KR20210146916A - 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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항저우 섬근 바이오테크 코포레이션, 엘티디.
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Abstract

종양(tumors) 및/또는 자가면역 질환(autoimmune diseases)을 치료하기 위한 융합 단백질, 면역접합체(immunoconjugate), 핵산 분자, 캐리어(carrier), 조성물, 세포 및 이와 관련된 제조방법이 제공된다.

Description

융합 단백질 및 이의 용도
본 출원은 생물의학 분야, 특히 다중특이성(multispecific) 융합 단백질, 및 추가로 종양(tumor) 및/또는 자가면역 질환(autoimmune disease)의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
현재 종양 치료 분야에서는 표적 약물을 투여하는 방법과 면역 요법(immunotherapy)의 두 가지 주요 방법이 있다. 이 두 치료법 사이에 상호 작용이 있을 수 있으며 더 강력한 세포 독성(cytotoxic) 효과를 유발하여 종양을 꾸준하고 지속적으로 완화한다. 그러나 표적 약물 및 면역 요법 사이의 상호 작용은 매우 복잡하고, 전반적인 항종양 효과 및 독성 프로파일(profile)은 종, 투여량, 순서, 투여 형태 등과 같은 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있다.
프로그램화된 사멸 1(Programmed death 1:PD-1) 항체는 면역 요법이다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수성 세포(myeloid cells)에서 발현되며, 이는 두 개의 리간드(ligands), 즉 프로그램화된 사멸 리간드 1(programmed death ligand 1:PD-L1) 및 PD-L2를 갖는다. PD-1 및/또는 PD-L1 억제제는 종양 세포의 PD-L1에 특이적으로 결합하여 항종양 효과(anti-tumor effect)를 달성할 수 있으며, 그러나 임상 반응률(clinical response rate)은 낮고, 폐렴(pneumonia), 대장염(colitis), 간염(hepatitis) 등을 일으키는 부작용이 있을 수 있다.
CD47 단백질은 면역글로불린 슈퍼패밀리(immunoglobulin superfamily)에 속하는 구성원인 막횡단 당단백질(transmembrane glycoprotein)의 일종이다. CD47은 정상 조직 세포에서 발현되는 것 외에도 많은 종양 세포에서 과발현된다. 종양 세포 표면의 CD47은 대식세포 표면의 SIRPα와 결합하여 대식세포에 의한 종양 세포의 식균 작용(phagocytosis)을 방지하는데, 이는 종양이 면역계의 감시를 회피하는 하나의 메커니즘으로 간주된다. CD47 단백질 및 SIRPα 사이의 상호 작용을 차단하면 종양 성장을 억제할 수 있다.
그러나 현재 CD47 단백질 및 SIRPα의 상호 작용을 차단하기 위해 사용되는 시약은 인식 활성이 제한되어 있고 CD47 단백질과의 친화력이 항상 부족하여 종양 억제 능력이 제한되어 있다. 또한, 현재 CD47을 표적으로 하는 항체 약물은 빈혈 반응(anemia responses)이나 혈소판 감소증(thrombocytopenia)과 같은 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서, CD47 단백질과 관련 종양 항원 모두를 특이적으로 표적화하는 효과적인 치료법을 얻는 것이 시급하다.
발명의 요약
본 출원은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인(first binding domain) 및 CD47 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인(second binding domain)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 출원은 또한 상기 융합 단백질을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate); 상기 융합 단백질을 엔코딩(encoding)하는 핵산 분자; 상기 융합 단백질을 포함 및/또는 발현할 수 있는 벡터, 조성물 및 세포; 및 상기 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 본 출원의 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물 및 세포는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: 1) CD47 단백질 및 PD-L1에 동시에 특이적으로 결합할 수 있고; 2) CD47 단백질 및 SIRPα 사이의 상호작용을 특이적으로 차단할 수 있고; 3) PD-1 및 PD-L1 사이의 상호작용을 특이적으로 차단할 수 있고; 4) 종양 또는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.
하나의 면에서, 본 출원은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 CD47 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인; 상기 제2 결합 도메인은 인간 SIRPα 변이체(variant) 1의 돌연변이체(mutant)를 포함하고, 상기 돌연변이체는 서열번호 29로 표시되는 서열과 비교하여 33번 내지 149번째 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기의 치환(substitution), 결실(deletion) 또는 추가(addition)를 포함한다.
일부 실시예에서, 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다: R22, I29, I61, V63, E77, Q82, K83, E84, V93, D95, L96, K98, N100, R107, G109 및 V132.
일부 실시예에서, 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다: (1) I61, V63, E77, E84, V93, L96, K98, N100 및 V132; (2) I61, E77, Q82, K83 및 E84; (3) I61, V63, K83, E84 및 V132; (4) I61, E77, E84, R107 및 V132; (5) I61, V63, E77, K83, E84 및 N100; (6) I61, E77, Q82, K83, E84 및 R107; (7) I61, E77, Q82, E84, V93, L96, N100, R107, G109 및 V132; (8) I61, E77, Q82, K83, E84 및 V132; (9) I61; (10) I61, D95, L96, G109 및 V132; (11) I61, D95, L96, K98, G109 및 V132; (12) I61, E77, E84, V93, R107 및 V132; (13) E77, L96, N100, G109 및 V132; (14) I61, V63, Q82, E84, D95, L96, N100 및 V132; (15) I61, E77, Q82, K83, E84, V93, D95, L96, K98, N100 및 V132; (16) I61, E77, Q82, K83, E84 및 V93; (17) I61, V63, E77, K83, E84, D95, L96, K98 및 N100; (18) I61, V63, E77, K83, D95, L96, K98, N100 및 G109; (19) I61, E77, Q82, E84, V93, D95, L96, K98 및 N100; 및 (20) I61, V63, E77, Q82 및 E84.
일부 실시예에서, 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: R22C, I29L, I61L/V/F, V63I, E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L, Q82S/R/G/N, K83R, E84K/H/D/R/G, V93L/A, D95H/R/E, L96S/T, K98R, N100G/K/D/E, R107N/S, G109R/H 및 V132L/R/I/S.
일부 실시예에서, 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 치환을 포함한다: (1) I61L, V63I, E77I, E84K, V93L, L96S, K98R, N100G 및 V132L; (2) I61V, E77N, Q82S, K83R 및 E84H; (3) I61F, V63I, K83R, E84K 및 V132I; (4) I61L, E77Q, E84D, R107N 및 V132I; (5) I61L, V63I, E77K, K83R, E84D 및 N100G; (6) I61V, E77H, Q82R, K83R, E84H 및 R107S; (7) I61L, E77I, Q82G, E84R, V93L, L96T, N100G, R107S, G109R 및 V132R; (8) I61L, E77M, Q82G, K83R, E84D 및 V132L; (9) I61L; (10) I61F, D95H, L96S, G109H 및 V132S; (11) I61F, D95H, L96S, K98R, G109H 및 V132S; (12) I61L, E77Q, E84D, V93A, R107N 및 V132I; (13) E77K, L96S, N100K, G109H 및 V132L; (14) I61L, V63I, Q82G, E84G, D95R, L96S, N100D 및 V132I; (15) I61L, E77R, Q82N, K83R, E84G, V93L, D95E, L96T, K98R, N100D 및 V132L; (16) I61V, E77N, Q82S, K83R, E84H 및 V93A; (17) I61V, V63I, E77V, K83R, E84D, D95E, L96T, K98R 및 N100E; (18) I61L, V63I, E77V, K83R, D95E, L96S, K98R, N100D 및 G109R; (19) I61V, E77L, Q82G, E84G, V93L, D95E, L96T, K98R 및 N100G; 및 (20) I61L, V63I, E77N, Q82G 및 E84G.
일부 실시예에서, 돌연변이체는 서열번호 30 내지 서열번호 49 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 결합 도메인은 항체 또는 항원 결합 단편 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시예에서, 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택된다: 단일 클론 항체(monoclonal antibody), 단일 사슬 항체(single-chain antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 및 완전 인간 항체(fully human antibody). 일부 실시예에서, 항원 결합 단편은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)2, dAb, 단리된 상보성 결정 영역(isolated complementary determining region) CDR, Fv 및 scFv.
일부 실시예에서, PD-L1은 인간 PD-L1이다.
일부 실시예에서, 항체는 항체의 중쇄(heavy chain) 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 4 및 서열번호 18로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, HCDR2는 서열번호 5 및 서열번호 19로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, HCDR3은 서열번호 6 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region) VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 8 및 서열번호 22로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 불변 영역(heavy chain constant region)을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG를 포함한다. 일부 실시예에서, IgG는 IgG1 및 IgG4로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시예에서, 항체의 중쇄는 서열번호 13 및 서열번호 27로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 항체는 항체의 경쇄(light chain) 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 1 및 서열번호 15로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, LCDR2는 서열번호 2 및 서열번호 16으로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, LCDR3은 서열번호 3 및 서열번호 17로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변 영역(light chain variable region) VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역 VL은 서열번호 7 및 서열번호 21로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 불변 영역(light chain constant region)을 포함하고, 상기 경쇄 불변 영역은 Igκ을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 11 및 서열번호 25로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인의 N-말단(N-terminal)에 위치한다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 추가로 링커(linker)를 포함하고, 상기 링커는 제1 결합 도메인의 C-말단(C-terminal) 및 제2 결합 도메인의 N-말단에 위치한다. 일부 실시예에서, 상기 링커는 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 융합 단백질은 적어도 2개의 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 제2 결합 도메인은 제2 결합 도메인의 C-말단 각각에 위치한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질을 포함하는, 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질 또는 면역접합체를 엔코드(encode)하는, 하나 이상의 단리된 핵산 분자(isolated nucleic acid molecules)를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 핵산 분자를 포함하는, 하나 이상의 벡터(vectors)를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 또는 핵산 분자, 및 선택적으로, 약학적으로(pharmaceutically) 허용되는 부형체(excipients)를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질의 발현이 가능한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 의약의 제조에서 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물, 또는 세포의 용도를 제공하며, 상기 의약은 종양 치료에 사용된다.
일부 실시예에서, 상기 종양은 고형 종양(solid tumor) 및 비-고형 종양(non-solid tumor)을 포함한다.
일부 실시예에서, 고형 종양 및 비-고형 종양은 다발성 골수종(multiple myeloma), 백혈병(leukemia), 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 신경교종(neuroglioma), 생식종(germinoma), 육종(sarcoma), 중피종(mesothelioma), 태반종(placentoma), 뇌종양(cerebral cancer), 골암(bone cancer), 피부암(skin cancer), 비인두암(nasopharynx cancer), 폐암(lung cancer), 구강암(oral cancer), 식도암(esophagus cancer), 위암(gastric cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 장암(intestinal cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 고환암(testicular cancer), 전두동 종양(frontal sinus tumor), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 후각신경아세포종(olfactory neuroblastoma), 혀암(tongue cancer), 치은암(gingival carcinoma), 팽대부암(ampulla carcinoma), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 신장암(kidney cancer), 요관암(ureteral carcinoma), 방광암(bladder cancer), 음경암(penile cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 눈꺼풀암(eyelid cancer), 망막모세포종(retinoblastoma)을 포함한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 종양을 치료하는데 사용되는 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물, 또는 세포를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물, 또는 세포의 유효량(effective amount)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PD-L1 단백질 및 PD-1 사이의 상호작용을 차단하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물, 또는 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD47 단백질 및 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물, 또는 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 또는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물, 또는 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 대상체에서 종양을 예방 또는 치료하는데 사용되는 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물, 또는 세포를 제공한다.
본 출원의 다른 측면 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에 의해 용이하게 생각될 수 있다. 다음의 상세한 설명은 단지 본 출원의 예시적인 실시예를 도시하고 설명한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 출원의 내용은 당업자가 본 출원과 관련된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시예를 변경할 수 있게 한다. 따라서, 본 출원의 첨부된 도면 및 명세서의 설명은 예시일 뿐, 제한적이지 않다.
본 출원과 관련된 특정 특징은 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 출원과 관련된 특징 및 이점은 이하에서 상세히 설명되는 실시예 및 첨부된 도면을 참조하면 더 잘 이해될 것이다. 첨부된 도면을 간략히 설명하면 다음과 같다:
도 1은 본 출원에 따른 융합 단백질의 예시적인 구조를 나타낸다.
도 2 내지 도 3은 본 출원에 따른 PD-L1에 대한 융합 단백질의 결합 능력을 나타낸다.
도 4는 본 출원에 따른 CD47에 대한 융합 단백질의 결합 능력을 나타낸다.
도 5는 본 출원에 따른 PD-L1 및 CD47에 대한 융합 단백질의 결합 능력을 동시에 나타낸다.
도 6은 본 출원의 융합 단백질이 CD47 및 그의 리간드 SIRPα 사이의 결합을 경쟁적으로 차단한다는 것을 보여준다.
도 7 내지 도 8은 본 출원의 융합 단백질이 PD-1 및 PD-L1 사이의 결합을 경쟁적으로 차단한다는 것을 보여준다.
도 9 내지 도 10은 인간 림프종(human lymphoma)의 마우스(mouse) 종양 모델에서 종양 부피의 성장이 본 출원의 융합 단백질의 사용에 의해 억제된다는 것을 보여준다.
본 출원의 구현은 다음의 특정 실시예에서 예시될 것이며, 본 출원의 다른 이점 및 효과는 명세서의 개시로부터 기술에 익숙한 사람들에 의해 용이하게 알 수 있을 것이다.
본 출원에서 용어 "융합 단백질(fusion protein)"은 일반적으로 2개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드의 융합으로부터 수득되는 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 인위적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 엔코딩(encoding)하는 유전자 또는 핵산 분자는 서로 연결되어 융합 단백질을 엔코딩 할 수 있는 융합 유전자 또는 융합된 핵산 분자를 형성할 수 있다. 융합 유전자의 번역은 단일 폴리펩티드를 생성할 수 있으며, 이는 융합 전에 적어도 하나 또는 심지어는 둘 이상의 단백질 또는 폴리펩티드 각각의 특성을 가질수 있다.
본 발명에서, 용어 "특이적으로 결합한다(specifically binds)"는 항체와 상기 항체를 생성하는 항원 사이의 반응과 같이, 두 분자 사이의 비-무작위(non-random) 결합 반응을 의미한다. 특정 항원에 특이적인 하나의 항체는 친화성(affinity)(KD)≤10-5M (예를 들어, 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M 등)으로 항원에 결합하는 것을 의미하며, 여기서 KD는 해리율 대 결합율(dissociation rate to binding rate, koff/kon)의 비율을 말하며, 이는 본 분야의 기술자에게 알려진 방법으로 결정할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "결합 도메인(binding domain)"은 일반적으로 표적(예를 들어, 항원)상의 특정 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합 및/또는 인식할 수 있는 도메인을 의미한다. 본 출원에서, 용어 "도메인(domain)"은 일반적으로 단백질의 서브 유닛 구조에서 명확하게 분리된 밀접한 구형 구조 영역을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬은 먼저 일부 영역에서 인접한 아미노산 잔기로부터 형성된 규칙적인 2차 구조(secondary structure)일 수 있으며, 이어서 인접한 2차 구조 단편을 함께 조립하여 형성된 초-2차 구조(super-secondary structure)일 수도 있고, 이를 기반으로 상기 폴리펩티드 사슬은 거의 구형인 3차 구조(tertiary structure)로 접힐 수 있다. 더 큰 단백질 분자 또는 서브 유닛의 경우, 폴리펩티드 사슬은 종종 공간에서 명확하게 구별될 수 있는 둘 이상의 상대적으로 독립적인 구역 구조의 결합에 의해 형성되는 3차 구조일 수 있으며, 이러한 상대적으로 독립적인 구역 구조는 도메인이라고 불릴 수 있다.
본 출원에서, "제1 결합 도메인(the first binding domain)" 및 "제2 결합 도메인(the second binding domain)"이라는 용어에서 사용되는 "제1(the first)", "제2(the second)"는 본 명세서에서 구별하기 위해서만 사용된다.
본 출원에서, 용어 "CD47 단백질(CD47 protein)"은 일반적으로 면역글로불린 슈퍼패밀리(immunoglobulin superfamily)에 속하는 다중 막횡단 수용체(multiple transmembrane receptor)인 인테그린 관련 단백질(integrin-associated protein:IAP)을 지칭한다. 예를 들어, CD47 단백질은 막 인테그린(membrane integrins)에 결합할 수 있으며, 이들의 리간드인 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1:TSP-1) 및 신호 조절 단백질 알파(signal-regulatory protein alpha:SIRPα)에도 결합할 수 있다. CD47 단백질은 세포막 표면에 광범위하게 발현된다. 본 출원에서, CD47 단백질은 인간 CD47의 임의의 변이체(variants), 이소타입(isotypes) 및 종 상동체(species homologues)를 포함할 수 있다. 인간 CD47 단백질의 아미노산 서열은 GenBank에 CEJ95640.1로 등재되어 있다. CD47 단백질은 세포에 의해 자연적으로 발현되거나 CD47 유전자로 형질감염된(transfected) 세포 상에서 발현될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "SIRPα"는 일반적으로 CD47 단백질의 리간드로 사용될 수 있는 SIRP 패밀리의 조절 막 당단백질(regulatory membrane glycoprotein)을 의미한다. 본 출원에서, SIRPα는 인간 SIRPα, 예를 들어 SIRPα 변이체 1 및 SIRPα 변이체 2를 포함할 수 있다. SIRPα 변이체 2는 13개 아미노산에서 SIRPα 변이체 1과 다르며, 그것의 아미노산 서열은 GenBank에 CAA71403.1로 나열되어 있다. 본 출원에서, "SIRPα 변이체 1"이라는 용어는 일반적으로 아미노산 서열이 NCBI RefSeq NP_542970.1(잔기 31-504가 성숙한 유형을 구성함)로 나열된 SIRPα 단백질을 의미하며, SIRPα 변이체 1의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시된다.
용어 "항체(antibody)"는 일반적으로 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자 단편에 의해 본질적으로 엔코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 면역글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ, δ, ε 및 μ 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 면역글로불린의 수많은 가변 영역 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄는 각각 면역글로불린의 유형을 정의할 수 있는 κ 또는 λ로 분류될 수 있다: Igκ 및 Igλ. 중쇄는 γ, μ, α, δ 또는 ε으로 분류될 수 있으며, 이는 차례로 각각 면역글로불린의 유형을 정의한다: IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE. 예를 들어, 항체는 4량체(tetramers)를 포함하는 구조 단위를 가질 수 있고, 각각의 4량체는 동일한 폴리펩티드 사슬의 두 쌍으로 구성될 수 있으며, 각 쌍은 "경쇄(light chain)"(약 25kD) 및 "중쇄(heavy chain)"(약 50 내지 70 kD), 각 구성의 N-말단(N-terminal)은 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의할 수 있으며, 이는 주로 항원 인식을 담당한다. 예를 들어, 용어 "경쇄 가변 영역(light chain variable region:VL)" 및 "중쇄 가변 영역(heavy chain variable region:VH)"은 일반적으로 각각 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다제(peptidases) 또는 드 노보 발현(de novo expression)을 사용한 소화에 의해 생성된 완전히 특성화된 단편으로 존재할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"은 일반적으로 항체가 결합하는 동일한 항원(예를 들어, PD-L1)에 대한 결합 능력을 실질적으로 유지하는 전장 항체(full-length antibody)의 하나 이상의 부분을 지칭하며, 그리고 그들은 항원에 특이적으로 결합하기 위해 전장 항체와 경쟁할 수 있다. 일반적으로, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., Edition 2, Raven Press, N.Y. (1989), 그 전체 내용이 참조로 여기에 통합되었다. 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술 또는 완전한 항체의 효소적(enzymatic) 또는 화학적 절단(chemical cleavage)을 통해 생성될 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, (Fab)2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(complementary determining region:CDR) 단편, 단일-사슬 항체(single-chain antibody) (예: scFv), 키메라 항체(chimeric antibody), 이량체(diabody) 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 해당 분야의 기술자에게 알려진 기존 기술(예: 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 절단 공정)은 주어진 항체로부터 항체의 항원 결합 단편을 얻기 위해 사용될 수 있고, 완전 항체에 대한 것과 동일한 방식으로 특이성 측면에서 항체의 항원 결합 단편을 스크린(screen)한다. 예를 들어, 펩신(pepsin)은 이황화 결합(disulfide bond) 아래의 힌지 영역(hinge region)에 있는 항체를 소화하여 F(ab')2를 생성할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "Fab"은 일반적으로 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "Fab"은 일반적으로 Fab 단편과 비교하여 CH1 도메인의 카복실 말단(carboxyl terminal)에 몇 개의 추가 잔기가 있는 항체 단편을 지칭한다. 예를 들어, Fab'는 항체의 힌지 영역에서 나오는 하나 이상의 시스테인(cysteine)을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "F(ab)2"는 일반적으로 시스테인과 결합된 쌍을 이룬 Fab 단편으로부터 수득된 항원 결합 단편을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "dAb 단편"은 일반적으로 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다(Ward et al, Nature 341:544-546(1989)).
본 출원에서, 용어 "상보적 결정 영역(omplementary determining regions) CDR"은 일반적으로 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 3개의 초가변 영역(hypervariable regions:HVRs)을 지칭하며, 초가변 영역은 상보적 결정 영역으로도 알려져 있는데, 이러한 영역은 항원 결정인자(antigenic determinants)와 정확한 공간 상보성(spatial complementarity)을 형성할 수 있기 때문이다.
본 출원에서, 용어 "Fv 단편(Fv fragments)"은 일반적으로 항체의 단일 암(single-armed) VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "scFv"는 일반적으로 단쇄 항체로도 알려진 짧은 펩티드 링커(linker)에 의해 연결된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 분자를 의미한다.
본 출원에서, 용어 "단일 클론 항체(monoclonal antibody)"는 일반적으로 실질적으로 상동성인(homologous) 항체 군을 말하며, 이 군에 포함된 다양한 항체는 미량의 자연 발생 돌연변이의 존재 가능성을 제외하고는 동일할 수 있다. 단일 클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 직접적으로 매우 특이적이다. 또한, 결정인자(determinants)(에피토프)에 대해 다른 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 달리, 항원에 대한 단일 결정인자와 관련하여 각 단클론 항체의 변형인 "단일 클론"은 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 단일 클론 항체는 하이브리도마(hybridoma) 기술에 의해 제조될 수 있거나 재조합 DNA 공정에 의해 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 생성될 수 있으며, 예를 들어, Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al., Mol. Biol., 222:581-597(1991)에 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리(phage antibody library)에서도 얻을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 일반적으로 이러한 항체를 지칭하며, 여기서 각 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 일부는 특정 종의 항체에서 상응하는 아미노산 서열과 상동성을 가지거나 특정 범주 및 사슬의 나머지 세그먼트(segments)는 다른 종의 해당 서열과 상동성을 갖는다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 한 동물 종(예: 마우스, 래트(rats) 등)에서 항체의 가변 영역으로부터 유래되는 반면, 불변 부분은 다른 종(예: 인간)의 항체 서열과 상동성을 갖는다. 예를 들어, 키메라 항체를 얻기 위해, 비인간 B 세포 또는 하이브리도마 세포를 활용하여 가변 영역을 생성할 수 있으며, 이들과 결합된 불변 영역은 인간에서 파생된다. 가변 영역은 준비가 용이한 장점이 있으며, 그들의 특이성은 그들과 결합된 불변 영역의 소스에 의해 영향을 받지 않는다. 한편, 키메라 항체의 불변영역은 인간으로부터 유래될 수 있으므로, 키메라 항체는 비인간 유래 불변 영역이 있는 항체를 사용하는 것보다 주사시 면역 반응을 유도할 가능성이 적다.
본 출원에서, 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 일반적으로 항체, 면역글로불린 결합 단백질 및 비인간 종(예: 마우스 또는 래트)에서 유래된 폴리펩티드의 면역원성(immunogenicity)을 인간에게 감소시키고 여전히 원래 항체의 항원 결합 특성을 유지하는 변형된 항체를 지칭한다. 예를 들어, 인간화 항체는 유전 공학 기술에 의해 제조될 수 있고, 비-인간 결합 도메인은 CDR 그라프팅(grafting)((Jones et al., Nature 321:522 (1986)) 및 재형성(reshaping)을 포함한 기술적 수단에 의한 변형(Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), 과키메라화(hyperchimerization)(Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154) 및 베니어링(veneering)(Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies." In: Metcalf B W, Dalton B J, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312)에 의해 인간화될 수 있다. 다른 영역, 예를 들어, 힌지 영역 및 불변 영역 도메인이 또한 비-인간 소스로부터 유래된 경우, 이들 영역도 인간화될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "완전 인간 항체(fully human antibody)"는 일반적으로 항체 유전자가 결실된 유전자 조작 동물에서 인간 항체를 엔코딩하는 유전자를 발현하여 얻은 항체를 의미한다. 예를 들어, 트랜스제닉(transgenic) 또는 트랜스-염색체(trans-chromosomal) 기술을 통해 인간 항체를 엔코딩하는 모든 유전자는 항체 유전자가 결실된 유전자 조작 동물에 전달되어 동물이 인간 항체를 발현할 수 있다.
본 출원에서 언급된 단백질, 폴리펩티드 및/또는 아미노산 서열은 또한 다음 범위를 포함하는 것으로 추가로 이해되어야 한다: 단백질 또는 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 기능을 갖는 변이체 또는 상동체.
본 출원에서, 변이체는 단백질 또는 단백질 및/또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 폴리펩티드 일 수 있다(예: PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편). 예를 들어, 기능적 변이체는 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 10, 추가로 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 기능적 변이체는 변형(예: 치환, 결실 또는 추가) 전 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 특성을 본질적으로 유지할 수 있다. 예를 들어, 기능적 변이체는 변형 전 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 특성의 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상을 유지할 수 있다(예: 항원 결합 능력). 예를 들어, 치환은 보존적 치환일 수 있다.
본 출원에서, 상동체는 단백질 및/또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 85% 이상의(예: 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 이상) 서열 상동성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다(PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편).
본 출원에서, 상동성은 일반적으로 둘 이상의 서열 간의 비교 가능성(comparability), 유사성 또는 관련성을 나타낸다. "서열 상동성 백분율(sequence homology percentage)"은 다음 방법으로 계산할 수 있다: 비교 창에서 비교하고자 하는 두 서열을 비교하여 두 서열에 포함된 동일한 핵산 염기(예: A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예: Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)의 위치 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 구하고, 이를 비교 창의 총 위치 수(즉, 창 크기)로 나눈 다음 100을 곱하여 서열 상동성 백분율을 얻는다. 서열 상동성 백분율을 결정하기 위한 비교는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 달성될 수 있으며, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용한다. 이 분야의 기술자는 비교되는 전장 서열의 범위 또는 표적 서열 영역에서 최대 정렬을 실현하는 데 필요한 모든 알고리즘을 포함하여 서열 정렬(aligning sequences)에 적합한 매개변수(parameters)를 결정할 수 있다. 상동성은 다음과 같은 방법으로도 확인할 수 있다: FASTA 및 BLAST. FASTA 알고리즘에 대한 설명은 Improved Tool for Comparison of Biological Sequences to W. R. Pearson and D. J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 2444-2448, 1988; 및 Fast and Sensitive Protein Comparability Search to D. J. Lipman and W. R. Pearson, Science, 227: 1435-1441, 1989에서 볼 수 있다.
BLAST 알고리즘에 대한 설명은 A Basic Search Tool for Local Alignment to S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D. Lipman, Journal of Molecular Biology, 215: 403-410, 1990에서 볼 수 있다.
본 출원에서, 용어 "PD-L1"은 일반적으로 CD274, B7-H 또는 B7H1로도 알려진 프로그램된 사멸-1(programmed death-1:PD-1) 단백질의 리간드를 지칭한다. PD-1은 특정 리간드(PD-L)와 상호작용하여 T 세포 항원 수용체의 신호전달을 부정적으로 조절한다. PD-L1은 다양한 종양의 예후 지표(prognostic indicator)일 수 있다. 본 출원에서, PD-L1은 인간 PD-L1일 수 있다. GenBank에 있는 인간 PD-L1의 유전자 ID는 29126이다.
본 출원에서, 용어 "PD-1"은 일반적으로 NACP, PARK1 또는 PARK4로도 알려질 수 있는 시누클레인 패밀리(synuclein family)의 구성원을 지칭한다. 본 출원에서, PD1은 인간 PD1일 수 있다. GenBank에 있는 인간 PD-L1의 유전자 ID는 6622이다.
일반적으로 폴리펩티드 사슬에서 아미노기는 폴리펩티드 사슬의 다른 카르복실기(carboxyl group)와 연결되어 하나의 사슬이 되고, 그러나 단백질의 두 말단에서, 각각 펩티드 결합을 형성하지 않는 아미노산 잔기가 남아 있고, 이는 각각 프리(free) 아미노기를 갖는 폴리펩티드 사슬 말단 및 카르복실기를 갖는 폴리펩티드 사슬 말단이다. 본 출원에서, 용어 "N-말단(N-terminal)"은 일반적으로 프리 아미노기를 보유하는 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드 사슬 말단을 지칭한다. 본 출원에서, 용어 "C-말단(C-terminal)"은 일반적으로 프리 카르복실기를 보유하는 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드 사슬 말단을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecules)"는 일반적으로 자연환경으로부터 분리되거나 인공적으로 합성된 임의의 길이의 분리된 형태의 뉴클레오티드(nucleotide), 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 또는 이의 유사체(analogue thereof)를 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "면역접합체(immunoconjugate)"는 일반적으로 하나 이상의 이종 분자(heterogenous molecules)(세포독소(cytotoxin)를 포함하나 이에 제한되지 않음)가 접합된 면역 기능을 갖는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 본 출원에서, "접합체(conjugate)" 및 "연결(link)", "융합(fusion)"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 예를 들어, 화학적 접합 또는 재조합을 포함하는 수단에 의해 둘 이상의 화학 원소, 서열 또는 성분이 함께 연결되는 것을 지칭한다. 이종 분자는 세포독소, 화학요법제(chemotherapeutic agent) 등일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 융합 단백질은 하나 이상의 이종 분자(예를 들어, 세포 독소)와 접합되어 면역접합체를 얻을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "벡터(vector)"는 특정 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)가 삽입되어 단백질이 발현될 수 있는 핵산 전달 비히클(vehicle)을 의미한다. 벡터는 형질전환(transforming), 형질도입(transducing) 또는 형질감염(transfecting)을 통해 그것이 운반하는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현되도록 한다. 예를 들어, 벡터는 다음을 포함한다: 플라스미드(plasmid); 파지미드(phagemid); 코스미드(cosmid); 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome:YAC), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome:BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(P1-derived artificial chromosome:PAC)와 같은 인공 염색체; λ 파지(phage) 또는 M13 파지와 같은 파지; 및 동물 바이러스 등. 벡터로 사용되는 동물 바이러스의 변종은 레트로바이러스(retrovirus)(렌티바이러스(lentivirus) 포함), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus)(예: 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)), 폭스바이러스(poxvirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 유두종 바이러스(papilloma virus), 파포바바이러스(papovavirus)(예: SV40)를 포함한다. 벡터는 프로모터(promoter) 서열, 전사 개시(transcription initiation) 서열, 인핸서(enhancer) 서열, 선택 요소(selection element) 및 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 발현 조절을 위한 다양한 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점(replication origins)을 포함할 수도 있다. 벡터는 또한 비리온(virion), 리포솜(liposome) 또는 단백질 코트(protein coat)와 같이 세포 내로 들어가는 데 도움이 되는 구성요소를 포함할 수 있지만 이러한 물질만이 아니다.
본 출원에서, 용어 "종양(tumor)"은 일반적으로 다양한 종양형성(tumorigenic) 인자의 작용 하에 포유동물의 유기체(예를 들어, 세포 또는 그의 일부)에서 국소 조직구(local histocytes)의 증식으로부터 형성된 신생물(neoplasms)을 지칭한다. 본 출원에서, 종양은 고형(solid) 종양 및 비-고형(non-solid) 종양을 포함할 수 있다. 고형 종양은 신경교종(neuroglioma), 생식세포종(germinoma), 육종(sarcoma), 중피종(mesothelioma), 태반(placentoma), 뇌암(cerebral cancer), 골암(bone cancer), 피부암(skin cancer), 비인두암(nasopharynx cancer), 폐암(lung cancer), 구강암(oral cancer), 식도암(esophagus cancer), 위암(gastric cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 장암(intestinal cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 고환암(testicular cancer)을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 비고형 종양은 다발성 골수종(multiple myeloma), 백혈병(leukemia), 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma)을 포함할 수 있다.
본 출원에서, "포함하다(comprise)"라는 용어는 일반적으로 명확하게 지정된 기능을 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는 것을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 일반적으로 특정 값보다 0.5% 내지 10% 초과 또는 미만의 범위의 변화, 예를 들어 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10% 초과 또는 지정된 값 미만의 범위를 의미한다.
융합 단백질
하나의 면에서, 본 출원은 융합 단백질을 제공하며, 상기 융합 단백질은 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다. 제1 결합 도메인은 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고; 제2 결합 도메인은 CD47 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 제2 결합 도메인은 인간 SIRPα 변이체 1의 돌연변이체를 포함할 수 있고, 상기 돌연변이체는 서열번호 29로 표시되는 서열과 비교하여 33번 내지 149번째 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다(예: 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10 또는 그 이상). 본 출원의 융합 단백질은 종양 관련 항원 및 CD47 단백질 모두에 특이적으로 결합할 수 있어 종양 및/또는 자가면역 질환의 치료에 역할을 한다.
본 출원에서, 용어 "제1 결합 도메인"은 일반적으로 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 지칭한다. 용어 "제2 결합 도메인"은 일반적으로 CD47 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 지칭한다.
CD47에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인
본 출원에서, 돌연변이체(예: CD47 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 SIRPα 변이체 1의 돌연변이)는 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의(예: 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10 또는 그 이상) 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다: R22, I29, I61, V63, E77, Q82, K83, E84, V93, D95, L96, K98, N100, R107, G109 및 V132.
본 출원에서, 아미노산 치환에 있어서의 아미노산 잔기의 위치는 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열에 기초하여 결정된 잔기의 수를 의미한다.
본 출원에서, "아미노산 치환 Xn"은 서열번호 29로 표시된 바에 상응하는 아미노산 서열에서 부위 n의 잔기 X에서 아미노산 치환이 일어나는 것을 의미하고, 여기서 n은 양의 정수이며, X는 하나의 아미노산 잔기의 약어이다. 예를 들어, "아미노산 치환 I61"은 서열번호 29로 표시된 바에 상응하는 아미노산 서열의 61번 부위의 잔기 I에서 아미노산 치환이 일어난다는 것을 나타낸다.
본 출원에서, 아미노산 치환은 비보존적(nonconservative) 치환일 수 있다. 비보존적 치환은 비보존적 형태의 표적 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 변화시키는 것을 포함할 수 있고, 예를 들어, 특정 측쇄(side chains) 크기 또는 특정 특성(예: 친수성)을 갖는 아미노산 잔기를 상이한 측쇄 크기 또는 상이한 특성(예: 소수성)을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 변경하는 것을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 아미노산 치환은 또한 보존적(conservative) 치환일 수 있다. 보존적 치환은 보존적 형태의 표적 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 변화시키는 것을 포함할 수 있고, 예를 들어, 특정 측쇄 크기 또는 특정 특성(예: 친수성)을 갖는 아미노산 잔기를 동일하거나 유사한 측쇄 크기 또는 동일하거나 유사한 특성(예: 여전히 친수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 변경하는 것을 포함한다. 이러한 보존적 치환은 일반적으로 생성된 단백질의 구조 또는 기능에 크게 영향을 미치지 않는다. 본 출원에서, 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체 또는 이의 단편은 단백질의 구조 또는 기능을 유의하게 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다(예: CD47을 차단하고 CD47 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 SIRPα 변이체 1의 돌연변이).
예를 들어, 다음 그룹의 각 그룹에서 다양한 아미노산의 상호 치환은 본 출원에서 보존적 치환으로 간주될 수 있다: 비극성 측쇄가 있는 아미노산 그룹: 알라닌(alanine), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine); 극성 측쇄가 있는 전하를 띠지 않는 아미노산 그룹: 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 티로신(tyrosine), 아스파라긴(asparagine) 및 글루타민(glutamine); 극성 측쇄가 있는 음전하를 띤 아미노산 그룹: 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid); 양전하를 띤 염기성 아미노산: 라이신(lysine), 아르기닌(arginine) 및 히스티딘(histidine); 및 페닐기를 갖는 아미노산: 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 티로신(tyrosine).
본 출원에서, 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다: (1) I61, V63, E77, E84, V93, L96, K98, N100 및 V132; (2) I61, E77, Q82, K83 및 E84; (3) I61, V63, K83, E84 및 V132; (4) I61, E77, E84, R107 및 V132; (5) I61, V63, E77, K83, E84 및 N100; (6) I61, E77, Q82, K83, E84 및 R107; (7) I61, E77, Q82, E84, V93, L96, N100, R107, G109 및 V132; (8) I61, E77, Q82, K83, E84 및 V132; (9) I61; (10) I61, D95, L96, G109 및 V132; (11) I61, D95, L96, K98, G109 및 V132; (12) I61, E77, E84, V93, R107 및 V132; (13) E77, L96, N100, G109 및 V132; (14) I61, V63, Q82, E84, D95, L96, N100 및 V132; (15) I61, E77, Q82, K83, E84, V93, D95, L96, K98, N100 및 V132; (16) I61, E77, Q82, K83, E84 및 V93; (17) I61, V63, E77, K83, E84, D95, L96, K98 및 N100; (18) I61, V63, E77, K83, D95, L96, K98, N100 및 G109; (19) I61, E77, Q82, E84, V93, D95, L96, K98 및 N100; 및 (20) I61, V63, E77, Q82 및 E84.
본 출원에서, 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의(예: 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10 또는 그 이상) 아미노산 치환을 포함할 수 있다: R22C, I29L, I61L/V/F, V63I, E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L, Q82S/R/G/N, K83R, E84K/H/D/R/G, V93L/A, D95H/R/E, L96S/T, K98R, N100G/K/D/E, R107N/S, G109R/H 및 V132L/R/I/S.
본 출원에서, 아미노산 치환 "XnY/Z"는 서열번호 29로 표시되는 바에 상응하는 아미노산 서열에서 n번째의 잔기 X가 아미노산 잔기 Y 또는 아미노산 잔기 Z로 치환됨을 의미하고, 여기서 n은 양의 정수이고, X, Y 및 Z는 독립적으로 아미노산 잔기의 약어이며 X는 Y 또는 Z와 다르다. 예를 들어, 아미노산 치환 "I61L/V/F"는 서열번호 29로 표시되는 바에 상응하는 아미노산 서열에서 부위 61의 잔기 I이 아미노산 잔기 L, V 또는 F에 의해 치환됨을 의미한다.
본 출원에서, 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 치환을 포함할 수 있다: (1) I61L, V63I, E77I, E84K, V93L, L96S, K98R, N100G 및 V132L; (2) I61V, E77N, Q82S, K83R 및 E84H; (3) I61F, V63I, K83R, E84K 및 V132I; (4) I61L, E77Q, E84D, R107N 및 V132I; (5) I61L, V63I, E77K, K83R, E84D 및 N100G; (6) I61V, E77H, Q82R, K83R, E84H 및 R107S; (7) I61L, E77I, Q82G, E84R, V93L, L96T, N100G, R107S, G109R 및 V132R; (8) I61L, E77M, Q82G, K83R, E84D 및 V132L; (9) I61L; (10) I61F, D95H, L96S, G109H 및 V132S; (11) I61F, D95H, L96S, K98R, G109H 및 V132S; (12) I61L, E77Q, E84D, V93A, R107N 및 V132I; (13) E77K, L96S, N100K, G109H 및 V132L; (14) I61L, V63I, Q82G, E84G, D95R, L96S, N100D 및 V132I; (15) I61L, E77R, Q82N, K83R, E84G, V93L, D95E, L96T, K98R, N100D 및 V132L; (16) I61V, E77N, Q82S, K83R, E84H 및 V93A; (17) I61V, V63I, E77V, K83R, E84D, D95E, L96T, K98R 및 N100E; (18) I61L, V63I, E77V, K83R, D95E, L96S, K98R, N100D 및 G109R; (19) I61V, E77L, Q82G, E84G, V93L, D95E, L96T, K98R 및 N100G; 및 (20) I61L, V63I, E77N, Q82G 및 E84G.
본 출원에서, 인간 SIRPα 변이체 1(서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열, 즉, 인간 SIRPα의 아미노산 서열에서 33번째 내지 149번째 부위의 잔기)에 기초하여, 상기 군 (1) 내지 (20)의 아미노산 치환을 포함하는 SIRPα 변이체 1의 돌연변이체는 각각 연속적으로 M1, M5, M12, M35, M37, M41, M57, M67, M81, M82, M84, M91, M99, M102, M111, M122, M126, M130, M135 및 M145로 명명된다. SIRPα 변이체 1의 돌연변이체는 서열번호 30 내지 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 연속적으로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, SIRPα 변이체 1의 돌연변이체는 M91이고, SIRPα 변이체 1의 돌연변이체는 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인
본 출원에서, 제1 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다: 단일클론 항체(monoclonal antibody), 단일 사슬 항체(single-chain antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 및 완전 인간 항체(fully human antibody). 예를 들어, 항원 결합 단편은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: Fab, Fab', (Fab')2, F(ab)2, dAb, 단리된 상보적 결정 영역 CDR, Fv 및 scFv.
본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합함으로써 종양 세포를 사멸시키고/시키거나 종양 성장을 억제할 수 있다. 예를 들어, 종양은 PD-L1 양성 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, PD-L1 양성 종양은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 폐암(lung cancer), 두경부 종양(head and neck tumor), 흑색종(melanoma), 신경교종(glioma), 림프상피종(lymphoepithelioma), 식도암(esophagus cancer) 또는 결장직장암(colorectal cancer). 본 출원에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 위암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 두경부 종양, 흑색종, 신경교종, 림프상피종, 식도암을 죽일 수 있고, 또는 결장직장암 세포 또는 위암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 두경부 종양, 흑색종, 신경교종, 림프상피종, 식도암 또는 결장직장암 세포의 성장을 억제한다.
본 출원의 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질 또는 그의 기능적 단편일 수 있다. 예를 들어, PD-L1 단백질은 마우스 PD-L1 단백질이 아닐 수 있거나 래트 PD-L1 단백질이 아닐 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 PD-L1 단백질 또는 래트 PD-L1 단백질에 실질적으로 결합하지 않는다.
본 출원에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PD-L1 단백질에 결합하기 위해 레퍼런스 항체(reference antibody)와 경쟁할 수 있다. 레퍼런스 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체의 경쇄 가변 영역은 LCDR1 내지 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 서열번호 1 및 서열번호 15로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 LCDR2는 서열번호 2 및 서열번호 16으로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 LCDR3은 서열번호 3 및 서열번호 17로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 레퍼런스 항체의 중쇄 가변 영역은 HCDR1 내지 HCDR3을 포함할 수 있으며, 상기 HCDR1은 서열번호 4 및 서열번호 18로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 상기 HCDR2는 서열번호 5 및 서열번호 19로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 및 상기 HCDR3은 서열번호 6 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 레퍼런스 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7 및 서열번호 21로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 레퍼런스 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8 및 서열번호 22로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 예로, 레퍼런스 항체의 경쇄는 서열번호 11 및 서열번호 25로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 및 레퍼런스 항체의 중쇄는 서열번호 13 및 서열번호 27로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체의 경쇄는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 레퍼런스 항체의 중쇄는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼런스 항체의 경쇄는 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 및 레퍼런스 항체의 중쇄는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 단편의 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편의 경쇄는 Igκ 불변 영역을 포함할 수 있고, 예를 들어, 이는 인간 Igκ 불변 영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항체 또는 이의 단편의 경쇄는 LCDR1를 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR2를 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 예로, 항체 또는 이의 단편의 경쇄는 LCDR1을 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR2를 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변영역 VL을 포함할 수 있고, 경쇄 가변 영역 VL의 아미노산 서열은 서열번호 7일 수 있다. 일부 실시예에서, 항체 또는 이의 단편의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 11일 수 있다. 추가적인 예에서, 경쇄 가변 영역 VL의 아미노산 서열은 서열번호 21일 수 있다. 일부 실시예에서, 항체 또는 이의 단편의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 25일 수 있다.
본 출원에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체의 중쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 인간 불변 영역을 추가로 포함한다. 상기, 인간 불변 영역은 인간 IgG 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기, IgG 불변영역은 인간 IgG1 불변영역 또는 IgG4를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 예에서, 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR2를 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR3을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체의 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역 VH를 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 항체의 중쇄는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 예에서, 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 항체의 중쇄는 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 11을 포함하고; 및 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 13을 포함하고; 또한 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 25를 포함하고; 및 그의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 27을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 1을 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 3을 포함할 수 있고; 및 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함할 수 있고; 또한 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 5를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 6을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 SG1201 또는 항체 SG1201에서와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원의 항체의 경쇄 또는 그의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7을 포함할 수 있고; 그의 중쇄는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 8을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 SG1201 또는 항체 SG1201에서와 동일한 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 SG1201을 포함하거나 항체 SG1201에 있는 것과 동일한 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 출원의 항체는 SG1201일 수 있다. 항체 SG1201에서 LCDR1 내지 LCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되고; VL의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고; 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시되고; HCDR1 내지 HCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되고; VH의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고; 및 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
일부 실시예에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 LCDR1의 아미노산 서열은 서열 번호 15를 포함할 수 있고; LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 16을 포함할 수 있고; LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 17을 포함할 수 있고; 및 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 18을 포함할 수 있고; HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 19를 포함할 수 있고; HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 20을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 SG1202 또는 항체 SG1202에서와 동일한 LCDR1 내지 LCDR3 및 HCDR1 내지 HCDR3을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원에서 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21을 포함할 수 있다; 및 그의 중쇄는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 22를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항체 SG1202 또는 항체 SG1202에서와 동일한 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되고 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시된다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 SG1202를 포함하거나 항체 SG1202에서와 동일한 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 본 출원의 항체는 SG1202일 수 있다. 항체 SG1202의 LCDR1 내지 LCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 표시되고; VL의 아미노산 서열은 서열번호 21로 표시되고; HCDR1 내지 HCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되고; VH의 아미노산 서열은 서열번호 22로 표시되고; 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되고; 및 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시된다.
본 출원에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 SG1201 및/또는 SG1202의 경쇄 및/또는 중쇄의 아미노산 서열에서 하나 이상의 무작위 돌연변이(예를 들어, 하나 이상, 예를 들어 하나 또는 여러 개의 아미노산 치환)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SG1201 및/또는 SG1202의 경쇄 가변 영역에서 프레임워크(framework) 영역 L-FR1-4의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 무작위 돌연변이(예를 들어, 하나 이상, 예를 들어 하나 또는 여러 개의 아미노산 치환)를 포함할 수 있고, 및/또는 SG1201 및/또는 SG1202의 중쇄 가변 영역에서 프레임워크 영역 H-FR1-4의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 무작위 돌연변이(예를 들어, 하나 이상, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환)를 포함한다.
제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이의 연결
본 출원에서, 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인의 N-말단에 위치할 수 있다. 예를 들어, 제1 결합 도메인의 C-말단은 링커(linker)를 통해 간접적으로 제2 결합 도메인의 N-말단에 연결될 수 있다. 일부 예에서, 제1 결합 도메인의 C-말단은 또한 제2 결합 도메인의 N-말단에 직접(예를 들어, 인-프레임(in-frame)) 연결될 수 있다.
본 출원에서, 융합 단백질은 또한 링커를 포함할 수 있고, 상기 링커는 제1 결합 도메인의 C-말단에 위치할 수 있고 제2 결합 도메인의 N-말단에 위치할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질에서, 제1 결합 도메인의 C-말단은 링커의 N-말단에 연결될 수 있고, 링커의 C-말단은 제2 결합 도메인의 N-말단에 연결될 수 있다. 예를 들어, 제1 결합 도메인, 링커 및 제2 결합 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 연속적으로 융합 단백질에 포함될 수 있다.
본 출원에서, 링커는 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 융합 단백질은 적어도 2개의(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 그 이상) 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 각각의 제2 결합 도메인은 제1 결합 도메인의 C-말단에 각각 위치할 수 있다. 본 출원에서, 2개 이상의 제2 결합 도메인은 제1 결합 도메인의 C-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
본 출원에서, 융합 단백질은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 및 CD47 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함할 수 있고, 상기 제2 결합 도메인은 인간 SIRPα 변이체 1의 돌연변이체를 포함할 수 있고, PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체의 C-말단 또는 그의 항원-결합 단편 또는 변이체는 인간 SIRPα 변이체 1의 돌연변이체의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 제2 결합 도메인은 인간 SIRPα 변이체 1의 적어도 2개의 돌연변이체를 포함할 수 있고, 인간 SIRPα 변이체 1의 두 돌연변이체의 N-말단은 각각 PD-L1 또는 항원-결합 단편 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합하는 항체의 C-말단에 연결된다.
예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 융합 단백질(SG12473)의 제1 결합 도메인은 SG1201을 포함할 수 있고, 그의 제2 결합 도메인은 SIRPα 변이체 1의 2개의 돌연변이체 M91을 포함할 수 있고, 사용된 링커 1의 서열은 서열번호 52로 표시되어 있고, 두 M91의 N-말단은 각각 링커 1을 통해 SG1201의 두 중쇄의 C-말단에 연결된다. 융합 단백질에서, M91은 SG1201의 중쇄의 C-말단에 연결되어 두 번째 폴리펩티드 사슬을 얻고, SG1201의 경쇄는 첫 번째 폴리펩티드 사슬로 명명될 수 있다. SG12473의 두 번째 폴리펩티드 사슬 및 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 각각 서열번호 53 및 서열번호 11로 표시되어 있다.
예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 융합 단백질(SG12474)의 제1 결합 도메인은 SG1202를 포함할 수 있고, 그의 두 번째 결합 도메인은 SIRPα 변이체 1의 2개의 돌연변이체 M91을 포함할 수 있고, 사용된 링커 1의 서열은 서열번호 52로 표시되며, 두 M91의 N-말단은 각각 링커 1을 통해 SG1202의 두 중쇄의 C-말단에 연결된다. 융합 단백질에서, M91은 SG1202의 중쇄의 C-말단에 연결되어 두 번째 폴리펩티드 사슬을 얻고, SG1202의 경쇄는 첫 번째 폴리펩티드 사슬로 명명될 수 있다. SG12474의 두 번째 폴리펩티드 사슬 및 첫 번째 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 각각 서열번호 54 및 서열번호 25로 표시되어 있다.
핵산 분자, 벡터 및 세포 뿐만 아니라 제조 방법
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질 또는 면역접합체를 엔코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 핵산 분자의 각각의 핵산 분자는 전체 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 엔코딩할 수 있으며, 또한 이의 일부(예: HCDR1 내지 HCDR3, LCDR1 내지 LCDR3, VL, VH, 경쇄 또는 중쇄)를 엔코딩할 수 있다.
본 출원의 핵산 분자는 분리될 수 있다. 예를 들어, 이들은 다음의 과정에 의해 생성 또는 합성될 수 있다: (i) 시험관내 증폭(amplification), 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction:PCR)을 통한 증폭에 의해 생성, (ii) 클로닝 재조합에 의해 생성, (iii) 정제됨, 예를 들어 효소 소화 및 겔 전기영동에 의해 분획화됨 또는, (iv) 합성됨, 예를 들어 화학적 합성을 통해 합성됨. 일부 싱시예에서, 단리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 핵산 분자이다.
재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989)(Maniatis) and by T. J. Silhavy, M. L. Bennan and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) as well as by Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience(1987)에 기재되어 있다. 간단히 말해서, 핵산은 게놈 DNA 단편, cDNA 및 RNA로부터 제조될 수 있으며, 이러한 모든 핵산은 세포에서 직접 추출되거나 다양한 증폭 방법(PCR 및 RT-PCR를 포함하나 이에 제한되지 않음)을 통해 재조합에 의해 생성될 수 있다.
핵산의 직접적인 화학적 합성은 일반적으로 성장하는 뉴클레오티드 중합체 사슬의 말단 5'-하이드록실에 3'-캡(3'-capped) 및 5'-캡(5'-capped) 뉴클레오티드 단량체를 순차적으로 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 첨가는 첨가된 단량체의 3'-위치에서 성장 사슬의 말단 5'-하이드록실을 친핵성 공격함으로써 실현되며, 상기 단량체는 일반적으로 포스포트리에스테르(phosphotriester), 포스포라미다이트(phosphoramidite) 등과 같은 인 유도체(phosphorus derivatives)이다, 예를 들어, Matteuci et al, Tet. Lett. 521:719 (1980); Caruthers et al.의 미국등록특허 No. 4,500,707; 및 Southern et al.의 미국등록특허 Nos. 5,436,327 및 5,700,637. 또 다른 면에서, 본 출원은 본 출원의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 임의의 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등일 수 있다. 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 벡터는 발현 벡터, 예를 들어 파지 디스플레이 벡터(phage display vector)이다.
또 다른 면에서, 본 출원은 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다. 예를 들어, 벡터는 본 출원의 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 각 벡터는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 적절한 숙주 세포 및 적절한 조건하에서 벡터를 선택할 수 있게 하는 마커 유전자와 같은 다른 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 적절한 숙주에서 코딩 영역의 정확한 발현을 허용하는 발현 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 이들은 유전자 전사 또는 mRNA 번역 등을 조절하기 위한 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 기타 조절 요소 등을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 발현 조절 서열은 조정 가능한 요소(tunable elements)이다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 세포 유형의 종 또는 기능에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 전사 및 번역 개시에 각각 관여하는 5'-비전사 서열(5'-non-transcribed sequences) 및 5' 및 3'-비번역 서열(5' and 3'-non-translated sequences), 예를 들어 TATA 카세트(TATA cassettes), 캡핑된 서열(capped sequences), CAAT 서열 등을 포함한다. 예를 들어, 5'-비전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사하고 조절하기 위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 인핸서 서열 또는 업스트림 활성제 서열(upstream activator sequence)을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에서, 적합한 프로모터는 예를 들어 SP6, T3 및 T7 폴리머라제(polymerases), 인간 U6RNA 프로모터, CMV 프로모터 및 인공 하이브리드(hybrid) 프로모터(예: CMV)에 대한 프로모터를 포함할 수 있으며, 여기서 프로모터의 특정 부분은 다른 세포 단백질(예를 들어, 인간 GAPDH, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase))의 유전자 프로모터의 특정 부분과 융합될 수 있고, 추가 인트론(intron)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 출원의 하나 이상의 핵산 분자는 발현 조절 요소와 작동 가능하게 연결될 수 있다.
벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지 또는 예를 들어 유전 공학에서 일반적으로 사용되는 다른 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
벡터는 또한 발현 후 다른 방식으로 벡터를 운반하는 숙주 세포를 선택하거나 확인하는 데 사용할 수 있는 하나 이상의 표현형 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 진핵 세포에 적합한 선택적 마커의 비제한적인 예는 디하이드로폴레이트 환원 효소(dihydrofolate reductase) 및 네오마이신 내성(neomycin resistance)을 포함한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 숙주 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 다음과 같은 다양한 세포 유형을 포함할 수 있다: Escherichia coli 또는 Bacillus subtilis와 같은 원핵 세포, 효모 세포 또는 Aspergillus와 같은 진균 세포, S2 Drosophila 세포 또는 Sf9와 같은 곤충 세포, 또는 섬유 아세포와 같은 동물 세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포.
예를 들어, 벡터는 다양한 확립된 기술을 통해 안정적으로 또는 일시적으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 벡터가 칼슘 침전(calcium precipitation)을 통해 도입되는 염화칼슘(calcium chloride) 처리를 포함한다. 인산 칼슘(calcium phosphate)과 같은 유사한 방법에 따라 다른 염도 사용할 수 있다. 또한, 전기 천공법(electroporation)(즉, 핵산에 대한 세포의 투과성을 높이기 위해 전류를 적용)을 사용할 수 있다. 형질 전환(transformation) 방법의 다른 예는 미세 주입(microinjection), DEAE 덱스트란 매개(DEAE dextran-mediated) 형질 전환 및 리튬 아세테이트(lithium acetate) 존재하의 열 충격(heat shock)을 포함한다. 지질 복합체(Lipid complexes), 리포솜(liposomes) 및 덴드리머(dendrimers)를 사용하여 숙주 세포를 형질 주입(transfect)시킬 수도 있다.
이종 서열(heterogenous)이 숙주 세포에 도입되는 경우, 벡터가 도입된 숙주 세포를 확인하기 위해 다양한 방법이 적용될 수 있다. 하나의 예시적인 선택 방법은 단일 세포를 계대배양(subculturing)하여 단일 콜로니를 형성한 다음 원하는 단백질 생성물의 발현을 테스트하는 것을 포함한다. 또 다른 방법은 벡터 내에 포함된 선택적 마커 유전자의 발현에 의해 부여된 표현형 특성에 기반한 이종 서열을 포함하는 숙주 세포의 선택을 필요로 한다.
예를 들어, 본 발명의 다양한 이종 서열의 숙주 세포로의 도입은 PCR, 서던 블롯(Southern blotting) 또는 노던 블롯 혼성화(Northern blotting hybridization)와 같은 다음 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 수득된 숙주 세포로부터 핵산을 제조할 수 있고, 특정 표적 서열은 표적 서열에 특이적인 프라이머(primers)를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 증폭된 생성물은 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis), 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 거친 다음에 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), SYBR Green 용액 등으로 염색하거나 UV 검출을 통해 DNA를 검출한다. 대안적으로, 표적 서열에 특이적인 핵산 프로브(probes)를 혼성화 반응에 사용할 수 있다. 특정 유전자 서열의 발현은 PCR 또는 노던 블롯과의 혼성화 또는 엔코딩된 유전자 산물과 반응하는 항체의 면역 분석을 사용하여 상응하는 mRNA의 역전사(reverse transcription) 검출에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 면역 분석(immunoassays)은 ELISA, 방사성 면역 분석(radioimmunoassay) 및 샌드위치 면역 분석(sandwich immunoassay)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 다양한 이종 서열의 숙주 세포로의 도입은 이종 서열로 엔코딩된 효소(예를 들어, 효소 마커)의 효소 활성에 의해 확인할 수 있다. 효소는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 효소 활성은 생성물의 형성 또는 조사중인 효소 반응의 기질의 변형에 의해 결정될 수 있다. 반응은 시험관내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 수행될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질의 발현이 가능한 조건에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 적절한 배양 배지, 적절한 온도 및 배양 시간이 사용될 수 있으며, 이러한 모든 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 예에서, 방법은 융합 단백질을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 융합 단백질은 단백질 G-아가로스(protein G-agarose) 또는 단백질 A-아가로스(protein A-agarose)를 사용하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 또는 겔 전기영동 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에 의해 정제 및 분리될 수 있다.
면역접합체, 조성물 및 적용
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질을 포함하는 면역접합체를 제공한다. 예를 들어, 면역접합체는 융합 단백질-약물 접합체(fusion protein-drug conjugate:ADC)일 수 있고, 본 출원의 융합 단백질은 하나 이상의 치료제와 접합되고, 상기 치료제는 세포독성제(cytotoxic agents), 방사성독성제(radiotoxic agents)(예를 들어, 방사성 동위원소(radioisotopes)) 및/또는 면역 억제제(immune inhibitors)(예를 들어, 면역 반응을 억제함으로써 세포를 죽이는 임의의 제제) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 치료제는 종양 관련 질병 또는 장애를 치료할 수 있는 것일 수 있다.
접합은 펩티드 링커(예를 들어, 절단 가능한 링커)에 의해 또는 다른 방식을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 링커는 산 불안정성 링커(acid labile linker), 펩티다제 민감성 링커(peptidase sensitive linker), 광불안정성 링커(photolabile linker) 등일 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 또는 핵산 분자, 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 완충제(buffering agents), 항산화제(antioxidants), 보존제(preservatives), 저분자량 폴리펩티드(low molecular weight polypeptides), 단백질, 친수성 중합체(hydrophilic polymers), 아미노산, 당, 킬레이트제(chelating agents), 반대 이온(counter ions), 금속 착물(metal complexes) 및/또는 비이온성 계면활성제(nonionic surfactants) 등을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 조성물은 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Edition 19, Gennaro ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995에 개시된 기술에 따라 이 분야의 통상적인 기술적 수단에 의해 약학적으로 허용되는 캐리어(carriers) 또는 희석제(diluents) 및 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
본 출원에서, 상기 조성물은 경구 투여(oral administration), 정맥 내 투여(intravenous administration), 근육 내 투여(intramuscular administration), 종양 부위에서의 원위치 투여(in situ administration at tumor sites), 흡입(inhalation), 직장 투여(rectal administration), 질 투여(vaginal administration), 경피 투여(transdermal administration) 또는 피하 저장소(subcutaneous reservoir)에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
예를 들어, 조성물은 종양 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 조성물은 질병의 발달 또는 진행을 억제 또는 지연시키고, 종양의 크기를 감소시키고(심지어 본질적으로 종양을 제거함), 및/또는 질병의 상태를 완화 및/또는 안정화시킬 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 조성물은 타블렛(tablets), 캡슐, 알약, 분말, 서방성 제제(sustained release preparations), 용액, 현탁액(suspensions)과 같은 경구 투여; 또는 멸균 용액, 현탁액 또는 에멀젼(emulsions)과 같은 비경구 주사(parenteral injection); 또는 연고(ointment) 또는 크림(cream)으로 국소(local) 투여를 위해; 또는 좌약(suppositories)으로 직장 투여를 위해 적합한 형태일 수 있다. 조성물은 정확한 투여량에서 단일 투여량에 적합한 단위 투여량 형태일 수 있다. 조성물은 통상적인 약물 캐리어 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 다른 약물 또는 제제, 캐리어, 보조제 등을 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 치료학적 유효량(therapeutically effective amount)의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 치료학적 유효량은 질병 또는 장애(예를 들어, 종양) 및/또는 이들 질병 또는 장애로 고통받거나 위험에 처한 대상체에서 질병 또는 장애(예: 종양) 및/또는 이의 임의의 합병증을 예방 및/또는 치료(적어도 부분적으로 치료)하는 데 필요한 투여량이다. 투여량의 구체적인 양/농도는 투여 방법 및 환자의 요구에 따라 변경될 수 있으며, 예를 들어 환자의 크기, 점도(viscosity) 및/또는 체중에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여량은 약 0.1mg 또는 1mg/kg/일 내지 약 50mg/kg/일 수 있고; 때로는 복용량이 더 높을 수 있다. 이들 특정 투여량은 특정 환자, 제제 및/또는 질병의 상태에 기초하여 당업자(예를 들어, 의사 또는 약사)에 의해 편리하게 조정될 수 있음을 이해해야 한다.
본 출원에서, 용어 "치료(treating)" 또는 "curing(치유)" 또는 "완화(relieving)" 또는 "개선(improving)"은 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 유익하거나 원하는 결과(치료학적 혜택 및/또는 예방적 혜택을 포함하되, 이에 제한되지 않음)를 얻을 수 있는 방법을 지칭한다. 본 출원에서, 치료적 이점은 일반적으로 치료되는 기저 상태(underlying conditions)의 심각도(severity)를 근절 또는 감소시키는 것을 지칭한다. 또한, 치료적 이점은 피험자의 개선을 관찰하기 위해 기저 상태의 심각성을 근절 또는 감소시키거나 기저 상태와 관련된 하나 이상의 신체적 증상의 발생을 감소시킴으로써 실현된다(피험자는 여전히 기저 상태로 고통받을 수 있음). 예방 이점과 관련하여, 조성물은 특정 질병이 발병할 위험이 있는 대상체 또는 보고된 질병의 하나 이상의 신체 증상이 있는 대상체에게, 질병이 진단되지 않았을 수 있는 경우에도 투여될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 의약이 종양 치료에 사용될 수 있는 의약 제조에서의 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물 또는 세포의 용도를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원의 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물 또는 세포는 종양 치료에 사용될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 본 출원의 조성물 또는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 본 출원의 융합 단백질 또는 조성물을 투여(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체 또는 세포 또는 생물학적 샘플에 투여)하는 단계를 포함하는, CD47 단백질과 SIRPα 사이의 상호작용을 차단하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질 또는 본 출원의 조성물을 투여(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체 또는 세포 또는 생물학적 샘플에 투여)하는 단계를 포함하는, PD-L1과 PD1 간의 상호작용을 차단하는 방법을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질 또는 본 출원의 조성물을 종양 또는 종양 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 또는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 접촉은 시험관 내일 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물 또는 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 또는 종양 세포의 성장 및/또는 증식을 억제할 수 있는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 종양은 고형 종양 및 비-고형 종양을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 고형 종양 및 비-고형 종양은 다발성 골수종, 백혈병, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 신경교종, 생식종, 육종, 중피종, 태반종, 뇌종양, 골암, 피부암, 비인두암, 폐암, 구강암, 식도암, 위암, 간암, 췌장암, 전립선암, 장암, 유방암, 자궁경부암, 난소암 및 고환암, 전두동 종양, 하인두암, 후각신경아세포종, 혀암, 치은암, 팽대부암, 대장암, 직장암, 신장암, 요관암, 방광암, 음경암, 난관암, 눈꺼풀암, 망막모세포종을 포함한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 종양 또는 자가면역 질환(autoimmune disease) 치료에 사용될 수 있는 융합 단백질, 면역접합체, 핵산 분자, 벡터, 조성물 또는 세포를 제공한다.
본 출원에서, 용어 "대상체(subject)"는 일반적으로 고양이, 개, 말, 돼지, 소, 양, 염소, 토끼, 마우스, 쥐 또는 원숭이를 포함하는 인간 또는 비인간 동물을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
이론에 얽매이지 않고, 이하의 실시예는 본 출원의 발명적 범위를 제한하기 보다는 본 출원의 융합 단백질, 제조방법 및 용도를 해석하기 위한 것일 뿐이다.
실시예
실시예 1 융합 단백질의 구성
도 1에 도시된 융합 단백질의 구조를 참조하여, 예를 들어 Roche's PD-L1 항체 아테졸리주맙(Atezolizumab)(SG1201) 및 SIRPα 변이체 1의 돌연변이 M91(서열번호 41)을 취하고, SG1201, 링커 및 2개의 M91을 연속적으로 연결하기 위해 N 말단에서 C 말단으로 선택된 링커 1(서열번호 52)을 사용하고, 여기서 두 M91의 N-말단은 각각 SG1201의 중쇄의 C-말단에 연결되어 융합 단백질 SG12473을 얻는다.
항체 SG1201의 LCDR1 내지 LCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되며; VL의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며; VL을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 9로 표시되고; 항체 SG1201의 HCDR1 내지 HCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되며; VH의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고; VH를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10으로 표시된다. 항체 SG1201의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시되며; 그의 경쇄를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12로 표시된다. 항체 SG1201의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 표시되며; 그의 중쇄를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14로 표시된다.
융합 단백질 SG12473은 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 SG1201의 경쇄이고, 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 Fc영역에 돌연변이가 있는 SG1201의 중쇄와 M91이 링커 1을 통해 연결되어 얻어지는 폴리펩티드 사슬이고, 아미노산 서열은 서열번호 53으로 표시된다.
도 1에 도시된 융합 단백질의 구조를 참조하여, 예를 들어, 아스트라제네카(AstraZeneca) PD-L1 항체 두르발루맙(Durvalumab)(SG1202) 및 SIRPα 변이체 1의 돌연변이 M91(서열번호 41)를 취하고, SG1202, 링커 및 2개의 M91를 연속적으로 연결하기 위해 N 말단에서 C 말단으로 선택된 링커 1(서열번호 52)을 사용하고, 여기서 두 M91의 N-말단은 각각 SG1202의 중쇄의 C-말단에 연결되어 융합 단백질 SG12474를 얻는다.
항체 SG1202의 LCDR1 내지 LCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 표시되며; VL의 아미노산 서열은 서열번호 21로 표시되며; VL을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 23으로 표시되고; 항체 SG1202의 HCDR1 내지 HCDR3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 표시되며; VH의 아미노산 서열은 서열번호 22로 표시되며; VH를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 24로 표시된다. 항체 SG1202의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되며; 그의 경쇄를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26으로 표시된다. 항체 SG1202의 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 27로 표시되고; 그의 중쇄를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28로 표시된다.
융합 단백질 SG12474는 첫 번째 폴리펩티드 사슬과 두 번째 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 첫 번째 폴리펩티드 사슬은 SG1202의 경쇄이고, 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되며; 두 번째 폴리펩티드 사슬은 Fc영역에 돌연변이가 있는 SG1202의 중쇄와 M91이 링커 1을 통해 연결되어 얻어지는 폴리펩티드 사슬이고, 아미노산 서열은 서열번호 54로 표시된다.
여기서, IgG1-Fc의 아미노산 서열은 서열번호 50으로 표시되고; 돌연변이가 있는 Fc의 아미노산 서열은 서열번호 51로 표시된다.
SIRPα 변이체 1의 돌연변이 M91(서열번호 41) 및 IgG1-Fc 사이의 융합 단백질 SS002M91은 동종이량체(homodimer)이고, 그의 단량체의 아미노산 서열은 서열번호 55로 표시된다.
실시예 2 2개의 항원 결합 활성 분석
(1) 다른 항원에 대한 인간화 항체를 대조군으로 하여, 상응하는 이중기능성 단백질(bifunctional protein) 및 관련 항원 간의 결합 활성을 ELISA에 의해 평가하였다.
PD-L1(인간유래, PD-L1/B7-H1/CD274 Protein(His Tag), Sino Biological Co.에서 구입)을 4°C에서 밤새 ELISA 스트립(strips)으로 코팅(coated)했고; PBST로 세척한 후, 10% 태아 송아지 혈청(fetal calf serum)을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 차단했으며; 다른 농도의 항체 SG1201 및 융합 단백질 SG12473, 또는 다른 농도의 항체 SG1202 및 융합 단백질 SG12474를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰고; PBST로 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 염소 항인간 IgG 2차 항체(a horseradish peroxidase-labeled goat anti-human)(Goat Anti human IgG HRP, Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰고, PBST로 5회 세척하였으며; 각 웰에 100㎕ TMB(eBioscience)를 첨가하고, 실온(20±5°C)에서 1분 내지 2분 동안 암실에 두었으며; 그런 다음 각 웰에 100㎕ 2N H2SO4 정지 용액(stop solution)을 첨가하여 기질의 반응을 종료하고, OD 값을 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)에서 450nm에서 판독하고, 관련 표적 항원에 결합하는 이중기능성 단백질의 능력을 분석하였다.
그 결과를 도 2 내지 도 3에 나타내었다. 도 2 내지 도 3은 융합 단백질 SG12473과 융합 단백질 SG12474에서 PD-L1의 항체 유형은 다르지만, PD-L1에 결합하는 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474의 능력은 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
(2) CD47 수용체의 돌연변이 M91을 대조군으로 사용하여, 상응하는 이중기능성 단백질과 CD47 사이의 결합 활성을 ELISA에 의해 평가하였다.
CD47(인간 유래, Sino Biological Co.에서 구입한 CD47 Protein(His Tag))을 4°C에서 밤새 ELISA 스트립으로 코팅했고; PBST로 세척한 후, 10%의 태아 송아지 혈청을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 차단했으며; 다른 농도의 융합 단백질 SS002M91, 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰고; PBST로 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 염소 항인간 IgG 2차 항체(Goat Anti human IgG HRP, Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰고, PBST로 5회 세척하였으며; 각 웰에 100㎕ TMB(eBioscience)를 첨가하고, 실온(20±5°C)에서 1분 내지 2분 동안 암실에 두었으며; 그런 다음 각 웰에 100㎕ 2N H2SO4 정지 용액(stop solution)을 첨가하여 기질의 반응을 종료하고, OD 값을 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 판독하고, CD47에 결합하는 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474의 능력을 분석하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474에서 PD-L1의 항체 유형이 다르지만, CD47에 결합하는 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474의 능력은 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 3 2개의 항원을 동시에 결합하는 활성 분석
다른 항원에 대한 인간화 항체를 대조군으로 하여, 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474의 생물학적 활성이 2개의 항원에 동시에 결합하는 것을 ELISA로 평가하였다.
PD-L1을 4°C에서 밤새 ELISA 스트립으로 코팅했고; PBST로 세척한 후, 10%의 태아 송아지 혈청을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 차단했으며; 다른 농도의 항체 SG1201, 융합 단백질 SG12473, 항체 SG1202 및 융합 단백질 SG12474를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰고; PBST로 세척한 후, 비오틴 표지된(biotin-labeled) CD47(Biotin-Fc-CD47)을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시키고, PBST로 5회 세척하였으며; 양고추냉이 퍼옥시다아제로 표지된 아비딘(horseradish peroxidase-labeled avidin)(Streptavidin-HRP, Jiaxuan Bio.)을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰고, PBST로 5회 세척하였으며; 각 웰에 100㎕ TMB(eBioscience)를 첨가하고 실온(20±5°C)에서 1분 내지 2분 동안 암실에 두었고; 그런 다음 각 웰에 100㎕ 2N H2SO4 정지 용액을 첨가하여 기질의 반응을 종료하고, OD 값은 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 판독되었고, PD-L1 및 CD47에 동시에 결합하는 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474의 능력을 분석하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 융합 단백질 SG12473과 융합 단백질 SG12474에서 PD-L1의 항체 유형이 다르지만, PD-L1 및 CD47에 동시에 결합하는 융합 단백질 SG12473 및 융합 단백질 SG12474의 능력은 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 4 CD47 / SIRPα 상호작용 차단 활성 분석
융합 단백질 SS002M91을 대조군으로 하여, CD47/SIRPα 상호작용을 차단하는 융합 단백질 SG12473 및 SG12474의 생물학적 활성을 평가하였다.
SIRPα-His는 4℃에서 밤새 1 ug/ml로 분석 플레이트 상에 코팅되었고; PBST로 세척한 후, 10%의 태아 송아지 혈청을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 차단했으며; SS002M91, SG12473, SG12474는 각각 태아 소 혈액(fetal bovine blood)의 10%로 점진적으로 희석되었고, Biotin-Fc-CD47은 최종 농도가 2μg/ml가 될 때까지 샘플에 첨가되었고, 1차 항체로 37°C에서 30분 동안 사전 인큐베이션(incubated) 하였으며; 분석 플레이트를 PBST로 세척한 후, 1차 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였으며; PBST로 5회 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다아제로 표지된 아비딘(Streptavidin-HRP, Jiaxuan Bio.)을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰고; PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 100㎕ TMB(eBioscience)를 추가하고, 실온(20±5°C)에서 1분 내지 5분 동안 암실에 두었고; 그런 다음 각 웰에 100㎕ 2N H2SO4 정지 용액을 첨가하여 기질의 반응을 종료하고, OD 값은 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 판독되었고, CD47/SIRPα에 대한 SS002M91, SG12473, SG12474의 차단 효과를 분석했다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 융합 단백질 SS002M91과 동일하게 융합 단백질 SG12473, SG12474가 CD47과 그의 리간드 SIRPα 사이의 결합을 경쟁적으로 차단할 수 있음을 보여주었다. 여기서, SG12473의 IC50 값은 1.26nM, SG12474의 IC50 값은 0.77nM, 및 SS002M91의 IC50 값은 1.16nM 이었다.
실시예 5 PD-1/PD-L1 상호작용 차단 활성 분석
SG1201 및 SG1202를 대조군으로 하여, PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 융합 단백질 SG12473 및 SG12474의 생물학적 활성을 평가하였다.
PD-L1-Fc를 4°C에서 밤새 2ug/ml로 분석 플레이트에 코팅했고; PBST로 세척한 후, 10%의 태아 송아지 혈청을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 차단하였으며; SG1201, SG12473, SG1202 및 SG12474는 각각 소 태아 혈액의 10%로 점진적으로 희석되었으며, Biotin-Fc-PD1은 최종 농도가 1ug/ml가 될 때까지 샘플에 첨가되었고, 1차 항체로 37°C에서 30분 동안 사전 인큐베인션 하였고; 분석 플레이트를 PBST로 세척한 후, 1차 항체를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였고; PBST로 5회 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제로-표지된 아비딘(Streptavidin-HRP, Jiaxuan Bio.)을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였으며; PBST로 5회 세척한 후, 각 웰에 100㎕ TMB(eBioscience)를 추가하고, 실온(20±5°C)에서 1분 내지 5분 동안 암실에 두었고; 그런 다음 각 웰에 100㎕ 2N H2SO4 정지 용액을 첨가하여 기질의 반응을 종료하고, OD 값은 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 판독되었고, PD-1/PD-L1에 대한 SG1201, SG12473, SG1202 및 SG12474의 차단 효과를 분석했다.
도 7 내지 도 8에서 볼 수 있듯이, SG1201 및 SG1202와 마찬가지로 융합 단백질 SG12473 및 SG12474는 PD-1과 PD-L1 간의 결합을 경쟁적으로 차단할 수 있다. 여기서, SG1201의 IC50값은 11.23nM, SG12473의 IC50값은 13.22nM, SG1202의 IC50값은 10.89nM, 및 SG12474의 IC50값은 9.12nM이다.
실시예 6 융합 단백질은 생체 내에서 종양 활성을 억제한다.
종양 활성에 대한 융합 단백질 SG12473의 억제 효과를 평가하기 위해 암컷 NCG 마우스 MiXeno 동물 모델에 인간 유래 림프종(human-derived lymphoma) KARPAS-299 세포주(cell line)를 이질적으로 이식(transplanted)하였다.
6주 내지 8주된 암컷 NCG 마우스(Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co. Ltd.에서 구입)가 테스트를 위해 선택되었다. 마우스에 KARPAS-299 세포를 피하로(subcutaneously) 접종하고 종양의 성장 프로파일(profiles)을 주기적으로 관찰하였다. 종양이 평균 35mm3 크기로 성장했을 때, 마우스는 투여를 위한 마우스의 종양 크기 및 체중에 따라 무작위로 그룹화되었다. 그룹화 당일(약 4일차), KARPAS-299 인간화 마우스 모델을 확립하기 위해 새로운 인간 PBMC(공여자 유래)를 꼬리 정맥(tail vein)을 통해 접종하였다. 시험은 용매 대조군(solvent control group), SG1201군 및 SG12473의 저용량, 중용량 및 고용량 그룹으로 나뉘었고, 각 그룹에는 12마리의 마우스가 있었고 6마리의 마우스는 동일한 소스의 PBMC를 활용했다. 약물은 총 3주 동안 일주일에 두 번 복강 내 주사(intraperitoneal injection)로 투여되었다. 특히,
그룹 1A 및 그룹 1B: 용매 대조군
그룹 2A 및 그룹 2B: SG1201 그룹, SG1201 5mg/Kg
그룹 3A 및 그룹 3B: 5mg/Kg에서 SG12473, SG12473의 저용량 그룹
그룹 4A 및 그룹 4B: 10mg/Kg에서 SG12473, SG12473의 중간용량 그룹
그룹 5A 및 그룹 5B: 20mg/Kg에서 SG12473, SG12473의 고용량 그룹;
치료 효능은 상대(relative) 종양 성장 억제(tumor growth inhibition:TGI)에 따라 평가되었으며, 동물의 체중과 사망률의 변화를 기반으로 안전성을 평가하였다.
그 결과, 기증자 A에서 유래한 PBMC를 사용한 마우스에서 SG12473의 저용량, 중간용량 및 고용량 그룹 모두에서 유의한 종양 억제 효과가 나타났다. 도 9의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 투여 완료 시 SG12473의 저용량, 중간용량 및 고용량 그룹의 TGI는 각각 44.71%, 47.16% 및 96.49%였고; 투여 완료 4일 후 TGI는 각각 43.71%, 47.92%, 95.94%였으며, 이는 용매 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p 값은 모두 <0.01). SG1201의 시험 투여량에서는 유의한 종양 억제 효과가 나타나지 않았다.
기증자 B로부터 유래된 PBMC를 사용하는 마우스에서, SG12473의 모든 저용량, 중간용량 및 고용량 그룹에서 유의한 종양 억제 효과가 나타났다. 도 10의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 투여 완료 시 SG12473의 저용량, 중간용량 및 고용량 그룹의 TGI는 각각 36.96%, 62.06% 및 98.90%였고; 투여 완료 4일 후 TGI는 각각 33.44%, 57.57%, 98.83%였으며, 이는 용매 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p 값은 모두 <0.01). SG1201의 시험 투여량에서는 유의한 종양 억제 효과가 나타나지 않았다.
각 처리군에서 동물 사망은 없었고, 명백한 약물 독성이 나타나지 않았으며, 처리 중 내성은 양호하였다.
전술한 상세한 설명은 설명 및 예를 통해 제공되지만 첨부된 청구항의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본 출원에 현재 열거된 실시예의 다양한 변형은 당업자에게 명백하며, 첨부된 특허청구범위 및 그에 상응하는 범위 내에서 유지된다.
<110> HANGZHOU SUMGEN BIOTECH CO., LTD. <120> FUSION PROTEIN AND USE THEREOF <130> 0070-PA-017KR <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG1201 LCDR1 <400> 1 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG1201 LCDR2 <400> 2 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG1201 LCDR3 <400> 3 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG1201 HCDR1 <400> 4 Asp Ser Trp Ile His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG1201 HCDR2 <400> 5 Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG1201 HCDR3 <400> 6 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG1201 VL <400> 7 Asp 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Arg Gln Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Asp Gly His 500 505 510 Phe Pro Arg Val Thr Thr Ala Ser Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met 515 520 525 Asp Phe Ser Ile Asn Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr 530 535 540 Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp Ile Glu Phe 545 550 555 560 Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 565 570 575 <210> 54 <211> 578 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SG12474 second polypeptide chain <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Gln 450 455 460 Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly Glu Thr Ala 465 470 475 480 Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly Pro Ile Gln 485 490 495 Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Gln Leu Ile Tyr Asn Gln Lys 500 505 510 Asp Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Ala Ser Asp Leu Thr Lys Arg 515 520 525 Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Asn Ile Gly Asn Ile Thr Pro Ala Asp 530 535 540 Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Asp 545 550 555 560 Ile Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys 565 570 575 Pro Ser <210> 55 <211> 350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SS002M91 monomer <400> 55 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly 20 25 30 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Gln Leu Ile Tyr 35 40 45 Asn Gln Lys Asp Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Ala Ser Asp Leu 50 55 60 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Asn Ile Gly Asn Ile Thr 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 85 90 95 Pro Asp Asp Ile Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Ser Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 115 120 125 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 145 150 155 160 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 165 170 175 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 180 185 190 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 195 200 205 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 210 215 220 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 225 230 235 240 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 245 250 255 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 260 265 270 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 275 280 285 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 290 295 300 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 305 310 315 320 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 325 330 335 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 350

Claims (41)

  1. 다음을 포함하는 융합 단백질:
    PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인(first binding domain); 및
    CD47 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인(second binding domain);
    여기서, 상기 제2 결합 도메인은 인간 SIRPα 변이체 1(variant 1)의 돌연변이체(mutant)를 포함하고, 상기 돌연변이체는 서열번호 29로 표시되는 서열과 비교하여 33번 내지 149번째 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 잔기의 치환(substitution), 결실(deletion) 또는 추가(addition)를 포함함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 융합 단백질: R22, I29, I61, V63, E77, Q82, K83, E84, V93, D95, L96, K98, N100, R107, G109 및 V132.
  3. 제2항에 있어서, 상기 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 융합 단백질:
    (1) I61, V63, E77, E84, V93, L96, K98, N100 및 V132;
    (2) I61, E77, Q82, K83 및 E84;
    (3) I61, V63, K83, E84 및 V132;
    (4) I61, E77, E84, R107 및 V132;
    (5) I61, V63, E77, K83, E84 및 N100;
    (6) I6, E77, Q82, K83, E84 및 R107;
    (7) I61, E77, Q82, E84, V93, L96, N100, R107, G109 및 V132;
    (8) I61, E77, Q82, K83, E84 및 V132;
    (9) I61;
    (10) I61, D95, L96, G109 및 V132;
    (11) I6, D95, L96, K98, G109 및 V132;
    (12) I61, E77, E84, V93, R107 및 V132;
    (13) E77, L96, N100, G109 및 V132;
    (14) I61, V63, Q82, E84, D95, L96, N100 및 V132;
    (15) I61, E77, Q82, K83, E84, V93, D95, L96, K98, N100 및 V132;
    (16) I61, E77, Q82, K83, E84 및 V93;
    (17) I61, V63, E77, K83, E84, D95, L96, K98 및 N100;
    (18) I61, V63, E77, K83, D95, L96, K98, N100 및 G109;
    (19) I61, E77, Q82, E84, V93, D95, L96, K98 및 N100; 및
    (20) I61, V63, E77, Q82 및 E84.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 융합 단백질: R22C, I29L, I61L/V/F, V63I, E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L, Q82S/R/G/N, K83R, E84K/H/D/R/G, V93L/A, D95H/R/E, L96S/T, K98R, N100G/K/D/E, R107N/S, G109R/H 및 V132L/R/I/S.
  5. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이체는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 융합 단백질:
    (1) I61L, V63I, E77I, E84K, V93L, L96S, K98R, N100G 및 V132L;
    (2) I61V, E77N, Q82S, K83R 및 E84H;
    (3) I61F, V63I, K83R, E84K 및 V132I;
    (4) I61L, E77Q, E84D, R107N 및 V132I;
    (5) I61L, V63I, E77K, K83R, E84D 및 N100G;
    (6) I61V, E77H, Q82R, K83R, E84H 및 R107S;
    (7) I61L, E77I, Q82G, E84R, V93L, L96T, N100G, R107S, G109R 및 V132R;
    (8) I61L, E77M, Q82G, K83R, E84D 및 V132L;
    (9) I61L;
    (10) I61F, D95H, L96S, G109H 및 V132S;
    (11) I61F, D95H, L96S, K98R, G109H 및 V132S;
    (12) I61L, E77Q, E84D, V93A, R107N 및 V132I;
    (13) E77K, L96S, N100K, G109H 및 V132L;
    (14) I61L, V63I, Q82G, E84G, D95R, L96S, N100D 및 V132I;
    (15) I61L, E77R, Q82N, K83R, E84G, V93L, D95E, L96T, K98R, N100D 및 V132L;
    (16) I61V, E77N, Q82S, K83R, E84H 및 V93A;
    (17) I61V, V63I, E77V, K83R, E84D, D95E, L96T, K98R 및 N100E;
    (18) I61L, V63I, E77V, K83R, D95E, L96S, K98R, N100D 및 G109R;
    (19) I61V, E77L, Q82G, E84G, V93L, D95E, L96T, K98R 및 N100G; 및
    (20) I61L, V63I, E77N, Q82G 및 E84G.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 30내지 서열번호 49 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment thereof)을 포함하는 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 융합 단백질: 단일 클론 항체(monoclonal antibody), 단일-사슬 항체(single-chain antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 및 완전 인간 항체(fully human antibody).
  9. 제7항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 융합 단백질: Fab, Fab', F(ab)2, dAb, 단리된 상보성 결정 영역(isolated complementary determining region) CDR, Fv 및 scFv.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PD-L1은 인간 PD-L1인 융합 단백질.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체의 중쇄( heavy chain) 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 HCDR1 내지 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 4 및 서열번호 18로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 HCDR2는 서열번호 5 및 서열번호 19로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  13. 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCDR3은 서열번호 6 및 서열번호 20으로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region) VH를 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역 VH는 서열번호 8 및 서열번호 22로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄 또는 이의 단편은 중쇄 불변 영역(heavy chain constant region)을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG를 포함하는 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 IgG는 IgG1 및 IgG4로 구성된 군에서 선택되는 융합 단백질.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 13 및 서열번호 27로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체의 경쇄( light chain) 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 LCDR1 내지 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 1 및 서열번호 15로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 LCDR2는 서열번호 2 및 서열번호 16으로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  20. 제18항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LCDR3은 서열번호 3 및 서열번호 17로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 가변 영역 VL을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역 VL은 서열번호 7 및 서열번호 21로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 또는 이의 단편은 경쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 불변 영역은 Igκ를 포함하는 융합 단백질.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 11 및 서열번호 25로 구성된 군에서 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 결합 도메인은 제2 결합 도메인의 N-말단(N-terminal)에 위치하는 융합 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 링커( linker)를 추가로 포함하고, 상기 링커는 제1 결합 도메인의 C-말단(C-terminal) 및 제2 결합 도메인의 N-말단에 위치하는 융합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 52로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 제2 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인 각각은 제1 결합 도메인의 C-말단 각각에 위치하는 융합 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제29항의 면역접합체를 엔코딩(encoding)하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자(isolated nucleic acid molecules).
  31. 제30항의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터(vectors).
  32. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제30항의 면역접합체 또는 제30항의 핵산 분자, 및 선택적으로, 약학적(pharmaceutically)으로 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 조성물.
  33. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제29항의 면역접합체, 제30항의 핵산 분자, 또는 제31항의 벡터를 포함하는 세포.
  34. 제33항에 따른 세포를 상기 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 제조방법.
  35. 종양(tumor) 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서, 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제29항의 면역접합체, 제30항의 핵산 분자, 제31항의 벡터, 제32항의 조성물, 또는 제33항의 세포의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 상기 종양은 고형 종양(said tumor) 및 비-고형 종양(non-solid tumor)을 포함하는 용도.
  37. 제36항에 있어서, 상기 고형 종양 및 비-고형 종양은 다발성 골수종(multiple myeloma), 백혈병(leukemia), 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 신경교종(neuroglioma), 생식종(germinoma), 육종(sarcoma), 중피종(mesothelioma), 태반종(placentoma), 뇌종양(cerebral cancer), 골암(bone cancer), 피부암(skin cancer), 비인두암(nasopharynx cancer), 폐암(lung cancer), 구강암(oral cancer), 식도암(esophagus cancer), 위암(gastric cancer), 간암(liver cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 장암(intestinal cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer) 및 고환암(testicular cancer), 전두동 종양(frontal sinus tumor), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 후각신경아세포종(olfactory neuroblastoma), 혀암(tongue cancer), 치은암(gingival carcinoma0), 팽대부암(ampulla carcinoma), 대장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 신장암(kidney cancer), 요관암(ureteral carcinoma), 방광암(bladder cancer), 음경암(penile cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 눈꺼풀암(eyelid cancer), 망막모세포종(retinoblastoma)을 포함하는 용도.
  38. 종양 치료에 사용되는 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제29항의 면역접합체, 제30항의 핵산 분자, 제31항의 벡터, 제32항의 조성물, 또는 제33항의 세포.
  39. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제29항의 면역접합체, 제30항의 핵산 분자, 제31항의 벡터, 제32항의 조성물, 또는 제33항의 세포의 유효량(effective amount)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PD-L1 단백질 및 PD-1 간의 상호작용을 차단하는 방법.
  40. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제29항의 면역접합체, 제30항의 핵산 분자, 제31항의 벡터, 제32항의 조성물, 또는 제33항의 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD47 단백질 및 SIRPα 간의 상호작용을 차단하는 방법.
  41. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제29항의 면역접합체, 제30항의 핵산 분자, 제31항의 벡터, 제32항의 조성물, 또는 제33항의 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 또는 종양세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법.


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