9L(서열번호 19)(여기에서 X1은 N, H, D, F, K, Y 및 T로 이루어진 군 중에서 선택되고; X2는 D, L, Y 및 H로 이루어진 군 중에서 선택되고; X3은 Q, E 및 K로 이루어진 군 중에서 선택되고; X4는 A, V 및 L로 이루어진 군 중에서 선택되고; X5는 S, H, P 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X6은 H 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X7은 D, N, H, P 및 G로 이루어진 군 중에서 선택되고; X8은 M, L, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택되고; X9는 Q, L 및 I로 이루어진 군 중에서 선택된다)에 의해 형성되는 C5a의 구조적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 본 발명과 관련하여 특히 적합한 "생물 활성"은 서열번호 2 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 인간 C5a의 구조적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 바람직하게는, 본 발명과 관련하여 적합한 "생물 활성"은 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 KDM에 의해 형성된 인간 C5a의 구조적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 결합 활성을 측정하기 위한 분석은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지되어 있으며 실시예 섹션에 개시된 것과 같은 ELISA를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "환자"는 본 발명에 개시된 표적-결합 부분에 의한 치료가 이로울 수 있는 임의의 포유동물 또는 조류를 의미한다. 바람직하게는 "환자"는 실험용 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트), 가축(예를 들어, 기니 피그, 토끼, 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개를 포함한다), 및 침팬지 및 인간을 포함한 영장류로 이루어진 군 중에서 선택된다. 상기 "환자"는 인간이 특히 바람직하다.
미국 흉부외과의 협회 및 중환자 의학회(문헌[Bone R.C. et al. (1992). "Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine". Chest 101 (6): 1644-55])에 따르면, 상이한 수준의 패혈증이 존재한다:
전신 염증 반응 증후군(SIRS):
하기의 소견들 중 2 개 이상의 존재에 의해 정의된다:
- 체온 < 36 ℃(97 ℉) 또는 > 38 ℃(100 ℉)(저체온증 또는 발열).
- 심박수 > 100 박동수/분(빈맥).
- 분당 호흡수 > 20, 또는 혈액 기체 상에서 32 mmHg(4.3 kPa) 미만의 Pa CO2(과호흡으로 인한 빈 호흡 또는 저탄소증).
- 백혈구 수 < 4,000 세포/㎣ 또는 > 12,000 세포/㎣(< 4 x 109 또는 > 12 x 109 세포/L), 또는 10% 초과의 밴드 형성(미성숙한 백혈구). (백혈구 감소증, 백혈구 증가증, 또는 미성숙 백혈구 증가증).
패혈증:
확인된 감염 과정에 반응하는 SIRS로서 정의된다. 감염은 (배양, 염색, 또는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해) 의심 또는 입증되거나, 감염에 대해 병리특징적인 임상 증후군일 수 있다. 감염에 대한 구체적인 증거는 통상적인 멸균 유체(예를 들어, 뇨 또는 뇌척수액(CSF)) 중의 WBC, 장관 천공의 증거(복부 x-선 또는 CT 스캔 상의 유리 기체, 급성 복막염의 징후), 폐렴(국소 혼탁화가 있음)과 일치하는 비정상적인 가슴 x-선(CXR), 또는 점상 출혈, 자반, 또는 전격자반을 포함한다.
중증 패혈증:
기관 기능부전, 관류저하, 또는 저혈압이 있는 패혈증으로서 정의된다.
패혈성 쇼크:
적절한 수액 소생에도 불구하고 무반응성 동맥 저혈압 또는 관류저하 이상이 있는 패혈증으로서 정의된다. 전신 관류저하의 징후는 말단-기관 기능부전이거나 4 mmol/㎗ 초과의 혈청 락테이트일 수 있다. 다른 징후는 소변 감소증 및 일변한 정신상태를 포함한다. 환자를 이들이 적극적인 수액 소생(전형적으로 6 리터 또는 40 ㎖/결정질 ㎏ 이상) 후에 패혈증 + 저혈압이 있는 경우 패혈성 쇼크가 있는 것으로 정의한다.
"종양"은 빠르고, 통제되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장 멈춤을 개시시킨 자극 후에도 계속해서 성장하는 세포 또는 조직의 이상 그룹을 의미한다. 종양은 정상 조직과의 구조적인 구성 및 작용 협조의 부분적인 또는 완전한 결여를 보이며, 대개는 양성이거나 악성일 수 있는 별개의 조직 덩어리를 형성한다.
"전이"는 암세포의 그의 원래 부위로부터 또 다른 신체 부분으로의 확산을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발 종양으로부터 악성 세포의 이탈, 세포 외 기질의 침입, 내피 기저 막의 침투로 체강 및 혈관으로 들어가고 이어서 혈액에 의해 운반된 후에 표적 기관에 침입함에 따른다. 최종적으로, 표적 부위에서 새로운 종양의 성장은 혈관신생에 좌우된다. 종양 전이는 종종 종양 세포 또는 성분이 남아 있어 전이 가능성을 나타낼 수도 있기 때문에 원발 종양의 제거 후에조차도 발생한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 "전이"란 용어는 상기 원발 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어져 있는 전이에 관한 "원격 전이"에 관한 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 질병 또는 질환을 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 하기 중 하나 이상을 수행함을 의미한다: (a) 상기 질환의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시킴; (b) 치료되는 질환(들)의 증상 특징의 발생을 제한하거나 예방함; (c) 치료되는 질환(들)의 증상 특징의 악화를 억제함; (d) 앞서 질환(들)이 있었던 환자에게서 상기 질환(들)의 재발을 제한하거나 예방함; 및 (e) 앞서 질환(들)의 증상을 나타낸 환자에게서 증상의 재발을 제한하거나 예방함.
본 발명에 사용된 바와 같이, 질병 또는 질환을 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 피실험자에게서 질환이 발생하는 것을 방지함을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "투여"는 생체 내 투여뿐만 아니라 생체 외에서 조직에 직접적인 투여, 예를 들어 정맥 이식을 포함한다.
"유효량"은 의도하는 목적을 성취하기에 충분한 치료제의 양이다. 주어진 치료제의 유효량은 상기 치료제의 성질, 투여 경로, 상기 치료제를 수용하는 동물의 크기 및 종, 및 상기 투여의 목적과 같은 인자에 따라 다양할 것이다. 각각의 개별적인 경우에 유효량은 당해 분야에 확립된 방법에 따라 숙련가에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"은 동물, 및 보다 특히는 인간에의 사용에 대해 연방 또는 주 정부 규제 당국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 승인된 약전에 나열됨을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "담체"란 용어는 상기 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 상기와 같은 약학 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 광물성 오일, 참깨 오일 등 중의 염수 용액일 수 있다. 염수 용액은 상기 약학 조성물을 정맥 내로 투여하는 경우 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 또한, 특히 주사용 용액에 대한 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카젤, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 경우에 따라, 상기 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물을, 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트라이글리세라이드와 함께 좌약으로서 제형화할 수 있다. 본 발명의 화합물을 중성 또는 염 형태로서 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 유리 아미노 기, 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유도된 기와 형성된 것들, 및 유리 카복실 기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 기와 형성된 것들을 포함한다. 적합한 약학 담체의 예들이 문헌[E.W. Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 개시되어 있다. 상기와 같은 조성물은 환자에게 적합한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해서 치료 유효량의 화합물을, 바람직하게는 정제된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
분자 생물학, 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기법 분야에 일반적으로 공지되고 실행된 방법들은 하기 계속해서 경신되는 발행물들에 충분히 개시되어 있다: 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al., Cold Spring Harbor]; [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons]; [Current Protocols in Protein Science, J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons]; [Current Protocols in Cell Biology, J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons] 및 [Current Protocols in Immunology, J. E. Colligan et al., Eds., Wiley & Sons]. 세포 배양 및 배지에 관한 공지된 기법들은 문헌["Large Scale Mammalian Cell Culture, Hu et al., Curr. Opin., Biotechnol. 8: 148, 1997]; ["Serum free Media", K. Kitano, Biotechnol. 17:73, 1991]; 및 ["Suspension Culture of Mammalian Cells", Birch et al. Bioprocess Technol. 19: 251, 1990]에 개시되어 있다.
발명의 실시태양
이제 본 발명을 추가로 개시할 것이다. 하기의 단락에서 본 발명의 상이한 태양들을 보다 상세히 정의한다. 그렇게 정의된 각각의 태양을 달리 명백히 나타내지 않는 한 임의의 다른 태양 또는 태양들과 연합할 수도 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로서 나타낸 임의의 특징을 바람직하거나 유리한 것으로서 나타낸 임의의 다른 특징 또는 특징들과 연합할 수도 있다.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 C5a의 아미노산 서열 X1X2ETCEX3RX4(서열번호 18) 및 X5X6KX7X8X9L(서열번호 19)에 의해 형성된 구조적 에피토프에 결합하는 결합 부분에 관한 것이며, 여기에서 X1은 N, H, D, F, K, Y 및 T로 이루어진 군 중에서 선택되고; X2는 D, L, Y 및 H로 이루어진 군 중에서 선택되고; X3은 Q, E 및 K로 이루어진 군 중에서 선택되고; X4는 A, V 및 L로 이루어진 군 중에서 선택되고; X5는 S, H, P 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X6은 H 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X7은 D, N, H, P 및 G로 이루어진 군 중에서 선택되고; X8은 M, L, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택되고; X9는 Q, L 및 I로 이루어진 군 중에서 선택된다. 즉, 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분은 서열번호 18에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 및 서열번호 19에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합한다.
서열번호 18은 인간 C5a의 아미노산 30 내지 38을 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes), 마카카 뮬라타(Macaca mulatta), 수스 스크로파(Sus scrofa), 에쿠우스 카발루스(Equus caballus), 보스 타우루스(Bos Taurus), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 카니스 루푸스(Canis lupus), 및 모노델피스 도메스티카(Monodelphis domestica) 중의 상응하는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정된 공통 서열이다. 서열번호 19는 인간 C5a의 아미노산 66 내지 72를 판 트로글로다이테스, 마카카 뮬라타, 수스 스크로파, 에쿠우스 카발루스, 보스 타우루스, 무스 무스쿨루스, 라투스 노르베기쿠스, 카니스 루푸스, 및 모노델피스 도메스티카 중의 상응하는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정된 공통 서열이다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 아미노산 서열 X2ETCEX3R(서열번호 20)의 하나 이상의 아미노산에 결합하며, 여기에서 X2 및 X3은 상기와 같이 정의된다. 서열번호 20은 서열번호 18에 따른 공통 서열의 보다 짧은 버전이고 인간 C5a의 아미노산 31 내지 37에 상응한다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 아미노산 서열 X6KX7X8X9(서열번호 21), 바람직하게는 KX7X8의 하나 이상의 아미노산에 결합하며, 여기에서 X6, X7, X8 및 X9는 상기와 같이 정의된다. 서열번호 21은 서열번호 19에 따른 공통 서열의 보다 짧은 버전이고 인간 C5a의 아미노산 67 내지 71에 상응한다. KX7X8은 서열번호 21에 따른 공통 서열의 보다 짧은 버전이고 인간 C5a의 아미노산 68 내지 70에 상응한다.
특히 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 아미노산 서열 X2ETCEX3R(서열번호 20) 내의 하나 이상의 아미노산 및 아미노산 서열 KX7X8 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합하며, 여기에서 X2, X3, X7 및 X8은 상기와 같이 정의된다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 구조적 에피토프는 (a) C5a의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)(호모 사피엔스(Homo sapiens) 및 판 트로글로다이테스로부터의 서열); (b) C5a의 아미노산 서열 HDETCEQRA(서열번호 22) 및 SHKDLQL(서열번호 23)(마카카 뮬라타로부터의 서열); (c) C5a의 아미노산 서열 DDETCEERA(서열번호 24) 및 SHKNIQL(서열번호 25)(수스 스크로파로부터의 서열); (d) C5a의 아미노산 서열 DLETCEQRA(서열번호 26) 및 SHKHIQL(서열번호 27)(에쿠우스 카발루스로부터의 서열); (e) C5a의 아미노산 서열 DDETCEQRA(서열번호 28) 및 HHKNMQL(서열번호 29)(보스 타우루스로부터의 서열); (f) C5a의 아미노산 서열 FYETCEERV(서열번호 30) 및 PHKPVQL(서열번호 31)(무스 무스쿨루스로부터의 서열); (g) C5a의 아미노산 서열 KYETCEQRV(서열번호 32) 및 HHKGMLL(서열번호 33)(라투스 노르베기쿠스로부터의 서열); (h) C5a의 아미노산 서열 YDETCEQRA(서열번호 34) 및 SNKPLQL(서열번호 35)(카니스 루푸스로부터의 서열); 또는 (i) C5a의 아미노산 서열 THETCEKRL(서열번호 36) 및 NHKPVIL(서열번호 37)(모노델피스 도메스티카로부터의 서열)에 의해 형성된다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 (a) DETCEQR(서열번호 4); (b) DETCEER(서열번호 38); (c) LETCEQR(서열번호 39); (e) YETCEER(서열번호 40); (f) YETCEQR(서열번호 41); 및 (g) HETCEKR(서열번호 42)로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 결합한다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 (a) HKDMQ(서열번호 5), 바람직하게는 KDM; (b) HKDLQ(서열번호 43), 바람직하게는 KDL; (c) HKNIQ(서열번호 44), 바람직하게는 KNI; (d) HKHIQ(서열번호 45), 바람직하게는 KHI; (e) HKNMQ(서열번호 46), 바람직하게는 KNM; (f) HKPVQ(서열번호 47), 바람직하게는 KPV; (g) HKGML(서열번호 48), 바람직하게는 KGM; (h) NKPLQ(서열번호 49), 바람직하게는 KPL; 및 (i) HKPVI(서열번호 50), 바람직하게는 KPV로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 결합한다.
상기 첫 번째 태양의 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 C5a는 인간 C5a이다. 따라서, 상기 결합 부분은 인간 C5a의 아미노산 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 구조적 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에 따른 결합 부분은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합한다. 서열번호 2는 인간 C5a의 아미노산 30 내지 38에 상응한다. 서열번호 3은 인간 C5a의 아미노산 66 내지 72에 상응한다. 상기 인간 C5a의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타낸다. 상기 첫 번째 태양의 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 아미노산 DETCEQR(서열번호 4) 중 하나 이상에 결합한다. 서열번호 4는 인간 C5a의 아미노산 31 내지 37에 상응한다. 상기 첫 번째 태양의 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 아미노산 HKDMQ(서열번호 5) 중 하나 이상에 결합하고, 보다 바람직하게는 아미노산 KDM 중 하나 이상에 결합한다. 서열번호 5는 인간 C5a의 아미노산 67 내지 71에 상응하고; 서열 KDM은 인간 C5a의 아미노산 68 내지 70에 상응한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 내의 하나 이상의 아미노산 및 아미노산 서열 KDM 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합한다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 구조적 에피토프를 형성하는 2 개의 서열(예를 들어, 서열번호 18 및 19; 서열번호 2 및 3; 서열번호 22 및 23; 서열번호 24 및 25; 서열번호 26 및 27; 서열번호 28 및 29; 서열번호 30 및 31; 서열번호 32 및 33; 서열번호 34 및 35; 서열번호 36 및 37에 따른 서열 쌍)이 본 발명의 결합 부분에 대한 결합에 관여하지 않는 1 내지 50 개의 연속적인 아미노산들에 의해 분리된다. 하기에서, 본 발명의 결합 부분에 대한 결합에 관여하지 않는 상기와 같은 아미노산을 "비-결합 아미노산"이라 칭할 것이다. 상기 구조적 에피토프를 형성하는 2 개의 서열은 바람직하게는 6 내지 45 개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 12 내지 40 개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 18 내지 35 개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 24 내지 30 개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 25 내지 29 개의 연속적인 비-결합 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 26 내지 28 개의 연속적인 비-결합 아미노산, 및 가장 바람직하게는 27 개의 연속적인 비-결합 아미노산에 의해 분리된다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 대해 10 nM 이하, 바람직하게는 9 nM 이하, 보다 바람직하게는 8 nM 이하, 보다 바람직하게는 7 nM 이하, 보다 바람직하게는 6 nM 이하, 보다 바람직하게는 5 nM 이하, 보다 바람직하게는 4 nM 이하, 보다 바람직하게는 3 nM 이하, 보다 바람직하게는 2 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1 nM 이하의 Kd 값을 갖는 결합 상수를 갖는다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 하나의 결합 부분은 한 분자의 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 의해 유발된 생물학적 효과에 대해 75% 이상의 차단 활성, 바람직하게는 80% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 85% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 차단 활성을 나타낸다. 이들 바람직한 차단 활성은 상기 결합 부분이 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 대한 단일 파라토프 결합을 포함하는 실시태양들에 관한 것이다. 상기 결합 부분이 2 개 이상의 C5a-특이적인 파라토프를 포함하는 실시태양들에서, 하나의 결합-부분 분자가 상기 결합 부분 중에 존재하는 C5a-특이적인 파라토프의 수와 동등한 수의 C5a 분자와 접촉할 때 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상 등의 상기 차단 활성이 성취된다. 즉, 상기 첫 번째 태양의 결합 부분의 파라토프와 C5a가 동 몰 농도로 존재할 때, 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분은 C5a에 의해 유발된 생물학적 효과에 대해 75% 이상의 차단 활성, 바람직하게는 80% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 85% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 차단 활성을 나타낸다. 차단되는 바람직한 생물학적 효과는 인간 전혈 세포로부터 C5a-유발된 라이소자임 방출이다. 이러한 C5a-유발된 라이소자임 방출 및 그의 차단을 측정하기 위한 분석을 실시예 섹션에 개시한다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 인간 혈장에서 CH50 활성을 억제하지 않는다. CH50 활성의 측정을 위한 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며 하기 실시예 섹션에 개시되어 있다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 하나 이상의 C5b 유발된 생물학적 효과에 대해 차단 활성을 나타내지 않고, 바람직하게는 상기 결합 부분은 어떠한 C5b 유발된 생물학적 효과에 대해서도 차단 활성을 나타내지 않는다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 인간 전혈에서 에스케리키아 콜라이 유발된 IL-8 생산을 감소시킬 수 있다. 전혈 중 IL-8 생산의 측정을 위한 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며 하기 실시예 섹션에 개시되어 있다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 (a) 항체 또는 그의 항원-결합 단편; (b) 올리고뉴클레오타이드; (c) 항체형 단백질; 및 (d) 펩타이드 유사물질 중에서 선택된다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 1가 항체, 이중 특이성 항체, 이종접합체 항체, 다중 특이성 항체, 탈면역화된 항체, 키메릭 항체, 인간화된(특히 CDR-그래프트화된) 항체, 및 인간 항체로 이루어진 군 중에서 선택된다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 항체의 항원-결합 단편이며, 상기 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 다이설파이드 결합된 Fv(dsFv), 단일 도메인 항체(또한 나노바디로서 공지됨), 및 단일 쇄 Fv(scFv) 항체로 이루어진 군 중에서 선택된다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 부분은 (i) 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR3 서열; 또는 (ii) 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 여기에서 상기 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 단편은 (i) 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열; 또는 (ii) 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열을 추가로 포함하며; 여기에서 상기 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체 또는 단편은 하기의 서열들 중 하나 이상을 추가로 포함하며: (i) 서열번호 10에 따른 중쇄 CDR2 서열; (ii) 서열번호 11에 따른 중쇄 CDR2 서열; (iii) 서열번호 12에 따른 경쇄 CDR2 서열; (iv) 서열번호 13에 따른 경쇄 CDR2 서열; (v) 서열번호 14에 따른 중쇄 CDR1 서열; (vi) 서열번호 15에 따른 중쇄 CDR1 서열; (vii) 서열번호 16에 따른 경쇄 CDR1 서열; 또는 (viii) 서열번호 17에 따른 경쇄 CDR1 서열; 여기에서 상기 중쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 상기 경쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 상기 중쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 상기 경쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다. 바람직하게는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 및 서열번호 17에 따른 아미노산 서열들 중 각각 하나의 서열에서 상기 임의의 변화의 총 수, 즉 각 서열 중의 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다.
상기 첫 번째 태양의 일부 실시태양에서, 상기 결합 부분은 올리고뉴클레오타이드이다. 이들 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 핵산 앱타머, 예를 들어 DNA 앱타머 또는 RNA 앱타머, 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오타이드를 포함하는 혼합된 앱타머인 것이 추가로 바람직하다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어 2'-불소-치환된 피리미딘으로 대체할 수도 있다. 핵산 앱타머를 또한 형광 정보제공 분자, 친화성 태그 및/또는 거대분자와 접합시킬 수도 있다. 예를 들어, 상기 앱타머를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 필적할만한 거대분자에 접합시키는 것은 상기 앱타머의 생물학적 반감기를 증가시킬 것이다.
상기 첫 번째 태양의 일부 실시태양에서, 상기 결합 부분은 항체형 단백질, 예를 들어 상기 "정의" 부분에서 예시된 바와 같은 항체형 단백질이다.
상기 첫 번째 태양의 일부 실시태양에서, 상기 결합 부분은 펩타이드 유사물질이다. 본 발명의 실시에 적합한 펩타이드 유사물질은 바람직하게는 상술한 바와 같은 항체형 단백질을 기본으로 한다.
상기 첫 번째 태양의 바람직한 실시태양은 급성 염증, 예를 들어 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 허혈/재관류 관련된 손상, 예를 들어 허혈성 심장 질병, 급성 폐 손상, 폐렴, 이식 환자의 급성 및 만성 이식편 거부, 이식편 대 숙주 반응을 비롯한 다양한 질병, 및 또한 만성 유형의 염증, 예를 들어 신장 사구체 질병, 예를 들어 사구체신염 및 신부전의 다른 존재, 류마티스성 관절염 및 유사한 자가면역 질병, 예를 들어 베크테레프병, 루푸스형 질병, 염증성 장 질병, 크론병, 종양 성장, 또는 고형 기관 암을 비롯한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 상기 결합 부분에 관한 것이다.
두 번째 태양에서, 본 발명은 (i) 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR3 서열; 또는 (ii) 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며; 여기에서 상기 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다. 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다. 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열; 또는 (ii) 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열을 추가로 포함하며; 여기에서 상기 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다. 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다. 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다.
본 발명의 두 번째 태양은 (i) 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열; 또는 (ii) 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며; 여기에서 상기 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다. 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다. 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다.
본 발명의 두 번째 태양은 또한 (i) 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열; 또는 (ii) 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며; 여기에서 상기 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다. 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다. 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열 중 이들 임의의 변화의 총 수, 즉 상기 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기의 서열들 중 하나 이상을 추가로 포함하며: (i) 서열번호 10에 따른 중쇄 CDR2 서열; (ii) 서열번호 11에 따른 중쇄 CDR2 서열; (iii) 서열번호 12에 따른 경쇄 CDR2 서열; (iv) 서열번호 13에 따른 경쇄 CDR2 서열; (v) 서열번호 14에 따른 중쇄 CDR1 서열; (vi) 서열번호 15에 따른 중쇄 CDR1 서열; (vii) 서열번호 16에 따른 경쇄 CDR1 서열; 또는 (viii) 서열번호 17에 따른 경쇄 CDR1 서열; 여기에서 상기 중쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 상기 경쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 상기 중쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 상기 경쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다. 바람직하게는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 및 서열번호 17에 따른 아미노산 서열들 중 각각 하나의 서열에서 상기 임의의 변화의 총 수, 즉 각 서열 중의 교환, 결실 및 첨가의 총 수는 1 또는 2이다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 1가 항체, 이중 특이성 항체, 이종접합체 항체, 다중 특이성 항체, 탈면역화된 항체, 키메릭 항체, 인간화된(특히 CDR-그래프트화된) 항체, 및 인간 항체로 이루어진 군 중에서 선택된다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 항체의 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 다이설파이드 결합된 Fv(dsFv), 단일 도메인 항체(또한 나노바디로서 공지됨), 및 단일 쇄 Fv(scFv) 항체로 이루어진 군 중에서 선택된다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 C5a의 아미노산 서열 X1X2ETCEX3RX4(서열번호 18) 및 X5X6KX7X8X9L(서열번호 19)에 의해 형성된 구조적 에피토프에 결합하며, 여기에서 X1은 N, H, D, F, K, Y 및 T로 이루어진 군 중에서 선택되고; X2는 D, L, Y 및 H로 이루어진 군 중에서 선택되고; X3은 Q, E 및 K로 이루어진 군 중에서 선택되고; X4는 A, V 및 L로 이루어진 군 중에서 선택되고; X5는 S, H, P 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X6은 H 및 N으로 이루어진 군 중에서 선택되고; X7은 D, N, H, P 및 G로 이루어진 군 중에서 선택되고; X8은 M, L, I 및 V로 이루어진 군 중에서 선택되고; X9는 Q, L 및 I로 이루어진 군 중에서 선택된다. 즉, 상기 두 번째 태양에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호 18에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 및 서열번호 19에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 X2ETCEX3R(서열번호 20)의 하나 이상의 아미노산에 결합하며, 여기에서 X2 및 X3은 상기와 같이 정의된다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 X6KX7X8X9(서열번호 21), 보다 바람직하게는 KX7X8의 하나 이상의 아미노산에 결합하며, 여기에서 X6, X7, X8 및 X9는 상기와 같이 정의된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 X2ETCEX3R(서열번호 20) 내의 하나 이상의 아미노산 및 아미노산 서열 KX7X8 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합하며, 여기에서 X2, X3, X7 및 X8은 상기와 같이 정의된다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 구조적 에피토프는 (a) C5a의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)(호모 사피엔스 및 판 트로글로다이테스로부터의 서열); (b) C5a의 아미노산 서열 HDETCEQRA(서열번호 22) 및 SHKDLQL(서열번호 23)(마카카 뮬라타로부터의 서열); (c) C5a의 아미노산 서열 DDETCEERA(서열번호 24) 및 SHKNIQL(서열번호 25)(수스 스크로파로부터의 서열); (d) C5a의 아미노산 서열 DLETCEQRA(서열번호 26) 및 SHKHIQL(서열번호 27)(에쿠우스 카발루스로부터의 서열); (e) C5a의 아미노산 서열 DDETCEQRA(서열번호 28) 및 HHKNMQL(서열번호 29)(보스 타우루스로부터의 서열); (f) C5a의 아미노산 서열 FYETCEERV(서열번호 30) 및 PHKPVQL(서열번호 31)(무스 무스쿨루스로부터의 서열); (g) C5a의 아미노산 서열 KYETCEQRV(서열번호 32) 및 HHKGMLL(서열번호 33)(라투스 노르베기쿠스로부터의 서열); (h) C5a의 아미노산 서열 YDETCEQRA(서열번호 34) 및 SNKPLQL(서열번호 35)(카니스 루푸스로부터의 서열); 또는 (i) C5a의 아미노산 서열 THETCEKRL(서열번호 36) 및 NHKPVIL(서열번호 37)(모노델피스 도메스티카로부터의 서열)에 의해 형성된다. 상기 두 번째 태양의 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (a) DETCEQR(서열번호 4); (b) DETCEER(서열번호 38); (c) LETCEQR(서열번호 39); (e) YETCEER(서열번호 40); (f) YETCEQR(서열번호 41); 및 (g) HETCEKR(서열번호 42)로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에 결합한다. 상기 두 번째 태양의 훨씬 더 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (a) HKDMQ(서열번호 5), 바람직하게는 KDM; (b) HKDLQ(서열번호 43), 바람직하게는 KDL; (c) HKNIQ(서열번호 44), 바람직하게는 KNI; (d) HKHIQ(서열번호 45), 바람직하게는 KHI; (e) HKNMQ(서열번호 46), 바람직하게는 KNM; (f) HKPVQ(서열번호 47), 바람직하게는 KPV; (g) HKGML(서열번호 48), 바람직하게는 KGM; (h) NKPLQ(서열번호 49), 바람직하게는 KPL; 및 (i) HKPVI(서열번호 50), 바람직하게는 KPV로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에 결합한다.
상기 두 번째 태양의 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 C5a는 인간 C5a이다. 따라서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 C5a의 아미노산 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 구조적 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합한다. 상기 두 번째 태양의 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 내의 하나 이상의 아미노산에 결합한다. 상기 두 번째 태양의 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 HKDMQ(서열번호 5) 내의 하나 이상의 아미노산에 결합하고, 보다 바람직하게는 아미노산 서열 KDM 내의 하나 이상의 아미노산에 결합한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 내의 하나 이상의 아미노산 및 아미노산 서열 KDM 내의 하나 이상의 아미노산에 동시에 결합한다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 대해 10 nM 이하, 바람직하게는 9 nM 이하, 보다 바람직하게는 8 nM 이하, 보다 바람직하게는 7 nM 이하, 보다 바람직하게는 6 nM 이하, 보다 바람직하게는 5 nM 이하, 보다 바람직하게는 4 nM 이하, 보다 바람직하게는 3 nM 이하, 보다 바람직하게는 2 nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 1 nM 이하의 Kd 값을 갖는 결합 상수를 갖는다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 한 분자의 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 의해 유발된 생물학적 효과에 대해 75% 이상의 차단 활성, 바람직하게는 80% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 85% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 차단 활성을 나타낸다. 이들 바람직한 차단 활성은 상기 항체(또는 그의 항원-결합 단편)가 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 대한 단일 파라토프 결합을 포함하는 실시태양들에 관한 것이다. 상기 항체(또는 그의 항원-결합 단편)가 2 개 이상의 C5a-특이적인 파라토프를 포함하는 실시태양들에서, 하나의 결합-부분 분자가 상기 항체(또는 그의 항원-결합 단편) 중에 존재하는 C5a-특이적인 파라토프의 수와 동등한 수의 C5a 분자와 접촉할 때 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상 등의 상기 차단 활성이 성취된다. 예를 들어, 상기 IgG-유형의 전형적인 항-C5a 항체는 C5a에 결합할 수 있는 2 개의 파라토프를 포함하는 반면, IgM-유형의 전형적인 항-C5a 항체는 C5a에 결합할 수 있는 10 개의 파라토프를 포함한다. 따라서, 상기 IgG-유형의 항체의 차단 활성은 상기 항체를 1:2의 몰 비로 C5a와 접촉시킴으로써 측정되어야 한다. 상기 IgM-유형의 항체의 차단 활성은 상기 항체를 1:10의 몰 비로 C5a와 접촉시킴으로써 측정되어야 한다. 이러한 몰 비를 선택하는 경우, 상기 항체 내의 파라토프 및 C5a는 동 몰 농도로 존재한다. 즉, 상기 두 번째 태양에 따른 항체(또는 그의 항원-결합 단편)의 파라토프와 C5a가 동 몰 농도로 존재할 때, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 C5a에 의해 유발된 생물학적 효과에 대해 75% 이상의 차단 활성, 바람직하게는 80% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 85% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 차단 활성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 차단 활성을 나타낸다. 차단되는 바람직한 생물학적 효과는 인간 전혈 세포로부터 C5a-유발된 라이소자임 방출이다. 이러한 C5a-유발된 라이소자임 방출 및 그의 차단을 측정하기 위한 분석을 실시예 섹션에 개시한다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 혈장에서 CH50 활성을 억제하지 않는다. CH50 활성의 측정을 위한 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며 하기 실시예 섹션에 개시되어 있다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하나 이상의 C5b 유발된 생물학적 효과에 대해 차단 활성을 나타내지 않고, 바람직하게는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 어떠한 C5b 유발된 생물학적 효과에 대해서도 차단 활성을 나타내지 않는다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 전혈에서 에스케리키아 콜라이 유발된 IL-8 생산을 감소시킬 수 있다. 전혈 중 IL-8 생산의 측정을 위한 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며 하기 실시예 섹션에 개시되어 있다.
상기 두 번째 태양의 바람직한 실시태양은 급성 염증, 예를 들어 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 허혈/재관류 관련된 손상, 예를 들어 허혈성 심장 질병, 급성 폐 손상, 폐렴, 이식 환자의 급성 및 만성 이식편 거부, 이식편 대 숙주 반응을 비롯한 다양한 질병, 및 또한 만성 유형의 염증, 예를 들어 신장 사구체 질병, 예를 들어 사구체신염 및 신부전의 다른 존재, 류마티스성 관절염 및 유사한 자가면역 질병, 예를 들어 베크테레프병, 루푸스형 질병, 염증성 장 질병, 크론병, 종양 성장, 또는 고형 기관 암을 비롯한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
상기 첫 번째 및 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR3, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR1 서열들의 세트 중 하나를 포함하며, 여기에서 각각의 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 중쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 중쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다:
본 발명의 항체 또는 그의 단편에 사용하기에 적합한 중쇄 CDR 서열들의 세트
중쇄 세트의 기호 CDR3 서열 CDR2 서열 CDR1 서열
A 서열번호 6 서열번호 10 서열번호 14
B 서열번호 6 서열번호 10 서열번호 15
C 서열번호 6 서열번호 11 서열번호 14
D 서열번호 6 서열번호 11 서열번호 15
E 서열번호 7 서열번호 10 서열번호 14
F 서열번호 7 서열번호 10 서열번호 15
G 서열번호 7 서열번호 11 서열번호 14
H 서열번호 7 서열번호 11 서열번호 15
상기 첫 번째 및 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR3, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR1 서열들의 세트 중 하나를 포함하며, 여기에서 각각의 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 경쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 경쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다:
본 발명의 항체 또는 그의 단편에 사용하기에 적합한 경쇄 CDR 서열들의 세트
항체 INab08(서열번호 12)의 CDR2 경쇄 서열은 항체 INab708(서열번호 13)의 CDR2 경쇄 서열과 일치하므로, 서열번호 13을 포함한 세트는 서열번호 12를 포함한 세트에 과잉일 수 있다. 따라서, 표는 오직 4 개의 경쇄 CDR 서열들의 세트만을 나타낸다
경쇄 세트의 수 CDR3 서열 CDR2 서열 CDR1 서열
I 서열번호 8 서열번호 12 서열번호 16
II 서열번호 8 서열번호 12 서열번호 17
III 서열번호 9 서열번호 12 서열번호 16
IV 서열번호 9 서열번호 12 서열번호 17
상기 첫 번째 및 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 표 1에 나타낸 중 CDR 세트 A 내지 H 중 하나와 상기 표 2에 나타낸 경쇄 CDR 세트 I 내지 IV 중 하나를 포함하며, 즉 하기 세트들의 조합 중 하나를 포함하며: A-I, A-II, A-III, A-IV, B-I, B-II, B-III, B-IV, C-I, C-II, C-III, C-IV, D-I, D-II, D-III, D-IV, E-I, E-II, E-III, E-IV, F-I, F-II, F-III, F-IV, G-I, G-II, G-III, G-IV, H-I, H-II, H-III, 또는 H-IV, 여기에서 각각의 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 중쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 중쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 경쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함하고; 여기에서 각각의 경쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3 개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3 개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3 개의 아미노산 첨가를 임의로 포함한다.상기 첫 번째 및 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) INab308의 VH 도메인; 또는 (ii) INab708의 VH 도메인을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 이루어진 VH 도메인을 포함한다.
상기 INab308 및 INab708의 VH 도메인을 한정하는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 서열을 하기 표 4에 나타낸다.
상기 첫 번째 및 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) INab308의 VL 도메인; 또는 (ii) INab708의 VL 도메인을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 이루어진 VL 도메인을 포함한다.
상기 INab308 및 INab708의 VL 도메인을 한정하는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 서열을 하기 표 4에 나타낸다.
상기 첫 번째 및 두 번째 태양의 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하며, 여기에서
(i) 상기 VH 도메인은 INab308의 VH 도메인을 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고, 상기 VL 도메인은 INab308의 VL 도메인을 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지거나;
(ii) 상기 VH 도메인은 INab708의 VH 도메인을 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나, 이루어지고, 상기 VL 도메인은 INab708의 VL 도메인을 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나, 이루어진다.
상기 첫 번째 및 두 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 개시한 바와 같은 하나 이상의 CDR, CDR들의 세트, 또는 CDR들의 세트의 조합을 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 항체 프레임워크 중에 상기 CDR을 포함한다.
본 발명에서 중쇄에 관하여 특정 쇄, 또는 특정 영역 또는 서열을 포함하는 항체에 대한 언급은 바람직하게는 상기 항체의 모든 중쇄가 상기 특정 쇄, 영역 또는 서열을 포함하는 상황에 관한 것이다. 이를 항체의 경쇄에도 상응하게 적용한다.
특정 핵산 및 아미노산 서열, 예를 들어 서열 목록에 나타낸 것들에 관하여 본 발명에 제공된 교시를 상기 특정 서열과 작용상 동등한 서열, 예를 들어 특정 아미노산 서열의 성질과 동일하거나 유사한 성질을 나타내는 아미노산 서열 및 특정 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 성질과 동일하거나 유사한 성질을 나타내는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 생성시키는 상기 특정 서열의 변형과 또한 관련되도록 해석해야 한다. 한 가지 중요한 성질은 항체의 그의 표적에 대한 결합을 유지하거나 항체의 효과기 작용을 지속시키는 것이다. 바람직하게는, 특정 서열에 관하여 변형된 서열은 상기 서열이 항체 중의 상기 특정 서열을 대체하는 경우, C5a, 특히 본 발명에 나타낸 C5a의 구조적 에피토프에 대한 상기 항체의 결합을 유지하고, 바람직하게는 본 발명에 개시된 바와 같은 상기 항체의 작용들, 예를 들어 인간 전혈 세포로부터 C5a-유발된 라이소자임 방출의 차단 및/또는 인간 전혈에서 에스케리키아 콜라이 유발된 IL-8 생산의 감소를 유지한다.
당해 분야의 숙련가들은 특히 CDR, 초가변 및 가변 영역의 서열들을 C5a에 결합하는 능력의 상실 없이 변형시킬 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 본 발명에 명시된 영역들과 동일하거나 매우 상동성일 것이다. "매우 상동성"은 상기 CDR 중에서 1 내지 5, 바람직하게는 1 내지 4, 예를 들어 1 내지 3 또는 1 또는 2 개의 치환, 결실 또는 첨가가 이루어질 수도 있는 것으로 생각된다. 또한, 상기 초가변 및 가변 영역을 이들 영역이 본 발명에 구체적으로 개시한 영역들과 실질적인 상동성을 보이도록 변형시킬 수도 있다.
더욱 또한, 본 발명에 따라 본 발명에 개시된 아미노산 서열, 특히 인간 중쇄 불변 영역의 서열들을 목적하는 알로타입, 예를 들어 백인 집단에서 발견되는 알로타입에 적합하도록 변형시키는 것이 요구될 수도 있다.
본 발명은 또한 항체의 작용 또는 약동학적 성질을 변화시키기 위해서 Fc 영역 중에 변경을 수행한 항체를 추가로 포함한다. 상기와 같은 변경은 C1q 결합 및 CDC 또는 FcγR 결합 및 ADCC의 감소 또는 증가를 생성시킬 수 있다. 치환은, 예를 들어 상기 중쇄 불변 영역의 아미노산 잔기들 중 하나 이상에서 이루어져, 변형된 항체에 비해 항원에 결합하는 능력은 유지하면서 효과기 작용에 변경을 일으킬 수 있다. 미국 특허 제 5,624,821 호 및 미국 특허 제 5,648,260 호 참조.
항체의 생체 내 반감기를, 상기 분자가 완전한 CH2 도메인 또는 완전한 Ig Fc 영역을 포함하지 않도록 상기 Ig 불변 도메인 또는 Ig형 불변 도메인의 구조(salvage) 수용체 에피토프를 변형시킴으로써 개선시킬 수 있다. 미국 특허 제 6,121,022 호 및 미국 특허 제 6,194,551 호 참조. 상기 생체 내 반감기를 더욱 또한, 상기 Fc 영역 중에 돌연변이를 생성시킴으로써, 예를 들어 252번 위치에서 류신을 쓰레오닌으로 치환함으로써, 254번 위치에서 세린을 쓰레오닌으로 치환함으로써, 또는 256번 위치에서 페닐알라닌을 쓰레오닌으로 치환함으로써 증가시킬 수 있다.
더욱 또한, 항체의 글리코실화 패턴을 상기 항체의 효과기 작용의 변화를 위해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체를, Fc-수용체에 대한 Fc 영역의 친화성을 향상시키고, 차례로 NK 세포의 존재 하에서 상기 항체의 ADCC를 증가시키기 위해서 상기 Fc 영역의 297번 위치에서 Asn에 통상적으로 부착되는 퓨코스 단위를 첨가하지 않은 형질주입종에서 발현시킬 수 있다. 문헌[Shield et al.(2002) JBC, 277:26733] 참조. 더욱 또한, CDC의 변형을 위해서 갈락토실화의 변형을 수행할 수 있다.
한편으로, 또 다른 실시태양에서, 예를 들어 포화 돌연변이에 의해서 항-C5a 항체 암호화 서열의 전부 또는 일부와 함께 돌연변이를 무작위로 도입시킬 수 있으며, 생성되는 변형된 항-C5a 항체를 결합 활성에 대해 선별할 수 있다.
세 번째 태양에서, 본 발명은 (a) 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분; 또는 (b) 상기 두 번째 태양에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
네 번째 태양에서, 본 발명은 급성 염증, 예를 들어 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 허혈/재관류 관련된 손상, 예를 들어 허혈성 심장 질병, 급성 폐 손상, 폐렴, 이식 환자의 급성 및 만성 이식편 거부, 이식편 대 숙주 반응을 비롯한 다양한 질병, 및 또한 만성 유형의 염증, 예를 들어 신장 사구체 질병, 예를 들어 사구체신염 및 신부전의 다른 존재, 류마티스성 관절염 및 유사한 자가면역 질병, 예를 들어 베크테레프병, 루푸스형 질병, 염증성 장 질병, 크론병, 종양 성장, 또는 고형 기관 암을 비롯한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한, (a) 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분; 또는 (b) 상기 두 번째 태양에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
다섯 번째 태양에서, 본 발명은 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 허혈/재관류 관련된 손상, 예를 들어 허혈성 심장 질병, 급성 폐 손상, 폐렴, 이식 환자의 급성 및 만성 이식편 거부, 이식편 대 숙주 반응을 비롯한 다양한 질병, 및 또한 만성 유형의 염증, 예를 들어 신장 사구체 질병, 예를 들어 사구체신염 및 신부전의 다른 존재, 류마티스성 관절염 및 유사한 자가면역 질병, 예를 들어 베크테레프병, 루프수형 질병, 염증성 장 질병, 크론병, 종양 성장, 또는 고형 기관 암을 비롯한 질병의 예방 및/또는 치료가 필요한 환자에 있어서 상기 질병의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 (a) 상기 첫 번째 태양에 따른 결합 부분; 또는 (b) 상기 두 번째 태양에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함을 포함한다.
본 발명의 임의의 태양의 실시에서, 상술한 바와 같은 약학 조성물 또는 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편)을 환자에게서 상기 결합 부분의 충분한 수준을 제공하는 당해 분야에 확립된 임의의 경로에 의해 상기 환자에게 투여할 수도 있다. 상기 약학 조성물 또는 결합 부분을 전신적으로 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 상기와 같은 투여는 비 경구, 점막 통과, 예를 들어 경구, 코, 직장, 질 내, 설하, 점막 하, 피부 통과에 의해, 또는 흡입에 의할 수 있다. 바람직하게는, 투여는 비 경구, 예를 들어 정맥 내 또는 복강 내 주사를 통해서이며, 또한 비 제한적으로 동맥 내, 근육 내, 피부 내 및 피하 투여를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 국소적으로 투여하는 경우, 상기 조성물을 치료하려는 기관 또는 조직 내로, 예를 들어 종양이 침범한 기관 내로 직접 주사할 수 있다.
경구 투여에 적합한 약학 조성물을 캡슐 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비-수성 액체 중의)으로서; 식용 포말 또는 휘프로서; 또는 유화액으로서 제공할 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토오스, 전분 또는 그의 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체, 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수도 있다.
경구 투여를 위한 활성제를 위장관 중의 상기 활성제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질로 코팅하거나 상기 물질과 혼합할 수도 있다(예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트를 사용할 수도 있다). 따라서, 활성제의 지속되는 방출을 수 시간에 걸쳐 성취할 수 있으며, 필요에 따라, 상기 활성제를 위 내에서 붕해되는 것으로부터 보호할 수도 있다. 경구 투여용 약학 조성물을 특정 pH 또는 효소 조건으로 인해 특정한 위장 위치에서 활성제의 방출을 촉진하기 위해 제형화할 수도 있다.
피부 통과 투여에 적합한 약학 조성물을 연장된 시간 동안 수용자의 표피와 긴밀히 접촉하여 남아있도록 별도의 패치로서 제공할 수도 있다. 국소 투여에 적합한 약학 조성물을 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 젤, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제공할 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직에 대한 국소 투여를 위해서, 바람직하게는 국소 연고 또는 크림이 사용된다. 연고로 제형화하는 경우, 상기 활성 성분을 파라핀 또는 수-혼화성 연고 베이스와 함께 사용할 수도 있다. 한편으로, 상기 활성 성분을 수중 유적형 베이스 또는 유중 수적형 베이스와 함께 크림으로 제형화할 수도 있다. 눈에 대한 국소 투여에 적합한 약학 조성물은 점안제를 포함한다. 이들 조성물에서, 상기 활성 성분을 적합한 담체, 예를 들어 수성 용매에 용해하거나 현탁할 수 있다. 입 안의 국소 투여에 적합한 약학 조성물은 로젠지, 알약 및 구강세정제를 포함한다.
코 투여에 적합한 약학 조성물은 고체 담체, 예를 들어 분말(바람직하게는 20 내지 500 ㎛ 범위의 입자 크기를 갖는다)을 포함할 수 있다. 분말을 코로 들이쉬는 방식으로, 즉 코에 가깝게 유지되는 분말의 용기로부터 상기 코를 통해 신속한 흡입에 의해 투여할 수 있다. 한편으로, 코 투여를 위해 채용된 조성물은 액체 담체, 예를 들어 코 스프레이 또는 코 점적제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 상기 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위한 조성물을, 상기 활성 성분의 소정의 투여량을 제공하도록 제작될 수 있는 특수하게 개조한 장치, 예를 들어 비 제한적으로 가압 에어로졸, 분무기 또는 취입기 중에서 공급할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물을 비강을 통해 폐로 투여한다.
직장 투여에 적합한 약학 조성물을 좌약 또는 관장약으로서 제공할 수 있다. 질 투여에 적합한 약학 조성물을 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 포말 또는 스프레이 제형으로서 제공할 수 있다.
비 경구 투여에 적합한 약학 조성물은 수성 및 비-수성 멸균 주사용 용액 또는 현탁액을 포함하며, 이들은 산화방지제, 완충제, 세균발육 저지제, 및 상기 조성물을 의도하는 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있다. 상기와 같은 조성물 중에 존재할 수 있는 다른 성분은 예를 들어 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 비 경구 투여에 적합한 조성물을 단위 용량 또는 수회 용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰풀 및 바이알 중에 제공할 수 있으며, 오직 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용 멸균 염수 용액의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조된 상태로 보관할 수 있다. 즉석 주사용액 및 현탁액을 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수도 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 조성물을 인간에 대한 정맥 내 투여에 적합한 약학 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제형화한다. 전형적으로, 정맥 내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 용해제, 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제, 예를 들어 리도카인을 추가로 포함할 수도 있다. 일반적으로, 상기 성분들을 별도로 또는 단일 투여형으로 함께 혼합하여, 예를 들어 활성제의 양을 가리키는 앰풀 또는 향낭과 같은 용봉한 용기 중의 건조한 동결건조된 분말 또는 수-비함유 농축물로서 공급한다. 상기 조성물을 주입에 의해 투여해야 하는 경우, 상기 조성물을 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병을 사용하여 분배할 수 있다. 상기 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 상기 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있도록 멸균 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 예를 들어 화학유인의 억제제를 조절된 방출 시스템 중에서 전달할 수 있다. 예를 들어 상기 억제제를 정맥 내 주입, 이식용 삼투 펌프, 피부 통과 패치, 리포솜, 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 펌프를 사용할 수도 있다(문헌[Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201]; [Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507]; [Saudek et al. (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574] 참조). 또 다른 실시태양에서, 상기 화합물을 소낭 중에, 특히 리포솜 중에서 전달할 수 있다(문헌[Langer (1990) Science 249:1527-1533]; [Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365]; WO 91/04014; 미국 특허 제 4,704,355 호 참조). 또 다른 실시태양에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.]; [Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61]; [Levy et al. (1985) Science 228:190]; [During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351]; [Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105] 참조).
더욱 또 다른 실시태양에서, 조절된 방출 시스템을 치료 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관에 근접하여 배치할 수 있으며, 따라서 단지 전신 용량의 일부만이 필요하다(예를 들어, 문헌[Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2] 참조). 다른 조절된 방출 시스템들이 문헌에 논의되어 있다(문헌[Langer , 1990, Science 249: 1527-1533]).
특정한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물을 치료가 필요한 부위에 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이를 예를 들어, 비 제한적으로 수술 중 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터를 사용하여, 좌약을 사용하여, 또는 이식물을 사용하여 성취할 수 있으며, 상기 이식물은 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질, 예를 들어 멤브레인, 예를 들어 실라스틱 멤브레인, 또는 섬유이다.
상기 바람직한 유효 용량의 선택은 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 공지되는 여러 인자를 고려하여 숙련가에 의해 결정될 것이다. 상기와 같은 인자는 상기 약학 조성물의 특정 형태, 예를 들어 폴리펩타이드 또는 벡터, 및 그의 약동학적 매개변수, 예를 들어 생물학적 이용 효능, 대사, 반감기 등을 포함하며, 이들 인자는 약학 화합물에 대한 규제 승인의 획득에 전형적으로 사용되는 통상적인 개발 절차 중에 확립되었을 것이다. 상기 용량의 고려에 있어서 추가의 인자는 예방 및/또는 치료되는 병 또는 질병, 또는 통상적인 개인에게서 성취되어야 하는 이점, 환자의 체 질량, 투여 경로, 투여의 급성 또는 만성 여부, 동반 투약, 및 투여된 약제의 효능에 영향을 미치는 것으로 널리 공지된 다른 인자를 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라, 예를 들어 표준 임상 기법에 따라, 개별적인 환자의 상태 및 면역 상태에 따라 결정되어야 한다.
종양 성장 또는 고형 기관 암의 예방 및/또는 치료와 관련된 본 발명의 임의의 태양의 실시에서, 본 발명의 결합 부분 또는 항체가 투여되는 피실험자를 화학요법제, 방사선, 또는 Fc 수용체, 예를 들어 Fc-감마 수용체, 예를 들어 사이토킨의 발현 또는 활성을 조절하는, 예를 들어 향상시키거나 억제하는 작용제로 추가로 치료한다. 치료 중 투여되는 전형적인 사이토킨은 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ), 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다. 전형적인 치료제는 다른 것들 중에서도 신생물 억제제, 예를 들어 독소루비신, 시스플라틴, 탁소테레, 5-플루오르유라실, 메토트렉세이트, 젬시타빈 및 사이클로포스파미드를 포함한다.
하기의 도면 및 실시예들은 단지 본 발명을 예시할 뿐이며 첨부된 특허청구범위에 의해 가리키는 바와 같은 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.
도면의 설명
도 1은 혈액 세포로부터 효소 방출에 대한 C5a 돌연변이체의 효과를 도시한다.
항체 에피토프의 구성을 위한 C5a 분자들 중의 잠재적인 아미노산이 알라닌으로 돌연변이되었으며, 이들 C5a 돌연변이체를 인간 전혈 세포로부터 라이소자임 방출을 유도하는 그들의 생물 활성에 대해 시험하였다. 인간 C5a에 비해 50% 초과의 생물 활성 상실을 생성시키는 C5a 부위 돌연변이가 C5a 생물 작용에 대한 중요한 부위로서 간주되었다. 이들 부위는 24, 29, 31, 37, 68 및 69이다.
도 2는 C5a 돌연변이체에 대한 INab308의 결합 능력을 도시한다.
C5a 및 C5a 돌연변이체를 96-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 이들 단백질에 대한 INab308의 결합 능력을 ELISA 접근법에 의해 평가하였다. 50% 초과의 결합 능력의 상실이 유의수준으로 간주된다. 상기 데이터는 INab308이 2 개의 영역, 31 내지 37 및 68 내지 69에 결합함을 가리킨다.
도 3은 C5a 돌연변이체에 대한 INab708의 결합 능력을 도시한다.
C5a 및 C5a 돌연변이체를 96-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 이들 단백질에 대한 INab708의 결합 능력을 ELISA 접근법에 의해 평가하였다. 50% 초과의 결합 능력의 상실이 유의수준으로 간주된다. 상기 데이터는 INab708이 2 개의 영역, 31 내지 37 및 68 내지 70에 결합함을 가리킨다.
도 4는 INab308 및 INab708이 인간 혈장 CH50 활성에 영향을 미치지 않음을 도시한다.
인간 혈장 용혈 활성을 전통적인 CH50 분석에 의해 측정하였다. INab708, INab308, 및 F20을 포함한 인간 C5a에 대한 단클론 항체들을 인간 혈장과 미리 배양하고 이어서 CH50 분석을 후속적으로 수행하였다. 이들 항체 중에서, F20이 CH50 활성을 강하게 억제하는 반면, INab708 및 INab308은 약 5 μM의 농도(이는 인간 전혈 중에 존재하는 C5 농도(약 0.4 μM)보다 현저하게 더 높다)로 사용될 때 영향을 미치지 않는다.
도 5는 C5a 생물 활성에 대한 INab308, INab708 및 L2B23의 차단 효과의 비교를 도시한다.
INab308, INab708 및 L2B23의 차단 활성을 C5a-유발된 라이소자임 방출 분석에 의해 평가하였다. 항체 대 C5a의 몰 비를, 2 개의 C5a 분자-유도된 생물학적 효과에 대한 하나의 항체의 차단 활성을 평가하기 위해 1:2로 정하였다. 상기 데이터는 INab308 및 INab708이 C5a 생물 활성에 대해 매우 높은 차단 활성(≥90%)을 갖는 반면, L2B23은 단지 최소의 효과만을 보임을 나타낸다.
도 6은 인간 전혈에서 에스케리키아 콜라이-유발된 IL-8 생산에 대한 INab308 및 INab708의 억제 효과를 도시한다.
에스케리키아 콜라이를 4 시간 동안 전혈과 배양하고, IL-8 수준을 ELISA에 의해 평가하였다. 상기 배양 중에 INab308 및 INab708의 존재 하에서, IL-8 수준은 현저하게 감소한 반면(P<0.01), L2B23의 존재 하에서는 현저한 감소는 없었다.
실시예
1. 방법
1.1 재조합 C5a 및 C5a 돌연변이체 제조:
인간 C5a를 암호화하는 DNA 서열을, 말초 혈액 백혈구로부터 단리된 RNA를 사용하여 역 전사효소-폴리머라제 쇄 반응(RT-PCR)에 의해 획득하였다. C5a 돌연변이체를 상기 돌연변이 부위에 GCT(알라닌)를 도입시킴으로써 PCR 방법을 사용하여 생성시켰다. 이어서 상기 C5a DNA를 pET-32a(노바젠(Novagen), 미국 뉴저지주 깁스타운 소재)와 연결시키고, 상기 연결 혼합물을 사용하여 JM109-수용 세포를 형질전환시켰다. 상기 발현 플라스미드를 표준 염화 칼슘 방법을 사용하여 BL21 내로 형질전환시켰다. 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 브로쓰(LB) 플레이트로부터 단일 콜로니를 집어, 암피실린이 있는 LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양물을 2L의 LB 배지로 옮기고 중간 지수 증식기(A600 약 0.6)까지 37 ℃에서 배양하고, 이어서 아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.1 mM의 최종 농도로 가하였다. 상기 세포를 30 ℃에서 밤새 계속 증식시키고 상기 배양물을 7,000 rpm, 4 ℃에서 15 분간 회전시켜 수확하였다. 포스페이트-완충된 염수(PBS; 10 mM PB, 150 mM NaCl[pH 7.4])로 1 회 세척한 후에, 상기 세균 펠릿을 PBS에 재현탁하고 얼음 상에서 초음파 처리하였다. 12,000 rpm, 4 ℃에서 15 분간 원심분리 후에, 용해성 분획을 불용성 펠릿으로부터 분리시켰다. 인간 재조합 C5a를 정제하기 위해서, 세포 용해물의 상등액을, PBS로 미리 평형화시킨 니켈-킬레이트화된 친화성 컬럼 상에 로딩하였다. 이어서 상기 컬럼을 PBS 중의 50 mM 이미다졸 및 200 mM 이미다졸 각각으로 세척하였다. 최종적으로, 결합된 단백질을 500 mM 이미다졸에 의해 용리시키고, PBS에 대해 밤새 투석시키고, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석하였다.
1.2 면역화 및 ELISA에 의한 하이브리도마 선별:
단클론 항체를 하이브리도마 방법을 사용하여 제조하였다. MAb의 면역화 및 생산을 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 5 마리의 4-주된 암컷 BALB/c 마우스를 동물당 100 ㎍의 완전 프로인트 항원보강제 중의 정제된 재조합 C5a로 피하 면역시켰다. 상기 동물들을 100 ㎍의 불완전 프로인트 항원보강제 중의 항원을 사용하여 4 주 간격으로 2 회 추가접종하였다. 상기 최종 추가접종 후 3일째에, 마우스를 죽이고, 그의 비장 세포를 NS-1과 5:1 비로 융합시키고, 200 ㎕의 세포를 5 개의 96-웰 플레이트 상의 각 웰에 도말하였다. 하이브리드를 20% 송아지 태아 혈청 및 5 x 10-3 M 하이포잔틴, 2 x 10-5 M 아미노프테린, 및 8 x 10-4 M 티미딘(HAT)이 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 중에서 선택하였다.
8일 후에, 인간 C5a에 대한 항체를 분비하는 세포 클론들을 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 선별하였다. 간단히, 96-웰 플레이트를 4 ℃에서 밤새 2 ㎍/㎖의 재조합 인간 C5a로 코팅하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 PBS 중의 5% 무지방 우유로 차단한 후에, 상기 성장하는 클론의 배양 배지 50 ㎕를 각 웰에 가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음, 1 시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)로 표지한 100 ㎕의 염소 항-마우스 항체를 가하였다. 상기 퍼옥시다제 반응은 5.5 mM o-페닐렌-다이아민 하이드로클로라이드(OPD) 및 8.5 mM H2O2를 함유하는 발색 용액에 의해 전개되었다. 흡광도를 ELISA 판독기(안토스(Anthos), 오스트리아 발스/잘츠부르크 소재)를 사용하여 492 ㎚에서 측정하였다.
1.3 단클론 항체의 생산 및 정제
다량의 Mab를 생산하기 위해서, 5 x 106 하이브리도마 세포를 마우스의 복강에 주사하였다. 14일 후에, 복수를 회수하고 1500 rpm, 4 ℃에서 5 분간 원심분리하였다. 상등액을 수거하고, PBS로 미리 평형화시킨 단백질 A-세파로스 4B의 컬럼에 적용하였다. 결합된 Mab를 시트르산(pH 4.0)으로 용리시키고 PBS에 대해 밤새 투석하였다. 상기 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
1.4 C5a 생물 활성에 대한 효소 방출 분석
탈과립에 의한 효소 방출의 유도는 C5a의 중요한 생물학적 특징이다. 우리의 연구에서, 건강한 자원자로부터의 신선한 인간 전혈을 사용하여 라이소자임 방출에 대한 C5a의 효과를 평가하였다. 상기 전혈 세포로부터 방출된 라이소자임 수준을 엔즈체크(EnzChek)(등록상표) 라이소자임 분석 키트(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 분석하였다. 상기 항-C5a 항체의 차단 활성을 연구하기 위해서, rhC5a(100 nM)를 상이한 농도의 항체와 혼합하였다. 그 후에, 전혈 세포를 바로 가하여 항체와 C5a와의 사전 배양을 피하였다. 배양 후에, 50 ㎕의 샘플 상등액을 50 ㎕의 희석된 기질 용액에 가하였다. 플레이트를 암실에서 37 ℃에서 30 분간 배양하고 그 후에 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 1420 다중표지 카운터(미국 매사추세츠주 소재)로 판독하였다. 형광 강도를 490 ㎚에서의 여기 및 525 ㎚에서의 방출로 측정하고 제로 표준 값(블랭크)을 모든 샘플에서 감하였다. 상기 항체의 차단 활성을 rhC5a-유발된 라이소자임 방출의 형광 강도로부터 rhC5a-독립적인 라이소자임 방출(완충제 대조군)의 형광 강도를 감한 후에 계산하였다. 차단 활성을 하기 식에 의해 계산하였다:
차단 활성 = C5a형광 - (C5a+Ab)형광/C5a형광 - 완충제 대조군형광
1.5 인간 C5a 또는 C5a 돌연변이체에 대한 INab308 및 INab708 결합 능력의 ELISA 분석
결합 ELISA를 수행하여 인간 C5a 및 C5a 돌연변이체에 대한 INab308 및 INab708의 결합 활성을 측정하였다. C5a 돌연변이체를, cDNA 수준으로부터 돌연변이 부위 내로의 GCT의 도입에 의해 상응하는 아미노산을 알라닌으로 치환함으로써 생산한다. 이들 C5a 돌연변이체는 24, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, 30/37 이중 돌연변이, 40, 53, 64, 65, 66, 68, 64/68, 66/68, 69, 70 및 C-del(12 개 아미노산이 C5a C 말단으로부터 결실되었다) 상에서의 부위 돌연변이를 포함한다.
인간 C5a(시그마 C5788), 재조합 C5a, 및 C5a 돌연변이체(2 ㎍/㎖)를 4 ℃에서 밤새 96-웰 EIA 플레이트(코스타(Costar) 9018) 상에 코팅하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 PBS 중의 5% 무지방 우유로 차단한 후에, 희석 완충제로 제조한 0.08, 0.4, 2 ㎍/㎖의 항-C5a 항체(INab308 및 INab708)를 각 웰에 가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 1 시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)로 표지한 100 ㎕의 염소 항-마우스 항체를 가하였다. 상기 퍼옥시다제 반응은 5.5 mM o-페닐렌-다이아민 하이드로클로라이드(OPD) 및 8.5 mM H2O2를 함유하는 발색 용액에 의해 전개되었다. 흡광도를 ELISA 판독기(안토스, 오스트리아 발스/잘츠부르크 소재)를 사용하여 492 ㎚에서 측정하였다. 상기 재조합 C5a에 대한 OD 값을 100% 결합 활성으로서 정하였다. C5a 돌연변이체의 결합 능력을 ODc5a돌연변이체/ODc5a에 의해 계산한다.
1.6 혈장 용혈 활성(CH50)
간단히, 양 적혈구 세포(sRBC)를 원심분리에 의해 신선한 양 전혈로부터 제조하고, 이어서 항-sRBC로 감작시켰다. 건강한 자원자로부터의 혈장 샘플을 연속적으로 희석하고 감작된 sRBC와 함께 배양하였다. 배양 후 30 분째에, 용해되지 않은 세포를 회전시키고, 상등액을 플레이트 판독기 상에서 542 ㎚에서 판독하였다. C5 활성화에 대한 항-C5a 항체의 효과를 측정하기 위해서, 각 부피의 항-C5a 항체 및 혈장을 상기 감작된 sRBC의 첨가 전에 1 시간 동안 예비 배양하였다.
1.7 에스케리키아 콜라이 감염의 전혈 모델에서 IL-8 생산
임상 패혈증에 가까운 환경에서 항-C5a 항체의 효능을 평가하기 위해서, 건강한 자원자로부터 250 ㎕의 전혈에 항-C5a 항체를 가하고, 이어서 1 x 107/㎖의 농도로 염수 완충제에 희석된 에스케리키아 콜라이 250 ㎕를 가하였다. 37 ℃에서 4 시간 배양 후, 상등액을 회전시키고 IL-8에 대한 ELISA 분석을 위해 수집하였다. 상기 상등액 중의 IL-8 수준을 IL-8 ELISA 키트(바이오레전드(BioLegend), 미국 소재)에 의해 분석하였다.
1.8 신규의 구조적 에피토프에 대한 항체 결합의 선별을 위한 분석
컴퓨터 모델링 방법으로부터 획득한 C5a의 3-D 구조에서, 펩타이드 C5a 28-40(VNNDETCEQRAAR, 서열번호 67) 및 C5a 펩타이드 65-70(ISHKDM, 서열번호 68)을 함유하는 공간상 에피토프는 무작위 코일로서 보여질 수 있다. 상기 두 펩타이드를 가요성 펩타이드 링커, GGGGS(서열번호 69)에 의해 결합시키는 경우, 상기 공간상 에피토프는, 상기 두 펩타이드로부터 약한 소수성 상호작용이 주머니 형상 형태를 보장하기 때문에, 모 항원 형태를 닮도록 재구성된다. 상기 펩타이드 NH2-28-40-링커(GGGGS)-65-70-COOH의 컴퓨터 모델링 분석은 모 항원과 동일한 형태를 유지한다. 상기 신규의 24-AA 펩타이드를 합성하고 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 접합시켜 면역원을 형성시켜 마우스를 면역시킬 수 있으며, 후속적으로 전통적인 하이브리도마 기술을 적용하여 선별 도구로서 상기 신규의 24-AA 펩타이드 기재 ELISA를 사용하여 INab308 및 INab708을 수득할 수 있다.
96-웰 ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 구조적 에피토프와 함께 1 내지 2 ㎍/㎖의 합성 펩타이드로 코팅한다. 37 ℃에서 1 시간 동안 PBS 중의 5% 무지방 우유로 차단한 후에, 50 ㎕의 상기 하이브리도마 성장 클론의 배양 배지를 각 웰에 가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 다음 1 시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)로 표지한 100 ㎕의 염소 항-마우스 항체를 가한다. 상기 퍼옥시다제 반응은 5.5 mM o-페닐렌-다이아민 하이드로클로라이드(OPD) 및 8.5 mM H2O2를 함유하는 발색 용액에 의해 전개되었다. 흡광도를 ELISA 판독기를 사용하여 492 ㎚에서 측정한다.
2. 결과
2.1 C5a 활성에 적합한 아미노산의 확인
가능한 항체 에피토프를 구성하는 C5a 분자 내의 여러 아미노산들을 알라닌으로 돌연변이시켰다. 특히, C5a 돌연변이체는 24, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 37, 30/37 이중 돌연변이, 40, 53, 64, 65, 66, 68, 64/68, 66/68, 69, 70 및 C-del(12 개 아미노산이 C5a의 C 말단으로부터 결실되었다) 상에서의 부위 돌연변이를 포함한다. 상기 C5a 돌연변이체를 인간 전혈 세포로부터 라이소자임 방출을 유도하는 그의 능력에 대해 시험하였다(도 1).
인간 C5a에 비해 50% 초과의 생물 활성 상실을 생성시키는 C5a 부위 돌연변이가 C5a 생물 작용에 대한 중요한 부위로서 간주되었다. 따라서, 아미노산 잔기 24, 29, 31, 37, 68 및 69가 작용에 중요한 부위로서 확인되었다(도 1).
2.2 항체 INab308 및 INab708에 의해 결합된 C5a에 대한 에피토프의 특성화
인간 C5a에 대한 항체를 분비하는 2000 개의 세포 클론을 작용 분석(효소 방출)에 의해 선별하였다. 오직 2 개의 항체만이 우수한 차단 활성을 나타내었다.
이들 2 개의 항체, INab308 및 INab708을 상기 두 항체에 의해 인식된 C5a 상의 특정 아미노산에 관하여 추가로 특성화하였다.
특히, 하나 이상의 아미노산이 알라닌으로 치환된 C5a의 여러 돌연변이체를 생성시켰다. 항체 INab308 및 INab708을 이들 돌연변이체와 접촉시키고 결합 정도를 ELISA에 의해 측정하였다(상기 섹션 1.5 참조). 50% 초과(야생형 C5a에 비해)의 결합 능력의 상실을 유의수준으로 간주하였다.
상기 데이터는 INab308이 2 개의 영역, 31-37 및 68-69에 결합함을 가리킨다(도 2). 마찬가지로, INab708은 2 개의 영역, 31-37 및 68-70에 결합한다(도 3).
현저하게는, 상기 두 항체에 대해 확인된 영역들은 상기 섹션 2.1에서 C5a 작용에 대해 중요한 부위로서 확인된 4 개의 아미노산 잔기(31, 37, 68 및 69)를 포함한다.
2.3 인간 혈장 용혈 활성에 대한 항체 INab308, INab708 및 F20의 효과
총 용혈 보체가 측정(CH50)은 전통적인 보체 경로의 활성화를 측정하기 위한 통상적인 방법이다(섹션 1.6 참조).
C5a에 대한 단클론 항체(INab308, INab708 및 F20)를 약 5 μM의 농도로 인간 혈장과 미리 배양하고, 이어서 상기 CH50 분석을 수행하였다. 이들 항체 중에서, F20은 CH50 활성을 강하게 억제하는 반면, INab308 및 INab708은 영향이 없었다(도 4).
이러한 결과는 INab308 및 INab708이 C5b에 의해 매개된 보체 활성화를 방해하지 않음을 입증한다.
2.4 C5a 생물 활성에 대한 항체 INab308, INab708 및 L2B23의 효과
C5a에 대한 항체 INab308, INab708 및 L2B23의 차단 활성을 C5a-유발된 라이소자임 방출 분석(섹션 1.4 참조)에 의해 평가하였다. 항체 대 C5a의 몰 비를 1:2로 정하여 2 개의 C5a 분자-유도된 생물학적 효과에 대한 하나의 항체의 차단 활성을 평가하였다. 이들 항체는 2가 항체이다. 따라서, 상기 1:2의 몰 비를 선택함으로써, 한편으로는 상기 항체의 파라토프 및 다른 한편으로는 C5a가 동 몰 농도로 존재한다.
도 5의 데이터는 INab308 및 INab708이 C5a 생물 활성에 대해 매우 높은 차단 활성을 갖는 반면(각각 94% 및 100%), L2B23은 단지 최소의 효과만을 나타냄(약 12%)을 보인다.
2.5 인간 전혈에서 에스케리키아 콜라이-유발된 IL-8 생산에 대한 항체 INab308 및 INab708의 효과
임상 패혈증에 가까운 환경에서 항-C5a 항체의 효능을 평가하기 위해서, 전혈 중의 에스케리키아 콜라이-유발된 IL-8 생산을 측정하였다. 상기 분석을 에스케리키아 콜라이 감염 모델로서 간주할 수 있다(또한 섹션 1.7 참조).
상기 배양 중 INab308 및 INab708의 존재 하에서, IL-8 수준은 현저하게 감소된 반면(P<0.01), L2B23의 존재 하에서는 현저한 감소가 없었다(도 6).
3. 요약
본 발명의 바람직한 항체 INab308 및 INab708의 중요한 성질들을 하기 표 3에 요약한다. 본 발명에서 확인된 구조적 에피토프의 2 개의 아미노산 서열, 즉 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열 모두에 동시에 결합하지 않는 비교상 항체, 8g8, MAb 137-26, Ab11876, G57, F20, L2B23, 및 G13을 추가로 포함한다. 비교상 항체 8g8, MAb 137-26, F20, G57, L2B23, 및 G13은 이들 2 개 아미노산 서열 중 단지 하나(8g8, MAb 137-26, F20, G57, 및 G13) 또는 상이한 아미노산 서열(L2B23)에 결합한다. Ab11876의 표적 에피토프는 공지되어 있지 않다.
Figure 112019034853018-pat00001
ND: 측정 안됨; *유럽 특허 출원 제 1 878 441 A2 호에 개시된 항체와 관련된 ATCC 클론 번호 PTA-3650; **Ab11876은 ABCAM(영국 캠브리지 소재)으로부터 수득할 수 있는 단클론 마우스 항 C5/C5a 항체이다.
표 3에 도시된 바와 같이, 일부 비교 항체들(8g8, MAb 137-26)은 본 발명의 바람직한 항체, INab308 및 INab708보다 더 높은 C5a에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, INab308 및 INab708은 연구된 어떠한 비교 항체보다 더 높은 차단 활성을 나타낸다. 보다 구체적으로, INab308 및 INab708 중 각각 하나는 화학량론적 양으로, 즉 하나의 에피토프당 하나의 파라토프의 비로, 즉 하나의 표적 분자당 0.5의 항체 분자로 사용되는 경우에조차도 매우 높은 차단 활성(≥90%)을 나타낸다. 종래 기술의 항체(MAb 137-26, Ab11876)는 오직 초화학량론적 양으로 사용되는 경우에만 합리적인 차단 활성을 성취하였다. 이러한 발견은 높은 결합 친화성이 항상 높은 차단 활성과 동일시될 수 있는 것은 아님을 입증한다.
요약하면, 본 발명은 최초로, 단지 화학량론적 양으로 사용되는 경우에조차 대단히 높은 차단 활성을 나타내는 항체를 제공한다.
항체 INab308 및 INab708의 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열들을 하기 표 4에 나타낸다.
항체 INab308 및 INab708(코티아(Chothia) 분류 방식)의 CDR 및 FR 서열
INab308 INab708
중쇄:
FR1: QVQLQQSGPQLVRPGTSVKIS
(서열번호 51)
CDR1: CKASGYSFTTFWMD
(서열번호 14)
FR2: WVKQRPGQGLEWIGR
(서열번호 52)
CDR2: IDPSDSESRLDQ
(서열번호 10)
FR3: RFKDRATLTVDKSSSTVYMQLSSPTSEDSAVYY
(서열번호 53)
CDR3: CARGNDGYYGFAY
(서열번호 6)
FR4: WGQGTLVTVSSA
(서열번호 54)		 중쇄:
FR1: VQLLESGAELMKPGASVKIS
(서열번호 59)
CDR1: CKATGNTFSGYWIE
(서열번호 15)
FR2: WVKQRPGHGLEWIGE
(서열번호 60)
CDR2: ILPGSGSTNYNE
(서열번호 11)
FR3: KFKGKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYY
(서열번호 61)
CDR3: CTRRGLYDGSSYFAY
(서열번호 7)
FR4: WGQGTLVTVSA
(서열번호 62)
경쇄:
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS
(서열번호 55)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMK
(서열번호 16)
FR2: WYQQKPGQPPKLL
(서열번호 56)
CDR2: IYAASNL
(서열번호 12)
FR3: QSGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYY
(서열번호 57)
CDR3: CQQSNEDPYT
(서열번호 8)
FR4: FGGGTKLEIK
(서열번호 58)		 경쇄:
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS
(서열번호 63)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMN
(서열번호 17)
FR2: WYQQKPGQPPKLL
(서열번호 64)
CDR2: IYAASNL
(서열번호 13)
FR3: GSGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEVAATYY
(서열번호 65)
CDR3: CQQNNEDPLT
(서열번호 9)
FR4: FGAGTLLELK
(서열번호 66)
참고문헌
Figure 112019034853018-pat00002
Figure 112019034853018-pat00003
서열 목록 프리 텍스트 정보
서열번호 6 INab308 CDR3 중쇄
서열번호 7 INab708 CDR3 중쇄
서열번호 8 INab308 CDR3 경쇄
서열번호 9 INab708 CDR3 경쇄
서열번호 10 INab308 CDR2 중쇄
서열번호 11 INab708 CDR2 중쇄
서열번호 12 INab308 CDR2 경쇄
서열번호 13 INab708 CDR2 경쇄
서열번호 14 INab308 CDR1 중쇄
서열번호 15 INab708 CDR1 중쇄
서열번호 16 INab308 CDR1 경쇄
서열번호 17 INab708 CDR1 경쇄
서열번호 18 아미노산 30-38의 영역 중의 C5a의 공통 서열
서열번호 19 아미노산 66-72의 영역 중의 C5a의 공통 서열
서열번호 20 아미노산 31-37의 영역 중의 C5a의 공통 서열
서열번호 21 아미노산 67-71의 영역 중의 C5a의 공통 서열
서열번호 51 INab308 FR1 중쇄
서열번호 52 INab308 FR2 중쇄
서열번호 53 INab308 FR3 중쇄
서열번호 54 INab308 FR4 중쇄
서열번호 55 INab308 FR1 경쇄
서열번호 56 INab308 FR2 경쇄
서열번호 57 INab308 FR3 경쇄
서열번호 58 INab308 FR4 경쇄
서열번호 59 INab708 FR1 중쇄
서열번호 60 INab708 FR2 중쇄
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CDR2 light chain <400> 12 Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 CDR2 light chain <400> 13 Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu 1 5 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab308 CDR1 heavy chain <400> 14 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Phe Trp Met Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 CDR1 heavy chain <400> 15 Cys Lys Ala Thr Gly Asn Thr Phe Ser Gly Tyr Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab308 CDR1 light chain <400> 16 Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Lys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 CDR1 light chain <400> 17 Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of C5a in the region of amino acids 30-38 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> N, H, D, F, K, Y, or T <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> D, L, Y, or H <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Q, E, or K <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> A, V, or L <400> 18 Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of C5a in the region of amino acids 66-72 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> S, H, P, or N <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> H or N <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> D, N, H, P, or G <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> M, L, I, or V <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Q, L, or I <400> 19 Ser His Lys Asp Met Gln Leu 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of C5a in the region of amino acids 31-37 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> D, L, Y, or H <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Q, E, or K <400> 20 Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of C5 in the region of amino acids 67-71 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> H or N <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> D, N, H, P, or G <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> M, L, I, or V <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Q, L, or I <400> 21 His Lys Asp Met Gln 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 22 His Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 23 Ser His Lys Asp Leu Gln Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 24 Asp Asp Glu Thr Cys Glu Glu Arg Ala 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 25 Ser His Lys Asn Ile Gln Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 26 Asp Leu Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 27 Ser His Lys His Ile Gln Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 28 Asp Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5 <210> 29 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1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Tyr Glu Thr Cys Glu Glu Arg 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 41 Tyr Glu Thr Cys Glu Gln Arg 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Monodelphis domestica <400> 42 His Glu Thr Cys Glu Lys Arg 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 43 His Lys Asp Leu Gln 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 44 His Lys Asn Ile Gln 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 45 His Lys His Ile Gln 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 46 His Lys Asn Met Gln 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 His Lys Pro Val Gln 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 48 His Lys Gly Met Leu 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Canis lupus <400> 49 Asn Lys Pro Leu Gln 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Monodelphis domestica <400> 50 His Lys Pro Val Ile 1 5 <210> 51 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab308 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Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 20 25 30 Tyr <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR4 heavy chain <400> 62 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 63 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR1 light chain <400> 63 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser 20 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR2 light chain <400> 64 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 1 5 10 <210> 65 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR3 light chain <400> 65 Gly Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 1 5 10 15 Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Val Ala Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR4 light chain <400> 66 Phe Gly Ala Gly Thr Leu Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ile Ser His Lys Asp Met 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 69 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (5)

  1. (i) 서열번호 6의 중쇄 CDR3 서열, 서열번호 10의 중쇄 CDR2 서열, 서열번호 14의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 8의 경쇄 CDR3 서열, 서열번호 12의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 경쇄 CDR1 서열; 또는
    (ii) 서열번호 7의 중쇄 CDR3 서열, 서열번호 11의 중쇄 CDR2 서열, 서열번호 15의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 9의 경쇄 CDR3 서열, 서열번호 12의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 17의 경쇄 CDR1 서열
    중에서 선택된 6개의 CDR 서열 세트를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    하나의 항체 또는 항원 결합 단편이 한 분자의 C5a에 의해 유발된 생물학적 효과에 대해 80% 이상의 차단 활성을 나타내는,
    항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이
    - C5a에 대해 2 nM 이하의 Kd 값을 갖는 결합 상수를 갖는 특성;
    - 한 분자의 C5a에 의해 유발된 생물학적 효과에 대해 90% 이상의 차단 활성을 나타내는 특성;
    - 인간 혈장에서 CH50 활성을 억제하지 않는 특성; 및
    - 인간 전혈에서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 유발된 IL-8 생산을 감소시킬 수 있는 특성
    중 하나 이상의 특성을 나타내는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항체가 다클론 항체, 단클론 항체, 키메릭 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군 중에서 선택되고,
    상기 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 다이설파이드 결합된 Fv(dsFv), 단일 도메인 항체 및 단일 쇄 Fv(scFv) 항체로 이루어진 군 중에서 선택되는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는, 급성 염증, 전신 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 허혈성 심장 질병, 급성 폐 손상, 폐렴, 이식 환자의 급성 및 만성 이식편 거부, 이식편 대 숙주 반응을 비롯한 질병뿐만 아니라, 만성 유형의 염증, 신장 사구체 질병, 사구체신염, 신부전, 류마티스성 관절염, 자가면역 질병, 베크테레프병(Bechterew's disease), 루푸스형 질병, 염증성 장 질병, 크론병, 종양 성장 또는 고형 기관 암을 비롯한 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물.
  5. 삭제
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