JP2022536982A - 癌およびその他の疾患の処置のためのα３β１インテグリンの標的化 - Google Patents

癌およびその他の疾患の処置のためのα３β１インテグリンの標的化 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、一部の態様において、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を標的とする抗体、キメラ抗原受容体、またはＲＮＡ干渉分子などの薬剤である。一つの態様は、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する有効量の薬剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌および類線維腫を処置する方法に関する。この方法は、有効量の化学療法または免疫療法を前記患者に投与することをさらに含み得る。

Description

本願は、２０１９年６月２１日付で出願された米国仮特許出願第６２／８６４，６１１号に基づく利益を主張し、その内容は参照によりその全文が本明細書に明示的に組み込まれる。
背景
１．分野
本発明の態様は、一般に医学の分野に関する。特定の態様は、ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとα３β１インテグリンの相互作用を妨害することによって癌を処置する方法に関する。
２．背景
線維性コラーゲンであるＩ型コラーゲン（ｃｏｌ１）は、人体に最も大量に存在するタンパク質であり、骨、腱および皮膚に最も大量に存在する。ｃｏｌ１の基本的な機能単位は、２本のａ１鎖と１本のａ２鎖で構成されるヘテロ三量体であり、これらが一緒になって三重らせん構造を形成する。各ａ鎖ポリペプチドはサイトゾルで合成され、他の２つのａ鎖と結合して、Ｎ末端およびＣ末端のプロペプチドをもつ三重らせんＩ型プロコラーゲンを生成する。続いて、プロコラーゲン分子は細胞外間隙に分泌され、そこでＮ末端およびＣ末端のプロペプチドがプロペプチダーゼによって切断され、Ｃｏｌ１の基本的な機能単位が生成される。Ｃｏｌ１三重らせん棒状分子は互いに相互作用してフィブリルを形成し、さらに架橋を受けて大きな線維の束を形成する。
胚発生の間、多くの器官はｃｏｌ１を発現して、細胞の遊走、分化、および構造的区画化を促進すると思われるが、ｃｏｌ１は成体の組織実質および器官にはほとんど存在しない（Ｈａｙ、１９８１）。Ｃｏｌ１ａ１遺伝子の全身的欠失（Ｉ型コラーゲンの完全な欠如をもたらす）は、胚性致死を引き起こす（Ｌｏｈｌｅｒら、１９８４）。臓器の線維症および癌などの病原性の症状では、Ｃｏｌ１は罹患組織にしっかりと蓄積する（Ａｐｔｅら、２０１２；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００４；Ｂａｃｈｅｍら、２００５；Ｆｕｊｉｔａら、２００９；Ｈａｂｅｒら、１９９９）。腫瘍組織に関連するＣｏｌ１は、癌細胞の周囲に生物物理学的に「堅い」環境を生成して、伝導性の線維の「トラック」を介する細胞遊走を促進し、異常な細胞相互作用を促進して癌細胞の増殖および生存を誘導することが知られている（Ａｐｔｅら、２０１２；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００４；Ｂａｃｈｅｍら、２００５；Ｅｇｅｂｌａｄら、２０１０；Ｆｕｊｉｔａら、２００９；Ｈａｂｅｒら、１９９９；Ｌｅｖｅｎｔａｌら、２００９）。この点において、Ｃｏｌ１は、膵臓癌に関連する腫瘍間質／微小環境の主要な成分である（Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒら、１９８７）。ＰＤＡＣに関連するａＳＭＡ＋筋線維芽細胞（ＭＦ）は、Ｃｏｌ１の産生に大きく寄与すると推測されており、癌細胞への薬物送達を妨げると提唱されている（Ａｐｔｅら、２０１２；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００４；Ｂａｃｈｅｍら、２００５；Ｅｇｅｂｌａｄら、２０１０；Ｆｕｊｉｔａら、２００９；Ｈａｂｅｒら、１９９９；Ｌｅｖｅｎｔａｌら、２００９；Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら、２０１２）。最近の研究は、ＰＤＡＣの間質線維芽細胞が状況に依存した機能を示し、腫瘍の促進および抑制に影響を与える可能性があることを示唆している（Ｂｉｆｆｉら、２０１９；Ｋａｌｌｕｒｉ，２０１６；Ｌａｋｌａｉら、２０１６；Ｌｅｅら、２０１４；Ｍｕｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｆｕｓｅｎｉｇ，２００４；Ｎｅｅｓｓｅら、２０１５；Ｏｈｌｕｎｄら、２０１４；Ｏｈｌｕｎｄら、２０１７；Ｏｌｉｖｅら、２００９；Ｏｚｄｅｍｉｒら、２０１４；Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏら、２０１２；Ｒｈｉｍら、２０１４；Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、２００６）。この点において、活性化星状細胞／筋線維芽細胞が産生するＩ型コラーゲンの、ＰＤＡＣの開始および進行における正確な機能は依然として不明である。
要旨
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、α３β１インテグリンに結合する抗体または抗体フラグメントを含む組成物である。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、上皮細胞でα３β１インテグリンに結合する。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、線維芽細胞でα３β１インテグリンに結合する。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、α３β１インテグリンによって生存促進性シグナル伝達を阻害する。
一部の態様では、抗体はキメラ抗体であるか、または二重特異性抗体である。一部の態様では、抗体はキメラ抗体であり、キメラ抗体はヒト化抗体である。一部の態様では、二重特異性抗体は、α３β１インテグリンとＣＤ３の両方に結合する。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、細胞傷害性薬剤に結合している。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、診断薬に結合している。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、本実施形態のいずれか１つの抗体または抗体フラグメントをコードするハイブリドーマまたは操作された細胞である。一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、本実施形態のいずれか１つの抗体または抗体フラグメントを含む医薬製剤である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、処置を必要とする患者を処置する方法であって、方法は、有効量のα３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントを投与することを含む方法である。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、上皮細胞でα３β１インテグリンに結合する。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、線維芽細胞でα３β１インテグリンに結合する。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する。一部の態様では、抗体または抗体フラグメントは、α３β１インテグリンによって生存促進性シグナル伝達を阻害する。一部の態様では、α３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントは、本実施形態のいずれか１つの抗体または抗体フラグメントである。
一部の態様では、患者は、癌、類線維種、組織傷害、ケロイド、臓器線維症、クローン病、狭窄、大腸炎、乾癬、または結合組織障害を有する。一部の態様では、患者は、組織傷害修復または組織再生を必要とする。一部の態様では、結合組織障害は、コラーゲンを含む結合組織障害である。一部の態様では、コラーゲンを含む結合組織障害は、１型コラーゲンを含む結合組織障害である。
特定の態様では、患者は癌を有する。一部の態様では、癌患者は、対照患者と比較して高レベルのα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンを発現すると判断された。一部の態様では、癌は膵臓癌である。一部の態様では、方法は、膵臓癌の転移を阻害する方法としてさらに定義される。一部の態様では、方法は、膵臓癌の増殖を阻害する方法としてさらに定義される。
一部の態様では、方法は、少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む。一部の態様では、第２の抗癌療法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である。一部の態様では、第２の抗癌療法は免疫療法である。一部の態様では、免疫療法はチェックポイント遮断療法である。一部の態様では、チェックポイント遮断療法は、抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメントを投与することを含む。一部の態様では、方法は、インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、処置を必要とする患者を処置する方法であって、方法は、α３β１インテグリンを通じて生存促進性シグナル伝達を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む方法である。一部の態様では、薬剤は、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する抗体または抗体フラグメントである。一部の態様では、α３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントは、本実施形態のいずれか１つの抗体または抗体フラグメントである。一部の態様では、薬剤は、α３β１インテグリンの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
一部の態様では、患者は、癌、類線維種、組織傷害、ケロイド、臓器線維症、クローン病、狭窄、大腸炎、乾癬、または結合組織障害を有する。一部の態様では、患者は、組織傷害修復または組織再生を必要とする。一部の態様では、結合組織障害は、コラーゲンを含む結合組織障害である。一部の態様では、コラーゲンを含む結合組織障害は、１型コラーゲンを含む結合組織障害である。
一部の態様では、患者は癌を有する請。一部の態様では、癌患者は、対照患者と比較して高レベルのα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンを発現すると判断された。一部の態様では、癌は膵臓癌である。一部の態様では、方法は、膵臓癌の転移を阻害する方法としてさらに定義される。一部の態様では、方法は、膵臓癌の増殖を阻害する方法としてさらに定義される。
一部の態様では、方法は、少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む。一部の態様では、第２の抗癌療法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である。一部の態様では、方法は、インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である。
一部の実施形態では，本明細書において提供されるのは、抗腫瘍有効量のα３β１インテグリンの発現を阻害する薬剤を投与することを含む、被験体を処置する方法である。一部の態様では、薬剤は、α３β１インテグリンのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである。一部の態様では、薬剤は脂質ナノ粒子中に製剤化されている。一部の態様では、脂質ナノ粒子は、エクソソームである。一部の態様では、被験体は癌を有する。一部の態様では、癌は膵臓癌である。一部の態様では、この方法は、インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドはα３β１インテグリンに結合する、ポリペプチドである。一部の態様では、抗原結合ドメインは、α３β１インテグリンに結合する一次抗体のＨＣＤＲ配列と、α３β１インテグリンに結合する二次抗体のＬＣＤＲ配列を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、α３β１インテグリンに結合する抗体のＨＣＤＲ配列とＬＣＤＲ配列を含む。一部の態様では、ＣＡＲは、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する。一部の態様では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ａヒンジドメインまたはＩｇＧ４ヒンジドメインである。一部の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインである。一部の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、本実施形態のいずれか１つのＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子である。一部の態様では、ＣＡＲポリペプチドをコードする配列は、発現制御配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、本実施形態のいずれか１つのＣＡＲポリペプチド、または本実施形態のいずれか１つの核酸を含む単離された免疫エフェクター細胞である。一部の態様では、核酸は、細胞のゲノムに組み込まれている。一部の態様では、細胞はＴ細胞である。一部の態様では、細胞はＮＫ細胞である。一部の態様では、細胞はヒト細胞である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、薬学的に許容される担体において本実施形態のいずれか１つに従う細胞の集団を含む医薬組成物である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、本実施形態のいずれか１つのＣＡＲポリペプチドを発現する抗腫瘍有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を投与することを含む、被験体を処置する方法である。一部の態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は同種異系細胞である。一部の態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は自家細胞である。一部の態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は被験体にＨＬＡ適合している。一部の態様では、被験体は癌を有する。一部の態様では、癌は膵臓癌である。一部の態様では、方法は、インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、本実施形態のいずれか１つに従って、ＣＡＲポリペプチドを発現する抗腫瘍有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ＮＫ細胞を投与することを含む、被験体を処置する方法である。一部の態様では、ＣＡＲ ＮＫ細胞は同種異系細胞である。一部の態様では、ＣＡＲ ＮＫ細胞は自家細胞である。一部の態様では、ＣＡＲ ＮＫ細胞は被験体のＨＬＡに適合している。一部の態様では、被験体は癌を有する。一部の態様では、癌は膵臓癌である。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である。一部の態様では、少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む。一部の態様では、第２の抗癌療法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である。一部の態様では、この方法は、インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する。一部の態様では、インテグリンシグナル伝達阻害剤は、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるのは、癌の被験体を処置する方法であって、方法は、（ａ）被験体に有効量のα３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントを投与するステップ；（ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲポリペプチドを発現する抗腫瘍有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を被験体に投与するステップであって、ＣＡＲポリペプチドはα３β１インテグリンに結合するステップ；または（ｃ）被験体に抗腫瘍有効量のα３β１インテグリンの発現を阻害する薬剤を投与するステップ；を含み、被験体の癌細胞は、健康な細胞または対照細胞と比較して、α３インテグリンの発現が増加していると判断された、方法である。一部の実施形態では、方法は、有効量の（ａ）のα３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントを被験体に投与することを含み、抗体または抗体フラグメントは、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する。一部の実施形態では、方法は、抗腫瘍有効量の（ｂ）のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を被験体に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、抗腫瘍有効量の（ｃ）の薬剤を被験体に投与することを含む。
本明細書において使用される、指定された成分に関して「本質的に含まない」は、指定された成分が意図的に組成物に配合されていないこと、および／または汚染物質としてまたは微量でのみ存在することを意味するために本明細書で使用される。そのため、組成物の意図しない汚染から生じる指定された成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、指定された成分が標準的な分析方法では検出することができない組成物である。
本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書の１または複数の請求項において、「含む」という語と併せて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という語は１つまたは複数を意味し得る。
請求項における用語「または」の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されていない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物および「および／または」のみを指す定義を支持する。本明細書において使用される場合、「もう一つの」は、少なくとも第２のまたはそれよりも多くを意味し得る。
本願を通して、用語「約」は、値に装置の固有の誤差の変動、値を決定するために用いられている方法、また研究対象間に存在する変動が含まれることを示すために使用される。
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本発明の実施形態を示してはいるが、例示のためだけに記載されていることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、１またはそれを超えるこれらの図面を参照することにより、よりよく理解され得る。
Ｉ型コラーゲンホモ三量体は、α３β１インテグリンを介した生存促進性シグナル伝達を誘導する。ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞に、ＤＤＲ１（Ａ、Ｂ）、インテグリンβ１（Ｃ）またはインテグリンα３（Ｄ）のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。次に、細胞を１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で６時間インキュベートした後、ｃｏｌ１ホモ三量体またはヘテロ三量体（５０μｇ／ｍＬ）で１６時間処置した。細胞を回収し、溶解し、ウエスタンブロット法で示されたタンパク質について調べた。 Ｉ型コラーゲンホモ三量体は、α３β１インテグリンを介した生存促進性シグナル伝達を誘導する。ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞に、ＤＤＲ１（Ａ、Ｂ）、インテグリンβ１（Ｃ）またはインテグリンα３（Ｄ）のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。次に、細胞を１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で６時間インキュベートした後、ｃｏｌ１ホモ三量体またはヘテロ三量体（５０μｇ／ｍＬ）で１６時間処置した。細胞を回収し、溶解し、ウエスタンブロット法で示されたタンパク質について調べた。
Ｉ型コラーゲンホモ三量体は、インテグリンを介して持続的な増殖シグナルを誘導する。（Ａ、Ｂ）ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞に、インテグリンβ１（Ａ）、α１、α２またはα３（Ｂ）のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。次に、細胞を１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で６時間インキュベートした後、ｃｏｌ１ホモ三量体またはヘテロ三量体（５０μｇ／ｍＬ）で１６時間処置した。細胞を回収し、溶解し、ウエスタンブロット法で調べた。（Ｃ）ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞における選択されたインテグリンサブユニットの発現レベル。（Ｄ）Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）データベースからのＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づく、選択されたインテグリンサブユニットヒトＰＤＡＣ細胞株（Ｐａｎｃ１、ＢｘＰＣ３、ＭｉａＰａｃａ２、ＰＳＮ１、ＨＰＡＣ、ＣＡＰＡＮ１）の発現レベル。ＲＭＡ（ロバストマルチアレイ平均アルゴリズム）の正規化が使用され、データはｌｏｇ２遺伝子発現シグナルである。（Ｅ）シングルセルＲＮＡシーケンシング解析を使用したｔ－ＳＮＥプロットに示される、ＫＰＰＣ腫瘍の様々な細胞クラスター間でのインテグリンα３（Ｉｔｇａ３）の発現プロファイル。（Ｆ）ＫＰＰＣ腫瘍切片のインテグリンα３ ＩＨＣ染色の代表画像。スケールバー：１００μｍ。（Ｇ）６ウェルプレートで増殖しているＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞を、通常の培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）で６０％コンフルエントに達するまで培養した。次に、細胞を１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で６時間インキュベートした後、ＦＡＫ阻害剤（ＶＳ－４７１８、１μＭ）の存在下または非存在下でｃｏｌ１ホモ三量体またはヘテロ三量体（５０μｇ／ｍＬ）で１６時間処置した。細胞を回収し、溶解し、ウエスタンブロット法で細胞のシグナル伝達について調べた。（Ｈ）ビヒクルまたはＦＡＫ阻害剤（ＶＳ－４７１８、強制経口投与処置、５０ｍｇ／ｋｇを１日２回、７日間）で処置したＫＰＰＣ（年齢を一致させた４週齢）マウスの膵臓のＨ＆Ｅ染色切片。スケールバー：１００μｍ。ＡＤＭおよびＰａｎＩＮ病変の面積率を定量化した。＊Ｐ＜０．０５。 同上。 同上。 同上。 同上。
示された細胞クラスターにおけるインテグリンサブユニットの発現パターンを示す、ＫＰＰＣ（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ）マウスの膵臓腫瘍の未分画生細胞混合物のシングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃ－ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析。機能性細胞クラスター１～１３の上位の増加した遺伝子シグネチャーのヒートマップが示される。図２Ｅの続きである。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
マウスおよびヒトの膵臓腫瘍組織切片でのインテグリンａ３ＩＨＣ染色の代表的画像。図２Ｆの続きである。スケールバー：１００μｍ。
組織マイクロアレイでのインテグリンα３免疫化学染色。図５Ａは、ヒトＰＤＡＣ切片における０～３のスケールでのインテグリンα３の免疫組織化学（ＩＨＣ）スコアを示す代表的な画像を示す。インテグリンα３の染色強度を、染色の視覚的スコアリング（３－非常に強い、２－強い、１－弱い、および０－陰性）によって定量化した。図５Ｂは、染色の強度および陽性腫瘍細胞の割合を組み合わせたスコアによって等級付けされたすべての試料のインテグリンα３のＩＨＣスコアを示す。インテグリンα３発現の平均スコアはコホート全体で１．８７であった。図５Ｃは、示されたインテグリンα３発現レベル（スコア２～３：非常に高い、スコア１～２：高い、スコア１未満：低い）を有するＰＤＡＣ試料の症例数と割合の表を示す。図５Ｄおよび５Ｅは、インテグリンα３発現レベルと全生存期間（図５Ｄ）および無増悪生存期間（図５Ｅ）との間の相関を示すカプラン・マイヤー生存曲線を示す。インテグリンα３の発現は、平均複合スコア１．８７をカットオフとして使用し、ＩＴＧＡ３－ｈｉｇｈ（下線；ｎ＝６８）とＩＴＧＡ３－ｌｏｗ（上線；ｎ＝６２）に分類した。 同上。
インビトロα３インテグリン（Ｉｔｇａ３）ｓｉＲＮＡ処置。ＫＰＰＣおよびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞に、インテグリンα３のｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。次に、細胞を１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で４８時間インキュベートし、細胞生存率アッセイで調べた（ｎ＝３ 生物学的複製）。＊＊Ｐ＜０．０１、ＮＳ：有意ではない。
エクソソームを介したＩｔｇａ３ ｓｉＲＮＡのＫＰＣＣマウスへの送達。ｓｉＲＮＡ－対照またはｓｉＲＮＡ－Ｉｔｇａ３でエレクトロポレーションした間葉系幹細胞由来エクソソームで処置したＫＰＰＣ（５週齢）マウスの生存率（４８時間ごとに０．１μｇのｓｉＲＮＡを含む１注射あたり１０８個のエクソソームによる腹腔内注射）。＊＊Ｐ＜０．０１。
癌細胞によるＩ型コラーゲンホモ三量体の欠失は、Ｔ細胞浸潤を増加させ、抗ＰＤ－１治療の有効性を可能性にする。図８Ａおよび８Ｂは、ＫＰＦＦ（図８Ａ）およびＫＰＦＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ（図８Ｂ）マウスの遺伝子組み換えの模式図を示す。図８Ｃは、ＫＰＰＦ腫瘍（ｎ＝３）およびＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍（ｎ＝４）のＲＮＡ－ｓｅｑを示す。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を実施して、ＫＰＰＦ腫瘍と比較して減少したＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍の免疫経路を視覚化した。また、これらの遺伝子は、ｌｏｇ２比の変化とＰ値とともに記載されている。図８Ｄおよび８Ｅは、ＫＰＰＣ（図８Ｄ）およびＫＰＰＣ；ＣｏｌｐｄｘＫＯ（図８Ｅ）マウスの遺伝子組み換えの模式図を示す。図８Ｆは、ＫＰＰＣ腫瘍（ｎ＝３）およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍（ｎ＝４）のＲＮＡ－ｓｅｑを示す。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ ｐａｔｈｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を実施して、ＫＰＰＣ腫瘍と比較して減少したＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍の免疫経路を視覚化した。また、これらの遺伝子は、ｌｏｇ２比の変化とＰ値とともに記載されている。図８Ｇは、ＫＰＰＦ腫瘍（ｎ＝４）およびＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍（ｎ＝４）の多重染色切片のマルチスペクトル画像からのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化を示す。スケールバー：１００μｍ。図８Ｈは、ＫＰＰＣ腫瘍（ｎ＝８）およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍（ｎ＝６）の多重染色切片のマルチスペクトル画像からのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化を示す。スケールバー：１００μｍ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ：有意ではない。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
癌細胞によるＩ型コラーゲンホモ三量体の欠失は、Ｔ細胞浸潤に対する免疫抑制性の影響を逆転させ、抗ＰＤ－１治療の有効性を可能性にする。図９Ａおよび９Ｂは、ＫＰＰＣ（図９Ａ）およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ（図９Ｂ）腫瘍（群あたり５匹のマウスに由来）における免疫細胞集団（示されたマーカーに対して陽性）の割合のフローサイトメトリー分析を示す。ＣＤ３＋細胞のうちのＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団に対するゲーティング戦略が示される。図９Ｃ～９Ｈは、％ＣＤ４５＋（図９Ｃ）、％ＣＤ３＋（図９Ｄ）、％ＣＤ４＋（図９Ｅ）、％ＰＤ１＋ＣＤ４＋（図９Ｆ）、％ＣＤ８＋（図９Ｇ）、および％ＰＤ１＋ＣＤ８＋（図９Ｈ）細胞の定量化を示す。図９Ｉは、ＫＰＰＣ（ｎ＝２６）およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ（ｎ＝３３）マウスと比較した、抗ＰＤ１治療で処置したＫＰＰＣマウス（ｎ＝６）およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯマウス（ｎ＝１０）の生存率を示す。図９Ｊは、本開示の実験方法の模式図を示す。図９Ｋ～９Ｎは、活性化（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体、１μｇ／ｍＬ）、ＫＰＰＣ癌細胞共培養、およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞共培養の存在下または非存在下で、脾臓リンパ球（４匹の健康なマウスから分離）を１日間培養した試験の結果を示す（リンパ球：癌細胞比＝１０：１）。次に、脾臓リンパ球をフローサイトメトリーで調べた。棒グラフは、各棒グラフの左から右へ、次の条件の結果を示す：活性化なし、活性化、活性化とＫＰＣＣ共培養、活性化とＫＰＣＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ共培養。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
詳細な説明
本開示の態様は、癌細胞が１型コラーゲンの変異体を特異的に産生するという事実に関する。理論に縛られることを望むものではないが、健康な筋線維芽細胞はα１／α２／α１ヘテロ三量体を産生し、それがＤＤＲ受容体に結合して腫瘍の増殖を抑制すると理解されている。一方、本明細書に開示されるように、癌細胞はα１／α１／α１ホモ三量体を産生し、これがα３β１インテグリンに結合し、それにより癌化促進シグナル（ｐｒｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ）が誘導される。
Ｃｏｌ１ホモ三量体は、ヘテロ三量体と比較した場合、ＤＤＲ１のリン酸化を強力に誘導し、ＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＥＲＫ１／２を活性化する。最初の評価では、これは以前に発表されたものとは対照的である（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００４；Ｂａｃｈｅｍら、２００５；Ｆｕｊｉｔａら、２００９）。しかし、そのような研究のすべてにおいて、癌細胞が産生したＣｏｌ１の寄与を無視することはできない。ＤＤＲ１の抑制は、ＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＥＲＫ１／２の継続的な活性化につながる。これは、Ｃｏｌ１ホモ三量体が他の受容体を並行してまたは代償機構として活性化することができることを示唆する。シングルセルＲＮＡシーケンシング分析により、膵臓癌細胞がα１β１、α２β１、およびα３β１などのＣｏｌ１結合インテグリンを発現することができることが示唆された。以前の研究では、インテグリンα１β１、α２β１、およびα３βはＣｏｌ１に結合することが示されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９１；Ｔａｋａｄａら、２００７）。本開示は、Ｃｏｌ１ホモ三量体がインテグリンα３β１と相互作用し、生存促進性シグナルを持続的に誘導することができることを示す。さらに、ＤＤＲ１の抑制は、インテグリンα３β１の発現を増加させる。さらに開示されるのは、癌のＴ細胞浸潤抑制におけるＣｏｌ１ホモ三量体の役割であり、これは、癌細胞でのＣｏｌ１ホモ三量体発現を減少または除去することによって逆転され得る。まとめると、これらの研究は、Ｃｏｌ１ホモ三量体が初期の膵臓癌開始細胞でインテグリンα３β１と相互作用して、増殖および生存を誘導し、免疫細胞の浸潤を抑制することを示唆する。ＫＰＰＣマウスの膵臓癌の初期段階でのＦＡＫの阻害は、有意な疾患の制御につながり、ＰＤＡＣの開始および進行におけるこのシグナル伝達軸の重要性が検証される。要約すると、これらの研究により、Ｃｏｌ１の新しい発癌性変異体が特定され、ＰＤＡＣの進行におけるＣｏｌ１の新しいバイモーダルな寄与が特定され、新しい治療戦略の開発に影響を与えることが示唆された。
したがって、例えば、抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、二重特異性抗体を使用する、ホモ三量体とα３β１インテグリンの結合の妨害を、癌または線維症を処置するために使用され得ることが企図される。本発明者らは、この違いを利用して癌を処置するためのいくつかの手段を特定した。これには、（１）α３β１インテグリンに特異的に結合する抗体の使用；（２）α３β１インテグリンによるシグナル伝達を阻害する薬剤の使用；（３）α３β１インテグリンの発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴ；（４）α３β１インテグリンを標的にするＣＡＲ－Ｔ細胞の使用；（５）α３β１インテグリンを標的にするＣＡＲ ＮＫ細胞の使用；および（６）Ｔ細胞を癌細胞に誘導するためのα３β１インテグリンとＣＤ３の両方を標的にする二重特異性抗体の使用が含まれる。さらに企図されるのは、チェックポイント遮断療法（例えば、抗ＰＤ－１治療）などの免疫療法と組み合わせて、Ｃｏｌ１ホモ三量体とα３β１インテグリンの結合を妨害するための、かかる方法の使用を含む方法である。
Ｉ．抗体およびその製造
「単離された抗体」は、その自然環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断もしくは治療用途に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含むことがある。特定の実施形態では、抗体は、（１）ローリー法で測定した抗体の９５重量％を超えるまで、特に９９重量％を超えるまで；（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで；または（３）クーマシーブルーまたは銀染色を使用した還元条件または非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均質な程度まで、精製されている。単離された抗体には、抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、組換え細胞内のインサイツ抗体が含まれる。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
基本的な４本鎖抗体単位は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロ四量体単位と、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドからなり、従って１０の抗原結合部位を含有するが、分泌型ＩｇＡ抗体は、重合して、２～５つの基本的な４本鎖単位をＪ鎖とともに含む多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４本鎖単位は一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されており、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１またはそれを超えるジスルフィド結合によって互いに連結されている。各ＨおよびＬ鎖は、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変領域（ＶＨ）と、その後にα及びγ鎖の各々では３つの定常ドメイン（ＣＨ）ならびにμ及びアイソタイプでは４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変領域（ＶＬ）と、その後に定常ドメイン（ＣＬ）をその他端に有する。ＶＬは、ＶＨと整列し、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変領域間の界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬが対合することにより、単一の抗原結合部位が形成される。さまざまなクラスの構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ ７１，ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。
任意の脊椎動物種のＬ鎖は、定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に異なる型のいずれかに割り当てることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つのクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる重鎖を有する。ガンマおよびアルファのクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的小さな違いに基づいてさらにサブクラスに分類され、ヒトは次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２。
「可変」という用語は、Ｖドメインの特定のセグメントの配列が抗体間で大きく異なっているという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域の１１０アミノ酸長にわたって均一に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチで構成され、それぞれ９～１２アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極めて変動性の高い、短い領域で区切られている。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ４つのＦＲを含み、これらのＦＲは主にβシート立体配置をとっており、３つの超可変領域によって接続されている。これらの超可変領域はβシート構造を接続するループを構成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖の超可変領域はＦＲによって近接して保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体と抗原の結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、抗体依存性好中球貪食（ＡＤＮＰ）、および抗体依存性補体沈着（ＡＤＣＤ）での抗体の関与など、さまざまなエフェクター機能を示す。
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬの約２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）残基の周辺、およびＶＨの約３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）残基の周辺；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬの２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）残基、およびＶＨの２６～３２（Ｈ１）、５２～５６（Ｈ２）および９５～１０１（Ｈ３）残基；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；および／または「超可変ループ」／ＣＤＲからのアミノ酸残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬの２７～３８（Ｌ１）、５６～６５（Ｌ２）および１０５～１２０（Ｌ３）、およびＶＨの２７～３８（Ｈ１）、５６～６５（Ｈ２）および１０５～１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９－２１２（１９９９）、Ｒｕｉｚ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１９－２２１（２０００））を含む。必要に応じて、抗体は、ＡＨｏに従って番号付けした場合に、１またはそれを超える次のポイント、ＶＬの２８、３６（Ｌ１）、６３、７４～７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）、およびＶｓｕｂＨの２８、３６（Ｈ１）、６３、７４～７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）に対称な挿入物を有する；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－６７０（２００１））。
「生殖系列核酸残基」とは、定常または可変領域をコードする生殖系列遺伝子に天然に存在する核酸残基を意味する。「生殖系列遺伝子」は、生殖細胞（すなわち、卵子または精子になる運命にある細胞）に見出されるＤＮＡである。「生殖細胞系列変異」とは、生殖細胞または単細胞期の接合体で生じた特定のＤＮＡの遺伝的変化を指し、そのような変異は子孫に伝達されると体のすべての細胞に組み込まれる。生殖細胞系列変異は、一つの体細胞で獲得される体細胞変異とは対照的である。場合によっては、可変領域をコードする生殖系列ＤＮＡ配列のヌクレオチドが変異して（すなわち、体細胞変異）、異なるヌクレオチドに置き換えられる。
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体、すなわち、少量で存在している場合がある、起こり得る自然発生の突然変異を除いて集団を構成する個々の抗体が同一である抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、単一の抗原性部位に対して作られている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して作られている。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、それらが他の抗体によって汚染されることなく合成され得るという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本開示において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法論によって調製されてもよいし、細菌、真核動物または植物細胞において抗原特異的なＢ細胞、すなわち感染または免疫化に応答する抗原特異的形質芽細胞の単一細胞選別の後に組換えＤＮＡ法を使用して（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、または抗原特異的にバルク選抜したコレクション中の単細胞からの連結された重鎖および軽鎖の捕捉を使用して作製されてもよい。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載された技法を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。
Ｂ．一般的な方法
α３β１インテグリンに結合するモノクローナル抗体にはいくつかの用途があることが理解される。これらには、癌の検出および診断、ならびに癌の処置に使用するための診断キットの製造が含まれる。これらの状況では、そのような抗体を診断薬または治療薬に連結させたり、それらを捕捉剤または競合アッセイの競合剤として使用したり、追加の薬剤を結合させずに単独で使用したりすることができる。抗体は、以下でさらに考察するように、変異していても修飾されていてもよい。抗体を調製および特徴づけるための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；米国特許第４，１９６，２６５号参照）。
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成する方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製する方法と同じ方針で始まる。これらの両方法の最初のステップは、適切な宿主の免疫化、または以前の自然感染または認可済みワクチンもしくは実験用ワクチンによるワクチン接種により免疫のある被験体の特定である。当技術分野で周知のように、免疫化のための所与の組成物は、その免疫原性が異なることがある。したがって、ペプチドまたはポリペプチドの免疫原をキャリアに結合させることによって達成され得るように、宿主の免疫系を強化することがしばしば必要である。キャリアの例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であるオボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどのその他のアルブミンもキャリアとして使用することができる。ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合させるための手段は当技術分野で周知であり、それには、グルタルアルデヒド、ｍ－マレイミドベンコイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス－ビアゾ化ベンジジンが含まれる。また、当技術分野で周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫応答の非特異的刺激剤の使用によって強化することができる。動物におけるアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（死滅したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられ、ヒトでは、ミョウバン、ＣｐＧ、ＭＦＰ５９および免疫賦活分子（「アジュバント系」、例えばＡＳ０１またはＡＳ０３など）の組合せが挙げられる。癌特異的Ｂ細胞を誘導するための追加の実験的な接種形態が可能であり、それには、ナノ粒子ワクチン、または、物理的送達系（例えば脂質ナノ粒子または金の微粒子銃ビーズなど）でＤＮＡまたはＲＮＡ遺伝子として送達される遺伝子コード化抗原、および針、遺伝子銃、経皮的エレクトロポレーション装置で送達される遺伝子コード化抗原が含まれる。抗原遺伝子はまた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、またはアルファウイルスレプリコンなどの複製能のあるまたは欠損したウイルスベクター、あるいはウイルス様粒子によってコードされたまま運ぶことができる。
ポリクローナル抗体の製造に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質ならびに免疫化に使用される動物によって異なる。多様な経路を使用して免疫原を投与することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）。ポリクローナル抗体の製造は、免疫化後のさまざまな時点で免疫化した動物の血液をサンプリングすることによってモニターすることができる。２回目のブースター注射も行われてよい。適した力価が達成されるまで、ブーストと力価測定のプロセスを繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫した動物から採血し、血清を単離、保存し、および／または動物を使用してＭａｂを作製することができる。
免疫化に続いて、抗体を産生する可能性のある体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）が、ＭＡｂ生成プロトコルで用いるために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、リンパ節、扁桃腺またはアデノイド、骨髄吸引物または生検、肺または消化管などの粘膜器官からの組織生検、または循環血液から得てよい。次に、免疫動物または免疫ヒトの抗体産生Ｂリンパ球を、不死骨髄腫細胞、一般に免疫された動物またはヒトまたはヒト／マウスキメラ細胞と同じ種の細胞の細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生融合法での使用に適した骨髄腫細胞株は、非抗体産生性であり、融合効率が高く、酵素欠損があるため所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地で増殖できないものが好ましい。当業者に公知のように、多数の骨髄腫細胞のうちの任意の１つを使用することができる。ＨＭＭＡ２．５細胞またはＭＦＰ－２細胞は、そのような細胞の特に有用な例である。
抗体産生脾臓もしくはリンパ節細胞と骨髄腫細胞のハイブリットを生成する方法は、通常、体細胞と骨髄腫細胞を２：１の比率で混合することを含むが、この比率は、細胞膜の融合を促進する１つまたは複数の薬剤（化学的または電気的）の存在下で、それぞれ約２０：１から約１：１まで変化し得る。場合によっては、最初のステップとしてヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換すると、Ｂ細胞のサイズが大きくなり、比較的大きなサイズの骨髄腫細胞との融合が促進される。ＥＢＶによる形質転換効率は、形質転換培地にＣｐＧおよびＣｈｋ２阻害剤を使用することによって向上する。あるいは、ヒトＢ細胞は、ＴＮＦスーパーファミリーのＩＩ型メンバーである、ＩＬ－２１およびヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）などの追加の可溶性因子を含む培地でＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）を発現するトランスフェクト細胞株と共培養することで活性化することができる。センダイウイルスを用いる融合法が記載されており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧを用いる融合法が記載されている。電気的に誘導された融合法の使用も適切であり、より良い効率のためのプロセスがある。融合手順は通常、約１×１０－６から１×１０－８の低い頻度で生存可能なハイブリッドを生成するが、最適化された手順を使用すると、２００分の１に近い融合効率を達成することができる。しかし、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地で培養することにより、親である注入細胞（特に、通常無限に分裂し続ける注入骨髄腫細胞）から分化するため、融合効率が比較的低いことは問題にはならない。選択培地は、一般に、ヌクレオチドの新規合成を遮断する薬剤を組織培養培地中に含有する培地である。薬剤の例は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンとメトトレキサートはプリンとピリミジンの両方の新規合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートを使用する場合、培地にはヌクレオチド源としてヒポキサンチンとチミジンが補充される（ＨＡＴ培地）。アザセリンを使用する場合、培地にはヒポキサンチンが補充される。Ｂ細胞源がＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞株である場合、骨髄腫に融合していないＥＢＶ形質転換株を除去するためにウワバインが追加される。
選択培地の例は、ＨＡＴまたはウワバインを含むＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を操作できる細胞だけがＨＡＴ培地で生き残ることができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に欠陥があり、生き残ることができない。Ｂ細胞はこの経路を操作することができるが、培養寿命は限られており、通常は約２週間以内に死滅する。そのため、選択培地で生き残ることができる唯一の細胞は、骨髄腫細胞とＢ細胞から形成されたハイブリッドである融合に使用されるＢ細胞の供給源が、今回のように、ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞の株である場合、ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞は薬物による殺傷の影響を受けやすいため、ウワバインはハイブリッドの薬物選択にも使用することができるが、使用される骨髄腫パートナーはウワバイン耐性であるように選択される。
培養によりハイブリドーマの集団が得られ、そこから特定のハイブリドーマを選択する。通常、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートでのシングルクローン希釈により細胞を培養し、その後、個々のクローン上清を（約２～３週間後に）所望の反応性について試験することにより行われる。アッセイは、高感度、簡便かつ迅速であるべきであり、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、細胞毒性試験、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどが挙げられる。次に、選択されたハイブリドーマは、連続希釈またはフローサイトメトリー選別により単細胞化され、個々の抗体産生細胞株にクローン化される。次に、そのクローンを無期限に増殖させてｍＡｂを得ることができる。これらの細胞株は、２つの基本的な方法でＭＡｂの製造に利用することができる。ハイブリドーマの試料は、動物（例えば、マウス）に（しばしば腹腔に）注射することができる。必要に応じて、注射の前に動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油で刺激する。ヒトハイブリドーマをこの方法に使用する場合、腫瘍拒絶反応を防ぐために、ＳＣＩＤマウスなどの免疫不全マウスに注射することが最適である。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生された特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次に、血清や腹水などの動物の体液を取り出すことにより、高濃度のＭＡｂを得ることができる。個々の細胞株はインビトロで培養することもでき、ＭＡｂは培養液中に自然に分泌され、そこからＭＡｂを容易に高濃度で得ることができる。あるいは、ヒトハイブリドーマ細胞株をインビトロで使用して、細胞上清中に免疫グロブリンを産生させるできる。細胞株は、高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化するために、無血清培地での増殖に適合させることができる。
いずれかの手段で産生させたＭＡｂは、必要に応じて、ろ過、遠心分離、およびＦＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィーなどのさまざまなクロマトグラフィー法を使用して、さらに精製してよい。本開示のモノクローナル抗体のフラグメントは、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断による方法を含む方法によって、精製モノクローナル抗体から得ることができる。あるいは、本開示に包含されるモノクローナル抗体フラグメントは、自動ペプチドシンセサイザーを使用して合成することができる。
モノクローナル抗体を作製するために、分子クローニングアプローチを用いることも企図されている。目的の抗原で標識された単一のＢ細胞は、常磁性ビーズ選択またはフローサイトメトリーソーティングを使用して物理的に選別することができ、次に単一細胞からＲＮＡを分離して、ＲＴ－ＰＣＲによって抗体遺伝子を増幅することができる。あるいは、抗原特異的な、バルク選別された細胞集団を微小胞に分離し、重鎖および軽鎖アンプリコンの物理的連結、または小胞の重鎖および軽鎖遺伝子の一般的なバーコードを使用して、一致した重鎖および軽鎖可変遺伝子を単一細胞から回収することができる。単一細胞から得た、一致した重鎖および軽鎖遺伝子は、ＲＴ－ＰＣＲプライマーと、細胞ごとに１つのバーコードで転写物をマーキングするためのバーコードとを有する細胞透過性ナノ粒子で細胞を処置することにより、抗原特異的Ｂ細胞集団からも入手することができる。また、抗体可変遺伝子をハイブリドーマ株のＲＮＡ抽出により分離し、抗体遺伝子をＲＴ－ＰＣＲにより入手し、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることもできる。あるいは、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリを、細胞株から分離したＲＮＡから調製し、ウイルス抗原を用いてパニングすることによって適切な抗体を発現するファージミドを選択する。従来のハイブリドーマ法と比較して、このアプローチの利点は、１回のラウンドで約１０４倍多くの抗体を産生し、スクリーニングすることができることと、Ｈ鎖とＬ鎖の組合せにより新しい特異性が生成され、適切な抗体を発見する確率がさらに高まることである。
本開示において有用な抗体の製造を教示する、各々参照により本明細書に組み込まれるその他の米国特許には、コンビナトリアルアプローチを使用するキメラ抗体の製造を記載する米国特許第５，５６５，３３２号；組換え免疫グロブリンを記載する米国特許４，８１６，５６７号；および抗体－治療薬複合体を記載する米国特許４，８６７，９７３号が含まれる。
Ｃ．本開示の抗体
本開示による抗体は、第一に、その結合特異性によって定義され得る。当業者であれば、当業者に周知の技法を使用して所与抗体の結合特異性／親和性を評価することにより、そのような抗体が本請求の範囲内にあるかどうかを決定することができる。例えば、所与抗体が結合するエピトープは、抗原分子内に位置する３またはそれを超える（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の）アミノ酸の単一の連続配列からなってよい（例えば、ドメイン内の線状エピトープ）。あるいは、エピトープは、抗原分子内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなってよい（例えば、高次構造エピトープ）。
当業者に公知のさまざまな技法を使用して、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１またはそれを超えるアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技法には、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されているような日常的な交差ブロッキングアッセイが含まれる。交差ブロッキングは、ＥＬＩＳＡ、生体層干渉法、表面プラズモン共鳴などのさまざまな結合アッセイで測定することができる。その他の方法には、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析、単粒子再構成、クライオＥＭ、またはトモグラフィーを使用する高解像度電子顕微鏡技法、結晶学的研究およびＮＭＲ解析が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。抗体と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができるもう一つの方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的には、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識した後、重水素で標識したタンパク質に抗体を結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は重水素を保持する可能性があり、したがって、界面に含まれていないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示す可能性がある。抗体が解離した後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは、一般に、変性溶媒に曝されても保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、一般に、変性溶媒で処置すると失われる。エピトープは、一般的には、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を特有の空間的立体構造に含む。ここで、一部の実施形態では、エピトープは、α３β１インテグリンに存在する線状または立体構造エピトープである。
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知である修飾支援プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＭＡＰ）は、同じ抗原に対して作られた多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的にまたは酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って分類する方法である（参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれるＵＳ２００４／０１０１９２０を参照）。各カテゴリーは、別のカテゴリーで表されるエピトープとは明らかに異なるか、または部分的に重複する特有のエピトープを反映している可能性がある。この技術により、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングが可能になり、遺伝的に異なる抗体に焦点を当てて特性評価を行うことができる。ハイブリドーマスクリーニングに応用すると、ＭＡＰは、所望の特性を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にする可能性がある。ＭＡＰを使用して、本開示の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体のグループに分類することができる。
本開示は、同じエピトープまたはエピトープの一部に結合し得る抗体を含む。同様に、本開示は、標的またはその断片への結合について、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のいずれかと競合する抗体も含む。抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、または結合について参照抗体と競合するかどうかは、当技術分野で公知の日常的な方法を使用することにより、容易に決定することができる。例えば、試験抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下で標的に結合させる。次に、標的分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照抗体との飽和結合に続いて標的分子に結合できる場合、試験抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体が参照抗体との飽和結合後に試験抗体が標的分子に結合できない場合、試験抗体は、参照抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
２つの抗体は、各々がもう一方の抗体と抗原との結合を競合的に抑制（遮断）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイで測定して、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％、さらには９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照）。あるいは、一方の抗体の結合を減少または除去する抗原の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の結合を減少または除去する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少または除去する一部のアミノ酸変異が他方の結合を減少または除去する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
次に、追加の日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合解析）を実行して、試験抗体の結合が観察されなかったことが、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するものかどうか、または立体的遮断（または別の現象）が結合が観察されなかったことの原因であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な他の定量的または定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。ＥＭまたは結晶学を用いた構造研究も、結合に関して競合する２つの抗体が同じエピトープを認識するかどうかを示すことができる。
別の態様では、抗体は、追加の「フレームワーク」領域を含むそれらの可変配列によって定義されてよい。さらに、抗体配列は、これらの配列とは異なる場合があり、必要に応じて、以下でより詳細に考察されている方法を使用する。例えば、核酸配列は、（ａ）可変領域が軽鎖および重鎖の定常ドメインから分離される場合がある、（ｂ）核酸が、それによってコードされる残基に影響を与えずに、上記に示した核酸とは異なる場合がある、（ｃ）核酸が、所与の割合、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性で、上記に示した核酸とは異なる場合がある、（ｄ）核酸が、約５０℃～約７０℃の温度で約０．０２Ｍ～約０．１５ＭのＮａＣｌによって提供されるような低塩および／または高温条件に例示される、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力によって、上記に示した核酸とは異なる場合がある、（ｅ）アミノ酸が、所与の割合、例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性で、上記に示した核酸とは異なる場合がある、あるいは（ｆ）アミノ酸が、保存的置換を可能にすることにより（後述）、上記に示した核酸とは異なる場合があるという点で、上記に示した核酸とは異なる場合がある。
ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列を比較する場合、後述するように、２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、最大一致を目指して整列させた場合に同じである場合に、２つの配列は「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、一般に、比較ウィンドウで配列を比較し、配列類似性の局所領域を特定し、比較することによって実行される。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列した後に配列を同じ数の隣接する位置の参照配列が比較することができる、少なくとも約２０、通常は３０から約７５、４０から約５０の隣接した位置のセグメントを指す。
比較に最適な配列アラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，ウィスコンシン州マディソン）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、デフォルトのパラメーターを使用して実行することができる。このプログラムは、以下の参考文献で説明されているいくつかのアライメントスキームを具体化している：Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ－－Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ。Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（編）中のＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５－３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｐｐ．６２６－６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６－４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ－－ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６－７３０。
あるいは、比較に最適な配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装によって、または検査によって実行されてよい。
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの１つの特定の例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、例えば、本明細書に記載されるパラメータと共に使用して、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列同一性パーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公開されている。抗体配列が再配列されていることと各遺伝子が可変長であることにより、１つの抗体配列に対して複数ラウンドのＢＬＡＳＴ検索が必要である。また、異なる遺伝子を手作業で組み立てることは困難であり、エラーが発生しやすい。配列解析ツールＩｇＢＬＡＳＴ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／のワールドワイドウェブ）は、生殖系列Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子との一致を識別し、再配列接合部の、Ｉｇ Ｖドメインフレームワーク領域および相補性決定領域の描写を示す。ＩｇＢＬＡＳＴは、ヌクレオチドまたはタンパク質の配列を解析することができ、配列をバッチで処理することができ、生殖系列遺伝子データベースと他の配列データベースを同時に検索することが可能であるため、おそらく最も一致する生殖系列Ｖ遺伝子を見逃す可能性を最小限にすることができる。
一つの例示的な例では、累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（一致する残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致の残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算することができる。各方向への検索語ヒットの拡張は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１またはそれを超える負のスコアをもつ残基アラインメントの累積のために累積スコアがゼロまたはそれ以下になった場合；あるいは、いずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。
アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算することができる。各方向への検索語ヒットの拡張は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１またはそれを超える負のスコアをもつ残基アラインメントの累積のために累積スコアがゼロまたはそれ以下になった場合；あるいは、いずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。
１つのアプローチでは、「配列同一性の割合」は、少なくとも２０の位置の比較ウィンドウにわたる、２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満、通常は５～１５パーセント、または１０～１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を求めて一致した位置の数を得、一致した位置の数を参照配列の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算される。
抗体を定義するさらに別の方法は、以下に説明する抗体およびそれらの抗原結合フラグメントのいずれかの「誘導体」として定義する方法である。「誘導体」とは、抗原に免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、「親」（または野生型）分子と比較して、１、２、３、４、５またはそれを超えるアミノ酸置換、付加、欠失または修飾を含むものをいう。そのようなアミノ酸の置換または付加には、天然に存在する（すなわち、ＤＮＡにコードされた）または天然に存在しないアミノ酸残基が導入されてよい。「誘導体」という用語は、例えば、エフェクターまたは結合特性の強化または低下を示す変異体Ｆｃ領域を有する、例えば抗体などを形成するように、変更されたＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４領域を有する変異体を包含する。「誘導体」という用語は、非アミノ酸修飾、例えば、グリコシル化（例えば、マンノース、２－Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、グルコース、シアル酸、５－Ｎ－アセチルノイラミン酸、５－グリコリルノイラミン酸（ｇｌｙｃｏｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの含有量が変化）、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結、などがなされていてよいアミノ酸をさらに包含する。一部の実施形態では、変更された炭水化物修飾は、抗体の可溶化、抗体の細胞内輸送および分泌の促進、抗体の集合の促進、立体構造の完全性、および抗体に媒介されるエフェクター機能、のうちの１またはそれを超えるものを調節する。特定の実施形態では、変更された炭水化物修飾は、炭化水素修飾を欠いた抗体に対する抗体媒介エフェクター機能を調節する。変更された抗体に媒介されるエフェクター機能の変化を導く炭水化物修飾は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００２）’’Ｌａｃｋ Ｏｆ Ｆｕｃｏｓｅ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＩ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，’’Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－２６７４０；Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．ら、（２００１）’’Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ ＧｎＴＩＩＩ Ｉｎ Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ＣＨＯ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ Ｌｅａｄｓ Ｔｏ Ａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｉｎ ＡＤＣＣ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｉｇｈｅｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｏｒ ＦＣ Ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ，’’Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７４（４）：２８８－２９４参照）。炭水化物含有量を変化させる方法は、当業者に公知である、例えば、Ｗａｌｌｉｃｋ，Ｓ．Ｃ．ら、（１９８８）’’Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ ＶＨ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｏｆ Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｌｐｈａ（１－－－－６）Ｄｅｘｔｒａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｉｔｓ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ，’’Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８（３）：１０９９－１１０９；Ｔａｏ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８９）’’Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｆ Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｕｓｅ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ．Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ，’’Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３（８）：２５９５－２６０１；Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ｇ．ら、（１９９５）’’Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＣＤ３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，’’Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０（８）：８４７－５３；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ら、（２００３）’’Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，’’Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４１４－２１；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００２）’’Ｌａｃｋ Ｏｆ Ｆｕｃｏｓｅ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＩ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，’’Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３－２６７４０）を参照されたい。
誘導体抗体または抗体フラグメントは、ビーズベースもしくは細胞ベースのアッセイまたは動物モデルでのインビボ研究で測定されるように、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、抗体依存性好中球貪食（ＡＤＮＰ）、または抗体依存性補体沈着（ＡＤＣＤ）機能に好ましいレベルの活性を付与するために、操作された配列またはグリコシル化状態を用いて作製することができる。
誘導体抗体または抗体フラグメントは、当業者に公知の技法を用いて化学修飾によって修飾されていてもよく、それには、限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝合成などが含まれる。一実施形態では、抗体誘導体は、親抗体と同様または同一の機能を有することになる。もう一つの実施形態では、抗体誘導体は、親抗体と比較して変化した活性を示すであろう。例えば、誘導体抗体（またはそのフラグメント）は、親抗体よりもそのエピトープにより強く結合し得るか、またはタンパク質分解に対してより耐性があり得る。
Ｄ．抗体配列の操作
さまざまな実施形態において、発現の向上、交差反応性の向上または標的外結合の減少などの多様な理由で、同定した抗体の配列を操作することを選択してもよい。修飾された抗体は、標準的な分子生物学的技法による発現、またはポリペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作成されていてよい。組換え発現のための方法は、本文書の他所で扱われている。以下は、抗体のエンジニアリングに関連する目標技法の一般的な説明である。
ハイブリドーマは、培養し、次に細胞を溶解し、全ＲＮＡを抽出することができる。ランダムヘキサマーは、ＲＴで使用してＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成し、次にすべてのヒト可変遺伝子配列を増幅すると予想されるＰＣＲプライマーの多重混合物を使用してＰＣＲを実行することができる。ＰＣＲ産物はｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクターにクローニングした後、標準ベクタープライマーを用いて自動ＤＮＡシーケンシングによって配列決定することができる。結合および中和のアッセイは、ハイブリドーマ上清から収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムを使用してＦＰＬＣで精製した抗体を使用して実行することができる。
組換え全長ＩｇＧ抗体は、重鎖および軽鎖Ｆｖ ＤＮＡをクローニングベクターからＩｇＧプラスミドベクターにサブクローニングし、２９３（例えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ）細胞またはＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、抗体を２９３またはＣＨＯ細胞上清から収集し精製することにより、作製することができる。他の適切な宿主細胞系には、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）などの細菌、昆虫細胞（Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）、植物細胞（例えば、ヒト様グリカンのための操作を含むまたは含まないタバコ）、藻類、あるいはマウス、ラット、ヤギまたはウシなどのさまざまな非ヒトトランスジェニックコンテキストのものが含まれる。
その後の抗体精製と宿主の処置の両方の目的で、抗体をコードする核酸を発現することも企図されている。抗体コード配列は、ネイティブＲＮＡまたは修飾ＲＮＡなどのＲＮＡであり得る。修飾ＲＮＡは、ｍＲＮＡに安定性の向上および免疫原性の低下をもたらし、それによって治療上重要なタンパク質の発現を促進する特定の化学修飾を企図する。例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍΨ）は、翻訳能力の点で、他のいくつかのヌクレオシド修飾およびそれらの組み合わせよりも優れている。免疫／ｅＩＦ２αリン酸化依存性の翻訳阻害をオフにすることに加えて、組み込まれたＮ１ｍΨヌクレオチドは、リボソームの一時停止およびｍＲＮＡ上での密度を増加させることにより、翻訳プロセスの動力学を劇的に変化させる。修飾ｍＲＮＡのリボソーム負荷の増加は、同じｍＲＮＡ上のリボソームの再利用または新規リボソーム動員のいずれかを支持することにより、ｍＲＮＡの開始に対する許容性を高める。そのような修飾を使用して、ＲＮＡの接種後のインビボでの抗体発現を強化することができ得る。ＲＮＡは、天然であろうと修飾されていようと、裸のＲＮＡとして、または脂質ナノ粒子などの送達ビヒクル中で送達され得る。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡを同じ目的で用いてよい。このＤＮＡは、設計された宿主細胞において活性なプロモーターを含む発現カセットに含まれている。発現カセットは、有利には、従来のプラスミドまたはミニベクターなどの複製可能なベクターに含まれる。ベクターにはウイルスベクターが含まれ、例えばポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスなどが企図されている。ＶＥＥウイルスまたはシンドビスウイルスに基づくアルファウイルスレプリコンなどの抗体遺伝子をコードするレプリコンもまた企図される。そのようなベクターの送達は、筋肉内、皮下、または皮内経路を通る針によって、あるいはインビボ発現が望まれる場合には皮下エレクトロポレーションによって実行することができる。
最終的なｃＧＭＰ製造プロセスと同じ宿主細胞および細胞培養プロセスで産生された抗体を迅速に利用できることで、プロセス開発プログラムの期間を短縮できる可能性がある。Ｌｏｎｚａは、ＣＨＯ細胞で少量（５０ｇまで）の抗体を迅速に製造するための、ＣＤＡＣＦ培地で増殖させた、プールした遺伝子導入体を使用する一般的な方法を開発した。本物の一過性の系よりもわずかに遅いが、生成物濃度が高く、製造用細胞株と同じ宿主とプロセスを使用できるなどの利点がある。使い捨てバイオリアクターでモデル抗体を発現するＧＳ－ＣＨＯプールの成長及び生産性の例：流加培養モードで動作する使い捨てバッグバイオリアクター培養（作業量５Ｌ）では、トランスフェクションから９週間以内に２ｇ／Ｌの回収抗体濃度が達成された。
抗体分子は、例えば、ｍＡｂのタンパク質切断によって生成されるフラグメント（Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２など）、または、例えば、組換え手段を介して生成可能な一本鎖免疫グロブリンを含む。Ｆ（ａｂ’）抗体誘導体は一価であるが、Ｆ（ａｂ’）２抗体誘導体は、二価である。一実施形態では、そのようなフラグメントは、互いに、または他の抗体フラグメントまたは受容体リガンドと組み合わせて、「キメラ」結合分子を形成することができる。重要なことに、そのようなキメラ分子は、同じ分子の異なるエピトープに結合することができる置換基を含んでいてもよい。
関連する実施形態では、抗体は、開示される抗体の誘導体、例えば、開示される抗体と同一のＣＤＲ配列を含む抗体（例えば、キメラ、またはＣＤＲグラフト抗体）である。あるいは、保存的変更を抗体分子に導入するなどの修飾を行ってもよい。このような変更を行う場合、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。相互作用的生物学的機能をタンパク質に付与する際のアミノ酸のヒドロパシー指標の重要性は、当技術分野で一般的に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシー性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。
同様のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効果的に行うことができることも当技術分野で理解されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，５５４，１０１号は、隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大の局所平均親水性が、そのタンパク質の生物学的性質と相関することを述べている。米国特許４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：塩基性アミノ酸：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、およびヒスチジン（－０．５）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、アスパラギン（＋０．２）、およびグルタミン（＋０．２）；親水性、非イオン性アミノ酸：セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、およびトレオニン（－０．４）、硫黄含有アミノ酸：システイン（－１．０）およびメチオニン（－１．３）；疎水性、非芳香族アミノ酸：バリン（－１．５）、ロイシン（－１．８）、イソロイシン（－１．８）、プロリン（－０．５±１）、アラニン（－０．５）、およびグリシン（０）；疎水性、芳香族アミノ酸：トリプトファン（－３．４）、フェニルアラニン（－２．５）、およびチロシン（－２．３）。
アミノ酸を、同様の親水性を有する別のアミノ酸で置換して、生物学的または免疫学的に修飾されたタンパク質を生成することができることは理解される。そのような変更では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらに特に好ましい。
上で概説したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の様々な特性を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとスレオニン、グルタミンとアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが含まれる。
本開示はまた、アイソタイプ修飾を企図する。異なるアイソタイプを有するようにＦｃ領域を修飾することにより、異なる機能を実現することができる。例えば、ＩｇＧ１に変更すると、抗体依存性細胞傷害性を高めることができ、クラスＡに切り替えると組織分布を向上させることができ、クラスＭに切り替えると結合価を向上させることができる。
あるいは、またはそれに加えて、アミノ酸修飾を、ＩＬ－２３ｐ１９結合分子のＦｃ領域のＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機能を変化させる１またはそれを超えるさらなるアミノ酸修飾と組み合わせることが有用でありうる。特に注目される結合ポリペプチドは、Ｃ１ｑに結合し、補体依存性細胞傷害を示すものであり得る。既存のＣ１ｑ結合活性を有し、必要に応じてＣＤＣを媒介する能力をさらに有するポリペプチドは、これらの活性の一方または両方が強化されるように修飾されてよい。Ｃ１ｑを変化させ、かつ／またはその補体依存性細胞傷害機能を修飾するアミノ酸修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第００４２０７２号に記載されている。
例えば、Ｃ１ｑ結合および／またはＦｃγＲ結合を修飾し、それによってＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性を変更することにより、エフェクター機能を変更した抗体のＦｃ領域を設計することができる。「エフェクター機能」は、（例えば、被験体の）生物活性の活性化または減少を担う。エフェクター機能の例としては、限定されるものではないが：Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能は、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせることを必要とすることがあり、さまざまなアッセイ（例えばＦｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイなど）を使用して評価することができる。
例えば、Ｃ１ｑ結合の向上とＦｃγＲＩＩＩ結合の向上を有する（例えば、ＡＤＣＣ活性の向上とＣＤＣ活性の向上の両方を有する）抗体の変異型Ｆｃ領域を作製することができる。あるいは、エフェクター機能を低下または除去することが望まれる場合には、ＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性を低下させた変異型Ｆｃ領域を設計することができる。他の実施形態では、これらの活性の１つだけを増加させ、必要に応じて、他の活性を低下させてもよい（例えば、ＡＤＣＣ活性は向上しているがＣＤＣ活性は低下している、その逆も同じ、Ｆｃ領域変異体を作製するため）。
ＦｃＲｎ結合Ｆｃ変異は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を変化させ、それらの薬物動態特性を向上させるために導入し操作することもできる。ＦｃＲｎへの結合が向上したヒトＦｃ変異体のコレクションが記載されている。Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ＦｃγＲＩ，ＦｃγＲＩＩ，ＦｃγＲＩＩＩ，ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎのヒトＩｇＧ１上の結合部位の高解像度マッピング、およびＦｃγＲへの結合が向上したＩｇＧ１変異体の設計）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６６０４）。半減期の増加をもたらすことができる多くの方法が公知であり、それには、アラニンスキャニング変異誘発、ランダム変異誘発、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合および／またはインビボでの挙動を評価するためのスクリーニングをはじめとする技法によって生成することができるアミノ酸修飾が含まれる。計算戦略とそれに続く突然変異誘発を使用して、変異させるアミノ酸変異の１つを選択してもよい。
したがって、本開示は、ＦｃＲｎへの結合が最適化された抗原結合タンパク質の変異体を提供する。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質の前記変異体は、前記抗原結合タンパク質のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、前記修飾は、前記親ポリペプチドと比較して、２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３３、２３４、２３９、２４１、２４３、２４６、２５０、２５２、２５６、２５９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２７６、２８４、２８５、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９４、２９７、２９８、２９９、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１５、３１７、３２０、３２２、３２５、３２７、３３０、３３２、３３４、３３５、３３８、３４０、３４２、３４３、３４５、３４７、３５０、３５２、３５４、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３６２、３６９、３７０、３７１、３７５、３７８、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、３９０、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１ ４０３、４０４、４０８、４１１、４１２、４１４、４１５、４１６、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２４、４２６、４２８、４３３、４３４、４３８、４３９、４４０、４４３、４４４、４４５、４４６および４４７のＦｃ領域からなる群から選択される。ここで、Ｆｃ領域のアミノ酸の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。本開示のさらなる態様では、修飾は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅである。
さらに、さまざまな刊行物に、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを分子に導入することによるか、あるいはＦｃＲｎ結合親和性は保持されているが他のＦｃ受容体に対する親和性が大幅に低下している抗体と分子を融合するか、または抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと分子を融合することによって半減期が変更されている生理活性分子を入手するための方法が記載されている。
誘導体化された抗体は、哺乳動物、特にヒトにおける親抗体の半減期（例えば、血清半減期）を変化させるために使用することができる。このような変化は、１５日を超える、好ましくは２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２ヶ月を超える、３ヶ月を超える、４ヶ月を超える、または５ヶ月を超える半減期をもたらす可能性がある。哺乳動物、好ましくはヒトにおいて本開示の抗体またはそのフラグメントの半減期が増加することにより、哺乳動物における前記抗体または抗体フラグメントの血清力価が高くなり、したがって、前記抗体または抗体フラグメントの投与の頻度が減少し、かつ／または投与される前記抗体または抗体フラグメントの濃度が低下する。インビボ半減期が増加した抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技法によって作製することができる。例えば、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与していると特定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失、または付加）することにより、インビボ半減期が増加した抗体またはそのフラグメントを作製することができる。
Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏら（２０１０）は、以前、デングウイルス感染を促進する傾向があるため、中和ｍＡｂのＣＨ２ドメインの１．３位と１．２位のロイシン残基（Ｃドメインに対するＩＭＧＴ独自の番号付けによる）がアラニン残基で置換されたものを作製することによる修飾を報告した。この修飾は、「ＬＡＬＡ」変異としても知られ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩａへの抗体結合を無効にする。変異型および未修飾組換えｍＡｂを、４つのデングウイルス血清型による感染を中和および増強する能力について比較した。ＬＡＬＡ変異体は、未修飾ｍＡｂと同じ中和活性を保持していたが、増強活性は全くなかった。したがって、この性質をもつＬＡＬＡ変異が、現在開示されている抗体との関連で企図されている。
グリコシル化の変化。本開示の特定の実施形態は、シアル酸、ガラクトース、またはフコースを含まない実質的に均質なグリカンを含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。モノクローナル抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらは両方とも、それぞれ重鎖または軽鎖定常領域に連結されていてよい。前述の実質的に均質なグリカンは、重鎖定常領域に共有結合していてもよい。
本開示の別の実施形態は、新規なＦｃグリコシル化パターンを有するｍＡｂを含む。単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントは、ＧＮＧＮまたはＧ１／Ｇ２グリコフォームで表される実質的に均質な組成で存在する。Ｆｃグリコシル化は、治療用ｍＡｂの抗ウイルスおよび抗癌特性において重要な役割を果たしている。本開示は、インビトロでのフコースを含まない抗ＨＩＶ ｍＡｂの抗レンチウイルス細胞媒介性のウイルス阻害の増加を示す最近の研究と一致している。コアフコースを欠く均質なグリカンを用いる本開示のこの実施形態は、特定のウイルスに対して２倍を超える防御率の増加を示した。コアフコースを除去すると、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に媒介されるｍＡｂのＡＤＣＣ活性が劇的に向上するが、多形核細胞（ＰＭＮ）のＡＤＣＣ活性には逆の効果があるように思われる。
ＧＮＧＮまたはＧ１／Ｇ２グリコフォームで表される実質的に均質な組成を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントは、実質的に均質なＧＮＧＮグリコフォームを含まず、Ｇ０、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、ＧＮＦ、ＧＮＧＮＦまたはＧＮＧＮＦＸ含有グリコフォームを含む同じ抗体と比較して、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩに対する結合親和性の増加を示す。本開示の一実施形態では、抗体は、ＦｃγＲＩとは１×１０－８Ｍまたはそれ未満のＫｄで、ＦｃγＲＩＩＩとは１×１０－７Ｍまたはそれ未満のＫｄで解離する。
Ｆｃ領域のグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、炭水化物部分とアスパラギン残基の側鎖の連結を指す。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つと、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンとの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンも使用することができる。炭水化物部分のアスパラギン側鎖ペプチド配列への酵素的結合の認識配列は、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンであり、ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である。したがって、これらのペプチド配列のいずれかがポリペプチドに存在すると、グリコシル化部位が作成される可能性がある。
グリコシル化パターンは、例えば、ポリペプチドに存在する１またはそれを超えるグリコシル化部位を削除することによって、かつ／またはポリペプチドに存在しない１またはそれを超えるグリコシル化部位を追加することによって変更することができる。抗体のＦｃ領域へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が１またはそれを超える上記のトリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）を含むようにアミノ酸配列を変更することによって簡便に達成される。例示的なグリコシル化変異体は、重鎖の残基Ａｓｎ２９７のアミノ酸置換を有する。この変更は、元のポリペプチドの配列（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）に、１またはそれを超えるセリンまたはスレオニン残基を追加または置換することによっても行うことができる。さらに、Ａｓｎ２９７をＡｌａに変更すると、グリコシル化部位の１つを除去することができる。
特定の実施形態では、抗体は、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）を発現する細胞で発現され、その結果、ＧｎＴ ＩＩＩはＧｌｃＮＡｃをＩＬ－２３ｐ１９抗体に付加する。このような方法で抗体を作製する方法は、国際公開第９９５４３４２号、国際公開第０３０１１８７８号、米国特許出願公開第２００３／０００３０９７（Ａ１）号、およびＵｍａｎａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：１７６－１８０、１９９９年２月に記載されている。細胞株は、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）などのゲノム編集技術を用いて、グリコシル化などの特定の翻訳後修飾を強化または減少または除去するように変更することが可能である。例えば、組換えモノクローナル抗体の発現に使用される２９３細胞またはＣＨＯ細胞において、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、グリコシル化酵素をコードする遺伝子を除去することができる。
モノクローナル抗体タンパク質配列のライアビリティの除去。ヒトＢ細胞から入手した抗体可変遺伝子配列を操作して、その製造可能性と安全性を高めることが可能である。可能性のあるタンパク質配列のライアビリティは、以下を含む部位に関連する配列モチーフを検索することによって特定することができる。
１）不対Ｃｙｓ残基、
２）Ｎ結合型グリコシル化、
３）Ａｓｎの脱アミド化、
４）ＡＳＰの異性化、
５）ＳＹＥのトランケーション、
６）Ｍｅｔの酸化、
７）Ｔｒｐの酸化、
８）Ｎ末端のグルタミン酸、
９）インテグリン結合、
１０）ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８結合、または
１１）断片化
このようなモチーフは、組換え抗体をコードするｃＤＮＡの合成遺伝子を変更することによって除去することができる。
治療用抗体の開発の分野におけるタンパク質工学の取り組みは、特定の配列または残基が、溶解度の違いに関連していることを明確に示している（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｅｓｃａｍｉｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（１０），１３０２－１３０６，２００４；Ｃｈｅｎｎａｍｓｅｔｔｙら、ＰＮＡＳ，１０６（２９），１１９３７－１１９４２，２００９；Ｖｏｙｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，２１（２），３８５－３９２，２０１０）。文献における溶解度を変化させる変異の証拠は、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびセリンなどの一部の親水性残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、リジン、およびアルギニンなどの他の親水性の残基よりも著しく有利にタンパク質の溶解度に寄与していることを示している。
安定性抗体は、生物物理学的特性を強化するために設計することができる。高温で抗体を展開し、平均の見かけ上の融解温度を使用して、相対的な安定性を判断することができる。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、分子の熱容量Ｃｐ（分子を１度加温するために必要な熱）を温度の関数として測定する。ＤＳＣは、抗体の熱安定性を調べるために使用することができる。ｍＡｂのＤＳＣデータは、時々、ｍＡｂ構造内の個々のドメインの展開を解決し、サーモグラムに最大３つのピーク（Ｆａｂ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの展開から）を生成することがあるため、特に興味深い。一般に、Ｆａｂドメインの展開は最も強いピークを生成する。ＤＳＣプロファイルとＦｃ部分の相対的な安定性は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスの特徴的な違いを示している（Ｇａｒｂｅｒ ａｎｄ Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５，７５１－７５７，２００７）。ＣＤスペクトロメーターで実行される円偏光二色性（ＣＤ）を使用して、平均の見かけ上の融解温度を決定することもできる。遠紫外ＣＤスペクトルは、０．５ｎｍ刻みで２００～２６０ｎｍの範囲の抗体について測定されることになる。最終的なスペクトルは、２０回の累積の平均として決定することができる。残基楕円率の値は、バックグラウンドを差し引いた後に計算することができる。熱による抗体のアンフォールディング（０．１ｍｇ／ｍＬ）は、２３５ｎｍで２５～９５℃および加熱速度１℃／分でモニターすることができる。動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、凝集の傾向を評価することができる。ＤＬＳは、タンパク質を含むさまざまな粒子のサイズを特徴づけるために使用される。系のサイズが分散していない場合は、粒子の平均有効径を求めることができる。この測定は、粒子コアのサイズ、表面構造のサイズ、および粒子濃度に依存する。ＤＬＳは基本的に粒子による散乱光強度の変動を測定するものであるため、粒子の拡散係数を求めることができる。市販のＤＬＡ装置に搭載されているＤＬＳソフトウェアは、異なる直径の粒子集団を表示する。安定性試験は、ＤＬＳを使用することで簡便に行うことができる。試料のＤＬＳ測定では、粒子の流体力学的半径が増加するかどうかを判断することにより、粒子が時間の経過とともに凝集するか、または温度変化とともに凝集するかを示すことができる。粒子が凝集する場合、より大きな半径の粒子のより大きな集団を見ることができる。温度に依存する安定性は、インサイツで温度を制御することによって分析することができる。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）技法には、抗体の安定性の特徴を決定するための実証済みの方法論が含まれている。ｉＣＥアプローチを使用して、脱アミド化、Ｃ末端リジン、シアル化、酸化、グリコシル化、およびタンパク質のｐＩの変化をもたらす可能性のあるタンパク質への他の変化によって、抗体タンパク質電荷変異体を分解することができる。発現した各抗体タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍａｕｒｉｃｅ装置を使用して、キャピラリーカラム（ｃＩＥＦ）でのハイスループットの自由溶液等電点電気泳動（ＩＥＦ）によって評価することができる。等電点（ｐＩ）に移動する分子をリアルタイムでモニタリングするために、カラム全体のＵＶ吸収検出は、３０秒ごとに実行することができる。このアプローチは、従来のゲルＩＥＦの高分解能と、カラムベースの分離に見られる定量化および自動化の利点を組み合わせ、可動化ステップの必要性を排除する。この技法により、発現した抗体の同一性、純度、および不均一性プロファイルを再現性よく定量分析することができる。これらの結果により、吸光モードとネイティブ蛍光検出モードの両方で、０．７μｇ／ｍＬまで低下した検出感度で、抗体の電荷の不均一性と分子サイジングを特定する。
溶解度抗体配列の固有の溶解度スコアを決定することができる。固有の溶解度スコアは、ＣａｍＳｏｌ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ（Ｓｏｒｍａｎｎｉら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２７，４７８－４９０，２０１５）を使用して計算することができる。ｓｃＦｖなどの各抗体フラグメントのＨＣＤＲ３の残基９５～１０２（Ｋａｂａｔの番号付け）のアミノ酸配列は、オンラインプログラムを介して評価して、溶解度スコアを算出することができる。実験室の技法を使用して溶解度を決定することもできる。さまざまな技法が存在し、それには、溶液が飽和して溶解限度に達するまで凍結乾燥タンパク質を溶液に添加する技術、または、マイクロコンセントレーター（ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）において適した分子量カットオフで限外ろ過により濃縮する技術がある。最も簡単な方法は、非晶質沈殿の誘導であり、硫酸アンモニウムを使用するタンパク質沈殿を伴う方法を使用してタンパク質の溶解度を測定する（Ｔｒｅｖｉｎｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３６６：４４９－４６０，２００７）。硫酸アンモニウム沈殿は、比溶解度値の迅速かつ正確な情報を提供する。硫酸アンモニウム沈殿は、明確な水相と固相を有する沈殿溶液を生成し、比較的少量のタンパク質を必要とする。硫酸アンモニウムによる非晶質沈殿の誘導を使用する溶解度測定も、異なるｐＨ値で簡単に実行することができる。タンパク質の溶解度はｐＨに大きく依存し、ｐＨは溶解度に影響を与える最も重要な外因性因子と考えられている。
自己反応性一般に、自己反応性クローンは、負の選択により、個体発生の過程で排除されると考えられている。しかし、自己反応性を有する多くのヒトの自然発生抗体が、成体の成熟したレパートリーで存続していることが明らかになってきた。初期のＢ細胞発生中の抗体のＨＣＤＲ３ループは、多くの場合、正電荷に富み、自己反応性パターンを示すことが指摘されている（Ｗａｒｄｅｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１，１３７４－１３７７，２００３）。所与抗体の自己反応性は、顕微鏡（付着性ＨｅＬａまたはＨＥｐ－２上皮細胞を使用）およびフローサイトメトリー細胞表面染色（ＪｕｒｋａｔＴ細胞および２９３Ｓヒト胚腎臓細胞懸濁液を使用）でヒト由来細胞への結合レベルを評価することにより、試験することができる。自己反応性は、組織アレイ内の組織への結合の評価を使用して調べることもできる。
好ましい残基（「ヒトらしさ」）。血液ドナー由来のヒトＢ細胞のＢ細胞レパートリーディープシークエンシングが、最近、多くの研究で大規模に実行されている。ヒトの抗体レパートリーの大部分に関する配列情報は、健康なヒトに共通する抗体配列の特徴を統計的に評価することを容易にする。ヒト組換え抗体可変遺伝子参照データベースの抗体配列の特徴を知ることにより、抗体配列の位置特異的な「ヒトらしさ」（ＨＬ）度を推定することができる。ＨＬは、治療用抗体またはワクチンとしての抗体など、臨床で使用される抗体の開発に有用であることが示されている。目標は、抗体のヒトらしさを高めて、抗体薬の有効性の大幅な低下につながるか、または深刻な健康への影響を誘発し得る可能性のある有害作用および抗抗体免疫応答を低減することである。３人の健康なヒト血液ドナーの合計約４億配列の複合抗体レパートリーの抗体特性を評価し、抗体の超可変領域に焦点を当てた新規な「相対的ヒトらしさ」（ｒＨＬ）スコアを作製することができる。ｒＨＬスコアにより、ヒト配列（正のスコア）と非ヒト配列（負のスコア）を容易に区別することが可能になる。抗体は、ヒトのレパートリーでは一般的ではない残基を除去するように設計することができる。
Ｅ．一本鎖抗体
一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、短い（通常はセリン、グリシン）リンカーで結合された、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の融合物である。このキメラ分子は、定常領域を除去し、リンカーペプチドを導入したにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。この修飾により、通常、特異性は変更されない。これらの分子は、歴史的に、抗原結合ドメインを単一のペプチドとして発現させるのに非常に便利なファージディスプレイを容易にするために作成された。あるいは、ｓｃＦｖは、ハイブリドーマまたはＢ細胞に由来する重鎖および軽鎖をサブクローン化したものから直接作製することもできる。一本鎖可変フラグメントは、完全な抗体分子に見いだされる定常Ｆｃ領域を欠いているため、抗体を精製するために使用される共通の結合部位（例えば、プロテインＡ／Ｇなど）を欠く。プロテインＬはκ軽鎖の可変領域と相互作用するため、これらのフラグメントは、多くの場合、プロテインＬを使用して精製／固定化することができる。
柔軟なリンカーは一般に、アラニン、セリン、およびグリシンなどのヘリックスおよびターンを促進するアミノ酸残基で構成されている。しかし、他の残基も機能する可能性がある。Ｔａｎｇら（１９９６）は、タンパク質リンカーライブラリから一本鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）用に作製されたリンカーを迅速に選択する手段としてファージディスプレイを使用した。重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子が、可変組成の１８アミノ酸ポリペプチドをコードするセグメントによって連結されている、ランダムリンカーライブラリが構築された。ｓｃＦｖレパートリー（約５×１０６の異なるメンバー）を繊維状ファージに表示させ、ハプテンとの親和性選択を行った。選択された変異体の集団は、結合活性の有意な増加を示したが、かなりの配列多様性を保持していた。続いて、１０５４個の個々の変異体をスクリーニングすると、可溶性形態で効率的に生成された、触媒活性のあるｓｃＦｖが得られた。配列解析により、ＶＨ Ｃ末端から２残基後のリンカーに保存されたプロリンと、その他の位置に豊富にあるアルギニンとプロリンが、選択されたテザーの唯一の共通の特徴として明らかになった。
本開示の組換え抗体はまた、受容体の二量体化または多量体化を可能にする配列または部分を含み得る。このような配列には、ＩｇＡに由来する配列が含まれ、これはＪ鎖とともに多量体の形成を可能にする。別の多量体化ドメインは、Ｇａｌ４二量体形成ドメインである。他の実施形態では、鎖は、２つの抗体の組み合わせを可能にするビオチン／アビジンなどの薬剤で修飾されてよい。
別の実施形態では、一本鎖抗体は、非ペプチドリンカーまたは化学ユニットを使用して、受容体軽鎖および重鎖を結合することによって作製することができる。一般に、軽鎖および重鎖は、別個の細胞で生成され、精製され、その後適切な方法で共に結合される（すなわち、重鎖のＮ末端が、適切な化学架橋を介して軽鎖のＣ末端に結合される）。
架橋試薬は、２つの異なる分子の官能基を結ぶ分子架橋を形成するために使用され、例えば、安定剤および凝固剤がある。しかし、同じ類似体の二量体または他量体、あるいは異なる類似体からなるヘテロマー複合体を作製することができると企図されている。２つの異なる化合物を段階的に結合するために、不要なホモポリマーの形成を除去するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。
例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、２つの反応性基を含み、１つは第一級アミン基（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、もう１つはチオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。第一級アミン反応性基を介して、架橋剤は、１つのタンパク質（例えば、選択された抗体またはフラグメント）のリジン残基と反応することがあり、チオール反応性基を介して、すでに最初のタンパク質に結合している架橋剤は、他方のタンパク質（例えば、選択剤）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
血液中で適切な安定性を有する架橋剤が用いられることが好ましい。ターゲティング剤および治療／予防剤を結合させるために首尾よく使用することができる多くの種類のジスルフィド結合含有リンカーが知られている。立体障害となるジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボでより高い安定性をもたらし、作用部位に到達する前に標的ペプチドが放出されるのを防ぐことができ得る。したがって、これらのリンカーは、連結剤の１つの群である。
別の架橋試薬はＳＭＰＴである。これは、隣接するベンゼン環とメチル基によって「立体障害」があるジスルフィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在し得るグルタチオンなどのチオラートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それによって結合した薬剤を標的部位に送達する前の複合体の分離を防ぐのに役立つと考えられている。
ＳＭＰＴ架橋試薬は、他の多くの既知の架橋試薬と同様に、システインのＳＨまたは第一級アミン（例えば、リジンのε－アミノ基）などの官能基を架橋する能力をに手を貸す。別の可能な種類の架橋剤には、スルホスクシンイミジル－２－（ｐ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネートなどの切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが含まれる。Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル基は、一級アミノ基と反応し、フェニルアジド（光分解時）は、任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。
ヒンダード架橋剤に加えて、非ヒンダードリンカーも、本明細書に従って採用することができる。保護されたジスルフィドを含むまたは生成するとは見なされない他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２－イミノチオランが含まれる。そのような架橋剤の使用は、当技術分野でよく理解されている。別の実施形態は、柔軟なリンカーの使用を含む。
米国特許第４，６８０，３３８号は、アミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とのリガンドの複合体を生成するために有用な、特にキレート剤、薬物、酵素、検出可能な標識などと抗体複合体を形成するために有用な、二官能性リンカーを記載している。米国特許第５，１４１，６４８号および第５，５６３，２５０号は、多様な温和条件下で切断可能な不安定な結合を含有する切断可能な複合体を開示している。このリンカーは、目的の薬剤がリンカーに直接結合することがあり、切断によって活性薬剤が放出されるという点で特に有用である。特定の用途には、抗体または薬物などのタンパク質に遊離アミノ基または遊離スルフヒドリル基を付加することが含まれる。
米国特許第５，８５６，４５６号は、ポリペプチド構成要素を接続して融合タンパク質、例えば一本鎖抗体を作製するのに使用するためのペプチドリンカーを提供している。リンカーは、最大約５０アミノ酸の長さであり、少なくとも１回の荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリジン）の出現とそれに続くプロリンの出現を含み、安定性がより高く、凝集が少ないことを特徴とする。米国特許第５，８８０，２７０号は、多様な免疫診断および分離技法において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示している。
Ｆ．多重特異性抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、二重特異性または多重特異性である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を持つ抗体である。例示的な二重特異性抗体は、単一の抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体は、第１の抗原結合部位を第２の抗原の結合部位と組み合わせてもよい。あるいは、抗原特異的アームは、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ３）、あるいはＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＩＩＩ（ＣＤ１６）にアームを結合し、それにより細胞防御機構を感染細胞に集中させ、局在化させてもよい。二重特異性抗体を使用して、細胞傷害性薬剤を感染細胞に局在化させてもよい。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性薬剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン－α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有している。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２二重特異性抗体）として調製することができる。国際公開第９６／１６６７３号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示する。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。従来の完全長二重特異性抗体の製造は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づいており、ここで２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖がランダムに分類されているため、これらのハイブリドーマ（クアドロマ）は１０種類の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうち１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィーのステップで行われるが、かなり面倒であり、生成物の収率も低い。同様の手順は、国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に開示されている。
別のアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体－抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。好ましくは、融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、少なくとも１つの融合物に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物と、必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適した宿主細胞に同時トランスフェクトされる。このことは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不均等な比率が所望の二重特異性抗体の最適な収量を提供する場合、実施形態において３つのポリペプチド断片の相互比率を調整する際に、より大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖を等しい比率で発現させると高い収量をもたらす場合、または比率が所望の鎖の組合せの収量にあまり影響を及ぼさない場合には、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの特定の実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームの第１の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、もう一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対（第２の結合特異性を提供）で構成される。免疫グロブリン軽鎖が二重特異性分子の半分にしか存在しないことにより容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造は、所望の二重特異性化合物を望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せから分離することを容易にすることが見出された。このアプローチは、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載の別のアプローチによると、組換え型細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように抗体分子対間の界面を設計することができる。好ましい界面は、少なくとも一部のＣＨ３ドメインを含む。この方法では、一次抗体分子の界面からの１またはそれを超える小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）に置き換えることにより、１つまたは複数の大きな側鎖と同一または類似のサイズの代償的な「空洞」が二次抗体分子の界面に作成される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ二量体の収量を増やすための機構を提供する。
二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンに結合することができ、他方をビオチンに結合することができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞の望ましくない細胞への標的化（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、および欧州特許第０３０８９号）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製することができる。適した架橋剤は当技術分野で周知であり、多くの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための技法もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順について説明している。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防ぐ。作製されたＦａｂ’フラグメントは、次にチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次に、Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’－チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体と混合すると二重特異性抗体が形成される。作製した二重特異性抗体は、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’－ＳＨフラグメントを直接回収し、これを化学的に結合させて二重特異性抗体を形成することを容易にする技法が存在する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７－２２５（１９９２）は、ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別々に分泌され、インビトロで直接化学カップリングを受けて二重特異性抗体を形成した。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し、ヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発できた。
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するためのさまざまな技法も記載されている（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，６７７－６８１（１９９８））。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して作製されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３，１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結されていた。抗体ホモ二量体はヒンジ領域で還元されて単量体を形成し、次に再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の製造にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）によって記載された「ダイアボディー」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供した。これらのフラグメントは、ＶＨとＶＬがリンカーによって接続されているが、このリンカーは短すぎて、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にしない。したがって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインを別の断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと強制的に対合させ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
特定の実施形態では、二重特異性もしくは多重特異性抗体は、ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体として形成されてよい（例えば、その各々の実施例の項が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，５２１，０５６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５５０，１４３号および同第７，６６６，４００号参照）。一般に、この技法は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、多様なＡＫＡＰタンパク質のいずれかに由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列との間に生じる特異的かつ高親和性の結合相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４；Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤペプチドおよびＡＤペプチドは、任意のタンパク質、ペプチド、またはその他の分子に結合させることができる。ＤＤＤ配列は自発的に二量体化してＡＤ配列に結合するため、この技法では、ＤＤＤまたはＡＤ配列に結合することができる、選択された分子間の複合体の形成が可能になる。
２よりも大きい結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０、１９９１；Ｘｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５８（６３５９）：８５－９０，２０１７）。多価抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内在化（および／または異化）され得る。本開示の抗体は、３またはそれを超える抗原結合部位を有する多価抗体（例えば、四価抗体）であってよく、それは抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に作製することができる。多価抗体は、二量体形成ドメインおよび３またはそれを超える抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体形成ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれからなる）。このシナリオでは、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端にある３またはそれを超える抗原結合部位を含む。本明細書における好ましい多価抗体は、３から約８、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、１または複数のポリペプチド鎖は、２またはそれを超える可変領域を含む。例えば、１または複数のポリペプチド鎖は、ＶＤ１－（Ｘ１）．ｓｕｂ．ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃを含んでよく、ここで、ＶＤ１は第１の可変領域、ＶＤ２は第２の可変領域、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチド、ｎは０または１である。例えば、１または複数のポリペプチド鎖は、ＶＨ－ＣＨ１－可動性リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含んでよい。本明細書の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変領域ポリペプチドをさらに含む。本明細書の多価抗体は、例えば、約２から約８の軽鎖可変領域ポリペプチドを含み得る。本明細書で企図される軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、必要に応じて、ＣＬドメインをさらに含む。
電荷修飾は、多重特異性抗体の状況において特に有用であり、Ｆａｂ分子のアミノ酸置換は、その結合アームの１つ（３つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合は１つ以上）でＶＨ／ＶＬ交換を行うＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の製造において発生する可能性のある、軽鎖と不一致重鎖の不対合（ベンスジョーンズ型副生成物）を減少させる（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１５０４４７号（特にその中の実施例）も参照）。
Ｇ．キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体分子は、組換え融合タンパク質であり、抗原との結合と、細胞質側末端に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介した活性化シグナルの伝達の両方を行う能力によって区別される。抗原結合部分（例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成される）を利用する受容体構築物は、ＨＬＡに依存しない方法で標的細胞表面上の天然抗原に結合するという点で「ユニバーサル」であるという追加の利点をもたらす。
キメラ抗原受容体は、当技術分野で公知の任意の手段によって作製することができるが、組換えＤＮＡ技法を使用して作製されることが好ましい。キメラ抗原受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列は、分子クローニングの標準的な技法（ゲノムライブラリスクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、酵母および細菌由来のｓｃＦｖライブラリ、部位特異的変異誘発など）により調製し、完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域は、発現ベクターに挿入し、Ｔ細胞やＮＫ細胞などの適した発現宿主の同種または自家免疫エフェクター細胞を形質転換するために使用することができる。
本明細書に記載のＣＡＲの実施形態には、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および１またはそれを超えるシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸が含まれる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１またはそれを超える抗原間の共有スペースからなるエピトープを認識することができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、およびｃ）抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。必要に応じて、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間に配置されたヒンジドメインを含むことができる。特定の態様では、実施形態のＣＡＲは、ＣＡＲの発現を細胞表面に向けるシグナルペプチドをさらに含む。例えば、一部の態様では、ＣＡＲは、ＧＭ－ＣＳＦからのシグナルペプチドを含むことができる。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、膜結合サイトカインと共発現させて、腫瘍関連抗原の量が少ない場合に持続性を向上させることもできる。例えば、ＣＡＲは膜結合型ＩＬ－１５と共発現させることができる。
ＣＡＲのドメインの配置およびドメインで使用される特定の配列に応じて、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対して異なるレベルの活性を有することがある。一部の態様では、異なるＣＡＲ配列を免疫エフェクター細胞に導入して、操作された細胞を生成し、その操作された細胞をＳＲＣの上昇について選択し、その選択された細胞を活性について試験して、最大の治療効力を有すると予測されるＣＡＲ構築物を特定してもよい。
１．抗原結合ドメイン
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはその抗原結合フラグメントを含み得る。もう一つの実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原を補完し、それによりその特定の抗原に対する特異性を受容体に与える、抗原受容体（例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見出される短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）が含まれている。抗原受容体は一般に２つのポリペプチド鎖で構成されているため、抗原と接触する可能性のあるＣＤＲは抗原受容体ごとに６つ存在する（重鎖と軽鎖にはそれぞれ３つのＣＤＲが含まれている）。免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体に関連するほとんどの配列変異はＣＤＲに見出されるため、これらの領域は超可変ドメインと呼ばれることもある。これらの中で、ＣＤＲ３はＶＪ（重鎖およびＴＣＲαβ鎖の場合はＶＤＪ）領域の組換えによってコードされているため、最大の変動性を示す。
ＣＡＲ核酸、特にｓｃＦｖ配列は、ヒト患者の細胞性免疫療法を増強するためのヒト遺伝子であることが企図されている。特定の実施形態では、全長ＣＡＲ ｃＤＮＡまたはコード領域が提供される。抗原結合領域またはドメインは、特定のマウス、またはヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のフラグメントを含むことができる。また、フラグメントは、抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであり得る。より具体的な実施形態では、フラグメントは、ヒト細胞での発現のためのヒトコドン使用に最適化された配列によってコード化された抗原特異的ｓｃＦｖである。特定の態様では、ＣＡＲのＶＨおよびＶＬドメインは、Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーなどのリンカー配列によって分離されている。実施形態に従って修飾または使用され得るＣＡＲ構築物は、参照により本明細書に組み込まれる国際（ＰＣＴ）特許公開第ＷＯ／２０１５／１２３６４２号にも提供されている。
前述のように、プロトタイプのＣＡＲは、膜貫通ドメインと１またはそれを超える細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよびシグナル伝達ドメイン）に結合した、１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来のＶＨドメインとＶＬドメインを含むｓｃＦｖをコードする。したがって、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原などの目的の抗原に結合する抗体のＬＣＤＲ１－３配列およびＨＣＤＲ１－３配列を含むことがある。しかし、さらなる態様では、目的の抗原に結合する２またはそれを超える抗体が特定され、以下を含むＣＡＲが構築される：（１）抗原に結合する第１の抗体のＨＣＤＲ１－３配列；および（２）抗原に結合する第２の抗体のＬＣＤＲ１－３配列。２つの異なる抗原結合抗体からのＨＣＤＲおよびＬＣＤＲ配列を含むこのようなＣＡＲは、抗原の特定の立体構造（例えば、正常組織に対して癌細胞に優先的に関連する立体構造）に対して優先的に結合するという利点を有することがある。
あるいは、異なるｍＡｂに由来するＶＨ鎖およびＶＬ鎖を使用してＣＡＲを設計して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のパネルを生成することができることも示される。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、第１の抗体のＬＣＤＲ１－３配列と第２の抗体のＨＣＤＲ１－３配列の任意の組み合わせを含むことができる。
２．ヒンジドメイン
特定の態様では、実施形態のＣＡＲポリペプチドは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置されたヒンジドメインを含むことができる。場合によっては、抗原結合ドメインと細胞表面との間に適切な距離を提供するため、またはＣＡＲ遺伝子修飾Ｔ細胞の抗原結合またはエフェクター機能に悪影響を与える可能性のある立体障害を軽減するために、ヒンジドメインをＣＡＲポリペプチドに含めてよい。一部の態様では、ヒンジドメインは、ＦｃγＲ２ａまたはＦｃγＲ１ａなどのＦｃ受容体に結合する配列を含む。例えば、ヒンジ配列は、Ｆｃ受容体に結合するヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）由来のＦｃドメインを含んでよい。特定の態様では、ヒンジドメイン（および／またはＣＡＲ）は、野生型ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３配列を含まない。
場合によってはＣＡＲヒンジドメインは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域またはＩｇヒンジを含むその一部、あるいはヒトＣＤ８α膜貫通ドメインおよびＣＤ８ａヒンジ領域に由来することがあり得る。一態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、抗体アイソタイプＩｇＧ４のヒンジＣＨ２－ＣＨ３領域を含むことができる。一部の態様では、点変異を抗体重鎖ＣＨ２ドメインに導入して、グリコシル化およびＣＡＲ－Ｔ細胞または他の任意のＣＡＲ修飾細胞の非特異的Ｆｃガンマ受容体結合を減少させることができ得る。
特定の態様では、実施形態のＣＡＲヒンジドメインは、Ｆｃ受容体結合を減少させる、野生型Ｉｇ Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つの突然変異を含むＩｇ Ｆｃドメインを含む。例えば、ＣＡＲヒンジドメインは、Ｆｃ受容体結合を減少させる、野生型ＩｇＧ４－Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つの突然変異を含むＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含む。一部の態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４－Ｆｃ配列と比較してＬ２３５および／またはＮ２９７に対応する位置に変異（アミノ酸の欠失または置換など）を有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含む。例えば、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４－Ｆｃ配列と比較してＬ２３５Ｅおよび／またはＮ２９７Ｑ変異を有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含むことができる。さらなる態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、位置Ｌ２３５に、親水性であるアミノ酸（例えばＲ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱなど）または「Ｅ」に類似する特性を有するアミノ酸（例えばＤなど）となるアミノ酸置換を有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含むことができる。特定の態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、位置Ｎ２９７に、「Ｑ」に類似する特性を有するアミノ酸（例えばＳまたはＴなど）となるアミノ酸置換を有するＩｇＧ４－Ｆｃドメインを含むことができる。
ある特定の態様では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４ヒンジドメイン、ＣＤ８ａヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメインまたは操作されたヒンジドメインと約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む。
３．膜貫通ドメイン
抗原特異的細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインによって連結され得る。膜貫通ドメインの一部として使用することができるポリペプチド配列には、限定されないが、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、膜貫通ヒトＣＤ３ζドメイン、またはシステイン変異ヒトＣＤ３ζドメイン、あるいはＣＤ１６およびＣＤ８およびエリスロポエチン受容体などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質からの他の膜貫通ドメインが含まれる。一部の態様では、例えば、膜貫通ドメインは、米国特許出願公開第２０１４／０２７４９０９（例えばＣＤ８および／またはＣＤ２８膜貫通ドメイン）または米国特許第 ８，９０６，６８２号（例えばＣＤ８α膜貫通ドメイン）に記載されているものの１つと少なくとも ８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含み、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。本発明で特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来する（すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域を含む）ことがある。ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインと８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。
４．細胞内シグナル伝達ドメイン
本実施形態のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、分化した細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。ナイーブ、メモリー、またはメモリー型Ｔ細胞のエフェクター機能には、抗原依存性の増殖が含まれる。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。一部の態様では、細胞内シグナル伝達ドメイン、天然の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。そのような天然の受容体の例としては、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η、δ、γ、またはε）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ ＲＩＩＩ、Ｆｃ ＲＩ、ならびにシグナル伝達分子の組合せ、例えばＣＤ３ζとＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ－１０、ＯＸ４０、およびこれらの組合せなど、ならびに他の類似する分子および断片が含まれる。活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用することができる。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はないであろう。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用され得る程度まで、そのような切断部分がエフェクター機能シグナルを依然として伝達する限り、それを無傷の鎖の代わりに使用してもよい。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、ＣＡＲが標的に結合すると、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を含むことを意味する。好ましい実施形態では、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインは、これらの実施形態のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとして使用される。
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内受容体シグナル伝達ドメインには、例えば、ＣＤ３のζ鎖などのＴ細胞抗原受容体複合体のシグナル伝達ドメイン、また、Ｆｃγ ＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２が、単独でまたはＣＤ３ζと直列で含まれる。特定の実施形態では、細胞内ドメイン（細胞質ドメインと呼ばれることもある）は、１またはそれを超えるＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ－２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＣＤ４０の一部または全部を含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインの内因性Ｔ細胞受容体複合体の任意の部分を使用する。いわゆる第３世代のＣＡＲは、少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを相加効果または相乗効果のために一緒に融合しているため、１つまたは複数の細胞質ドメインを用いることができる。例えばＣＤ２８と４－１ＢＢをＣＡＲ構築物において組み合わせることができる。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、追加の他の共刺激ドメインを含む。その他の共刺激ドメインとしては、限定されるものではないが、１またはそれを超えるＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられ得る。ＣＤ３ζによって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体によって提供される追加シグナルは、T細胞の完全な活性化に重要であり、インビボでの持続性および養子免疫療法の治療上の成功を改善するのに役立ち得る。
ある特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ１３７細胞内ドメイン、または４－１ＢＢ細胞内ドメインと融合したＣＤ２８細胞内ドメインを含むドメインと８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一の配列を含む。
Ｈ．ＡＤＣ
抗体薬物複合体またはＡＤＣは、疾患をもつ人を処置するための標的治療として設計された、新しいクラスの非常に強力なバイオ医薬品である。ＡＤＣは、抗体（全ｍＡｂ、または一本鎖可変フラグメントなどの抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ）で構成される複合分子であり、不安定な結合をもつ安定な化学リンカーを介して、生物学的に活性な細胞傷害性／抗ウイルス性のペイロードすなわち薬物に結合させたものである。抗体薬物複合体は、バイオコンジュゲートおよび免疫コンジュゲートの例である。
モノクローナル抗体の特有のターゲティング能力と細胞傷害性薬の癌殺傷能力を組み合わせることにより、抗体薬物複合体は、健康な組織と病気の組織を高感度に識別することができる。これは、従来の全身的アプローチとは対照的に、抗体薬物複合体は病気の細胞を標的にして攻撃するため、健康な細胞はそれほど深刻な影響を受けないことを意味する。
ＡＤＣベースの抗腫瘍治療の開発では、抗癌剤（例えば、細胞毒（ｃｅｌｌ ｔｏｘｉｎ）または細胞毒（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ））が、特定の細胞マーカー（例えば、理想的には、感染細胞の中または上にのみ見られるタンパク質）を特異的に標的とする抗体に結合される。抗体はこれらのタンパク質を体内で追跡し、癌細胞の表面に付着する。抗体と標的タンパク質（抗原）の間の生化学反応により、腫瘍細胞は、シグナルを誘発し、細胞毒素と一緒に抗体を吸収または内在化する。ＡＤＣが内在化した後、細胞傷害性薬が放出され、細胞を殺傷するか、細胞の複製を障害する。このターゲティングにより、理想的には、この薬は他の薬剤よりも副作用が少なく、治療域が広くなる。
抗体と細胞傷害性薬剤との間の安定した結合は、ＡＤＣの重要な側面である。リンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾンまたはペプチド（切断可能）、またはチオエーテル（切断不可能）をはじめとする化学モチーフに基づいており、細胞傷害性薬剤の標的細胞への分布および送達を制御する。切断可能および切断不可能な種類のリンカーは、前臨床試験および臨床試験において安全であることが証明されている。ブレンツキシマブベドチンには、強力で毒性の高い微小管阻害剤であるモノメチルオーリスタチンＥまたは合成抗腫瘍剤であるＭＭＡＥをヒト特異的ＣＤ３０陽性悪性細胞に送達する、酵素に感受性があり切断可能なリンカーが含まれる。チューブリンの重合を阻害することにより細胞分裂を阻害するＭＭＡＥは毒性が高いため、単剤の化学療法薬として使用することはできない。しかし、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体（ｃＡＣ１０、腫瘍壊死因子またはＴＮＦ受容体の細胞膜タンパク質）に結合したＭＭＡＥの組み合わせは、細胞外液中で安定であり、カテプシンによって切断可能であり、治療に安全であることが証明された。トラスツズマブエムタンシンは、もう一つの承認済みＡＤＣで、マイタンシンの誘導体である微小管形成阻害剤メルタンシン（ＤＭ－１）と、安定な切断不可能なリンカーで結合させた抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）の組合せである。
より優れた、より安定したリンカーが利用可能になったことで、化学結合の機能が変化した。切断可能なまたは切断不可能なリンカーの種類により、細胞傷害性（抗癌）薬に特定の特性が与えられる。例えば、切断不可能なリンカーは、細胞内に薬物を保持する。その結果、全ての抗体、リンカー、細胞傷害性薬剤が標的癌細胞に侵入し、そこで抗体はアミノ酸のレベルまで分解される。結果として得られる複合体（アミノ酸、リンカーおよび細胞傷害性薬剤）は、ここで活性薬物となる。対照的に、切断可能なリンカーは、宿主細胞内の酵素によって触媒され、細胞傷害性薬剤を放出する。
現在開発中の別の種類の切断可能なリンカーは、細胞傷害性薬と切断部位の間に余分な分子を追加する。このリンカー技術により、研究者は切断速度の変化を心配することなく、より柔軟性のあるＡＤＣを作成できる。また、研究者らはペプチド中のアミノ酸を配列決定する方法であるエドマン分解に基づくペプチド切断の新しい方法の開発も行っている。ＡＤＣの開発における今後の方向性には、安定性および治療指数をさらに改善するための部位特異的結合（ＴＤＣ）、およびα線放出免疫複合体および抗体結合ナノ粒子の開発も含まれる。
Ｉ．ＢｉＴＥ
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ：ＢｉＴＥ）は、抗癌剤としての使用が検討されている人工二重特異性モノクローナル抗体の１つのクラスである。ＢｉＴｅは、感染細胞に対して、宿主の免疫系、より具体的にはＴ細胞の細胞障害活性を向かわせる。ＢｉＴＥはＭｉｃｒｏｍｅｔ ＡＧの登録商標である。
ＢｉＴＥは、約５５キロダルトンの単一のペプチド鎖上の、異なる抗体の２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、または４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖの１つはＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、もう１つは特定の分子を介して感染細胞に結合する。
他の二重特異性抗体と同様に、そして通常のモノクローナル抗体とも異なって、ＢｉＴＥはＴ細胞と標的細胞との間にリンクを形成する。これにより、Ｔ細胞は、ＭＨＣ Ｉまたは共刺激分子の存在とは無関係に、パーフォリンおよびグランザイムのようなタンパク質を産生することにより、感染細胞に細胞毒性活性を発揮する。これらのタンパク質は感染細胞に侵入し、細胞のアポトーシスを開始する。Ｔこの作用は、Ｔ細胞が感染細胞に攻撃する間に観察される生理的プロセスを模倣している。
Ｊ．イントラボディ
特定の実施形態では、抗体は、細胞内での作用に適した組換え抗体であり、そのような抗体は「イントラボディ」として公知である。これらの抗体は、細胞内のタンパク質輸送の変更、酵素機能の阻害、タンパク質－タンパク質相互作用またはタンパク質－ＤＮＡ相互作用の遮断など、多様な機構によって標的機能を阻害することがある。多くの点で、これらの構造は、上記の一本鎖および単一ドメイン抗体の構造を模倣しているかまたは同等である。実際に、単一転写物／一本鎖は、標的細胞での細胞内発現を可能にし、また細胞膜を通過するタンパク質をより実現可能にする重要な特徴である。しかし、さらなる特徴が必要である。
イントラボディ治療の実施に影響を与える２つの主要な問題は、細胞／組織ターゲティングを含む送達と安定性である。送達に関しては、組織指向性送達、細胞型特異的プロモーターの使用、ウイルスベースの送達、および細胞透過性／膜移行ペプチドの使用など、多様なアプローチが採用されてきた。送達の１つの手段は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１７７７２７号に教示されているように、脂質ベースのナノ粒子またはエクソソームの使用を含む。安定性に関しては、アプローチは、一般に、ファージディスプレイを伴い、配列の成熟またはコンセンサス配列の発達を含み得る方法を含む、総当たりによるスクリーニングによるか、あるいは、挿入安定化配列（例えば、Ｆｃ領域、シャペロンタンパク質配列、ロイシンジッパー）およびジスルフィド置換／修飾などのさらなる指向性修飾による。
イントラボディが必要とし得るさらなる特徴は、細胞内ターゲティングのためのシグナルである。イントラボディ（または他のタンパク質）を細胞質、核、ミトコンドリア、およびＥＲなどの細胞内領域に標的化することができるベクターは、設計され、市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。
Ｋ．精製
本開示の抗体は精製されてよい。本明細書で使用される「精製された」という用語は、他の成分から分離可能な組成を指すことを意図し、この際、タンパク質は、その天然に得られる状態に対してある程度に精製されている。したがって、精製されたタンパク質とは、自然に存在し得る環境から分離されたタンパク質も指す。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この呼称は、タンパク質またはペプチドが組成物の主成分を形成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成する組成物を指すことになる。
タンパク質精製技法は当業者に周知である。これらの技法は、あるレベルでは、細胞環境のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への粗分画を含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、目的のポリペプチドは、部分的または完全な精製（または均質にする精製）を達成するために、クロマトグラフィーおよび電気泳動の技法を使用してさらに精製することができる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。タンパク質精製のためのその他の方法には、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などによる沈殿、または熱変性とそれに続く遠心分離；ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィー；ならびにこのような技法とその他の技法の組合せが含まれる。
本開示の抗体を精製する際、原核生物または真核生物の発現系でポリペプチドを発現させ、変性条件を使用してタンパク質を抽出することが望ましい場合がある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ付けされた部分に結合するアフィニティーカラムを使用して、他の細胞成分から精製してもよい。当技術分野で一般に公知のように、さまざまな精製工程を実施する順序は変更してもよいし、特定の工程を省略してもよく、それでも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適した方法が得られると考えられる。
一般に、完全な抗体は、抗体のＦｃ部分に結合する薬剤（すなわちプロテインＡ）を利用して分画される。あるいは、抗原を使用して、適切な抗体を同時に精製および選択してもよい。このような方法では、カラム、フィルター、ビーズなどの支持体に結合させた選択剤を利用することが多い。抗体を支持体に結合させ、汚染物質を除去（例えば、洗浄）し、条件（塩、熱など）を加えることによって抗体を放出させる。
タンパク質又はペプチドの精製の程度を定量化するためのさまざまな方法は、本開示に照らして当業者の知るところであろう。これらには、例えば、活性画分の比活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する別の方法は、画分の比活性を計算し、それを最初の抽出物の比活性と比較して、純度の程度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択した特定のアッセイ技法と、発現したタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存する。
ペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの条件が異なると、場合によっては大幅に変化する可能性があることが知られている。したがって、電気泳動条件下が異なれば、精製されたまたは部分的に精製された発現産物の見かけの分子量が変化し得ることが理解されよう。
Ｌ．抗体複合体
本開示の抗体は、少なくとも１つの薬剤に連結されて抗体複合体を形成することができる。抗体分子の診断薬または治療薬としての有効性を高めるために、従来法では、少なくとも１つの所望の分子や部分を連結するか、または共有結合させるかまたは複合体化する。そのような分子または部分は、限定されるものではないが、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であり得る。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合させたエフェクター分子の限定されない例には、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、増殖因子、およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の部分として定義される。抗体に結合させたレポーター分子の限定されない例には、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子または、ビオチンなどのリガンドが含まれる。
抗体複合体は、一般に、診断薬として使用することが好ましい。抗体診断薬は、一般に２つのクラスに分類され、インビトロ診断、例えば多様なイムノアッセイで使用するためのもの、および一般に「抗体指向性イメージング」と呼ばれるインビボ診断プロトコールで使用するためのものがある。多くの適切な造影剤が当技術分野で公知であり、それらを抗体に結合させるための方法も同様である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号、および同第４，４７２，５０９号参照）。使用されるイメージング部分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、およびＸ線造影剤であり得る。
常磁性イオンの場合、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）および／またはエルビウム（ＩＩＩ）などのイオンを例として挙げることができ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線画像化などの他の状況で有用なイオンには、限定されるものではないが ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、特にビスマス（ＩＩＩ）が含まれる。
治療用途および／または診断用途の放射性同位元素の場合には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｉｃｉｕｍ）９９ｍおよび／またはイットリウム９０を挙げることができる。１２５Ｉは、特定の実施形態での使用にしばしば好まれ、テクネチウム（ｔｅｃｈｎｉｃｉｕｍ）９９ｍおよび／またはインジウム１１１も、その低エネルギーおよび長距離検出への適合性から、好まれることが多い。本開示の放射性標識モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法に従って製造されてよい。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウムと、次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤とを接触させることによってヨウ素化することができる。本開示によるモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスで、例えば、過テクネチウム酸塩（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）をスズ溶液で還元し、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上でキレート化し、このカラムに抗体を適用することによって、テクネチウム９９ｍで標識されてよい。あるいは、例えば、過テクネチウム酸塩（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）、ＳＮＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウム－カリウム溶液などの緩衝液、および抗体をインキュベートすることによる、直接標識する技法を使用してもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素を抗体に結合するためによく使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
複合体としての使用が企図されている蛍光標識には、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６－ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドがある。
本開示で企図されるさらなる種類の抗体は、主にインビトロでの使用を意図したものであり、ここで抗体は、二次結合リガンドおよび／または発色基質と接触して着色生成物を生成する酵素（酵素タグ）に連結されている。適した酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋わさび）水素ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼが含まれる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号に記載されている。
抗体への分子の部位特異的結合のさらに別の方法は、抗体とハプテンベースの親和性標識との反応を含む。基本的に、ハプテンベースの親和性標識は抗原結合部位のアミノ酸と反応し、それによってこの部位を破壊し、特定の抗原反応を遮断する。しかし、これは、抗体複合体による抗原結合の喪失をもたらすので、有利ではないかもしれない。
アジド基を含有する分子は、強度の低い紫外線によって生成される反応性ナイトレン中間体を通じてタンパク質に共有結合を形成するためにも使用することができる。特に、プリンヌクレオチドの２－および８－アジド類似体は、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を識別するための部位特異的光プローブとして使用されてきた。２－および８－アジドヌクレオチドは、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするためにも使用されており、抗体結合剤として使用され得る。
抗体とそのコンジュゲート部分を結合またはコンジュゲートさせるためのいくつかの方法が、当技術分野で公知である。いくつかの結合方法は、例えば、抗体に結合した、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ－クロロ－ｐ－トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ－３α－６α－ジフェニルグリコールウリル（ｄｉｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｏｕｒｉｌ）－３などの有機キレート剤を使用する金属キレート錯体の使用を伴う（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号）。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとの複合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。米国特許４，９３８，９４８号では、乳腺腫瘍の画像化はモノクローナル抗体を使用して達成され、検出可能な画像化部分はメチル－ｐ－ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ－スクシンイミジル－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネートなどのリンカーを使用して抗体に結合させる。
他の実施形態では、抗体結合部位を変化させない反応条件を使用して、免疫グロブリンのＦｃ領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が企図される。この方法論に従って作製された抗体複合体は、改善された寿命、特異性および感度を示すことが開示されている（米国特許第５，１９６，０６６号、参照により本明細書に組み込まれる）。レポーターまたはエフェクター分子がＦｃ領域の炭水化物残基に結合されている、エフェクターまたはレポーター分子の部位特異的結合もまた、文献に開示されている。このアプローチは、現在臨床評価中の診断的および治療的に有望な抗体を生成することが報告されている。
ＩＩ．処置方法
本実施形態の特定の態様は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）などのホモ三量体Ｉ型コラーゲンの存在に関連する疾患または障害を予防または処置するために使用することができる。ホモ三量体Ｉ型コラーゲンの機能は、ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとα３β１インテグリンとの相互作用を妨害する適した薬剤によって低下する可能性がある。例えば、そのような物質には、抗α３β１インテグリン抗体、α３インテグリンｓｉＲＮＡ、Ｃｏｌ１ ｓｉＲＮＡなどが含まれ得る。
「処置」および「処置すること」は、疾患または健康に関連する症状の治療上の利益を得ることを目的とする、被験体への治療薬の投与または適用、あるいは被験体に対する手順またはモダリティの実施を指す。例えば、処置には、α３β１インテグリンを単独で、あるいは化学療法、免疫療法、または放射線療法の投与、手術の実施、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて標的とする、薬学的有効量の抗体の投与が含まれてよい。
本明細書において使用される「被験体」という用語は、対象の方法が実行される任意の個人または患者を指す。一般に、被験体はヒトであるが、当業者に理解されるように、被験体は動物であってもよい。したがって、哺乳動物をはじめとするその他の動物、例えば齧歯動物（マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む）、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）などが、被験体の定義に含まれる。
本出願を通して使用される「治療上の利益」または「治療上効果的」という用語は、この症状の医学的処置に関して被験体の幸福を促進または増強するあらゆるものを指す。これには、限定されるものではないが、癌または類線維種などの疾患の兆候または症候の頻度または重症度の低下が含まれる。例えば、癌の処置は、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の増殖速度の低下、または転移の予防を含み得る。癌の処置は、癌を有する被験体の生存を延長することを指すこともある。
本明細書において使用される「癌」という用語は、固形腫瘍、転移性癌、または非転移性癌を説明するために使用され得る。特定の実施形態では、癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、首、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮に発生する可能性がある。
癌は具体的には以下の組織型のものである可能性があるが、これらに限定されるものではない：新生物、悪性；癌腫；未分化癌腫；巨細胞および紡錘細胞の癌腫；小細胞癌腫；乳頭癌腫；扁平上皮癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌腫；毛母癌腫；移行上皮癌腫；乳頭移行上皮癌腫；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管細胞癌腫；肝細胞癌腫；肝細胞癌腫と胆管細胞癌腫の併発；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；腺癌、家族性大腸腺腫症；固形癌腫；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞腺癌；乳頭状および濾胞状腺癌；非被嚢性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ）癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；漿液性乳頭状嚢胞腺癌；粘液嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性乳管癌腫；髄様癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌腫；扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性アンドロブラストーマ；セルトリ細胞癌腫；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；大色素性母斑の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎生期癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；悪性血管周皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル芽細胞歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル芽細胞線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫、上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起膠細胞腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外肺葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞型悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ性肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；および毛様細胞性白血病。それにもかかわらず、本発明は、非癌性疾患（例えば、真菌感染症、細菌感染症、ウイルス感染症、神経変性疾患、および／または遺伝性障害）を処置するためにも使用され得ることも認識されている。
Ｂ．製剤および投与
本開示は、α３β１インテグリンに選択的に結合する抗体を含む医薬組成物を提供する。そのような組成物は、予防上または治療上有効量の抗体またはそのフラグメント、および薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の規制当局によって承認された、または動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬とともに投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油などの無菌の液体、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の特定の担体である。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射溶液の液体担体として用いることができる。他の適した医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。
組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。経口製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含めることができる。適した医薬品の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、予防上または治療上有効量の抗体またはそのフラグメントを、好ましくは精製された形態で、患者に適切に投与するための形態を提供するように、適した量の担体とともに含有することになる。製剤は、経口、静脈内、動脈内、頬内、鼻腔内、噴霧、気管支吸入、直腸内、膣、局所、または人工呼吸による送達など、投与様式に適したものでなければならない。
抗体の受動的移行は、一般に、静脈内または筋肉内注射の使用を伴う。抗体の形態は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であり得る。このような免疫は一般に短期間しか持続せず、特に非ヒト由来のガンマグロブリンによる過敏反応および血清病の潜在的なリスクもある。抗体は、注射に適した、すなわち無菌で注射可能な担体に処方される。
一般に、本開示の組成物の成分は、別々に供給されるか、または一緒に混合して単位投与形態で、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器内の乾いた凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が点滴によって投与される場合、それは、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する点滴ボトルで分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本開示の組成物は、中性または塩の形態として処方することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンで形成された塩、および、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンで形成された塩が含まれる。
Ｃ．キットおよび診断薬
実施形態のさまざまな態様では、治療薬および／または他の治療薬および送達剤を含有するキットが想定される。本実施形態は、実施形態の治療を調製および／または投与するためのキットを企図している。キットは、本実施形態の医薬組成物のいずれかを含有する１またはそれを超える密閉バイアルを含んでよい。キットには、例えば、少なくとも１つのα３β１インテグリン抗体ならびに本実施形態の成分を調製、処方および／または投与するための試薬、あるいは本発明の方法の１またはそれを超えるステップを実行するための試薬が含まれてよい。一部の実施形態では、キットは、キットの成分と反応しない適した容器、例えば、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、注射器、ボトル、またはチューブなどを含んでいてもよい。容器は、プラスチックやガラスなどの滅菌可能な材料で製造されていてよい。
キットは、本明細書に記載の方法の手順ステップを概説する説明書をさらに含むことができ、本明細書に記載されるのと実質的に同じ手順、または当業者に知られている手順に従うことになる。指示情報は、機械可読命令を含むコンピュータ可読媒体中にあってよく、機械可読命令は、コンピュータを使用して実行されると、薬学的有効量の治療薬を送達する現実または仮想の手順を表示させる。
Ｄ．ＡＤＣＣ
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解につながる免疫機構である。標的細胞は、一般にＦｃ領域のＮ末端であるタンパク質部分を介して、Ｆｃ領域を含む抗体またはそのフラグメントが特異的に結合する細胞である。「抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加した／減少した抗体」とは、当業者に公知の適した方法によって決定されるＡＤＣＣの増加／減少を有する抗体を意味する。
明細書において使用される、「増加した／減少したＡＤＣＣ」という用語は、標的細胞を取り囲む培養液中の所定の抗体濃度で、上記で定義されたＡＤＣＣの機構によって所定の時間内に溶解する標的細胞の数の増加／減少として、さらに／または、ＡＤＣＣの機構によって所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を実現するために必要な、標的細胞を取り囲む培養液中の抗体濃度の減少／増加として定義される。ＡＤＣＣの増加／減少は、同じ種類の宿主細胞によって、同じ標準的な製造、精製、製剤化および保存方法（これらは当業者に公知である）を使用して産生されたが操作されていない、同じ抗体が介在するＡＤＣＣと比較したものである。例えば、本明細書に記載の方法によってグリコシル化のパターンが変化するように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、または他のグリコシルトランスフェラーゼを発現するように）操作された宿主細胞によって産生される抗体によって媒介されるＡＤＣＣの増加は、同じ種類の操作されていない宿主細胞によって産生される同じ抗体が介在するＡＤＣＣと比較される。
Ｅ．ＣＤＣ
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、補体系の機能である。免疫系の抗体や細胞が関与することなく、病原体の膜を損傷することによって病原体を殺傷するのは、免疫系のプロセスである。主要なプロセスは３つある。３つすべてが病原体に１またはそれを超える膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を挿入し、致死的なコロイド浸透圧膨潤、すなわちＣＤＣを引き起こす。これは、抗体または抗体フラグメントが細胞傷害作用を発揮する機構の１つである。
Ｆ．併用治療
特定の実施形態では、本実施形態の組成物および方法は、化学療法または免疫療法（例えば、チェックポイント遮断療法）などの第２のまたは追加の治療と併用した、α３β１インテグリンの活性を阻害するためのα３β１インテグリンに対する抗体または抗体フラグメントを含む。このような治療は、ホモ三量体Ｉ型コラーゲンの上昇に関連するあらゆる疾患の処置に適用することができる。例えば、疾患は、癌または類線維種であり得る。
併用療法を含む方法および組成物は、治療効果または保護効果を増強し、かつ／あるいは別の抗癌または抗過剰増殖治療の治療効果を増加させる。治療的および予防的な方法および組成物は、癌細胞の殺傷および／または細胞の過剰増殖の抑制などの所望の効果を達成するのに効果的な併用量で提供することができる。このプロセスは、抗体または抗体フラグメントと第２の治療の両方を細胞に接触させることを伴うことがある。組織、腫瘍、または細胞は、１またはそれを超える薬剤（すなわち、抗体または抗体フラグメントまたは抗癌剤）を含む１またはそれを超える組成物または薬理学的製剤と、接触させることができ、あるいは、組織、腫瘍、および／または細胞を２またはそれを超える別個の組成物または製剤と接触させることにより、接触させることができる。ここで、１つの組成物は１）抗体または抗体フラグメント、２）抗癌剤、または３）抗体または抗体フラグメントと抗癌剤の両方を提供する。また、そのような併用治療は、化学療法、放射線療法、外科的治療、または免疫療法と組み合わせて使用することができることが企図されている。
細胞に適用される場合、「接触」および「曝露」という用語は、治療用構築物と化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接並置されるプロセスを説明するために、本明細書において使用される。例えば、細胞の殺傷を達成するためには、両方の薬剤を、細胞を殺傷するかまたは細胞の分裂を防ぐために効果的な併用量で細胞に送達する。
治療用抗体は、抗癌処置と比べて、前に、最中に、後に、または様々な組合せで投与されてよい。投与は、同時から数分から数日から数週間の範囲の間隔で行うことができる。抗体または抗体断片が抗癌剤とは別に患者に提供される実施形態では、一般に、２つの化合物が有利な併用効果を患者になお発揮することが可能なように、各送達の時間の間にかなりの時間が経って期限が過ぎないようにする。そのような場合、互いに約１２～２４または７２時間以内、より具体的には互いに約６～１２時間以内に患者に抗体療法および抗癌療法を提供し得ることが企図される。一部の状況では、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）が経過する場合には、処置の期間を大幅に延長することが望ましいことがある。
特定の実施形態では、処置の過程は、１～９０日またはそれを超えて続くことになる（このような範囲は、介在する日を含む）。１つの薬剤を１日目から９０日目の任意の日（このような範囲は、介在する日を含む）またはその任意の組合せに投与し、別の薬剤を１日目から９０日目の任意の日（このような範囲は、介在する日を含む）またはその任意の組合せに投与することが企図されている。１日（２４時間）以内に、患者は、１またはそれを超える薬剤の１回または複数回の投与を受けることができる。さらに、一連の処置の後、抗癌処置が投与されない期間があることが企図される。この期間は、患者の症状、例えば予後、体力、健康状態などに応じて、１～７日、および／または１～５週間、および／または１～１２か月またはそれを超えて（このような範囲は、介在する日を含む）続く場合がある。処置サイクルは、必要に応じて繰り返されると予測される。
様々な組合せを用いることができる。以下の例では、抗体療法は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である。
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
本実施形態の化合物または療法の患者への投与は、存在する場合は薬剤の毒性を考慮に入れて、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従うことになる。そのため、一部の実施形態では、併用療法に起因する毒性を監視するステップがある。
２．化学療法
幅広い種類の化学療法剤を、本実施形態に従って使用することができる。用語「化学療法」とは、癌を処置する薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の処置の際に投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内の活動モード、例えば、細胞周期に影響を与えるかどうか、およびどの段階で影響を与えるかによって分類される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡの間に介入する能力、または核酸合成に影響を与えることにより染色体異常および有糸分裂異常を誘発する能力に基づいて特徴付けられ得る。
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；エチレンイミンおよび、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、およびウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなど；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特にカリチアマイシンガンマＩ（ｇａｍｍａｌＩ）およびカリチアマイシンオメガ１（ｏｍｅｇａＩ１））など；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネートなど；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣなど、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなど；プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えばミトタンおよびトリロスタンなど；葉酸補充剤、例えばフォリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサマイトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリニック酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ抑制剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸など；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ抑制剤、トランス白金、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸、または誘導体が含まれる。
３．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範に使用されているその他の因子には、γ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の指示された送達として一般に公知のものが含まれる。マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号および４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射などのＤＮＡ損傷因子のその他の形態も企図される。これらの因子はすべて、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高いと思われる。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）に対する５０～２００レントゲンの一日線量から２０００～６０００レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度および種類、ならびに新生細胞による取り込みに依存する。
４．免疫療法
当業者は、免疫療法が実施形態の方法と組み合わせて、またはそれと併せて使用されてよいことを理解するであろう。癌の処置の状況において、免疫療法は、一般に、癌細胞を標的として破壊することを免疫エフェクター細胞および分子の使用に頼る。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、そのような一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の一部のマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療のエフェクターとして働く場合もあれば、細胞の死滅に実際に影響を及ぼすために他の細胞を動員する場合もある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合され、単に標的化剤として働く場合がある。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、ターゲティングに適している、すなわち他の細胞の大部分には存在しない、いくつかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが、本実施形態の状況でのターゲティングに好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替態様は、抗癌効果と免疫刺激効果を組み合わせることである。免疫刺激分子も存在し、それには、サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、γ－ＩＦＮなど、ケモカイン、例えばＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８など、および増殖因子、例えばＦＬＴ３リガンドなどが含まれる。
現在調査されているまたは使用されている免疫療法は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および５，７３９，１６９号）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＮＦ；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、およびｐ５３（米国特許第５，８３０，８８０号および５，８４６，９４５号）；およびモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（米国特許第５，８２４，３１１号）が含まれる。１またはそれを超える抗癌療法は、本明細書に記載される抗体療法とともに用いることができると企図される。
一部の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント抑制剤を含み得る（すなわち、チェックポイント遮断療法であってよい）。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を上げるか、シグナルを下げる。免疫チェックポイント遮断によって標的となり得る抑制性免疫チェックポイントには、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても公知）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）およびＴ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が含まれる。特定の実施形態では、免疫チェックポイント抑制剤は、ＰＤ－１軸および／またはＣＴＬＡ－４を標的とする。一部の実施形態では、本開示の免疫療法は、抗ＰＤ－１チェックポイント遮断療法（例えば、抗ＰＤ－１抗体）を含む。
免疫チェックポイント抑制剤は、小分子などの薬物、リガンドまたは受容体の組換え体、または特にヒト抗体などの抗体であり得る（例えば、本明細書に参考として援用される国際特許公開ＷＯ２０１５０１６７１８）。免疫チェックポイントタンパク質またはその類似体の既知の抑制剤を使用してよく、特に抗体のキメラ化、ヒト化またはヒト型を使用してよい。当業者が知るように、代替および／または同等の名称が、本開示で言及される特定の抗体に使用されていることがある。そのような代替名および／または同等名は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはＭＫ－３４７５およびペンブロリズマブの代替名および同等名でも公知である。
一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１とそのリガンド結合パートナーの結合を抑制する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。もう一つの実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１とその結合パートナーの結合を抑制する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。もう一つの実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２とその結合パートナーの結合を抑制する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ２結合パートナーはＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，３５４，５０９号、および同第８，００８，４４９号に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において提供される方法で使用するための他のＰＤ－１軸アンタゴニストは、米国特許出願公開第２０１４０２９４８９８号、同第２０１４０２２０２１号、および同第２０１１０００８３６９号に記載されているように当技術分野で公知であり、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびＣＴ－０１１からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。一部の実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストはＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても公知のニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、およびＳＣＨ－９００４７５としても公知のペムブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載される抗ＰＤ－１抗体である。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても公知のＣＴ－０１１は、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載される抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても公知のＡＭＰ－２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されるＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性受容体である。
本明細書で提供される方法で標的となり得るもう一つの免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても公知の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４はＴ細胞の表面に見出され、抗原提示細胞の表面のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面に発現し、抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８に類似し、両方の分子は、それぞれＢ７－１およびＢ７－２と呼ばれる、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ４は抑制シグナルをＴ細胞に伝達するが、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞にも見出され、それらの機能に重要であり得る。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８によるＴ細胞の活性化は、Ｂ７分子の抑制性受容体であるＣＴＬＡ－４の発現増加につながる。
一部の実施形態では、免疫チェックポイント抑制剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
本発明の方法での使用に適切な抗ヒト－ＣＴＬＡ－４抗体（またはそれに由来するＶＨおよび／またはＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成され得る。あるいは、当該分野で認識される抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号、国際公開第０１／１４４２４号、国際公開第９８／４２７５２号；国際公開第００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブとしても公知；旧名チシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚら、（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１；Ｃａｍａｃｈｏら、（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（抗体ＣＰ－６７５２０６）；およびＭｏｋｙｒら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：５３０１－５３０４、に開示されている抗ＣＴＬＡ－４抗体を本明細書に開示される方法で使用することができる。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ－４への結合についてこれらの当技術分野で認められている抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、国際特許出願第ＷＯ２００１０１４４２４号、ＷＯ２００００３７５０４号、および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
例となる抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても公知）またはその抗原結合断片および変異体である（例えば、ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと）。その他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖のＣＤＲまたはＶＲを含む。従って、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、およびイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。もう一つの実施形態では、抗体は、上記の抗体と同じＣＴＬＡ－４上のエピトープとの結合について競合し、かつ／または結合する。もう一つの実施形態では、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、または９９％可変領域同一性）を有する。
ＣＴＬＡ－４を調節するためのその他の分子には、米国特許第５８４４９０５号、同第５８８５７９６号および国際特許出願第ＷＯ１９９５００１９９４号およびＷＯ１９９８０４２７５２号（これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなＣＴＬＡ－４リガンドおよび受容体、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８３２９８６７号に記載されるようなイムノアドヘシンが含まれる。
一部の実施形態では、免疫治療は、生体外で作製成された自己の抗原特異的Ｔ細胞の移入を伴う養子免疫療法であり得る。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖または遺伝子工学によるＴ細胞のリダイレクションのいずれかによって作製することができる（Ｐａｒｋ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２０１１）。腫瘍特異的Ｔ細胞の分離および移動は、黒色腫の処置に成功することが示された。Ｔ細胞の新規な特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子導入によってうまく生成されている（Ｊｅｎａ、Ｄｏｔｔｉら、２０１０）。ＣＡＲは、単一の融合分子内の１またはそれを超えるシグナル伝達ドメインに会合しているターゲティング部分で構成される合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインで構成され、可動性リンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変フラグメントを含む。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も、うまく使用されている。第１世代のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃ受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。ＣＡＲは、リンパ腫および固形腫瘍を含むさまざまな悪性腫瘍の腫瘍細胞の表面に発現する抗原に対してＴ細胞をリダイレクトさせることに成功している。
一実施形態では、本出願は、癌の処置のための併用治療を提供し、併用治療は、養子Ｔ細胞治療とチェックポイント阻害剤とを含む。一態様では、養子Ｔ細胞治療は、自家および／または同種異系Ｔ細胞を含む。別の態様では、自家および／または同種異系Ｔ細胞は、腫瘍抗原に対して標的化されている。
５．手術
癌患者の約６０％は何らかの種類の手術を受けることになり、それには予防手術、診断的または病期決定手術、根治手術および緩和手術が含まれる。根治手術には、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、切除、および／または破壊する切除術が含まれ、他の療法、例えば本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法などと併用することができる。腫瘍切除術とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡制御手術（モース術）が含まれる。
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部を切除すると、体内に空洞が形成されることがある。処置は、灌流、直接注射、または追加の抗癌療法による領域の局所適用によって達成されてよい。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６、または７日ごと、あるいは１、２、３、４、および５週ごと、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月ごとに繰り返すことができる。これらの処置も同様に様々な投与量のものであってよい。
６．その他の薬剤
処置の治療効果を改善するために、その他の薬剤を本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用し得ることが企図される。これらの追加の薬剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合のアップレギュレーションに影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の抑制剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める薬剤、またはその他の生物剤が含まれる。ギャップ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させる。その他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤を本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用して、処置の抗過剰増殖効力を改善することができる。細胞間接着の抑制剤は、本実施形態の有効性を改善することが企図される。細胞間接着抑制剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）抑制剤およびロバスタチンである。さらに、アポトーシスに対する過増殖性細胞の感受性を増加させるその他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５などを、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用して、処置効力を改善することができ得ることが企図される。
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実践において十分に機能するために発明者によって発見された技術を表すことを当業者は理解するべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、多くの変更が開示された特定の実施形態において行われ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
実施例１－癌の処置のためのアルファ３ベータ１（α３β１）インテグリンの標的化
材料および方法
組織学および免疫組織化学。パラフィン固定試料のために、マウス組織を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、５μｍの厚さに切片化した。切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色用に処理した。ゴモリのトリクローム染色キット（３８０１６ＳＳ２、ライカバイオシステムズ）を使用して、マッソンのトリクローム染色（ＭＴＳ）を実施した。コラーゲンのピクロシリウスレッド染色は、０．１％ピクロシリウスレッド（Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｄ８０；シグマ）を使用して行い、ワイゲルトヘマトキシリンで対比染色した。画像は、ライカＤＭ１０００ＬＥＤ顕微鏡とＬａｓＶ４．４ソフトウェア（ライカ）を備えたＭＣ１２０ＨＤ顕微鏡カメラでキャプチャされた。ホルマリン固定、パラフィン包埋切片を、以前に文書化されているように免疫組織化学染色用に処理した（Ｃｈｅｎら、２０１８）。切片を一次抗体：αＳＭＡ（Ｍ０８５１、Ｄａｋｏ、１：１００）、ＣＫ１９（ａｂ５２６２５、Ａｂｃａｍ、１：２００）、コラーゲンＩ（ａｂ３４７１０、Ａｂｃａｍ、１：２００）、インテグリンα３（ａｂ１３１０５５、Ａｂｃａｍ、１：３００）、Ｓｏｘ９（ａｂ１８５９６６、Ａｂｃａｍ、１：２００）、次にビオチン化二次抗体、およびストレプトアビジンＨＲＰ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）とともにインキュベートした。すべての免疫標識実験では、切片をＤＡＢで現像し、ヘマトキシリンで対比染色した。
シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃ－ＲＮＡ－ｓｅｑ）ＫＰＰＣマウスの新鮮な腫瘍組織を滅菌ランセットで細かく切り刻み、コラゲナーゼＩＶ（１７１０４０１９、Ｇｉｂｃｏ、４ｍｇ／ｍＬ）／ディスパーゼＩＩ（１７１０５０４１、Ｇｉｂｃｏ、４ｍｇ／ｍＬ）／ＤＭＥＭで３７℃で０．５時間消化させ、７０μｍセルストレーナーでろ過し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳに単一細胞懸濁液として再懸濁させた。この単一細胞懸濁液をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（６５－０８６５－１４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、４０μｍメッシュでろ過した後、ＭＤＡＣＣのサウスキャンパス・フローサイトメトリー・コアラボラトリー（Ｓｏｕｔｈ Ｃａｍｐｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でＡｒｉａ ＩＩ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で生細胞を選別した。ＫＰＰＦ（ＦＳＦ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ｆｒｔ／ｆｒｔ；Ｐｄｘ１－Ｆｌｐ）マウスの腫瘍について、２匹のマウスからの合計４０６４個の細胞を分析した。ＫＰＰＣ（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ）マウスの腫瘍について、２匹のマウスからの合計３９８９個の細胞を分析した。これらの試料のＳｃ－ＲＮＡ－ｓｅｑは、ＭＤＡＣＣのシーケンシングおよびマイクロアレイ施設でＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒとシングルセル３’試薬キットｖ２（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して実施された。シングルセルゲルビーズインエマルジョン（ＧＥＭ）の作製およびバーコード化、ＧＥＭ－ＲＴ後のクリーンアップおよびｃＤＮＡ増幅、ライブラリ構築およびイルミナに対応するシーケンスライブラリ作製は、製造業者のガイドラインに従って調製した。高感度ｄｓＤＮＡ Ｑｕｂｉｔキットを使用して、ｃＤＮＡとライブラリの濃度を推定した。ｃＤＮＡの定量にはＨＳ ＤＮＡ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用した。ＤＮＡ １０００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒはライブラリの定量に使用した。「ｃ－ｌｏｕｐｅ」ファイルは、製造業者のガイドラインに従ってＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒソフトウェアパイプラインを使用して生成された。未分画腫瘍細胞は、１０Ｘ ＧｅｎｏｍｉｃｓのＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒとシングルセル３’試薬キットｖ２を使用してカプセル化された。捕捉と溶解に続いて、ｃＤＮＡを合成および増幅してイルミナシーケンスライブラリーを構築した。１試料あたり約１，０００個の細胞から得たライブラリーを、イルミナＮｅｘｔｓｅｑ ５００でシーケンスした。実行フォーマットは、リード１では２６サイクル、インデックス１では８サイクル、リード２では１２４サイクルであった。ｓｃ－ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＭＤアンダーソン癌センター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）のシーケンシングおよびマイクロアレイ施設によって処理された。バイオコンダクタープロジェクトのＲパッケージソフトウェアを使用して、さらなるデータ解析を行った。
ウェスタンブロッティング抽出したＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）溶液および可溶化したマトリゲル（増殖因子低減、３５４２３０、コーニング）を、６倍還元ＳＤＳ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－ｗｏｒｌｄ）で調製し、９５℃で２０分間変性させた。次に、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸプレキャストポリアクリルアミドゲル（バイオ・ラッド）を使用して試料を電気泳動にかけ、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（バイオ・ラッド）を使用してポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスブロットした。Ｃｏｌ１はヤギ抗ｃｏｌ１抗体（１３１０、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、１：１０００）およびＨＲＰ標識ロバ抗ヤギ二次抗体でブロットした。ＩＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ４）は、ウサギ抗Ｃｏｌ４抗体（ａｂ５２２３５、Ａｂｃａｍ、１：３００）およびＨＲＰ標識二次ヤギ抗ウサギ抗体でブロットした。
インビボでのＦＡＫ阻害剤（ＦＡＫｉ）処置。２１日齢のＫＰＰＣマウスを、さらなる処置のために、無作為に対照群またはＦＡＫｉ（ＶＳ－４７１８またはＰＮＤ－１１８６、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）治療群に分けた。ＦＡＫｉ処置群のマウスは、以前に記載されたように（Ｊｉａｎｇら、２０１６）、滅菌水中の０．５％カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁した５０ｍｇ／ｋｇのＦＡＫｉで、１日２回、強制経口投与によって処置された。対照群のマウスは、同じ投与戦略を使用してビヒクルを投与された。マウスから膵臓組織を採取し、２８日齢の同じ年齢で７日間の処置後に調べた。
結果
腫瘍は、癌細胞と、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の構成要素、例えば線維芽細胞およびＩ型コラーゲンの両方を含有している。腫瘍微小環境が腫瘍増殖の促進物質として機能するのか、または腫瘍増殖を抑制するのかは未だ不明である。ＴＭＥのいくつかの側面が腫瘍進行の正の調節因子として機能し、他の側面が腫瘍増殖の負の調節因子として機能する可能性がある。筋線維芽細胞により産生されるＩ型コラーゲン（コラーゲンＩ）は、コラーゲンＩの２本のα１鎖（α１（Ｉ）コラーゲン）とコラーゲンＩの１本のα２鎖（α２（Ｉ）コラーゲン）を含むヘテロ三量体であり、癌細胞および他の間質細胞の可能性のある受容体（おそらくディスコイジン（ｄｉｓｃｏｄｉｎ）ドメイン受容体ＩＩ－ＤＤＲ２）および免疫細胞との結合によって癌／腫瘍を抑制する。対照的に、癌細胞は、癌／腫瘍を促進し、癌細胞の特定の受容体に結合して生存促進シグナル、抗アポトーシスシグナル、増殖シグナル、増殖促進シグナル、および癌化促進シグナルを誘導する、３本のα１（Ｉ）コラーゲン鎖を有するコラーゲンＩホモ三量体を産生する。ホモ三量体（癌細胞によって作られる）は、腫瘍微小環境の筋線維芽細胞によって作られるヘテロ三量体と比較すると、メタロプロテイナーゼおよび他のプロテイナーゼに耐性がある。ホモ三量体は、ヘテロ三量体と比較して異なるエピトープを露出する異なる構造を示し、このホモ三量体に対して生成された抗体は、他の機構の中でも、癌細胞上の癌化促進受容体を通じてシグナル伝達を妨害することによって腫瘍抑制特性を有することになる。
インテグリンが癌細胞上のコラーゲン受容体として広く研究されているため（Ｅｇｅｂｌａｄら、２０１０；Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ、２０１１；Ｙｅｈら、２０１２）、ｃｏｌ１ホモ三量体が誘導する生存促進性シグナル伝達におけるインテグリンの直接的な機能的関与を調べた。Ｃｏｌ１ホモ三量体は、ＤＤＲ１、ＦＡＫ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化を誘導する。しかし、ｓｉＲＮＡでＤＤＲ１をノックダウンしても、おそらくＤＤＲ１ノックダウン後のインテグリン（特にα３β１）の代償性アップレギュレーションのために、ｃｏｌ１ホモ三量体によるＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＥＲＫの活性化は阻害されなかった（図１Ａ、１Ｂ）。一方、ｓｉＲＮＡでインテグリンβ１を抑制すると、ｃｏｌ１ホモ三量体が誘導するＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＥＲＫの活性化が著しく低下したことから、癌細胞の生存促進機能ｃｏｌ１ホモ三量体の媒介におけるインテグリンβ１の重要な役割が示唆された（図１Ｃ、図２Ａ）。
インテグリンα１、α２、およびα３サブユニットに対するｓｉＲＮＡを使用したさらなる検査により、α１インテグリンサブユニットではなく、インテグリンα３に対するｓｉＲＮＡ（図１Ｃ、２Ｂ）は、ｃｏｌ１ホモ三量体が誘導するＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化を著しく阻害するが、インテグリンα２のｓｉＲＮＡは、ｃｏｌ１ホモ三量体が誘導するリン酸化を中程度に阻害したことが明らかになった。マウス（図２Ｃ）およびヒト（図２Ｄ、ＣＣＬＥデータベース）膵臓癌細胞株から得たＲＮＡ－ｓｅｑデータにより、インテグリンα３が膵臓癌細胞によって発現される最も豊富なインテグリンα－サブユニットであることが確認された。コラーゲン結合インテグリンサブユニットとしても公知のインテグリンα１０およびα１１は、それらのβ１インテグリンサブユニットパートナーとともに、膵臓癌細胞での発現が最小であったことが明らかになった（図２Ｃ、２Ｄ）。癌細胞におけるインテグリンα３の広範な発現パターンは、ＫＰＰＣ腫瘍（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ）でのシングルセルＲＮＡシーケンシング解析（図２Ｅおよび３Ａ～３Ｘ）と、マウスおよびヒト腫瘍でのＩＨＣ染色によってさらに確認された（図２Ｆおよび４Ａ～４Ｆ）。
次に、膵臓癌に関連する初期病変の病因におけるｃｏｌ１ホモ三量体誘導性ＦＡＫリン酸化の役割を試験するために、ＦＡＫとＰＹＫ２を標的とする二重阻害剤である、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１１８６）を用いて、ｃｏｌ１ホモ三量体誘導性生存促進性シグナル伝達へのその影響を評価した。ＶＳ－４７１８はＦＡＫおよびＰＹＫ２（インテグリンおよびＤＤＲ１媒介シグナル伝達経路の下流メディエーター）を阻害し、ｃｏｌ１ホモ三量体が誘導するＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＥＲＫの活性化を抑制した（図２Ｇ）。ＫＰＰＣマウスのＶＳ－４７１８処置も、以前の知見（Ｊｉａｎｇら、２０１６）と一致して、初期のＰａｎＩＮ進行を阻害した（図２Ｈ）。まとめると、これらの結果により、ｃｏｌ１ホモ三量体がコラーゲン結合インテグリンα３β１を介してＦＡＫ、ＡＫＴ、およびＥＲＫの持続的な活性化を誘導することによってＰＤＡＣ細胞増殖を促進することが明らかとなった。
実施例２－ヒトＰＤＡＣ患者におけるα３インテグリン発現の同定および生存転帰との相関
方法
すべてのヒトＰＤＡＣ切片を、各患者の代表的な１ｍｍコアを３個（腫瘍から２個、良性膵臓組織から１個）を含有する組織マイクロアレイスライドに固定した。インテグリンα３の染色強度を、染色の視覚的スコアリングによって０～３の尺度（３－非常に強い、２－強い、１－弱い、および０－陰性）で定量化した。すべての試料のインテグリンα３のＩＨＣスコアは、染色の強度と陽性腫瘍細胞の割合を組み合わせたスコアによって等級付けられる。染色スコアの式を使用した：Ｓ＝ｐ１ｘ１＋ｐ２ｘ２＋ｐ３ｘ３、ここで、ｐ１、ｐ２、ｐ３はそれぞれ１、２、３の各染色カテゴリーを表す腫瘍細胞の割合を表す。インテグリンα３（ＩＴＧＡ３）発現の平均スコアはコホート全体で１．８７であった。インテグリンα３の発現は、平均複合スコア１．８７をカットオフとして使用し、ＩＴＧＡ３－ｈｉｇｈ（ｎ＝６８）とＩＴＧＡ３－ｌｏｗ（ｎ＝６２）に分類した。
結果
組織マイクロアレイスライドに固定されたヒトＰＤＡＣ切片（ｎ＝１４１）をインテグリンα３のＩＨＣスコアについて調べ（図５Ａ）、コホート全体の平均スコアは１．８７であった（図５Ｂ）。ヒトＰＤＡＣ切片の大部分（９７％）は、非常に高いまたは高いインテグリンα３発現を明らかにした（図５Ｃ）。高いインテグリンα３発現レベルは、患者の全生存期間の低下（図５Ｄ）および無増悪生存期間の低下（図５Ｅ）と有意に相関していた。ＩＴＧＡ３の高い患者は、図５Ｄおよび５Ｅの下側の線に示され、一方、ＩＴＧＡ３の低い患者は、図５Ｄおよび５Ｅの上側の線に示されている。
実施例３－ＰＤＡＣ細胞のインビトロＩｔｇａ３ ｓｉＲＮＡ処置
方法
ＫＰＰＣ（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ）およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ（ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）細胞を、９６ウェルプレートに播種し（１％ＦＢＳを含む１００μＬ ＲＰＭＩ中、ウェル当たり３×１０３細胞）、次に示されたｓｉＲＮＡで４８時間処置した。６ウェルまたは９６ウェルプレートの各ウェルの細胞生存率／数を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ８；Ａｂｃａｍ ａｂ２２８５５４）を使用して求め、マイクロプレートリーダーでＯＤ ４５０ｎｍで製造業者の指示に従って調べた。
結果
α３インテグリンをｓｉＲＮＡで抑制すると、ＫＰＰＣ癌細胞の増殖は減少するが、ＫＰＣＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯは減少しない（図６）。このことは、癌細胞でのＣｏｌ１ホモ三量体とα３インテグリンとの結合を阻害すると、その増殖に影響することを示している。
実施例４－インビトロＩｔｇａ３ ｓｉＲＮＡ処置。
方法
エクソソームを、ヒト間葉系幹細胞から産生させた。１０９個の総エクソソーム（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（商標）分析によって測定）と１μｇのｓｉＲＮＡ（スクランブルされたｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔｒｏｌまたはｓｉＲＮＡ－Ｉｔｇａ３）を４００μＬのエレクトロポレーションバッファー（１．１５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２、２５ｍＭ塩化カリウム、２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）中で混合した。これらのエクソソームを、単一の４ｍｍキュベットを使用し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド、１６５－２０８１）を使用してエレクトロポレーションした。マウスに、１回の注射あたり１０８個のエクソソームを１００μＬの容量で注射した。この投与量は、４８時間ごとのマウスへの１回の注射あたり約０．１５～０．２０μｇのエクソソームタンパク質負荷に相当する。
結果
インテグリンα３を標的とするｓｉＲＮＡを含有するエクソソームによる処置は、スクランブルされたｓｉＲＮＡ対照を含有するエクソソームと比較して、ＫＰＰＣマウスの生存を有意に延長した（図７）。
実施例５－膵臓癌細胞におけるＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）の欠失は、免疫細胞の蓄積を増加させ、チェックポイント遮断に対する感受性を増加させる
方法
マウス
ＦＳＦ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋（５）、Ｐｄｘ１－Ｆｌｐ（５）、Ｔｒｐ５３ｆｒｔ／＋（６）、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋（７）、Ｔｒｐ５３ｌｏｘＰ／＋（８）、Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ（７）、αＳＭＡ－Ｃｒｅ（９）、およびＦｓｐ１－Ｃｒｅ（１０、１１）マウス系統は、以前に文書化された。Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰマウス系統（ｌｏｘＰ隣接エクソン２－５を含む）を、ヨーロッパマウス変異株細胞レポジトリ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ：ＥｕＭＭＣＲ）から入手したＣｏｌ１ａ１ｔｍ１ａ（ＥＵＣＯＭＭ）Ｗｔｓｉ胚幹細胞を使用して、ＭＤアンダーソンがんセンター（ＭＤＡＣＣ）の遺伝子改変マウス施設で確立した。
Ｒｏｓａ２６－ＣＡＧ－ｌｏｘＰ－ｆｒｔ－Ｓｔｏｐ－ｆｒｔ－ＦｉｒｅｆｌｙＬｕｃ－ＥＧＦＰ－ｌｏｘＰ－ＲｅｎｉｌｌａＬｕｃ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｒ２６Ｄｕａｌとも呼ばれる）マウス系統には、Ｐｄｘ１－Ｆｌｐ導入遺伝子の制御下でＥＧＦＰ発現、またはαＳＭＡ－ＣｒｅおよびＦｓｐ１－Ｃｒｅ導入遺伝子の制御下でｔｄＴｏｍａｔｏ発現を可能にする新規なＲ２６Ｄｕａｌ二重蛍光レポーター対立遺伝子が含まれる（１２）。ＦＳＦ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｐｄｘ１－Ｆｌｐ（ＫＦとも呼ばれる）またはＦＳＦ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ｆｒｔ／ｆｒｔ；Ｐｄｘ１－Ｆｌｐ（ＫＰＰＦとも呼ばれる）マウスの遺伝子型判定および疾患表現型の特徴づけは、Ｓａｕｒらが以前に記載した通り実行した（５）。Ｃｏｌ１ａ２変異を有する骨形成不全症マウス（ＯＩＭ）系統は、ジャクソン・ラボラトリー（００１８１５；Ｂ６Ｃ３Ｆｅ ａ／ａ－Ｃｏｌ１ａ２ｏｉｍ／Ｊ）から購入した。本発明者らは、ＫＦマウスおよびＫＰＰＦマウスをαＳＭＡ－Ｃｒｅ、Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ、Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ、Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ、またはＲ２６Ｄｕａｌマウス系統と交配し、その結果、ＫＦ；αＳＭＡ－Ｃｒｅ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯとも呼ばれる）、ＫＦ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＦ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯとも呼ばれる）、ＫＰＰＦ；αＳＭＡ－Ｃｒｅ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯとも呼ばれる）、ＫＰＰＦ；Ｆｓｐ１－Ｃｒｅ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｆｓｐＫＯとも呼ばれる）マウスが生成された。これらのマウスは、自発的ＰＤＡＣの状況において、αＳＭＡ＋筋線維芽細胞（ＭＦ）またはＦｓｐ１＋細胞集団のいずれかでＣｏｌ１ａ１の欠失を可能にする。ＫＦ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯマウスとＫＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯマウスは同じ対照マウス（ＫＦ；Ｃｒｅ陰性；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ）を共有しており、これらの３つの系統（ＫＦ対照群、ＫＦ；αＳＭＡを発現する筋線維芽細胞でＣｏｌ１が欠失したＣｏｌ１ｓｍａＫＯ群、およびＰｄｘ１系列癌細胞でＣｏｌ１が欠失したＫＦ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ群）間で疾患の進行を直接比較できるようになった。本発明者らはまた、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ（ＫＣとも呼ばれる）、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＰＣとも呼ばれる）、またはＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ（ＫＰＰＣとも呼ばれる）マウスを、Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘマウス系統と交配し、その結果、ＫＣ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯとも呼ばれる）、ＫＰＣ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯとも呼ばれる）、およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ａ１ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ（ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯとも呼ばれる）が生成された。ＫＦ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ、ＫＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ、およびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯマウスは、ＰＤＡＣ細胞でのＣｏｌ１ａ１の欠失を可能にする。所望の遺伝子型を有する前述の実験用マウスを、無作為化や盲検化を行わずにモニターし、分析した。実験用マウスには、ＰＤＡＣに望ましい１つまたは複数の遺伝子型を有する雌と雄の両方のマウスを使用した。抗ＰＤ１（ＢＥ０２７３、２９Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）抗体は、各マウスに１００μｇの用量で、３日間隔で（３５日齢で開始）合計３回の注射で腹腔内に投与された。すべてのマウスはＭＤＡＣＣ動物施設で標準的な飼育条件下で飼育され、すべての動物の手順はＭＤＡＣＣ施設内動物実験委員会によって審査され、承認された。
全ｍＲＮＡシーケンシング
腫瘍組織のｍＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析の場合、新たに解剖した腫瘍試料を液体窒素を用いてＲＮａｓｅフリーチューブで凍結させ、－８０℃で保存した。試料は、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｂｅａｄ Ｍｉｌｌ ２４ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でセラミックビーズを含むビーズチューブを使用してホモジナイズした。細胞株のＲＮＡ－ｓｅｑの場合、ＫＰＰＣおよび／またはＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞を、６ウェルプレート（コーニング）で、ビヒクル（０．５Ｍグリセロールを含むＰＢＳ）、ホモ三量体Ｃｏｌ１（５０μｇ／ｍＬ）またはヘテロ三量体Ｃｏｌ１（５０μｇ／ｍＬ）とともに培養した。４８時間の培養後に細胞を回収した。組織と細胞の両方について、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。
品質管理分析は、ＲＮＡ ６０００ ＮａｎｏＫｉｔを使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）で実施した。全ｍＲＮＡシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕｅＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡｓｅｑライブラリと、ＭＤＡＣＣシーケンシングおよびｎｃＲＮＡプログラムコアファシリティ（ＭＤＡＣＣ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｎｃＲＮＡ Ｐｒｏｇｒａｍ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙ）によるＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）高出力シーケンシング（Ｈｉｇｈ－Ｏｕｔｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ＰＥ ７５ｘ７５ ｎｔを使用して実行された。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームからの生シーケンシングデータをＦａｓｔｑファイルに変換し、Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏ ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＳＴＡＲ）アルゴリズムを用いて参照ゲノムｍｍ１０にアライメントした。次に、ＨＴＳｅｑ－ｃｏｕｎｔを利用して、各遺伝子の生カウントを生成した。次に、標準的な手順に従って、データ処理、正規化、および差次的発現解析についてＤＥＳｅｑ２によって生カウントを解析した。ＲＮＡ－ｓｅｑデータからの機能分類と経路再構成は、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ；Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）およびＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施された。すべての解析はＲで実施された。
フローサイトメトリー
免疫浸潤の特徴付けのために、新鮮な腫瘍組織（それぞれ５３日齢のＫＰＰＣおよびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ由来）を、秤量し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒで細かく切り刻み、１ｍｇ／ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ）および０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ ＩをＲＰＭＩ培地に含む溶液２ｍＬで３７℃で３０分間消化させた。免疫染色の前に、組織溶解物を１００μｍメッシュでろ過した。その後の単細胞懸濁液は、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と適切な抗体で染色した。試料を４０μｍメッシュでろ過し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０を使用して検査した。陽性細胞の割合をＦｌｏｗＪｏ １０．１によって解析し、ＣＤ４５陽性でゲーティングした。未染色、生存率染色のみ、および単一染色のビーズ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をコンペンセーションコントロールとして使用した。
多重染色切片のマルチスペクトル画像
ＮｕａｎｃｅおよびｉｎＦｏｒｍイメージングソフトウェアを使用した多重染色手順、スペクトルアンミキシングおよび細胞セグメンテーションは以前に記載されている（１）。多重染色したスライドを、Ｖｅｃｔｒａ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで、Ｖｅｃｔｒａソフトウェア、バージョン３．０．３（パーキンエルマー）を使用して画像化した。４倍の対物レンズを使用して、各組織切片の全体をスキャンした。Ｐｈｅｎｏｃｈａｒｔソフトウェア（パーキンエルマー）を使用して、切片あたり最大８０領域（２０倍時）がマルチスペクトルイメージングに選択された。各マルチプレックスフィールドは、各発光フィルターキューブの範囲全体で１０ｎｍの発光スペクトルごとにスキャンされた。マルチスペクトルイメージングに使用したフィルターキューブは、ＤＡＰＩ（４４０～６００ｎｍ）、ＦＩＴＣ（５２０ｎｍ～６８０ｎｍ）、Ｃｙ３（５７０～６９０ｎｍ）、テキサスレッド（５８０～７００ｎｍ）およびＣｙ５（６８０～７２０ｎｍ）であった。
Ｎｕａｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、対応するフルオロフォアを含む単一マーカーで染色したスライドから得たマルチスペクトル画像を使用して、スペクトルライブラリを作成した。このライブラリは、すべてのフルオロフォアの発光スペクトルのピークを含んでいたので、画像解析ソフトウェアｉｎＦｏｒｍ ２．２を使用して、各マルチスペクトル画像をその個々の６つの成分にアンミックス（スペクトル分解）するために使用した。全ての対照で陽性のシグナルを確実に一貫してキャプチャするために、さまざまなマーカーの検出の閾値をさまざまなコホート間で調整した。各コホートのすべての画像は、染色陽性の同じ閾値を使用して処理された。
マウス脾臓リンパ球とＰＤＡＣ癌細胞の共培養
ＫＰＰＣおよびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞（２×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。２．５ヶ月齢の４匹の健康なマウス（ＫＰＰＣおよびＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯマウス同じ遺伝的背景を持つ）の脾臓を細かく切り刻み、４０μｍメッシュでろ過し、氷冷ＰＢＳで洗浄した後、５ｍＬの赤血球溶解液（ｓｃ－２９６２５８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）に氷上で５分間再懸濁し、ＰＢＳで洗浄した。脾臓リンパ球をカウントし、丸底９６ウェルプレート（２×１０５細胞／ウェル）に２４時間活性化ありまたはなしで播種した後、ＫＰＰＣまたはＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞（または癌細胞を含まず培養液のみ）を含む９６ウェルプレートに移した。２４時間共培養した後、脾臓リンパ球を回収し、上記のフローサイトメトリー方法を使用して染色し、リンパ球活性化について調べた。抗ＣＤ３（５５３０５７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ２８（５５３２９４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体（１μｇ／ｍＬ）を、Ｔ細胞のインビトロ活性化に使用した。
統計
フローサイトメトリーおよび免疫染色の定量化の統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、対応のない両側ｔ検定、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置分散分析、またはＦｉｓｈｅｒの正確確率検定によって実行した。χ２解析は、マウスの複数の組織学的パラメータにわたる転移頻度を比較して実行された。
生存解析のためにカプラン・マイヤープロットを描き、ログランクマンテルコックス検定を使用して統計的差異を評価した。データは各統計検定の前提条件を満たしており、分散が等しくない場合（Ｆ検定で判定）、不等分散に対するＷｅｌｃｈの補正が適用された。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。エラーバーは、複数の視野を平均して各動物について単一の値を生成したときの平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表し、次に再び平均して各グラフの群の平均バーを表した。
結果
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって明らかにされたように、ＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯマウスおよびＫＰＰＦコントロールマウスの腫瘍組織からの全ＲＮＡのＲＮＡ－ｓｅｑは、筋線維芽細胞のＣｏｌ１欠失によりＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍では免疫応答経路（リンパ球活性化／動員経路など）が著しく減少していることが明らかになった。さらに、ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）により、ＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍におけるＴ細胞応答に関連する遺伝子、例えばＣＤ３ｇ、ＣＤ３ｅ、ＰｄＣＤ１、Ｉｌ２ｒｇ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６などが著しく減少していることが明らかになった（図８Ａ～８Ｃ）。対照的に、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯマウスとＫＰＰＣコントロールマウスの腫瘍組織の全ＲＮＡのＲＮＡ－ｓｅｑにより、癌細胞のＣｏｌ１が欠失すると、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍で免疫応答経路（リンパ球活性化／動員経路など）が著しく増加したことが明らかになった。ＩＰＡにより、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍におけるＴ細胞応答に関連する、著しく増加した遺伝子が明らかになり、それには、Ｃｄ３ｄ、Ｃｄ３ｇ、Ｃｄ４、Ｃｄ８ａ、Ｃｔｌａ４、Ｐｄｃｄ１、およびＩｌ２ｒａが含まれていた（図８Ｄ～８Ｆ）。次に、ＫＰＰＣ、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ、ＫＰＰＦ、およびＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯマウスの腫瘍切片をＴＳＡマルチスペクトルイメージングで調べた（１）。ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞浸潤は、それぞれＫＰＰＣおよびＫＰＰＦ対照腫瘍と比較した場合、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍では増加したが、ＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍では減少した（図８Ｇおよび図８Ｈ）。まとめると、ＫＰＰＦ；Ｃｏｌ１ｓｍａＫＯ腫瘍の筋線維芽細胞におけるＣｏｌ１欠失は、間質Ｃｏｌ１レベルとＴ細胞浸潤の両方を減少させたが、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯの癌細胞におけるＣｏｌ１欠失はＴ細胞浸潤を増加させた。
新鮮な組織のフローサイトメトリー分析は、ＫＰＰＣ腫瘍と比較した場合、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍がＴ細胞浸潤および関連するＴ細胞活性化マーカーを上昇させたことを示した（図９Ａ～９Ｈ）。具体的には、ＣＤ４＋／ＰＤ－１＋（図９Ｆ）およびＣＤ８＋／ＰＤ－１＋細胞（図９Ｈ）の有意な増加がＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍で観察された。ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ腫瘍のＰＤ－１＋Ｔ細胞のこのような増加が機能的に重要であるかどうかを判断するために（２）、ＫＰＰＣマウスおよび進行したＰＤＡＣを有するＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯマウスを抗ＰＤ－１抗体で処置した。以前の報告（３、４）と同様に、ＫＰＰＣマウスは抗ＰＤ－１処置に不応性であった（図９Ｉ）。しかし、ＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯは抗ＰＤ－１処置に陽性反応を示し、全生存期間の延長を示した（図９Ｉ）。
マウス脾臓リンパ球とＰＤＡＣ癌細胞のインビトロ共培養システム（その概略図は図９Ｊに示されている）を使用して、ＫＰＰＣ癌細胞が共培養されたマウス脾臓リンパ球の活性化および増殖を有意に抑制したことがさらに実証された。対照的に、Ｃｏｌ１ホモ三量体を欠失したＫＰＰＣ；Ｃｏｌ１ｐｄｘＫＯ癌細胞は、共培養したマウス脾臓リンパ球に対するそのような免疫抑制作用を失った（図９Ｋ～９Ｎ）。
まとめると、これらの結果から、癌細胞における発癌性のＣｏｌ１ホモ三量体の欠失が、免疫抑制性のＰＤＡＣ微小環境を緩和し、腫瘍へのＴ細胞浸潤を促進し、抗ＰＤ－１チェックポイント遮断療法の有効性を高めることが明らかになる。
＊ ＊ ＊
本明細書において開示および特許請求される方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作成および実行することができる。本発明の組成物および方法は、特定の実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および本明細書に記載される方法のステップまたはステップの順序に変化が加えられてもよいことは当業者に明らかであろう。より具体的には、同じまたは同様の結果を達成しながら、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を本明細書に記載される薬剤の代わりに使用してよいことは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変はすべて、添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順またはその他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Figure 2022536982000003
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Claims (123)

  1. α３β１インテグリンに結合する抗体または抗体フラグメントを含む組成物。
  2. 前記抗体または抗体フラグメントが、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する請求項１に記載の組成物。
  3. 前記抗体フラグメントが、組換えｓｃＦｖ（可変一本鎖フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントである請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記抗体がキメラ抗体であるか、または二重特異性抗体である請求項１または２に記載の組成物。
  5. 前記抗体がキメラ抗体であり、前記キメラ抗体がヒト化抗体である請求項４に記載の組成物。
  6. 前記二重特異性抗体が、α３β１インテグリンとＣＤ３の両方に結合する請求項４に記載の組成物。
  7. 前記抗体または抗体フラグメントが、細胞傷害性薬剤に結合している請求項１～６いずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記抗体または抗体フラグメントが、診断薬に結合している請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物の抗体または抗体フラグメントをコードするハイブリドーマまたは操作された細胞。
  10. 請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬製剤。
  11. 処置を必要とする患者を処置する方法であって、前記方法が、有効量のα３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントを投与することを含む方法。
  12. 前記抗体または抗体フラグメントが、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する請求項１１に記載の方法。
  13. 前記抗体または抗体フラグメントが、α３β１インテグリンによって生存促進性シグナル伝達を阻害する請求項１１に記載の方法。
  14. 前記患者が、癌、類線維種、組織傷害、ケロイド、臓器線維症、クローン病、狭窄、大腸炎、乾癬、または結合組織障害を有する請求項１１に記載の方法。
  15. 前記結合組織障害が、コラーゲンを含む結合組織障害である請求項１４に記載の方法。
  16. コラーゲンを含む前記結合組織障害が、１型コラーゲンを含む結合組織障害である請求項１５に記載の方法。
  17. 前記患者が癌を有する請求項１５に記載の方法。
  18. 前記α３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントが、請求項１～８のいずれか一項に記載の前記組成物の前記抗体または抗体フラグメントである請求項１１に記載の方法。
  19. 前記癌患者が、対照患者と比較して高レベルのα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンを発現すると判断された請求項１７に記載の方法。
  20. 前記癌が膵臓癌である請求項１７に記載の方法。
  21. 膵臓癌の転移を阻害する方法としてさらに定義される請求項２０に記載の方法。
  22. 膵臓癌の増殖を阻害する方法としてさらに定義される請求項２０に記載の方法。
  23. 少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む請求項１７に記載の方法。
  24. 前記第２の抗癌療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である請求項２３に記載の方法。
  25. 前記第２の抗癌療法が免疫療法である請求項２４に記載の方法。
  26. 前記免疫療法がチェックポイント遮断療法である請求項２５に記載の方法。
  27. 前記チェックポイント遮断療法が、抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメントを投与することを含む請求項２６に記載の方法。
  28. インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む請求項１７～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する請求項２８に記載の方法。
  30. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である請求項２８に記載の方法。
  31. 処置を必要とする患者を処置する方法であって、前記方法が、α３β１インテグリンを通じて生存促進性シグナル伝達を阻害する有効量の薬剤を投与することを含む方法。
  32. 前記薬剤が、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する抗体または抗体フラグメントである請求項３１に記載の方法。
  33. 前記薬剤が、α３β１インテグリンの前記発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項３１に記載の方法。
  34. 前記患者が、癌、類線維種、組織傷害、ケロイド、臓器線維症、クローン病、狭窄、大腸炎、乾癬、または結合組織障害を有する請求項３１に記載の方法。
  35. 前記結合組織障害が、コラーゲンを含む結合組織障害である請求項３４に記載の方法。
  36. コラーゲンを含む前記結合組織障害が、１型コラーゲンを含む結合組織障害である請求項３５に記載の方法。
  37. 前記患者が癌を有する請求項３５に記載の方法。
  38. 前記α３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントが、請求項１～８のいずれか一項に記載の前記抗体または抗体フラグメントである請求項３１に記載の方法。
  39. 前記癌患者が、対照患者と比較して高レベルのα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンを発現すると判断された請求項３７に記載の方法。
  40. 前記癌が膵臓癌である請求項３７に記載の方法。
  41. 膵臓癌の転移を阻害する方法としてさらに定義される請求項４０に記載の方法。
  42. 膵臓癌の増殖を阻害する方法としてさらに定義される請求項４０に記載の方法。
  43. 少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む請求項３７に記載の方法。
  44. 前記第２の抗癌療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である請求項４３に記載の方法。
  45. インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する請求項４５に記載の方法。
  47. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である請求項４５に記載の方法。
  48. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドがα３β１インテグリンに結合する、ポリペプチド。
  49. 前記抗原結合ドメインが、α３β１インテグリンに結合する一次抗体のＨＣＤＲ配列と、α３β１インテグリンに結合する二次抗体のＬＣＤＲ配列を含む請求項４８に記載のポリペプチド。
  50. 前記抗原結合ドメインが、α３β１インテグリンに結合する抗体のＨＣＤＲ配列とＬＣＤＲ配列を含む請求項４８に記載のポリペプチド。
  51. 前記ＣＡＲが、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する請求項４８～５０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８ａヒンジドメインまたはＩｇＧ４ヒンジドメインである請求項４８～５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  53. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインである請求項４８～５２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  54. 細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメインを含む請求項４８～５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  55. 請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子。
  56. 前記ＣＡＲポリペプチドをコードする前記配列が、発現制御配列に作動可能に連結されている請求項５５に記載の核酸分子。
  57. 請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド、または請求項５５または５６に記載の核酸を含む単離された免疫エフェクター細胞。
  58. 前記核酸が、前記細胞のゲノムに組み込まれている請求項５７に記載の細胞。
  59. 前記細胞がＴ細胞である請求項５７または５８に記載の細胞。
  60. 前記細胞がＮＫ細胞である請求項５７または５８に記載の細胞。
  61. 前記細胞がヒト細胞である請求項５７～６０のいずれか一項に記載の細胞。
  62. 請求項５８～６１のいずれか一項に記載の細胞と、薬学的に許容される担体を含む細胞の集団を含む医薬組成物。
  63. 請求項４８～５４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチドを発現する抗腫瘍有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を投与することを含む、被験体を処置する方法。
  64. 前記ＣＡＲ Ｔ細胞が同種異系細胞である請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ＣＡＲ Ｔ細胞が自家細胞である請求項６３に記載の方法。
  66. 前記ＣＡＲ Ｔ細胞が前記被験体にＨＬＡ適合している請求項６３に記載の方法。
  67. 前記被験体が癌を有する請求項６３～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記癌が膵臓癌である請求項６７に記載の方法。
  69. インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む請求項６３～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する請求項６９に記載の方法。
  71. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である請求項６９に記載の方法。
  72. 少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む請求項６３～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記第２の抗癌療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である請求項７２に記載の方法。
  74. 前記第２の抗癌療法が免疫療法である請求項７３に記載の方法。
  75. 前記免疫療法がチェックポイント遮断療法である請求項７４に記載の方法。
  76. 前記チェックポイント遮断療法が、抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメントを投与することを含む請求項７５に記載の方法。
  77. α３β１インテグリンの発現を阻害する抗腫瘍有効量の薬剤を投与することを含む、被験体を処置する方法。
  78. 前記薬剤が、α３β１インテグリンｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである請求項７７に記載の方法。
  79. 前記薬剤が、α３β１インテグリンｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡである請求項７７に記載の方法。
  80. 前記薬剤が脂質ナノ粒子中に製剤化されている請求項７７または７８に記載の方法。
  81. 前記脂質ナノ粒子がエクソソームである請求項７７に記載の方法。
  82. 前記エクソソームが間葉系幹細胞に由来するエキソソームである請求項８１に記載の方法。
  83. 前記被験体が癌を有する請求項７７～８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記癌が膵臓癌である請求項８３に記載の方法。
  85. インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む請求項７７～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する請求項８５に記載の方法。
  87. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である請求項８５に記載の方法。
  88. 少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む請求項７７～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記第２の抗癌療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である請求項８８に記載の方法。
  90. 前記第２の抗癌療法が免疫療法である請求項８９に記載の方法。
  91. 前記免疫療法がチェックポイント遮断療法である請求項９０に記載の方法。
  92. 前記チェックポイント遮断療法が、抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメントを投与することを含む請求項９１に記載の方法。
  93. 癌の被験体を処置する方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記被験体に有効量のα３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントを投与するステップ；
    （ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲポリペプチドを発現する抗腫瘍有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を前記被験体に投与するステップであって、前記ＣＡＲポリペプチドはα３β１インテグリンに結合するステップ；または
    （ｃ）前記被験体に抗腫瘍有効量のα３β１インテグリンの発現を阻害する薬剤を投与するステップ；を含み、
    前記被験体の癌細胞は、健康な細胞または対照細胞と比較して、α３インテグリンの発現が増加していると判断された、方法。
  94. 前記方法が、前記有効量の（ａ）の前記α３β１インテグリン特異的抗体または抗体フラグメントを前記被験体に投与することを含み、前記抗体または抗体フラグメントが、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する請求項９３に記載の方法。
  95. 前記抗体フラグメントが、組換えｓｃＦｖ（可変一本鎖フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントである請求項９４に記載の方法。
  96. 前記抗体がキメラ抗体であるか、または二重特異性抗体である請求項９４または９５に記載の方法。
  97. 前記抗体がキメラ抗体であり、前記キメラ抗体がヒト化抗体である請求項９６に記載の方法。
  98. 前記抗体が二重特異性抗体であり、前記二重特異性抗体が、α３β１インテグリンとＣＤ３の両方に結合する請求項９６に記載の方法。
  99. 前記抗体または抗体フラグメントが、細胞傷害性薬剤に結合している請求項９４～９８いずれかに記載の方法。
  100. 前記抗体または抗体フラグメントが、診断薬に結合している請求項９４～９８のいずれかに記載の方法。
  101. 前記方法が、前記抗腫瘍有効量の（ｂ）の前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を前記被験体に投与することを含む請求項９３～１００のいずれかに記載の方法。
  102. 前記抗原結合ドメインが、α３β１インテグリンに結合する一次抗体のＨＣＤＲ配列と、α３β１インテグリンに結合する二次抗体のＬＣＤＲ配列を含む請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記抗原結合ドメインが、α３β１インテグリンに結合する抗体のＨＣＤＲ配列およびＬＣＤＲ配列を含む請求項１０１に記載の方法。
  104. 前記ＣＡＲが、α３β１インテグリンとα１ホモ三量体Ｉ型コラーゲンとの間の相互作用を妨害する請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８ａヒンジドメインまたはＩｇＧ４ヒンジドメインである請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインである請求項１０１～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメインを含む請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記方法が、前記抗腫瘍有効量の前記（ｃ）の薬剤を前記被験体に投与することを含む請求項９３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記薬剤が、α３β１インテグリンｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記薬剤が、α３β１インテグリンｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡである請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記薬剤が脂質ナノ粒子中に製剤化されている請求項１０８～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記脂質ナノ粒子がエクソソームである請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記エクソソームが間葉系幹細胞に由来するエキソソームである請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記被験体が癌を有する請求項９３～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記癌が膵臓癌である請求項１１４に記載の方法。
  116. インテグリンシグナル伝達阻害剤を投与することをさらに含む請求項９３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＦＡＫおよび／またはＰＹＫ２を阻害する請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記インテグリンシグナル伝達阻害剤が、ＶＳ－４７１８（ＰＮＤ－１０８６）である請求項１１７に記載の方法。
  119. 少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む請求項９３～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記第２の抗癌療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法またはサイトカイン療法である請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記第２の抗癌療法が免疫療法である請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記免疫療法がチェックポイント遮断療法である請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記チェックポイント遮断療法が、抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメントを投与することを含む請求項１２２に記載の方法。
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