KR20220036941A - 암 및 기타 질환의 치료를 위한 알파3베타1 인테그린 표적화 - Google Patents

암 및 기타 질환의 치료를 위한 알파3베타1 인테그린 표적화 Download PDF

Info

Publication number
KR20220036941A
KR20220036941A KR1020227002005A KR20227002005A KR20220036941A KR 20220036941 A KR20220036941 A KR 20220036941A KR 1020227002005 A KR1020227002005 A KR 1020227002005A KR 20227002005 A KR20227002005 A KR 20227002005A KR 20220036941 A KR20220036941 A KR 20220036941A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
integrin
cell
cancer
therapy
Prior art date
Application number
KR1020227002005A
Other languages
English (en)
Inventor
라구 칼루리
Original Assignee
더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 filed Critical 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Publication of KR20220036941A publication Critical patent/KR20220036941A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

본원에서는 일부 양상에서 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 표적화하는 항체, 키메라 항원 수용체, 또는 RNA 간섭 분자와 같은 제제가 제공된다. 하나의 양상들은 이를 필요로 하는 환자에게 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시키는 유효량의 제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 및 섬유종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 추가로 유효량의 화학치료요법 또는 면역치료요법을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

암 및 기타 질환의 치료를 위한 알파A3베타1 인테그린의 표적화
[0001] 본 출원은 2019년 6월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 62/864,611호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 전문이 본원에 참조로 인용된다.
1. 분야
[0002] 본 발명의 양상은 일반적으로 의약 분야에 관한 것이다. 특정 양상은 동종삼량체 I형 콜라겐과 α3β1 인테그린 간의 상호작용을 붕괴시킴에 의해 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
2. 배경
[0003] 미소섬유 콜라겐인 I형 콜라겐(col1)은 사람 신체에서 가장 풍부한 단백질이고 골, 힘줄 및 피부에 가장 풍부하게 존재한다. col1의 기본 기능성 유닛은 함께 3중 나선 구조를 형성하게 되는 2개의 a1 쇄 및 1개의 a2 쇄로 이루어진 이종삼량체이다. 각각의 a-쇄 폴리펩타이드는 시토졸에서 합성되고 2개의 다른 a-쇄와 조합되어 N-말단 및 C-말단 폴리펩타이드를 갖는 3중-나선 I형 프로콜라겐을 생성한다. 후속적으로, 프로콜라겐 분자는 세포외 공간으로 분비되고, 여기서, 상기 N-말단 및 C-말단 프로-펩타이드는 프로펩티다제에 의해 절단되어 Col1의 기본 기능성 유닛을 생성한다. Col1 3중 나선 막대형 분자는 서로 상호작용하여 미소섬유를 형성하고 추가로 가교결합을 진행하여 큰 다발의 섬유를 형성한다.
[0004] 배발생 동안에, 많은 기관은 col1을 발현하고 능히 세포 이동, 분화 및 구조 격실화를 촉진시키지만 성인 조직 실질 및 기관에서는 대부분 부재이다(문헌참조: Hay, 1981). Col1a1 유전자의 전신 결실(I형 콜라겐의 완전한 부재를 유도하는)은 배아 치사율을 초래한다(문헌참조: Lohler et al., 1984). 기관 섬유증 및 암과 같은 병원성 병태에서, Col1은 환부 조직에서 확고하게 축적된다(문헌참조: Apte et al., 2012; Armstrong et al., 2004; Bachem et al., 2005; Fujita et al., 2009; Haber et al., 1999). 종양 조직 관련 Col1은 암 세포 주변의 생물리적으로 “스티프(stiff)” 환경을 생성하여 유도 섬유 ‘트랙’을 통해 세포 이동을 촉진시키고, 비정상적 세포 상호작용을 촉진하여 암 세포의 증식 및 생존을 유도하는 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Apte et al., 2012; Armstrong et al., 2004; Bachem et al., 2005; Egeblad et al., 2010; Fujita et al., 2009; Haber et al., 1999; Levental et al., 2009). 이와 관련하여, Col1은 췌장암과 관련된 종양 기질/미세환경의 주요 성분이다(문헌참조: Mollenhauer et al., 1987). PDAC 관련된 aSMA+ 근섬유아세포 (MF)는 Col1의 생성에 상당히 기여하는 것으로 고려되고 암 세포로의 약물 전달을 방해하는 것으로 시사된다(문헌참조: Apte et al., 2012; Armstrong et al., 2004; Bachem et al., 2005; Egeblad et al., 2010; Fujita et al., 2009; Haber et al., 1999; Levental et al., 2009; Provenzano et al., 2012). 최근 연구는 PDAC에서 기질 섬유아세포가 종양 촉진 및 제한 영향을 부여하는, 상황에 의존하는 기능을 나타냄을 시사한다(문헌참조: Biffi et al., 2019; Kalluri, 2016; Laklai et al., 2016; Lee et al., 2014; Mueller and Fusenig, 2004; Neesse et al., 2015; Ohlund et al., 2014; Ohlund et al., 2017; Olive et al., 2009; Ozdemir et al., 2014; Provenzano et al., 2012; Rhim et al., 2014; Sugimoto et al., 2006). 이와 관련하여, PDAC의 개시 및 진행에서 활성화된 성상 세포/근섬유아세포 생성된 I형 콜라겐의 정확한 기능은 아직 알려져 있지 않다.
발명의 개요
[0005] 일부 구현예에서, 본원에서는α3β1 인테그린에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 상피 세포 상의 α3β1 인테그린에 결합한다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 섬유아세포 상의 α3β1 인테그린에 결합한다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시킨다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 α3β1 인테그린을 통한 생존 촉진 신호전달을 억제한다.
[0006] 일부 양상에서, 항체 단편은 재조합 scFv (단일쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab’)2 단편, 또는 Fv 단편이다. 일부 양상에서, 상기 항체는 키메라 항체이거나 이특이적 항체이다. 일부 양상에서, 키메라 항체는 사람화된 항체이다. 일부 양상에서, 이특이적 항체는 α3β1 인테그린 및 CD3 둘다에 결합한다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 세포독성제에 접합된다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 진단제에 접합된다.
[0007] 일부 구현예에서, 본원에서는 본원의 구현예 중 어느 하나의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하이브리도마 또는 가공된 세포가 제공된다. 하나의 구현예에서, 본원에서는 본원의 구현예 중 어느 하나의 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 제형이 제공된다.
[0008] 일부 구현예에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 유효량의 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 상피 세포 상의 α3β1 인테그린에 결합한다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 섬유아세포 상의 α3β1 인테그린에 결합한다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시킨다. 일부 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 α3β1 인테그린을 통한 생존 촉진 신호전달을 억제한다. 일부 양상에서, α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편은 본원의 구현예의 어느 하나의 항체 또는 항체 단편이다.
[0009] 일부 양상에서, 환자는 암, 섬유종 질환, 조직 손상, 켈로이드, 기관 섬유증, 크론 질환, 협착, 대장염, 건선 또는 연결 조직 장애를 갖는다. 일부 양상에서, 환자는 조직 손상 복구 또는 조직 재생을 필요로 한다. 일부 양상에서, 연결 조직 장애는 콜라겐을 포함하는 연결 조직 장애이다. 일부 양상에서, 콜라겐을 포함하는 연결 조직 장애는 1형 콜라겐을 포함하는 연결 조직 장애이다.
[0010] 특정 양상에서, 환자는 암을 갖는다. 일부 양상에서, 암 환자는 대조군 환자에 비해 상승된 수준의 α1 동종삼량체 I형 콜라겐을 발현하는 것으로 결정되었다. 일부 양상에서, 암은 췌장암이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 췌장암 전이를 억제하는 방법으로서 정의된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 췌장암 성장을 억제하는 방법으로서 정의된다.
[0011] 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 제2 항암 치료요법을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 제2 항암 치료요법은 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법이다. 일부 양상에서, 제2 항-암 치료요법은 면역치료요법이다. 일부 양상에서, 면역치료요법은 관문(checkpoint) 차단 치료요법이다. 일부 양상에서, 관문 차단 치료요법은 항-PD-1 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 FAK 및/또는 PYK2를 억제한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 VS-4718 (PND-1086)이다.
[0012] 일부 구현예에서, 본원에서는 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 α3β1 인테그린을 통한 생존 촉진 신호전달을 억제하는 유효량의 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 제제는 항체 또는 항체 단편이고, 이는 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시킨다. 일부 양상에서, α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편은 본원의 구현예의 어느 하나의 항체 또는 항체 단편이다. 일부 양상에서, 제제는 α3β1 인테그린의 발현을 억제하는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드이다.
[0013] 일부 양상에서, 환자는 암, 섬유종 질환, 조직 손상, 켈로이드, 기관 섬유증, 크론 질환, 협착, 대장염, 건선 또는 연결 조직 장애를 갖는다. 일부 양상에서, 환자는 조직 손상 복구 또는 조직 재생을 필요로 한다. 일부 양상에서, 연결 조직 장애는 콜라겐을 포함하는 연결 조직 장애이다. 일부 양상에서, 콜라겐을 포함하는 연결 조직 장애는 1형 콜라겐을 포함하는 연결 조직 장애이다.
[0014] 일부 양상에서, 환자는 암을 갖는다. 일부 양상에서, 암 환자는 대조군 환자에 비해 상승된 수준의 α1 동종삼량체 I형 콜라겐을 발현하는 것으로 결정되었다. 일부 양상에서, 암은 췌장암이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 췌장암 전이를 억제하는 방법으로서 정의된다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 췌장암 성장을 억제하는 방법으로서 정의된다.
[0015] 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 제2 항암 치료요법을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 제2 항암 치료요법은 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 FAK 및/또는 PYK2를 억제한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 VS-4718 (PND-1086)이다.
[0016] 일부 구현예에서, 본원에서는 α3β1 인테그린의 발현을 억제하는 항-종양 유효량의 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 제제는 α3β1인테그린 mRNA를 표적화하는 siRNA이다. 일부 양상에서, 제제는 지질 나노입자 중에 제형화된다. 일부 양상에서, 지질 나노입자는 엑소좀이다. 일부 양상에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 양상에서, 암은 췌장암이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 FAK 및/또는 PYK2를 억제한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 VS-4718 (PND-1086)이다.
[0017] 일부 구현예에서, 본원에서는 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩타이드가 제공되고, 이는 N-말단에서 C-말단으로 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 CAR 폴리펩타이드는 α3β1 인테그린에 결합한다. 일부 양상에서, 항원 결합 도메인은 α3β1 인테그린에 결합하는 제1 항체로부터의 HCDR 서열 및 α3β1 인테그린에 결합하는 제2 항체로부터 LCDR 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 인테그린 결합 도메인은 α3β1 인테그린에 결합하는 항체로부터의 HCDR 서열 및 LCDR 서열을 포함한다. 일부 양상에서, CAR은 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시킨다. 일부 양상에서, 힌지 도메인은 CD8a 힌지 도메인 또는 IgG4 힌지 도메인이다. 일부 양상에서, 막관통 도메인은 CD8a 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인이다. 일부 양상에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3z 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
[0018] 일부 구현예에서, 본원에서는 본원의 구현예 중 어느 하나의 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 양상에서, CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되어 있다.
[0019] 일부 구현예에서, 본원에서는 본원의 구현예 중 어느 하나에 따른 CAR 폴리펩타이드 또는 본원의 구현예 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 단리된 면역 이펙터 세포가 제공된다. 일부 양상에서, 핵산은 세포의 게놈으로 통합된다. 일부 양상에서, 세포는 T 세포이다. 일부 양상에서, 세포는 NK 세포이다. 일부 양상에서, 세포는 사람 세포이다.
[0020] 일부 구현예에서, 본원에서는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 본원의 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 집단을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
[0021] 일부 구현예에서, 본원에서는 본 발명의 구현예의 어느 하나에 따라 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 항-종양 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양상에서, CAR T 세포는 동종이계 세포이다. 일부 양상에서, CAR T 세포는 자가 세포이다. 일부 양상에서, CAR T 세포는 대상체에 매칭된 HLA이다. 일부 양상에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 양상에서, 암은 췌장암이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 FAK 및/또는 PYK2를 억제한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 VS-4718 (PND-1086)이다.
[0022] 일부 구현예에서, 본원에서는 본 발명의 구현예의 어느 하나에 따라 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 항-종양 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) NK 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양상에서, CAR NK 세포는 동종이계 세포이다. 일부 양상에서, CAR NK 세포는 자가 세포이다. 일부 양상에서, CAR NK 세포는 대상체에 매칭된 HLA이다. 일부 양상에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 양상에서, 암은 췌장암이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 FAK 및/또는 PYK2를 억제한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 VS-4718 (PND-1086)이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 적어도 제2 항암 치료요법을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 제2 항암 치료요법은 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 추가로 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 FAK 및/또는 PYK2를 억제한다. 일부 양상에서, 인테그린 신호전달의 억제제는 VS-4718 (PND-1086)이다.
[0023] 일부 구현예에서, 본원에서는 암에 대해 대상체를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 유효량의 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계; (b) N-말단에서 C-말단으로, 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 항-종양 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 CAR 폴리펩타이드가 α3β1 인테그린에 결합하는, 단계; 또는 (c) α3β1 인테그린의 발현을 억제하는 항-종양 유효량의 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고; 상기 대상체로부터의 암 세포가 건강한 세포 또는 대조군 세포에 비해 α3 인테그린의 증가된 발현을 갖는 것으로 결정되었다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a)의 유효량의 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항체 단편은 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (b)의 항-종양 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (c)의 항-종양 유효량의 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
[0024] 본원에 사용된 바와 같은 특정 성분과 관련하여 “필수적으로 부재”는 본원에서 특정 성분의 어느 것도 의도적으로 조성물에 제형화되지 않고/않거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01%이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0025] 본원 명세서에서, 단수형 관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0026] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
[0027] 본 출원 전반에 걸쳐, “약” 이라는 용어는 어떠한 값이 해당 장치, 그 값을 측정하는데 사용되는 방법에 대한 고유의 오차 변화, 또는 해당 연구 대상들 간에 존재하는 변화를 포함함을 나타내는데 사용된다.
[0028] 본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명을 보면 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
[0029] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0030] 도 1a-1d I형 콜라겐 동종삼량체는 α3β1 인테그린을 통한 생존 촉진 신호전달을 유도한다. KPPC;Col1pdxKO 암 세포는 DDR1 (A,B), 인테그린 β1 (C), 또는 인테그린 α3 (D)의 siRNA로 형질감염시켰다. 세포는 이어서 16시간 동안 col1 동종삼량체 또는 이종삼량체 (50 μg/mL)를 사용한 처리 전 6시간동안 1% FBS를 갖는 DMEM 배지로 항온처리하였다. 세포는 수거하고, 용해시키고 웨스턴 블롯팅에 의해 지적된 단백질에 대해 조사하였다.
[0031] 도 2a-2h I형 콜라겐 동종삼량체는 인테그린을 통한 지속적인 증식 신호를 유도한다. (A,B) KPPC;Col1pdxKO 암 세포는 β1 (A), α1, α2, 또는 α3 (B)의 siRNA로 형질감염시켰다. 세포는 이어서 16시간 동안 col1 동종삼량체 또는 이종삼량체 (50 μg/mL)를 사용한 처리 전 6시간동안 1% FBS를 갖는 DMEM 배지로 항온처리하였다. 세포는 수거하고, 용해시키고 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. (C) KPPC;Col1pdxKO 암 세포에서 선택된 인테그린 서브유닛의 발현 수준. (D) 데이터베이스 (Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE))로부터의 RNA-seq 데이터를 기반으로 선택된 인테그린 서브유닛 사람 PDAC 세포주(Panc1, BxPC3, MiaPaca2, PSN1, HPAC, CAPAN1)의 발현 수준. RMA (강력한 다중-어레이 평균 알고리즘) 정규화를 사용하였고 데이터는 log2 유전자 발현 신호이다. (E) 단일 세포 RNA 서열분석을 사용하여 t-SNE 플롯에 나타낸 바와 같이 KPPC 종양으로부터 다양한 세포 클러스터 중에 인테그린 α3 (Itga3)의 발현 프로필. (F) KPPC 종양 섹션 상에 인테그린 α3 IHC 염색의 대표적인 이미지. 스케일 바: 100 μm. (G) 6-웰 플레이트에서 성장하는 KPPC;Col1pdxKO 암 세포는 일반 배지 (10% FBS를 갖는 DMEM)로 60% 컨플루언스에 도달하도록 배양하였다. 세포는 이어서 16시간 동안 FAK 억제제 (VS-4718, 1 μM)의 존재 또는 부재하에 col1 동종삼량체 또는 이종삼량체 (50 μg/mL)를 사용한 처리 전 6시간동안 1% FBS를 갖는 DMEM 배지로 항온처리하였다. 세포는 수거하고, 용해시키고 웨스턴 블롯팅에 의해 세포 신호전달에 대해 조사하였다. (H) 비히클 또는 FAK 억제제(VS-4718, 구강 위관 영양처리, 7일 동안 하루 당 2회 50mg/kg)로 처리된 KPPC (연령-매칭된 4주령) 마우스의 췌장의 H&E-염색된 섹션. 스케일 바: 100 μm. ADM 및 PanIN 병변의 퍼센트 면적을 정량하였다. * P < 0.05.
[0032] 도 3a-3x 지적된 세포 클러스터에서 인테그린 서브유닛의 발현 패턴을 보여주는, KPPC ( LSL-KrasG12D;Trp53loxP/loxP;Pdx1-Cre ) 마우스의 췌장 종양으로부터의 비분획화된 생세포 혼합물의 단일 세포 RNA 서열 (sc-RNA-seq) 분석. 기능성 세포 클러스터 1-13의 상부 상향조절된 유전자 시그니처의 히트 맵을 나타낸다. 도 2e로부터 계속됨
[0033] 도 4. 뮤린 및 사람 췌장 종양 조직 섹션 상에 인테그린 a3 IHC 염색의 대표적인 이미지. 도 2f로부터 계속됨 스케일 바: 100 μm.
[0034] 도 5a-5e 조직 마이크로어레이 상에 인테그린 α3 면역화학적 염색. 도 5a는 사람 PDAC 섹션에서 0 내지 3의 스케일 상의 인테그린 α3의 면역조직화학적 (IHC) 스코어를 보여주는 대표적인 이미지를 보여준다. 인테그린 α3의 염색 강도는 염색의 가시적 스코어링(3-매우 높은, 2-높은, 1-낮은, 및 0-음성)에 의해 정량하였다. 도 5b는 양성 종양 세포의 염색 및 퍼센트의 강도의 조합 스코어에 의해 등급화된 모든 샘플에 대해 인테그린 α3의 IHC 스코어를 보여준다. 인테그린 α3 발현의 평균 스코어는 전체 코호트에 대해 1.87이었다. 도 5c는 지적된 인테그린 α3 발현 수준 (스코어 2-3: 매우 높은, 스코어 1-2: 높은, 및 스코어 <1: 낮음)을 갖는 PDAC 샘플의 사례 수 및 퍼센트의 표를 보여준다. 도 5d 및 5e는 인테그린 α3 발현 수준과 전체 생존률 (도 5d) 및 진행 부재 생존률(도 5e) 간의 상호관계를 보여주는 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존률 곡선을 보여준다. 인테그린 α3의 발현은 컷오프로서 평균 조합 스코어 1.87을 사용하여 ITGA3-높은 (하한선; n = 68) 및 ITGA3-낮은 (상한선; n = 62)로서 카테고리화하였다.
[0035] 도 6. 시험관내 α3 인테그린 (Itga3) siRNA 처리. KPPC 및 KPPC;Col1pdxKO 암 세포는 siRNA of 인테그린 α3의 siRNA로 형질감염시켰다. 세포는 이어서 48시간동안 1% FBS를 갖는 RPMI 배지로 항온처리하고 세포 생존능 검정(n=3 생물학적 복제물)에 의해 조사하였다. ** P < 0.01, NS: 유의적이지 않음.
[0036] 도 7. KPCC 마우스로 엑소좀-매개된 Itga3 siRNA 전달. 중간엽 줄기 세포-유래된 엑소좀으로 처리된 KPPC (5주령) 마우스에 siRNA-대조군 또는 siRNA-Itga3를 전기천공하였다(48시간 마다 0.1 μg of siRNA을 함유하는 주사 당 108 엑소좀을 사용한 복막내 주사). ** P < 0.01.
[0037] 도 8a-8h 암 세포에 의한 I형 동종삼량체의 결실은 T 세포 침윤을 증가시키고 항-PD-1 치료요법의 효능을 가능하게 한다. 도 8a 및 8b는 KPFF (도 8a) 및 KPFF;Col1smaKO (도 8b) 마우스의 유전학적 변형의 대표 도식을 보여준다. 도 8c는 KPPF 종양 (n = 3) 및 KPPF;Col1smaKO 종양(n=4)에 대한 RNA-seq를 보여준다. KPPF 종양과 비교하는 경우, 독창적 경로 분석(IPA)을 수행하여 KPPF;Col1smaKO 종양에서 하향조절된 면역 경로를 가시화하였다. 이들 유전자는 또한 log2-배수 변화 및 P 값과 함께 열거한다. 도 8d 및 8e는 KPPC (도 8d) 및 KPPC;ColpdxKO (도 8e) 마우스의 유전학적 변형의 대표적인 도식을 보여준다. 도 8f는 KPPC 종양 (n = 3) 및 KPPC;Col1smaKO 종양(n=4)에 대한 RNA-seq를 보여준다. KPPC 종양과 비교하는 경우, 독창적 경로 분석(IPA)을 수행하여 KPPC;Col1pdxKO 종양에서 하향조절된 면역 경로를 가시화하였다. 이들 유전자는 또한 log2-배수 변화 및 P 값과 함께 열거한다. 도 8g는 KPPF 종양 (n = 4) 및 KPPF;Col1smaKO 종양(n = 4)의 멀티플렉스 염색된 섹션의 다중스펙트럼 이미지화로부터 CD3+, CD4+, 및 CD8+ T 세포 정량을 보여준다. 스케일 바: 100 ㎛. 도 8h는 KPPC 종양 (n = 8) 및 KPPC;Col1pdxKO 종양(n = 6)의 멀 티플렉스 염색된 섹션의 다중스펙트럼 이미지화로부터 CD3+, CD4+, 및 CD8+ T 세포 정량을 보여준다. 스케일 바: 100 ㎛. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, NS: 유의적이지 않음.
[0038] 도 9a-9n 암 세포에 의한 I형 동종삼량체의 결실은 T 세포 침윤에 대한 면역억제 영향을 역전시키고 항-PD-1 치료요법의 효능을 가능하게 한다. 도 9a 및 9b는 KPPC (도 9a) 및 KPPC;Col1pdxKO (도 9b) 종양 (그룹 당 5마리의 마우스로부터)에서 퍼센트 면역 세포 집단 (지적된 마커에 대해 양성인)의 유동 세포측정 분석을 보여준다. CD3+ 세포 중에서 CD4+ and CD8+ 집단에 대한 게이팅 전략을 나타낸다. 도 9c-9h는 % CD45+ (도 9c), % CD3+ (도 9d), % CD4+ (도 9e), % PD1+CD4+ (도 9f), % CD8+ (도 9g), 및 % PD1+CD8+ (도 9h) 세포의 정량을 보여준다. 도 9i는 KPPC (n = 26) 및 KPPC;Col1pdxKO (n = 33) 마우스와 비교하여, 항-PD1 치료요법으로 처리된 KPPC 마우스 (n=6) 및 KPPC;Col1pdxKO 마우스(n=10)의 생존률을 보여준다. 도 9J는는 본원 개시내용의 실험 방법의 도식을 보여준다. 도 9k-9n은 비장 림프구 (4개의 건강한 마우스로부터 단리된)가 하기의 존재 또는 부재하에 배양되는 연구로부터의 결과를 보여준다: 활성화 (항-CD3/항-CD28 항체, 1 ng/mL), KPPC 암 세포 동시-배양, 및 1일동안의 KPPC;Col1pdxKO 암 세포 동시 배양(림프구:암 세포 비율 = 10:1). 이어서 비장 림프구는 유동 세포측정에 의해 조사하였다. 바(Bar) 그래프는 각각의 바 그래프에 대해 좌측에서 우측으로 하기의 조건으로부터의 결과를 보여준다: 활성화 부재, 활성화, 활성화 및 KPCC 동시 배양, 및 활성화 및 KPCC;Col1pdxKO 동시 배양.
[0039] 본원 개시내용의 양상은 암 세포가 구체적으로 1형 콜라겐 변이체를 생성한다는 사실에 관한 것이다. 이론에 국한시키고자 하는 것 없이, 건강한 근섬유아세포는 DDR 수용체에 결합하고 종양 성장을 제한하는 α1/α2/α1 이종삼량체를 생성하는 것으로 이해된다. 한편, 본원에 기재된 바와 같은, 암 세포는 α3β1 인테그린에 결합하여 발암 촉진 신호를 유도하는 α1/α1/α1 동종삼량체를 생성한다.
[0040] Col1 동종삼량체는 이종삼량체와 비교하는 경우, DDR1의 인산화를 강하게 유도하고, FAK, AKT 및 ERK1/2를 활성화시킨다. 제1 평가에 대해, 이것은 이전에 공개된 것과 대조적이다(문헌참조: Armstrong et al., 2004; Bachem et al., 2005; Fujita et al., 2009). 그러나, 상기 연구 모두에서, 암 세포에 의해 생성된 Col1의 기여는 배제될 수 없다. DDR1의 억제는 FAK, AKT, 및 ERK1/2의 계속되는 활성화를 유도한다. 이것은 Col1 동종삼량체가 다른 수용체를 병행하여 또는 보상 기전으로서 활성화시킬 수 있음을 시사한다. 단일 세포 RNA 서열분석은 췌장 암 세포가 Col1-결합 인테그린, 예를 들어, α1β1, α2β1, 및 α3β1을 발현시킬 수 있음을 시사하였다. 이전의 연구는 인테그린 α1β1, α2β1, 및 α3β1이 Col1에 결합함을 보여주었다(문헌참조: Ruoslahti, 1991; Takada et al., 2007). 본원의 개시내용은 Col1 동종삼량체가 인테그린 α3β1과 상호작용할 수 있고 지속적으로 생존률 촉진 신호를 유도할 수 있음을 보여준다. 더욱이, DDR1의 억제는 인테그린 α3β1의 상향조절을 유도한다. 추가로, 암 세포에서 Col1 동종삼량체 발현의 감소 또는 제거를 통해 역전될 수 있는, T 세포 침윤의 암 억제에서 Col1 동종삼량체에 대한 역할이 기재되어 있다. 총체적으로, 이들 연구는 Col1 동종삼량체가 조기 단계 췌장 암-개시 세포 상의 인테그린 α3β1과 상호작용하여 증식 및 생존률을 유도하고 면역 세포 침윤을 어게함을 시사한다. KPPC 마우스에서 췌장 암의 조기 단계에서 FAK의 억제는 유의적인 질환 제어를 유도하고, PDAC의 개시 및 진행에서 상기 신호전달 축의 중요성을 확증한다. 요약하면, 이들 연구는 새로운 치료학적 전략의 개발과 관련하여, Col1의 신규 발암성 변이체 동정과 함께 PDAC 진행에서 Col1의 이중 모드 기여를 동정한다.
[0041] 이와 같이, 예를 들어, 항체, 소분자, siRNA, 안티-센스 올리고스, CAR-T 세포, CAR-NK 세포, 이특이적 항체를 사용한 α3β1 인테그린으로의 동종삼량체 결합의 차단이 암 또는 섬유증을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본원 발명자들은 이를 통해 상기 구별을 이용하여 암을 치료하는 여러 방법을 확인하였다. 이들은 (1) α3β1 인테그린에 특이적으로 결합하는 항체의 용도; (2) α3β1 인테그린을 통한 신호전달을 억제하는 제제의 용도; (3) α3β1 인테그린의 발현을 억제하는 siRNA 또는 안티-센스 올리고스; (4) α3β1 인테그린을 표적화하는 CAR-T 세포의 용도; (5) α3β1 인테그린을 표적화하는 CAR-NK 세포의 용도; 및 (6) 3β1 인테그린 및 CD3 둘다를 표적화하여 T 세포를 암 세포로 지시하는 이특이적 항체의 용도를 포함한다. 추가로, 관문 차단 치료요법 (예를 들어, 항-PD-1 치료요법)과 같은 면역치료요법과 조합하여 Col1 동종삼량체의 α3β1 인테그린으로의 결합을 차단하기 위한 방법의 용도를 포함하는 방법이 고려된다.
I. 항체 및 이의 제조
[0042] “단리된 항체”는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분들은 항체에 대한 진단학적 또는 치료학적 사용을 차단하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 항체는 하기와 같이 정제된다: (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같은 항체의 95중량% 초과로, 및 가장 특히 99중량% 초과로; (2) 스피닝 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로; 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 실버 염색을 사용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의한 균질성으로. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내 동일계 항체를 포함한다. 통상적으로, 그러나, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다.
[0043] 기본 4개의 쇄 항체 유닛은 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H) 쇄로 구성된 이종사량체 당단백질이다. IgM 항체는 J쇄로 불리우는 추가의 폴리펩타이드와 함께 5개의 기본 이종사량체 유닛으로 이루어지고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하고, 분비된 IgA 항체는 중합하여 J쇄와 함께 기본 4개의 쇄 유닛의 2 내지 5개를 포함하는 다가 어셈블리체를 형성할 수 있다. IgG의 경우에, 4개-쇄 유닛은 일반적으로 약 150,000 돌턴이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H쇄에 연결되고, 2개의 H쇄는 H 쇄 이소타입에 의존하여 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에 가변 영역(VH)에 이어서 알파 및 감마 쇄 각각에 대한 3개의 불변 도메인 (CH) 및 mu 및 이소타입에 대한 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L쇄는 N-말단에, 가변 영역(VL)에 이어서 이의 다른 말단에 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, Cl은L은 중쇄 (CH1)의 제1 불변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 영역 사이에 계면을 형성하는 것으로 사료된다. VH 및 VL과 함께 쌍 형성은 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 항체 부류의 구조 및 성질에 대해서는 예를 들어, 문헌(Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6)을 참조한다.
[0044] 임의의 척추동물 종으로부터의 L쇄는 이들의 불변 도메인 (CL)의 아미노산 서열을 기준으로 카파 및 람다로 불리는 2개의 명백하게 특유의 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 이들의 중쇄 (CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존하여, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 이소타입에 할당될 수 있다. 5개 부류의 면역글로불린이 있다: 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 u로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 감마 및 알파 부류는 추가로 CH 서열 및 기능에서 상대적으로 최소의 차이를 기준으로 아부류로 세분되고, 사람은 하기의 아부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2.
[0045] 용어 “가변”은 V 도메인의 특정 분절이 항체 중에 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 언급한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 영역의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 균등하게 분포되어 있지 않다. 대신, V 영역은 각각 9 내지 12개 아미노산 길이인 “초가변 영역”으로 불리우는 보다 짧은 영역의 극한 가변성에 의해 분리된 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역 (Fr)으로 불리우는 상대적으로 불변의 스트레치로 이루어진다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 대부분 베타-시트 형태를 채택하는 4개의 FR 영역을 포함하며, 베타-시트 형태는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되어 루프 연결을 형성하고 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각각의 쇄 중에 초가변 영역은 함께 FR에 의해 밀접하게 유지되고 있고, 다른 쇄 기원의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항체가 항원으로 결합하는데 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP), 항체 의존성 호중구 식세포작용 (ADNP), 및 항체 의존성 보체 침적 (ADCD)의 관여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
[0046] 본원에 사용되는 경우 용어 “초가변 영역”은 항원 결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 언급한다. 초가변 영역은 일반적으로 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우 VL에서 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 주변 및 VH에서 약 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 주변; 문헌참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); 및/또는 “초가변 루프”로부터의 상기 잔기(예를 들어, 초티아 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우 VL에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에서 26-32 (H1), 52-56 (H2) 및 95-101 (H3); 문헌참조: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); 및/또는 those residues from a “초가변 루프”/CDR로부터의 상기 잔기 (예를 들어, IMGT 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 경우 VL에서 잔기 27-38 (L1), 56-65 (L2) 및 105-120 (L3), 및 VH에서 27-38 (H1), 56-65 (H2) 및 105-120 (H3); 문헌참조: Lefranc, M. P. et al. Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M. et al. Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000))들을 포함한다. 임의로 상기 항체는 Aho에 따라 넘버링되는 경우 VL에서 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) 및 123 (L3) 및 VsubH에서 28, 36 (H1), 63, 74-75 (H2) 및 123 (H3)의 지점 중 하나 이상에서 대칭 삽입을 갖는다(문헌참조: Honneger, A. and Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)).
[0047] “생식계열 핵산 잔기”는 불변 또는 가변 영역을 암호화하는 생식계열 유전자에 천연적으로 존재하는 핵산 잔기를 의미한다. “생식계열 유전자”는 생식 세포 (즉, 난자 또는 정자가 될 세포)에서 발견되는 DNA이다. "생식계열 돌연변이"는 단일 세포 단계에서 생식 세포 또는 접합체에서 발생한 특정 DNA의 유전가능한 변화를 언급하고, 자손에게 전달되는 경우, 이러한 돌연변이는 신체의 모든 세포에 도입된다. 생식계열 돌연변이는 단일 신체 세포에서 획득된 체세포 돌연변이와는 대조적이다. 일부 경우에, 가변 영역을 암호화하는 생식계열 DNA 서열에서 뉴클레오타이드는 돌연변이되고 (즉, 체세포 돌연변이) 상이한 뉴클레오타이드로 대체된다.
[0048] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 언급하고, 즉, 상기 집단을 포함하는 상기 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 추가로, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상에 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성에 추가로, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 상태로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 “모노클로날”은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본원의 개시내용에서 유용한 모노클로날 항체는 문헌(참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 의해 먼저 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 항원 특이적 B 세포, 감염 또는 면역화에 반응하는 항원 특이적 형질모세포의 단일 세포 분류 또는 벌크 분류된 항원 특이적 수거에서 단일 세포로부터 연결된 중쇄 및 경쇄의 포획 후 세균, 진핵 동물 또는 식물 세포 (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호)에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다. “모노클로날 항체”는 또한 예를 들어, 문헌(참조: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
B. 일반 방법
[0049] α3β1 인테그린에 결합하는 모노클로날 항체는 여러 응용을 갖는 것으로 이해된다. 이들은 암을 검출하고 진단하고 이를 치료하는데 사용하기 위한 진단 키트의 생산을 포함한다. 이들 문맥에서, 당업자는 상기 항체를 진단학적 또는 치료학적 제제에 연결할 수 있거나, 이들을 경쟁 검정에서 포획제 또는 경쟁자로서 사용하거나 여기에 접착된 추가의 제제 없이 이들을 개별적으로 사용할 수 있다. 항체는 하기에 추가로 논으된 바와 같이 돌연변이되거나 변형될 수 있다. 항체를 제조하고 특징 분석하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 미국 특허 제4,196,265호).
[0050] 모노클로날 항체 (MAb)를 생성하기 위한 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하기 위한 것들과 동일한 라인을 따라 개시한다. 이들 방법 둘다를 위한 제1 단계는 적절한 숙주의 면역화 또는 이전의 천연 감염 또는 허가된 또는 실험적 백신으로 면역성이 있는 대상체의 동정이다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 면역화를 위한 소정의 조성물은 이의 면역원성에서 다양할 수 있다. 따라서, 흔히 펩타이드 또는 폴리펩타이드 면역원을 담체에 커플링시킴에 의해 성취될 수 있는 바와 같이 숙주 면역계를 부스팅할 필요가 있다. 예시적인 담체는 키홀 림펫 호모시아닌 (KLH) 및 소 혈청 알부민 (BSA)이다. 난알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민과 같은 기타 알부민이 또한 담체로서 사용될 수 있다. 폴리펩타이드를 담체 단백질에 접합시키기 위한 수단은 당업계에 널리 공지되어 있고, 글루타르알데하이드, m-말레이미도벤코일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 카보디이미드 및 비스-비아조티화된 벤지딘을 포함한다. 또한, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 보조제로서 공지된 면역 반응으 비-특이적 자극인자의 사용에 의해 증진될 수 있다. 동물에서 예시적인 보조제는 완전 프룬트 보조제(사멸된 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비-특이적 자극인자), 불완전 프룬트 보조제 및 수산화알루미늄 보조제를 포함하고 사람에서는 알룸(alum), CpG, MFP59 및 면역자극 분자의 조합 (“보조제 시스템”, 예를 들어, AS01 또는 As03)을 포함한다. 암 특이적 B 세포를 유도하는 추가의 실험 형태의 접종이 가능하고, 물리적 전달 시스템 (예를 들어, 지질 나노입자로서 또는 골드 바이올리스틱 비드)에서 나노입자 백신 또는 DNA 또는 RNA 유전자로서 전달되고, 바늘, 유전자총, 경피 전기천공 장치를 사용하여 전달된 유전자 암호화된 항원을 포함한다. 항원 유전자는 또한 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 또는 알파바이러스 레플리콘 또는 대안적으로 바이러스 유사 입자와 같은 복제 적격 또는 결손 바이러스 벡터에 의해 암호화된 바와 같이 운반될 수 있다.
[0051] 폴리클로날 항체의 생성에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역화를 위해 사용되는 동물 뿐만 아니라 면역원의 성질에 따라 다양하다. 다양한 경로 (피하, 근육내, 피내, 정맥내 및 복막내)를 사용하여 면역원을 투여할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조는 면역화 후 다양한 지점에서 면역화된 동물의 혈액을 샘플링함에 의해 모니터링될 수 있다. 제2의 부스터 주사가 또한 주어질 수 있다. 부스팅 및 타이터링의 공정은 적합한 역가가 성취될때까지 반복한다. 목적하는 수준의 면역원성이 수득되는 경우, 면역화된 동물은 채혈될 수 있고 혈청을 단리하고 저장하고/하거나 동물은 Mab를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
[0052] 면역화 후, 항체를 생성하기 위한 잠재력을 갖는 체세포, 구체적으로 B 림프구 (B 세포)는 Mab 생성 프로토콜에 사용하기 위해 선택된다. 이들 세포는 생검 비장, 림프절, 편도 또는 아데노이드, 골수 흡인물 또는 생검, 폐 또는 GI 관과 같은 점막 기관으로부터의 조직 생검으로부터 또는 순환 혈액으로부터 수득될 수 있다. 면역화된 동물 또는 면역 사람으로부터 항체 생성 B 림프구는 이어서 불멸의 골수종 세포, 일반적으로 면역화된 동물과 동일한 종의 세포 또는 사람 또는 사람/마우스 키메라 세포와 융합된다. 하이브리도마-생성 융합 절차에 사용하기 위해 적합한 골수종 세포주는 바람직하게는 비항체-생성 골수종 세포로서, 높은 융합 효율을 나타내며, 바람직한 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 지지하는 특정 선택 배지에서 이들의 성장을 불가능하게 만드는 효소 결핍을 갖는다. 다수의 골수종 세포의 어느 하나는 당업자에게 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. HMMA2.5 세포 또는 MFP-2 세포는 특히 상기 세포의 유용한 예이다.
[0053] 항체-생성 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 생성하기 위한 방법은 일반적으로 세포막의 융합을 촉진시키는 제제 또는 제제들(화학적 또는 전기)의 존재하에 체세포를 골수종 세포와 2:1의 비율로 혼합하는 단계를 포함하지만, 상기 비율은 각각 약 20:1 내지 약 1:1로 다양할 수 있다. 일부 경우에, 초기 단계로서 사람 B 세포의 엡슈타인 바르 바이러스 (EBV)를 사용한 형질전환은 B 세포의 크기를 증가시켜 상대적으로 대형 크기의 골수종 세포와의 융합을 증진시킨다. EBV에 의한 형질전환 효율은 형질전환 배지에서 CpG 및 Chk2 억제제 약물을 사용함에 의해 증진된다. 대안적으로, 사람 B 세포는 추가의 가용성 인자, 예를 들어, IL-21 및 사람 B 세포 활성화 인자 (BAFF), TNF 슈퍼패밀리의 II형 구성원을 함유하는 배지에서 CD40 리간드 (CD154)를 발현하는 형질감염된 세포주와 동시 배양함에 의해 활성화될 수 있다. 센다이 바이러스를 사용한 융합 방법은 보고되었고, 37% (v/v) PEG와 같은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하는 것들이다. 전기 유도 융합 방법의 사용이 또한 적절하고, 보다 양호한 효율을 위한 공정이 있다. 융합 절차는 일반적으로 낮은 빈도로, 약 1 x 10-6 내지 1 x 10-8로 생존가능한 하이브리드를 생성하지만, 최적화된 절차와 함께 당업자는 200 중 1에 가까운 융합 효율을 성취할 수 있다. 그러나, 상대적으로 낮은 융합 효율은 생존가능한 융합된 하이브리드가 선택 배지에서 배양함에 의해 모계 주입된 세포 (특히, 정상적으로 무한적으로 계속 분열하는 융합된 골수종 세포)로부터 유래하기 때문에 문제를 부과하지 않는다. 선택 배지는 일반적으로 조직 배양 배지에서 뉴클레오타이드의 드 노보 합성을 차단하는 제제를 함유하는 배지이다. 예시적인 제제는 아미노프테린, 메토트렉세이트 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 퓨린 및 피리미딘 둘다의 드 노보 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 단지 퓨린 합성을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 배지에는 뉴클레오타이드의 공급원으로서 하이포크산틴 및 티미딘이 보충된다(HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 배지는 하이포크산틴이 보충된다. 우아바인(Ouabain)은 B 세포 공급원이 EBV-형질전환된 사람 B 세포주인 경우 첨가되어 골수종과 융합되지 않은 EBV-형질전환된 세포주를 제거하였다.
[0054] 예시적인 선택 배지는 HAT 또는 우아바인을 갖는 HAT이다. 뉴클레오타이드 구제 (salvage) 경로를 작동시킬 수 있는 세포만이 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 골수종 세포는 구제 경로의 주요 효소, 예를 들어, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT)가 결함이고 이들은 생존할 수 없다. B 세포는 상기 경로를 작동시킬 수 있지만 이들은 배양에서 제한된 수명을 갖고 일반적으로 약 2주 내에 죽는다. 따라서, 선택 배지에서 생존할 수 있는 유일한 세포는 골수종과 B 세포로부터 형성된 하이브리드이다. 융합을 위해 사용되는 B 세포의 공급원이 본원에서와 같이 EBV-형질전환된 B 세포의 세포주인 경우, 우아바인은 또한 EBV-형질전환된 B 세포가 약물 사멸에 민감할 수 있는 반면 사용되는 골수종 파트너는 우아바인에 내성인 것으로 선택되기 때문에 하이브리드의 약물 선택을 위해 사용될 수 있다.
[0055] 배양은 이로부터 특이적 하이브리도마가 선택되는 하이브리도마 집단을 제공한다. 전형적으로, 하이브리도마의 선택은 세포를 미세적정 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 배양함에 이어서 목적하는 반응성에 대한 개별 클론 상등액 (약 2 내지 3주 후)을 시험함에 의해 수행된다. 방사선면역검정, 효소 면역검정, 세포독성 검정, 플라크 검정 도트 면역결합 검정 등과 같은 검정은 민감성이고, 단순하고 신속해야만 한다. 선택된 하이브리도마는 이어서 연속으로 희석하거나 유동 세포측정 분류에 의해 단일 세포 분류하고, 개별 항체 생산 세포주에 클로닝하고, 이어서 상기 클론을 무한으로 증식시켜 mAb를 수득한다. 세포주는 2개의 기본 방식으로 Mab의 생성을 위해 활용될 수 있다. 하이브리도마 샘플은 동물 (예를 들어, 마우스)에게 주사 (흔히 복강으로)될 수 있다. 임의로, 상기 동물은 탄화수소, 특히 주사 전 프리스탄 (테트라메틸펜다데칸)과 같은 오일로 프라이밍시킨다. 사람 하이브리도마가 상기 방식으로 사용되는 경우, SCID 마우스와 같은 면역손상된 마우스에 주사하여 종양 거부를 방지하는 것이 최적이다. 주사된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성된 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발생시킨다. 혈청 또는 복수액과 같은 동물의 체액은 이어서 두드려서 고농도로 Mab를 수득할 수 있다. 개별 세포주는 또한 시험관내 배양될 수 있고, 여기서, Mab는 천연적으로 배양 배지로 분비되고 이로부터 이들은 고농도로 신속하게 수득될 수 있다. 대안적으로, 사람 하이브리도마 세포주는 시험관내 사용하여 세포 상등액 중에 면역글로불린을 생성할 수 있다. 세포주는 무혈청 배지 중에서 성장을 위해 적응시켜 고순도의 사람 모노클로날 면역글로불린을 회수하는 능력을 최적화시킬 수 있다.
[0056] 어느 한 수단에 의해 생성되는 Mab는 경우에 따라 여과, 농축 및 다양한 크로마토그래피 방법, 예를 들어, FPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 본원 개시내용의 모노클로날 항체의 단편은 효소, 예를 들어, 펩신 또는 파파인을 사용한 분해를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 황원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 정제된 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 본원의 개시내용에 의해 포괄되는 모노클로날 항체 단편은 자동화 펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
[0057] 또한 분자 클로닝 접근법을 사용하여 모노클로날 항체를 생성하는 것이 고려된다. 관심 대상의 항원으로 표지된 단일 B 세포는 상자성 비드 선택 또는 유동 세포측정 분류를 사용하여 물리적으로 분류될 수 있고 이어서 RNA는 RT-PCR에 의해 증폭된 단일 세포 및 항체 유전자로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, 세포의 항원-특이적 벌크 분류된 집단은 미세소포체로 분리될 수 있고, 매칭된 중쇄 및 경쇄 가변 유전자는 중쇄 및 경쇄 앰플리콘의 물리적 연결 또는 소포체로부터 중쇄 및 경쇄 유전자의 통상적인 바코딩을 사용하여 단일 세포로부터 회수될 수 있다. 단일 세포로부터 매칭된 중쇄 및 경쇄 유전자는 또한 RT-PCR 프라이머, 및 전사체를 세포 당 하나의 바코드로 마킹하기 위한 바코드를 함유하는 세포 침투 나노입자로 처리함에 의해 항원 특이적 B 세포 집단으로부터 수득될 수 있다. 항체 가변 유전자는 또한 하이브리도마 세포주의 RNA 추출 및 RT-PCR에 의해 수득된 항체 유전자에 의해 단리되고 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 대안적으로, 조합 면역글로불린 파아지미드 라이브러리는 세포주로부터 단리된 RNA로부터 제조되고, 적절한 항체를 발현하는 파아지미드는 바이러스 항원을 사용한 패닝(panning)에 의해 선택된다. 통상적인 하이브리도마 기술 보다 상기 접근법의 이점은 대략 104 배 더 많은 항체가 생성될 수 있고 단일 라운드로 스크리닝될 수 있고, 새로운 특이성이 적절한 항체를 발현할 기회를 추가로 증가시키는 H 및 L쇄 조합에 의해 생성된다는 것이다.
[0058] 본원의 개시내용에 유용한 항체의 생성을 교시하는 본원에 참조로 각각 인용된 다른 미국 특허는 조합 접근법을 사용한 키메라 항체의 생성을 기재하는 미국 특허 제5,565,332호; 재조합 면역글로불린 제제를 기재하는 미국 특허 제4,816,567호; 및 항체-치료학적 제제 접합체를 기재하는 미국 특허 제4,867,973호를 포함한다.
C. 본원 개시내용의 항체
[0059] 본원 개시내용에 따른 항체는 첫번째 경우에 이들의 결합 특이성에 의해 정의될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 기술을 하용하여 소정의 항체의 결합 특이성/친화성을 평가함에 의해 당업자는 상기 항체가 본원의 청구항의 범위 내에 있는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 소정의 항체가 결합하는 에피토프는 항원 분자내 위치한 3개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20)의 아미노산의 단일 연속 서열(예를 들어, 도메인 내 선형 에피토프)로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 상기 에피토프는 상기 에피토프는 항원 분자내에 위치하는 다수의 비연속 아미노산 (또는 아미노산 서열) (예를 들어, 입체구조형 에피토프)로 이루어질 수 있다.
[0060] 당업자에게 공지된 다양한 기술들을 사용하여 항체가 폴리펩타이드 또는 단백질 내에서 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지”의 여부를 결정할 수 있다. 예시적 기술로는, 예를 들어, 문헌 [Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)]에 기술된 것과 같은, 일반적인 교차-차단 검정을 포함한다. 교차-차단은 ELISA, 바이오층 간섭계, 또는 표면 플라스몬 공명과 같은 다양한 결합 검정에서 측정될 수 있다. 다른 방법은 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석(문헌참조: Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), 펩타이드 절단 분석, 단일 입자 재구성, cryoEM, 또는 단층촬영을 사용한 고-해상도 전자 현미경 기술, 결정학 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법도 사용될 수 있다 (문헌참조: Tomer (2000) ProtTomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 동정하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법으로 검출되는 수소/중수소 교환법이다. 일반적으로, 상기 수소/중수소 교환법은 관심대상 단백질을 중수소-표지화한 후, 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 상기 단백질/항체 복합체를 물로 옮기고 상기 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내에서 교환가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내에서 교환가능한 양성자보다 더 느린 속도로 중수소에서 수소로의 역교환을 겪게 된다. 그 결과, 상기 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있기 때문에, 상기 계면에 포함되지 않은 아미노산에 비해 비교적 더 높은 질량을 나타낸다. 항체의 해리 후, 표적 단백질을 프로테아제 절단 및 질량 분광법 분석을 거치게 함으로써, 상기 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 예를 들어, 문헌(Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A)을 참조한다.
[0061] “에피토프"라는 용어는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B-세포 에피토프는 단백질의 3차 폴딩(folding)에 의해 병치된 연속 아미노산 및 비연속 아미노산들 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 일반적으로 독특한 입체구조를 갖는 적어도 3개 및 그 이상, 통상 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다. 여기서, 일부 구현예에서, 에피토프는 α3β1 인테그린에 존재하는 선형 또는 입체구조형 에피토프이다.
[0062] 항원 구조 기반의 항체 프로파일링(Antigen Structure-based Antibody Profiling; ASAP)으로도 알려져 있는 변형 보조 프로파일링(Modification-Assisted Profiling; MAP)은 화학적으로 변형되거나 또는 효소에 의해 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라 동일한 항원을 겨냥하는 다수의 단일 클론 항체 (mAb)를 분류하는 방법이다 (US 2004/0101920호를 참조하며, 본원에 그 전문이 구체적으로 포함됨). 각각의 범주는 또 다른 범주로 나타낸 에피토프와 확연히 다르거나 또는 이와 부분적으로 중첩되는 독특한 에피토프를 반영할 수도 있다. 이 기법은 유전적으로 동일한 항체의 신속한 필터링을 가능하게 하기 때문에 유전적으로 구별되는 항체에 특성화의 초점을 맞출 수 있다. MAP를 하이브리도마 스크리닝에 적용하는 경우, 원하는 특성을 갖는 mAb를 생산하는 희귀 하이브리도마 클론을 용이하게 식별할 수 있다. MAP를 사용하여 본원 개시내용의 항체를 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 그룹으로 분류할 수 있다.
[0063] 본원의 개시내용은 동일한 에피토프 또는 에피토프의 일부에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이와 마찬가지로, 본원의 개시내용은 또한 표적 또는 이의 단편에 대한 결합에 대하여 본원에 기재된 임의의 특정한 예시적 항체와 경쟁하는 항체를 포함한다. 당업자라면 누구나, 당업계에 공지된 일반적인 방법을 사용하여 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 참조 항체와 결합에 대하여 경쟁하는지의 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조물과 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체가 포화 조건 하에 표적에 결합하도록 한다. 다음으로, 시험 항체가 표적 분자에 결합하는 능력을 평가한다. 시험 항체가 참조 항체와 포화 결합한 후에 표적 분자에 결합할 수 있는 경우, 상기 시험 항체는 참조 항체와 다른 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 한편, 시험 항체가 참조 항체와 포화 결합한 후에 표적 분자에 결합할 수 없는 경우, 상기 시험 항체는 본 발명의 참조 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
[0064] 2개의 항체는 각각이 경쟁적으로 다른 항체의 항원으로의 결합을 억제(차단)하는 경우 동일한 또는 중첩된 에피토프에 결합한다. 즉, 하나의 항체의 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 초과량은 경쟁적 결합 분석으로 측정시 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 다른 항체의 결합을 억제한다 (예를 들어, 문헌 [Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내 필수적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중첩 에피토프를 갖는다.
[0065] 이후에, 추가의 일반적인 실험 (예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 시험 항체에서 관찰된 결합의 결여 문제가 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여 문제의 원인인지를 확인할 수 있다. 이러한 종류 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유세포분석법 또는 당업계에서 이용하는 임의의 기타 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. EM 또는 결정학을 사용한 구조 연구는 또한 결합에 대해 경쟁하는 2개의 항체가 동일한 에피토프를 인지하는지의 여부를 입증할 수 있다.
[0066] 또 다른 양상에서, 항체는 추가의 “프레임워크” 영역을 포함하는, 이들의 가변 서열에 의해 정의될 수 있다. 추가로, 항체 서열은 임의로 하기에서 보다 상세하게 논의된 방법을 사용하여 이들 서열로부터 다양할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 (a) 가변 영역이 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인으로부터 구분될 수 있거나, (b) 핵산이 이에 의해 암호화된 잔기에 영향을 미치지 않으면서 상기 제시된 것들로부터 다양할 수 있거나, (c) 핵산이 소정의 퍼센트, 예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성에 의해 상기 제시된 것들로부터 다양할 수 있거나, (d) 핵산이 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M NaCl에 의해 제공된 바와 같은 저염 및/또는 고온 조건에 의해 예시된 바와 같은 높은 엄중도 조건하에 하이브리드화하는 능력에 의해 상기 제시된 것들로부터 다양할 수 있거나, (e) 소정의 퍼센트, 예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성에 의해 상기 제시된 것들로 부터 다양할 수 있거나, (f) 아미노산은 보존적 치환 (하기 논의된)에 의해 상기된 제시된 것들로부터 다양할 수 있다는 점에서 상기 제시된 것들로부터 다양할 수 있다.
[0067] 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드 서열을 비교하는 경우, 2개의 서열은 2개의 서열 내 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열이 하기된 바와 같이 최대 상응성을 위해 정렬되었을때 동일한 경우 “동일한” 것으로 일컬어진다. 2개의 서열 간의 비교는 전형적으로 비교 윈도우 상에 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 동정하고 비교함에 의해 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은 “비교 윈도우”는 적어도 약 20개 연속 위치, 일반적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 50개의 분절을 언급하고, 여기서, 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 연속 위치의 참조 서열과 비교될 수 있다.
[0068] 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 디폴트 파라미터를 사용한 바이오인포매틱스 소프트웨어 (bioinformatics software) (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.)의 레이저유전자 슈트 (Lasergene suite)에서 메갈린 (Megalign) 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 프로그램은 하기의 문헌에 기재된 여러 정렬 계획을 구현한다: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins--Matrices for detecting distant relationships. 문헌(참조: Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogeny pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730)에 기재되어 있다.
[0069] 대안적으로, 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌(참조: Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, by the identity alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, by the search for similarity methods of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, by computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.))의 국소 동일성 알고리즘에 의해, 또는 조사에 의해 수행될 수 있다.
[0070] 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 하나의 특정 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이들은 각각 문헌(참조: Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들어, 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용되어 본원 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 기관 (National Center for Biotechnology Information)을 통해 공개적으로 가용하다. 항체 서열의 재배열된 성질 및 각각의 유전자의 다양한 길이는 단일 항체 서열에 대한 다중 라운드의 BLAST 검색을 필요로 한다. 또한, 상이한 유전자의 수동 어셈블리는 어렵고 오류-성향이다. 서열 분석 도구 IgBLAST(world-wide-web at ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)는 생식계열 V, D 및 J 유전자에 대한 매칭, 재배열 접합부의 세부사항, Ig V 도메인 프레임워크 영역 및 상보성 결정 영역의 묘사를 동정한다. IgBLAST는 뉴클레오타이드 또는 단백질 서열을 분석할 수 있고, 배치내 서열을 가공할 수 있고 최상의 매칭 생식계열 V 유전자를 능히 상실시키는 기회를 최소화하기 위해 생식계열 유전자 데이터베이스 및 다른 서열 데이터베이스에 대해 동시 검색을 가능하게 한다.
[0071] 하나의 도해적 예에서, 누적 스코어는 뉴클레오타이드 서열에 대해 파라미터 M (매칭 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 사용하여 계산할 수 있다. 각각의 방향에서 문자 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 이의 최대 성취된 값으로부터 정량X에 의해 뒤처지는 경우; 누적 스코어가 하나 이상의 음성-스코어 잔기 정렬의 누적으로 인해 제로 이하로 떨어지는 경우; 또는 어느 서열의 말단에 도달되는 경우 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열에 대해)은 디폴트로서 11의 문자 길이, 및 10의 예측 (E) 및 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 정렬 (B), 10의 예측 (E), M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다.
[0072] 아미노산 서열에 대해, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산할 수 있다. 각각의 방향에서 문자 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 이의 최대 성취된 값으로부터 정량X에 의해 뒤처지는 경우; 누적 스코어가 하나 이상의 음성-스코어 잔기 정렬의 누적으로 인해 제로 이하로 떨어지는 경우; 또는 어느 서열의 말단에 도달되는 경우 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다.
[0073] 하나의 접근법에서, “서열 동일성의 퍼센트”는 적어도 20개 위치의 비교 윈도우 상에 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함에 의해 결정되고, 여기서, 비교 윈도우 내 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 부분은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위한 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는)과 비교하여 20 퍼센트 이하, 일반적으로 5 내지 15퍼센트 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 매칭된 위치의 수를 산출하기 위해 2개의 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하고, 상기 매칭된 위치의 수를 참조 서열에서 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누고 서열 동일성의 퍼센트를 산출하기 위해 상기 결과에 100을 곱함에 의해 계산된다.
[0074] 항체를 정의하는 또 다른 방식은 임의의 하기된 항체 및 이들의 항원 결합 단편의 “유도체”로서이다. 용어 “유도체”는 면역특이적으로 항원에 결합하지만 “모계” (또는 야생형) 분자에 상대적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환, 부가, 결실 또는 변형을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 언급한다. 상기 아미노산 치환 또는 부가는 천연적으로 존재 (즉, DNA-암호화된) 또는 비-천연적으로 존재하는 잔기를 도입할 수 있다. 용어 “유도체”는 예를 들어, 변경된 CH1, 힌지, CH2, CH3 또는 CH4 영역을 갖는 변이체를 포괄하여, 증진되거나 손상된 이펙터 또는 결합 특징을 나타내는 변이체 Fc 영역을 갖는 항체 등을 형성한다. 용어 “유도체”는 추가로 비-아미노산 변형, 예를 들어, 당화될 수 있는 아미노산(예를 들어, 변경된 만노스, 2-N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 푸코스, 글루코스, 시알산, 5-N-아세틸뉴라민산, 5-글리코뉴라민산, 등의 내용물), 아세틸화된, 페길화된, 인산화된, 아미드화된, 공지된 보호/차단 그룹에 의해 유도체화된 것, 단백질용해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질 등에 연결된 것 등을 포괄한다. 일부 구현예에서, 변경된 탄수화물 변형은 하기 중 하나 이상을 조절한다: 항체의 가용화, 항체의 아세포 수송 및 분비의 촉진, 항체 어셈블리의 촉진, 입체구조 형태의 통합성 및 항체 매개된 이펙터 기능. 특정 구현예에서, 변경된 탄수화물 변형은 탄수화물 변형이 없는 항체에 비해 항체 매개된 이펙터 기능을 증진시킨다. 변경된 항체 매개된 이펙터 기능을 유도하는 탄수화물 변형은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Shields, R. L. et al. (2002) “Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,” J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001) “Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII,” Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294). 탄수화물 내용물을 변경하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Wallick, S. C. et al. (1988) “Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen,” J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M. H. et al. (1989) “Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region,” J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E. G. et al. (1995) “The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody,” Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003) “Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering,” Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R. L. et al. (2002) “Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,” J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740)을 참조한다.
[0075] 유도체 항체 또는 항체 단편은 가공된 서열 또는 당화 상태와 함께 생성되어 동물 모델에서 비드 기반 또는 세포 기반 검정 또는 생체내 연구에 의한 측정시 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP), 항체 의존성 호중구 식세포작용 (ADNP), 또는 항체 의존성 보체 침적(ADCD) 기능에서 바람직한 활성 수준을 부여할 수 있다.
[0076] 유도체 항체 또는 항체 단편은 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신의 대사 합성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 고잊된 기수를 사용한 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 유도체는 모계 항체와 유사하거나 동일한 기능을 소유한다. 또 다른 구현예에서, 항체 유도체는 모계 항체에 비해 변경된 활성을 나타낸다. 예를 들어, 유도체 항체 (또는 이의 단편)는 이의 에피토프에 보다 강하게 결합할 수 있거나 모계 항체 보다 단백질용해에 보다 내성일 수 있다.
D. 항체 서열의 가공
[0077] 다양한 구현예에서, 당업자는 개선된 발현, 개선된 교차-반응성 또는 감소된 오프-표적 결합과 같은 다양한 이유 때문에 동정된 항체의 서열을 가공하는 것을 선택할 수 있다. 변형된 항체는 표준 분자 생물학적 기술 또는 폴리펩타이드의 화학적 합성을 통한 발현을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현을 위한 방법은 본원에 다른 곳에 기재되어 있다. 하기된 것은 항체 가공을 위한 관련 목표 기술에 대한 일반적인 논의이다.
[0078] 하이브리도마는 배양될 수 있고, 이어서 세포를 용해시키고 총 RNA를 추출할 수 있다. 무작위 육량체는 RT와 함께 사용되어 RNA의 cDNA 카피물을 생성할 수 있고 이어서 PCR은 모든 사람 가변 유전자 서열을 증폭시킬 것으로 예상되는 PCR 프라이머의 멀티플렉스 혼합물을 사용하여 수행된다. PCR 생성물은 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝될 수 있고 이어서 표준 벡터 프라이머를 사용한 자동화 DNA 서열분석에 의해 서열분석될 수 있다. 결합 및 중화 검정은 하이브리도마 상등액으로부터 수거된 항체를 사용하여 수행될 수 있고, 단백질 G 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 정제될 수 있다.
[0079] 재조합 전장 IgG 항체는 클로닝 벡터로부터의 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 IgG 플라스미드 벡터로 서브클로닝하고 293 (예를 들어, 자유형) 세포 또는 CHO 세포에 형질감염시킴에 의해 생성될 수 있고, 항체는 293 또는 CHO 세포 상등액으로부터 수거되고 정제될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포 시스템은 세균, 예를 들어, 이. 콜리(E. Coli),), 곤충 세포(S2, Sf9, Sf29, 하이 파이브(High Five)), 식물 세포(예를 들어, 사람 유사 글리칸에 대한 가공의 존재 또는 부재하에, 담배), 조류 또는 다양한 비-사람 유전자전이 맥락에서 예를 들어, 마우스, 래트, 염소 또는 소를 포함한다.
[0080] 후속 항체 정제의 목적 및 숙주 치료 둘다를 위해 항체를 암호화하는 핵산의 발현이 또한 고려된다. 항체 암호화 서열은 RNA, 예를 들어, 고유 RNA 또는 변형된 RNA일 수 있다. 변형된 RNA는 증가된 안정성 및 낮은 면역원성을 mRNA에 부여하여 치료학적으로 중요한 단백질의 발현을 촉진시키는 특정 화학적 변형을 고려한다. 예를 들어, N1-메틸-슈도우리딘 (N1mΨ)은 해독 능력 측면에서 여러 다른 뉴클레오사이드 변형 및 이들의 조합을 능가한다. 해독의 면역/eIF2α 인산화-의존성 억제를 중단시키는 것 뿐만 아니라, 혼입된 N1mΨ 뉴클레오타이드는 mRNA 상에 리보솜 중지 및 밀도를 증가시킴에 의해 해독 공정의 역학을 급격히 변경한다. 변형된 mRNA의 증가된 리보솜 부하는 동일한 mRNA 상에 리보솜 재활용 또는 드 노보 리보솜 동원을 선호함에 의한 개시를 위해 이들이 보다 허용될 수 있게 한다. 상기 변형을 사용하여 RNA로 접종 후 생체내 항체 발현을 증진시킬 수 있다. 고유한 것이거나 변형된 것이든 상관 없이 RNA는 나출된 RNA로서 또는 지질 나노입자와 같은 전달 비히클에서 전달될 수 있다.
[0081] 대안적으로, 항체를 암호화하는 DNA는 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. DNA는 프로모터가 이를 위해 디자인된 숙주 세포에서 활성인 프로모터를 포함하는 발현 카세트에 포함된다. 발현 카세트는 복제 가능한 벡터, 예를 들어, 통상적인 플라스미드 또는 소형벡터에 유리하게 포함된다. 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 렌티바이러스가 고려된다. VEE 바이러스 또는 신드비스 바이러스를 기반으로 하는 알파바이러스 레플리콘과 같은 항체 유전자를 암호화하는 레플리콘이 또한 고려된다. 상기 벡터의 전달은 근육내, 피하 또는 피내 경로를 통한 바늘에 의해 또는 생체내 발현이 요망되는 경우 경피 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
[0082] 최종 cGMP 제조 공정과 동일한 숙주 세포 및 세포 배양 공정에서 제조된 항체의 신속 가용성은 공정 개발 프로그램의 지속기간을 감소시키는 잠재력을 갖는다. 론자(Lonza)는 CHO 세포에서 소량 (최대 50g)의 항체의 신속한 제조를 위해 CDACF 배지에서 성장한 풀링된 형질감염체를 사용하는 일반 방법을 개발하였다. 실제 일과성 시스템 보다는 약간 느리지만, 이점은 보다 높은 생성물 농도 및 생산 세포주와 동일한 숙주 및 공정의 용도를 포함한다. 1회용 생물반응기에서 모델 항체를 발현하는 GS-CHO 풀의 성장 및 생산성의 예: 유가식으로 작동되는 1회용 백 생물반응기 배양(5 L 작동 용적)에서, 2g/L의 수거 항체 농도는 형질감염 9주 이내에 성취되었다.
[0083] 항체 분자는 예를 들어, mAb, 또는 재조합 수단을 통해 생성될 수 있는 단일쇄 면역글로불린의 단백질용해 절단에 의해 제조되는 단편(예를 들어, F(ab'), F(ab')을 포함한다. F(ab') 항체 유도체는 1가이지만, F(ab')2 항체 유도체는 2가이다. 하나의 구현예에서, 상기 단편은 서로 조합되거나 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 조합하여 “키메라” 결합 분자를 형성할 수 있다. 유의적으로, 상기 키메라 분자는 동일한 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환체를 함유할 수 있다.
[0084] 관련 구현예에서, 항체는 본원에 개시된 항체의 유도체, 예를 들어, 본원에 개시된 항체 (예를 들어, 키메라 또는 CDR-접목된 항체)의 서열과 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체이다. 대안적으로, 당업자는 항체 분자에 보존성 변화를 도입하는 것과 같이 변형시키고 싶을 수 있다. 상기 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 수치 (hydropathic) 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호작용 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수치 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다. 이것은 아미노산의 상대적 수치적 특징이 수득한 단백질의 2차 구조에 기여하고 이어서 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 한정하는 것으로 받아들여진다.
[0085] 이것은 또한 당업계에서 유사 아미노산의 치환이 친수성을 토대로 효과적으로 만들어질 수 있는 것으로 이해된다. 미국 특허 제4,554,101호는 본원에 참조로 인용되고 이의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같은 단백질의 최대 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 성질과 상호관련됨을 기재한다. 미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기재된 바와 같이, 하기의 친수성 값은 아미노산 잔기에 할당되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌 (+3.0), 라이신 (+3.0), 및 히스티딘 (-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트 (+3.0±1), 글루타메이트 (+3.0±1), 아스파라긴 (+0.2), 및 글루타민 (+0.2); 친수성 비이온 아미노산: 세린 (+0.3), 아스파라긴(+0.2), 글루타민 (+0.2), 및 트레오닌(-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인 (-1.0) 및 메티오닌 (-1.3); 소수성, 비방향족 아미노산: 발린 (-1.5), 류신 (-1.8), 이소류신(-1.8), 프롤린(-0.5±1), 알라닌(-0.5), 및 글라이신(0); 소수성의 방향족 아미노산: 트립토판(-3.4), 페닐알라닌(-2.5), 및 티로신(-2.3).
[0086] 아미노산이 유사한 친수성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 변화에서, 이의 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산의 치환은 바람직하고, ±1 이내에 있는 아미노산의 치환이 특히 바람직하고 ±0.5 이내에 있는 아미노산의 치환이 보다 더 특히 바람직하다.
[0087] 상기 명시된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환으 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 하전, 크기 등을 기준으로 한다. 다양한 이전의 특징을 고려하는 예시적 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있고 다음을 포함한다: 아르기닌과 라이신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신과 이소류신.
[0088] 본원의 개시내용은 또한 이소타입 변형을 고려한다. 상이한 이소타입을 갖도록 Fc 영역을 변형시킴에 의해, 상이한 관능기가 성취될 수 있다. 예를 들어, IgG1으로의 변화는 항체 의존성 세포 세포독성을 증가시킬 수 있고, 부류 A로의 전환은 조직 분포를 개선시킬 수 있고, 부류 M으로의 전환은 결합가를 개선시킬 수 있다.
[0089] 대안적으로 또는 추가로, 아미노산 변형을, C1q 결합 및/또는 Il-23p19 결합 분자의 Fc 영역의 보체 의존성 세포독성 (CDC) 기능을 변경시키는 하나 이상의 추가의 아미노산 변형과 조합하는 것이 유용할 수 있다. 특정 관심 대상의 결합 폴리펩타이드는 C1q에 결합하고 보체 의존성 세포독성을 나타내는 것일 수 있다. 임의로 CDC를 매개하는 능력을 추가로 갖는 기존의 C1q 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드는 변형되어 이들 활성 중 하나 또는 둘다가 증진되도록 할 수 있다. C1q를 변경하고/하거나 이의 보체 의존성 세포독성 기능을 변형시키는 아미노산 변형은 예를 들어, 본원에 참조로 인용되는 WO/0042072에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 인용된다.
[0090] 당업자는 예를 들어, C1q 결합 및/또는 FcγR 결합을 변형시켜 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴에 의해 변경된 이펙터 기능을 갖는 항체의 Fc 영역을 디자인할 수 있다. “이펙터 기능”은 생물학적 활성 (예를 들어, 대상체에서)을 활성화시키거나 감소시키는데 관여한다. 이펙터 기능의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등. 상기 이펙터 기능은 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 요구할 수 있고, 다양한 검정(예를 들어, Fc 결합 검정, ADCC 검정, CDC 검정 등)을 사용하여 평가될 수 있다.
[0091] 예를 들어, 당업자는 개선된 C1q 결합 및 개선된 FcγRIII 결합을 갖는(예를 들어, 개선된 ADCC 활성 및 개선된 CDC 활성 둘다를 갖는) 항체의 변이체 Fc 영역을 생성할 수 있다. 대안적으로, 이펙터 기능이 감소되거나 제거되는 것이 요구되는 경우, 변이체 Fc 영역은 감소된 CDC 활성 및/또는 감소된 ADCC 활성을 갖도록 가공될 수 있다. 다른 구현예에서, 이들 활성 중 단지 하나가 증가될 수 있고, 임의로 또한 다른 활성은 감소될 수 있다(예를 들어, 개선된 ADCC 활성을 갖지만 감소된 CDC 활성을 갖고 또한 그 반대의 경우를 갖는 Fc 영역 변이체를 생성하기 위해).
[0092] FcRn 결합. Fc 돌연변이는 또한 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와 이들의 상호작용을 변경시키고 이들의 약동학 성질을 개선시키기 위해 도입되고 가공될 수 있다. FcRn에 대해 개선된 결합을 갖는 총체적 사람 Fc 변이체가 보고되었다. FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 및 FcRn에 대한 사람 IgG1 상의 결합 부위의 고해상도 맵핑 및 FcγR에 대한 개선된 결합을 갖는 IgG1 변이체의 디자인 (문헌참조: J. Biol. Chem. 276:6591-6604). 알라닌 스캐닝 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발 및 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합 및/또는 생체내 거동을 평가하기 위한 스크리닝을 포함하는 기술을 통해 생성될 수 있는 아미노산 변형을 포함하는, 증가된 반감기를 유도할 수 있는 다수의 방법이 공지되어 있다. 컴퓨터 계산 전략에 이어서 돌연변이 유발을 또한 사용하여 돌연변이시키기 위해 아미노산 돌연변이 중 하나를 선택할 수 있다.
[0093] 본원의 개시내용은 따라서 FcRn으로의 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단백질의 상기 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서, 상기 변형은 상기 모계 폴리펩타이드와 비교하여 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 Fc 영역 내 아미노산의 넘버링은 카바트에서 EU 지수의 넘버링이다. 본원 개시내용의 추가의 양상에서, 상기 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
[0094] 추가로, 다양한 공보는 이의 반감기가 FcRn-결합 폴리펩타이드를 상기 분자로 도입함에 의해 또는 상기 분자를 이의 FcRn-결합 친화성이 보존되지만 다른 Fc 수용체에 대한 친화성이 크게 감소된 항체와 융합시키거나 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합시킴에 의해 변형된 생리학적 활성 분자를 수득하기 위한 방법을 기재한다.
[0095] 유도체화된 항체는 포유류, 특히 사람에서 모계 항체의 반감기 (예를 들어, 혈청 반감기)를 변경하기 위해 사용될 수 있다. 상기 변경은 15일 초과, 바람직하게 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과, 또는 5개월 초과의 반감기를 유도할 수 있다. 포유류, 바람직하게 사람에서 본원 개시내용의 항체 또는 이의 단편의 증가된 반감기는 포유류에서 상기 항체 또는 항체 단편의 보다 높은 혈청 역가를 유도하고 따라서 상기 항체 또는 항체 단편의 투여의 빈도를 감소시키고/시키거나 투여될 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 간의 상호작용에 관여하는 것으로서 동정된 아미노산 잔기를 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)시킴에 의해 생성될 수 있다.
[0096] 문헌(참조: Beltramello et al. (2010))은 이전에 CH2 도메인 (C-도메인에 대한 IMGT 특유의 넘버링에 따라)의 위치 1.3 및 1.2에서 류신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 것을 생성시킴에 의한 뎅기열 바이러스 감염을 증진시키는 이들의 경향으로 인한 중화 mAb의 변형을 보고하였다. 또한 “LALA” 돌연변이로서 공지된 상기 변형은 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa로의 항체 결합을 폐지시킨다. 변이체 및 비변형된 재조합 mAb는 4개의 뎅기열 바이러스 혈청형에 의한 감염을 중화시키고 증진시키는 이들의 능력에 대해 비교하였다. LALA 변이체는 비변형된 mAb와 동일한 중화 활성을 보유하였지만, 증진 활성이 완전히 없다. 상기 성질의 LALA 돌연변이는 따라서 본원에 기재된 항체와 관련하여 고려된다.
[0097] 변경된 당화. 본원의 특정 구현예는 시알산, 갈락토스 또는 푸코스가 없는 실질적으로 균질의 글리칸을 함유하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 모노클로날 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이들 둘다는 각각 중쇄 또는 경쇄 불변 영역에 부착될 수 있다. 상기 언급된 실질적으로 균질의 글리칸은 중쇄 불변 영역에 공유적으로 부착될 수 있다.
[0098] 본원 개시내용의 또 다른 구현예는 신규 Fc 당화 패턴을 갖는 mAb를 포함한다. 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 GNGN 또는 G1/G2 당형태로 나타나는 실질적으로 균질의 조성물에 존재한다. Fc 당화는 치료학적 mAb의 항-바이러스 및 항-암 성질에서 유의적인 역할을 수행한다. 상기 개시내용은 시험관내 푸코스 부재 항-HIV mAb의 증가된 항-렌티바이러스 세포 매개된 바이러스 억제를 보여주는 최근 연구와 일치한다. 코어 푸코스가 없는 균질의 글리칸을 갖는 본원 개시내용의 상기 구현예는 2배 초과의 인자로 특이적 바이러스에 대해 증가된 보호를 보여주었다. 코어 푸코스의 제거는 천연 킬러 (NK) 세포에 의해 매개되는 mAb의 ADCC 활성을 급격히 개선시키지만 다형핵 세포 (PMN)의 ADCC 활성에 대해서는 반대 효과를 갖는 것으로 나타난다.
[0099] GNGN 또는 G1/G2 당형태로 나타낸 실질적으로 균질의 조성물을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실질적으로 균질의 GNGN 당형태가 부재이고 G0, G1F, G2F, GNF, GNGNF 또는 GNGNFX 함유 당형태를 갖는 동일한 항체와 비교하여 Fc 감마 RI 및 Fc 감마 RIII에 대해 증가된 결합 친화성을 나타낸다. 본원 개시내용의 하나의 구현예에서, 항체는 1 x 10-8 M 이하의 Kd로 Fc 감마 RI로부터 해리하고 1 x 10-7 M 이하의 Kd로 Fc 감마 RIII로부터 해리한다.
[00100] Fc 영역의 당화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 부착을 언급한다. O-연결된 당화는 슈가 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스 중 하나가 하이드록시아미노산에, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 부착된 것을 언급하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다. 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 측쇄 펩타이드 서열로의 효소적 부착을 위한 인지 서열은 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이고, 여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 따라서, 폴리펩타이드 내 이들 펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적 당화 부위를 생성한다.
[00101] 당화 패턴은 예를 들어, 폴리펩타이드 내에서 발현되는 하나 이상의 당화 부위(들)을 결실시키고/시키거나 폴리펩타이드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위(들)을 부가함에 의해 변경될 수 있다. 당화 부위의 항체의 Fc 영역으로의 부가는 간편하게 이것이 하나 이상의 상기된 트리펩타이드 서열 (N-연결된 당화 부위를 위해)을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함에 의해 성취된다. 예시적인 당화 변이체는 중쇄의 잔기 Asn297의 아미노산 치환을 갖는다. 상기 변경은 또한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 본래의 폴리펩타이드의 서열 (O-연결된 당화 부위에 대해)로의 부가 또는 이에 의한 치환에 의해 수행될 수 있다. 추가로, Asn 297의 Ala로의 변화는 당화 부위 중 하나를 제거할 수 있다.
[00102] 특정 구현예에서, 항체는 GnT III가 GlcNAc를 IL-23p19 항체로 부가하도록 베타 (1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnT III)를 발현하는 세포에서 발현된다. 상기 양상으로 항체를 제조하기 위한 방법은 문헌(참조: WO/9954342, WO/03011878, 특허 공개 공보 US 2003/0003097A1, 및 Umana et al., Nature Biotechnology, 17:176-180, February 1999)에 제공된다. 세포주는 클러스터링된 규칙적 사이 공간 짧은 팔린드롬 반복체 (CRISPR)과 같은 게놈 편집 기술을 사용하여 당화와 같은 특정 해독 후 변경을 증진시키거나 감소시키거나 제거하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 기술은 재조합 모노클로날 항체를 발현시키기 위해 사용된 293 또는 CHO 세포에서 당화 효소를 암호화하는 유전자를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
[00103] 모노클로날 항체 단백질 서열 관여의 제거. 사람 B 세포로부터 수득된 항체 가변 유전자 서열을 가공하여 이들의 제조가능성 및 안전성을 증진시킬 수 있다. 잠재적 단백질 서열 관여가 하기를 함유하는 부위와 연합된 서열 모티프를 검색함에 의해 동정될 수 있다:
1) 쌍을 이루지 않은 Cys 잔기,
2) N-연결된 당화,
3) Asn 탈아미드화,
4) Asp 이성체화,
5) SYE 절단,
6) Met 산화,
7) Trp 산화,
8) N-말단 글루타메이트,
9) 인테그린 결합,
10) CD11c/CD18 결합, 또는
11) 단편화
상기 모티프는 재조합 항체를 암호화하는 cDNA에 대한 합성 유전자를 변경함에 의해 제거될 수 있다.
[00104] 치료학적 항체의 개발 분야에서 단백질 가공 노력은 명백하게 특정 서열 또는 잔기들이 용해도 차이와 연관되어 있음을 밝힌다(문헌참조: Fernandez-Escamilla et al., Nature Biotech., 22 (10), 1302-1306, 2004; Chennamsetty et al., PNAS, 106 (29), 11937-11942, 2009; Voynov et al., Biocon. Chem., 21 (2), 385-392, 2010) 문헌에서 용해도 변경 돌연변이로부터의 증거는 일부 소수성 잔기, 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산 및 세린이 유의적으로 보다 선호적으로 다른 친수성 잔기, 예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 라이신 및 아르기닌 보다 단백질 용해도에 기여함을 지적한다.
[00105] 안정성. 항체는 증진된 생물리학적 성질을 위해 가공될 수 있다. 당업자는 상승된 온도를 사용하여 항체를 언폴딩하여 평균 겉보기 용융 온도를 사용한 상대적 안정성을 결정할 수 있다. 시차 주사 열량계(DSC)는 온도의 함수로서 분자의 열용량(Cp)(도당 가온하는데 필요한 열)을 측정한다. 당업자는 항체의 열 안정성을 연구하기 위해 DSC를 사용할 수 있다. mAb에 대한 DSC 데이터는 특히 이것이 때로는 mAb 구조 내 개별 도메인의 언폴딩을 서모그램에서 최대 3개의 피크를 생성(Fab, CH2, 및 CH3 도메인의 언폴딩으로부터)하면서 구분하기 때문에 흥미롭다. 전형적으로, Fab 도메인의 언폴딩은 가장 강한 피크를 생성한다. Fc 부분의 DSC 프로필 및 상대적 안정성은 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4　아부류에 대한 특징적인 차이를 보여준다(문헌참조: Garber and Demarest, Biochem. Biophys. Res. Commun.　355, 751-757, 2007). CD 분광기로 수행되는 원형 이색성(CD)을 사용하여 평균 겉보기 용융 온도를 결정할 수도 있다. 원(Far)-UV CD 스펙트럼은 0.5 nm 증분으로 200 ~ 260 nm 범위의 항체에 대해 측정된다. 최종 스펙트럼은 20개 누적의 평균으로 결정할 수 있다. 잔기 타원도 값은 배경 공제 후에 계산할 수 있다. 항체(0.1 mg/mL)의 열 언폴딩은 25-95℃ 및 1℃/min의 가열 속도에서 235 nm에서 모니터링될수 있다. 당업자는 역학적 광산란(DLS)을 사용하여 응집 성향을 평가할 수 있다. DLS는 단백질을 포함하는 다양한 입자의 크기를 특징 분석하기 위해 사용된다. 시스템이 크기별로 분산되지 않는 경우, 입자의 평균 유효 직경이 결정될 수 있다. 상기 측정은 입자 코어의 크기, 표면 구조의 크기 및 입자 농도에 의존한다. DLS는 필수적으로 입자로 인해 산란된 광 강도에서의 변동을 측정하기 때문에, 입자의 확산 계수를 결정할 수 있다. 시판되는 DLA 장비에서 DLS 소프트웨어는 상이한 직경에서 입자 집단을 나타낸다. 안정성 연구는 DLS를 사용하여 간편하게 수행될 수 있다. 샘플의 DLS 측정은 입자의 유체역학적 반경이 증가하는지의 여부를 결정함에 의해 시간 경과에 따라 또는 온도 변화에 따라 입자가 응집되는지의 여부를 나타낼 수 있다. 입자가 응집하는 경우, 당업자는 보다 큰 반경을 갖는 보다 큰 입자 집단을 볼 수 있다. 온도에 의존하는 안정성은 동일계 온도를 제어함에 의해 분석될 수 있다. 모세관 전기영동 (CE) 기술은 항체 안정성의 특성을 결정하기 위해 입증된 방법을 포함한다. 당업자는 단백질의 pI에서의 변화를 유도할 수 있는 단백질에 대한 탈아미드화, C-말단 라이신, 시알화, 산화, 당화, 및 임의의 다른 변화로 인한 항체 단백질 하전 변이체를 구분하기 위한 iCE 접근법을 사용할 수 있다. 발현된 각각의 항체 단백질은 단백질 심플 마우리스(Protein Simple Maurice) 장비를 사용하여 모세관 컬럼(cIEF)에서 고속처리, 유리 용액 등전점 포커싱(IEF)에 의해 평가될 수 있다. 전체-컬럼 UV 흡광도 검출은 등전점 (pI)에서 분자 포커싱의 실시간 모니터링을 위해 30초 마다 수행될 수 있다. 이 접근법은 통상적인 겔 IEF의 고분해능과 컬럼 기반 분리에서 발견된 정량 및 자동화의 이점을 조합하고, 이동 단계의 필요성을 제거한다.　상기 기술은 발현된 항체에 대한 동일성, 순도 및 이종성 프로필의 재현 가능한 정량 분석을 산출한다. 결과는 흡광도 및 고유 형광성 검출 방식과 0.7μg/mL까지의 검출 감도를 사용하여 항체 상의 전하 이종성 및 분자 크기를 동정한다.
[00106] 용해도. 당업자는 항체 서열의 고유 용해도 스코어를 결정할 수 있다. 고유 용해도 스코어는 CamSol Intrinsic을 사용하여 계산될 수 있다(문헌참조: Sormanni et al., J Mol Biol 427, 478-490, 2015). scFv와 같은 각각의 항체 단편의 HCDR3에서 잔기 95 내지 102 (카바트 넘버링)에 대한 아미노산 서열은 온라인 프로그램을 통해 평가하여 용해도 스코어를 계산할 수 있다. 당어자는 또한 연구 기술을 사용하여 용해도를 결정할 수 있다. 다양한 기술이 존재하고, 동결건조된 단백질을 용액이 포화된 상태로 되고 용해도 한계에 도달할때까지 또는 적합한 분자량 컷오프를 갖는 미세농축기에서 초원심분리에 의한 농축때까지 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 가장 간단한 방법은 황산 암모늄을 사용하여 단백질 침전을 포함하는 방법을 사용하여 단백질 용해도를 측정하는 무정형 침전을 유도하는 것이다(문헌참조: Trevino et al., J Mol Biol, 366: 449-460, 2007).　 황산암모늄 침전은 상대적 용해도 값에 대해 신속하고 정확한 정보를 제공한다. 황산암모늄 침전은 잘-한정된 수성 및 고체상을 갖는 침전된 용액을 생성하고 상대적으로 소량의 단백질을 필요로 한다. 황산암모늄에 의한 무정형 침전의 유도를 사용하여 수행된 용해도 측정은 또한 상이한 pH 값에서 용이하게 수행될 수 있다. 단백질 용해도는 고도로 pH 의존성이고, pH는 용해도에 영향을 미치는 가장 중요한 고유 인자로 고려된다.
[00107] 자가반응성. 일반적으로 자가반응성 클론은 음성 선택에 의해 개체발생(ontogeny) 동안 제거되어야 한다고 사료되지만 자가반응 성질을 가진 많은 사람 자연 발생 항체가 성인 성숙한 레퍼토리에 지속된다는 것이 명백해 졌다. 조기 B 세포 개발 동안에 항체 내 HCDR3 루프는 양전하에서 흔히 풍부하고, 자가반응성 패턴을 나타내는 것으로 주지되었다(문헌참조: Wardemann et al., Science 301, 1374-1377, 2003). 당업자는 현미경에서 사람 기원 세포(현탁액 Jurkat T 세포 및 293S 배아 콩팥 세포를 사용하여)에 결합하는 수준을 평가하고 유동 세포측정 세포 표면 염색에 의해 자가반응성에 대한 소정의 항체를 시험할 수 있다. 자가반응성은 또한 조직 어레이 내 조직으로의 결합 평가를 사용하여 조사될 수 있다.
[00108] 바람직한 잔기 (“사람 유사성”). 혈액 공여자로부터 사람 B 세포의 B 세포 레퍼터리 심층 서열분석은 많은 최근 연구에서 광범위 규모로 수행된다. 사람 항체 레퍼토리의 유의적인 부분에 대한 서열 정보는 건강한 사람에서 통상적인 항체 서열 성질의 통계학적 평가를 용이하게 한다. 사람 재조합된 항체 가변 유전자 참조 데이터베이스에서 항체 서열 성질에 대한 지식과 함께, 항체 서열의 “사람 유사성” (Hl)의 위치 특이적 정도가 평가될 수 있다. HL은 치료학적 항체 또는 백신으로서 항체와 같이 임상적 용도에서 항체의 개발을 위해 유용한 것으로 나타났다. 상기 목표는 항체 약물의 유의적으로 감소된 효능을 유도하거나 중증의 건강 영향을 유도할 수 있는 잠재적 부작용 및 항-항체 면역 반응을 감소시키기 위해 항체의 사람 유사성을 증가시키는 것이다. 당업자는 총 약 4억만 서열의 3개의 건강한 사람 혈액 공여자의 조합된 항체 레퍼토리의 항체 특징을 평가할 수 있고, 항체의 초가변 영역 상에 포커싱된 신규 “상대적 사람 유사성” (rHL) 스코어를 생성하였다. rHL 스코어는 사람 (양성 스코어) 및 비-사람 서열 (음성 스코어)을 용이하게 구분할 수 있게 해준다. 항체는 사람 레퍼토리에서 통상적이지 않은 잔기를 제거하도록 가공될 수 있다.
E. 단일쇄 항체
[00109] 단일쇄 가변 단편(scFv)은 짧은 (일반적으로 세린, 글라이신) 링커와 함께 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합이다. 상기 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩타이드의 도입에도 불구하고 본래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다. 상기 변형은 일반적으로 특이성이 변경되지 않도록 한다. 이들 분자는 역사적으로 파아지 디스플레이를 촉진시키기 위해 생성되었고, 이는 단일 펩타이드로서 항원 결합 도메인을 발현시키기에 매우 간편하다. 대안적으로, scFv는 하이브리도마 또는 B 세포로부터 유래된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 단일쇄 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 부재임에 따라서 통상적인 결합 부위 (예를 들어, 단백질 A/G)는 항체를 정제하기 위해 사용된다. 이들 단편은 흔히 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문에 단백질 L을 사용하여 정제되고/고정화될 수 있다.
[00110] 가요성 링커는 일반적으로 나선- 및 회전-촉진 아미노산 잔기, 예를 들어, 알라닌, 세린 및 글라이신으로 구성된다. 그러나, 다른 잔기가 또한 기능할 수 있다. 문헌(참조: Tang et al. (1996))은 단백질 링커 라이브러리로부터 단일쇄 항체 (scFv)를 위해 개조된 링커를 신속하게 선택하는 수단으로서 파아지 디스플레이를 사용하였다. 무작위 링커 라이브러리를 제조하였고, 여기서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자는 가변 조성물의 18개 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 분절에 의해 연결되어 있다. scFv 레퍼토리(대략 5　×　106의 상이한 구성원)는 필라멘트형 파아지상에 나타나고 합텐을 사용한 친화성 선택에 적용하였다. 선택된 변이체 집단은 결합 활성에서 유의적인 증가를 나타냈지만 상당한 서열 다양성을 보유하였다. 후속적으로 1054개 개별 변이체의 스크리닝은 가용성 형태로 효율적으로 생성된 촉매 활성 scFv를 산출하였다. 서열 분석은 링커 내 보존된 프롤린, VH C 말단 후 2개의 잔기 및 선택된 테더(techer)의 단지 통상적인 특성으로 다른 위치에서 풍부한 아르기닌 및 프롤린을 밝혔다.
[00111] 본원 개시내용의 재조합 항체는 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 가능하게 하는 서열 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 서열은 J-쇄와 접합된 다량체의 형성을 가능하게 하는 IgA로부터 유래된 것들을 포함한다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 구현예에서, 쇄는 2개의 항체의 조합을 가능하게 하는, 비오틴/아비딘과 같은 제제로 변형될 수 있다.
[00112] 별도의 구현예에서, 단일쇄 항체는 비-펩타이드 링커 또는 화학적 유닛을 사용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결함에 의해 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고, 후속적으로 적당한 양상 (즉, 중쇄의 N-말단은 적당한 화학적 브릿지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착되어 있다)으로 함께 연결된다.
[00113] 가교-결합 시약을 사용하여 2개의 상이한 분자, 예를 들어, 안정화제 및 응고제의 작용기를 연결하는 분자 브릿지를 형성한다. 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 이종성 복합체가 생성될 수 있는 것으로 고려된다. 단계적 방식으로 2개의 상이한 화합물을 연결하기 위해, 헤테로-이기능성 가교 링커가 사용될 수 있고 이는 원치 않는 동종중합체 형성을 제거한다.
[00114] 예시적인 헤테로-이기능성-가교 링커는 2개의 반응성 그룹: 1차 아민 그룹과 반응하는 하나(예를 들어, N-하이드록시 숙신이미드) 및 티올 그룹과 반응하는 다른 하나(예를 들어, 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)를 함유한다. 1차 아민 반응성 그룹을 통해, 가교 링커는 하나의 단백질 (예를 들어, 선택된 항체 또는 단편)의 라이신 잔기(들)과 반응할 수 있고, 티올 반응성 그룹을 통해, 제1 단백질에 이미 연결된 가교 링커는 다른 단백질 (예를 들어, 선택 제제)의 시스테인 잔기 (유리된 설프하이드릴 그룹)과 반응한다.
[00115] 혈중에서 합당한 안정성을 갖는 가교 링커가 사용되는 것이 바람직하다. 수많은 유형의 디설파이드 결합 함유 링커는 공지되어 있고 표적화 및 치료학적/예방적 제제를 접합시키기 위해 성공적으로 사용될 수 있다. 입체 장애가 있는 디설파이드 결합을 함유하는 링커는 생체내 보다 큰 안정성을 부여하여 작용 부위에 도달하기 전에 표적화 펩타이드의 방출을 차단함을 입증할 수 있다. 이들 링커는 따라서 연결 제제의 하나의 그룹이다.
[00116] 또 다른 가교 링커는 SMPT이고, 이는 인접한 벤젠 환 및 메틸 그룹에 의해 “입체 장애”가 있는 디설파이드 결합을 함유하는 이기능성 가교 링커이다. 디설파이드 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액에 존재할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 작용에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 제공함으로써 부착된 제제의 표적 부위로 전달 전에 접합체의 탈커플링을 방지하는데 도움을 주는 것으로 사료된다.
[00117] 많은 다른 공지된 가교 결합 시약과 함께 SMPT 가교 결합 시약은 시스테인의 SH 또는 1차 아민 (예를 들어, 라이신의 엡실론 아미노 그룹)과 같은 작용기를 가교결합시키는 능력을 부여한다. 또 다른 가능한 유형의 가교 링커는 설포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트와 같은 절단가능한 디설파이드 결합을 함유하는 헤테로-이기능성 광반응성 페닐아지드를 포함한다. N-하이드록시-숙신이미딜 그룹은 1차 아미노 그룹과 상호작용하고, 페닐아지드(광용해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비-선택적으로 반응한다.
[00118] 장애가 있는 가교 링커에 추가로, 비-장애가 있는 링커는 또한 이에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 고려되지 않는 다른 유용한 가교 링커는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다. 상기 가교 링커의 용도는 당업계에서 잘 이해되고 있다. 또 다른 구현예는 가요성 링커의 용도를 포함한다.
[00119] 미국 특허 제4,680,338호는 아민-함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 접합체를 생성하기 위해, 특히 킬레이터, 약물, 효소, 검출가능한 표지 등과의 항체 접합체를 형성하기 위해 유용한 이기능성 링커를 기재한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 온화한 조건하에서 절단가능한 불안정한 결합을 함유하는 접합체를 기재한다. 상기 링커는 특히 관심 대상의 제제가 활성제의 방출을 유도하는 절단과 함께 링커에 직접 결합될 수 있다는 점에서 유용하다. 특정 용도는 유리된 아미노 또는 유리된 설프하이드릴 그룹을 단백질, 예를 들어, 항체 또는 약물에 첨가함을 포함한다.
[00120] 미국 특허 5,856,456호는 융합 단백질, 예를 들어, 단일쇄 항체들을 제조하기 위해 폴리펩타이드 성분들을 연결하는데 사용하기 위한 펩타이드 링커를 제공한다. 링커는 최대 약 50개 아미노산 길이이고, 하전된 아미노산 (바람직하게 아르기닌 또는 라이신)에 이어서 프롤린의 적어도 하나의 존재를 함유하고 보다 큰 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역진단학적 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시-함유 링커를 기재한다.
F. 다중 특이적 항체
[00121] 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 항체는 이특이적이거나 다중특이적이다. 이특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이특이적 항체는 단일 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 상기 항체는 제1 항원 결합 부위를 제2 항원에 대한 결합 부위와 조합할 수 있다. 대안적으로, 항원-특이적 아암은 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 Fc 감마 RIII (CD16)와 같은 백혈구 상에 촉발 분자에 결합하는 아암과 조합되어 세포 방어 기전을 감염된 세포에 집중시키고 국소화시킬 수 있다. 이특이적 항체는 또한 세포독성제를 감염된 세포에 국소화시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체는 항원 결합 아암 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사능 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 소유한다. 이특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab').sub.2 이특이적 항체)으로서 제조될 수 있다. WO 96/16673은 이특이적 항-ErbB2/항-Fc 감마 RIII 항체를 기재하고, 미국 특허 제5,837,234호는 이특이적 항-ErbB2/항-Fc 감마 RI 항체를 기재한다. 이특이적 항-ErbB2/Fc 알파 항체는 Wo98/02463에 나타낸다. 미국 특허 제5,821,337호는 이특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시하고 있다.
[00122] 이특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이특이적 항체의 통상적인 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현을 기반으로 하고 여기서, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다(문헌참조: Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 할당때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 이중 단지 하나가 올바른 이특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 집단의 잠재적 혼합물을 생성한다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고 생성물 수율은 낮다. 유사한 과정은 WO 93/08829 및 문헌(참조: Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991))에 기재되어 있다.
[00123] 상이한 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 영역 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열과 융합한다. 바람직하게, 상기 융합은 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 융합체 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고 적합한 숙주 세포에 동시에 형질감염된다. 이것은 작제에 사용되는 3개의 폴리펩타이드 쇄의 비균등한 비율이 목적하는 이특이적 항체의 최적의 수율을 제공하는 경우의 구현예에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정하는데 보다 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 2개 또는 모든 3개의 폴리펩타이드 쇄에 대한 암호화 서열을 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄의 발현이 보다 큰 수율을 유도하는 경우 또는 상기 비율이 목적하는 쇄 조합의 수율에 대한 유의적인 효과를 갖지 않는 경우 단일 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다.
[00124] 상기 접근법의 특정 구현예에서, 이특이적 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 구성된다. 비대칭 구조는 이특이적 분자의 하나의 절반에서만 면역글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에 원치 않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 이특이적 화합물의 분리를 용이하게하는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근접은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이특이적 항체를 생성하는 추가의 세부 사항에 대해, 예를 들어, 문헌(Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986))을 참조한다.
[00125] 미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또 다른 접근접에 따라, 한쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 퍼센트를 최대화하기 위해 가공될 수 있다. 바람직한 계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 소형 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 대형 측쇄 (들)과 동일하거나 유사한 크기의 상보적 “공동”은 대형 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함에 의해 제2 항체 분자의 계면상에 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물 보다 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
[00126] 이특이적 항체는 가교 결합되거나 “이종접합체” 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체에서 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있거나 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키고(미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 제안되었다(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089). 이종접합체 항체는 임의의 간편한 가교 결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교 결합제는 당업계에 널리 공지되어 있고, 다수의 가교 결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
[00127] 항체 단편으로부터 이특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. 문헌(참조: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985))은 온전한 항체가 단백질용해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 과정을 기재하고 있다. 이들 단편은 디티올 복합체화제인 아비산나트륨의 존재하에 감소되어 인접 티티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 이어서 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 이어서 머캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab’-티올로 재전환되고, 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이특이적 항체를 형성한다. 생성된 이특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
[00128] 이특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있는 이, 콜라이 기원의 Fab’-SH 단편의 직접적인 회수를 촉진시키는 기술이 존재한다. 문헌(참조: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))은 사람화된 이특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성을 기재한다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되고, 시험관내 지시된 화학적 커플링에 적용하여 이특이적 항체를 형성하였다. 이와같이 형성된 이특이적 항체는 ErbB2 수용체 및 정상 사람 T 세포를 과발현하는 세포에 결합할 수 있고 사람 유방 종양 표적에 대해 사람 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있다.
[00129] 재조합 세포 배양물로부터 이특이적 항체 단편을 직접적으로 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술은 또한 보고되었다(문헌참조: Merchant et al., Nat. Biotechnol .　16,　677-681　(1998)). 예를 들어, 이특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 제조되었다(문헌참조: Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992). Fos 및 Jun 단백질로부터 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab’ 부분에 결합시켰다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고 이어서 재산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 문헌(참조: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))에 기재된 “디아바디” 기술은 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 기전을 제공하였다. 상기 단편은 너무 짧아 동일한 쇄상의 2개의 도메인 간의 쌍 형성을 가능하게 하는 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성함으로써 2개의 항원-결합 부위를 형성하도록 강제된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용에 의해 이특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌(Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994))을 참조한다.
[00130] 특정 구현에에서, 이특이적 또는 다중특이적 항체는 DOCK-AND-LOCK™ (DNL™) 복합체로서 형성될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,521,056호; 제7,527,787호; 제7,534,866호; 제7,550,143호 및 제7,666,400호, 이들 각각의 실시예 부부은 본원에 참조로 인용된다). 일반적으로, 상기 기술은 cAMP-의존성 단백질 키나제 (PKA)의 조절 (R) 서브유닛의 이량체화 및 도킹 도메인 (DDD)과 임의의 다양한 AKAP 단백질로부터 유래된 앵커 도메인 (AD) 서열 간에 존재하는 특이적 및 고친화성 결합 상호작용을 이용한다(문헌참조: Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264; Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5: 959). DDD 및 AD 펩타이드는 임의의 단백질, 펩타이드 또는 다른 분자에 부착될 수 있다. DDD 서열은 자발적으로 이량체화하고 AD 서열에 결합하기 때문에, 상기 기술은 DDD 또는 AD 서열에 부착될 수 있는 임의의 선택된 분자들 간에 복합체의 형성을 가능하게 한다.
[00131] 2초과의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼특이적 항체가 제조될 수 있다(문헌참조: Tutt et al., J. Immunol. 147: 60, 1991; Xu et al., Science, 358(6359):85-90, 2017). 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체 보다 신속하게 내재화(되고/되거나 대사)될 수 있다. 본원 개시내용의 항체는 3개 이상의 결합 부위를 갖는 다가 항체 (예를 들어, 4가 항체)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다(또는 이루어진다). 상기 시나리오에서 항체는 Fc 영역 및 상기 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 본원에 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개를 포함(하거나 이들로 이루어진)하지만 바람직하게는 4개 항원 결합 부위를 포함(하거나 이들로 이루어진)한다. 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩타이드 쇄 (및 바람직하게 2개의 폴리펩타이드 쇄)를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드 쇄(들)은 2개 이상의 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 쇄(들)은 VD1-(X1).sub.n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있고, 여기서, VD1은 제1 가변 영역이고, Vd2는 제2 가변 영역이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩타이드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드 쇄(들)는 다음을 포함할 수 있다: VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본원에서 다가 항체는 바람직하게 적어도 2개 (및 바람직하게 4개)의 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어, 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드는 경쇄 가변 영역을 포함하고 임의로 추가로 CL 도메인을 포함한다.
[00132] 전하 변형은 특히 다중특이적 항체와 관련하여 유용하고, 여기서, Fab 분자 내 아미노산 치환은 결합 아암 중 하나 (또는 2개 초과의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에 그 이상)에서 VH/VL이 교환된 Fab-기반 이특이적/다중특이적 항원 결합 분자의 생성에서 일어날 수 있는 비-매칭 중쇄과 경쇄의 잘못된 쌍 형성 (벤즈-죤스-형(Bence-Jones-type) 부산물)을 감소시킨다(또한, PCT 공개 번호 WO 2015/150447, 특히 이의 실시예를 참조하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용됨).
G. 키메라 항원 수용체
[00133] 키메라 항원 수용체 분자는 재조합 융합 단백질이고, 이들의 세포질 꼬리에 존재하는 면역수용체 활성화 모티프 (ITAM)를 통해 항원에 결합하고 활성화 신호를 전달하는 이들의 능력 둘다에 의해 구분된다. 항원-결합 모이어티 (예를 들어, 단일쇄 항체 (scFv)로부터 생성된)를 사용하는 수용체 작제물은 이들이 HLA 독립적 방식으로 표적 세포 항원 상의 고유 항원에 결합한다는 점에서 “범용”이라는 추가의 이점을 제공한다.
[00134] 키메라 항원 수용체는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있지만, 바람직하게 이것은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된다. 키메라 항원 수용체의 여러 영역을 암호화하는 핵산 서열은 제조될 수 있고 분자 클로닝 (게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머 지원 연결, 효모 및 세균으로부터의 scFv 라이브러리, 부위 지시된 돌연변이 유발 등)의 표준 기술에 의해 완전한 암호화 서열에 어셈블리될 수 있다. 수득한 암호화 영역은 발현 벡터에 삽입될 수 있고 T 세포 또는 NK 세포와 같은 동종이계 또는 자가 면역 이펙터 세포의 적합한 발현 숙주를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
[00135] 본원에 기재된 CAR의 구현예는 세포내 신호전달 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 항원-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 사이에 공유된 공간으로 구성된 에피토프를 인지할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 다음을 포함한다: a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인. 임의로, CAR은 막관통 도메인과 항원 결합 도메인 사이에 위치한 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 상기 구현예의 CAR은 추가로 CAR의 발현을 세포 표면으로 지시하는 신호 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 일부 양상에서, CAR은 GM-CSF로부터의 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
[00136] 특정 구현예에서, CAR은 또한 막-결합된 사이토킨과 동시 발현되어 소량의 종량 관련 항원이 있는 경우 지속성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, CAR은 막 결합된 IL-15와 동시 발현될 수 있다.
[00137] CAR의 도메인과 상기 도메인 내 사용되는 특정 서열의 정렬에 의존하여, CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포는 표적 세포에 대해 상이한 수준의 활성을 가질 수 있다. 일부 양상에서, 상이한 CAR 서열은 면역 이펙터 세포에 도입되어 가공된 세포를 생성할 수 있고, 상기 가공된 세포는 상승된 SRC에 대해 선택되고 상기 선택된 세포는 최대 치료학적 효능을 가질 것으로 예측되는 CAR 작제물을 동정하는 활성에 대해 시험된다.
1. 항원 결합 도메인
[00138] 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역, 모노클로날 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토카인)로부터 유래한다. “상보성 결정 영역(CDR)”은 항원을 보완함에 따라서 수용체에 상기 특정 항원에 대한 특이성을 제공하는, 항원 수용체 (예를 들어, 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질에서 발견되는 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각각의 폴리펩타이드 쇄는 3개의 CDR (CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체는 전형적으로 2개의 폴리펩타이드 쇄로 구성되기 때문에, 항원과 접촉할 수 있는, 각각의 항원 수용체에 대해 6개 CDR이 있고--각각의 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 면역글로불린과 T-세포 수용체와 연관된 대부분의 서열 변화는 CDR에서 발견되기 때문에, 이들 영역은 때로는 초가변 도메인으로서 언급된다. 이들 중에서, CDR3은 이것이 VJ (중쇄 및 TCR αβ 쇄의 경우에 VDJ) 영역의 재조합에 의해 암호화되어 있기 때문에 최대 가변성을 보여준다.
[00139] CAR 핵산, 특히, scFv 서열은 사람 환자에 대한 세포 면역치료요법을 증진시키기 위한 사람 유전자인 것으로 고려된다. 특정 구현예에서, 전장 CAR cDNA 또는 암호화 영역이 제공된다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 특정 마우스, 또는 사람 또는 사람화된 모노클로날 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 또한 항원-특이적 항체의 임의의 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 보다 구체적인 구현예에서, 상기 단편은 사람 세포에서 발현을 위한 사람 코돈 용법을 위해 최적호된 서열에 의해 암호화된 항원-특이적 scFv이다. 특정 양상에서, CAR의 VH 및 VL 도메인은 Whitlow 링커와 같은 링커 서열에 의해 분리된다. 구현예에 따라 변형되거나 사용될 수 있는 CAR 작제물은 또한 본원에 참조로 인용된 국제 (PCT) 특허 공개 공보 WO/2015/123642에 제공된다.
[00140] 이전에 기재된 바와 같이, 원형 CAR은 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포질 신호전달 도메인 (예를 들어, 동시 자극 도메인 및 신호전달 도메인)에 커플링된 하나의 모노클로날 항체 (mAb)로부터 유래된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 scFv를 암호화한다. 따라서, CAR은 종양 관련 항원과 같은 관심 대상의 항원에 결합하는 항체의 LCDR1-3 서열 및 HCDR1-3 서열을 포함할 수 있다. 추가의 양상에서, 그러나, 관심 대상의 항원에 결합하는 2개 이상의 항체가 동정되고 다음을 포함하는 CAR이 작제된다: (1) 항원에 결합하는 제1 항체의 HCDR1-3 서열; 및 (2) 항원에 결합하는 제2 항체의 LCDR1-3 서열. 2개의 상이한 항원 결합 항체로부터의 HCDR 및 LCDR 서열을 포함하는 상기 CAR은 항원의 특정 형태 (예를 들어, 정상 조직에 비해 암 세포와 우선적으로 연관된 형태)에 우선적으로 결합하는 이점을 가질 수 있다.
[00141] 대안적으로, CAR은 상이한 mAb로부터 유래된 VH 및 VL 쇄를 사용하여 가공되어 CAR+ T 세포의 패널을 생성할 수 있는 것으로 나타난다. CAR의 항원 결합 도메인은 제1 항체의 LCDR1-3 서열 및 제2 항체의 HCDR1-3 서열의 임의의 조합을 함유할 수 있다.
2. 힌지 도메인
[00142] 특정 양상에서, 상기 구현예의 CAR 폴리펩타이드는 항원 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 힌지 도메인은 CAR 폴리펩타이드에 포함되어 항원 결합 도메인과 세포 표면 사이에 적당한 거리를 제공하거나 CAR-유전자 변형된 T 세포의 항원 결합 또는 이펙터 기능에 안좋은 영향을 미칠 수 있는 가능한 입체 장애를 완화시킬 수 있다. 일부 양상에서, 힌지 도메인은 Fc 수용체, 예를 들어, FcγR2a 또는 FcγR1a에 결합하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 힌지 서열은 Fc 수용체에 결합하는 사람 면역글로불린 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 또는 IgE)으로부터의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 힌지 도메인(및/또는 CAR)은 야생형 사람 IgG4 CH2 및 CH3 서열을 포함하지 않는다.
[00143] 일부 경우에, CAR 힌지 도메인은 사람 면역글로불린 (Ig) 불변 영역 또는 Ig 힌지를 포함하는 이의 일부로부터 또는 사람 CD8 α 막관통 도메인 및 CD8a-힌지 영역으로부터 유래할 수 있다. 하나의 양상에서, CAR 힌지 도메인은 항체 이소타입 IgG4의 힌지-CH2-CH3 영역을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 점 돌연변이는 항체 중쇄 CH2 도메인에 도입되어 CAR-T 세포 또는 임의의 다른 CAR-변형된 세포의 당화 및 비-특이적 Fc 감마 수용체를 감소시킬 수 있다.
[00144] 특정 양상에서, 상기 구현예의 CAR 힌지 도메인은 Fc-수용체 결합을 감소시키는, 야생형 Ig Fc 도메인에 비해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 Ig Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR 힌지 도메인은 Fc-수용체 결합을 감소시키는, 야생형 Ig Fc 도메인에 비해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4-Fc 서열에 비해 L235 및/또는 N297에 상응하는 위치에서 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 결실 또는 치환)를 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4-Fc 서열에 비해 L235E 및/또는 N297Q 돌연변이를 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 양상에서, CAR 힌지 도메인은 위치 L235에서 R, H, K, D, E, S, T, N 또는 Q와 같은 친수성이거나 “E”와 유사한 성질을 갖는 아미노산으로의 아미노산 치환을 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, CAR 힌지 도메인은 위치 N297에서 S 또는 T와 같은 “Q”와 유사한 성질을 갖는 아미노산으로의 아미노산 치환을 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다.
[00145] 특정 구체적인 양상에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인, CD8a 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인 또는 가공된 힌지 도메인과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
3. 막관통 도메인
[00146] 항원 특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호전달-도메인은 막관통 도메인에 의해 연결될 수 있다. 막관통 도메인의 일부로서 사용될 수 있는 폴리펩타이드 서열은 제한 없이 사람 CD4 막관통 도메인, 사람 CD28 막관통 도메인, 막관통 사람 CD3
Figure pct00001
도메인, 또는 시스테인 돌연변이된 사람 CD3
Figure pct00002
도메인, 또는 기타 사람 막관통 신호전달 단백질, 예를 들어, CD16 및 CD8 및 에리트로포이에틴 수용체로부터의 다른 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 예를 들어, 막관통 도메인은 미국 특허 공개 공보 제2014/0274909호에 제공된 것들 (예를 들어, CD8 및/또는 CD28 막관통 도메인) 또는 미국 특허 제8,906,682호에 제공된 것들 (예를 들어, CD8α 막관통 도메인) 중 하나와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 상기 문헌들은 본원에 참조로 인용된다. 본 발명에서 특정 용도를 갖는 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 쇄로부터 유래할 수 있다(즉, 이들의 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다). 특정 구체적인 양상에서, 막관통 도메인은 CD8a 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인과 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
4. 세포내 신호전달 도메인
[00147] 상기 구현예의 키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 키메라 항원 수용체를 발현하도록 가공된 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화에 관여한다. 용어 “이펙터 기능”은 분화된 세포의 특수 기능을 언급한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어, 사이토킨의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 나이브, 기억 또는 기억-유형 T 세포의 이펙터 기능은 항원-의존성 증식을 포함한다. 따라서, 용어 “세포내 신호전달 도메인”은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포에게 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 언급한다. 일부 양상에서, 세포내 신호전달 도메인은 고유 수용체의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유래한다. 상기 고유 수용체의 예는 T-세포 수용체의 제타 쇄 또는 이의 임의의 동족체(예를 들어, 에타, 델타, 감마, 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호 전달 분자, 예를 들어, CD3
Figure pct00003
및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, Ox40의 조합, 및 이들의 조합, 및 다른 유사한 분자 및 단편을 포함한다. 단백질을 활성화시키는 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분이 사용될 수 있다. 일반적으로, 전체 세포내 신호전달 도메인이 많은 경우에 사용되지만, 전체 세포내 폴리펩타이드를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용될 수 있는 정도로, 상기 절단된 부분은 이것이 여전히 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 온전한 쇄를 대신하여 사용될 수 있다. 용어 “세포 내 신호전달 도메인”은 따라서 표적으로의 CAR 결합 시 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 사람 CD3
Figure pct00004
세포내 도메인은 상기 구현예의 CAR에 대한 세포내 신호전달 도메인으로서 사용된다.
[00148] 특정 구현예에서, CAR 내 세포 내 수용체 신호전달 도메인은 T 세포 항원 수용체 복합체의 것들, 예를 들어, CD3의
Figure pct00005
쇄, 또한 FcγRIII 동시 자극 신호전달 도메인, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2를 단독으로 포함하거나 일련의 CD3
Figure pct00006
과 함께 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 내 도메인(세포질 도메인으로서 언급될 수 있는)은 TCR
Figure pct00007
쇄, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2Rβ/CD122, IL-2Rα/CD132, DAP10, DAP12, 및 CD40의 하나 이상의 일부 또는 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 당업자는 세포내 도메인 내 임의의 내인성 T 세포 수용체 복합체의 일부를 사용한다. 하나 또는 다중 세포질 도메인은 소위 제3 세대 CAR이 상가 또는 상승작용 효과를 위해 함께 융합된 적어도 2개 또는 3개의 신호전달 도메인을 갖기 때문에 사용될 수 있고, 예를 들어, CD28 및 4-1BB는 CAR 작제물에서 조합될 수 있다.
[00149] 일부 구현예에서, CAR은 추가의 다른 동시 자극 도메인을 포함한다. 다른 동시자극 도메인은 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. CD3에 의해 개시된 1차 신호에 추가로, 사람 CAR에 삽입된 사람 동시 자극 수용체에 의해 제공된 추가의 신호는 T 세포의 완전한 활성화를 위해 중요하고 입양 면역치료요법의 생체내 지속성 및 치료학적 성공의 개선을 도와줄 수 있다.
[00150] 특정 구체적인 양상에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 세포내 도메인, CD28 세포내 도메인, CD137 세포내 도메인 또는 4-1BB 세포내 도메인에 융합된 CD28 세포내 도메인과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
H. ADC
[00151] 항체 약물 접합체 또는 ADC는 질환을 갖는 사람들의 치료를 위한 표적화된 치료요법으로서 디자인된 새로운 부류의 고도로 강력한 생물약제학적 약물이다. ADC는 불안정한 결합과 함께 안정한 화학적 링커를 통해 생물학적 활성 세포독성/항-바이러스 페이로드 또는 약물에 연결된 항체 (전체 mAb 또는 단일쇄 가변 단편 또는 scFv와 같은 항체 단편)으로 구성된 복합체 분자이다. 항체 약물 접합체는 생물접합체 및 면역접합체의 예이다.
[00152] 모노클로날 항체의 특유의 표적화 능력을 세포독성 약물의 암-사멸 능력과 조합함에 의해, 항체-약물 접합체는 건강한 조직과 환부 조직간의 민감한 구분을 가능하게 한다. 이것은 통상적인 전신 접근법과는 대조적으로 항체-약물 접합체가 건강한 세포는 덜 심하게 영향을 받도록 환부 세포를 표적화하고 공격하는 것을 의미한다.
[00153] ADC 기반 항-종양 치료요법의 개발에서, 항암 약물(예를 들어, 세포 독소(cell toxin) 또는 세포독소(cytotoxin))는 특정 세포 마커 (예를 들어, 이상적으로 감염된 세포에서 또는 세포 상에서만 발견되는 단백질)를 특이적으로 표적화하는 항체에 커플링된다. 항체는 체내에서 이들 단백질 추적하고 자체가 암 세포의 표면에 부착한다. 항체와 표적 단백질 (항원) 간의 생화학적 반응은 종양 세포에서 신호를 촉발하고 이는 이어서 세포독소와 함께 항체를 흡수하거나 내재화한다. ADC가 내재화된 후, 세포독성 약물은 방출되고 세포를 사멸시키거나 세포 복제를 손상시킨다. 상기 표적화로 인해, 이상적으로 상기 약물은 보다 낮은 부작용을 갖고 다른 제제 보다 광범위한 치료학적 윈도우를 제공한다.
[00154] 항체와 세포독성 제제간의 안정한 연결은 ADC의 결정적인 양상이다. 링커는 디설파이드, 하이드라존 또는 펩타이드 (절단가능한) 또는 티오에테르 (절단가능하지 않은)을 포함하는 화학적 모티프를 기반으로하고 세포독성 제제의 표적 세포로의 분포 및 전달을 제어한다. 절단가능하고 절단가능하지 않은 유형의 링커는 임상전 및 임상 시험에서 안전한 것으로 입증되었다. 브렌툭시맙 베도틴은 강력하고 고도의 독성 항미세소관 제제인 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 MMAE, 합성 항신생물 제제를 사람 특이적 CD30-양성 악성 종양 세포에 전달하는 효소-민감성 절단가능한 링커를 포함한다. 이의 높은 독성 때문에, 튜불린 중합을 차단함에 의해 세포 분열을 억제하는 MMAE는 단일 제제의 화학치료학적 약물로서 사용될 수 없다. 그러나, 항-CD30 모노클로날 항체에 연결된 MMAE(cAC10, 종양 괴사 인자 또는 TNF 수용체의 세포막 단백질)의 조합은 세포외 유체에서 안정한 것으로 입증되었고, 카뎁신(cathepsin)에 의해 절단될 수 있고 치료요법을 위해 안전하다. 다른 승인된 ADC인 트라스투주맙 엠탄신은 안정한 절단가능하지 않은 링커에 의해 부착되는 메이탄신의 유도체인 미세소관-형성 억제제 메르탄신(DM-1)과 항체 트라스투주맙(Herceptin®/Genentech/Roche)의 조합체이다.
[00155] 보다 양호하고 보다 안정한 링커의 가용성은 화학적 결합의 기능을 변화시켰다. 절단 가능하거나 절단가능하지 않은 링커의 유형의 특이적 성질을 세포독성 (항-암) 약물에 부여한다. 예를 들어, 절단가능하지 않은 링커는 약물을 세포내에 유지시킨다. 결과로서, 전체 항체, 링커 및 세포독성 제제는 표적화된 암 세포에 진입하고, 여기서, 상기 항체는 아미노산 수준으로 분해된다. 수득한 복합체 - 아미노산, 링커 및 세포독성 제제 -는 지금 활성 약물이 된다. 대조적으로, 절단가능한 링커는 숙주 세포에서 효소에 의해 촉매되고 이것은 세포독성 제제를 방출한다.
[00156] 현재 개발 중에 있는 또 다른 유형의 절단가능한 링커는 여분의 분자를 세포독성 약물과 절단 부위 사이에 부가한다. 상기 링커 기술은 연구자가 절단 동력학을 변화시키는 것에 대한 걱정 없이 보다 유연성을 갖는 ADC를 생성하도록 한다. 연구자는 또한 Edman 분해를 기준으로 펩타이드 절단의 신규 방법으로서, 펩타이드 내 아미노산을 서열분석하는 방법을 개발하고 있다. ADC의 개발 중에 있는 미래의 방향은 또한 안정성 및 치료학적 지수 및 α 발산 면역접합체 및 항체-접합된 나노입자를 추가로 개선시키기 위한 부위-특이적 접합(TDC)의 개발을 포함한다.
I. BiTE
[00157] 이특이적 T-세포 인게이져(engager) (BiTE)는 항암 약물로서 사용하기 위해 연구된 부류의 인공 이특이적 모노클로날 항체이다. 이들은 숙주의 면역계, 보다 구체적으로 T 세포의 세포독성 활성이 감염된 세포에 대항하도록 지시한다. BiTE는 제조원(Micromet AG)의 등록된 상표이다.
[00158] BiTE는 약 55 킬로돌턴의 단일 펩타이드 쇄 상에 상이한 항체의 2개의 단일쇄 가변 단편 (scFv) 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고 다른 하나는 특이적 분자를 통해 감염된 세포에 결합한다.
[00159] 다른 이특이적 항체와 같이 및 통상의 모노클로날 항체와 같지 않게 BiTE는 T 세포와 표적 세포 간에 연결을 형성한다. 이것은 T 세포가 MHC I 또는 동시 자극 분자와는 별개로 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)과 같은 단백질을 생성함에 의해 감염된 세포 상에 세포독성 활성을 발휘하도록 한다. 이들 단백질은 감염된 세포로 진입하고 세포의 아폽토시스를 개시한다. 상기 작용은 감염된 세포에 대한 T 세포 공격 동안에 관찰된 생리학적 과정을 모방한다.
J. 인트러바디
[00160] 특정 구현예에서, 상기 항체는 세포의 내부에서 작용하기 위해 적합한 재조합 항체이고-상기 항체는 “인트러바디”로서 공지되어 있다. 이들 항체는 다양한 기전에 의해, 예를 들어, 세포내 단백질 트래픽킹을 변경함에 의해 표적 기능에 방해하여 효소 기능을 방해하고 단백질-단백질 또는 단백질-DNA 상호작용을 차단할 수 있다. 많은 방식으로, 이들의 구조는 상기 논의된 단일쇄 및 단일 도메인 항체의 구조를 모방하거나 병행한다. 실제로, 단일-전사체/단일쇄는 표적 세포에서 세포내 발현을 가능하게하고 또한 단백질이 세포막을 거쳐 보다 용이하게 통과하게 하는 중요한 특성이다. 그러나, 추가의 특성이 요구된다.
[00161] 인트러바디 치료제의 수행에 영향을 미치는 2개의 주요 문제는 세포/조직 표적화를 포함하는 전달 및 안정성이다. 전달과 관련하여, 다양한 접근법이 사용되었고, 예를 들어, 조직-지시된 전달, 세포 유형 특이적 프로모터의 사용, 바이러스-기반 전달 및 세포-투과성/막 전위 펩타이드의 사용이 있다. 하나의 전달 수단은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 출원 공개 공보 제2018/0177727호에 교시된 바와 같이 지질 기반 나노입자 또는 엑소좀의 용도를 포함한다. 안정성과 관련하여, 상기 접근법은 일반적으로 억제 기법 (brute force)에 의해 스크리닝하는 것이고, 이는 파아지 디스플레이를 포함하는 방법을 포함하고, 서열 성숙화 또는 컨센서스 서열의 개발, 또는 삽입 안정화 서열 (예를 들어, Fc 영역, 샤페론(chaperone) 단백질 서열, 류신 지퍼) 및 디설파이드 대체/변형과 같은 보다 지시된 변형을 포함할 수 있다.
[00162] 인트러바디가 요구할 수 있는 임의의 추가의 특성은 세포내 표적화를 위한 신호이다. 표적 인트러바디 (또는 기타 단백질)를 아세포 영역, 예를 들어, 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 ER에 표적화할 수 있는 벡터가 디자인되었고 통상적으로 가용하다(제조원: (Invitrogen Corp.)).
K. 정제
[00163] 본원 개시내용의 항체는 정제될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “정제된”은 다른 성분들로부터 단리될 수 있는 조성물을 언급하는 것으로 의도되고, 여기서, 상기 단백질은 이의 천연적으로 수득할 수 있는 상태에 비해 어느 정도 정제된다. 따라서 정제된 단백질은 또한 이것이 천연적으로 존재할 수 있는 환경으로부터 유리된 단백질을 언급한다. 용어 “실질적으로 정제된”이 사용되는 경우, 상기 지정은 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 성분을 형성하는 조성물을 언급하고, 예를 들어, 주요 성분은 상기 조성물 중에 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상을 구성한다.
[00164] 단백질 정제 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이들 기술은 하나의 수준에서 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획에 대한 세포 환경의 조악한 분획화를 포함한다. 폴리펩타이드를 다른 단백질로부터 분리한 후, 관심 대상의 폴리펩타이드는 추가로 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 정제하여 부분적 또는 완전한 정제 (또는 균일하게 정제)를 성취할 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석적 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점 포커싱이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법은 황산암모늄, PEG, 항체 등을 사용한 침전 또는 가열 변성에 이어서 원심분리; 겔 여과, 역상, 하이드록시애퍼타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 상기 및 기타 기술의 조합을 포함한다.
[00165] 본원 개시내용의 항체를 정제하는데 있어서, 원핵 또는 진핵 세포 시스템에서 폴리펩타이드를 발현하고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 태그된 부분에 결합하는 친화성 컬럼을 사용한 기타 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변화될 수 있거나 특정 단계가 생략되고 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조를 위한 적합한 방법을 유도하는 것으로 사료된다.
[00166] 통상적으로, 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제 (즉, 단백질 A)를 사용하여 분획화된다. 대안적으로, 항원은 적당한 항체를 동시에 정제하고 선택하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 흔히 컬럼, 필터 또는 비드와 같은 지지체에 결합된 선택 제제를 사용한다. 상기 항체는 지지체에 결합되고, 오염물은 제거되고 (예를 들어, 세척 제거), 항체는 조건 (염, 가열 등)을 적용함에 의해 방출된다.
[00167] 단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량하기 위한 다양한 방법은 본원 개시내용의 측면에서 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들어, 활성 분획물의 비활성을 결정하는 단계 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획물 내 폴리펩타이드의 양을 평가하는 단계를 포함한다. 분획물의 순도를 평가하기 위한 또 다른 방법은 분획물의 비활성을 계산하여 이를 초기 추출물의 비활성과 비교함에 따라서 순도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 유닛은 물론 정제를 수행하기 위해 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는지의 여부에 의존한다.
[00168] 폴리펩타이드의 이동은 때로는 유의적으로 SDS/PAGE의 상이한 조건과 함께 다양할 수 있다. 따라서, 상이한 전기영동 조건 하에, 정제되거나 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량이 다양할 수 있는 것으로 인지된다.
L. 항체 접합체
[00169] 본원 개시내용의 항체는 적어도 하나의 제제에 연결되어 항체 접합체를 형성할 수 있다. 진단학적 또는 치료학적 제제로서 항체 분자의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 하나의 목적하는 분자 또는 모이어티에 연결하거나 공유 결합시키거나 이와 복합체를 형성시키는 것이 통상적이다. 상기 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 이펙터 분자는 목적하는 활성, 예를 들어, 세포독성 활성을 갖는 분자를 포함한다. 항체에 부착된 이펙터 분자의 비제한적인 예는 독소, 항-종양 제제, 치료학적 효소, 방사능핵종, 항바이러스 제제, 킬레이팅제, 사이토킨, 성장 인자, 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 대조적으로, 리포터 분자는 검정을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성표지, 합텐, 형광성 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 광친화성 분자, 착색된 입자 또는 리간드, 예를 들어, 비오틴을 포함한다.
[00170] 항체 접합체는 일반적으로 진단제로서 사용하기 위해 바람직하다. 항체 진단제는 일반적으로 2개의 부류, 다양한 면역검정에서와 같이 시험관내 진단제에 사용하기 위한 것들 및 일반적으로 “항체-지시된 이미지화”로서 공지된, 생체내 진단 프로토콜에 사용하기 위한 것들로 나누어진다. 많은 적당한 이미지화제는 당업계에 공지되어 있고, 이는 이들의 항체로의 부착을 위한 방법에서와 같다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호, 및 제4,472,509호). 사용되는 이미지화 모이어티는 상자성 이온, 방사능 동위원소, 형광색소, NMR-검출가능한 물질 및 X-선 이미지화제일 수 있다.
[00171] 상자성 이온의 경우에, 예시적인 이온, 예를 들어, 크로뮴(III), 망간(II), 철 (III), 철(II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴(neodymium) (III), 사마륨(III), 이터븀 (III), 가돌리늄(III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로시움 (III), 홀미움 (III) 및/또는 에르븀(III)을 언급하고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. X선 이미지화와 같은 다른 문맥에서 유용한 이온은 란탄(lanthanum) (III), 골드 (III), 납 (II), 및 특히 비스무트 (III)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00172] 치료학적 및/또는 진단학적 적용을 위한 방사능 동위원소의 경우에, 아스타틴211, 14탄소, 51크로뮴, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90이 있다. 125I는 흔히 특정 구현예에 사용하기 위해 바람직하고, 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 또한 흔히 이들의 낮은 에너지 및 오랜 범위의 검출을 위한 적합성으로 인해 바람직하다. 본원 개시내용의 방사능 표지된 모노클로날 항체는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 차아염소산나트륨과 같은 화학적 산화제, 또는 효소적 산화제, 예를 들어, 락토퍼옥시다제와 접촉시켜 요오드화될 수 있다. 본원 개시내용에 따른 모노클로날 항체는 리간드 교환 공정에 의해, 예를 들어, 퍼테크네이트를 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세퍼덱스 컬럼 상에 킬레이팅하고 상기 항체를 상기 컬럼에 적용함에 의해 테크네튬99m으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 직접적인 표지화 기술은 예를 들어, 퍼테크네이트, 환원제, 예를 들어, SNCl2, 완충 용액, 예를 들어, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액 및 항체를 항온처리힘에 의해 사용될 수 있다. 금속 이온으로서 존재하는 방사능 동위원소를 항체에 결합시키기 위해 사용되는 중재 작용기는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라세트산 (EDTA)이다.
[00173] 접합체로서 사용하기 위해 고려되는 형광성 표지 중에는 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루, Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그래핀, ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드가 포함된다.
[00174] 본원 개시내용에 고려되는 추가 유형의 항체는 주로 시험관내에서 사용하기 위한 것들이고, 상기 항체는 발색성 기질과 접촉 시 착색된 생성물을 생성하는 2차 결합 리간드 및/또는 효소 (효소 태그)에 연결되어 있다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼린 포스파타제, (서양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 상기 표지의 사용은 당업자에게 널리 공지되어 있고 예를 들어, 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기재되어 있다.
[00175] 분자의 항체로의 부위 특이적 부착의 또 다른 공지된 방법은 합텐 기반 친화성 표지와 항체의 반응을 포함한다. 필수적으로, 합텐 기반 친화성 표지는 항원 결합 부위에서 아미노산과 반응함으로써 상기 부위를 파괴하고 특이적 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이것은 이것이 항체 접합체에 의한 항원 결합을 상실시키기 때문에 유리하지 않을 수 있다.
[00176] 아지도 그룹을 함유하는 분자를 또한 사용하여 저강도 자외선광에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 특히, 퓨린 뉴클레오타이드의 2- 및 8-아지도 유사체는 부위 지시된 광프로브로서 사용하여 조악한 세포 추출물 내 뉴클레오타이드 결합 단백질을 동정하였다. 2- 및 8-아지도 뉴클레오타이드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오타이드 결합 도메인을 맵핑하기 위해 사용되었고 항체 결합 제제로서 사용될 수 있다.
[00177] 여러 방법은 항체의 이의 접합체 모이어티로의 부착 또는 접합을 위해 당업계에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은 예를 들어, 유기 킬레이팅제, 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 항체에 부착된 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 착물의 용도를 포함한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 모노클로날 항체는 또한 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 커플링제의 존재하에 효소와 반응될 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 이들 커플링제의 존재하에 제조되거나 이소티오시아네이트와 반응시킴에 의해 제조된다. 미국 특허 제4,938,948호에서, 유방 종양의 이미지화는 모노클로날 항체를 사용하여 성취되고, 검출가능한 이미지화 모이어티는 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 항체에 결합된다.
[00178] 다른 구현예에서, 항체 조합 부위를 변경시키지 않는 반응 조건을 사용하여 면역글로불린의 Fc 영역에서 설프하이드릴 그룹을 선택적으로 도입함에 의한 면역글로불린의 유도체화가 고려된다. 상기 방법에 따라 생성된 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 민감성을 나타내는 것으로 기재되어 있다(본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,196,066호). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역에서 탄수화물 잔기로 접합되는 이펙터 또는 리포터 분자의 부위-특이적 부착은 또한 문헌에 기재되어 있다. 상기 방법은 현재 임상 평가중에 있는 진단학적으로 및 치료학적으로 유망한 항체를 생성하는 것으로 보고되었다.
II. 치료 방법
[00179] 본원 구현예의 특정 양상은 이종삼량체 I형 콜라겐의 존재와 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어, 췌장 도관 선암종 (PDAC)을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 동종삼량체 I형 콜라겐의 기능은 동종삼량체 I형 콜라겐과 α3β1 인테그린 간에 상호작용을 붕괴시키는 임의의 적합한 약물에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 상기 물질은 항-α3β1 인테그린 항체, α3 인테그린 siRNA, Col1 siRNA 등을 포함할 수 있다.
[00180] “치료” 및 “치료하는”은 질환 또는 건강 관련 병태의 치료학적 이득을 수득할 목적으로 치료학적 제제의 대상체로의 투여 또는 적용 또는 대상체에 대한 과정 또는 방식의 수행을 언급한다. 예를 들어, 치료는 단독으로 또는 화학치료요법, 면역치료요법 또는 방사선치료요법, 수술 수행 또는 이의 임의의 조합과 함께 α3β1 인테그린을 표적화하는 약제학적 유효량의 항체의 투여를 포함할 수 있다.
[00181] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “대상체”는 본원의 방법이 수행되는 개체 또는 환자를 언급한다. 일반적으로, 대상체는 사람이지만 당업자가 인지하는 바와 같이 대상체는 동물일 수 있다. 따라서, 설치류 (마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그를 포함하는), 고양이, 개, 토끼, 농장 동물 (소, 말, 염소, 양, 돼지 등을 포함하는), 및 영장류 (몽키, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라)와 같은 포유류를 포함하는 다른 동물은 대상체의 정의 내에 포함된다.
[00182] 본원 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 이득" 또는 "치료학적 유효량"은 상기 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 웰빙을 촉진시키거나 증진시키는 어떠한 것을 언급한다. 이것은 암 또는 섬유종 질환과 같은 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도에서의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암의 치료는 예를 들어, 종양 크기에서의 감소, 종양 공격성에서의 감소, 암 성장율에서의 감소 또는 전이의 예방을 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 갖는 대상체의 생존을 지연시키는 것을 언급할 수 있다.
[00183] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “암”은 고형 종양, 전이암 또는 비-전이암을 기재하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 콩팥, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 기원할 수 있다.
[00184] 상기 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형을 가질 수 있지만 이들에 제한되지 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프구상피 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종폴립 내 선암종; 가족성 폴립증 콜리 선암종; 고형 암종; 악성 카시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 색소형성 암종; 호산성 암종; 호산소성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종 (skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종; 귀지 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막상피 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭선암종; 점소양 선암종; 시그넷 환 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파게트 질환(paget's disease, mammary); 소포 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 상피화생; 악성 흉선종thymoma; 악성 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor, malignant); 악성 포막종(thecoma, malignant); 악성 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor, malignant); 악성 암성모세포종; 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor, malignant); 악성 지질 세포 종양; 악성 부신결정종(paraganglioma, malignant); 악성 유선외 부신결정종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종(pheochromocytoma); 사구체혈관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 거대 색소성모반에서 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색모반(blue nevus, malignant); 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종(myxosarcoma); 지방육종; 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양; 신아세포종(nephroblastoma); 간아세포종(hepatoblastoma); 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너 종양 (brenner tumor, malignant); 악성 엽상 종양(phyllodes tumor, malignant); 활액 육종; 악성 중피종(mesothelioma, malignant); 미분화배세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(teratoma, malignant); 악성 난소갑상선종(struma ovarii, malignant); 융모암종; 악성 중신종(mesonephroma, malignant); 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종(hemangiopericytoma, malignant); 림프관 육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 골의 거대 세포 종양; 어윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양(odontogenic tumor, malignant); 에나멜아세포 치원서육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 에나멜아세포종(ameloblastoma, malignant); 사기질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종(ependymoma); 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절아세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종(meningioma, malignant); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(neurilemmoma, malignant); 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨(hodgkin's); 파라육아종(paragranuloma); 소림프구 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 대형 세포 확산 악성 림프종(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종(mycosis fungoides); 다른 특정 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병)(erythroleukemia); 림프구육종 세포 백혈병; 골수백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수 육종; 및 만모발 세포 백혈병. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 또한 비-암성 질환 (예를 들어, 진균류 감염, 세균 감염, 바이러스 감염, 신경변성 질환 및/또는 유전학적 장애)을 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로 인지된다.
B. 제형 및 투여
[00185] 본원의 개시내용은 α3β1 인테그린에 선택적으로 결합하는 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 예방학적 또는 치료학적 유효량의 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 구현예에서, 용어 “약제학적으로 허용되는”은 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 동물에서 및 보다 특히 사람에 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 약전에서 열거된 것을 의미한다. 용어 “담체”는 치료제가 이와 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 언급한다. 상기 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물, 및 석유, 동물 기원, 식물 기원 또는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 무기물 오일, 참깨유 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우 특정 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 겔라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
[00186] 조성물은 필요에 따라 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지연 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구용 제형은 약젝학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 제제의 예는 문헌(참조: “Remington's Pharmaceutical Sciences”)에 기재되어 있다. 상기 조성물은 적합한 담체의 양과 함께 예방학적 또는 치료학적 유효량의 항체 또는 이의 단편을 바람직하게 정제된 형태로 함유하여 환자에게 적절한 투여를 위해 형태를 제공한다. 제형은 경구, 정맥내, 동맥내, 협측, 비강, 분무, 기관지 흡입, 직장내, 질, 국소 또는 기계적 환기에 의해 전달될 수 있는 투여 방식에 적합해야 한다.
[00187] 항체의 수동적 전달은 일반적으로 정맥내 주사 또는 근육내 주사를 포함한다. 항체 형태는 모노클로날 항체 (Mab)일 수 있다. 상기 면역력은 일반적으로 단기간 동안만 지속되며 특히 비-사람 기원의 감마 글로불린으로 인한 과민 반응 및 혈청병의 잠재적 위험이 있다. 항체는 주사에 적합한, 즉 멸균되고 주사기에 적합한 담체에서 제형화된다.
[00188] 일반적으로, 본원 개시내용의 조성물의 성분들은 별도로 공급되거나, 예를 들어, 활성제의 양을 표시한 앰푸울 또는 사쉐와 같은 밀폐로 밀봉된 컨테이너에서 무수 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 단위 투여 형태에서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야만 하는 경우, 멸균 약제 등급수 또는 식염수를 함유하는 병으로 분배할 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰푸울은 투여 전 성분들이 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
[00189] 본원 개시내용의 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약제적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온으로 형성된 염, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함한다.
C. 키트 및 진단제
[00190] 구현예의 다양한 양상에서, 치료학적 제제 및/또는 다른 치료학적 및 전달 제제를 함유하는 키트가 고려된다. 본원의 구현예는 상기 구현예의 치료요법을 제조하고/하거나 투여하기 위한 키트를 고려한다. 키트는 본원의 구현예의 임의의 약제학적 조성물을 함유하는 하나 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 상기 키트는 예를 들어, 적어도 하나의 α3β1 인테그린 항체, 및 구현예의 성분들을 제조하고, 제형화하고/하거나 투여하거나 본 발명의 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 또한 키트의 성분과 반응하지 않는 컨테이너, 예를 들어, 에펜도르프 튜브, 검정 플레이트, 주사기, 병 또는 튜브인 적합한 컨테이너를 포함할 수 있다. 컨테이너는 플라스틱 또는 유리와 같은 안정화 가능한 물질로부터 제조될 수 있다.
[00191] 키트는 본원에 제시된 방법의 절차적 단계를 명시하는 지침서 시트를 추가로 포함할 수 있고, 실질적으로 본원에 기재된 바와 동일한 과정에 따르거나 당업자에게 공지되어 있다. 지침서 정보는 컴퓨터를 사용하여 수행되는 경우, 약제학적 유효량의 치료학적 제제를 전달하는 실재 또는 가상의 절차를 디스플레이시키는 기계 판독가능한 지침서를 함유하는 컴퓨터 판독가능한 매체에 있을 수 있다.
D. ADCC
[00192] 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)은 면역 이펙터 세포에 의한 항체 코팅된 표적 세포의 용해를 유도하는 면역 기전이다. 표적 세포는 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 이의 단편이 일반적으로 Fc 영역에 대한 N-말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. “증가된/감소된 항체 의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 갖는 항체”란 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정된 바와 같이 증가된/감소된 ADCC를 갖는 항체를 의미한다.
[00193] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “증가된/감소된 ADCC”는 상기 정의된 ADCC의 기전에 의해 표적 세포 주변의 매질에서 항체의 소정의 농도에서 소정의 시점에 용해되는 표적 세포의 수에서 증가/감소로서 및/또는 ADCC의 기전에 의해 소정의 시점에서 소정의 수의 표적 세포의 용해를 성취하는데 요구되는 표적 세포 주변의 매질에서 항체의 농도에서 감소/증가로서 정의된다. ADCC에서 증가/감소는 동일한 표준 생성, 정제, 제형 및 저장 방법 (당업자에게 공지된)을 사용하지만 가공되지 않은 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 변경된 당화 패턴을 갖도록 (예를 들어, 글리코실트랜스퍼라제, GnTIII, 또는 다른 글루코실트랜스퍼라제를 발현하도록) 가공된 숙주 세포에 의해 생성된 항체에 의해 매개된 ADCC에서의 증가는 동일한 유형의 비-가공된 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 상대적이다.
E. CDC
[00194] 보체-의존성 세포독성 (CDC)은 보체계의 기능이다. 이것은 면역계의 항체 또는 세포의 관여 없이 이들의 막을 손상시킴에 의해 병원체를 사멸시키는 면역계 내 공정이다. 3개의 주요 공정이 있다. 모든 3개는 하나 이상의 막 공격 복합체(MAC)를 치명적인 콜로이드-삼투압 팽균, 즉, CDC를 유발하는 병원체에 삽입한다. 이것은 이에 의한 항체 또는 항체 단편이 세포독성 효과를 갖는 기전 중 하나이다.
F. 조합 치료요법
[00195] 특정 구현예에서, 본원 구현예의 조성물 및 방법은 화학치료요법 또는 면역치료요법 (예를 들어, 관문 차단 치료요법)과 같은 제2 또는 추가의 치료요법과 함께, 활성을 억제하기 위해 α3β1 인테그린에 대한 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 상기 치료요법은 상승된 동종삼량체 I형 콜라겐과 연관된 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 질환은 암 또는 섬유종 질환일 수 있다.
[00196] 조합 치료요법을 포함하는 방법 및 조성물은 치료학적 또는 보호 효과를 증진시키고/시키거나 또 다른 항-암 또는 항-과증식성 치료요법의 치료학적 효과를 증가시킨다. 치료학적 및 예방학적 방법 및 조성물은 암 세포의 사멸 및/또는 세포 과증식의 억제와 같은 목적하는 효과를 성취하기 위해 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 상기 공정은 세포를 항체 또는 항체 단편 및 제2 치료요법 둘다와 접촉시킴을 포함할 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 제제 (즉, 항체 또는 항체 단편 또는 항암제)를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)과 접촉될 수 있거나, 조직, 종양 및/또는 세포를 2개 이상의 특유의 조성물 또는 제형과 접촉시킴에 의해 접촉될 수 있고, 여기서, 하나의 조성물은 1) 항체 또는 항체 단편, 2) 항암제 또는 3) 항체 또는 항체 단편 및 항암제 둘다를 제공한다. 또한, 상기 조합 치료요법은 화학치료요법, 방사선치료요법, 수술 치료요법 또는 면역치료요법과 연계하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
[00197] 세포에 적용되는 경우 용어 “접촉된” 및 “노출된”은 본원에서 치료학적 작제물 및 화학치료학적 또는 방사선치료학적 제제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포에 바로 인접하게 위치되는 공정을 기재하기 위해 사용된다. 세포 사멸을 성취하기 위해, 예를 들어, 제제 둘다는 세포를 사멸시키거나 이의 분열을 방지하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에게 전달된다.
[00198] 치료학적 항체는 항암 치료에 상대적으로 전에, 동안에 후에 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 내지 수분 내지 수일 내지 수주 범위의 간격일 수 있다. 항체 또는 항체 단편이 항암제와는 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 당업자는 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 충분한 시기가 만료되지 않도록 보장하여 2개의 화합물은 여전히 환자에 대한 유리한 조합 효과를 발휘할 수 있다. 상기 경우에, 당업자는 환자에게 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 서로 약 12 내지 24 또는 72 h 내에, 보다 특히 서로 약 6-12 h 내에 항체 치료요법 및 항암 치료요법이 제공될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 각각의 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 경우, 치료를 위한 시기를 유의적으로 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
[00199] 특정 구현예에서, 치료 과정은 1 내지 90일 이상 (이러한 상기 범위는 개입일을 포함한다) 지속한다. 하나의 제제는 1일 내지 90일의 임의의 날짜 (이러한 상기 범위는 개입일을 포함한다) 또는 이의 임의의 조합으로 제공될 수 있고, 또 다른 제제는 1일 내지 90일의 임의의 날짜 (이러한 상기 범위는 개입일을 포함한다) 또는 이의 임의의 조합으로 제공될 수 있다. 하루 (24시간 기간) 내에, 환자에게는 제제(들)의 하나 또는 다중 투여가 제공될 수 있다. 더욱이, 치료 과정 후, 어떠한 항암 치료제가 투여되지 않는 기간이 있음이 고려된다. 상기 기간은 1-7일, 및/또는 1-5주, 및/또는 1-12개월 이상 (상기 범위는 개입일을 포함한다)지속할 수 있고, 이는 환자의 병태, 예를 들어, 이들의 예후, 힘, 건강 등에 의존한다. 치료 주기는 필요한 만큼 반복되는 것으로 예측된다.
[00200] 다양한 조합이 사용될 수 있다. 예시적인 하기의 항체에 대해, 치료요법은 “A”이고, 항암 치료요법은 “B”이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[00201] 본 구현예의 임의의 화합물 또는 치료요법의 환자로의 투여는 경우에 따라 제제의 독성을 고려하여 상기 화합물의 투여를 위한 일반 프로토콜에 따른다. 따라서, 일부 구현예에서, 조합 치료요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
2. 화학치료요법
[00202] 광범위한 화학치료학적 제제는 본 발명의 구현예에 따라 사용될 수 있다. 용어 “화학치료요법”은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 언급한다. “화학치료학적 제제”는 암의 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이들 제제 또는 약물은 이들이 세포 주기에 영향을 미칠지 및 어느 단계에서 영향을 미칠지와 같은 세포 내 이들의 활성 방식에 의해 분류된다. 대안적으로, 제제는 DNA를 직접 가교결합시키거나 DNA에 삽입되거나 핵산 합성에 영향을 미침에 의해 염색체 및 유사분열 일탈을 유도하는 이의 능력을 기준으로 특징 분석될 수 있다.
[00203] 화학치료학적 제제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드,트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 , KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우트레오빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감몰 및 칼리케아미신 오메가I1); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스퍼라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모프폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스톨락톤; 항-부신제(anti-adrenal), 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 이오니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2”-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (“Ara-C”); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 플라티늄 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 임의의 유도체를 포함한다.
3. 방사선 치료요법
[00204] DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자들은 통상적으로 γ-선, X-선, 및/또는 방사성 동위원소의 종양 세포의 직접적인 전달로서 공지된 것을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려되고, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호), 및 UV-조사가 있다. 모든 이들 인자들은 DNA에 대해, DNA의 전구체에 대해, DNA의 복제 및 복구에 대해 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대해 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 높다. X-선에 대한 용량 범위는 장기간 (3 내지 4주) 동안 하루 50 내지 200 뢴트겐로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 매우 다양하고 동위원소의 반감기, 방출된 방사선 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
4. 면역치료요법
[00205] 당업자는 면역치료요법이 구현예의 방법과 조합하거나 연계하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료와 관련하여, 면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)은 그러한 예이다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 단독의 항체는 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나 이것은 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 동원할 수 있다. 상기 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사선핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있고, 단지 표적화제로서 작용한다. 대안적으로, 이펙터는 직접적으로 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 함유하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
[00206] 면역치료요법의 하나의 양상에서, 종양 세포는 표적화에 순응할 수 있는, 즉 대다수의 다른 세포 상에 존재하지 않는 일부 마커를 함유해야만 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 임의의 이들 마커는 본 발명의 구현예와 관련하여 표적화를 위해 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155를 포함한다. 면역치료요법의 대안적 양상은 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자는 또한 다음을 포함한다: 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모킨, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
[00207] 연구중에 있거나 사용중에 있는 면역치료요법의 예는 면역 보조제, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물 (미국 특허 제5,801,005호 및 제5,739,169호); 사이토킨 치료요법, 예를 들어, 인터페론 , 및 , IL-1, GM-CSF, 및 TNF; 유전자 치료요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53 (미국 특허 제5,830,880호 및 제5,846,945호); 및 모노클로날 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2, 및 항-p185 (미국 특허 제5,824,311호)이다. 하나 이상의 항암 치료요법은 본원에 기재된 항체 치료요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
[00208] 일부 구현예에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제를 포함할 수 있다(즉, 관문 차단 치료요법일 수 있다). 면역 관문은 신호 (예를 들어, 동시 자극 분자)를 상향시키거나 신호를 하향시킨다. 면역 관문 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 관문은 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (또한 CD276로서 공지된), B 및 T 림프구 약화인자 (BTLA), 세포독성 T-림프구-연합 단백질 4 (CTLA-4, 또한 CD152로서 공지된), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 서프레서(VISTA)를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4에 표적화한다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용의 면역치료요법은 항-PD-1 관문 차단 치료요법 (예를 들어, 항-PD-1 항체)을 포함한다.
[00209] 면역 관문 억제제는 소분자, 재조합 형태의 리간드 또는 수용체와 같은 약물일 수 있거나 특히 항체, 예를 들어, 사람 항체일 수 있다(문헌참조: 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 국제 특허 공개 공보 WO2015016718). 면역 관문 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있고 특히 키메라화된, 사람화된 또는 사람 형태의 항체가 사용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 대안적 및/또는 균등한 명칭이 본원 개시내용에 언급된 특정 항체에 대해 사용될 수 있다. 상기 대안적 및/또는 균등한 명칭은 본원 개시내용과 관련하여 상호교환될 수 있다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안적 및 균등한 명칭인 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로 공지되어 있다.
[00210] 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1의 이의 리간드 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PDL1의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2의 이의 결합 파트너로의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양상에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 예시적인 항체는 모두 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제8,735,553호, 제8,354,509호, 및 제8,008,449호에 기재되어 있다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제는 모두 본원에 참조로 인용된 미국 특허 공개 공보 US20140294898, US2014022021, 및 US20110008369에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
[00211] 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역어드헤신　(예를 들어,　불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역어드헤신)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO®로서 공지된 니볼루맙은 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA®, 및 SCH-900475로서 또한 공지된 펨브롤리주맙은 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로서 또한 공지된 Ct-011은 WO2009/101611에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로서 또한 공지된 AMP-224는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
[00212] 본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 CD152로서 공지된 세포독성 T-림프구-연합된 단백질 4 (CTLA-4)이다. 사람 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 승인 번호 L15006을 갖는다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되고 항원-제공 세포의 표면 상에 CD80 또는 CD86에 결합하는 경우 “오프” 스위치로서 작용한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면상에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전송하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CTLA4는 T-세포 동시 자극 단백질 CD28과 유사하고 2개의 분자는 각각 항원-제공 세포 상에서 B7-1 및 B7-2으로 불리우는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 억제 신호를 T 세포에 전송하는 반면 CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절 T 세포에서 발견되고 이들의 기능을 위해 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인, CTLA-4의 증가된 발현을 유도한다.
[00213] 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
[00214] 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적합한 항-사람-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당업계에서 인지된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,119,129호, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504 (또한 트레멜리무맙으로서 공지된 CP675,206; 이전에 티실리무맙), 미국 특허 제6,207,156호; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (항체 CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304)에 기재된 항-CTLA-4 항체가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 상기 언급된 공개 공보 각각의 교시는 참조로 인용된다. CTLA-4와 결합하는 것에 대해 임의의 당업계에 인지된 항체와 경쟁하는 항체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 사람화된 CTLA-4 항체는 국제 특허 출원 WO2001014424, WO2000037504, 및 미국 특허 제8,017,114호에 기재되어 있고; 이 모두는 본원에 참조로 인용된다.
[00215] 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(또한 10D1, MDX- 010, MDX- 101, 및 Yervoy®로서 공지된) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다(문헌참조: 예를 들어, WO 01/14424). 다른 구현예에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 CTLA-4상의 동일한 항체에 결합하는 것에 경쟁하고/하거나 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 동일성)을 갖는다.
[00216] CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자는 모두 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5844905호, 제5885796호 및 국제 특허 출원 WO1995001994 및 WO1998042752에 기재된 바와 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체, 및 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제8329867호에 기재된 바와 같은 면역어드헤신을 포함한다.
[00217] 일부 구현예에서, 면역 치료요법은 입양 면역치료요법일 수 이쏘, 이는 생체외 자가 항원-특이적 T 세포의 전달을 포함한다. 입양 면역치료요법을 위해 사용되는 세포는 항원-특이적 T 세포의 확장 또는 유전학적 가공을 통한 T 세포의 재지시에 의해 생성될 수 있다. 종양 특이적 T 세포의 단리 및 전달은 흑색종을 치료하는데 성공적인 것으로 나타났다. T 세포에서 신규 특이성은 유전자전이 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (cAR)의 유전학적 전달을 통해 성공적으로 생성되었다(CAR) (문헌참조: Jena, Dotti et al. 2010). CAR은 단일 융합 분자 내 하나 이상의 신호전달 도메인과 연합된 표적화 모이어티로 이루어진 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 연결된 모노클로날 항체의 경쇄 및 가변 단편을 포함하는, 단일쇄 항체 (scFv)의 항원-결합 도메인으로 이루어진다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기반으로 하는 결합 모이어티는 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 제1 세대 CAR을 위한 신호전달 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마쇄의 세포질 영역으로부터 유래한다. CAR은 성공적으로 T 세포가 림프종 및 고체 종양을 포함하는 다양한 악성종양으로부터의 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원에 대해 재지시되도록 하였다.
[00218] 하나의 구현예에서, 본 출원은 암 치료를 위한 조합 치료요법을 제공하고, 여기서, 상기 조합 치료요법은 입양 T 세포 치료요법 및 관문 억제제를 포함한다. 하나의 양상에서, 적응성 T 세포 치료요법은 자가 및/또는 동종이계 T 세포를 포함한다. 또 다른 양상에서, 자가 및/또는 동종이계 T-세포는 종양 항원에 대해 표적화된다.
5. 수술
[00219] 암을 갖는 사람의 대략 60%는 동일한 유형의 수술을 진행하고 이는 예방적, 진단학적 또는 단계 결정, 치유적 및 일시적인 수술을 포함한다. 치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고, 절제되고/되거나 파괴된 절제술을 포함하고 본 발명의 구현예의 치료, 화학치료요법, 방사성 치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법 및/또는 대안적 치료요법과 같은 다른 치료요법과 연계하여 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 언급한다. 종양 절제술에 추가로, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경적으로 제어된 수술(모흐 수술(Mohs’ surgery))을 포함한다.
[00220] 암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제 시, 공동이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접적인 주사 또는 추가의 항암 치료요법을 사용한 영역의 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 용량일 수 있다.
6. 다른 제제
[00221] 다른 제제는 치료의 치료학적 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이들 추가의 제제는 세포 표면 수용체 및 GAP 접속부의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포증식 억제 및 분화제, 세포 접착의 억제제, 과증식성 세포의 아폽토시스 유도제에 대한 민감성을 증가시키는 제제 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. GAP 접속부의 수를 상승시킴에 의한 세포내 신호전달의 증가는 이웃하는 과증식성 세포 집단에 대한 항-과증식성 효과를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포증식억제 또는 분화제는 치료의 항-과증식성 효능을 개선시키기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있다. 세포 접착의 억제제는 본 구현예의 효능을 개선시키는 것으로 고려된다. 세포 접착 억제제의 예는 병소 접착 키나제 (FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 과증식성 세포의 아폽토시스에 대한 민감성을 증가시키는 다른 제제, 예를 들어, 항체 c225는 치료 효능을 개선하기 위해 본 구현예의 특정 양상과 조합하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
III. 실시예
[00222] 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 후속 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 수행에서 잘 기능하는 것으로 본원 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내는 것으로 당업자는 인지해야 한다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 암의 치료를 위한 알파3베타1 (α3β1) 인테그린 표적화
재료 및 방법
[00223] 조직학 및 면역조직화학. 파라핀 고정된 샘플에 대해, 마우스 조직은 10% 중성 완충 포르말린에 고정화시키고, 파라핀에 매립하고 5 μm의 두께로 절개하였다. 절개부는 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 위해 가공하였다. 마손 트리크롬 염색(Masson’s trichrome stain)(MTS)은 고모리(Gomori)의 트리크롬 염색 키트(38016SS2, Leica Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 콜라겐에 대한 피크로시리우스 레드 염색(Picrosirius red staining)은 0.1% 피크로시리우스 레드(Direct Red80; Sigma)를 사용하여 수행하였고, 비게르트 (Weigert)의 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 이미지는 Leica DM 1000 LED 현미경 및 Las V4.4 소프트웨어 (Leica)를 갖는 MC120 HD 현미경 카메로로 캡쳐하였다. 포르말린-고정화된, 파라핀 매립된 절개부는 이전에 보고된 바와 같이 면역조직화학 염색을 위해 가공하였다(문헌참조: Chen et al., 2018). 절개부는 1차 항체: αSMA (M0851, Dako, 1:100), CK19 (ab52625, Abcam, 1:200), 콜라겐 I (ab34710, Abcam, 1:200), 인테그린 α3 (ab131055, Abcam, 1:300), Sox9 (ab185966, Abcam, 1:200)에 이어서 비오티닐화된 2차 항체 및 스트렙타비딘 HRP(Biocare Medical)로 항온처리하였다. 모든 면역표지화 실험을 위해, 절개부는 DAB에 의해 전개하였고 헤마톡실린으로 대비염색하였다.
[00224] 단일 세포 RNA 서열분석 (sc-RNA-seq). KPPC 마우스의 새로운 종양 조직을 멸균 란셋으로 잘게 썰고, 콜라게나제 IV(17104019, Gibco, 4mg/mL)/디스파제 II(17105041, Gibco, 4mg/mL)/DMEM으로 37℃에서 0.5시간 동안 분해시키고, 70 μm 세포 스트레이너로 여과하고 PBS/2%FBS에 단일 세포 현탁액으로 재현탁시켰다. 단일 세포 현탁액을 생/사(Live/Dead) 생존능 염료 eFluor 780(65-0865-14, eBioscience)으로 염색하고, 40μm 메쉬를 통해 여과한 다음 연구소(South Campus Flow Cytometry Core Laboratory of MDACC)에서 Aria II 분류기(BD Biosciences)로 생세포를 분류하였다. KPPF (FSF-KrasG12D/+;Trp53frt/frt;Pdx1-Flp) 마우스의 종양에 대해, 총 2마리의 마우스에서 4064개 세포를 분석하였다. KPPC (LSL-KrasG12D;Trp53loxP/loxP;Pdx1-Cre) 마우스의 종양에 대해, 총 2마리의 마우스에서 3989개 세포를 분석하였다. 이들 샘플에 대한 Sc-RNA-seq는 MDACC의 서열분석 및 마이크로어레이 시설에서 크로뮴 제어기(Chromium Controller) 및 단일 세포 3' 시약 키트 v2(10X Genomics)를 사용하여 수행하였다. GEM-RT 클린업 및 cDNA 증폭, 라이브러리 작제 및 Illumina-즉석 서열분석 라이브러리 생성 후 단일 세포 겔 비드-인-에멀젼(GEM) 생성 및 바코딩을 제조업자의 지침에 따라 제조하였다. 고민감성 dsDNA Qubit 키트를 사용하여 cDNA 및 라이브러리 농도를 평가하였다. HS DNA 생분석기는 cDNA의 정량을 위해 사용하였다. DNA 1000 생분석기는 라이브러리의 정량을 위해 사용하였다. “C-루페(loupe)” 파일은 제조업자의 지침에 따라 세포 레인저 소프트웨어 파이프라인을 사용함에 의해 생성하였다. 비분획화된 종양으로부터의 세포는 10X 게놈학의 크로뮴 제어기 및 단일 세포 3’ 시약 키트 v2를 사용하여 캡슐화하였다. 캡쳐 및 용해 후, cDNA를 합성하고 증폭시켜 Illumina 서열분석 라이브러리를 작제하였다. 샘플 당 약 1,000개 세포로부터의 라이브러리는 llumina Nextseq 500으로 서열분석하였다. 수행 포맷은 판독1에 대해 26 주기, 8주기 지수 1, 및 판독 2에 대해 124주기이었다. sc-RNA-seq 데이터는 연구소 (MD Anderson Cancer Center)에서 서열분석 및 마이크로어레이 설비에 의해 가공하였다. 추가의 데이터 분석은 바이오컨덕터 프로젝트의 R 팩키지 소프트웨어를 사용함에 의해 수행하였다.
[00225] 웨스턴 블롯팅. 추출된 I형 콜라겐(Col1) 용액 및 가용화된 매트리겔 (성장-인자-감소된, 354230, Corning)은 6x 감소 SDS Laemmli 샘플 완충액(Bio-world)에서 제조하였고, 95 ℃에서 20분동안 변성시켰다. 샘플은 이어서 소형-PROTEAN TGX 프레캐스트 폴리아크릴아미드 겔 (Bio-Rad)을 사용한 전기영동에 적용하고, 트랜스-블롯 터보 전달 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막상으로 트랜스블롯팅하였다. Col1은 염소 항-col1 항체(1310, SouthernBiotech, 1:1000) 및 HRP-접합된 당나귀 항-염소 2차 항체로 블롯팅하였다. IV형 콜라겐 (Col4)은 토끼 항-Col4 항체(ab52235, Abcam, 1:300) 및 HRP-접합된 2차 염소 항-토끼 항체로 블롯팅하였다.
[00226] 생체내 FAK 억제제 (FAKi) 치료. 21일령의 KPPC 마우스는 추가의 처리를 위해 대조군 그룹 또는 FAKi (VS-4718 또는 PND-1186, Selleckchem) 처리 그룹으로 무작위화하였다. FAKi 처리 그룹의 마우스는 이전에 기재된 바와 같이 하루에 2회 경구위관영양에 의해 멸균수 중에 0.5% 카복시메틸 셀룰로스(Sigma-Aldrich) 및 0.1% Tween-80 (Sigma-Aldrich)에 재현탁된 50mg/kg FAKi로 처리하였다(문헌참조: Jiang et al., 2016). 대조군 그룹의 마우스에는 동일한 투여 전략을 사용하여 비히클을 투여하였다. 마우스로부터 췌장 조직을 수거하였고, 7일의 처리 후 동일한 28일령에서 조사하였다.
결과
[00227] 종양은 암세포, 및 섬유아세포 및 I형 콜라겐과 같은 종양 미세환경(TME)의 성분 둘다를 함유한다. 이것은 여전히 종양 미세환경이 종양 성장의 촉진인자로서 작용하거나 종양 성장을 제한하는지 명확하지 않다. TME의 일부 양상은 종양 진행 등의 양성 조절인자로서 및 종양 성장의 음성 조절인자로서 작용할 수 있는 가능성이 있다. 근섬유아세포에 의해 생성된 I형 콜라겐 (콜라겐 I)은 암 세포 및 기타 기질 세포 (유사하게 디스코딘 도메인 수용체 II-DDR2) 및 면역 세포 상의 잠재적 수용체와의 결합을 통해 암/종양을 억제하는 2개의 콜라겐 I의 α1 쇄 (α1(I) 콜라겐) 및 1개의 α2 쇄(α2(I) 콜라겐)를 포함하는 이종삼량체이다. 대조적으로, 암 세포는 암/종양을 촉진하고 암 세포에서 특이적 수용체에 결합하여 생존 촉진 신호, 항-아폽토시스 신호, 증식 신호 및 발암 촉진 신호를 유도하는 3개의 α1(I) 콜라겐 쇄를 갖는 콜라겐 I 동종삼량체를 생성한다. 동종삼량체 (암 세포에 의해 제조된)는 종양 미세환경에서 근섬유아세포에 의해 제조된 이종삼량체와 비교하는 경우 메탈로프로테이나제 및 기타 프로테이나제에 내성이다. 동종삼량체는 이종삼량체와 비교하여 특유의 에피토프의 노출과 함께 상이한 구조를 나타내고, 동종삼량체에 대해 생성된 항체는 기타 기전 중에서 암 세포 상의 발암 촉진 수용체를 통한 신호전달을 붕괴시킴에 의해 종양 억제 성질을 갖는다.
[00228] 인테그린이 암세포 상의 콜라겐 수용체로서 널리 연구되었다는 점을 감안할 때(문헌참조: Egeblad et al., 2010; Leitinger, 2011; Yeh et al., 2012), col1 동종삼량체로 유도된 생존 촉진 신호 전달에서 인테그린의 직접적인 기능적 관여가 조사되었다. Col1 동종삼량체는 DDR1, FAK, AKT 및 ERK의 인산화를 유도한다. 그러나, siRNA에 의한 DDR1의 녹다운은 col1 동종삼량체에 의한 FAK, AKT, 및 ERK의 활성화를 억제하지 않았고(도 1a,1b), 이는 추정컨대 DDR1 녹다운 후 인테그린(특히 α3β1)의 보상적 상향조절로 인한 것이다. 반면, siRNA에 의한 인테그린 β1의 억제는 FAK, AKT, 및 ERK의 col1 동종삼량체 유도된 활성화를 감소시켰고, 암 세포 상의 생존 촉진 기능 col1 동종삼량체를 매개하는데 인테그린 β1의 중추적 역할을 시사한다(도 1c,2a).
[00229] 인테그린 α1, α2, 및 α3 서브유닛에 대한 siRNA를 사용하는 추가의 조사는 α1 인테그린 서브유닛이 아닌 인테그린 α3에 대한 siRNA (도 1c, 2b)가 FAK, AKT, 및 ERK의 col1 동종삼량체-유도된 인산화를 유의적으로 억제하고, 인테그린 α2의 siRNA는 col1 동종삼량체 유도된 인산화를 적당히 억제함을 밝혔다. 마우스 (도 2c) 및 사람 (도 2d, CCLE 데이터베이스) 췌장암 세포주로부터의 RNA-seq 데이터는 인테그린 α3가 췌장암 세포에 의해 발현되는 가장 풍부한 인테그린 α-서브유닛임을 확인시켜 준다. β1 인테그린 서브유닛 파트너와 함께 콜라겐 결합 인테그린 서브유닛으로서도 공지된 인테그린 α10 및 α11은 췌장 암 세포에서 최소 발현을 밝혔다(도 2c, 2d). 암 세포에서 인테그린 α3의 광범위 발현 패턴은 추가로 KPPC 종양 (LSL-Kras G12D ;Trp53 loxP/loxP ;Pdx1-Cre)에서 단일 세포 RNA 서열 분석(도 2e 및 3a-3x) 및 마우스 및 사람 종양에서 IHC 염색 (도 2f 및 4a-4f)에 의해 확인되었다.
[00230] 이어서, 췌장암과 연관된 초기 병변의 발병기전에서 col1 동종삼량체로 유도된 FAK 인산화의 역할을 시험하기 위해, FAK와 PYK2를 표적화하는 이중 억제제인 VS-4718(PND-1186)을 사용하여 col1 동종삼량체 유도된 생존률 촉진 신호 전달에 대한 효과를 평가하였다. VS-4718은 FAK 및 PYK2 (인테그린- 및 DDR1-매개된 신호 전달 경로의 다운스트림 매개체)를 억제하였고, FAK, AKT, 및 ERK의 col1 동종삼량체 유도된 활성화를 폐지시켰다(도 2g). KPPC 마우스의 VS-4718 처리는 또한 조기 PanIN 진행을 억제하였고(도 2h), 이는 이전의 관찰과 일치하였다(문헌참조: Jiang et al., 2016). 종합해 보면, 이들 결과는 col1 동종삼량체가 콜라겐-결합 인테그린, α3β1을 통해 FAK, AKT 및 ERK의 지속적인 활성화를 유도함에 의해 PDAC 세포 증식을 촉진시킴을 확립한다.
실시예 2 - 사람 PDAC 환자에서 α3 인테그린 발현의 동정 및 생존률 결과와의 상관관계
방법
[00231] 모든 사람 PDAC 절개부는 각각의 환자로부터의 3개의 대표적인 1mm 코어(종양 기원의 2개 및 양성 췌장 조직으로부터의 하나)를 함유하는, 조직 마이크로어레이 슬라이드 상에 고정화시켰다. 인테그린 α3의 염색 강도는 0 내지 3의 스케일(3-매우 높은, 2-높은, 1-낮은, 및 0-음성)로 가시적 염색 스코어링에 의해 정량하였다. 모든 샘플에 대한 인테그린 α3의 IHC 스코어는 양성 종양 세포의 염색 및 퍼센트의 강도의 조합 스코어에 의해 등급화된다. 염색 스코어에 대한 수학식이 사용되었다: S = p1 x 1 + p2 x 2 + p3 x 3, 여기서, p1, p2 및 p3은 각각 1, 2 및 3의 염색 카테고리를 나타내는 종양 세포의 분획을 나타낸다. 인테그린 α3 (ITGA3) 발현의 평균 스코어는 전체 코호트에 대해 1.87이었다. 인테그린 α3의 발현은 컷오프로서 평균 조합 스코어 1.87을 사용하여 ITGA3-높은 (n = 68) 및 ITGA3-낮은 (n = 62)로서 카테고리화하였다.
결과
[00232] 조직 마이크로어레이 슬라이드 상에 고정화된 사람 PDAC 절개부 (n = 141)는 전체 코호트에 대해 1.87의 평균 스코어를 보여주는(도 5b) 인테그린 α3의 IHC 스코어(도 5a)에 대해 조사하였다. 사람 PDAC 절개부의 대부분(97%)은 매우 높거나 높은 인테그린 α3 발현을 밝혔다(도 5c). 높은 인테그린 α3 발현 수준은 환자의 불량한 전체 생존률 (도 5d)과 진행 부재 생존률 (도 5e)과 유의적으로 상관관계가 있다. ITGA3-높은 환자는 도 5d 및 5e의 하한선에 나타내고, ITGA3-낮은 환자는 도 5d 및 5e의 상한선에 나타낸다.
실시예 3 - PDAC 세포의 시험관내 Itga3 siRNA 처리
방법
[00233] KPPC (LSL-KrasG12D;Trp53loxP/loxP;Pdx1-Cre) 및 KPPC;Col1pdxKO (KPPC;Col1a1loxP/loxP) 세포는 96-웰 플레이트에 씨딩하였고(1% FBS를 갖는 100μL에서 웰당 3 × 103 세포)이어서 48시간 동안 지적된 siRNA로 처리하였다. 6- 또는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에서 세포 생존능/수는 세포 계수 키트-8 (CCK8; Abcam ab228554)을 사용하여 결정하였고, 제조업자의 치침에 따라 마이크로플레이트 판독기 상에서 OD 450nm에서 조사하였다.
결과
[00234] siRNA에 의한 α3 인테그린의 억제는 KPPC 암 세포의 증식을 감소시켰지만 KPCC;Col1pdxKO (도 6)을 감소시키지 않았고, 이는 Col1 동종삼량체와 암 세포 상의 α3 인테그린의 결합 방해는 이들의 증식에 영향을 미침을 지적한다.
실시예 4 - 시험관내 Itga3 siRNA 처리
방법
[00235] 엑소좀은 사람 중간엽 줄기 세포로부터 제조하였다. 109 수의 총 엑소좀(NanosightTM 분석에 의해 측정된) 및 1 μg의 siRNA (스크램블된 siRNA-대조군 또는 siRNA-Itga3)는 400 μL의 전기천공 완충액(1.15mM 인산칼륨 pH 7.2, 25mM 염화칼륨, 21% Optiprep)에서 혼합하였다. 이들 엑소좀은 유전자 펄서 Xcell 전기천공 시스템 (BioRad, 165-2081)을 사용한 단일 4mm 큐벳을 사용하여 전기천공하였다. 마우스에는 100μL의 용적 중에서 주사 당 108 엑소좀을 주사하였다. 상기 용량은 48시간 마다 마우스에서 주사 당 대략 0.15 내지 0.20 μg의 엑소좀 단백질 부하량을 나타낸다.
결과
[00236] siRNA 표적화 인테그린 α3을 함유하는 엑소좀을 사용한 처리는 스크램블된 siRNA 대조군을 함유하는 엑소좀과 비교하여 KPPC 마우스 생존률을 연장시켰다(도 7).
실시예 5 - 췌장암 세포에서 I형 콜라겐 (Col1)의 결실은 면역 세포의 축적을 증가시키고 관문 차단에 대한 민감성을 증가시킨다
방법
마우스
[00237] FSF-Kras G12D/+ (5), Pdx1-Flp (5), Trp53 frt/+ (6), LSL-Kras G12D/+ (7), Trp53 loxP/+ (8), Pdx1-Cre (7), αSMA-Cre (9), 및 Fsp1-Cre (10, 11) 마우스 변종은 이전에 보고되었다. Col1a1 loxP/loxP 마우스 변종(loxP-플랭킹된 엑손 2-5)는 기관(Genetically Engineered Mouse Facility at MD Anderson Cancer Center (MDACC))에서 유럽 마우스 돌연변이 세포 기탁기관 ((European Mouse Mutant Cell Repository(EuMMCR))로부터 수득된 Col1a1tm1a(EUCOMM)Wtsi 배아 줄기 세포를 사용하여 확립하였다.
[00238] Rosa26-CAG-loxP-frt-Stop-frt-FireflyLuc-EGFP-loxP-RenillaLuc-td토마토 (R26Dual로서 언급된) 마우스 변종은 신규 R26Dual 이중-형광성 리포터 대립형질을 함유하고, 이는 Pdx1-Flp 전이유전자의 제어하에 EGFP 발현 또는 αSMA-Cre 및 Fsp1-Cre 전이유전자의 제어하에 tdTomato 발현을 가능하게 한다(12). FSF-Kras G12D/+ ;Pdx1-Flp (Kf로서 언급된) 또는 FSF- Kras G12D/+ ;Trp53 frt/frt ;Pdx1-Flp (KPPF로서 언급된) 마우스에 대한 유전자형 및 질환 표현형의 특징 분석은 문헌(Saur and colleagues (5))에 의해 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. Col1a2 돌연변이를 함유하는 골형성 불완전 뮤린 (OIM) 변종은 연구소(Jackson Laboratory)로부터 구입하였다(001815; B6C3Fe a/a-Col1a2oim/J). 본원 발명자들은 KF 및 KPPF 마우스를 αSMA-Cre, Pdx1-Cre, Fsp1-Cre, Col1a1 loxP/loxP , 또는 R26 Dual 마우스 변종과 교배하여 KF;αSMA-Cre;Col1a1loxP/loxP (KF;Col1smaKO로서 언급됨), KF;Pdx1-Cre;Col1a1loxP/loxP (KF;Col1pdxKO로서 언급됨), KPPF;αSMA-Cre;Col1a1loxP/loxP (KPPF;Col1smaKO로서 언급됨), KPPF;Fsp1-Cre;Col1a1loxP/loxP (KPPF;Col1fspKO로서 언급됨) 마우스를 생성하였다. 이들 마우스는 자발적 PDAC와 관련하여 αSMA+ 근섬유아세포 (MF) 또는 Fsp1+ 세포 집단에서 Col1a1을 결실시킨다. KF;Col1pdxKO 마우스 및 KF;Col1smaKO 마우스는 동일한 대조군 마우스(KF;Cre-negative;Col1a1 loxP/loxP )를 공유하였고, 상기 3개의 변종 (KF 대조군 그룹, αSMA-발현 근섬유아세포에서 Col1 결실을 갖는 KF;Col1smaKO 그룹, 및 Pdx1-계통 암 세포에서 Col1 결실을 갖는 KF;Col1pdxKO 그룹) 간에 질환 진행의 직접적인 비교를 가능하게 한다. 본원 발명자들은 또한 LSL-Kras G12D ;Pdx1-Cre (KC로서 언급됨), LSL-Kras G12D /+;Trp53R 172H/+ ;Pdx1-Cre;Col1a1 loxP/loxP (KPC로서 언급된), 또는 LSL-Kras G12D ;Trp53 loxP/loxP ;Pdx1-Cre (KPPC로 언급됨) 마우스를 Col1a1 loxP/loxP 마우스 변종과 교배하여 KC;Col1a1loxP/loxP (KC;Col1pdxKO로서 언급됨), KPC;Col1a1loxP/loxP (KPC;Col1pdxKO로서 언급됨), 및 KPPC;Col1a1loxP/loxP (KPPC;Col1pdxKO로서 언급됨)를 생성하였다. KF;Col1pdxKO, KC;Col1pdxKO, 및 KPPC;Col1pdxKO 마우스는 PDAC 세포에서 Col1a1을 결실시킨다. 상기 언급된 목적하는 유전자형을 가진 실험 마우스를 무작위화 또는 블라인딩없이 모니터링하고 분석하였다. PDAC에 대한 암컷 및 수컷 마우스 둘다는 실험 마우스를 위해 사용하였다. 항-PD1(BE0273, 29F.1A12, BioXCell) 항체를 각각 100㎍/마우스의 용량으로 3일 간격으로 총 3회(35일령에 개시) 주사로 복막내 투여하였다. 모든 마우스는 MDACC 동물 시설에서 표준 거주 조건하에 거주시키고, 모든 동물 절차들을 검토하고 MDACC 연구 동물 보호 및 사용 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.
총 mRNA 서열분석
[00239] 종양 조직의 mRNA 서열분석(RNA-seq)을 위해, 새로 해부된 종양 샘플을 액체 질소가 포함된 RNase가 없는 튜브에서 동결하고 -80℃에서 보존하였다. Fisherbrand Bead Mill 24 균질화기(Fisher Scientific)상에서 세라믹 비드가 있는 비드 튜브를 사용하여 샘플을 균질화하였다. 세포주의 RNA-seq를 위해, KPPC 및/또는 KPPC;Col1pdxKO 암세포를 비히클(0.5M 글리세롤이 포함된 PBS), 동종삼량체 Col1(50μg/mL) 또는 이종삼량체 Col1( 50μg/mL)을 갖는 6웰 플레이트 (Corning)에서 배양하였다. 세포는 48시간 배양 후 수거하였다. 조직 및 세포 둘다를 위해, 총 RNA는 직접적인-zol RNA 키트(Zymo Research)를 사용하여 추출하였다.
[00240] 품질 관리 분석은 생물분석기 2100 (Agilent) 상에서 RNA 6000 나노 키트를 사용하여 수행하였다. 총 mRNA 서열분석은 MDACC 서열분석 및 ncRNA 프로그램 코어 설비에 의해 NextSeq 500 (Illumina) 상에서 Illumina TrueSeq 가닥 mRNAseq 라이브러리 및 고출력 서열분석 PE 75x75 nt를 사용하여 수행하였다. Illumina 플랫폼으로부터 미가공 서열분석 데이터는 Fastq 파일로 전환시키고, 참조 (STAR) 알고리즘으로의 스플라이싱된 전사체 할당을 사용하여 참조 게놈 mm10으로 할당하였다. 이어서 HTSeq-수를 사용하여 각각의 유전자에 대한 미가공 수를 생성하였다. 이어서 미가공 수는 표준 과정에 따른 데이터 가공, 정규화 및 차등 발현 분석에 대해 DESeq2에 의해 분석하였다. RNA-seq 기능적 카테고리화 및 RNA-seq 데이터로부터 경로 재구성은 유전자 세트 농축 분석(GSEA; Broad Institute) 및 독창적 경로 분석 (Ingenuity Pathway Analysis) (IPA) 소프트웨어 (Qiagen)를 사용하여 수행하였다. 모든 분석은 R에서 수행하였다.
유동 세포측정
[00241] 면역 침윤의 특징 분석을 위해, 새로운 종양 조직(각각 53일령 KPPC 및 KPPC;Col1pdxKO 마우스로부터)을 칭량하고, gentleMACS 분해자(Dissociator)로 잘게 썰고, 30분동안 37℃에서 RPMI 배지에서 1mg/mL 리버라제 TL(Roche) 및 0.2mg/ml의 DNase I를 함유하는 2mL 용액에서 분해시켰다. 조직 용해물을 면역염색 전 100 μm 메쉬를 통해 여과하였다. 후속 단일-세포 현탁액을 고정화될 수 있는 생존능 염료 eFluor 780 (eBioscience) 및 적당한 항체를 사용하여 염색시켰다. 샘플은 40 μm 메쉬를 통해 여과하고, BD LSR Fortessa X20을 사용하여 조사하였다. 퍼센트 양성 세포는 FlowJo 10.1에 의해 분석하였고 CD45 양성에 대해 게이팅하였다. 염색되지 않은 생존능 염색만 및 단일 염색된 비드(eBioscience)는 보상 대조군으로서 사용하였다.
멀티플렉스 염색된 조직 절개부의 다중스펙트럼 이미지화
[00242] 멀티플렉스 염색 절차, 스펙트럼 비혼합 및 Nuance 및 inForm 이미지화 소프트웨어를 사용한 세포 분절화는 이전에 기재되었다(1). 멀티플렉스 염색된 슬라이드는 Vectra 소프트웨어 버전 3.0.3(Perkin Elmer)을 사용하여 Vectra 다중스펙트럼 이미지화 시스템으로 이미지화하였다. 각각의 조직 절개부는 4x 대물렌즈를 사용하여 이의 전체를 스캐닝하였다. 절개부 당 최대 80개 영역(20x에서)은 Phenochart 소프트웨어(Perkin Elmer)를 사용한 다중스펙트럼 이미지화를 위해 선택하였다. 각각의 멀티플렉스 필드는 각각의 발광 필터 큐브의 범위에 걸쳐 발광 스펙트럼 10nm 마다 스캐닝하였다. 다중스펙트럼 이미지화를 위해 사용된 필터 큐브는 DAPI (440-600 nm), FITC (520 nm-680 nm), Cy3 (570-690 nm), 텍사스 레드 (580-700 nm) 및 Cy5 (680-720 nm)이었다.
[00243] Nuance 이미지 분석 소프트웨어(Perkin Elmer)를 사용하여 스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위해 상응하는 형광단이 있는 단일 마커 염색된 슬라이드의 다중 스펙트럼 이미지를 사용하였다. 라이브러리에는 모든 형광단의 방출 스펙트럼 피크가 포함되어 있고, inForm 2.2 이미지 분석 소프트웨어를 사용함에 의해 각 다중 스펙트럼 이미지(스펙트럼 혼합 해제)를 개별 6개 구성 요소로 혼합 해제하는데 사용되었다. 모든 대조군에 걸친 양성 신호의 일관된 캡쳐를 보장하기 위해 상이한 마커에 대한 검출 역치를 상이한 코호트에 걸쳐 조정하였다. 각 코호트의 모든 이미지는 염색 양성의 동일한 역치를 사용하여 가공하였다.
마우스 비장 림프구 및 PDAC 암 세포의 동시 배양
[00244] KPPC 및 KPPC;Col1pdxKO 암 세포 (2 × 104 세포/웰)는 96웰 플레이트에 씨딩하였다. 2.5개월령의 4마리의 건강한 마우스(KPPC 및 KPPC; Col1pdxKO 마우스와 동일한 유전학적 배경을 가짐)로부터의 비장을 잘게 썰고 40μm 메쉬를 통해 여과하고 빙냉 PBS로 세척한 다음 5분동안 빙상에서 5mL의 적혈구 세포 용해 용액(sc-296258, Santa Cruz) 중에 재현탁시키고 이어서 PBS로 세척하였다. 비장 림프구를 계수하고 KPPC 또는 KPPC;Col1pdxKO 암 세포(또는 암 세포가 없는 배양 배지만)을 함유하는 96-웰 플레이트로 이동시키기 전에 24시간 동안 활성화의 존재 또는 부재하에 환저 96-웰 플레이트 (2 x 105 세포/웰)에 씨딩하였다. 동시 배양 24h 후, 비장 림프구를 수거하고 유동 세포측정의 상기 방법을 사용하여 염색시키고 림프구 활성화를 위해 조사하였다. 항-CD3 (553057, BD Biosciences) 및 항-CD28 (553294, BD Biosciences) 항체(1 μg/mL)는 T 세포의 시험관내 활성화를 위해 사용하였다.
통계
[00245] 유동 세포측정 및 면역염색 정량화의 통계 분석은 쌍을 이루지 않은 양측(two=tailed) t 시험, Tukey의 다중 비교 시험을 사용한 일원(one-way) ANOVA 또는 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용한 Fisher의 정확한 시험으로 수행하였다. χ2 분석을 수행하여 마우스에서 다중 조직학적 파라미터에 걸쳐 전이 빈도를 비교하였다.
[00246] 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯을 생존률 분석을 위해 그리고 log 랭크 만텔-콕스 시험(rank Mantel-Cox test)을 사용하여 통계적 차이를 비교하였다. 데이터는 각각의 통계 시험의 추정치를 충족시키고, 여기서, 변량은 균등하지 않고 (F-시험에 의해 결정된), 균등하지 않은 변량에 대한 벨치(Welch)의 보정을 적용하였다. P 값 <0.05은 통계학적으로 유의적인 것으로 고려되었다. 오차 막대는 각 동물에 대한 단일 값을 생성하기 위해 여러 시야의 평균을 냈을 때 평균(S.E.M.)의 표준 오차를 나타내며, 다시 평균을 내어 각 그래프에서 그룹에 대한 평균 막대를 나타낸다.
결과
[00247] 유전자 세트 농축 분석(GSEA)에 의해 밝혀진 바와 같이, KPPF; Col1smaKO 마우스 및 KPPF 대조군 마우스의 종양 조직으로부터의 총 RNA에 대한 RNA-seq는 근섬유아세포에서 Col1의 결실시 KPPF; Col1smaKO 종양에서 유의적으로 하향조절된 면역 반응 경로(림프구 활성화/동원 경로와 같은)를 나타냈다. 추가로 독창적 경로 분석(IPA)은 KPPF;Col1smaKO 종양에서 T 세포 반응과 연관된 유의적으로 하향조절된 유전자, 예를 들어, Cd3g, Cd3e, Pdcd1, Il2rg, Cd80, 및 Cd86을 밝혔다(도 8a-8c). 대조적으로, KPPC; Col1pdxKO 마우스 및 KPPC 대조군 마우스의 종양 조직으로부터의 총 RNA에 대한 RNA-seq는 암세포에서 Col1의 결실시 KPPC; Col1pdxKO 종양에서 유의적으로 상향조절된 면역 반응 경로(림프구 활성화/동원 경로와 같은)를 나타냈다. IPA는 Cd3g, Cd4, Cd8a, Ctla4, Pdcd1, 및 Il2ra를 포함하는, KPPC;Col1pdxKO 종양에서 T 세포 반응과 연관된 유의적으로 상향조절된 유전자를 밝혔다(도 8d-8f). 이어서, KPPC, KPPC;Col1pdxKO, KPPF, 및 KPPF;Col1smaKO마우스로부터의 종양 절개부는 TSA 다중스펙트럼 이미지화에 의해 조사하였다(1). CD3, CD4 및 CD8 T 세포 침윤은 각각 KPPC 및 KPPF 대조군 종양과 비교하는 경우 KPPC;Col1pdxKO 종양에서 증가하였지만 KPPF;Col1smaKO 종양에서 감소하였다(도 8g 및 8h). 종합해보면, KPPF;Col1smaKO 종양의 근섬유아세포에서 Col1 결실은 기질 Col1 수준 및 T 세포 침윤 둘다를 감소시키는 반면, KPPC;Col1pdxKO의 암 세포에서 Col1 결실은 T 세포 침윤을 증가시켰다.
[00248] 새로운 조직에 대한 유동 세포측정 분석은 KPPC;Col1pdxKO 종양이 KPPC 종양과 비교하는 경우 상승된 T 세포 침윤 및 연합된 T 세포 활성화 마커를 가짐을 입증하였다(도 9a-9h). 구체적으로 CD4+/PD-1+ (도 9f) 및 CD8+/PD-1+ 세포 (도 9h)에서 유의적 증가는 KPPC;Col1pdxKO 종양에서 관찰되었다. KPPC;Col1pdxKO 종양의 PD-1+ T 세포에서 상기 증가가 어떠한 기능적 유의성을 갖는지를 결정하기 위해(2), 진행된 PDAC를 갖는 KPPC 마우스 및 KPPC;Col1pdxKO 마우스는 항-PD-1 항체로 처리하였다. 이전의 보고와 유사하게(3, 4), KPPC 마우스는 항-PD-1 처리에 대해 내성이었다(도 9i). 그러나, KPPC;Col1pdxKO는 항-PD-1 처리에 양성으로 응답하였고, 지연된 전체 생존률을 나타냈다(도 9i).
[00249] 마우스 비장 림프구 및 PDAC 암 세포의 시험관내 동시 배양 시스템을 사용하여(이의 도식은 도 9j에 나타낸다), KPPC 암 세포가 동시 배양된 마우스 비장 림프구의 활성화 및 확장을 유의적으로 억제함이 입증되었다. 대조적으로, Col1 동종삼량체가 결실된 KPPC;Col1pdxKO 암 세포는 동시 배양된 마우스 비장 림프구에 대한 상기 면역억제 영향을 상실하였다(도 9k-9n).
[00250] 종합해 보면, 이들 결과는 암 세포에서 발암성 Col1 동종삼량체 결실이 면역억제 PDAC 미세환경을 완화시키고, 종양으로의 T 세포 침윤을 촉진시키고 항-PD-1 관문 차단 치료요법의 효능을 증진시킴을 밝힌다.
* * *
[00251] 본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험없이 만들어 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 특정 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012

Claims (123)

  1. α3β1 인테그린에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시키는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv (단일쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab’)2 단편, 또는 Fv 단편인, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체 또는 이특이적 항체인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체이고, 상기 키메라 항체가 사람화된 항체인, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 이특이적 항체가 α3β1 인테그린 및 CD3 둘다에 결합하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포독성제에 접합된, 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 진단제에 접합된, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 하이브리도마 또는 가공된 세포.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시키는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 α3β1 인테그린을 통한 생존 촉진 신호전달을 억제하는, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 환자가 암, 섬유종 질환, 조직 손상, 켈로이드, 기관 섬유증, 크론 질환, 협착, 대장염, 건선 또는 연결 조직 장애를 갖는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 연결 조직 장애가 콜라겐이 관여하는 연결 조직 장애인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 콜라겐을 포함하는 상기 연결 조직 장애가 1형 콜라겐이 관여하는 연결 조직 장애인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 환자가 암을 갖는, 방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편이 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물의 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 암 환자가 대조군 환자에 비해 상승된 수준의 α1 동종삼량체 I형 콜라겐을 발현하도록 결정된, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 암이 췌장암인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 췌장암 전이를 억제하는 방법으로서 추가로 정의되는, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 췌장암 성장을 억제하는 방법으로서 추가로 정의되는, 방법.
  23. 제17항에 있어서, 적어도 제2 항-암 치료요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 면역치료요법인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 면역치료요법이 관문(checkpoint) 차단 치료요법인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 관문 차단 치료요법이 항-PD-1 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 FAK 및/또는 PYK2를 억제하는, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 VS-4718 (PND-1086)인, 방법.
  31. 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 α3β1 인테그린을 통한 생존 촉진 신호전달을 억제하는 유효량의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제제가 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시키는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 제제가 α3β1 인테그린의 발현을 억제하는 안티-센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 환자가 암, 섬유종 질환, 조직 손상, 켈로이드, 기관 섬유증, 크론 질환, 협착, 대장염, 건선 또는 연결 조직 장애를 갖는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 연결 조직 장애가 콜라겐이 관여하는 연결 조직 장애인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 콜라겐이 관여하는 상기 연결 조직 장애가 1형 콜라겐이 관여하는 연결 조직 장애인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 환자가 암을 갖는, 방법.
  38. 제31항에 있어서, 상기 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편이 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 암 환자가 대조군 환자에 비해 상승된 수준의 α1 동종삼량체 I형 콜라겐을 발현하도록 결정된, 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 암이 췌장암인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 췌장암 전이를 억제하는 방법으로서 추가로 정의되는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 췌장암 성장을 억제하는 방법으로서 추가로 정의되는, 방법.
  43. 제37항에 있어서, 적어도 제2 항-암 치료요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법인, 방법.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 FAK 및/또는 PYK2를 억제하는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 VS-4718 (PND-1086)인, 방법.
  48. N-말단에서 C-말단으로 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩타이드로서, 상기 CAR 폴리펩타이드가 α3β1 인테그린에 결합하는, 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩타이드.
  49. 제48항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 α3β1 인테그린에 결합하는 제1 항체로부터의 HCDR 서열 및 α3β1 인테그린에 결합하는 제2 항체로부터의 LCDR 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  50. 제48항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 α3β1 인테그린에 결합하는 항체로부터의 HCDR 서열 및 LCDR 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시키는, 폴리펩타이드.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 CD8a 도메인 또는 IgG4 힌지 도메인인, 폴리펩타이드.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8a 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인인, 폴리펩타이드.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 CD3z 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
  56. 제55항에 있어서, 상기 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된, 핵산 분자.
  57. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 CAR 폴리펩타이드 또는 제55항 또는 제56항의 핵산을 포함하는 단리된 면역 이펙터 세포.
  58. 제57항에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈으로 통합되는, 세포.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 세포가 T 세포인, 세포.
  60. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 세포가 NK 세포인, 세포.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 사람 세포인, 세포.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 세포 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  63. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 항-종양 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 CAR T 세포가 동종이계 세포인, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 CAR T 세포가 자가 세포인, 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 CAR T 세포가 상기 대상체와 HLA 매칭되는, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 암을 갖는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 암이 췌장암인, 방법.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 FAK 및/또는 PYK2를 억제하는, 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 VS-4718 (PND-1086)인, 방법.
  72. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 항-암 치료요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 면역치료요법인, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 면역치료요법이 관문(checkpoint) 차단 치료요법인, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 관문 차단 치료요법이 항-PD-1 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. α3β1 인테그린의 발현을 억제하는 항-종양 유효량의 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 제제가 α3β1 인테그린 mRNA를 표적화하는 siRNA인, 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 제제가 α3β1 인테그린 mRNA를 표적화하는 shRNA인, 방법.
  80. 제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 제제가 지질 나노입자에 제형화되는, 방법.
  81. 제77항에 있어서, 상기 지질 나노입자가 엑소좀인, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 엑소좀이 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 엑소좀인, 방법.
  83. 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 암을 갖는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 암이 췌장암인, 방법.
  85. 제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 FAK 및/또는 PYK2를 억제하는, 방법.
  87. 제85항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 VS-4718 (PND-1086)인, 방법.
  88. 제77항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 항-암 치료요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 면역치료요법인, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 면역치료요법이 관문(checkpoint) 차단 치료요법인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 관문 차단 치료요법이 항-PD-1 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  93. 암에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) 유효량의 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계;
    (b) N-말단에서 C-말단으로, 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 항-종양 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 CAR 폴리펩타이드가 α3β1 인테그린에 결합하는, 단계; 또는
    (c) α3β1 인테그린의 발현을 억제하는 항-종양 유효량의 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고;
    상기 대상체로부터의 암 세포가 건강한 세포 또는 대조군 세포에 비해 α3 인테그린의 증가된 발현을 갖는 것으로 결정된, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 방법이 (a)의 유효량의 α3β1 인테그린-특이적 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 항체 단편이 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시키는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 항체 단편이 재조합 scFv (단일쇄 단편 가변) 항체, Fab 단편, F(ab’)2 단편, 또는 Fv 단편인, 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체이거나 이특이적 항체인, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 항체가 키메라 항체이고, 상기 키메라 항체가 사람화된 항체인, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 항체가 이특이적 항체이고, 상기 이특이적 항체가 α3β1 인테그린 및 CD3 둘다에 결합하는, 방법.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 세포독성제에 접합된, 방법.
  100. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 진단제에 접합된, 방법.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 (b)의 항-종양 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 α3β1 인테그린에 결합하는 제1 항체로부터의 HCDR 서열 및 α3β1 인테그린에 결합하는 제2 항체로부터의 LCDR 서열을 포함하는, 방법.
  103. 제101항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 α3β1 인테그린에 결합하는 항체로부터의 HCDR 서열 및 LCDR 서열을 포함하는, 방법.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 α3β1 인테그린과 α1 동종삼량체 I형 콜라겐 간의 상호작용을 붕괴시키는, 방법.
  105. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 CD8a 힌지 도메인 또는 IgG4 힌지 도메인인, 방법.
  106. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8a 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인인, 방법.
  107. 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 CD3z 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  108. 제93항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 (c)의 항-종양 유효량의 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 제제가 α3β1 인테그린 mRNA를 표적화하는 siRNA인, 방법.
  110. 제108항에 있어서, 상기 제제가 α3β1 인테그린 mRNA를 표적화하는 shRNA인, 방법.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 지질 나노입자에 제형화되는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 지질 나노입자가 엑소좀인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 엑소좀이 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 엑소좀인, 방법.
  114. 제93항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 암을 갖는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 암이 췌장암인, 방법.
  116. 제93항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 신호전달의 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 FAK 및/또는 PYK2를 억제하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 인테그린 신호전달의 억제제가 VS-4718 (PND-1086)인, 방법.
  119. 제93항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 항-암 치료요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 유전자 치료요법, 수술, 호르몬 치료요법, 항-혈관형성 치료요법 또는 사이토킨 치료요법인, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 제2 항-암 치료요법이 면역치료요법인, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 면역치료요법이 관문(checkpoint) 차단 치료요법인, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 관문 차단 치료요법이 항-PD-1 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020227002005A 2019-06-21 2020-06-17 암 및 기타 질환의 치료를 위한 알파3베타1 인테그린 표적화 KR20220036941A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962864611P 2019-06-21 2019-06-21
US62/864,611 2019-06-21
PCT/US2020/038158 WO2020257296A1 (en) 2019-06-21 2020-06-17 Targeting alpha3beta1 integrin for treatment of cancer and other diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220036941A true KR20220036941A (ko) 2022-03-23

Family

ID=74040872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227002005A KR20220036941A (ko) 2019-06-21 2020-06-17 암 및 기타 질환의 치료를 위한 알파3베타1 인테그린 표적화

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230139944A1 (ko)
EP (1) EP3986426A4 (ko)
JP (1) JP2022536982A (ko)
KR (1) KR20220036941A (ko)
CN (1) CN114641310A (ko)
AU (1) AU2020296004A1 (ko)
CA (1) CA3143989A1 (ko)
WO (1) WO2020257296A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210093251A (ko) * 2018-10-16 2021-07-27 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 및 다른 질환의 진단 및 치료를 위한 병원성 세포외 매트릭스의 동정 및 표적화
WO2023114888A1 (en) * 2021-12-15 2023-06-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for altering a tumor microbiome

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070014788A1 (en) * 2004-12-13 2007-01-18 Novo Nordisk A/S Laminin-5 modulators and uses thereof
CN102372773B (zh) * 2010-08-11 2013-06-05 中国科学院生物物理研究所 人膀胱癌肿瘤标志物及其抗体和应用
MX359410B (es) * 2011-12-13 2018-09-27 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd Minicélulas intactas derivadas bacterialmente para suministro de agentes terapéuticos a tumores cerebrales.
EP2823035A4 (en) * 2012-03-09 2015-08-05 Massachusetts Inst Technology SIGNATURES OF ACCESSION
EA201890895A1 (ru) * 2013-03-15 2019-02-28 Зинджения, Инк. Мультивалентные и моновалентные мультиспецифические комплексы и их применение
WO2015002956A1 (en) * 2013-07-01 2015-01-08 Ohio State Innovation Foundation Exosome delivery system
GB201413357D0 (en) * 2014-07-28 2014-09-10 Philogen Spa Antibodies for treatment and diagnosis
BR112017004510A8 (pt) * 2014-09-09 2018-06-26 Univ Texas anticorpos monoclonais isolados; anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação a antígenos do mesmo; composição; moléculas polinucleotídicas isoladas; polipeptídeo recombinante; polipeptídeos; célula hospedeira; método de fabricação de um anticorpo; uso de um agente para o tratamento de câncer em um paciente; usos de anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígenos do mesmo para o tratamento de um sujeito que sofre de um câncer; uso de anticorpo monoclonal para o tratamento de um sujeito que sofre de um câncer; composição compreendendo um anticorpo de ligação a agr2; composição compreendendo um anticorpo de ligação a c4.4a; composição compreendendo um anticorpo de ligação a agr2 e um anticorpo de ligação a c4.4a; composição compreendendo um anticorpo; uso de um anticorpo de ligação a agr2; uso de um anticorpo de ligação a c4.4a; uso de um anticorpo; e kit compreendendo um anticorpo
SG11201702598XA (en) * 2014-10-29 2017-05-30 Seattle Genetics Inc Dosage and administration of non-fucosylated anti-cd40 antibodies
CA3002674A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
EP3423482A1 (en) * 2016-03-04 2019-01-09 Novartis AG Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore

Also Published As

Publication number Publication date
CA3143989A1 (en) 2020-12-24
JP2022536982A (ja) 2022-08-22
EP3986426A4 (en) 2023-10-18
EP3986426A1 (en) 2022-04-27
CN114641310A (zh) 2022-06-17
AU2020296004A1 (en) 2022-01-27
WO2020257296A1 (en) 2020-12-24
US20230139944A1 (en) 2023-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2623161C2 (ru) Полипептиды и полинуклеотиды и их применение для лечения иммунологических нарушений и рака
TW201833139A (zh) 抗人類ｖｉｓｔａ抗體及其用途
KR20170122258A (ko) Ｃｄ20 결합 분자 및 그의 용도
US20230139944A1 (en) Targeting alpha3beta1 integrin for treatment of cancer and other diseases
US20220389106A1 (en) Anti-epha10 antibodies and methods of use thereof
US20230014398A1 (en) Anti-b7-h3 monoclonal antibody and methods of use thereof
US20220089707A1 (en) Monoclonal antibodies against mhc-bound human dickkopf-1 peptides and uses thereof
US20220144938A1 (en) Identification and targeting of tumor promoting carcinoma associated fibroblasts for diagnosis and treatment of cancer and other diseases
EP4041767A1 (en) Antibodies specific to glycosylated ctla-4 and methods of use thereof
US20240085427A1 (en) AN AGR2Xcd3 BISPECIFIC ENGAGER FOR THE TREATMENT OF CANCER
US20220144926A1 (en) Identification and targeting of pathogenic extracellular matrix for diagnosis and treatment of cancer and other diseases
US20230128075A1 (en) Monoclonal antibodies targeting hsp70 and therapeutic uses thereof
WO2023056361A1 (en) Anti-hsp70 antibodies and therapeutic uses thereof