KR20230116767A - Muc1-c/세포외 도메인(muc1-c/ecd)에 대한 항체 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 결합하는 항체 및 MUC1 항원을 발현하는 암을 치료하기 위해 이러한 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2020년 7월 16일에 출원된 미국 가 특허원 제63/052,599호에 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
39KB(Microsoft Windows®에서 측정됨)이고 2021년 7월 6일에 생성된 GENUP0047WO_ST25.txt라는 파일에 함유된 서열 목록은 전자 제출로 여기에 제출되며, 본원에 참조로 통합된다.
배경
1. 분야
본 개시내용은 일반적으로 의학, 종양학 및 면역치료제 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, MUC-1 양성 암을 검출 및 치료하는데 사용하기 위한 면역 시약의 개발에 관한 것이다.
2. 배경
뮤신은 주로 상피 세포로 발현되는 광범위하게 O-글리코실화 단백질이다. 분비된 및 막 결합된 뮤신은 독소, 미생물 및 외부 환경과의 계면에서 발생하는 다른 유형의 스트레스에 의해 유도된 손상으로부터 상피 세포의 정단 경계를 보호하는 물리적 장벽을 형성한다. 막관통 뮤신 1(MUC1)은 또한 세포질 도메인을 통해 세포의 내부로 신호를 전달할 수 있다. MUC1은 바다 성게 정자 단백질-엔테로키나제-아그린(SEA) 도메인의 존재를 제외하고는 다른 막 결합 뮤신과 서열 유사성을 갖지 않는다(Duraisamy et al., 2006). 그 점에서, MUC1은 단일 폴리펩티드로 번역된 다음 SEA 영역에서 자가 절단을 겪는다(Macao et al., 2006).
MUC1은 암에서의 역할에 대해 발명자들 및 타인에 의해 광범위하게 연구되어 왔다. 위에서 논의된 바와 같이, 인간 MUC1은 단일 폴리펩티드로 번역되고, 소포체 내 N- 및 C-말단 서브유닛(MUC1-N 및 MUC1-C)으로 절단된 이종 이량체 당단백질이다(Ligtenberg et al., 1992; Macao et al., 2006; Levitin et al., 2005). 대부분의 인간 암종(Kufe et al., 1984)에서 발견된 바와 같이, MUC1의 비정상적인 과발현은 앵커리지 독립적 성장 및 종양원성을 부여한다(Li et al., 2003a; Huang et al., 2003; Schroeder et al., 2004; Huang et al., 2005). 다른 연구들은 MUC1의 과발현이 산화 스트레스 및 유전독성 항암제에 의해 유도된 아폽토시스에 대한 내성을 부여한다는 것을 입증했다(Yin and Kufe, 2003; Ren et al., 2004; Raina et al., 2004; Yin et al., 2004; Raina et al., 2006; Yin et al., 2007).
테더된 및 분비된 뮤신의 패밀리는 상피 세포 표면의 보호 장벽을 제공하는 데 기능한다. 상피층의 손상이 있는 경우, 인접한 세포 사이의 단단한 접합부가 파괴되고, 세포가 헤레굴린 유도 복구 프로그램을 개시함에 따라 극성이 손실된다(Vermeer et al., 2003). MUC1-N은 세포 표면으로부터 방출되어(Abe and Kufe, 1989), MUC1-C가 세포의 내부로 환경 스트레스 신호의 변환기로서 기능하게 한다. 이와 관련하여, MUC1-C는 ErbB 수용체 패밀리의 구성원과 세포 표면 복합체를 형성하고, MUC1-C는 헤레룰린 자극에 대한 반응으로 핵을 표적으로 한다(Li et al., 2001; Li et al., 2003c). MUC1-C는 또한 MUC1 세포질 도메인(CD)과 카테닌 패밀리의 구성원 사이의 직접적인 상호 작용을 통해 ErbB 수용체 및 Wnt 신호 전달 경로를 통합하는 기능을 한다(Huang et al., 2005; Li et al., 2003c; Yamamoto et al., 1997; Li et al., 1998; Li et al., 2001; Li and Kufe, 2001). 다른 연구는 MUC1-CD가 글리코겐 신타제 키나제 3β, c-Src, 단백질 키나제 Cδ, 및 c-Abl에 의해 인산화된다는 것을 증명하였다(Raina et al., 2006; Li et al., 1998; Li et al., 2001; Ren et al., 2002). 전술한 상호 작용들 중 임의의 것을 억제하는 것은 MUC1-관련 암에 대한 치료적 개입의 잠재적인 지점을 나타낸다.
요약
따라서, 본 개시내용에 따라, 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 단편이 제공되고, 여기서 상기 항체는 각각 서열번호 3, 4 및 5, 또는 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 9, 10 및 11, 또는 12, 13 및 14의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 각각 서열번호 15, 17, 또는 19와 80% 이상의 상동성(homology)을 갖는 가변 중쇄, 및 서열번호 16, 18, 또는 20/25/26과 80% 이상의 상동성을 갖는 가변 경쇄를 포함할 수 있거나, 각각 서열번호 21, 23, 또는 27과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩(encoding)된 가변 중쇄, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩된 가변 경쇄를 포함할 수 있다.
항체는 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody) 또는 키메라 항체(chimeric antibody)일 수 있다. 항체 단편은 Fab 단편일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 MUC1-C/ECD에 대한 특이성, 및 별개의 암 세포 표면 항원을 갖는 재조합 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항체는 뮤린(murine) 항체, IgG, 인간화 항체(humanized antibody), 또는 인간화 IgG 항체일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 표지(label)를 추가로 포함할 수 있다. 표지는 펩티드 태그(peptide tag), 효소, 자성 입자(magnetic particle), 발색단, 형광 분자, 화학 발광 분자, 또는 염료일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 항종양 약물(antitumor drug)이 광불안정성 링커(photolabile linker)를 통해 상기 항체 또는 이의 단편에 연결되거나, 상기 항종양 약물이 효소적으로 절단된 링커를 통해 상기 항체 또는 이의 단편에 연결되는 경우와 같이 그에 연결된 항종양 약물을 추가로 포함할 수 있다. 항종양 약물은 독소, 방사성 동위원소, 사이토카인 또는 효소일 수 있다.
중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 15, 17, 또는 19, 및 서열번호 16, 18, 또는 20/25/26과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가질 수 있거나, 각각 서열번호 21, 23, 또는 27, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 나노입자 또는 리포좀에 접합될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 항체 의존성 세포 세포독성 또는 보체 매개 세포독성(complement-mediated cytoxocity)을 포함하는 세포 사멸(cell death)을 유도할 수 있다.
대상체의 MUC1-양성 암 세포를 상기 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 또한 제공되고, 여기서 상기 항체는 각각 서열번호 3, 4, 및 5, 또는 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 9, 10 및 11, 또는 12, 13 및 14를 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 각각 서열번호 15, 17, 또는 19와 80% 이상의 상동성을 갖는 가변 중쇄, 및 서열번호 16, 18, 또는 20/25/26과 80% 이상의 상동성을 갖는 가변 경쇄를 포함할 수 있거나, 각각 서열번호 21, 23, 또는 27과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩된 가변 중쇄, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩된 가변 경쇄를 포함할 수 있다.
항체는 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 이중특이적 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 항체 단편은 Fab 단편일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 MUC1-C/ECD에 대한 특이성, 및 별개의 암 세포 표면 항원을 갖는 재조합 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항체는 뮤린 항체, IgG, 인간화 항체, 또는 인간화 IgG 항체일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 표지를 추가로 포함할 수 있다. 표지는 펩티드 태그, 효소, 자성 입자, 발색단, 형광 분자, 화학 발광 분자, 또는 염료일 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 항종양 약물이 광불안정성 링커를 통해 상기 항체 또는 이의 단편에 연결되거나, 상기 항종양 약물이 효소적으로 절단된 링커를 통해 상기 항체 또는 이의 단편에 연결되는 경우와 같이 그에 연결된 항종양 약물을 추가로 포함할 수 있다. 항종양 약물은 독소, 방사성 동위원소, 사이토카인 또는 효소일 수 있다.
중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 15, 17, 또는 19, 및 서열번호 16, 18, 또는 20/25/26과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가질 수 있거나, 각각 서열번호 21, 23, 또는 27, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 나노입자 또는 리포좀에 접합될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 항체 의존성 세포 세포독성 또는 보체 매개 세포독성을 포함하는 세포 사멸을 유도할 수 있다.
MUC1-양성 암 세포는 고형 종양 세포, 예를 들어, 폐암(lung cancer) 세포, 뇌암(brain cancer) 세포, 두경부암(head & neck cancer) 세포, 유방암(breast cancer) 세포, 피부암(skin cancer) 세포, 간암(liver cancer) 세포(예: 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)), 췌장암(pancreatic cancer) 세포, 위암(stomach cancer) 세포, 결장암(colon cancer) 세포, 직장암(rectal cancer) 세포, 자궁암(uterine cancer) 세포, 자궁경부암(cervical cancer) 세포, 난소암(ovarian cancer) 세포, 고환암(testicular cancer) 세포, 피부암 세포, 또는 식도암(esophageal cancer) 세포일 수 있다. MUC1-양성 암 세포는 백혈병(leukemia) 또는 골수종(myeloma), 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 또는 다발성 골수종(multiple myeloma)일 수 있다. MUC1-양성 암 세포는 전이성 암 세포, 다중 약물 내성 암(multiply drug resistant cancer) 세포 또는 재발성 암 세포일 수 있다.
상기 방법은 상기 MUC1-양성 암 세포를 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 독소 요법과 같은 제2 항암제 또는 치료와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제2 항암제 또는 치료는 세포내 MUC1 기능을 억제할 수 있다. 제2 항암제 또는 치료는 상기 제1 제제와 동시에 제공되거나 상기 제1 제제 전 및/또는 후에 제공될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에서 정의된 바와 같은 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자궁경부암과 같은 인간 유두종 바이러스를 포함하거나 위암과 같은 에이치. 파일로리(H. pylori)를 포함하는 암을 치료하는 방법이 제공된다.
추가의 구현예에서, 본원에서 정의된 바와 같은 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 염증 상태는 급성 및 만성 염증 상태, 예를 들어, 대장염(colitis), IBD 및 IPF를 포함한다. 염증 상태는 또한 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 감염, 예를 들어, SRS-Cov-2, 인간 유두종 바이러스, 및 에이치. 파일로리를 포함할 것이다.
또한, 대상체 또는 이로부터의 세포 함유 샘플과 본원에서 정의된 바와 같은 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 MUC1-양성 암을 진단하는 방법이 추가로 제공된다. MUC1-양성 암은 고형 종양 암, 예를 들어, 폐암, 뇌암, 두경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 고환암, 피부암, 또는 식도암일 수 있다. MUC1-양성 암은 백혈병 또는 골수종, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종일 수 있다. MUC-1 양성 암은 인간 유두종 바이러스에 의해 유발되는 간세포 암종 또는 자궁경부암일 수 있다.
상기 방법은 본원에 정의된 바와 같은 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 독소 요법과 같은 항암제 또는 치료를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. MUC1-양성 암은 전이성 암, 다중 약물 내성 암 또는 재발성 암일 수 있다. 세포 함유 샘플은 고형 조직 샘플, 예를 들어, 생검(biopsy), 또는 유체 샘플, 예를 들어, 소변, 정액, 객담, 타액, 유두 흡인물, 또는 혈액일 수 있다.
추가의 구현예는 (a) 본원에 정의된 바와 같은 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 제형 및 약제학적으로 허용되는 담체, 완충제 또는 희석제를 포함했다. 약제학적 제형은 임의로 보조제(adjuvant), 또는 면역조직화학 시약 또는 방사선이미징제(radioimaging agent)를 추가로 포함하는 백신 제형으로서 추가로 정의될 수 있다. 상기 제형은 추가 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, (i) 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C/세포외 도메인(ECD)에 선택적으로 결합하는 제1 단일 쇄 항체로서, 상기 항체가 각각 서열번호 3, 4, 및 5, 또는 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 9, 10 및 11, 또는 12, 13 및 14를 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 제1 단일 쇄 항체; 및 (ii) T 또는 B 세포에 결합하는 제2 단일 쇄 항체를 포함하는 융합 단백질(fusion protein)이 제공된다. 제2 단일 쇄 항체는 CD3, CD16, PD1, PD-L1, CD33, Her-2, EGFR, CTLA-4, OX40, FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16A), FcαRI (CD89), CD163, CD68, CD89 Mab에 결합할 수 있다. 융합 단백질은 표지 또는 치료적 모이어티(therapeutic moiety)를 추가로 포함할 수 있다. 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 15, 17, 또는 19, 및 서열번호 16, 18, 또는 20/25/26과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가질 수 있거나, 각각 서열번호 21, 23, 또는 27, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다.
또 다른 구현예에서, (i) 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 단일 쇄 항체 가변 영역을 포함하는 엑토도메인(ectodomain)으로서, 상기 항체가 상기 단일 쇄 가변 영역의 C-말단에 부착된 가요성 힌지(flexible hinge)와 함께, 각각 서열번호 3, 4, 및 5, 또는 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 9, 10 및 11, 또는 12, 13 및 14를 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 엑토도메인; (ii) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및 (iii) 엔도도메인(endodomain)으로서, 상기 엔도도메인이 상기 단일 쇄 항체 가변 영역이 MUC1과 결합될 때 신호 전달 기능을 포함하는, 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체가 제공된다. 막관통 도메인 및 엔도도메인은 동일한 분자로부터 유래될 수 있다. 엔도도메인은 CD3-제타 도메인 또는 고 친화성(high affinity) FcεRI를 포함할 수 있다. 가요성 힌지는 CD8α 또는 Ig로부터 유래될 수 있다. 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 15, 17, 또는 19, 및 서열번호 16, 18, 또는 20/25/26과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가질 수 있거나, 각각 서열번호 21, 23, 또는 27, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가질 수 있다.
추가로, 상기 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포가 제공된다. 막관통 도메인 및 엔도도메인은 동일한 분자로부터 유래될 수 있다. 엔도도메인은 CD3-제타 도메인 또는 고 친화성 FcεRI를 포함할 수 있다. 가요성 힌지는 CD8α 또는 Ig로부터 유래될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물이 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 때 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 그것은 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다. 단어 "약"은 명시된 수치의 ± 5%를 의미한다.
본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 취지 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 개시내용의 특정 구현예를 나타내는 동시에 단지 예시로 제공되는 것으로 이해해야 한다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 개시내용은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합하여 이러한 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-d. 항체 서열. (도 1a) GO-701m 서열. (도 1b) GO-702m 서열. (도 1c) GO-702h 아미노산 서열. (도 1d) GO-702h 핵산 서열.
도 2. 키메라 항체 및 인간화 항체의 친화성 측정. 실시간 반응은 곡선으로 제시되었다. 비아코어 실험 데이터의 1:1 상호 작용 모델에의 맞춤은 블랙으로 제시되었다. 상부 패널에 사용되는 항원 농도는 각각 3.125nM, 6.25nM, 12.5nM, 25nM, 50nM이었다. 하부 패널에 사용되는 항원 농도는 각각 1.875nM, 3.75nM, 7.5nM, 15nM, 30nM, 60nM이었다.
도 3. 비-환원 조건하에 선택된 항체의 SDS-PAGE 결과. 환원 조건: 레인 M(마커); 레인 1(VH1+VL3); 레인 3(VH1+VL4); 레인 5(VH2+VL3); 레인 7(VH5+VL1); 레인 9(VH5+VL2); 레인 11(VH5+VL3); 레인 13(VH5+VH4). 비환원 조건: 레인 2(VH1+VL3); 레인 4(VH1+VL4); 레인 6(VH2+VL3); 레인 8(VH5+VL1); 레인 10(VH5+VL2); 레인 12(VH5+VL3); 레인 14(VH5+VH4); 레인 15(마우스 IgG).
도 4. 키메라 IgG 및 인간화 IgG의 친화성 측정. 실시간 반응은 컬러 곡선으로 제시되었다. 비아코어 실험 데이터의 1:1 상호 작용 모델에의 맞춤은 블랙으로 제시되었다. 항원 농도는 각각 1.875nM, 3.75nM, 7.5nM, 15nM, 30nM, 60nM이었다.
도 5. 유세포 분석에 의한 키메라 IgG 및 인간화 IgG의 친화성 비교. 항체를 HCT116/MUC1 세포와 함께 배양한 후, 2차 항체와 배양하였다. 결합은 유세포 분석에 의해 분석하였다.
도 6. HCT116 / MUC1에 대한 mAb의 농도 의존적 결합. 인간 IgG1로부터의 Fc를 함유하는 GO-702m 및 GO-702m/hFc 키메라 둘 다의 야생형 및 아푸코실화(AF) 형태를 상이한 농도(상기 제시된 바와 같음)의 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-hIGG-비오틴+스트렙타비딘-PE 또는 항-마우스 IgGk-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 농도 의존 방식으로 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다.
도 7. 도 6에 대한 음성 대조군으로 사용되는 미염색 세포.
도 8a-b. GO-702m은 알파-4 나선을 표적으로 한다. (도 8a) 58-aa 인간 MUC1-C(서열번호 2), 시노몰구스 원숭이(서열번호 38), 및 마우스(서열번호 39) Muc1-C 세포외 도메인의 aa 서열. α3 및 α4 나선이 강조된다. p62/p58 이종이량체의 NMR 분광법으로 제시된 바와 같이, mAb GO-702m 에피토프의 α4 나선으로의 국소화(Macao et al., 2006). (도 8b) 지시된 농도의 mAb GO-702m을 HCT116/벡터 또는 HCT116/MUC1 세포와 함께 배양하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 알파-4 나선의 경우 WT p58/p62 이종이량체 및 S33A, R34G, Y35A, N36A 돌연변이체 단백질 또는 알파-3 나선의 경우 D19E/V20A/T22A 돌연변이체 단백질에 대한 ELISA에 의한 mAb GO-702m(각 컬럼 세트 중 중간 막대)의 결합. mAb CD1(각 컬럼 세트 중 오른쪽 막대)은 대조군으로 사용되었다. MAb 3D1(각 컬럼 세트의 왼쪽 막대)은 알파-3-양성 결합의 대조군으로 사용되었다. 결과는 WT 단백질(>3.0 OD 단위)로 수득된 것과 비교하여 백분율 대조군 결합으로 표시된다.
도 9. HCT116 / MUC1에 대한 GO- 702mFc 키메라 mAb의 결합. 인간 IgG1 유래 Fc를 함유하는 동일한 것의 야생형 키메라(GO-702m/hFc) 및 아푸코실화 형태를 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-hIgG-비오틴+스트렙타비딘-PE 또는 항-마우스 IgGk-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다.
도 10a-b. 마우스 Fc 수용체( FcRIV )에 대한 GO-702h의 농도 의존적 결합. (도 10a) GO-702h의 야생형 및 아푸코실화(AF) 형태를 상이한 농도(상기 제시된 바와 같음)의 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-인간 IgG-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 농도 의존 방식으로 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다. (도 10b) GO-702h의 야생형(다이아몬드) 및 아푸코실화(AF) 형태(정사각형)를 상이한 농도의 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-인간 IgG-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 농도 의존 방식으로 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다. 우측: 결합의 그래프 표현.
도 11. MAb(GO-702m-AF)로 처리된 MUC1.Tg 마우스의 혈액 화학 분석. MC-38/MUC1 종양을 보유하는 MUC1.Tg 마우스에 5mg/kg MAb 아푸코실화 GO-702m을 복강내 주입하였다. 완전한 혈액 화학을 수행하여 아푸코실화 GO-702m 항체의 임의의 독성을 평가하였다.
도 12. MAb(GO-702m-AF)로 처리된 MUCT1 - Tg 마우스의 혈액학 분석. MC-38/MUC1 종양을 보유하는 MUC1.Tg 마우스에 5mg/kg MAb 아푸코실화 GO-702m을 복강내 주입하였다. 완전한 혈액학 분석을 수행하여 아푸코실화 GO-702m 항체의 임의의 독성을 평가하였다.
도 13. HCT116 - MUC1 세포에 대한 GO-702m, GO-702h 및 GO-701m 항체의 결 합. 인간 MUC1로 과발현된 HCT116 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. 5㎍의 지시된 항-MUC1 항체 또는 아이소타입 대조군을 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 또는 항-인간 면역글로불린(1차 항체에 의존)을 2차 시약으로 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 14. 야생형 및 아푸코실화 GO-702h와 HCT116 / MUC1 세포의 결합. 인간 MUC1로 과발현된 HCT116 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. GO-702h 야생형, 아푸코실화된 GO-702h 또는 음성 대조군으로서 CD1 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-인간 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 15. HCT116 ± MUC -1을 사용한 GO-702m의 유세포 분석. MUC1이 없는 HCT116 세포(블랙) 및 인간 MUC1로 과발현된 HCT116 세포(회색)에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. GO-702m 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 16. ZR -75-1 세포에서 GO-702m의 유세포 분석. ZR -75-1 유방암 세포주에 대한 항체 결합. GO-702m 항-MUC1 항체(회색) 또는 음성 대조군으로서 MUC1 CD1 항체(블랙)를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 17. MCF -7/ CshRNA 대 MCF -7/ MUC1shRNA에서 GO-702m의 유세포 분석. MCF-7/MUC1shRNA(블랙) 또는 MCF-7/CshRNA(회색) 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. GO-702m 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 18. H-1975 NSCLC 세포에서 GO-702m의 유세포 분석. H-1975 NSCLC 세포주에 대한 항체 결합. GO-702m 항-MUC1 항체(회색) 또는 음성 대조군으로 IgG(블랙)를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 19. MDA -MB-468 CshRNA / MUC1shRNA에서 GO-702m의 유세포 분석. MSA-MB-468/MUXshRNA(우측 회색 피크) 또는 MDA-MB-468/CshRNA(좌측 회색 피크) 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. IgG를 음성 대조군으로서 사용하였다(좌측 블랙 피크). GO-702m 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 20. GO-702m(원) 및 GO-702m- AF(HCT-MUC1; 정사각형)의 ADCC 활성. 96-웰 플레이트의 HCT116/MUC1 세포를 이펙터 세포로서 Jurkat 세포(여기서, FcRIV에 대한 항체 결합은 NEAT 매개 루시퍼라제 발현에 연결된다)와 20:1의 E:T 비율로 6시간 동안 3배 연속 희석으로 1㎍/ml에서 시작하는 지시된 항체의 존재하에 배양하였다. 루시퍼라제 활성을 기질로서 루시페린을 사용하여 측정하고 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 농도에 대해 플롯팅하였다.
도 21. BT549 상의 GO-702m- IgG2a의 ADCC 활성. 96-웰 플레이트의 BT549 세포를 이펙터 세포로서 Jurkat 세포(여기서, FcRIV에 대한 항체 결합은 NEAT 매개 루시퍼라제 발현에 연결된다)와 20:1의 E:T 비율로 6시간 동안 3배 연속 희석으로 1㎍/ml에서 시작하는 지시된 항체의 존재하에 배양하였다. 루시퍼라제 활성을 기질로서 루시페린을 사용하여 측정하고 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 농도에 대해 플롯팅하였다. 정사각형= 아푸스코실화된 GO-702m 항체; 삼각형- wt GO-702m 항체.
도 22. MC-38/ MUC1 종양을 보유하는 MUC1.Tg 마우스에서 아푸코실화된 GO-702m의 효능. MC-38 과발현 MUC1 세포를 MUC1.Tg 마우스에 주사하였다. 10 내지 12일 후, 마우스를 2개의 상이한 그룹으로 무작위화하였다. 그룹 1: 비히클 대조군; 그룹 2: 아푸코실화된 GO-702m 항체 5mg/kg 주 1회 x 3주 IP. 종양 측정은 격일로 수행되었다. 다이아몬드: 비히클 대조군(그룹에 대한 평균 종양으로 제시된 곡선) 및 원: 아푸코실화된 GO-702m(개별 마우스에 대해 제시된 곡선). 체중 변화에는 큰 변화가 없었다. 효능은 최대 84일까지 제시된다.
도 23. HCT116 / MUC1 결장 암종 세포에서 hGO -702와 비교하여 hGO702 - AF 항체를 사용한 ADCC 시험관내 연구. 96-웰 플레이트의 HCT116/MUC1 세포를 이펙터 세포로서 Jurkat 세포(여기서, FcRIV에 대한 항체 결합은 NEAT 매개 루시퍼라제 발현에 연결된다)와 20:1의 E:T 비율로 6시간 동안 3배 연속 희석으로 1㎍/ml에서 시작하는 지시된 항체의 존재하에 배양하였다. 루시퍼라제 활성을 기질로서 루시페린을 사용하여 측정하고 농도에 대해 플롯팅하였다.
도 24. hGO -702와 비교하여 hGO702 - AF 항체를 사용하는 ADCC 생체내 연구. 6 내지 8주령 C57BL/6 마우스는 100㎕의 DMEM 배양 배지 중 인간 MUC1을 발현하는 마우스 결장 암종 세포(MuC38/MUC1)인 5 x 105 MC38/MUC1을 옆구리에 피하 주사하였다. 마우스는 두 개의 치료군(hGO-702-WT 그룹용 6마리 마우스 및 아푸코실화e도된(AF) hGO-702 그룹용 7마리 마우스)에 무작위화하였다. 평균 종양 용적이 70-130mm3에 도달했을 때, 마우스는 5mg/kg의 아푸코실화된 인간화 GO-702(hGO-702-AF) 또는 야생 형 인간화 GO-702(hGO-702-WT)로 주 1회 3주 동안 IP로 처리하였다. 종양 측정과 체중을 격일로 기록하였다. 종양이 다음 화학식: (폭)2 X 길이/2로 계산된 바와 같이 >2,000mm3에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 결과는 치료 일수에 대한 종양 용적(평균±SEM)으로 표시된다.
도 1a-d. 항체 서열. (도 1a) GO-701m 서열. (도 1b) GO-702m 서열. (도 1c) GO-702h 아미노산 서열. (도 1d) GO-702h 핵산 서열.
도 2. 키메라 항체 및 인간화 항체의 친화성 측정. 실시간 반응은 곡선으로 제시되었다. 비아코어 실험 데이터의 1:1 상호 작용 모델에의 맞춤은 블랙으로 제시되었다. 상부 패널에 사용되는 항원 농도는 각각 3.125nM, 6.25nM, 12.5nM, 25nM, 50nM이었다. 하부 패널에 사용되는 항원 농도는 각각 1.875nM, 3.75nM, 7.5nM, 15nM, 30nM, 60nM이었다.
도 3. 비-환원 조건하에 선택된 항체의 SDS-PAGE 결과. 환원 조건: 레인 M(마커); 레인 1(VH1+VL3); 레인 3(VH1+VL4); 레인 5(VH2+VL3); 레인 7(VH5+VL1); 레인 9(VH5+VL2); 레인 11(VH5+VL3); 레인 13(VH5+VH4). 비환원 조건: 레인 2(VH1+VL3); 레인 4(VH1+VL4); 레인 6(VH2+VL3); 레인 8(VH5+VL1); 레인 10(VH5+VL2); 레인 12(VH5+VL3); 레인 14(VH5+VH4); 레인 15(마우스 IgG).
도 4. 키메라 IgG 및 인간화 IgG의 친화성 측정. 실시간 반응은 컬러 곡선으로 제시되었다. 비아코어 실험 데이터의 1:1 상호 작용 모델에의 맞춤은 블랙으로 제시되었다. 항원 농도는 각각 1.875nM, 3.75nM, 7.5nM, 15nM, 30nM, 60nM이었다.
도 5. 유세포 분석에 의한 키메라 IgG 및 인간화 IgG의 친화성 비교. 항체를 HCT116/MUC1 세포와 함께 배양한 후, 2차 항체와 배양하였다. 결합은 유세포 분석에 의해 분석하였다.
도 6. HCT116 / MUC1에 대한 mAb의 농도 의존적 결합. 인간 IgG1로부터의 Fc를 함유하는 GO-702m 및 GO-702m/hFc 키메라 둘 다의 야생형 및 아푸코실화(AF) 형태를 상이한 농도(상기 제시된 바와 같음)의 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-hIGG-비오틴+스트렙타비딘-PE 또는 항-마우스 IgGk-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 농도 의존 방식으로 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다.
도 7. 도 6에 대한 음성 대조군으로 사용되는 미염색 세포.
도 8a-b. GO-702m은 알파-4 나선을 표적으로 한다. (도 8a) 58-aa 인간 MUC1-C(서열번호 2), 시노몰구스 원숭이(서열번호 38), 및 마우스(서열번호 39) Muc1-C 세포외 도메인의 aa 서열. α3 및 α4 나선이 강조된다. p62/p58 이종이량체의 NMR 분광법으로 제시된 바와 같이, mAb GO-702m 에피토프의 α4 나선으로의 국소화(Macao et al., 2006). (도 8b) 지시된 농도의 mAb GO-702m을 HCT116/벡터 또는 HCT116/MUC1 세포와 함께 배양하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 알파-4 나선의 경우 WT p58/p62 이종이량체 및 S33A, R34G, Y35A, N36A 돌연변이체 단백질 또는 알파-3 나선의 경우 D19E/V20A/T22A 돌연변이체 단백질에 대한 ELISA에 의한 mAb GO-702m(각 컬럼 세트 중 중간 막대)의 결합. mAb CD1(각 컬럼 세트 중 오른쪽 막대)은 대조군으로 사용되었다. MAb 3D1(각 컬럼 세트의 왼쪽 막대)은 알파-3-양성 결합의 대조군으로 사용되었다. 결과는 WT 단백질(>3.0 OD 단위)로 수득된 것과 비교하여 백분율 대조군 결합으로 표시된다.
도 9. HCT116 / MUC1에 대한 GO- 702mFc 키메라 mAb의 결합. 인간 IgG1 유래 Fc를 함유하는 동일한 것의 야생형 키메라(GO-702m/hFc) 및 아푸코실화 형태를 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-hIgG-비오틴+스트렙타비딘-PE 또는 항-마우스 IgGk-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다.
도 10a-b. 마우스 Fc 수용체( FcRIV )에 대한 GO-702h의 농도 의존적 결합. (도 10a) GO-702h의 야생형 및 아푸코실화(AF) 형태를 상이한 농도(상기 제시된 바와 같음)의 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-인간 IgG-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 농도 의존 방식으로 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다. (도 10b) GO-702h의 야생형(다이아몬드) 및 아푸코실화(AF) 형태(정사각형)를 상이한 농도의 세포와 함께 배양한 다음, 2차 시약으로서 항-인간 IgG-FITC와 배양하였다. 결합 효율은 농도 의존 방식으로 평균 형광 강도(MFI)로 나타내었다. 우측: 결합의 그래프 표현.
도 11. MAb(GO-702m-AF)로 처리된 MUC1.Tg 마우스의 혈액 화학 분석. MC-38/MUC1 종양을 보유하는 MUC1.Tg 마우스에 5mg/kg MAb 아푸코실화 GO-702m을 복강내 주입하였다. 완전한 혈액 화학을 수행하여 아푸코실화 GO-702m 항체의 임의의 독성을 평가하였다.
도 12. MAb(GO-702m-AF)로 처리된 MUCT1 - Tg 마우스의 혈액학 분석. MC-38/MUC1 종양을 보유하는 MUC1.Tg 마우스에 5mg/kg MAb 아푸코실화 GO-702m을 복강내 주입하였다. 완전한 혈액학 분석을 수행하여 아푸코실화 GO-702m 항체의 임의의 독성을 평가하였다.
도 13. HCT116 - MUC1 세포에 대한 GO-702m, GO-702h 및 GO-701m 항체의 결 합. 인간 MUC1로 과발현된 HCT116 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. 5㎍의 지시된 항-MUC1 항체 또는 아이소타입 대조군을 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 또는 항-인간 면역글로불린(1차 항체에 의존)을 2차 시약으로 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 14. 야생형 및 아푸코실화 GO-702h와 HCT116 / MUC1 세포의 결합. 인간 MUC1로 과발현된 HCT116 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. GO-702h 야생형, 아푸코실화된 GO-702h 또는 음성 대조군으로서 CD1 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-인간 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 15. HCT116 ± MUC -1을 사용한 GO-702m의 유세포 분석. MUC1이 없는 HCT116 세포(블랙) 및 인간 MUC1로 과발현된 HCT116 세포(회색)에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. GO-702m 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 16. ZR -75-1 세포에서 GO-702m의 유세포 분석. ZR -75-1 유방암 세포주에 대한 항체 결합. GO-702m 항-MUC1 항체(회색) 또는 음성 대조군으로서 MUC1 CD1 항체(블랙)를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 17. MCF -7/ CshRNA 대 MCF -7/ MUC1shRNA에서 GO-702m의 유세포 분석. MCF-7/MUC1shRNA(블랙) 또는 MCF-7/CshRNA(회색) 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. GO-702m 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 18. H-1975 NSCLC 세포에서 GO-702m의 유세포 분석. H-1975 NSCLC 세포주에 대한 항체 결합. GO-702m 항-MUC1 항체(회색) 또는 음성 대조군으로 IgG(블랙)를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 19. MDA -MB-468 CshRNA / MUC1shRNA에서 GO-702m의 유세포 분석. MSA-MB-468/MUXshRNA(우측 회색 피크) 또는 MDA-MB-468/CshRNA(좌측 회색 피크) 세포에 대한 항체 결합은 유세포 분석법으로 분석하였다. IgG를 음성 대조군으로서 사용하였다(좌측 블랙 피크). GO-702m 항-MUC1 항체를 얼음 상에서 60분 동안 세포와 함께 배양하였다. FITC-접합 염소 F(ab')2 항-마우스 면역글로불린을 2차 시약으로서 사용하였다. 세포 표면에 대한 항체 결합은 FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
도 20. GO-702m(원) 및 GO-702m- AF(HCT-MUC1; 정사각형)의 ADCC 활성. 96-웰 플레이트의 HCT116/MUC1 세포를 이펙터 세포로서 Jurkat 세포(여기서, FcRIV에 대한 항체 결합은 NEAT 매개 루시퍼라제 발현에 연결된다)와 20:1의 E:T 비율로 6시간 동안 3배 연속 희석으로 1㎍/ml에서 시작하는 지시된 항체의 존재하에 배양하였다. 루시퍼라제 활성을 기질로서 루시페린을 사용하여 측정하고 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 농도에 대해 플롯팅하였다.
도 21. BT549 상의 GO-702m- IgG2a의 ADCC 활성. 96-웰 플레이트의 BT549 세포를 이펙터 세포로서 Jurkat 세포(여기서, FcRIV에 대한 항체 결합은 NEAT 매개 루시퍼라제 발현에 연결된다)와 20:1의 E:T 비율로 6시간 동안 3배 연속 희석으로 1㎍/ml에서 시작하는 지시된 항체의 존재하에 배양하였다. 루시퍼라제 활성을 기질로서 루시페린을 사용하여 측정하고 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 농도에 대해 플롯팅하였다. 정사각형= 아푸스코실화된 GO-702m 항체; 삼각형- wt GO-702m 항체.
도 22. MC-38/ MUC1 종양을 보유하는 MUC1.Tg 마우스에서 아푸코실화된 GO-702m의 효능. MC-38 과발현 MUC1 세포를 MUC1.Tg 마우스에 주사하였다. 10 내지 12일 후, 마우스를 2개의 상이한 그룹으로 무작위화하였다. 그룹 1: 비히클 대조군; 그룹 2: 아푸코실화된 GO-702m 항체 5mg/kg 주 1회 x 3주 IP. 종양 측정은 격일로 수행되었다. 다이아몬드: 비히클 대조군(그룹에 대한 평균 종양으로 제시된 곡선) 및 원: 아푸코실화된 GO-702m(개별 마우스에 대해 제시된 곡선). 체중 변화에는 큰 변화가 없었다. 효능은 최대 84일까지 제시된다.
도 23. HCT116 / MUC1 결장 암종 세포에서 hGO -702와 비교하여 hGO702 - AF 항체를 사용한 ADCC 시험관내 연구. 96-웰 플레이트의 HCT116/MUC1 세포를 이펙터 세포로서 Jurkat 세포(여기서, FcRIV에 대한 항체 결합은 NEAT 매개 루시퍼라제 발현에 연결된다)와 20:1의 E:T 비율로 6시간 동안 3배 연속 희석으로 1㎍/ml에서 시작하는 지시된 항체의 존재하에 배양하였다. 루시퍼라제 활성을 기질로서 루시페린을 사용하여 측정하고 농도에 대해 플롯팅하였다.
도 24. hGO -702와 비교하여 hGO702 - AF 항체를 사용하는 ADCC 생체내 연구. 6 내지 8주령 C57BL/6 마우스는 100㎕의 DMEM 배양 배지 중 인간 MUC1을 발현하는 마우스 결장 암종 세포(MuC38/MUC1)인 5 x 105 MC38/MUC1을 옆구리에 피하 주사하였다. 마우스는 두 개의 치료군(hGO-702-WT 그룹용 6마리 마우스 및 아푸코실화e도된(AF) hGO-702 그룹용 7마리 마우스)에 무작위화하였다. 평균 종양 용적이 70-130mm3에 도달했을 때, 마우스는 5mg/kg의 아푸코실화된 인간화 GO-702(hGO-702-AF) 또는 야생 형 인간화 GO-702(hGO-702-WT)로 주 1회 3주 동안 IP로 처리하였다. 종양 측정과 체중을 격일로 기록하였다. 종양이 다음 화학식: (폭)2 X 길이/2로 계산된 바와 같이 >2,000mm3에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 결과는 치료 일수에 대한 종양 용적(평균±SEM)으로 표시된다.
본 발명자들은 MUC1-C 단백질의 외부 도메인의 58 아미노산 비방출 부분에 대한 항체를 생성하였다. 이러한 항체는 MUC1-C의 이 부분에 선택적으로 결합하는 것으로 입증되었고, 그 자체로 N-단말 영역의 절단 후 MUC1의 활성을 차단할 기회를 제시한다. 그들은 또한 N-말단 MUC1 도메인의 절단 후에도 MUC1-발현 암 세포에 치료 페이로드를 전달하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 이들 및 다른 측면은 아래에서 더 상세히 기재된다.
I.
MUC1
A. 구조
MUC1은 정상 분비 상피 세포의 정단 경계에서 발현되는 뮤신형 당단백질이다(Kufe et al., 1984). MUC1은 단일 폴리펩티드로서 합성 및 전구체의 소포체 내 두 서브유닛으로 절단 후 이종이량체를 형성한다(Ligtenberg et al., 1992). 절단은 자가촉매 공정에 의해 매개될 수 있다(Levitan et al., 2005). >250kDa MUC1 N-말단(MUC1 N-ter, MUC1-N) 서브유닛은 고도로 보존된 변이로 불완전하고 O-연결된 글리칸에 의해 변형된 20개의 아미노산 탠덤 반복체의 가변 수를 함유한다(Gendler et al., 1988; Siddiqui et al., 1988). MUC1-N은 72-아미노산 세포질 도메인(MUC1-C/CD), 28 아미노산 막관통 도메인(MUC1-C/TMD), 58 아미노산 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 이어서, 함께 이량체화하여 SEA 도메인을 형성하는 62 아미노산 영역을 포함하는 약 23kDa C-말단 서브유닛(MUC1 C-ter, MUC1-C)과의 이량화에 의해 세포 표면에 테더링된다(Merlo et al., 1989). MUC1-C/ECD의 58 아미노산 부분(이탤릭체)은 본 개시내용의 항체에 결합하는데 중요한 역할을 한다. 인간 MUC1-C 서열은 아래와 같다:
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFP ARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL(서열번호 1).
굵은 서열은 CD를 나타내고, 밑줄 친 부분은 올리고머-억제 펩티드이다. 정상 상피의 암종으로의 변형으로, MUC1은 시토졸 내 및 전체 세포 막 상에서 비정상적으로 과발현된다(Kufe et al., 1984; Perey et al., 1992). 세포 막-관련 MUC1은 클라트린-매개 엔도사이토시스에 의해 엔도좀을 표적으로 한다(Kinlogh et al., 2004). 또한, MUC1-N이 아닌 MUC1-C는 핵(Baldus et al., 2004; Huang et al., 2003; Li et al., 2003a; Li et al., 2003b; Li et al., 2003c; Wei et al., 2005; Wen et al., 2003) 및 미토콘드리아(Ren et al., 2004)를 표적으로 한다.
B. 기능
MUC1-C는 ErbB 수용체 패밀리의 구성원(Li et al., 2001b; Li et al., 2003c; Schroeder et al., 2001) 및 Wnt 이펙터, E-카테닌(Yamamoto et al., 1997)과 상호 작용한다. 표피 성장 인자 수용체 및 c-Src는 Y-46 상에서 MUC1 세포질 도메인(MUC1-CD)을 인산화시키고, 따라서 MUC1 및 E-카테닌의 결합을 증가시킨다(Li et al., 2001a; Li et al., 2001b). MUC1 및 E-카테닌의 결합은 또한 글리코겐 신타제 키나제 3β 및 단백질 키나제 Cδ에 의해 조절된다(Li et al., 1998; Ren et al., 2002). MUC1은 핵 내 β-카테닌과 공동 국소화하고(Baldus et al., 2004; Li et al., 2003a; Li et al., 2003c; Wen et al., 2003), Wnt 표적 유전자의 전사를 공동 활성화한다(Huang et al., 2003). 다른 연구는 MUC1이 또한 p53에 직접 결합하고 p53 표적 유전자의 전사를 조절한다는 것을 나타냈다(Wei et al., 2005). 특히, MUC1-C의 과발현은 앵커리지 독립적 성장 및 종양원성을 유도하기에 충분하다(Huang et al., 2003; Li et al., 2003b; Ren et al., 2002; Schroeder et al., 2004).
II.
모노클로날
항체 생산
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 더욱이, 상이한 결정 인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정 인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 이외에, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 변형제 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 개시내용에 유용한 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 감염 또는 면역화에 반응하는 항원 특이적 형질모세포인 항원 특이적 B 세포의 단일 세포 분류 또는 벌크 분류된 항원 특이적 수집에서 단일 세포로부터 연결된 중쇄 및 경쇄의 포획 후 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호). "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌(Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
"단리된 항체"는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 결정된 바와 바와 같은 항체의 95중량% 초과, 가장 특히 99중량% 초과로, (2) 회전 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로; 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로 재조합 세포 내 원위치에 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본적 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 이종사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄라는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적 이종사량체 단위로 구성되고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합되어 J 쇄와 함께 2 내지 5개의 기본적 4-쇄 단위를 포함하는 다가 집합체를 형성할 수 있다. IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000달톤이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 두 개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에 가변 영역(VH)에 이어, 알파 및 감마 쇄 각각에 대해 3개의 불변 도메인(CH) 및 mu 및 아이소타입에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N-말단에 가변 영역(VL)에 이어, 다른 말단에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 영역 사이에 계면을 형성하는 것으로 간주된다. VH와 VL의 쌍은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조와 특성에 대해, 예를 들어, 문헌(Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6)을 참조한다.
임의의 척추동물 종의 L 쇄는 이들의 불변 도메인(CL)의 아미노산 서열을 기초로 카파 및 람다라고 하는 2개의 명백하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 이들의 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입에 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 부류가 존재한다: 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 그들 감마 및 알파 부류는 CH 서열 및 기능에서 비교적 사소한 차이에 기초하여 하위부류로 추가로 나누어지며, 인간은 다음 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "가변적"은 V 도메인의 특정 세그먼트가 항체들 사이에서 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110-아미노산 스팬 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12 아미노산 길이인 "초가변 영역"이라는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 비교적 불변 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 구성을 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이는 베타-시트 구조를 연결하며, 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄 중 초가변 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합시키는데 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존 세포 식균 작용(ADCP), 항체-의존 호중구 식균 작용(ADNP) 및 항체-의존 보체 침착(ADCD)에서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 경우 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래 아미노산 잔기(예: 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따라 넘버링된 경우 VL 내의 대략 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 주위 및 VH 내의 대략 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 주위; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); 및/또는 "초가변 루프"(예: 초티아 넘버링 시스템(Chothia numbering system)에 따라 넘버링된 경우 VL 내의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 VH 내의 26-32(H1), 52-56(H2) 및 95-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); 및/또는 "초가변 루프"/CDR 유래 잔기들(예: IMGT 넘버링 시스템(IMGT numbering system)에 따라 넘버링된 경우 VL 내의 잔기 27-38(L1), 56-65(L2) 및 105-120(L3), 및 VH 내의 27-38(H1), 56-65(H2) 및 105-120(H3); Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000))을 포함한다. 임의로, 항체는 아호(AHo)에 따라 넘버링된 경우 VL 내의 다음 지점 28, 36(L1), 63, 74-75(L2) 및 123(L3), 및 VsubH 내의 28, 36(H1), 63, 74-75(H2) 및 123(H3) 중 하나 이상에 대칭적 삽입을 갖는다; Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001).
"생식계열 핵산 잔기"는 불변 또는 가변 영역을 인코딩하는 생식계열 유전자에서 자연적으로 발생하는 핵산 잔기를 의미한다. "생식계열 유전자"는 생식 세포(즉, 난자 또는 정자가 될 운명의 세포)에서 발견되는 DNA이다. "생식계열 돌연변이"는 생식 세포 또는 단일 세포 단계에서 접합체에서 발생한 특정 DNA의 유전 가능한 변화를 지칭하고, 자손에게 전달될 때, 이러한 돌연변이는 신체의 모든 세포에 통합된다. 생식계열 돌연변이는 단일 신체 세포에서 획득되는 체세포 돌연변이와 대조적이다. 일부 경우에, 가변 영역을 인코딩하는 생식계열 DNA 서열 중 뉴클레오티드가 돌연변이되고(즉, 체세포 돌연변이), 상이한 뉴클레오티드로 대체된다.
A. 일반적인 방법
UC1-C/ECD에 대한 항체는 당업계에 익히 공지된 바와 같이 표준 방법에 의해 생성될 수 있다(참조: 예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 미국 특허 제4,196,265호). 모노클로날 항체(mAb)를 생성하는 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하기 위한 것들과 동일한 라인을 따라 시작한다. 이들 방법 모두에 대한 첫 번째 단계는 적절한 숙주의 면역화 또는 이전 자연 감염으로 인해 면역이 있는 대상체의 식별이다. 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 면역화용으로 제공된 조성물은 이의 면역원성이 변할 수 있다. 따라서, 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 담체에 커플링시킴으로써 달성될 수 있는 바와 같이, 숙주 면역계를 증강시키는 것이 종종 필요하다. 예시적이고 바람직한 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 소 혈청 알부민(BSA)이다. 다른 알부민, 예를 들어, 난백 알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민도 또한 담체로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 담체 단백질에 접합시키기 위한 수단은 당업계에 익히 공지되어 있고, 글루타르알데히드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시석신이미드 에스테르, 카보디이미드 및 비스-비아조화 벤지딘을 포함한다. 또한, 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 보조제로서 공지된 면역 반응의 비특이적 자극제의 사용에 의해 향상될 수 있다. 예시적이고 바람직한 보조제는 완전 프로인트 보조제(사멸된 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 보조제 및 수산화알루미늄 보조제를 포함한다.
폴리클로날 항체의 생산에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역원의 성질뿐만 아니라 면역화에 사용되는 동물에 따라 달라진다. 다양한 경로가 면역원을 투여하기 위해 사용될 수 있다(피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복강내). 폴리클로날 항체의 생산은 면역 동물의 혈액을 면역화 후 다양한 지점에서 샘플링함으로써 모니터링할 수 있다. 두 번째 부스터 주사도 제공될 수 있다. 부스팅 및 역가 공정은 적절한 역가가 달성될 때까지 반복된다. 목적하는 수준의 면역원성이 수득되면, 면역화된 동물을 채혈하고 혈청을 단리시키고 저장할 수 있고/있거나, 동물을 사용하여 MAb를 생성할 수 있다.
면역화 후, 항체를 생산할 잠재력을 갖는 체세포, 특히 B 림프구(B 세포)는 MAb 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택된다. 이러한 세포는 생검화 비장 또는 림프절로부터 또는 순환하는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 이어서, 면역화된 동물로부터 항체 생산 B 림프구를 일반적으로 불멸화된 또는 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포였던 동물과 동일한 종 중 하나인 불멸 골수종 세포의 세포와 융합시킨다. 하이브리도마 생성 융합 절차에 사용하기에 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 비-항체 생산성이며, 높은 융합 효율, 및 목적하는 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 지원하는 특정 선택 배지에서 성장할 수 없도록 만드는 효소 결핍을 갖는다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 다수의 골수종 세포 중 어느 하나가 사용될 수 있다(Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984). 예를 들어, 면역화된 동물이 마우스인 경우, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 Bul을 사용할 수 있고; 래트인 경우, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210을 사용할 수 있으며; U-266, GM1500-GRG2, LiCR-LON-HMy2 및 UC729-6은 모두 인간 세포 융합과 관련하여 유용하다. 하나의 특정 뮤린 골수종 세포는 NG-1 골수종 세포주(또한, P3-NS-1-Ag4-1이라 칭명됨)이며, 이는 세포주 저장소 번호 GM3573을 요청함으로써 NIGMS 인간 유전자 돌연변이체 세포 저장소에서 쉽게 이용 가능하다. 사용될 수 있는 다른 마우스 골수종 세포주는 8-아자구아닌 내성 마우스 뮤린 골수종 SP2/0 비생산자 세포주이다. 보다 최근에, KR12(ATCC CRL-8658; K6H6/B5(ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668) 및 HMMA2.5(Posner et al., 1987)를 포함하는, 인간 B 세포와 함께 사용하기 위한 추가 융합 파트너 라인이 기재되었다. 본 개시내용의 항체는 SP2/0/mIL-6 세포주, SP2/0 라인의 IL-6 분비 유도체를 사용하여 생성되었다.
항체 생산 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 생성하기 위한 방법은 일반적으로 일반적으로 체세포와 골수종 세포를 2:1 비율로 혼합하는 단계를 포함하지만, 상기 비율은 세포막의 융합을 촉진시키는 제제 또는 제제들(화학적 또는 전기적)의 존재하에 각각 약 20:1 내지 약 1:1로 가변적일 수 있다. 센다이 바이러스를 이용한 융합 방법은 문헌(참조: Kohler and Milstein (1975; 1976))에 의해 기재되었고; 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들어, 37%(v/v) PEG를 사용하는 방법은 문헌(참조: Gefter et al. (1977))에 기재되어 있다. 전기적으로 유도된 융합 방법의 사용도 적절하다(Going, pp. 71-74, 1986).
융합 절차는 일반적으로 약 1 x 10-6 내지 1 x 10-8의 저주파에서 실행 가능한 하이브리드를 생성한다. 그러나, 생존 가능한 융합된 하이브리드는 선택 배지에서 배양함으로써 부모 주입 세포(특히, 일반적으로 계속 무기한으로 분할되는 주입된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에, 이는 문제가 되지 않는다. 선택 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 새로운(de novo) 합성을 차단하는 제제를 함유하는 것이다. 예시적이고 바람직한 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세트는 퓨린 및 피리미딘 모두의 새로운 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세트가 사용되는 경우, 배지는 뉴클레오티드의 공급원(HAT 배지)으로서 하이포크산틴 및 티미딘으로 보충된다. 아자세린이 사용되는 경우, 배지는 하이포크산틴으로 보충된다. 우아베인은 B 세포 공급원이 엡스타인 바 바이러스(EBV) 형질전환된 인간 B 세포주인 경우, 골수종에 융합되지 않은 EBV 형질전환 라인을 제거하기 위해 첨가된다.
바람직한 선택 배지는 HAT 또는 우아베인을 갖는 HAT이다. 뉴클레오티드 구조 경로를 작동할 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 구조 경로의 주요 효소, 예를 들어, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT)에 결함이 있으며, 그들은 생존할 수 없다. B 세포는 이러한 경로를 작동시킬 수 있지만, 그들은 배양시 제한된 수명을 갖고, 일반적으로 약 2주 이내에 사망한다. 따라서, 선택 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종 및 B 세포로부터 형성된 하이브리드이다. 융합에 사용된 B 세포의 공급원이 EBV-형질전환 B 세포의 라인인 경우, 여기에서와 같이, 우아베인은 또한 EBV-형질전환 B 세포가 약물 사멸에 취약하기 때문에 하이브리드의 약물 선택에 사용된 반면, 사용된 골수종 파트너는 우아베인 내성인 것으로 선택된다.
배양은 특정 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마의 집단을 제공한다. 전형적으로, 하이브리도마의 선택은 세포를 미세역가 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 배양한 다음, 목적하는 반응성에 대해 개별적 클론 상청액을 테스트하여(약 2 내지 3주 후) 수행된다. 검정, 예를 들어, 방사선 면역 검정, 효소 면역 검정, 세포독성 검정, 플라크 검정 도트 면역결합 검정 등은 민감하고, 간단하며 신속해야 한다.
이어서, 선택된 하이브리도마는 연속 희석되거나 유세포 분석 분류에 의해 정렬되고 개별 항체 생산 세포주로 클로닝된 단일 세포이고, 이어서 이 클론은 무한대로 전파되어 mAb를 제공할 수 있다. 세포주는 두 가지 기본적인 방법으로 MAb 생산을 위해 이용될 수 있다. 하이브리도마의 샘플은 동물(예: 마우스)에 (종종 복강내로) 주입될 수 있다. 임의로, 동물은 주사 전에 탄화수소, 특히 오일, 예를 들어, 프리스탄(테트라메틸펜타데칸)으로 프라이밍된다. 인간 하이브리도마가 이러한 방식으로 사용되는 경우, SCID 마우스와 같은 면역손상된 마우스를 주입하여 종양 거부 반응을 예방하는 것이 최적이다. 주입된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성된 특정 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 개발한다. 이어서, 동물의 체액, 예를 들어, 혈청 또는 복수액을 탭핑하여 MAb를 고농도로 제공할 수 있다. 개별 세포주는 또한 시험관내에서 배양될 수 있으며, 여기서 MAb는 그들이 고농도로 쉽게 수득될 수 있는 배양 배지에 자연적으로 분비된다. 대안적으로, 인간 하이브리도마 세포주는 세포 상청액에서 면역글로불린을 생산하기 위해 시험관내에서 사용될 수 있다. 세포주는 고순도의 인간 모노클로날 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화하기 위해 무혈청 배지에서의 성장에 적응될 수 있다.
어느 하나의 수단에 의해 생성된 mAb는 원하는 경우 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법, 예를 들어, FPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 본 개시내용의 모노클로날 항체의 단편은 효소, 예를 들어, 펩신 또는 파파인에 의한 소화를 포함하는 방법 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 정제된 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용에 포함되는 모노클로날 항체 단편은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
분자 클로닝 접근법이 사용되어 모노클로날을 생성할 수 있는 것도 또한 고려된다. 이를 위해, RNA는 하이브리도마 라인 및 RT-PCR에 의해 수득된 항체 유전자로부터 단리되고 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 대안적으로, 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고, 적절한 항체를 발현하는 파지미드는 바이러스 항원을 사용하는 패닝에 의해 선택된다. 종래의 하이브리도마 기술에 비해 이러한 접근법의 장점은 많은 항체의 대략 104배가 생성되고 단일 라운드로 스크리닝될 수 있고, 새로운 특이성이 적절한 항체를 찾을 기회를 더욱 증가시키는 H 및 L 쇄 조합에 의해 생성된다는 것이다.
본 개시내용에 유용한 항체의 생산을 교시하는, 본원에 각각 참조로 포함된 다른 미국 특허는 조합 접근법을 사용하는 키메라 항체의 생산을 기재하는 미국 특허 제5,565,332호; 재조합 면역글로불린 제제를 기재하는 미국 특허 제4,816,567호; 및 항체-치료제 접합체를 기재하는 미국 특허 제4,867,973호를 포함한다.
B. 본 개시내용의 항체
본 개시내용에 따른 항체는 제1 예에서 이들의 결합 특이성, 즉, 항체가 결합하는 에피토프에 의해 정의될 수 있다. 용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B-세포 에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비연속 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 보유되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 독특한 공간적 형태로 포함한다.
이 경우, p58/p62 이종이량체로부터, 에피토프의 주요 부분은 MUC1-C/ECD, 특히 SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAG(서열번호 2)에서 발견된다. 당업자는 당업자에게 익히 공지된 기술을 사용하여 제공된 항체의 결합 특이성/친화성을 평가함으로써 이러한 항체가 본 청구범위의 범위 내에 속하는지 여부를 결정할 수 있다.
항원 구조 기반 항체 프로파일링(ASAP)으로도 공지된 변형-보조 프로파일링(MAP)은 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 지시된 많은 수의 모노클로날 항체(mAb)를 분류하는 방법이다(참조: US 2004/0101920, 본원에 그 전체가 참조로 구체적으로 포함됨). 각 카테고리는 다른 카테고리로 표시된 에피토프와 뚜렷하게 상이하거나 부분적으로 중첩되는 독특한 에피토프를 반영할 수 있다. 이 기술은 특성화가 유전적으로 별개의 항체에 집중될 수 있도록 유전적으로 동일한 항체의 신속한 필터링을 허용한다. 하이브리도마 스크리닝에 적용될 때, MAP는 목적하는 특성을 갖는 mAb를 생산하는 희귀한 하이브리도마 클론의 식별을 용이하게 할 수 있다. MAP는 본 개시내용의 항체를 상이한 에피토프를 결합하는 항체의 그룹으로 분류하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 동일한 에피토프 또는 에피토프의 일부에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 특정 예시적인 항체와 표적 또는 이의 단편에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체를 또한 포함한다. 항체가 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용함으로써 기준 항체와 동일한 에피토프와 결합하는지 또는 이와의 결합에 대해 경쟁하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 기준과 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 기준 항체는 포화 조건하에 표적에 결합하도록 허용된다. 다음으로, 표적 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 시험 항체가 기준 항체와 포화 결합 후 표적 분자에 결합할 수 있는 경우, 시험 항체는 기준 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론지을 수 있다. 한편, 시험 항체가 기준 항체와 포화 결합 후 표적 분자에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
항체가 기준 항-MUC1 항체와의 결합을 위해 경쟁하는지를 결정하기 위해, 상기-기재된 결합 방법론은 두 배향으로 수행된다: 제1 배향에서, 기준 항체는 포화 조건하에 MUC1 항원에 결합한 후 MUC1 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가하도록 한다. 제2 배향에서, 시험 항체는 포화 조건하에 MUC1 항원 분자에 결합한 후 MUC1 분자에 대한 기준 항체의 결합을 평가하도록 한다. 두 배향에서, 제1 (포화)항체만이 MUC1에 결합할 수 있으면, 시험 항체와 기준 항체가 MUC1에 대한 결합을 위해 경쟁한다는 결론을 내린다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 기준 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 반드시 결합하지 않을 수 있지만 중첩 또는 인접한 에피토프를 결합시킴으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
두 항체는 각각이 항원에 대한 다은 부분의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하면 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합한다. 즉, 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100배 과량의 하나의 항체는 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 다른 하나의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 억제한다(참조: 예를 들어, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). 대안적으로, 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거하는 항원에서 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 두 항체는 중첩되는 에피토프를 갖는다.
이어서, 추가의 일상적 실험(예: 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)은 시험 항체의 관찰된 결합 부족이 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합에 기인하는지 또는 입체적 차단 (또는 다른 현상)이 관찰된 결합의 부족에 책임이 있는지 여부를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다. EM 또는 결정학에 의한 구조적 연구는 결합을 위해 경쟁하는 두 항체가 동일한 에피토프를 인식하는지 여부를 입증할 수 있다.
한 구현예에서, 항체는 면역글로불린 G(IgG) 항체 아이소타입이다. 인간의 혈청 면역글로불린의 대략 75%를 나타내는 IgG는 순환에서 발견되는 가장 풍부한 항체 아이소타입이다. IgG 분자는 혈장 B 세포에 의해 합성되고 분비된다. 인간에는 혈청 내의 풍부함(IgG1이 가장 풍부함) 순으로 명명된 4개의 IgG 서브클래스(IgG1, 2, 3 및 4)가 있다. Fc 수용체에 대해 높은 친화성을 갖는 것에서부터 전혀 친화성이 없는 범위이다.
IgG는 신체 조직의 감염을 조절할 수 있도록 하는 혈액 및 세포외 유체에서 발견되는 주요 항체 아이소타입이다. 바이러스, 박테리아 및 진균을 나타내는 많은 종류의 병원체를 결합시킴으로써, IgG는 신체를 감염으로부터 보호한다. 그것은 다수의 면역 메커니즘을 통해 이를 수행한다: 병원체의 IgG 매개 결합은 응집을 통해 함께 이들의 고정화 및 결합을 유발하고; 병원체 표면의 IgG 코팅(옵소닌화로서 공지됨)은 식세포 면역 세포에 의한 인식 및 섭취를 허용하고; IgG는 병원체 제거를 초래하는 면역 단백질 생산의 케스케이드인 보체 시스템의 고전적인 경로를 활성화하고; IgG는 또한 독소에 결합하여 중화시킨다. IgG는 또한 항체-의존 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 세포내 항체 매개 단백질분해에서 중요한 역할을 하며, 여기서 마킹된 비리온을 시토졸 내 프로테아좀에 지시하기 위해 TTR21(인간 내 IgG에 가장 큰 친화성을 갖는 수용체)에 결합한다. IgG는 또한 유형 II 및 유형 III 과민증과 관련이 있다. IgG 항체는 항체 반응의 부류 전환 및 성숙 후 생성되고, 따라서 2차 면역 반응에 주로 참여한다. IgG는 조직을 쉽게 관류할 수 있도록 하는 크기가 작은 단량체로서 분비된다. 그것은 인간 태반을 통한 통과를 용이하게 하는 수용체를 갖는 유일한 아이소타입이다. 모유에서 분비된 IgA와 함께 태반을 통해 흡수된 잔류 IgG는 자체 면역계가 발달하기 전에 체액성 면역을 신생아에게 제공한다. 초유는 높은 비율의 IgG, 특히 소 초유를 함유한다. 병원체에 대한 이전 면역성을 갖는 개체에서, IgG는 항원성 자극 후 약 24 내지 48시간에 나타난다.
또 다른 측면에서, 항체는 이들의 결합 특이성을 결정하는 이들의 가변 서열에 의해 정의될 수 있다. 예가 아래에 제공된다:
[표 1]
게다가, 항체 서열은 임의로 이하 더 상세히 논의된 방법을 사용하여 상기 제공된 서열과 상이할 수 있다. 예를 들어, 아미노 서열은 (a) 가변 영역이 경쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있으며, (b) 아미노산이 잔기의 화학적 성질에 크게 영향을 미치지 않으면서 상기 제시된 것들과 상이할 수 있으며(소위 보존적 치환), (c) 아미노산이, 소정의 백분율, 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성에 의해 상기 제시된 것들과 상이할 수 있다는 점에서 상기 제시된 것들과 상이할 수 있다. 대안적으로, 항체를 인코딩하는 핵산은 (a) 경쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있으며, (b) 코딩된 잔기를 변화시키지 않고 상기 제시된 것들과 상이할 수 있으며, (c) 소정의 백분율, 예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성에 의해 상기 제시된 것들과 상이할 수 있거나, (d) 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M NaCl로 제공되는 것과 같이 저염 및/또는 고온 조건에 의해 예시된 바와 같이, 매우 엄격성 조건하에 하이브리드화하는 능력에 의해 상기 제시된 것들과 상이할 수 있다.
아미노산 서열의 보존적 변화를 만드는 데 있어서, 아미노산의 수치 요법 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수치 요법 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적 수치 요법 특성은 생성되는 단백질의 2차 구조에 기여하는 것이 허용되며, 이는 차례로 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호 작용을 정의한다.
또한, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다. 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호는 이의 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성은 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다고 명시한다. 미국 특허 제4,554,101호에서 상세화된 바와 같이, 다음과 같은 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌(+3.0), 리신(+3.0), 및 히스티딘(-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트(+3.0±1), 글루타메이트(+3.0±1), 아스파라긴(+0.2), 및 글루타민(+0.2); 친수성, 비이온성 아미노산: 세린(+0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민(+0.2), 및 트레오닌(-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인(-1.0) 및 메티오닌(-1.3); 소수성, 비방향족 아미노산: 발린(-1.5), 류신(-1.8), 이소류신(-1.8), 프롤린(-0.5±1), 알라닌(-0.5), 및 글리신(0); 소수성, 방향족 아미노산: 트립토판(-3.4), 페닐알라닌(-2.5), 및 티로신(-2.3).
아미노산은 유사한 친수성을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고, 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것들이 특히 바람직하며, ±0.5 이내인 것들이 훨씬 더 특히 바람직하다.
상기 요약된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 전술된 다양한 특성을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, Wis)의 Lasergene suit의 Megalign 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 다음의 참조문헌에 기재된 몇 가지 정렬 방식을 구현한다: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.
대안적으로, 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌(Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482)의 국소 동일성 알고리즘, 문헌(Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443)의 동일성 정렬 알고리즘, 문헌(Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)의 유사성 방법의 검색, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터화 구현, 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성과 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 특정 예는 각각 문헌(Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402) 및 문헌(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들어, 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용되어 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 항체 서열의 재배열된 성질 및 각 유전자의 가변적인 길이는 단일 항체 서열에 대한 다중 라운드의 BLAST 검색을 필요로 한다. 또한, 상이한 유전자의 수동 조립은 어렵고 오류가 발생하기 쉽다. 서열 분석 도구 IgBAST(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/의 월드-와이드 웹)는 생식계열 V, D 및 J 유전자와의 일치, 재배열 접합에서의 세부 사항, Ig V 도메인 프레임워크 영역의 묘사 및 상보성 결정 영역을 식별한다. IgBLAST는 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 분석할 수 있고, 서열을 배치로 처리하고 생식계열 유전자 데이터베이스 및 다른 서열 데이터베이스에 대한 검색을 동시에 허용하여 아마 가장 잘 일치하는 생식계열 V 유전자가 누락될 가능성을 최소화할 수 있다.
하나의 예시적인 예에서, 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산될 수 있다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은 다음의 경우에 중단된다: 누적 정렬 점수가 최대 달성 값으로부터 X량 만큼 떨어지고; 누적 점수가 하나 이상의 음수 점수 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 이동하고; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드 길이(W) 11, 및 기대치(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 정렬, (B) 50, 기대치(E) 10, M=5, N=4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산할 수 있다. 각 방향에서 단어 히트의 확장은 다음의 경우에 중단된다: 누적 정렬 점수가 최대 달성 값으로부터 X량 만큼 떨어지고; 누적 점수가 하나 이상의 음수 점수 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 이동하고; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다.
하나의 접근법에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 발생하여 일치된 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 기준 서열 내의 총 위치의 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
항체를 정의하는 또 다른 방법은 임의의 하기 기재된 항체 및 이들의 항원-결합 단편의 "유도체"로서이다. 용어 "유도체"는 항원에 면역특이적으로 결합하지만, "부모" (또는 야생형) 분자에 비해 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 변형을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 이러한 아미노산 치환 또는 부가는 천연(즉, DNA-인코딩됨) 또는 비천연 아미노산 잔기를 도입할 수 있다. 용어 "유도체"는, 예를 들어, 강화된 또는 손상된 이펙터 또는 결합 특성을 나타내는 변이체 Fc 영역을 갖는 항체 등을 형성하기 위해, 예를 들어, 변이체로서 변경된 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 영역을 포함한다. 용어 "유도체"는 추가로 비아미노산 변형, 예를 들어, 글리코실화(예: 변경된 만노스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 푸코스, 글루코스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리콜뉴라민 등의 함량을 가짐), 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의해 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 연결될 수 있는 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 변경된 탄수화물 변형은 다음 중 하나 이상을 조절한다: 항체의 가용화, 항체의 세포하 수송 및 분비의 촉진, 항체 조립의 촉진, 구조적 완전성, 및 항체 매개 이펙터 기능. 특정 구현예에서, 변경된 탄수화물 변형은 탄수화물 변형이 결여된 항체에 비해 항체 매개 이펙터 기능을 향상시킨다. 변경된 항체 매개 이펙터 기능을 유도하는 탄수화물 변형은 당업계에 익히 공지되어 있다(예를 들어, 참조: Shields, R. L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001), Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). 탄수화물 함량을 변경하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Wallick, S. C. et al. (1988), J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M. H. et al. (1989), J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G. et al. (1995), Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003), Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R. L. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740)을 참조한다.
유도체 항체 또는 항체 단편은 비드 기반 또는 세포 기반 분석 또는 동물 모델에서의 생체내 연구에 의해 측정된 바와 같이 항체 의존 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존 세포 식균 작용(ADCP), 항체 의존 호중구 식균 작용(ADNP), 또는 항체-의존 보체 침착(ADCD) 기능에서 바람직한 수준의 활성을 부여하기 위해 조작된 서열 또는 글리코실화 상태로 생성될 수 있다.
유도체 항체 또는 항체 단편은 특정 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 유도체는 부모 항체와 유사하거나 동일한 기능을 보유할 것이다. 다른 구현예에서, 항체 유도체는 부모 항체에 비해 변경된 활성을 나타낼 것이다. 예를 들어, 유도체 항체 (또는 이의 단편)는 이의 에피토프에 보다 단단하게 결합하거나 부모 항체보다 단백질 분해에 더 내성일 수 있다.
C. 항체 서열의 조작
다양한 구현예에서, 다양한 이유, 예를 들어, 개선된 발현, 개선된 교차-반응성, 감소된 표적외 결합 또는 하나 이상의 천연 이펙터 기능, 예를 들어, 보체 의 활성화 또는 면역 세포(예: T 세포)의 동원의 폐지로 식별된 항체의 서열을 조작하도록 선택할 수 있다. 특히, IgM 항체는 IgG 항체로 전환될 수 있다. 다음은 항체 공학을 위한 관련 기술에 대한 일반적인 논의이다.
하이브리도마를 배양한 후 세포를 용해시키고, 총 RNA를 추출할 수 있다. 무작위 육량체는 RT와 함께 사용되어 RNA의 cDNA 카피를 생성할 수 있고, 이어서 모든 인간 가변 유전자 서열을 증폭시킬 것으로 예상되는 PCR 프라이머의 다중 혼합물을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생성물은 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝된 다음, 표준 벡터 프라이머를 사용하여 자동화된 DNA 서열분석에 의해 서열분석될 수 있다. 결합 및 중화의 검정은 하이브리도마 상청액으로부터 수집되고 단백질 G 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 정제된 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 재조합 전장 IgG 항체는 클로닝 벡터로부터 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 Lonza pConIgG1 또는 pConk2 플라스미드 벡터로 서브클로닝하여 생성되고, 293 프로스타일 세포 또는 Lonza CHO 세포로 형질감염되고, CHO 세포 상청액으로부터 수집 및 정제될 수 있다.
최종 cGMP 제조 공정과 동일한 숙주 세포 및 세포 배양 공정에서 생산된 항체의 신속한 가용성은 공정 개발 프로그램의 지속 기간을 감소시킬 잠재력을 갖는다. 론자는 CHO 세포에서 소량(최대 50g)의 항체의 신속한 생산을 위해 CDACF 배지에서 성장된 풀링된 형질감염체를 사용하여 일반적인 방법을 개발하였다. 진정한 일시적 시스템보다 약간 더 느리지만, 이점은 더 높은 생성물 농도 및 생산 세포주와 동일한 숙주 및 공정의 사용을 포함한다. 일회용 생물 반응기에서 모델 항체를 발현하는 GS-CHO 풀의 성장 및 생산성의 예: 공급-배치 모드로 작동되는 일회용 백 생물 반응기 배양(5L 작업 용적)에서, 2g/L의 수확 항체 농도가 9주의 형질감염 이내에 달성되었다.
pCon 벡터TM는 전체 항체를 재발현하는 쉬운 방법이다. 불변 영역 벡터는 pEE 벡터로 클로닝된 면역글로불린 불변 영역 벡터의 범위를 제공하는 벡터 세트이다. 이러한 벡터는 인간 불변 영역을 갖는 전장 항체의 쉬운 구성 및 GS System™의 편리성을 제공한다.
항체 분자는, 예를 들어, mAb의 단백질 분해 절단에 의해 생성되는 단편(예: F(ab'), F(ab')2), 또는, 예를 들어, 재조합 수단을 통해 생산 가능한 단일 쇄 면역글로불린을 포함할 것이다. 이러한 항체 유도체는 1가이다. 하나의 구현예에서, 이러한 단편은 서로, 또는 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합되어 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 유의하게, 이러한 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환기를 함유할 수 있다.
인간 요법에 사용될 때 임의의 면역 반응을 약화시키기 위해 비인간 숙주에서 생성된 항체를 "인간화"하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 인간화 항체는 시험관내 또는 생체내 맥락에서 연구될 수 있다. 인간화 항체는, 예를 들어, 항체의 면역원성 부분을 상응하지만 비면역원성 부분(즉, 키메라 항체)으로 대체함으로써 생성될 수 있다. PCT 출원 PCT/US86/02269; EP 출원 184,187; EP 출원 171,496; EP 출원 173,494; PCT 출원 WO 86/01533; EP 출원 125,023; Sun et al. (1987); Wood et al. (1985); and Shaw et al. (1988); 이 참조문헌 모두 본원에 참조로 포함된다. "인간화" 키메라 항체의 일반적인 검토는 문헌(Morrison (1985))에 의해 제공되며; 또한 본원에 참조로 포함된다. "인간화" 항체는 대안적으로 CDR 또는 CEA 치환에 의해 생성될 수 있다. Jones et al. (1986); Verhoeyen et al. (1988); Beidler et al. (1988); 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
관련 구현예에서, 항체는 개시된 항체의 유도체, 예를 들어, 개시된 항체에서의 것들과 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체(예: 키메라, 인간화 또는 CDR-그래프트 항체)이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 완전한 인간 재조합 항체이다.
Fc 변형. 본 개시내용은 또한 아이소타입 변형을 고려한다. Fc 영역을 상이한 아이소타입을 갖도록 변형시킴으로써, 상이한 기능성이 달성될 수 있다. 예를 들어, IgG1로 변경하면 항체 의존성 세포 세포독성을 증가시킬 수 있으며, 부류 A로 전환하면 조직 분포를 개선시킬 수 있고, 부류 M으로 전환하면 원자가를 개선시킬 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, IL-23pl9 결합 분자의 Fc 영역의 Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 기능을 변경시키는 하나 이상의 추가의 아미노산 변형과 아미노산 변형을 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 특정 관심의 결합 폴리펩티드는 Clq에 결합하고 보체 의존성 세포독성을 나타내는 것일 수 있다. 임의로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 갖는, 기존의 Clq 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는 이들 활성 중 하나 또는 둘 모두가 향상되도록 변형될 수 있다. Clq를 변경하고/하거나 이의 보체 의존성 세포독성 기능을 변경하는 아미노산 변형은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 WO/0042072에 기재되어 있다.
예를 들어, Clq 결합 및/또는 FcγR 결합을 변형시키고, 따라서 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써, 변경된 이펙터 기능을 갖는 항체의 Fc 영역을 설계할 수 있다. "이펙터 기능"은 생물학적 활성(예를 들어, 대상체에서)을 활성화 또는 감소시키는 책임이 있다. 이펙터 기능의 예는 Clq 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존 세포 매개 세포독성(ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 이펙터 기능은 Fc 영역이 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 결합될 것을 필요로 할 수 있고, 다양한 검정(예: Fc 결합 검정, ADCC 검정, CDC 검정 등)을 사용하여 평가될 수 있다.
예를 들어, 개선된 Clq 결합 및 개선된 FcγRIII 결합(예를 들어, 개선된 ADCC 활성 및 개선된 CDC 활성 모두를 가짐)을 갖는 항체의 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 대안적으로, 이펙터 기능이 감소되거나 절제되는 것이 목적시되는 경우, 변이체 Fc 영역은 감소된 CDC 활성 및/또는 감소된 ADCC 활성으로 조작될 수 있다. 다른 구현예에서, 이들 활성 중 하나만이 증가될 수 있고, 임의로, 또한 다른 활성은 감소될 수 있다(예를 들어, 개선된 ADCC 활성을 갖지만 감소된 CDC 활성을 갖거나 그 반대의 경우의 Fc 영역 변이체를 생성하기 위해).
FcRn 결합. Fc 돌연변이는 또한 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 상호 작용을 변경하고 이들의 약동학적 특성을 개선시키도록 도입되고 조작될 수 있다. FcRn에 대한 결합이 개선된 인간 Fc 변이체의 수집이 기재되어 있다(Shelds et al.,(2001)). FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRnR에 대한 인간 IgGl 상의 결합 부위의 고해상도 매핑 및 FcγR에 대한 결합이 개선된 IgG1 변이체의 설계(J. Biol. Chem. 276:6591-6604). 알라닌 스캐닝 돌연변이생성, 무작위 돌연변이생성 및 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 및/또는 생체내 거동을 평가하기 위한 스크리닝을 포함하는 기술을 통해 생성될 수 있는 아미노산 변형을 포함하여 증가된 반감기를 초래할 수 있는 다수의 방법이 공지된다(Kuo and Aveson, (2011)). 돌연변이생성에 따른 계산 전략은 또한 돌연변이할 아미노산 돌연변이 중 하나를 선택하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 FcRn에 대한 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단백질의 상기 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 상기 부모 폴리펩티드와 비교하여 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 Fc 영역의 아미노산에서 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링이다. 본 개시내용의 추가 측면에서, 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
추가로, 다양한 간행물은 FcRn-결합 폴리펩티드를 분자에 도입하거나, 분자를 FcRn-결합 친화성은 보존되었지만 다른 Fc 수용체에 대한 친화성은 크게 감소된 항체와 융합시키거나 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시킴으로써 반감기가 변형된 생리학적 활성 분자를 수득하기 위한 방법을 기재하고, 예를 들어, 문헌(Kontermann (2009))을 참조한다.
유도체화 항체가 사용되어 포유동물, 특히 인간에서 부모 항체의 반감기(예: 혈청 반감기)를 변경할 수 있다. 이러한 변경은 15일 초과, 바람직하게는 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과, 또는 5개월 초과의 반감기를 초래할 수 있다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 본 개시내용의 항체 또는 이의 단편의 증가된 반감기는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 더 높은 혈청 역가를 초래하고, 따라서 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고/시키거나, 투여될 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호 작용에 관여된 것으로 식별된 아미노산 잔기를 변형(예: 치환, 결실 또는 부가)함으로써 생성될 수 있다.
문헌(Beltramello et al. (2010))은 이전에 CH2 도메인의 위치 1.3 및 1.2의 류신 잔기(C-도메인에 대한 IMGT 고유 넘버링에 따라)가 알라닌 잔기로 치환된 경우를 생성함으로써 뎅기 바이러스 감염을 향상시키는 경향으로 인해 중화 mAb의 변형을 보고했다. "LALA" 돌연변이로서 공지되기도 한 이 변형은 문헌(Hessell et al. (2007))에 의해 기재된 바와 같이, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa에 대한 항체 결합을 폐지한다. 변이체 및 변형되지 않은 재조합 mAb는 4개의 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 감염을 중화시키고 향상시키는 용량에 대해 비교하였다. LALA 변이체는 변형되지 않은 mAb와 동일한 중화 활성을 유지했지만 활성 향상은 전혀 없었다. 따라서, 이러한 성질의 LALA 돌연변이가 현재 개시된 항체의 맥락에서 고려된다.
변경된 글리코실화 . 본 개시내용의 특정 구현예는 시알산, 갈락토스 또는 푸코스 없이 실질적으로 균질한 글리칸을 함유하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이들 모두는 각각 중쇄 또는 경쇄 불변 영역에 부착될 수 있다. 상기한 실질적으로 균질한 글리칸은 중쇄 불변 영역에 공유 부착될 수 있다.
본 개시내용의 다른 구현예는 신규한 Fc 글리코실화 패턴을 갖는 mAb를 포함한다. 단리된 모노클로날 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 GNGN 또는 G1/G2 글리코형태로 표시되는 실질적으로 균질한 조성물에 존재한다. Fc 글리코실화는 치료 mAb의 항바이러스 및 항암 특성에 중요한 역할을 한다. 본 개시내용은 시험관내 푸코스 부재 항-HIV mAb의 증가된 항렌티바이러스 세포 매개 바이러스 억제를 나타내는 최근 연구와 일치한다. 코어 푸코스가 결여된 균질한 글리칸을 사용하는 본 개시내용의 이 구현예는 2배 초과의 비율로 특정 바이러스에 대해 증가된 보호를 보여주었다. 코어 푸코스의 제거는 자연 살해(NK) 세포에 의해 매개된 mAb의 ADCC 활성을 극적으로 개선시키지만 다형핵 세포(PMN)의 ADCC 활성에 대한 반대 효과를 갖는 것으로 보인다.
GNGN 또는 G1/G2 글리코형태로 표시된 실질적으로 균질한 조성물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실질적으로 균질한 GNGN 글리코형태를 갖지 않고 G0, G1F, G2F, GNF, GNGNF 또는 GNGNFX 함유 글리코형태를 갖는 동일한 항체와 비교하여 Fc 감마 RI 및 Fc 감마 RIIII에 대한 증가된 결합 친화성을 나타낸다. 본 개시내용의 하나의 구현예에서, 항체는 1 x 10-8M 이하의 Kd로 Fc 감마 RI로부터 및 1 x 10-7M 이하의 Kd로 Fc 감마 RIII로부터 해리된다.
Fc 영역의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기의 부착을 지칭한다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에의 부착을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있다. 아스파라긴 측쇄 펩티드 서열에 탄수화물 모이어티의 효소 부착을 위한 인식 서열은 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩티드 중 이들 펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다.
글리코실화 패턴은, 예를 들어, 폴리펩티드에서 발견된 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 결실시키고/시키거나, 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위(들)를 부가함으로써 변경될 수 있다. 항체의 Fc 영역에 글리코실화 부위의 부가는 (N-연결된 글리코실화 부위를 위해) 상기 기재된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다. 예시적인 글리코실화 변이체는 중쇄의 잔기 Asn 297의 아미노산 치환을 갖는다. 변경은 또한 (O-연결된 글리코실화 부위를 위해) 원래 폴리펩티드의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 추가로, Asn 297의 Ala로의 변화는 글리코실화 부위 중 하나를 제거할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 베타 (1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnT III)을 발현하는 세포에서 발현되어 GnT III이 IL-23p19 항체에 GlcNAC를 부가하도록 한다. 이러한 방식으로 항체를 제조하는 방법은 WO/9954342, WO/03011878, 특허 공보 2003000307A1 및 문헌(Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999)에 제공된다. 세포주는 게놈 편집 기술, 예를 들어, 클러스터형 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repets; CRISPR)을 사용하여 글리코실화와 같은 특정 번역후 변형을 향상 또는 감소 또는 제거하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 기술을 사용하여 재조합 단클론 항체를 발현하는데 사용되는 293 또는 CHO 세포에서 글리코실화 효소를 인코딩하는 유전자를 제거할 수 있다.
모노클로날 항체 단백질 서열 책임성(liability)의 제거. 인간 B 세포로부터 수득된 항체 가변 유전자 서열을 조작하여 이들의 제조 가능성 및 안전성을 향상시킬 수 있다. 잠재적 단백질 서열 책임성은 다음을 함유하는 부위와 연관된 서열 모티프를 검색함으로써 식별될 수 있다:
1) 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기,
2) N-연결된 글리코실화,
3) Asn 탈아미드화,
4) Asp 이성체화,
5) SYE 절단,
6) Met 산화,
7) Trp 산화,
8) N-말단 글루타메이트,
9) 인테그린 결합,
10) CD11c/CD18 결합, 또는
11) 단편화.
이러한 모티프는 재조합 항체를 인코딩하는 cDNA에 대한 합성 유전자를 변경함으로써 제거될 수 있다.
치료 항체 개발 분야에서 단백질 조작 노력은 특정 서열 또는 잔기가 용해도 차이와 연관된다는 것을 명확하게 나타낸다(Fernandez-Escamilla et al., Nature Biotech., 22 (10), 1302-1306, 2004; Chennamsetty et al., PNAS, 106 (29), 11937-11942, 2009; Voynov et al., Biocon . Chem., 21 (2), 385-392, 2010). 문헌에서 용해도 변경 돌연변이의 증거는 일부 친수성 잔기, 예를 들어, 아스파르트 산, 글루탐산 및 세린은 다른 친수성 잔기, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 리신 및 아르기닌보다 단백질 용해도에 상당히 더 유리하게 기여한다는 것을 나타낸다.
안정성. 항체는 향상된 생물물리학적 특성을 위해 조작될 수 있다. 평균 겉보기 용융 온도를 사용하여 상대적 안정성을 결정하기 위해 항체를 펼치기 위해 상승된 온도를 사용할 수 있다. 시차 주사 열량 측정법(DSC)은 온도의 함수로서 분자의 열 용량, Cp(도당 그것을 가온시키는데 필요한 열)를 측정한다. DSC를 사용하여 항체의 열안정성을 연구할 수 있다. mAb에 대한 DSC 데이터는 때때로 mAb 구조 내의 개별 도메인의 전개를 해결하여 써모그램(Fab, CH2 및 CH3 도메인의 전개로부터)에서 최대 3개의 피크를 생산하기 때문에 특히 흥미롭다. 전형적으로 Fab 도메인의 전개는 가장 강한 피크를 생성한다. DSC 프로파일과 Fc 부분의 상대적 안정성은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스에 대한 특징적인 차이를 나타낸다(Garber and Demarest, Biochem . Biophys . Res. Commun . 355, 751-757, 2007). 또한, CD 분광계로 수행된 원형 이색성(CD)을 사용하여 평균 겉보기 용융 온도를 결정할 수 있다. 원자외선 CD 스펙트럼은 0.5nm 증분으로 200 내지 260nm 범위의 항체에 대해 측정될 것이다. 최종 스펙트럼은 20회 축적의 평균으로 결정될 수 있다. 잔기 타원율 값은 배경 감산 후에 계산될 수 있다. 항체의 열적 전개(0.1mg/mL)는 25 내지 95℃에서 235nm에서 1℃/분의 가열 속도로 모니터링될 수 있다. 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 응집 성향을 평가할 수 있다. DLS는 단백질을 포함하는 다양한 입자의 크기를 특성화하는 데 사용된다. 시스템이 크기로 분산되지 않으면, 입자의 평균 유효 직경이 결정될 수 있다. 이 측정은 입자 코어의 크기, 표면 구조의 크기 및 입자 농도에 의존한다. DLS는 본질적으로 입자로 인한 산란 광 세기의 변동을 측정하기 때문에, 입자의 확산 계수가 결정될 수 있다. 상업용 DLA 기기에서 DLS 소프트웨어는 상이한 직경의 입자 집단을 표시한다. 안정성 연구는 DLS를 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 샘플의 DLS 측정은 입자의 유체역학적 반경이 증가하는지 여부를 결정함으로써 입자가 시간 경과에 따라 또는 온도 변화에 따라 응집되는지 여부를 나타낼 수 있다. 입자가 응집되면, 더 큰 반경을 갖는 더 큰 입자 집단을 볼 수 있다. 온도에 따른 안정성은 현장 온도를 제어함으로써 분석될 수 있다. 모세관 전기영동(CE) 기술은 항체 안정성의 특징을 결정하기 위한 입증된 방법론을 포함한다. iCE 접근법을 사용하여 탈아미드화, C-말단 리신, 시알릴화, 산화, 글리코실화, 및 단백질의 pI의 변화를 초래할 수 있는 단백질에 대한 임의의 다른 변화로 인한 항체 단백질 전하 변이체를 해결할 수 있다. 발현된 항체 단백질 각각은 단백질 단순 모리스 기구를 사용하여 모세관 컬럼(cIEF)에서 높은 처리량, 유리 용액 등전 초점(IEF)에 의해 평가될 수 있다. 전체 컬럼 UV 흡수 검출은 등전점(pI)에서 초점을 맞춘 분자의 실시간 모니터링을 위해 30초 마다 수행될 수 있다. 이 접근법은 이동 단계의 필요성을 제거하면서 전통적인 겔 IEF의 고해상도를 컬럼 기반 분리에서 발견된 정량화 및 자동화의 장점과 결합한다. 기술은 발현된 항체에 대한 동일성, 순도 및 이질성 프로파일의 재현 가능한 정량 분석을 산출한다. 결과는 흡광도와 천연 형광 검출 모드 모두와 0.7μg/mL까지의 검출 감도로 항체 상의 전하 이질성 및 분자 크기를 식별한다.
용해도. 항체 서열의 고유 용해도 점수를 결정할 수 있다. 고유 용해도 점수는 CamSol 내재성을 사용하여 계산될 수 있다(Sormanni et al., J Mol Biol 427, 478-490, 2015). scFv와 같은 각 항체 단편의 HCDR3에서 잔기 95-102(카바트 넘버링)에 대한 아미노산 서열은 온라인 프로그램을 통해 평가하여 용해도 점수를 계산할 수 있다. 또한, 실험실 기술을 사용하여 용해도를 결정할 수 있다. 용액이 포화되고 용해도 한계에 도달할 때까지 동결 건조 단백질의 부가 또는 적절한 분자량 컷-오프를 가진 미세 농축기에서 한외여과에 의한 농축을 포함하는 다양한 기술이 존재한다. 가장 간단한 방법은 무정형 침전의 유도이고, 이는 황산암모늄을 사용하는 단백질 침전을 포함하는 방법을 사용하여 단백질 용해도를 측정한다(Trevino et al., J Mol Biol, 366: 449-460, 2007). 황산암모늄 침전은 상대적 용해도 값에 대한 신속하고 정확한 정보를 제공한다. 황산암모늄 침전은 잘 정의된 수성 및 고체 상을 갖는 침전된 용액을 생성하며 비교적 소량의 단백질을 필요로 한다. 황산암모늄에 의한 무정형 침전의 유도를 사용하여 수행된 용해도 측정은 또한 상이한 pH 값에서 용이하게 수행될 수 있다. 단백질 용해도는 매우 pH 의존적이며, pH는 용해도에 영향을 미치는 가장 중요한 외인성 인자로 간주된다.
자가 반응성. 일반적으로, 자기 반응성 클론은 음성 선택에 의해 개체 발생 동안 제거되어야 한다고 생각되지만, 자가 반응성 특성을 갖는 많은 인간 천연 항체가 성인 성숙한 레퍼토리에서 지속되고, 자가 반응성이 병원체에 대한 많은 항체의 항바이러스 기능을 향상시킬 수 있음이 명백해졌다. 초기 B 세포 개발 동안 항체의 HCDR3 루프는 종종 양전하가 풍부하고 자가 반응성 패턴을 나타낸다는 것이 주시되었다(Wardemann et al., Science 301, 1374-1377, 2003). 현미경 검사(부착형 HeLa 또는 HEp-2 상피 세포 사용) 및 유세포 분석 세포 표면 염색(현탁 Jurkat T 세포 및 293S 인간 배아 신장 세포 사용)에서 인간 기원 세포에 대한 결합 수준을 평가함으로써 자가 반응성을 위한 제공된 항체를 시험할 수 있다. 자가 반응성은 또한 조직 어레이에서 조직에 대한 결합의 평가를 사용하여 조사될 수 있다.
바람직한 잔기 ("인간 유사성"). 혈액 공여자로부터 인간 B 세포의 B 세포 레퍼토리 딥 서열분석은 많은 최근 연구에서 광범위한 규모로 수행되고 있다. 인간 항체 레퍼토리의 상당 부분에 대한 서열 정보는 건강한 인간에서 공통인 항체 서열 특징의 통계적 평가를 용이하게 한다. 인간 재조합 항체 가변 유전자 참조 데이터베이스에서 항체 서열 특징에 대한 지식으로, 항체 서열의 "인간 유사성"(HL)의 위치 특이적 정도가 추정될 수 있다. HL은 치료 항체 또는 백신으로서의 항체와 같이 임상 사용에서 항체의 개발에 유용한 것으로 나타났다. 목표는 항체의 인간 유사성을 증가시켜 항체 약물의 효능을 현저하게 감소시키거나 심각한 건강 효과를 유도할 수 있는 잠재적인 악영향과 항-항체 면역 반응을 감소시키는 것이다. 총 약 4억 개의 서열을 갖는 3명의 건강한 인간 혈액 공여자의 결합된 항체 레퍼토리의 항체 특성을 평가하고, 항체의 초가변 영역에 초점을 맞추는 신규한 "상대적 인간 유사성"(rHL) 점수를 생성할 수 있다. rHL 점수는 인간(양의 점수)과 비인간 서열(음의 점수)을 쉽게 구별할 수 있도록 한다. 항체는 인간 레퍼토리에서 통상적이지 않은 잔기를 제거하도록 조작될 수 있다.
변형된 항체는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 발현, 또는 폴리펩티드의 화학적 합성을 포함한 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현을 위한 방법은 본 문서의 다른 곳에서 다루어진다.
D. 발현
본 개시내용에 따른 핵산은 임의로 다른 단백질 서열에 연결된 항체를 인코딩할 것이다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "MUC1-C 항체를 인코딩하는 핵산"은 전체 세포 핵산이 없는 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 제시된 임의의 서열에 의해 인코딩되는 항체에 관한 것이다.
[표 2]
본 개시내용의 DNA 세그먼트는 상기 기재된 서열의 생물학적으로 기능적인 등가의 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 것들을 포함한다. 이러한 서열은 핵산 서열 및 따라서 인코딩된 단백질 내에서 자연적으로 발생하는 것으로 공지된 코돈 중복성 및 아미노산 기능적 등가성의 결과로서 발생할 수 있다. 대안적으로, 기능적으로 등가의 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술의 적용을 통해 생성될 수 있고, 여기서 단백질 구조의 변화는 교환되는 아미노산의 특성의 고려에 기초하여 조작될 수 있다. 사람에 의해 설계된 변화는 부위-지시된 돌연변이생성 기술의 적용을 통해 도입될 수 있거나, 무작위로 도입될 수 있고, 이하 기재된 바와 같이, 목적하는 기능에 대해 나중에 스크리닝될 수 있다.
특정 구현예 내에서, 발현 벡터는 이로부터 발현된 폴리펩티드를 생성하고 단리시키기 위해 MUC1-C 리간드 트랩을 발현시키는데 사용된다. 다른 구현예에서, 발현 벡터는 유전자 요법에 사용된다. 발현은 적절한 신호가 벡터에 제공될 것을 필요로 하고, 이는 숙주 세포에서 관심 유전자의 발현을 유도하는 바이러스성 및 포유류 공급원 모두로부터 인핸서/프로모터와 같은 다양한 조절 요소를 포함한다. 숙주 세포에서 메신저 RNA 안정성 및 번역성을 최적화하도록 설계된 요소도 정의된다. 생성물을 발현시키는 영구적이고 안정한 세포 클론을 확립시키기 위한 다수의 우성 약물 선택 마커의 사용 조건은 또한 약물 선택 마커의 발현을 폴리펩티드의 발현에 연결하는 요소와 같이 제공된다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "발현 작제물"은 서열을 인코딩하는 핵산의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전자 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 전사체는 단백질로 번역될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 특정 구현예에서, 발현은 유전자의 전사 및 mRNA의 유전자 산물로의 번역 모두를 포함한다. 다른 구현예에서, 발현은 관심 유전자를 인코딩하는 핵산의 전사만을 포함한다.
용어 "벡터"는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있으며, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 이질적이거나 서열이 일반적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치 중 세포 내의 서열과 상동성임을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예: YAC)를 포함한다. 당업자는 모두 본원에 참조로 포함된 문헌(Sambrook et al. (1989) and Ausubel et al. (1994))에 기재된 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하도록 잘 장착될 것이다.
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이어서 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 이러한 서열은, 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 지배하는 제어 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 또한 수행하는 핵산 서열을 함유할 수 있고, 아래에 기재된다.
1. 조절 요소
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 그것은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소, 예를 들어, RNA 중합효소 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 문구 "작동 가능하게 위치된", "작동 가능하게 연결된", "제어하에" 및 "전사 제어하에"는 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재함을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용성 조절 서열을 지칭하는 "인핸서"와 함께 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치된 5'-비코딩 서열을 단리시킴으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 하류 또는 상류에 위치된 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 특정 이점은 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 획득될 것이며, 이는 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 지칭한다.
재조합 또는 이종 인핸서는 또한 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 또는 "천연"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것 이외에, 서열은 본원에 개시된 조성물과 함께 PCR™을 포함한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(참조: 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호, 각각 본원에 참조로 포함됨). 더욱이, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내의 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 사용될 수 있음이 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포 유형, 소기관 및 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서, 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있으며, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌(Sambrook et al. (1989))을 참조한다. 사용된 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산에 유리한 것과 같은, 도입된 DNA 세그먼트의 고수준 발현을 지시하는 적절한 조건하에 구성적, 조직-특이적, 유도성이고/이거나 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
표 3은 본 개시내용의 맥락에서 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 여러 요소/프로모터를 나열한다. 이 목록은 발현의 촉진에 관여하는 모든 가능한 요소를 포괄하는 것으로 의도되지 않고, 단지 예시적인 것으로 의도된다. 표 4는 특정 자극에 반응하여 활성화될 수 있는 핵산 서열의 영역인 유도성 요소의 예를 제공한다.
[표 3]
[표 4]
조직 특이적 프로모터 또는 요소의 정체성뿐만 아니라 이들의 활성을 특성화하는 검정은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이러한 영역의 예는 인간 LIMK2 유전자(Nomoto et al. 1999), 소마토스타틴 수용체 2 유전자(Kraus et al., 1998), 뮤린 부고환 레틴산-결합 유전자(Lareyre et al., 1999), 인간 CD4(Zhao-Emonet et al., 1998), 마우스 알파2(XI) 콜라겐(Tsumaki, et al., 1998), D1A 도파민 수용체 유전자(Lee, et al., 1997), 인슐린 유사 성장 인자 II(Wu et al., 1997), 인간 혈소판 내피 세포 부착 분자-1(Almendro et al., 1996)을 포함한다. 종양 특이적 프로모터는 또한 본 개시내용에서 용도를 찾을 것이다. 일부 이러한 프로모터는 표 5에 제시되어 있다.
[표 5]
특정 개시 신호가 또한 코딩 서열의 효율적인 번역에 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 쉽게 이를 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 목적하는 코딩 서열의 판독 프레임과 함께 "프레임 내"여야 한다는 것이 익히 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 포함에 의해 향상될 수 있다.
2. IRES
본 개시내용의 특정 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소의 사용은 다중 유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5'-메틸화 Cap 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코르나바이러스 패밀리의 두 구성원(소아마비(polio) 및 뇌척수 심근염(encephalomyocarditis))으로부터의 IRES 요소(Pelletier and Sonenberg, 1988)뿐만 아니라 포유류 메시지로부터의 IRES(Macejak and Sarnew, 1991)가 기재되었다. IRES 요소는 이종성 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다수의 개방 판독 프레임이 함께 전사될 수 있고, 각각 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소에 의해, 각 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보좀에 접근 가능하다. 다중 유전자는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현되어 단일 메시지를 전사할 수 있다(참조: 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호, 본원에 참조로 포함됨).
3. 다목적
클로닝
부위
벡터는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있으며, 그 중 임의의 것은 벡터를 분해하기 위해 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있다. 본원에 참조로 포함된 문헌(Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997)을 참조한다. "제한 효소 소화"는 핵산 분자 내 특정 위치에서만 기능하는 효소를 갖는 핵산 분자의 촉매 절단을 지칭한다. 이러한 제한 효소의 다수는 시판되고 있다. 이러한 효소의 사용은 당업자에게 널리 이해된다. 빈번하게, 벡터는 MCS 내에서 절단하여 외인성 서열이 벡터에 결찰되도록 할 수 있는 제한 효소를 사용하여 선형화되거나 단편화된다. "결찰"은 서로 인접할 수 있거나 서로 인접하지 않을 수 있는 두 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다. 제한 효소 및 결찰 반응을 포함하는 기술은 재조합 기술의 기술 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
4.
스플라이싱
부위
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 RNA 스플라이싱을 경험하여 1차 전사체로부터 인트론을 제거할 것이다. 게놈 진핵생물 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적절한 처리를 보장하기 위해 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다(참조: Chandler et al., 1997, 본원에 참조로 포함됨).
5. 종결 신호
본 개시내용의 벡터 또는 작제물은 일반적으로 적어도 하나의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결자"는 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사체의 특정 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 구현예에서, RNA 전사체의 생산을 종료하는 종결 신호가 고려된다. 종결자는 바람직한 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요할 수 있다.
진핵생물 시스템에서, 종결자 영역은 또한 폴리아데닐화 부위를 노출시키기 위해 새로운 전사체의 부위 특이적 절단을 허용하는 특정 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이는 전사체의 3' 말단에 약 200 A 잔기(폴리A)의 스트레치를 부가하도록 특수화된 내인성 중합효소를 신호화한다. 이 폴리A 테일로 변형된 RNA 분자는 보다 안정적으로 보이고, 보다 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵생물을 포함하는 다른 구현예에서, 그 종결자는 RNA의 절단을 위한 신호를 포함하는 것이 바람직하고, 종결자 신호가 메시지의 폴리아데닐화를 촉진하는 것이 더욱 바람직하다. 종결자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메시지 수준을 향상시키고/시키거나 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 역할을 할 수 있다.
본 개시내용에 사용하기 위해 고려되는 종결자는, 예를 들어, 유전자의 종결 서열, 예를 들어, 소 성장 호르몬 종결자 또는 바이러스 종결 서열, 예를 들어, SV 종결자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 공지된 전사 종결자를 포함한다. 특정 구현예에서, 종결 신호는 서열 절단으로 인한 것과 같이, 전사 가능하거나 번역 가능한 서열의 부족일 수 있다.
6.
폴리아데닐화
신호
발현, 특히 진핵생물 발현에서, 전형적으로 전사체의 적절한 폴리아데닐화에 영향을 미치는 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 개시내용의 성공적인 실시에 중요한 것으로 간주되지 않고/않거나 임의의 이러한 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예는 SV40 폴리아데닐화 신호 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함하고, 편리하고/하거나 다양한 표적 세포에서 잘 작용하는 것으로 공지되어 있다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있거나 세포질 수송을 용이하게 할 수 있다.
7. 복제 기점(Origins of Replication)
숙주 세포에서 벡터를 전파하기 위해, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제 부위(종종 "ori"라 칭명됨)의 하나 이상의 기점을 함유할 수 있다. 대안적으로, 자율적으로 복제하는 서열(ARS)은 숙주 세포가 효모인 경우에 사용될 수 있다.
8. 선택 가능하고 스크리닝 가능한
마커
본 개시내용의 특정 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 식별될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 식별을 허용하는 세포에 식별 가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로, 선택 가능한 마커는 선택을 허용하는 속성을 부여하는 것이다. 양성의 선택 가능한 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 허용하는 것인 반면, 음성의 선택 가능한 마커는 이의 존재가 이의 선택을 방지하는 것이다. 양성의 선택 가능한 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로, 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 식별에 도움이 되며, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 가능한 마커이다. 조건의 구현에 기초하여 형질전환체의 차별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 이의 기준이 비색 분석인 GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 고려된다. 대안적으로, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 스크리닝 가능한 효소가 이용될 수 있다. 당업자는 또한 아마도 FACS 분석과 관련하여 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알 것이다. 사용된 마커는 유전자 산물을 인코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한, 중요하다고 간주되지 않는다. 선택 가능하고 스크리닝 가능한 마커의 추가 예는 당업자에게 익히 공지되어 있다.
9. 바이러스 벡터
세포를 효율적으로 감염시키거나 진입하고, 숙주 세포 게놈에 통합하고 바이러스 유전자를 안정적으로 발현하는 특정 바이러스 벡터의 능력은 다수의 상이한 바이러스 벡터 시스템의 개발 및 적용을 초래하였다(Robbins et al., 1998). 바이러스 시스템은 현재 생체외 및 생체내 유전자 전달을 위한 벡터로서 사용하기 위해 개발되고 있다. 예를 들어, 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 레트로바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터는 암, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 고셔병(Gaucher disease), 신장 질환(renal disease) 및 관절염(arthritis)과 같은 질환의 치료를 위해 현재 평가되고 있다(Robbins and Ghivizzani, 1998; Imai et al., 1998; 미국 특허 제5,670,488호). 하기 기재된 다양한 바이러스 벡터는 특정 유전자-치료 적용에 따라 특정 이점 및 단점을 제공한다.
아데노바이러스 벡터. 특정 구현예에서, 아데노바이러스 발현 벡터가 발현 작제물의 전달을 위해 고려된다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 패키징을 지지하고, (b) 그 안에 클로닝된 조직 또는 세포 특이적 작제물을 궁극적으로 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 해당 작제물을 포함하는 것을 의미한다.
아데노바이러스는 크기가 30 내지 35kb 범위인 게놈을 갖는 선형의 이중 가닥 DNA를 포함한다(Reddy et al., 1998; Morrison et al., 1997; Chillon et al., 1999). 본 개시내용에 따른 아데노바이러스 발현 벡터는 아데노바이러스의 유전적으로 조작된 형태를 포함한다. 아데노바이러스 유전자 전달의 이점은 비분할 세포를 포함한 매우 다양한 세포 유형을 감염시키는 능력, 중간 크기의 게놈, 조작의 용이성, 높은 감염성 및 높은 역가로 성장하는 능력을 포함한다(Wilson, 1996). 또한, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스 DNA가 다른 바이러스 벡터와 연관된 잠재적 유전자 독성 없이 에피솜 방식으로 복제할 수 있기 때문에 염색체 통합을 초래하지 않는다. 아데노바이러스는 또한 구조적으로 안정하며(Marleenfeld et al., 1999), 광범위한 증폭 후 게놈 재배열은 검출되지 않았다(Parks et al., 1997; Bett et al., 1993).
아데노바이러스 게놈의 두드러진 특징은 초기 영역(E1, E2, E3 및 E4 유전자), 중간 영역(pIX 유전자, Iva2 유전자), 후기 영역(L1, L2, L3, L4 및 L5 유전자), 주요 후기 프로모터(MLP), 역전된-말단-반복(ITR) 및 ψ 서열이다(Zheng, et al., 1999; Robbins et al., 1998; Graham and Prevec, 1995). 초기 유전자 E1, E2, E3 및 E4는 감염 후 바이러스로부터 발현되고, 바이러스 유전자 발현, 세포 유전자 발현, 바이러스 복제, 및 세포 아폽토시스의 억제를 조절하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또한, 바이러스 감염 동안, MLP가 활성화되어 아데노바이러스 캡슐화에 필요한 폴리펩티드를 인코딩하는 후기 (L) 유전자의 발현을 초래한다. 중간 영역은 아데노바이러스 캡시드의 성분을 인코딩한다. 아데노바이러스 역전 말단 반복체(ITR; 100-200 bp 길이)는 시스 요소이며, 복제의 기점으로서 기능하고 바이러스 DNA 복제에 필요하다. Ψ 서열은 아데노바이러스 게놈의 패키징에 필요하다.
유전자 전달 벡터로서 사용하기 위한 아데노바이러스를 생성하기 위한 공통 접근법은 E2, E3 및 E4 프로모터의 유도에 관여하는 E1 유전자의 결실(E1-)이다(Graham and Prevec, 1995). 이어서, 치료 유전자 또는 유전자들은 E1 유전자 대신 재조합적으로 삽입될 수 있으며, 여기서 치료 유전자(들)의 발현은 E1 프로모터 또는 이종 프로모터에 의해 구동된다. 이어서, E1-, 복제-결핍 바이러스는 트랜스로 E1 폴리펩티드를 제공하는 "헬퍼" 세포주(예: 인간 배아 신장 세포주 293)에서 증식된다. 따라서, 본 개시내용에서 E1-코딩 서열이 제거된 위치에서 형질전환 작제물을 도입하는 것이 편리할 수 있다. 그러나, 아데노바이러스 서열 내의 작제물의 삽입 위치는 본 개시내용에 중요하지 않다. 대안적으로, E3 영역, E4 영역의 일부 또는 모두가 결실될 수 있고, 여기서 진핵생물 세포에서 작동 가능한 프로모터의 제어하에 이종 핵산 서열이 유전자 전달에 사용하기 위한 아데노바이러스 게놈에 삽입된다(미국 특허 제5,670,488호; 미국 특허 제5,932,210호, 각각 본원에 구체적으로 포함됨).
아데노바이러스 기반 벡터가 다른 벡터 시스템에 비해 몇몇 고유한 이점을 제공하지만, 그들은 종종 벡터 면역원성, 재조합 유전자의 삽입을 위한 크기 제약 및 낮은 복제 수준에 의해 제한된다. 전장 디스트로핀 유전자 및 복제에 필요한 말단 반복체를 포함하는 모든 개방 판독 프레임이 결실된 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조(Haeker et al., 1996)는 상기 언급된 아데노바이러스 단점에 잠재적으로 유망한 몇몇 이점을 제공한다. 벡터는 293 세포에서 헬퍼 바이러스에 의해 높은 역가로 성장되었으며, mdx 마우스, 시험관내 근관 및 생체내 근섬유에서 디스트로핀을 효율적으로 형질도입할 수 있었다. 헬퍼-의존 바이러스 벡터가 이하에서 논의된다.
아데노바이러스 벡터를 사용하는 데 있어서 주요 관심사는 패키징 세포주에서 벡터 생산 동안 또는 개체의 유전자 요법 치료 동안 복제-적격 바이러스의 생성이다. 복제-적격 바이러스의 생성은 환자에 대한 의도하지 않은 바이러스 감염 및 병리학적 결과의 심각한 위협을 초래할 수 있다. 문헌(Armentano et al. (1990))은 복제-적격 아데노바이러스의 부주의한 생성 가능성을 제거하는 것으로 청구된 복제-결함 아데노바이러스 벡터의 제조를 기재한다(미국 특허 제5,824,544호, 본원에 구체적으로 참조로 포함됨). 복제-결함 아데노바이러스 방법은 결실된 E1 영역 및 재배치된 단백질 IX 유전자를 포함하며, 여기서 벡터는 이종성 포유류 유전자를 발현한다.
아데노바이러스 벡터가 복제 결함이거나 적어도 조건적으로 결함이라는 요건 이외에, 아데노바이러스 벡터의 성질은 본 개시내용의 성공적인 실시에 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 공지된 혈청형 및/또는 하위그룹 A-F 중 어느 하나일 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 조건부 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위해, 서브그룹 C의 아데노바이러스 유형 5가 바람직한 출발 물질이다. 이는 아데노바이러스 유형 5가 상당량의 생화학적 및 유전 정보가 공지되어 있는 인간 아데노바이러스이며, 그것이 역사적으로 아데노바이러스를 벡터로서 사용하는 대부분의 구성에 사용되어 왔기 때문이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 개시내용에 따른 전형적인 벡터는 복제 결함이며, 아데노바이러스 E1 영역을 갖지 않을 것이다. 아데노바이러스 성장 및 조작은 당업자에게 공지되어 있으며, 시험관내 및 생체내에서 광범위한 숙주 범위를 나타낸다(미국 특허 제5,670,488호; 미국 특허 제5,932,210호, 미국 특허 제5,824,544호). 이 바이러스 그룹은 높은 역가로, 예를 들어, ml당 109 내지 1011 플라크-형성 단위로 수득될 수 있으며, 그들은 매우 감염성이다. 아데노바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세포 게놈으로의 통합을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 외래 유전자는 에피솜이고, 따라서 숙주 세포에 대한 낮은 유전독성을 갖는다. 유전자 전달 벡터로서 아데노바이러스의 사용을 위해 많은 실험, 혁신, 전임상 연구 및 임상 시험이 현재 조사 중이다. 예를 들어, 간 질환(liver diseases)(Han et al., 1999), 정신 질환(psychiatric diseases)(Lesch, 1999)(Lesch, 1999), 신경학적 질환(Smith, 1998; Hermens and Verhaagen, 1998), 관상 동맥 질환(coronary diseases)(Feldman et al., 1996), 근육 질환(muscular diseases)(Petrof, 1998), 위장 질환(gastrointestinal diseases)(Wu, 1998) 및 다양한 암, 예를 들어, 결장직장암(Fujiwara and Tanaka, 1998; Dorai et al., 1999), 췌장암, 방광암(Irie et al., 1999), 두경부암(Blackwell et al., 1999), 유방암(Stewart et al., 1999), 폐암(Batra et al., 1999) 및 난소암(Vanderkwaak et al., 1999)에 대한 아데노바이러스 유전자 전달 기반 유전자 요법이 개발되고 있다.
레트로바이러스 벡터. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 유전자 전달을 위한 레트로바이러스의 사용이 고려된다. 레트로바이러스는 RNA 게놈을 포함하는 RNA 바이러스이다. 숙주 세포가 레트로바이러스에 의해 감염되면, 게놈 RNA는 감염된 세포의 염색체 DNA에 통합되는 DNA 중간체로 역전사된다. 이러한 통합된 DNA 중간체를 프로바이러스라고 한다. 레트로바이러스의 특별한 이점은 면역원성 바이러스 단백질을 발현하지 않고, 숙주 DNA에 통합함으로써 관심 유전자(예: 치료 유전자)로 분열하는 세포를 안정적으로 감염시킬 수 있다는 것이다. 이론적으로, 통합된 레트로바이러스 벡터는 관심 유전자를 발현하는 감염된 숙주 세포의 수명 동안 유지될 것이다.
레트로바이러스 게놈과 프로바이러스 DNA는 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열에 의해 인접된 3개의 유전자를 갖는다: gag, pol 및 env. gag 유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 인코딩하고; pol 유전자는 RNA-지시된 DNA 중합효소(역전사 효소)를 인코딩하고, env 유전자는 바이러스 엔벨로프 당단백질을 인코딩한다. 5' 및 3' LTR은 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진시키는 역할을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 모든 다른 시스-작용성 서열을 함유한다.
본 개시내용의 재조합 레트로바이러스는 천연 바이러스의 구조적 감염성 유전자의 일부가 제거되고 대신 표적 세포에 전달될 핵산 서열로 대체되는 방식으로 유전적으로 변형될 수 있다(미국 특허 제5,858,744호; 미국 특허 제5,739,018호, 각각 본원에 참조로 포함된다). 바이러스에 의한 세포의 감염 후, 바이러스는 이의 핵산을 세포에 주입하고, 레트로바이러스 유전 물질은 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다. 이어서, 전달된 레트로바이러스 유전 물질은 전사되고 숙주 세포 내의 단백질로 번역된다. 다른 바이러스성 벡터 시스템과 마찬가지로, 벡터 생산 동안 또는 요법 동안, 복제-적격 레트로바이러스의 생성이 주요 관심사이다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 표적 세포를 감염시킬 수 있고, 이들의 RNA 게놈을 역전사시킬 수 있고, 역전사된 DNA를 표적 세포 게놈에 통합시킬 수 있지만, 감염성 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해 표적 세포 내에서 복제할 수 없는 결함 레트로바이러스 벡터이다(예를 들어, 표적 세포로 전달된 레트로바이러스 벡터는 비리온 구조 단백질을 인코딩하는 유전자인 gag 및/또는 역전사 효소를 인코딩하는 유전자인 pol에서 결함이 있다). 따라서, 프로바이러스의 전사 및 감염성 바이러스로의 조립은 적절한 헬퍼 바이러스의 존재하에 또는 오염성 헬퍼 바이러스의 동시 생산 없이 캡슐화를 가능하게 하는 적절한 서열을 함유하는 세포주에서 발생한다.
레트로바이러스의 성장 및 유지는 당업계에 공지되어 있다(미국 특허 제5,955,331호; 미국 특허 제5,888,502호, 각각 구체적으로 본원에 참조로 포함된다). 문헌(Nolan et al.)은 이종 유전자를 포함하는 안정한 고역가, 헬퍼 비함유 레트로바이러스의 생산을 기재한다((미국 특허 제5,830,725호, 구체적으로 본원에 참조로 포함된다). 양쪽성 또는 생태 영양 숙주 범위를 갖는 헬퍼 비함유 재조합 레트로바이러스의 생성에 유용한 패키징 세포주를 작제하기 위한 방법뿐만 아니라 생체내 및 시험관내에서 진핵생물 세포로 관심 유전자를 도입하기 위해 재조합 레트로바이러스를 사용하는 방법이 본 개시내용에서 고려된다(미국 특허 제5,955,331호).
현재, 벡터 매개 유전자 전달에 대한 모든 임상 시험의 대부분은 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)-기반 레트로바이러스 벡터 유전자 전달을 사용한다(Robbins et al., 1998; Miller et al., 1993). 레트로바이러스 유전자 전달의 단점은 안정한 감염을 위한 진행 중인 세포 분열에 대한 요구 사항 및 큰 유전자의 전달을 방지하는 코딩 용량을 포함한다. 그러나, 특정 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 렌티바이러스(예: HIV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 및 말 감염성-빈혈 바이러스(EIAV)와 같은 벡터의 최근 개발은 잠재적으로 유전자 요법 적용을 위한 레트로바이러스 벡터의 생체내 사용을 허용한다(Amado and Chen, 1999; Klimatcheva et al., 1999; White et al., 1999; Case et al., 1999). 예를 들어, HIV 기반 벡터는 비분열 세포, 예를 들어, 뉴런(Miyatake et al., 1999), 섬(Leibowitz et al., 1999) 및 근육 세포(Johnston et al., 1999)를 감염시키는데 사용되어 왔다. 레트로바이러스를 통한 유전자의 치료적 전달은 현재 다양한 장애, 예를 들어, 염증성 질환(Moldower et al., 1999), AIDS(Amado and Chen, 1999; Engel and Kohn, 1999), 암(Clay et al., 1999), 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease)(Weihl et al., 1999) 및 혈우병(hemophilia)(Kay, 1998)의 치료에 대해 평가되고 있다.
헤르페스 바이러스 벡터. 단순 포진 바이러스(HSV) 유형 I 및 유형 II는 70 내지 80개의 유전자를 인코딩하는 대략 150kb의 이중 가닥 선형 DNA 게놈을 함유한다. 야생형 HSV는 세포를 용균적으로 감염시키고 특정 세포 유형(예: 뉴런)에서 잠복기를 확립할 수 있다. 아데노바이러스와 유사하게, HSV는 또한 근육(Yeung et al., 1999), 귀(Derby et al., 1999), 눈(Kaufman et al., 1999), 종양(Yoon et al., 1999; Howard et al., 1999), 폐(Kohut et al., 1998), 뉴런(Garrido et al., 1999; Lachmann and Efstathiou, 1999), 간(Miytake et al., 1999; Kooby et al., 1999) 및 췌장 섬(Rabinovitch et al., 1999)을 포함한 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다.
HSV 바이러스 유전자는 세포 RNA 중합효소 II에 의해 전사되고 시간적으로 조절되어 대략 3개의 식별 가능한 단계 또는 동역학 부류에서 유전자 산물의 전사 및 후속적 합성을 초래한다. 이러한 유전자의 단계는 즉각적인 조기(IE) 또는 α 유전자, 조기(E) 또는 β 유전자 및 후기(L) 또는 γ 유전자로서 지칭된다. 새로 감염된 세포의 핵에서 바이러스의 게놈의 도착 직후, IE 유전자가 전사된다. 이러한 유전자의 효율적인 발현은 이전 바이러스 단백질 합성을 필요로 하지 않는다. IE 유전자의 생성물은 전사를 활성화하고 바이러스 게놈의 나머지를 조절하는데 필요하다.
치료 유전자 전달에 사용하기 위해, HSV는 복제 결함이도록 해야 한다. 복제-결함 HSV 헬퍼 바이러스 비함유 세포주를 생성하기 위한 프로토콜이 기재되어 있다(미국 특허 제5,879,934호; 미국 특허 제5,851,826호, 각각 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함된다). α4 또는 Vmw175로도 공지된 하나의 IE 단백질인 ICP4는 바이러스 감염성 및 IE에서 이후 전사로의 전환 모두에 절대적으로 필요하다. 따라서, ICP4는 복잡하고 다기능적 성질 및 HSV 유전자 발현의 조절에 있어서 중심적인 역할로 인해, 전형적으로 HSV 유전자 연구의 표적이었다.
ICP4가 결실된 HSV 바이러스의 표현형 연구는 이러한 바이러스가 유전자 전달 목적에 잠재적으로 유용할 것이라는 것을 나타낸다(Krisky et al., 1998a). 유전자 전달에 바람직하도록 하는 ICP4가 결실된 바이러스의 한 가지 특성은 바이러스의 구조적 단백질뿐만 아니라 바이러스 DNA 합성을 지시하는 단백질을 인코딩하는 바이러스 유전자의 발현 없이 5개의 다른 IE 유전자만을 발현한다는 것이다: ICP0, ICP6, ICP27, ICP22 및 ICP47(DeLuca et al., 1985). 이 특성은 숙주 세포 대사 또는 유전자 전달 후 면역 반응에 대한 가능한 유해한 영향을 최소화하는 데 바람직하다. ICP4 이외에, IE 유전자 ICP22 및 ICP27의 추가 결실은 HSV 세포독성의 감소를 실질적으로 개선하고 조기 및 후기 바이러스 유전자 발현을 방지한다(Krisky et al., 1998b).
유전자 전달에서 HSV의 치료 잠재력은 파킨슨병(Parkinson's)(Yamada et al., 1999), 망막모세포종(retinoblastoma)(Hayashi et al., 1999), 뇌내 및 피내 종양(Moriuchi et al., 1998), B-세포 악성 종양(Suzki et al., 1998), 난소 암(Wang et al., 1998) 및 뒤셴형 근이영양증(Huard et al, 1997)과 같은 질환에 대해 다양한 시험관내 모델 시스템 및 생체내에서 입증되었다.
아데노 -관련 바이러스 벡터. 파보바이러스 패밀리의 구성원인 아데노 관련 바이러스(AAV)는 유전자 전달 치료제에 점점 더 많이 사용되고 있는 인간 바이러스이다. AAV는 다른 바이러스 시스템에서 발견되지 않는 몇 가지 유리한 특징을 갖는다. 첫째, AAV는 비분열 세포를 포함하는 광범위한 범위의 숙주 세포를 감염시킬 수 있다. 둘째, AAV는 상이한 종으로부터 세포를 감염시킬 수 있다. 셋째, AAV는 임의의 인간 또는 동물 질환과 연관되지 않고, 통합시 숙주 세포의 생물학적 특성을 변경시키는 것으로 나타나지 않는다. 예를 들어, 인간 집단의 80 내지 85%가 AAV에 노출된 것으로 추정된다. 마지막으로, AAV는 그 자체로 생산, 저장 및 수송 요건에 적합한 광범위한 물리적 및 화학적 조건에서 안정하다.
AAV 게놈은 4681개의 뉴클레오티드를 함유하는 선형의 단일 가닥 DNA 분자이다. AAV 게놈은 일반적으로 길이 약 145bp의 역전된 말단 반복체(ITR)에 의해 각 단부 상에 인접된 내부 비반복 게놈을 포함한다. ITR은 DNA 복제의 기점과 바이러스 게놈에 대한 패키징 신호를 포함하는 여러 기능을 갖는다. 게놈의 내부 비반복 부분은 AAV 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자로 공지된 2개의 큰 개방 판독 프레임을 포함한다. rep 및 cap 유전자는 바이러스가 바이러스 게놈을 비리온으로 복제 및 포장할 수 있도록 하는 바이러스 단백질을 코딩한다. 적어도 4개의 바이러스 단백질의 패밀리는 겉보기 분자량에 따라 명명된 AAV rep 영역, Rep 78, Rep 68, Rep 52, 및 Rep 40으로부터 발현된다. AAV cap 영역은 적어도 3개의 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 인코딩한다.
AAV는 AAV 비리온을 형성하기 위해 헬퍼 바이러스(예: 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백시니아)에 의한 공동감염을 요구하는 헬퍼-의존 바이러스이다. 헬퍼 바이러스에 의한 공동감염의 부재하에, AAV는 바이러스 게놈이 숙주 세포 염색체에 삽입되는 잠복 상태를 확립하지만 감염성 비리온은 생성되지 않는다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속적 감염은 통합된 게놈을 "구조하여" 이의 게놈을 감염성 AAV 비리온으로 복제하고 포장할 수 있도록 한다. AAV는 상이한 종으로부터 세포를 감염시킬 수 있지만, 헬퍼 바이러스는 숙주 세포와 동일한 종이어야 한다(예를 들어, 인간 AAV는 개 아데노바이러스로 공동감염된 개 세포에서 복제될 것이다).
AAV는 AAV 게놈의 내부 비반복 부분을 결실시키고 ITR 사이에 이종 유전자를 삽입함으로써 관심 유전자를 전달하도록 조작되었다. 이종 유전자는 표적 세포에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 이종 프로모터(구성적, 세포 특이적 또는 유도성)에 기능적으로 연결될 수 있다. 이종 유전자를 함유하는 감염성 재조합 AAV(rAAV)를 생산하기 위해, 적합한 생산자 세포주를 이종 유전자를 함유하는 rAAV 벡터로 형질감염시킨다. 생산자 세포는 그들 각각의 내인성 프로모터 또는 이종 프로모터의 제어하에 AAV rep 및 cap 유전자를 보유하는 제2 플라스미드로 동시에 형질감염시킨다. 마지막으로, 생산자 세포는 헬퍼 바이러스로 감염된다.
일단 이러한 인자가 함께 모이면, 이종 유전자는 마치 야생형 AAV 게놈인 것처럼 복제되고 포장된다. 표적 세포가 생성되는 rAAV 비리온으로 감염되면, 이종 유전자가 들어가서 표적 세포에서 발현된다. 표적 세포는 rep 및 cap 유전자와 아데노바이러스 헬퍼 유전자가 부족하기 때문에, rAAV는 추가로 야생형 AAV를 복제, 포장 또는 형성할 수 없다.
그러나, 헬퍼 바이러스의 사용은 다수의 문제를 제시한다. 첫째, rAAV 생산 시스템에서 아데노바이러스의 사용은 숙주 세포가 rAAV 및 감염성 아데노바이러스 모두를 생산하도록 한다. 오염성 감염성 아데노바이러스는 열 처리(56℃, 1시간 동안)에 의해 비활성화될 수 있다. 그러나, 열 처리는 기능적 rAAV 비리온의 역가에서 대략 50% 감소를 초래한다. 둘째, 다양한 양의 아데노바이러스 단백질이 이들 제제에 존재한다. 예를 들어, 이러한 rAAV 비리온 제제에서 수득된 총 단백질의 약 50% 이상이 유리 아데노바이러스 섬유 단백질이다. 완전히 제거되지 않은 경우, 이들 아데노바이러스 단백질은 환자로부터 면역 반응을 유도할 가능성을 갖는다. 셋째, 헬퍼 바이러스를 사용하는 AAV 벡터 생산 방법은 특히 헤르페스 바이러스의 사용과 관련하여 다수의 건강 및 안전 문제를 제공하는 많은 양의 고역가 감염성 헬퍼 바이러스의 사용 및 조작을 필요로 한다. 넷째, rAAV 비리온 생산 세포에서 헬퍼 바이러스 입자의 수반되는 생산은 rAAV 비리온 생산으로부터 많은 양의 숙주 세포 자원을 전환시켜 잠재적으로 낮은 rAAV 비리온 수율을 초래한다.
렌티바이러스 벡터. 렌티바이러스는 공통 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에, 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복잡한 레트로바이러스이다. 복잡도가 높을수록 잠재적 감염 과정에서와 같이 바이러스가 이의 생활 주기를 조절할 수 있게 한다. 렌티바이러스의 일부 예는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 유인원 면역결핍 바이러스: SIV를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자를 증식 감쇠시킴으로써 생성되었고, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu and nef가 결실되어 벡터가 생물학적으로 안전하게 만든다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현 모두에 사용될 수 있다. 렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 레트로바이러스에서 발견된 3개의 유전자: gag, pol 및 env를 갖고, 이는 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열에 의해 인접된다. gag 유전자는 내부 구조적 (매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 인코딩하고; pol 유전자는 RNA-지시된 DNA 중합효소(역전사 효소), 프로테아제 및 인테그라제를 인코딩하고; env 유전자는 바이러스 엔벨로프 당단백질을 인코딩한다. 5' 및 3' LTR'는 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진시키는 역할을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 모든 다른 시스 작용성 서열을 함유한다. 렌티바이러스는 vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx를 포함하는 추가 유전자를 갖는다.
5' LTR에 인접한 것은 게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 바이러스 RNA의 입자로의 효율적인 캡슐화(Psi 부위)에 필요한 서열이다. 캡슐화(또는 레트로바이러스 RNA의 감염성 비리온으로의 패키징)에 필요한 서열이 바이러스 게놈으로부터 누락되면, 시스 결함은 게놈 RNA의 캡슐화를 방지한다. 그러나, 생성되는 돌연변이체는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 문헌(Naldini et al., (1996); Zufferey et al., (1997); 미국 특허 제6,013,516호; 및 제5,994,136호)을 참조한다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스-기반이고, 외래 핵산을 통합하고, 핵산을 선택하고 숙주 세포로 전달하기 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 관심 벡터의 gag, pol 및 env 유전자도 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 관련 유전자는 선택된 벡터로 클로닝된 다음, 관심 표적 세포를 형질전환하는데 사용된다.
재조합 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 여기서 적절한 숙주 세포는 패키징 기능을 운반하는 둘 이상의 벡터, 즉 gag, pol 및 env로 형질감염될 뿐만 아니라 rev와 tat는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있다. 이는 바이러스 gag 및 pol 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있는 제1 벡터 및 바이러스 env를 인코딩하는 핵산을 제공하여 패키징 세포를 생산할 수 있는 다른 벡터를 기재한다. 본 개시내용에서 STAT-1α 유전자와 같은 이종 유전자를 제공하는 벡터를 그 패키징 세포에 도입하면 관심 외래 유전자를 운반하는 감염성 바이러스 입자를 방출하는 생산자 세포를 산출한다. env는 바람직하게는 인간 및 다른 종의 세포의 형질도입을 허용하는 양쪽성 엔벨로프 단백질이다.
특정 세포 유형의 수용체를 표적화하기 위한 항체 또는 특정 리간드와 엔벨로프 단백질의 결합에 의해 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 관심 서열(조절 영역 포함)을 특정 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 인코딩하는 다른 유전자와 함께 바이러스 벡터에 삽입함으로써, 예를 들어, 벡터는 이제 표적 특이적이다.
바이러스 env 핵산 서열을 제공하는 벡터는 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서와 작동 가능하게 연관된다. 조절 서열은, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소, 인간 사이토메갈로바이러스 인핸서 또는 백시니아 P7.5 프로모터를 포함하는 임의의 진핵생물 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 일부 경우, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소에서, 프로모터-인핸서 요소는 LTR 서열 내에 또는 인접하여 위치된다.
이종 또는 외래 핵산 서열, 예를 들어, 본원에서 STAT-1α 인코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 조절 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 프로모터에 연결되어 키메라 유전자를 초래한다. 이종 핵산 서열은 또한 바이러스 LTR 프로모터-인핸서 신호 또는 내부 프로모터의 제어하에 있을 수 있고, 레트로바이러스 LTR 내에 보유된 신호는 여전히 도입유전자의 효율적인 발현을 일으킬 수 있다. 마커 유전자는 벡터의 존재에 대해 검정하고, 따라서 감염 및 통합을 확인하기 위해 활용될 수 있다. 마커 유전자의 존재는 삽입물을 발현하는 숙주 세포의 선택 및 성장을 보장한다. 전형적인 선택 유전자는 항생제 및 다른 독성 물질, 예를 들어, 히스티디놀, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 네오마이신, 메토트렉세이트 등 및 세포 표면 마커에 대한 내성을 부여하는 단백질을 인코딩한다.
벡터는 형질감염 또는 감염을 통해 패키징 세포주에 도입된다. 패키징 세포주는 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 입자를 생성한다. 형질감염 또는 감염을 위한 방법은 당업자에 의해 익히 공지되어 있다. 패키징 벡터 및 전달 벡터의 패키징 세포주로의 공동형질감염 후, 재조합 바이러스는 배양 배지로부터 회수되고 당업자에 의해 사용된 표준 방법에 의해 적정된다. 따라서, 패키징 작제물은 일반적으로 우성 선택 가능한 마커, 예를 들어, neo, DHFR, Gln 신세타제 또는 ADA와 함께 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공에 이어, 적절한 약물의 존재하에 선택 및 클론의 단리에 의해 인간 세포주에 도입될 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 작제물 내의 패키징 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
렌티바이러스 전달 벡터(Naldini et al.(1996))는 시험관내에서 성장 정지된인간 세포를 감염시키고 성체 래트의 뇌에 직접 주사 후 뉴런을 형질도입하는데 사용되어 왔다. 벡터는 생체내 마커 유전자를 뉴런으로 전달하는 데 효율적이었고, 검출 가능한 병리학의 부재하에 장기간 발현이 달성되었다. 벡터의 단일 주사 10개월 후 분석된 동물은 도입유전자 발현의 평균 수준의 감소와 조직 병리학 또는 면역 반응의 징후를 나타내지 않았다(Blomer et al., 1997). 따라서, 본 개시내용에서, 생체외에서 재조합 렌티바이러스로 감염된 세포를 이식 또는 이식할 수 있거나, 생체내에서 세포를 감염시킬 수 있다.
다른 바이러스 벡터. 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터의 개발 및 유용성은 지속적으로 개선되고 진화하고 있다. 폭스바이러스와 같은 다른 바이러스 벡터; 예를 들어, 백시니아 바이러스(Nant et al., 1999; Gnant et al., 1999), 알파 바이러스; 예를 들어, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스(Lununstrom, 1999), 레오바이러스(Coffey et al., 1998) 및 인플루엔자 A 바이러스(Neumann et al., 1999)는 본 개시내용에서 사용하기 위해 고려되고, 표적 시스템의 필수 속성에 따라 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 백시니아 바이러스 벡터가 본 개시내용에서 사용하기 위해 고려된다. 백시니아 바이러스는 이종 유전자를 발현하기 위한 특히 유용한 진핵생물 바이러스 벡터 시스템이다. 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스가 적절하게 조작되면, 단백질은 합성되고, 처리되고 원형질막으로 수송된다. 유전자 전달 벡터로서 백시니아 바이러스는 최근에 유전자를 인간 종양 세포, 예를 들어, EMAP-II(Gnant et al., 1999), 내이(Derby et al., 1999), 신경 교종 세포, 예를 들어 p53(Timiryasova et al., 1999) 및 다양한 포유류 세포, 예를 들어, P450(미국 특허 제5,506,138호)에 전달하는 것으로 입증되었다. 백시니아 바이러스의 제조, 성장 및 조작은 미국 특허 제5,849,304호 및 미국 특허 제5,506,138호(각각 구체적으로 본원에 참조로 포함된다)에 기재된다.
다른 구현예에서, 신드비스 바이러스 벡터는 유전자 전달에 사용하기 위해 고려된다. 신드비스 바이러스는 베네수엘라, 서부 및 동부 말 뇌염 바이러스(Sawai et al., 1999; Mastrangelo et al., 1999)로서 이러한 중요한 병원체를 포함하는 알파바이러스 속의 종(Garoff and Li, 1998)이다. 시험관내에서, 신드비스 바이러스는 다양한 조류, 포유류, 파충류 및 양서류 세포를 감염시킨다. 신드비스 바이러스의 게놈은 길이 11,703개의 뉴클레오티드인 단일 가닥 RNA의 단일 분자로 구성된다. 게놈 RNA는 감염성이며, 5' 말단에서 캡핑되고, 3' 말단에서 폴리아데닐화되고, mRNA 역할을 한다. 백시니아 바이러스 26S mRNA의 번역은 3개의 바이러스 구조 단백질, 캡시드 단백질(C) 및 2개의 엔벨로프 당단백질(El 및 PE2, 비리온 E2의 전구체)을 제공하기 위해 바이러스 및 아마도 숙주 인코딩된 프로테아제의 조합에 의해 공동- 및 번역후 절단되는 폴리단백질을 생성한다.
신드비스 바이러스의 세 가지 특징은 이종 유전자의 발현에 유용한 벡터가 될 것임을 시사한다. 첫째, 자연과 실험실 모두에서 광범위한 숙주 범위. 둘째, 유전자 발현은 숙주 세포의 세포질에서 발생하며, 빠르고 효율적이다. 셋째, 감염 후 다양한 시간에 배양물을 비허용 온도로 간단히 이동시킴으로써 이종 코딩 서열의 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 RNA 합성의 온도-민감성 돌연변이가 이용 가능하다. 신드비스 바이러스의 성장 및 유지는 당업계에 공지되어 있다(미국 특허 제5,217,879호, 구체적으로 본원에 참조로 포함된다).
키메라 바이러스 벡터. 키메라 또는 하이브리드 바이러스 벡터는 치료 유전자 전달에 사용하기 위해 개발되고 있으며 본 개시내용에서 사용하기 위해 고려된다. 키메라 폭스바이러스/레트로바이러스 벡터(Holzer et al., 1999), 아데노바이러스/레트로바이러스 벡터(Feng et al., 1997; Bilbao et al., 1997; Caplen et al., 1999) 및 아데노바이러스/아데노-관련 바이러스 벡터(Fisher et al., 1996; 미국 특허 제5,871,982호)가 기재되었다.
이러한 "키메라" 바이러스 유전자 전달 시스템은 2개 이상의 부모 바이러스 종의 유리한 특징을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌(Wilson et al.)은 이하 기재된 아데노바이러스, AAV 5' 및 3' ITR 서열 및 선택된 도입유전자의 일부를 포함하는 키메라 벡터 작제물을 제공한다(미국 특허 제5,871,983호, 구체적으로 본원에 참조로 포함된다).
아데노바이러스/AAV 키메라 바이러스는 아데노바이러스 핵산 서열을 셔틀로서 사용하여 재조합 AAV/도입유전자 게놈을 표적 세포에 전달한다. 하이브리드 벡터에 사용된 아데노바이러스 핵산 서열은 하이브리드 바이러스 입자를 생산하기 위해 헬퍼 바이러스의 사용을 필요로 하는 최소 서열 양으로부터 단지 아데노바이러스 유전자의 선택된 결실에 이르기까지 다양할 수 있으며, 이 결실된 유전자 산물은 선택된 패키징 세포에 의해 하이브리드 바이러스 생산 공정에서 제공될 수 있다. 최소한으로, pAdA 셔틀 벡터에 사용된 아데노바이러스 핵산 서열은 모든 바이러스 유전자가 결실되고 아데노바이러스 게놈 DNA를 미리 형성된 캡시드 헤드로 패키징하기 위해 필요한 해당 아데노바이러스 서열만을 함유하는 아데노바이러스 게놈 서열이다. 보다 구체적으로, 사용된 아데노바이러스 서열은 E1 프로모터에 대한 선형 AD 게놈 및 인핸서 요소를 패키징하기 위해 필요한 서열을 함유하는 아데노바이러스(복제 기점으로 기능함)의 시스-작용성 5' 및 3' 역전된 말단 반복(ITR) 서열 및 천연 5' 패키징/인핸서 도메인이다. 아데노바이러스 서열은 목적하는 기능이 제거되지 않는 한, 목적하는 결실, 치환, 또는 돌연변이를 함유하도록 변형될 수 있다.
상기 키메라 벡터에 유용한 AAV 서열은 rep 및 cap 폴리펩티드 인코딩 서열이 결실되는 바이러스 서열이다. 보다 구체적으로, 사용된 AAV 서열은 시스 작용성 5'및 3' 역전된 말단 반복(ITR) 서열이다. 이러한 키메라는 숙주 세포로의 고역가 도입유전자 전달 및 도입유전자를 숙주 세포 염색체로 안정하게 통합하는 능력을 특징으로 한다(미국 특허 제5,871,983호, 구체적으로 본원에 참조로 포함된다). 하이브리드 벡터 작제물에서, AAV 서열은 상기 논의된 선택된 아데노바이러스 서열에 의해 인접된다. 5' 및 3' AAV ITR 서열 자체는 하기 기재된 선택된 도입유전자 서열 및 관련 조절 요소에 의해 인접된다. 따라서, 도입유전자에 의해 형성된 서열 및 인접하는 5' 및 3' AAV 서열은 벡터의 아데노바이러스 서열의 임의의 결실 부위에 삽입될 수 있다. 예를 들어, AAV 서열은 아데노바이러스의 결실된 E1a/E1b 유전자의 부위에 바람직하게 삽입된다. 대안적으로, AAV 서열은 E3 결실, E2a 결실 등에 삽입될 수 있다. 아데노바이러스 5' ITR/패키징 서열 및 3' ITR 서열만이 하이브리드 바이러스에 사용되면, AAV 서열이 그들 사이에 삽입된다.
벡터 및 재조합 바이러스의 도입유전자 서열은 관심 있는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 단편을 인코딩하는, 아데노바이러스 서열에 이종인, 유전자, 핵산 서열 또는 이의 역전사체일 수 있다. 도입유전자는 도입유전자 전사를 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다. 도입유전자 서열의 조성은 생성되는 하이브리드 벡터가 놓일 용도에 의존할 것이다. 예를 들어, 한 유형의 도입유전자 서열은 숙주 세포에서 목적하는 유전자 산물을 발현하는 치료 유전자를 포함한다. 이러한 치료 유전자 또는 핵산 서열은 전형적으로 유전된 또는 비유전된 유전적 결함을 대체 또는 교정하거나 후성 유전적 장애 또는 질환을 치료하기 위해 생체내 또는 생체외 환자에서 투여 및 발현을 위한 생성물을 인코딩한다.
10.
비바이러스
형질전환
본 개시내용과 함께 사용하기 위한 소기관, 세포, 조직 또는 유기체의 형질전환을 위한 핵산 전달에 적합한 방법은 사실상 핵산(예: DNA)이 본원에 기재된 바와 같거나 당업자에게 공지된 바와 같이 소기관, 세포, 조직 또는 유기체로 도입될 수 있는 임의의 방법을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 방법은 미세주사(Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 제5,789,215호, 본원에 참조로 포함됨)를 포함하는 주사(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호, 각각 본원에 참조로 포함됨); 전기천공(미국 특허 제5,384,253호, 본원에 참조로 포함됨); 인산칼슘 침전(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); DEAE-덱스트란에 이어 폴리에틸렌 글리콜의 사용(Gopal, 1985); 직접 음파 로딩(Fecchheimer et al., 1987); 리포좀 매개 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); 미세발사체 충격(PCT Application Nos. WO 94/09699 및 95/06128; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호, 각각 본원에 참조로 포함됨); 탄화규소 섬유에 의한 진탕(Kaeppler et al., 1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호, 각각 본원에 참조로 포함됨); 또는 원형질체의 PEG-매개 형질전환(Omirulleh et al., 1993; 미국 특허 제4,684,611호 및 제4,952,500호, 각각 본원에 참조로 포함됨); 건조/억제-매개 DNA 흡수(Potrikus et al., 1985)에 의해서와 같은 DNA의 직접 전달을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)가 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
주사. 특정 구현예에서, 핵산은, 예를 들어, 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내와 같은 하나 이상의 주사(즉, 침상 주사)를 통해 소기관, 세포, 조직 또는 유기체에 전달될 수 있다. 백신의 주사 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다(예: 식염수를 포함하는 조성물의 주사). 본 개시내용의 추가의 구현예는 직접 미세주사에 의한 핵산의 도입을 포함한다. 직접 미세주사는 핵산 작제물을 제노푸스 난모세포에 도입하는데 사용되었다(Harland and Weintraub, 1985).
전기천공. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 핵산은 전기천공을 통해 소기관, 세포, 조직 또는 유기체로 도입된다. 전기천공은 세포 및 DNA의 현탁액의 고전압 전기 방전에 대한 노출을 포함한다. 이 방법의 일부 변이체에서, 특정 세포벽 분해 효소, 예를 들어, 펙틴 분해 효소는 표적 수용자 세포가 비처리된 세포보다 전기천공에 의한 형질전환에 더 민감하게 만드는 데 사용된다(미국 특허 제5,384,253호, 본원에 참조로 포함됨). 대안적으로, 수용자 세포는 기계적 상처에 의한 형질전환에 더 민감해질 수 있다.
전기천공을 사용한 진핵생물 세포의 형질감염은 매우 성공적이었다. 마우스 프리-B 림프구는 인간 κ-면역글로불린 유전자로 형질감염되었고(Potter et al., 1984), 래트 간세포는 이러한 방식으로 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(Tur-Kaspa et al., 1986)로 형질감염되었다.
예를 들어, 식물 세포와 같은 세포에서 전기천공에 의해 형질전환에 영향을 미치기 위해, 세포의 현탁 배양 또는 배아 생성 캘러스와 같은 부서지기 쉬운 조직을 사용할 수 있거나, 대안적으로 미성숙 배아 또는 다른 조직화된 조직을 직접 형질전환시킬 수 있다. 이 기술에서, 선택된 세포의 세포벽을 펙틴 분해 효소(펙톨리아제)에 노출시키거나 제어된 방식으로 기계적으로 상처를 입힘으로써 부분적으로 분해할 것이다. 온전한 세포의 전기천공에 의해 형질전환된 일부 종의 예는 옥수수(미국 특허 제5,384,253호; Rhodes et al., 1995; D'Halluin et al., 1992), 밀 (Zhou et al., 1993), 토마토(Hou and Lin, 1996), 대두(Christou et al., 1987) 및 담배(Lee et al., 1989)를 포함한다.
또한, 식물 세포의 전기천공 형질전환을 위한 원형질체를 사용할 수 있다(Bates, 1994; Lazzeri, 1995). 예를 들어, 자엽 유래 원형질체의 전기천공에 의한 유전자도입 대두 식물의 생성은 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 제WO 92/17598호에 디르(Dhir) 및 위드홀름(Widholm)에 의해 기재된다. 원형질체 형질전환이 기재된 종의 다른 예는 보리(Lazerri, 1995), 수수(Battrow et al., 1991), 옥수수(Bhattacharjee et al., 1997), 밀(He et al., 1994) 및 토마토(Tsukada, 1989)를 포함한다.
인산칼슘. 본 개시내용의 다른 구현예에서, 핵산은 인산칼슘 침전을 사용하여 세포에 도입된다. 인간 KB 세포는 이 기술을 사용하여 아데노바이러스 5 DNA(Graham and Van Der Eb, 1973)로 형질감염시켰다. 또한, 이러한 방식으로, 마우스 L(A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포는 네오마이신 마커 유전자로 형질감염시켰고(Chen and Okayama, 1987), 래트 간세포는 다양한 마커 유전자로 형질감염시켰다(Rippe et al., 1990).
DEAE-덱스트란: 다른 구현예에서, 핵산은 DEAE-덱스트란에 이어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 세포로 전달된다. 이러한 방식으로, 리포터 플라스미드를 마우스 골수종 및 적백혈병 세포에 도입하였다(Gopal, 1985).
초음파 처리 로딩. 본 개시내용의 추가 구현예는 직접 음파 로딩에 의한 핵산의 도입을 포함한다. LTK- 섬유아세포는 초음파 처리 로딩에 의해 티미딘 키나제 유전자로 형질감염시켰다(Fechheimer et al., 1987).
리포좀 매개 형질감염. 본 개시내용의 추가의 구현예에서, 핵산은, 예를 들어, 리포좀과 같은 지질 복합체에 포획될 수 있다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 배지를 특징으로 하는 소포 구조물이다. 다중층 리포좀은 수성 배지에 의해 분리된 다수의 지질 층을 갖는다. 그들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조물의 형성 전에 자기 재배열을 겪고, 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다(Ghosh and Bachhawat, 1991). 또한, 리포펙타민(Gibco BRL) 또는 슈퍼펙트(Qiagen)와 복합체화된 핵산이 고려된다.
리포좀-매개 핵산 전달 및 시험관내 외래 DNA의 발현은 매우 성공적이었다(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). 배양된 병아리 배아, HeLa 및 간종양 세포에서 외래 DNA의 리포좀-매개 전달 및 발현의 타당성도 또한 입증되었다(Wong et al., 1980).
본 개시내용의 특정 구현예에서, 리포좀은 혈구응집 바이러스(HVJ)와 복합체화될 수 있다. 이는 세포막과의 융합을 촉진하고 리포좀 캡슐화 DNA의 세포 진입을 촉진하는 것으로 나타났다(Kaneda et al., 1989). 다른 구현예에서, 리포좀은 핵 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 복합체화되거나 함께 사용될 수 있다(Kato et al., 1991). 추가의 구현예에서, 리포좀은 HVJ 및 HMG-1 모두와 복합체화되거나 함께 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포좀을 포함할 수 있다.
수용체-매개 형질감염. 또 추가로, 핵산은 수용체 매개 전달 비히클을 통해 표적 세포로 전달될 수 있다. 이들은 표적 세포에서 발생할 수용체-매개 엔도시토시스에 의한 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 다양한 수용체의 세포 유형-특이적 분포의 관점에서, 이 전달 방법은 본 개시내용에 또 다른 정도의 특이성을 부가한다.
특정 수용체-매개 유전자 표적화 비히클은 세포 수용체 특이적 리간드 및 핵산-결합제를 포함한다. 다른 것들은 전달될 핵산이 작동 가능하게 부착된 세포 수용체 특이적 리간드를 포함한다. 몇몇 리간드가 수용체 매개 유전자 전달에 사용되었고(Wu and Wu, 1987; Wagner et al., 1990; Perales et al., 1994; Myers, EPO 0273085), 이는 기술의 조작성을 확립한다. 다른 포유류 세포 유형의 맥락에서 특이적 전달이 기재되었다(Wu and Wu, 1993; 본원에 참조로 포함됨). 본 개시내용의 특정 측면에서, 리간드는 표적 세포 집단 상에서 특이적으로 발현되는 수용체에 상응하도록 선택될 것이다.
다른 구현예에서, 세포 특이적 핵산 표적화 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포좀과 함께 특정 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달될 핵산(들)은 리포좀 내에 수용되고 특정 결합 리간드는 리포좀 막에 기능적으로 통합된다. 리포좀은 따라서 표적 세포의 수용체(들)에 특이적으로 결합하고, 내용물을 세포에 전달할 것이다. 이러한 시스템은, 예를 들어, 표피 성장 인자(EGF)가 EGF 수용체의 상향 조절을 나타내는 세포에 핵산의 수용체-매개 전달에서 사용되는 시스템을 사용하여 기능적인 것으로 나타났다.
또 다른 구현예에서, 표적화 전달 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포좀 자체일 수 있으며, 이는 바람직하게는 세포 특이적 결합을 지시하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함할 것이다. 예를 들어, 락토실-세라마이드, 갈락토스-말단 아시알강글리오사이드는 리포좀에 통합되었고 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수 증가가 관찰되었다(Nicholau et al., 1987). 본 개시내용의 조직 특이적 형질전환 작제물은 유사한 방식으로 표적 세포로 특이적으로 전달될 수 있는 것으로 고려된다.
11. 발현 시스템
상기 논의된 조성물의 적어도 일부 또는 전부를 포함하는 다수의 발현 시스템이 존재한다. 원핵생물- 및/또는 진핵생물-기반 시스템은 핵산 서열, 또는 이들의 동족 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드를 생산하기 위해 본 개시내용과 함께 사용하기 위해 사용될 수 있다. 많은 이러한 시스템은 상업적으로 널리 이용 가능하다.
곤충 세포/바쿨로바이러스 시스템은 모두 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제5,871,986호 및 제4,879,236호에 기재된 바와 같은 이종 핵산 세그먼트의 높은 수준의 단백질 발현을 생성할 수 있고, 이는, 예를 들어, Invitrogen®으로부터의 MaxBac® 2.0 및 Clontech®로부터의 BacPackTM 바쿨로바이러스 발현 시스템이라는 명칭하에 구입될 수 있다.
발현 시스템의 다른 예는 합성 엑디손-유도성 수용체를 포함하는 Stratagene®의 완전 ControlTM 유도성 포유류 발현 시스템, 또는 이의 pET 발현 시스템, 이. 콜리(E. coli) 발현 시스템을 포함한다. 유도성 발현 시스템의 다른 예는 전장 CMV 프로모터를 사용하는 유도성 포유류 발현 시스템인 T-Rex™(테트라사이클린-조절 발현) 시스템을 운반하는 Invitrogen®로부터 이용 가능하다. Invitrogen®은 또한 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica) 발현 시스템이라는 효모 발현 시스템을 제공하고, 이는 메틸로트로픽 효모 피키아 메탄올리카에서 재조합 단백질의 고수준 생산을 위해 설계된다. 당업자는 핵산 서열 또는 이의 동족 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위해 발현 작제물과 같은 벡터를 발현하는 방법을 알 것이다.
1차 포유류 세포 배양물은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 시험관내에서 발현 작제물과 접촉하는 동안 세포를 생존 가능하게 유지하기 위해, 세포가 산소 및 이산화탄소 및 영양소의 정확한 비율로 접촉을 유지하지만 미생물 오염으로부터 보호된다는 것을 보장할 필요가 있다. 세포 배양 기술은 잘 문서화되어 있다.
전술한 것의 한 구현예는 단백질의 생산을 위해 세포를 불멸화하기 위한 유전자 전달의 사용을 포함한다. 관심 단백질의 유전자는 상기 기재된 바와 같이 적절한 숙주 세포로 전달된 후 적절한 조건하에서 세포의 배양이 이어질 수 있다. 사실상 임의의 폴리펩티드에 대한 유전자가 이러한 방식으로 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터의 생성, 및 그 안에 포함된 요소는 상기 논의된다. 대안적으로, 생성될 단백질은 문제의 세포에 의해 일반적으로 합성된 내인성 단백질일 수 있다.
유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 Vero 및 HeLa 세포 및 차이니즈 햄스터 난소, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN 및 MDCK 세포의 세포주이다. 추가로, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 목적하는 방식으로 유전자 산물을 변형시키고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예:글리코실화) 및 처리(예: 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 번역후 처리 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다.
각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 HSV 티미딘 키나제, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사산물 내성은 내성을 부여하는 dhfr; 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt; 아미노글리코사이드 G418에 대한 내성을 부여하는 neo; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro의 선택 기준으로서 사용될 수 있다.
E. 정제
특정 구현예에서, 본 개시내용의 항체가 정제될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하도록 의도되며, 여기서 단백질은 자연적으로 수득 가능한 상태에 비해 임의의 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 단백질은 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경이 없는 단백질을 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 명칭은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예를 들어, 조성물 중의 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상을 구성하는 조성물을 지칭할 것이다.
단백질 정제 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 이들 기술은 한 수준에서 폴리펩티드 및 비폴리펩티드 분획에 대한 세포 환경의 조악한 분획화를 수반한다. 다른 단백질로부터 폴리펩티드를 분리한 후, 관심 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제하여 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질성으로 정제)를 달성할 수 있다. 순수한 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전 초점이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등에 의한 침전 또는 열 변성에 이은 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 이러한 기술과 다른 기술의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 항체를 정제함에 있어서, 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현시키고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태깅된 부분에 결합하는 친화성 컬럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나, 또는 특정 단계가 생략될 수 있고, 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드의 제조에 적합한 방법을 초래하는 것으로 여겨진다.
일반적으로, 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제(즉, 단백질 A)를 이용하여 분획화된다. 대안적으로, 항원은 적절한 항체를 동시에 정제하고 선택하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 종종 지지체, 예를 들어, 컬럼, 필터 또는 비드에 결합된 선택 제제를 활용한다. 항체는 지지체에 결합되며, 오염 물질은 제거되며(예를 들어, 세척되며), 항체는 조건(염, 열 등)을 적용하여 방출된다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 이들은, 예를 들어, 활성 분획의 특정 활성을 결정하는 단계, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 다른 방법은 분획의 특정 활성을 계산하고, 그것을 초기 추출물의 특정 활성과 비교하고, 따라서 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용된 실제 단위는 물론 정제를 따르기 위해 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출 가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존할 것이다.
폴리펩티드의 이동은 SDS/PAGE의 상이한 조건에 따라 때로는 상당히 변할 수 있는 것으로 공지되어 있다(Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서 정제되거나 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량이 변할 수 있음을 인식될 것이다.
F. 단일 쇄/단일 도메인 항체
단일 쇄 가변 단편(scFv)은 짧은 (일반적으로, 세린, 글리신) 링커와 함께 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합이다. 단일 도메인 항체로도 공지된 이 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩티드의 도입에도 불구하고, 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 이러한 변형은 일반적으로 특이성이 변경되지 않은 상태로 둔다. 이러한 분자는 역사적으로 생성되어 항원 결합 도메인을 단일 펩티드로서 발현하는 것이 매우 편리한 파지 디스플레이를 용이하게 하였다. 대안적으로, scFv는 하이브리도마로부터 유도된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 단일 도메인 또는 단일 쇄 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 부족하고, 따라서, 공통 결합 부위(예: 단백질 A/G)가 항체를 정제하기 위해 사용된다(단일 쇄 항체는 Fc 영역을 포함한다). 이러한 단편은 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호 작용하기 때문에 종종 단백질 L을 사용하여 정제/고정화될 수 있다.
가요성 링커는 일반적으로 나선- 및 회전-촉진 아미노산 잔기, 예를 들어, 알라인, 세린 및 글리신으로 구성된다. 그러나, 다른 잔기도 기능할 수 있다. 문헌(Tang et al.(1996))은 단백질 링커 라이브러리로부터 단일 쇄 항체(scFv)에 대한 맞춤형 링커를 신속하게 선택하는 수단으로 파지 디스플레이를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 위한 유전자가 가변 조성물의 18-아미노산 폴리펩티드를 인코딩하는 세그먼트에 의해 연결된 무작위 링커 라이브러리가 작제되었다. scFv 레퍼토리(약 5×106개의 상이한 구성원)는 필라멘트 파지 상에 표시하고, 합텐과의 친화성 선택을 실시하였다. 선택된 변이체의 집단은 결합 활성에서 상당한 증가를 나타내었지만 상당한 서열 다양성을 유지했다. 1054개의 개별 변이체를 스크리닝하면 후속적으로 가용성 형태로 효율적으로 생산되는 촉매 활성 scFv를 산출하였다. 서열 분석은 VH C 말단 이후의 링커 2개의 잔기에서 보존된 프롤린과 선택된 테더의 유일한 공통 특징으로서 다른 위치에서 아르기닌 및 프롤린의 풍부함을 밝혀냈다.
본 개시내용의 재조합 항체는 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 허용하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 J-쇄와 함께 다량체의 형성을 허용하는 IgA로부터 유도된 것들을 포함한다. 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 구현예에서, 쇄는 두 항체의 조합을 허용하는 비오틴/아비딘과 같은 제제로 변형될 수 있다.
별개의 구현예에서, 단일 쇄 항체는 비-펩티드 링커 또는 화학 단위를 사용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 결합시킴으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고, 후속적으로 적절한 방식으로 함께 연결될 것이다(즉, 중쇄의 N-말단은 적절한 화학적 브리지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착된다).
가교 결합 시약은 2개의 상이한 분자의 작용기, 예를 들어, 안정화제 및 응고제를 묶는 분자 브릿지를 형성하는데 사용된다. 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 헤테로머 복합체가 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적 방식으로 연결하기 위해, 원치 않는 단독중합체 형성을 제거하는 헤테로-이작용성 가교결합제가 사용될 수 있다.
예시적인 헤테로-이작용성 가교결합제는 2개의 반응성 그룹을 함유한다: 하나는 1급 아민 그룹(예: N-하이드록시 석신이미드)과 반응하고 다른 하나는 티올 그룹(예: 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)과 반응한다. 1급 아민 반응성 그룹을 통해, 가교결합제는 하나의 단백질(예: 선택된 항체 또는 단편)의 리신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응성 그룹을 통해, 이미 제1 단백질에 이미 묶인 가교결합제는 다른 단백질(예: 선택제)의 시스테인 잔기(유리 설프하이드릴 그룹)와 반응한다.
혈액 중 합리적인 안정성을 갖는 가교결합제가 사용되는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료/예방제를 접합하는데 성공적으로 사용될 수 있는 수많은 유형의 디설파이드-결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체적으로 방해되는 디설파이드 결합을 함유하는 링커는 생체내에서 더 큰 안정성을 제공하여 작용 부위에 도달하기 전에 표적화 펩티드의 방출을 방지하는 것을 증명할 수 있다. 따라서, 이러한 링커는 연결제의 한 그룹이다.
다른 가교결합 시약은 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 "입체적으로 방해되는" 디설파이드 결합을 함유하는 이작용성 가교결합제인 SMPT이다. 디설파이드 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액에 존잴할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 하며, 이에 따라 표적 부위에 부작된 제제의 전달 이전에 접합체의 분리를 방지하는데 도움이 되는 것으로 여겨진다.
SMPT 가교결합 시약은, 많은 다른 공지된 가교결합 시약과 마찬가지로, 시스테인의 SH 또는 1급 아민(예: 리신의 엡실론 아미노 그룹)과 같은 작용성 그룹을 가교결합시키는 능력을 부여한다. 다른 가능한 유형의 가교결합제는 설포석신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트와 같은 절단 가능한 디설파이드 결합을 함유하는 헤테로-이작용성 광반응성 페닐아지드를 포함한다. N-하이드록시-석신이미딜 그룹은 1급 아미노 그룹과 반응하고, 페닐아지드(광분해 시)는 임의의 아미노산 잔기와 비-선택적으로 반응한다.
방해된 가교결합제 이외에, 비방해된 링커도 이에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 고려되지 않은 다른 유용한 가교결합제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다(Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 이러한 가교결합제의 사용은 당업계에서 잘 이해된다. 다른 구현예는 가요성 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는 아민 함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 접합체를 생성하기 위해, 특히 킬레이트제, 약물, 효소, 검출 가능한 표지 등과 항체 접합체를 형성하기 위해 유용한 이작용성 링커를 기재한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 온화한 조건하에 절단 가능한 불안정한 결합을 함유하는 절단 가능한 접합체를 개시한다. 이 링커는 관심 제제가 링커에 직접 결합될 수 있고, 절단과 함께 활성제의 방출을 초래할 수 있다는 점에서 특히 유용하다. 특정 용도는 단백질, 예를 들어, 항체, 또는 약물에 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴 그룹을 첨가함을 포함한다.
미국 특허 제5,856,456호는 융합 단백질, 예를 들어, 단일 쇄 항체를 제조하기 위해 폴리펩티드 성분을 연결하는데 사용하기 위한 펩티드 링커를 제공한다. 링커는 최대 약 50개 아미노산 길이이고, 하전된 아미노산(바람직하게는 아르기닌 또는 리신)에 이은 프롤린의 적어도 하나의 발생을 함유하고, 더 큰 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역 진단 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시 함유 링커를 개시한다.
G. 변형된 항체
1. CAR
인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR)로도 공지됨)는 조작된 수용체이며, 이는 면역 이펙터 세포에 임의의 특이성을 이식한다. 전형적으로, 이들 수용체는 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진된 이들의 코딩 서열의 전달과 함께 T 세포에 모노클로날 항체의 특이성을 이식하는데 사용된다. 이러한 방식으로, 많은 수의 암 특이적 T 세포가 입양 세포 전달을 위해 생성될 수 있다. 이 접근법의 I상 임상 연구는 효능을 보여준다.
이러한 분자의 가장 일반적인 형태는 CD3-제타 막관통 및 엔도도메인에 융합된 모노클로날 항체로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 융합이다. 이러한 분자는 이의 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 제타 신호의 전달을 초래한다. 이러한 작제물의 예는 14g2a-제타이며, 이는 하이브리도마 14g2a(디시알로강글리오사이드 GD2를 인식함)로부터 유래된 scFv의 융합이다. T 세포가 이 분자를 발현할 때(일반적으로, 온코레트로바이러스 벡터 형질도입에 의해 달성됨), 그들은 GD2(예: 신경모세포종 세포)를 발현하는 표적 세포를 인식하고 사멸시킨다. 악성 B 세포를 표적화하기 위해, 연구자는 B-계통 분자, CD19에 특이적인 키메라 면역수용체를 사용하여 T 세포의 특이성을 재지시하였다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 가요성 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 이 scFv는 신호 펩티드가 선행되어 초기 단백질을 소포체 및 후속 표면 발현(이는 절단됨)으로 지시한다. 가요성 스페이서는 scFv가 상이한 방향으로 배향되어 항원 결합을 가능하게 한다. 막관통 도메인은 일반적으로 세포 내로 돌출되어 목적하는 신호를 전달하는 신호전달 엔도도메인의 원래 분자로부터 유래된 전형적인 소수성 알파 나선이다.
유형 I 단백질은 사실 사이에서 막관통 알파 나선에 의해 연결된 2개의 단백질 도메인이다. 막관통 도메인이 통과하는 세포막 지질 이중층은 외부 부분(엑토도메인)으로부터 내부 부분(엔도도메인)을 단리시키는 역할을 한다. 하나의 단백질의 엑토도메인을 다른 단백질의 엔도도메인에 부착하면 전자의 인식과 후자의 신호를 결합하는 분자를 초래한다는 것은 그렇게 놀라운 것은 아니다.
엑토도메인 . 신호 펩티드는 초기 단백질을 소포체 내로 지시한다. 이것은 수용체가 글리코실화되고 세포막에 고정되는 경우에 필수적이다. 임의의 진핵생물 신호 펩티드 서열은 일반적으로 잘 작동한다. 일반적으로, 아미노-말단 대부분의 성분에 천연적으로 부착된 신호 펩티드가 사용된다(예: 배향 경쇄-링커-중쇄를 갖는 scFv에서, 경쇄의 천연 신호가 사용된다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 scFv이다. 그러나, 많은 대안이 존재한다. 천연 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터의 항원 인식 도메인은 간단한 엑토도메인(예: HIV 감염 세포를 인식하기 위한 CD4 엑토도메인) 및 연결된 사이토카인(사이토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식으로 이어짐)과 같은 더 많은 외래 인식 성분을 갖는 것으로 기재되어 있다. 사실, 높은 친화성으로 주어진 표적에 결합하는 거의 모든 것이 항원 인식 영역으로 사용될 수 있다.
스페이서 영역은 항원 결합 도메인을 막관통 도메인에 연결한다. 그것은 항원 결합 도메인이 상이한 방향으로 배향되어 항원 인식을 용이하게 하도록 충분히 가요성이어야 한다. 가장 간단한 형태는 IgGl의 힌지 영역이다. 대안은 면역글로불린의 CH2CH3 영역과 CD3의 일부를 포함한다. 대부분의 scFv 기반 작제물의 경우, IgGl 힌지가 충분하다. 그러나, 최상의 스페이서는 종종 경험적으로 결정되어야 한다.
막관통 도메인. 막관통 도메인은 막에 걸쳐 있는 소수성 알파 나선이다. 일반적으로, 엔도도메인의 대부분의 막 근위 성분으로부터의 막관통 도메인이 사용된다. 흥미롭게도, CD3-제타 막관통 도메인을 사용하면 천연 CD3-제타 막관통 하전된 아스파르트산 잔기의 존재에 의존하는 인자인 천연 TCR에 인공 TCR의 통합을 초래할 수 있다. 상이한 막관통 도메인은 상이한 수용체 안정성을 초래한다. CD28 막관통 도메인은 밝게 발현된 안정한 수용체를 초래한다.
엔도도메인 . 이것은 수용체의 "맨끝(business-end)"이다. 항원 인식 후, 수용체 클러스터 및 신호가 세포에 전달된다. 가장 일반적으로 사용되는 엔도도메인 성분은 3개의 ITAM을 함유하는 CD3-제타이다. 이는 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포에 전달한다. CD3-제타는 완전 적격 활성화 신호를 제공할 수 없고, 추가의 공동자극 신호전달이 필요하다. 예를 들어, 키메라 CD28 및 0X40은 증식성/생존 신호를 전달하기 위해 CD3-제타와 함께 사용될 수 있거나, 모두 3개가 함께 사용될 수 있다.
"1세대" CAR은 전형적으로 내인성 TCR로부터의 신호의 1차 전달자인 CD3ξ-쇄로부터의 세포내 도메인을 가졌다. "2세대" CAR은 다양한 공동자극 단백질 수용체(예: CD28, 41BB, ICOS)로부터 세포내 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 꼬리에 부가하여 추가 신호를 T 세포에 제공한다. 전임상 연구는 CAR 설계의 2세대가 T 세포의 항종양 활성을 개선시킨다는 것을 나타냈다. 보다 최근에, "3세대" CAR은 복수의 신호전달 도메인, 예를 들어, CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 결합하여 효능을 더욱 강화한다.
키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포의 입양 전달은 CAR 변형된 T 세포가 사실상 임의의 종양 관련 항원을 표적으로 하도록 조작될 수 있기 때문에 유망한 항암 치료제이다. 이 접근법은 환자-특이적 암 요법을 심오한 방식으로 개선할 큰 잠재력을 갖는다. 환자의 T 세포의 수집에 이어, 세포를 유전적으로 조작하여 환자의 종양 세포 상의 항원을 향해 특이적으로 지시된 CAR을 발현한 다음, 환자에게 다시 주입된다. CAR-변형된 T-세포의 입양 전달은 독특하고 유망한 암 치료제이지만, 상당한 안전 문제가 있다. 이 요법의 임상 시험은 건강한 조직이 종양 세포와 동일한 표적 항원을 발현하여 이식편 대 숙주 질환(GVHD)과 유사한 결과를 유도할 때 이러한 CAR의 잠재적인 독성 효과를 밝혀냈다. 이 문제에 대한 잠재적인 해결책은 자살 유전자를 변형된 T 세포로 조작하는 것이다. 이러한 방식으로, GVHD 동안 자살 유전자를 활성화하도록 설계된 프로드럭의 투여는 자살 유전자 활성화 CAR T 세포에서 아폽토시스를 유발한다. 이 방법은 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)에서 안전하고 효과적으로 사용되어 왔다. CAR-변형된 T 세포 입양 세포 전달의 임상 적용에 대한 자살 유전자 요법의 채택은 전체 항종양 효능을 향상시키면서 GVHD를 완화시킬 잠재력을 갖는다.
2.
ADC
항체 약물 접합체 또는 ADC는 암을 앓고 있는 사람들의 치료를 위한 표적화 요법으로 설계된 새로운 부류의 매우 강력한 생물약제학적 약물이다. ADC는 불안정한 결합을 갖는 안정한 화학적 링커를 통해 생물학적 활성 세포독성(항암) 페이로드 또는 약물에 연결된 항체(전체 mAb 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 쇄 가변 단편, 또는 scFv)로 구성된 복합체 분자이다. 항체 약물 접합체는 생물접합체 및 면역접합체의 예이다.
모노클로날 항체의 독특한 표적화 능력을 세포독성 약물의 암 사멸 능력과 결합시킴으로써, 항체-약물 접합체는 건강한 조직과 병든 조직 사이의 민감한 차별을 허용한다. 이는, 전통적인 화학요법제와 대조적으로, 항체-약물 접합체는 암 세포를 표적으로 하여 공격하여 건강한 세포가 덜 심각하게 영향을 받도록 함을 의미한다.
ADC 기반 항-종양 요법의 개발에서, 항암 약물(예: 세포 독소 또는 세포독소)은 특정 종양 마커(예: 이상적으로, 단지 종양 세포 내에서 또는 종양 세포 상에서 발견되는 단백질; 이 경우에 MUC1)를 특이적으로 표적화하는 항체에 결합된다. 항체는 이러한 단백질을 체내에서 아래로 추적하고, 그 자체를 암 세포의 표면에 부착시킨다. 항체와 표적 단백질(항원) 사이의 생화학적 반응은 종양 세포에서 신호를 유발한 다음, 세포독소와 함께 항체를 흡수하거나 내재화한다. ADC가 내재화된 후, 세포독성 약물은 방출되고 암을 사멸시킨다. 이러한 표적화로 인해, 이상적으로 약물은 부작용이 적고, 다른 화학요법제보다 더 넓은 치료 창을 제공한다.
항체와 세포독성제(항암제) 사이의 안정한 연결은 ADC의 중요한 측면이다. 링커는 디설파이드, 하이드라존 또는 펩티드(절단 가능), 또는 티오에테르(비절단 가능)를 포함하는 화학적 모티프를 기반으로 하고, 표적 세포로의 세포독성제의 분포 및 전달을 조절한다. 절단 가능한 및 비절단 가능한 유형의 링커는 전임상 및 임상 시험에서 안전한 것으로 입증되었다. 브렌툭시맙 베도틴은 강력하고 매우 독성인 항미세관제 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 MMAE, 합성 항종양제를 인간 특이적 CD30-양성 악성 세포에 전달하는 효소 민감성 절단 가능한 링커를 포함한다. 이의 높은 독성 때문에, 튜불린의 중합을 차단함으로써 세포 분열을 억제하는 MMAE는 단일-제제 화학요법 약물로서 사용될 수 없다. 그러나, 항-CD30 모노클로날 항체(cAC10, 종양 괴사 인자 또는 TNF 수용체의 세포 막 단백질)에 연결된 MMAE의 조합은 세포외 유체에서 안정하며, 카텝신에 의해 절단 가능하고 요법에 안전한 것으로 입증되었다. 다른 승인된 ADC인 트라스투주맙 엠탄신은 메이탄신의 유도체인 미세관 형성 억제제 머탄신(DM-1)과 안정하고 비절단 가능한 링커에 의해 부착된 항체 트라스투주맙(Hercepin®/Genentech/Roche)의 조합이다.
더 우수하고 더 안정적인 링커의 가용성은 화학적 결합의 기능을 변화시켰다. 절단 가능하거나 비절단 가능한 링커의 유형은 세포독성(항암) 약물에 특정 특성을 제공한다. 예를 들어, 비절단 가능한 링커는 세포 내에서 약물을 유지한다. 그 결과, 전체 항체, 링커 및 세포독성(항암) 제제는 표적화 암 세포에 들어가고, 여기서 항체는 아미노산의 수준으로 분해된다. 생성되는 복합체- 아미노산, 링커 및 세포독성제-가 이제 활성 약물이 된다. 대조적으로, 절단 가능한 링커는 암 세포에서 효소에 의해 촉매되고, 여기서 그것은 세포독성제를 방출한다. 차이는 절단 가능한 링커를 통해 전달된 세포독성 페이로드가 표적 세포로부터 벗어날 수 있고, "방관자 사멸"이라고 지칭되는 과정에서, 이웃하는 암 세포를 공격한다는 점이다.
현재 개발 중인 다른 유형의 절단 가능한 링커는 세포독성 약물과 절단 부위 사이에 여분의 분자를 추가한다. 이 링커 기술은 연구자들이 절단 동역학을 변경할 염려 없이 더 많은 가요성을 갖는 ADC를 생성할 수 있게 한다. 연구자들은 또한 펩티드에서 아미노산을 서열분석하는 방법인 Edman 분해에 기초한 새로운 펩티드 절단 방법을 개발하고 있다. ADC의 개발에 있어서의 미래 방향은 또한 안정성 및 치료 지수를 더욱 개선시키기 위한 부위 특이적 접합(TDC) 및 α 방출 면역접합체 및 항체 접합 나노 입자의 개발을 포함한다.
3. BiTE
이중특이적 T-세포 인게이저(BiTE)는 항암 약물로서 사용하기 위해 조사되는 인공 이중특이적 모노클로날 항체의 부류이다. 그들은 숙주의 면역계, 보다 구체적으로 암 세포에 대한 T 세포의 세포독성 활성을 지시한다. BiTE는 Micromet AG의 등록 상표이다.
BiTE는 약 55킬로달톤의 단일 펩티드 쇄 상의 상이한 항체의 두 개의 단일 쇄 가변 단편(scFv) 또는 4개의 상이한 유전자의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 다른 하나는 종양 특이적 분자, 이 경우 MUC1을 통해 종양 세포에 결합한다.
다른 이중특이적 항체와 같이, 그리고 일반적인 모노클로날 항체와는 달리, BiTE는 T 세포와 종양 세포 사이에 연결을 형성한다. 이것은 T 세포가 MHC I 또는 공동자극 분자의 존재와 독립적으로 퍼포린 및 그랜자임과 같은 단백질을 생산함으로써 종양 세포에 대한 세포독성 활성을 발휘하게 한다. 이러한 단백질은 종양 세포에 들어가 세포의 아폽토시스를 개시한다. 이 작용은 종양 세포에 대한 T 세포 공격 동안 관찰된 생리적 과정을 모방한다.
2010년 7월 현재 임상 시험 중인 BiTE는 B 세포 상에서 발현된 표면 분자인 CD 19를 향해 지시된, 비호지킨 림프종 및 급성 림프구성 백혈병의 치료를 위한 블리나투모맙(MT103); 및 EpCAM 항원을 향해 지시된, 위장암 및 폐암 치료를 위한 MT110을 포함한다.
동일한 기술을 사용하여, 블랙종(MCSP 특이적 BiTE 포함) 및 급성 골수성 백혈병(CD33 특이적 BiTE 포함)이 표적화될 수 있다. 이 분야에 대한 연구가 현재 진행 중이다. 새로운 항암 요법을 위한 또 다른 방법은 BiTE 접근법을 사용하여 트라스투주맙(HER2/neu를 표적화함), 세툭시맙 및 파니투무맙(모두 EGF 수용체를 표적화함)과 같은 현재 사용되는 통상적인 항체 중 일부를 재조작하는 것이다. CD66e 및 EphA2에 대한 BiTE도 개발되고 있다.
4.
ADCC
치료 항체는 항체-약물 접합체(ADC), 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC)의 유도와 같은 상이한 방식으로 악성 종양의 치료에 사용되어 왔다. 항체-의존 세포 매개 세포독성(ADCC)은 면역계의 이펙터 세포가 표적 세포를 능동적으로 용해시키고, 이의 막 표면 항원이 특이적 항체에 의해 결합되는 세포 매개 면역 방어 메커니즘이다.
지난 수십 년 동안, ADCC는 치료적 항암 항체의 임상 효능에 기초하는 중요한 메커니즘 중 하나로 확인되었다. 암 세포 상의 세포 표면 표적에 대해 지시된 치료 항체가 이들의 임상 효과를 발휘하는 핵심 이펙터 메커니즘이다. 상기 공정은 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포 및 호산구를 포함한 면역계의 이펙터 세포 상에서 Fc 수용체에 대한 IgG의 결합을 통해 매개된다. IgG의 Fc는 FCRI, FcRII 및 주로 FcRIIIa에 결합한다.
IgG의 Fc 영역은 각각의 CH2 도메인 중 Asn-297에 보존된 글리코실화 부위를 보유한다. 이 부위에서 발현된 N-연결된 올리고당류는 IgG의 이펙터 기능에 상당한 영향을 미친다. 당조작된 항체의 임상 적용과 관련하여, IgG-Fc의 N-글리칸으로부터 코어 푸코스 잔기의 제거는 FcR 수용체 IIIa(FcRIIIa)에 대한 개선된 IgG 결합을 통해 항체 의존 세포 세포독성(ADCC)의 극적인 향상(>50배)을 초래한다(Yamane-Ohnuki et al., 2004; Iida et al., 2009). 몇몇 연구는 푸코스 잔기의 존재가 심각하게 감소된 ADCC 효율을 유도할 수 있음을 입증하였다. 몇몇 학계 그룹 및 제약 회사는 현재 탈푸코실화 mAb, 예를 들어, 효소 a-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하거나 재조합 b-1,4-N-아세틸글루코사미닐-트랜스퍼라제 III을 과발현하여 이등분된 및 비푸코실화 올리고당이 풍부한 항체를 유도하는 FUT8 유전자의 결실된 CHO 세포주를 생성할 수 있는 새로운 세포주의 개발에 집중하고 있다.
III. 약제학적 제형 및 질환의 치료.
A. 암
암은 조직으로부터의 세포의 클론 집단의 파생물로 인해 발생한다. 발암성으로 지칭되는 암의 발달은 다수의 방법으로 모델링되고 특성화될 수 있다. 암과 염증의 발병 사이의 연관성이 오랫동안 인식되었다. 염증 반응은 미생물 감염에 대한 숙주 방어에 관여하고, 또한, 조직 복구 및 재생을 유도한다. 상당한 증거는 염증과 암이 발병할 위험 사이의 연관성을 지적하고, 즉 만성 염증은 이형성증을 유도할 수 있다.
본 개시내용의 방법이 적용될 수 있는 암 세포는 일반적으로 MUC1을 발현하는, 보다 구체적으로 MUC1을 과발현하는 임의의 세포를 포함한다. 적절한 암 세포는 유방암, 폐암, 결장암, 췌장암, 신장암, 위암, 간암, 골암, 혈액암(예: 백혈병 또는 림프종), 신경 조직암, 블랙종, 난소암, 고환암, 전립선암, 자궁경부암, 질암, 또는 방광암 세포일 수 있다. 또한, 본 개시내용의 방법은 광범위한 종, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류(예: 원숭이, 개코원숭이, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 래트 및 마우스에 적용될 수 있다. 암은 또한 재발성, 전이성 및/또는 다중 약물 내성일 수 있고, 본 개시내용의 방법은 특히 이러한 암에 적용하여 그들을 절제 가능하게 하고, 완화를 연장하거나 재유도하고, 혈관신생을 억제하고, 전이를 방지하거나 제한하고/하거나 다중 약물 내성 암을 치료하도록 할 수 있다. 세포 수준에서, 이는 암 세포를 사멸시키고, 암 세포 성장을 억제하거나, 그렇지 않으면 종양 세포의 악성 표현형을 역전시키거나 감소시키는 것으로 번역될 수 있다.
B. 염증성 질환 상태 및 조건
암 이외의 질환 상태에서 MUC1의 역할이 잘 확립되었다. 최근에, 문헌(Kufe et al. (2020))은 대장염 및 결장직장암으로의 진행에서 MUC1의 역할에 대해 보고하였고(JCI Insight, 5(12):137112), 문헌(Alimova et al. (2020))은 SARS-CoV-2 감염 및 폐 손상에서 MUC1의 역할을 보고하였다(doi: 10.1101/2020.06.30.180380). 다음은 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편이 사용될 수 있는 염증성 잠재 질환 상태 및 장애의 일반적인 논의이다.
1. 패혈증(Sepsis)
패혈증은 감염으로 인한 전신 염증 상태를 특징으로 하는 심각한 의학적 상태이다. 전통적으로 용어 패혈증(sepsis)은 패혈증(septicaemia) 및 패혈증(septicemia)("혈액 중독")과 상호 교환적으로 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 용어는 더 이상 동의어로 간주되지 않고; 패혈증(septicemia)은 패혈증(sepsis)의 서브세트로 간주된다.
패혈증의 증상은 종종 근본적인 감염 과정과 관련이 있다. 감염이 패혈증으로 넘어갈 때, 생성되는 증상은 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)의 증상이다: 일반 염증, 발열, 백혈구 수 증가(백혈구 증가), 및 상승된 심박수(빈맥(tachycardia)) 및 호흡수(빈호흡(tachypnea)). 상기에 2차적으로, 증상은 또한 오한(chill)과 같은 독감(flu)을 포함한다.
패혈증을 유발하는 면역학적 반응은 염증 및 응고 경로의 광범위한 활성화를 유발하는 전신 염증성 반응이다. 이는 순환계의 기능 장애로 진행될 수 있고, 최적의 치료하에서도, 다기관 기능 장애 증후군을 초래하고, 결국 사망을 초래할 수 있다.
감염이 고도로 의심되거나 입증되고, 다음 전신 염증성 반응 증후군(SIRS) 기준 중 둘 이상이 충족된다면 패혈증이 존재하는 것으로 간주된다:
심박수 > 분당 90회
체온 < 36℃(96.8℉) 또는 > 38℃(100.4℉)
과호흡(높은 호흡률) > 분당 20회 호흡 또는 혈액 가스에서, 32mmHg 미만의 PaCO2
백혈구 수 < 4000 세포/mm3 또는 >12000 세포/mm3 (< 4 x 109 또는 > 12 x 109 세포/L), 또는 10% 초과의 밴드 형태(미성숙 백혈구).
그러나, 컨센서스 정의는 임상 병상 경험을 반영하기 위해 패혈증의 징후 및 증상의 목록을 확장하면서 최신으로 계속 진화한다.
패혈증의 보다 중요한 서브세트는 중증 패혈증(급성 장기 기능 장애가 있는 패혈증) 및 패혈성 쇼크(난치성 동맥 저혈압이 있는 패혈증)이다. 대안적으로, 두 개 이상의 전신 염증성 반응 증후군 기준이 감염의 증거 없이 충족되는 경우, 환자는 간단히 "SIRS"로 진단될 수 있다. SIRS 및 급성 장기 기능 장애를 갖는 환자는 "중증 SIRS"로 지칭될 수 있다.
환자는 패혈증과 전신 저관류 징후; 말단 장기 기능 장애 또는 4mmol/dL 초과의 혈청 락테이트를 갖는 경우 "중증 패혈증"을 갖는 것으로 정의된다. 환자는 적절한 유체 볼루스(전형적으로, 20ml/kg의 결정상) 후 패혈증과 저혈압을 갖는 경우 패혈성 쇼크를 갖는 것으로 정의된다. 패혈증을 갖는 성인을 진단하기 위한 기준은 1개월 미만의 영아에게는 적용하지 않는다. 영아의 경우, 감염의 존재와 감염에 대한 전신 반응과 일치하는 징후 및 증상의 "성좌"만이 진단에 필요하다.
패혈증의 요법은 항생제, 감염된 유체 수집의 외과적 배수, 유체 교체 및 장기 기능 장애에 대한 적절한 지원에 달려 있다. 이는 신장 부전의 혈액 투석, 폐 기능 장애의 기계적 환기, 혈액 생성물의 수혈 및 순환 장애를 위한 약물 및 유체 요법을 포함할 수 있다. 비경구 영양에 의해 필요한 경우 적절한 영양을 보장하는 것이 장기간 질병 동안 중요하다.
패혈증 환자의 적절한 관리에서의 문제는 패혈증이 인식된 후에 요법을 투여하는 데 있어서 지연이었다. 발표된 연구는 적절한 항생제 요법의 투여에서 매시간 지연에 대해 사망률이 7% 증가한다는 것을 입증하였다. 패혈증에 대해 사람들을 교육시키고, 패혈증 환자 결과를 개선하기 위해 "패혈증 생존 캠페인"이라는 대규모 국제 협력이 확립되었다. 캠페인은 이후 몇 년 동안 완전한 지침을 발표하기 위한 목적으로 중증 패혈증에 대한 관리 전략의 증거 기반 검토를 발표했다.
염증 과정 자체를 목적으로 한 대부분의 요법은 결과를 개선시키지 못했지만, 드로트레코긴 알파(활성화 단백질 C, 응고 인자 중 하나)는 중증 패혈증에서 사망률을 약 31%에서 약 25%로 감소시키는 것으로 나타났다. 드로트레코긴 알파에 대해 자격을 부여하기 위해, 환자는 APDACE II 점수가 25 이상이고 출혈 위험이 낮은 중증 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 가져야 한다. 저용량 하이드로코르티손 치료는 ACTH 자극 시험에 의해 정의된 바와 같이 상대적 부신 기능 부전을 갖는 패혈성 쇼크 환자에게 가능성을 보여주었다.
패혈증이 의심되는 영아의 표준 치료는 지지 치료, 정맥내 유체로 유체 상태 유지 및 β-락탐 항생제(예: 암피실린)와 아미노글리코사이드, 예를 들어, 겐타마이신의 조합으로 구성된다.
2. 외상(Trauma)
신체 외상은 사지 제거와 같은 심각하고 신체를 변경하는 신체적 부상이다. 둔기 외상은 무딘 물체로부터 또는 이에 의해 가해지는 충격 또는 다른 힘으로 인한 신체 외상의 한 유형인 반면, 관통 외상은 피부 또는 조직이 물체에 의해 관통되는 신체 외상의 한 유형이다. 외상은 또한 사고와 같은 계획되지 않은 외상, 또는 수술의 경우와 같이 계획된 외상 둘 다로서 기재될 수 있다. 둘 다 경증 내지 중증 조직 손상, 혈액 손실 및/또는 쇼크를 특징으로 할 수 있고, 둘 다 패혈증을 포함한 후속적인 감염으로 이어질 수 있다. 본 발명은 전치료(의료 절차의 경우)과 발생된 외상 손상 후 치료 둘 다를 포함하는 외상 치료를 제공한다.
수술. 수술은 환자에게 수술 매뉴얼 및 기구 기술을 사용하여 질환 또는 손상과 같은 병리학적 상태를 조사 및/또는 치료하고, 신체 기능 또는 외관을 개선하거나, 때로는 일부 다른 이유로 도움을 준다. 본 발명은 아래에서 추가로 정의된 바와 같이 수술로 인한 외상을 처리할 수 있다.
일반적으로, 절차는 환자의 조직 절단 또는 이전에 지속된 상처의 봉합을 포함하는 경우 수술로 간주된다. 혈관 성형술 또는 내시경 검사와 같이 반드시 이 루브릭하에 있지 않은 다른 절차는 멸균 환경의 사용, 마취, 소독 상태, 전형적인 수술 도구, 및 봉합 또는 스테이플링과 같은 일반적인 수술 절차 또는 환경을 포함하는 경우 수술로 간주될 수 있다. 모든 형태의 수술은 침습적인 절차로 간주되고; 소위 비침습적 수술은 일반적으로 치료되는 구조를 관통하지 않는 절제(예: 각막의 레이저 절제) 또는 방사선 수술 절차(예: 종양의 조사)를 지칭한다. 수술은 수 분 내지 수 시간까지 지속될 수 있다.
수술 절차는 일반적으로 긴급성, 절차 유형, 관련된 신체 시스템, 침습성 정도 및 특수 도구에 의해 분류된다. 선택적 수술은 생명을 위협하지 않는 상태를 교정하기 위해 수행되며, 환자의 요청에 따라 외과 의사와 수술 시설의 가용성에 따라 수행된다. 응급 수술은 생명, 사지 또는 기능적 능력을 구하기 위해 신속하게 수행되어야 하는 수술이다. 탐색적 수술은 진단을 돕거나 확인하기 위해 수행된다. 치료 수술은 이전에 진단된 상태를 치료한다.
절단은 신체 부위, 일반적으로 사지 또는 손가락을 절단하는 것을 포함한다. 재이식은 절단된 신체 부위를 재부착하는 것을 포함한다. 재건 수술은 신체의 부상, 절단 또는 변형된 부분의 재건을 포함한다. 성형 수술은 그렇지 않으면 정상적인 구조의 외관을 개선하기 위해 수행된다. 절제는 환자로부터 장기, 조직 또는 다른 신체 부위를 절단하는 것이다. 이식 수술은 다른 사람(또는 동물)의 다른 장기 또는 신체 부분을 환자에게 삽입하여 장기 또는 신체 부위를 대체하는 것이다. 이식에 사용하기 위해 살아있는 사람 또는 동물로부터 장기 또는 신체 부분을 제거하는 것도 수술의 한 유형이다.
수술이 하나의 장기 시스템 또는 구조에 대해 수행될 때, 관련된 장기, 장기 시스템 또는 조직에 의해 분류될 수 있다. 예는 심장 수술(심장에 수행됨), 위장 수술(소화관 및 부속 기관 내에서 수행됨), 및 정형외과 수술(뼈 및/또는 근육에 수행됨)을 포함한다.
최소 침습 수술은 복강경 수술 또는 혈관 성형술에서와 같이 체강 또는 구조 내에 소형화된 기구를 삽입하기 위한 더 작은 외부 절개(들)를 포함한다. 대조적으로, 개방형 수술 절차는 관심 영역에 접근하기 위해 큰 절개가 필요하다. 레이저 수술은 메스 또는 유사한 수술 도구 대신 조직을 절단하기 위해 레이저의 사용을 포함한다. 미세수술은 외과의가 작은 구조를 볼 수 있도록 수술 현미경의 사용을 포함한다. 로봇 수술은 다빈치(Da Vinci) 또는 제우스(Zeus) 수술 시스템과 같은 수술 로봇을 사용하여 외과 의사의 지시에 따라 기구를 제어한다.
외상성 출혈. 외상성 출혈은 부상의 광범위한 국제적 영향의 대부분을 차지하여 상당한 비율의 사망을 일으키고, 부상자에게 큰 이환율을 유발한다. 병원전 치료의 차이에도 불구하고, 외상성 출혈의 급성 관리는 전세계적으로 유사하고 충분히 허용 발표된 가이드라인을 따른다. 심각하게 부상을 입은 환자의 치료는 소생술, 수술 및 중요한 치료 단계의 4개의 종종 겹치는 세그먼트로서 발생한다. 출혈의 진단 및 제어는 외상 치료의 모든 단계 동안 최우선 순위가 되어야 하며, 출혈성 쇼크 환자에게 특히 중요하다. 출혈 제어에서의 초기 시도는 직접적인 압력, 압력 드레싱 또는 지혈대로 가시적인 심각한 출혈원의 직접적인 제어; 긴 뼈 및 골반 골절의 안정화; 및 환자를 따뜻하게 유지하는 것을 포함한다. 소생 단계 동안, 가온된 정맥내 유체, 출혈의 외과적 제어 이전에 저혈압 소생술, 및 혈액 및 혈액 제품의 적절한 수혈이 제공된다. 수술 단계에서, 출혈 및 임의의 다른 부상의 외과적 제어, 및 추가 수혈이 제공된다. 마지막으로, 중요한 치료 단계는 수술 후 지원 및 조직 관류를 제공한다.
3. 급성 췌장염(Acute
Pancreatitis
)
급성 췌장염은 급속하게 발병하는 췌장의 염증이다. 이의 중증도에 따라, 치료에도 불구하고 심각한 합병증과 높은 사망률을 가질 수 있다. 경증의 경우는 종종 보수적인 조치 또는 복강경 검사로 성공적으로 치료되는 반면, 심각한 경우는 질환 과정을 함유하기 위해 침습적 수술(종종 하나 이상의 개입)을 필요로 한다.
4. 급성 호흡 곤란 증후군(Acute Respiratory Distress Syndrome)
호흡 곤란 증후군(RDS) 또는 성인 호흡 곤란 증후군(IRDS와 대조적)으로도 공지된 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)은 다양한 형태의 폐 손상에 대한 심각한 반응이다. 이것은 투과성 폐 부종을 증가시키는 가장 중요한 장애이다.
ARDS는 다양한 직접적 및 간접적 모욕으로 인해 발생하는 심각한 폐 질환이다. 그것은 염증, 저산소혈증(hypoxemia)을 유발하고 종종 다발성 장기 부전을 초래하는 염증 매개체의 수반되는 전신 방출과 함께 손상된 가스 교환으로 이어지는 폐 실질(lung parenchyma)의 염증을 특징으로 한다. 이 상태는 생명을 위협하고 종종 치명적이며, 일반적으로 기계적 환기 및 집중 치료 시설에의 입원이 필요하다. 덜 심각한 형태는 급성 폐 손상(ALI)이라고 한다.
ARDS는 급성 질병의 부상 또는 공격의 24 내지 48시간 내에 발생할 수 있다. 이러한 경우에, 환자는 일반적으로 호흡 곤란(shortness of breath), 빈호흡(tachypnea) 및 근본 원인과 관련된 증상, 즉 쇼크(shock)를 나타낸다. 말라리아(malaria)와 같은 장기간 질병도 또한 그것을 유발할 수 있다. 그런 다음, ARDS는 특히 급성 감염 사례의 발병 후에 종종 발생할 수 있다.
동맥 혈액 가스 분석 및 흉부 X-선은 상기 언급된 기준을 사용하여 추론에 의한 공식적인 진단을 허용한다. 심각한 저산소혈증이 일반적으로 포함되지만, 비정상적 PaO2를 정의하는 적절한 임계치는 체계적으로 연구된 적이 없다. 폐 부종의 임의의 심인성 원인은 배제되어야 한다. 이는 폐 동맥 쐐기 압력을 측정하기 위한 폐 동맥 카테터를 배치함으로써 행해질 수 있다. 그러나, 이는 필요하지 않으며, 폐 동맥 카테터의 사용이 ARDS를 포함한 중증 질병에서 개선된 환자 결과를 유도하지 않는다는 것을 입증하는 풍부한 증거가 나타났기 때문에 이제는 거의 수행되지 않는다. 일반 흉부 X-선은 대부분의 경우 양측 폐포 침윤을 문서화하기에 충분하다. CT 스캐닝은 ARDS에서 폐 실질의 보다 정확한 이미지를 유도하는 반면, 그것은 ARDS 환자의 임상 관리에는 거의 유용성이 없으며, 주로 연구 도구로 남아 있다.
급성 호흡 곤란 증후군은 일반적으로 집중 치료 시설에서 기계적 환기로 치료된다. 환기는 일반적으로 장기간 환기(≥ 2주)가 불가피할 때마다 구강-기관 삽관 또는 기관 절개술을 통해 전달된다. 비침습적 환기 가능성은 질환의 매우 초기 기간 또는 질환(비정형적 폐렴(atypical pneumonias), 폐 타박상(pulmonary contusion), 주요 수술 환자)의 발병 위험이 있는 개체의 예방으로 제한된다. 근본적인 원인의 치료는 ARDS 사진을 유지하는 경향이 있기 때문에 필수적이다. 적절한 항생제 요법은 미생물학적 배양 결과가 이용 가능한 즉시 투여되어야 한다. 국소 미생물학적 감시가 효율적이라면 경험적 요법이 적절할 수 있다. ARDS 환자의 60% 이상은 폐 손상 발병 전 또는 후에 (원내) 폐 감염을 경험한다. 감염의 기원은, 외과적으로 치료할 수 있는 경우, 수술을 받아야 한다. 패혈증이 진단되면, 적절한 국소 프로토콜이 제정되어야 한다.
5. 허혈-
재관류
손상(
Ischemia
-
Reperfusion
Injury)
재관류 손상은 혈액 공급이 허혈 기간 후에 조직으로 되돌아올 때 유발되는 조직에 대한 손상을 지칭한다. 혈액으로부터 산소와 영양분의 부재는 순환의 회복이 정상적인 기능의 회복보다는 산화 스트레스의 유도를 통해 염증 및 산화적 손상을 초래하는 상태를 생성한다.
재관류 손상의 손상은 부분적으로 손상된 조직의 염증 반응에 기인한다. 새롭게 돌아온 혈액에 의해 영역으로 운반되는 백혈구는 조직 손상에 대한 반응으로 자유 라디칼뿐만 아니라 인터류킨과 같은 염증 인자의 숙주를 방출한다. 회복된 혈류는 세포 단백질, DNA 및 원형질막을 손상시키는 세포 내에 산소를 재도입한다. 세포의 막에 대한 손상은 결국 더 많은 자유 라디칼의 방출을 유발할 수 있다. 이러한 반응성 종은 또한 아폽토시스를 공격하기 위해 산화 환원 신호전달에 간접적으로 작용할 수 있다. 백혈구는 또한 작은 모세혈관에 축적되어 그들을 방해하고 더 많은 허혈로 이어질 수 있다.
재관류 손상은 뇌졸중 및 뇌 외상에 관여하는 뇌의 허혈 캐스케이드에서 역할을 한다. 허혈 및 재관류 손상의 반복적인 발작은 또한 욕창 및 당뇨병성 족부 궤양과 같은 만성 상처의 형성 및 치유 실패로 이어지는 요인으로 생각된다. 연속적인 압력은 혈액 공급을 제한하고 허혈을 유발하고, 염증은 재관류 중에 발생한다. 이 과정이 반복됨에 따라, 그것은 결국 상처를 유발하기에 충분히 조직을 손상시킨다.
연장된 허혈(60분 이상)에서, 하이포크산틴은 ATP 대사의 분해 생성물로서 형성된다. 효소 크산틴 탈수소효소는 산소의 높은 가용성의 결과로서 크산틴 옥시다제로 전환된다. 이 산화는 분자 산소가 매우 반응성 슈퍼옥사이드 및 하이드록실 라디칼로 전환되는 결과를 초래한다. 크산틴 옥시다제는 또한 요산을 생성하며, 이는 산화촉진제 및 퍼옥시나이트라이트와 같은 반응 종의 스캐빈저 둘 다로서 작용할 수 있다. 재관류 동안 생성된 과도한 산화질소는 슈퍼옥사이드와 반응하여 강력한 반응성 종인 퍼옥시나이트라이트를 생성한다. 이러한 라디칼 및 반응성 산소 종은 세포막 지질, 단백질 및 글리코사미노글리칸을 공격하여 추가 손상을 일으킨다. 그들은 또한 산화환원 신호전달에 의해 특정 생물학적 과정을 개시할 수 있다.
6. 심혈관 질환
심혈관 질환은 심장 또는 혈관(동맥 및 정맥)을 포함하는 질환의 부류를 지칭한다. 상기 용어는 기술적으로 심혈관계에 영향을 미치는 임의의 질환을 지칭하는 반면, 일반적으로 죽상 동맥 경화증(동맥 질환)과 관련된 질환을 지칭하는 데 사용된다. 이러한 상태는 유사한 원인, 메커니즘 및 치료를 갖는다. 심혈관 질환의 치료는 각 환자에서 특정 형태의 질환에 의존하지만, 효과적인 치료는 항상 상기 논의된 예방적 생활 습관 변화를 포함한다. 혈압 감소 약물, 아스피린 및 스타틴 콜레스테롤 저하 약물과 같은 약물이 도움이 될 수 있다. 일부 상황에서, 수술 또는 혈관 성형술이 손상된 혈관을 재개방, 수리 또는 교체하기 위해 필요할 수 있다.
대부분의 서방 국가들은 높고 증가하는 비율의 심혈관 질환에 직면한다. 매년, 심장 질환은 암보다 더 많은 미국인을 죽인다. 심장 질환만으로 모든 사망의 30%가 유발되었고, 심혈관계의 다른 질환은 상당한 추가 사망 및 장애를 유발한다. 2005년까지, 그것은 미국 및 대부분의 유럽 국가에서 사망 및 장애의 1번 원인이었다. 대규모 조직학적 연구(PDAY)에 따르면 청소년기로부터 혈관 손상이 축적되어 어린 시절부터 1차 예방 노력이 필요했다.
일부 바이오마커는 심혈관 질환의 보다 상세한 위험을 제공하는 것으로 생각된다. 그러나, 이러한 바이오마커의 임상적 가치가 의심스럽다. 현재, 심혈관 질환의 더 높은 위험을 반영할 수 있는 바이오마커는 다음을 포함한다:
더 높은 피브리노겐 및 PAI-1 혈액 농도,
상승된 호모시스테인 또는 심지어 정상의 상반부,
비대칭 디메틸아르기닌의 상승된 혈액 수준,
C-반응성 단백질에 의해 측정된 높은 염증,
B형 나트륨 이뇨성 펩티드(BNP)의 상승된 혈액 수준.
심혈관 질환의 다양한 형태는 동맥류(aneurysms), 협심증(angina), 부정맥(arrhythmia), 죽상 동맥 경화증(atherosclerosis), 심근병증(cardiomyopathy), 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease), 선천성 심장 질환(congenital heart disease), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 심근염(myocarditis), 판막 질환(valve disease), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 확장성 심근병증(dilated cardiomyopathy), 이완기 기능 장애(diastolic dysfunction), 심내막염(endocarditis), 고혈압(고혈압(hypertension)), 비후성 심근병증(hypertrophic cardiomyopathy), 질판막 탈출증(nitral valve prolapse), 심근경색(myocardial infarction), 및 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism)을 포함한다.
7. 자가면역/염증 질환
본 발명은 다양한 자가면역 및/또는 염증성 질환 상태, 예를 들어, 척추 관절병증(spondyloarthropathy), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis), 장병성 관절염(enteropathic arthritis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 장 질환(irritable bowel disease), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 청소년 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 가족성 지중해 열(familial Mediterranean fever), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 초기 관절염(early arthritis), 바이러스성 관절염(viral arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis) 또는 건선(psoriasis)의 치료를 고려한다. 이러한 질환의 진단 및 치료는 문헌에 잘 문서화되어 있다.
8. 화학요법, 방사선요법 및 사이토카인 요법 독성
화학요법, 방사선 및 사이토카인을 포함한 다양한 형태의 암 요법은 암 환자에서 독성, 때로는 심한 독성과 관련된다. 독성은 적어도 부분적으로 히스톤의 세포외 작용에 의해 유발되는 정도로, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하여 이러한 독성을 감소시켜 환자의 일부에 대한 불쾌감을 감소시키거나 완화시키고, 더 높은 투여량의 요법을 허용하고자 한다.
9. 화상(Burn)
의학에서, 화상은 열, 추위, 전기, 화학 물질, 마찰 또는 방사선으로 인한 손상일 수 있다. 1도 화상은 일반적으로 발적(홍반), 백색 플라크 및 부상 부위의 경미한 통증으로 제한된다. 이러한 화상은 일반적으로 표피로만 확장된다. 2도 화상은 추가로 투명한 유체로 채워지고, 피부의 표재성 물집이 생기며, 신경 관여 수준에 따라 다소 통증을 포함할 수 있다. 2도 화상은 표재성 (유두) 진피를 포함하며, 또한 깊은 (망상) 진피층을 포함할 수 있다. 3도 화상은 추가로 피부가 탄화되어 단단한 가죽형 딱지(eschar)를 생성한다. 딱지는 신체의 영향을 받지 않은 부분으로부터 분리된 딱지(scab)이다. 종종, 보라색 유체도 있다. 이러한 유형의 화상은 신경 말단이 화상 영역에서 파괴되었기 때문에 종종 무통이다. 심각한 화상은, 특히 그들이 신체의 넓은 면적을 덮으면, 사망을 유발할 수 있고; 폐에 대한 화상 손상의 임의의 전조(예: 연기 흡입을 통해)는 의학적 응급 상황이다.
근육 또는 뼈와 같이 피부 밑에 있는 조직을 손상시키는 화상은 때때로 4도 화상으로 분류된다. 이러한 화상은 3개의 추가 도로 나뉜다: 4도 화상은 피부가 회복할 수 없을 정도로 손실되고, 5도 화상은 근육이 회복할 수 없을 정도로 손실되고, 6도 화상은 뼈가 까맣게 탄 결과를 초래한다.
"표재성 두께", "부분적 두께"(표재성 및 심층 범주로 나뉜다) 및 "전체 두께"의 새로운 분류는 보다 정확하게 피부의 표피, 진피 및 피하 층에 관련되고, 치료를 안내하고 결과를 예측하는 데 사용된다.
화학적 화상은 일반적으로 수산화나트륨(lye), 질산은과 같은 화학적 화합물 및 더 심각한 화합물(예: 황산)에 의해 야기된다. 중등도 내지 중증의 화학적 화상을 유발할 수 있는 대부분의 화학 물질(전부는 아님)은 강산 또는 염기이다. 산화제로서 질산은 아마도 최악의 화상 발생 화학 물질 중 하나이다. 불화수소산은 뼈까지 먹을 수 있고, 그 화상은 종종 즉시 분명하지 않다. 중등도 내지 중증 화학적 화상을 유발할 수 있는 대부분의 화학 물질은 부식성이라고 한다.
전기 화상은 일반적으로 감전, 번개에 의해 타격되거나, 전도성 젤 없이 제세동되거나 심장전환되는 증상이다. 지속되는 내부 손상은 전류의 입구 및 출구 상처일 뿐이므로- 보이는 "화상"의 크기에 비례하지 않을 수 있다.
화상은 전체 신체 표면적(TBSA)의 관점에서 평가되고, 이는 부분적 두께 또는 전체 두께 화상(표재성 두께 화상은 계수되지 않음)의 영향을 받는 백분율이다. 9의 규칙은 영향을 받은 TBSA를 추정하는 신속하고 유용한 방법으로 사용된다. 화상을 입은 사람을 관리하는 첫 번째 단계는 연소 과정을 중지시키는 것이다. 건조 분말 화상의 경우, 분말을 먼저 닦아내야 한다. 다른 화상의 경우, 영향받은 영역은 다량의 깨끗한 물로 세정하여 이물질을 제거하고 연소 과정의 중지를 도와야 한다. 화상 피해자의 체온 상태를 심각하게 손상시킬 수 있기 때문에, 광범위한 화상을 입은 사람에게는 냉수를 결코 적용하지 않아야 한다. 이 관리 단계에서, 기도 상태를 평가하는 것도 중요하다. 환자가 화재에 연루된 경우, 달리 입증될 때까지 지속적인 흡입 손상을 입었다고 가정해야 하며, 그에 따라 치료를 관리해야 한다.
일단 연소 과정이 중단되고, 기도 상태가 보장되면, 환자는 파크랜드 공식(Parkland formula)에 따라 체적 소생되어야 한다. 이 공식은 부상 시간 후 처음 24시간 동안 전달되는 락테이트화 링거액의 양이 다음과 같음을 지시한다:
유체= 4cc x %TBSA x 중량(kg)
%TBSA는 임의의 1도 화상을 제외한다.
이 유체의 절반은 부상 후 처음 8시간 동안 제공되어야 하고, 나머지는 이후 16시간 동안 제공되어야 한다. 상기 공식은 가이드일 뿐이며, 주입은 소변 배출량 및 중심 정맥압에 맞게 조정되어야 한다. 부적절한 유체 소생술은 신부전 및 사망을 유발한다. 전체 두께 화상의 심한 부종은 괴사딱지절개술(escharotomy)로 치료될 수 있다.
C. 감염성 질환
염증성 질환의 또 다른 범주는 바이러스, 박테리아, 진균 및 병원체를 포함한 감염 질환이다. MUC1이 역할을 하는 것으로 나타난 특정 감염성 질환은 SARS-CoV-2, 인간 유두종 바이러스 및 에이치. 파일로리(H. pylori) 감염이다.
D. 제형 및 투여
본 개시내용은 항-MUC1-C 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 보다 특히 인간에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거되었음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 함께투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등일 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 식염수, 덱스트로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같은 음이온으로 형성된 염과 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
본 개시내용의 항체는 고전적인 약제학적 제제를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 이들 조성물의 투여는 표적 조직이 그 경로를 통해 이용 가능한 한 임의의 일반적인 경로를 통해 이루어질 것이다. 이는 경구, 비강, 협측, 직장, 질 또는 국소를 포함한다. 대안적으로, 투여는 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의한 것일 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 상기 문헌에 기재된 약제학적으로 허용되는 조성물로서 투여될 것이다. 특별한 관심은 직접적인 종양 내 투여, 종양의 관류, 또는 종양에 대한 국소 또는 국부 투여, 예를 들어, 국소 또는 국부 맥관 구조 또는 림프계, 또는 절제된 종양 층에서의 투여이다.
활성 화합물은 또한 비경구 또는 복강내로 투여될 수 있다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다.
E. 병용 암 요법
본 발명의 맥락에서, 본원에 기재된 항-MUC1-C 항체가 화학요법 또는 방사선요법 개입, 또는 다른 치료와 함께 유사하게 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 또한, 특히 MUC1 세포질 도메인을 표적으로 하는 펩티드 및 소분자와 같은, MUC1 기능의 다른 측면을 표적으로 하는 다른 요법과 항-MUC1-C/ECD 항체를 결합시키는 것이 효과적일 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물을 사용하여 세포를 사멸시키거나, 세포 성장을 억제하거나, 전이를 억제하거나, 혈관 신생을 억제하거나 그렇지 않으면 종양 세포의 악성 표현형을 역전시키거나 감소시키기 위해, 일반적으로 "표적 세포"를 본 개시내용에 따른 항-MUC1-C 항체 및 적어도 하나의 다른 제제와 접촉시킬 것이다. 이러한 조성물은 세포를 사멸시키거나 이의 증식을 억제하는데 효과적인 조합량으로 제공될 것이다. 이 과정은 세포를 본 발명에 따른 항-MUC1-C 항체 및 다른 제제(들) 또는 인자(들)와 동시에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이는 세포를 두 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 접촉시키거나 세포를 두 개의 별개의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시킴으로써 달성될 수 있고, 여기서 하나의 조성물은 본 개시내용에 따른 항-MUC1-C 항체를 포함하고 다른 하나는 다른 제제를 포함한다.
대안적으로, 항-MUC1-C 항체 요법은 수 분 내지 수 주에 이르는 간격으로 다른 제제 치료에 선행하거나 뒤따를 수 있다. 다른 제제 및 항-MUC1 항체가 세포에 별도로 적용되는 구현예에서, 일반적으로, 제제 및 발현 작제물이 여전히 세포에 유리하게 결합된 효과를 발휘할 수 있도록, 상당한 시간이 각 전달 시간 사이에서 만료되지 않는 것을 보장할 것이다. 이러한 예에서, 세포를 서로 약 12 내지 24시간 내에, 더욱 바람직하게는 서로 약 6 내지 12시간 내에 두 양식으로 접촉시킬 것이 고려되고, 단지 약 12시간의 지연 시간이 가장 바람직하다. 일부 상황에서, 치료 기간을 크게 연장하는 것이 바람직할 수 있지만, 여기서 각 투여 사이에 수 일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과한다.
항-MUC1 항체 또는 다른 제제 중 어느 하나의 하나 이상의 투여가 목적시될 것으로 생각할 수 있다. 다양한 조합이 사용될 수 있으며, 여기서 이하 예시된 바와 같이, 본 개시내용 요법에 따른 항-MUC1-C 항체는 "A"이고, 다른 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
다른 조합이 고려된다. 다시, 세포 사멸을 달성하기 위해, 두 제제는 세포를 사멸시키기에 효과적인 조합량으로 세포에 전달된다.
암 요법에 적합한 제제 또는 인자는 세포에 적용될 때 DNA 손상을 유도하는 임의의 화학적 화합물 또는 치료 방법을 포함한다. 이러한 제제 및 인자는 DNA 손상을 유도하는 방사선 및 파동, 예를 들어, 조사, 마이크로파, 전자 방출 등을 포함한다. "화학요법" 또는 "유전 독성제"로서도 기재된 다양한 화학적 화합물이 사용될 수 있다. 이는 국소 종양 부위를 조사함으로써 달성될 수 있고; 대안적으로, 종양 세포는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 제제와 접촉될 수 있다.
다양한 부류의 화학요법제가 본 개시내용과 함께 사용하기 위해 고려된다. 예를 들어, 선택적 에스트로겐 수용체 길항제("SERM"), 예를 들어, 타목시펜, 4-하이드록시 타목시펜(아피목스펜), 팔소덱스, 랄록시펜, 바제독시펜, 클로미펜, 페마렐, 라소폭시펜, 오르멜록시펜 및 토레미펜.
사용되는 것으로 고려되는 화학요법제는, 예를 들어, 캄프토테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C를 포함한다. 본 개시내용은 또한 방사선 기반 또는 실제 화합물에 관계 없이 하나 이상의 DNA 손상제의 조합의 사용, 예를 들어, 시스플라틴과 함께 X-선의 사용 또는 에토포사이드와 함께 시스플라틴의 사용을 포함한다. 제제는 상기 기재된 바와 같이 MUC1 펩티드와 결합함으로써 조합된 치료 조성물 또는 키트로서 제조되고 사용될 수 있다.
열 충격 단백질 90은 많은 진핵생물 세포에서 발견되는 조절 단백질이다. HSP90 억제제는 암 치료에 유용한 것으로 나타났다. 이러한 억제제는 겔다나마이신, 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, PU-H71 및 리파부틴을 포함한다.
DNA를 직접 가교결합시키거나 부가물을 형성하는 제제도 또한 구상된다. 시스플라틴과 같은 제제, 및 다른 DNA 알킬화제가 사용될 수 있다. 시스플라틴은 암을 치료하는데 널리 사용되어 왔으며, 총 3개의 코스에 대해 3주 마다 5일 동안 20mg/m2의 임상 적용에 효과적인 투여량이 사용된다. 시스플라틴은 경구로 흡수되지 않고, 따라서 정맥내, 피하, 종양내 또는 복강내 주사를 통해 전달되어야 한다.
DNA를 손상시키는 제제는 또한 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물을 포함한다. 이러한 화학요법 화합물은 독소루비신, 에토포사이드, 베라파밀, 포도필로톡신 등으로도 공지된 아드리아마이신을 포함한다. 신생물의 치료를 위한 임상 환경에서 널리 사용되는 이들 화합물은 독소루비신의 경우 21일 간격으로 25 내지 75mg/m2 범위의 용량으로 정맥내 볼루스 주사를 통해, 에토포사이드의 경우 35 내지 50mg/m2로 정맥내로 또는 정맥내 투여량의 두 배로 경구로 투여된다. 탁산과 같은 미세소관 억제제가 또한 고려된다. 이러한 분자는 탁서스(Taxus) 속의 식물에 의해 생성된 디테르펜이고, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한다.
표피 성장 인자 수용체 억제제, 예를 들어, Iressa, mTOR, FK506-결합 단백질 12-라파마이신 관련 단백질 1(FRAP1)로도 공지된 라파마이신의 포유류 표적은 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동성, 세포 생존, 단백질 합성 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 따라서, 본 개시내용에 따른 암 요법에 사용하기 위한 라파마이신 및 이의 유사체("라파로그")가 고려된다.
다른 가능한 요법은 전신 염증에 관여하는 사이토카인 및 급성 단계 반응을 자극하는 사이토카인 그룹의 구성원인 TNF-α(종양 괴사 인자-알파)이다. TNF의 주요 역할은 면역세포의 조절에 있다. TNF는 또한 아폽토시스 세포사를 유도하고, 염증을 유도하고, 종양형성 및 바이러스 복제를 억제할 수 있다.
핵산 전구체 및 서브유닛의 합성 및 충실도를 방해하는 제제는 또한 DNA 손상을 유도한다. 이와 같이 다수의 핵산 전구체가 개발되었다. 특히 유용한 것은 광범위한 검사를 거쳐 쉽게 이용 가능한 제제이다. 이와 같이, 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 제제는 신생물 조직에 의해 우선적으로 사용되어 이 제제가 신생물 세포를 표적화하는 데 특히 유용하게 한다. 매우 독성이 있지만, 5-FU는 국소를 포함하는 광범위한 범위의 담체에 적용 가능하지만, 3 내지 15mg/kg/일 범위의 투여량의 정맥내 투여가 일반적으로 사용된다.
DNA 손상을 일으키고 광범위하게 사용된 다른 인자는 일반적으로 γ-선, x-선 및/또는 종양 세포로 방사성 동위원소의 지시된 전달로 공지된 것들을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태, 예를 들어, 마이크로파 및 UV-조사도 또한 고려된다. 이러한 모든 요인이 광범위한 범위의 손상 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 영향을 미칠 가능성이 높다. x-선에 대한 용량 범위는 장기간(3 내지 4주) 동안 50 내지 200뢴트겐의 1일 투여량으로부터 2,000 내지 6000뢴트겐의 단일 투여량까지 다양하다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 매우 다양하며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
또한, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법 및 수술이 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 특히, 아바스틴, 에르비툭스, 글리벡, 헤르셉틴 및 리툭산과 같은 표적 요법을 사용할 수 있다.
병용 요법에 대한 하나의 특히 유리한 접근법은 MUC1을 표적으로 하는 제2 제제를 선택하는 것이다. 본 발명자들에 의해 출원된 공계류중인 출원에서, 적어도 4개의 연속 MUC1 잔기 및 20개 이하의 연속 MUC1 잔기의 MUC1 펩티드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고 서열 CQC를 포함하는, 대상체에서 MUC1-양성 종양 세포를 억제하는 방법이 개시되어 있고, 여기서 CQC의 아미노-말단 시스테인은 이의 NH2-말단 상에서 천연 MUC-1 막관통 서열에 상응할 필요가 없는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 덮인다. 펩티드는 적어도 5개의 연속 MUC1 잔기, 적어도 6개의 연속 MUC1 잔기, 적어도 7개의 연속 MUC1 잔기, 적어도 8개의 연속 MUC1 잔기를 포함할 수 있으며, 서열은 보다 구체적으로 CQCR(서열번호 31), CQCRR(서열번호 32), CQCRRR(서열번호 33), CQCRRRR(서열번호 34), CQCRRK(서열번호 35), CQCRRKN(서열번호 36), 또는 RRRRRRRRRCQCRRKN(서열번호 37)을 포함할 수 있다. 펩티드는 MUC1의 10개 이하의 연속 잔기, 11개의 연속 잔기, 12개의 연속 잔기, 13개의 연속 잔기, 14개의 연속 잔기, 15개의 연속 잔기, 16개의 연속 잔기, 17개의 연속 잔기, 18개의 연속 잔기 또는 19개의 연속 잔기를 함유할 수 있다. 펩티드는 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K와 같은 세포 전달 도메인에 융합될 수 있다. 펩티드는 모든 L 아미노산, 모든 D 아미노산, 또는 L 및 D 아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 미국 특허 제8,524,669호를 참조한다.
이 기술에 대한 변형은 미국 특허 출원 일련 번호 제13/026,858호에 기재되어 있다. 그 출원에, 적어도 4개의 연속 MUC1 잔기 및 20개 이하의 연속 MUC1 잔기의 MUC1 펩티드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 서열 CQC를 포함하는 MUC1-양성 암 세포를 억제하는 방법이 개시되어 있으며, 여기서 (i) CQC의 아미노-말단 시스테인은 이의 NH2-말단 상에서 천연 MUC1 막관통 서열에 상응할 필요가 없는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 덮이고; (ii) 펩티드는 천연 MUC1 잔기에 상응하는 양으로 하전된 아미노산 잔기 이외에 3 내지 5개의 연속적인 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함한다. MUC1-양성 세포는 고형 종양 세포, 예를 들어, 폐암 세포, 뇌암 세포, 두경부암 세포, 유방암 세포, 피부암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 위암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 자궁암 세포, 자궁경부암 세포, 난소암 세포, 고환암 세포, 피부암 세포 또는 식도암 세포일 수 있다. MUC1-양성 세포는 백혈병 또는 골수종 세포, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종일 수 있다. 펩티드는 스테이플링 펩티드, 사이클릭화 펩티드, 펩티도미메틱 또는 펩토이드일 수 있다. 상기 방법은 세포를 제2 항암제와 접촉시키는 단계, 예를 들어, 제2 항암제가 펩티드 이전에, 펩티드 이후에 또는 펩티드와 동시에 접촉되는 경우를 추가로 포함할 수 있다. 억제는 암 세포 성장, 암 세포 증식을 억제하거나, 예를 들어, 아폽토시스에 의한 암 세포 사멸을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명자들에 의해 진보된 또 다른 기술(참조: 미국 특허 출원 일련 번호 제13/045,033호)은 상기 세포를 다음 구조를 갖는 플라본 또는 이의 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 염증성 신호전달을 억제하는 방법을 포함한다:
상기 식에서,
R1은 H, -OH, =O, 치환되거나 비치환된 알킬(C1-8), 알콕시(C1-8), 할로알킬(C1-8), 치환된 페닐 또는 비치환된 페닐이고, 여기서 R1이 =O이면, C7-C8은 이중 결합이고;
R2는 H, -OH, 알킬(C1-8), 치환된 페닐, 비치환된 페닐, 페닐, 페닐 티아졸, 이미다졸, 피라졸 또는 푸란이고;
R3은 H, -OH, =O, 할로겐, 할로알킬(C1-8), 치환되거나 비치환된 알킬(C1-8), 치환된 페닐 또는 비치환된 페닐이고, 여기서 R3이 =O이면, C8-C9는 이중 결합이고;
R4는 H 또는 -OH이고;
R5는 H, -OH, 치환되거나 비치환된 알킬(C1-8) 또는 알콕시(C1-8), 또는 OR8이고, 여기서 R8은 알킬(C1-8), 에스테르 또는 아미드이고;
R6은 H, -OH, 치환되거나 비치환된 알킬(C1-8) 또는 알콕시(C1-8), 또는 OR8이고, 여기서 R8은 알킬(C1-8), 에스테르 또는 아미드이고;
R7은 H, -OH, 또는 치환되거나 비치환된 알킬(C1-8)이고,
단, R1 및 R3은 둘 다 =O일 수 없다.
R1은 =O일 수 있다. R3은 =O일 수 있다. 모린 중 플라본, 아피게닌, 캄페롤, 피세틴, PD98059, 7-(벤질옥시)-4-(트리플루오로메틸)-2H-크로멘-2-온 또는 7-[(3-옥소부탄-2-일)옥시]-4-페닐-2H-크로멘-2-온 또는 전술한 것 중 어느 하나의 염.
당업자는 문헌(참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, Chapter 33, in particular pages 624-652)에 지시된다. 용량의 일부 변형은 치료될 대상체의 상태에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 대상체에게 적합한 투여량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물제제 표준에 의해 요구되는 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
IV. 항체 접합체
항체는 적어도 하나의 제제에 연결되어 항체 접합체를 형성할 수 있다. 진단제 또는 치료제로서 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 목적하는 분자 또는 모이어티를 연결하거나 공유 결합시키거나 복합체화하는 것이 통상적이다. 이러한 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이펙터 분자는 면역억제/항염증과 같은 목적하는 활성을 갖는 분자를 포함한다. 이러한 분자의 비제한적인 예는 상기 제시되어 있다. 이러한 분자는 임의로 분자가 표적 부위에서 또는 그 근처에서 방출될 수 있도록 설계된 절단 가능한 링커를 통해 부착된다.
대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 크로모포어, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예를 들어, 비오틴을 포함한다.
항체 접합체는 일반적으로 진단제로서 사용하기에 바람직하다. 항체 진단은 일반적으로 다양한 면역검정에서와 같이 시험관내 진단에 사용하기 위한 것들과 일반적으로 "항체 지시 이미징"으로 공지된 생체내 진단 프로토콜에 사용하기 위한 것들인 두 부류에 속한다. 항체에 대한 이들의 부착을 위한 방법과 같이, 많은 적절한 이미징제가 당업계에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호, 및 제4,472,509호). 사용된 이미징 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 플루오로크롬, NMR 검출 가능 물질, 및 X-선 이미징제일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀(III)과 같은 이온을 예로 언급할 수 있고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. X-선 이미징과 같은 다른 맥락에서 유용한 이온은 란탄(III), 금(III), 납(II), 및 특히 비스무트(III)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
치료 및/또는 진단 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 125I는 종종 특정 구현예에서 사용하기에 바람직하고, 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 또한 낮은 에너지와 장거리 검출에 대한 적합성으로 인해 종종 바람직하다. 방사성 표지된 모노클로날 항체는 당업계에 익히 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 화학적 산화제, 예를 들어, 차아염소산나트륨, 또는 효소적 산화제, 예를 들어, 락토퍼옥시다제와의 접촉에 의해 요오드화될 수 있다. 모노클로날 항체는 리간드 교환 공정에 의해, 예를 들어, 퍼테크네이트를 제1 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 컬럼 상에 킬레이트화하고 이 컬럼에 항체를 적용함으로써 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 퍼테크네이트, 환원제, 예를 들어, SNCl2, 완충 용액, 예를 들어, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액, 및 항체를 배양함으로써 직접 표지화 기술이 사용될 수 있다. 중간 작용성 그룹은 종종 방사성 동위원소를 항체에 결합시키는 데 사용되고, 금속 이온이 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)일 때 존재한다.
접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광 표지 중에는, Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPT-TRX, 캐스케이드 블루, Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오리건 그린 488, 오리건 그린 500, 오리건 그린 514, 퍼시픽 블루, REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그래핀, ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민 및/또는 텍사스 레드가 포함된다.
고려되는 다른 유형의 항체 접합체는 주로 시험관내에서 사용하기 위한 것들이며, 여기서 항체는 2차 결합 리간드 및/또는 발색 기질과 접촉시 착색된 생성물을 생성할 효소(효소 태그)에 연결된다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기재되어 있다.
항체에 대한 분자의 부위 특이적 부착의 또 다른 공지된 방법은 항체와 합텐 기반 친화성 표지의 반응을 포함한다. 본질적으로, 합텐 기반 친화성 표지는 항원 결합 부위에서 아미노산과 반응하여 이 부위를 파괴하고 특정 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이는 항체 접합체에 의한 항원 결합의 손실을 초래하기 때문에 유리하지 않을 수 있다.
아지도 그룹을 함유하는 분자는 또한 저강도 자외선에 의해 생성된 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 대한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있다(Potter and Haley, 1983). 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조악한 세포 추출물에서 뉴클레오티드 결합 단백질을 식별하기 위해 부위-지시된 광프로브로서 사용되어 왔다(Owens & Haley, 1987; Atheron et al., 1985). 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 맵핑하는 데 사용되어 왔고(Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989), 항체 결합제로서 사용될 수 있다.
접합체 모이어티에 대한 항체의 부착 또는 접합을 위한 몇몇 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은, 예를 들어, 유기 킬레이트제, 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 착물의 사용을 포함한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 모노클로날 항체는 또한 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트와 같은 커플링제의 존재하에 효소와 반응할 수 있다. 플루오레세인 마커를 갖는 접합체는 이들 커플링제의 존재하에 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 이미징은 모노클로날 항체를 사용하여 달성되고, 검출 가능한 이미징 모이어티는 링커, 예를 들어, 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-석신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트를 사용하여 항체에 결합된다.
다른 구현예에서, 항체 결합 부위를 변경하지 않는 반응 조건을 사용하여 면역글로불린의 Fc 영역에 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 이 방법론에 따라 생산된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성, 및 감도를 나타내는 것으로 개시되어 있다(미국 특허 제5,196,066호, 본원에 참조로 포함됨). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역 내의 탄수화물 잔기에 접합되는 이펙터 또는 리포터 분자의 부위 특이적 부착도 또한 문헌(O'Shannessy et al., 1987)에 개시되어 있다. 이 접근법은 현재 임상 평가 중인 진단적으로 및 치료적으로 유망한 항체를 생산하는 것으로 보고되었다.
V. 면역검출 방법
추가의 구현예에서, MUC1 및 이의 관련 항원을 결합, 정제, 제거, 정량화 및 달리 일반적으로 검출하는 면역검출 방법이 있다. 일부 면역검출 방법은, 몇 가지를 언급하자면, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 방사상 면역 검정(RIA), 면역 방사 측정 검정, 형광 면역 검정, 화학발광 검정, 생물발광 검정, 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 특히, MUC1-C 항체의 검출 및 정량화를 위한 경쟁적 검정이 또한 제공된다. 다양한 유용한 면역 검출 방법의 단계가 과학 문헌, 예를 들어, 문헌(참조: Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987))에 기재되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은 샘플을 수득하고, 경우에 따라 면역복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에 본원에서 논의된 구현예에 따르는 제1 항체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다.
선택된 생물학적 샘플을 면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에 충분한 시간 동안 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 샘플에 항체 조성물을 간단히 첨가하고, 항체가 존재하는 MUC1과 면역 복합체를 형성하기에, 즉 MUC1에 결합하기에 충분한 기간 동안 혼합물을 배양하는 문제이다. 이 시간 후에, 샘플-항체 조성물, 예를 들어, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯은 일반적으로 세척되어 임의의 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하여 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체만이 검출될 수 있도록 한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 다수의 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소 태그 중 임의의 것과 같은 표지 또는 마커의 검출에 기초한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이, 제2 결합 리간드, 예를 들어, 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열의 사용을 통해 추가의 이점을 찾을 수 있다.
검출에 사용된 항체는 그 자체가 검출 가능한 표지에 연결될 수 있으며, 여기서 하나는 이 표지를 간단히 검출하여 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양이 결정될 수 있도록 할 것이다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에 결합되는 제1 항체는 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우에, 제2 결합 리간드는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 제2 결합 리간드는 그 자체가 종종 항체이며, 이는 따라서 "2차" 항체로 명명될 수 있다. 1차 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에 충분한 시간 동안 표지된 2차 결합 리간드, 또는 항체와 접촉시킨다. 이어서, 2차 면역 복합체는 일반적으로 세척하여 임의의 비특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거한 다음, 2차 면역 복합체 내의 나머지 표지를 검출시킨다.
추가의 방법은 두 단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 항체와 같은 제2 결합 리간드는 상기 기재된 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성하기 위해 사용된다. 세척 후, 2차 면역 복합체는 다시 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에 충분한 시간 동안 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어 이렇게 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 허용한다. 이 시스템은 이것이 목적시되는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역 검출의 한 가지 방법은 2개의 상이한 항체를 사용한다. 제1 비오티닐화 항체가 표적 항원을 검출하는 데 사용되고, 이어서 제2 항체는 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하는 데 사용된다. 그 방법에서, 시험되는 샘플은 제1 단계 항체를 함유하는 용액에서 먼저 배양된다. 표적 항원이 존재하면, 항체의 일부는 항원에 결합하여 비오티닐화 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 항체/항원 복합체는 스트렙타비딘(또는 아비딘), 비오티닐화 DNA, 및/또는 상보적인 비오티닐화 DNA의 연속 용액에서 배양하여 증폭시키며, 각 단계는 항체/항원 복합체에 추가 비오틴 부위를 추가한다. 증폭 단계는 적절한 수준의 증폭이 달성될 때까지 반복되며, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양된다. 이 제2 단계 항체는, 예를 들어, 크로모겐 기질을 사용하여 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 효소와 같이 표지된다. 적절한 증폭으로, 거시적으로 가시적인 접합체가 생성될 수 있다.
또 다른 공지된 면역 검출 방법은 면역-PCR(중합효소 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR 방법은 비오티닐화 DNA와 함께 배양시까지 캔터 방법(Cantor method)과 유사하지만, 여러 라운드의 스트렙타비딘 및 비오티닐화 DNA 배양을 사용하는 대신, DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체는 항체를 방출하는 낮은 pH 또는 높은 염 완충액으로 세척한다. 이어서, 생성되는 세척 용액은 적절한 대조군을 갖는 적합한 프라이머와 PCR 반응을 수행하는데 사용된다. 적어도 이론적으로, PCR의 막대한 증폭 능력과 특이성은 단일 항원 분자를 검출하는 데 활용될 수 있다.
A. ELISA
면역 검정은, 이들의 가장 간단한 의미에서, 결합 검정이다. 특정의 바람직한 면역 검정은 당업계에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사성 면역 검정(RIA)이다. 조직 절편을 사용하는 면역조직화학적 검출도 특히 유용하다. 그러나, 검출은 이러한 기술로 제한되지 않으며, 웨스턴 블롯, 도트 블롯팅, FACS 분석 등이 또한 사용될 수 있음이 쉽게 이해될 것이다.
하나의 예시적인 ELISA에서, 본 개시내용의 항체는 폴리스티렌 미세역가 플레이트의 웰과 같은 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면 상에 고정시킨다. 이어서, MUC1을 함유하는 것으로 의심되는 시험 조성물이 웰에 첨가된다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해 결합 및 세척 후, 결합된 항원이 검출될 수 있다. 검출은 검출 가능한 표지에 연결된 다른 항-MUC1-C 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유형의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항-MUC1-C 항체의 첨가에 이어, 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있고, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.
또 다른 예시적인 ELISA에서, MUC1 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 웰 표면에 고정시킨 다음, 항-MUC1-C 항체와 접촉시킨다. 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위해 결합 및 세척 후, 결합된 항-MUC1-C 항체가 검출된다. 초기 항-MUC1-C 항체가 검출 가능한 표지에 연결되는 경우, 면역 복합체는 직접 검출될 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제1 항-MUC1-C 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제2 항체를 사용하여 검출될 수 있으며, 제2 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.
사용된 포맷에 관계없이, ELISA는 코팅, 배양 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체의 검출과 같은 특정 특징을 공통으로 갖는다. 이들은 이하에 기재된다.
항원 또는 항체로 플레이트를 코팅하는 데 있어서, 일반적으로 플레이트의 웰을 밤새 또는 지정된 시간 동안 항원 또는 항체의 용액으로 배양할 것이다. 이어서, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거할 것이다. 이어서, 웰의 임의의 나머지 이용 가능한 표면은 시험 항혈청에 대해 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"시킨다. 이들은 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유 용액을 포함한다. 코팅은 고정 표면 상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 허용하고, 따라서 표면 상의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 아마도 더 일반적이다. 따라서, 웰에 단백질 또는 항체를 결합시키고, 배경을 감소시키기 위해 비반응성 물질로 코팅하고, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 고정화 표면은 면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에 시험되는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이어서, 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 제3 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
"면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에"란 상기 조건이 바람직하게는 항원 및/또는 항체를 용액, 예를 들어, BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)/Tween으로 희석하는 단계를 포함한다는 것을 의미한다. 이러한 추가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소를 돕는 경향이 있다.
"적절한" 조건은 또한 배양이 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도에서 또는 시간 동안임을 의미한다. 배양 단계는 전형적으로 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 약 1 내지 2 내지 4시간 정도이거나, 약 4℃ 정도에서 밤새일 수 있다.
ELISA에서 모든 배양 단계에 이어, 접촉된 표면을 세척하여 비복합체화 물질을 제거한다. 바람직한 세척 절차는 용액, 예를 들어, PBS/Tween, 또는 보레이트 완충액으로 세척하는 것을 포함한다. 시험 샘플과 본래 결합된 물질 사이에 특정 면역 복합체의 형성, 및 후속적 세척에 이어서, 심지어 미세한 양의 면역 복합체의 발생이 결정될 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출을 허용하기 위해 관련 표지를 가질 것이다. 바람직하게, 이는 적절한 발색 기질과 배양시 발색을 생성할 효소일 것이다. 따라서, 예를 들어, 제1 및 제2 면역 복합체를 추가의 면역 복합체 형성의 개발에 유리한 시간 동안 및 조건하(PBS 함유 용액, 예를 들어, PBS-Tween에서 실온에서 2시간 동안 배양)에 우레아제, 글로코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 수소 퍼옥시다제 접합 항체와 접촉시키거나 배양하는 것을 목적으로 할 것이다.
표지된 항체와 함께 배양 후, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척에 이어, 표지의 양은, 예를 들어, 발색 기질, 예를 들어, 우레아, 또는 브로모크레졸 퍼플, 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS)), 또는 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우 H2O2와의 배양에 의해 정량화한다. 이어서, 정량화는, 예를 들어, 가시성 스펙트럼 분광 광도계를 사용하여 생성된 색의 정도를 측정함으로써 달성된다.
B.
웨스턴
블롯
웨스턴 블롯 (대안적으로, 단백질 면역블롯)은 조직 균질액 또는 추출물의 주어진 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기술이다. 그것은 겔 전기영동을 사용하여 폴리펩티드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3-D 구조(천연/비변성 조건)에 의해 천연 또는 변성된 단백질을 분리한다. 이어서, 단백질은 막(전형적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 옮겨지며, 여기서 그들은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로빙(검출)된다.
샘플은 전체 조직 또는 세포 배양으로부터 취해질 수 있다. 대부분의 경우, 고형 조직은 먼저 블렌더(더 큰 샘플 용적의 경우). 균질화기(더 작은 용적)를 사용하거나 초음파 처리에 의해 기계적으로 분해시킨다. 세포는 또한 상기 기계적 방법 중 하나에 의해 절단 개방될 수 있다. 그러나, 박테리아, 바이러스 또는 환경적 샘플은 단백질의 공급원일 수 있고, 따라서 웨스턴 블롯팅은 세포 연구에만 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 다양한 세제, 염, 및 완충액은 세포의 용해를 장려하고 단백질을 가용화하기 위해 사용될 수 있다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제는 종종 그 자체의 효소에 의한 샘플의 소화를 방지하기 위해 첨가된다. 조직 제조는 종종 단백질 변성을 피하기 위해 차가운 온도에서 수행된다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리시킨다. 단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하, 또는 이러한 인자의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 분리의 성질은 샘플의 처리 및 겔의 성질에 의존한다. 이는 단백질을 결정하는 매우 유용한 방법이다. 단일 샘플로부터 단백질을 2차원으로 퍼뜨리는 2차원(2-D) 겔을 사용하는 것도 가능하다. 단백질은 1차원에서는 등전점(그들이 중성 순 전하를 갖는 pH)에 따라 및 2차원에서는 분자량에 따라 분리된다.
단백질을 항체 검출에 접근 가능하도록 하기 위해, 그들은 겔 내에서 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 제조된 막으로 이동한다. 막은 겔의 상부에 배치시키고, 그 위에 여과지 더미를 배치시킨다. 전체 더미를 모세관 작용에 의해 용지 위로 이동시키는 완충 용액에 배치하여 단백질을 제공한다. 단백질을 전달하는 또 다른 방법은 전기블롯팅이라고 칭명되며, 전류를 사용하여 단백질을 겔로부터 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막으로 끌어당긴다. 단백질은 겔 내에서 그들이 갖는 조직을 유지하면서 겔 내에서 막으로 이동한다. 이 블롯팅 과정의 결과로서, 단백질은 검출을 위해 얇은 표면층에 노출된다(아래 참조). 두 종류의 막은 이들의 비특이적 단백질 결합 특성을 위해 선택된다(즉, 모든 단백질을 동일하게 결합시킨다). 단백질 결합은 소수성 상호 작용뿐만 아니라 막과 단백질 사이의 하전된 상호 작용에 기초한다. 니트로셀룰로스 막은 PVDF보다 저렴하지만, 훨씬 더 깨지기 쉽고 반복된 프로빙에 잘 견디지 못한다. 겔로부터 막으로의 단백질 전달의 균일성 및 전반적인 효과는 쿠마시 브릴리언트 블루 또는 폰세오 S 염료로 막을 염색하여 확인할 수 있다. 일단 전달되면, 단백질은 표지된 1차 항체, 또는 표지되지 않은 1차 항체를 사용하여 검출된 후, 표지된 단백질 A 또는 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 2차 표지 항체를 사용하여 간접 검출한다.
C. 면역조직화학
항체는 또한 면역조직화학(IHC)에 의한 연구를 위해 제조된 새로 동결된 및/또는 포르말린-고정된, 파라핀-매립 조직 블록 둘 다와 함께 사용될 수 있다. 이들 미립자 시험편으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자의 이전 IHC 연구에서 성공적으로 사용되었고, 당업자에게 익히 공지되어 있다(Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
간략하게, 동결된-절편은 실온에서 50ng의 동결 "분쇄된" 조직을 작은 플라스틱 캡슐 중의 인산염 완충 식염수(PBS)에서 재수화시키고; 입자를 원심분리로 펠릿화하고; 그들을 점성 매립 배지(OCT)에 재현탁시키고; 캡슐을 역전시키고/시키거나 원심분리로 다시 펠릿화하고; -70℃ 이소펜탄에서 스냅 동결시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고/하거나 조직의 동결된 실린더를 제거하고; 조직 실린더를 저온 유지 장치 마이크로톰 척에 고정하고/하거나; 캡슐로부터 25 내지 50개의 직렬 절편을 절단함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 전체 동결 조직 샘플이 직렬 절편 절단에 사용될 수 있다.
영구적 절편은 플라스틱 마이크로퓨즈 튜브에서 50mg의 샘플의 재수화; 펠렛화; 4시간 고정 동안 10% 포르말린에 재현탁; 세척/펠렛화; 따뜻한 2.5% 한천에 재현탁; 펠렛화; 한천을 경화시키기 위해 빙수에서 냉각; 튜브로부터 조직/한천 블록의 제거; 블록을 파라핀에 침윤 및/또는 매립; 및/또는 최대 50개의 직렬 영구 절편의 절단을 포함하는 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다시, 전체 조직 샘플이 치환될 수 있다.
D. 면역검출
키트
추가의 구현예에서, 상기 기재된 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트가 있다. 따라서, 면역검출 키트는 적절한 용기 수단에 MUC1 항원에 결합하는 제1 항체, 및 임의로 면역검출 시약을 포함할 것이다.
특정 구현예에서, MUC1-C 항체는 고체 지지체, 예를 들어, 컬럼 매트릭스 및/또는 미세역가 플레이트의 웰에 사전 결합될 수 있다. 키트의 면역검출 시약은 제공된 항체와 관련되거나 연결된 검출 가능한 표지를 포함한 다양한 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 연관되거나 이에 부착되는 검출 가능한 표지도 또한 고려된다. 예시적인 2차 리간드는 제1 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체이다.
본 키트에 사용하기 위한 추가의 적합한 면역검출 시약은 제2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제3 항체와 함께 제1 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체를 포함하는 2-성분 시약을 포함하며, 상기 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다. 상기 주시된 바와 같이, 다수의 예시적인 표지가 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 모든 표지는 본원에서 논의된 구현예와 함께 사용될 수 있다.
키트는 검출 검정에 대한 표준 곡선을 제조하기 위해 사용될 수 있는 바와 같이, 표지되든 표지되지 않든 MUC1 항원의 적합하게 분취된 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 완전히 접합된 형태, 중간체의 형태, 또는 키트의 사용자에 의해 접합되는 별개의 모이어티로서 항체-표지 접합체를 함유할 수 있다. 키트의 성분은 수성 배지 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 항체가 배치될 수 있거나, 바람직하게는 적합하게 분액화될 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 키트는 또한 항체, 항원, 및 상업적 판매를 위해 밀접한 감금으로 임의의 다른 시약 용기를 함유하는 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 목적하는 바이알이 유지되는 사출 또는 취입-성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
VI.
실시예
하기 실시예는 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 다음 실시예에 개시된 기술이 구현예의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위해 바람직한 양식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 개시된 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 본 개시내용의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 같은 또는 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인식해야 한다.
실시예
1- 방법
서열분석 방법. 총 RNA는 TRIzol® 시약의 기술적 매뉴얼에 따라 하이브리도마 세포로부터 단리시켰다. 이어서, 총 RNA는 PrimeScriptTM 1차 가닥 cDNA 합성 키트의 기술적 매뉴얼에 따라 아이소타입 특이적 안티-센스 프라이머 또는 범용 프라이머를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 중쇄 및 경쇄의 항체 단편은 GenScript의 cDNA 말단의 급격한 증폭(RACE)의 표준 작동 절차(SOP)에 따라 증폭시켰다. 증폭된 항체 단편은 표준 클로닝 벡터에 별도로 클로닝시켰다. 콜로니 PCR을 수행하여 올바른 크기의 삽입물을 갖는 클론을 스크리닝하였다. 컨센서스 서열이 제공되었다.
인간화 물질 및 장비. pTT5 발현 벡터 및 HEK293-6E 세포(GenScript에 의해 제조됨); 37℃ CO2 배양기(Thermo Scientific, 모델. 3951); 생물학적 안전 캐비닛(Thermo Scientific, 모델. 1384); 오르비탈 진탕기(Thermo Scientific, 모델. 416); 폴리에틸렌이민(Polysciences, Cat. No. 23966); FreeStyle 293 배지(lifetechnologies, Cat. No. 12338-018); TN1(Organotechnie, Cat. No. 19553); 125-ml 진탕 플라스크(Corning, Cat. No. 430421); 500-ml 진탕 플라스크(Corning, Cat. No. 421145), 단백질-A 수지(GenScript, Cat. No. L00210); 결합 완충액: 0.15M NaCl, 20mM Na2HPO4, pH 7.0; 용출 완충액: 0.1M 글리신-HCl, pH 3.2; 중화 완충액: 1M 트리스-HCl, pH 9.0; Biacore T200(GE Healthcare); 시리즈 S 센서 칩 CM5(GE Healthcare, Cat. No.: BR-1005-30); HBS-EP: 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Tween 20, pH 7.4; 포획 항체: 항-인간 Fc 감마 특이적 항체(Jackson Immunoresearch Cat. No. 109-005; NHS: H2O 중 100mM N-하이드록시석신이미드; EDC: H2O 중 400mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드; 에탄올아민: 1M 에탄올아민 하이드로클로라이드, NaOH로 pH 8.5로 조정됨; 10mM 나트륨 아세테이트, pH 4.5; 50mM HCl; 코팅 완충액: 0.05M NaHCO3, pH 9.6; 차단 완충액: 5% 탈지유를 갖는 PBS; 테트라메틸벤지딘(TMB, GenScript); 1M HCl(GenScript); HCT116/MUC1 세포주(U0920DE100-A); 샘플: 정제된 항체(300nM으로부터 희석됨, 3*희석, 10 희석); 아이소타입 대조군: 인간 IgG(300nM으로부터 희석됨, 3*희석, 10 희석); 2차 항체: 염소 항 인간 IgG(H+L) iFlor 647(3μg/ml).
CDR 그래프팅에 의한 항체 인간화: 수용체 프레임워크의 선택. 부모 항체의 가변 도메인 서열을 NCBI Ig-Blast를 사용하여 인간 생식계열의 데이터베이스에서 검색하였다. 각 중쇄 및 경쇄에 대한 5개의 다양한 인간 수용체(즉, 부모 항체와 높은 싱동성을 갖는 인간 가변 도메인)가 선택되었다. 인간 수용체의 CDR은 마우스 대응물로 대체하여 인간화 가변 도메인 서열을 초래하였다. 경쇄의 인간화 가변 도메인은 VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5로 명명되었다. 유사하게, 중쇄의 인간화 가변 도메인은 VHl, VH2, VH3, VH4 및 VH5로 명명되었다. 인간화 경쇄의 서열은 부록 I에 제시되어 있다.
키메라 항체의 결합 확인. Ag MUC1-ECD에 결합하는 항체의 친화성은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 바이오센서, Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 결정하였다. 항체는 Fc 포획 방법을 통해 센서 칩에 고정시켰다. 항원 MUC1-ECD를 분석물로서 사용하였다. 해리(kd) 및 회합(ka) 속도 상수의 데이터는 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수득되었다. 겉보기 평형 해리 상수(KD)는 ka에 대한 kd의 비율로부터 계산되었다.
인간화 항체의 작제 및 생산. 인간화 IgG 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 합성하고 pTT5 벡터에 삽입하여 전장 IgG의 발현 플라스미드를 작제하였다. 25개의 인간화 항체를 HEK 293 세포 배양물에서 발현시키고 정제하였다. 결합 확인 및 친화성 순위는 Biacore T200을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 시험하였다.
인간화 항체의 친화성 순위. 항-인간 Fc 감마 특이적 항체를 아민 커플링 방법을 이용하여 센서 칩 상에 고정시켰다. 배양 배지 + 부모 항체로 분비된 25개의 인간화 항체를 주입하고, 개별적으로 Fc(포획 단계)를 통해 항-인간 Fc 항체에 의해 포획하였다. 평형화 후, Ag MUC1-ECD를 200초 동안 주입하고(회합 단계), 이어서 600초 동안 작동 완충액을 주입하였다(해리 단계). 참조 유동 세포(유동 세포 1)의 반응은 각 주기 동안 인간화 항체 유동 세포의 반응으로부터 감산하였다. 표면은 다른 인간화 항체의 주입 전에 재생되었다. 모든 항체가 분석될 때까지 과정을 반복하였다. 인간화 항체의 오프 속도(off-rate)는 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 1:1 상호 작용 모델에 국소적으로 적합화하여 수득하였다. 항체는 해리 속도 상수(오프 속도, kd)에 의해 순위가 매겨졌다. 부모 항체와 유사한 친화성으로 Ag MUC1-ECD와 상호 작용하는 결합제가 선택되었다.
선택된 항체의 생산 및 친화성 측정. 상위 7개의 결합제를 선택하여 HEK293 세포 배양에서 발현시켰다. 배지로 분비된 재조합 IgG는 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제시켰다. MUC1-ECD에 결합하는 정제된 항체의 친화성은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 바이오센서, 비아코어 T200을 사용하여 결정하였다. 항체를 아민 커플링 방법을 통해 센서 칩에 고정화하였다. 항원 MUC1-ECD를 분석물로서 사용하였다. 해리(kd) 및 회합(ka) 속도 상수의 비율은 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수득하였다. 평형 상수(KD)는 kd 또는 ka의 비율로부터 계산하였다.
인간화 항체의 FACS 적정. HCT116/MUC1 세포(MUC1을 발현하도록 조작된 인간 결장암 세포주)에 대한 인간화 항체의 친화성 순위를 위해, 정제된 항체는 FAC 적정을 실시하였다. 간결하게, HCT116/MUC1 세포를 배양하고 원심분리로 수확하였다. 웰 당 약 2.5 x 105개 세포를 PBS로 2회 세척하고, 4℃에서 30분 동안 200㎕의 일련의 항체 희석물에서 배양하였다. PBS로 세척한 후, 2차 항체(3μg의 염소 항-인간 IgG(H+L) I Fluor 647)를 세포에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 FACS Calibur(BD Bioscience, San Jose, CA) 및 Flowjo 소프트웨어를 사용하여 결합(EC50)에 대해 분석하였다.
실시예
2 - 결과
선택된 항체의 생산 및 친화성 측정. 7개의 선택된 인간화 항체를 발현시키고 정제하였다. 통상적인 조건하에 소량의 단백질 침전이 존재한다. SDS-PAGE로부터 평가하면, 인간화 IgG의 순도는 모두 90% 이상이다. 7개의 정제된 IgG의 수율은 표 6에 나열되어 있다.
각 항체의 결합 데이터를 처리하고 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 상호 작용 모델에 적합시켰다. 모든 실험 데이터는 모델에 잘 적합화될 수 있다(도 4). 표 7에 나열된 바와 같이, 7개의 인간화 항체는 부모 키메라 항체에대한 필적할 만한 항원 결합 친화성을 보유한다.
인간화 항체의 FACS 적정. 7개의 항체 각각은 다양한 농도에서 HCT116/MUC1 세포에 대한 이의 결합 능력에 대해 적정되었고, 결과는 표 8에 언급되어 있으며, 도 5에 그래프 표현이 있다.
결론. 이 프로젝트에서 부모 항체는 성공적으로 인간화되었다. 5개의 인간화 중쇄와 5개의 인간화 경쇄를 설계하고, 합성하고 발현 벡터에 삽입하였다. 인간화 항체를 발현시킨 다음, 친화성 순위 시험에 사용하였다. 마지막으로, 키메라 항체에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는 3개의 인간화 항체를 전달을 위해 정제하였다.
[표 6]
[표 7]
[표 8]
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 개시내용의 조성물과 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 기재된 반면, 본 개시내용의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 변형이 상기 조성물 및 방법, 및 본원에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되면서 본원에 기재된 제제로 치환될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 개시내용의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
VII. 참고문헌
하기 참고문헌은 그들이 본원에 제시된 것들에 보충된 예시적인 절차 또는 다른 세부사항을 제공하는 범위까지, 본원에 참조로서 구체적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
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GENUS ONCOLOGY, LLC
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<170> PatentIn version 3.5
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ile Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Phe
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Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
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180 185 190
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr Ser
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 20
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 20
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Gln Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly
65 70 75 80
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Asn Trp Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 21
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 21
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt cgactcccag 60
gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcaga gaagctgtcc 120
tgcaaggctt ctgggcacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca acggtcgtac ttactacaat 240
gagaacttca agaccaaggc cacactgact gtagacaaat attccagctc agcctccatg 300
caactccgca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag tgatggtgac 360
tacgtctcgg gctttgccta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414
<210> 22
<211> 381
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 22
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Ala Thr Cys Cys Ala Thr
20 25 30
Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Ala Thr
35 40 45
Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala
50 55 60
Thr Thr Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Ala Thr Cys
65 70 75 80
Thr Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly
115 120 125
Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr
130 135 140
Gly Thr Gly Gly Gly Thr Ala Cys Thr Thr Ala Thr Gly Thr Ala Thr
145 150 155 160
Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala
165 170 175
Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
180 185 190
Ala Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ala Cys Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Thr Ala
210 215 220
Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Thr
225 230 235 240
Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly
245 250 255
Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr
260 265 270
Cys Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys
275 280 285
Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly
290 295 300
Ala Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Thr Ala Cys
325 330 335
Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr
340 345 350
Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala
355 360 365
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala
370 375 380
<210> 23
<211> 354
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 23
Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr
20 25 30
Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys
35 40 45
Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys Cys Thr
50 55 60
Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr
65 70 75 80
Cys Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Cys Thr Thr Cys
85 90 95
Thr Gly Gly Ala Thr Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala
115 120 125
Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr
130 135 140
Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Gly
145 150 155 160
Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Ala
165 170 175
Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys
180 185 190
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Ala Thr
195 200 205
Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Ala Thr Cys
210 215 220
Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys
225 230 235 240
Ala Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys
245 250 255
Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys
260 265 270
Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr
275 280 285
Gly Thr Ala Ala Gly Ala Thr Ala Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Ala
290 295 300
Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys
325 330 335
Thr Cys Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr
340 345 350
Cys Ala
<210> 24
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 24
gacattgtgc tcacccaatc tccaggttct ttggctgtgt ctctagggca gagtgtcacc 60
atctcctgca gagccagtga aagtgttcaa tattctggca ctagtttaat gcactggtat 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg gtgcatccaa cgtagagact 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaaattggaa ggttccttgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 25
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 25
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Gln Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Asn Trp Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 26
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 26
Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Gln Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Asn Trp Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 27
<211> 411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 27
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgag 60
gtgcagctgg tgcagtccgg agcagaggtg aagaagccag gcgagtctct gaagatcagc 120
tgcaagggct ccggcttcac ctttaactac ttctggatcg agtgggtgcg gcagatgcca 180
ggcaagggcc tggagtggat gggagagatc ctgcctggca ccggctctac aaactacaat 240
gagaagttta agggccaggt gaccatcagc gccgacaaga gcatctccac agcctatctg 300
cagtggagct ccctgaaggc ctctgatacc gccatgtact attgtgccag atacgactat 360
acatctagca tggattattg gggccagggc accctggtga cagtgtcctc t 411
<210> 28
<211> 390
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 28
Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala
1 5 10 15
Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Gly
50 55 60
Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys
65 70 75 80
Ala Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly
100 105 110
Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly
115 120 125
Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly
130 135 140
Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Ala Thr
145 150 155 160
Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala
165 170 175
Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala
180 185 190
Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys
195 200 205
Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys
210 215 220
Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Ala
225 230 235 240
Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala
245 250 255
Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly
260 265 270
Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly
275 280 285
Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly
290 295 300
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys
305 310 315 320
Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Gly
325 330 335
Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys
340 345 350
Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala
355 360 365
Gly Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly
370 375 380
Ala Thr Cys Ala Ala Gly
385 390
<210> 29
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 29
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgac 60
atccagatga cccagtcccc tagctccctg tccgcctctg tgggcgatcg ggtgaccatc 120
acatgcagag ccagcgagtc cgtgcagtac tctggcacaa gcctgatgca ctggtatcag 180
cagaagcccg gcaaggcccc taagctgctg atctacggag catccaacgt ggagacagga 240
gtgccatctc ggttctctgg aagcggatcc ggcacagact tcacctttac aatctctagc 300
ctgcagccag aggatatcgc cacctactat tgtcagcaga attggaaggt gccctggacc 360
tttggccagg gcacaaagct ggagatcaag 390
<210> 30
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 30
atgggctgga gctggatcct gctgttcctc ctgagcgtga cagcaggagt gcacagcgac 60
atccagatga cccagtcccc tagctccctg tccgcctctg tgggcgatcg ggtgaccatc 120
acatgcagag ccagcgagtc cgtgcagtac tctggcacaa gcctgatgca ctggtatcag 180
cagaagcccg gcaaggcccc taagctgctg atctacggag catccaacgt ggagacagga 240
gtgccatctc ggttctctgg aagcggatcc ggcacagact ttaccctgac aatctctagc 300
ctgcagccag aggatttcgc cacctactat tgtcagcaga attggaaggt gccctggacc 360
tttggcggcg gcacaaaggt ggagatcaag 390
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 31
Cys Gln Cys Arg
1
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 32
Cys Gln Cys Arg Arg
1 5
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 33
Cys Gln Cys Arg Arg Arg
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 34
Cys Gln Cys Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 35
Cys Gln Cys Arg Arg Lys
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 36
Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn
1 5
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 37
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn
1 5 10 15
<210> 38
<211> 59
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 38
Ser Val Val Val Gln Ser Thr Leu Val Phe Arg Glu Gly Thr Thr Asn
1 5 10 15
Val His Asp Val Glu Glu Thr Gln Phe Asn Gln Arg Lys Thr Glu Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Ser Val Arg Asp Val
35 40 45
Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Thr Gly Ala Gly
50 55
<210> 39
<211> 58
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 39
Ser Val Val Val Glu Ser Thr Val Val Phe Arg Glu Gly Thr Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Asp Val Lys Ser Gln Leu Ile Gln His Lys Lys Glu Ala Asp
20 25 30
Ser Asp Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Glu Val Lys Val Asn Glu Met Gln
35 40 45
Phe Pro Pro Ser Ala Gln Ser Arg Pro Gly
50 55
Claims (65)
- 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C 세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편으로서, 상기 항체가 각각 서열번호 3, 4 및 5, 또는 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 9, 10 및 11, 또는 12, 13 및 14를 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 각각 서열번호 15, 17, 또는 19와 80% 이상의 상동성(homology)을 갖는 가변 중쇄, 및 서열번호 16, 18, 또는 20/25/26와 80% 이상의 상동성을 갖는 가변 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 각각 서열번호 21, 23, 또는 27과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩(encoding)되는 가변 중쇄, 및 서열번호 22, 24, 또는 28/29/30과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체가 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody) 또는 키메라 항체(chimeric antibody)인, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab 단편인, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체가 MUC1-C/ECD에 대한 특이성, 및 별개의 암 세포 표면 항원을 갖는 재조합 항체인, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체가 뮤린(murine) 항체인, 항체 또는 이의 단편.
- 제7항에 있어서, 상기 뮤린 항체가 IgG인, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 항체가 인간화 항체(humanized antibody)인, 항체 또는 이의 단편.
- 제9항에 있어서, 상기 인간화 항체가 IgG인, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 표지(label)를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
- 제11항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 태그(peptide tag), 효소, 자성 입자(magnetic particle), 발색단, 형광 분자, 화학 발광 분자 또는 염료인, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체가 이에 연결된 항종양 약물(antitumor drug)을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
- 제13항에 있어서, 상기 항종양 약물이 광불안정성 링커(photolabile linker)를 통해 상기 항체 또는 이의 단편에 연결되는, 항체 또는 이의 단편.
- 제13항에 있어서, 상기 항종양 약물이 효소적으로 절단된 링커를 통해 상기 항체 또는 이의 단편에 연결되는, 항체 또는 이의 단편.
- 제13항에 있어서, 상기 항종양 약물이 독소, 방사성 동위원소, 사이토카인 또는 효소인, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열번호 15, 17 또는 19, 및 서열번호 16, 18 또는 20/25/26과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열번호 21, 23 또는 27, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩되는, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 나노입자 또는 리포좀에 접합되는, 항체 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 세포사(cell death)의 유도가 항체-의존 세포 세포독성 또는 보체 매개 세포독성(complement-mediated cytoxocity)을 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
- 대상체의 MUC1-양성 암 세포를 제1항 내지 제20항의 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암 세포가 고형 종양 세포인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 고형 종양 세포는 폐암(lung cancer) 세포, 뇌암(brain cancer) 세포, 두경부암(head & neck cancer) 세포, 유방암(breast cancer) 세포, 피부암(skin cancer) 세포, 간암(liver cancer) 세포(예: 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)), 췌장암(pancreatic cancer) 세포, 위암(stomach cancer) 세포, 결장암(colon cancer) 세포, 직장암(rectal cancer) 세포, 자궁암(uterine cancer) 세포, 자궁경부암(cervical cancer) 세포, 난소암(ovarian cancer) 세포, 고환암(testicular cancer) 세포, 피부암(skin cancer) 세포, 또는 식도암(esophageal cancer) 세포인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암 세포가 백혈병(leukemia) 세포 또는 골수종(myeloma) 세포, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 세포, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 세포 또는 다발성 골수종(multiple myeloma) 세포인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 암 세포가 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 자궁경부암 세포, 또는 에이치. 파일로리(H. pylori)에 의해 유발된 위암 세포인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암 세포를 제2 항암제 또는 치료와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 제2 항암제 또는 치료가 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 독소 요법인, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 제2 항암제 또는 치료가 세포내 MUC1 기능을 억제하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 제2 항암제 또는 치료가 상기 제1 제제와 동시에 제공되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 제2 항암제 또는 치료가 상기 제1 제제 전 및/또는 후에 제공되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암 세포가 전이성 암 세포, 다중 약물 내성 암 세포 또는 재발성 암 세포인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항체가 단일 쇄 항체인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항체가 단일 도메인 항체인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab 단편인, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항체가 MUC1-C/ECD에 대한 특이성을 갖는 재조합 항체, 및 별개의 암 세포 표면 항원인, 방법.
- 대상체 또는 이로부터의 세포 함유 샘플을 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 MUC1-양성 암을 진단하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암이 고형 종양 암인, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 고형 종양 암이 폐암, 뇌암, 두경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 고환암, 피부암 또는 식도암인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암이 백혈병 또는 골수종, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암이 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 간세포 암종 또는 자궁경부암인, 방법.
- 제37항에 있어서, 항암제 또는 치료를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 항암제 또는 치료가 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 호르몬 요법 또는 독소 요법인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암 세포가 전이성 암, 다중 약물 내성 암(multiply drug resistant cancer) 또는 재발성 암인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 세포 함유 샘플이 고형 조직 샘플, 예를 들어, 생검(biopsy)인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 세포 함유 샘플이 유체 샘플, 예를 들어, 소변, 정액, 객담, 타액, 유두 흡인물, 또는 혈액인, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체, 완충제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 제형.
- 제47항에 있어서, 상기 제형이 임의로 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는, 암 백신 제형인, 약제학적 제형.
- 제47항에 있어서, 상기 제형이 면역조직화학 시약 또는 방사선이미징제(radioimaging agent)인, 약제학적 제형.
- 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 제형.
- 융합 단백질(fusion protein)로서,
(i) 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 제1 단일 쇄 항체로서, 상기 항체가 각각 서열번호 3, 4 및 5, 또는 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 9, 10 및 11, 또는 12, 13 및 14를 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 제1 단일 쇄 항체; 및
(ii) T 또는 B 세포에 결합하는 제2 단일 쇄 항체를 포함하는, 융합 단백질. - 제51항에 있어서, 상기 제2 단일 쇄 항체가 CD3, CD16, PD1, PD-L1, CD33, Her-2, EGFR, CTLA-4, OX40, FcγRI(CD64), FcγRIIIa(CD16A), FcαRI(CD89), C163, CD68, CD89 Mab에 결합하는, 융합 단백질.
- 제51항에 있어서, 상기 융합 단백질이 표지 또는 치료적 모이어티(therapeutic moiety)를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
- 제51항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열번호 15, 17 또는 19, 및 서열번호 16, 18 또는 20/25/26과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는, 융합 단백질.
- 제51항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열번호 21, 23 또는 27, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩되는, 융합 단백질.
- 키메라 항원 수용체로서,
(i) 서열번호 1에 의해 정의된 MUC1-C/세포외 도메인(MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 단일 쇄 항체 가변 영역을 포함하는 엑토도메인(ectodomain)으로서, 상기 항체가 상기 단일 쇄 항체 가변 영역의 C-말단에 부착된 가요성 힌지(flexible hinge)와 함께, 각각 서열번호 3, 4 및 5, 또는 6, 7 및 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 서열번호 9, 10 및 11, 또는 12, 13 및 14를 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는, 엑토도메인;
(ii) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및
(iii) 엔도도메인(endodomain)을 포함하고,
상기 엔도도메인이 상기 단일 쇄 항체 가변 영역이 MUC1과 결합될 때 신호 전달 기능을 포함하는, 키메라 항원 수용체. - 제56항에 있어서, 상기 막관통 도메인 및 엔도도메인이 동일한 분자로부터 유래되는, 키메라 항원 수용체.
- 제56항에 있어서, 상기 엔도도메인이 CD3-제타 도메인 또는 고 친화성(high affinity) FcεRI를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
- 제56항에 있어서, 상기 가요성 힌지가 CD8α 또는 Ig로부터 유래되는, 키메라 항원 수용체.
- 제56항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열번호 15, 17 또는 19, 및 서열번호 16, 18 또는 20/25/26과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는, 키메라 항원 수용체.
- 제56항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열번호 21, 23 또는 27, 및 서열번호 22, 24 또는 28/29/30과 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 핵산에 의해 인코딩되는, 키메라 항원 수용체.
- 제56항, 제60항 또는 제61항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포.
- 제62항에 있어서, 상기 막관통 도메인 및 엔도도메인이 동일한 분자로부터 유래되는, 세포.
- 제62항에 있어서, 상기 엔도도메인이 CD3-제타 도메인 또는 고 친화성 FcεRI를 포함하는, 세포.
- 제62항에 있어서, 상기 가요성 힌지가 CD8α 또는 Ig로부터 유래되는, 세포.
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