TW202208427A - 人源化抗ｃ５ａ抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明是有關特異性結合至人類C5a之構形性表位的抗體。本發明尤其是有關人源化抗C5a抗體。本文所述抗體在醫藥組成物中用作為活性劑。該等抗體以及醫藥組成物尤其用於治療和預防涉及病理性C5a活性的疾病或病症。

Description

人源化抗C5A抗體
本發明是有關特異性結合至人類C5a之構形性表位的抗體。本發明尤其是有關人源化抗C5a抗體。本文所述抗體在醫藥組成物中用作為活性劑。該等抗體以及醫藥組成物尤其用於治療和預防涉及病理性C5a活性的疾病或病症。
C5a
C5a是其「母分子」C5的一個橫跨74個胺基酸的分裂產物，且代表著補體活化級聯的一個終點。它可以透過活化至少三個經充分描述的路徑(替代路徑，經典路徑和MBL路徑)產生。所有路徑均在C3層面匯合，形成C5-或替代性C5轉化酶，從而導致C5裂解為C5a和C5b。C5b與C6、C7，C8和多個C9分子結合，最終導致在例如細菌膜中形成孔洞(終末膜攻擊複合物，terminal Membrane Attack Complex，MAC)。當補體系統在發炎以及其他免疫和發炎性病症/疾病的情況下被活化時，會產生C5a。
在補體活化產物中，C5a是最為有效的發炎性肽之一，具有廣泛的功能(Guo and Ward 2005)。C5a經由高親和力C5a受體(C5aR和C5L2)發揮其作用(Ward 2009)。C5aR屬於具有七個跨膜區段之G蛋白偶聯受體的視紫質家族；C5L2具有類似結構，但似乎不是G蛋白偶聯的。目前咸信C5a主要透過C5a-C5aR交互作用來發揮其生物學功能，因為很少發現C5a-C5L2交互作用的生物學反應。然而，最新的報導證實也會透過C5L2活化來傳遞訊號(Rittirsch et al. 2008)。
C5aR在包括嗜中性球、嗜酸性球，嗜鹼性球和單核細胞的骨髓細胞以及許多器官(尤其是肺臟和肝臟)中的非骨髓細胞上廣泛表現，這表明C5a/C5aR信號傳導的重要性。在敗血症發作期間發生C5aR表現的廣泛上調，而在囓齒動物敗血症模型中，抗C5a或抗C5aR抗體或C5aR拮抗劑對C5a/C5aR交互作用的阻斷具有高度保護作用(Czermak et al. 1999；Huber-Lang et al. 2001；Riedemann et al. 2002)。
C5a具有多種生物學功能(Guo and Ward 2005)。C5a對嗜中性球來說是一種強有力的化學吸引物，且對單核細胞和巨噬細胞也具有趨化活性。C5a在嗜中性球中引起氧化爆發(oxidative burst)(O2 消耗)，並提高吞噬作用和顆粒酶的釋放。也已經發現到C5a是一種血管舒張劑。已經顯示C5a參與調節各種細胞類型的細胞介素表現，並提高嗜中性球上黏附分子表現的表現。高劑量的C5a可導致嗜中性球的非特異性趨化性「減敏」，從而引起廣泛的功能障礙。許多發炎性疾病可歸因於C5a的影響，包括敗血症、急性肺損傷、發炎性腸病、類風濕性關節炎與其他疾病。在敗血症的實驗環境中，嗜中性球暴露於C5a可能導致嗜中性球功能障礙和信號傳導路徑麻痺，使得NADPH氧化酶組裝有缺陷、MAPK信號級聯麻痺、氧化爆發、吞噬作用和趨化性大大降低(Guo et al. 2006；Huber-Lang et al. 2002)。胸腺細胞凋亡和嗜中性球凋亡延遲是敗血症進展的兩個重要致病事件，這取決於C5a的存在。在實驗性敗血症期間，C5a上調嗜中性球上的β2-整合素表現，促使細胞遷移至器官中，是造成多重器官衰竭(MOF)的主要原因之一。還發現到，C5a可歸因於實驗性敗血症中發生的凝血路徑活化。C5a刺激促發炎性細胞介素(諸如TNF-α、IL-1β、IL-6，IL-8和巨噬細胞遷移抑制因子(MIF))的合成以及從人類白血球釋放。考慮到補體活化是在急性發炎發作期間所發生的事件，因此C5a可能在大多數發炎性「細胞介素風暴」出現之前就發揮作用了。C5a似乎在協調和放大細胞介素網絡的性能以及全身性發炎反應症候群(SIRS)的形成中扮演著關鍵作用。
在適應性免疫之後的免疫調節網絡中，C5a影響樹突狀細胞(DC)與γδ T細胞之間的交談，且這可能導致大量產生發炎性介質，諸如IL-17 (Xu et al. 2010))。在全身性紅斑狼瘡(SLE)的致病性Th17反應的產生中，已經確定並定義了C5a的關鍵角色(Pawaria et al. 2014)。另外，據報導，C5a是Treg細胞的關鍵調節因子，其對Treg的增殖和誘導具有強大抑制作用(Strainic et al. 2013)。考慮到Treg和TH17是自體免疫疾病環境中必不可少的因素，抑制C5a信號傳導預期會顯著降低自體免疫疾病中過度活化的免疫狀態。IFX-1
IFX-1是嵌合單株IgG4抗體，其特異性結合至可溶性人類補體分裂產物C5a。IFX-1由1328個胺基酸組成，分子量約為148,472道爾頓。IFX-1的CDR和FR序列揭示於WO 2015/140304 A1的表3中，也公開於US 2017/0137499 A1中。WO 2015/140304 A1和US 2017/0137499 A1的內容以全文引用的方式併入本文。
IFX-1以重組蛋白的形式在哺乳動物CHO細胞株中表現，且最終調配於磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS＋0.05%聚山梨醇酯80)中以供靜脈內投藥。這個抗體與人類C5a的結合是透過使C5a無法結合至其對應細胞結合受體結合並與其反應，促進C5a誘導的生物學效應的高效阻斷。
進行了各種非臨床研究來評估IFX-1的藥理學和毒物學方面，這些方面可分為活體外/離體測試和活體內研究，包括食蟹猴的GLP毒物學研究(使用IFX-1)。所進行的非臨床試驗和研究均未發現IFX-1有任何毒物學或安全性問題。人類第I期試驗表明，安全實驗室參數，生命徵象和ECG參數無臨床相關的時間-或劑量相關的變化。
IFX-1的活體外分析證實，它對可溶性人類C5a具有很強的結合能力，並且具有C5a誘導的生物學效應的高阻斷活性，諸如從人類嗜中性球釋放溶菌酶或在人類全血嗜中性球中上調CD11b。一種IFX-1抗體能夠在活體外實驗環境中以接近100%效率達到中和2個C5a分子的作用。IFX-1的臨床試驗一直在進行，以測試其在數種發炎性疾病中的臨床效力。 本發明背後的技術問題
在先前技藝中已經描述過特異性結合至C5之C5a部分但不結合C5b部分的抗體(Klos et al. (1998) J. Immunol. Meth. 111: 241-252；WO 01/15731；WO 03/015819)。先前生成的抗C5a抗體對C5a誘導的生物學效應僅展現出中等的阻斷活性。因此，先前技藝的抗C5a抗體不能達到完全阻斷C5a誘導的生物學效應，或者必須以超化學計量之量使用才能達到對C5a活性有相當高的阻斷。發明人成功生產出兩種單株抗C5a抗體(命名為INab308和INab708)，即使以化學計量之量使用，對C5a誘導的生物學效應也展現出強烈阻斷活性，即每莫耳C5a 為0.5莫耳的二價抗體 (參見WO 2011/063980 A1，其內容以引用的方式併入本文)。基於單株抗體INab308，發明人開發出嵌合抗體IFX-1，其展現出相同強烈的阻斷活性(參見WO 2015/140304 A1，其內容以引用的方式併入本文)。
然而，在WO 2011/063980 A1中具體描述的兩種單株抗體INab308和INab708是鼠類抗體。WO 2015/140304 A1中描述的抗體IFX-1是嵌合抗體。因此，當投與給人類時，這些抗體可能引起不樂見的免疫學反應。
因此，考慮到在患者體內的預期臨床用途，在先前技暨中仍然需要更為類似於人類抗體但仍展現出優異C5a活性阻斷作用的抗C5a抗體。
現在，發明人成功地生產出人源化抗-C5a抗體，相較於WO 2011/063980 A1與WO 2015/140304 A1中所述的抗體，其已經大幅增進人類性，同時仍保有WO 2011/063980 A1和WO 2015/140304 A1中所述抗體的有利性質，即對C5a誘導的生物學效應展現出相同的高阻斷活性，而不影響C5b的生物學活性。
以上概述不必然描述本發明所解決的全部問題。
在第一態樣中，本發明是有關包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的抗體或其抗原結合片段， 其中該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：10的胺基酸序列(QVQLV QSGAE VKK PGA SVKV SCKASGYSFT TFWMDWVRQA PGQGLEWIGR IDPSDSESRL DQRFKDRVTM TVDKST STVY MELSSLRSED TAVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS，VH4)，或 與SEQ ID NO：10具有至少80%序列同一性的胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：10具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：20至22的CDR1H、CDR2H，以及CDR3H序列，且其中與SEQ ID NO：10具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含在胺基酸位置5的V、在胺基酸位置10的E、在胺基酸位置12的K、在胺基酸位置13的K、在胺基酸位置16的A、在胺基酸位置40的A，及/或在胺基酸位置76的T，以及 其中該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：16的胺基酸序列(DIQMTQSPSS LSA SV GD RV T IT CKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKA PKL LIYAASNLQS GVPS RFSGSG SGTDFTLT IS SLQ PEDF ATY YCQQSNEDPY TFGQ GTKLEI K，Vκ4)，或 與SEQ ID NO：16具有至少80%序列同一性的胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：16具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：23至25的CDR1L、CDR2L，CDR3L序列，且其中與SEQ ID NO：16具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含在胺基酸位置13的A、在胺基酸位置15的V、在胺基酸位置17的D、在胺基酸位置19的V、在胺基酸位置22的T、在胺基酸位置46的K、在胺基酸位置47的A、在胺基酸位置64的S、在胺基酸位置78的T、在胺基酸位置80的S、在胺基酸位置81的S、在胺基酸位置82的L、在胺基酸位置83的Q、在胺基酸位置87的F，及/或在胺基酸位置104的Q。
在第二態樣中，本發明是有關包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的抗體或其抗原結合片段， 其中該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：17的胺基酸序列(QVQLVQSGX9 E X11 KKPGASVKX20 SCKASGYSFT TFWMDWVX38 QA PGQGLEWX48 GR IDPSDSESRL DQX63 FKDRX68 TX70 TVDKSTSTVY MX82 LSSX86 X87 SED X91 AVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS)，其中X9 為A或P、X11 為L或V、X20 為I或V、X38 為K或R、X48 為I或M、X63 為K或R、X68 為A或V、X70 為L或M、X82 為E或Q、X86 為L或P、X87 為R或T，而X91 為S或T，或 如SEQ ID NO：17之具有一個，兩個或三個胺基酸取代的胺基酸序列，其中具有一個，兩個或三個胺基酸取代的該胺該基酸序列包含分別為SEQ ID NO：20至22的CDR1H、CDR2H、CDR3H序列，以及 其中該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：18的胺基酸序列(DIX3 X4 TQSPX9 S LX12 ASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GX62 PSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQX84 EDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K)，其中X3 為V或Q、X4 為L或M、X9 為A或S、X12 為A或S、X62 為I或V，而X84 為E或P，或 如SEQ ID NO：18之具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個胺基酸取代的胺基酸序列，其中具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個胺基酸取代的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：23至25的CDR1L、CDR2L、CDR3L序列。
在第三態樣中，本發明是有關一種包含以下的醫藥組成物： 如第一態樣的抗體或其抗原結合片段或如第二態樣的抗體或其抗原結合片段；以及 進一步包含一或多種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑、填充劑、黏合劑、潤滑劑、助滑劑、崩散劑、吸附劑，及/或防腐劑。
在第四態樣中，本發明是有關如第一態樣的抗體或其抗原結合片段，或如第二態樣的抗體或其抗原結合片段供醫藥之用途。
在第五態樣中，本發明是有關如第一態樣的抗體或其抗原結合片段，或如第二態樣的抗體或其抗原結合片段供治療或預防涉及病理性C5a活性之疾病或病症的用途。
本發明內容不一定說明本發明的所有特徵。從綜觀隨後的詳細說明，其他具體例將會變得至為灼然。
定義
在下面詳細說明本發明之前，應當理解，本發明不限於本文描述的特定方法學，方案和試劑，因為它們可能會有所改變。還應理解，本文所使用的術語僅出於說明特定具體例之目的，並不希望要限制本發明的範疇，本發明的範圍僅受到隨附申請專利範圍所囿限。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技術者一般所理解的相同含義。
較佳地，本文所用的術語如「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」，Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kölbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)中所述。
在通篇說明書和之後的申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含」以及諸如「包含(comprises和comprising)」的變體將被理解為暗示包括所陳述之整數或步驟或整數或步驟之群組，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群組。
在本說明書的全文中引用了一些文獻(例如：專利、專利申請案、科學出版物、製造商的說明書、操作指南、GenBank登錄號序列提交等)。本文中的任何內容均不應解釋為承認本發明無權憑藉在先發明而早於此等揭露。本文引用的某些文件的特徵在於「以引用的方式併入」。在這種併入參考文獻的定義或教示與本說明書中引用的定義或教示之間相衝突的情況下，以本說明書的文字為準。
序列：本文提及的所有序列揭示於所附序列表中，其全部內容和揭示內容是本說明書的一部分。
如本文所用，「人類C5a」是指以下74個胺基酸的肽： TLQKKIEEIA AKYKHSVVKK CCYDGACVNN DETCEQRAAR ISLGPRCIKA FTECCVVASQ LRANISHKDM QLGR       (SEQ ID NO：1)。
人類C5a的胺基酸序列可以在登錄號UniProtKB P01031 (CO5_HUMAN)下找到。術語「人類C5a」以及「hC5a」在本文中可交替使用。
如本文所用，若第一化合物(例如抗體)與第二化合物(例如抗原，諸如目標蛋白)的解離常數Kd 為1 µM或更少，則認為其「結合」至該第二化合物，解離常數Kd 較佳900 nM或更少、更佳800 nM或更少、更佳700 nM或更少、更佳600 nM或更少、更佳500 nM或更少、更佳400 nM或更少、更佳300 nM或更少、更佳200 nM或更少、甚至更佳100 nM或更少、甚至更佳90 nM或更少、甚至更佳80 nM或更少、甚至更佳70 nM或更少、甚至更佳60 nM或更少、甚至更佳50 nM或更少、甚至更佳40 nM或更少、甚至更佳30 nM或更少、甚至更佳20 nM或更少、甚至更佳10 nM或更少、甚至更佳5 nM或更少、甚至更佳4 nM或更少、甚至更佳3 nM或更少、甚至更佳2 nM或更少，以及甚至更佳1 nM或更少。
根據本發明的術語「結合」較佳地是有關特異性結合。「特異性結合」表示與結合至另一個目標相比，結合部分(例如抗體)更為強烈地結合至其特異的目標(諸如表位)。如果結合部分以比對第二目標的解離常數(Kd )更低的解離常數結合至第一目標，則與第二目標相比，其更為強烈地結合至第一目標。結合部分特異性結合之目標的解離常數(Kd )比結合部分未特異性結合之目標的解離常數較佳大於10倍，較佳大於20倍，更佳大於50倍，甚至更佳大於100倍、200倍、500倍或1000倍。
如本文所用，術語「Kd 」(通常以「mol/L」量測，有時縮寫為「M」)是指結合部分(例如抗體或其片段)與目標分子(例如抗原或其表位)之間特定交互作用的解離平衡常數。
用於測定化合物之結合親和力的方法，即用於測定解離常數Kd 的方法是技藝中具有通常技術者已知的，並且可以選自例如本技藝中已知的以下方法：基於表面電漿共振(SPR)的技術、生物層干涉法(BLI)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、流動式細胞測量術、等溫滴定熱量測定法(ITC)、分析型超速離心法、放射免疫分析(RIA或IRMA)和增強化學發光(ECL)。通常，解離常數Kd 在20℃、25℃，30℃或37℃下進行測定。如果沒有另外特別說明，則本文所述的Kd 值是在20℃下藉由SPR進行測定。
「表位」，也稱為抗原決定位(antigen determinant)，是大分子的一部分，其可被免疫系統所辯識，特別是被抗體、B細胞或T細胞所辯識。如本文所用，「表位」是能夠結合至如本文所述的化合物(例如抗體或其抗原結合片段)的大分子的部分。在本文中，術語「結合」較佳地是有關特異性結合。表位通常由分子的化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。構形性和非構形性表位的區別在於在變性溶劑存在下前者的結合喪失而不是後者的結合。
如本文所用，「構形性表位」是指由該大分子的三維結構形成的線性大分子(例如多肽)的表位。在本申請案的上下文中，「構形性表位」是「不連續表位」，即大分子(例如多肽)上的構形性表位，其由大分子的一級序列(例如，多肽的胺基酸序列)中的至少兩個個別區域所形成。換言之，如果表位由本發明抗體(或其抗原結合片段)同時結合之一級序列中的至少兩個個別區域組成，則該表位在本發明的上下文中被認為是「構形性表位」，其中這些至少兩個個別的區域被本發明抗體(或其抗原結合片段)不結合的一級序列中的一或多個區域打斷。較佳地，這樣的「構形性表位」存在於多肽上，並且一級序列中的兩個個別區域是本發明抗體(或其抗原結合片段)結合的兩個個別的胺基酸序列，其中這些至少兩個個別的胺基酸序列被本發明抗體(或其抗原結合片段)不結合的一級序列中的一或多個胺基酸序列打斷。較佳地，中斷胺基酸序列是包含抗體(或其抗原結合片段)不結合的兩個或更多個胺基酸的連續胺基酸序列。本發明抗體(或其抗原結合片段)結合的至少兩個個別的胺基酸序列就其長度而言沒有特別限制。這樣一個個別的胺基酸序列可以僅由一個胺基酸組成，只要該至少兩個個別胺基酸序列內的胺基酸總數大到足以實現抗體(或其抗原結合片段)和構形性表位之間的特異性結合即可。
「互補位(paratope)」是抗體結合至表位的部分。在本發明的上下文中，「互補位」是如本文所述抗C5a抗體(或其抗原結合片段)結合至表位的部分。
術語「抗體」通常是指包含藉由二硫鍵交互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的醣蛋白，或其抗原結合部分。術語「抗體」還包括抗體的所有重組形式，尤其是本文所述的抗體，例如在原核生物中表現的抗體、未糖基化的抗體、在真核生物(例如CHO細胞)中表現的抗體，糖基化的抗體以及任何抗原結合抗體片段和如下所述的衍生物。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH或VH )和重鏈恆定區組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL或VL )和輕鏈恆定區組成。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著更為保守的區域，稱為框架區(FR)。每條VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原交互作用的結合域。抗體的恆定區可以媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。
如本文所用，術語抗體的「抗原結合片段」(或簡稱為「結合部分」)是指保留特異性結合至抗原之能力的抗體的一或多個片段。已顯示抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來執行。術語抗體的「抗原結合部分」所含括的結合片段的實例包括：(i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH結構域組成的單價片段；(ii) F(ab')2 片段，包含在鉸鏈區由二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段、(v) dAb片段(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546)，其由VH結構域組成；(vi)分離的互補決定區(CDR)，以及(vii)兩個或更多個分離的CDR的組合，其可以視情況藉由合成連接子接合。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH是由個別的基因所編碼，但是它們可以使用重組方法藉由合成連接子而接合，從而使它們成為一條蛋白鏈，其中VL和VH區成對而形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird et al. (1988) Science 242: 423-426；與Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。這樣的單鏈抗體也意欲含括在抗體的術語「抗原結合片段」內。另一個實例是結合結構域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合至免疫球蛋白鉸鏈區多肽的結合域多肽、(ii)融合至鉸鏈區的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區，和(iii)融合至CH2恆定區的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區。結合結構域多肽可以是重鏈可變區或輕鏈可變區。結合域免疫球蛋白融合蛋白進一步揭示於US 2003/0118592和US 2003/0133939中。使用習於技藝者熟知的常規技術獲得這些抗體片段，並以與完整抗體相同的方式篩選片段的效用。「抗原結合片段」的更多實例是衍生自單個CDR的所謂微抗體。例如Heap et al., 2005描述了一種衍生自針對HIV-1之gp120被膜醣蛋白的抗體的重鏈CDR3的17個胺基酸殘基的微抗體(Heap C.J. et al. (2005)Analysis of a 17-amino acid residue, virus-neutralizing microantibody. J. Gen. Virol. 86:1791-1800)。其他實例包括小型抗體模擬物，其包含彼此融合的兩個或更多個CDR區，較佳地藉由同源框架區彼此融合。Qiu et al., 2007已描述過這樣一種小型抗體模擬物(其包含藉由同源VH FR2連接的VH CDR1和VL CDR3) (Qiu X.-Q. et al. (2007)Small antibody mimetics comprising two complementary-determining regions and a framework region for tumor targeting. Nature biotechnology 25(8):921-929)。
因此，如本文所用，術語「抗體或其抗原結合片段」是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結合位點的分子，其在以免疫特異的方式結合抗原。在廣義上，術語「抗體或其抗原結合片段」包括任何類型的免疫球蛋白分子(例如IgG、IgE、IgM、IgD，IgA和IgY)。但是，本發明的較佳免疫球蛋白分子是IgG類型。在IgG類型中，本發明的較佳免疫球蛋白分子可以來自任何類型或亞類(例如，IgG1；IgG2，較佳IgG2a和IgG2b；IgG3；或IgG4)。
可用於本發明的抗體及其抗原結合片段可以來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。因此，抗體或其片段可以來自人類、黑猩猩、囓齒動物(例如小鼠、大鼠，天竺鼠或兔子)、雞、火雞、豬、綿羊、山羊、駱駝、牛、馬、驢，貓或狗來源。就許多應用來說，尤佳的抗體是人類或鼠類來源的。適用於本發明的抗體包括嵌合分子，其中衍生自一種物種(例如人類)的抗體恆定區與衍生自另一種物種(例如小鼠)的抗原結合位點組合。在本發明最佳具體例中，抗體及其抗原結合片段包括人源化分子，其中衍生自非人類物種(例如，來自小鼠)的抗體的抗原結合位點與人類來源的恆定區和框架區組合。
如本文所舉例說明的，本發明抗體可以直接從表現抗體的融合瘤獲得，或者可以被選殖至宿主細胞(例如CHO細胞或淋巴細胞)中並重組表現。宿主細胞的更多實例是微生物(諸如大腸桿菌)和真菌(諸如酵母)。或者，它們可以在轉基因非人類動物或植物中以重組方式生產。
術語「嵌合抗體」是指那些重鏈和輕鏈的每個胺基酸序列的一部分與衍生自特定物種或屬於特定類別的抗體中的對應序列同源，而該鏈的其餘片段與另一物種或類別中的對應序列同源。通常，輕鏈和重鏈的可變區都模仿衍生自一種哺乳動物物種的抗體可變區，而恆定部分與衍生自另一種哺乳動物的抗體的序列同源。這種嵌合形式的一個明顯優點是可變區可以方便地使用已經可得自非人類宿主生物的B細胞或融合瘤與衍生自例如人類細胞製品的恆定區組合從目前已知來源衍生而來。儘管可變區具有易於製備的優點，且特異性不受來源所影響，但是當注射抗體時，人類恆定區比來自非人類來源之恆定區者更不能引起人類個體的免疫反應。但是，定義不限於該特定實例。
術語「人源化抗體」是指具有抗原結合位點的分子，該抗原結合位點基本上源自於非人類物種的免疫球蛋白，其中分子的其餘免疫球蛋白結構是以人類免疫球蛋白的結構及/或序列為基礎。抗原結合位點可包含融合至恆定域上的完整可變域，或僅嫁接到可變域中適當框架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型的或經一或多個胺基酸取代所修飾，例如被修飾成與人類免疫球蛋白更為相似。某些形式的人源化抗體保留了所有CDR序列(例如，含有來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。其他形式具有相對於原始抗體有所改變的一或多個CDR。
如Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience, 13:1619-1633中所評論的，用於使抗體人源化的不同方法是習於技藝者已知的，其內容以全文引用的方式併入本文。Almagro＆Fransson的評論文章在US 2012/0231008 A1中進行了簡要概述，該份文件是國際專利申請案WO 2011/063980 A1的進入國家階段。US 2012/0231008 A1和WO 2011/063980 A1的內容以全文引用的方式併入本文。
如本文所用，「人類抗體」包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本發明的人類抗體可包括未被人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，由活體外隨機或位點特異性誘變或活體內體細胞突變引入的突變) 。本發明的人類抗體包括從人類免疫球蛋白庫或從經一或多種人類免疫球蛋白轉基因的動物分離且不表現內源性免疫球蛋白的抗體，如例如Kucherlapati & Jakobovits的美國專利第5,939,598號中所述。
如本文所用，術語「單株抗體」是指具有單一分子組成的抗體分子的製品。單株抗體對特定表位展現出單一結合特異性和親和力。通常，單株抗體是由融合瘤產生的，該融合瘤包括與永生化細胞融合的B細胞(得自非人類動物，例如小鼠)。
如本文所用，術語「重組抗體」包括藉由重組方式製備、表現，創造或分離的所有抗體，諸如(a)從相對於免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或由其製備之融合瘤分離的抗體；(b)從被轉形成表現抗體的宿主細胞分離的抗體，例如從轉染瘤分離的抗體；(c)從重組組合抗體庫分離的抗體；和(d)藉由涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的其他方式製備、表現，創造或分離的抗體。
如本文所用，術語「轉染瘤」包括表現抗體的重組真核宿主細胞，諸如CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞，植物細胞或真菌，包括酵母細胞。
如本文所用，「異源性抗體」是就產生這種抗體的轉基因生物所定義的。這個術語是指具有與在不由轉基因生物組成的生物中發現的胺基酸序列或編碼核酸序列相對應的胺基酸序列或編碼核酸序列的抗體，該抗體通常衍生自轉基因生物以外的物種。
如本文所用，「異源雜合抗體」是指具有不同生物來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠類輕鏈締合的人類重鏈的抗體是異源雜合抗體。
因此，「抗體及其抗原結合片段」通常包括但不限於多株、單株、單價、雙特異性、異結合物、多特異性、重組、異源、雜合、嵌合、人源化(特別是CDR移植)、去免疫的或人類抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、由Fab表現庫產生的片段、Fd、Fv、二硫鍵連接的Fv (dsFv)、單鏈抗體(例如scFv)、雙功能抗體或四功能抗體(Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 6444-6448)、奈米抗體(也稱為單域抗體)、抗個體基因型(抗-Id)抗體(包括例如針對本發明抗體的抗-Id抗體)和以上任一者的表位結合片段。
本文所述的抗體較佳是經分離的。如本文所用，「經分離的抗體」意指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體；例如，特異性結合至C5a的經分離抗體基本上不含特異性結合C5a以外之抗原的抗體。然而，特異性結合至人類C5a的表位，同功型或變體的經分離抗體可能與其他相關抗原具有交叉反應性，例如來自其他物種的相關抗原(例如C5a物種同源物，諸如大鼠C5a)。此外，經分離抗體可以基本上不含其他細胞物質及/或化學物質。如本文所用，「經分離抗體的組合」是有關具有不同特異性並且以明確限定組成所組合的抗體。
如本文所用，術語「天然存在」若應用於物體是指可以在自然界中發現物體的事實。例如，存在於生物(包括病毒)中之可由自然界分離出來，且在實驗室中未經人為有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在。
可以例如基於所涉及的胺基酸殘基的極性、電荷、大小、溶解度、疏水性，親水性及/或兩親性質的相似性來進行「保守取代」。胺基酸可分為以下六個標準胺基酸群： (1) 疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile： (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈方位的殘基：Gly、Pro；以及 (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所用，「保守取代」定義為胺基酸與上面顯示六個標準胺基酸群之同一群中列出的另一個胺基酸交換。例如，Asp交換成Glu在經這樣修飾的多肽中保留了一個負電荷。另外，基於甘胺酸和脯胺酸破壞α-螺旋的能力，它們可以彼此取代。上述六群中的某些較佳保守取代是以下子群中的交換：(i) Ala、Val，Leu和Ile；(ii) Ser和Thr；(ii) Asn和Gln；(iv) Lys和Arg；以及(v) Tyr和Phe。有鑑於已知的遺傳密碼子，以及重組與合成DNA技術，習於技藝的科學家可以輕鬆構建編碼保守胺基酸變體的DNA。
如本文所用，「非保守取代」或「非保守胺基酸交換」被定義為某一個胺基酸與上示六個標準胺基酸群(1)至(6)的不同群中列出的另一個胺基酸交換。
核苷酸和胺基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以經由序列比對來確定。可以用數種本技藝中已知的演算法來進行此演算法，較佳使用Karlin and Altschul的數學演算法(Karlin & Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)、使用hmmalign (HMMER package)或使用CLUSTAL演算法(Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994)Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)或CLUSTALW2演算法(Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics , 23, 2947-2948)。
可以使用例如BLAST，BLAT或BlastZ (或BlastX)來計算序列同一性(序列匹配)的等級。將類似的演算法併入Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410的BLASTN與BLASTP程式中。BLAST蛋白質檢索是利用BLASTP程式執行的，例如，該程式可在以下網站上找到： http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome 所使用的較佳演算法參數為預設參數，因為它們是在所指網站上所設定的： 預期閾值＝10，字長＝3，查詢範圍內的最大匹配項＝0，矩陣＝BLOSUM62，空位罰分＝存在：11 擴展：1，成分調整＝條件成分分數矩陣調整以及非冗餘蛋白質序列數據庫(nr)。
為了獲得用於比較目的之空位比對，如Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402中所述，採用Gapped BLAST。當採用BLAST和Gapped BLAST程式時，使用各個程式的預設參數。序列匹配分析可以藉由已確立的同源性作圖技術來補充，例如Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62)或馬可夫隨機場。
當在本申請中提及序列同一性的百分比時，若無另外特別說明，則相對於所指參考序列的全長來計算這些百分比。例如，表達方式「與SEQ ID NO：XYZ具有至少80%序列同一性的胺基酸序列」表示相對於SEQ ID NO：XYZ的總長度計算出序列同一性百分比。
如本文所用，「生物活性」是指多肽可展現出的任何活性，包括但不限於：酶促活性；對另一個化合物的結合活性(例如結合至另一個多肽，特別是結合至受體，或結合至核酸)；抑制活性(例如酶抑制活性)；活化活性(例如酶活化活性)；或毒性作用。有關多肽的變體和衍生物，變體或衍生物不需要展現出以與親本多肽相同程度的此一活性。如果變體展現出的活性程度為親本多肽之相關活性的至少10% (例如至少20%、至少30%，至少40%或至少50%)，則在本申請案上下文中將其視為變體。同樣地，如果衍生物展現出的活性程度為親本多肽之相關活性的至少10%，則在本申請案上下文中將其視為衍生物。在本發明上下文中，特別相關的「生物活性」是對由胺基酸序列NDETCEQRA (SEQ ID NO：2)和SHKDMQL (SEQ ID NO：3)形成之人類C5a的構形性表位的結合活性。較佳地，在本發明的上下文中，相關的「生物活性」是對由胺基酸序列DETCEQR (SEQ ID NO：4)和HKDMQ (SEQ ID NO：5)形成之人類C5a的構形性表位的結合活性。甚至更佳地，在本發明的上下文中，相關的「生物活性」是對由胺基酸序列DETCEQR (SEQ ID NO：4)和KDM形成之人類C5a的構形性表位的結合活性。用於測定結合活性的分析是技藝中具有通常技術者已知的，並且包括ELISA和表面電漿共振分析。
如本文所用，「患者」表示可能受益於使用本文所述抗C5a抗體治療的任何哺乳動物或鳥類。較佳地，「患者」選自由實驗動物(例如小鼠或大鼠)、家畜(包括例如天竺鼠、兔子、雞、火雞、豬、綿羊、山羊、駱駝、牛、馬、驢，貓或狗)或靈長類動物(包括猴子，例如非洲綠猴、黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩)和人類組成之群組。尤佳地，「患者」是人類。術語「患者」和「待治療的個體」(或簡稱為「個體」)在本文中可交替使用。
如本文所用，疾病或病症的「治療(treat，treating或treatment)」表示完成以下一項或多項：(a)降低病症的嚴重程度及/或持續時間；(b)限制或預防待治療疾病的特徵症狀發展；(c)抑制待治療病症的特徵症狀惡化；(d)限制或預防先前有病症的患者的病症復發；以及(e)限制或預防先前有病症症狀的患者的症狀復發。
如本文所用，疾病或病症的「預防(prevent、preventing，prevention或prophylaxis)」表示防止個體發生病症持續某個時間量。例如，如果將本發明抗體(或其抗原結合片段)以預防疾病或病症為目的投與給個體，則至少在投與當天，並且較佳地在投與當天後一或多天(例如1到30天；或2到28天；或3到21天；或4到14天；或5到10天)，防止該疾病或病症發生。
如本文所用，「投與」包括活體內投與，以及離體直接投與至組織(諸如靜脈移植物)。
根據本發明的「醫藥組成物」可以以組合物形式存在，其中不同的活性成分和稀釋劑及/或載劑彼此混合，或者可以採取組合製品的形式，其中活性成分以部分或完全不同的形式存在。這種組合或組合製品的一個實例是部件套組。
「有效量」是足以達到預期目的之治療劑之量。給定治療劑的有效量將隨諸如藥劑的性質、投藥路徑，接受治療劑的個體的身材和物種以及投藥目的而改變。每種個別情況下的有效量可以由習於技藝者根據本技藝中已確立的方法憑經驗來決定。
若上下文沒有另外說明，則術語「活性劑」是指本發明的抗體和本發明的抗原結合片段。術語「活性劑」和「治療劑」在本文中可交替使用。
如本文所用，術語「輔助療法」是指一種組合療法，其中向患者投與至少兩種不同藥物。可以將這些至少兩種不同藥物調配成含有兩種藥物的單一醫藥組成物。或者，可以將每種藥物調配成單獨的醫藥組成物，並且將醫藥組成物分別(例如在不同的時間點及/或藉由不同的投與路徑)投與給患者。在這個後者選項中，可以以部件套組的形式提供(至少)兩種不同藥物。
「醫藥上可接受的」表示經聯邦或州政府的監管機構批准或在美國藥典或其他公認的藥典中列出的用於動物(尤其是人類)。
如本文所用，術語「載劑」是指與治療劑一起投與的稀釋劑、佐劑，賦形劑或媒劑。這樣的醫藥載劑可以是無菌液體，諸如在水中的鹽水溶液和油，油包括石油、動物，植物或合成來源的，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油與類似物。當靜脈內投與醫藥組成物時，鹽水溶液是較佳的載劑。鹽水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液體載劑，特別是用於可注射溶液。合適的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水，乙醇和類似物。如果需要的話，該組合物還可含有少量的濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以採溶液、懸浮劑、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、散劑，緩釋調配物與類似物形式。該組合物可以與傳統黏合劑和載體(諸如三酸甘油酯)一起調配成栓劑。本發明化合物可以調配成中性或鹽形式。醫藥上可接受的鹽包括與游離胺基形成的鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸，酒石酸等的彼等；以及與游離羧基形成的鹽，諸如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸，普魯卡因等的彼等。合適醫藥載劑的實例描述於「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」 22nd edition, Loyd V. Allen Jr. et al. (eds.), Pharmaceutical Press, 2012。這樣的組合物將含治療有效量的化合物，較佳呈純化的形式，與適量載劑一起提供合適投與給患者的形式。該調配物應適合於投藥模式。
在分子生物學、細胞生物學，蛋白質化學和抗體技術的領域中普遍已知和實施的方法在持續更新的出版物「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 (Sambrook et al., Cold Spring Harbor)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons)；「Current Protocols in Protein Science」 (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons)；「Current Protocols in Cell Biology」 (J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons)以及「Current Protocols in Immunology」 (J. E. Colligan et al., Eds., Wiley & Sons)中有完整描述。與細胞培養以及培養基有關的已知技術描述於「Large Scale Mammalian Cell Culture (D. Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148-153, 1997)；「Serum free Media」 (K. Kitano, Biotechnol. 17:73-106, 1991)；以及「Suspension Culture of Mammalian Cells」 (J.R. Birch et al. Bioprocess Technol. 10:251-270, 1990)。發明的具體例
現在將進一步說明本發明。在以下段落中，更為詳細地定義了本發明的各種態樣。除非明確相反地指出，否則以下定義的每個態樣可以與任何其他一或多個態樣組合。特別地，指示為較佳或有利的任何特徵可以與指示為較佳或有利的任何其他一或多個特徵組合。
在第一態樣中，本發明有關包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的抗體或其抗原結合片段， 其中該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：10的胺基酸序列(QVQLV QSGAE VKK PGA SVKV SCKASGYSFT TFWMDWVRQA PGQGLEWIGR IDPSDSESRL DQRFKDRVTM TVDKST STVY MELSSLRSED TAVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS，VH4)，或 與SEQ ID NO：10具有至少80%序列同一性(較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、甚至更佳至少98%，或最佳至少99%序列同一性)的胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：10具有至少80% (至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%)序列同一性的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：20至22的CDR1H、CDR2H，以及CDR3H序列，且其中與SEQ ID NO：10具有至少80% (至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%)序列同一性的該胺基酸序列包含在胺基酸位置5的V、在胺基酸位置10的E、在胺基酸位置12的K、在胺基酸位置13的K、在胺基酸位置16的A、在胺基酸位置40的A，及/或在胺基酸位置76的T，以及 其中該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：16的胺基酸序列(DIQMTQSPSS LSA SV GD RV T IT CKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKA PKL LIYAASNLQS GVPS RFSGSG SGTDFTLT IS SLQ PEDF ATY YCQQSNEDPY TFGQ GTKLEI K，Vκ4)或 與SEQ ID NO：16具有至少80%序列同一性(較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、甚至更佳至少98%，或最佳至少99%序列同一性)的胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：16具有至少80% (至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%)序列同一性的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：23至25的CDR1L、CDR2L，CDR3L序列，且其中與SEQ ID NO：16具有至少80% (至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%)序列同一性的該胺基酸序列包含在胺基酸位置13的A、在胺基酸位置15的V、在胺基酸位置17的D、在胺基酸位置19的V、在胺基酸位置22的T、在胺基酸位置46的K、在胺基酸位置47的A、在胺基酸64位置的S、在胺基酸位置78的T、在胺基酸位置80的S、在胺基酸位置81的S、在胺基酸位置82的L、在胺基酸位置83的Q、在胺基酸位置87的F，及/或在胺基酸位置104的Q。
在第一態樣的一個較佳具體例中，與SEQ ID NO：10具有至少80% (較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、甚至更佳至少98%，或最佳至少99%)序列同一性的胺基酸序列在所指位置處包含以下七個胺基酸中的至少四個(較佳至少5個、更佳至少6個、最佳7個)： -        胺基酸位置5處的V， -        胺基酸位置10處的E， -        胺基酸位置12處的K， -        胺基酸位置13處的K， -        胺基酸位置16處的A， -        胺基酸位置40處的A，或 -        胺基酸位置76處的T。
在第一態樣的一個較佳具體例中，與SEQ ID NO：16具有至少80% (較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、甚至更佳至少98%，或最佳至少99%)序列同一性的胺基酸序列在所指位置處包含以下十五個胺基酸中的至少八個(較佳至少9個、更佳至少10個、更佳至少11個、甚至更佳至少12個、甚至更佳至少13個、甚至更佳至少14個，最佳15個)： -        胺基酸位置13處的A， -        胺基酸位置15處的V， -        胺基酸位置17處的D， -        胺基酸位置19處的V， -        胺基酸位置22處的T， -        胺基酸位置46處的K， -        胺基酸位置47處的A， -        胺基酸位置64處的S， -        胺基酸位置78處的T， -        胺基酸位置80處的S， -        胺基酸位置81處的S， -        胺基酸位置82處的L， -        胺基酸位置83處的Q， -        胺基酸位置87處的F，或 -        胺基酸位置104處的Q。
在第一態樣的一個較佳具體例中，與SEQ ID NO：10具有至少80% (較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、甚至更佳至少98%，或最佳至少99%)序列同一性的胺基酸序列在所指位置處包含以下七個胺基酸中的至少四個(較佳至少5個、更佳至少6個、最佳7個)： -        胺基酸位置5處的V， -        胺基酸位置10處的E， -        胺基酸位置12處的K， -        胺基酸位置13處的K， -        胺基酸位置16處的A， -        胺基酸位置40處的A，或 -        胺基酸位置76處的T； 且視情況包含1，2或3個胺基酸取代，較佳保守取代，位在SEQ ID NO：10的胺基酸位置1至4或6至9處；以及 與SEQ ID NO：16具有至少80% (較佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少95%、更佳至少96%、更佳至少97%、甚至更佳至少98%，或最佳至少99%)序列同一性的胺基酸序列在所指位置處包含以下十五個胺基酸中的至少八個(較佳至少9個、更佳至少10個、更佳至少11個、甚至更佳至少12個、甚至更佳至少13個、甚至更佳至少14個，最佳15個)： -        胺基酸位置13處的A， -        胺基酸位置15處的V， -        胺基酸位置17處的D， -        胺基酸位置19處的V， -        胺基酸位置22處的T， -        胺基酸位置46處的K， -        胺基酸位置47處的A， -        胺基酸位置64處的S， -        胺基酸位置78處的T， -        胺基酸位置80處的S， -        胺基酸位置81處的S， -        胺基酸位置82處的L， -        胺基酸位置83處的Q， -        胺基酸位置87處的F，或 -        胺基酸位置104處的Q； 且視情況包含1，2或3個胺基酸取代，較佳保守取代，位在SEQ ID NO：16的胺基酸位置1至10處。
在第二態樣中，本發明有關包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的抗體或其抗原結合片段， 其中該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：17的胺基酸序列(QVQLVQSGX9 E X11 KKPGASVKX20 SCKASGYSFT TFWMDWVX38 QA PGQGLEWX48 GR IDPSDSESRL DQX63 FKDRX68 TX70 TVDKSTSTVY MX82 LSSX86 X87 SED X91 AVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS)，其中X9 為A或P、X11 為L或V、X20 為I或V、X38 為K或R、X48 為I或M、X63 為K或R、X68 為A或V、X70 為L或M、X82 為E或Q、X86 為L或P、X87 為R或T，而X91 為S或T，或 如SEQ ID NO：17之具有一個，兩個或三個胺基酸取代的胺基酸序列，其中具有一個，兩個或三個胺基酸取代的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：20至22的CDR1H、CDR2H、CDR3H序列，以及 其中該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：18的胺基酸序列(DIX3 X4 TQSPX9 S LX12 ASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GX62 PSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQX84 EDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K)，其中X3 為V或Q、X4 為L或M、X9 為A或S、X12 為A或S、X62 為I或V，而X84 為E或P，或 如SEQ ID NO：18之具有一個、兩個、四個、五個、六個或七個胺基酸取代的胺基酸序列，其中具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個胺基酸取代的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：23至25的CDR1L、CDR2L、CDR3L序列。
在第一或第二態樣的一個具體例中，該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成：VH1至VH5 (SEQ ID NO：7至11)；及/或該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成：Vκ1至Vκ4 (SEQ ID NO：13至16)。
在第一或第二態樣的一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段包含： a)        包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VH域：SEQ ID NO：10的胺基酸序列(VH4)；以及包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VL域：SEQ ID NO：16的胺基酸序列(Vκ4)，或 b)       包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VH域：SEQ ID NO：11的胺基酸序列(VH5)；以及包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VL域：SEQ ID NO：15的胺基酸序列(Vκ3)。
在第一或第二態樣的一個具體例中，該抗體為人源化抗體。
在第一或第二態樣的一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段進一步包含恆定域。在第一或第二態樣的一個具體例中，該恆定域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成：SEQ ID NO：19的胺基酸序列(IgG4 WT恆定)， 其中如SEQ ID NO：19的該胺基酸序列視情況包含下列胺基酸交換中的一或多個： -        胺基酸交換S108P； -        胺基酸交換T130Q與M308L； -        胺基酸交換M132Y、S134T，與T136E。
在第一或第二態樣的一個具體例中，抗體的抗原結合片段選自由以下組成之群組：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fd片段、Fv片段、二硫鍵連接的Fv (dsFv)，單域抗體和單鏈Fv (scFv)抗體。
在第一或第二態樣的一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段展現下列性質中的一或多者： -        該抗體或該其抗原結合片段具有與C5a的結合常數，其中Kd 值為10 nM或更小(例如9 nM或更小；8 nM或更小、7 nM或更小、6 nM或更小、5 nM或更小、4 nM或更小，3 nM或更小或2 nM或更小)； -        就由一分子C5a引起的生物學效應，該抗體或該其抗原結合片段展現至少75%阻斷活性； -        該抗體或該其抗原結合片段在人類血漿中不抑制CH50活性； -        該抗體或該其抗原結合片段在人類全血中能夠減少大腸桿菌誘發的IL-8產生。 -        相較於IFX-1，該抗體或該其抗原結合片段的免疫原性降低。
下面實例中顯示用於測定相對免疫原性的一個方法，即ADA篩選分析。縮寫ADA是指抗-藥物抗體(anti-drug antibodies)。
在第一或第二態樣的一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段結合至由C5a之胺基酸序列NDETCEQRA (SEQ ID NO：2)和SHKDMQL (SEQ ID NO：3)形成的構形性表位， 其中該抗體或其抗原結合片段結合至SEQ ID NO：2之胺基酸序列內的至少一個胺基酸，並結合至SEQ ID NO：3之胺基酸序列內的至少一個胺基酸。
在第一或第二態樣的又一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段結合至由C5a之胺基酸序列DETCEQR (SEQ ID NO: 4)和HKDMQ (SEQ ID NO: 5)形成的構形性表位， 其中該抗體或其抗原結合片段結合至SEQ ID NO：4之胺基酸序列內的至少一個胺基酸，並結合至SEQ ID NO：5之胺基酸序列內的至少一個胺基酸。
在第一或第二態樣的又一個具體例中，該抗體或其抗原結合片段結合至由C5a之胺基酸序列DETCEQR (SEQ ID NO: 4)和KDM形成的構形性表位， 其中該抗體或其抗原結合片段結合至SEQ ID NO：4之胺基酸序列內的至少一個胺基酸，並結合至KDM之胺基酸序列內的至少一個胺基酸。
在第三態樣中，本發明是有關一種醫藥組成物，其包含： 如第一態樣之抗體或其抗原結合片段，或如第二態樣之抗體或其抗原結合片段；並 進一步包含一或多種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑、填充劑、黏合劑、潤滑劑、助滑劑、崩散劑、吸附劑，及/或防腐劑。
在第四態樣中，本發明是有關如第一態樣之抗體或其抗原結合片段，或如第二態樣之抗體或其抗原結合片段供醫藥之用途。
在第五態樣中，本發明是有關如第一態樣之抗體或其抗原結合片段，或如第二態樣之抗體或其抗原結合片段，供治療或預防涉及病理性C5a活性之疾病或病症的用途。
在第五態樣的一個具體例中，該疾病或病症選自由以下組成之群組： -        自體免疫病症， -        發炎性病症、自體發炎性病症或相關病況， -        心血管或腦血管病症， -        細菌或病毒感染， -        神經退化性病症或相關疾病，以及 -        癌症或癌前病況。
在第五態樣的一些具體例中，病毒感染為HIV或AIDS。實例
提出以下實例向所屬技術領域具有通常知識者提供有關如何製備和使用本發明的化合物，組合物和方法的完整揭示和說明，且無意限制發明人所視為的發明範疇。已經盡力確保所使用數字的準確性，但是應考慮一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，否則分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，而壓力是大氣壓或接近大氣壓。實例 1 ：產生衍生自 IFX-1 的完全人源化抗 C5a 抗體 (IFX-2 殖株 )
這個實例詳細說明操作，其中使用複合人類抗體™ (Composite Human Antibody™)技術，使用編碼嵌合抗體IFX-1 (VH0/Vκ0)的V區基因序列來構建一系列的完全人源化抗體。所設計的重鏈與輕鏈可變區基因被分別選殖至編碼人類IgG4重鏈恆定域(參見SEQ ID NO：19，但具有S108P胺基酸交換)和人類κ輕鏈恆定域的載體中。在其他出版物中，有時將S108P胺基酸交換稱為S241P胺基酸交換(使用全長人類IgG4的Kabat編號)。嵌合抗體和人源化抗體在HEK EBNA細胞中瞬時表現，並經蛋白質A純化。方法與結果 設計複合人類抗體 ™ 可變區序列
使用Swiss PDB生產IFX-1抗體V區的結構模型並進行分析，以識別V區中重要的「限制性」胺基酸，這些胺基酸可能對抗體的結合性質不可或缺。CDR中所含的大多數殘基與許多框架殘基一起被認為是重要的。IFX-1的VH和Vκ序列包含典型框架殘基，且CDR 1、2和3模體與許多鼠類抗體相當。
根據以上分析，認為可以廣泛地創造IFX-1的複合人類序列，以用於CDR之外的替代殘基，但是在CDR序列內僅具有狹窄的可能殘基選單。初步分析指明，可以將來自幾個人類抗體的對應序列片段進行組合，以創造出與鼠類序列相似或相同的CDR。關於CDR之外和側接CDR的區域，鑑定出廣泛篩選的人類序列片段是新穎人源化V區的可能組分。CD4+ T 細胞表位迴避 (CD4+ T Cell Epitope Avoidance)
基於結構分析，篩選了可用於創造IFX-1人源化變體的大量初步序列片段組，並使用iTope™技術進行分析，供用於結合至人類MHC第II類等位基因的肽進行計算機分析(Perryet al New Approaches to Prediction of Immune Responses to Therapeutic Proteins during Preclinical Development (2008). Drugs R D 9 (6): 385-396)，並使用已知抗體序列相關T細胞表位的TCED™ (Brysonet al Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins (2010). Biodrugs 24 (1):1-8)。丟棄被鑑定為人類MHC第II類重要非人類生殖系結合物或對TCED™評定為重要命中的序列片段。這導致片段組減少，並且如上所述，再次分析這些片段的組合以確保片段之間的接合不含潛在的T細胞表位。將選定的序列片段組裝成完整V區序列，其沒有明顯的T細胞表位。接著挑出五條重鏈(VH1至VH5)和四條輕鏈(Vκ1至Vκ4)序列用於基因合成並在哺乳動物細胞中表現。VH1至VH5的胺基酸序列在序列表中分別顯示為SEQ ID NO：7至11。Vκ1至Vκ4的胺基酸序列在序列表中分別顯示為SEQ ID NO：13至16。構建嵌合抗體和人源化變體
用側接限制酶位點合成IFX-1 (VH0 (SEQ ID NO：6)和Vκ0 (SEQ ID NO：12))的VH和Vκ序列及其人源化變體，以供選殖到Abzena的pANT表現載體系統分別用於人類IgG4 (S241P)重鏈和κ輕鏈。VH區被選殖到Mlu I和Hind III限制位點之間，而Vκ區被選殖到BssH II和BamH I限制位點之間。藉由定序確認所有構建體。抗體的表現及純化
嵌合IFX-1(VH0/Vκ0)，兩個對照抗體(VH0/Vκ1，VH1/Vκ0)與複合IgG4 (S241P) VH和Vκ鏈的組合(共23對，表1)使用PEI轉染方法瞬時轉染到HEK EBNA貼壁細胞(LGC Standards, Teddington, UK)中，並在轉染後培育歷時7天。藉著ELISA測定上清液抗體效價，並且觀察到相較於其他變體，含有VH1的變體顯示表現始終較差(數據未顯示)。表 1. 藉由瞬時轉染產生(打叉框)產生的抗體的彙整表，包括嵌合(VH0/Vκ0)，兩個對照人源化抗體(VH1/Vκ0和VH0/Vκ1)以及20個IFX-1複合人類抗體™變體。
  VH0 VH1 VH2 VH3 VH4 VH5
Vκ0 X X        
Vκ1 X X X X X X
Vκ2   X X X X X
Vκ3   X X X X X
Vκ4   X X X X X
抗體(不含表現差的VH1變體)是由細胞培養物上清液在蛋白質A瓊脂糖管柱(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)上進行純化、經緩衝交換至1×PBS pH 7.2，並透過OD280nm 使用消光係數(Ec(0.1%) )基於預測的胺基酸序列進行定量。使用SDS-PAGE藉由加載1 μg各抗體至凝膠上分析抗體且觀察對應於典型抗體外觀的蛋白帶(數據未示出)。實例 2 ：不同的 IFX-2 殖株與親本抗體 IFX-1 的比較 材料及試劑
關於CD11b分析： 。  ACD，Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)，Cat. No. C3821-50ML 。  流式細胞儀的試劑(全為BD Bioscience, NJ, USA) •   FACS Flow Sheat Fluid，Cat. No. 342003 •   FACS Shutdown溶液，Cat. No. 334224 •   FACS Clean溶液，Cat. No. 340345 •   大鼠抗小鼠CD11b:FITC，Cat. No. 553310，0.5 mg/mL •   10×溶解液，BD Bioscience (NJ, USA)，Cat. No. 349202→1:10稀釋於AnalaR水中 。  HBSS，Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)，Cat. No. 14025-050 。  FBS，Invitrogen (CA, USA)，Cat. No. 10099133→熱不活化：56℃，30 min 。  偶氮化鈉，Merck (Darmstadt, Germany)，Cat. No. 1.06688.0250 。  重組人類C5a (rhC5a)，Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)，Cat. No. C5788-.1MG，在大腸桿菌中表現，純度：~95%，溶解於無菌AnalaR水中 。  染色緩衝液(SB-緩衝液)：1%熱不活化FBS + 0.1%偶氮化鈉於1× PBS中 。  健康捐贈者的人類血液(即用)，含有12% ACD
關於基於C5a的PK ELISA： 。  AnalaR水，VWR International (Darmstadt, Germany)，Cat. No. 102923C 。  重組人類C5a (rhC5a)，Hycult Biotech (Uden, The Netherlands)，Cat. No. HC2101，在大腸桿菌中表現，溶解於無菌AnalaR水中 。  rhC5a去精胺酸衍生物(rhC5aDArg)，Hycult Biotech (Uden, The Netherlands)，Cat. No. HC2102，在大腸桿菌中表現，溶解於無菌AnalaR水中 。  IFX-1，抗人類C5a抗體用作為對照，InflaRx (Jena, Germany)，10 mg/mL於PBS ＋ 0.05% Tween80中 。  小鼠抗人類IgG4:HRP，AbD Serotec (Puchheim, Germany)，Cat. No. MCA2098P，1 mg/mL 。  Na2 CO3 ，Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany)，Cat. No. 71350 (Sigma, WI, USA, Cat. No. 31432) 。  NaHCO3 ，VWR International (Darmstadt, Germany)，Cat. No. L1730 。  NaN3 ，VWR International, (Darmstadt, Germany)，Cat. No. 1.06688.0100 。  PBS粉，Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany)，Cat. No. P5368-10PAK→1袋溶解於1000 mL去離子水中 。  Tween 20，Sigma-Aldrich, (Taufkirchen, Germany)，Cat. No. P1379-25ML 。  BSA，Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany)，Cat. No. A7030-100G 。  塗覆緩衝液：1.59 g Na2 CO3 ＋ 2.93 g NaHCO3 ＋ 0.2 g NaN3 於1000 mL AnalaR水中，pH 9.6 。  洗滌緩衝液：1× PBS ＋ 0.05% Tween 20 。  分析稀釋液：3% BSA於1× PBS ＋ 0.05% Tween 20 (3% BSA/PBST)中 。  TMB受質(受質溶液C)，BioLegend/Biozol (Heidelberg, Germany)，Cat. No. BLD-78105 。  終止溶液：硫酸(Sigma-Aldrich，Cat. No. 258105-100ML) 1:10稀釋於AnalaR水中
關於血漿溶血活性(CH50)： 。  AnalaR水，VWR International (Darmstadt, Germany)，Cat. No. 102923C 。  Complement CH50分析，Haemoscan (Groningen, Netherlands)，Cat. No. K002 。  健康人類血漿池，huPP-013，內部製品方法 基於 rhC5a 的 ELISA
有關ELISA，將100 µL rhC5a (1 µg/mL)在4℃下塗覆於96孔ELISA盤上過夜。洗滌盤(5×)，並在37℃下用200 μL阻斷緩衝液阻斷歷時1小時。洗滌步驟(5×)後，將250 ng/mL – 3.91 ng/mL的2倍連續稀釋IFX殖株添加到經C5a塗覆的孔。在37°C下培育2小時以及洗滌步驟(5×)後，於37°C下施加0.04 µg/mL HRP標記的抗人類IgG4抗體歷時1 h，以偵測結合的IFX殖株。為了顯色，洗滌(5×)後添加100 µL TMB受質，並在室溫下培育歷時5分鐘。用100 µL終止溶液終止顯色反應。顯色反應後30分鐘內，使用讀盤儀在450 nm處讀取吸光度。原始數據進行空白扣除。血漿溶血活性 (CH50)
總溶血補體效價(CH50)是用來決定經典補體路徑活化的一種常規方法。簡言之，透過離心從新鮮綿羊全血製備綿羊紅血球(sRBC)，並用抗sRBC抗體予以致敏。將含有IFX殖株的健康志願者的血漿樣品進行連續稀釋，並與經致敏的sRBC在37℃下培育30分鐘。培育後，將混合物離心，並藉由測量在450 nm下被釋放到上清液的血紅素的吸光度來定量溶血程度。透過檢查測試血漿樣品的不同稀釋液溶解經致敏sRBC的能力來測定補體活性之量。CD11b 效能分析
用16.7 nM rhC5a刺激人類全血。為了測試IFX-1和IFX-2殖株對經rhC5a誘導的CD11b上調的阻斷活性，將該等抗體稀釋至最終濃度Ag：Ab比例為1：1。單獨用緩衝液培育的血液(HBSS對照)作為未受刺激條件來評估基線CD11b表現。使用僅含IFX抗體的血液可排除該抗體對人類血液的抑制或刺激作用。將混合的樣品在37℃下培育20分鐘，以誘導C5a媒介的CD11b上調。之後，將FITC結合的抗小鼠CD11b抗體與樣品在冰上進一步培育歷時30分鐘，以將顆粒球表面上的CD11b染色。透過流式細胞儀捕獲螢光信號。統計分析
使用GraphPad PRISM® V7.05進行圖表和統計分析。結果 與 IFX-1 相比， IFX-2 殖株充分平均地結合至 C5a
為了對IFX-2殖株與C5a的結合進行特徵鑑定，採用了基於rhC5a的ELISA平台。將範圍為3.91 ng/mL – 250 ng/mL的12× IFX-2和1× IFX-1 (VH0Vk0)殖株用作為樣品，施加至經1 µg/mL rhC5a塗覆的96孔盤上。然後用0.04 µg/mL的HRP結合抗人類IgG4 mAb偵測受到C5a捕獲的IFX殖株。結合至C5a的IFX抗體越多，則顯露出的化學發光信號越強。如圖1中所示，所有施加濃度範圍內的測試抗體均以可相比擬的劑量依賴性方式結合至塗覆的rhC5a。
在ABZENA中進行類似的基於ELISA的分析，以定量IFX殖株在C5a結合時的EC50 。在0-100 ng/mL的範圍內，所有IFX殖株均表現出與C5a的結合行為非常緊密。與親本分子IFX-1相比，所有IFX-2殖株的相對EC50 都在2倍範圍內，中位數為1.04 (表2)。表 2. IFX-2相對於IFX-1 (VH0Vk0)對C5a結合親和力的相對EC50 。
樣品 ID 相對 EC50 樣品 ID 相對 EC50
VH0Vk0 (IFX-1) 1.00 VH4Vk3 0.91
VH2Vk3 1.09 VH4Vk4 1.03
VH2Vk4 0.99 VH5Vk1 1.28
VH3Vk2 1.05 VH5Vk2 1.05
VH3Vk4 0.86 VH5Vk3 1.14
VH4Vk1 1.00 VH5Vk4 1.53
VH4Vk2 0.86 IFX-2 殖株的中位數 1.04
IFX-2 抗體顯示對膜攻擊複合物 (MAC) 的形成沒有抑制作用
已知親本IFX-1 (VH0Vk0)會中和C5a，但不會干擾C5裂解成C5a和C5b。C5b是膜攻擊複合物C5b-9的起始材料，其為經典補體路徑的最終產物並在膜中形成孔洞。總溶血補體效價(CH50)用於經由MAC媒介的致敏綿羊紅血球(SRBC)溶血來表示經典補體路徑的活化。將初始濃度為100 µg/mL的各個IFX殖株(12× IFX-2和1× IFX-1 (VH0Vk0))的合併人類血漿連續稀釋4、8、16、32、64，和128倍，並與紅血球懸液一起培育。透過測量在450nm被釋放到上清液的血紅素的吸光度來定量溶血程度。表 3. 每個測試IFX殖株的CH50 (血漿稀釋係數)。
樣品 ID CH50 (DF ， - 倍數 ) 樣品 ID CH50 (DF ，倍數 )
VH0Vk0 (IFX-1) 74.25 VH4Vk3 70.47
VH2Vk3 72.62 VH4Vk4 75.31
VH2Vk4 74.19 VH5Vk1 71.20
VH3Vk2 76.71 VH5Vk2 74.21
VH3Vk4 75.46 VH5Vk3 73.24
VH4Vk1 75.69 VH5Vk4 76.87
VH4Vk2 72.04 IFX-2 殖株的中位數 74.20
如圖 2 和表3中所示，要實現50%溶血，需要稀釋70至77倍(中位數74倍)的IFX-2殖株或稀釋74倍的親本分子IFX-1 (CH50)，其為完全相當的。這證明IFX-2殖株上的突變不會損害經典補體路徑的活化。IFX-2 抗體有效地阻斷了 rhC5a 所驅動的 CD11b 上調
在向人類全血添加rhC5a後數分鐘之內即可偵測到人類顆粒球表面上的CD11b上調。使用經螢光標記的抗CD11b抗體測定CD11b含量，並表示為平均螢光強度(MFI)。在兩個CD11b效能分析中，與IFX-1相比，使用12× IFX-2抗體評估了rhC5a所驅動的CD11b上調的阻斷作用。在這兩個分析中，均使用16.7 nM rhC5a作為刺激，分別誘導CD11b表現的3.65倍和5.89倍上調。以1：1莫耳比測試所有IFX殖株對CD11b上調的阻斷作用。根據rhC5a刺激條件下對應的螢光強度變化來計算IFX殖株的阻斷活性。親本分子IFX-1的活性設為100%。在rhC5a：IFX殖株比例為1：1時，IFX-2殖株顯示出94%-104%的相對阻斷活性(參見圖3)。IFX-2殖株的中位數相對阻斷活性為100.68%。實例 3 ： IFX-1/IFX-2 處理後非人類靈長類動物的 ADA 分析 材料及試劑 表 4. 試劑及其供應商。
前體 供應商 產品編號
AnalaR水 VWR International 102923C
卵白素-HRP Biolegend 405103
溶液C (TMB) Biolegend 78105
兔抗-CaCP29-IgG4 pAB Charles River n/a
IFX-1 InflaRx n/a
IFX-2 InflaRx n/a
阻斷緩衝液I AppliChem A7099.0500
Cross Down Buffer AppliChem A6485.0500
猴子血清 LPT Hamburg n.a.
PBS粉 Sigma-Aldrich P5368-10PAK
偶氮化鈉NaN3 VWR International 1.06688.0100
碳酸氫鈉NaHCO3 VWR International L1703
碳酸鈉Na2 CO3 Honeywell 31432-250G
硫酸H2 SO4 VWR International 258105-100ML
Tween20 Sigma-Aldrich P1379-25ML 
方法
抗藥物抗體是在一個兩步驟方法中進行測定。在ADA篩選ELISA中篩選血清樣品中的抗藥物抗體。基於光學密度(OD)的固定分析切點為0.102 (根據ADA篩選ELISA驗證，使用人類血漿偵測IFX-1 ADA)，應產生9%的偽陽性樣品。因此，必須在ADA確認ELISA中分析在ADA篩選ELISA中呈陽性的樣品，以確認或拒絕結果並確定ADA濃度(如果適用)。
ADA篩選ELISA是一種橋接ELISA，採用藥物IFX-1 (抗人類C5a抗體)作為捕獲抗體(未標記)和偵測抗體(經生物素標記)。用經純化IFX-1免疫兔子後，從兔子血清純化用於製備校正(CAL)曲線和摻合品質控制(QC)樣品的抗藥物抗體。由於抗藥物抗體具有兩個結合位點，因此它們可以結合(橋接)捕獲IFX-1以及用於偵測的經標記IFX-1這兩者。在基於ADA篩選ELISA設定的ADA確認ELISA中重新評估所有篩選為ADA陽性的血漿樣品。將額外游離的未標記藥物(IFX-1)添加到樣品中，以與潛在的抗藥物抗體競爭結合至盤上捕獲的IFX-1。如果有抗藥物抗體可用，它們將結合至所添加的游離未標記IFX-1，因此會無法偵測到。如果觀察到藥物特異性ADA抑制作用並確認了篩選結果，則樣品被認為是確認陽性。
如以下中所述進行ADA篩選ELISA和ADA確認ELISA：
簡言之，將100 µl/孔捕獲抗體(IFX-1，0.5 µg/ml)在高結合盤上於5±3℃下培育過夜。洗滌步驟後，將200 µl阻斷緩衝液移入各孔中，並將盤在37℃±2℃下培育歷時2小時。在另一個洗滌步驟後，將100 µl/孔CAL樣品，QC樣品和感興趣樣品(測試樣品)吸移到孔中，並在37℃±2℃下培育歷時2小時。洗滌步驟後，將100 µl偵測抗體(生物素化的IFX-1，0.08 µg/ml)吸移到各孔中，在37℃±2℃下培育歷時60分鐘。之後洗滌盤，並向各孔加入100 μl經稀釋的卵白素-HRP (1：3000)，且在37℃±2℃下培育歷時30分鐘。在最後的洗滌步驟後，添加100 µl/孔TMB (受質溶液)，在室溫下避光培育歷時5分鐘，然後藉由添加100 µl/孔的稀硫酸來中止反應。使用magellan™ 6.5軟體，利用Tecan Infinite M200讀取儀在450 nm下分析色彩強度。
將未知ADA濃度的血漿樣品在CrossDown緩衝液中以1：2稀釋，然後在ADA篩選ELISA中進行分析。為了在ADA確認ELISA中進行重新評估，將樣品在CrossDown緩衝液中以1：2稀釋一次，並在摻藥的CrossDown緩衝液(IFX-1濃度100 µg/ml)中稀釋一次。
在ADA篩選分析中，OD值低於0.102的樣品被歸類為「陰性」。在ADA確認分析中，信號阻斷超過50%的樣品被歸類為「確認陽性」。結果顯示於表5中：結果
投與後8週，經IFX-2處理的動物未產生可偵測到的ADA。表 5. ADA篩選和確認ELISA的摘要
經 IFX-1 處理的動物 經 IFX-2 處理的動物
動物 ID ( 時間點 ) ADA 篩選 ADA 確認 動物 ID ( 時間點 ) ADA 篩選 ADA 確認
#1 (前) 陰性 不適用 #13 (前) 陰性 不適用
#1 (TD 57) 陰性 不適用 #13 (TD 57) 陰性 不適用
#2 (前) 陰性 不適用 #14 (前) 陰性 不適用
#2 (TD 57) 可能陽性 確認陽性 #14 (TD 57) 陰性 不適用
#3 (前) 陰性 不適用 #15 (前) 陰性 不適用
#3 (TD 57) 陰性 不適用 #15 (TD 57) 陰性 不適用
#4 (前) 陰性 不適用 #16 (前) 陰性 不適用
#4 (TD 57) 可能陽性 確認陽性 #16 (TD 57) 陰性 不適用
#5 (前) 陰性 不適用 #17 (前) 陰性 不適用
#5 (TD 57) 陰性 不適用 #17 (TD 57) 陰性 不適用
#6 (前) 陰性 不適用 #18 (前) 陰性 不適用
#6 (TD 57) 陰性 不適用 #18 (TD 57) 陰性 不適用
序列表自由文字（free text）資訊 SEQ ID NO: 6              VH0 SEQ ID NO: 7              VH1 SEQ ID NO: 8              VH2 SEQ ID NO: 9              VH3 SEQ ID NO: 10            VH4 SEQ ID NO: 11            VH5 SEQ ID NO: 12            V_κ_0 SEQ ID NO: 13            V_κ_1 SEQ ID NO: 14            V_κ_2 SEQ ID NO: 15            V_κ_3 SEQ ID NO: 16            V_κ_4 SEQ ID NO: 17            由VH1至VH5的組合所形成的一致序列 SEQ ID NO: 18            由V_κ_1至V_κ_4的組合所形成的一致序列 SEQ ID NO: 20            IFX-1 CDR1重鏈 SEQ ID NO: 21            IFX-1 CDR2重鏈 SEQ ID NO: 22            IFX-1 CDR3重鏈 SEQ ID NO: 23            IFX-1 CDR1輕鏈 SEQ ID NO: 24            IFX-1 CDR2輕鏈 SEQ ID NO: 25            IFX-1 CDR3輕鏈
無
圖1. IFX殖株以可相比較的劑量依賴性方式在不同濃度下與rhC5a結合。親本分子IFX-1標記為VH0Vk0。
圖2. 繪示樣品溶血(%)和血漿稀釋係數(倍數)以計算CH50。親本分子IFX-1標記為VH0Vk0。
圖3. 過敏毒素rhC5a誘導的CD11b上調和，及在Ag：Ab莫耳比為1：1下相較於其受到IFX-1 (測試AB-的IgG4-004)的阻斷，受到12個IFX-2殖株的個別阻斷。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Figure 12_A0101_SEQ_0017
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Claims (12)

  1. 一種包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的抗體或其抗原結合片段， 其中該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：10的胺基酸序列(QVQLV QSGAE VKK PGA SVKV SCKASGYSFT TFWMDWVRQA PGQGLEWIGR IDPSDSESRL DQRFKDRVTM TVDKST STVY MELSSLRSED TAVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS，VH4)，或 與SEQ ID NO：10具有至少80%序列同一性的胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：10具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：20至22的CDR1H、CDR2H，以及CDR3H序列，且其中與SEQ ID NO：10具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含在胺基酸位置5的V、在胺基酸位置10的E、在胺基酸位置12的K、在胺基酸位置13的K、在胺基酸位置16的A、在胺基酸位置40的A，及/或在胺基酸位置76的T，以及 其中該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：16的胺基酸序列(DIQMTQSPSS LSA SV GD RV T IT CKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKA PKL LIYAASNLQS GVPS RFSGSG SGTDFTLT IS SLQ PEDF ATY YCQQSNEDPY TFGQ GTKLEI K，Vκ4)，或 與SEQ ID NO：16具有至少80%序列同一性的胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：16具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：23至25的CDR1L、CDR2L，CDR3L序列，且其中與SEQ ID NO：16具有至少80%序列同一性的該胺基酸序列包含在胺基酸位置13的A、在胺基酸位置15的V、在胺基酸位置17的D、在胺基酸位置19的V、在胺基酸位置22的T、在胺基酸位置46的K、在胺基酸位置47的A、在胺基酸位置64的S、在胺基酸位置78的T、在胺基酸位置80的S、在胺基酸位置81的S、在胺基酸位置82的L、在胺基酸位置83的Q、在胺基酸位置87的F，及/或在胺基酸位置104的Q。
  2. 一種包含重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的抗體或其抗原結合片段， 其中該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：17的胺基酸序列(QVQLVQSGX9 E X11 KKPGASVKX20 SCKASGYSFT TFWMDWVX38 QA PGQGLEWX48 GR IDPSDSESRL DQX63 FKDRX68 TX70 TVDKSTSTVY MX82 LSSX86 X87 SED X91 AVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS)，其中X9 為A或P、X11 為L或V、X20 為I或V、X38 為K或R、X48 為I或M、X63 為K或R、X68 為A或V、X70 為L或M、X82 為E或Q、X86 為L或P、X87 為R或T，而X91 為S或T，或 如SEQ ID NO：17之具有一個、兩個或三個胺基酸取代的胺基酸序列，其中具有一個、兩個或三個胺基酸取代的該胺該基酸序列包含分別為SEQ ID NO：20至22的CDR1H、CDR2H、CDR3H序列，以及 其中該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成： 如SEQ ID NO：18的胺基酸序列(DIX3X4TQSPX9S LX12ASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GX62PSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQX84EDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K)，其中X3 為V或Q、X4 為L或M、X9 為A或S、X12 為A或S、X62 為I或V，而X84 為E或P，或 如SEQ ID NO：18之具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個胺基酸取代的胺基酸序列，其中具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個胺基酸取代的該胺基酸序列包含分別為SEQ ID NO：23至25的CDR1L、CDR2L、CDR3L序列。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段， 其中該VH域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成：選自由VH1至VH5 (SEQ ID NO：7至11)組成之群組的胺基酸序列；及/或 該VL域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成：選自由Vκ1至Vκ4 (SEQ ID NO：13至16)組成之群組的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： a)    包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VH域：SEQ ID NO：10的胺基酸序列(VH4)；以及包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VL域：SEQ ID NO：16的胺基酸序列(Vκ4)，或 b)    包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VH域：SEQ ID NO：11的胺基酸序列(VH5)；以及包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成的VL域：SEQ ID NO：15的胺基酸序列(Vκ3)。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其進一步包含恆定域，其中該恆定域包含以下、基本上由以下組成，或由以下組成：SEQ ID NO：19的胺基酸序列(IgG4 WT恆定)， 其中如SEQ ID NO：19的該胺基酸序列視情況包含下列胺基酸交換中的一或多個： -        胺基酸交換S108P； -        胺基酸交換T130Q與M308L； -        胺基酸交換M132Y、S134T，與T136E。
  7. 如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中抗體的抗原結合片段選自由以下組成之群組：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fd片段、Fv片段、二硫鍵連接的Fv (dsFv)，單域抗體和單鏈Fv (scFv)抗體。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或該其抗原結合片段展現下列性質中的一或多者： -        該抗體或該其抗原結合片段具有與C5a的結合常數，其中Kd 值為10 nM或更小； -        就由一分子C5a引起的生物學效應，該抗體或該其抗原結合片段展現至少75%阻斷活性； -        該抗體或該其抗原結合片段在人類血漿中不抑制CH50活性； -        相較於IFX-1，該抗體或該其抗原結合片段的免疫原性降低。
  9. 一種醫藥組成物，其包含： 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段；並 進一步包含一或多種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑、填充劑、黏合劑、潤滑劑、助滑劑、崩散劑、吸附劑，及/或防腐劑。
  10. 如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於醫藥之用途。
  11. 如請求項1至8中任一項之化合物，其用於治療或預防涉及病理性C5a活性之疾病或病症的用途。
  12. 如請求項11之化合物，其中該疾病或病症選自由以下組成之群組： -        自體免疫病症， -        發炎性病症、自體發炎性病症或相關病況， -        心血管或腦血管病症， -        細菌或病毒感染， -        神經退化性病症或相關疾病，以及 -        癌症或癌前病況。
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