MX2012006060A - Porciones de enlace a anti-c5a con alta actividad de bloqueo. - Google Patents

Porciones de enlace a anti-c5a con alta actividad de bloqueo.

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Abstract

La presente invención se refiere a porciones de enlace que se enlazan específicamente a un epítopo conformacional de C5a, en particular C5a humana. Las porciones de enlace preferida son los anticuerpos anti-C5a que se enlazan a este epítopo conformacional. Las porciones de enlace descritas en este documento son útiles como agentes activos en composiciones farmacéuticas para el tratamiento y prevención de varias enfermedades agudas y crónicas, en particular enfermedades inflamatorias agudas, tal como el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y diferentes grados de sepsis incluyendo sepsis, sepsis grave y choque séptico.

Description

PORCIONES DE ENLACE A ANTI-C5a CON ALTA ACTIVIDAD DE BLOQUEO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a porciones de enlace que se enlazan específicamente a un epítopo conformacional de C5a, en particular C5a humano. Las porciones de enlace preferidas son anticuerpos anti-C5a que se enlazan a este epítopo conformacional . Las porciones de enlace descritas en este documento son útiles como agentes activos en composiciones farmacéuticas para el tratamiento y prevención de varias enfermedades agudas y crónicas, en particular enfermedades inflamatorias agudas, tal como el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) , y diferentes grados de sepsis incluyendo sepsis, sepsis grave y choque séptico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El C5a se escinde de C5 en la activación del complemento. Entre los productos de activación del complemento, C5a es uno de los péptidos inflamatorios más potentes, con un amplio espectro de funciones (Guo y Ward 2005) . El C5a es una glicoproteína presente en la sangre de humanos sanos con un peso molecular de 11.2 kDa. La porción de polipéptido de C5a contiene 74 aminoácidos, que representan un peso molecular de 8.2 kDa mientras que la porción de carbohidratos representa aproximadamente 3 kDa. El C5a ejerce sus efectos a través de los receptores de C5a de alta afinidad (C5aR y C5L2) (Ward 2009). El C5aR pertenece a la familia de tipo rodopsina de receptores acoplados a la proteína G con siete segmentos transmembrana; el C5L2 es similar pero no está . acoplado a la proteína G. se cree actualmente que el. C5a ejerce sus funciones biológicas principalmente a través de la interacción de C5a-C5aR, ya que se han descubierto pocas respuestas biológicas para la interacción de C5a-C5L2. El C5aR se expresa ampliamente en las células mieloides incluyendo . neutrófilos , eo.sinófilos, basófilos, y monocitos, y células no mieloides en muchos órganos, especialmente en los pulmones e hígado, indicativos de la importancia de la señalización de C5a/C5aR. El C5a tiene una variedad de funciones biológicas (Guo y Ward 2005) . El C5a es un quimioatrayente potente para neutrófilos y también tiene actividad quimiotáctica para miocitos y macrófagos. El C5a causa un estallido oxidante (consumo de 02) en los neutrófilos, y aumenta la fagocitosis y libera enzimas granulares. También se ha descubierto que el C5a es un vasodilatador. Se ha mostrado que el C5a se implica en la modulación de la expresión de citocinas a partir de varios tipos de células, para aumentar la expresión de moléculas de adhesión en los neutrófilos. Se descubrió que el C5a es sumamente perjudicial ' cuando se produce demasiado en los entornos de enfermedad, ya que es un potenciador e inductor potente para respuestas inflamatorias que funcionan en la cadena arriba de la cadena de reacción inflamatoria. Altas dosis de C5a pueden conducir a "desensibilización" quimiotáctica no especifica para neutrófilos, causando en consecuencia amplia disfunción (Huber-Lang y colaboradores 2001a) .
Se ha reportado- que C5a ejerce numerosas respuestas pro-inflamatorias, y se ha reportado que es perjudicial durante la sepsis. La inhibición de C5a o el receptor de C5a (C5aR) por anticuerpos han mostrado que mejora notablemente la supervivencia en varios modelos en sepsis en ratones y ratas (Czermak y colaboradores 1999; Guo y colaboradores 2000;. Huber-Lang y colaboradores 2001b; Riedemann y colaboradores 2002a) . Además, varios reportes han mostrado efectos perjudiciales del C5a para funciones inmunes y de órganos innatas intactas durante la sepsis experimental (Guo y colaboradores 2000; Guo y colaboradores 2002-; Huber-Lang y colaboradores 2001a; Huber-Lang y colaboradores 2002; Laudes y colaboradores 2002; Riedemann y colaboradores 2003; Riedemann y colaboradores 2004a; Riedemann y colaboradores 2004b) . El C5a actúa como una anafilatoxina y se ha reportado que ejerce numerosos efectos pro-inflamatorios. En humanos, altos niveles de sepsis de C5a se ha reportado que se asocian con el resultado significativamente empeorado en varios estudios (Bengtson y Heideman 1988; Nakae y colaboradores 1994; Nakae y colaboradores 1996) .
En el entorno experimental en la sepsis, la exposición de neutrófilos a C5a puede conducir a disfunción de neutrófilos y parálisis de rutas de señalización, conduciendo al ensamble defectuoso de NADPH oxidasa, parálisis de cascada de señalización MAP, un estallido oxidante grandemente deprimido, fagocitosis y quimiotaxis (Guo y colaboradores 2006a; Huber-Láng y colaboradores 2002). La apoptosis de timocitos y apoptosis de neutrófilos retardada son dos eventos patogénicos importantes para el desarrolla de sepsis, que son dependientes en la presencia de C5a (Guo y colaboradores 2000; Guo y colaboradores 2006b) . Durante la sepsis experimental, el C5a regula por incremento la expresión de la integrina ß2 en los neutrófilos para promover la migración celular en los órganos (Guo y colaboradores 2002),. una de las causas principales de falla orgánica múltiple (MOF) . También se descubrió que el C5a es atribuible a la activación de la ruta de coagulación que se lleva a cabo en la sepsis experimental (Laudes y colaboradores 2002). El C5a estimula la síntesis y liberación de leucocitos humanos de citocinas pro-inflamatorias tales como TNF-a, IL-ß, IL-6, IL-8, y el factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) (Hopken y colaboradores 1996; Riedemann y colaboradores 2004a; Strieter y colaboradores 1992) . El C5a produce un potente efecto sinérgico con LPS en la producción de TÑF-a, la proteina inflamatoria de macrófagos (MEP)-2, quimioatrayente de neutrófilos inducidos por citocina (CINC)-l, e IL-?ß en células epiteliales alveolares (Riedemann . y colaboradores 2002b; Rittirsch y colaboradores 2008) . Dado que la activación que el complemento es un evento que se lleva a cabo durante el inicio de la sepsis,, el C5a puede entrar en juego antes de la emergencia de la "tormenta de citocinas inflamatorias". Parece que el C5a desempeña una función clave en orquestar el desempeño de la red de citocinas y la formación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) . El bloqueo del C5a en el entorno de la sepsis experimental atenúa notablemente el MOF y SIRS. La regulación por incremento generalizada de la expresión de C5aR se lleva a cabo durante el inicio de la sepsis, y el bloqueo de la interacción de C5a/C5aR por anti-C5a, o anticuerpos anti-C5aR, o antagonistas de C5aR se vuelve altamente protectores los efectos en los modelos de roedor de la sepsis (Czermak y colaboradores 1999; Huber-Lang y colaboradores 2001b; Riedemann y colaboradores 2002a) .
Además de la indicación de sepsis, el bloqueo de C5a también ha probado que es protector en muchos otros modelos de inflamación tal como lesión por isquemia/reperfusión, enfermedad renal, rechazo de injerto, malaria, artritis reumatoide, enfermedad infecciosa del intestino, enfermedad inflamatoria de los pulmones, enfermedades autoinmunes similar a lupus, enfermedad neurodegenerativa, etcétera en varias especies como es revisadas parcialmente bajo Klos A. et al (Klos y colaboradores 2009) y Allegretti . et al (Allegretti y colaboradores 2005) . Por otra parte, se ha descubierto recientemente que . el bloqueo de C5a ha mostrado un potente beneficio terapéutico en un modelo de tumor en ratones (Markiewski y colaboradores 2008) .
Problemas Técnicos que Subyacen a la Presente Invención Los anticuerpos que se enlazan específicamente a la parte de C5a pero no a la .parte de C5b de C5 son conocidos de la técnica anterior (Klos y colaboradores (1998) J. Immunol. Meth. 111: 241-252; O 01/15731; WO 03/015819).
Sin embargo, los anticuerpos anti-C5a previamente generados mostraron solamente actividades de bloqueo moderado en efectos biológicos inducidos por C5a. En consecuencia, los anticuerpos anti-C5a de la técnica anterior ya sea no fueron capaces de lograr un bloqueo completo de efectos biológicos inducidos de C5a o tuvieron que ser utilizados en cantidades superestequiométricas para alcanzar un bloqueo razonablemente alto de actividad de C5a.- De esta manera, especialmente en vista de un uso clínico potencial en pacientes, hubo una necesidad en la técnica anterior por anticuerpos anti-C5a u otras porciones de enlace que muestran una actividad de bloqueo más potente para efectos biológicos inducidos por C5a mientras que se enlazan específicamente a C5a con alta afinidad. También, de manera preferente, estos anticuerpos no se deben enlazar a C5b y en consecuencia no deben afectar las actividades biológicas de C5b.
De manera bastante sorprendente, los inventores de la presente invención fueron capaces de identificar un nuevo epítopo de enlace adaptivo con anticuerpos de enlace correspondientes que cumplen los requisitos avanzados mencionados en lo anterior y otros. En experimentos tediosos que subyacen a la presente invención, se podrían generar dos anticuerpos anti-C5a de más de 2000 que muestren una actividad de bloqueo improcedentes a los efectos biológicos inducidos por C5a cuando se empleen en cantidades estequiométricas , es decir 0.5 mol de un anticuerpo bivalente por mol de C5a.
La descripción general anterior no describe necesariamente todos los problemas resueltos por la presente invención .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una porción de enlace que se enlaza a un epitopo conformacional formado por secuencias de aminoácidos X1X2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) y X5X6KX7X8X9L (SEQ ID NO: 19) de C5a, en donde Xi se selecciona del grupo que consiste de N, H, D, F, K, Y, y T; X2 se selecciona del grupo que consiste de D, L, Y, y H; X3 se selecciona del grupo que consiste de Q, E, y K; X4 se selecciona del grupo que consiste de A, V, y L; X5 se selecciona del grupo que- consiste de S, H, P, y N; X6 se selecciona del grupo, que consiste de H y N; X7 se selecciona del grupo que consiste de D, N, H, P, y G; X8 se selecciona del grupo que consiste de M, L, I, y V; y X9 se selecciona del grupo que consiste de Q, L, e l.
En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo que comprende: (i) una secuencia CDR3 de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 6; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 7; en donde la secuencia CDR3 de' cadena pesada comprende opcionalmente intercambios de 1, 2, o 3 aminoácidos, supresiones de 1, 2 o 3 aminoácidos y/o adiciones de 1, 2, o 3 aminoácidos.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende (a) una porción de enlace de acuerdo, con el primer aspecto o (b) el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo de acuerdo con el segundo aspecto y que comprende además uno o más portadores, diluyentes, excipientes, rellenos, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, desintegrantes, absorbentes y/o conservadores.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un uso de (a) una porción de enlace de acuerdo con el primer aspecto o (b) un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo de acuerdo con el segundo aspecto con la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y o tratamiento de varias enfermedades que implican inflamación aguda tal como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tal como enfermedad cardíaca isquémica, lesión aguda de pulmón, neumonía, rechazo de injerto agudo y crónico en pacientes de trasplante, reacciones de injerto contra el hospedero, pero también enfermedades que implican un tipo crónico de inflamación tal como enfermedades glomerulares renales tal como glomerulonefritis y otras entidades de insuficiencia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares tales como enfermedad de Bechterew enfermedades de tipo lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, crecimiento tumoral o cáncer de órganos sólidos.
En un quinto aspecto, la presente invención se dirige a un método para tratar síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) , sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tal como enfermedad cardiaca isquémica, lesión aguda de pulmón, neumonía, rechazo de injerto agudo y crónico en pacientes de trasplante, reacciones de injerto contra el hospedero, enfermedades glomerulares renales tal como glomerulonefritis y otras entidades de insuficiencia renal, artritis reumatoide enfermedades autoinmunes similares tales como enfermedad de Bechterew, enfermedades tipo lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, crecimiento de tumor o cáncer de órganos sólidos en un paciente en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de (a) una porción de enlace de acuerdo con el primer aspecto o (b) un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con el segundo aspecto.
Este sumario de la invención no describe necesariamente todas lás características de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de los mutantes C5a en las liberaciones de enzima a partir de células de sangre.
Los aminoácidos potenciales en las moléculas C5a para la constitución de epítopos de anticuerpo se mutaron en alanina, y estos mutantes C5a se sometieron a prueba para su bioactividad para inducir liberaciones de lisozimas de células de sangre entera humana. La mutación de sitio C5a que da por resultado más de 50% de pérdida de bioactividad en comparación con la C5a humana se consideró como un sitio crítico para la función biológica de C5a. Estos sitios son 24, 29, 31, 37, 68, y 69.
La Figura 2 muestra la capacidad de enlace de INab308 a los mutantes C5a La C5a y los mutantes C5a se recubrieron en una placa de 96 pocilios. Las capacidades de enlace de INab308 a estas proteínas se evaluaron por el procedimiento ELISA. La pérdida de capacidad de enlace mayor que 50% se considera significativa. Los datos indican que INab308 se enlaza a dos regiones, 31-37 y 68-69.
La Figura 3 muestra la capacidad de enlace de INab708 a los mutantes C5a La C5a y los mutantes C5a se recubrieron en una placa de 96 pocilios. Las capacidades de enlace de INab708 a estas proteínas se evaluaron por el procedimiento ELISA. La pérdida de capacidad de enlace mayor que 50% se considera significativa. Los datos indican que INab708 se enlaza a dos regiones, 31-37 y 68-70.
Figura 4: INab308 y INab708 no afectan la actividad de CH50 del plasma humano La actividad hemolítica del plasma humano se determinó por el ensayo CH50 clásico. Anticuerpos monoclonales a C5a humanos incluyendo INab708, INab308, y F20, se pre-incubaron con plasma humano, y luego se realizó subsecuentemente el ensayo CH50. Entre estos anticuerpos, el F20 inhibe fuertemente la actividad de CH50, mientras que INab708 y INab308 no tienen influencia cuando se utilizan en una concentración de aproximadamente 5 µ?, que es significativamente mayor que la concentración de C5 que ocurre en la sangre entera humana (aproximadamente 0.4 µ?) .
Figuras 5A-5C muestran una comparación de los efectos de bloqueo de INab308, INab708, y L2B23 en la bioactividad de C5a La actividad de bloqueo de INab308, INab708 y L2B23 se evalúo por el ensayo de liberación de lisozimas inducida por C5a. La relación molar del anticuerpo a C5a se ajustó a 1:2 para evaluar la actividad de' bloqueo de un anticuerpo al efecto biológico inducido por dos moléculas de C5a. Los datos muestran que INab308 y INab708 poseen actividad de bloqueo muy alta (>90%) a bioactividad de C5a, mientras que L2B23 solamente muestra un efecto mínimo.
La Figura 6 muestra el efecto inhibidor de INab308 y INab708 en la producción de IL-8 inducida por E. col± en sangre entera humana.
El E. coli se incubó con sangre entera durante 4 horas, y los niveles de IL-8 se evaluaron por el ELISA. En presencia de INab308 y INab708 ' durante la incubación, los niveles de IL-8 se atenuaron significativamente (P < 0.01), mientras que no hubo reducción significativa en presencia de L2B23.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Antes de que la presente invención se describa con detalle a continuación, se va a entender que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos en este documento ya que estos pueden variar. También se va a entender que la terminología utilizada en este documento es para el propósito de describir solamente modalidades particulares, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención que se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.
De manera preferente, los términos utilizados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations ) " , Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds . (1995), Helvética Chimica Acta, CH-40.10 Basel, Suiza) .
Por toda esta especificación y reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprenden", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá por implicar la inclusión de un número entero establecido o etapa o grupo de números enteros o etapas pero la no. la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de número entero o etapa.
Varios documentos son citados por todo el texto de esta especificación. Cada uno de los documentos citados en este documento (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, peticiones de secuencia de Número de Acceso de GenBank etcétera) , ya se supra o infra, se incorporan en este documento a manera de referencia en su totalidad. Nada de ese documento se va a considerar como una misión de que la invención no concede derecho para anteceder esta descripción en virtud de la invención anterior.
Como se utiliza en este documento, "C5a humano" se refiere al siguiente péptido de 74 aminoácidos: TLQKKIEEIA AKYKHSWKK CCYDGACVNN DETCEQRAAR ISLGPRCIKA FTECC ASQ LRANISHKDM QLGR (SEQ ID NO: 1) .
El término "porción de enlace", como se utiliza en este documento, se refiere a cualquier molécula o parte de una molécula que se pueden hacer específicamente a una molécula objetivo o epitopo objetivo. Las porciones de enlace preferidas en el contexto de la presente solicitud son (a) anticuerpos o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos; (b) oligonucleótidos ; (c) proteínas similares a anticuerpos; o (d) peptidomiméticos, "Porciones de enlace" que se pueden utilizar para practicar la presente invención son capaces de enlazarse a un epitopo conformacional de C5a de mamífero que se forma por las dos secuencias de aminoácidos XiX2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) y X5X6KX7X8 9L (SEQ ID NO: 19), en donde Xi se selecciona del grupo que consiste de N, H, D, F, K, Y, y T; X2 se selecciona del grupo que consiste de D, L, Y, y H; X3 se selecciona del grupo que consiste de Q, E, y K; X4 se selecciona del grupo que consiste de A, V, y L; X5 se selecciona del grupo que consiste de S, H, P, y N; X6 se selecciona del grupo, que consiste de H y N; X7 se selecciona del grupo que consiste de D, N, H, P, y G; X8 se selecciona del grupo que consiste de M, L, I, y V; y X9 se selecciona del grupo que consiste de Q, L, e l. "Porciones de enlace" que son particularmente adecuadas para practicar la presente invención son capaces ' de enlazarse a un epitopo conformacional de C5a humano que se forma por las dos secuencias de aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) .
Como se utiliza en este documento, un primer compuesto (por ejemplo un anticuerpo) se considera que se "enlaza" a un segundo compuesto (por ejemplo un antigeno tal como una proteina · objetivo), si tiene una constante de disociación Kd al segundo compuesto de 1 mM o menor, de manera preferente de 100 µ? o menor, de manera preferente de 50 µ? o menor, de manera preferente de 30 µ? o menor, de manera preferente de 20 µ? o menor, de manera preferente de 10 µ? o menor, de manera preferente de 5 µ? o menor, de manera más preferente de 1 µ? o menor, de manera más preferente de 900 nM o menor, de manera más preferente de 800 nM o menor, de manera más preferente de 700 nM o menor, de manera más preferente de 600 nM o menor, de manera más preferente de 500 nM o menor, de manera más preferente de 400 nM o menor, de manera más preferente de 300 nM o menor, de manera más preferente de 200 nM o menor, de manera aún más preferente de 100 nM o menor, de manera aún más preferente de 90 nM o menor, de manera aún más preferente de 80 nM o menor, de manera aún más preferente de 70 nM o menor, de manera aún más preferente de 60 nM o menor, de manera aún más preferente de 50 nM o menor, de manera aún más preferente de 40 nM o menor, de manera aún más preferente de 30 nM o menor, de manera aún más preferente de 20 nM - o menor, y de manera aún más preferente de 10 nM o menor.
El término "enlace" de acuerdo con la invención se refiere de manera preferente a un enlace especifica. "Enlace especifico" propone que una porción de enlace (por ejemplo un anticuerpo) se enlace fuertemente a un objetivo tal como un epitopo para el cual se comparar especifico con el enlace a otro objetivo. Una porción de enlace se enlaza fuertemente a un primer objetivo comparado con un segundo objetivo si se enlaza al primer objetivo con una constante de disociación (Kd) que es menor que la constante de disociación para el segundo objetivo. De manera preferente la constante de disociación (Kd) para el objetivo al cual la porción de enlace se enlaza específicamente es más de 10 veces, de manera preferente más de 20 veces, de manera más preferente más de 50 veces, de manera aún más preferente más de 100 veces, 200 veces, 500. veces o 1000 veces inferior que la constante de disociación (Kd) para el objetivo al cual la porción de enlace no se enlaza específicamente.
Como se utiliza en este documento, el término (Kd) (medido en "mol/L", algunas veces abreviado como "M") se propone para referirse a la constante de equilibrio de disociación de la interacción particular entre una porción de enlace (por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo) y una molécula objetivo (por ejemplo un antígeno o epítopo del mismo) .
Un "epítopo", también conocido como determinante antigénico, es la parte de una macromolécula que se reconoce por el sistema inmunitario, específicamente por anticuerpos, células B o células T. Como se utiliza en este documento, un "epítopo" es la parte de una macromolécula capaz de enlazarse a una porción de enlace (por ejemplo un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo) como se describe en este documento. En este contexto, el término "enlace" se refiere de manera preferente a. un enlace específico. Los epítopos consistes usualmente de agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen usualmente características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específicas. Do epítopos adaptivos y no adaptivos se distinguen en que el enlace al primero pero ¦ no al último es la pérdida en presencia de solventes de desnaturalización.
Como se utiliza en este documento, un "epitopo conformacional" se refiere a un epitopo de una macromolécula lineal (por ejemplo, un polipéptido) que se forma por la estructura tridimensional de la macromolécula. El contexto de la presente solicitud, un "epitopo conformacional" es un "epitopo discontinuo", es decir el epitopo conformacional en la macromolécula (por ejemplo un polipéptido) que se forma de por lo menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la macromolécula (por ejemplo la secuencia de aminoácidos de un polipéptido) . En otras palabras, un epitopo se considera que es un "epitopo conformacional" en el contexto de la presente invención, si el epitopo consiste por lo menos dos regiones esperadas en la secuencia primaria a la cual una porción de enlace de. la invención (por ejemplo un anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo) se enlaza simultáneamente, en- donde por lo menos estas dos regiones separadas se interrumpen por una o más regiones en la secuencia primaria en la cual una porción de enlace de la invención no se enlaza. De manera preferente, este "epitopo conformacional" está presente en un polipéptido, y las dos regiones separada en la secuencia primaria son dos secuencias de aminoácidos separadas a las cuales una porción de enlace de la invención (por ejemplo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo) se enlaza, en donde estas por lo menos dos secuencias de aminoácidos separadas se interrumpen por una o más secuencias de aminoácidos en la secuencia primaria a la cual una porción de enlace de la invención no se enlaza. De manera preferente, la secuencia de aminoácidos de interrupción es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende dos o más aminoácidos a los cuales la porción de enlace no se enlaza. Las por lo menos dos secuencias de aminoácidos separadas a las cuales una porción de enlace de la invención se enlaza no se limitan particularmente con respecto a su longitud. Esta secuencia de aminoácidos separada puede conseguir solamente de un aminoácido siempre y cuando el número total de aminoácidos dentro de por lo menos dos secuencias de aminoácidos separadas sea suficientemente grande para efectuar el enlace especifico entre la porción de enlace y el epitopo conformacional .
Un "parátopo" es la parte de un anticuerpo que reconoce el epitopo. En el contexto de la presente invención, un "parátopo" es la parte de una porción de enlace (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo) como se describe en este documento que reconoce el epitopo.
El término "anticuerpo" se refiere típicamente a una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro, o una porción de enlace a antígeno de los mismos. El término "anticuerpo" también incluye todas las formas recombinantes de anticuerpos, en particular de los anticuerpos descritos en este documento, por ejemplo anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glicosilados, y cualquier fragmento de anticuerpo de enlace a antígeno y derivados como se describen posteriormente. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como VH o VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está comprendida de una región, variable de cadena ligera (abreviada en este documento como VL o VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (COR) , intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arreglados de aminoterminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 , CDR3, ' FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con un. antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en enlace de la inmunoglobulina a tejidos o factores hospederos, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
El término "fragmento de enlace a antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de enlace"), como se utiliza en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de enlazarse específicamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de enlace a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten de los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd que consisten de los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) fragmentos de dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341: 544-546), que consiste de un dominio VH; (vi) regiones de determinación de complementariedad (CDR) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDRs aisladas que se pueden unir opcionalmente por una ligadura sintética. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes , por una ligadura sintética que les permite ser hechos como una sola cadena de proteínas en la cual las regiones VL y VH se parean para formar moléculas monovalentes (conocida como Fv de cadena individual (scFv); véase por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242: 423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883). Estos anticuerpos de cadena individual también se proponen para ser abarcados dentro del término "fragmento de enlace a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo 'adicional es una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace que comprende (i) un polipéptido de dominio de enlace que se fusiona a un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesadas de inmunoglobulina fusionada a la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región constante CH2. El polipéptido de dominio de enlace puede ser una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de enlace se 'dan a conocer adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellas personas con experiencia en la técnica, y los fragmentos se clasifican para utilidad en la misma manera ya que son anticuerpos intactos. Ejemplos adicionales de "fragmentos de enlace a antigeno" son los asi llamados microanticuerpos, que se derivan de CDRs individuales. Por ejemplo, Heap y colaboradores, 2005, describe un microanticuerpo de 17 residuos de aminoácido derivado de la CDR3 de cadena pesada de un anticuerpo dirigido' contra la glicoproteina de envoltura gpl20 de HIV-1. Otros¦ ejemplos incluyen miméticos de anticuerpo pequeños que comprenden dos o más regiones CDR que se fusionan entre si, de manera preferente por regiones de estructura cognadas. Este mimético de anticuerpo pequeño que comprende CDR1 VH y CDR3 VL enlazadas por el FR2 VH cognado se han descrito por Qiu y colaboradores, 2007.
De esta manera, el término "anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo" como se utiliza en este documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas es decir moléculas que contienen un sitio de enlace a antigeno que . enlaza inmunoespecificamente un antigeno. También están comprendidas proteínas similares a inmunoglobulina que se seleccionan a través de técnicas que incluyen, por ejemplo, expresión en fago para enlazarse específicamente a una molécula objetivo o epitopo objetivo, por ejemplo al epitopo conformacional de C5a formado por las secuencias de aminoácidos XiX2ETCEX3RX (SEQ ID NO: 18) y X5X6 X7X8 9L (SEQ ID NO: 19), en donde Xi, se selecciona del grupo que consiste de N, H, D, F, K, Y, y T; X2 se selecciona del grupo que consiste de D, L, Y, y H; X3 se selecciona del grupo que consiste de Q, E, y K; X4 se selecciona del grupo que consiste de A, V, y L; X5 se selecciona del grupo que consiste de S, H, P, y N; X6 se selecciona del grupo que consiste de H y N; X7 se selecciona del grupo que consiste de D, N, H, P, y G; Xs se selecciona del grupo que consiste de M, L, I, y V; y X9 se selecciona del grupo que consiste de Q, L, y I; o un epitopo conformacional de C5a humano formado por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; o el epitopo conformacional de C5a humano formado por la secuencia de aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4) y KDM. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, de manera preferente IgG2a e IgG2b, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Los anticuerpos y fragmentos de enlace a antígeno de los mismos utilizables en la . invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. De manera preferente, los anticuerpos o fragmentos son de humano, chimpancé, roedor (por ejemplo ratón, rata, cobayo o conejo) , gallina, pavo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato, o de origen canino. Se prefiere de manera particular que los anticuerpos sean de origen humano o de murino. Los anticuerpos de la invención también incluyen moléculas quiméricas en las cuales una región constante de anticuerpo derivada de una especie, de manera preferente humana, se combine con el sitio de enlace a antígeno derivado de otra especie, por ejemplo ratón. Por otra parte los anticuerpos de la invención incluyen moléculas humanizadas en las cuales los sitios de enlace a antígeno de un anticuerpo derivada de una especie no humana (por ejemplo de ratón) se combinan con regiones constantes y de estructura de origen humano.
Como se ejemplifica en este documento, los anticuerpos de la invención se pueden obtener directamente de híbrido más que expresan el anticuerpo, o se pueden clonar y expresar recombinantemente en una célula hospedera (por ejemplo, una célula CHO, o una célula linfocítica) . Ejemplos adicionales de células hospederas son microorganismos, tales como E. coli, y hongos, tal como levadura. Alternativamente, se pueden producir recombinantemente en un animal no humano transgénico o planta.
El término "anticuerpo quimérico", se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras es homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena sea homólogo a las secuencias correspondientes en otra especie o clase. Típicamente la región variable de las cadenas tanto ligeras como pesadas imitan las regiones variables de los anticuerpos' derivados de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes son homologas a las secuencias de anticuerpos derivados de otros. Una ventaja clara para estas formas quiméricas es que la región variable se puede derivar convenientemente de fuentes actualmente conocidas utilizando células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos hospederos no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de facilidad de preparación y la especificidad no se afecta por la fuente, la región constante que es humana es menos probable que induzca una respuesta inmune de un sujeto humano cuando los anticuerpos se inyecten lo que sería la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de enlace a antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde .la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de enlace a antigeno puede comprender ya sea dominios variables completos fusionados en los dominios constantes o solamente las regiones de determinación de complementariedad (CDR) injertadas en las regiones de estructura apropiadas en los dominios variables. Los sitios de enlace a 'antígeno puede ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo modificados para semejarse a inmunoglobulinas humanas más estrechamente. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDRs del anticuerpo de ratón) . Otras formas tienen una o más CDRs que se alteran con respeto al anticuerpo original.
Diferentes métodos para humanizar anticuerpos son conocidos por la persona experta, como es revisado por Almagro & Fransson, ·2008, el contenido de la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. El artículo de revisión por Almagro & Fransson se resume brevemente en lo siguiente. Almagro & Fransson distinguen entre procedimientos racionales y procedimientos empíricos. Los procedimientos racionales se caracterizan al generar pocas variantes del anticuerpo diseñado y al evaluar su enlace o cualquier otra propiedad de interés. Si las variantes diseñadas no producen los resultados esperados, se inicia un nuevo sitio de evaluación de diseño y enlace. Los procedimientos racionales incluyen injerto de CDR, Sustitución de la superficie, Superhumanización y Optimización de Contenido de la Cadena Humana. En contraste, los procedimientos empíricos se basan en generación de grandes bibliotecas de variantes humanizadas y selección de los mejores clones utilizando . tecnologías de enriquecimiento o clasificación de alto rendimiento. Por consiguiente, los procedimientos empíricos son dependientes de un sistema de selección y/o clasificación confiable que es capaz de investigar a través de un .vasto espacio de variantes de anticuerpo. Las tecnologías de expresión in vitro, tal como expresión en fago y expresión de ribosomas cumplen estos requisitos y son bien conocidas por la persona experta. Los procedimientos empíricos incluyen bibliotecas de FR, Selección guiada, Entrelazado de estructuras y Tecnología HumaneeringMR.
Injerto de CDR Un protocolo de injerto de CDR comprende típicamente tres puntos de toma de decisiones: (1) definición de las regiones que determinan la especificidad del anticuerpo donador, es decir el objetivo para injerto, (2) identificación de una fuente ' de secuencias humanas que se utilizan como donadores FR, y (3) selección de residuos fuera de la región que define la especificidad, es decir determinación de las posiciones de aminoácidos que son objetivos para la mutación posterior para restaurar o mejorar la afinidad del anticuerpo humanizado. (1) Regiones que .determinan la especificidad de anticuerpos La estructura experimental del anticuerpo no humano en complejo con el antígeno proporciona un mapa detallado de residuos en contacto con el antígeno y por lo tanto aquellos responsables para determinar su especificidad. La información estructural se puede complementar con mutagénesis de exploración de alanina y/o mutagénesis de combinación para identificar los residuos que contribuyen a la mayoría de la energía de enlace o parátopo · funcional. Puesto que el parátopo funcional es un subconjunto de residuos en contacto, el injerto solamente para el parátopo funcional reduciría el número de residuos no humanos en el producto humanizado. Sin embargo, solo en casos- raros son la estructura experimental del complejo de antigeno-anticuerpo y/o el parátopo funcional disponibles en el inicio de un protocolo de humanización. En ausencia de una definición precisa de residuos responsables para una especificidad de anticuerpo proporcionada, la CDR se emplea frecuentemente como regiones que definen la especificidad. También es posible utilizar una combinación de CDR y rizo de HV como objetivos para el injerto. Para reducir el número de residuos que se injertan en las FRs, se ha descrito el injerto SDR, es decir el injerto de residuos de determinación de especificidad (SDRs). (2) Fuente de la FRs humanas La segunda etapa en un protocolo de injerto de CDR típico es identificar donadores de FR humana. Trabajos iniciales utilizaron FRs de anticuerpos humanos de estructura conocida, sin considerar su homología al anticuerpo no humano. Este procedimiento es conocido como "método de FR. Fija. Trabajos posteriores utilizaron secuencias humanas que tiene la homología más alta al anticuerpo no humano. Este procedimiento se ha llamado "mejor ajuste". Mientras que las estrategias de "Mejor -Ajuste". Tienden a dar por resultado anticuerpos con mayor afinidad, otros parámetros tales como baja inmunogenicidad y rendimientos de producción se han tomado en cuenta, también cuando se selecciona una FR para humanización. De esta manera, las combinaciones de "mejor ajuste" y "FR fija" también son posibles. Por ejemplo, la parte VL se puede humanizar de acuerdo con el método FR fija y la parte VH se puede humanizar de acuerdo con el método de mejor ajuste, o viceversa.
Se han utilizado dos fuentes de secuencias humanas: secuencias maduras y de linea germinal. Las secuencias, maduras, que son productos de respuestas inmunitarias , llevan mutaciones somáticas generadas por procesos aleatorios y no están bajo la selección de especie, dan por resultado residuos inmunogénicos potenciales. De esta manera, para evitar los residuos inmunogénicos, los genes de linea germinar humana se han utilizado cada vez más como fuente de donadores de FR. Las secuencias de nucleótidos de las FRs de linea germinal humana se dan a conocer por ejemplo en los apéndices A y B del articulo por Dall'Acqua et al, 2005. Adicionalmente, los anticuerpos basados en el gen de linea germinal tienden a ser más flexibles como es comparado con los anticuerpos maduros. Esta mayor flexibilidad se cree que mejor se adapta a las CDRs diversas con pocas o nada de mutaciones en la FR para restaurar la afinidad del anticuerpo humanizado. (3) Mutaciones posteriores para restaurar o aumentar la afinidad Comúnmente, la afinidad disminuye después del injerto de CDR como una consecuencia de incompatibilidad entre las CDRs no humanas y las FRs humanas. Por lo tanto, la tercera etapa en protocolo de injerto de CDR típico es definida en mutaciones que restaurarían o prevendrían las pérdidas de afinidad. Las mutaciones posteriores tienen que ser diseñadas cuidadosamente con base en la estructura o un modelo del anticuerpo humanizado y sometidas a prueba experimentalmente . Un sitio en la red para la modelación de anticuerpos automatizados llamado AM se puede encontrar en la URL http://anticue.rpo.bath.ac.uk. El Software para la modelación de la estructura de la proteína se puede descargar en los sitios http://salilab.org/modeller/modeller.html (Modeller) y http://spdbv.vital-it.ch (Swiss Pdb Viewer) .
Sustitución de la superficie La sustitución de la superficie similar al injerto de la CDR y comparte los primeros dos puntos de toma de decisiones. En contraste al injerto de CDR, la sustitución de superficie retiene los residuos no expuestos del anticuerpo no humano. Solamente los residuos superficiales en el anticuerpo no humano se cambiar a residuos humanos.
Superhumanización Mientras que el injerto de CDR depende de la comparación de FR entre las secuencias no humanas y las humanas, la superhumanización se' basa en una comparación de CDR de modo que la homología de FR es irrelevante. El procedimiento incluye una comparación de la secuencia no humana con el repertorio de genes de línea germinal humana funcional. Luego se seleccionan esos genes que codifican los mismos o relacionan estrechamente las estructuras canónicas con las secuencias de murino. Después, dentro de los genes que comparten las estructuras canónicas con el anticuerpo no humano, aquellos con la homología más alta dentro de las CDRs se seleccionan como donadores de FR finalmente, las CDRs no humanas se injerta en esas FRs .
Optimización del' Contenido de Cadena Humana Este procedimiento se basa en una medida de la "humanidad" del anticuerpo, llamado Contenido de Cadena Humana (HSC) . En resumen, este procedimiento compara la secuencia de ratón con el repertorio de los genes de línea germinal humana. Las diferencias se clasifican como HSC. La secuencia objetivo es la humanizada al maximizar su HSC antes que utilizando una medida de identidad global para generar múltiples variantes humanizadas diversas.
Bibliotecas de Estructura (abreviada: bibliotecas FR) En el procedimiento de biblioteca FR, una colección de variantes de residuos se introduce en posiciones especificas en la FR seguido por el inmunoplaqueteo de la biblioteca para seleccionar la FR que mejor soporta la CDR injertada. De esta manera, este procedimiento se asemeja al injerto de CDR pero en lugar de crear pocas mutaciones posteriores en la FR, se construye una biblioteca combinatoria de típicamente más de 100 variantes mutacionales .
Selección guiada Este procedimiento incluye combinar el dominio VH o VL de un anticuerpo no humano dado específico para un antígeno particular con una biblioteca de VH y VL humana. Subsecuentemente, los dominios V humanos específicos se seleccionan contra el antígeno de interés. Por ejemplo, un anticuerpo no humano se puede humanizar primero al combinar el VH con una biblioteca de cadenas ligeras humanas. La biblioteca después se selecciona contra el antígeno objetivo mediante expresión en fago y luego el VL seleccionado se clona en una biblioteca de cadenas VH humanas y se selecciona contra el antígeno objetivo. También es posible comenzar con la combinación del VL no humano con una biblioteca de cadenas pesadas humanas. La biblioteca después se selecciona contra el antígeno objetivo mediante la expresión en fago y el VH seleccionado se clona en una biblioteca de cadenas VL humanas y se selecciona contra el antígeno objetivo. Como resultado, un anticuerpo completamente humano con afinidad similar como el anticuerpo no humano se puede aislar. Para evitar la ocurrencia de una deriva de epitopos, es posible implementar una asi llamada ELISA de inhibición, que permite la selección de clones que reconocen el mismo epitopo como el anticuerpo precursor. Alternativamente, la ' retención de CDR se puede aplicar para evitar una deriva de epitopos. En la retención de CDR, se retienen una o más CDRs no humanas, de manera preferente la CDR3 de cadena pesada, puesto que la CDR está en el centro del sitio de enlace a antigeno.
Transposición. de estructura (abreviada : transposición FR) En el procedimiento de transposición FR, FRs enteras se combinan, con las CDRs no humanas. Utilizando la transposición FR, Dall'Acqua y colaboradores humanizaron un anticuerpo de murino. Las seis CDRs del anticuerpo de murino se clonaron en una biblioteca que contiene todas las FRs de genes de linea germinal humana (Dall'Acqua y colaboradores, 2005) . Las bibliotecas se clasificaron para el enlace en un proceso de selección de dos etapas, primero humanizar la VL, seguido por VH. En . un estudio posterior, se utilizó exitosamente un proceso de transposición de FR de una etapa (Damschroder y colaboradores, 2007) . Las secuencias de oligonucleótidos que codifican todas las estructuras de cadena litera de linea germinal humana conocidas (?) se dan a conocer por Dall'Acqua y colaboradores, 2005, como el Apéndice A. Las secuencias de oligonucleótidos que codifican todas las estructuras de cadena pesadas de linea germinal humana conocidas se dan a conocer por Dall'Acqua y colaboradores, 2005, como el Apéndice B.
Tecnología Humaneering La tecnología Humaneering permite el aislamiento de anticuerpos que son 91-96% homólogos a los anticuerpos de genes de línea germinal humana. El método se basa en la identificación experimental de determinantes de especificidad mínima esencial (MSDs) y en el reemplazo secuencial de fragmentos no humanos en bibliotecas de FRs humanas y evaluación del enlace. Comienza con las regiones de las CDR3 de cadenas de VH y VL no humanas y reemplaza progresivamente otras regiones del anticuerpo no humano en las FRs humanas, incluyendo la CDR1 y CDR2 de tanto VH como VL.
Los métodos para humanizar anticuerpos explicados en lo anterior son preferidos cuando se generan anticuerpos humanizados que se enlazan específicamente a los epítopos adaptivos descritos en este documento. No obstante, la presente invención no se limita a los métodos mencionados en lo anterior para humanizar anticuerpos.
Algunos de los métodos de humanización mencionados en lo anterior se pueden realizar sin información acerca de las secuencias FR en el anticuerpo donador, particularmente el "Método de FR Fija" (una variante de injerto de CDR) , Superhumanización, Transposición de estructura, y Tecnología Humaneering. Las variaciones del "método FR fija" se llevó a cabo exitosamente por Qin y colaboradores, 2007 y Chang y colaboradores, 2007. En particular, Qin y colaboradores construyeron un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada- humana en la cual las tres regiones CDR se reemplazan por péptidos antigénicos, que se derivaron de las secuencias de CDR de un anticuerpo de murino. Chang y colaboradores continuaron estos experimentos y construyeron un fragmento scFv, en el cual todas las CDRs de la parte VH y la CDR3 de la parte VL se reemplazaron por péptidos antigénicos, que se derivaron de las secuencias CDR de un anticuerpo de murino.
Como se utiliza en este documento "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. . Los anticuerpos humanos de la invención puede incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo) . Los anticuerpos humanos de la invención incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulina humana y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe por ejemplo en la patente de E.U.A. No. 5, 939, 598 por Kucherlapati & Jakobovits.
El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en este documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Un anticuerpo monoclonal expresa una sola especificidad de enlace y afinidad para un epitopo particular. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, ratón, fusionado a una célula inmortalizada .
El término '"anticuerpo recombinante", como se utiliza en este documento, incluye todos los anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aislan por medios recombinantes , tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir del mismo, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedera transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo de una transíectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme . de las secuencias de genes de inmunoglobulina a otras secuencias de DNA.
El término "transfectoma" , como se utiliza en este documento, incluye células hospederas eucarióticas recombinantes que expresa un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HE 293T, células vegetales, u hongos, incluyendo células de levadura.
Como se utiliza en- este documento, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce este anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos de codificación que corresponde a aquella encontrada en un organismo que no consiste del organismo transgénico, y que se deriva en general de una especie diferente al organismo transgénico .
Como se utiliza en este documento, un "anticuerpo heterohibrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de diferentes, orígenes de organismo. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera de murino es un anticuerpo heterohibrido .
De esta manera, "anticuerpos y fragmentos de enlace a antigeno de los mismos" adecuados para el uso en la presente invención incluyen, ' pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecificos , heteroconjugados, multiespecificos, recombinantes , heterólogos, heterohibridos , quiméricos, humanizados (en particular injertados con CDR) , deshumanizados, o humanos, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos, F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, Fd, Fv, Fvs enlazados a disulfuro (dsFv) , anticuerpos de cadena individual (por ejemplo, scFv) , diacuerpos o tetracuerpos (Holliger P. y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 90(14), 6444-6448), nanocuerpos (también conocidos como anticuerpos de dominio individual), anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id a anticuerpos de la invención), y fragmentos de enlace a epitopo de cualquiera de lo anterior.
Los anticuerpos descritos en este documento se aislan de manera preferente. Un "anticuerpo aislado" como se utiliza en este documento, se propone para referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un ánticuerpo aislado que se enlaza específicamente a C5a está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlazan específicamente antígenos diferentes a C5a) . Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un epítopo, isoforma o variante del C5a humano puede, sin embargo, tener la actividad cruzada a otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (por ejemplo homólogos de especies C5a, tal como C5a de rata). Por otra parte, un anticuerpo- aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se relaciona con anticuerpos que tienen diferentes especificidades y se combinan en una composición bien definida.
El término "de origen natural", como se utiliza en este documento, como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar en una fuente en la naturaleza y la cual no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.
Como se utiliza en este documento, el término "aptámero de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha diseñado a través de corridas repetidas de selección in vitro o SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para enlazarse a una molécula objetivo (para una revisión véase: Brody E.N. and Gold L. (2000), Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 74(1):5-13). El aptámero de ácido nucleico puede ser una molécula de DNA o RNA. Los aptámeros pueden contener modificaciones, por ejemplo nucleótidos modificados tales como pirimidinas sustituidas con 2' -flúor.
Como se utiliza en este documento, el término "proteína similar a anticuerpo" se refiere a una proteína que se ha diseñado (por ejemplo mediante mutagénesis de rizos) para enlazarse específicamente a una molécula objetivo. Típicamente, esta proteína similar a anticuerpo comprende por lo menos un rizo de péptido variable unido en ambos extremos a un andamio de proteínas. Esta restricción estructural doble incrementa grandemente la afinidad de enlace de la proteína similar a anticuerpo a- niveles comparables a aquellos de un anticuerpo. La longitud de rizo de péptido variable consiste típicamente de 10 a 20 aminoácidos. La proteína andamio puede ser cualquier proteínas que tiene buenas propiedades de solubilidad. De manera preferente, la proteína andamio es una proteína globular pequeña. Las proteínas similares a anticuerpos incluyen sin limitación aficuerpos, anticalinas y proteínas de repetición de anquirina diseñadas (para revisión véase: Binz H.K. y colaboradores (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol . 23 ( 10 ): 1257-1268 ) . Las proteínas similares a anticuerpos se pueden derivar de grandes bibliotecas de mutantes, por ejemplo ser inmunoplaqueteadas de grandes bibliotecas de expresión en fago y si se pueden aislar en analogía a anticuerpos regulares. También, las proteínas de enlace similar a anticuerpo se pueden obtener mediante mutagénesis combinatoria de residuos expuestos en la superficie en proteínas globulares. Las proteínas similares a anticuerpo algunas veces son referidas como "aptámeros de péptido".
Como se utiliza en este documento, un "peptidomimético" es una cadena similar a proteínas pequeña diseñada para imitar un péptido. Los peptidomiméticos surgen típicamente de la modificación de un péptido existente a fin de alterar las propiedades de la molécula. Por ejemplo, pueden surgir de modificaciones para cambiar la estabilidad de la molécula o actividad biológica. Esto puede tener una función en el desarrollo de compuestos similar a fármaco de péptidos existentes. Estas modificaciones implican cambios al péptido que no serán 'de origen natural (tal como cadenas principales alteradas y la incorporación de aminoácidos) .
Se pueden hacer, "sustituciones conservadoras" por ejemplo, sobre la base de la similitud en la polaridad, carga, tamaño, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos de aminoácido implicados. Los aminoácidos se pueden agrupar en los siguientes seis grupos de aminoácidos estándares: (1) hidrofóbicos : Met, Ala, Val, Leu, He; (2) hidrofilicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) acidicps: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromáticos :' Trp, Tyr, Phe .
Como se utiliza en este documento, "sustituciones conservadoras" se definen como intercambios de un aminoácido por otro aminoácido listado dentro del mismo grupo de los seis grupos de aminoácidos estándares mostrados en lo anterior. Por ejemplo, el intercambio de Asp por Glu retiene una carga negativa en el polipéptido modificado de esta manera. Además, la glicina y prolina se pueden sustituir por otro basado en su capacidad de interrumpir las a-hélices. Algunas sustituciones conservadora preferidas dentro de los seis grupos anteriores son los intercambios dentro de los siguientes sub-grupos; (i) Ala, Val, Leu y He; (ii) Ser y Thr; (ii) Asn y Gin; (iv) Lys y Arg; y (v) Tyr y Phe. Dado el código genético conocido, y las técnicas de DNA recombinante y sintético, el científico experto puede construir fácilmente DNAs que codifican las variantes de aminoácido conservadoras.
Como se utiliza en este documento, "sustituciones no conservadoras" o. "intercambios de aminoácidos no conservadores" se definen como intercambio de un aminoácido por otro aminoácido listado en un diferente grupo de los seis grupos de aminoácidos estándares (1) a (6) mostrados en lo anterior .
Una "actividad biológica" como se utiliza en este documento, se refiere ¦ a cualquier actividad que un polipéptido pueda mostrar, incluyendo sin limitación: actividad enzimática; actividad de enlace a otro compuesto (por ejemplo que se enlaza a otro polipéptido, en particular que se enlaza a un receptor, o que se enlaza aun ácido nucleico) ; actividad inhibidora (por ejemplo actividad inhibidora enzimática) ; actividad de activación (por ejemplo actividad de activación enzimática); o efectos tóxicos. Sin considerar las variantes y derivados de un polipéptido, no se requiere que la variante o derivado muestre esta actividad al mismo grado como el polipéptido precursor. Una variante es considerad como una variante dentro del contexto de la presente solicitud, si muestra la actividad relevante a un grado de por lo menos 10% de la actividad del polipéptido precursor. Del mismo modo, un derivado se considera como un derivado dentro del contexto de la presente solicitud, si muestra la actividad biológica relevante a un grado de por lo menos 10% de la actividad del polipéptido precursor. La "actividad biológica" relevante en el contexto de la presente invención es una actividad de enlace a un epitopo conformacional de C5a 'formado por secuencias de aminoácidos X IX2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) y X5X6KX7X8X9L (SEQ ID NO: 19), en donde Xx se selecciona del grupo que consiste de N, H, D, F, K, Y, y T; X2 se selecciona del grupo que consiste de D, L, Y, y H; X3 se selecciona del grupo que consiste de Q, E, y K; X4, se selecciona del grupo que consiste de A, V, y L; X5 se selecciona del grupo que consiste . de S, H, P, y N; X6 se selecciona del grupo que consiste de H y N; X7 se selecciona del grupo que consiste de D, N, H, P, y G; X8 se selecciona del grupo que consiste de M, L, I, y V; y X9 se selecciona del grupo que consiste de Q, L, e I. Una "actividad biológica" particularmente relevante en el contexto de la presente invención es una actividad de enlace al epitopo conformacional del C5a humano formado por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. De manera preferente, la "actividad biológica" relevante en el contexto de la presente invención es una actividad de enlace al epitopo conformacional de la C5a humana formada por las secuencias de aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4) y KDM. Los ensayos para determinar la actividad de enlace son conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica e incluyen ELISA tal como la descrita en la sección de ejemplo.
Como se utiliza en este documento, un "paciente" significa cualquier mamífero o ave quien puede beneficiarse de un tratamiento con la porción de enlace objetivo descrita en este documento. De manera preferente, un "paciente" se selecciona del grupo que consiste de animales de laboratorio (por ejemplo ratón o rata), animales domésticos (incluyendo por ejemplo, cobayo, conejo, pollo, pavo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro) , o primates incluyendo chimpancés seres humanos. Se prefiere de manera particular que el "paciente" sea un ser humano.
De acuerdo .con the American College of Chest Physicians and the Society of Critical Care Medicine (Bone R.C. y colaboradores (1992). "Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine". Chest 101 (6): 1644-55), existen niveles de sepsis: Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) : Definido . por la presencia de dos o más de las siguientes investigaciones: - Temperatura corporal < 36°C (97°F) o > 38°C (100°F) (hipotermia o fiebre).
Frecuencia cardiaca > 100 latidos por minuto (taquicardia) .
- Frecuencia respiratoria > 20 respiraciones por minuto o, gas en sangre, un C02 Pa menos que 32 mm Hg (4.3 kPa) (taquipnea o hipocapnia debido a hiperventilación) .
- Conteo de glóbulos blancos < 4,000 células/mm3 o > 12,000 células/mm3 (< 4 x 109 o > 12 x 109 células/L) , o mayor que 10% de formas de banda (glóbulos blancos inmaduros), (leucopenia, leucocitosis, o bandemia) .
Sepsis: Definida como SIRS en respuesta a un proceso infeccioso confirmado. La infección se puede sospechar o prevenir (mediante cultivo, tinción, o reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), o un síndrome clínico pactonómico para infección. La evidencia específica para la infección incluye WBCs en fluido normalmente estéril (tal como orina o fluido cefalorraquídeo (CSF) , evidencia de una visera perforada (sin. aire en los rayos x abdominales o exploración CT, signos de peritonitis aguda) , rayos x de pecho anormal (CXR) consistente con neumonía (con opacificación focal), o petequias, purpura, o purpura fulminans Sepsis grave: Definida como sepsis con disfunción de órganos, hipoperfusión, o hipotensión.
Choque séptico: Definido como sepsis con anormalidades de hipotensión o hipoperfusión arterial refractaria a pesar de resucitación de fluido adecuada. Signos de hipoperfusión sistémico puede ser ya sea disfunción de órganos finales o lactato en suero mayor que 4 mmol/dL. Otros signos incluyen oliguria y estado mental alterado. Los pacientes se definen por tener choque séptico y tienen sepsis más hipotensión después de reposición agresiva de fluidos (típicamente arriba de 6 litros y 40 ml/kg de cristaloide) .
Por "tumor" significa un grupo anormal de células o tejidos que se desarrollan por una proliferación celular no controlada, rápida y continúa creciendo después de que los estímulos iniciaron el nuevo cese de crecimiento. Los tumores muestran parcial o falta completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, usualmente forman una masa distinta de tejido, que pueden ser ya sea benigno o maligno.
Por "metástasis" se propone la propagación de células cancerosas de su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende de la separación de células malignas del tumor primario, invasión de la matriz extracelular , penetración de la membranas básales endoteliales para entrar a la cavidad corporal y vaso, y luego, después de ser transportadas por la sangre, infiltración de órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio objetivo depende de la angiogénesis . La metástasis tumoral se lleva a cabo frecuentemente aún después de la remoción del tumor primario debido a que las células tumorales o componentes pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a "metástasis distante" que se relaciona con una metástasis que es remota del tumor primario y el sistema de nodos linfáticos regional.
Como se utiliza en este documento, "trata", "que trata" o "tratamiento" de una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de lo siguiente: (a) reducir la gravedad y/o duración del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos del trastorno (s) que se trata; (c) inhibir el empeoramiento de los síntomas característica del trastorno (s) que se trata; (d) limitar o prevenir la recurrencia del trastorno (s) en pacientes que han tenido previamente el trastorno (s) ; y (e) limitar o prevenir la recurrencia de síntomas en pacientes que fueron previamente sintomáticos para el trastorno (s) .
Como se utiliza en este documento, "previene", "que previene", "prevención", o "profilaxis" de una enfermedad o trastorno significa prevenir que ocurra un trastorno en el sujeto.
Como se utiliza en este documento, "que administra" incluye administración in vivo, asi como también administración directamente al tejido ex vivo, tal como injertos de vena.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad de un agente terapéutico suficiente para lograr la propuesta intencionada. La cantidad efectiva de un agente terapéutico proporcionado variará con los factores tales como naturaleza del agente, la vía de administración, el tamaño y especie del animal que recibe el agente terapéutico, y el propósito de la administración. La cantidad efectiva en cada caso individual se puede determinar empíricamente por un artífice experto de acuerdo con los métodos establecidos en la técnica.
"Farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agente reguladora de gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de E.U.A. u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales, y de manera más particular en humanos.
El término "portador", como se utiliza en este documento, se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similar. Una solución salina es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y. glicerol acuosas también, se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similar. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes , o agentes amortiguadores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similar. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes tradicionales y portadores tales como triglicéridos . Los compuestos de la invención se pueden formular como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellos derivados de ácidos clorhídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etcétera, y aquellos formados con grupos carboxilo libres tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamina-etanol , histidina, procaína, etcétera. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, de . manera preferente en forma purifica, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la. forma de administración apropiada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
En general los métodos conocidos y practicados en los campos de la biología molecular, biología celular, química proteínica y técnicas de anticuerpos se describen completamente en las publicaciones continuamente actualizadas "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Sambrook y colaboradores, Cold Spring Harbor) ; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel y colaboradores Eds . , Wiley & Sons); Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan y colaboradores eds . , · Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J. S. Bonifacino y colaboradores, Wiley & Sons) and Current Protocols in Immunology (J. E. Colligan y colaboradores, Eds., Wiley & Sons). Técnicas conocidas que se relacionan con un cultivo celular y medios se describen en "Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu y colaboradores, Curr. Opin., Biotechnol . 8: 148, 1997); "Serum free Media" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73, 1991); and "Suspensión Culture of Mammalian Células" (Birch y colaboradores Bioprocess Technol. 19: 251, 1990) .
Modalidades de la Invención La presente invención ahora se describirá adicionalmente . En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto de esta manera definido se puede combinar con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada por ser preferida o ventajosa se puede combinar con cualquier otra característica o características indicadas por ser preferidas o ventajosas.
En un primer aspecto, la presente invención se dirige a una porción de enlace que se enlaza a un epítopo conformacional formado por secuencias de aminoácidos X1X2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) y X5X6KX7X8X9L (SEQ ID NO: 19) de C5a, en donde Xi se selecciona del grupo que consiste de N, H, D, F, K, Y, y T; X2 se selecciona del grupo que consiste de D, L, Y, y H; X3 se selecciona del grupo que consiste de Q, E, y K; X4 se selecciona del grupo que consiste de A, V, y L; X5 se selecciona del grupo que consiste de S, H, P, y N; X se selecciona del grupo que consiste de H y N; X7 se selecciona del grupo que consiste de D, N, H, P, y G; X8 se selecciona del grupo que consiste de M, L, I, y V; y X9 se selecciona del grupo que consiste de Q, L, e l. en otras palabras, una porción de enlace de acuerdo con el primer aspecto se enlaza al mismo tiempo a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 18 y a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 19.
SEQ ID NO: 18 es una secuencia de consenso determinada al comparar los aminoácidos 30-38 del C5a humana con las secuencias de aminoácidos correspondientes en Pan troglodytes, Macaca mulatto, Sus scrofa, Equus caballus, Bos Taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Canis lupus, y Monodelphis domestica . SEQ ID NO: 19 es una secuencia consenso determinada al comparar los aminoácidos 66-72 de la C5a humana con las secuencias de aminoácidos correspondientes en Pan troglodytes, Macaca mulatta, Sus scrofa, Equus caballus, Bos Taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Canis lupus, y Monodelphis domestica .
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace se enlaza a por lo menos un aminoácido de la secuencia de aminoácidos X2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20), en donde X2 y X3 se definen como en lo anterior. SEQ ID NO: 20 es una versión más corta de la secuencia consenso de acuerdo con SEQ ID NO: 18 y corresponde a los aminoácidos 31-37 de la C5a humana .
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace se enlaza a por lo menos un aminoácido de la secuencia de aminoácidos. X6KX7X8X9 (SEQ ID NO: 21) , de manera preferente KX7X8, en donde ?ß, ?t, X8, y X9 se definen como en lo anterior. SEQ ID NO: 21 es una versión más corta de la secuencia consenso de acuerdo con SEQ ID NO: 19 y corresponde a los aminoácidos 67-71 de la C5a humana. KX7X8 es una versión más corta de la secuencia consenso de acuerdo con SEQ ID NO: 21 y corresponde a los aminoácidos 68-70 de la C5a humana .
En modalidades particularmente preferidas, la porción de enlace se enlaza al mismo tiempo a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos X2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20) y por lo menos un aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos KX7X8, en donde X2, X3, X7, y X8 se definen como en lo anterior.
En modalidades preferidas del primer aspecto, el epitopo conformacional se forma por (a) secuencias de aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) de C5a (secuencias de Homo sapiens y Pan troglodytes) ; (b) secuencias de aminoácidos HDETCEQRA (SEQ ID NO: 22) y SHKDLQL (SEQ ID NO: 23) de C5a (secuencias de Macaca mulatta) ; (c) secuencias de aminoácidos DDETCEERA (SEQ ID NO: 24) y SHKNIQL (SEQ ID NO: 25) de C5a (secuencias de Sus scrofa); (d) secuencias de aminoácidos DLETCEQRA (SEQ ID NO: 26) y SHKHIQL (SEQ ID NO: 27) de C5a (secuencias de Equus caballus) ; (e) secuencias de aminoácidos DDETCEQRA (SEQ ID NO: 28) y HHKN QL (SEQ ID NO: 29) de C5a (secuencias de Bos taurus) ; (f) secuencias de aminoácidos FYETCEERV (SEQ ID NO: 30) y PHKPVQL (SEQ ID NO: 31) de C5a (secuencias de Mus musculus) ; (g) secuencias de aminoácidos KYETCEQRV (SEQ ID NO: 32) y HHKG LL (SEQ ID NO: 33) de C5a (secuencias de Rattus norvegicus) ; (h) secuencias de aminoácidos YDETCEQRA (SEQ ID NO: 34) y SNKPLQL (SEQ ID NO: 35) de C5a (secuencias de Canis lupus)., o (i) secuencias de aminoácidos THETCEKRL (SEQ ID NO: 36) y NHKPVIL (SEQ ID NO: 37) de C5a (secuencias de Monodelphis domestica).
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace se enlaza a por lo menos un aminoácido de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (a) DETCEQR .(SEQ ID NO: 4); (b) DETCEER (SEQ ID NO: 38); (c) LETCEQR (SEQ ID NO: 39); (e) YETCEER (SEQ ID NO: 40); (f) YETCEQR (SEQ ID NO: 41); y (g) HETCEKR (SEQ ID NO: 42) .
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace se enlaza a por lo menos un aminoácido de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (a) HKDMQ (SEQ ID NO: 5) , de manera preferente KDM; (b) HKDLQ (SEQ ID NO: 43), de manera preferente KDL; (c) HKNIQ (SEQ ID NO: 44), de' manera preferente K; (d) HKHIQ (SEQ ID NO: 45), de manera preferente KHI; (e) HKNMQ (SEQ ID NO: 46), de manera preferente KN ; (f) HKPVQ (SEQ ID NO: 47), de manera preferente PV; (g) HKGML (SEQ ID NO: 48), de manera preferente KGM; (h) NKPLQ (SEQ ID NO: 49), de manera preferente KPL; y (i) HKPVI (SEQ ID NO: 50), de manera preferente KPV.
En modalidades particularmente preferidas del primer aspecto, la C5a es C5a humana. De esta manera, se prefiere que la porción de enlace se enlace a un epitopo conformacional formado por los aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: .3) de la C5a humana. En otras palabras, una porción de enlace de acuerdo con esta modalidad preferida del primer aspecto se enlaza al mismo tiempo por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 2 corresponde los aminoácidos 30-38 de la C5a humana. La SEQ ID NO: 3 corresponde a los aminoácidos 66-72 de la C5a humana. La secuencia de aminoácidos de la C5a humana se representa en SEQ ID NO: 1. En modalidades más preferidas del primer aspecto, la porción de enlace se enlaza a por lo menos uno de los aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4). La SEQ ID NO: 4 corresponde a los aminoácidos 31-37 de la C5a humana. En modalidades ' más preferidas del primer aspecto, la porción de enlace se enlaza a por lo menos uno de los aminoácidos HKDMQ (SEQ ID NO: 5) , de manera más preferente a por lo menos uno de los aminoácidos KDM. SEQ ID NO: 5 que corresponden a los aminoácidos 67-71 de la C5a humana; la secuencia KDM corresponde a los aminoácidos 68-70 de la C5a humana. En modalidades particularmente preferidas, la porción de enlace se enlaza al mismo tiempo a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4) y a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos KDM.
En modalidades preferidas del primer aspecto, las dos secuencias que forman el epitopo conformacional (por ejemplo pares de secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 18 y 19; SEQ ID NO: 2 y 3; SEQ ID NO: 22 y 23; SEQ ID NO: 24 y 25; SEQ ID NO: 26 y 27; SEQ ID NO': 28 y 29; SEQ ID NO: 30 y 31; SEQ ID NO: 32 y 33; SEQ ID NO: 34 y 35; SEQ ID NO: 36 y 37) se separan por 1-50 aminoácidos contiguos que no participan en el enlace a la porción de enlace de la invención. En lo siguiente, estos aminoácidos que no participan en el enlace a la porción de enlace de la invención se referirán como "aminoácidos no de enlace". Las dos secuencias que forman el epitopo conformacional se separan de manera preferente por 6-45 aminoácidos no de enlace contiguos, de manera más preferente por 12-40 aminoácidos no de enlace contiguos, de manera más preferente por 18-35 aminoácidos no de enlace contiguos, de manera más preferente por 24-30 aminoácidos no de enlace contiguos, de. manera más preferente por 25-29 aminoácidos no de enlace contiguos, de manera aún más preferente por 26-28 aminoácidos no de enlace contiguos, y de manera mucho más preferente por 27 aminoácidos no de enlace contiguos .
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace tiene una constante de enlace a C5a, de manera preferente C5a humana, con un valor Kd de 10 nM o menos, de manera preferente 9 nM. o menos, de manera más preferente 8 nM o menos, de manera más preferente 7 nM o menos, de manera más preferente 6 nM o menos, de manera más preferente 5 nM o menos, de manera más preferente 4 nM o menos, de manera más preferente 3 nM o menos, de manera más preferente 2 nM o menos y de manera aún más preferente 1 nM o menos.
En modalidades preferidas del primer aspecto, una porción de enlace muestra por lo menos 75% de actividad de bloqueo, de manera preferente . por lo menos 80% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 85% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 90% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 95% de actividad de bloqueo para efectos biológicos inducidos por una molécula C5a, de manera preferente C5a humana. Estas actividades de bloqueo preferidas se refieren a aquellas modalidades, en donde la porción de enlace comprende un parátopo individual que se enlaza a C5a, de manera preferente C5a humana. En modalidades, en donde la porción de enlace comprende dos o más parátopos específicos de C5a, las actividades de bloqueo de por lo menos 75%, de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 85%, etcétera se logran cuando una molécula de porción de se pone en contacto con un número de moléculas C5a iguales al número de parátopos específicos de C5a presentes en la porción de enlace. En otras palabras cuando los parátopos de una porción del. primer aspecto y C5a están presentes en concentraciones equimolares, la porción de enlace de acuerdo con el primer aspecto muestra por lo menos 75% de actividad de bloqueo, de manera preferente por lo menos 80% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 85% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 90% de actividad de bloqueo, y de manera más preferente por lo menos 95% de actividad de bloqueo para efectos biológicos inducidos por C5a. Un efecto biológico preferido que se bloquea es la liberación de lisozima inducida por C5a de células sanguíneas enteras humanas. Ensayos para determinar esta liberación de lisozima inducida por C5a y su bloqueo se describen en la sección de ejemplos.
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace no inhibe la .actividad de CH50 en plasma humano. Los ensayos para determinar la actividad de CH50 son conocidos por la persona experta y se describen a continuación en la sección de ejemplo.
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace no muestra una actividad de bloqueo en por lo menos un efecto biológico inducido por C5b, de manera preferente la porción de enlace no muestra una actividad de bloqueo en cualquier efecto biológico inducido por C5b.
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de en lace es capaz de reducir la producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre entera humana. Ensayos para medir la producción de IL-8 en sangre entera son conocidos por la persona experta y se describirán posteriormente en la sección de ejemplos.- En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace 'se selecciona de: (a) anticuerpos o fragmentos de enlace a antigeno de los mismos; (b) oligonucleótidos ; (c) proteínas similares a anticuerpos; o (d) peptidomiméticos .
En modalidades preferidas del primer aspecto, la porción de enlace es un' anticuerpo o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos biespecífieos , anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos multiespecífieos , anticuerpos desinmunizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, (en particular injertados con CDR) , y anticuerpos humanos.
En modalidades . preferidas del primer aspecto, la porción de enlace es un fragmento de enlace a antígeno de un anticuerpo, el fragmento se selecciona del grupo que consiste de fragmentos Fab, fragmentos Fab' , fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, fragmentos Fvs enlazados a disulfuro (dsFv) , anticuerpos de dominio individual (también conocidos como nanocuerpos) , y anticuerpos Fv de . cadena individual (scFv) .
En una modalidad particularmente preferida del primer aspecto, la porción de enlace es un anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo que comprende (i) una secuencia CDR3 de cadena . pesada como se expone en SEQ ID NO: 6; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 7; en donde la secuencia CDR3 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos.
De manera preferente, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además: (i) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 8; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 9; en donde la secuencia CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios, de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos .
De manera preferente, el anticuerpo o fragmento comprende además por lo menos una de las siguientes secuencias: (i) una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 10; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 11; (iii) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 12; (iv) una secuencia CDR2 de .cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 13; (v) una secuencia CDRl de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 14; (vi) una secuencia CDRl de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 15; (vii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 16; o (viii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 17; en donde la secuencia CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde, la secuencia CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDRl de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDRl de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos. De manera preferente, el número total de estos cambios opcionales en cada una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17, es decir el número total de intercambios, supresiones y adiciones en cada secuencia, es 1 o 2.
En algunas modalidades del primer aspecto, la porción de enlace es un oligonucleótido . En estas modalidades, se prefiere adicionalmente que el oligonucleótido sea un aptámero de ácido nucleico, tal como un aptámero de DNA o aptámero de RNA o un aptámero mezclado que comprende nucleótidos de DNA y RNA. En algunas modalidades, uno o más' nucleótidos se pueden reemplazar por nucleótidos modificados tales como pirimidinas sustituida con 2' -flúor. Los aptámeros de ácido nucleico también se pueden conjugar con moléculas reporteras fluorescentes, etiquetas de afinidad y/o macromoléculas. Por ejemplo, la conjugación del aptámero a polietilenglicol (PEG) o a una molécula comparable incrementará la vida media biológica del aptámero.
En algunas modalidades del primer aspecto, la porción de enlace es una. proteina similar a anticuerpo, por ejemplo una proteina similar a anticuerpo como es ejemplificada en lo anterior en la sección "Definiciones".
En algunas modalidades del primer aspecto, la porción de enlace es un peptidomimético . Los peptidomiméticos adecuados para practicar la presente invención se basan de manera preferente en proteínas similares a anticuerpo como se describe en lo anterior.
Una modalidad preferida del primer aspecto se dirige a la porción de enlace para la prevención y o tratamiento de varias enfermedades que implican inflamación aguda tal como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) , sepsis, sepsis grave, choque séptico, . lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tal como enfermedad cardíaca isquémica, lesión aguda de pulmones, neumonía, rechazo de injerto agudo y crónico en pacientes de trasplante, reacciones de injerto contra el hospedero, pero también enfermedades que implican tipos crónicos de inflamación tales como enfermedades glomerulares renales tales como glomerulonefritis y otras entidades de deficiencia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares tales como enfermedad de Bechterew, enfermedades de tipo lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, crecimiento tumoral o cáncer de órganos sólidos.
En un segundo aspecto de la presente invención se dirige a un anticuerpo o a un fragmento de enlace a anticuerpo del mismo que comprende: (i) una secuencia CDR3 de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 6; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 7; en donde la secuencia' CDR3 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos. De manera- preferente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, es decir el número total de intercambios, supresiones, y adiciones, es de 1 o 2. De manera preferente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, es decir el número total de intercambios, supresiones y adiciones, es de 1 o 2.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende además: (i) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 8; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 9; en donde la secuencia CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos. De manera preferente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, es decir el número total de intercambios, supresiones y adiciones, es de 1 o 2. De manera preferente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, es decir el número total de intercambios, supresiones y adiciones, es de 1 o 2.
El segundo aspecto de la presente invención también se refiere a un anticuerpo o a un fragmento de enlace a antigeno del mismo que comprende: (i) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se' expone en SEQ ID NO: 8; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 9; en donde la secuencia CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos. De manera preferente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia . de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, es decir el número total de intercambios, supresiones y adiciones, es de 1 o .2. De manera preferente, el número total de estos cambios opcionales en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID' NO: 9, es decir el número total de intercambios, supresiones y adiciones, es de 1 o 2.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende además por lo menos una de las siguientes secuencias: (i) una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 10; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 11; (iii) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 12; (iv) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 13; (v) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 14; (vi) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15; (vii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 16; o (viii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 17; en donde la secuencia CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDRl de cadena pesada comprende opcionalmente 1 , 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDRl de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos. De manera preferente, el número total de estos cambios opcionales en ¦ cada una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17, es decir el número total de intercambios, supresiones y adiciones en cada secuencia, es de 1 o 2.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos biespecífieos , anticuerpos heteroconj ugados , anticuerpos multiespecificos, anticuerpos deshumanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados (en particular injertados con CDR) , y anticuerpos humanos.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el fragmento de enlace a antigeno de un anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de fragmentos de Fab, fragmentos Fab' , fragmentos F(ab' ) 2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, fragmentos Fvs enlazados a disulfuro (dsFv) , anticuerpos de dominio individual (también conocidos · como nanocuerpos ) , y anticuerpos Fv de cadena individual (scFv) .
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza a un epitopo conformacional formado por secuencias de aminoácidos ?^???????^ (SEQ ID NO: 18) y ?5?6????ß?^ (SEQ ID NO: 19) de C5a, en donde Xi se selecciona del grupo que consiste de N, H, D, F, K, Y, y T; X2 se selecciona del grupo que consiste de D, L, Y, y H; X3 se selecciona del grupo que consiste de Q, E, y K; X4 se selecciona del grupo que consiste de A, V, y L; Xs se selecciona del grupo que consiste de S, H, P, y N; X6 se selecciona del grupo que consiste de H y N; X7 se selecciona del grupo que consiste de D, N, H, P, y G; Xs se selecciona del grupo que consiste de , L, I, y V; y X9 se selecciona del grupo que consiste de Q, L, e I. En otras palabras, un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno de acuerdo .con el segundo aspecto se enlaza al mismo tiempo a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 18 y a por lo menos un aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 19. De manera preferente, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza a por lo menos un aminoácido de la secuencia de aminoácidos X2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20) , en donde X2 y X3 son como se definen en lo anterior. De manera preferente, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza a por lo menos un aminoácido de la secuencia de aminoácidos X6KX7X8X9 (SEQ ID NO: 21), de manera más preferente KX7Xs en donde Xs, X7, Xs, y X9 se definen como en lo anterior. En modalidades particularmente preferidas, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza al mismos tiempo a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos X2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20) y a por lo menos un .aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos KX7Xs, en donde X2, X3, X , y Xs se definen como en lo anterior.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el epitopo conformacional se forma por (a) secuencias de aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) y SHKD QL (SEQ ID NO: 3) de C5a (secuencias de Homo sapiens y Pan troglodytes) ; (b) secuencias de aminoácidos HDETCEQRA (SEQ ID NO: 22) y SHKDLQL (SEQ ID NO: 23) de C5a (secuencias de Macaca mulatta) ; (c) secuencias de aminoácidos DDETCEERA (SEQ ID NO: 24) y SHKNIQL (SEQ ID NO: 25) de C5a (secuencias de Sus scrofa) ; (d) secuencias de aminoácidos DLETCEQRA (SEQ ID NO: 26) y SHKHIQL (SEQ ID NO: 27) de C5a (secuencias de Equus caballus) ; (e) secuencias de aminoácidos DDETCEQRA (SEQ ID NO: 28) y HHKNMQL (SEQ ID NO: 29) de C5a (secuencias de Bos taurus) ; (f) secuencias de aminoácidos FYETCEERV (SEQ ID NO: 30) y PHKPVQL (SEQ ID NO: 31) de C5a (secuencias de Mus musculus) ; (g) secuencias de aminoácidos KYETCEQRV (SEQ ID NO: 32) y HH GMLL (SEQ ID NO: 33) de C5a (secuencias de Rattus norvegicus) ; (h) secuencias de aminoácidos YDETCEQRA (SEQ ID NO: 34) y SNKPLQL (SEQ ID NO: 35) de C5a (secuencias de Canis lupus) ; o (i) secuencias de aminoácidos THETCEKRL ' (SEQ ID NO: 36) y NHKPVIL (SEQ ID NO: 37) de C5a (secuencias de Monodelphis domestica) . En modalidades más preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza a por lo menos un aminoácidos dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (a) DETCEQR (SEQ ID NO: 4); (b) DETCEER (SEQ ID NO: 38); (c) LETCEQR (SEQ ID NO: 39); (e.) YETCEER (SEQ ID NO: 40); (f) YETCEQR (SEQ ID NO: 41); y (g) HETCEKR (SEQ ID NO: 42). En modalidades aún más preferidas del primer aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza por lo menos un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (a) HKD Q (SEQ ID NO: 5), de manera preferente KDM; (b) HKDLQ (SEQ ID NO: 43), de manera preferente KDL; (c) HKNIQ (SEQ ID NO: 44), de manera preferente KNI; (d) HKHIQ (SEQ ID NO: 45), de manera preferente KHI; (e) HKNMQ (SEQ ID NO: 46), de manera preferente KNM; (f) HKPVQ . (SEQ ID NO: 47), de manera preferente KPV; (g) HKG L (SEQ ID NO: 48), de manera preferente KGM; (h) NKPLQ (SEQ ID NO: 49), de manera preferente KPL; y (i) HKPVI (SEQ ID NO: 50), de manera preferente KPV.
En modalidades particularmente preferidas del segundo aspecto, la C5a es C5a humana. De esta manera, se prefiere que el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlace a un epitopo conformacional formado por los aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID. NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) de la C5a humana. En otras palabras, un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo de acuerdo con esta modalidad preferida del segundo aspecto se enlaza al mismo tiempo a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo . con SEQ ID NO: 2 y a por lo menos un aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3. En modalidades más preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza por lo menos un aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO: 4) . En modalidades más preferidas- del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos HKDMQ (SEQ ID NO: 5) , de manera más preferente a por lo menos un aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos KDM. En modalidades particularmente preferidas, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo se enlaza al mismo tiempo al por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos DETCEQR (SEQ ID NO:- 4) y a por lo menos un aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos KDM.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo tiene una constante de enlace a C5a, de manera preferente C5a humana, con un valor Kd de 10 nM o menor, de manera preferente 9 nM o menor, de manera más preferente 8 nM o menor, de manera más preferente 7 nM o menor, de manera más preferente 6 nM o menor, de manera más preferente 5 nM o menor, de manera más preferente 4 nM o menor, de manera más preferente 3 nM o menor, de manera más preferente 2 nM o menor, y de manera aún más preferente 1 nM o menor.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo muestra por lo menos 75% de actividad de bloqueo, de manera preferente por lo menos 80% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 85% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 90% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 95% de actividad de bloqueo para efectos biológicos inducidos por una molécula C5a, de manera preferente C5a humana. Estas actividades de bloqueo preferidas se refieren a' aquellas modalidades, en donde el anticuerpo (o el fragmento de enlace a antigeno del mismo) comprende un parátopo individual que se enlaza a C5a, de manera preferente C5a humana. En modalidades, en donde el anticuerpo (o el fragmento de enlace a antigeno del mismo) comprende dos o más parátopos específicos de C5a, las actividades de bloqueo de por lo menos 75%, de manera preferente por lo menos 80%, de manera más preferente por lo menos 85%, etcétera se logran cuando una molécula de porción de enlace se pone en contacto con un número de moléculas C5a igual al número de parátopos específicos de C5a presentes en el anticuerpo (o el fragmento de enlace a antígeno del mismo) . Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a típico del tipo IgG comprende dos parátopos capaces de enlazarse a C5a, mientras que un anticuerpo anti-C5a típico del tipo IgM comprende diez parátopos capaces de enlazarse a C5a. De esta manera, la actividad de bloqueo de un anticuerpo de tipo IgG se debe determinar al poner en contacto el anticuerpo con C5a en una relación molar de 1:2. La actividad de bloqueo de un anticuerpo del tipo IgM se debe determinar al poner en contacto el anticuerpo con C5a en una relación molar de 1:10. Cuando se seleccionan estas relaciones molares, los parátopos dentro del anticuerpo y C5a están presentes en concentraciones equimolares. En otras palabras, . cuando los parátopos de un anticuerpo (o fragmento de enlace a antigeno del mismo) de acuerdo con el segundo aspecto y C5a están presentes en concentraciones equimolares, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo muestra por lo menos 75% de actividad de bloqueo, de manera preferente por lo menos 80% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 85% de actividad de bloqueo, de manera más preferente por lo menos 90% de actividad de bloqueo, y de manera más preferente por lo menos 95% de actividad de bloqueo para efectos biológicos inducidos por C5a. Un efecto biológico preferido que se bloquea es de liberación de lisozima inducida por C5a de células sanguíneas enteras humanas. Los ensayos -para determinar esta liberación de lisozima inducida por C5a y su bloqueo se describen en la sección de ejemplos.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo no inhibe la actividad de CH50 en el plasma humano. Los ensayos para determinar la actividad de CH50 son conocidos por la persona experta y se describen posteriormente en la sección de ejemplos.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo no muestra una actividad de bloqueo en por lo menos un efecto biológico inducido por C5b, de manera preferente el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo no muestra una actividad de bloqueo en cualquier efecto biológico inducido por C5b.
En modalidades preferidas del segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo es capaz de reducir la producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre entera humana. Los ensayos para medir la producción de IL-8 en sangre entera son conocidos por la persona experta y se describirán posteriormente en la sección de ejemplos.
Una modalidad preferida del segundo aspecto se dirige al anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo para la prevención y o tratamiento de varias enfermedades que implican inflamación aguda tal como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tal como enfermedad cardíaca isquémica, lesión aguda de pulmón, neumonía, rechazo de injerto agudo- y crónico en pacientes de trasplante, reacciones de injerto contra el hospedero, pero también enfermedades que implican un tipo crónico de inflamación tales como enfermedades glomerulares renales tal como glomerulonefrit is y otras entidades de insuficiencia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares tales como enfermedad de Bechterew, enfermedades de tipo lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, crecimiento tumoral o cáncer de órganos sólidos.
En modalidades preferidas del primer y el segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende uno de los conjuntos de secuencias CDR3, de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada y CDR1 de cadena pesada como se- lista posteriormente en la Tabla 1, en donde cada secuencia CDR3 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; y en donde cada secuencia CDR1 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos: Tabla 1 : Conjuntos de secuencias CDR de cadena pesada adecuadas para el uso en los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención modalidades preferidas del primero y segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende uno de los siguientes conjuntos de secuencias CDR3 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera, y CDRl de cadena ligera como se lista en la Tabla 2, en donde cada secuencia CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; y en donde cada secuencia CDRl de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos: Tabla 2 : Conjunto de secuencias CDR de cadena ligera adecuadas para el uso en los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención Puesto que la secuencia CDR2 de cadena ligera del anticuerpo INab308 (SEQ ID NO: 12) es idéntica a la secuencia de CDR2 de cadena ligera del anticuerpo INab708 (SEQ ID NO: 13) , los conjuntos que incluyen SEQ ID NO: 13 serian redundantes a los conjuntos que incluyen SEQ ID NO: 12. Por lo tanto, la tabla lista solamente cuatro conjuntos de secuencias CDR de cadena ligera. modalidades preferidas del primero y segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende uno de los conjuntos CDR de cadena pesada A-H listados en lo anterior en la Tabla 1 y uno de los conjuntos CDR de cadena ligera I-IV listados en lo anterior en la Tabla 2, es decir una de las siguientes combinaciones de conjuntos: A-I, A-II, A-III, A-IV, B-I, B-II, B-III, B-IV, C-I, C-II, C-III, C-IV, D-I, D-II, D-III, D-IV, E-I, E-II, E-III, E-IV, F-I, F-II, F-III, F-IV, G-I, G-II, G-III, G-IV, H-I, H-II, H-III, o H-IV, en donde cada secuencia CDR3 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o .3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia CDR1 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos; y en donde cada secuencia CDR1 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, de manera preferente intercambios de aminoácidos conservadores, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos .
En modalidades preferidas del primero y segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende un dominio VH que comprende, consiste esencialmente de o consiste de (i) el dominio VH de INab308 o (ii) el dominio VH de INab708.
Las secuencias FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4 que definen los dominios VH de INab308 y INab708 se muestran posteriormente en la Tabla 4.
En modalidades preferidas del primero y segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende un dominio VL que comprende, consiste esencialmente de o consiste de (i) el dominio VL de INab308 o (ii) el dominio VL de INab708.
Las secuencias FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3, y FR4 que definen los dominios VL de INab308 y INab708 se muestran posteriormente en la Tabla 4.
En modalidades preferidas adicionales del primero y segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo comprende un dominio VH y un dominio VL, en donde (i) el dominio VH comprende, consiste esencialmente de o consiste del dominio VH de INab308 y el dominio VL comprende, consiste esencialmente o consiste de del dominio VL de INab308; o (i) el dominio VH comprende, consiste esencialmente de o consiste del dominio VH de INab708 y el dominio VL comprende, consiste esencialmente de o consiste del dominio VL de INab708.
En modalidades preferidas del primero y segundo aspecto, el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo que comprende una o más CDRs, un conjunto de CDRs o una combinación de conjuntos' de CDRs como se describe en este documento comprende las CDRs en una estructura de anticuerpo humano .
La referencia en este documento a un anticuerpo que comprende con respecto a la cadena pesada del mismo una cadena particular, o una región particular o secuencia se refieren de manera preferente a la situación donde todas las cadenas pesadas del' anticuerpo comprenden la cadena particular, región o secuencia. Esto aplica correspondientemente a la cadena ligera del anticuerpo.
La enseñanza dada en este documento con respecto a secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos especificas, por ejemplo aquellas mostradas en el listado de secuencias, se va a considerar también para referirse a modificaciones de las secuencias específicas que dan por resultado secuencias que son funcionalmente equivalentes de las secuencias específicas, por ¦ ejemplo secuencias de aminoácidos que muestran propiedades idénticas o similares a aquellas de las secuencias de aminoácidos específicas y secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos que muestran propiedades idénticas o similares a aquellas de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias e ácidos nucleicos específicos. Una propiedad importante es retener el enlace de un anticuerpo a su objetivo o sostener las funciones efectoras de un anticuerpo. De manera preferente, una secuencia modificada con respecto a una secuencia específica, · cuando se reemplaza la secuencia específica de un anticuerpo retiene el enlace del anticuerpo a C5a, en particular al epítopo conformacional de identificado en este documento, y retiene de manera preferente las funciones del anticuerpo como se describe en este documento, por ejemplo el bloqueo de la liberación de lisozimas inducida por C5a de células de sangre entera humana y/o reducir la producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre entera humana.
Se apreciará por aquellas personas expertas en la técnica que en particular las secuencias de la COR, se pueden modificar las regiones hipervariables y variables sin perder la capacidad de enlazarse a C5a. Por ejemplo, las regiones CDR serán ya sea idénticas o sumamente homologas a las regiones especificadas en este documento. Por "sumamente homologas" se contempla que de 1 a 5, de manera preferente de 1 a 4, tal como de l a 3 o de l o 2 sustituciones, supresiones, o adiciones se pueden hacer en las CDRs. Además las regiones hipervariables y variables se pueden modificar para que muestran homología sustancial con las regiones dadas a conocer específicamente en este, documento.
Adicionalmente, se puede desear de acuerdo con la presente invención modificar las secuencias de aminoácidos descritas en este documento, en particular a aquellas de regiones constantes de cadena pesada humanas para adaptar la secuencia a un halotipo deseado, por ejemplo un halotipo encontrado en la población Caucásica.
La presente invención comprende además anticuerpos en los cuales las alteraciones se han hecho en la región Fe a fin de cambiar las propiedades funcionales o farmacocinéticas de los anticuerpos. Estas alteraciones pueden dar por resultado una disminución o incremento del enlace Clq y CDC o del enlace FcyR y ADCC. Las sustituciones pueden, por ejemplo, ser hechas en uno o más de los residuos de aminoácidos de la región constante de cadena pesada, causando en consecuencia una alteración en una función efectora mientras que retiene la capacidad de enlazarse al antigeno como es comparada con el- anticuerpo modificado, patente de E.U.A. cf. No. 5,624,821 y la patente de E.U.A. No. 5, 648, 260.
La vida media in vivo de los anticuerpos se puede mejorar al modificar el epitopo del receptor silvestre del dominio constante Ig o un dominio constante similar a Ig tal que la molécula no comprenda un dominio CH2 intacto o una región Fe de Ig intacta, véase la patente de E.U.A. No. 6,121,022 y patente de E.U.A. No. 6,194,551. La vida media in vivo se puede incrementar adicionalmente al hacer mutaciones en la región Fe, por ejemplo, al sustituir treonina por leucina en la posición 252, al sustituir treonina por serina en la posición 254, o al sustituir treonina por fenilalanina en la posición 256, véase la patente de E.U.A. No. 6,277,375.
Adicionalmente, el patrón de glicosilación de los anticuerpos se puede modificar a fin de cambiar la función efectora de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden expresar en una transfectoma que no agrega la unidad de fucosa adherida normalmente a Asn en la posición 297 de la región Fe a fin de mejorar la afinidad de la región Fe para los receptores, gue, a su vez, darán por resultado un ADCC incrementado de los anticuerpos en presencia de células NK, véase Shield y colaboradores (2002) JBC, 277: 26733.
Adicionalmente, se puede hacer la modificación de la galactosilación a fin de modificar el CDC.
Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir aleatoriamente mutaciones a lo largo de todo parte de una secuencia de codificación de anticuerpo anti-C5a anticuerpo, tal como mediante mutagénesis por saturación y los anticuerpos anti-C5a. modificados resultantes se pueden clasificar para la actividad de enlace.
En un tercer aspecto la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende (a) la porción de enlace de acuerdo, con el primer aspecto o (b) el anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo de acuerdo con el segundo aspecto, y que comprende además uno o más portadores, diluyentes, ' excipientes, rellenos, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, adsorbentes y/o conservadores farmacéuticamente aceptables.
En un cuarto aspecto, la presente invención se dirige a un uso de (a) una porción de enlace de acuerdo con el primer aspecto o (b) un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo de acuerdo con el segundo aspecto, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y o tratamiento de varias enfermedades que implican inflamación aguda tal como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tal como enfermedad cardiaca isquémica, lesión aguda de pulmón, neumonía, rechazo de injerto agudo y crónico en pacientes de trasplante, reacciones de injerto contra el hospedero, pero también enfermedades que. implican un tipos crónicos de inflamación tal como enfermedades glomerulares renales tal como glomerulonef itis y otras entidades de insuficiencia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares tales como enfermedad de Bechterew, enfermedades de tipo lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, crecimiento tumoral o cáncer de órganos sólidos.
En un quinto aspecto, la presente invención se dirige a un método para prevenir y o tratar varias enfermedades que implican inflamación aguda tal como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfusión tal como enfermedad cardíaca isquémica, lesión aguda de pulmón, neumonía, rechazo de injerto agudo y crónico en pacientes de trasplante, reacciones de injerto contra el hospedero, pero también enfermedades que implican tipos crónicos de inflamación tal como enfermedades glomerulares renales tal como glomerulonefritis y otras entidades de insuficiencia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunes similares, tales como enfermedad de Bechterew enfermedades de tipo lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, crecimiento tumoral o cáncer de órganos sólidos en un paciente en necesidad del mismos, el método que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de (a) una porción de enlace de acuerdo con el primer aspecto o (b) un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo de acuerdo con el segundo aspecto.
En la práctica de cualquier aspecto de la invención, una composición farmacéutica como se describe en lo anterior o una porción de enlace (por ejemplo un anticuerpo o fragmento de enlace a antigeno del mismo) se puede administrar a un paciente mediante cualquier vía establecida en la técnica que proporcione un nivel suficiente de porción de enlace en el paciente. Se puede administrar sistémica o locamente. Esta administración puede ser parenteral, transmucosa, por ejemplo, de forma oral, nasal, rectal, intravaginal, sublingual, submucosa, transdérmica, o por inhalación. De manera preferente, la administración es parenteral, por ejemplo, a través de inyección intravenosa o intraperitoneal , y también incluye, pero no se limita a, administración intra-arterial, intramuscular, intradérmica y subcutánea. Si la composición farmacéutica de la presente invención se administra localmente se puede inyectar directamente en el órgano o tejido que se trata, por ejemplo en el órgano afligido por un tumor.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración oral, se puede proporcionar como cápsulas o tabletas; como polvos o gránulos; como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos); como espumas comestibles o postres; o como emulsiones. Las tabletas o cápsulas de gelatina dura pueden' comprender lactosa, almidón o derivados de los mismos,- estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, ácido esteárico, o sales de los mismos. Las cápsulas de gelatina blanda pueden comprender aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos etcétera. Las soluciones y jarabes pueden comprender agua polioles y azúcares.
Un agente activo propuesto para administración oral se puede recubrir con o mezclar con un material que retarda la desintegración y/o absorción del agente activo en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, se pueden utilizar monoestearato de glicerilo o distearato de glicerilo) . De esta manera, la liberación sostenida de un agente activo se puede lograr a través de muchas horas y, si es necesario, el agente activo se puede proteger de ser degradado dentro del estómago. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral . se pueden formular para facilitar la liberación de un agente activo en una ubicación gastrointestinal particular debido a pH o condiciones enzimáticas especificas.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración transdérmica se pueden proporcionar como parches discretos propuestos para permanecer en contacto intimo con la epidermis del recipiente durante un periodo de tiempo prolongado. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración oral se pueden proporcionar como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos soluciones, pastas, geles, rocíos, aerosoles o aceites. Para la administración tópica a la piel, boca, ojos u otros tejidos externos se utiliza de manera preferente un ungüento tópico o crema. Cuando se formulan en un ungüento, el ingrediente activo se puede emplear con ya sea una base de ungüento parafínico o miscible ¦ en agua. Alternativamente, el ingrediente activo se puede formular en una crema con una base de aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica a los ojos incluyen gotas para los ojos. En estas composiciones, el ingrediente activo se puede disolver o suspender en un portador adecuado, por ejemplo, en un solvente acuoso. .Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica en la boca incluyen grageas, pastillas y lavados bucales.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración nasal pueden' comprender portadores sólidos tales como polvos (que tienen de- manera preferente un tamaño de partícula en el intervalo de 20 a 500 mieras) . Los polvos se pueden administrar en la manera en la cual se aspire, es decir, mediante rápida inhalación a través de la nariz de un contenedor de polvo mantenido cercano a la nariz. Alternativamente, las composiciones adaptadas para la administración nasal pueden comprender portadores líquidos, por ejemplo, rocíos nasales o gotas nasales. Estas composiciones pueden comprender soluciones acuosas o aceite del ingrediente activo. Las composiciones para la administración mediante inhalación se pueden suministrar en dispositivos especialmente adaptados incluyendo, pero no limitado a, aerosoles presurizados, nebulizantes o insufladores , que se pueden construir para proporcionar dosificaciones predeterminadas del ingrediente activo. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a través de la cavidad nasal a los pulmones.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración rectal se pueden proporcionar como supositorios o enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración vaginal se pueden proporciona como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de roció.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones inyectables estériles acuosas y · no acuosas, que pueden contener antioxidantes, soluciones amortiguadoras, bacteriostatos y solutos que vuelven las composiciones sustancialmente isotónicas con la sangre de un recipiente propuesto. Otros componentes que pueden estar presentes en estas composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones adaptadas para la administración parenteral se pueden presentar en contenedores de dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo ampolletas y frasquitos sellados, y se pueden almacenar en una condición deshidratada. por congelación (liofilizada) requiriendo solamente la adición de un portador liquido estéril, por ejemplo, solución salina estéril para inyecciones,, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas.
En una modalidad preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en solución amortiguadora acuosa isotónica estéril. Donde sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la invención. En general, los ingredientes se suministran ya sea separadamente o mezclados conjuntamente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o saquito indicando la cantidad de agente activo. Donde la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Donde la composición se administra por inyección, una ampolleta de solución salina estéril se puede proporcionar para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
En otra modalidad, por ejemplo, un inhibidor de quimioatracción se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, en inhibidor se puede administrar utilizando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (véase Sefton (1987) CRC Crit. Ref.
Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald y colaboradores (1980) Surgery 88:507; Saudek y colaboradores (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574). En otra modalidad, el compuesto se puede suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat y colaboradores (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; U.S. 4,704,355). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Reléase (1974) Langer y ise (eds.), CRC Press: Boca Ratón, Fia.; Controlled Drug Bioavailabil ity, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen y Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger y¦ Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; véase también Levy y colaboradores (1985) Science 228:190; During y colaboradores (1989) Ann . Neurol. 25: 351; Howard y colaboradores (1989) J. Neurosurg. 71: 105) .
En todavía otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación con'tralada en proximidad del objetivo terapéutico, es decir, las células objetivo, tejido u órgano, requiriendo de esta manera solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Reléase, vol. 2). Otros sistemas de liberación controlada se plantean en la revisión por Langer (1990, Science 249: 1527-1533) .
En una modalidad especifica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no a manera de limitación, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, en conjunción con un aposito de heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, el implante que es de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas silásticas, o fibras.
La selección de la dosis efectiva preferida se determinará por un artífice experto con base en la consideración de varios factores que serán conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Estos factores incluyen la forma particular de la composición farmacéutica, por ejemplo polipéptido o vector, y sus parámetros farmacocinéticos tal como biodisponibilidad, metabolismo, vida meda, etcétera, que habrán sido establecidos durante los procedimientos del desarrollo usual empleados típicamente en la obtención de la aprobación reguladora para un compuesto farmacéutico. Los factores adicionales en la consideración de la dosis incluyen la condición o enfermedad que se previene y o se trata o el beneficio que se logra en un individuo normal, la masa corporal del paciente., la vía de administración, si la administración es aguda o crónica, medicaciones concomitantes, y otros factores bien conocidos para afectar la eficacia de los agentes farmacéuticos administrados. De esta manera la dosis precisa se debe decidir de acuerdo con la evaluación del profesional y cada circunstancia del paciente, por ejemplo, dependiendo de la condición y el estado inmune del paciente individual, de acuerdo con las técnicas clínicas estándares.
En la práctica de cualquier aspecto de la presente invención que se relaciona con la prevención y o tratamiento de crecimiento tumoral o cáncer de órganos sólidos, el sujeto al que se le administra la porción de enlace o anticuerpo de la invención se trata adicionalmente con un agente quimioterapéutico, radiación, o una agente que modula, por ejemplo, potencia o inhibe, la expresión de o actividad de un receptor Fe, por ejemplo un receptor Fc-gamma, tal como citocina. Las citocinas típicas, para la administración durante el tratamiento incluyen factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , interferón-? (IFN-?), y factor de necrosis tumoral (TNF) . Los agentes terapéuticos típicos incluyen, entre otros, agentes neoplásicos tales como doxorubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluoruracilo, metotrexato, gemzitabina y ciclofosfamida .
Las siguientes figuras y ejemplos son meramente ilustrativos de la presente invención y no se deben considerar para limitar el alcance de la invención de cualquier manera como se indica por las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS 1. Métodos 37 °C durante toda la. noche. El cultivo se transfirió a 2 L de medio de LB y se incubó a 37°C hasta la. fase media exponencial (A600 ~ 0.6), y luego se agregó isopropil-/?-D-t iogalactopiranosido (IPTG) a una concentración final de 0.1 mM. Las células se dejaron desarrollar a 30°C durante toda la noche y se recolectaron al hacer .girar el cultivo a 7,000 rpm, 4°C, durante 15 minutos. Después del lavado con solución salina amortiguada con fosfato (PBS; PB 10 mM, NaCl 150 mM [pH 7.4]) una vez, la pelotilla de bacterias sk resuspendió en PBS y se sónico sobre hielo. Después de la centrifugación a 12,000 rpm, 4°C, durante 15 minutos, la fracción soluble se separó de la pelotilla insoluble. Para purificar la C5a recombinante humana, el sobrenadante de lisado celular se cargó sobre una columna de afinidad quelada con níquel pre-equilibrada con PBS. Después la columna se lavó con imidazol 50 mM e imidazol 200 mM en PBS, respectivamente, finalmente, las proteínas enlazadas se eluyeron mediante imidazol 500 mM, se dializaron contra PBS durante toda la noche y se dializaron mediante electroforesis en gel de dcj>decilsulfato de sodio-poliacrilamid (SDS-PAGE) . 1.2 Inmunización y clasificación de hibridoma por ELISA: Se hicieron anticuerpos monoclonales utilizando métodos de hibridoma. La inmunización y producción de MAbs se llevaron a cabo utilizando protocolos estándares. Ratones solución de desarrollo de color que contiene clorhidrato de o-fenilen-diamina (OPD) y H202 8.5 mM. La absorbancia ligera se midió a 492 nm con un lector ELISA (Anthos, W¡als/Salzburg, Austria) . 1.3 Producción y purificación de anticuerpos mon clonales: Para producir los Mab en gran cantidad, 5 x 106 células de hibridoma se inyectaron en la cavidad peritoneal de los ratones. Después de 14 días, se retiraron los ascitos y se centrifugaron a 1500 rpm, 4°C, durante 5¡ minutos . sobrenadante se recolectó y se aplicó a una) columna Sepharose 4B de proteina A, gue se había pre-e<jjuilibrado en PBS. El Mab enlazado se eluyó con ácido cítrico (pH 4.0) y se dializó contra PBS durante toda la noche. Las proteínas purificadas se analizaron por SDS-PAGE. 1.4 Ensayo de Liberación de Enzimas para la Bioactividad de C5a La inducción de liberaciones de pnzimas por desgranulación es una característica biológic importante de la C5a. En el estudio- de los inventores, sangre entera humana reciente de voluntarios sanos se utilizó para evaluar el efecto de C5a en liberaciones de lisozimas. Los niveles de lisozimas liberadas de células de sangre entera se analizaron por el . Kit de Ensayo de Lisozima EnzChekMR (Invitrogen, CA, EUA) . Para estudiar la actividad de bloqueo de los anticuerpos anti-C5a, rhC5a (100 nM) se mezcló con diferente concentración de anticuerpo. Después, las células de sangre entera se agregaron inmediatamente para evitar la pre-incubación de anticuerpos con C5a Después de la incubación, 50 µ? de los sobrenadantes de muestra se agregaron a 50 µ? de solución pe substrato diluido. La placa se incubó durante 37°C durante 30 minutos en la oscuridad y se leyó después con] el contador de múltiples etiquetas Perkin Elmer 1420 (Méissachusett s , EUA) . La intensidad de fluorescencia se midió con una excitación a 490 nm y una emisión a 525 nm y se sustrajo el valor estándar cero (en blanco) de todas l|as muestras . La actividad de bloqueo¦ del anticuerpo se cal|culó6 después de la sustracción de la intensidad de fluorescencia de la liberación de lisozimás independiente de rhC5a (control de amortiguador) de la intensidad de fluorescencia de la liberación de lisozimás inducida por rhC5a. :ia actividad de bloqueo se calculó con la siguiente fórmula, actividad de bloqueo = C5a Fluorescencia ~ (C5a+Ab) Fluorescencia / C5a Fluorescencia ~ Control Amortiguador Fluorescencia' 1.5 Análisis ELISA de la capacidad de enlace de INab308 y INab708 a la C5a humana o mutantes C5a Se llevó a cabo un Elisa de énlace para determinar las actividades de enlace de INab3Q8 y INab708 a la C5a humana y mutantes de C5a. Los mutanttes de C5a se produjeron al reemplazar el · aminoácido correspondiente alanina mediante la introducción de GCT en el sitio mutación del nivel de cDNA . Estos mutantes C$a incluyeron la mutación de sitio en 24, 29, 30, 31, 35, 36, 37, mutación doble 30/37, 40, 53, 64, 65, 68, 64/68, 66/68, 69, 70, y C-del (12 aminoácidos suprimieron de la C-terminal de C5a ) .
La C5a humana (Sigma C5788), C5a req:ombinante , y mutantes de C5a (2 pg/mL) se recubrieron en lina placa EIA de 96 pocilios (Costar 9018) a 4°C durante teda la noche Después de ser bloqueada de 5% de leche sin grasa en PBS a 37°C durante 1 h, 0.08, 0.4, 2 g/ml de anticuerpos anti-C5a (INab308 y INab708) preparada con solución amortiguadora de dilución se agregaron a cada pocilio y se incubaron a 37°C durante 1 hora, seguido por 100 µ? de anticuerpo anti-ratón de cabra etiquetado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora. La reacción de peroxidasa se desarrolló con solución de desarrollo de color que contiene clorhidrato de o-fenilen-dijamina 5.5 mM (OPD) y H2C>2. La absorbancia de luz se midió k 492 nm con un lector ELISA (Anthos, als/Salzburg, Austrila) . El valor OD para la C5a recombinante . se ajustó como 100% de actividad de enlace. La capacidad de enlace de los mutantes C5a se calcula por ODCsa mutam/ODcsa · 1.6 Actividad Hemolitica en Plasma (CH50) : (BioLegend, EUA) 1.8 Ensayo para clasificar anticuerpos que s¡e enlazan al nuevo epitopo conformacional: En la estructura 3-D de la C5a obtenida en el método de modelación por computadora, los epitopos espaciales que contienen el péptido | C5a 28-40 ( V DETCEQRAAR , SEQ ID NO: 67) y el péptido C5a 65-70 ( ISHKDM, SEQ ID NO: 68) se pueden observar como serpentines aleatorios. Cuando los dos péptidcs se enlazan por una ligadura de péptido flexible, GGGGS ( SEQ ID NO: 69), los epitopos espaciales se reconstruyen ásemej ándose a la conformación del antigeno precursor, ya que la interacción hidrofóbica débil de los dos péptidos asegura una conformación en. forma de bolsillo. El análisis de modelación por computadora ' del péptido NH2-28-40-Linker (GGGGS) -65-70-COOH · mantienen la misma Iconformación como el antigeno precursor. Este nuevo péptido 24-AA se puede sintetizar yo conjugar con hemocianina de lapa californiana (KLH) para formar un inmurjógeno para inmunizar ratones, . y la tecnología de hibridoma tradicional se puede aplicar subsecuentemente jbara obtener INab308 y INab708 utilizando el nuevo ELISA basado en el péptido 24-AA como .una herramienta de clasificación.
Una placa ELISA de 96 pocilios se recubre con 1-2 de 50% de pérdida de bioactividad en comparación con la C5a humana se consideró como . un sitio crítico para la función biológica de C5a. De esta manera, los residuos de aminoácidos 24, 29, 31, 37, 68, y 69 se identificaron como sitio críticos para la función (Figura 1) . 2.2 Caracterización de los epitopos en C5a enlazada por anticuerpos INab308 e INab708 2000 clones celulares que secretan anticuerpos contra C5a humana se clasificaron con el ensajyo funcional (liberación de enzimas) . Solamente dos anticuerpos mostraron actividades de bloqueo superior.
Estos dos' anticuerpos, INab308 y INab708, se caracterizaron adicionalmente con respecto los aminoácidos particulares en C5a reconocida por los dos anticuerpos .
En particular, se generaron varios mutantes de C5a en los cuales uno o más aminoácidos se reemplazaron por alanina. Los anticuerpos INab308 y INab708 se pusieron en contacto con estos mutantes y el grado de enlace se determinó por el ELISA (véase la sección 1. í> anterior). Una pérdida de capacidad de en lace mayor que 30% (como es comparado con la C5a tipo silvestre) se: consideró significativa.
Los datos indican que INab308 se enlaza a dos regiones, 31-37 y 68-6-9 (Figura 2). Del mismo modo, INab708 se enlaza a dos regiones, 31-37 y 68-70 (Figura 3) .
Notablemente, las regiones identificadas por ambos anticuerpos cubren cuatro residuos de aminoáci dcos (31, 37, 68, y 69) que se identificaron como sitios crij' icos para la función de C5a en la sección 2.1 anterior. 2.3 Efecto de anticuerpos INab308, INab708¡ y F20 en actividad hemolxtica en plasma humana El titulo de complemento hemolitico total (CH50) es un método convencional para la determinación de |la activación de la ruta de complemento clásica (véase la sección 1.6) Los anticuerpos monoclonales a C a¿ (INab708, INab308, y F20) se pre-incubaron con plasma hu.mano en una concentración de aproximadamente 5 µ?, y luego e realizó el ensayo CH50. Entre estos anticuerpos, el F20 inhibe fuertemente la actividad de CH50, mientras qje INab708 y INab308 no tienen influencia (Figura 4) .
Estos resultados muestran que INab708 y INab308 no interfieren con la activación de complemento mediJada por C5b. 2.4 Efecto de anticuerpos INab308, INab708, y L2B23 en la bioactividad de C5a La actividad de bloqueo de los anticuerpos INab308, INab708, y L2B23 en C5a se evaluó pe r el ensayo de liberación de lisozimas inducida por C5a (véase la sección 1.4) . La relación molar del anticuerpo a C5a se ajustó a 1:2 para evaluar la actividad de bloqueo de un anticuerpo al efecto biológico inducido por dos moléculas de C5a. Estos anticuerpos son anticuerpos bivalentes. Por consiguiente, al seleccionar la relación molar anterior de 1:2, los parátopos de los anticuerpos por otra parte y C5a por la otra están presentes en concentraciones equimolares.
Los datos en la Figura 5 muestran q|ue INab308 y INab708 poseen actividad de bloqueo muy alta la bioactividad de C5a (94% y 100%, respectivamente), mientras que L2B23 muestra solamente un efecto mínimo (aproximadamente 12%). 2.5 Efecto de los anticuerpos INab308 y INab708 en la producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre entera humana Para evaluar la eficacia de los anticiuerpos anti C5a en un entorno cercano a la sepsis clínica, se determinó producción de IL-8 inducida por E. coli en sangre entera Este ensayo se puede considerar como un modelo ide infección por E. coli (también véase la sección 1.7) .
En presencia de INab308 y INab708 durante la incubación, los niveles de IL-8 se atenuaron significativamente (P < 0'.01) ,¦ mientras que no hubo reducción significativa en presencia de L2B23 (Figura 6) 3. Sumario Las propiedades importantes de lo¿ anticuerpos preferidos de la invención INab308 y INab708 se resumen en la Tabla 3 a continuación. Se incluyen cidicionalmente anticuerpos comparativos 8g8, MAb 137-26, A 1876, G57, F20, L2B23, y G13 que no se enlazan simultáneamente a ambas secuencias de aminoácidos del epitopo conformacional identificado en la presente invención, es decir secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Los anticuerpos comparativos 8g8, MAb 137-26, F20, G57, L2B23, y G13 se enlazan a solamente una de estas dos secuencias de aminoácidos (8g8, MAb 137-26, F20, G57, y GL3) o a una secuencia de aminoácidos diferente (L2B23) . El epitopo objetivo de Abl 1876 no se conoce.
Tabla 3 : Anticuerpos neutralizantes a C5a y los ¿pitopos Los anticuerpos monoclonales a C5a humana generaron utilizando tecnología de hibridoma [clásica . sitios de enlace de Mab a C5a humana se determinaron por el método de clasificación de alanina. Las actividades de bloqueo del Mab se cuantificaron por inhibición de las liberaciones de lisozima inducidas por C5a de células de sangre entera humana ND: NO determinado; clon *ATCC no. PTA-3650 que\ se relaciona con un anticuerpo dado a conocer en la solicithd de Patente Europea 1 878 441 A2; **Abll8T6 es un anticuerpo anti-C5/C5a de ratón monoclonal obtenible de ABC AM (Cambridge, RU) .
Como se muestra^ en la Tabla 3, algunos anticuerpos comparativos (8g8, MAb 137-26) muestran mayores afinidades de enlace a C5a que los anticuerpos preferidos de La invención, INab308 y INab708. No obstante, los INab30 e INab708 muestran mayores actividades de bloqueo que cualquier anticuerpo comparativo estudiado. Más específicamente, cada uno de INab308 y INab708 muestra una actividad d bloqueo muy alta (>90%) , aún cuando se utilizan en cantidades estequiométricas, es decir en una relación de 1 parátopo por 1 epítopo; es decir 0.5 moléculas de anticuerpo por 1 molécula objetivo. Los anticuerpos de la técnjica anterior (MAb 137-26, Abll876) . lograron actividades de bloqueo razonables solamente cuando se utilizaron en! cantidades superestequiométricas . Estas investigaciones £tran que la alta afinidad de enlace no siempre puede ser i blada con la alta actividad de bloqueo.
Cadena Ligera: Cadena Ligera:: FR l : DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS FRl : DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 63) CDR1 : C ASQSVDYDGDSYMK CDR 1 : CKASQSVDYDGlDSY N (= SEQ ID NO: 16) (= SEQ ]D NO: ? ?? FR2: WYQQKPGQPPKLL FR2: WYQQKPGQPP L (SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 64) CDR2: rYAASNL CDR2: rYAASNL (= SEQ ID NO: 1 2) (= SEQ ID NO: 13) FR3: FR3 : QSG1PARFSGSGSGTDFTLN1HPVEEEDA GSGIPARFSGSGSGTDF|rLNIHPVEEEVA ATYY ATYY (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: 65) CDR3: CQQSNEDPYT CDR3: CQQNNEDPLT (= SEQ ID NO: 8) (= SEQ ID NO: 9) FR4: FGGGTK.LEIK FR4: FGAGTLLELK (SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 66) REFERENCIAS Allegretti M, Moriconi A, Beccari AR, Di Bitongo R, Bizzarri C, Bertini R, and Colotta F. 2005. Targetimg C5a: recent advances in drug discovery. Curr Med Ch;¡em 12 (2) :217- 236.
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Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invencion, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una porción de enlace que se e|nlaza a un epitopo conformacional formado por secuencias de aminoácidos X1X2ETCEX3RX4 (SEQ ID NO: 18) y X5X 6KX7X8X 9L (SEQ IE) NO: 19) de C5a, en donde Xi se selecciona del grupo que consiste de N, H, D, y T; X2 se selecciona del grupo que consiste de D, L, Y, X3 se selecciona del grupo que consiste de Q, E, y X4 se selecciona del grupo que consiste de A, V, y L; X5 se selecciona del grupo que consiste pe S, H, P, y N; X6 se selecciona del grupo que consiste de H y N; X7 se selecciona del grupo que consiste tie D, N, H, X8 se selecciona del grupo que consiste de M, L, I, Y V; y X9 se selecciona del grupo que consiste de Q, L, e i; en donde la porción de enlace se sel)ecciona del grupo que consiste de: (a) anticuerpos o fragmentos de enlace a antígenos de los mismos; (b) oligonucleótidos ; (c) proteínas similares a anticuerpo; o (d) peptidomiméticos . 2. La porción de enlace de conformi!dad con la reivindicación 1, caracterizada porque la porción de enlace se enlaza a por lo menos un aminoácido de la secuencia de aminoácidos X2ETCEX3R (SEQ ID NO: 20), en donde X2 y X3 se definen coftio en la reivindicación 1 3. La porción de enlace de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la porción de enlace se enlaza a por lo menos un aminoácido de 1a secuencia de aminoácidos X6KX7X8X9 (SEQ ID NO: 21), de manera preferente KX7X8, · en donde X , X7, X8, y X9 se definen como en la reivindicación 1. La porción de enlace de conformidad con la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizada porque| el epitopo conformacional se forma por (a) secuencias de aminoácidos NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) y SHKDMQL (SEQ ID NO: 3) de C5a; (b) secuencias de aminoácidos HDETCEQRA ;SEQ ID NO: 22) y SHKDLQL (SEQ ID NO: 23) de C5a; (c) secuencias de aminoácidos DDETCEERA [SEQ ID NO: 24) y SHKNIQL (SEQ ID NO: 25) de C5a; (d) secuencias de aminoácidos DLETCEQRA ¡SEQ ID NO: 26) y SHKHIQL (SEQ ID NO: 27) de C5a; (e) secuencias de aminoácidos DDETCEQRA ¡SEQ ID NO; 28) y HHKNMQL (SEQ ID NO: 29) de C5a; (f) secuencias de aminoácidos FYETCEERV SEQ ID NO: 30) y PHKPVQL (SEQ ID NO: 31) de C5a; (g) secuencias de aminoácidos KYETCEQRV SEQ ID NO: 32) y HHKGMLL (SEQ ID NO: 33) de C5a; (h) secuencias de aminoácidos YDETCEQRA SEQ ID NO: 34) y SNKPLQL (SEQ ID NO: 35) de C5a; o (i) secuencias de aminoácidos THETCEKRL SEQ ID NO: 36) y NHKPVIL (SEQ ID NO: 37) de C5a. 5. La porción de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la porción de enlace se enlaza a por lo menos un aminoácido de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (a) DETCEQR (SEQ ID NO: 4); (b) DETCEER (SEQ ID NO: 38) (c) LETCEQR (SEQ ID NO: 39) (e) YETCEER (SEQ ID NO: 40) (f) YETCEQR (SEQ ID NO: 41) (g) HETCEKR (SEQ ID NO: 42) . 6. La porción de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la porción de enlace se enlaza a por 4.0 menos un aminoácidos de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (a) HKDMQ (SEQ ID NO: 5), de manera preférente KDM; (b) HKDLQ (SEQ ID NO: 43), de manera preferente KDL; HKNIQ (SEQ ID NO: 44), de man preferente KNI; ¡d) HKHIQ (SEQ ID NO: 45), de manera preferente KHI; HKNMQ (SEQ ID NO: 46), de man preferente KNM; f) HKPVQ (SEQ ID NO: 47), de manera preferente KPV; con SEQ ID NO: 10; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada| de acuerdo con SEQ ID NO: 11; (iii) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 12; (iv) una secuencia CDR2 de cadena ligera1 de acuerdo con SEQ ID NO: 13; (v) una secuencia CDRl de cadena pesada | de acuerdo con SEQ ID NO: 14; (vi) una secuencia CDRl de cadena pesada| de acuerdo con SEQ ID NO: 15; (vii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 16; o (viii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 17; en donde la secuencia CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 2} adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDRl de cadeina pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR1 de cadpna ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios apainoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 B adiciones de aminoácidos. 11. El anticuerpo o fragmento del mismo conformidad con cualquiera de la reivindicjación caracterizado porque además comprende: (i) una secuencia CDR3 de cadena ligejra como se expone en SEQ ID NO: 8; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 9; en donde la secuencia CDR3 de cadéna ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o adiciones de aminoácidos. 12. Un anticuerpo o un fragmento de| enlace a antígeno del mismo caracterizado porque comprende: (i) una secuencia CDR3 de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 8; o (ii) una secuencia CDR3 de cadena ligeía como se expone en SEQ ID NO: 9; en donde la secuencia CDR3 de cad|ena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de a|minoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 , o |3 adiciones de aminoácidos . 13. El anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 12, caracteri ado porque además comprende por lo menos una de las siguientes secuencias : (i) una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 10; (ii) una secuencia CDR2 de cadena pesada] de acuerdo con SEQ ID NO: 11; (iii) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 12; (iv) una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 13; (V) una secuencia CDRl de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 14; (vi) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15; (vii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 16; o (viii) una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 17; en donde la secuencia CDR2 de cadena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de Aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o| 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de ¡aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o| 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR1 de cajdena pesada comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios aminoácidos , 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2 3 adiciones de aminoácidos; en donde la secuencia CDR1 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de ¡aminoácidos , 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o| 3 adiciones de aminoácidos. 14. Un anticuerpo o fragmento de enlaq |e a antigeno del mismo caracterizado porque comprende un conjunto de secuencias CDR3 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada, y CDR1 de cadena pesada seleccionadas de uno de los siguientes conjuntos : i) una secuencia CDR3 de cadena pesadk de acuerdo con SEQ ID NO: 6, una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 10, y una secuencia CDí de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 14; (ii) una secuencia CDR3 de cadena pesada! de acuerdo con SEQ ID NO: 6, una secuencia CDR2 de cadenaf pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 10, y una secuencia CDRl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15; (iii) una secuencia CDR3 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 6, una secuencia CDR2 de caldeena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 11, y una secuencia CDR1 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 14; (iv) una secuencia CDR3 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 6, una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 11, y una secuencia CDR1 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15; una secuencia CDR3 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 7, una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 10, y una secuencia CDR]| de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 14; (vi) una secuencia CDR3 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 7, una secuencia CDR2 de cadena pesada de acuerdo con SEQ ED NO: 10, y una secuencia CDR1 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 15; (vii) una secuencia CDR3. de cadena pesada de acuerdo con SEQ ID NO: 7, una secuencia CDR2 de caldena pesada de acuerdo con SEQ ED NO: 11, y una secuencia CDRL de cadena acuerdo con SEQ ID NO: 12, y una secuencia CDFl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 16; (ii) una secuencia CDR3 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 8, una secuencia CDR2 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ED NO: 12, y una secuencia CDíjtl de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 17; (iii) una secuencia CDR3 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 9, una secuencia CDR2 de c adena ligera de acuerdo con SEQ ED NO: 12, y una secuencia CDR1 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 16; o (iv) una secuencia CDR3 de cadena liger de acuerdo con SEQ ID NO: 9, una secuencia CDR2 de cader ligera de acuerdo con SEQ ED NO: 12, y una secuencia CDíjí.1 de cadena ligera de acuerdo con SEQ ID NO: 17; en donde cada secuencia CDR3 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de ¡aminoácidos, 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, oj 3 adiciones de aminoácidos; en donde cada secuencia CDR2 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de aminoácidos , 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o| 3 adiciones de aminoácidos; y en donde cada secuencia CDR1 de cadena ligera comprende opcionalmente 1, 2 o 3 intercambios de ¡aminoácidos , 1, 2, o 3 supresiones de aminoácidos y/o 1, 2, o 3 adiciones de aminoácidos. 16. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: (a) la porción de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o (b) el anticuerpo o fragmento de enlacé a antigeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reiv ndicaciones 10 a 15 y que comprende además uno o más portadores, diluyentes, excipientes, rellenadores , a utinantes , lubricantes, deslizantes, desintegrantes, abso bentes y/o conservadores farmacéuticamente aceptables. 17. El uso de (a) una porción de enlace de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o (b) un anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y o tratamiento de varias enfermedades que implican inflamación aguda tales como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) , sepsis, sepsis grave, choque séptico, lesiones relacionadas con isquemia/reperfjusión tales como enfermedad cardíaca isquémica, lesión aguda del pulmón, neumonía, rechazo de injerto agudo y crónico en acientes de trasplante, reacciones de injerto contra el hosjpedero, así como enfermedades que implican tipos crónicos de inflamación tal como enfermedades glomerulares renales tal como glomerulonefritis y otras entidades de insuficieneia renal, artritis reumatoide y enfermedades autoinmunitari s similares tales como enfermedad de Bechterew enfermedadfes de t lupus, enfermedad inflamatoria del intestino, er fermedad Crohn, crecimiento tumoral o cáncer de órganos sól idos .
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