CN117693530A - 针对muc1-c/胞外结构域（muc1-c/ecd）的抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及与MUC1‑C/胞外结构域(MUC1‑C/ECD)结合的抗体以及使用这样的抗体来治疗表达MUC1抗原的癌症的方法。

Description

针对MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)的抗体
本申请要求2020年7月16日提交的美国临时申请序列号63/052,599的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入。
包含在39KB(在Microsoft 中测量的)的并且于2021年7月6日创建的名为GENUP0047WO_ST25.txt的文件中的序列表通过电子提交随同提交，并且通过引用并入本文。
背景
1.技术领域
本公开内容总体上涉及医学、肿瘤学和免疫治疗学领域。更特别地，其涉及用于检测和治疗MUC1阳性癌症的免疫试剂的开发。
2.背景技术
黏蛋白普遍是主要由上皮细胞表达的O-糖基化的蛋白质。分泌的和膜结合的黏蛋白形成物理屏障，该物理屏障保护上皮细胞的顶端边缘免受由毒素、微生物和在与外部环境的接触面处发生的其他形式的应激所诱导的损伤。跨膜黏蛋白1(mucin 1，MUC1)也可以通过其胞质结构域向细胞内部发出信号。除了存在海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白(enterokinase-agrin，SEA)结构域之外，MUC1与其他膜结合黏蛋白没有序列相似性(Duraisamy et al.,2006)。在这方面，MUC1被翻译为单一多肽，并随后在SEA结构域处进行自切割(Macao et al.,2006)。
本发明人和其他人已经广泛研究了MUC1在癌症中的作用。如上所述，人MUC1是翻译为单一多肽并在内质网中切割成N-和C-端亚基(MUC1-N和MUC1-C)的异二聚体糖蛋白(Ligtenberg et al.,1992；Macao et al.,2006；Levitin et al.,2005)。如在大多数人癌中存在的MUC1的异常过表达(Kufe et al.,1984)赋予了锚定非依赖性生长和致瘤性(Liet al.,2003a；Huang et al.,2003；Schroeder et al.,2004；Huang et al.,2005)。其他研究已经证明，MUC1的过表达赋予对氧化应激和基因毒性抗癌药剂诱导的凋亡的抗性(Yinand Kufe,2003；Ren et al.,2004；Raina et al.,2004；Yin et al.,2004；Raina et al.,2006；Yin et al.,2007)。
系链和分泌黏蛋白家族在提供上皮细胞表面的保护屏障中发挥作用。随着上皮层的损伤，相邻细胞之间的紧密连接被破坏，并且当细胞启动调蛋白诱导的修复程序时极性丧失(Vermeer et al.,2003)。MUC1-N从细胞表面脱落(Abe and Kufe,1989)，留下MUC1-C用作环境压力信号的传递者进入细胞内部。在该方面，MUC1-C与ErbB受体家族的成员形成细胞表面复合物，并且MUC1-C在对调蛋白刺激的响应中靶向细胞核(Li et al.,2001；Liet al.,2003c)。MUC1-C还通过MUC1胞质结构域(cytoplasmic domain，CD)和连环蛋白家族成员之间的直接相互作用在整合ErbB受体和Wnt信号传导通路中发挥作用(Huang et al.,2005；Li et al.,2003c；Yamamoto et al.,1997；Li et al.,1998；Li et al.,2001；Liand Kufe,2001)。其他研究已表明，MUC1-CD被糖原合酶激酶3β、c-Src、蛋白激酶Cδ和c-Abl磷酸化(Raina et al.,2006；Li et al.,1998；Li et al.,2001；Ren et al.,2002)。抑制任何前述相互作用代表了MUC1相关癌症的潜在治疗性干预点。
发明内容
因此，根据本公开内容，提供了与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的抗体或片段，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:3、4和5或者6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区，并且所述可变轻链包含含有SEQ ID NO:9、10和11或者12、13和14的CDR1、CDR2和CDR3区。该抗体或其片段可分别包含与SEQ ID NO:15、17或19具有80％或更高同源性的可变重链，以及与SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有80％或更高同源性的可变轻链，或者可分别包含由与SEQ ID NO:21、23或27具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链，以及由与SEQ ID NO:22、24或28/29/30具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链。
抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。抗体片段可以是Fab片段。抗体或其片段可以是对MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体或其片段。抗体可以是鼠抗体、IgG、人源化抗体或人源化IgG抗体。抗体或其片段还可包含标记。该标记可以是肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。抗体或其片段还可包含与其连接的抗肿瘤药物，例如其中抗肿瘤药物通过光不稳定的接头与所述抗体或其片段连接，或者所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体或其片段连接。抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
重链和轻链可分别与SEQ ID NO:15、17或19以及SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者可分别由与SEQ ID NO:21、23或27以及SEQ IDNO:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。抗体或其片段可以与纳米粒或脂质体缀合。抗体或其片段可诱导细胞死亡，包含抗体依赖性细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
还提供了治疗癌症的方法，其包括使对象中的MUC1阳性癌细胞与这样的抗体或其片段接触：所述抗体或其片段与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:3、4和5或者6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区，并且所述可变轻链包含含有SEQ ID NO:9、10和11或者12、13和14的CDR1、CDR2和CDR3区。该抗体或其片段可分别包含与SEQ ID NO:15、17或19具有80％或更高同源性的可变重链，以及与SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有80％或更高同源性的可变轻链，或者可分别包含由与SEQ ID NO:21、23或27具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链，以及由与SEQ ID NO:22、24或28/29/30具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链。
该抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。该抗体片段可以是Fab片段。抗体或其片段可以是对MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体或其片段。抗体可以是鼠抗体、IgG、人源化抗体或人源化IgG抗体。抗体或其片段还可包含标记。该标记可以是肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。抗体或其片段还可包含与其连接的抗肿瘤药物，例如其中抗肿瘤药物通过光不稳定的接头与所述抗体或其片段连接，或者所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体或其片段连接。抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
重链和轻链可以分别与SEQ ID NO:15、17或19以及SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者可以分别由与SEQ ID NO:21、23或27以及SEQID NO:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。抗体或其片段可以与纳米粒或脂质体缀合。抗体或其片段可诱导细胞死亡，包含抗体依赖性细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
MUC1阳性癌细胞可以是实体瘤细胞，例如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞(例如肝细胞癌)、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食管癌细胞。MUC1阳性癌细胞可以是白血病或骨髓瘤，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。MUC1阳性癌细胞可以是转移性癌细胞、多重药物抗性癌细胞或复发性癌细胞。
该方法还可包括使所述MUC1阳性癌细胞与第二抗癌药剂或治疗(例如化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗)接触。第二抗癌药剂或治疗可抑制胞内MUC1功能。第二抗癌药剂或治疗可以与所述第一药剂同时给予，或者在所述第一药剂之前和/或之后给予。
在另一个实施方案中，提供了治疗涉及人乳头瘤病毒的癌症(例如宫颈癌)或涉及幽门螺杆菌(H.pylori)的癌症(例如胃癌)的方法，该方法包括向对象施用如本文所限定的与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的抗体或其片段。
在另一个实施方案中，提供了治疗炎性病症的方法，其包括向对象施用如本文所限定的与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的抗体或其片段。这样的炎性病症包括急性和慢性炎性病症，例如结肠炎、IBD和IPF。炎性病症还包括细菌、病毒、真菌和寄生虫感染，例如SARS-Cov-2、人乳头瘤病毒和幽门螺杆菌。
还提供了在对象中诊断MUC1阳性癌症的方法，其包括使对象或来自对象的含有细胞的样品与抗体或其片段接触，所述抗体或其片段如本文所限定的与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合。MUC1阳性癌症可以是实体瘤癌症，例如肺癌、脑癌、头颈癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌或食管癌。MUC1阳性癌症可以是白血病或骨髓瘤，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。MUC-1阳性癌症可以是肝细胞癌或由人乳头瘤病毒引起的宫颈癌。
该方法还可包括向所述对象施用抗癌药剂或治疗，例如化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗，包括如本文所限定的与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的抗体或其片段。MUC1阳性癌症可以是转移性癌症、多重药物抗性癌症或复发性癌症。含有细胞的样品可以是固体组织样品(例如活检物)或流体样品，例如尿、精液、痰、唾液、乳头抽吸物或血液。
另一些实施方案包括(a)药物制剂，其包含如本文所限定的与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的抗体或其片段，以及可药用载体、缓冲剂或稀释剂。药物制剂可进一步限定为疫苗制剂，任选地还包含佐剂、或免疫组织化学试剂或放射成像剂。该制剂还可包含另外的治疗剂。
在另一个实施方案中，提供了融合蛋白，其包含(i)与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C/胞外结构域(extracellular domain，ECD)选择性地结合的第一单链抗体，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:3、4和5或者6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区，并且所述可变轻链包含含有SEQ ID NO:9、10和11或者12、13和14的CDR1、CDR2和CDR3区；以及(ii)与T或B细胞结合的第二单链抗体。第二单链抗体可与CD3、CD16、PD1、PD-L1、CD33、Her-2、EGFR、CTLA-4、OX40、FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16A)、FcαRI(CD89)、CD163、CD68、CD89 Mab结合。融合蛋白还可包含标记或治疗性部分。重链和轻链可分别与SEQ ID NO:15、17或19以及SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者分别由与SEQ ID NO:21、23或27以及SEQ ID NO:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。
在又一个实施方案中，提供了嵌合抗原受体，其包含(i)胞外域，该胞外域包含与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的单链抗体可变区，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:3、4和5或者6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区，并且所述可变轻链包含含有SEQ ID NO:9、10和11或者12、13和14的CDR1、CDR2和CDR3区，其中在所述单链抗体可变区的C端处附接有柔性铰链；(ii)跨膜结构域；以及(iii)内结构域，其中当所述单链抗体可变区与MUC1接合时，所述内结构域包含信号转导功能。跨膜和内结构域可以来源于同一分子。内结构域可包含CD3-ζ结构域或高亲和力FcεRI。柔性铰链可以来自CD8α或1g。重链和轻链可分别与SEQ ID NO:15、17或19以及SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性，或者可分别与SEQID NO:21、23或27以及SEQ ID NO:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％的同源性。
另外，提供了表达如上所述嵌合抗原受体的细胞。跨膜和内结构域可以来源于同一分子。内结构域可包含CD3-ζ结构域或高亲和力FcεRI。柔性铰链可以来自CD8α或1g。
预期本文所述的任何方法或组合物可以相对于本文所述的任何其他方法或组合物来实施。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词的使用可意指“一个/种”，但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。“约”一词意指所述数字的正负5％。
本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的具体实施方案，但仅通过举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1A至1D.抗体序列。(图1A)GO-701m序列。(图1B)GO-702m序列。(图1C)GO-702h氨基酸序列。(图1D)GO-702h核酸序列。
图2.嵌合抗体和人源化抗体的亲和力测量。实时响应用曲线示出。Biacore实验数据与1:1相互作用模型的拟合以黑色示出。用于上图的抗原浓度分别为3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM。用于下图的抗原浓度分别为1.875nM、3.75nM、7.5nM、15nM、30nM、60nM。
图3.非还原条件下所选抗体的SDS-PAGE结果。还原条件：泳道M(标记)、第1泳道(VH1+VL3)、第3泳道(VH1+VL4)、第5泳道(VH2+VL3)、第7泳道(VH5+VL1)、第9泳道(VH5+VL2)、第11泳道(VH5+VL3)、第13泳道(VH5+VH4)。非还原条件：第2泳道(VH1+VL3)、第4泳道(VH1+VL4)、第6泳道(VH2+VL3)、第8泳道(VH5+VL1)、第10泳道(VH5+VL2)、第12泳道(VH5+VL3)、第14泳道(VH5+VH4)、第15泳道(小鼠IgG)。
图4.嵌合IgG和人源化IgG的亲和力测量。实时响应用彩色曲线示出。Biacore实验数据与1:1相互作用模型的拟合以黑色示出。抗原浓度分别为1.875nM、3.75nM、7.5nM、15nM、30nM、60nM。
图5.图5.嵌合IgG和人源化IgG通过流式细胞术的亲和力比较。抗体与HCT116/MUC1细胞一起孵育，并随后与第二抗体一起孵育。通过流式细胞术来分析结合。
图6.mAb与HCT116/MUC1的浓度依赖性结合。将野生型和非岩藻糖基化(afucosylated，AF)形式的GO-702m和含有来自人IgG1的Fc的GO-702m/hFc嵌合体二者与不同浓度(如上所示)的细胞一起孵育，并随后与作为第二试剂的抗hIgG-生物素+链霉亲和素-PE或抗小鼠IgGk-FITC一起孵育。结合效率以浓度依赖方式表示为平均荧光强度(meanfluorescence Intensity，MFI)。
图7.未染色的细胞用作图6的阴性对照。
图8A至8B.GO-702m靶向α-4螺旋。(图8A)58-aa人MUC1-C(SEQ ID NO:2)、食蟹猴(SEQ ID NO:38)和小鼠(SEQ ID NO:39)Muc1-C胞外结构域的aa序列。α3和α4螺旋突出显示。如p62/p58异二聚体的NMR谱所示，mAb GO-702m表位定位于α4螺旋(Macao et al.,2006)。(图8B)所示浓度的mAb GO-702m与HCT 116/载体或HCT116/MUC1细胞一起孵育。通过流式细胞术来测定平均荧光强度(MFI)。通过ELISA的mAb GO-702m(每个柱组中的中间条)与WT p58/p62异二聚体和α-4螺旋的S33A、R34G、Y35A、N36A突变蛋白或α-3螺旋的D19E/V20A/T22A突变蛋白的结合。mAb CD1(每个柱组中的右侧条)用作对照。MAb 3D1(每个柱组中的左侧条)用作α-3阳性结合的对照。结果表示为与用WT蛋白(>3.0OD单位)获得的结果相比的对照结合百分比。
图9.GO-702mFc嵌合mAb与HCT116/MUC1的结合。将野生型嵌合体(GO-702m/hFc)和非岩藻糖基化形式的该嵌合体(含有来自人IgG1的Fc)与细胞一起孵育，随后与作为第二试剂的抗hIgG-生物素+链霉亲和素-PE或抗小鼠IgGk-FITC一起孵育。结合效率表示为平均荧光强度(MFI)。
图10A至10B.GO-702h与小鼠Fc受体(FcRIV)的浓度依赖性结合。(图10A)将野生型和非岩藻糖基化(AF)形式的GO-702h与不同浓度(如上所示)的细胞一起孵育，随后与作为第二试剂的抗人IgG-FITC一起孵育。结合效率以浓度依赖方式表示为平均荧光强度(MFI)。(图10B)将野生型(菱形)和非岩藻糖基化(AF)形式(方形)的GO-702h与不同浓度的细胞一起孵育，随后与作为第二试剂的抗人IgG-FITC一起孵育。结合效率以浓度依赖方式表示为平均荧光强度(MFI)。右侧；结合的图示。
图11.用MAb(GO-702m-AF)处理的MUC1.Tg小鼠的血液化学分析。在携带MC-38/MUC1肿瘤的MUC1.Tg小鼠中i.p注射5mg/kg MAb非岩藻糖基化GO-702m。进行全血液化学以评价非岩藻糖基化的GO-702m抗体的任何毒性。
图12.用MAb(GO-702m-AF)处理的MUCT1-Tg小鼠的血液学分析。在携带MC-38/MUC1肿瘤的MUC1.Tg小鼠中i.p注射5mg/kg MAb非岩藻糖基化GO-702m。进行完整的血液学分析以评价非岩藻糖基化GO-702m抗体的任何毒性。
图13.GO-702m、GO-702h和GO-701m抗体与HCT116-MUC1细胞的结合。通过流式细胞术分析与用人MUC1过表达的HCT116细胞结合的抗体。将5μg指定的抗MUC1抗体或同种型对照与细胞在冰上一起孵育60分钟。FITC缀合的山羊F(ab′)2抗小鼠或抗人免疫球蛋白(取决于第一抗体)用作第二试剂。使用FACS Canto II分析与细胞表面结合的抗体。
图14.野生型和非岩藻糖基化GO-702h与HCT116/MUC1细胞的结合。通过流式细胞术分析与用人MUC1过表达的HCT116细胞结合的抗体。将GO-702h野生型、非岩藻糖基化GO-702h或作为阴性对照的CD1抗MUC1抗体与细胞在冰上一起孵育60分钟。FITC缀合的山羊F(ab′)2抗人免疫球蛋白用作第二试剂。使用FACS Canto II分析与细胞表面结合的抗体。
图15.具有HCT116+MUC-1的GO-702m的流式细胞术。通过流式细胞术分析与不含MUC1的HCT116细胞(黑色)和用人MUC1过表达的HCT116细胞(灰色)结合的抗体。GO-702m抗MUC1抗体与细胞在冰上一起孵育60分钟。FITC缀合的山羊F(ab′)2抗小鼠免疫球蛋白用作第二试剂。使用FACS Canto II分析与细胞表面结合的抗体。
图16.ZR-75-1细胞中GO-702m的流式细胞术。与ZR-75-1乳腺癌细胞系结合的抗体。GO-702m抗MUC1抗体(灰色)或作为阴性对照的MUC1 CD1抗体(黑色)与细胞在冰上一起孵育60分钟。FITC缀合的山羊F(ab′)2抗小鼠免疫球蛋白用作第二试剂。使用FACS CantoII分析与细胞表面结合的抗体。
图17.MCF-7/CshRNA相对于MCF-7/MUC1shRNA中GO-702m的流式细胞术。通过流式细胞术分析与MCF-7/MUC1shRNA(黑色)或MCF-7/CshRNA(灰色)细胞结合的抗体。GO-702m抗MUC1抗体与细胞在冰上一起孵育60分钟。FITC缀合的山羊F(ab′)2抗小鼠免疫球蛋白用作第二试剂。使用FACS Canto II分析与细胞表面结合的抗体。
图18.H-1975NSCLC细胞中GO-702m的流式细胞术。与H-1975NSCLC细胞系结合的抗体。GO-702m抗MUC1抗体(灰色)或作为阴性对照的IgG(黑色)与细胞在冰上一起孵育60分钟。FITC缀合的山羊F(ab′)2抗小鼠免疫球蛋白用作第二试剂。使用FACS Canto II分析与细胞表面结合的抗体。
图19.MDA-MB-468CshRNA/MUC1shRNA中GO-702m的流式细胞术。通过流式细胞术分析与MDA-MB-468/MUCshRNA(右侧灰色峰)或MDA-MB-468/CshRNA(左侧所述灰色峰)细胞结合的抗体。IgG用作阴性对照(左侧黑色峰)。GO-702m抗MUC1抗体与细胞在冰上一起孵育60分钟。FITC缀合的山羊F(ab′)2抗小鼠免疫球蛋白用作第二试剂。使用FACS Canto II分析与细胞表面结合的抗体。
图20.GO-702m(圆圈)和GO-702m-AF(HCT-MUC1；方形)的ADCC活性。将96孔板中的HCT116/MUC1细胞与作为效应细胞的Jurkat细胞(其中与FcRIV结合的抗体与NFAT介导的萤光素酶表达连接)以20:1的E:T比例在所示抗体(起始于1μg/ml，以3倍系列稀释度)存在下一起孵育6小时。萤光素酶活性使用萤光素作为底物来测量，并使用Microsoft Excel对浓度作图。
图21.BT549上GO-702m-IgG2a的ADCC活性。将96孔板中的BT549细胞与作为效应细胞的Jurkat细胞(其中与FcRIV结合的抗体与NFAT介导的萤光素酶表达连接)以20:1的E:T比例在所示抗体(起始于1μg/ml，以3倍系列稀释度)存在下一起孵育6小时。萤光素酶活性使用萤光素作为底物来测量，并使用Microsoft Excel对浓度作图。方形＝非岩藻糖基化GO-702m抗体；三角形–wt GO-702m抗体。
图22.非岩藻糖基化GO-702m在患有MC-38/MUC1肿瘤的MUC1.Tg小鼠中的效力。将MC-38过表达的MUC1细胞注射到MUC1.Tg小鼠中。在10至12天之后，将小鼠随机分成2个不同的组。第1组：载剂对照；第2组：非岩藻糖基化GO-702m抗体(5mg/kg，每周一次×3周，IP)。每隔一天进行肿瘤测量。菱形：载剂对照组(曲线显示为该组的平均肿瘤)和圆形：非岩藻糖基化的GO-702m(曲线显示为单个小鼠)。体重没有明显变化。显示长至84天的效力。
图23.hGO702-AF抗体与hGO-702相比在HCT116/MUC1结肠癌细胞中的ADCC体外研究。将96孔板中的HCT116/MUC1细胞与作为效应细胞的Jurkat细胞(其中与FcRIV结合的抗体与NFAT介导的萤光素酶表达相连)以20:1的E:T比例在所示抗体(起始于1μg/ml，以3倍系列稀释度)存在下一起孵育6小时。使用萤光素作为底物测量萤光素酶活性，并对浓度作图。
图24.hGO702-AF抗体与hGO-702相比的ADCC体内研究。在六-八周龄的C57BL/6小鼠的胁腹皮下注射在100μl DMEM培养基中的5×105MC38/MUC1，其为表达人MUC1的小鼠结肠癌细胞(MC38/MUC1)。将小鼠随机分成两个处理组(hGO-702-WT组6只小鼠，以及hGO-702非岩藻糖基化(AF)组7只小鼠)。当平均肿瘤体积达到70至130mm3时，用5mg/kg的非岩藻糖基化人源化GO-702(hGO-702-AF)或野生型人源化GO-702(hGO-702-WT)IP处理小鼠，每周一次持续3周。每隔一天记录肿瘤测量值和体重。如通过以下公式：(宽度)2×长度/2所计算的，当肿瘤达到>2,000mm3时，处死小鼠。结果表示为针对处理天数的肿瘤体积(平均值+SEM)。
具体实施方式
本发明人已经生成了针对MUC1-C蛋白外部结构域的58个氨基酸非脱落部分的抗体。这些抗体已被证明能与MUC1-C的这一部分选择性地结合，并因此为在N端区被切割后阻断MUC1的活性提供了机会。即使N端MUC1结构域切割后，该抗体也可用于将治疗有效载荷递送至表达MUC1的癌细胞。下文更详细地描述了本公开内容的这些和其他方面。
I.MUC1
A.结构
MUC1是在正常分泌上皮细胞的顶端边缘表达的黏蛋白型糖蛋白，(Kufe et al.,1984)。MUC1在合成为单一多肽并在内质网中将前体切割成两个亚基后形成异二聚体(Ligtenberg et al.,1992)。这种切割可以是由自动催化过程介导的(Levitan et al.,2005)。>250kDa的MUC1 N端(MUC1 N-ter，MUC1-N)亚基包含可变数量的20个氨基酸串联重复，这些重复是不完美的，具有高度保守的变异并被O-连接的聚糖修饰(Gendler et al.,1988；Siddiqui et al.,1988)。MUC1-N通过与约23kDa的C-端亚基(MUC1 C-ter，MUC1-C)二聚化而被系链至细胞表面，其包括72个氨基酸的胞质结构域(MUC1-C/CD)、28个氨基酸的跨膜结构域(MUC1-C/TMD)、58个氨基酸的胞外结构域(MUC1-C/ECD)，随后是62个氨基酸的区域，二聚化在一起以形成SEA结构域(Merlo et al.,1989)。正是MUC1-C/ECD的58个氨基酸部分(斜体)在与本公开内容抗体的结合中起主要作用。人MUC1-C序列如下所示：
粗体序列表示CD，带下划线部分是寡聚体抑制肽。随着正常上皮向癌的转化，MUC1在胞质溶胶中和整个细胞膜上异常过表达(Kufe et al.,1984；Perey et al.,1992)。细胞膜相关MUC1通过网格蛋白介导的内吞作用靶向内体(Kinlough et al.,2004)。另外，MUC1-C而非MUC1-N靶向细胞核(Baldus et al.,2004；Huang et al.,2003；Li et al.,2003a；Liet al.,2003b；Li et al.,2003c；Wei et al.,2005；Wen et al.,2003)和线粒体(Ren etal.,2004)。
B.功能
MUC1-C与ErbB受体家族的成员(Li et al.,2001b；Li et al.,2003c；Schroederet al.,2001)以及与Wnt效应子β-连环蛋白(Yamamoto et al.,1997)相互作用。表皮生长因子受体和c-Src磷酸化Y-46上的MUC1胞质结构域(MUC1-CD)，并由此提高MUC1和β-连环蛋白的结合(Li et al.,2001a；Li et al.,2001b)。MUC1和β-连环蛋白的结合还受糖原合酶激酶3β和蛋白激酶Cδ的调节(Li et al.,1998；Ren et al.,2002)。MUC1在细胞核中与β-连环蛋白共定位(Baldus et al.,2004；Li et al.,2003a；Li et al.,2003c；Wen et al.,2003)并共激活Wnt靶基因的转录(Huang et al.,2003)。其他研究已表明，MUC1还直接与p53结合并调节p53靶基因的转录(Wei et al.,2005)。值得注意的是，MUC1-C的过表达足以诱导锚定非依赖性生长和致瘤性(Huang et al.,2003；Li et al.,2003b；Ren et al.,2002；Schroeder et al.,2004)。
II.产生单克隆抗体
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体的群体获得的抗体，即除可少量存在的可能天然存在突变之外，包含该群体的各抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点是高度特异性的。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于其可被合成而不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆”不应被解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本公开内容中的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可在对抗原特异性B细胞、响应于感染或免疫接种的抗原特异性浆母细胞进行单细胞分选，或大量经分选抗原特异性集合中从单个细胞中捕获连接的重链和轻链之后使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。
“分离的抗体”是已从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在一些具体实施方案中，抗体被纯化至：(1)通过劳里法(Lowrymethod)确定的抗体的按重量计大于95％，并且最特别地按重量计大于99％；(2)通过使用旋转杯序列分析仪(spinning cup sequenator)足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或者(3)使用考马斯蓝或银染色剂在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE的均质。由于抗体天然环境的至少一种组分将不存在，分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，通常来说，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
基础四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基础异四聚体单元以及被称为J链的另外的多肽组成，并且因此包含10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个基础4链单元以及J链的多价聚集体。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或更多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有可变区(VH)，随后是对于每个α和γ链的三个恒定结构域(CH)，以及对于μ和同种型是四个CH结构域。每条L链在N端具有可变区(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和特性，参见例如Basic and ClinicalImmunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域(CL)的氨基酸序列分配为两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。根据其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别或同种型。存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别定名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对较小差异，其γ和α类别进一步分为亚类，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变”是指V结构域的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀地分布于可变区的110个氨基酸跨度中。相反，V区由15至30个氨基酸的称为框架区(frameworkregion，FR)的相对不变的段(stretch)组成，所述相对不变的段被每个9至12个氨基酸长的称为“高变区”的极度可变的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变区各自包含通过被形成环连接的三个高变区连接的四个FR，所述四个FR主要采用β-片层构型，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,SequencesofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应物功能，例如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(antibody dependentcellular cytotoxicity，ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependentcellular phagocytosis，ADCP)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬作用(ntibody-dependentneutrophil phagocytosis，ADNP)和抗体依赖性补体沉积(antibody-dependentcomplement deposition，ADCD)。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的约第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基附近，以及VH中的约第31至35位(H1)、第50至65位(H2)和第95至102位(H3)残基附近，当根据Kabat编号系统编号时；Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的第24至34位(L1)、第50至56位(L2)和第89至97位(L3)残基，以及VH中的第26至32位(H1)、第52至56位(H2)和第95至101位(H3)残基，当根据Chothia编号系统编号时；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的那些残基(例如，VL中的第27至38位(L1)、第56至65位(L2)和第105至120位(L3)残基，以及VH中的第27至38位(H1)、第56至65位(H2)和第105至120位(H3)残基，当根据IMGT编号系统编号时；Lefranc,M.P.et al.Nucl.Acids Res.27:209-212(1999),Ruiz,M.et al.Nucl.AcidsRes.28:219-221(2000))。任选地，抗体在以下点中的一个或更多个处具有对称插入：VL中的28、36(L1)、63、74至75(L2)和123(L3)，以及VsubH中的28、36(H1)、63、74至75(H2)和123(H3)，当根据AHo编号时；Honneger,A.and Plunkthun,A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001)。
“种系核酸残基”意指天然存在于编码恒定区或可变区的种系基因中的核酸残基。“种系基因”是在生殖细胞(即注定要变成卵子或精子的细胞)中发现的DNA。“种系突变”是指在单细胞阶段在生殖细胞或受精卵中发生的特定DNA的可遗传变化，并且当传递给后代时，这样的突变被并入身体的每个细胞中。种系突变与在单个体细胞中获得的体细胞突变形成对比。在一些情况下，编码可变区的种系DNA序列中的核苷酸突变(即体细胞突变)并被不同的核苷酸替换。
A.一般方法
针对MUC1-C/ECD的抗体可通过本领域公知的标准方法来产生(参见，例如，Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；美国专利4,196,265)。用于产生单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的方法相同的路线开始。这两种方法的第一步均是对合适的宿主进行免疫接种或鉴定由于之前的自然感染而免疫接种的对象。如本领域中公知的，用于免疫接种的给定组合物的免疫原性可不同。因此，通常有必要加强宿主的免疫系统，如可通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。一些示例性且优选的载体是钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。用于使多肽与载体蛋白缀合的方式是本领域中公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺(carbodiimyde)和双-重氮联苯胺(bis-biazotized benzidine)。同样如本领域中公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含经杀伤结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特异性免疫应答刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而不同。可使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可通过在免疫接种之后的不同时间点对经免疫接种的动物采血来监测多克隆抗体的产生。还可给予第二、加强注射。重复加强免疫和滴定过程直至获得合适的效价。当获得期望的免疫原性水平时，可对经免疫接种的动物采血并分离和储存血清，和/或可将动物用于产生MAb。
在免疫接种之后，选择具有产生抗体之潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于MAb产生方案。这些细胞可从经活检脾或淋巴结或者从循环血液中获得。然后使来自经免疫接种动物之产生抗体的B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(其通常为与经免疫接种动物相同物种的细胞，或者人或人/小鼠嵌合细胞)的细胞融合。适用于产生杂交瘤的融合操作的骨髓瘤细胞系优选地不产生抗体、具有高融合效率和酶缺陷，这然后使得其不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。
如本领域技术人员已知的，可使用多种骨髓瘤细胞中的任一种(Goding,第65至66页,1986；Campbell,第75至83页,1984)。例如，在经免疫接种的动物是小鼠的情况下，可使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO,NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；以及U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6全部均可与用于与人细胞融合结合。一种特定的鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，其可容易地通过请求细胞系储库号GM3573从NIGMS人遗传突变细胞储库(Human Genetic Mutant CellRepository)获得。另一种可使用的小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非产生细胞系。最近，已经描述了用于人B细胞的其他融合配偶体系，包括KR12(ATCCCRL-8658；K6H6/B5(ATCC CRL-1823SHM-D33(ATCC CRL-1668)和HMMA2.5(Posner et al.,1987)。本公开内容中的抗体使用SP2/0/mIL-6细胞系(SP2/0系的分泌IL-6的衍生物)产生。
用于产生抗体产生脾细胞或抗体产生淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括：在存在促进细胞膜融合的一种或更多种试剂(化学的或电学的)的情况下使体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，但是该比例可分别为约20:1至约1:1而不等。Kohler和Milstein(1975；1976)已描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，并且Gefter etal.,(1977)已描述了使用聚乙二醇(PEG)例如37％(v/v)PEG的融合方法。使用电诱导融合方法也是合适的(Goding,第71至74页,1986)。
融合操作通常以较低频率(约1×10-6至1×10-8)产生活的杂交体。然而，这并不造成问题，因为通过在选择培养基中培养，活的融合杂合体与亲本未融合细胞(特别是在正常情况下将持续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，向培养基中补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，向培养基中补充次黄嘌呤。如果B细胞来源是EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)转化的人B细胞系，则添加哇巴因(ouabain)以清除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。
优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT))中有缺陷，因此其不能存活。B细胞可进行该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约两周内死亡。因此，只有可在选择培养基中存活的细胞才是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当用于融合的B细胞的来源是EBV转化B细胞系时，此时还将哇巴因用于杂合体的药物选择，因为EBV转化B细胞对药物杀伤易感，而选择所使用的骨髓瘤配偶体对哇巴因具有抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常来说，杂交瘤的选择如下进行：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，随后测试单独的克隆上清液(在约两至三周之后)的期望反应性。测定应灵敏、简单并且迅速，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定等。
然后将选择的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆到单独抗体产生细胞系中，所述克隆然后可无限增殖以提供mAb。细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可将杂交瘤样品注射(通常注射到腹膜腔中)到动物(例如，小鼠)中。任选地，在注射之前将动物用烃，特别是油(例如姥鲛烷(四甲基十五烷))致敏(prime)。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫妥协小鼠(例如SCID小鼠)是最佳的，以防止肿瘤排斥。经注射动物产生分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可取出动物的体液(例如血清或腹水)以提供高浓度的MAb。也可在体外培养单个细胞系，其中mAb自然地分泌到培养基中，从中可容易地获得高浓度的mAb。或者，可在体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。可将细胞系调整为在不含血清的培养基中生长，以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果期望的话，可使用过滤、离心和多种色谱方法(例如FPLC或亲和色谱)对通过任一种方式产生的mAb进行进一步纯化。本公开内容的单克隆抗体的片段可通过以下方法由经纯化的单克隆抗体获得：其包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化，和/或通过经化学还原切割二硫键。或者，本公开内容所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪合成。
还考虑了可使用分子克隆方法来产生单克隆。为此，可从杂交瘤系分离RNA，并通过RT-PCR获得抗体基因，并将其克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，由从细胞系分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并使用病毒抗原通过淘选选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是可在单轮中产生并筛选约104倍多的抗体，并且通过H链和L链组合产生新特异性，其进一步提高了发现合适抗体的机会。
教导产生可用于本公开内容的抗体的其他美国专利(其各自通过引用并入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
B.本公开内容的抗体
根据本公开内容的抗体可在第一种情况下通过其结合特异性(即与抗体结合的表位)来限定。术语“表位”是指抗原上B和/或T细胞对其做出响应的位点。B细胞表位可由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸二者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含具有独特的空间构象的至少3个，并且更通常地至少5或8至10个氨基酸。
在来自p58/p62异二聚体的这种情况下，表位的主要部分存在于MUC1-C/ECD中，特别是：
(SEQ ID NO:2)。通过使用本领域技术人员公知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员可确定这样的抗体是否落入本发明权利要求书的范围内。
修饰辅助谱分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也称为基于抗原结构的抗体谱分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，是根据每种抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合特性的相似性对大量针对相同抗原的单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(参见US 2004/0101920，特别地其通过引用整体并入本文)。每个类别可反映与通过另一类别所代表的表位明显不同或部分重叠的独特表位。该技术使得能够快速过滤遗传上相同的抗体，从而使表征可集中在遗传上独特的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可有助于鉴定产生具有期望特征的mAb的罕见杂交瘤克隆。MAP可用于将本公开内容的抗体分类为结合不同表位的抗体组。
本公开内容包括可与相同表位或表位的一部分结合的抗体。同样，本公开内容还包括与本文中所述的任何具体示例性抗体竞争与靶标或其片段结合的抗体。通过使用本领域中已知的常规方法，可容易地确定抗体是否与参考抗体结合相同的表位，或与其竞争结合。例如，为了确定受试抗体是否与参考结合相同表位，允许参考抗体在饱和条件下与靶标结合。接下来，评估受试抗体与靶分子结合的能力。如果受试抗体能够与与参考抗体饱和结合之后的靶分子结合，则可得出结论，受试抗体与参考抗体结合不同的表位。在另一方面，如果受试抗体不能与与参考抗体饱和结合之后的靶分子结合，则受试抗体可与与由参考抗体结合的表位相同的表位结合。
为了确定抗体是否与参考抗MUC1抗体竞争结合，在两个方向上进行上述结合方法：在第一个方向上，使参考抗体与MUC1抗原在饱和条件下结合，随后评估受试抗体与MUC1分子的结合。在第二个方向上，使受试抗体与MUC1抗原分子在饱和条件下结合，随后评估参考抗体与MUC1分子的结合。如果在两个方向上，仅第一(饱和)抗体能够与MUC1结合，则可得出结论，受试抗体和参考抗体竞争与MUC1的结合。如本领域普通技术人员将理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合相同的表位，但可通过结合重叠或相邻表位而在空间上阻断参考抗体的结合。
如果两种抗体中的一种竞争性地抑制(阻断)另一种与抗原的结合，则两种抗体与相同或重叠的表位结合。即，一种抗体过量1-、5-、10-、20-或100倍会抑制另一种抗体的结合至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测定中测量的(参见，例如，Junghans et al.,Cancer Res.1990 50:1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体结合的基本上所有氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同表位。如果降低或消除一种抗体结合的一些氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠表位。
然后可进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的受试抗体的结合缺乏是否实际上是由于与参考抗体结合相同的表位，或者空间阻断(或其他现象)是否是缺乏观察到的结合的原因。可使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合测定来进行这类实验。使用EM或晶体学进行的结构研究也可证明两种竞争结合的抗体是否识别相同的表位。
在一个实施方案中，抗体是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)抗体同种型。IgG占人中血清免疫球蛋白的大约75％，是循环中存在最丰富的抗体同种型。IgG分子由血浆B细胞合成和分泌。在人中有四种IgG亚类(IgG1、2、3和4)，按照其在血清中的丰度顺序来命名(IgG1是最丰富的)。范围从对Fc受体具有高亲和力至没有亲和力。
IgG是存在于血液和胞外流体中的主要抗体同种型，使其能够控制身体组织的感染。通过结合多种病原体-代表病毒、细菌和真菌-IgG保护身体免受感染。IgG通过以下数种免疫机制做到这一点：IgG介导的病原体结合导致其固定并通过凝集结合在一起；病原体表面的IgG包衣(已知为调理作用)允许其通过吞噬免疫细胞的识别和摄取；IgG激活补体系统的经典途径，即免疫蛋白产生的级联反应，其导致病原体消除；IgG还结合并中和毒素。IgG还在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)和胞内抗体介导的蛋白水解中发挥重要作用，其中IgG与TRIM21(人中与IgG具有最大亲和力的受体)结合，以便将标记的病毒体导向胞质溶胶中的蛋白酶体。IgG还与II型和III型超敏反应有关。IgG抗体是在抗体应答的类别转换和成熟后产生的，并因此主要参与二次免疫应答。IgG作为单体分泌，其尺寸小使其易于灌注组织。IgG是唯一具有受体以促进穿过人胎盘的同种型。与母乳中分泌的IgA一起，通过胎盘吸收的残余IgG在新生儿自身的免疫系统发育之前为其提供了体液免疫。初乳含有高百分比的IgG，尤其是牛初乳。在先前对病原体有免疫力的个体中，IgG在抗原刺激之后约24至48小时出现。
在另一个方面中，抗体可以由其可变序列限定，该可变序列决定其结合特异性。以下提供了一些实例：
表1–抗体CDR序列
此外，抗体序列可以不同于以上提供的序列，任选使用以下更详细讨论的方法。例如，氨基酸序列可在以下方面与上面列出的那些不同：(a)可变区可与轻链的恒定结构域分开，(b)氨基酸可与上面列出的那些不同，同时因此不显著影响残基的化学性质(所谓的保守替换)，(c)氨基酸可与上面列出的那些以给定的百分比变化，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。或者，编码抗体的核酸可(a)与轻链的恒定结构域隔开，(b)在不改变由其编码的残基的同时与上面列出的那些不同，(c)可与上面列出的那些以给定的百分比变化，例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，或者(d)由于在高严格性条件下杂交的能力而与上面列出的那些不同，如通过低盐和/或高温条件所例示的，例如在约50℃至约70℃的温度下由约0.02M至约0.15M NaCl提供。
在进行保守改变氨基酸序列时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常理解的(Kyte andDoolittle,1982)。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其继而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域中还应理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性控制)与该蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已向氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应理解，氨基酸可被替换为具有类似亲水性的另一氨基酸，并且产生在生物学或免疫学上修饰的蛋白质。在这样的变化中，亲水性值在±2之内的氨基酸的替换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，并且在±0.5之内的那些是甚至更特别优选的。
如以上所概括的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。预期多个前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
用于比较的序列的最佳比对可使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR，Inc.，Madison，Wis.)使用默认参数来进行。该程序体现了描述于以下参考文献中的数种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)Amodel of evolutionary changein proteins--Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington D.C.第5卷,增刊3,第345至358页；Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogeny第626至645页Methods in Enzymology第183卷,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.(1989)CABIOS5:151-153；Myers,E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy--the Principles and PracticeofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,Calif.；Wilbur,W.J.andLipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA80:726-730。
或者，用于比较的序列的最佳比对可通过以下来进行：Smith and Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法、通过Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法、通过Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的检索相似性方法、通过这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.)的计算机实施或通过检查。
适合于确定序列同一性和序列相似性的百分比的算法的一个特定实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。BLAST和BLAST 2.0可例如与本文中所述的参数一起使用，以确定本公开内容的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。抗体序列的重排性质和每个基因的可变长度需要多轮BLAST检索以寻找单一抗体序列。而且，不同基因的人工组装是困难且容易出错的。序列分析工具IgBLAST(万维网网址为ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鉴定与种系V、D和J基因的匹配，重排接界的细节，Ig V结构域框架区和互补决定区的描述。IgBLAST可分析核苷酸或蛋白质序列，并且可分批处理序列，并允许同时对种系基因数据库和其他序列数据库进行检索，以使丢失可能的最佳匹配的种系V基因的机会最小。
在一个举例说明性实例中，对于核苷酸序列，可使用参数M(匹配残基对的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积评分。在以下情况下，将停止单词命中在每个方向上的扩展：累积比对评分从其最大实现值下降了量X；累积评分变为零或更低，由于一个或更多个负评分残基比对的累积；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，以及期望(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对，(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝-4，以及对两条链的比较。
对于氨基酸序列，可使用评分矩阵来计算累积评分。在以下情况下，将停止单词命中在每个方向上的扩展：累积比对评分从其最大实现值下降了量X；累积评分变为零或更低，由于一个或更多个负评分残基比对的累积；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。
在一种方法中，通过在至少20个位置的比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中与两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸或多肽序列的一部分可包含20％或更低，通常为5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即空位(gap))。百分比通过以下来计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以参考序列中位置的总数目(即窗大小)，并将结果乘以100，即可得出序列同一性的百分比。
限定抗体的又一种方式是作为下述抗体及其抗原结合片段的任一种的“衍生物”。术语“衍生物”是指与抗原免疫特异性地结合但相对于“亲本”(或野生型)分子包含1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换、添加、缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。这样的氨基酸置换或添加可引入天然存在的(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”涵盖例如如具有改变的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区域的变体，以便形成例如具有表现出增强的或受损的效应物或结合特征的变体Fc区的抗体等。术语“衍生物”另外涵盖非氨基酸修饰，例如可被糖基化(例如，具有改变的甘露糖、2-N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-羟乙酸神经氨酸等含量)，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，被已知的保护/阻断基团衍生化，蛋白水解切割，与细胞配体或其他蛋白质连接等的氨基酸，在一些实施方案中，改变的碳水化合物修饰调节以下中的一项或更多项：抗体增溶、促进抗体的亚细胞运输和分泌、促进抗体组装、构象完整性和抗体介导的效应物功能。在一个具体实施方案中，相对于缺乏碳水化合物修饰的抗体，改变的碳水化合物修饰增强了抗体介导的效应物功能。导致抗体介导的效应物功能改变的碳水化合物修饰是本领域公知的(例如，参见Shields,R.L.et al.(2002),J.Biol.Chem.277(30):26733-26740；DaviesJ.et al.(2001),Biotechnology&Bioengineering 74(4):288-294)。改变碳水化合物含量的方法是本领域技术人员已知的，参见，例如，Wallick,S.C.et al.(1988),J.Exp.Med.168(3):1099-1109；Tao,M.H.et al.(1989),J.Immunol.143(8):2595-2601；Routledge,E.G.et al.(1995),Transplantation 60(8):847-53；Elliott,S.et al.(2003),NatureBiotechnol.21:414-21；Shields,R.L.et al.(2002),J.Biol.Chem.277(30):26733-26740)。
可产生具有经改造序列或糖基化状态的衍生抗体或抗体片段，以赋予在以下中的优选的活性水平：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、抗体依赖性嗜中性粒细胞吞噬(ADNP)或抗体依赖性补体沉积(ADCD)功能，如通过基于珠的或基于细胞的测定或者在动物模型中进行的体内研究所测量的。
衍生抗体或抗体片段可通过使用本领域技术人员已知的技术进行化学修饰来修饰，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、制剂、衣霉素代谢合成等。在一个实施方案中，抗体衍生物将具有与亲本抗体相似或相同的功能。在另一个实施方案中，相对于亲本抗体，抗体衍生物将表现出改变的活性。例如，与亲本抗体相比，衍生抗体(或其片段)可更紧密地与其表位结合或对蛋白水解更具抗性。
C.抗体序列的改造
在多个实施方案中，可出于多种原因，例如改善表达、改善交叉反应性、降低脱靶结合或消除一种或更多种天然效应子功能，例如补体的激活或免疫细胞(例如T细胞)的募集而选择对所鉴定抗体的序列进行改造。特别是，IgM抗体可以转化为IgG抗体。以下是用于抗体改造的相关技术的一般讨论。
可培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可使用随机六聚体和RT一起来产生RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。可将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集并使用G蛋白柱通过FPLC纯化的抗体进行结合和中和的测定。可通过以下产生重组全长IgG抗体：将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到Lonza pConIgG1或pConK2质粒载体中，将其转染到293Freestyle细胞或Lonza CHO细胞中，并从CHO细胞上清液中收集和纯化。
与最终cGMP制造过程在相同宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的迅速可用性有可能降低过程开发计划的持续时间。Lonza已经开发了使用在CDACF培养基中培养的合并转染子用于在CHO细胞中迅速产生少量(多至50g)抗体的一般方法。尽管比真正的瞬时系统稍慢，但是其优点包括更高的产物浓度和与产生细胞系使用相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体之GS-CHO库的生长和产生力的实例为：在以补料分批模式进行的一次性袋状生物反应器培养(5L工作体积)中，在转染后9周内达到了2g/L的收获抗体浓度。
pCon载体TM是重新表达完整抗体的简单方法。恒定区载体是提供了克隆到pEE载体中的一系列免疫球蛋白恒定区载体的一组载体。这些载体提供了具有人恒定区的全长抗体的简单构建和GS系统TM的便利性。
抗体分子将包含例如通过mAb的蛋白水解切割产生的片段(例如F(ab’)、F(ab’)2)或者例如可通过重组方式产生的单链免疫球蛋白。这样的抗体衍生物是单价的。在一个实施方案中，这样的片段可彼此组合，或者与其他抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。明显地，这样的嵌合分子可包含能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
可期望将在非人宿主中产生的抗体“人源化”，以便在用于人治疗时减弱任何免疫应答。这样的人源化抗体可以在体外或体内环境中进行研究。可以产生人源化抗体，例如通过用相应的但非免疫原性部分替换抗体的免疫原性部分(即嵌合抗体)。PCT申请PCT/US86/02269；EP申请184,187；EP申请171,496；EP申请173,494；PCT申请WO 86/01533；EP申请125,023；Sun et al.(1987)；Wood et al.(1985)；以及Shaw et al.(1988)；所有这些参考文献通过引用并入本文。Morrison(1985)提供了“人源化”嵌合抗体的综述；也通过引用并入本文。“人源化”抗体或者可以通过CDR或CEA取代来产生。Jones et al.(1986)；Verhoeyen etal.(1988)；Beidler et al.(1988)；所有这些参考文献通过引用并入本文。
在在一些相关实施方案中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包含与所公开抗体中CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合、人源化的或CDR接枝抗体)。在又一个实施方案中，抗体是完全人重组抗体。
Fc修饰。本公开内容还考虑了同种型修饰。通过修饰Fc区域以具有不同同种型，可实现不同功能。例如，改变为IgG1可提高抗体依赖性细胞细胞毒性，转换为A类可改善组织分布，以及转换为M类可改善价位。
作为替代或补充，将氨基酸修饰与改变IL-23p19结合分子的Fc区的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)功能的一种或更多种另外的氨基酸修饰组合在一起可以是有用的。特别令人感兴趣的结合多肽可以是与C1q结合并显示出补体依赖性细胞毒性的结合多肽。可修饰具有预先存在的C1q结合活性，任选地还具有介导CDC能力的多肽以使得这些活性中的一种或两种得到增强。改变C1q和/或修饰其补体依赖性细胞毒性功能的氨基酸修饰描述于例如WO/0042072中，其在此通过引用并入。
可例如通过修饰C1q结合和/或FcγR结合并由此改变CDC活性和/或ADCC活性来设计具有改变的效应物功能的抗体的Fc区。“效应物功能”负责激活或减弱生物活性(例如，在对象中)。效应物功能的一些实例包括但不限于：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等。这样的效应物功能可需要待与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合的Fc区，并可使用多种测定(例如Fc结合测定、ADCC测定、CDC测定等)进行评估。
例如，可产生抗体的具有改善的C1q结合和改善的FcγRIII结合(例如，具有改善的ADCC活性和改善的CDC活性二者)的变体Fc区。或者，如果期望降低或消除效应物功能，则可将变体Fc区改造为具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性。在另一些实施方案中，可提高这些活性中的仅一种，并且任选地，另一种活性也降低(例如，产生具有改善的ADCC活性但是降低的CDC活性的Fc区变体，反之亦然)。
FcRn结合。还可引入Fc突变并将其改造成改变其与新生Fc受体(FcRn)的相互作用并改善其药动学特性。已经描述了具有与FcRn的结合改善的人Fc变体的集合(Shields etal.,(2001).High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcγRI,FcγRII,FcγRIII,and FcRn and design of IgG1 variants with improvedbinding to the FcγR,(J.Biol.Chem.276:6591-6604)。已知可导致半衰期提高的许多方法(Kuo and Aveson,(2011))，包括可通过包括以下的技术产生氨基酸修饰：丙氨酸扫描诱变、随机诱变以及筛选，以评估与新生Fc受体(FcRn)结合和/或体内行为。诱变之后的计算策略也可用于选择氨基酸突变中之一以进行突变。
因此，本公开内容提供了具有与FcRn的最佳结合的抗原结合蛋白的变体。在一个具体实施方案中，抗原结合蛋白的所述变体在所述抗原结合蛋白的Fc区中包含至少一个氨基酸修饰，其中与所述亲本多肽相比，所述修饰选自Fc区的第226位、第227位、第228位、第230位、第231位、第233位、第234位、第239位、第241位、第243位、第246位、第250位、第252位、第256位、第259位、第264位、第265位、第267位、第269位、第270位、第276位、第284位、第285位、第288位、第289位、第290位、第291位、第292位、第294位、第297位、第298位、第299位、第301位、第302位、第303位、第305位、第307位、第308位、第309位、第311位、第315位、第317位、第320位、第322位、第325位、第327位、第330位、第332位、第334位、第335位、第338位、第340位、第342位、第343位、第345位、第347位、第350位、第352位、第354位、第355位、第356位、第359位、第360位、第361位、第362位、第369位、第370位、第371位、第375位、第378位、第380位、第382位、第384位、第385位、第386位、第387位、第389位、第390位、第392位、第393位、第394位、第395位、第396位、第397位、第398位、第399位、第400位、第401 403位、第404位、第408位、第411位、第412位、第414位、第415位、第416位、第418位、第419位、第420位、第421位、第422位、第424位、第426位、第428位、第433位、第434位、第438位、第439位、第440位、第443位、第444位、第445位、第446位和第447位，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中EU索引的编号。在本公开内容的另一方面中，修饰是M252Y/S254T/T256E。
另外，多个出版物描述了用于获得半衰期被修饰的生理活性分子的方法，参见例如Kontermann(2009)，通过将FcRn结合多肽引入到分子中，或者通过将分子与保留了FcRn结合亲和力但针对其他Fc受体的亲和力已大大降低的抗体融合或与抗体的FcRn结合结构域融合。
衍生抗体可用于改变亲本抗体在哺乳动物，特别是人中的半衰期(例如血清半衰期)。这样的改变可导致半衰期大于15天，优选大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5个月。本公开内容的抗体或其片段在哺乳动物，优选人中的半衰期提高使得所述抗体或抗体片段在哺乳动物中的血清效价更高，并因此降低了所述抗体或抗体片段的施用频率和/或降低了待施用的所述抗体或抗体片段的浓度。具有提高的体内半衰期的抗体或其片段可通过本领域技术人员已知的技术来产生。例如，具有提高的体内半衰期的抗体或其片段可通过对被鉴定为参与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰(例如，替换、缺失或添加)来产生。
Beltramello et al.(2010)先前报道了通过产生其中CH2结构域的1.3和1.2位的亮氨酸残基(根据C结构域的IMGT独特编号)被丙氨酸残基替换来使mAb(由于其倾向于增强登革病毒(dengue virus)感染)中和的修饰。该修饰(也称为“LALA”突变)消除了与FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa结合的抗体，如Hessell et al.(2007)所述。比较变体和未经修饰的重组mAb的中和和增强四种登革病毒血清型的感染的能力。LALA变体保留了与未经修饰mAb相同的中和活性，但完全没有增强活性。因此，在当前公开的抗体的上下文中，考虑了这种性质的LALA突变。
糖基化改变。本公开内容的一个具体实施方案是包含无唾液酸、半乳糖或岩藻糖的基本上均质的聚糖的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其二者可分别与重链或轻链恒定区连接。前述基本上均质的聚糖可与重链恒定区共价连接。
本公开内容的另一个实施方案包含具有新Fc糖基化模式的mAb。分离的单克隆抗体或其抗原结合片段存在于由GNGN或G1/G2糖型表示的基本上均质的组合物中。Fc糖基化在治疗性mAb的抗病毒和抗癌特性中发挥重要作用。本公开内容与最近的研究一致，该研究显示在体外无岩藻糖的抗HIV mAb的抗慢病毒细胞介导的病毒抑制提高。具有缺乏核心岩藻糖的均质聚糖的本公开内容的该实施方案显示出针对特定病毒的保护提高了两倍以上。消除核心岩藻糖显著改善了由自然杀伤(natural killer，NK)细胞介导的mAb的ADCC活性，但显示对多形核细胞(polymorphonuclear cell，PMN)的ADCC活性具有相反的作用。
与不具有基本上均质的GNGN糖型和具有含G0、G1F、G2F、GNF、GNGNF或GNGNFX糖型的相同抗体相比，包含由GNGN或G1/G2糖型表示的基本上均质的组合物的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段表现出对FcγRI和FcγRIII的结合亲和力提高。在本公开内容的一个实施方案中，所述抗体以1×10-8M或更小的Kd从FcγRI解离并且以1×10-7M或更小的Kd从FcγRIII解离。
Fc区的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。用于将碳水化合物部分与天冬酰胺侧链肽序列酶促连接的识别序列是天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中这些肽序列中任一个的存在均产生了潜在的糖基化位点。
糖基化模式可例如通过缺失一个或更多个存在于多肽中的糖基化位点和/或添加一个或更多个不存在于多肽中的糖基化位点来改变。通过改变氨基酸序列以使其包含一个或更多个上述三肽序列，方便地实现了将糖基化位点添加至抗体的Fc区(对于N-连接的糖基化位点)。示例性的糖基化变体具有重链的残基Asn 297的氨基酸替换。该改变也可通过向原始多肽的序列添加一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基替换原始多肽的序列来进行(对于O-连接的糖基化位点)。另外，将Asn 297改变为Ala可去除糖基化位点之一。
在某些实施方案中，抗体在表达β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnT III)的细胞中表达，使得GnT III将GlcNAc添加至IL-23p19抗体。用于以这样的方式产生抗体的方法提供于WO/9954342、WO/03011878、专利公开20030003097A1和Umana et al.,NatureBiotechnology,17:176-180,February 1999中。可使用基因组编辑技术例如成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)将细胞系改变以增强或降低或消除某些翻译后修饰，例如糖基化。例如，CRISPR技术可用于在用于表达重组单克隆抗体的293或CHO细胞中消除编码糖基化酶的基因。
单克隆抗体蛋白质序列倾向性(liability)的消除。可改造从人B细胞获得的抗体可变基因序列以增强其可制造性和安全性。潜在的蛋白质序列倾向性可通过检索与包含以下的位点相关的序列基序来鉴定：
1)未配对的Cys残基，
2)N-连接的糖基化，
3)Asn脱酰胺，
4)Asp异构化，
5)SYE截短，
6)Met氧化，
7)Trp氧化，
8)N端谷氨酸，
9)整合素结合，
10)CD11c/CD18结合，或
11)片段化。
这样的基序可通过改变编码重组抗体的cDNA的合成基因来消除。
在开发治疗性抗体领域中的蛋白质改造工作清楚地揭示了某些序列或残基与溶解度差异相关(Fernandez-Escamilla et al.,Nature Biotech.,22(10),1302-1306,2004；Chennamsetty et al.,PNAS,106(29),11937-11942,2009；Voynov et al.,Biocon.Chem.,21(2),385-392,2010)。文献中来自溶解度改变突变的证据表明与另一些亲水性残基，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸相比，一些亲水性残基例如天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸明显更有利地有助于蛋白质溶解度。
稳定性。可对抗体进行改造以增强生物物理特性。可使用平均表观解链温度(average apparent melting temperature)，使用升高的温度来使抗体解折叠(unfold)以确定相对稳定性。差示扫描量热术(Differential Scanning Calorimetry，DSC)测量作为温度函数的分子的热容Cp(使该分子升温每度所需的热)。可使用DSC研究抗体的热稳定性。mAb的DSC数据是特别令人感兴趣的，因为其有时解析了mAb结构内单独结构域的解折叠，从而在热谱图中产生多至三个峰(来自Fab、CH2和CH3结构域的解折叠)。通常来说，Fab结构域的解折叠产生最强峰。Fc部分的DSC谱和相对稳定性显示了人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类的特征差异(Garber and Demarest,Biochem.Biophys.Res.Commun.355,751-757,2007)。还可使用圆二色性(circular dichroism，CD)(用CD分光计进行)来确定平均表观解链温度。将以0.5nm的增量在200至260nm范围内测量抗体的远紫外CD谱。最终谱可确定为20次累积的平均值。可在背景减除之后计算残基椭圆率值。抗体(0.1mg/mL)的热解折叠可在235nm处在25℃至95℃下以及以1℃/分钟的加热速率进行监测。可使用动态光散射(dynamic lightscattering，DLS)来评估聚集的倾向性。DLS用于表征多种颗粒包括蛋白质的尺寸。如果体系在尺寸上不分散，则可确定颗粒的平均有效直径。这种测量取决于颗粒核芯的尺寸、表面结构的尺寸和颗粒浓度。由于DLS基本上测量了由颗粒引起的散射光强度的波动，因此可确定颗粒的扩散系数。商业DLA仪器中的DLS软件显示不同直径的颗粒群。可使用DLS方便地进行稳定性研究。样品的DLS测量可通过确定颗粒的流体动力学半径是否提高来显示颗粒是否随时间或随温度变化而聚集。如果颗粒聚集，则可看到半径更大的更大颗粒群。取决于温度的稳定性可通过控制原位温度来分析。毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术包括经过验证的用于确定抗体稳定性特征的方法。可使用iCE方法解析由于脱酰胺、C端赖氨酸、唾液酸化、氧化、糖基化以及可导致蛋白质pI变化的任何其他蛋白质变化而引起的抗体蛋白质电荷变体。可使用Protein Simple Maurice仪器在毛细管柱(cIEF)中通过高通量、自由溶液等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)来评价每种表达的抗体蛋白质。可每30秒进行全柱UV吸收检测，以实时监测聚焦在等电点(pI)的分子。这种方法将传统凝胶IEF的高分辨率与基于柱的分离中存在的定量和自动化的优点相组合，同时消除了对转移步骤的需要。该技术对表达的抗体的身份、纯度和异质性谱进行可重现、定量分析。结果确定了抗体上的电荷异质性和分子尺寸，在吸光度和天然荧光检测模式二者下并且检测灵敏度低至0.7μg/mL。
溶解度。可确定抗体序列的固有溶解度评分。固有溶解度评分可使用CamSolIntrinsic(Sormanni et al.,J Mol Biol 427,478-490,2015)进行计算。可通过在线程序评价每个抗体片段例如scFv的HCDR3中第95至102位残基(Kabat编号)的氨基酸序列，以计算溶解度评分。也可使用实验室技术确定溶解度。存在多种技术，包括将冻干的蛋白质添加至溶液直至溶液变得饱和并达到溶解度极限，或者通过在具有合适的分子量截止值的微浓缩器中超滤进行浓缩。最直接的方法是诱导无定形沉淀，其使用涉及使用硫酸铵进行蛋白质沉淀的方法来测量蛋白质溶解度(Trevino et al.,J Mol Biol,366:449-460,2007)。硫酸铵沉淀提供有关相对溶解度值的快速且准确的信息。硫酸铵沉淀产生具有明确水相和固相的沉淀的溶液，并且需要相对少量的蛋白质。使用通过硫酸铵诱导无定形沉淀进行的溶解度测量也可在不同的pH值下容易地进行。蛋白质溶解度是高度pH依赖性的，并且pH被认为是影响溶解度的最重要的外在因素。
自身反应性。通常认为，应在个体发生期间通过负选择消除自身反应性克隆；然而，已经清楚的是，具有自身反应性特性的许多人天然存在抗体在成体成熟库中仍然存在，并且自身反应性可增强许多抗体针对病原体的抗病毒功能。已经注意到，在早期B细胞发育期间抗体中的HCDR3环通常富含正电荷并且表现出自身反应性模式(Wardemann et al.,Science301,1374-1377,2003)。可通过在显微镜(使用黏附的HeLa或HEp-2上皮细胞)和流式细胞术细胞表面染色(使用悬浮的Jurkat T细胞和293S人胚肾细胞)中评估与人来源细胞结合的水平来测试给定抗体的自身反应性。也可使用对与组织阵列中组织的结合的评估来考察自身反应性。
优选残基(“人相似性”)。在许多近期研究中，正在大规模地对来自血液供体的人B细胞进行B细胞库深度测序。关于人抗体库重要部分的序列信息有助于对健康人中常见的抗体序列特征进行统计学评估。利用人重组抗体可变基因参考数据库中有关抗体序列特征的知识，可估计抗体序列的“人相似性”(Human Likeness，HL)的位置特异性程度。已表明HL可用于开发临床使用的抗体，如治疗性抗体或作为疫苗的抗体。目的是提高抗体的人相似性，以降低将导致抗体药物的效力显著下降或可诱导严重的健康影响的潜在不良作用和抗抗体免疫应答。可评估总共约4亿个序列的三名健康人血液供体的组合抗体库的抗体特征，并创建了聚焦于抗体的高变区的新“相对人相似性”(rHL)评分。rHL评分使人们容易地区分人序列(正评分)与非人序列(负评分)。可对抗体进行改造，以消除人库中不常见的残基。
经修饰抗体可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术包括通过标准分子生物技术表达、或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件的其他地方提出。
D.表达
根据本公开内容的核酸将编码抗体，其任选地与其他蛋白质序列连接。如在本申请中所使用的，术语“编码MUC1-C抗体的核酸”是指已经分离的不含总细胞核酸的核酸分子。在某些实施方案中，本公开内容涉及由本文所述的任何序列编码的抗体。
表2-密码子
本公开内容的DNA区段包括上述序列的编码生物功能上等同蛋白质和肽的那些。这样的序列可由于已知在核酸序列和由此编码的蛋白质中天然存在的密码子冗余和氨基酸功能等同而产生。或者，可以通过应用重组DNA技术来产生功能上等同的蛋白质或肽，其中可以基于对所交换氨基酸的特性的考虑来改造蛋白质结构的变化。如下文所述，可通过应用定点诱变技术引入人为设计的变化，或可随机引入并随后筛选期望的功能。
在某些实施方案内，使用表达载体来表达MUC1-C配体陷阱，以便产生和分离由其表达的多肽。在另一些实施方案中，表达载体用于基因治疗。表达需要在载体中提供适当的信号，并且其包括多种调节元件，例如驱动目的基因在宿主细胞中表达的来自病毒和哺乳动物来源二者的增强子/启动子。还定义了设计成优化信使RNA在宿主细胞中的稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用许多显性药物选择标志物来建立表达产物的永久的稳定细胞克隆的条件，以及将药物选择标志物的表达与多肽的表达联系起来的元件。
在本申请通篇，术语“表达构建体”意在包括包含编码基因产物的核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部的核酸编码序列能够被转录。转录物可以翻译成蛋白质，但不是必须的。在某些实施方案中，表达包括基因转录和mRNA翻译成基因产物二者。在另一些实施方案中，表达仅包括编码目的基因的核酸的转录。
术语“载体”用于指载体核酸分子，其中可插入核酸序列以引入到其可在那里进行复制的细胞中。核酸序列可以是“外源的”，这意味着其对引入载体的细胞是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源但处于宿主细胞核酸内该序列通常不存在的位置中。载体包括质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员通过标准重组技术将很熟练地构建载体，所述标准重组技术描述于Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1994)中，二者均通过引用并入本文中。
术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的基因产物的至少一部分之核酸序列的载体。在一些情况下，随后将RNA分子翻译成蛋白质、多肽或肽。在另一些情况下，这些序列不翻译，例如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指在特定宿主生物体中转录并可以翻译可操作地连接的编码序列所需的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可包含用于其他功能的核酸序列，并且在下文中进行描述。
1.调控元件
“启动子”是控制序列，其是控制转录的起始和速率的核酸序列的区域。启动子可包含调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合的基因元件。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子处于相对于核酸序列的正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可与或可不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可以是与基因或序列自然缔合的启动子，因为其可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这样的启动子可被称为“内源性”的。类似地，增强子可以是与核酸序列自然缔合、位于该序列的上游或下游的增强子。或者，通过将编码核酸区段定位在重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述启动子指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。
重组或异源增强子也是指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。这样的启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子以及非“天然存在”的启动子或增强子(即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变)。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，可结合本文中公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)产生序列(参见美国专利4,683,202、美国专利5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，考虑到也可以使用指导在非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等)内的序列转录和/或表达的控制序列。
当然，利用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中进行表达的启动子和/或增强子将是非常重要的。分子生物学领域的技术人员通常已知使用启动子、增强子和细胞类型组合来进行蛋白质表达，例如，参见Sambrook et al.(1989)，通过引用并入本文。所使用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和/或在合适的条件下有用的以指导引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于大规模产生重组蛋白和/或肽。启动子可以是异源的或内源的。
表3列出了在本发明的上下文中可用于调节基因表达的数种元件/启动子。该列表并不旨在穷尽在促进表达中所涉及的所有可能的元件，而仅仅是示例性的元件。表4提供了诱导型元件的一些实例，该诱导型元件是可响应于特定刺激而被激活的核酸序列的区域。
组织特异性启动子或元件的特性以及表征其活性的测定是本领域技术人员公知的。这样的区域的一些实例包括人LIMK2基因(Nomoto et al.1999)、生长抑素受体2基因(Kraus et al.,1998)、鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre et al.,1999)、人CD4(Zhao-Emonet et al.,1998)、小鼠α2(XI)胶原蛋白(Tsumaki,et al.,1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee,et al.,1997)、胰岛素样生长因子II(Wu et al.,1997)、人血小板内皮细胞黏附分子-1(Almendro et al.,1996)。发现肿瘤特异性启动子也可用于本公开内容中。表5中列出了一些这样的启动子。
表5-用于癌症基因治疗的候选组织特异性启动子
编码序列的有效翻译也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。本领域普通技术人员将能够容易地对此进行确定并提供所需信号。公知的是，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框“同框”以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可增强表达效率。
2.IRES
在本公开内容的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site，IRES)元件用来产生多基因或多顺反子信息(message)。IRES元件能够绕过5’甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg,1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg,1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow,1991)。IRES元件可与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框架可以一起转录，每个由IRES分隔开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框是核糖体可及的以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息，多基因可以有效表达(参见美国专利5,925,565和5,935,819，通过引用并入本文)。
3.多用途克隆位点
载体可包含多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，其是包含多个限制酶位点的核酸区域，其中任一个可与标准重组技术结合使用来消化载体。参见Carbonelli etal.,1999；Levenson et al.,1998；和Cocea,1997，通过引用并入本文。“限制酶消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置发挥功能的酶对核酸分子进行催化切割。这些限制酶中的许多是可商购的。这样的酶的使用是本领域技术人员广泛理解的。通常，使用在MCS内切割的限制酶将载体线性化或片段化，以使外源序列能够连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可彼此连续或可不连续。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员公知的。
4.剪接位点
大多数转录的真核生物RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物除去内含子。包含基因组真核序列的载体可需要供体和/或接受体剪接位点以确保转录物的正确加工用于蛋白质表达(参见Chandler et al.,1997，通过引用并入本文)。
5.终止信号
本公开内容的载体或构建体将通常包含至少一种终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑了结束RNA转录物产生的终止信号。终止子可以是在体内达到期望信使水平所必需的。
在真核生物系统中，终止子区域还可包含特异性DNA序列，该序列允许新转录物的位点特异性切割以暴露多腺苷酸化位点。其发出信号使特化的内源聚合酶将一段约200个A残基(polyA)添加至转录物的3’端。用这种poly A尾修饰的RNA分子显示出更稳定并且更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的另一些实施方案中，优选地，终止子包含用于RNA切割的信号，并且更优选地，终止子信号促进信使的多腺苷酸化。终止子和/或多腺苷酸化位点元件可用来提高信使水平和/或使从该盒通读到其他序列中减至最小。
考虑用于本公开内容的终止子包括本文中所述或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可缺少可转录或可翻译的序列，例如由于序列截短。
6.多腺苷酸化信号
在表达中，特别是在真核生物表达中，通常将包含多腺苷酸化信号以实现转录物合适的多腺苷酸化。不认为多腺苷酸化信号的性质是成功实践本公开内容的关键，和/或可采用任何这样的序列。一些优选实施方案包括SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号，其在多种靶细胞中是方便的和/或已知能发挥良好的功能。多腺苷酸化可提高转录物的稳定性或可促进胞质运输。
7.复制的起始
为了在宿主细胞中增殖载体，其可包含一个或更多个复制起始位点(一般称为“ori”)，其是在此处起始复制的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)。
8.选择标志物和筛选标志物
在本公开内容的某些实施方案中，可通过在表达载体中包含标志物来体外或体内鉴定包含本公开内容的核酸构建体的细胞。这样的标志物将赋予细胞可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。一般来说，选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中标志物的存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的一个实例是抗药性标志物。
通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇之抗性的基因是有用的选择标志物。除赋予允许基于条件实施来区分转化体之表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括筛选标志物，例如GFP，其基础是比色分析。或者，可利用筛选酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)。本领域技术人员还知晓如何使用免疫标志物，可能与FACS分析结合。认为所使用的标志物不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标志物和筛选标志物的另外的实例是本领域技术人员公知的。
9.病毒载体
某些病毒载体有效感染或进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并稳定表达病毒基因的能力已导致许多不同病毒载体系统的开发和应用(Robbins et al.,1998)。目前正在开发的病毒系统用作离体和体内基因转移的载体。例如，目前正在评价腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体用于治疗疾病，例如癌症、囊性纤维化、戈谢病(Gaucherdisease)、肾病和关节炎(Robbins和Ghivizzani,1998；Imai et al.,1998；美国专利5,670,488)。根据具体的基因治疗应用，以下描述的多种病毒载体呈现特定的优点和缺点。
腺病毒载体。在一些具体实施方案中，腺病毒表达载体被考虑用于表达构建体的递送。“腺病毒表达载体”意指包括包含足以(a)支持构建体包装和(b)最终表达在其中克隆的组织特异性或细胞特异性构建体之腺病毒序列的那些构建体。
腺病毒包含线性双链DNA，其基因组大小为30至35kb(Reddy et al.,1998；Morrison et al.,1997；Chillon et al.,1999)。根据本公开内容的腺病毒表达载体包含腺病毒的基因工程化形式。腺病毒基因转移的优点包括感染广泛多种细胞类型(包括非分裂细胞)的能力、中等大小的基因组、易于操作、高感染性和生长至高滴度的能力(Wilson,1996)。此外，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以附加体的方式复制，而没有与其他病毒载体相关的潜在遗传毒性。腺病毒也是结构上稳定的(Marienfeld et al.,1999)并且在广泛扩增之后未检测到基因组重排(Parks et al.,1997；Bett et al.,1993)。
腺病毒基因组的突出特征是早期区域(E1、E2、E3和E4基因)、中间区域(pIX基因、Iva2基因)、晚期区域(L1、L2、L3、L4和L5基因)、主要晚期启动子(major late promoter，MLP)、末端反向重复(inverted-terminal-repeat，ITR)和一个ψ序列(Zheng,et al.,1999；Robbins et al.,1998；Graham and Prevec,1995)。早期基因E1、E2、E3和E4在感染之后由病毒表达，并且编码调节病毒基因表达、细胞基因表达、病毒复制和细胞凋亡抑制的多肽。此外，在病毒感染期间，MLP被激活，导致晚期(L)基因的表达，编码腺病毒衣壳化所需的多肽。中间区域编码腺病毒衣壳的组分。腺病毒的末端反向重复序列(ITR；长度为100至200bp)是顺式元件，起复制起点的作用并且是病毒DNA复制所必需的。腺病毒基因组的包装需要ψ序列。
产生用作基因转移载体的腺病毒的通用方法是缺失E1基因(E1-)，其参与E2、E3和E4启动子的诱导(Graham and Prevec,1995)。随后，可以重组插入治疗基因来代替E1基因，其中治疗基因的表达由E1启动子或异源启动子驱动。然后，E1-，复制缺陷型病毒在反式提供E1多肽的“辅助”细胞系(例如人胚肾细胞系293)中增殖。因此，在本公开内容中，可以方便地将转化构建体引入已经去除E1编码序列的位置。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置对于本公开内容并不重要。或者，可以缺失E3区域、E4区域的部分或两者，其中将在真核细胞中可操作启动子的控制下的异源核酸序列插入腺病毒基因组中用于基因转移(美国专利5,670,488；美国专利5,932,210，各自通过引用明确并入本文)。
尽管基于腺病毒的载体提供了相对于其他载体系统的数个独特优势，但它们通常受到载体免疫原性、重组基因插入的尺寸限制和低复制水平的限制。制备包含全长肌营养不良蛋白基因和复制所需末端重复的缺失了所有开放阅读框的重组腺病毒载体(Haeckeret al.,1996)为上述腺病毒缺点提供了一些潜在的有希望的优点。该载体在293细胞中与辅助病毒一起生长至高滴度，并且能够在mdx小鼠、在体外肌管和体内肌纤维中有效转导肌营养不良蛋白。以下讨论了辅助细胞依赖性病毒载体。
使用腺病毒载体的主要问题是在包装细胞系中的载体产生期间或在个体的基因治疗治疗期间产生具有复制能力的病毒。具有复制能力的病毒的产生可对患者造成非预期的病毒感染和病理后果的严重威胁。Armentano et al.(1990)描述了复制缺陷型腺病毒载体的制备，声称消除了无意中产生具有复制能力的病毒的可能性(美国专利5,824,544，通过引用明确并入本文中)。复制缺陷型腺病毒方法包含缺失的E1区和重新定位的蛋白IX基因，其中载体表达异源的哺乳动物基因。
除了要求腺病毒载体是复制缺陷型的或至少条件性缺陷的之外，不认为腺病毒载体的性质对成功实施本公开内容至关重要。腺病毒可以是42种不同的已知血清型和/或A-F亚群中的任何一种。为了获得用于本公开内容的条件复制缺陷型腺病毒载体，C亚群的5型腺病毒是优选的起始材料。这是因为5型腺病毒是关于其已知大量的生物化学和遗传信息的人腺病毒，并且其历史上已被用于采用腺病毒作为载体的大多数构建体。
如上所述，根据本公开内容的典型载体是复制缺陷型的，并且不具有腺病毒E1区。腺病毒的生长和操作是本领域技术人员已知的，并且在体外和体内表现出广泛的宿主范围(美国专利5,670,488；美国专利5,932,210；美国专利5,824,544)。这组病毒可以以高滴度获得，例如每ml 109至1011个噬斑形成单位，并且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外来基因是附加体，因此对宿主细胞的遗传毒性低。目前许多实验、创新、临床前研究和临床试验正在研究使用腺病毒作为基因递送载体。例如，基于腺病毒基因递送的基因治疗正被开发用于肝病(Han et al.,1999)、精神疾病(Lesch,1999)、神经疾病(Smith,1998；Hermens和Verhaagen,1998)、冠状动脉疾病(Feldman et al.,1996)、肌肉疾病(Petrof,1998)、胃肠疾病(Wu,1998)和多种癌症例如结直肠癌(Fujiwara and Tanaka,1998；Dorai et al.,1999)、胰腺癌、膀胱癌(Irieet al.,1999)、头颈癌(Blackwell et al.,1999)、乳腺癌(Stewart et al.,1999)、肺癌(Batra et al.,1999)和卵巢癌(Vanderkwaak et al.,1999)。
逆转录病毒载体。在本公开内容的某些实施方案中，考虑了使用逆转录病毒进行基因递送。逆转录病毒是包含RNA基因组的RNA病毒。当宿主细胞被逆转录病毒感染时，基因组RNA被逆转录成DNA中间体，其整合到感染细胞的染色体DNA中。这种整合的DNA中间体被称为原病毒。逆转录病毒的一个特别的优点是它们可以通过整合到宿主DNA中用目的基因(例如治疗基因)稳定地感染的分裂细胞，而不表达免疫原性病毒蛋白。理论上，整合的逆转录病毒载体将在感染的宿主细胞的生命内维持，表达目的基因。
逆转录病毒基因组和原病毒DNA具有三个基因：gag、pol和env，其以两个长末端重复(long terminal repeat，LTR)序列为侧翼。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)，并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所必需的所有其他顺式作用序列。
本公开内容的重组逆转录病毒可以以这样的方式进行遗传修饰：天然病毒的一些结构感染基因已经被去除并替换为待递送至靶细胞的核酸序列(美国专利5,858,744；美国专利5,739,018，各自通过引用并入本文)。在用病毒感染细胞之后，病毒将其核酸注入细胞中，并且逆转录病毒遗传物质可整合到宿主细胞基因组中。然后转移的逆转录病毒遗传物质在宿主细胞内被转录并翻译成蛋白质。与其他病毒载体系统一样，在载体产生期间或在治疗期间具有复制能力的逆转录病毒的产生是一个主要问题。适用于本公开内容的逆转录病毒载体通常是有缺陷的逆转录病毒载体，所述有缺陷的逆转录病毒载体能够感染靶细胞、逆转录其RNA基因组、并将逆转录的DNA整合到靶细胞基因组中，但不能在靶细胞内复制以产生感染性的逆转录病毒颗粒(例如，转移到靶细胞中的逆转录病毒基因组的gag(编码病毒粒子结构蛋白的基因)和/或pol(编码逆转录酶的基因)是有缺陷的)。因此，原病毒和组装体转录成感染性病毒在合适的辅助病毒的存在下或在包含能够进行衣壳化而不会同时产生污染的辅助病毒的合适序列的细胞系中发生。
逆转录病毒的生长和维持是本领域已知的(美国专利5,955,331；美国专利第5,888,502，其各自均通过引用明确并入本文)。Nolan et al.描述了包含异源基因的稳定的高滴度、无辅助病毒的逆转录病毒的产生(美国专利5,830,725，其通过引用明确并入本文)。在本公开内容(美国专利5,955,331)中考虑了用于构建包装细胞系(所述包装细胞系用于产生具有双嗜性(amphoteric)或单嗜性(ecotrophic)宿主范围的无辅助病毒的重组逆转录病毒)的方法，以及使用重组逆转录病毒在体内和体外将目的基因引入到真核细胞中的方法。
目前，大多数载体介导的基因递送的临床试验使用基于鼠白血病病毒(murineleukemia virus，MLV)的逆转录病毒载体基因递送(Robbins et al.,1998；Miller etal.,1993)。逆转录病毒基因递送的缺点包括稳定感染需要进行中的细胞分裂，以及阻止大基因递送的编码能力。然而，载体(例如慢病毒(例如HIV)、猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiency virus，SIV)和马传染性贫血病毒(equine infectious-anemia virus，EIAV))的最新进展可感染某些非分裂细胞，潜在地允许在体内使用逆转录病毒载体进行基因治疗应用(Amado and Chen,1999；Klimatcheva et al.,1999；White et al.,1999；Caseet al.,1999)。例如，基于HIV的载体已被用于感染非分裂细胞，例如神经元(Miyatake etal.,1999)、胰岛(Leibowitz et al.,1999)和肌肉细胞(Johnston et al.,1999)。目前正在评估通过逆转录病毒的基因的治疗性递送用于治疗多种病症，例如炎性疾病(Moldaweret al.,1999)、AIDS(Amado and Chen,1999；Engel and Kohn,1999)、癌症(Clay et al.,1999)、脑血管疾病(Weihl et al.,1999)和血友病(Kay,1998)。
疱疹病毒载体。I型和II型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)包含编码70至80个基因的约150kb的双链线性DNA基因组。野生型HSV能够溶解地感染细胞并在某些细胞类型(例如神经元)中建立潜伏期。与腺病毒类似，HSV也可以感染多种细胞类型，包括肌肉(Yeung et al.,1999)、耳(Derby et al.,1999)、眼(Kaufman et al.,1999)、肿瘤(Yoon et al.,1999；Howard et al.,1999)、肺(Kohut et al.,1998)、神经元(Garrido etal.,1999；Lachmann and Efstathiou,1999)、肝(Miytake et al.,1999；Kooby et al.,1999)和胰岛(Rabinovitch et al.,1999)。
HSV病毒基因由细胞RNA聚合酶II转录并暂时受到调节，导致大约三个可辨别的阶段或动力学类别的基因产物的转录和随后的合成。这些基因阶段被称为立即早期(Immediate Early，IE)或α基因，早期(Early，E)或β基因和晚期(Late，L)或γ基因。在病毒基因组到达新感染的细胞的核之后，立即转录IE基因。这些基因的有效表达不需要先前的病毒蛋白质合成。需要IE基因的产物来激活转录并调节病毒基因组的剩余部分。
为了用于递送治疗基因，必须使HSV复制缺陷。已经描述了用于产生复制缺陷型HSV无辅助病毒细胞系的方案(美国专利5,879,934；美国专利5,851,826，各自通过引用整体明确并入本文)。一种IE蛋白(ICP4)，也称为α4或Vmw175，对于病毒感染性和从IE转录到后期转录均是绝对需要的。因此，由于其复杂、多功能的性质以及在HSV基因表达调节中的核心作用，ICP4通常是HSV遗传研究的对象。
缺失ICP4的HSV病毒的表型研究表明这样的病毒可能对基因转移的目的有用(Krisky et al.,1998a)。缺失ICP4使其成为基因转移理想的病毒的一个特性是它们只表达五个其他IE基因：ICP0、ICP6、ICP27、ICP22和ICP47(DeLuca et al.,1985)，而不表达编码指导病毒DNA合成的蛋白质以及病毒的结构蛋白的病毒基因。这种特性对于使基因转移之后对宿主细胞代谢或免疫应答的可能有害影响最小化是理想的。除ICP4之外，IE基因ICP22和ICP27的进一步缺失显著改善了HSV细胞毒性的降低并且阻止了早期和晚期病毒基因表达(Krisky et al.,1998b)。
已经在多种体外模型系统和体内中证明了HSV在基因转移中对于例如以下的疾病的治疗潜力：帕金森病(Yamada et al.,1999)、视网膜母细胞瘤(Hayashi et al.,1999)、脑内和皮内肿瘤(Moriuchi et al.,1998)、B细胞恶性肿瘤(Suzuki et al.,1998)、卵巢癌(Wang et al.,1998)和杜氏肌营养不良(Huard et al.,1997)。
腺相关病毒载体。腺病毒相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是细小病毒家族的成员，是一种越来越多地用于基因递送治疗的人病毒。AAV具有数个在其他病毒系统中未发现的有利特征。第一，AAV可以感染多种宿主细胞，包括非分裂细胞。第二，AAV可以感染来自不同物种的细胞。第三，AAV未与任何人或动物疾病相关，并且在整合时似乎不改变宿主细胞的生物学特性。例如，估计人群体的80％至85％暴露于AAV。最后，AAV在不同的物理和化学条件下都是稳定的，这适合于其自身生产、储存和运输要求。
AAV基因组是包含4681个核苷酸的线性单链DNA分子。AAV基因组通常包含内部非重复基因组，其在每个末端以长约145bp的末端反向重复序列(ITR)为侧翼。ITR具有多种功能，包括DNA复制的起源以及病毒基因组的包装信号。基因组的内部非重复部分包含两个大的开放阅读框，称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。rep和cap基因编码病毒蛋白质，其允许病毒复制并将病毒基因组包装成病毒粒子。从AAV rep区域Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep40(根据它们的表观分子量命名)表达家族的至少四种病毒蛋白质。AAV cap区域编码至少三种蛋白质，VP1、VP2和VP3。
AAV是辅助依赖性病毒，需要与辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共感染以形成AAV病毒粒子。在没有与辅助病毒共感染的情况下，AAV建立了潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体中，但不产生感染性病毒粒子。由辅助病毒进行的随后感染“拯救”整合的基因组，允许其复制并将其基因组包装成感染性AAV病毒粒子。尽管AAV可以感染来自不同物种的细胞，但是辅助病毒必须与宿主细胞是同一物种(例如，人AAV将在用犬腺病毒共感染的犬细胞中复制)。
已经通过删除AAV基因组的内部非重复部分并在ITR之间插入异源基因来工程化AAV以递送目的基因。异源基因可以与能够在靶细胞中驱动基因表达的异源启动子(组成型、细胞特异性或诱导型)功能性连接。为了产生包含异源基因的感染性重组AAV(rAAV)，用包含异源基因的rAAV载体转染合适的生产细胞系。生产细胞用具有AAV rep和cap基因的第二质粒在其各自的内源启动子或异源启动子的控制下同时转染。最后，用辅助病毒感染生产细胞。
一旦这些因素聚集在一起，异源基因如同其是野生型AAV基因组被复制和包装。当靶细胞感染了产生的rAAV病毒体时，异源基因进入并在靶细胞中表达。因为靶细胞缺乏rep和cap基因以及腺病毒辅助基因，所以rAAV不能进一步复制、包装或形成野生型AAV。
然而，辅助病毒的使用带来了许多问题。首先，在rAAV产生系统中使用腺病毒导致宿主细胞产生rAAV和感染性腺病毒二者。污染的感染性腺病毒可以通过热处理灭活(56℃，持续1小时)。然而，热处理导致功能性rAAV病毒体的滴度下降约50％。第二，在这些制剂中存在不同量的腺病毒蛋白。例如，在这样的rAAV病毒体制剂中获得的总蛋白的大约50％或更多是游离腺病毒纤维蛋白。如果不完全清除，这些腺病毒蛋白具有引发患者的免疫应答的可能性。第三，使用辅助病毒的AAV载体产生方法需要使用和操作大量的高滴度感染性辅助病毒，这带来了许多健康和安全问题，特别是关于疱疹病毒的使用。第四，辅助病毒颗粒在rAAV病毒体产生细胞中的伴随产生转移大量宿主细胞资源远离rAAV病毒体产生，可能导致较低的rAAV病毒体产量。
慢病毒载体。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env以外，其还包含具有调节功能或结构功能的其他基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，就像在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过对HIV毒力基因进行多次减毒(例如，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef)产生慢病毒载体，使得载体在生物学上是安全的。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达二者。慢病毒基因组和原病毒DNA具有在逆转录病毒中存在的三种基因：gag、pol和env，其以两个长末端重复(LTR)序列为侧翼。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。
与5’LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效衣壳化成颗粒(Psi位点)所需的序列。如果从病毒基因组中缺失衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒粒子)所需的序列，则顺式缺陷会阻止基因组RNA的衣壳化。然而，所得的突变体仍然能够指导所有病毒粒子蛋白质的合成。
慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini et al.,(1996)；Zufferey et al.,(1997)；美国专利6,013,516和5,994,136。通常，载体是基于质粒或基于病毒的，并且被配置为携带并入外来核酸所必需的序列，用于选择和将核酸转移到宿主细胞中。目的载体的gag、pol和env基因也是本领域中已知的。因此，将相关的基因克隆到所选择的载体中，然后用于转移目的靶细胞。
美国专利5,994,136(其通过引用并入本文)中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞用携带包装功能的两种或更多种载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat。这描述了可以提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体，以及可以提供编码病毒env的核酸以产生包装细胞的另一载体。将提供异源基因(例如本公开内容中的STAT-1α基因)的载体引入到该包装细胞，产生释放携带目的外源基因的感染性病毒颗粒的生产细胞。env优选是允许转导人和其他物种的细胞的兼向性包膜蛋白。
可以通过包膜蛋白与抗体或特定配体的连接来靶向重组病毒，以靶向特定细胞类型的受体。例如，通过将目的序列(包括调节区)与编码特定靶细胞上受体的配体的另一基因一起插入到病毒载体中，载体这时是靶标特异性的。
提供病毒env核酸序列的载体与调控序列，例如启动子或增强子可操作地相关联。调节序列可以是任何真核启动子或增强子，包括例如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件、人巨细胞病毒增强子或牛痘P7.5启动子。在一些情况下，例如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件，启动子-增强子元件位于LTR序列内或与LTR序列相邻。
异源或外源核酸序列，例如本文中编码STAT-1α的多核苷酸序列与调节性核酸序列可操作地连接。优选地，异源序列与启动子连接，产生嵌合基因。异源核酸序列还可处于病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的控制之下，并且逆转录病毒LTR内保留的信号仍然可以导致转基因的有效表达。标记基因可用于检测载体的存在，从而以确认感染和整合。标记基因的存在确保了仅那些表达插入物的宿主细胞被选择和生长。典型的选择基因编码赋予抗生素和其他毒性物质抗性的蛋白质，例如，组氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、氨甲喋呤等和细胞表面标志物。
通过转染或感染将载体引入到包装细胞系中。包装细胞系产生包含载体基因组的病毒颗粒。转染或感染的方法是本领域技术人员公知的。将包装载体和转移载体共转染至包装细胞系之后，从培养基中回收重组病毒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。因此，包装构建体通常与显性选择标志物例如neo、DHFR、Gln合成酶或ADA一起可通过磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔引入到人细胞系中，随后在合适药物的存在下进行选择并分离克隆。可选择标记基因可以与构建体中的包装基因物理连接。
慢病毒转移载体Naldini et al.(1996)已用于体外感染生长停滞的人细胞，并在直接注射到成年大鼠的脑中之后来转导神经元。该载体在体内将标记基因转移到神经元中是有效的，并且在不存在可检测的病理状况的情况下实现了长期表达。在单次注射载体之后10个月分析的动物显示转基因表达的平均水平没有降低，并且没有组织病理学或免疫应答的迹象(Blomer et al.,1997)。因此，在本公开内容中，可以离体移植或植入感染了重组慢病毒的细胞，或体内感染细胞。
其他病毒载体。用于基因递送的病毒载体的开发和功用正在不断改进和发展。其他病毒载体，例如痘病毒；例如痘苗病毒(Gnant et al.,1999；Gnant et al.,1999)，α病毒；例如辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(Lundstrom,1999)、呼肠孤病毒(Coffey etal.,1998)和甲型流感病毒(Neumann et al.,1999)预期用于本公开内容，并可根据靶标系统的必要特性进行选择。
在某些实施方案中，考虑将痘苗病毒载体用于本公开内容。痘苗病毒是用于表达异源基因的特别有用的真核病毒载体系统。例如，当重组痘苗病毒被适当地工程化时，蛋白质被合成、加工并运输至质膜。最近已证明痘苗病毒作为基因递送载体可将基因转移至人肿瘤细胞，例如EMAP-II(Gnant et al.,1999)、内耳(Derby et al.,1999)、神经胶质瘤细胞，例如p53(Timiryasova et al.,1999)和多种哺乳动物细胞，例如P450(美国专利5,506,138)。在美国专利5,849,304和美国专利5,506,138(其各自通过引用明确并入本文)中描述了痘苗病毒的制备、生长和操作。
在另一些实施方案中，辛德比斯病毒载体被考虑用于基因递送。辛德比斯病毒是甲病毒属的一种(Garoff和Li,1998)，其包括重要的病原体如委内瑞拉、西部和东部马脑炎病毒(Sawai et al.,1999；Mastrangelo et al.,1999)。在体外，辛德比斯病毒感染多种鸟类、哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞。辛德比斯病毒的基因组由单链RNA的单分子组成，长度为11,703个核苷酸。基因组RNA是感染性的，在5’末端处加帽并在3’末端处多腺苷酸化，并用作mRNA。痘苗病毒26S mRNA的翻译产生多蛋白，该多蛋白被病毒和可能的宿主编码的蛋白酶的组合共翻译和翻译后切割，以得到三种病毒结构蛋白(衣壳蛋白(C)和两种包膜糖蛋白(E1和PE2，病毒体E2的前体)。
辛德比斯病毒的三个特征表明，其将是表达异源基因的有用载体。首先，辛德比斯病毒在自然界和在实验室二者中有广泛的宿主范围。第二，基因表达发生在宿主细胞的胞质中，并且快速且有效。第三，RNA合成中的温度敏感性突变是可用的，其可用于仅通过在感染后的不同时间将培养物转移至非许可温度来调节异源编码序列的表达。辛德比斯病毒的生长和维持是本领域已知的(美国专利5,217,879，其通过引用明确并入本文)。
嵌合病毒载体。正在开发嵌合或杂交病毒载体用于治疗基因递送，并且预期用于本公开内容。已经描述了嵌合痘病毒/逆转录病毒载体(Holzer et al.,1999)、腺病毒/逆转录病毒载体(Feng et al.,1997；Bilbao et al.,1997；Caplen et al.,1999)和腺病毒/腺相关病毒载体(Fisher et al.,1996；美国专利5,871,982)。
这些“嵌合”病毒基因转移系统可以利用两种或更多种亲本病毒物种的有利特征。例如，Wilson等人提供了嵌合载体构建体，其包含腺病毒的部分，AAV 5’和3’ITR序列和所选择的转基因，如下所述(美国专利5,871,983，通过引用明确并入本文)。
腺病毒/AAV嵌合病毒使用腺病毒核酸序列作为穿梭物(shuttle)来将重组AAV/转基因基因组递送至靶细胞。杂合载体中使用的腺病毒核酸序列的范围可以从需要使用辅助病毒来产生杂合病毒颗粒的最小序列量至仅腺病毒基因的选择性缺失，该缺失的基因产物可以由选择的包装细胞在杂合病毒产生过程中提供。至少，pAdA穿梭载体中使用的腺病毒核酸序列是其中删除了所有病毒基因并且只含有将腺病毒基因组DNA包装到预先形成的衣壳头中所需的那些腺病毒序列的腺病毒基因组序列。更特别地，所用的腺病毒序列是腺病毒的顺式作用5’和3’反向末端重复(ITR)序列(其用作复制起点)和含有包装线性Ad基因组和用于E1启动子的增强子元件所必需序列的天然5’包装/增强子结构域。腺病毒序列可以被修饰以包含所期望的缺失、替代或突变，前提是不消除所期望的功能。
在上述嵌合载体中有用的AAV序列是其中删除了rep和cap多肽编码序列的病毒序列。更特别地，所用的AAV序列是顺式作用5’和3’反向末端重复(ITR)序列。这些嵌合体的特征在于向宿主细胞的高滴度转基因递送以及将转基因稳定整合到宿主细胞染色体中的能力(美国专利55,871,983，其通过引用明确并入本文)。在杂交载体构建体中，AAV序列的侧翼是以上讨论的所选择的腺病毒序列。5’和3’AAV ITR序列本身位于选定的转基因序列和相关调控元件的侧翼，如下所述。因此，由转基因和侧翼的5’和3’AAV序列形成的序列可以插入载体腺病毒序列的任何缺失位点。例如，期望在腺病毒缺失的E1a/E1b基因的位点处插入AAV序列。或者，可以在E3缺失、E2a缺失等处插入AAV序列。如果在杂交病毒中仅使用腺病毒5’ITR/包装序列和3’ITR序列，则在它们之间插入AAV序列。
载体和重组病毒的转基因序列可以是与腺病毒序列异源的基因、核酸序列或其反向转录物，其编码目的蛋白质、多肽或肽片段。转基因以允许转基因转录的方式与调节组件有效连接。转基因序列的组成将取决于将导入的所得杂交载体的用途。例如，一种类型的转基因序列包括在宿主细胞中表达所期望基因产物的治疗性基因。这些治疗性基因或核酸序列通常编码用于体内或离体在患者中施用和表达的产物，以替代或纠正遗传或非遗传性遗传缺陷或治疗表观遗传病症或疾病。
10.非病毒转化
认为用于转化用于本公开内容的细胞器、细胞、组织或生物体的核酸递送的合适方法实际上包括可将核酸(例如DNA)引入到细胞器、细胞、组织或生物体中的任何方法，如本文中所述或本领域普通技术人员已知的。这样的方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，其各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub,1985；美国专利5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利5,384,253，通过引用并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb,1973；Chen和Okayama,1987；Rippe et al.,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，随后使用聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声加载(Fechheimer et al.,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987；Wong et al.,1980；Kaneda et al.,1989；Kato et al.,1991)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且其各自通过引用并入本文)；通过与碳化硅纤维一起搅拌(Kaeppler et al.,1990；美国专利5,302,523和5,464,765，其各自通过引用并入本文)；或者通过PEG介导的原生质体的转化(Omirulleh et al.,1993；美国专利4,684,611和4,952,500，其各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus et al.,1985)。通过应用诸如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可被稳定或瞬时转化。
注射。在某些实施方案中，可通过一次或更多次例如皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内注射(即针注射)将核酸递送至细胞器、细胞、组织或生物体。注射疫苗的方法是本领域普通技术人员公知的(例如，注射包含盐水溶液的组合物)。本公开内容的另一些实施方案包括通过直接显微注射引入核酸。已经使用直接显微注射将核酸构建体引入到非洲爪蟾卵母细胞中(Harland和Weintraub,1985)。
电穿孔。在本公开内容的某些实施方案中，通过电穿孔将核酸引入到细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔涉及将细胞和DNA的混悬液暴露于高压放电。在该方法的一些变体中，使用某些细胞壁降解酶(例如果胶降解酶)使靶接受者细胞比未经处理的细胞更易于通过电穿孔转化(美国专利5,384,253，通过引用并入本文)。或者，可以使接受者细胞更易受通过机械伤害的转化的影响。
使用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。已经以这种方式用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter et al.,1984)，并且用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa et al.,1986)。
为了通过电穿孔在细胞(例如植物细胞)中进行转化，可以使用易碎组织，例如细胞混悬培养物或胚性愈伤组织，或者可以直接转化未成熟胚胎或其他有机组织。在该技术中，通过将所选细胞暴露于果胶降解酶(果胶酶)或以受控的方式进行机械伤害，可部分降解所选细胞的细胞壁。已通过对完整细胞的电穿孔进行转化的一些物种的实例包括玉米(美国专利5,384,253；Rhodes et al.,1995；D’Halluin et al.,1992)、小麦(Zhou etal.,1993)、番茄(Hou和Lin,1996)、大豆(Christou et al.,1987)和烟草(Lee et al.,1989)。
还可使用原生质体进行植物细胞的电穿孔转化(Bates,1994；Lazzeri,1995)。例如，Dhir和Widholm在国际专利申请号WO 92/17598(通过引用并入本文)中描述了通过对子叶来源的原生质体进行电穿孔来产生转基因大豆植物。已经描述了原生质体转化的物种的另一些实例，包括大麦(Lazerri,1995)、高粱(Battraw et al.,1991)、玉米(Bhattacharjee et al.,1997)、小麦(He et al.,1994)和番茄(Tsukada,1989)。
磷酸钙。在本公开内容的另一些实施方案中，使用磷酸钙沉淀将核酸引入细胞。已经使用该技术用腺病毒5DNA转染了人KB细胞(Graham和Van Der Eb,1973)。同样以这种方式，用新霉素标志物基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞(Chen和Okayama,1987)，并用多种标志物基因转染了大鼠肝细胞(Rippe et al.,1990)。
DEAE-葡聚糖：在另一个实施方案中，使用DEAE-葡聚糖随后使用聚乙二醇将核酸递送至细胞中。以这种方式，将报道质粒引入到小鼠骨髓瘤和红白血病细胞中(Gopal,1985)。
超声加载。本公开内容的另外一些实施方案包括通过直接声波加载引入核酸。已经通过超声加载用胸苷激酶基因转染LTK-成纤维细胞(Fechheimer et al.,1987)。
脂质体介导的转染。在本公开内容的另一个实施方案中，核酸可包载在脂质复合物(例如脂质体)中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。其在磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排并包载脂双层之间的水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat,1991)。还考虑了与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。
脂质体介导的核酸递送和外来DNA的体外表达是非常成功的(Nicolau和Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987)。还已经证明了培养的鸡胚胎、HeLa和肝癌细胞中外来DNA之脂质体介导的递送和表达的可行性(Wong et al.,1980)。
在本公开内容的某些实施方案中，脂质体可与血凝病毒(hemagglutinatingvirus，HVJ)复合。已显示这有助于与细胞膜融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kanedaet al.,1989)。在另一些实施方案中，脂质体可与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或结合使用(Kato et al.,1991)。在另一些的实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1两者复合或与其结合使用。在另一些实施方案中，递送载剂可包含配体和脂质体。
受体介导的转染。更进一步地，核酸可通过受体介导的递送载剂递送至靶细胞。这些利用大分子的选择摄取，其通过将在靶细胞中发生的受体介导的内吞作用进行。鉴于不同受体的细胞类型特异性分布，该递送方法为本公开内容补充了另一程度的特异性。
某些受体介导的基因靶向的载剂包含细胞受体特异性配体和核酸结合剂。另一些包含已与待递送的核酸有效地连接的细胞受体特异性配体。已经将数种配体用于受体介导的基因转移(Wu和Wu,1987；Wagner et al.,1990；Perales et al.,1994；Myers,EPO0273085)，其确立了该技术的可操作性。已经描述了在另一哺乳动物细胞类型的背景下的特异性递送(Wu和Wu,1993；通过引用并入本文)。在本公开内容的某些方面中，将选择配体以对应于在靶细胞群上特异性表达的受体。
在另一些实施方案中，细胞特异性核酸靶向的载剂的核酸递送载剂组分可包含与脂质体组合的特异性结合配体。待递送的核酸容纳在脂质体内，并且特异性结合配体功能性地并入脂质体膜中。因此，脂质体将与靶细胞的受体特异性结合并将内容物递送至细胞。已经显示这样的系统是功能性使用的系统，其中例如表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)用于受体介导地将核酸递送至表现出EGF受体上调的细胞。
在另一些实施方案中，靶向递送载剂的核酸递送载剂组分可以是脂质体本身，其将优选地包含指导细胞特异性结合的一种或更多种脂质或糖蛋白。例如，乳糖基神经酰胺(一种半乳糖末端脱唾液酸神经节苷脂)，已并入到脂质体中，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取提高(Nicolau et al.,1987)。考虑到本公开内容的组织特异性转化构建体可以以相似的方式特异性地递送到靶细胞中。
11.表达系统
存在许多表达系统，其包含以上所讨论组合物的至少部分或全部。基于原核生物和/或真核生物的系统可用于与本公开内容一起使用以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统是可商购的并且可广泛获得的。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生高水平的异源核酸区段的蛋白表达，例如在美国专利5,871,986和4,879,236中所述，二者均通过引用并入本文，并且其可例如从以名称2.0和从以BacPackTMBaculovirusExpression System购买。
表达系统的另一些实例包括的Complete ControlTM诱导型哺乳动物表达系统，其涉及合成的蜕皮激素诱导型受体，或其pET表达系统，该系统是大肠杆菌(E.coli)表达系统。诱导型表达系统的另一个实例可从获得，其携带T-RexTM(四环素调节的表达)系统，该系统是使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。还提供了称为甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)表达系统的酵母表达系统，其被设计用于在甲基营养型酵母甲醇毕赤酵母中高水平产生重组蛋白。本领域技术人员将知道如何表达载体，例如表达构建体，以产生核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。
原代哺乳动物细胞培养物可以以多种方式制备。为了使细胞在体外并与表达构建体接触时保持活力，必需确保细胞维持与合适比例的氧气和二氧化碳和营养物接触，但要保护其免受微生物污染。细胞培养技术已有充分的文献记载。
前述的一个实施方案涉及使用基因转移使细胞永生化以用于产生蛋白质。可如上所述将目的蛋白质的基因转移到合适的宿主细胞中，随后在合适的条件下培养细胞。实际上，任何多肽的基因都可以以该方式使用。以上讨论了重组表达载体的产生以及其中包含的元件。或者，待产生的蛋白质可以是通常由所讨论细胞合成的内源性蛋白质。
可用的哺乳动物宿主细胞系的一些实例是Vero和HeLa细胞以及中国仓鼠卵巢细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN和MDCK细胞。另外，可选择调节插入序列的表达或以所期望方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。
可使用许多选择系统，包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。同样，抗代谢物抗性可用作选择以下的基础：dhfr，其赋予抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷G418的抗性；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性。
E.纯化
在某些实施方案中，本公开内容的抗体可以是经纯化的。如本文中使用的术语“纯化的”旨在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质被纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。因此，经纯化的蛋白质也指这样的蛋白质，其脱离了其可天然存在的环境。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成该组合物的主要组分，例如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级至多肽级分和非多肽级分。在使多肽与其他蛋白质分离之后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化目的多肽以实现部分纯化或完全纯化(或纯化至均质)。特备适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚集。其他用于蛋白质纯化的方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性进行沉淀，然后进行离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；以及这样的技术与其他技术的组合。
在纯化本公开内容的抗体中，可期望在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可使用与多肽的标记部分结合的亲和柱使多肽从其他细胞组分纯化。如本领域中通常已知的，认为进行各纯化步骤的顺序可改变，或者可省略某些步骤，并且仍然获得适合制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的试剂(即，蛋白A)对完全抗体进行分级。或者，可使用抗原以同时纯化和选择合适的抗体。这样的方法通常使用结合在支持物(例如柱、过滤器或珠)上的选择剂。使抗体与支持物结合，除去(例如，冲洗掉)污染物，并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
根据本公开内容，本领域技术人员将知道多种用于对蛋白质或肽之纯化程度进行定量的方法。这些包括例如确定活性级分的比活性(specific activity)，或者通过SDS/PAGE分析来评估级分中多肽的量。另一种用于评估级分纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，并因此计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于根据纯化而选择的特定测定技术，以及所表达蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
已知多肽的迁移可随着不同的SDS/PAGE条件而改变，有时候显著地改变(Capaldiet al.,1977)。因此，应理解的是，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可改变。
F.单链/单结构域抗体
单链可变片段(scFv)是用短(通常丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起的免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合物。这种嵌合分子也称为单结构域抗体，其虽然去除了恒定区并且引入了接头肽但是保留了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰通常不改变特异性。历史上产生这些分子是为了有利于噬菌体展示，其中将抗原结合结构域表达为单个肽非常方便。或者，可由来源于杂交瘤的亚克隆重链和轻链直接产生scFv。单结构域或单链可变片段缺少存在于完全抗体分子中的恒定Fc区，并且因此缺少用于纯化抗体(包含Fc区的单链抗体)的常见结合位点(例如，蛋白A/G)。这些片段通常可使用蛋白L纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常由促进螺旋和转角的氨基酸残基(例如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸)构成。然而，其他残基也可很好地作用。Tang et al.(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库中快速选择用于单链抗体(scFv)的专用接头的方式。构建随机接头文库，其中用于重链和轻链可变结构域的基因通过编码具有可变组成的18-氨基酸多肽的区段连接。在丝状噬菌体上展示scFv库(约5×106个不同成员)并且用半抗原进行亲和选择。所选择变体的群体表现出结合活性显著提高，但是保留了相当大的序列多样性。随后筛选1054个单独变体产生了以可溶性形式有效产生的催化活性scFv。序列分析揭示，所选择栓链(tether)的仅有的共同特征是：VHC末端之后的两个残基是接头中的保守脯氨酸以及在其他位置处有大量的精氨酸和脯氨酸。
本公开内容的重组抗体还可涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。这样的序列包括来源于IgA的那些，其允许与J链联合形成多聚体。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在另一些实施方案中，可用允许两个抗体组合的试剂(例如生物素/抗生物素蛋白)对链进行修饰。
在一个独立的实施方案中，可通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链来产生单链抗体。通常来说，使轻链和重链在不同细胞中产生，纯化，并且随后以合适的方式连接在一起(即，通过合适的化学桥将重链的N端与轻链的C端连接)。
使用交联试剂形成将两个不同分子的官能团系住的分子桥，例如，稳定和凝结剂。然而，考虑了可产生相同类似物的二聚体或多聚体或者包含不同类似物的异聚复合体。为了以逐步方式连接两个不同化合物，可使用异-双官能交联剂，其消除了不想要的均聚物形成。
一种示例性的异-双官能交联剂包含两个反应性基团：一个与伯胺基(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应并且另一个与硫醇基团(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应基，交联剂可与一个蛋白质(例如，所选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应基，已经系在第一蛋白质上的交联剂与另一蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选的是将使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型含二硫键的接头可成功用于使靶向剂和治疗剂/预防剂缀合。包含在空间上受阻之二硫键的接头可证明在体内提供更高稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。
另一种交联试剂是SMPT，这是一种包含二硫键的双官能交联剂，该二硫键由于邻近的苯环和甲基而在“空间上受阻”。认为二硫键的空间位阻发挥了保护键不被可存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子(例如谷胱甘肽)攻击的功能，并且从而有助于防止缀合物在连接的药剂递送到靶部位之前解偶联。
与许多其他已知的交联试剂一样，SMPT交联试剂也能够使官能团例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)交联。另一种可能的交联剂类型包括含有可切割二硫键的异-双官能光反应性叠氮基苯，例如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3’-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且叠氮基苯(光分解之后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了受阻交联剂，非受阻交联剂也可据此使用。不考虑包含或产生被保护的二硫化物的话，其他可用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak &Thorpe,1987)。这样的交联剂的使用是本领域中非常了解的。另一个实施方案涉及使用柔性接头。
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双官能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了包含在多种温和条件下可切割之不稳定键的可切割缀合物。这种接头特别可用，因为目的药剂可直接与接头键合，并且其切割导致活性剂的释放。特别的用途包括向蛋白质例如抗体或药物添加游离氨基或游离巯基。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白(例如，单链抗体)的肽接头。接头的长度为多至约50个氨基酸；包含带电氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)接着是脯氨酸，出现至少一次；并且以更高的稳定性和聚集降低为特征。美国专利5,880,270公开了可用于多种免疫诊断和分离技术的含氨基氧基接头。
G.经修饰的抗体
1.CAR
人工T细胞受体(也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体、嵌合抗原受体(CAR))是经改造的受体，其可将任意特异性移植到免疫效应细胞上。通常来说，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上，通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。以这种方式，可产生大量的癌症特异性T细胞以用于过继细胞转移。这种方法的I期临床研究显示出效力。
这些分子的最常见形式是来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合，其与CD3-ζ跨膜和内结构域融合。这样的分子导致响应于scFv对其靶标的识别的ζ信号的传递。这样的构建体的一个实例是14g2a-ζ，其是来源于杂交瘤14g2a(识别二唾液酸神经节苷脂GD2)的scFv的融合体。当T细胞表达这种分子(通常通过癌逆转录病毒载体转导实现)时，其识别并杀伤表达GD2的靶细胞(例如神经母细胞瘤细胞)。为了靶向恶性B细胞，研究者使用对B谱系分子CD19具有特异性的嵌合免疫受体重定向了T细胞的特异性。
免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合以形成scFv。该scFv之前是信号肽，以将新生蛋白定向至内质网并随后进行表面表达(这是经切割的)。柔性间隔子允许scFv在不同方向上定向，以使得能够进行抗原结合。跨膜结构域是通常来源于信号传导内结构域的原始分子的典型疏水α螺旋，所述信号传导内结构域突入细胞中并传递所期望的信号。
I型蛋白质实际上是其之间通过跨膜α螺旋连接的两个蛋白质结构域。跨膜结构域通过的细胞膜脂质双层用于将内部部分(内结构域)与外部部分(胞外域)分离。并不出人意料的是，将来自一种蛋白质的胞外域与另一种蛋白质的内结构域连接产生了将前者的识别与后者的信号组合的分子。
胞外域。信号肽将新生蛋白定向至内质网中。如果受体待被糖基化并锚定在细胞膜中，这是必不可少的。任何真核信号肽序列通常均很好地发挥作用。通常，使用与最氨基末端组分天然连接的信号肽(例如，在具有轻链-接头-重链取向的scFv中，使用轻链的天然信号)。
抗原识别结构域通常是scFv。然而，有很多替代物。已描述了来自天然T细胞受体(T-cell receptor，TCR)α和β单链的抗原识别结构域，如具有简单的胞外域(例如识别HIV感染细胞的CD4胞外域)和更独特的识别组分例如连接的细胞因子(其导致识别带有细胞因子受体的细胞)。实际上，几乎以高亲和力结合给定靶标的任何事物均可用作抗原识别区域。
间隔区将抗原结合结构域与跨膜结构域连接。它应有足够柔性以允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原识别。最简单的形式是来自IgG1的铰链区。替代物包括免疫球蛋白的CH2CH3区域和部分CD3。对于大部分基于scFv的构建体，IgG1铰链就足够了。然而，最好的间隔子通常必须凭经验确定。
跨膜结构域。跨膜结构域是跨越膜的疏水α螺旋。通常，使用来自内结构域最靠近膜的组分的跨膜结构域。令人感兴趣的是，使用CD3-ζ跨膜结构域可导致将人工TCR并入到天然TCR中，该因素取决于天然CD3-ζ跨膜带电荷天冬氨酸残基的存在。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。CD28跨膜结构域产生明显表达的稳定受体。
内结构域。这是受体的“行使功能的一端(business-end)”。在抗原识别之后，受体聚集并且信号传递至细胞。最常用的内结构域组分是包含3ITAM的CD3-ζ。这在抗原被结合之后将活化信号传递至T细胞。CD3-ζ可不提供完全有效的活化信号并且需要另外的共刺激信号传导。例如，嵌合CD28和OX40可与CD3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号，或者所有这三种可一起使用。
“第一代”CAR通常具有来自CD3ξ-链的胞内结构域，其是来自内源性TCR的信号的主要传递器。“第二代”CAR将来自多种共刺激蛋白受体(例如CD28、41BB、ICOS)的胞内信号传导结构域添加至CAR的胞质尾以为T细胞提供另外的信号。临床前研究表明，第二代CAR设计提高了T细胞的抗肿瘤活性。最近，“第三代”CAR组合了多种信号传导结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以进一步增强效力。
表达嵌合抗原受体的T细胞的过继转移是有希望的抗癌治疗，因为可将经CAR修饰的T细胞改造以靶向几乎任何肿瘤相关抗原。这种方法有大的潜力以深刻的方式改善患者特异性癌症治疗。在收集患者的T细胞之后，将细胞进行遗传改造以表达特别地针对患者肿瘤细胞上的抗原的CAR，随后输回患者中。尽管经CAR修饰的T细胞的过继转移是独特且有希望的癌症治疗，但存在重大的安全问题。这种治疗的临床试验揭示，当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶抗原时，这些CAR的潜在毒性作用导致与移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)类似的结局。该问题的一个潜在解决方案是将自杀基因改造到经修饰的T细胞中。以这种方式，设计以在GVHD期间活化自杀基因的前药的施用会触发自杀基因活化的CAR T细胞中的凋亡。该方法已安全且有效地用于造血干细胞移植(hematopoieticstem cell transplantation，HSCT)。将自杀基因治疗应用于经CAR修饰的T细胞过继细胞转移的临床应用有可能减轻GVHD，同时改善整体抗肿瘤效力。
2.ADC
抗体药物缀合物或ADC是被设计为治疗患有癌症的人的靶向治疗的新类别高度强效生物药物。ADC是由通过具有不稳定键的稳定化学接头与生物活性细胞毒性(抗癌)有效负荷或药物连接的抗体(完整的mAb或抗体片段，例如单链可变片段或scFv)构成的复合分子。抗体药物缀合物是生物缀合物和免疫缀合物的实例。
通过将单克隆抗体独特的靶向能力与细胞毒性药物的癌症杀伤能力相结合，抗体-药物缀合物允许灵敏地区分健康组织和患病组织。这意味着，与传统的化学治疗剂形成对照，抗体-药物缀合物靶向并攻击癌细胞，因此健康细胞受到的影响没那么严重。
在基于ADC的抗肿瘤治疗的开发中，将抗癌药物(例如细胞毒素(cell toxin)或细胞毒素(cytotoxin))与特异性靶向某些肿瘤标志物(例如，理想地仅在受感染细胞中或肿瘤细胞上发现的蛋白质；在本案例中为MUC1)的抗体偶联。抗体在体内追踪这些蛋白质并将其自身附着于癌细胞表面。抗体与靶蛋白(抗原)之间的生化反应触发肿瘤细胞中的信号，肿瘤细胞然后吸收或内化抗体以及细胞毒素。在ADC内化之后，细胞毒性药物被释放并杀伤癌症。由于这种靶向，与其他化学治疗剂相比，理想地该药物具有更低的副作用并给予更宽的治疗窗。
抗体与细胞毒性(抗癌)剂之间的稳定连接是ADC的一个关键方面。接头基于包括二硫化物、腙或肽(可切割)或硫醚(不可切割)的化学基序，并控制细胞毒性剂的分布和向靶细胞的递送。在临床前和临床试验中，已证明可切割和不可切割类型的接头是安全的。本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)包含将强效且高毒性的抗微管剂，合成的抗肿瘤剂单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E)或MMAE，递送至人特异性CD30阳性恶性细胞的酶敏感的可切割接头。MMAE由于其高毒性(其通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂)，因此不能用作单一药剂化学治疗药物。然而，与抗CD30单克隆抗体(cAC10，肿瘤坏死因子或TNF受体的一种细胞膜蛋白)连接的MMAE的组合被证明在胞外流体中是稳定的，可被组织蛋白酶裂解，并且用于治疗是安全的。曲妥珠单抗美坦新(Trastuzumab emtansine)作为另一种批准的ADC，是微管形成抑制剂美登素(DM-1)(美登素的衍生物)与抗体曲妥珠单抗(/Genentech/Roche)通过稳定的、不可切割的接头连接的组合。
更好和更稳定的接头的可用性已改变了化学键的功能。接头的类型(可切割的或不可切割的)为细胞毒性(抗癌)药物提供了特定的特性。例如，不可切割的接头将药物保留在细胞内。作为结果，整个抗体、接头和细胞毒性剂进入靶癌细胞，在那里抗体被降解至氨基酸水平。所得的复合体(氨基酸、接头和细胞毒性(抗癌)剂)现成为活性药物。相反，可切割的接头被癌细胞中的酶催化，在那里释放细胞毒性剂。不同之处在于，通过可切割接头递送的细胞毒性有效载荷可以从靶细胞中逃逸，并在称为“旁观者杀伤”的过程中攻击邻近的癌细胞。
目前在开发中的另一种类型的可切割接头在细胞毒性药物药物与裂解位点之间添加了额外的分子。该接头技术允许研究人员创建具有更高灵活性的ADC，而不必担心改变裂解动力学。研究人员还在开发基于Edman降解的肽裂解的新方法，该方法是对肽中的氨基酸进行测序的方法。ADC开发的未来方向还包括位点特异性缀合(TDC)的开发，以进一步改善稳定性和治疗指数以及发射α的免疫缀合物和抗体缀合的纳米粒。
3.BiTE
双特异性T细胞接合物(Bi-specific T-cell engager，BiTE)是一类人工双特异性单克隆抗体，已被研究用作抗癌药物。其指导宿主的免疫系统，更具体地T细胞的细胞毒性活性，来针对癌细胞。BiTE是Micromet AG的注册商标。
BiTE是融合蛋白，其由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)或者来自约55千道尔顿的单条肽链上的四个不同基因的氨基酸序列组成。scFv中的一个通过CD3受体与T细胞结合，另一个通过肿瘤特异性分子(在本案例中为MUC1)与癌细胞结合。
与其他双特异性抗体一样，与普通的单克隆抗体不同，BiTE在T细胞和肿瘤细胞之间形成连接。这导致T细胞独立于MHC I或共刺激分子的存在，通过产生例如穿孔素和颗粒酶的蛋白质对肿瘤细胞发挥细胞毒性活性。这些蛋白质进入肿瘤细胞并引发细胞凋亡。该作用模仿了在T细胞攻击肿瘤细胞期间观察到的生理过程。
截至2010年7月，处于临床试验中的BiTE包括针对B细胞上表达的表面分子CD19的用于治疗非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)和急性淋巴细胞性白血病的博纳吐单抗(Blinatumomab)(MT103)和针对EpCAM抗原的用于治疗胃肠癌和肺癌的MT110。
利用相同的技术，可以靶向黑素瘤(具有MCSP特异性BiTE)和急性髓细胞性白血病(具有CD33特异性BiTE)。在该方面的研究目前正在进行。新型抗癌治疗的另一个途径是使用BiTE方法重新设计一些目前使用的常规抗体，如曲妥珠单抗(靶向HER2/neu)、西妥昔单抗和帕尼单抗(二者均靶向EGF受体)。针对CD66e和EphA2的BiTE也正在进行开发。
4.ADCC
治疗性抗体已经以不同的方式(例如抗体-药物缀合物(antibody-drugconjugate，ADC)，诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC))用于恶性肿瘤的治疗。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞介导的免疫防御机制，由此免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞，该靶细胞的膜表面抗原已经被特异性抗体结合。
在过去的数十年中，ADCC被认为是治疗性抗癌抗体的潜在临床效力的关键机制之一。这是关键的效应机制，针对癌细胞上细胞表面靶标的治疗性抗体通过这种机制发挥其临床作用。该过程通过IgG与免疫系统效应细胞(包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞)上的Fc受体结合来介导。IgG的Fc与FCRI、FcRII和主要的FcRIIIa结合。
IgG的Fc区在每个CH2结构域中的Asn-297处具有保守的糖基化位点。在该位点处表达的N-连接寡糖对IgG的效应子功能有显著影响。关于糖工程化抗体的临床应用，从IgG-Fc的N-聚糖中去除核心岩藻糖残基通过改善IgG与FcR受体IIIa(FcRIIIa)的结合导致了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的显著增强(>50倍)(Yamane-Ohnuki et al.,2004；Iida etal.,2009)。数项研究表明，岩藻糖残基的存在可导致ADCC效率的严重降低。数个学术团体和制药公司目前正致力于开发能够产生脱糖基化mAb的新细胞系，例如缺失了编码酶a-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因的CHO细胞系，或过表达重组b-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III的CHO细胞系，从而产生富含二等分和非岩藻糖基化寡糖的抗体。
III.药物制剂和疾病的治疗
A.癌症
癌症由来自组织的细胞的克隆群的外生长所致。癌症的发生(称为致癌作用)可以以多种方式进行建模和表征。早已认识到癌症的发生与炎症之间的关联。炎性应答涉及宿主针对微生物感染的防御，并且还驱动组织修复和再生。相当多的证据表明炎症与癌症发生风险之间存在联系，即，慢性炎症可导致发育异常。
可应用本公开内容的方法的癌细胞一般地包括表达MUC1并且更特别地过表达MUC1的任何细胞。合适的癌细胞可以是乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症(例如，白血病或淋巴瘤)、神经组织癌症、黑素瘤、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌或膀胱癌的细胞。另外，本公开内容的方法可应用于多种物种，例如人、非人灵长类(例如猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。癌症还可以是复发性的、转移性的和/或多重抗药性的，并且本公开内容的方法可特别地应用于这样的癌症以使其可切除、延长或重新诱导缓解、抑制血管生成、预防或限制转移，和/或治疗多重抗药性癌症。在细胞水平上，这可转化为杀伤癌细胞、抑制癌细胞生长或以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型。
B.炎性疾病状态和病症
MUC1在除癌症之外的疾病状态中的作用已经被很好地确定。最近，Kufe et al.(2020)报告了MUC1在结肠炎和结直肠癌进展中的作用(JCI Insight,5(12):137112)，而Alimova et al.(2020)报告了MUC1在SARS-CoV-2感染和肺损伤中的作用(doi:10.1101/2020.06.30.180380)。以下是对炎性潜在疾病状态和病症的一般性讨论，其中可以使用本文中所述的抗体及其片段。
1.脓毒症
脓毒症是一种以感染引起的全身炎性状态为特征的严重医学疾病。传统上，术语脓毒症与败血病(septicaemia)和败血症(septicemia)(“血液中毒”)可互换使用。然而，这些术语不再被视为同义词；败血症被认为是脓毒症的子集。
脓毒症的症状通常与潜在的感染过程有关。当感染过渡到脓毒症时，所产生的症状是全身炎性反应综合征(SIRS)的症状：一般炎症、发烧、升高的白细胞计数(白细胞增多症)以及升高的心率(心动过速)和呼吸频率(呼吸急促)。其次，症状还包括流感，如发冷。
导致脓毒症的免疫学应答是引起炎症和凝血途径之广泛激活的全身性炎性应答。这可能会发展为循环系统的功能障碍，即使在最佳治疗下，也可能导致多器官功能障碍综合征并最终死亡。
如果高度怀疑或证实感染并且满足以下全身性炎性反应综合征(SIRS)标准中的两项或更多项，则认为存在败血症：
心率>每分钟90次
体温<36℃(96.8℉)或>38℃(100.4℉)
换气过度(高呼吸率)>每分钟20次呼吸，或在血液气体方面，PaCO2低于32mm Hg
白血细胞<4000个细胞/mm3或>12000个细胞/mm3(<4×109或>12×109细胞/升)，或大于10％的带型(未成熟白血细胞)。
然而，共识定义随着脓毒症的体征和症状列表的最新扩展而继续演变，以反映临床床边经验。
脓毒症的更关键子集是严重脓毒症(具有急性器官功能障碍的脓毒症)和脓毒性休克(具有难治性动脉低血压的脓毒症)。或者，当满足两种或更多种全身炎性反应综合征标准而没有感染证据时，患者可简单地被诊断具有“SIRS”。患有SIRS和急性器官功能障碍的患者可称为“严重SIRS”。
如果患者具有脓毒症加全身低灌注的体征，任一末端器官功能障碍或大于4mmol/dL的血清乳酸，则其将被定义为具有“严重脓毒症”。如果患者在适当的流体推注(通常为20ml/kg的crystaloid)后具有脓毒症加低血压，则其将被定义为患有脓毒性休克。诊断成人具有脓毒症的标准不适用于一个月以下的婴儿。在婴儿中，诊断只需要存在感染以及符合对于感染的全身性应答的体征和症状的“群(constellation)”。
脓毒症的治疗依赖于抗生素、经感染流体收集的手术引流、流体替换和对器官功能障碍的适当支持。这可能包括肾衰竭中的血液透析，肺功能障碍中的机械通气，血液制品的输液，以及用于循环衰竭的药物和流体治疗。如果需要，通过肠胃外营养确保足够的营养在长时间的疾病中是重要的。
脓毒症患者适当管理的一个问题是脓毒症被认定后施用治疗的延迟。公开的研究表明，对于施用适当的抗生素治疗中每1小时的延迟，死亡率响应地上升了7％。建立了一个大的国际合作来教育人们关于脓毒症和改善脓毒症的患者结果，题为“拯救脓毒症运动”。该运动已经出版了用于严重脓毒症的管理策略之基于证据的综述，目标是在随后数年中出版一整套指南。
针对炎性过程本身的大多数治疗未能改善结果，然而已表明屈曲可净α(drotrecogin alfa)(活化的蛋白C，凝血因子之一)将严重脓毒症中的死亡率从约31％降低至约25％。要符合屈曲可净α的资格，患者必须有严重脓毒症或脓毒性休克，APACHE II评分为25或更高并且具有较低出血风险。低剂量氢化可的松治疗显示出对于通过ACTH刺激测试定义的相对肾上腺功能不全的败血性休克患者的希望。
具有怀疑的脓毒症的婴儿的标准治疗由支持性护理，用静脉内流体维持流体状态，以及β-内酰胺抗生素(例如氨苄青霉素)与氨基糖苷(例如庆大霉素)的组合组成。
2.创伤
物理创伤是一种严重的身体改变的身体损伤，例如肢体的移除。钝力创伤是一种由或用钝性物体施加的冲击力或其他力造成物理创伤，而穿透性创伤是其中皮肤或组织被物体刺穿的一种物理创伤。创伤也可以描述为计划外的(例如事故)或者计划的(在手术的情况下)两者。两者的特征都可以为轻度至严重的组织损伤、失血和/或休克，并且两者都可能导致随后的感染，包括脓毒症。本发明提供了创伤的治疗，包括预治疗(在医学程序的情况下)以及在创伤损伤发生后的治疗。
手术。手术在患者上使用手术的手工和仪器技术以研究和/或治疗病理状态，例如疾病或损伤，从而帮助改善身体功能或外观，或有时候用于一些其他原因。本发明可以解决手术造成的创伤，如下文进一步定义的。
一般来说，当涉及切割患者的组织或封闭以前持续的伤口时，程序被认为是手术。不一定列入该标题的其他程序，例如血管成形术或内窥镜检查，如果涉及常见的手术程序或设备，例如使用无菌环境、麻醉、防腐条件、典型手术仪器以及缝合或包扎，则可以认为它们是手术。所有形式的手术被认为是侵入性程序；所谓的非侵入性手术通常是指不穿透被处理结构的切除(例如，角膜的激光消融)或放射手术程序(例如肿瘤的辐照)。手术可以持续数分钟到数小时。
手术程序通常通过紧急性、程序类型、所涉及的身体系统、侵入程度和专用仪器分类。进行选择性手术是为了纠正非危及生命的病症，并按照患者的要求，根据外科医生和手术设施的可用性进行。紧急手术是这样的手术，其必须立即进行以挽救生命、肢体或功能。进行探查性手术以辅助或确认诊断。治疗性手术治疗之前诊断的病症。
截肢包括切断身体部位，通常是肢体或指/趾。再植包括重新接上被切断的身体部位。重建手术包括重建身体的受伤、残缺或变形的部位。进行整容手术以改善其他正常结构的外观。切除是切除患者的器官、组织或其他身体部位。移植手术是通过向患者中插入来自不同的人(或动物)的另一个器官或身体部位来替换器官或身体部位。从活的人或动物中移出器官或身体部位用于移植也是一种手术类型。
当在一个器官系统或结构上进行手术时，其可以由所涉及的器官、器官系统或组织分类。实例包括心脏手术(在心脏上进行)、消化道手术(在消化道及其辅助器官内进行)和矫形手术(在骨骼和/或肌肉上进行)。
微创手术涉及较小的外切口以将小型化仪器插入体腔或结构内，如腹腔镜手术或血管成形术。相比之下，开放性手术程序需要大切口以接近目的区域。激光手术涉及使用激光切割组织而不是手术刀或类似的手术仪器。显微手术涉及外科医生使用手术显微镜查看小结构。机器人手术使用手术机器人如Da Vinci或Zeus手术系统来在外科医生的指导下控制仪器。
创伤性出血。创伤性出血占多种国际损伤影响的中的大多数，造成很大一部分死亡并且在伤员中产生极大的发病率。尽管在院前护理方面存在差异，但创伤性出血的急性控制在世界各地都是类似的，并根据公认的公开指南。严重受伤的患者的护理以四个经常重叠的部分出现：复苏、手术和危急护理阶段。在创伤护理的所有阶段期间，出血的诊断和控制应该是高度优先的，并且其在出血性休克的患者中尤其重要。出血控制的早期尝试包括用直接压力、压力敷料或止血带直接控制严重出血的可见来源；使长骨和骨盆骨折稳定；并保持病患者的温暖。在复苏阶段期间，提供加热的静脉内流体，手术控制出血之前的低血压复苏，以及血液和血液制品的适当输液。在手术阶段中，提供出血和其他任何损伤的手术控制，以及额外的输液。最后，危急护理阶段提供术后支持和组织灌注。
3.急性胰腺炎
急性胰腺炎是快速发作的胰腺炎症。根据其严重程度，尽管进行治疗，其仍可具有严重的并发症和高死亡率。虽然轻度病例经常用保守措施或腹腔镜检查成功治疗，但严重的病例需要进行侵入性手术(通常是多于一次干预)来控制疾病进程。
4.急性呼吸窘迫综合征
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)也称为呼吸窘迫综合征(RDS)或成人呼吸窘迫综合征(相比于IRDS)，是对多种形式的肺损伤的严重反应。这是导致肺水肿渗透性增加的最重要的疾病。
ARDS是由多种直接和间接损伤引起的严重肺部疾病。其特征在于肺实质的炎症，导致气体交换受损，并伴随炎性介质的全身释放，从而造成炎症、低氧血症并经常导致多器官功能衰竭。这种病症是危及生命的，通常是致命的，通常需要机械通气并进入重症监护病房。较不严重的形式称为急性肺损伤(ALI)。
ARDS可在急性疾病损伤或发作的24至48小时内发生。在这种情况下，患者通常出现呼吸短促，呼吸急促，以及与根本原因相关的症状，即休克。长期的疾病(例如疟疾)也可能引起所述疾病。然后，ARDS可能在特定急性感染病例发作之后的某一时刻发生。
动脉血气分析和胸部X射线允许使用上述标准通过推理进行正式诊断。虽然通常包括严重的低氧血症，但是从来没有系统地研究定义异常PaO2的适当阈值。应排除肺水肿的任何心源性原因。这可以通过放置肺动脉导管来测量肺动脉楔压来进行。然而，这并不是必需的，并且现在很少这么做，因为已经出现了丰富的证据表明使用肺动脉导管不能在包括ARDS在内的重症疾病中产生改善的患者结果。在大多数情况下，简单的胸部X射线足以记录双侧肺泡浸润。虽然CT扫描产生ARDS中肺实质更准确的图像，但在ARDS患者的临床管理中几乎没有效用，并且在很大程度上仍然是一种研究工具。
急性呼吸窘迫综合征通常在重症监护室中使用机械通气治疗。每当长时间通气(≥2周)被认为是不可避免时，通常通过口腔气管插管或气管造口术递送通气。非侵入性通气的可能性限于疾病的非常早期阶段，或者更好地预防具有发生疾病(非典型肺炎、肺挫伤、大手术患者)的风险的个体。根本原因的治疗是必要的，因为其倾向于维持ARDS情景。一旦获得微生物培养结果，必须施用适当的抗生素治疗。如果局部微生物监督有效，则经验疗法可能是适当的。超过60％的ARDS患者在肺损伤发生之前或之后经历(医院)肺部感染。当可手术治疗时，必须在感染的来源上进行手术。当诊断为脓毒症时，应制定适当的局部方案。
5.缺血-再灌注损伤
再灌注损伤是指在缺血一段时间后血液供应返回到组织时引起的对组织的损伤。缺乏来自血液的氧气和营养物产生一种状况，其中循环的恢复通过诱导氧化应激导致炎症和氧化损伤，而不是恢复正常功能。
再灌注损伤的损伤部分由于受损组织的炎性应答。通过新返回的血液携带到该区域的白细胞释放许多炎性因子，例如白介素以及响应于组织损伤的自由基。恢复的血流在细胞内再次引入氧，其破坏细胞蛋白质、DNA和质膜。细胞膜的损伤可继而导致释放更多的自由基。这种反应性物质也可间接作用于氧化还原信号转导以开启凋亡。白细胞也可能在小毛细血管中积聚，从而阻塞它们并导致更多的缺血。
再灌注损伤在脑缺血性级联中起作用，其涉及卒中和脑创伤。缺血和再灌注损伤的反复发作也被认为是导致慢性伤口(如压疮和糖尿病足溃疡)形成和不能愈合的因素。持续压力限制血液供应并引起缺血，并且在再灌注期间发生炎症。因为这个过程重复，其最终损伤组织足以造成伤口。
在长时间缺血(60分钟或更久)中，形成作为ATP代谢的分解产物的次黄嘌呤。由于氧气的较高可用性，酶黄嘌呤脱氢酶被转化为黄嘌呤氧化酶。这种氧化导致分子氧转化为高反应性超氧化物和羟基自由基。黄嘌呤氧化酶还产生尿酸，其可以充当促氧化剂(prooxidant)以及充当反应性物质如过氧化亚硝酸盐(peroxinitrite)的清除剂两者。在再灌注期间产生的过量一氧化氮与超氧化物反应以产生强反应性物质过氧化亚硝酸盐。这种自由基和活性氧物质攻击细胞膜脂质、蛋白质和糖胺聚糖，造成进一步的损害。它们还可以通过氧化还原信号转导起始特定生物过程。
6.心血管疾病
心血管疾病是指涉及心脏或血管(动脉和静脉)的疾病类型。虽然所述术语在技术上是指影响心血管系统的任何疾病，但通常用于指与动脉粥样硬化(动脉疾病)相关的疾病。这些病症具有类似的原因、机制和治疗。心血管疾病的治疗取决于每位患者的疾病的具体形式，但有效的治疗总是包括上述讨论的预防性生活方式改变。药物，如减血压药物阿司匹林和他汀类降胆固醇药物可能是有帮助的。在一些情况下，可能需要手术或血管成形术以重新开启、修复或更换损伤的血管。
大多数西方国家具有高的和增加的心血管疾病发病率。每年，与癌症相比，心脏病导致更多的美国人死亡。单独心脏疾病造成所有死亡的30％，其他心血管系统疾病实质上造成进一步的死亡和残疾。直到2005年，其为美国和大多数欧洲国家死亡和残疾的首要原因。大组织学研究(PDAY)显示血管损伤从青春期积累，使得初级预防努力需要从童年开始。
一些生物标志物被认为提供了更详细的心血管疾病风险。然而，这些生物标志物的临床价值是可疑的。目前，可反映心血管疾病较高风险的生物标志物包括：
较高的纤维蛋白原和PAI-1血液浓度
升高的半胱氨酸，或甚至高于正常水平一半
血液水平升高的不对称二甲基精氨酸
如通过C-反应蛋白测量的高炎症
血液水平升高的B型钠尿肽(BNP)
多种形式的心血管疾病包括动脉瘤、绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、脑血管病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、瓣膜疾病、冠状动脉疾病、扩张型心肌病、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(高血压病)、肥厚型心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗死和静脉血栓栓塞。
7.自身免疫性/炎症性疾病
本发明考虑多种自身免疫性和/或炎性疾病状态的治疗，例如脊柱关节病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、反应性关节炎、肠病性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激病、炎性肠病、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、家族性地中海热、肌萎缩性侧索硬化、舍格伦综合征、早期关节炎、病毒性关节炎、多发性硬化、特发性肺纤维化或银屑病。这些疾病的诊断和治疗在文献中有详细记载。
8.化学治疗、放射治疗和细胞因子治疗毒性
多种形式的癌症治疗，包括化学治疗、放射和细胞因子，都与癌症患者中的毒性相关，有时是严重的。在毒性至少部分地由组蛋白的胞外作用引起的情况下，本发明寻求使用本发明的药物组合物来降低该毒性，从而减少或减轻患者部分的不适，以及允许更高剂量的治疗。
9.烧伤
在医学上，烧伤可能是由热、冷、电、化学物质、摩擦或辐射引起的损伤。一度烧伤通常限于发红(红斑)、白斑和损伤部位的轻微疼痛。这些烧伤通常仅延伸到表皮。二度级伤额外充满清澈流体，具有皮肤浅表起泡，并且根据神经涉及程度可能包括或多或少地疼痛。二度烧伤涉及浅表(乳头状)真皮，也可能涉及深(网状)真皮层。三度烧伤额外具有皮肤烧焦，并产生硬的皮革样的焦痂。焦痂是与身体未受影响的部位分离的痂。通常，也有紫色流体。这些类型的烧伤通常是无痛的，因为在烧伤区域中的神经末梢已被破坏。严重烧伤，特别是如果其覆盖身体的大部分区域，可能导致死亡；对肺部的任何一丝烧伤损伤(例如通过吸入烟雾)都是医疗紧急情况。
损伤皮肤下面的组织(如肌肉或骨骼)的烧伤有时被分类为四度烧伤。这些烧伤分为三个额外的度：四度烧伤导致皮肤不可挽回地丧失，五度烧伤导致肌肉不可挽回地丧失，而六度烧伤导致骨骼被烧焦。
“浅表厚度”、“部分厚度”(分为浅表和深类)和“全厚度”的更新分类更为精确地涉及皮肤的表皮层、真皮层和皮下层，用于指导治疗和预测结果。
化学烧伤通常由化学化合物引起，如氢氧化钠(碱液)、硝酸银和更严重的化合物(如硫酸)。可能导致中度至重度化学烧伤的大多数化学物质(但不是全部)是强酸或碱。硝酸作为氧化剂，可能是引起最严重烧伤的化学物质之一。氢氟酸可以向下腐蚀至骨，其烧伤通常不会立即显现。大多数可能导致中度至重度化学烧伤的化学物质被称为苛性的。
电烧伤通常是电击、被雷电击中、去纤颤或心脏复律而没有导电凝胶等的症状。持续的内部损伤可能与所见到的“烧伤”的大小不成比例，因为这些只是电流的入口和出口伤口。
根据总体表面积(TBSA)评估烧伤，其为受部分厚度或全厚度烧伤(浅表厚度烧伤不计入)影响的百分比。九条规则被用作估计受影响的TBSA的快速有用的方法。管理烧伤人的第一步是停止燃烧过程。对于干粉烧伤，应首先清除掉粉末。对于其他烧伤，应当用大量清水冲洗受影响的区域，以除去异物，并有助于停止燃烧过程。冷水不应应用于具有大量烧伤的任何人，因为这可能会严重危及烧伤受害者的温度状态。在这个管理阶段，评估气道状态也至关重要。如果患者卷入了火灾，则必须假定他或她已持续吸入伤害，直到证明另外情况，并且应当相应地管理治疗。
一旦燃烧过程停止，并确保了气道状态，应根据Parkland公式对患者进行体积复苏。该公式表示，在受伤后的前二十四小时内递送的乳酸林格氏溶液的量是：
流体＝4cc x％TBSA x重量(以kg计)
％TBSA不包括任何一度烧伤
一半的这种流体应在受伤后的前8小时内给予，其余的在随后的16小时内给予。该公式仅仅是指南，输液必须适应尿液输出和中枢静脉压。流体复苏不足导致肾衰竭和死亡。全厚度烧伤的严重水肿可以通过焦痂切开术治疗。
C.感染性疾病
另一类炎性疾病是感染，包括病毒、细菌、真菌和病原体。已证明MUC1在其中起作用的特定感染性疾病是SARS-CoV-2、人乳头瘤病毒和幽门螺杆菌感染。
D.制剂和施用
本公开内容提供了包含抗MUC1-C抗体的药物组合物。在一个具体实施方案中，术语“可药用”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物并且更特别地用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。另一些合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、盐水、右旋糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
所述组合物可以配制为中性或盐形式。可药用盐包括与阴离子形成的那些，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；以及与阳离子形成的那些，所述阳离子例如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
本公开内容的抗体可包括经典药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用将通过任何常见途径进行，只要靶组织通过该途径可及即可。这包括经口、经鼻、含服、经直肠、经阴道或表面。或者，施用可通过皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射来进行。这样的组合物通常作为上述的可药用组合物施用。特别感兴趣的是直接瘤内施用、肿瘤输注或者局部或区域性施用到肿瘤，例如在局部或区域性脉管系统或淋巴系统中，或者在切除的肿瘤床中。
活性化合物还可经肠胃外或腹膜内施用。作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
E.组合癌症治疗
在本公开内容的上下文中，还考虑本文中所述的抗MUC1-C抗体可类似地与化学或放射治疗干预或其他治疗联合使用。特别地，将抗MUC1-C/ECD抗体与靶向MUC1功能不同方面的其他治疗(例如靶向MUC1胞质结构域的肽和小分子)进行组合也可证明是有效的。
为了使用本公开内容的方法和组合物来杀伤细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管生成或以其他方式逆转或降低肿瘤细胞的恶性表型，通常将使“靶”细胞与根据本公开内容的抗MUC1-C抗体和至少一种其他药剂接触。这些组合物将以有效杀伤或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可包括使细胞与根据本公开内容的抗MUC1-C抗体和另外药剂或因子同时接触。这可通过使细胞与包含这两种药剂的单一组合物或药理制剂接触来实现，或者通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含根据本公开内容的抗MUC1-C抗体并且另一种包含其他药剂。
或者，抗MUC1-C抗体治疗可在另外药剂治疗之前或之后，间隔数分钟至数周进行。在另外药剂和抗MUC1抗体单独施加于细胞的一些实施方案中，通常应确保每次递送的时间之间不超过很长时间，使得药剂和表达构建体仍能够对细胞发挥有利组合作用。在这种情况下，考虑在彼此约12至24小时内使细胞与这两种形式接触，并且更优选地在彼此约6至12小时内，并且延迟时间为仅约12小时是最优选的。在一些情况下，可期望显著延长治疗时间段，然而，在各施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
还可考虑期望将抗MUC1抗体或另外药剂施用多于一次。如下所示，可使用多种组合，其中根据本公开内容的抗MUC1-C抗体的治疗是“A”，另外治疗是“B”：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
考虑其他组合。再次，为了实现细胞杀伤，将这两种药剂以有效杀伤细胞的组合量递送至细胞。
适合于癌症治疗的药剂或因素包括在向细胞施加时诱导DNA损伤的任何化学化合物或治疗方法。这样的药剂和因素包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如辐照、微波、电子发射等。可使用多种化学化合物，其也描述为“化学治疗剂”或“遗传毒性剂”。这可通过对局部肿瘤部位进行辐照来实现；或者，可通过向对象施用治疗有效量的药物组合物来使肿瘤细胞与药剂接触。
考虑将多个种类的化学治疗剂与本公开内容一起使用。例如，选择性雌激素受体拮抗剂(selective estrogen receptor antagonist，“SERM”)，例如他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬(Afimoxfene)、氟维司群(Falsodex)、雷洛昔芬(Raloxifene)、巴多昔芬(Bazedoxifene)、氯米芬(Clomifene)、Femarelle、拉索昔芬(Lasofoxifene)、奥美昔芬(Ormeloxifene)和托瑞米芬(Toremifene)。
考虑将使用的化学治疗剂包括例如喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C。本公开内容还涵盖使用一种或更多种DNA损伤剂(无论是基于辐射还是真实的化合物)的组合，例如使用X射线与顺铂或使用顺铂与依托泊苷。如上所述，所述药剂可通过将其与MUC1肽组合来制备并用作组合的治疗性组合物或试剂盒。
热休克蛋白90是发现于许多真核细胞中的调节蛋白。已经表明HSP90抑制剂可用于治疗癌症。这样的抑制剂包括格尔德霉素(Geldanamycin)、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、PU-H71和利福布汀(Rifabutin)。
还设想了直接交联DNA或形成加合物的药剂。可使用药剂(例如顺铂)和其他DNA烷化剂。顺铂已被广泛用于治疗癌症，临床应用中使用的有效剂量为每三周20mg/m2 5天，总共三个疗程。顺铂经口不吸收，并去因此必须通过静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。
损伤DNA的药剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这样的化学治疗化合物包括阿霉素(adriamycin)(也称为多柔比星(doxorubicin))、依托泊苷、维拉帕米(verapamil)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)等。在用于治疗赘生物的临床环境中广泛使用时，这些化合物通过静脉内推注注射(bolus injection)施用，剂量对于多柔比星为每隔21天25至75mg/m2，对于依托泊苷为静脉内35至50mg/m2或者经口给药为静脉内的2倍。还预期了微管抑制剂，例如紫杉烷。这些分子是由红豆杉(Taxus)属植物产生的二萜，并且包含紫杉醇和多西他赛。
表皮生长因子受体抑制剂，例如易瑞沙(Iressa)，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR，也称为FK506结合蛋白12-雷帕霉素相关蛋白1(FK506-binding protein 12-rapamycinassociated protein 1，FRAP1)，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动性、细胞存活、蛋白质合成和转录。因此，根据本公开内容，考虑将雷帕霉素及其类似物(rapalogs)用于癌症治疗。
另一种可能的治疗是TNF-α(肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha))，其是参与全身炎症的细胞因子并且是刺激急性期反应的一组细胞因子的成员。TNF的主要作用是调节免疫细胞。TNF还能够诱导凋亡细胞死亡，诱导炎症以及抑制肿瘤发生和病毒复制。
破坏核酸前体和亚单位的合成和保真度的药剂也导致DNA损伤。因此，已经开发了许多核酸前体。特别有用的是经历广泛测试并且容易获得的药剂。因此，药剂(如5-氟尿嘧啶(5-FU))优先被赘生性组织所使用，使得这种药剂特别可用于靶向赘生性细胞。尽管具有非常大的毒性，5-FU可适用于多种载体中(包括表面)，但是常用的是以3至15mg/kg/天的剂量静脉内施用。
造成DNA损伤并且已经广泛使用的其他因素包括通常已知的γ-射线、x-射线和/或直接向肿瘤细胞递送放射性同位素。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波和UV辐照。最可能的是所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛的损伤。x射线的剂量范围为从50至200伦琴的每日剂量持续延长的一段时间(3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射的放射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
另外，还考虑可使用免疫治疗、激素治疗、毒素治疗和手术。特别地，可使用靶向治疗，例如阿瓦斯汀(Avastin)、爱必妥(Erbitux)、格列卫(Gleevec)、赫赛汀(Herceptin)和利妥昔单抗(Rituxan)。
组合治疗的一个特别有利的方法是选择靶向MUC1的第二药剂。在本发明人提交的共同待审的申请中，公开了在对象中抑制MUC1阳性肿瘤细胞的方法，该方法包括向所述对象施用至少4个连续MUC1残基且不超过20个连续MUC1残基并且包含序列CQC的MUC1肽，其中CQC的氨基末端半胱氨酸在其NH2端被不需要对应于天然MUC-1跨膜序列的至少一个氨基酸残基覆盖，所述肽可包含至少5个连续的MUC1残基、至少6个连续的MUC1残基、至少7个连续的MUC1残基、至少8个连续的MUC1残基，并且所述序列可更具体地包含CQCR(SEQ ID NO:31)、CQCRR(SEQ ID NO:32)、CQCRRR(SEQ ID NO:33)、CQCRRRR(SEQ ID NO:34)、CQCRRK(SEQID NO:35)、CQCRRKN(SEQ ID NO:36)或RRRRRRRRRCQCRRKN(SEQ ID NO:37)。该肽可含有MUC1的不超过10个连续残基、11个连续残基、12个连续残基、13个连续残基、14个连续残基、15个连续残基、16个连续残基、17个连续残基、18个连续残基或19个连续残基。该肽可以与细胞递送结构域融合，例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K。该肽可以包含所有L氨基酸、所有D氨基酸或L和D氨基酸的混合物。参见美国专利No.8,524,669。
在美国专利申请序列No.13/026,858中描述了该技术的变体。在该申请中，公开了抑制MUC1阳性癌细胞的方法，其包括使细胞与至少4个连续MUC1残基且不超过20个连续MUC1残基并且包含序列CQC的MUC1肽接触，其中(i)CQC的氨基末端半胱氨酸在其NH2末端被不需要对应于天然MUC1跨膜序列的至少一个氨基酸残基覆盖；以及(ii)除了对应于天然MUC1残基的那些带正电荷的氨基酸残基之外，该肽还包含3至5个连续的带正电荷的氨基酸残基。MUC1阳性细胞可以是实体瘤细胞，例如肺癌细胞、脑癌细胞、头颈部癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食管癌细胞。MUC1阳性细胞可以是白血病或骨髓瘤细胞，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。该肽可以是固定肽、环化肽、肽模拟物或类肽。该方法还可包括使细胞与第二抗癌药剂接触，例如在肽之前、在肽之后或与肽同时接触第二抗癌药剂。抑制可包含抑制癌细胞生长、癌细胞增殖或诱导癌细胞死亡，例如通过凋亡。
发明人提出的另一项技术(参见美国专利申请序列No.13/045,033)涉及抑制细胞中炎性信号传导的方法，其包括使所述细胞与具有以下结构的黄酮或其盐接触：
其中：
R1是H、–OH、＝O、经取代或未经取代的烷基(C1-8)、烷氧基(C1-8)、卤代烷基(C1-8)、经取代的苯基或未经取代的苯基，其中如果R1是＝O，则C7-C8是双键；
R2是H、–OH、烷基(C1-8)、经取代的苯基、未经取代的苯基、苯基、苯基噻唑、咪唑、吡唑或呋喃；
R3是H、–OH、＝O、卤素、卤代烷基(C1-8)、经取代或未经取代的烷基(C1-8)、经取代的苯基或未经取代的苯基，其中如果R3是＝O，则C8-C9是双键；
R4是H或–OH；
R5是H、–OH、经取代或未经取代的烷基(C1-8)或烷氧基(C1-8)或OR8，其中R8是烷基(C1-8)、酯或酰胺；
R6是H、–OH、经取代或未经取代的烷基(C1-8)或烷氧基(C1-8)或OR8，其中R8是烷基(C1-8)、酯或酰胺；和
R7是H、–OH或经取代或未经取代的烷基(C1-8)，
前提是R1和R3不能二者均是＝O。
R1可以是＝O。R3可以是＝O。桑色素、芹菜素、山奈酚、非瑟素(Fisetin)、PD98059、7-(苄氧基)-4-三氟甲基-2H-色烯-2-酮或7-[(3-氧代丁烷-2-基)氧基]-4-苯基-2H-色烯-2-酮中的黄酮，或任何前述的盐。
技术人员受“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，具体是第624至652页的指导。根据所治疗对象的情况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定对个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应符合由FDA生物制品办公室标准要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
IV.抗体缀合物
抗体可与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，常规地与至少一种期望的分子或部分连接或共价结合或复合。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有期望活性，例如免疫抑制/抗炎的分子。这样的分子的一些非限制性实例在上文描述。这样的分子任选地通过设计为允许该分子在靶位点处或附近释放的可切割接头连接。
相比之下，报道分子被定义为可使用测定检测的任何部分。已经与抗体缀合的报道分子的一些非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和分子、着色颗粒或配体，例如生物素。
通常优选使用抗体缀合物作为诊断剂。抗体诊断剂通常属于两类：用于体外诊断例如用于多种免疫测定的那些，以及用于通常称为“抗体指导的成像”的体内诊断方案的那些。许多合适的显像剂是本领域中已知的，其与抗体连接的方法也如此(参见，例如，美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁性离子、放射性同位素、荧光染料、可NMR检测物质和X-射线显像剂。
在顺磁性离子的情况下，可通过以下示例性离子来提及：例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中特别优选钆。在另一些情况(例如X-射线成像)下可用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和特别是铋(III)。
在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可提及砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。在某些实施方案中通常优选使用125I，并且也通常优选锝99m和/或铟111，因为其能量低和适用于长距离检测。放射性标记的单克隆抗体可根据本领域公知的方法产生。例如，可通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶促氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触来使单克隆抗体碘化。单克隆抗体可通过配体交换过程用锝99m标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体施加于该柱。或者，可使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂(例如SNCl2)、缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠钾溶液)和抗体进行。中间官能团通常用于使放射性同位素与抗体结合并且作为金属离子存在，其是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
考虑用作缀合物的荧光标记包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红(Texas Red)。
所考虑的另一种类型的抗体缀合物是主要意图体外使用的那些，其中抗体与第二结合配体和/或在与显色底物接触之后产生着色产物的酶(酶标签)连接。合适的酶的一些实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素以及抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。这样的标记的使用对于本领域技术人员是公知的，并且在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述。
分子与抗体的位点特异性连接的另一种已知方法包括使抗体与基于半抗原的亲和标记反应。实质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，从而破坏该位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能是不利的，因为其导致通过抗体缀合物的抗原结合丧失。
包含叠氮基的分子也可用于经由通过低强度紫外光产生的反应性氮宾中间体来与蛋白质形成共价键(Potter和Haley,1983)。特别地，已经使用嘌呤核苷酸的2-叠氮类似物和8-叠氮类似物作为定点光探针以鉴定粗制细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens&Haley,1987；Atherton et al.,1985)。2-叠氮核苷酸和8-叠氮核苷酸还已被用于对经纯化蛋白质的核苷酸结合结构域进行图谱绘制(Khatoon et al.,1989；King et al.,1989；Dholakia et al.,1989)并且可用作抗体结合剂。
用于使抗体与其缀合部分连接或缀合的数种方法是本领域中已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合物复合物，其使用例如与抗体连接的有机螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对-甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(tetrachloro-3α-6α-diphenylglycouril-3)(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体还可在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐的情况下与酶反应。与荧光素标记的缀合物在存在这些偶联剂的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。在美国专利4,938,948中，使用单克隆抗体实现了乳腺肿瘤的成像并且使用接头例如甲基-对羟基苯甲亚氨酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯使可检测成像部分与抗体结合。
在另一些实施方案中，考虑了通过使用不改变抗体结合位点的反应条件选择性地将巯基引入免疫球蛋白的Fc区中来使免疫球蛋白衍生化。据公开，根据这种方法产生的抗体缀合物表现出改善的寿命、特异性和灵敏度(美国专利5,196,066，其通过引用并入本文)。在文献中也已经公开了效应分子或报道分子的位点特异性连接，其中报道分子或效应分子与Fc区中的糖残基缀合(O’Shannessy et al.,1987)。已经报道该方法产生目前处于临床评价之中的在诊断和治疗方面有希望的抗体。
V.免疫检测方法
在另一些实施方案中，存在用于结合、纯化、去除、定量和以其他方式通用检测MUC1及其相关抗原的免疫检测方法。一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和Western印迹等。特别地，还提供了用于检测和定量MUC1-C抗体的竞争性测定。在科学文献例如Doolittle和Ben-Zeev(1999)、Gulbis andGaland(1993)、De Jager et al.(1993)和Nakamura et al.(1987)中已描述了多种可用免疫检测方法的步骤。通常来说，免疫结合方法包括获得样品并根据本文中所讨论的一些实施方案使样品与第一抗体接触，视情况而定，这在有效允许免疫复合物形成的条件下进行。
使所选生物样品与抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的时间通常是简单地将抗体组合物添加至样品并将混合物孵育足够长的时间以使抗体与存在的MUC1形成免疫复合物(即与之结合)的问题。在该时间之后，通常对样品-抗体组合物，例如组织切片、ELISA板、斑点印迹或Western印迹进行洗涤以去除任何非特异性结合的抗体种类，从而允许只有特异性结合在初级免疫复合物中的那些抗体被检测到。
通常来说，免疫复合物形成的检测是本领域中公知的，并且可通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标志物(例如那些放射性标签、荧光标签、生物标签和酶标签中的任一种)的检测。有关使用这样的标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域中已知的，通过使用第二结合配体例如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合布置，可发现另外的优点。
用于检测的抗体可本身与可检测标记连接，其中然后将简单地检测该标记，从而允许确定组合物中初级免疫复合物的量。或者，可通过对第一抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测结合在初级免疫复合物中的该抗体。在这些情况下，第二结合配体可与可检测标记连接。第二结合配体本身通常是抗体，其因此可称为“第二”抗体。使初级免疫复合物与经标记的第二结合配体或抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成次级免疫复合物的时间。然后，通常洗涤次级免疫复合物以去除任何非特异性结合的经标记的第二抗体或配体，并且随后检测次级免疫复合物中的剩余标记。
另一些方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。如上所述，将对抗体具有结合亲和力的第二结合配体(例如抗体)用于形成次级免疫复合物。在洗涤之后，再次使次级免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的时间。第三配体或抗体与可检测标记连接，从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。如果期望的话，该系统可提供信号放大。
一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。将第一生物素化抗体用于检测靶抗原，并且然后将第二抗体用于检测与复合生物素连接的生物素。在该方法中，首先将待测试样品在包含第一步抗体的溶液中孵育。如果存在靶抗原，则一些抗体与抗原结合形成生物素化抗体/抗原复合物。然后通过在链霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)、生物素化DNA和/或互补生物素化DNA的连续溶液中孵育来扩大抗体/抗原复合物，其中每个步骤向抗体/抗原复合物添加另外的生物素位点。重复扩大步骤直至达到合适的扩大水平，此时将样品在包含针对生物素的第二步抗体的溶液中孵育。该第二步抗体是经标记的，例如经酶标记的，所述酶可用于使用色原底物通过组织酶学来检测抗体/抗原复合物的存在。经过适当扩大，可产生宏观可见的缀合物。
另一种已知的免疫检测方法利用免疫PCR(聚合酶链反应)方法。在与生物素化DNA一起孵育之前，PCR方法类似于Cantor方法，然而，作为使用多轮链霉抗生物素蛋白和生物素化DNA孵育的替代，将DNA/生物素/链霉抗生物素蛋白/抗体复合物用低pH或高盐缓冲液洗掉，这释放抗体。然后将所得洗涤溶液用于用合适的引物与合适的对照进行PCR反应。至少在理论上，PCR的巨大扩增能力和特异性可用于检测单抗原分子。
A.ELISA
免疫测定最简单而言是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域中已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，将容易理解的是，检测不限于此类技术，并且也可使用western印迹、斑点印迹、FACS分析等。
在一种示例性ELISA中，将本公开内容的抗体固定在表现出蛋白质亲和力的所选表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔上。随后，向孔添加怀疑包含MUC1的受试组合物。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物之后，可检测结合的抗原。检测可通过添加与可检测标记连接的另外的抗MUC1-C抗体来实现。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测也可通过添加第二抗MUC1-C抗体，随后添加对该第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中该第三抗体与可检测标记连接。
在另一种示例性ELISA中，将怀疑包含MUC1抗原的样品固定在孔表面上，并随后与抗MUC1-C抗体接触。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物之后，检测结合的抗MUC1-C抗体。当初始抗MUC1-C抗体与可检测标记连接时，可直接检测免疫复合物。同样，可使用对第一抗MUC1-C抗体具有结合亲和力的第二抗体来检测免疫复合物，其中第二抗体与可检测标记连接。
不论使用何种形式，ELISA都具有某些共同特征，例如包被、孵育和结合、洗涤以去除非特异性结合的物质以及检测结合的免疫复合物。以下对这些进行描述。
在用抗原或抗体包被板中，通常用抗原或抗体的溶液孵育板的孔过夜或持续指定的一段时间。然后对板的孔进行洗涤以去除不完全吸附的物质。然后，将孔的任何剩余可用表面用相对于受试抗血清为抗原性中性的非特异性蛋白质“包被”。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或乳粉溶液。包被允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，并因此降低由抗血清在表面上的非特异性结合引起的背景。
在ELISA中，可能更习惯于使用二级或三级检测方法而不是直接操作。因此，在蛋白质或抗体与孔结合，用非反应性物质包被以降低背景，并洗涤以去除未结合的物质之后，使固定表面与待测试的生物样品在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下接触。然后，免疫复合物的检测需要经标记的第二结合配体或抗体，以及与经标记的第三抗体或第三结合配体联合的第二结合配体或抗体。
“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”意指该条件优选包括用溶液(例如BSA、牛丙种球蛋白(bovine gamma globulin，BGG)或磷酸缓冲盐水(PBS)/吐温)来稀释抗原和/或抗体。这些添加的试剂还倾向于有助于降低非特异性背景。
“合适的”条件还意指孵育在足以允许有效结合的温度或时间下进行。孵育步骤通常在优选为约25℃至27℃的温度下进行约1至2至4小时左右，或者可在约4℃左右下过夜进行。
在ELISA中所有孵育步骤之后，洗涤接触的表面以去除未复合的物质。一个优选的洗涤过程包括用溶液例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液洗涤。在受试样品与最初结合物质之间形成特异性免疫复合物并随后进行洗涤之后，可确定甚至是微量的免疫复合物的出现。
为了提供检测手段，第二或第三抗体具有缔合的标记以允许检测。优选地，这是在与合适的显色底物孵育之后产生显色的酶。因此，例如，期望在有利于发生进一步的免疫复合物形成的时间和条件下使初级和次级免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或孵育(例如，在室温下在含有PBS的溶液(例如PBS-吐温)中孵育2小时)。
在与经标记的抗体孵育并随后进行洗涤以去除未结合的物质之后，对标记的量进行定量，例如通过与显色底物(例如尿素或溴甲酚紫或2,2’-联氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或H2O2(在过氧化物酶作为酶标记的情况下))一起孵育进行。然后通过测量产生的颜色的程度，例如使用可见光谱分光光度计实现定量。
B.Western印迹
Western印迹(或者，蛋白质免疫印迹)是用于在给定的组织匀浆或提取物样品中检测特定蛋白质的分析技术。其使用凝胶电泳通过多肽的长度(变性条件)或通过蛋白质的3-D结构(天然/非变性条件)来分离天然或变性的蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素或PVDF)上，在膜上使用对靶蛋白具有特异性的抗体对其进行探测(检测)。
样品可取自整个组织或来自细胞培养物。在大多数情况下，首先使用搅拌器(用于较大的样品体积)、使用均化器(较小的体积)或通过声处理将实体组织机械破碎。细胞也可通过上述机械方法之一破裂。然而，应注意的是，细菌、病毒或环境样品可以是蛋白质的来源，并因此Western印迹不仅限于细胞研究。可使用多种洗涤剂、盐和缓冲剂来促进细胞裂解和使蛋白质溶解。通常添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。组织制备通常在低温下进行以避免蛋白质变性。
使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。蛋白质的分离可通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合来进行。分离的本质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是确定蛋白质的非常有用的方法。也可使用二维(two-dimensional，2-D)凝胶，其将来自单个样品的蛋白质以两个维度散布。在第一维度中根据等电点(蛋白质具有中性净电荷时的pH)分离蛋白质，而在第二维度中根据其分子量分离蛋白质。
为了使蛋白质易于进行抗体检测，将其从凝胶中移动到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将膜放置在凝胶的顶部，并在其顶部放置一叠滤纸。将整叠放置在缓冲溶液中，该缓冲溶液通过毛细作用移动至纸上，从而使蛋白质随之移动。用于转移蛋白质的另一种方法称为电印迹，并且使用电流将蛋白质从凝胶拉到PVDF或硝酸纤维素膜中。蛋白质在维持其在凝胶中具有的组织的同时从凝胶中移动到膜上。作为该印迹过程的结果，蛋白质被暴露在薄的表面层上用于检测(参见下文)。选择这两种膜是因为其非特异性的蛋白质结合特性(即，同等良好地结合所有蛋白质)。蛋白质结合基于疏水性相互作用以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF便宜，但更加易脆而不能良好地经受反复探测。蛋白质从凝胶转移到膜上的均匀性和整体有效性可通过用考马斯亮蓝或丽春红S(Ponceau S)染料对膜进行染色来检查。一旦转移，就使用经标记的初级抗体或未经标记的初级抗体并随后使用经标记蛋白A或与初级抗体的Fc区结合的第二经标记抗体进行间接检测来检测蛋白质。
C.免疫组织化学
抗体还可与新鲜冷冻和/或福尔马林固定石蜡包埋的组织块二者联合使用，所述组织块为了通过免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)进行研究而制备。由这些颗粒状试样制备组织块的方法已成功用于多种预后因子的先前IHC研究中，并且是本领域技术人员公知的(Brown et al.,1990；Abbondanzo et al.,1990；Allred et al.,1990)。
简言之，冷冻切片可通过以下来制备：在室温下在小塑料囊中的磷酸缓冲盐水(PBS)中将50ng冷冻的“粉碎”组织再水合；通过离心使颗粒沉淀；将其重悬在黏性包埋介质(OCT)中；将囊倒置和/或通过离心再次沉淀；在-70℃异戊烷中速冻；切割塑料囊和/或取出冷冻的组织圆柱状物；将组织圆柱状物固定在低温恒温切片机卡盘上；和/或从囊上切下25至50个连续切片。或者，可将整个冷冻的组织样品用于连续切片切割。
可通过类似的方法制备永久切片，其包括在塑料微量离心管中将50mg样品再水合；沉淀；重悬于10％福尔马林中固定4小时；洗涤/沉淀；重悬于温热的2.5％琼脂中；沉淀；在冰水中冷却以使琼脂硬化；从管中取出组织/琼脂块；将块浸入和/或包埋在石蜡中；和/或切割多至50个连续的永久切片。同样，整个组织样品可替换。
D.免疫检测试剂盒
在另一些实施方案中，存在与上述免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。免疫检测试剂盒因此在合适的容器装置中包含与MUC1抗原结合的第一抗体和任选地免疫检测试剂。
在某些实施方案中，MUC1-C抗体可与固体支持物，例如柱基质和/或微量滴定板的孔预先结合。试剂盒的免疫检测试剂可采取多种形式中的任一种，包括与给定抗体缔合或连接的那些可检测标记。也考虑了与第二结合配体缔合或连接的可检测标记。一些示例性的第二配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些第二抗体。
用于本发明试剂盒的其他合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，其包含对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体，以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，所述第三抗体与可检测标记连接。如上所述，许多示例性的标记在本领域中是已知的，并且所有这样的标记均可结合本文中所讨论的实施方案使用。
试剂盒还可包含适当等分的MUC1抗原组合物，无论是标记的还是未标记的，如可用于制备用于检测测定的标准曲线那样。试剂盒可包含以完全缀合形式、以中间体形式或作为将由试剂盒使用者进行缀合的独立部分的抗体-标记缀合物。试剂盒的组分可包装在水性介质中或以冻干形式包装。
试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，其中可放置抗体，或者优选将抗体适当地等分。试剂盒还包括用于封闭限制式容纳抗体、抗原和任何其他试剂容器以用于商业销售的装置。这样的容器可包含其中保持期望小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。
VI.实施例
包括以下实施例以说明优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在下面的实例中公开的技术代表了发明人发现的在实施方案的实践中很好地发挥作用的技术，因此可以被认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应当理解可以对公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得类似的或相似的结果而不脱离本公开内容的精神和范围。
实施例1–方法
测序方法。按照试剂的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。然后按照PrimeScriptTM第1链cDNA合成试剂盒的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript的cDNA末端快速扩增(RACE)的标准操作程序(standard operating procedure，SOP)扩增重链和轻链的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有合适大小插入物的克隆。提供了共有序列。
人源化的材料和设备。pTT5表达载体和HEK293-6E细胞(由GenScript制备)；37℃CO2培养箱(Thermo Scientific,Model.3951)；生物安全柜(Thermo Scientific,Model.1384)；定轨振荡器(Thermo Scientific,Model.416)；聚乙烯亚胺(Polysciences，货号23966)；FreeStyle293培养基(lifetechnologies，货号12338-018)；TN1(Organotechnie，货号19553)；125-ml摇瓶(Corning，货号430421)；500-ml摇瓶(Corning，货号421145)；蛋白质-A树脂(GenScript，货号L00210)；结合缓冲液：0.15M NaCl，20mMNa2HPO4，pH 7.0；洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl，pH 3.2；中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH 9.0；Biacore T200(GE Healthcare)；S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare，货号：BR-1005-30)；HBS-EP：10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％吐温20，pH 7.4；捕获抗体：抗人Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，货号109-005；NHS：在H2O中的100mMN-羟基琥珀酰亚胺；EDC：在H2O中的400mM1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；乙醇胺：用NaOH调节至pH 8.5的1M乙醇胺盐酸盐；10mM醋酸钠，pH 4.5；50mM HCl；包被缓冲液：0.05MNaHCO3，pH 9.6封闭缓冲液：含5％脱脂乳的PBS；四甲基联苯胺(TMB，GenScript)；1M HCl(GenScript)；HCT116/MUC1细胞系(U0920DE100-A)；样品：纯化抗体(从300nM稀释，3倍稀释，10倍稀释)；同种型对照：人IgG(从300nM稀释，3倍稀释，10倍稀释)；二抗：羊抗人IgG(H+L)iFluor 647(3μg/ml)。
通过CDR移植的抗体人源化：受体框架的选择。使用NCBI Ig-Blast在人种系数据库中搜索亲本抗体的可变结构域序列。为每条重链和轻链选择五种不同的人受体(即与亲本抗体高度同源的人可变结构域)。人受体的CDR用其小鼠对应物替代，产生人源化可变结构域序列。轻链的人源化可变结构域被命名为VL1、VL2、VL3、VL4和VL5。类似地，重链的人源化可变结构域被命名为VH1、VH2、VH3、VH4和VH5。人源化轻链的序列在附录I中示出。
嵌合抗体的结合确认。使用表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200(GEHealthcare)测定与Ag MUC1-ECD结合的抗体的亲和力。通过Fc捕获法将抗体固定在传感器芯片上。抗原MUC1-ECD用作分析物。使用Biacore T200评估软件获得解离速率(kd)和结合速率(ka)常数的数据。表观平衡离解常数(KD)由kd相对于ka的比值计算。
人源化抗体的构建和产生。合成编码人源化IgG重链和轻链的DNA序列，并将其插入到pTT5载体中，以构建全长IgG的表达质粒。在HEK293细胞培养物中表达25种人源化抗体，并将其纯化。使用Biacore T200通过表面等离子体共振(SPR)测试结合确认和亲和力排序。
人源化抗体的亲和力排序。使用胺偶联法将抗人Fcγ特异性抗体固定在传感器芯片上。将分泌至培养基中的25种人源化抗体加亲本抗体分别注射并通过Fc(捕获期)被抗人Fc抗体捕获。在平衡之后，注射Ag MUC1-ECD 200秒(结合期)，随后注射运行缓冲液600秒(解离期)。在每个周期期间，从人源化抗体流动细胞的响应中减去参考流动细胞(流动细胞1)的响应。在注射其他人源化抗体之前，使表面再生。重复该过程，直到所有抗体被分析。使用Biacore T200评估软件，通过将实验数据局部拟合至1:1相互作用模型，获得人源化抗体的解离速率。通过抗体的解离速率常数(解离速率，kd)对抗体进行排序。选择与Ag MUC1-ECD相互作用的结合物，其亲和力与亲本抗体相似。
所选择抗体的产生和亲和力测定。选择前7种结合物以在HEK293细胞培养物中表达。使用蛋白A亲和色谱纯化分泌至培养基中的重组IgG。使用表面等离子共振(SPR)生物传感器Biacore T200测定经纯化抗体与MUC1-ECD结合的亲和力。抗体通过胺偶联法固定在传感器芯片上。抗原MUC1-ECD用作分析物。使用Biacore T200评估软件获得解离速率(kd)和结合速率(ka)常数。平衡常数(KD)由kd或ka的比率来计算。
人源化抗体的FACS滴定。对于人源化抗体对HCT116/MUC1细胞(经改造以表达MUC1的人结肠癌细胞系)的亲和力排序，对经纯化的抗体进行FACS滴定。简言之，培养HCT116/MUC1细胞并通过离心来收获。用PBS洗涤每孔约2.5×105个细胞两次，并在200μl系列抗体稀释液中于4℃下孵育30分钟。在用PBS洗涤之后，向细胞添加二抗(3μg山羊抗人IgG(H+L)IFluor 647)并在4℃下孵育30分钟。在用PBS洗涤之后，通过使用FACS Calibur(BDBioscience，San Jose，CA)和Flowjo软件分析细胞的结合(EC50)。
实施例2–结果
选定抗体的产生和亲和力测定。表达并纯化了7种选择的人源化抗体。常规条件下有少量蛋白质沉淀。由SDS-PAGE评估，人源化IgG的纯度均超过90％。在表6中列出了七种经纯化IgG的产量。
使用Biacore T200评价软件处理每种抗体的结合数据，并将其拟合至1:1相互作用模型。所有实验数据都可以很好地拟合至模型(图4)。如表7所列，七种人源化抗体保留了与亲本嵌合抗体相当的抗原结合亲和力。
人源化抗体的FACS滴定。对7种抗体中的每一种在多种浓度下对HCT116/MUC1细胞的结合能力进行滴定，并且结果在表8中提及，并在图5中用图表表示。
结论。在该项目中，亲本抗体被成功人源化。设计、合成五条人源化重链和五条人源化轻链并将其插入到表达载体中。表达人源化抗体，然后将其用于亲和力排序测试。最后，纯化与嵌合抗体具有相似结合亲和力的三种人源化抗体用于递送。
表6–经纯化IgG的纯度和产量
表7–嵌合和人源化抗体的亲和力测量
表8.嵌合和人源化抗体的FACS滴定结合测试
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根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有组合物和方法均可以在不进行过度实验的情况下制造和执行。虽然已经按照优选的实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，在不脱离本公开内容的构思、精神和范围的情况下，可以对本文中所描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变。更具体地，明显的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员来说明显的所有这样的类似的替代和修饰被认为在所附权利要求书限定的本公开内容的精神、范围和概念之内。
VII.参考文献
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<130> GENU.P0047WO
<140> 与此同时提交
<141> 2021-07-15
<150> US 63/052,599
<151> 2020-07-16
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 158
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn
1 5 10 15
Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala
20 25 30
Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro
35 40 45
Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile
50 55 60
Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr
65 70 75 80
Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln
85 90 95
Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr
100 105 110
Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp
115 120 125
Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu
145 150 155
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn
1 5 10 15
Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala
20 25 30
Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro
35 40 45
Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly
50 55
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Asp Gly Asp Tyr Val Ser Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Phe Trp
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Arg Tyr Asp Tyr Thr Ser Ser Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Met His
1 5 10 15
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Gln Gln Asn Trp Lys Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp
1 5 10 15
Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Glu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Asn Phe Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Tyr Ser Ser
85 90 95
Ser Ala Ser Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ser Asp Gly Asp Tyr Val Ser Gly Phe Ala Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 16
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser
20 25 30
Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Val Gly Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asn
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr
100 105 110
Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 17
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ile Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Phe
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Tyr Asp Tyr Thr Ser Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 18
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr Ser
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Trp
85 90 95
Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 19
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe
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65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asp Tyr Thr Ser Ser Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
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130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
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210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 20
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
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Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly
65 70 75 80
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
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Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Asn Trp Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
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Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
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Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 21
<211> 414
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt cgactcccag 60
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caactccgca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag tgatggtgac 360
tacgtctcgg gctttgccta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414
<210> 22
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Ala Thr Cys Cys Ala Thr
20 25 30
Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Ala Thr
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Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala
50 55 60
Thr Thr Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Ala Thr Cys
65 70 75 80
Thr Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys
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Ala Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly
115 120 125
Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr
130 135 140
Gly Thr Gly Gly Gly Thr Ala Cys Thr Thr Ala Thr Gly Thr Ala Thr
145 150 155 160
Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala
165 170 175
Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
180 185 190
Ala Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ala Cys Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Thr Ala
210 215 220
Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Thr
225 230 235 240
Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly
245 250 255
Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr
260 265 270
Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys
275 280 285
Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly
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Ala Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Ala Cys
325 330 335
Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr
340 345 350
Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala
355 360 365
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala
370 375 380
<210> 23
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr
20 25 30
Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys
35 40 45
Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys
85 90 95
Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala
115 120 125
Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr
130 135 140
Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly
145 150 155 160
Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala
165 170 175
Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys
180 185 190
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Ala Thr
195 200 205
Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Ala Thr Cys
210 215 220
Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys
225 230 235 240
Ala Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys
245 250 255
Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys
260 265 270
Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr
275 280 285
Gly Thr Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Ala
290 295 300
Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys
325 330 335
Thr Cys Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
340 345 350
Cys Ala
<210> 24
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
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acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaata aaa 333
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<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
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Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
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Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly
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Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 26
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
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Gln Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
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Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
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Gln Asn Trp Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
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Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
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Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
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Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 27
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgag 60
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gagaagttta agggccaggt gaccatcagc gccgacaaga gcatctccac agcctatctg 300
cagtggagct ccctgaaggc ctctgatacc gccatgtact attgtgccag atacgactat 360
acatctagca tggattattg gggccagggc accctggtga cagtgtcctc t 411
<210> 28
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala
1 5 10 15
Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly
50 55 60
Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys
65 70 75 80
Ala Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly
100 105 110
Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly
115 120 125
Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly
130 135 140
Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Ala Thr
145 150 155 160
Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala
165 170 175
Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala
180 185 190
Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys
195 200 205
Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys
210 215 220
Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Ala
225 230 235 240
Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala
245 250 255
Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly
260 265 270
Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly
275 280 285
Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly
290 295 300
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys
305 310 315 320
Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly
325 330 335
Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys
340 345 350
Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala
355 360 365
Gly Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly
370 375 380
Ala Thr Cys Ala Ala Gly
385 390
<210> 29
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
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atccagatga cccagtcccc tagctccctg tccgcctctg tgggcgatcg ggtgaccatc 120
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ctgcagccag aggatatcgc cacctactat tgtcagcaga attggaaggt gccctggacc 360
tttggccagg gcacaaagct ggagatcaag 390
<210> 30
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgac 60
atccagatga cccagtcccc tagctccctg tccgcctctg tgggcgatcg ggtgaccatc 120
acatgcagag ccagcgagtc cgtgcagtac tctggcacaa gcctgatgca ctggtatcag 180
cagaagcccg gcaaggcccc taagctgctg atctacggag catccaacgt ggagacagga 240
gtgccatctc ggttctctgg aagcggatcc ggcacagact ttaccctgac aatctctagc 300
ctgcagccag aggatttcgc cacctactat tgtcagcaga attggaaggt gccctggacc 360
tttggcggcg gcacaaaggt ggagatcaag 390
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Cys Gln Cys Arg
1
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Cys Gln Cys Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Cys Gln Cys Arg Arg Lys
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn
1 5
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn
1 5 10 15
<210> 38
<211> 59
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 38
Ser Val Val Val Gln Ser Thr Leu Val Phe Arg Glu Gly Thr Thr Asn
1 5 10 15
Val His Asp Val Glu Glu Thr Gln Phe Asn Gln Arg Lys Thr Glu Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Ser Val Arg Asp Val
35 40 45
Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Thr Gly Ala Gly
50 55
<210> 39
<211> 58
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 39
Ser Val Val Val Glu Ser Thr Val Val Phe Arg Glu Gly Thr Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Asp Val Lys Ser Gln Leu Ile Gln His Lys Lys Glu Ala Asp
20 25 30
Ser Asp Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Glu Val Lys Val Asn Glu Met Gln
35 40 45
Phe Pro Pro Ser Ala Gln Ser Arg Pro Gly
50 55

Claims (65)

1.与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的抗体或其片段，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:3、4和5或者6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区，并且所述可变轻链包含含有SEQ ID NO:9、10和11或者12、13和14的CDR1、CDR2和CDR3区。
2.权利要求1所述的抗体或其片段，其分别包含与SEQ ID NO:15、17或19具有80％或更高同源性的可变重链，和与SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有80％或更高同源性的可变轻链。
3.权利要求1所述的抗体或其片段，其分别包含由与SEQ ID NO:21、23或27具有70％或更高同源性的核酸编码的可变重链，和由与SEQ IDNO:22、24或28/29/30具有70％或更高同源性的核酸编码的可变轻链。
4.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体是单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。
5.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体片段是Fab片段。
6.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体是对MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体。
7.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体是鼠抗体。
8.权利要求7所述的抗体或其片段，其中所述鼠抗体是IgG。
9.权利要求1所述的抗体或其片段，其中抗体是人源化抗体。
10.权利要求9所述的抗体或其片段，其中所述人源化抗体是IgG。
11.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段还包含标记。
12.权利要求11所述的抗体或其片段，其中所述标记是肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。
13.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体还包含与其连接的抗肿瘤药物。
14.权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述抗肿瘤药物通过光不稳定接头与所述抗体或其片段连接。
15.权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体或其片段连接。
16.权利要求13所述的抗体或其片段，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
17.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链分别与SEQ ID NO:15、17或19以及SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性。
18.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述重链和轻链分别由与SEQ ID NO:21、23或27以及SEQ ID NO:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。
19.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与纳米粒或脂质体缀合。
20.权利要求1所述的抗体或其片段，其中细胞死亡的诱导包含抗体依赖性细胞毒性或补体介导的细胞毒性。
21.治疗癌症的方法，其包括使对象中的MUC1阳性癌细胞与权利要求1至20中所述的抗体或其片段接触。
22.权利要求21所述的方法，其中所述MUC1阳性癌细胞是实体瘤细胞。
23.权利要求22所述的方法，其中所述实体瘤细胞是肺癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞(例如肝细胞癌)、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、子宫癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞或食管癌细胞。
24.权利要求21所述的方法，其中所述MUC1阳性癌细胞是白血病细胞或骨髓瘤细胞，例如急性髓性白血病细胞、慢性髓细胞性白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。
25.权利要求21所述的方法，其中所述癌细胞是由人乳头瘤病毒引起的宫颈癌细胞或由幽门螺杆菌(H.pylori)引起的胃癌细胞。
26.权利要求21所述的方法，其还包括使所述MUC1阳性癌细胞与第二抗癌药剂或治疗接触。
27.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗是化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗。
28.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗抑制胞内MUC1功能。
29.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗与所述第一药剂同时给予。
30.权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌药剂或治疗在所述第一药剂之前和/或之后给予。
31.权利要求21所述的方法，其中所述MUC1阳性癌细胞是转移性癌细胞、多重药物抗性癌细胞或复发性癌细胞。
32.权利要求21所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
33.权利要求21所述的方法，其中所述抗体是单结构域抗体。
34.权利要求21所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
35.权利要求21所述的方法，其中所述抗体片段是Fab片段。
36.权利要求21所述的方法，其中所述抗体是对MUC1-C/ECD和独特的癌细胞表面抗原具有特异性的重组抗体。
37.在对象中诊断MUC1阳性癌症的方法，其包括使所述对象或来自所述对象的含有细胞的样品与权利要求1至20中所述的抗体或其片段接触。
38.权利要求37所述的方法，其中所述MUC1阳性癌症是实体瘤癌症。
39.权利要求38所述的方法，其中所述实体瘤癌症是肺癌、脑癌、头颈癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、皮肤癌或食管癌。
40.权利要求37所述的方法，其中所述MUC1阳性癌症是白血病或骨髓瘤，例如急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病或多发性骨髓瘤。
41.权利要求37所述的方法，其中所述MUC1阳性癌症是肝细胞癌或由人乳头瘤病毒引起的宫颈癌。
42.权利要求37所述的方法，其还包括向所述对象施用抗癌药剂或治疗。
43.权利要求42所述的方法，其中所述抗癌药剂或治疗是化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或毒素治疗。
44.权利要求37所述的方法，其中所述MUC1阳性癌细胞是转移性癌症、多重药物抗性癌症或复发性癌症。
45.权利要求37所述的方法，其中所述含有细胞的样品是固体组织样品，例如活检物。
46.权利要求37所述的方法，其中所述含有细胞的样品是流体样品，例如尿、精液、痰、唾液、乳头抽吸物或血液。
47.药物制剂，其包含权利要求1至20所述的抗体或其片段以及可药用载体、缓冲剂或稀释剂。
48.权利要求47所述的药物制剂，其中所述制剂是癌症疫苗制剂，任选地还包含佐剂。
49.权利要求47所述的药物制剂，其中所述制剂是免疫组织化学试剂或放射成像剂。
50.权利要求47至49所述的药物制剂，其还包含另外的治疗剂。
51.融合蛋白，其包含：
(i)与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C/胞外结构域(ECD)选择性地结合的第一单链抗体，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:3、4和5或者6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区，并且所述可变轻链包含含有SEQ ID NO:9、10和11或者12、13和14的CDR1、CDR2和CDR3区；以及
(ii)与T或B细胞结合的第二单链抗体。
52.权利要求51所述的融合蛋白，其中所述第二单链抗体与CD3、CD16、PD1、PD-L1、CD33、Her-2、EGFR、CTLA-4、OX40、FcγRI(CD64)、FcγRIIIa(CD16A)、FcαRI(CD89)、CD163、CD68、CD89 Mab结合。
53.权利要求51所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含标记或治疗性部分。
54.权利要求51所述的融合蛋白，其中所述重链和轻链分别与SEQ ID NO:15、17或19以及SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性。
55.权利要求51所述的融合蛋白，其中所述重链和轻链分别由与SEQ ID NO:21、23或27以及SEQ ID NO:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。
56.嵌合抗原受体，其包含：
(i)胞外域，所述胞外域包含与由SEQ ID NO:1限定的MUC1-C/胞外结构域(MUC1-C/ECD)选择性地结合的单链抗体可变区，其中所述抗体分别包含可变重链和可变轻链，所述可变重链包含SEQ ID NO:3、4和5或者6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区，并且所述可变轻链包含含有SEQ ID NO:9、10和11或者12、13和14的CDR1、CDR2和CDR3区，其中在所述单链抗体可变区的C端处附接有柔性铰链；
(ii)跨膜结构域；以及
(iii)内结构域，
其中当所述单链抗体可变区与MUC1接合时，所述内结构域包含信号转导功能。
57.权利要求56所述的受体，其中所述跨膜和内结构域来源于同一分子。
58.权利要求56所述的受体，其中所述内结构域包含CD3-ζ结构域或高亲和力FcεRI。
59.权利要求56所述的受体，其中所述柔性铰链来自CD8α或Ig。
60.权利要求56所述的受体，其中所述重链和轻链分别与SEQ ID NO:15、17或19以及SEQ ID NO:16、18或20/25/26具有85％、90％、95％或99％的同源性。
61.权利要求56所述的受体，其中所述重链和轻链分别由与SEQ IDNO:21、23或27以及SEQ ID NO:22、24或28/29/30具有85％、90％、95％或99％同源性的核酸编码。
62.细胞，其表达权利要求56、60或61所述的嵌合抗原受体。
63.权利要求62所述的细胞，其中所述跨膜和内结构域来源于同一分子。
64.权利要求62所述的细胞，其中所述内结构域包含CD3-ζ结构域或高亲和力FcεRI。
65.权利要求62所述的细胞，其中所述柔性铰链来自CD8α或Ig。
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