JP2022527705A - 融合タンパク質およびその使用 - Google Patents
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Abstract
腫瘍および/または自己免疫疾患の治療のための融合タンパク質、その関連免疫複合体、核酸分子、ベクター、組成物、細胞および調製方法を提供する。【選択図】図１
Description
本発明は、バイオメディカル分野に関して、具体的に、多重特異的融合タンパク質に関して、さらに、腫瘍および/あるいは自己免疫疾患の治療における使用に関する。
現在、腫瘍の治療分野には、標的薬物の投与と免疫の治療といった2つの方法がある。この2つの治療方法は、相互作用の可能性があり、細胞毒性をより強く作用させることによって、腫瘍を安定的で永続的に寛解する。しかし、標的薬物と免疫治療の間の相互作用は、非常に複雑であり、併用療法は、種類、用量、順番、剤形などのいろんな要因によって、全体の抗腫瘍効果や毒性特性が影響される。
プログラム細胞死タンパク質1（programmed death 1, PD-1）抗体は、免疫療法の一つである。PD-1は、活性化T細胞、B細胞およびミエロイド系細胞に発現しており、プログラム細胞死リガンド-1（programmed death ligand 1, PD-L1）およびPD-L2の2つのリガンドが存在する。PD-1および/またはPD-L1阻害薬は、腫瘍細胞上のPD-L1に特異的に結合することによって抗腫瘍効果を発揮することができるが、その臨床的有用性が低く、さらに、例えば、肺炎、大腸炎、肝炎などを引き起こすいくつかの副作用をもたらす。
CD47タンパク質は、膜貫通型糖タンパク質であって、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーに属し、正常組織細胞によるCD47の発現に以外、CD47が多くの腫瘍細胞によって過剰に発現される。腫瘍細胞表面のCD47は、マクロファージ表面のSIRPαに結合することによって腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食を阻止し、これは、腫瘍細胞が生体免疫監視から逃避するメカニズムであると見なされる。CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を遮断することによって、腫瘍成長を抑制することができる。
しかし、従来のCD47タンパク質とSIRPαの相互作用を遮断するための試薬は、認識活性に限界があり、CD47タンパク質との親和性が不十分なものが多く、腫瘍抑制能が制限されている。同時に、従来の標的CD47という抗体類医薬品には、貧血反応または血小板減少をきたす副作用がある。そして、CD47タンパク質と腫瘍関連抗原への同時特異性標的指向の有効治療方法を得るよう望んでいる。
本発明は、PD-L1に特異的に結合する第1結合ドメインと、CD47タンパク質に特異的に結合する第2結合ドメインを持つ融合タンパク質を提供する。本発明は、該融合タンパク質を含む免疫複合体、該融合タンパク質をコード化する核酸分子、該融合タンパク質を含むおよび/または発現することができるベクター、組成物ならびに細胞、および上記の融合タンパク質の調製方法をさらに提供する。本発明の融合タンパク質、免疫複合体、核酸分子、ベクター、組成物および細胞は、1）CD47タンパク質とPD-L1に同時に特異的に結合することができ、2）CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を特異的に遮断することができ、3）PD-1とPD-L1の相互作用を特異的に遮断することができ、4）腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を効果的に抑制することができるという特性を１種または複数種備える。
一方、本発明は、PD-L1に特異的に結合する第1結合ドメインと、SEQ ID NO:29で表される配列に比べて、33位～149位における1つまたは複数の位置にアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含むヒトSIRPα変異体1の突然変異体を含むCD47タンパク質に特異的に結合する第2結合ドメインを持つ融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、上記の突然変異体は、R22、I29、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109およびV132からなる群から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸残基にアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態において、上記の突然変異体は、（1）I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100およびV132、（2）I61、E77、Q82、K83およびE84、（3）I61、V63、K83、E84およびV132、（4）I61、E77、E84、R107およびV132、（5）I61、V63、E77、K83、E84およびN100、（6）I61、E77、Q82、K83、E84およびR107、（7）I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109およびV132、（8）I61、E77、Q82、K83、E84およびV132、（9）I61、（10）I61、D95、L96、G109およびV132、（11）I61、D95、L96、K98、G109およびV132、（12）I61、E77、E84、V93、R107およびV132、（13）E77、L96、N100、G109およびV132、（14）I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100およびV132、（15）I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100およびV132、（16）I61、E77、Q82、K83、E84およびV93、（17）I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98およびN100、（18）I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100およびG109、（19）I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98およびN100、ならびに、（20）I61、V63、E77、Q82およびE84からなる群から選ばれるアミノ酸残基にアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態において、上記の突然変異体は、R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sからなる群から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態において、上記の突然変異体は、（1）I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100GおよびV132L、（2）I61V、E77N、Q82S、K83RおよびE84H、（3）I61F、V63I、K83R、E84KおよびV132I、（4）I61L、E77Q、E84D、R107NおよびV132I、（5）I61L、V63I、E77K、K83R、E84DおよびN100G、（6）I61V、E77H、Q82R、K83R、E84HおよびR107S、（7）I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109RおよびV132R、（8）I61L、E77M、Q82G、K83R、E84DおよびV132L、（9）I61L、（10）I61F、D95H、L96S、G109HおよびV132S、（11）I61F、D95H、L96S、K98R、G109HおよびV132S、（12）I61L、E77Q、E84D、V93A、R107NおよびV132I、（13）E77K、L96S、N100K、G109HおよびV132L、（14）I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100DおよびV132I、（15）I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100DおよびV132L、（16）I61V、E77N、Q82S、K83R、E84HおよびV93A、（17）I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98RおよびN100E、（18）I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100DおよびG109R、（19）I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98RおよびN100G、ならびに、（20）I61L、V63I、E77N、Q82GおよびE84Gからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態において、上記の突然変異体は、SEQ ID NO:30-49のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記の第1結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態において、上記の抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト化抗体からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態において、上記の抗原結合断片は、Fab、Fab’、F（ab'）2、F（ab）2、dAb、散在している相補性決定領域CDR、FvおよびscFvからなる群から選ばれる。
いくつかの実施形態において、上記のPD-L1は、ヒトPD-L1である。
いくつかの実施形態において、上記の抗体は、SEQ ID NO:4、およびSEQ ID NO:18からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するHCDR1-3を含有する抗体重鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、上記のHCDR2は、SEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：19からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、上記のHCDR3は、SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：20からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO：8およびSEQ ID NO：22からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域VHを含む。いくつかの実施形態において、上記の抗体重鎖またはその断片は、IgGを有する重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、上記のIgGは、IgG1およびIgG4からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態において、上記の抗体重鎖は、SEQ ID NO：13およびSEQ ID NO：27からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記の抗体は、SEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：15からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するLCDR1-3を含有する抗体軽鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、上記のLCDR2は、SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：16からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、上記のLCDR3は、SEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：17からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、上記の抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO：21からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域VLを含む。いくつかの実施形態において、上記の抗体軽鎖またはその断片は、Igκを有する軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、上記の抗体軽鎖は、SEQ ID NO：11およびSEQ ID NO：25からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記の第1結合ドメインは、上記の第2結合ドメインのN末端に位置する。いくつかの実施形態において、上記の融合タンパク質は、さらに、上記の第1結合ドメインのC末端かつ上記の第2結合ドメインのN末端にあるリンカーを有する。いくつかの実施形態において、上記のリンカーは、SEQ ID NO：52で表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記の融合タンパク質は、少なくとも2つの上記の第2結合ドメインを持つ。いくつかの実施形態において、各上記の第2結合ドメインは、それぞれ上記の第1結合ドメインのC末端に位置する。
また、本発明は、上記の融合タンパク質を含む免疫複合体を提供する。
また、本発明は、上記の融合タンパク質または上記の免疫複合体をコード化する1つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。
また、本発明は、上記の核酸分子を含む1つまたは複数のベクターを提供する。
また、本発明は、上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、または上記の核酸分子、および任意選択で薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物を提供する。
また、本発明は、上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、または上記のベクターを含む細胞を提供する。
また、本発明は、上記の融合タンパク質を発現可能な条件で上記の細胞を培養することを含む上記の融合タンパク質の調製方法を提供する。
また、本発明は、腫瘍の治療のための医薬品の調製における上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞の使用を提供する。
いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、固形腫瘍および非固形腫瘍を含む。
いくつかの実施形態において、上記の固形腫瘍および非固形腫瘍は、多発性骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、神経膠腫、胚細胞腫瘍、肉腫、中皮腫、胎盤腫、脳癌、骨癌、皮膚がん、鼻咽頭癌、肺癌、口腔がん、食道がん、胃癌、肝臓がん、膵臓癌、前立腺がん、腸癌、乳がん、子宮頚部癌、卵巣癌および精巣癌、上顎洞癌、下咽頭がん、嗅神経芽細胞腫、舌癌、歯肉癌、膨大部癌、結腸がん、結直腸癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱がん、陰茎癌、卵管癌、眼瞼癌、網膜芽細胞腫を含む。
また、本発明は、腫瘍を治療するための上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を提供する。
また、本発明は、必要のある被験者に、有効量の上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を投与することを含むPD-L1タンパク質とPD-1の相互作用を遮断する方法を提供する。
また、本発明は、必要のある被験者に、有効量の上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を投与することを含むCD47タンパク質とSIRPαの相互作用を遮断する方法を提供する。
また、本発明は、必要のある被験者に、有効量の上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を投与することを含む腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害する方法を提供する。
また、本発明は、必要のある被験者に、有効量の上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を投与することを含む被験者における腫瘍を予防または治療する方法を提供する。
また、本発明は、被験者における腫瘍を予防または治療する上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を提供する。
当該技術分野における当業者は、以降の詳細な記載からの本開示のその他の側面や利点の把握が容易であろう。以下の詳細な記載では、本開示の例示的実施形態しか表現して記載していない。当該技術分野における当業者にとって、本開示の詳細によって、本発明に係る趣旨や範囲を逸脱しない限り、公開されている具体的な実施形態を変更してもよい。それに応じて、本発明において、図面や明細書の記載があくまでも例であり、本発明を限定するものではない。
本発明に係る具体的な特徴は、添付の請求項のように示されたものである。本発明に係る特徴やメリットは、以下詳しく記載されている例示的実施形態や図面を参照することによって、より確実的に把握されるだろう。図面に関しては、以下のように概略的に説明する。
図1は、本発明に記載の融合タンパク質の構造例を示す。
図2～3は、本発明に記載の融合タンパク質とPD-L1の結合能を示す。
図4は、本発明に記載の融合タンパク質とCD47の結合能を示す。
図5は、本発明に記載の融合タンパク質とPD-L1およびCD47の同時結合能を示す。
図6は、本発明に記載の融合タンパク質がCD47とそのリガンドSIRPαの結合を競合的に遮断することを示す。
図7～8は、本発明に記載の融合タンパク質がPD-1とPD-L1の結合を競合的に遮断することを示す。
図9～10は、本発明に記載の融合タンパク質を用いてマウス-ヒトリンパ腫の腫瘍モデルに腫瘍体積の増大を抑制することを示す。
図2～3は、本発明に記載の融合タンパク質とPD-L1の結合能を示す。
図4は、本発明に記載の融合タンパク質とCD47の結合能を示す。
図5は、本発明に記載の融合タンパク質とPD-L1およびCD47の同時結合能を示す。
図6は、本発明に記載の融合タンパク質がCD47とそのリガンドSIRPαの結合を競合的に遮断することを示す。
図7～8は、本発明に記載の融合タンパク質がPD-1とPD-L1の結合を競合的に遮断することを示す。
図9～10は、本発明に記載の融合タンパク質を用いてマウス-ヒトリンパ腫の腫瘍モデルに腫瘍体積の増大を抑制することを示す。
以下、本願発明の実施形態を、所定の具体的な実施例によって説明するが、当業者が、本明細書に公開された内容により、本願発明のその他のメリットや効果を容易に把握することができる。
本発明において、「融合タンパク質」という用語は、通常、2つまたはより多くのタンパク質またはポリペプチドにより融合されたタンパク質を指す。融合タンパク質は、組換えDNA技術により人工的に調製されることができる。例えば、上記の2つまたはより多くのタンパク質もしくはポリペプチドをコード化する遺伝子または核酸分子は、互いに連結されることによって、上記の融合タンパク質をコード化する融合遺伝子または融合される核酸分子を形成することができる。上記の融合遺伝子の翻訳によって、融合される前の上記の2つまたはより多くのタンパク質もしくはポリペプチドのうちの少なくとも1つ、ひいては1つごとの特性をもつ単一ポリペプチドを産生する。
本発明において、「特異的結合」という用語は、通常、抗体と該抗体を産生する抗原間の反応のような両分子間の非ランダム化の結合反応を指す。いくらかの抗原特異性抗体は、親和性の（KD）≦10-5 M（例えば、10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 Mなど）で該抗原に結合するものを指し、ここで、KDとは解離定数と結合定数の比の値（koff/kon）であって、当該技術分野における当業者に周知の手段で測定されることができる。
本発明において、「結合ドメイン」という用語は、通常、標的（例えば抗原）上の特定のエピトープに対して特異的に結合および/または認識することができるドメインを指す。本発明において、「ドメイン」という用語は、通常、タンパク質サブユニット構造におけるはっきり離れている密接な球形構造領域を指す。例えば、ポリペプチド鎖は、まず、いくつかの領域における隣接するアミノ酸残基に規則的な二次構造が形成されてよく、そして、さらに、隣接する二次構造断片を一緒に組み込むことにより超二次構造を形成し、この上で、球形に近い三次構造に折り畳まれてもよい。ポリペプチド鎖は、大きいタンパク質分子やサブユニットに対して、空間的にはっきり区別される相対的に独立したドメインとも呼ばれる領域性構造が2つまたは複数会合することによって三次構造になり得ることが多い。
本発明において、「第1結合ドメイン」および「第2結合ドメイン」に記載の「第1」、「第2」という用語は、ただ記述上で区別されているに過ぎない。
本発明において、「CD47タンパク質」という用語は、通常、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する複数回膜貫通型の受容体であるインテグリン関連タンパク質（IAP）を指す。例えば、CD47タンパク質は、膜インテグリン（membrane integrins）に結合してよく、その配位子のトロンボスポンジンタンパク質-1（thrombospondin-1, TSP-1）やシグナル調節タンパク質α（signal-regulatory protein alpha, SIRPα）に結合してよい。CD47タンパク質は、細胞膜表面に幅広く発現する。本発明において、上記のCD47タンパク質は、ヒトCD47の任意の変異体、アイソフォームおよび種ホモログを含む。ヒトCD47タンパク質のアミノ酸配列は、GenBankにCEJ95640.1として挙げられる。上記のCD47タンパク質は、細胞により自然に発現するか、またはCD47遺伝子によりトランスフェクトされた細胞上に発現する。
本発明において、「SIRPα」という用語は、通常、CD47タンパク質の配位子でありうるSIRPファミリー由来の調節性膜糖タンパク質を指す。本発明において、上記のSIRPαは、ヒトSIRPαを含んでよい。例えば、SIRPα変異体1およびSIRPα変異体2を含んでよい。上記のSIRPα変異体2は、13個のアミノ酸が上記のSIRPα変異体1とは異なり、そのアミノ酸配列がGenBankにCAA71403.1として挙げられる。本発明において、「SIRPα変異体1」という用語は、通常、アミノ酸配列がNCBI RefSeq NP_542970.1として挙げられる（残基31-504が成熟型を構成する）SIRPαタンパク質を指し、この時、SIRPα変異体1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:29で表される。
「抗体」という用語は、通常、基本的に免疫グロブリン遺伝子や免疫グロブリン遺伝子断片によってコードされるポリペプチドを1つまたは複数含むタンパク質を指す。例えば、免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εとμ定常領域遺伝子、および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含んでよい。例えば、軽鎖は、κやλに区分され、それぞれIgκとIgλといった免疫グロブリンタイプを定義することができる。重鎖は、γ、μ、α、δやεに区分され、それぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEといった免疫グロブリンタイプを順次に定義することができる。例えば、抗体は、それぞれが1対ごとに1本の「軽」鎖（約25 kD）と1本の「重鎖」（約50-70 kD）を有する2対の同一ポリペプチド鎖より構成される四量体を含む構造ユニットを有してよく、各メンバーのN末端が、約100～110個またはより多くのアミノ酸の可変領域を規定することによって、主に抗原認識を担う。例えば、「軽鎖可変領域（VL）」および「重鎖可変領域（VH）」という用語は、通常、それぞれ軽鎖および重鎖の可変領域を指す。抗体は、完全免疫グロブリンとして存在するか、または、各種のペプチダーゼによる消化や新規発現によって多くの十分な特徴づけの断片として存在してよい。
本発明において、「抗原結合断片」という用語は、通常、基本的に抗体の結合した同一抗原（例えば、PD-L1）に結合する能力を保持しており抗原への特異的結合を完全長抗体と競合可能な完全長抗体の1つまたは複数の部分を指す。通常、Fundamental Immunology, Ch. 7 （Paul, W., ed., 第2版、Raven Press, N.Y. （1989）を参照して、その内容全体が引用により本願に取り込まれる。抗原結合断片は、組換えDNA技術、または完全抗体の酵素作用または化学開裂により産生されることができる。いくつかの場合において、抗原結合断片は、Fab、Fab'、F（ab'）2、（Fab）2、Fd、Fv、dAbや相補性決定領域（CDR）断片、一本鎖抗体（例えば、scFv）、キメラ抗体、ダイアボディ（diabody）およびこのようなポリペプチドを含み、ポリペプチド特異性抗原の結合能を十分に与える抗体の少なくとも一部を含む。当該技術分野における当業者に周知の従来技術（例えば、組換えDNA技術、酵素作用または化学開裂法）を用いて、所定の抗体から、抗体の抗原結合断片を得ると共に、完全抗体と同一の態様で抗体の抗原結合断片を特異的にスクリーニングすることができる。例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中ジスルフィド結合以下の抗体を消化し、F（ab'）2を製造することができる。
本発明において、「Fab」という用語は、通常、VL、VH、CLとCH1ドメインからなる抗体断片を指す。
本発明において、「Fab'」という用語は、通常、Fab断片に比べて、CH1ドメインのカルボキシ末端にいくつかの余分な残基を含む抗体断片を指す。例えば、Fab'は、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含んでよい。
本発明において、「F（ab）2」という用語は、通常、システインにより連結されるペアになっているFab断片から得られる抗原結合断片を指す。
本発明において、「dAb断片」という用語は、通常、VHドメインからなる抗体断片（Wardら, Nature 341:544-546 （1989））を指す。
本発明において、「相補性決定領域CDR」という用語は、通常、軽鎖可変領域（VL）と重鎖可変領域（VH）の3つの高頻度可変領域（HVR）を指し、該部位が、空間構造上、抗原決定基とと共に厳密な相補を形成しているため、高頻度可変領域が相補的決定領域とも呼ばれる。
本発明において、「Fv断片」という用語は、通常、抗体の単一アームのVLとVHドメインからなる抗体断片を指す。
本発明において、「scFv」という用語は、通常、抗体重鎖可変領域と軽鎖可変領域が短ペプチドリンカー（linker）により連結されている分子を意味し、一本鎖抗体とも呼ばれる。
本発明において、「モノクローナル抗体」という用語は、通常、微量存在するかもしれない起こりうる天然突然変異を除いて同一である各抗体より構成される基本的に相同抗体である1群の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に直接に対応する。なお、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含んでいる従来のポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対応する。「モノクローナル」という修飾語は、いかなる特定の方法による抗体の生産を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、上記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法で調製されるか、又は、組換えDNA法で細菌、真核動物や植物細胞中で産生されることができるし、例えば、ファージ抗体ライブラリーから、Clackson etal. , Nature, 352:624-628（1991）およびMarks et al., Mol.Biol.、222:581-597（1991）に記載の技術を使用して得られてもよい。
本発明において、「キメラ抗体」という用語は、通常、各重鎖又は軽鎖アミノ酸配列の一部が、特定の種由来の抗体中で対応するアミノ酸配列と相同か、あるいは特定のクラスに属する一方で、その鎖の残りの部分が他の種由来の対応する配列と相同である抗体を意味する。例えば、軽鎖および重鎖は、可変領域がともに1つの動物種（例えば、マウス、ラット等）の抗体の可変領域に由来し、定常部分が別の種（例えばヒト）に由来する抗体の配列と相同である。例えば、キメラ抗体を得るために、非ヒトB細胞又はハイブリドーマ細胞により、可変領域を産生することができ、また、組み合わせた定常領域がヒト由来である。上記可変領域は、調製容易なメリットを有しており、その特異性は、組み合わせた定常領域由来による影響がない。同時に、キメラ抗体は、定常領域がヒト由来でありうるため、注射の場合、キメラ抗体は、定常領域が非ヒト由来である抗体よりも、免疫応答を引き起こす可能性が低い。
本発明において、「ヒト化抗体」という用語は、通常、非ヒト生物種（例えばマウスまたはラット）由来の抗体、免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドのヒトへの免疫原性を低下させると同時に、オリジナル抗体の抗原結合特性を保持する改変抗体を指す。例えば、遺伝子工学技術を利用してヒト化抗体を調製することができ、CDR移植（Jones et al., Nature 321:522 （1986））およびその変異体と、「再構成」（reshaping）、（Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271）、「超キメラ化」（hyperchimerization）、（Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154）および「ベニヤリング」（veneering）、（Mark, et al., “Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.”In: Metcalf B W, Dalton B J, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312）からなる技術とを使用し、非ヒト由来の結合ドメインをヒト化することができる。その他の領域、例えばヒンジ領域および定常領域ドメインも非ヒト由来であれば、それらの領域をヒト化することもできる。
本発明において、「完全ヒト化抗体」という用語は、通常、遺伝子工学的な改変された抗体遺伝子欠失動物にヒト抗体をコード化する遺伝子を発現することにより得られる抗体を指す。例えば、ヒト抗体遺伝子は、遺伝子組み換えまたは染色体転移技術、ヒト抗体をコード化する遺伝子を全部遺伝子工学的な改変された抗体遺伝子欠失動物に導入し、動物にヒト抗体を発現させる。
本発明に係るタンパク質、ポリペプチドおよび/またはアミノ酸配列は、さらに、少なくとも該上記のタンパク質またはポリペプチドと相同または同様の機能を持つ変異体または相同体などの範囲を含むと理解されたい。
本発明において、上記の変異体は、上記のタンパク質および/または上記のポリペプチド（例えば、PD-L1タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片）のアミノ酸配列中で1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失または付加されたタンパク質またはポリペプチドであってよい。例えば、上記の機能性変異体は、少なくとも1つ、例えば1～30つ、1～20つまたは1～10つ、又、例えば1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸が置換、欠失および/または挿入されることによってアミノ酸変化を有するタンパク質またはポリペプチドを含みうる。上記の機能性変異体は、基本的に変化（例えば置換、欠失または付加）した前の上記のタンパク質または上記のポリペプチドの生物学的特性を保持することができる。例えば、上記の機能性変異体は、変化した前の上記のタンパク質または上記のポリペプチドの少なくとも60%、70%、80%、90%、または100%の生物学的活性（例えば抗原の結合能）を保持することができる。例えば、上記の置換は、保存的置換であってよい。
本発明において、上記の相同体は、上記のタンパク質および/または上記のポリペプチド（例えば、PD-L1タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片）のアミノ酸配列と少なくとも約85%（例えば、少なくとも約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはより高い）の配列相同性を持つタンパク質またはポリペプチドであってよい。
本発明において、上記相同性とは、通常、2個または複数の配列間の相似性、類似性または相関性を指す。「配列相同性パーセント」は、2本の整列しようとする配列を比較ウインドウにわたって比較することにより、2本の配列において同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）或いは同一のアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet）が存在する位置の数を勘定して、マッチする位置の数を算出し、マッチする位置の数を比較ウインドウにおける位置総数（即ち、ウインドウの大きさ）で除算し、その結果に100を乗算して、配列相同性パーセントを得る。配列相同性パーセントを特定するための整列は、当該技術分野における周知の様々な手段、例えば、公開されているコンピュータソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNやMegalign（DNASTAR）ソフトウェアに従って実現される。当該技術分野における当業者は、比較している全長配列範囲や、対象配列領域における最大整列を達成するに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列整列のための適切なパラメータを決定可能である。上記相同性は、FASTAおよびBLASTアルゴリズムで測定することもできる。FASTAアルゴリズムは、W.R.PearsonおよびD.J.Lipmanの“生物学的配列比較のために改善されたツール”、米国科学アカデミー紀要（Proc.Natl.Acad.Sci.）、85：2444-2448、1988、およびD.J.LipmanおよびW.R.Pearsonの“タンパク質相似性の高速高感度な検索”、Science、227：1435-1441、1989に記載されている。BLASTアルゴリズムは、S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.MyersおよびD.Lipmanの“基本的な局所的整列（alignment）検索ツール”、分子生物学誌、215：403-410、1990に記載されている。
本発明において、「PD-L1」という用語は、通常、プログラム細胞死タンパク質-1（programmed death-1, PD-1）タンパク質のリガンドを指し、CD274、B7-HまたはB7H1とも呼ばれる。PD-1は、特異的リガンド（PD-L）の相互作用で、T細胞抗原受容体シグナル伝達を負に制御する。上記のPD-L1は、いろんな腫瘍の予後指標としてよい。本発明において、上記のPD-L1はヒトPD-L1であってよい。上記のヒトPD-L1は、GenBankにおけるGeneIDが29126である。
本発明において、「PD-1」という用語は、通常、シヌクレインファミリーのメンバーを指し、NACP、PARK1またはPARK4とも呼ばれる。本発明において、上記のPD1は、ヒトPD1であってよい。上記のヒトPD1は、GenBankにおけるGeneIDが6622である。
一般的には、ポリペプチド鎖において、アミノ基が、1つの鎖になるように、ポリペプチド鎖中のもう１個のカルボキシ基に連結することができるが、タンパク質の2個の末端において、それぞれ遊離アミノ基を保有するポリペプチド鎖末端とカルボキシを保有するポリペプチド鎖末端であってそれぞれペプチド結合になっていないアミノ酸残基が残している。本発明において、「N末端」という用語は、通常、アミノ酸残基が遊離アミノ基を保有するポリペプチド鎖の末端を指す。本発明において、「C末端」という用語は、通常、アミノ酸残基が遊離カルボキシを保有するポリペプチド鎖の末端を指す。
本発明において、「核酸分子」という用語は、通常、その天然環境から単離され、または人工合成された任意長さの単離形態であるヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、あるいはリボヌクレオチドまたはそのアナログを指す。
本発明において、「免疫複合体」という用語は、通常、1つまたは複数の異種分子（細胞毒素を含むが限定されない）が複合しており免疫機能を持つポリペプチド分子を指す。本発明において、「複合」、「連結」、「融合」は、本発明において置換可能に使用され、かつ、通常、例えば化学複合や組換えを含む手段によって、2つまたはより多くの化学元素、配列または成分を連結することを指す。上記の異種分子は、細胞毒素、化学療法薬などであってよい。例えば、本発明に記載の融合タンパク質を1つまたは複数の異種分子（例えば、細胞毒素）に複合することにより、上記の免疫複合体を得ることができる。
本発明において、「ベクター」という用語は、あるタンパク質をコード化するポリヌクレオチドが挿入され、タンパク質発現を得る核酸ビヒクルを指す。ベクターは、宿主細胞を転換、伝達またはトランスフェクトすることによって、ベクターが保有する遺伝物質要素を宿主細胞内で発現させることができる。例として、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（YAC）のような人工染色体、細菌人工染色体（BAC）またはP1由来人工染色体（PAC）、λファージまたはM13ファージなどのようなファージ、および動物ウイルスなどを含む。ベクターとして用いられる動物ウイルスの種類は、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（SV40など）が挙げられる。ベクターは、1種類として、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含んで、発現を制御する様々な要素を含み得る。加えて、ベクターは、複製開始部位を含んでいてもよい。ベクターは、ビリオン、リポソームまたはタンパク膜のような細胞への進出を支援する成分をさらに含みうるが、これらに限定されない。
本発明において、「腫瘍」という用語は、通常、哺乳類動物中の生体（例えば、細胞またはその組成）において、各種の発癌因子作用下で、局所の組織細胞の増殖により形成される新生物を指す。本発明において、腫瘍は、固形腫瘍と非固形腫瘍を含んでよい。固形腫瘍は、神経膠腫、胚細胞腫瘍、肉腫、中皮腫、胎盤腫、脳癌、骨癌、皮膚がん、鼻咽頭癌、肺癌、口腔がん、食道がん、胃癌、肝臓がん、膵臓癌、前立腺がん、腸癌、乳がん、子宮頚部癌、卵巣癌および精巣癌を含み得る。本発明において、非固形腫瘍は、多発性骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫を含み得る。
本発明において、「含む」という用語は、通常、明確に特定された特徴を意味するが、他の要素を除外するものではない。
本発明において、「約」という用語は、通常、指定された数から0.5%～10%以上または以下の範囲、例えば指定された数から0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%以上または以下の範囲に変動するものを指す。
融合タンパク質
一方、本発明は、第1結合ドメインと第2結合ドメインを含み得る融合タンパク質を提供する。上記の第1結合ドメインは、PD-L1に特異的に結合し、上記の第2結合ドメインは、CD47タンパク質に特異的に結合し、SEQ ID NO:29で表される配列に比べて、33位～149位における1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）の位置にアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含むヒトSIRPα変異体1の突然変異体を含む。本発明に記載の融合タンパク質は、腫瘍関連抗原とCD47タンパク質に同時に特異的に結合することによって、腫瘍および/あるいは自己免疫疾患の治療に機能する。
一方、本発明は、第1結合ドメインと第2結合ドメインを含み得る融合タンパク質を提供する。上記の第1結合ドメインは、PD-L1に特異的に結合し、上記の第2結合ドメインは、CD47タンパク質に特異的に結合し、SEQ ID NO:29で表される配列に比べて、33位～149位における1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）の位置にアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含むヒトSIRPα変異体1の突然変異体を含む。本発明に記載の融合タンパク質は、腫瘍関連抗原とCD47タンパク質に同時に特異的に結合することによって、腫瘍および/あるいは自己免疫疾患の治療に機能する。
本発明において、「第1結合ドメイン」という用語は、通常、PD-L1に特異的に結合することができるドメインを指す。「第2結合ドメイン」という用語は、通常、CD47タンパク質に特異的に結合することができるドメインを指す。
CD47に特異的に結合する第2結合ドメイン
本発明において、上記の突然変異体（例えば、CD47タンパク質に特異的に結合するヒトSIRPα変異体1の突然変異体）は、R22、I29、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109およびV132からなる群から選ばれる1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）のアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む。
本発明において、上記の突然変異体（例えば、CD47タンパク質に特異的に結合するヒトSIRPα変異体1の突然変異体）は、R22、I29、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109およびV132からなる群から選ばれる1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）のアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む。
本発明において、上記のアミノ酸置換におけるアミノ酸残基の位置は、SEQ ID NO: 29で表されるアミノ酸配列を基準として特定される残基番号である。
本発明において、「アミノ酸置換Xn」は、SEQ ID NO: 29で表されるアミノ酸配列中でn位に相当する残基Xにアミノ酸置換が起こり、ここで、nが正整数であり、Xが任意のアミノ酸残基の略語である。例えば、「アミノ酸置換I61」は、SEQ ID NO:29で表されるアミノ酸配列中で61位に相当する残基Iにアミノ酸置換が起こることを意味する。
本発明において、上記のアミノ酸置換は、非保存的置換であってよい。上記の非保存的置換は、非保存的に標的タンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸残基を変え、例えば、ある種類の側鎖大きさまたはある種類の特性（例えば、親水性）を有するアミノ酸残基を異なる側鎖大きさまたは異なる特性（例えば、疎水性）を有するアミノ酸残基に変えることを含んでよい。
本発明において、上記のアミノ酸置換は、保存的置換であってもよい。上記の保存的置換は、保存的に標的タンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸残基を変え、例えば、ある種類の側鎖大きさまたはある種類の特性（例えば、親水性）を有するアミノ酸残基を同一または同様の側鎖大きさまたは同一または同様の特性（例えば、同じく親水性）を有するアミノ酸残基に変えることを含んでよい。このような保存的置換は、通常、産生されたタンパク質の構造または機能に大きく影響することがない。本発明において、上記の融合タンパク質やその断片のアミノ酸配列変異体は、タンパク質構造またはその機能（例えば、CD47とCD47タンパク質に特異的に結合するヒトSIRPα変異体1の突然変異体を遮断する）を明らかに変化させない保存的アミノ酸置換を含んでよい。
例として、下記の各群において、1群ごとの各アミノ酸間の相互置換が本発明中で保存的置換と見られ、非極性側鎖を含むアミノ酸群：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン。非帯電した極性側鎖を含むアミノ酸群：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン。負帯電した極性側鎖を含むアミノ酸群：アスパラギン酸およびグルタミン酸。正帯電した塩基性アミノ酸：リシン、アルギニンおよびヒスタジン。フェニル基を持つアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
本発明において、上記の突然変異体は、（1）I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100およびV132、（2）I61、E77、Q82、K83およびE84、（3）I61、V63、K83、E84およびV132、（4）I61、E77、E84、R107およびV132、（5）I61、V63、E77、K83、E84およびN100、（6）I61、E77、Q82、K83、E84およびR107、（7）I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109およびV132、（8）I61、E77、Q82、K83、E84およびV132、（9）I61、（10）I61、D95、L96、G109およびV132、（11）I61、D95、L96、K98、G109およびV132、（12）I61、E77、E84、V93、R107およびV132、（13）E77、L96、N100、G109およびV132、（14）I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100およびV132、（15）I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100およびV132、（16）I61、E77、Q82、K83、E84およびV93、（17）I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98およびN100、（18）I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100およびG109、（19）I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98およびN100、ならびに、（20）I61、V63、E77、Q82およびE84からなる群から選ばれるアミノ酸残基にアミノ酸置換を有してよい。
本発明において、上記の突然変異体は、R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sからなる群から選ばれる1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）のアミノ酸置換を有してよい。
本発明において、アミノ酸置換「XnY/Z」は、SEQ ID NO: 29で表されるアミノ酸配列中でn位に相当する残基Xがアミノ酸残基Yまたはアミノ酸残基Zに置換され、ここで、nが正整数であり、X、YおよびZがそれぞれ独立的に任意のアミノ酸残基の略語であり、かつ、XがYまたはZと異なることを指す。例えば、アミノ酸置換「I61L/V/F」は、SEQ ID NO:29で表されるアミノ酸配列中で61位に相当する残基Iがアミノ酸残基L、VまたはFに置換されることを指す。
本発明において、上記の突然変異体は、（1）I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100GおよびV132L、（2）I61V、E77N、Q82S、K83RおよびE84H、（3）I61F、V63I、K83R、E84KおよびV132I、（4）I61L、E77Q、E84D、R107NおよびV132I、（5）I61L、V63I、E77K、K83R、E84DおよびN100G、（6）I61V、E77H、Q82R、K83R、E84HおよびR107S、（7）I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109RおよびV132R、（8）I61L、E77M、Q82G、K83R、E84DおよびV132L、（9）I61L、（10）I61F、D95H、L96S、G109HおよびV132S、（11）I61F、D95H、L96S、K98R、G109HおよびV132S、（12）I61L、E77Q、E84D、V93A、R107NおよびV132I、（13）E77K、L96S、N100K、G109HおよびV132L、（14）I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100DおよびV132I、（15）I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100DおよびV132L、（16）I61V、E77N、Q82S、K83R、E84HおよびV93A、（17）I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98RおよびN100E、（18）I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100DおよびG109R、（19）I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98RおよびN100G、ならびに、（20）I61L、V63I、E77N、Q82GおよびE84Gからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有してよい。
本発明において、ヒトSIRPα変異体1（例えば、SEQ ID NO: 29で表されるアミノ酸配列であるヒトSIRPαのアミノ酸配列中で33～149位の残基）に基づいて、それぞれ以上の（1）～（20）のアミノ酸置換群を有するSIRPα変異体1の突然変異体が、順次にM1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135およびM145と命名される。上記のSIRPα変異体1の突然変異体は、順次に例えばSEQ ID NO:30-49のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有してよい。
いくつかの実施形態において、上記のSIRPα変異体1の突然変異体は、M91であり、例えばSEQ ID NO:41で表されるアミノ酸配列を有する。
PD-L1に特異的に結合する第1結合ドメイン
本発明において、上記の第1結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片もしくは変異体を含み得る。例えば、上記の抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体と完全ヒト化抗体からなる群から選ばれる。例えば、上記の抗原結合断片は、Fab、Fab'、(Fab')2、F（ab）2、dAb、散在している相補性決定領域CDR、FvおよびscFvからなる群から選ばれる。
本発明において、上記の第1結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片もしくは変異体を含み得る。例えば、上記の抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体と完全ヒト化抗体からなる群から選ばれる。例えば、上記の抗原結合断片は、Fab、Fab'、(Fab')2、F（ab）2、dAb、散在している相補性決定領域CDR、FvおよびscFvからなる群から選ばれる。
本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、PD-L1タンパク質に特異的に結合することによって、腫瘍細胞の殺傷および/または腫瘍成長の抑制を行える。例えば、上記の腫瘍は、PD-L1陽性の腫瘍を含み得る。例えば、上記のPD-L1陽性の腫瘍は、胃癌、乳がん、子宮頚部癌、肺癌、頭頸部腫瘍、黒色腫、神経膠腫、リンパ上皮腫、食道がんまたは結腸・直腸癌からなる群から選ばれる。本発明において、上記の抗体、その抗原結合断片は、胃癌、乳がん、子宮頚部癌、肺癌、頭頸部腫瘍、黒色腫、神経膠腫、リンパ上皮腫、食道がんまたは結腸・直腸癌細胞の殺傷または胃癌、乳がん、子宮頚部癌、肺癌、頭頸部腫瘍、黒色腫、神経膠腫、リンパ上皮腫、食道がんまたは結腸・直腸癌細胞成長の抑制を行える。
本発明に記載のPD-L1タンパク質は、ヒトPD-L1タンパク質またはその機能的断片であってよい。例えば、上記のPD-L1タンパク質は、マウスPD-L1タンパク質ではなくてよく、または、ラットPD-L1タンパク質ではなくてよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体、その抗原結合断片は、基本的にマウスPD-L1タンパク質またはラットPD-L1タンパク質に結合しない。
本発明に記載の抗体、その抗原結合断片は、リファレンス抗体と競合して上記のPD-L1タンパク質に結合することができる。上記のリファレンス抗体は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む。例えば、上記のリファレンス抗体は、軽鎖可変領域が、LCDR1がSEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：15からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有し、LCDR2がSEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：16からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有し、LCDR3がSEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：17からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するLCDR1-3を含んでよい。上記のリファレンス抗体は、重鎖可変領域が、HCDR1がSEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：18からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有し、HCDR2がSEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：19からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有し、HCDR3がSEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：20からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するHCDR1-3を含んでよい。
例えば、上記のリファレンス抗体は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO：7およびSEQ ID NO：21からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有し、かつ、重鎖可変領域のアミノ酸配列がSEQ ID NO：8およびSEQ ID NO：22からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有してよい。又、例えば、上記のリファレンス抗体は、軽鎖がSEQ ID NO：11およびSEQ ID NO：25からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有し、かつ、重鎖がSEQ ID NO：13およびSEQ ID NO：27からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有してよい。例えば、上記のリファレンス抗体は、軽鎖がSEQ ID NO:11で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、重鎖がSEQ ID NO:13で表されるアミノ酸配列を有してよい。例えば、上記のリファレンス抗体は、軽鎖がSEQ ID NO:25で表されるアミノ酸配列を有し、かつ、重鎖がSEQ ID NO:27で表されるアミノ酸配列を有してよい。
本発明に記載の抗体、その抗原結合断片は、抗体軽鎖またはその断片を含んでよい。例えば、上記の抗体軽鎖またはその断片は、Igκ定常領域、例えばヒトIgκ定常領域を含んでよい。
例えば、上記の抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するLCDR1を含んでよい。上記の抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するLCDR2を含んでよい。上記の抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する LCDR3を含んでよい。又、例えば、上記の抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有するLCDR1を含んでよい。上記の抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有するLCDR2を含んでよい。上記の抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有するLCDR3を含んでよい。
本発明に記載の抗体の軽鎖またはその断片は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:7でありうる軽鎖可変領域VLを含んでよい。いくつかの実施形態において、上記の抗体軽鎖またはその断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:11であってよい。又、例えば、上記の軽鎖可変領域VLのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:21であってよい。いくつかの実施形態において、上記の抗体軽鎖またはその断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:25であってよい。
本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、抗体重鎖またはその断片を含んでよい。例えば、上記の抗体重鎖またはその断片は、さらに、ヒト定常領域を含む。ここで、上記のヒト定常領域は、ヒトIgG定常領域を含んでよい。ここで、上記のIgG定常領域は、ヒトIgG1定常領域またはIgG4を含んでよい。
例えば、上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有するHCDR1を含んでよい。上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有するHCDR2を含んでよい。上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有するHCDR3を含んでよい。又、例えば、上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有するHCDR1を含んでよい。上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有するHCDR2を含んでよい。上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有するHCDR3を含んでよい。
上記の抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域VHを含んでよい。いくつかの実施形態において、上記の抗体重鎖は、SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有してよい。又、例えば、上記の重鎖可変領域VHは、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有してよい。いくつかの実施形態において、上記の抗体重鎖は、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有してよい。
いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:11を有し、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:13を有してよく、または、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:25を有し、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:27を有してよい。
いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片では、LCDR1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:1、LCDR2のアミノ酸配列がSEQ ID NO:2、LCDR3のアミノ酸配列がSEQ ID NO:3を有してよく、かつ、HCDR1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:4、または、HCDR2のアミノ酸配列がSEQ ID NO:5、HCDR3のアミノ酸配列がSEQ ID NO:6を有してよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体SG1201またはそれと同一のLCDR1-3およびHCDR1-3を含有する抗体を含んでよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:7を有する軽鎖可変領域を含んでよく、かつ、重鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:8を有する重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体SG1201またはそれと同一の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体を含んでよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO:11で表される軽鎖と重鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO:13で表される重鎖を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体SG1201またはそれと同一の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含有する抗体を含んでよい。
いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体は、SG1201であってよい。抗体SG1201は、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:7で表され、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:11で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:8で表され、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:13で表される。
いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片において、LCDR1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:15を有し、LCDR2のアミノ酸配列がSEQ ID NO:16を有し、LCDR3のアミノ酸配列がSEQ ID NO:17を有し、かつ、HCDR1のアミノ酸配列がSEQ ID NO:18を有し、HCDR2のアミノ酸配列がSEQ ID NO:19を有し、HCDR3のアミノ酸配列がSEQ ID NO:20を有してよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体SG1202またはそれと同一のLCDR1-3およびHCDR1-3を含有する抗体を含んでよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:21を有する軽鎖可変領域を含んでよく、かつ、重鎖が、アミノ酸配列がSEQ ID NO:22を有する重鎖可変領域を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体SG1202またはそれと同一の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含有する抗体を含んでよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO:25で表される軽鎖および重鎖アミノ酸配列がSEQ ID NO:27で表される重鎖を含んでよい。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、抗体SG1202またはそれと同一の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含有する抗体を含んでよい。
いくつかの実施形態において、本発明に記載の抗体は、SG1202であってよい。抗体SG1202は、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:21で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:22で表され、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:25で表され、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:27で表される。
本発明に記載の抗体またはその抗原結合断片は、さらに、SG1201および/またはSG1202の軽鎖および/または重鎖のアミノ酸配列に1つまたは複数のランダム突然変異（例えば、1つまたは複数、例えば1つまたはいくつかのアミノ酸置換）を有してよい。例えば、上記の抗体、その抗原結合断片は、SG1201および/またはSG1202の軽鎖可変領域のフレームワーク領域L-FR1-4の1つまたは複数の部位に、1つまたは複数のランダム突然変異（例えば、1つまたは複数、例えば1つまたはいくつかのアミノ酸置換）を有してよく、および/または、SG1201および/またはSG1202の重鎖可変領域のフレームワーク領域H-FR1-4の1つまたは複数の部位に、1つまたは複数のランダム突然変異（例えば、1つまたは複数、例えば1つまたはいくつかのアミノ酸置換）を有してよい。
第1結合ドメインと第2結合ドメインの連結
本発明において、上記の第1結合ドメインは、上記の第2結合ドメインのN末端に位置してよい。例えば、上記の第1結合ドメインのC末端は、リンカーによって上記の第2結合ドメインのN末端に間接に連結してよい。いくつかの場合において、上記の第1結合ドメインのC末端は、第2結合ドメインのN末端に直接に（例えば、フレームワーク内）連結してもよい。
本発明において、上記の第1結合ドメインは、上記の第2結合ドメインのN末端に位置してよい。例えば、上記の第1結合ドメインのC末端は、リンカーによって上記の第2結合ドメインのN末端に間接に連結してよい。いくつかの場合において、上記の第1結合ドメインのC末端は、第2結合ドメインのN末端に直接に（例えば、フレームワーク内）連結してもよい。
本発明において、上記の融合タンパク質は、さらに、上記の第1結合ドメインのC末端かつ上記の第2結合ドメインのN末端にあるリンカーを含んでよい。例えば、上記の融合タンパク質において、第1結合ドメインのC末端は、リンカーのN末端に連結し、リンカーのC末端は、第2結合ドメインのN末端に連結してよい。例えば、上記の融合タンパク質において、N末端からC末端にかけて、順次に第1結合ドメインと、リンカーと、第2結合ドメインとを含み得る。
本発明において、上記のリンカーは、SEQ ID NO:52で表されるアミノ酸配列を有してよい。
いくつかの場合において、上記の融合タンパク質は、少なくとも2つ（例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10つ、またはより多く）の上記の第2結合ドメインを持ってよい。本発明において、各上記の第2結合ドメインは、それぞれ上記の第1結合ドメインのC末端に位置してよい。本発明において、上記の2つ以上の第2結合ドメインは、それぞれ上記の第1結合ドメインのC末端に直接または間接に連結してよい。
本発明において、上記の融合タンパク質は、PD-L1に特異的に結合する第1結合ドメイン、およびCD47タンパク質に特異的に結合する第2結合ドメインを含んでよく、ここで、第2結合ドメインがヒトSIRPα変異体1の突然変異体を含んでよく、PD-L1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片もしくは変異体のC末端がヒトSIRPα変異体1の突然変異体のN末端に直接または間接に連結してよい。例えば、上記の第2結合ドメインは、少なくとも、N末端がそれぞれPD-L1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片もしくは変異体のC末端に連結しているヒトSIRPα変異体1の突然変異体を2つ含んでよい。
例えば、図1に示されるように、上記の融合タンパク質（SG12473）は、第1結合ドメインがSG1201を有し、第2結合ドメインが2つのSIRPα変異体1の突然変異体M91を有してよく、用いられるリンカー1の配列がSEQ ID NO:52で表され、2つのM91のN末端がそれぞれリンカー1を介してSG1201の2本の重鎖のC末端に連結しており、上記の融合タンパク質に、M91がSG1201重鎖のC末端に連結することによって、第2ポリペプチド鎖を得て、SG1201の軽鎖が第1ポリペプチド鎖と呼ばれる。SG12473の上記の第2ポリペプチド鎖と上記の第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:53とSEQ ID NO:11で表される。
例えば、図1に示されるように、上記の融合タンパク質（SG12474）は、第1結合ドメインがSG1202を有し、第2結合ドメインが2つのSIRPα変異体1の突然変異体M91を有してよく、用いられるリンカー1の配列がSEQ ID NO:52で表され、2つのM91のN末端がそれぞれリンカー1を介してSG1202の2本の重鎖のC末端に連結しており、上記の融合タンパク質に、M91がSG1202重鎖のC末端に連結することによって、第2ポリペプチド鎖を得て、SG1202の軽鎖が第1ポリペプチド鎖と呼ばれる。SG12474の上記の第2ポリペプチド鎖と上記の第1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:54とSEQ ID NO:25で表される。
核酸分子、ベクター、ならびに細胞および調製方法
他方、本発明は、上記の融合タンパク質または上記の免疫複合体をコード化する1つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。例えば、上記の１種または複数種の核酸分子における各核酸分子が、完全な上記の抗体またはその抗原結合断片をコード化することができるし、その一部（例えば、HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、軽鎖あるいは重鎖のうちの１種または複数種）をコード化することもできる。
他方、本発明は、上記の融合タンパク質または上記の免疫複合体をコード化する1つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。例えば、上記の１種または複数種の核酸分子における各核酸分子が、完全な上記の抗体またはその抗原結合断片をコード化することができるし、その一部（例えば、HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、軽鎖あるいは重鎖のうちの１種または複数種）をコード化することもできる。
本発明に記載の核酸分子は、単離されたものであって良い。例えば、それは、（i）インビトロでの増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅と、（ii）クローン組換えと、（iii）精製、例えば、酵素消化およびゲル電気泳動分画と、或いは、（iv）合成、例えば、化学合成とによって産生または合成されてよい。ある実施形態において、上記単離された核酸は、組換えDNAの技術で調製される核酸分子である。
組換えDNAおよび分子クローン技術は、Sambrook, J., Fritsch, E. F.およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, （1989）（Maniatis）、T. J. Silhavy, M. L. BennanとL. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. （1984）およびAusubel, F. M.らによるCurrent Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience（1987）に記述の技術を含む。つまり、上記の核酸は、ゲノムDNA断片、cDNAおよびRNAから調製可能であり、細胞から直接に抽出されるか、または、各種の増幅方法（PCRおよびRT-PCRを含むが限定されない）を用いて組換えにより産生されることができる。
核酸の直接化学合成は、通常、3'キャップと5'キャップのヌクレオチド単量体を、順次に成長中のヌクレオチド重合体鎖の末端5'ヒドロキシ基に付加し、但し、各付加は、求核攻撃により付加された単量体の3'位における成長鎖の末端5'ヒドロキシ基によって実現され、上記の単量体は、通常、りん酸トリエステル、ホスホロアミダイトなどのようなリン誘導体である。例えば、Matteuciら、Tet. Lett. 521:719 （1980）、Caruthersらに属する米国特許第4,500,707号、およびSouthernらに属する米国特許第5,436,327号と第5,700,637号を参照し、また、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。上記のベクターは、いかなる線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、RNAベクター、ウイルスベクターなどであってよい。ウイルスベクターは、非限定的な例として、レトロウイルス、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスを含み得る。いくつかの実施態様において、上記のベクターは、例えば、ファージディスプレイベクターなどの発現ベクターである。
他方、本発明は、上記の核酸分子を含む1つまたは複数のベクターを提供する。例えば、上記のベクターは、本発明に記載の１種または複数種の核酸分子を含んでよい。各種のベクターには、１種または複数種の上記の核酸分子を含んでよい。なお、上記ベクターは、さらに、コード領域が適切な宿主中で正しく発現することが許容される発現調節因子を含んで良い。このような調節因子は、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写やmRNAの翻訳を調節するその他の調節因子などを含めて、当該技術分野における当業者の周知のものである。ある実施形態において、上記発現調節配列が調節可能なものである。上記発現調節配列の具体な構造は、生物種や細胞種の機能により変化するが、通常、例えばTATAボックス、キャッピング配列、およびCAAT配列などそれぞれ転写および翻訳の開始を関与する5’非転写配列並びに5’および3’非翻訳配列を含む。例えば、5’非転写発現調節配列は、機能的に連結された核酸を転写制御するためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含んで良い。上記の発現控制配列は、エンハンサー配列や上流アクチベーター配列も含み得る。本発明において、適当なプロモーターは、例えばSP6、T3およびT7ポリメラーゼに用いられるプロモーター、ヒトU6RNAプロモーター、CMVプロモーターおよびその人工雑種プロモーター（例えば、CMV）を含んでよく、ここで、プロモーターのある部分が、他の細胞タンパク質（例えば、ヒトGAPDH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーターのある部分に融合することができ、また、別のイントロンを含んでも、含まなくてもよい。本発明に記載の１種または複数種の核酸分子は、上記の発現調節因子に操作可能に連結することができる。
上記のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または、例えば遺伝子工学に一般的に用いられるその他のベクターを含んで良い。いくつかの実施形態において、上記のベクターは、発現ベクターであってよい。
上記のベクターは、さらに、発現後にベクターを保有している宿主細胞を選択するか、他の手段で同定するための1つまたは複数の表現型形質を与える1つまたは複数の選択可能標識遺伝子を含んでよい。真核細胞に用いられる適切な選択可能標識は、非限定的な例として、ジヒドロ葉酸レダクターゼとネオマイシン耐性を含む。
他方、本発明は、上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、または上記のベクターを含む細胞を提供する。上記の細胞は、宿主細胞であってよい。例えば、上記の細胞は、例えば、大腸菌または枯草菌などの原核細胞、酵母細胞またはコウジカビなどの真菌細胞、S2キイロショウジョウバエ細胞またはSf9などの昆虫細胞、または、線維芽細胞、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞、BHK細胞、HEK 293細胞もしくはヒト細胞の動物細胞などのいろんな細胞種を含み得る。
例えば、複数種の作成された技術により、上記のベクターを宿主細胞に安定または一過性に導入する。例えば、カルシウム沈殿によりベクターを導入する塩化カルシウム処理に係る方法である。同様の方法で他の塩、例えばリン酸カルシウムを用いてよい。なお、電気穿孔（すなわち、細胞の核酸に対する透過性を高めるように電流を印加する）を用いてよい。転換方法は、他の例として、顕微注入、DEAEデキストラン媒介転換および酢酸リチウムの存在下でのヒートショックを含む。脂質複合体、リポソームやデンドリマーは、宿主細胞のトランスフェクトにも用いられる。
異種配列を宿主細胞に導入する場合に、複数種の方法でベクターが導入された宿主細胞を同定する。一つの方法としては、単一細菌コロニーを形成するように単一細胞を継代培養し、そして、必要なタンパク質産物の発現を測定する例示的選択方法である。もう一つの方法としては、ベクターに含まれる選択可能標識遺伝子の発現により与えられる表現型形質によって異種配列を有する宿主細胞を選択するものである。
例えば、本発明の各種の異種配列を宿主細胞に導入する場合に、PCR、SouthernブロッティングまたはNorthernブロッティングハイブリダイゼーションなどの方法で確認することができる。例えば、得られる宿主細胞から核酸を調製し、また、標的配列に対して特異的であるプライマーを用いて、PCR増幅で標的配列を特定することができる。増幅生成物のアガロースゲルゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を行い、そして、臭化エチジウム、SYBR Green溶液などによる染色、またはUV検出によってDNAを検出する。または、ハイブリダイゼーション反応で標的配列に対して特異的な核酸プローブを利用することができる。遺伝子配列の発現は、PCR、Northernブロッティングとハイブリダイゼーションをさせるか、コード化される遺伝子産物と反応する抗体の免疫測定の逆転写を用いて対応するmRNAを検出することによって特定される。例示的免疫測定は、ELISA、放射免疫測定法やサンドイッチ免疫測定法を含むが限定されない。
なお、本発明の各種の異種配列を宿主細胞に導入する場合に、異種配列でコード化される酵素（例えば、酵素マーカー）の酵素作用の活性によって確認することができる。酵素は、当該技術分野における周知の複数種の方法で測定される。通常、酵素活性は、産物の形成、または、検討中の酵素作用反応の基質の転換によって特定される。上記の反応は、インビトロまたはインビボで実施される。
他方、本発明は、上記の融合タンパク質を発現可能な条件で上記の細胞を培養することを含む上記の融合タンパク質の調製方法を提供する。例えば、当該技術分野における一般的な当業者にとって、適当な培地、適当な温度と培養時間などを利用するなど、これらの方法が公知である。
いくつかの場合において、上記の方法は、さらに、上記の融合タンパク質を分離および/または精製する工程を含んでよい。例えば、プロテインG-アガロースゲルまたはプロテインA-アガロースゲルによって親和性クロマトグラフィーを行うことができるし、さらに、ゲル電気泳動および/または高速液体クロマトグラフィーなどで本発明に記載の融合タンパク質を精製および分離することができる。
免疫複合体、組成物および使用
他方、本発明は、上記の融合タンパク質を含む免疫複合体を提供する。例えば、上記の免疫複合体は、本発明に記載の融合タンパク質が細胞毒性薬、放射性毒性薬剤（例えば、放射性同位体）および/または免疫阻害剤（例えば、免疫応答を抑制することなどによって細胞を殺傷するいかなる薬剤）などを含むが限定されない１種または複数種の治療薬と複合する融合タンパク質-薬物複合体（ADC）であってよい。いくつかの実施形態において、上記の治療薬は、腫瘍関連疾患または病症を治療可能な治療薬であってよい。
他方、本発明は、上記の融合タンパク質を含む免疫複合体を提供する。例えば、上記の免疫複合体は、本発明に記載の融合タンパク質が細胞毒性薬、放射性毒性薬剤（例えば、放射性同位体）および/または免疫阻害剤（例えば、免疫応答を抑制することなどによって細胞を殺傷するいかなる薬剤）などを含むが限定されない１種または複数種の治療薬と複合する融合タンパク質-薬物複合体（ADC）であってよい。いくつかの実施形態において、上記の治療薬は、腫瘍関連疾患または病症を治療可能な治療薬であってよい。
上記の複合は、ペプチドリンカー（例えば、切断可能なリンカー）、または他の態様で行い、また、上記のリンカーは、例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ敏感リンカー、光不安定リンカーなどであってよい。
他方、本発明は、上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、または上記の核酸分子、および任意選択で薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物を提供する。
例えば、上記の薬学的に許容可能な賦形剤は、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属複合体および/又は非イオン界面活性剤などを含んでよい。
本発明において、当該技術分野における従来技術手段に従って、上記の組成物を薬学的に許容可能なベクターまたは希釈剤、その他の周知のいかなる補助剤および賦形剤と調製し、例えばRemington：The Science and Practice of Pharmacy、第十九版、Gennaro編集、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1995に公開の技術に基づき操作してよい。
本発明において、上記の組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位におけるin situ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下貯蔵部による投与のために調製されることができる。
例えば、上記の組成物は、腫瘍成長の抑制に用いられる。例えば、本発明の組成物は、疾患の発展または進行を抑制または遅延したり、腫瘍の大きさを低減したり（ひいては、基本的に腫瘍を消去）、疾患状態を緩和および/または安定させることができる。
例えば、本発明に記載の組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸薬、粉末剤、徐放性製剤、溶液剤、懸濁剤などの経口投与に適する態様であってよく、または、例えば、無菌液、懸濁剤やエマルションなどの腸管外注射、あるいは軟膏やクリームなどの局所投与、もしくは坐剤の経肛門投与に用いられる。上記の組成物は、正確な用量の単回投与に適する単位用量態様であってよい。上記の組成物は、さらに、従来の医薬品のベクターまたは賦形剤を含み得る。なお、上記の組成物は、他の医薬品または薬剤、ベクター、アジュバントなどを含み得る。
本発明に記載の組成物は、治療有効量の上記の融合タンパク質を含み得る。上記の治療有効量は、進行リスクがある被験者の病気（例えば腫瘍）及び/又はそのいかなる合併症を予防及び/又は治療（少なくとも一部治療）するための用量である。上記の用量の具体的量/濃度は、投与方法や患者の必要によるものであって、例えば患者の体積、粘度および/または体重などに基づき特定してよい。例えば、適切な用量は、約0.1mgまたは1mg/kg/日から約50mg/kg/日までであってよく、より高い場合もある。これらの特定される用量は、当該技術分野における当業者（例えば、医者または薬剤師）により、所定の患者、医薬剤および/または疾患の状況に基づき、便利に調整してよいことが理解されたい。
本発明において、「治療」、「治癒」、「寛解」または「改善」という用語は、本発明に交換可能に使用され、かつ、有用または必要な結果（治療効果および/または予防効果を含むが限定されない）を得る方法を指す。本発明において、治療効果は、通常、治療される基礎症状の重症度を根絶または軽減することを指す。なお、被験者の改善（被験者が基礎症状からの苦痛を抱えるとしても）が見られるように、重症度を根絶、軽減するか、１種または複数種の基礎症状関連兆候の発生率を減少することにより、治療効果を達成する。予防効果について、特定疾患の進行リスクにいる被験者、またはレポーター疾患における１種または複数種の兆候がある被験者に、該疾患が診断されなくても組成物を投与してもよい。
他方、本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞の使用を提供する。
他方、本発明に記載の融合タンパク質、免疫複合体、核酸分子、ベクター、組成物または細胞は、上記の腫瘍の治療に用いられる。
他方、本発明は、被験者に本発明に記載の融合タンパク質、免疫複合体、核酸分子、ベクター、組成物または細胞を投与することを含む腫瘍の治療方法を提供する。
他方、本発明は、（例えば、必要のある被験者、細胞または生物学的試料に）本発明に記載の融合タンパク質または組成物を投与することを含むCD47タンパク質とSIRPαの相互作用を遮断する方法を提供する。
また、本発明は、（例えば、必要のある被験者、細胞または生物学的試料に）本発明に記載の融合タンパク質または組成物を投与することを含むPD-L1とPD1の相互作用を遮断する方法を提供する。
また、本発明は、本発明に記載の融合タンパク質または組成物に上記の腫瘍または腫瘍細胞を接触させることを含む腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制する方法を提供する。例えば、上記の接触は、インビトロであってよい。
また、本発明は、必要のある被験者に、有効量の上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を投与することを含む腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を抑制する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、固形腫瘍および非固形腫瘍を含み得る。
いくつかの実施形態において、上記の固形腫瘍および非固形腫瘍は、多発性骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、神経膠腫、胚細胞腫瘍、肉腫、中皮腫、胎盤腫、脳癌、骨癌、皮膚がん、鼻咽頭癌、肺癌、口腔がん、食道がん、胃癌、肝臓がん、膵臓癌、前立腺がん、腸癌、乳がん、子宮頚部癌、卵巣癌および精巣癌、上顎洞癌、下咽頭がん、嗅神経芽細胞腫、舌癌、歯肉癌、膨大部癌、結腸がん、結直腸癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱がん、陰茎癌、卵管癌、眼瞼癌、網膜芽細胞腫を含み得る。
また、本発明は、腫瘍あるいは自己免疫疾患を治療することができる上記の融合タンパク質、上記の免疫複合体、上記の核酸分子、上記のベクター、上記の組成物、または上記の細胞を提供する。
本発明において、「被験者」という用語は、通常、ヒトまたは非ヒト動物を指し、猫、犬、馬、ブタ、牛、羊、ヤギ、ウサギ、マウス、ラットまたはサルを含むが限定されない。
以下の実施例は、どんな理論にもよらず、本発明の融合タンパク質、調製方法や使用などを釈明することに過ぎなく、本願発明の範囲を制限するものではない。
実施例1融合タンパク質の構築
図1に示される融合タンパク質構造を参照して、ロシュPD-L1抗体Atezolizumab（SG1201）、SIRPα変異体1の突然変異体M91（SEQ ID:NO 41）を例として、N末端からC末端にかけて、選択的リンカー1（SEQ ID:NO 52）を選んで、順次にSG1201、リンカーとN末端がそれぞれSG1201の重鎖のC末端に連結した2つのM91に連結することによって、融合タンパク質SG12473が得られた。
図1に示される融合タンパク質構造を参照して、ロシュPD-L1抗体Atezolizumab（SG1201）、SIRPα変異体1の突然変異体M91（SEQ ID:NO 41）を例として、N末端からC末端にかけて、選択的リンカー1（SEQ ID:NO 52）を選んで、順次にSG1201、リンカーとN末端がそれぞれSG1201の重鎖のC末端に連結した2つのM91に連結することによって、融合タンパク質SG12473が得られた。
抗体SG1201は、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:7で表され、VLをコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:9で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:8で表され、VHをコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:10で表される。抗体SG1201は、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:11で表され、その軽鎖をコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:12で表される。抗体SG1201は、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:13で表され、その重鎖をコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:14で表される。
上記の融合タンパク質SG12473は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:11で表されるSG1201の軽鎖である第1ポリペプチド鎖、Fc領域突然変異を含むSG1201の重鎖がリンカー1を介してM91に連結することによって得られアミノ酸配列がSEQ ID NO:53で表されるポリペプチド鎖である第2ポリペプチド鎖より構成される。
図1に示される融合タンパク質構造を参照して、アストラゼネカPD-L1抗体Durvalumab（SG1202）、SIRPα変異体1の突然変異体M91（SEQ ID:NO 41）を例として、N末端からC末端にかけて、選択的リンカー1（SEQ ID:NO 52）を選んで、順次にSG1202、リンカーとN末端がそれぞれSG1202の重鎖のC末端に連結した2つのM91に連結することによって、融合タンパク質SG12474が得られた。
抗体SG1202は、LCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17で表され、VLのアミノ酸配列がSEQ ID NO:21で表され、VLをコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:23で表され、HCDR1-3のアミノ酸配列がそれぞれSEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20で表され、VHのアミノ酸配列がSEQ ID NO:22で表され、VHをコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:24で表される。抗体SG1202は、軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:25で表され、その軽鎖をコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:26で表される。抗体SG1202は、重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO:27で表され、その重鎖をコード化するヌクレオチド配列がSEQ ID NO:28で表される。
上記の融合タンパク質SG12474は、アミノ酸配列がSEQ ID NO:25で表されるSG1202の軽鎖である第1ポリペプチド鎖、Fc領域突然変異を含むSG1202の重鎖がリンカー1を介してM91に連結することによって得られアミノ酸配列がSEQ ID NO:54で表されるポリペプチド鎖である第2ポリペプチド鎖より構成される。
ここで、IgG1-Fcのアミノ酸配列はSEQ ID NO:50で表され、突然変異を含むFcのアミノ酸配列はSEQ ID NO:51で表される。
SIRPα変異体1の突然変異体M91（SEQ ID:NO 41）は、IgG1-Fc融合タンパク質SS002M91と、ホモ二量体になり、そのモノマーのアミノ酸配列がSEQ ID NO:55で表される。
実施例2二重抗原との結合活性検出
（1）異なる抗原に対するヒト化抗体を対照とし、対応する二官能性タンパク質と関連抗原の結合活性に対してELISA評価を行った。
（1）異なる抗原に対するヒト化抗体を対照とし、対応する二官能性タンパク質と関連抗原の結合活性に対してELISA評価を行った。
PD-L1（ヒト由来、Sino Biological社から購入のPD-L1/B7-H1/CD274 Protein（His Tag））でELISAストリップを被覆して4℃で一晩し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を添加して、37℃でブロッキングを1時間行い、濃度の異なる抗体SG1201、融合タンパク質SG12473、または、濃度の異なる抗体SG1202、融合タンパク質SG12474を加えて、37℃で1時間反応させて、PBSTによる洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体（Goat Anti human IgG HRP、Thermo Fisher Scientific）を加えて、37℃で30分間反応させて、PBSTによる洗浄を5回行い、各ウェルにそれぞれ100μl TMB（eBioscience）を加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1～2min静置し、そして、各ウェルにそれぞれ100μl 2N H2SO4反応停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、二官能性タンパク質と関連標的抗原の結合能を分析した。
結果は図2～3で表される。図2～3は、融合タンパク質SG12473と融合タンパク質SG12474において、PD-L1の抗体タイプが異なるが、これにより、融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474とPD-L1の結合能を影響していないことを示した。
（2）CD47受容体の突然変異体M91を対照とし、対応する二官能性タンパク質とCD47の結合活性に対してELISA評価を行った。
CD47（ヒト由来、Sino Biological社から購入のCD47 Protein（His Tag））でELISAストリップを被覆して4℃で一晩し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を添加して、37℃でブロッキングを1時間行い、濃度の異なる融合タンパク質SS002M91、融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474を加えて、37℃で1時間反応させて、PBSTによる洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG二次抗体（Goat Anti human IgG HRP、Thermo Fisher Scientific）を加えて、37℃で30分間反応させて、PBSTによる洗浄を5回行い、各ウェルにそれぞれ100μl TMB（eBioscience）を加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1～2min静置し、そして、各ウェルにそれぞれ100μl 2N H2SO4反応停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474とCD47の結合能を分析した。
結果は図4で表される。図4は、融合タンパク質SG12473と融合タンパク質SG12474において、PD-L1の抗体タイプが異なるが、これにより、融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474とCD47の結合力を影響していないことを示した。
実施例3二重抗原との同時結合の活性検出
異なる抗原に対するヒト化抗体を対照とし、二重抗原に対する融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474による同時結合の生物学的活性に対してELISA分析を行った。
異なる抗原に対するヒト化抗体を対照とし、二重抗原に対する融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474による同時結合の生物学的活性に対してELISA分析を行った。
PD-L1でELISAストリップを被覆して4℃で一晩し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を添加して、37℃でブロッキングを1時間行い、それぞれ濃度の異なる抗体SG1201、融合タンパク質SG12473、抗体SG1202、融合タンパク質SG12474を加えて、37℃で1時間反応させて、PBSTによる洗浄後、ビオチン標識CD47（Biotin-Fc-CD47）を加えて、37℃で30分間反応させて、PBSTによる洗浄を5回行い、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識アビジン（Streptavidin-HRP、Jiaxuan Biotech）を加えて、37℃で30分間反応させて、PBSTによる洗浄を5回行い、各ウェルにそれぞれ100μl TMB（eBioscience）を加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1～2min静置し、そして、各ウェルにそれぞれ100μl 2N H2SO4反応停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474とPD-L1およびCD47の同時結合能を分析した。
結果は図5で表され、図5は、融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474においてPD-L1の抗体タイプが異なるが、融合タンパク質SG12473および融合タンパク質SG12474とPD-L1およびCD47の同時結合能を影響していないことを示した。
実施例4 CD47/SIRPαの相互作用遮断の活性分析
融合タンパク質SS002M91を対照とし、融合タンパク質SG12473、SG12474によるCD47/SIRPαの相互作用遮断の生物学的活性を評価した。
融合タンパク質SS002M91を対照とし、融合タンパク質SG12473、SG12474によるCD47/SIRPαの相互作用遮断の生物学的活性を評価した。
SIRPα-Hisでアッセイプレートを被覆して、1ug/m、l4℃で一晩し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を添加して、37℃でブロッキングを1時間行い、10%のウシ胎児血でそれぞれSS002M91、SG12473、SG12474を勾配希釈しながら、試料にBiotin-Fc-CD47を最終濃度が2μg/mlになるまで入れて、37℃で30minプレインキュベートして、一次抗体とし、PBSTによるアッセイプレート洗浄後、一次抗体を加えて、37℃で1時間培養したら、PBSTによって5回洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識アビジン（Streptavidin-HRP、Jiaxuan Biotech）を加えて、37℃で30分間培養し、PBSTによって5回洗浄して、各ウェルにそれぞれ100μl TMB (eBioscience) を加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1～5min静置し、各ウェルにそれぞれ100μl 2N H2SO4反応停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、CD47/SIRPαに対するSS002M91、SG12473、SG12474による遮断作用を分析した。
結果は図6で表され、図6は、融合タンパク質SG12473、SG12474は、融合タンパク質SS002M91と同様に、CD47とそのリガンドSIRPαの結合を競合的に遮断することができることが分かった。ここで、SG12473のIC50値が1.26nM、SG12474のIC50値が0.77nM、SS002M91のIC50値が1.16nMであった。
実施例5 PD-1/PD-L1の相互作用遮断の活性分析
SG1201、SG1202を対照とし、融合タンパク質SG12473、SG12474によるPD-1/PD-L1の相互作用遮断の生物学的活性を評価した。
SG1201、SG1202を対照とし、融合タンパク質SG12473、SG12474によるPD-1/PD-L1の相互作用遮断の生物学的活性を評価した。
PD-L1-Fcでアッセイプレートを被覆して、2ug/m、l4℃で一晩し、PBSTによる洗浄後、10%のウシ胎児血清を添加して、37℃でブロッキングを1時間行い、10%のウシ胎児血でそれぞれSG1201、SG12473、SG1202、SG12474を勾配希釈しながら、試料にBiotin-Fc-PD1を最終濃度が1ug/mlになるまで入れて、37℃で30minプレインキュベートして、一次抗体とし、PBSTによるアッセイプレート洗浄後、一次抗体を加えて、37℃で1時間培養したら、PBSTによって5回洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識アビジン（Streptavidin-HRP、Jiaxuan Biotech）を加えて、37℃で30分間培養し、PBSTによって5回洗浄して、各ウェルにそれぞれ100μl TMB (eBioscience) を加えて、室温（20±5℃）で光のあたらない所に1～5min静置し、各ウェルにそれぞれ100μl 2N H2SO4反応停止液を加えて基質反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450 nmにおけるOD値を読み取り、PD-1/PD-L1に対するSG1201、SG12473、SG1202、SG12474による遮断作用を分析した。
図7～8から、融合タンパク質SG12473、SG12474は、SG1201、SG1202と同様に、PD-1とPD-L1の結合を競合的に遮断することができることが分かった。ここで、SG1201のIC50値が11.23nM、SG12473のIC50値が13.22nM、SG1202のIC50値が10.89nM、SG12474のIC50値が9.12nMであった。
実施例6 融合タンパク質のインビボ抗腫瘍活性
ヒトリンパ腫KARPAS-299細胞株を、雌NCGマウスMiXeno動物モデルに皮下で異種移植し、融合タンパク質SG12473の抗腫瘍活性効果を評価した。
ヒトリンパ腫KARPAS-299細胞株を、雌NCGマウスMiXeno動物モデルに皮下で異種移植し、融合タンパク質SG12473の抗腫瘍活性効果を評価した。
6～8週齢の雌NCGマウス（江蘇集萃薬康生物医薬有限公司より購入）を選んで、試験を行った。マウスに、KARPAS-299細胞を皮下で接種し、腫瘍成長を定期的に観察しながら、腫瘍が35mm3の平均体積に成長した場合、腫瘍の大きさとマウスの体重に基づいてランダムに群分けて投与した。群分けの当日（約Day4）に、新鮮なヒトPBMC（ドナー由来）を尾静脈より接種し、KARPAS-299ヒト化マウスモデルを作成した。
試験は、マウスを、12匹を1群として、溶媒対照群、SG1201群およびSG12473低、中、高用量群に分けて、6匹ごとに同一由来のPBMCを利用するようにした。投与は、腹腔内注射であり、週に2回、合計3週間であった。具体的に、
群1Aと群1B：溶媒対照群
群2Aと群2B：SG1201群、SG1201 5mg/Kg
群3Aと群3B：SG12473低用量群、SG12473 5mg/Kg
群4Aと群4B：SG12473中用量群、SG12473 10mg/Kg
群5Aと群5B：SG12473高用量群、SG12473 20mg/Kgであった。
群2Aと群2B：SG1201群、SG1201 5mg/Kg
群3Aと群3B：SG12473低用量群、SG12473 5mg/Kg
群4Aと群4B：SG12473中用量群、SG12473 10mg/Kg
群5Aと群5B：SG12473高用量群、SG12473 20mg/Kgであった。
相対腫瘍増殖抑制率（TGI）に基づき、治療効果を評価すると共に、動物の体重変化や死亡状況に基づき、安定性を評価した。
結果から、ドナーA由来のPBMCが用いられたマウスにおいて、SG12473の低、中、高用量群がともに有意な抗腫瘍効果を示したことが分かった。図9の結果から、SG12473の低、中、高用量群が、投与完了の場合、TGIがそれぞれ44.71%、47.16%および96.49%であり、投与完了4日後に、TGIがそれぞれ43.71%、47.92%および95.94%であり、相対溶媒対照群にともに統計学的な差が有意にあった（p値がともに<0.01）ことが分かった。SG1201は、用量が測定された場合に有意な抗腫瘍効果を示していない。
ドナーB由来のPBMCが用いられたマウスにおいて、SG12473の低、中、高用量群が、ともに有意な抗腫瘍効果を示した。図10の結果から、SG12473の低、中、高用量群が、投与完了の場合、TGIがそれぞれ36.96%、62.06%および98.90%であり、投与完了4日後に、TGIがそれぞれ33.44%、57.57%および98.83%であり、相対溶媒対照群にともに統計学的な差が有意にあった（p値がともに<0.01）ことが分かった。SG1201は、用量が測定された場合に有意な抗腫瘍効果を示していない。
各治療群は、いずれも死亡した動物がなく、有意な薬物毒性が見られず、治療期における耐性がよかった。
以上、解釈又は図示による説明を記載したが、添付の請求項範囲を限定するわけではない。これまで本明細書に記載の実施形態に、多様な変更などがあることが当業者に明らかであり、且つ、添付の請求項とその均等の実施形態の範囲に属する。
いくつかの実施形態において、上記の突然変異体は、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109およびV132からなる群から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸残基にアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態において、上記の突然変異体は、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sからなる群から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。
CD47に特異的に結合する第2結合ドメイン
本発明において、上記の突然変異体（例えば、CD47タンパク質に特異的に結合するヒトSIRPα変異体1の突然変異体）は、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109およびV132からなる群から選ばれる1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）のアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む。
本発明において、上記の突然変異体（例えば、CD47タンパク質に特異的に結合するヒトSIRPα変異体1の突然変異体）は、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109およびV132からなる群から選ばれる1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）のアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む。
本発明において、上記の突然変異体は、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sからなる群から選ばれる1つまたは複数（例えば、1～2つ、1～3つ、1～4つ、1～5つ、1～6つ、1～7つ、1～8つ、1～9つ、1～10つまたはより多く）のアミノ酸置換を有してよい。
Claims (41)
- PD-L1に特異的に結合する第1結合ドメイン、および
SEQ ID NO:29で表される配列に比べて、33位～149位における1つまたは複数の位置にアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含むヒトSIRPα変異体1の突然変異体を含むCD47タンパク質に特異的に結合する第2結合ドメインを持つ、
融合タンパク質。 - 前記突然変異体は、R22、I29、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100、R107、G109およびV132からなる群から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸残基にアミノ酸置換を有する、
請求項1に記載の融合タンパク質。 - 前記突然変異体は、
（1）I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100およびV132、
（2）I61、E77、Q82、K83およびE84、
（3）I61、V63、K83、E84およびV132、
（4）I61、E77、E84、R107およびV132、
（5）I61、V63、E77、K83、E84およびN100、
（6）I6、E77、Q82、K83、E84およびR107、
（7）I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109およびV132、
（8）I61、E77、Q82、K83、E84およびV132、
（9）I61、
（10）I61、D95、L96、G109およびV132、
（11）I6、D95、L96、K98、G109およびV132、
（12）I61、E77、E84、V93、R107およびV132、
（13）E77、L96、N100、G109およびV132、
（14）I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100およびV132、
（15）I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100およびV132、
（16）I61、E77、Q82、K83、E84およびV93、
（17）I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98およびN100、
（18）I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100およびG109、
（19）I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98およびN100、ならびに、
（20）I61、V63、E77、Q82およびE84からなる群から選ばれるアミノ酸残基にアミノ酸置換を有する、
請求項2に記載の融合タンパク質。 - 前記突然変異体は、R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、L96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/HおよびV132L/R/I/Sからなる群から選ばれる1つまたは複数のアミノ酸置換を有する、
請求項1～3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記突然変異体は、
（1）I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100GおよびV132L、
（2）I61V、E77N、Q82S、K83RおよびE84H、
（3）I61F、V63I、K83R、E84KおよびV132I、
（4）I61L、E77Q、E84D、R107NおよびV132I、
（5）I61L、V63I、E77K、K83R、E84DおよびN100G、
（6）I61V、E77H、Q82R、K83R、E84HおよびR107S、
（7）I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109RおよびV132R、
（8）I61L、E77M、Q82G、K83R、E84DおよびV132L、
（9）I61L、
（10）I61F、D95H、L96S、G109HおよびV132S、
（11）I61F、D95H、L96S、K98R、G109HおよびV132S、
（12）I61L、E77Q、E84D、V93A、R107NおよびV132I、
（13）E77K、L96S、N100K、G109HおよびV132L、
（14）I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100DおよびV132I、
（15）I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100DおよびV132L、
（16）I61V、E77N、Q82S、K83R、E84HおよびV93A、
（17）I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98RおよびN100E、
（18）I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100DおよびG109R、
（19）I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98RおよびN100G、ならびに、
（20）I61L、V63I、E77N、Q82GおよびE84Gからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有する、
請求項4に記載の融合タンパク質。 - 前記突然変異体は、SEQ ID NO:30-49のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1～5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記第1結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む、
請求項1～6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト化抗体からなる群から選ばれる、
請求項7に記載の融合タンパク質。 - 前記抗原結合断片は、Fab、Fab’、F（ab）2、F（ab）2、dAb、散在している相補性決定領域CDR、FvおよびscFvからなる群から選ばれる、
請求項7～8のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記PD-L1は、ヒトPD-L1である、
請求項1～9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体は、SEQ ID NO:4、およびSEQ ID NO:18からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するHCDR1-3を含有する抗体重鎖またはその断片を含む、
請求項7～10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記HCDR2は、SEQ ID NO：5およびSEQ ID NO：19からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項11に記載の融合タンパク質。 - 前記HCDR3は、SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：20からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項11～12のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体重鎖またはその断片は、SEQ ID NO：8およびSEQ ID NO：22からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域VHを含む、
請求項11～13のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体重鎖またはその断片は、IgGを有する重鎖定常領域を含む、
請求項11～14のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記IgGは、IgG1およびIgG4からなる群から選ばれる、
請求項15に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体重鎖は、SEQ ID NO：13およびSEQ ID NO：27からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項11～16のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体は、SEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：15からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するLCDR1-3を含有する抗体軽鎖またはその断片を含む、
請求項6～17のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記LCDR2は、SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：16からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項18に記載の融合タンパク質。 - 前記LCDR3は、SEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：17からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項18～19のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体軽鎖またはその断片は、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO：21からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域VLを含む、
請求項18～20のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体軽鎖またはその断片は、Igκを有する軽鎖定常領域を含む、
請求項18～21のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記抗体軽鎖は、SEQ ID NO：11およびSEQ ID NO：25からなる群のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項18～22のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記第1結合ドメインは、前記第2結合ドメインのN末端に位置する、
請求項1～23のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - さらに、前記第1結合ドメインのC末端かつ前記第2結合ドメインのN末端にあるリンカーを有する、
請求項1～24のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 前記リンカーは、SEQ ID NO:52で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項25に記載の融合タンパク質。 - 少なくとも2つの前記第2結合ドメインを持つ、
請求項1～26のいずれか1項に記載の融合タンパク質。 - 各前記第2結合ドメインは、それぞれ前記第1結合ドメインのC末端に位置する、
請求項27に記載の融合タンパク質。 - 請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質を含む、
免疫複合体。 - 請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項29に記載の免疫複合体をコード化する、
1つまたは複数の単離された核酸分子。 - 請求項30に記載の核酸分子を含む、
1つまたは複数のベクター。 - 請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項30に記載の免疫複合体、または請求項30に記載の核酸分子、および任意選択で薬学的に許容可能な賦形剤を含む、
組成物。 - 請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項29に記載の免疫複合体、請求項30に記載の核酸分子、または請求項31に記載のベクターを含む、
細胞。 - 前記融合タンパク質を発現可能な条件で請求項33に記載の細胞を培養することを含む、
請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質の調製方法。 - 腫瘍の治療のための医薬品の調製における請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項29に記載の免疫複合体、請求項30に記載の核酸分子、請求項31に記載のベクター、請求項32に記載の組成物、または請求項33に記載の細胞の使用。
- 前記腫瘍は、固形腫瘍および非固形腫瘍を含む、
請求項35に記載の使用。 - 前記固形腫瘍および非固形腫瘍は、多発性骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、神経膠腫、胚細胞腫瘍、肉腫、中皮腫、胎盤腫、脳癌、骨癌、皮膚がん、鼻咽頭癌、肺癌、口腔がん、食道がん、胃癌、肝臓がん、膵臓癌、前立腺がん、腸癌、乳がん、子宮頚部癌、卵巣癌および精巣癌、上顎洞癌、下咽頭がん、嗅神経芽細胞腫、舌癌、歯肉癌、膨大部癌、結腸がん、結直腸癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱がん、陰茎癌、卵管癌、眼瞼癌、網膜芽細胞腫を含む、
請求項36に記載の使用。 - 腫瘍を治療するための請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項29に記載の免疫複合体、請求項30に記載の核酸分子、請求項31に記載のベクター、請求項32に記載の組成物、または請求項33に記載の細胞。
- 必要のある被験者に、有効量の請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項29に記載の免疫複合体、請求項30に記載の核酸分子、請求項31に記載のベクター、請求項32に記載の組成物、または請求項33に記載の細胞を投与することを含む、
PD-L1タンパク質とPD-1の相互作用を遮断する方法。 - 必要のある被験者に、有効量の請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項29に記載の免疫複合体、請求項30に記載の核酸分子、請求項31に記載のベクター、請求項32に記載の組成物、または請求項33に記載の細胞を投与することを含む、
CD47タンパク質とSIRPαの相互作用を遮断する方法。 - 必要のある被験者に、有効量の請求項1～28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項29に記載の免疫複合体、請求項30に記載の核酸分子、請求項31に記載のベクター、請求項32に記載の組成物、または請求項33に記載の細胞を投与することを含む、
腫瘍または腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害する方法。
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