KR20230006456A

KR20230006456A - 인간화 항-C5a 항체

Info

Publication number: KR20230006456A
Application number: KR1020227033905A
Authority: KR
Inventors: 렌펭 구오; 닐스 씨. 리데만
Original assignee: 인플라알엑스 게엠베하
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2023-01-10
Also published as: AU2021268752A1; AR122029A1; EP4146693A1; US20230279087A1; IL295933A; BR112022018191A2; CA3176837A1; CN115485296A; JP2023534355A; TW202208427A; MX2022013780A; WO2021224366A1

Abstract

본 발명은 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 특히 인간화 항-C5a 항체에 관한 것이다. 본원에 기재된 항체는 약제학적 조성물에서 활성제로서 유용하다. 항체 및 약제학적 조성물은 병리학적 C5a 활성을 포함하는 질병 또는 장애의 치료 및 예방에 특히 유용하다.

Description

인간화 항-C5a 항체

본 발명은 인간 C5a의 입체형태적 에피토프(conformational epitope)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 특히 인간화 항-C5a 항체(humanized anti-C5a antibody)에 관한 것이다. 본원에 기재된 항체는 약제학적 조성물에서 활성제로서 유용하다. 항체 및 약제학적 조성물은 병리학적 C5a 활성을 포함하는 질병 또는 장애의 치료 및 예방에 특히 유용하다.

C5a

C5a는 "모분자(mother molecule)" C5의 74개 아미노산 범위 분할 산물이며 보체 활성화 캐스케이드(cascade)의 한 종점을 나타낸다. 이는 적어도 세 가지 잘 기재된 경로(대안, 통상적 및 MBL 경로)의 활성화를 통해 생성될 수 있다. 모든 경로는 C3 수준에서 병합되어 C5 또는 대안적 C5 전환효소를 형성하여 C5를 C5a 및 C5b로 절단한다. 후자는 C6, C7, C8 및 다수의 C9 분자와 결합하여 궁극적으로 예를 들어, 박테리아 막에 기공(pore)을 형성한다(말단 막 공격 복합체 = MAC). C5a는 염증 및 기타 면역학적 및 염증성 장애/질병 설정에서 보체계(complement system)가 활성화될 때 생성된다.

보체 활성화 산물 중에서 C5a는 가장 강력한 염증성 펩타이드 중 하나이며 광범위한 기능을 가지고 있다(문헌[Guo and Ward 2005]). C5a는 고친화도 C5a 수용체(C5aR 및 C5L2)를 통해 효과를 발휘한다(문헌[Ward 2009]). C5aR은 7개의 막관통 분절(transmembrane segment)이 있는 G-단백질 결합 수용체의 로돕신 패밀리에 속하며; C5L2는 유사한 구조를 갖지만 G-단백질 결합되지 않은 것으로 나타난다. 현재 C5a-C5L2 상호작용에 대한 생물학적 반응이 거의 발견되지 않았기 때문에 C5a는 주로 C5a-C5aR 상호작용을 통해 생물학적 기능을 발휘하는 것으로 여겨진다. 그러나 최신 보고서는 C5L2 활성화를 통한 신호전달을 또한 보여준다(문헌[Rittirsch et al. 2008]).

C5aR은 많은 기관, 특히 폐 및 간에서 호중구, 호산구, 호염기구 및 단핵구를 포함하는 골수성 세포 및 비-골수성 세포에서 널리 발현되며, 이는 C5a/C5aR 신호전달의 중요성을 나타낸다. C5aR 발현의 광범위한 상향 조절은 패혈증(sepsis) 발병 동안 발생하고 항-C5a, 항-C5aR 항체 또는 C5aR 길항제에 의한 C5a/C5aR 상호작용의 차단은 패혈증의 설치류 모델에서 높은 보호 효과를 제공한다(문헌[Czermak et al. 1999, Huber-Lang et al. 2001, Riedemann et al. 2002]).

C5a는 다양한 생물학적 기능을 가지고 있다(문헌[Guo and Ward 2005]). C5a는 호중구에 대한 강력한 화학유인물질이며 단핵구 및 대식세포에 대한 화학주성 활성을 또한 갖는다. C5a는 호중구에서 산화적 폭발(O₂ 소모)을 일으키고 식세포 작용과 과립 효소의 방출을 향상시킨다. C5a는 또한 혈관 확장제인 것으로 밝혀졌다. C5a는 다양한 세포 유형에서 사이토카인 발현의 조절에 관여하고 호중구에 대한 부착 분자 발현의 발현을 향상시키는 것으로 나타났다. 고 투여량의 C5a는 호중구의 비특이적 화학주성 "탈감작화(desensitization)"를 일으켜 광범위한 기능장애를 유발할 수 있다. 패혈증, 급성 폐 손상(acute lung injury), 염증성 장 질병(inflammatory bowel disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 등을 포함한 많은 염증성 질병이 C5a의 영향에 기인한다. 패혈증의 실험적 설정에서 호중구의 C5a 노출은 호중구 기능 장애 및 신호전달 경로의 마비로 이어질 수 있으며, 이는 NADPH 산화효소의 결함 조립, MAPK 신호전달 캐스케이드의 마비, 산화 폭발, 식세포 작용 및 주화성의 큰 저하를 초래할 수 있다(문헌[Guo et al. 2006, Huber-Lang et al. 2002]). 흉선세포 아폽토시스(apoptosis)와 지연된 호중구 아폽토시스는 C5a의 존재에 의존하는 패혈증 발병에 대한 두 가지 중요한 병원성 현상이다. 실험적 패혈증 동안 C5a는 호중구에서 β2-인테그린(integrin) 발현을 상향 조절하여 다기관 부전(MOF)의 주요 원인 중 하나인 기관으로의 세포 이동을 촉진한다. 또한 C5a는 실험적 패혈증에서 발생하는 응고 경로의 활성화에 기인하는 것으로 밝혀졌다. C5a는 인간 백혈구에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 대식세포 이동 억제 인자(MIF)와 같은 전염증성 사이토카인(cytokine)의 합성 및 방출을 자극한다. 보체 활성화가 급성 염증이 개시되는 동안 발생하는 현상이라는 점을 감안할 때 C5a는 대부분의 염증성 "사이토카인 폭풍(cytokine storm)"이 발생하기 전에 작용할 수 있다. C5a는 사이토카인 네트워크의 성능과 전신 염증 반응 증후군(SIRS)의 형성을 조정하고 증폭하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.

적응 면역에 뒤따르는 면역 조절 네트워크에서 C5a는 수지상 세포(DC)와 γδ T 세포 사이의 혼선(crosstalk)에 영향을 미치며, 이는 IL-17과 같은 염증 매개체의 대량 생성을 초래할 수 있다(문헌[Xu et al. 2010]). C5a의 필수 역할은 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus)(SLE)에서 병원성 Th17 반응의 생성에서 확립되고 정의되었다(문헌[Pawaria et al. 2014]). 또한, C5a는 Treg 증식 및 유도에 대한 강력한 억제 효과를 제공하는 Treg 세포의 핵심 조절인자인 것으로 보고되었다(문헌[Strainic et al. 2013]). Treg와 TH17이 자가면역 질병 환경에서 필수적인 역할을 한다는 사실을 감안할 때, C5a 신호전달의 억제는 자가면역 질병에서 과민성 면역 상태를 상당히 감소시킬 것으로 예상된다.

IFX-1

IFX-1은 가용성 인간 보체 분할 산물 C5a에 특이적으로 결합하는 키메라 단일클론(monoclonal) IgG4 항체이다. IFX-1은 1328개의 아미노산으로 구성되어 있으며 대략적인 분자량은 148,472달톤이다. IFX-1의 CDR 및 FR 서열은 US 2017/0137499 A1로도 공개된 WO 2015/140304 A1의 표 3에 개시되어 있다. WO 2015/140304 A1 및 US 2017/0137499 A1의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

IFX-1은 포유류 CHO 세포주에서 재조합 단백질로 발현되고 최종적으로 정맥내 투여를 위해 인산염 완충 식염수 용액(PBS + 0.05% 폴리소르베이트 80(polysorbate 80))에서 제형화된다. 인간 C5a에 대한 이 항체의 결합은 상응하는 세포 결합 수용체에 대한 C5a 결합 및 반응을 불활성화함으로써 C5a 유도 생물학적 효과의 매우 효과적인 차단을 촉진한다.

IFX-1의 약리학적 및 독성학적 양태를 평가하기 위해 다양한 비임상 연구가 수행되었으며, 이는 사이노몰구스 원숭이(IFX-1 사용)에서의 GLP 독성 연구를 포함하는 시험관내/체외 시험 및 생체내 연구로 나눌 수 있다. 수행된 비임상 시험 및 연구 중 어느 것도 IFX-1에 대한 독성 또는 안전성 문제를 나타내지 않았다. 인체 I상 시험은 안전성 실험실 매개변수, 활력 징후 및 ECG 매개변수가 임상적으로 관련된 시간 또는 투여량 관련 변화를 나타내지 않았음을 나타낸다.

IFX-1의 시험관내 분석은 가용성 인간 C5a에 대한 강력한 결합 능력 뿐만 아니라 인간 호중구로부터의 리소자임 방출 또는 인간 전혈 내 호중구의 CD11b 상향 조절과 같은 C5a 유도 생물학적 효과의 높은 차단 활성(blocking activity)을 나타낸다. 하나의 IFX-1 항체는 시험관내 실험 환경에서 100%에 가까운 효율로 2분자 C5a의 효과를 중화하는 능력에 도달한다. IFX-1에 대한 임상 시험은 다수의 염증성 질병에서 임상 효능을 시험하기 위해 계속 진행되고 있다.

본 발명의 기반이 되는 기술적 문제

C5a 부분에는 특이적으로 결합하지만 C5의 C5b 부분에는 결합하지 않는 항체는 선행 기술에 기재되어 있다(문헌[Klos et al. (1998) J. Immunol. Meth. 111: 241-252]; WO 01/15731; WO 03/015819). 이전에 생성된 항-C5a 항체는 C5a에 의해 유도된 생물학적 효과에 대해 중간 정도의 차단 활성만을 나타냈다. 결과적으로, 선행 기술의 항-C5a 항체는 C5a-유도 생물학적 효과의 완전한 차단을 달성할 수 없거나 C5a 활성의 상당히 높은 차단에 도달하기 위해 초화학양론적 양으로 사용되어야만 했다. 본 발명자들은 화학양론적 양, 즉 C5a 1몰당 2가 항체 0.5몰을 사용하는 경우에도 C5a 유도 생물학적 효과에 대한 강력한 차단 활성을 나타내는 2개의 단일클론 항-C5a 항체(INab308 및 INab708로 명명됨)를 생성하는데 성공했다(WO 2011/063980 A1 참조, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 단일클론 항체 INab308에 기반하여, 본 발명자들은 동일한 강력한 차단 활성을 나타내는 키메라 항체 IFX-1을 개발하였다(WO 2015/140304 A1 참조, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함됨).

그러나, WO 2011/063980 A1에 구체적으로 기재된 2개의 단일클론 항체 INab308 및 INab708은 뮤린 항체이다. WO 2015/140304 A1에 기재된 항체 IFX-1은 키메라 항체이다. 결과적으로, 이들 항체는 인간에게 투여될 때 부적절한 면역학적 반응을 유발할 수 있다.

따라서, 환자에서의 의도된 임상적 용도의 관점에서, 인간 항체와 더 유사하지만 여전히 C5a 활성의 우수한 차단을 나타내는 항-C5a 항체에 대한 선행 기술의 필요성이 남아 있었다.

본 발명자들은 이제 WO 2011/063980 A1 및 WO 2015/140304 A1에 기재된 항체와 비교하여 인간화가 크게 개선된 인간화 항-C5a 항체를 제조하는데 성공하였고, 이는 WO 2011/063980 A1 및 WO 2015/140304 A1에 기재된 항체의 유리한 특성을 여전히 유지하는 것으로, 즉 C5b의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않으면서 C5a-유도 생물학적 효과에 대해 동일한 높은 차단 활성을 나타낸다.

상기 개괄은 필수적으로 본 발명에 의해 해결되는 모든 문제를 기재한 것은 아니다.

제1 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)으로서,

상기 VH 도메인은

서열번호 10 (QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT TFWMDWVRQA PGQGLEWIGR IDPSDSESRL DQRFKDRVTM TVDKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS, VH4)에 따른 아미노산 서열 또는

서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열(여기서, 서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 20 내지 22의 CDR1H, CDR2H, 및 CDR3H 서열을 포함하고, 서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 아미노산 위치 5의 V, 아미노산 위치 10의 E, 아미노산 위치 12의 K, 아미노산 위치 13의 K, 아미노산 위치 16의 A, 아미노산 위치 40의 A, 및/또는 아미노산 위치 76의 T를 포함함)

을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,

상기 VL 도메인은

서열번호 16 (DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K, Vκ4)에 따른 아미노산 서열 또는

서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(여기서, 서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 23 내지 25의 CDR1L, CDR2L, CDR3L 서열을 포함하고, 서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 아미노산 위치 13의 A, 아미노산 위치 15의 V, 아미노산 위치 17의 D, 아미노산 위치 19의 V, 아미노산 위치 22의 T, 아미노산 위치 46의 K, 아미노산 위치 47의 A, 아미노산 위치 64의 S, 아미노산 위치 78의 T, 아미노산 위치 80의 S, 아미노산 위치 81의 S, 아미노산 위치 82의 L, 아미노산 위치 83의 Q, 아미노산 위치 87의 F, 및/또는 아미노산 위치 104의 Q를 포함함)

을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

제2 양태에서, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,

상기 VH 도메인은

서열번호 17 (QVQLVQSGX⁹E X¹¹KKPGASVKX²⁰ SCKASGYSFT TFWMDWVX³⁸QA PGQGLEWX⁴⁸GR IDPSDSESRL DQX⁶³FKDRX⁶⁸TX⁷⁰ TVDKSTSTVY MX⁸²LSSX⁸⁶X⁸⁷SED X⁹¹AVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS)에 따른 아미노산 서열(여기서, X⁹는A 또는 P이고, X¹¹은L 또는 V이고, X²⁰은I 또는 V이고, X³⁸은K 또는 R이고, X⁴⁸은I 또는 M이고, X⁶³은K 또는 R이고, X⁶⁸은A 또는 V이고, X⁷⁰은L 또는 M이고, X⁸²는 E 또는 Q이고, X⁸⁶은L 또는 P이고, X⁸⁷은R 또는 T이고, X⁹¹은 S 또는 T임), 또는

1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 17에 따른 아미노산 서열(1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 22 내지 22의 CDR1H, CDR2H, CDR3H 서열을 포함함)

상기 VL 도메인은

서열번호 18 (여기서, DIX³X⁴TQSPX⁹S LX¹²ASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GX⁶²PSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQX⁸⁴EDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K)에 따른 아미노산 서열(X³은V 또는 Q이고, X⁴는L 또는 M이고, X⁹는A 또는 S이고, X¹²는 A 또는 S이고, X⁶²는I 또는 V이고, X⁸⁴는E 또는 P임), 또는

1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 18에 따른 아미노산 서열(여기서, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 23 내지 25의 CDR1L, CDR2L, CDR3L 서열을 포함함)

제3 양태에서, 본 발명은

제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제2 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고;

하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제(glidant), 붕해제(disintegrant), 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

제4 양태에서, 본 발명은 약제(medicine)에 사용하기 위한 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제2 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

제5 양태에서, 본 발명은 병리학적 C5a 활성을 포함하는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제2 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 요약은 반드시 본 발명의 모든 특징을 기재하는 것은 아니다. 다른 실시형태는 이어지는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.

도 1. 비교가능한 투여량 의존성 방식으로 상이한 농도에서 rhC5a에 대한 IFX 클론의 결합. 모 분자(parent molecule) IFX-1은 VH0Vk0로 표시되었다.
도 2. CH50을 계산하기 위한 샘플 용혈(%) 및 혈장 희석 배(배수)의 그래프. 모 분자 IFX-1은 VH0Vk0로 표시되었다.
도 3. IFX-1(testAB IgG4 004)에 의한 것과 비교하여 1:1의 Ag:Ab 몰비에서 12개의 IFX-2 클론에 의한 아나필라톡신(Anaphylatoxin) rhC5a 유도-CD11b 상향조절 및 이의 개별 차단.

정의

본 발명이 아래에 상세하게 기재되기 전에, 본 발명은 다양할 수 있기 때문에 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하기 위한 것이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

바람직하게는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and K

lbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)]에 기재된 바와 같이 정의된다.

본원 및 뒤따르는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "~를 포함하다" 및 "~를 포함한다" 및 "~를 포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹은 제외되지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

여러 문서(예를 들어, 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체 설명서, 지침, GenBank 수탁 번호 서열 제출물 등)가 본원의 텍스트 전체에 인용된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 문서 중 일부는 "참조로 포함됨"으로 특징지어진다. 이렇게 포함된 참조문헌의 정의 또는 교시와 본원에 인용된 정의 또는 교시 사이에 모순이 있는 경우, 본원의 텍스트가 우선한다.

서열: 본원에 언급된 모든 서열은 그 전문 및 개시내용과 함께 본원의 일부인 첨부된 서열 목록에 개시되어 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "인간 C5a"는 하기 74개 아미노산 펩타이드를 지칭한다:

Tlqkkieeia akykhsvvkk ccydgacvnn detceqraar islgprcika

fteccvvasq lranishkdm qlgr (서열번호 1).

인간 C5의 아미노산 서열은 수탁번호 UniProtKB P01031(CO5_인간) 하에 찾을 수 있다. 용어 "인간 C5a" 및 "hC5a"는 본원에서 상호 혼용된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 제1 화합물 (예를 들어 항체)은 상기 제2 화합물에 대한 해리 상수 K_d가 1　μM 이하, 바람직하게는 900　nM 이하, 더욱 바람직하게는 800　nM 이하, 더욱 바람직하게는 700　nM 이하, 더욱 바람직하게는 600　nM 이하, 더욱 바람직하게는 500　nM 이하, 더욱 바람직하게는 400　nM 이하, 더욱 바람직하게는 300　nM 이하, 더욱 바람직하게는 200　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 100　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 90　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 80　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 70　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 60　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 50　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 40　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 30　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 20　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 10　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 5　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 4　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 3　nM 이하, 훨씬 더욱 바람직하게는 2　nM 이하, 및 훨씬 더욱 바람직하게는 1　nM 이하인 한, 제2 화합물 (예를 들어 항원, 예컨대, 표적 단백질)에 "결합"하는 것으로 고려된다.

본 발명에 따른 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. "특이적 결합"은 결합 모이어티(binding moiety)(예를 들어, 항체)가 다른 표적에 대한 결합과 비교하여 특이적인 표적, 예컨대 에피토프에 더 강하게 결합함을 의미한다. 결합 모이어티는 제2 표적에 대한 해리 상수보다 더 낮은 해리 상수(K_d)로 제1 표적에 결합하는 경우 제2 표적과 비교하여 제1 표적에 더 강하게 결합한다. 바람직하게는 결합 모이어티가 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수(K_d)는 결합 모이어티가 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수(K_d)보다 10배수 초과, 바람직하게는 20배수, 더욱 바람직하게는 50배수 초과, 훨씬 더욱 바람직하게는 100배수, 200배수, 500배수 또는 1000배수 초과 더 낮다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "K_d"(보통 "mol/L"로 측정, 때때로 "M"로 약칭됨)는 결합 모이어티(예를 들어, 항체 또는 이의 단편) 및 표적 분자(예를 들어, 항원 또는 이의 에피토프) 사이의 특정 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.

화합물의 결합 친화도를 결정하기 위한, 즉 해리 상수 K_d를 결정하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 당업계에 공지된 하기 방법으로부터 선택될 수 있다: 표면 플라스몬 공명(SPR)) 기반 기술, 생물층 간섭계(BLI), 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 유세포 분석, 등온 적정 열량계(ITC), 분석 초원심분리, 방사선면역분석(RIA 또는 IRMA) 및 강화 화학발광(ECL). 일반적으로 해리 상수 K_d는 20℃, 25℃, 30℃ 또는 37℃에서 결정된다. 이와 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 본원에 인용된 K_d 값은 SPR에 의해 20℃에서 결정된다.

항원 결정기로도 알려진 "에피토프"는 면역계, 특히 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 거대분자의 일부이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 본원에 기재된 바와 같은 화합물(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)에 결합할 수 있는 거대분자의 부분이다. 이러한 맥락에서, 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기로 구성되며 일반적으로 특정 3차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 가지고 있다. 구조적 에피토프와 비구조적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합이 손실되지 않고 후자에 대한 결합이 손실된다는 점에서 구별될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "입체형태적 에피토프"는 상기 거대분자의 3차원 구조에 의해 형성되는 선형 거대분자(예를 들어, 폴리펩타이드)의 에피토프를 지칭한다. 본 출원의 맥락에서, "입체형태적 에피토프"는 "불연속적인 에피토프", 즉 거대분자의 1차 서열(예를 들어, 폴리펩타이드의 아미노산 서열)에서 적어도 2개의 개별 영역으로부터 형성되는 거대분자(예를 들어, 폴리펩타이드) 상의 입체형태 에피토프이다. 다시 말해서, 에피토프가 본 발명의 항체(또는 항원-결합 이의 단편)이 동시에 결합하는 1차 서열 내의 적어도 2개의 개별 영역으로 구성되고, 이러한 적어도 2개의 개별 영역은 본 발명의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 결합하지 않는 1차 서열의 하나 이상의 영역에 의해 중단되는 경우, 본 발명과 관련하여 "입체형태적 에피토프"로 고려된다. 바람직하게는, 이러한 "입체형태적 에피토프"는 폴리펩타이드에 존재하고, 1차 서열의 2개의 개별 영역은 본 발명의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 결합하는 2개의 개별 아미노산 서열이며, 적어도 2개의 개별 아미노산 서열은 본 발명의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 결합하지 않는 1차 서열의 하나 이상의 아미노산 서열에 의해 중단된다. 바람직하게는, 중단 아미노산 서열은 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 결합하지 않는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 본 발명의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 결합하는 적어도 2개의 개별 아미노산 서열은 길이와 관련하여 특별히 제한되지 않는다. 이러한 개별 아미노산 서열은 상기 적어도 2개의 개별 아미노산 서열 내의 아미노산의 총 수가 항체(또는 이의 항원 결합 단편) 및 구조적 에피토프 사이에 특이적 결합을 수행하기에 충분히 큰 한 단 하나의 아미노산으로 이루어질 수 있다.

"파라토프(paratope)"는 에피토프에 결합하는 항체의 일부이다. 본 발명의 맥락에서, "파라토프"는 에피토프에 결합하는 본원에 기재된 항-C5a 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 일부이다.

용어 "항체"는 일반적으로 이황화물 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 용어 "항체"는 또한 모든 재조합 형태의 항체, 특히 본원에 기재된 항체, 예를 들어, 원핵생물에서 발현된 항체, 글리코실화되지 않은 항체, 진핵생물(예를 들어, CHO 세포)에서 발현된 항체, 글리코실화된 항체, 및 하기에 기재된 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH 또는 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL 또는 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 통상적 보체계의 제1 요소(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 단편"(또는 간단히 "결합 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체(full-length antibody)의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이는 재조합 방법을 사용하여 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 이루어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(단일사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어 문헌[Bird et al.(1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883] 참조). 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 추가 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합된 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 획득되고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. "항원 결합 단편"의 추가 예는 단일 CDR로부터 유래된 소위 미세항체이다. 예를 들어, 문헌[Heap et al., 2005]은 HIV-1의 gp120 외피 당단백질에 대한 항체의 중쇄 CDR3에서 유래된 17개 아미노산 잔기 미세항체를 기재한다(문헌[Heap C.J. et al. (2005) Analysis of a 17-Amino acids residue, virus-neutralizing microantibody. J. Gen. Virol. 86:1791-1800). 다른 예는 바람직하게는 동족 프레임워크 영역(cognate framework region)에 의해 서로 융합된 2개 이상의 CDR 영역을 포함하는 소형 항체 모방체를 포함한다. 동족 V_H FR2에 의해 연결된 V_H CDR1 및 V_L CDR3을 포함하는 이러한 소형 항체 모방체는 문헌[Qiu et al., 2007 (Qiu X.-Q. et al. (2007) Small antibody mimetics comprising two complementary-determining regions and a framework region for tumor targeting. Nature biotechnology 25(8):921-929)]에 기재되어 있다.

따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 분자를 지칭한다. 넓은 의미에서, 용어 "항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 임의의 유형의 면역글로불린 분자(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY)를 포함한다. 그러나, 본 발명의 바람직한 면역글로불린 분자는 IgG 유형이다. IgG 유형 내에서, 본 발명의 바람직한 면역글로불린 분자는 임의의 클래스 또는 하위클래스(예를 들어, IgG1; IgG2, 바람직하게는 IgG2a 및 IgG2b; IgG3, 또는 IgG4)로부터 유래할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 항체 및 이의 항원 결합 단편은 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 유래로부터 유래될 수 있다. 따라서 항체 또는 이의 단편은 인간, 침팬지, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 기니피그 또는 토끼), 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 유래일 수 있다. 많은 적용을 위해, 항체가 인간 또는 뮤린 유래인 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 항체는 하나의 종, 예를 들어, 인간으로부터 유래된 항체 불변 영역이 또 다른 종, 예를 들어 마우스로부터 유래된 항원 결합 부위와 조합된 키메라 분자를 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시형태에서, 항체 및 이의 항원-결합 단편은 비-인간 종 (예를 들어, 마우스)으로부터 유래된 항체의 항원-결합 부위가 인간 유래의 불변 및 프레임워크 영역과 조합된 인간화 분자를 포함한다.

본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 획득될 수 있거나, 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 림프구 세포)에서 클로닝되고 재조합적으로 발현될 수 있다. 숙주 세포의 추가 예는 E. 콜라이와 같은 미생물 및 효모와 같은 진균이다. 대안적으로, 이는 트랜스제닉(transgenic) 비인간 동물 또는 식물에서 재조합적으로 생성될 수 있다.

용어 "키메라(chimeric) 항체"는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 상동성이고, 사슬의 나머지 분절은 다른 종이나 클래스의 상응하는 서열에 상동성인 항체를 지칭한다. 통상적으로, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 포유류의 한 종에서 유래된 항체의 가변 영역을 모방하고, 불변 부분은 다른 종에서 유래된 항체의 서열과 상동성이다. 이러한 키메라 형태에 대한 한 가지 분명한 이점은 가변 영역이 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합하여 비인간 숙주 유기체로부터 쉽게 입수가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유래될 수 있다는 것이다. 가변영역은 제조가 용이하고 공급원에 의해 특이성이 영향을 받지 않는다는 장점이 있지만, 인간의 불변 영역은 항체가 주입될 때 비인간 공급원으로부터의 불변 영역보다 인간 대상체(subject)로부터 면역반응을 유도할 가능성이 더 적다. 그러나 정의는 이 특정 예에 제한되지 않는다.

용어 "인간화 항체"는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원-결합 부위를 갖고, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역 글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인(constant domain)에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인의 적절한 프레임워크 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원 결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있으며, 예를 들어 인간 면역 글로불린과 더 유사하도록 변형될 수 있다. 일부 형태의 인간화 항체에서 모든 CDR 서열이 보존된다(예를 들어, 마우스 항체의 6개 CDR 모두를 포함하는 인간화 마우스 항체). 다른 형태는 원래 항체와 관련하여 변이된 하나 이상의 CDR을 갖는다.

항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당업자에게 공지되어 있고, 이는 문헌[Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience, 13:1619-1633에서 검토되는 바와 같으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. Almagro & Fransson의 리뷰 기사는 국제 특허 출원 WO 2011/063980 A1의 국내 진입 단계인 US 2012/0231008 A1에 간략하게 요약되어 있다. US 2012/0231008 A1 및 WO 2011/063980 A1의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용되는 바와 같이, "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어 Kucherlapati & Jakobovits의 미국 특허 제 5,939,598호에 기재된 바와 같이 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 트랜스제닉 동물로부터 단리되고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단일 클론 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화도를 나타낸다. 통상적으로, 단일클론 항체는 불멸의 세포에 융합된 인간이 아닌 동물, 예를 들어, 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체, 예를 들어 (a) 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 예를 들어, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 단계를 포함하는 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스펙토마"는 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함하는 진균을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "이종 항체(heterohybrid antibody)"는 이러한 항체를 생성하는 트랜스제닉 유기체와 관련하여 정의된다. 이 용어는 트랜스제닉 유기체로 이루어지지 않은 유기체에 존재하는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 인코딩 핵산 서열을 갖고 일반적으로 트랜스제닉 유기체 이외의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "이종혼성체 항체"는 상이한 유기체 유래의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 이종혼성체 항체이다.

따라서, "항체 및 이의 항원 결합 단편"은 일반적으로 다음에 제한되는 것은 아니나 다클론, 단일클론, 1가, 이중특이성, 이종접합체, 다중특이성, 재조합체, 이종성, 이종혼성체, 키메라, 인간화(특히 CDR 이식), 탈면역 또는 인간 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, Fd, Fv, 이황화물-연결(disurfide-linked) Fv(dsFv), 단일 사슬 항체(예를 들어, scFv), 디아바디 또는 테트라바디(문헌[Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 6444-6448]), 나노바디(단일 도메인 항체로도 알려짐), 항-이디오타입(anti-idiotypic)(항-Id)) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기의 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다.

본원에 기재된 항체는 바람직하게는 단리된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도되고; 예를 들어, C5a에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 C5a 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다. 그러나 인간 C5a의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예를 들어 다른 종(예를 들어, 랫트 C5a와 같은 C5a 종 동족체)에서 유래된 다른 관련 항원에 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "단리된 항체의 조합"은 상이한 특이성을 갖고 잘 정의된 조성물로 조합되는 항체에 관한 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 발생"은 대상체에 적용되는 바와 같이 물질이 천연에서 존재할 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하며 천연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연적으로 발생한다.

"보존적 치환"은 예를 들어 관련된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다. 아미노산은 다음 6가지 표준 아미노산 그룹으로 분류할 수 있다:

(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

본원에 사용되는 바와 같이, "보존적 치환"은 상기 나타낸 6개의 표준 아미노산 그룹의 동일한 그룹 내에 나열된 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교체으로 정의된다. 예를 들어, Glu에 의한 Asp의 교체는 그렇게 변형된 폴리펩타이드에서 하나의 음전하를 유지한다. 또한, 글리신과 프롤린은 α-나선을 파괴하는 능력에 따라 서로 치환될 수 있다. 상기 6개 그룹 내의 일부 바람직한 보존적 치환은 하기 하위 그룹 내의 교체이다: (i) Ala, Val, Leu 및 Ile; (ii) Ser 및 Thr; (ii) Asn 및 Gln; (iv) Lys 및 Arg; 및 (v) Tyr 및 Phe. 알려진 유전자 코드와 재조합 및 합성 DNA 기술이 주어지면 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 인코딩하는 DNA를 쉽게 작제할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "비보존적 치환" 또는 "비보존적 아미노산 교체"는 상기 제시된 6개의 표준 아미노산 그룹 (1) 내지 (6)의 다른 그룹에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교체로 정의된다.

뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 유사성, 즉 서열 동일성의 백분율은 서열 정렬을 통해 결정될 수 있다. 이러한 정렬은 다수의 기술분야에 공지된 알고리즘, 바람직하게는 Karlin 및 Altschul의 수학적 알고리즘 (문헌[Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877]), hmmalign (HMMER 패키지) 또는 CLUSTAL 알고리즘(문헌[Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80] 또는 CLUSTALW2 알고리즘(문헌[Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948])에 의해 수행될 수 있다.

서열 동일성의 등급(서열 매칭)은 예를 들어 BLAST, BLAT 또는 BlastZ(또는 BlastX)를 사용하여 계산될 수 있다. 유사한 알고리즘이 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 포함되었다. BLAST 단백질 검색은 예를 들어, 웹 사이트:

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome

에서 이용 가능한 BLASTP 프로그램으로 수행된다.

사용된 바람직한 알고리즘 매개변수는 표시된 웹 사이트:

예상 임계값 = 10, 단어 크기 = 3, 쿼리 범위에서 최대 매칭 = 0, 행렬 = BLOSUM62, 갭 비용 = 존재: 11 확장: 1, 조성 조정 = 비-중복 단백질 서열(nr)의 데이터베이스와 함께 조건부 조성 점수 행렬 조정.

에 설정된 기본 매개변수이다.

비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 갭 BLAST가 사용된다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때 각 프로그램의 기본 매개변수가 사용된다. 서열 매칭 분석은 Shuffle-LAGAN(문헌[Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62]) 또는 Markov 랜덤 필드와 같은 확립된 상동성 매핑 기술에 의해 보완될 수 있다.

본 출원에서 서열 동일성의 백분율이 언급될 때, 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 이러한 백분율은 지시된 참조 서열의 전체 길이와 관련하여 계산된다. 예를 들어, "서열번호 XYZ에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열"이라는 문구는 서열 동일성 백분율이 서열번호 XYZ의 전체 길이와 관련하여 계산됨을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "생물학적 활성"은 제한 없이 다음을 포함하여 폴리펩타이드가 나타낼 수 있는 임의의 활성을 지칭한다: 효소 활성; 다른 화합물에 대한 결합 활성(예를 들어, 다른 폴리펩타이드에 대한 결합, 특히 수용체에 대한 결합, 또는 핵산에 대한 결합); 억제 활성(예를 들어, 효소 억제 활성); 활성화 활성(예를 들어, 효소 활성화 활성); 또는 독성 효과. 폴리펩타이드의 변이체 및 유도체와 관련하여, 변이체 또는 유도체가 모 폴리펩타이드와 동일한 정도로 그러한 활성을 나타낼 필요는 없다. 모 폴리펩타이드의 활성의 적어도 10%(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%) 정도의 관련 활성을 나타내는 경우, 변이체는 본 출원의 맥락 내의 변이체로 고려된다. 유사하게, 모 폴리펩타이드 활성의 적어도 10% 정도로 관련 생물학적 활성을 나타내는 경우, 유도체는 본 출원의 맥락 내의 유도체로 고려된다. 본 발명의 맥락에서 특히 관련된 "생물학적 활성"은 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 관련된 "생물학적 활성"은 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 HKDMQ(서열번호 5)에 의해 형성된 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 훨씬 더욱 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 관련 "생물학적 활성"은 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 KDM에 의해 형성된 인간 C5a의 형태적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 결합 활성을 결정하기 위한 분석은 당업자에게 알려져 있으며 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명 분석을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "환자"는 본원에 기재된 항-C5a 항체를 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 포유류 또는 조류를 의미한다. 바람직하게는, "환자"는 실험 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트), 가축(예를 들어, 기니피그, 토끼, 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개) 또는 원숭이(예를 들어, 아프리카 녹색 원숭이, 침팬지, 보노보, 고릴라) 및 인간을 포함한 영장류로 이루어진 군으로부터 선택된다. "환자"가 인간인 것이 특히 바람직하다. 용어 "환자" 및 "치료 대상체"(또는 간단히: "대상체")는 본원에서 상호 혼용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 질병 또는 장애의 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다: (a) 장애의 중증도 및/또는 기간을 감소시키는 것; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 발생을 제한하거나 예방하는 것; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 억제하는 것; (d) 이전에 장애(들)가 있었던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하거나 예방하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 있었던 환자에서 증상의 재발을 제한하거나 예방하는 것.

본원에 사용된 바와 같이, 질병 또는 장애의 "예방하다", "예방하는", "예방" 또는 "방지"는 장애가 대상체에서 일정 시간 동안 발생하는 것을 예방하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 질병 또는 장애를 예방할 목적으로 대상체에게 투여되는 경우, 상기 질병 또는 장애가 적어도 투여 당일 및 바람직하게는 또한 투여일 다음 1일 이상(예를 들어, 1 내지 30일, 또는 2 내지 28일, 또는 3 내지 21일, 또는 4 내지 14일, 또는 5 내지 10일)에 발생하는 것을 예방한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "투여"는 생체내 투여 뿐만 아니라 정맥 이식편과 같은 생체외 조직에 직접 투여를 포함한다.

본 발명에 따른 "약제학적 조성물"은 상이한 활성 요소 및 희석제 및/또는 담체가 서로 혼합된 조성물의 형태로 존재할 수 있거나, 조합 제제의 형태를 취할 수 있으며, 활성 요소는 부분적으로 또는 완전히 개별 형태로 존재한다. 이러한 조합 또는 조합 제제의 예는 부품 키트(kit-of-parts)이다.

"유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 치료제의 양이다. 소정의 치료제의 유효량은 제제의 성질, 투여 경로, 치료제를 투여받는 대상체의 크기 및 종, 및 투여 목적과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 각각의 개별 경우의 유효량은 당업계에 확립된 방법에 따라 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.

문맥상 달리 언급하지 않는 경우, 용어 "활성제"는 본 발명의 항체 및 본 발명의 항원 결합 단편을 지칭한다. "활성제" 및 "치료제"라는 용어는 본원에서 상호 혼용된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "보조 요법"은 적어도 2종의 상이한 약물이 환자에게 투여되는 조합 요법을 지칭한다. 이러한 적어도 2종의 상이한 약물은 두 약물을 모두 포함하는 하나의 단일 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 대안적으로, 각각의 약물은 별도의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고 약제학적 조성물은 환자에게 개별적으로 (예를 들어, 상이한 시점에서 및/또는 상이한 투여 경로에 의해) 투여된다. 이 후자의 대안에서 (적어도) 두 가지 다른 약물이 부품 키트로 제공될 수 있다.

"약제학적으로 허용 가능한"은 미국 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 보다 특히 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 기타 약전에 등재된 것을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체(carrier)"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 애주번트(adjuvant), 부형제 또는 비히클(vehicle)을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일 중의 식염수 용액과 같은 멸균 액체일 수 있다. 식염수 용액은 약제학적 조성물이 정맥내 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수, 덱스트로스 및 글리세롤 수용액도 특히 주사용액의 경우 액체 담체로 사용할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 모노스테아르산글리세롤, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유 건조, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적절한 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충액를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지속 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트리글리세리드와 같은 통상적인 결합제 및 담체와 함께 좌제로 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래된 것과 같은 유리 아미노기로 형성된 염, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2철 수산화물, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 같은 유리 카복실기로 형성된 염을 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" 22^nd edition, Loyd V. Allen Jr. et al. (eds.), Pharmaceutical Press, 2012]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 담체와 함께 치료 유효량의 화합물, 바람직하게는 정제된 형태를 포함할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.

분자 생물학, 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기술 분야에서 일반적으로 알려져 있고 실행되는 방법은 지속적으로 업데이트되는 간행물 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons); "Current Protocols in Protein Science" (J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons); "Current Protocols in Cell Biology" (J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) and "Current Protocols in Immunology" (J. E. Colligan et al., Eds., Wiley & Sons)]에 완전히 기재되어 있다. 세포 배양 및 배지와 관련된 공지된 기술은 문헌["Large Scale Mammalian Cell Culture (D. Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148-153, 1997); "Serum free Media" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73-106, 1991); and "Suspension Culture of Mammalian Cells" (J.R. Birch et al. Bioprocess Technol. 10:251-270, 1990)]에 기재되어 있다.

본 발명의 실시형태

본 발명은 이제 더 기재될 것이다. 다음 구절에서 본 발명의 다른 양태가 더 자세히 정의된다. 아래에 정의된 각 양태는 달리 명확하게 표시되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.

제1 양태에서 본 발명은 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,

상기 VH 도메인은

서열번호 10에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열(서열번호 10에 대해 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 20 내지 22의 CDR1H, CDR2H, 및 CDR3H 서열을 포함하고, 서열번호 10에 대해 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 아미노산 위치 5의 V, 아미노산 위치 10의 E, 아미노산 위치 12의 K, 아미노산 위치 13의 K, 아미노산 위치 16의 A, 아미노산 위치 40의 A, 및/또는 아미노산 위치 76의 T를 포함함)

상기 VL 도메인은

서열번호 16에 대해 적어도 80% 서열 동일성 (바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열(서열번호 16에 대해 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 23 내지 25의 CDR1L, CDR2L, CDR3L 서열을 포함하고, 서열번호 16에 대해 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 아미노산 위치 13의 A, 아미노산 위치 15의 V, 아미노산 위치 17의 D, 아미노산 위치 19의 V, 아미노산 위치 22의 T, 아미노산 위치 46의 K, 아미노산 위치 47의 A, 아미노산 위치 64의 S, 아미노산 위치 78의 T, 아미노산 위치 80의 S, 아미노산 위치 81의 S, 아미노산 위치 82의 L, 아미노산 위치 83의 Q, 아미노산 위치 87의 F, 및/또는 아미노산 위치 104의 Q를 포함함)

제1 양태의 바람직한 실시형태에서, 서열번호 10에 대해 적어도 80% (바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 소정의 위치의 다음 7개의 아미노산:

- 아미노산 위치 5의 V,

- 아미노산 위치 10의 E,

- 아미노산 위치 12의 K,

- 아미노산 위치 13의 K,

- 아미노산 위치 16의 A,

- 아미노산 위치 40의 A, 또는

- 아미노산 위치 76의 T

중 적어도 4(바람직하게는 적어도 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 가장 바람직하게는 7)개를 포함한다.

제1 양태의 바람직한 실시형태에서, 서열번호 16에 대해 적어도 80% (바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 소정의 위치의 다음 15개의 아미노산:

- 아미노산 위치 13의 A,

- 아미노산 위치 15의 V,

- 아미노산 위치 17의 D,

- 아미노산 위치 19의 V,

- 아미노산 위치 22의 T,

- 아미노산 위치 46의 K,

- 아미노산 위치 47의 A,

- 아미노산 위치 64의 S,

- 아미노산 위치 78의 T,

- 아미노산 위치 80의 S,

- 아미노산 위치 81의 S,

- 아미노산 위치 82의 L,

- 아미노산 위치 83의 Q,

- 아미노산 위치 87의 F, 또는

- 아미노산 위치 104의 Q

중 적어도 8(바람직하게는 적어도 9, 더욱 바람직하게는 적어도 10, 더욱 바람직하게는 적어도 11, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 12, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 13, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 14, 가장 바람직하게는 15)개를 포함한다.

- 아미노산 위치 5의 V,

- 아미노산 위치 10의 E,

- 아미노산 위치 12의 K,

- 아미노산 위치 13의 K,

- 아미노산 위치 16의 A,

- 아미노산 위치 40의 A, 또는

- 아미노산 위치 76의 T

중 적어도 4(바람직하게는 적어도 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 가장 바람직하게는 7)개를 포함하고

서열번호 10의 아미노산 위치 1 내지 4 또는 6 내지 9에 위치한 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 치환을 포함하고;

서열번호 16에 대해 적어도 80% (바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 소정의 위치의 다음 15개의 아미노산:

- 아미노산 위치 13의 A,

- 아미노산 위치 15의 V,

- 아미노산 위치 17의 D,

- 아미노산 위치 19의 V,

- 아미노산 위치 22의 T,

- 아미노산 위치 46의 K,

- 아미노산 위치 47의 A,

- 아미노산 위치 64의 S,

- 아미노산 위치 78의 T,

- 아미노산 위치 80의 S,

- 아미노산 위치 81의 S,

- 아미노산 위치 82의 L,

- 아미노산 위치 83의 Q,

- 아미노산 위치 87의 F, 또는

- 아미노산 위치 104의 Q

중 적어도 8(바람직하게는 적어도 9, 더욱 바람직하게는 적어도 10, 더욱 바람직하게는 적어도 11, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 12, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 13, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 14, 가장 바람직하게는 15)개를 포함하고

선택적으로 서열번호 16의 아미노산 위치 1 내지 10에 위치한 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 보전적 치환을 포함한다.

제2 양태에서 본 발명은 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,

상기 VH 도메인은

서열번호 17 (QVQLVQSGX⁹E X¹¹KKPGASVKX²⁰ SCKASGYSFT TFWMDWVX³⁸QA PGQGLEWX⁴⁸GR IDPSDSESRL DQX⁶³FKDRX⁶⁸TX⁷⁰ TVDKSTSTVY MX⁸²LSSX⁸⁶X⁸⁷SED X⁹¹AVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS)에 따른 아미노산 서열(X⁹는A 또는 P이고, X¹¹은L 또는 V이고, X²⁰은I 또는 V이고, X³⁸은K 또는 R이고, X⁴⁸은I 또는 M이고, X⁶³은K 또는 R이고, X⁶⁸은A 또는 V이고, X⁷⁰은L 또는 M이고, X⁸²는 E 또는 Q이고, X⁸⁶은L 또는 P이고, X⁸⁷은R 또는 T이고, X⁹¹은 S 또는 T임), 또는

1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 17에 따른 아미노산 서열(1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 20 내지 22의 CDR1H, CDR2H, CDR3H 서열을 포함함)

상기 VL 도메인은

서열번호 18 (DIX³X⁴TQSPX⁹S LX¹²ASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GX⁶²PSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQX⁸⁴EDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K)에 따른 아미노산 서열(X³은V 또는 Q이고, X⁴는L 또는 M이고, X⁹는A 또는 S이고, X¹²는 A 또는 S이고, X⁶²는I 또는 V이고, X⁸⁴는E 또는 P임), 또는

1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 18에 따른 아미노산 서열(1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 23 내지 25의 CDR1L, CDR2L, CDR3L 서열을 포함함)

제1 또는 제2 양태의 일 실시형태에서, VH 도메인은 VH1 내지 VH5 (서열번호 7 내지 11)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고/지거나; VL 도메인은 Vκ1 내지 Vκ4 (서열번호 13 내지 16)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.

제1 또는 제2 양태의 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은

a) 서열번호 10 (VH4)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인, 및 서열번호 16 (Vκ4)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는

b) 서열번호 11 (VH5)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인, 및 서열번호 15 (Vκ3)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인

을 포함한다.

제1 또는 제2 양태의 일 실시형태에서, 항체는 인간화 항체이다.

제1 또는 제2 양태의 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 불변 도메인을 추가로 포함한다. 제1 또는 제2 양태의 일부 실시형태에서, 불변 도메인은 서열번호 19에 따른 아미노산 서열(IgG4 WT 불변)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,

서열번호 19에 따른 상기 아미노산 서열은 선택적으로 다음 아미노산 교체(exchange)

- 아미노산 교체 S108P;

- 아미노산 교체 T130Q 및 M308L;

- 아미노산 교체 M132Y, S134T, 및 T136E

중 하나 이상을 포함한다.

제1 또는 제2 양태의 일 실시형태에서, 항체의 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fd 단편, Fv 단편, 이황화물-연결 Fvs (dsFv), 단일 도메인 항체 및 단일 사슬 Fv (scFv) 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

-상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 10nM 이하 (예를 들어 9 nM 이하; 8 nM 이하, 7 nM 이하, 6 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 또는 2 nM 이하)의 K_d 값으로 C5a에 대한 결합 상수를 갖는 특성;

- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 한 분자 C5a에 의해 유도된 생물학적 효과에 대해 적어도 75%의 차단 활성을 나타내는 특성;

- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 인간 혈장에서 CH50 활성을 억제하지 않는 특성;

- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 인간 전혈에서 E. 콜라이 유도된 IL-8 생성을 감소시킬 수 있는 특성;

- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 IFX-1과 비교하여 감소된 면역원성(immunogenicity)을 갖는 특성 중 하나 이상을 나타낸다.

상대적 면역원성을 결정하는 방법은 하기 실시예, 즉 ADA 스크리닝 분석에 제시되어 있다. 약어 ADA는 항-약물 항체를 지칭한다.

제1 또는 제2 양태의 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C5a의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 결합하고,

항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다.

제1 또는 제2 양태의 추가 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C5a의 아미노산 서열 DETCEQR (서열번호 4) 및 HKDMQ (서열번호 5)에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 결합하고,

항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 및 서열번호 5에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다.

제1 또는 제2 양태의 추가 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 C5a의 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 KDM에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 결합하고,

항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 및 KDM에 따른 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다.

제3 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제2 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고;

하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

제4 양태에서, 본 발명은 약제에 사용하기 위한 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제2 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.

제5 양태에서, 본 발명은 병리학적 C5a 활성을 포함하는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제2 양태에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

제5 양태의 실시형태에서, 질병 또는 장애는

- 자가면역 장애(autoimmune disorder),

- 염증성 장애(inflammatory disorder), 자가-염증성 장애(auto-inflammatory disorder), 또는 관련 병태(condition),

- 심혈관 또는 뇌혈관 장애(cardiovascular or cerebrovascular disorder),

- 박테리아 또는 바이러스 감염,

- 신경퇴행성 장애(neurodegenerative disorder) 또는 관련 질병, 및

- 암 또는 전암 병태(precancerous condition)

로 이루어진 군으로부터 선택된다.

제5 양태의 일부 실시형태에서, 바이러스 감염은 HIV 또는 AIDS이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 본 발명자들의 발명으로 고려하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 이와 달리 명시되지 않는 한, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 그 부근이다.

실시예 1: IFX-1로부터 유래된 완전 인간화 항-C5a 항체(IFX-2 클론)의 생성

이 실시예는 키메라 항체 IFX-1(VH0/Vκ0)을 인코딩하는 V 영역 유전자 서열을 사용하고 복합 인간 항체™ 기술을 사용하여 일련의 완전 인간화 항체를 작제하는 작업을 자세히 기재한다. 중쇄 및 경쇄의 설계된 가변 영역 유전자를 각각 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인(서열번호 19 참조, 그러나 S108P 아미노산 교체 포함) 및 인간 카파 경쇄 불변 도메인을 인코딩하는 벡터 내로 클로닝하였다. 다른 간행물에서 S108P 아미노 교체는 때때로 S241P 아미노산 교체(전장 인간 IgG4의 카밧 넘버링 사용)로 지칭된다. 키메라 및 인간화 항체를 HEK EBNA 세포에서 일시적으로 발현시키고 단백질 A를 정제하였다.

방법 및 결과

복합 인간 항체™ 가변 영역 서열의 설계

IFX-1 항체 V 영역의 구조적 모델을 Swiss PDB를 사용하여 생성하고 항체의 결합 특성에 필수적일 가능성이 있는 V 영역에서 중요한 "구속" 아미노산을 확인하기 위해 분석하였다. 다수의 프레임워크 잔기와 함께 CDR 내에 포함된 대부분의 잔기가 중요한 것으로 고려되었다. IFX-1의 VH 및 Vκ 서열은 통상적인 프레임워크 잔기를 포함하고 CDR 1, 2 및 3 모티프는 많은 뮤린 항체와 비교가능하다.

상기 분석으로부터, IFX-1의 복합 인간 서열은 CDR 외부의 대안적 잔기에 대해 넓은 관용도를 가지지만 CDR 서열 내에서 가능한 잔기의 좁은 메뉴로 생성될 수 있다고 고려되었다. 예비 분석은 다수의 인간 항체의 상응하는 서열 분절을 조합하여 뮤린 서열의 것과 유사하거나 동일한 CDR을 생성할 수 있음을 나타내었다. CDR 외부 및 플랭킹(flanking) 영역의 경우, 인간 서열 분절의 광범위한 선택이 신규 인간화 V 영역의 가능한 요소로서 확인되었다.

CD4+ T 세포 에피토프 회피

구조적 분석에 기반하여, IFX-1 인간화 변이체를 생성하는데 사용될 수 있는 대규모 예비 서열 분절 세트를 선택하고 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에 대한 펩타이드 결합의 인실리코 분석을 위해 iTope™ 기술(문헌[Perry et al New Approaches to Prediction of Immune Responses to Therapeutic Proteins during Preclinical Development (2008). Drugs R D 9 (6): 385-396]을 사용하고, 알려진 항체 서열 관련 T 세포 에피토프의 TCED™(문헌[Bryson et al Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins (2010). Biodrugs 24 (1):1-8])을 사용하여 선택 및 분석하였다. 인간 MHC 클래스 II에 대한 상당한 비인간 생식계열 결합제로서 확인되거나 TCED™에 대해 상당한 히트(hit)를 기록한 서열 절편을 제거하였다. 이는 감소된 분절 세트를 초래하고, 분절 사이의 접합부가 잠재적인 T 세포 에피토프를 포함하지 않음을 보장하기 위해 위와 같이 이의 조합을 다시 분석했다. 선택된 서열 분절을 유의한 T 세포 에피토프가 없는 완전한 V 영역 서열로 조립하였다. 그런 다음 5개의 중쇄(VH1 내지 VH5) 및 4개의 경쇄(Vκ1 내지 Vκ4) 서열을 포유류 세포에서 유전자 합성 및 발현을 위해 선택하였다. VH1 내지 VH5의 아미노산 서열은 각각 서열번호 7 내지 11로 서열목록에 나타나 있다. Vκ1 내지 Vκ4의 아미노산 서열은 각각 서열번호 13 내지 16과 같이 서열목록에 제시되어 있다.

키메라 항체 및 인간화 변이체의 작제

IFX-1(VH0(서열번호 6) 및 Vκ0(서열번호 12))의 VH 및 Vκ 서열 및 이의 인간화 변이체를 각각 인간 IgG4(S241P) 중쇄 및 카파 경쇄에 대해 Abzena의 pANT 발현 벡터 시스템으로 클로닝하기 위한 플랭킹 제한 효소 부위와 함께 합성하였다. VH 영역을 Mlu I과 Hind III 제한 부위 사이에 클로닝하고 Vκ 영역을 BssH II와 BamHI 제한 부위 사이에 클로닝하였다. 모든 작제물을 시퀀싱에 의해 확인하였다.

항체의 발현 및 정제

키메라 IFX-1(VH0/Vκ0), 2개의 대조군 항체(VH0/Vκ1, VH1/Vκ0) 및 복합 IgG4(S241P) VH 및 Vκ 사슬의 조합(총 23개의 쌍, 표 1)을 PEI 형질감염 방법을 사용하여 HEK EBNA 부착 세포(LGC Standards, Teddington, UK)에 일시적으로 형질감염시키고, 형질감염 후 7일 동안 인큐베이션하였다. 상청액 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고, VH1 포함 변이체는 다른 변이체와 비교할 때 일관되게 더 낮은 발현을 나타내는 것으로 관찰되었다(데이터는 표시되지 않음).

키메라(VH0/Vκ0), 2개의 대조군 인간화 변이체(VH1/Vκ0 및 VH0/Vκ1) 및 20개의 IFX-1 복합 인간 항체™ 변이체를 포함하는 일시적 형질감염(교차 상자)에 의해 생성된 항체의 요약표.

	VH0	VH1	VH2	VH3	VH4	VH5
Vκ0	X	X
Vκ1	X	X	X	X	X	X
Vκ2		X	X	X	X	X
Vκ3		X	X	X	X	X
Vκ4		X	X	X	X	X

단백질 A 세파로스 컬럼(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)의 세포 배양 상청액으로부터 항체(저발현 VH1 변이체 제외)를 정제하고, 완충액을 1x PBS pH 7.2로 교체하고, 예측된 아미노산 서열을 기반으로 하여 흡광 계수(Ec_(0.1%))를 사용하여 OD_280nm에 의해 정량화하였다. 겔에 각 항체 1μg을 부가하여 SDS-페이지를 사용하여 항체를 분석하였고, 통상적인 항체의 특성에 상응하는 밴드를 관찰하였다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 2: 모 항체 IFX-1에 대한 상이한 IFX-2 클론의 비교

재료 및 시약

CD11b 분석:

o ACD, Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany), Cat. No. C3821-50ML

o 유세포분석의 시약 (모두 BD Bioscience, NJ, USA)

·FACS 유동 시트 유체 Cat. No. 342003

·FACS 셧다운 용액, Cat. No. 334224

·FACS 세정액, Cat. No. 340345

·랫트 항-마우스 CD11b:FITC, Cat. No. 553310, 0.5 mg/mL

·10Х 용해액, BD Bioscience (NJ, USA), Cat. No. 349202 → AnalaR 물 중 1:10 희석

oHBSS, Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany), Cat. No. 14025-050

o FBS, Invitrogen (CA, USA), Cat. No. 10099133 → 열-불활성화: 56℃, 30 min

o 아지드화나트륨, Merck (Darmstadt, Germany), Cat. No. 1.06688.0250

o 재조합 인간 C5a (rhC5a), Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany), Cat. No. C5788-.1MG, E. 콜라이에서 발현, 순도: 약　95%, 멸균 AnalaR 물 중 용해,

o 염색 완충액 (SB-완충액): 1% 열-불활성화 FBS + 1Х PBS 중 0.1% 아지드화나트륨

o 12% ACD를 포함하는 건강한 공여체로부터의 인간 혈액(즉시 사용),

C5a-기반 PK ELISA:

o AnalaR 물, VWR International (Darmstadt, Germany), Cat. No. 102923C

o 재조합 인간 C5a (rhC5a), Hycult Biotech (Uden, The Netherlands), Cat. No. HC2101, E. 콜라이에서 발현, 멸균 AnalaR 물 중 용해,

o rhC5a 데스아르기닌 유도체 (rhC5aDArg), Hycult Biotech (Uden, The Netherlands), Cat. No. HC2102, E. 콜라이에서 발현, 멸균 AnalaR 물 중 용해,

o 대조군으로서 적용된 IFX-1, 항-인간 C5a 항체, InflaRx (Jena, Germany), PBS + 0.05% Tween80 중 10　mg/mL,

o 마우스 항-인간 IgG4:HRP, AbD Serotec (Puchheim, Germany), Cat. No. MCA2098P, 1 mg/mL

o Na₂CO₃, Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany), Cat. No. 71350 (Sigma, WI, USA, Cat. No. 31432)

o NaHCO₃, VWR International (Darmstadt, Germany), Cat. No. L1730

o NaN₃, VWR International, (Darmstadt, Germany), Cat. No. 1.06688.0100

o PBS 분말, Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany), Cat. No. P5368-10PAK → 1 패키지, 1000 mL 탈이온수 중 용해,

o Tween 20, Sigma-Aldrich, (Taufkirchen, Germany), Cat. No. P1379-25ML

o BSA, Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany), Cat. No. A7030-100G

o 코팅 완충액: 1000 mL AnalaR 물 pH 9.6 중 1.59 g Na₂CO₃ + 2.93 g NaHCO₃ + 0.2 g NaN₃

o 세척 완충액: 1x PBS + 0.05% Tween 20

o 분석 희석제: 1Х PBS 중 3% BSA + 0.05% Tween 20 (3% BSA/PBST)

o TMB 기질(기질 용액 C), BioLegend/Biozol (Heidelberg, Germany), Cat. No. BLD-78105

o 정지 용액: 황산(Sigma-Aldrich, Cat. No. 258105-100ML), AnalaR 물 중 1:10 희석,

혈장 용혈 활성(CH50):

o AnalaR 물, VWR International (Darmstadt, Germany), Cat. No. 102923C

o 보체 CH50 분석, Haemoscan (Groningen, Netherlands), Cat. No. K002

o 건강한 인간 혈장 풀, huPP-013, 자체 제조,

방법

rhC5a-기반 ELISA

ELISA의 경우, 100μL의 rhC5a(1μg/mL)를 4℃에서 밤새 96-웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 플레이트를 세척(5회)하고 37℃에서 1시간 동안 차단 완충액 200μL로 차단했다. 세척 단계(5x)에 이어, 250ng/mL 내지 3.91ng/mL의 2배수 연속 희석액의 IFX 클론을 C5a 코팅된 웰에 추가했다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 및 세척 단계(5x) 후, 0.04μg/mL HRP-표지된 항-인간 IgG4 항체를 37℃에서 1시간 동안 적용하여 결합된 IFX 클론을 검출하였다. 발색을 위해 세척(5x) 후 100μL의 TMB 기질을 추가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션했다. 100μL 정지 용액으로 색 반응을 중지했다. 플레이트 판독기를 사용하여 발색 반응 후 30분 이내에 450 nm에서의 흡광도 판독을 수행하였다. 원 데이터로 공백 축소를 수행했다.

혈장 용혈 활성(CH50)

총 용혈 보체 역가(CH50)는 통상적 보체 경로의 활성화를 결정하기 위한 통상적인 방법이다. 간단히 말해서, 양 적혈구 세포(sRBC)를 원심분리에 의해 신선한 양 전혈로부터 제조하고 항-sRBC 항체로 감작화시켰다. IFX 클론을 포함하는 건강한 지원자의 혈장 샘플을 연속 희석하고 37℃에서 30분 동안 감작화된 sRBC와 함께 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 혼합물을 원심분리하고, 450 nm에서 상청액으로 방출된 헤모글로빈의 흡광도를 측정하여 용혈 정도를 정량화하였다. 보체 활성의 양을 감작화된 sRBC를 용해하기 위한 시험 혈장 샘플의 다양한 희석 능력을 조사함으로써 결정하였다.

CD11b 효능 분석

인간 전혈을 16.7 nM rhC5a로 자극하였다. rhC5a-유도된 CD11b 상향조절에 대한 IFX-1 및 IFX-2 클론의 차단 활성을 시험하기 위해 항체를 Ag:Ab 비 1:1로 최종 농도로 희석하였다. 완충액 단독(HBSS 대조군)과 함께 인큐베이션된 혈액을 기준선 CD11b 발현을 평가하기 위한 비자극 조건으로 사용하였다. IFX 항체 단독이 있는 혈액을 사용하여 인간 혈액에 대한 항체의 억제 또는 자극 효과를 제외하였다. 혼합 샘플을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 C5a 매개 CD11b 상향 조절을 유도했다. 그 후, FITC-접합된 항-마우스 CD11b 항체를 샘플과 함께 얼음 위에서 30분 동안 추가로 인큐베이션하여 과립구 세포 표면의 CD11b를 염색하였다. 형광 신호를 유세포분석기를 통해 포획하였다.

통계적 분석

그래프 및 통계 분석을 GraphPad PRISM® V7.05로 수행하였다.

결과

IFX-1과 비교하여 IFX-2 클론은 C5a에 균등하게 잘 결합하였다

C5a에 대한 IFX-2 클론의 결합을 특성화하기 위해, rhC5a 기반 ELISA 플랫폼을 사용하였다. 3.91ng/mL 내지 250ng/mL 범위의 12x IFX-2 및 1x IFX-1(VH0Vk0) 클론을 1μg/mL rhC5a 코팅 96웰 플레이트에 샘플로 적용했다. 그런 다음 C5a-포획된 IFX 클론을 0.04μg/mL의 HRP-접합된 항-인간 IgG4 mAb로 검출하였다. 더 많은 IFX 항체가 C5a에 결합할수록 더 강한 화학발광 신호가 나타날 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 적용된 농도 범위에서 시험된 모든 항체는 비교가능한 투여량 의존성 방식으로 코팅된 rhC5a에 결합하였다.

유사한 ELISA 기반 분석을 ABZENA에서 수행하여 C5a 결합에 대한 IFX 클론의 EC50을 정량화했다. 0 내지 100ng/mL 범위에서 모든 IFX 클론은 C5a에 매우 근사한 결합 거동을 보였다. 모 분자 IFX 1과 비교하여, 모든 IFX 2 클론의 상대 EC₅₀은 2배수 범위 내에 있었고 중앙값(median value)은 1.04였다(표 2).

C5a 결합 친화도에 대한 IFX-2 대 IFX-1(VH0Vk0)의 상대적 EC₅₀.

샘플 ID	상대 EC ₅₀	샘플 ID	상대 EC ₅₀
VH0Vk0 (IFX-1)	1.00	VH4Vk3	0.91
VH2Vk3	1.09	VH4Vk4	1.03
VH2Vk4	0.99	VH5Vk1	1.28
VH3Vk2	1.05	VH5Vk2	1.05
VH3Vk4	0.86	VH5Vk3	1.14
VH4Vk1	1.00	VH5Vk4	1.53
VH4Vk2	0.86	IFX-2 클론의 중앙값	1.04

IFX-2 항체는 막 공격 복합체(MAC)의 형성에 대한 억제를 나타내지 않았다

모 IFX-1(VH0Vk0)은 C5a 및 C5b로의 C5 절단을 방해하지 않으면서 C5a를 중화시키는 것으로 알려져 있다. C5b는 막 공격 복합체 C5b-9의 출발 물질로, 이는 통상적 보체 경로의 최종 산물이며 막에 기공을 형성한다. 총 용혈 보체 역가(CH50)를 감작화된 양 적혈구(SRBC)의 MAC 매개 용혈을 통한 통상적 보체 경로의 활성화를 지수화하는데 사용하였다. 각각의 IFX 클론(12x IFX-2 및 1x IFX-1(VH0Vk0))의 초기 농도가 100μg/mL인 풀링된 인간 혈장을 4-, 8-, 16-, 32-, 64-, 및 128배수로 연속 희석하고, 적혈구 현탁액과 함께 인큐베이션하였다. 용혈 정도를 450 nm에서 상청액으로 방출된 헤모글로빈의 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

각 시험 IFX 클론의 CH50(혈장 희석 배).

샘플 ID	CH50 (DF, 배수)	샘플 ID	CH50 (DF, 배수)
VH0Vk0 (IFX-1)	74.25	VH4Vk3	70.47
VH2Vk3	72.62	VH4Vk4	75.31
VH2Vk4	74.19	VH5Vk1	71.20
VH3Vk2	76.71	VH5Vk2	74.21
VH3Vk4	75.46	VH5Vk3	73.24
VH4Vk1	75.69	VH5Vk4	76.87
VH4Vk2	72.04	IFX-2 클론의 중앙값	74.20

도 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, IFX-2 클론의 70배수 내지 77배수(중앙값 74배수) 희석액 또는 모분자 IFX-1의 74배수 희석액은 50% 용혈(CH50)을 달성하는데 필요하였으며, 이는 매우 비교가능하다. IFX-2 클론의 돌연변이가 통상적 보체 경로의 활성화를 손상시키지 않은 것으로 나타났다.

IFX-2 항체는 rhC5a-유도된 CD11b 상향조절을 효과적으로 차단하였다

인간 과립구 표면의 CD11b 상향조절은 인간 전혈에 rhC5a를 첨가한 후 수분 이내에 검출가능하다. CD11b 수준을 형광 표지된 항-CD11b 항체를 사용하여 결정하고 평균 형광 강도(MFI)로 표시하였다. rhC5a-유도된 CD11b 상향 조절의 차단을 2개의 CD11b 효능 분석에서 IFX-1과 비교하여 12x IFX-2 항체로 평가하였다. 두 분석 모두에서 16.7 nM rhC5a를 자극으로 사용하였으며, 이는 각각 CD11b 발현의 3.65배 및 5.89배수 상향조절을 유도했다. 모든 IFX 클론을 CD11b 상향조절에 대한 차단에 대해 1:1 몰비로 시험하였다. IFX 클론의 차단 활성을 rhC5a 자극 조건에 대한 각각의 형광 강도 변화에 따라 계산하였다. 모 분자 IFX-1의 활성을 100%로 설정하였다. 1:1의 rhC5a:IFX 클론 비에서 IFX-2 클론은 상대 차단 활성의 94% 내지 104%를 보여주었다(도 3 참조). IFX-2 클론의 중앙값 상대 차단 활성은 100.68%였다.

실시예 3: IFX-1/IFX-2 처리 후 비인간 영장류에서 ADA 분석

재료 및 시약

시약 및 공급업체.

전구체	공급업체	제품 번호
AnalaR 물	VWR International	102923C
아비딘-HRP	Biolegend	405103
용액 C (TMB)	Biolegend	78105
토끼 항-CaCP29-IgG4 pAB	Charles River	n/a
IFX-1	InflaRx	n/a
IFX-2	InflaRx	n/a
차단 완충액 I	AppliChem	A7099.0500
Cross Down 완충액	AppliChem	A6485.0500
원숭이 혈청	LPT Hamburg	n.a.
PBS 분말	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
아지드화나트륨 NaN₃	VWR International	1.06688.0100
중탄산나트륨 NaHCO3	VWR International	L1703
탄산나트륨 Na₂CO₃	Honeywell	31432-250G
황산 H₂SO₄	VWR International	258105-100ML
Tween20	Sigma-Aldrich	P1379-25ML

방법

항-약물 항체를 2단계 접근법으로 결정한다. 혈청 샘플을 ADA 스크리닝 ELISA 내에서 항-약물 항체에 대해 스크리닝한다. 광학 밀도(OD)를 기반으로 하는 고정 분석 컷포인트는 0.102(IFX-1 ADA 검출을 위한 인간 혈장을 사용한 ADA 스크리닝 ELISA 검증에 따름)이며 9%의 위양성 샘플을 생성해야 한다. 따라서 ADA 스크리닝 ELISA에서 양성으로 얻은 샘플을 결과를 확인하거나 거부하고 해당되는 경우 ADA 농도를 결정하기 위해 ADA 스크리닝 ELISA 내에서 분석해야 한다.

ADA 스크리닝 ELISA는 포획 항체(비표지) 및 검출 항체(비오틴 표지)로서 약물 IFX-1(항-인간 C5a 항체)을 사용하는 가교 ELISA이다. 보정(CAL) 곡선의 작도 및 특질 관리(QC) 샘플의 스파이킹에 사용된 항-약물 항체를 정제된 IFX-1로 토끼를 면역시킨 후 토끼 혈청에서 정제했다. 항-약물 항체는 2개의 결합 부위를 가지고 있기 때문에 검출에 사용되는 표지된 IFX-1뿐만 아니라 포획 IFX-1 모두에 결합할 수 있다(가교). ADA-양성으로 스크리닝된 모든 혈장 샘플을 ADA 스크리닝 ELISA 설정을 기반으로 하는 ADA 확인 ELISA에서 재평가한다. 플레이트 상의 포획된 IFX-1에 대한 잠재적인 항-약물 항체의 결합을 경쟁시키기 위해 추가적인 유리 비표지 약물(IFX-1)을 샘플에 첨가한다. 사용 가능한 항약물 항체가 있는 경우 이는 추가된 유리 비표지 IFX-1에 결합하므로 검출할 수 없다. 약물 특이적인 ADA 억제가 관찰되어 스크리닝 결과가 확인되면 샘플은 양성으로 확인된 것으로 고려된다.

ADA 스크리닝 ELISA 및 ADA 확인 ELISA를 하기에 기재된 바와 같이 수행하였다:

간략하게, 100 μl/웰 포획 항체(IFX-1, 0.5 μg/ml)를 고결합(high binding) 플레이트 상에서 5 ± 3℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 단계 후, 200μl 차단 완충액을 각 웰에 피펫팅하고 플레이트를 37℃ ± 2℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 또 다른 세척 단계 후 100μl/웰 CAL 샘플, QC 샘플 및 해당 샘플(시험 샘플)을 웰에 피펫팅하고 37℃ ± 2℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세척 단계 후, 100 μl의 검출 항체(비오틴화된 IFX-1, 0.08 μg/ml)를 37℃ ± 2℃에서 60분 동안 인큐베이션하기 위해 각 웰에 피펫팅한다. 그 후 플레이트를 세척하고 100μl 희석된 아비딘-HRP(1:3000)를 각 웰에 첨가하고 37℃ ± 2℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 최종 세척 단계 후, 100 μl/웰 TMB(기질 용액)를 첨가하고, 빛이 차단된 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 100 μl/웰의 희석된 황산을 첨가하여 반응을 정지시킨다. 색 강도를 magellan™ 6.5 소프트웨어를 사용하는 Tecan Infinite M200 판독기로 450nm에서 분석한다.

미지의 ADA 농도를 갖는 혈장 샘플을 ADA 스크리닝 ELISA에서 분석하기 전에 CrossDown 완충액에서 1:2로 희석한다. ADA 확인 ELISA에서 재평가를 위해 샘플을 CrossDown 완충액에서 1:2로 희석하고 약물이 스파이킹된 CrossDown 완충액(IFX-1 농도 100μg/ml)에서 1회 희석한다.

ADA 스크리닝 분석에서 OD 값이 0.102 미만인 샘플을 "음성"으로 분류한다. ADA 확인 분석에서 신호 차단이 50% 초과인 샘플을 "확인된 양성"으로 분류한다. 결과는 표 5에 나와 있다:

결과

IFX-2 처리된 동물은 투여 후 8주째에 검출가능한 ADA가 발생하지 않았다.

ADA 스크리닝 및 확인 ELISA 요약

IFX-1 시험 동물			IFX-2 시험 동물
동물 ID (시점)	ADA 스크리닝	ADA 확인	동물 ID (시점)	ADA 스크리닝	ADA 확인
#1 (pre)	음성	정보없음	#13 (pre)	음성	정보없음
#1 (TD 57)	음성	정보없음	#13 (TD 57)	음성	정보없음
#2 (pre)	음성	정보없음	#14 (pre)	음성	정보없음
#2 (TD 57)	잠재적 양성	확인된 양성	#14 (TD 57)	음성	정보없음
#3 (pre)	음성	정보없음	#15 (pre)	음성	정보없음
#3 (TD 57)	음성	정보없음	#15 (TD 57)	음성	정보없음
#4 (pre)	음성	정보없음	#16 (pre)	음성	정보없음
#4 (TD 57)	잠재적 양성	확인된 양성	#16 (TD 57)	음성	정보없음
#5 (pre)	음성	정보없음	#17 (pre)	음성	정보없음
#5 (TD 57)	음성	정보없음	#17 (TD 57)	음성	정보없음
#6 (pre)	음성	정보없음	#18 (pre)	음성	정보없음
#6 (TD 57)	음성	정보없음	#18 (TD 57)	음성	정보없음

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SEQUENCE LISTING <110> InflaRx GmbH <120> Humanized anti-C5a antibodies <130> 680-10 PCT <150> EP20173255.9 <151> 2020-05-06 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 1 5 10 15 Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu 20 25 30 Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45 Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn 50 55 60 Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg 65 70 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser His Lys Asp Met Gln Leu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Lys Asp Met Gln 1 5 <210> 6 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH0 <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser 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Ser Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V_kappa_1 <400> 13 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Glu Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V_kappa_2 <400> 14 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 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MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa38 is K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa48 is I or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa63 is K or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa68 is A or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa70 is L or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa82 is E or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (86)..(86) <223> Xaa86 is L or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa87 is R or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa91 is S or T <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Phe 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asp Gln Xaa Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Xaa Thr Xaa Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Xaa Leu Ser Ser Xaa Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Asp Gly Tyr Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence formed from the combination of V_kappa_1 to V_kappa_4 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa3 is V or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa4 is L or M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa9 is A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa12 is A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa62 is I or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa84 is E or P <400> 18 Asp Ile Xaa Xaa Thr Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Xaa Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Xaa Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IFX-1 CDR1 heavy chain <400> 20 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Phe Trp Met Asp 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims

중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)으로서,
상기 VH 도메인은
서열번호 10 (QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT TFWMDWVRQA PGQGLEWIGR IDPSDSESRL DQRFKDRVTM TVDKSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS, VH4)에 따른 아미노산 서열 또는
서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열(여기서, 서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 20 내지 22의 CDR1H, CDR2H, 및 CDR3H 서열을 포함하고, 서열번호 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 아미노산 위치 5의 V, 아미노산 위치 10의 E, 아미노산 위치 12의 K, 아미노산 위치 13의 K, 아미노산 위치 16의 A, 아미노산 위치 40의 A, 및/또는 아미노산 위치 76의 T를 포함함)
을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,
상기 VL 도메인은
서열번호 16 (DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K, Vκ4)에 따른 아미노산 서열 또는
서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열(여기서, 서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 23 내지 25의 CDR1L, CDR2L, CDR3L 서열을 포함하고, 서열번호 16과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은 아미노산 위치 13의 A, 아미노산 위치 15의 V, 아미노산 위치 17의 D, 아미노산 위치 19의 V, 아미노산 위치 22의 T, 아미노산 위치 46의 K, 아미노산 위치 47의 A, 아미노산 위치 64의 S, 아미노산 위치 78의 T, 아미노산 위치 80의 S, 아미노산 위치 81의 S, 아미노산 위치 82의 L, 아미노산 위치 83의 Q, 아미노산 위치 87의 F, 및/또는 아미노산 위치 104의 Q를 포함함)
을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
상기 VH 도메인은
서열번호 17 (QVQLVQSGX⁹E X¹¹KKPGASVKX²⁰ SCKASGYSFT TFWMDWVX³⁸QA PGQGLEWX⁴⁸GR IDPSDSESRL DQX⁶³FKDRX⁶⁸TX⁷⁰ TVDKSTSTVY MX⁸²LSSX⁸⁶X⁸⁷SED X⁹¹AVYYCARGN DGYYGFAYWG QGTLVTVSS)에 따른 아미노산 서열(여기서, X⁹는A 또는 P이고, X¹¹은L 또는 V이고, X²⁰은I 또는 V이고, X³⁸은K 또는 R이고, X⁴⁸은I 또는 M이고, X⁶³은K 또는 R이고, X⁶⁸은A 또는 V이고, X⁷⁰은L 또는 M이고, X⁸²는 E 또는 Q이고, X⁸⁶은L 또는 P이고, X⁸⁷은R 또는 T이고, X⁹¹은 S 또는 T임), 또는
1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 17에 따른 아미노산 서열(1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 20 내지 22의 CDR1H, CDR2H, CDR3H 서열을 포함함)
을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,
상기 VL 도메인은
서열번호 18 (DIX³X⁴TQSPX⁹S LX¹²ASVGDRVT ITCKASQSVD YDGDSYMKWY QQKPGKAPKL LIYAASNLQS GX⁶²PSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQX⁸⁴EDFATY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K)에 따른 아미노산 서열(여기서, X³은V 또는 Q이고, X⁴는L 또는 M이고, X⁹는A 또는 S이고, X¹²는 A 또는 S이고, X⁶²는I 또는 V이고, X⁸⁴는E 또는 P임), 또는
1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 18에 따른 아미노산 서열(여기서, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열은 각각 서열번호 23 내지 25의 CDR1L, CDR2L, CDR3L 서열을 포함함)
을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 VH 도메인은 VH1 내지 VH5 (서열번호 7 내지 11)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고/지거나;
상기 VL 도메인은 Vκ1 내지 Vκ4 (서열번호 13 내지 16)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은
a) 서열번호 10 (VH4)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인, 및 서열번호 16 (Vκ4)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인, 또는
b) 서열번호 11 (VH5)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VH 도메인, 및 서열번호 15 (Vκ3)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 VL 도메인
을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 도메인(constant domain)을 추가로 포함하고, 상기 불변 도메인은 서열번호 19에 따른 아미노산 서열(IgG4 WT 불변)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어지고,
서열번호 19에 따른 상기 아미노산 서열은 선택적으로 선택적으로
- 아미노산 교체(exchange) S108P;
- 아미노산 교체 T130Q 및 M308L;
- 아미노산 교체 M132Y, S134T, 및 T136E
중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fd 단편, Fv 단편, 이황화물-연결(disulfide-linked) Fvs (dsFv), 단일 도메인 항체 및 단일 사슬 Fv (scFv) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은
- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 10nM 이하의 K_d 값으로 C5a에 대한 결합 상수를 갖는 특성;
- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 한 분자 C5a에 의해 유도된 생물학적 효과에 대해 적어도 75%의 차단 활성(blocking activity)을 나타내는 특성;
- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 인간 혈장에서 CH50 활성을 억제하지 않는 특성;
- 상기 항체 또는 상기 이의 항원-결합 단편은 IFX-1과 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 특성
중 하나 이상을 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고;
하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제(glidant), 붕해제(disintegrant), 흡착제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약제(medicine)에 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
병리학적 C5a 활성을 포함하는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
제11항에 있어서, 질병 또는 장애는
- 자가면역 장애(autoimmune disorder),
- 염증성 장애(inflammatory disorder), 자가-염증성 장애(auto-inflammatory disorder), 또는 관련 병태(condition),
- 심혈관 또는 뇌혈관 장애(cardiovascular or cerebrovascular disorder),
- 박테리아 또는 바이러스 감염,
- 신경퇴행성 장애(neurodegenerative disorder) 또는 관련 질병, 및
- 암 또는 전암 병태(precancerous condition)
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.