KR101455447B1 - Ｍｕｃ１＊ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MUC1*에 대한 모노클로날 항체를 기술한다.

Description

ＭＵＣ１＊ 항체{MUC1* Antibodies}
관련 출원의 전후 참조
본 출원은, 내용의 전문이 본원에 참조로 인용된, 2008년 10월 6일자로 출원된 미국 가특허원 제61/103,204호의 이익을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 MUC1*에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
당해 분야의 일반적인 배경 및 설명
MUC1 수용체는 많은 인간 암에 연류된 뮤신 계열로부터의 제I형 막관통 당단백질이다. 모든 고형 종양의 대략 75%가 MUC1 수용체를 비정상적으로 발현하는 것으로 추정되고 있다. MUC1+ 암의 그룹은 90% 이상의 유방 암종, 47%의 전립선 종양 및 높은 비율의 난소, 직장결장, 폐 및 췌장 암을 포함한다. MUC1 수용체의 정상 기능 중에서는 세포 부착, 생식능력 및 면역 반응에서의 역할이 있다는 일부 증거가 있다. 암에서 MUC1 수용체의 역할은 아직 문헌에 확립되어 있지 않다. 그러나, 암에서 세포 표면 발현 및 수용체 패턴에 있어서의 주요 차이점은 잘 문서화되어 있다. 건강한 세포상에서의 MUC1 발현과 암 세포에서의 발현 사이의 가장 놀랄만한 차이점은, 건강한 세포에서는 수용체가 끝 주변(apical border)에 무리지어 있는 반면, 암 세포에서 수용체는 세포의 전체 표면에 걸쳐 균일하게 분포되어 있다는 것이다. 또한, 수용체가 비정상적인 패턴외에 종양 세포에서 과발현된다는 일부 증거가 있다.
MUC1의 정상적인 기능 및 암에 대한 이의 결합은 아직 명확히 측정되어 있지 않다. 알려진 것은, MUC1의 세포외 도메인의 일부가 떨어지거나 절단되어 유방암 환자의 혈청에서 검출될 수 있다는 것이다. 유방암 환자에서, 혈청중 떨어진 MUC1의 수준은 때때로 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하기 위해 측정한다. MUC1의 세포질성 테일(cytoplasmic tail)은 다양한 시그날 형질도입 단백질에 대한 모티프(motif)가 풍부하다. 일반적인 시그날링 단백질인, Grb2 및 SOS가 MUC1의 세포질성 테일과 관련되어 있음은 문헌에 보고되어 있다. 암 세포에서, 세포외 도메인이 글리코실화되어있지 않다는 것은 과학 문헌에 주지되어 있다.
막-결합 MUC1 절단 생성물인, MUC1*은 배양된 암 세포 및 암성 조직에서 우세한 형태의 단백질이다. MUC1*은 세포질성 테일, 막관통(transmembrane) 도메인, 및 약 45개 아미노산의 세포외 도메인(ECD)으로 이루어져 있다. 그러나 절단의 정확한 부위(들)은 일부 불명확하게 남아있다.
MUC1*은 리간드-유도된 이량체화에 의해 활성화되는 경우 세포 성장을 자극한다. 특정 세포의 성장을 증진시키는 것이 바람직한 경우 몇가지 예가 존재하며 이를 위해, 수행하기 위한 편리한 방법은 2가 항-MUC1* 항체의 첨가를 통하는 것이며, 이는 이량체성 리간드를 자극한다. 다른 경우에, MUC1*-양성 세포의 성장을 억제하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 많은 암 세포는 MUC1*을 발현한다. MUC1-양성 암 세포의 성장은, 1가 제제가 MUC1*에 결합하여 이량체화를 방지하는 경우에 억제된다. MUC1*-매개된 세포 성장을 차단하기 위한 편리한 1가 제제는 1가 항체이다. 1가 항체는 효소적 분해 생성물인 항체 단편일 수 있거나, 단지 하나의 항원 결합 부위를 가지도록 가공될 수 있다. MUC1*에 1가로 결합하는 항체는 또한 MUC1*의 세포외 도메인의 이량체화를 억제하기 때문에 양특이적인 항체를 포함한다. MUC1*의 자극(2가) 및 억제(1가)는 MUC1 성장 인자 수용체(PSMGFR) 서열(서열 1)의 주요 서열 및 이의 변이체를 인지하는 폴리클로날 항체를 사용한 세포 성장을 매개하였다. 본원에서, 본 발명의 발명자들은 PSMGFR 서열 및 변이체을 인지하는 모노클로날 항체의 생성을 기술한다.
모노클로날 항체를 확인하는 것은 많은 이유가 있다. 예를 들면, 단일 항체 종을 생산하는 하이브리도마는 완전히 재생될 수 없는 다양한 친화성, 특이성 및 생성을 갖는 항체의 수집보다는, 단일 항체, 모노클로날의 재생가능한 공급을 제공한다. 항체의 각각의 뱃치는 상이한 동물 및 상이한 면역화로부터 온다. 대조적으로, 바람직한 특성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마가 확인되면, 하이브리도마를 유지시킴으로써, 재생가능한 단일 종 항체를 무제한 공급한다. 또한, 항체의 모노클로날 또는 단일 종이 확인되면, 항체의 서열 또는 이의 가변 영역을 결정할 수 있다. 이는 예를 들면, 일본쇄, 이특이적인, 디아바디(diabody), 및 항체-화학물질 융합체 또는 항체-단백질 융합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체 유도체를 제조하는데 사용될 수 있는 많은 형태의 단백질 가공 및 재조합체 DNA 기술을 가능하도록 한다. 예를 들면, 링커 서열에 의해 연결된 가변 경쇄 및 중쇄 영역으로 이루어진 1가의 일본쇄 항체를 생성하도록 하는 항체의 서열은 알려져 있다. 표적에 따라서, 각각의 가변 영역(중쇄 및 경쇄)이 상이한 표적을 인지하는 양특이적 항체를 생성하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
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발명의 요약
본 발명은 MUC1* 항체 및 항체 유도체를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 MMP-14 또는 TACE와 같은 다른 MUC1* 자극 종, 또는 MUC1*에 대한 천연 리간드인 NM23 등과 같은 다른 MUC1 절단 효소에 대한 유전자와 함께 사용될 수 있는 MUC1* 항체를 암호화하는 유전자의 사용을 또한 포함한다. 이들 유전자는 세포, 또는 숙주 동물 또는 인간에서 MUC1* 성장 인자 수용체 활성을 자극하는데 사용된다.
하나의 양태에서, MUC1* 항체를 암호화하는 핵산은 조직 특이적인 프로모터의 하부(downstream)에 삽입되고 난자 및 정자의 완전한 융합 직전에 전구핵 또는 유사핵내로 주사되어 유전자삽입 동물을 생성한다. 이는 간헐적으로 종양을 형성하거나 보다 더 종양을 형성하는 경향이 있는 마우스 또는 다른 유전자삽입 동물을 생성할 것이다. 유사하게, 항-MUC1* 항체를 암호화하는 유전자를 다른 종양-촉진 유전자를 암호화하여 종양 형성을 증진시키는 플라스미드내로 동시에 주사하거나 삽입한다.
MUC1, MUC1* 또는 MUC1* 자극제에 대한 유전자를 도입함으로써 줄기-유사 세포 성장의 자극을 증가시키는 방법이 세포 배양물내에서 시험관내에서 뿐만 아니라 수용체 동물 또는 인간에서도 사용된다. 하나의 양태에서, MUC1* 항체를 암호화하는 플라스미드는 세포 성장 속도를 증가시키고 MUC1*의 자극을 통해 세포 사멸에 대해 세포 내성이 되도록 함으로써 항체 생산을 증가시키기 위해 외인성으로 가해지거나 항체-생산 하이브리도마내로 형질감염된다. 본 발명의 측면에서, 바람직한 항체인 생성물을 오염시키지 않고 항체-생산 세포의 성장을 증진시킨다. 항체-생산 세포는, 혈청 성분이 이의 많은 항체를 함유하므로, 혈청이 감소된 배지 속에서 통상적으로 성장한다. 세포 배양 배지속에서 혈청의 양을 감소시키는 것은 오염을 통한 이동을 최소화시키지만 또한 세포 성장 및 바람직한 항체의 전체 수율을 감소시킨다. 외인성 항-MUC1*의 첨가 또는 항-MUC1*에 대하여 암호화하는 플라스미드의 형질감염은 세포 성장 및 생존을 증가시키는 반면, 단일의 공지된 항체를 바람직한 항체인 생성물로부터 선택적으로 정제할 수 있다. NM23과 같은 MUC1* 이량체화 리간드의 첨가를 또한 사용할 수 있다.
하나의 양태에서, MUC1* 자극 항체는 패혈증의 치료를 위해 환자에게 투여된다. 많은 세포 유형이 스트레스에 대한 반응시 MUC1*의 발현을 증가시킨다. 환자는 거대한 세포 사멸로 인하여 패혈증에 급속히 굴복한다. 환자에게 이의 천연 리간드 NM23 또는 이의 인지체 항체와 같은 MUC1* 이량체화제를 투여하면 세포 생존률이 증가되며 이동안 환자는 감염을 사멸시키는 제제로 치료함으로써 환자 생존률을 증가시킨다.
다른 양태에서, MUC1* 자극 항체는 감염으로 고생하는 환자에게 투여되며, 여기서, 세포 사멸의 양을 감소시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 특정의 병원체는 국소적으로 작용하여 조직을 신속하게 파괴한다. MUC1* 자극 항체는 전신적으로 또는 국소적으로 투여되어 병원체-유도된 세포 사멸을 감소시키거나 예방한다.
다른 양태에서, MUC1* 자극 항체를 암호화하는 유전자는 새로운 수정란내로 삽입시켜 줄기 세포와 같은 원시 세포를 제조할 수 있으며, 여기서, 수득되는 세포는 다능성(pluripotency) 및 다른 줄기 세포-유사 특성을 증진시키거나 유도하는 이들 자체의 MUC1* 자극 리간드를 생산한다.
본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명은 MUC1*에 대한 분리된 모노클로날 항체에 관한 것이다. 항체는 MUC1*에 대해 2가 또는 1가일 수 있다. 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 중쇄 가변영역 내에 NYGMN(서열 번호: 330), GYAMS(서열 번호: 331) 또는 R/GYA/GMS(서열 번호: 332)와 적어도 90% 동일하거나 서열 번호: 172 내지 184 중에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 CDR1 영역의; WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(서열 번호: 333) 또는 TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 334)과 적어도 90% 동일하거나 서열 번호: 198 내지 210 중에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 CDR2 영역내의; S/TGT/DT/AXXY/FYA(서열 번호: 335), TGTTAILNG(서열 번호: 336), SGDGYWYYA(서열 번호: 337) 또는 DNYGXXYDYG/A(서열 번호: 338)에 대해 적어도 90% 동일하거나 서열 번호: 224 내지 236 중에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체이다.
다른 측면에서, 본 발명은 (i) CDR1 영역내에, NYGMN(서열 번호: 330), GYAMS(서열 번호: 331) 또는 R/GYA/GMS(서열 번호: 332)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (ii) CDR2 영역내에, WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(서열 번호: 333) 또는 TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 334)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 모노클로날 항체는 (i) CDR1 영역내, NYGMN(서열 번호: 330), GYAMS(서열 번호: 331) 또는 R/GYA/GMS(서열 번호: 332)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (ii) CDR3 영역내에, S/TGT/DT/AXXY/FYA(서열 번호: 335), TGTTAILNG(서열 번호: 336), SGDGYWYYA(서열 번호: 337) 또는 DNYGXXYDYG/A(서열 번호: 338)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 가질 수 있다. 모노클로날 항체는 (i) CDR2 영역내에, WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(서열 번호: 333) 또는 TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 334)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (ii) CDR3 영역내에, S/TGT/DT/AXXY/FYA(서열 번호: 335), TGTTAILNG(서열 번호: 336), SGDGYWYYA(서열 번호: 337) 또는 DNYGXXYDYG/A(서열 번호: 338)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 가질 수 있다. 모노클로날 항체는 (i) CDR1 영역내에, NYGMN(서열 번호: 330), GYAMS(서열 번호: 331) 또는 R/GYA/GMS(서열 번호: 332)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내에, WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(서열 번호: 333) 또는 TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 334)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내에, S/TGT/DT/AXXY/FYA(서열 번호: 335), TGTTAILNG(서열 번호: 336), SGDGYWYYA(서열 번호: 337) 또는 DNYGXXYDYG/A(서열 번호: 338)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 카파 쇄 가변영역내에 SASSSV/ISYM/IH/Y(서열 번호: 339) 또는 RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 340)에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 모노클로날 항체는 카파 쇄 가변영역내에 서열 번호: 108 내지 110 및 서열 번호: 112 내지 118 중에서 선택된 CDR1 영역내의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 모노클로날 항체는 카파 쇄 가변영역내에 S/GTSNLAS(서열 번호: 341) 또는 LASNLES(서열 번호: 342)에 대해 적어도 90% 동일하거나 서열 번호: 129 내지 138 중에서 선택된 영역에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역내의; QQRSS/NYPS/FT(서열 번호: 343) 또는 QHSRELPFT(서열 번호: 344)에 대해 적어도 90% 동일하거나 서열 번호: 149 내지 158 중에서 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체가 (i) CDR1 영역내, SASSSV/ISYM/IH/Y(서열 번호: 339) 또는 RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 340)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (ii) CDR2 영역내에, S/GTSNLAS(서열 번호: 341) 또는 LASNLES(서열 번호: 342)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 카파 쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 갖는 것에 관한 것이다. 모노클로날 항체는 (i) CDR1 영역내, SASSSV/ISYM/IH/Y(서열 번호: 339) 또는 RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 340)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (ii) CDR3 영역내, QQRSS/NYPS/FT(서열 번호: 343) 또는 QHSRELPFT(서열 번호: 344)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 카파 쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 가질 수 있다. 모노클로날 항체는 (i) CDR2 영역내에, S/GTSNLAS(서열 번호: 341) 또는 LASNLES(서열 번호: 342)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (ii) CDR3 영역내, QQRSS/NYPS/FT(서열 번호: 343) 또는 QHSRELPFT(서열 번호: 344)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 카파 쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특허청구범위 제1항에 따른 모노클로날 항체는 (i) CDR1 영역내에, SASSSV/ISYM/IH/Y(서열 번호: 339) 또는 RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 340)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내에, S/GTSNLAS(서열 번호: 341) 또는 LASNLES(서열 번호: 342)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내에, QQRSS/NYPS/FT(서열 번호: 343) 또는 QHSRELPFT(서열 번호: 344)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 카파 쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체가 (i) CDR1 영역내, NYGMN(서열 번호: 330), GYAMS(서열 번호: 331) 또는 R/GYA/GMS(서열 번호: 332)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내, WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(서열 번호: 333) 또는 TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 334)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내, S/TGT/DT/AXXY/FYA(서열 번호: 335), TGTTAILNG(서열 번호: 336), SGDGYWYYA(서열 번호: 337) 또는 DNYGXXYDYG/A(서열 번호: 338)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역내 아미노산 서열; 및 (i) CDR1 영역내, SASSSV/ISYM/IH/Y(서열 번호: 339) 또는 RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 340)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내, S/GTSNLAS(서열 번호: 341) 또는 LASNLES(서열 번호: 342)에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내에, QQRSS/NYPS/FT(서열 번호: 343) 또는 QHSRELPFT(서열 번호: 344)에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 카파 쇄 가변 영역내 아미노산 서열을 가지는 것에 관한 것이다.
여전히 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역내에 서열 번호: 331에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 334에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 374에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역내에 서열 번호: 340에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 342에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 344에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
다른 측면에서, 모노클로날 항체는 경쇄 가변 영역내에 서열 번호: 332에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 334에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 338에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3내 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역내에 서열 번호: 339에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 341에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 343에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3내 아미노산 서열을 가질 수 있다.
여전히 다른 측면에서, 본 발명은 인간 중쇄내에, 서열 번호: 353에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 355에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 357에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 359에 대해 적어도 90% 동일한 FWR4 서열, 및 인간 경쇄내에, 서열 번호: 345에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 347에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 349에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 351에 대해 적어도 90% 동일한 FWR4 서열을 포함하는 인간 FWR 서열을 포함하는, 모노클로날 항체에 관한 것이다.
여전히 다른 측면에서, 본 발명은 인간 중쇄내에, 서열 번호: 362에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 363에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 364에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 및 인간 경쇄내에, 서열 번호: 365에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 366에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 367에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열을 포함하는 인간 FWR 서열을 포함하는, 모노클로날 항체에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 중쇄내에, 서열 번호: 353에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 355에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 357에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 359에 대해 적어도 90% 동일한 FWR4 서열, 및 인간 경쇄내에, 서열 번호: 345에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 347에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 349에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 351에 대해 적어도 90% 동일한 FWR4 서열을 포함하는, 인간 FWR 서열을 추가로 포함하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간 중쇄내에, 서열 번호: 368에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 369에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 370에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 및 인간 경쇄내에, 서열 번호: 371에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 372에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 373에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열을 포함하는, 인간 FWR 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 인간화된 모노클로날 항체에 관한 것이며, 여기서, 바람직하게는 골격 영역은 공지된 인간 골격 서열이다.
다른 측면에서, 본 발명은 위에서 기술한 모노클로날 항체를 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 위에서 기술한 모노클로날 항체를 발현하는 분리된 하이브리도마에 관한 것이다. 항체는 Fab, 또는 일본쇄 1가 항체일 수 있다. 항체는 양특이적일 수 있으며, 여기서, 하나의 인지 측면은 서열 번호: 1의 펩타이드에 결합하고 다른 것은 다른 에피토프(epitope)를 인지한다. 다른 에피토프는 HER2 또는 DLL4일 수 있다.
본 발명은 MUC1*에 대해 특이적인 scFv 융합 단백질에 관한 것이며 여기서, 면역글로불린-유사 VH 도메인은 면역글로불린-유사 VL 도메인에 연결되어 있고, 여기서, 상기 VH 쇄 및 상기 VL 쇄는 펩타이드 링커를 통해 연결되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 MUC1*을 발현하는 세포를 위에서 기술한 1가 모노클로날 항체와 접촉시킴을 포함하여, 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 세포는 암 세포일 수 있다.
여전히 다른 측면에서, 본 발명은 MUC1*을 발현하는 세포를 위에서 기술한 2가 모노클로날 항체와 접촉시킴을 포함하여, 세포 증식을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 세포는 다능성 또는 전구 세포일 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적은 하기 본 발명의 설명, 이에 첨부된 참조 도면 및 이에 첨부된 특허청구범위로부터 더 완전히 이해될 것이다.
바람직한 양태의 상세한 설명
본 출원에서, "하나"("a" 및 "an")는 단일 및 다수의 대상 둘 다를 언급하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 것으로서, "MUC1 성장 인자 수용체"(MGFR)는 성장 인자와 같은 활성화 리간드 또는 절단 효소와 같은 변형화 효소와 상호작용하는 MUC1 수용체의 일부를 의미하는 기능적 정의이다. MUC1의 MGFR 영역은 세포 표면에 가장 근접해 있고 하기 정의한 바와 같이 PSMGFR의 대부분 또는 모두에 의해 정의된 세포외 부위이다. MGFR은 예를 들면, 포스포릴화, 글리코실화 등과 같이 효소 변형을 겪은 펩타이드 및 변형되지 않은 펩타이드 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, "MUC1 성장 인자 수용체의 주 서열"(PSMGFR)은 일부 경우에 MGFR의 대부분 또는 모두를 정의하는 펩타이드 서열, 및 펩타이드 서열의 작용적 변이체 및 단편을 말한다. PSMGFR은 서열 번호: 1, 및 20 이하 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)의 어떠한 정수 값의 아미노산 치환, 및/또는 이의 N-말단 및/또는 C-말단에서 20개 이하의 어떠한 정수 값의 아미노산 첨가 또는 결실을 갖는 이의 모든 작용적 변이체 및 단편으로 정의된다. 상기 내용에서 "작용적 변이체 또는 단편"은 서열 번호: 1의 펩타이드에 결합하거나, 또는 기타의 경우에는 이와 특이적으로 상호작용하는 리간드에 특이적으로 결합하거나, 또는 다른 방식으로 이와 특이적으로 반응하는 능력을 가지지만 이들 자체와 동일한 다른 펩타이드 분자의 동일한 영역과는 강력하게 결합하지 않음으로써, 펩타이드 분자가 다른 동일한 펩타이드 분자와 응집(즉, 자가-응집)하는 능력을 가지게 되는 변이체 또는 단편을 말한다. 서열 번호: 1의 PSMGFR 펩타이드의 작용적 변이체인 PSMGFR의 하나의 예는 -SRY- 대신에 -SPY- 서열을 포함함으로써 서열번호: 1과 상이한 서열 번호: 2이다.
본원에 사용된 것으로서 "MUC1*"은 N-말단이 트렁케이트(truncate)됨으로써 세포외 도메인이 필수적으로 PSMGFR(서열 번호: 1)을 포함하는 MUC1 단백질을 말한다.
서열 목록 자유 교본
a, g, c, t 이외의 뉴클레오타이드 기호의 사용과 관련하여, 이들은 WIPO 표준 ST.25, 부록 2, 표 1에 설정되어 있으며, 여기서, k는 t 또는 g를 나타내고; n은 a, c, t 또는 g를 나타내며; m은 a 또는 c를 나타내고; r은 a 또는 g를 나타내며; s는 c 또는 g를 나타내고; w는 a 또는 t를 나타내며 y는 c 또는 t를 나타낸다.
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호: 1)는 1110 내지 1155번 아미노산으로부터 MUC1의 막 근접 세포외 영역을 기술한다.
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호: 2)는 아미노산 1110 내지 1155번 아미노산으로부터 MUC1의 막 근접 세포외 영역의 변이체를 기술한다.
5'-ggaaagcttatagacagatgggggtgtcgttttggc-3(서열 번호: 3)은 PCR 프라이머, IgG1 불변 영역 역방향 프라이머를 함유하는 HindIII 제한 부위를 기술한다.
5'-ggaaagcttcttgaccaggcatcctagagtca-3'(서열 번호: 4)는 PCR 프라이머, IgG2A 불변 영역 역방향 프라이머를 함유하는 HindIII 제한 부위를 기술한다.
5'-ggaaagcttaggggccagtggatagactgatgg-3'(서열 번호: 5)는 PCR 프라이머, IgG2B 불변 영역 역방향 프라이머를 함유하는 HindIII 제한 부위를 기술한다.
5'-cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtc-3'(서열 번호: 6)는 PCR 프라이머, 중쇄 FR1 영역 정방향 프라이머 1을 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtcwgg-3'(서열 번호: 7)는 PCR 프라이머, 중쇄 FR1 영역 정방향 프라이머 2를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-ggtgtcgacggatacagttggtgcagcatc-3'(서열 번호: 8)는 PCR 프라이머, 카파 쇄 불변 영역 역방향 프라이머를 함유하는 SalI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggagctcgayattgtgmtsacmcarwctmca-3'(서열 번호: 9)는 PCR 프라이머, 카파 쇄 FR1 영역 공통의 변성된 정방향 프라이머를 기술한다.
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctat(서열 번호: 10)는 MIN-C2 중쇄 가변 영역을 기술한다.
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVY(서열 번호: 11)는 MIN-C2 중쇄 가변 영역을 기술한다.
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(서열 번호: 12)는 MIN-C2 카파 쇄 가변 영역을 기술한다.
DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 13)는 MIN-C2 카파 쇄 가변 영역을 기술한다.
ggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatca(서열 번호: 14)는 링커를 기술한다.
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctatggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(서열 번호: 15)는 MIN-C2 중쇄-링커-경쇄를 기술한다.
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctatggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcctgt(서열 번호: 16)는 MIN-C2 중쇄-링커-경쇄-Cys를 기술한다.
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSVD(서열 번호: 17)는 MIN-C2 중쇄-링커-경쇄를 기술한다.
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSC(서열 번호: 18)는 MIN-C2 중쇄-링커-경쇄-Cys를 나타낸다.
gaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagggataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctat(서열 번호: 19)는 MIN-E6 중쇄-7 가변 영역을 기술한다.
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDNYGSSYDYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVY(서열 번호: 20)는 MIN-E6 중쇄-7 가변 영역을 기술한다.
gaggtaaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaag(서열 번호: 21)는 MIN-E6 중쇄-8 가변 영역을 기술한다.
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKRLEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVK(서열 번호: 22)는 MIN-E6 중쇄-8 가변 영역을 기술한다.
gatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(서열 번호: 23)는 MIN-E6 카파 쇄 가변 영역을 기술한다.
DIVITQTTAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 24)는 MIN-E6 카파 쇄 가변 영역을 기술한다.
gaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagggataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaagggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(서열 번호: 25)는 MIN-E6 scFv: 중쇄 7-링커-경쇄 (VH + 링커 + VL)를 기술한다.
gaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagggataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaagggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcctgt(서열 번호: 26)는 MIN-E6 scFv-Cys: 중쇄 7-링커-경쇄-Cys (VH + 링커 + VL + Cys)를 기술한다.
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDNYGSSYDYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 27)는 MIN-E6 scFv 중쇄 7-링커-경쇄 (VH + 링커 + VL)를 기술한다.
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDNYGSSYDYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSC(서열 번호: 28)는 MIN-E6 scFv-Cys 중쇄 7-링커-경쇄-Cys (VH + 링커 + VL + Cys)를 기술한다.
gaggtaaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaagggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(서열 번호: 29)는 MIN-E6 중쇄 8-링커-경쇄를 기술한다.
gaggtaaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaagggtggaggcggatcaggtggaggcggatcaggtggaggcggatcagatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcctgt(서열 번호: 30)는 MIN-E6 중쇄 8-링커-경쇄-Cys를 기술한다.
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKRLEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 31)는 MIN-E6 중쇄 8-링커-경쇄를 기술한다.
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKRLEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGGGGSGGGGSGGGGSDIVITQTTAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSC(서열 번호: 32)는 MIN-E6 중쇄 8-링커-경쇄-Cys를 기술한다.
5'-gggaattccaccatggratgsagctgkgtmatsctctt-3'(서열 번호: 33)는 PCR 프라이머, 감마 정방향-1를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatgracttcgggytgagctkggtttt-3'(서열 번호: 34)는 PCR 프라이머, 감마 정방향-2를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatggctgtcttggggctgctcttct-3'(서열 번호: 35)는 PCR 프라이머, 감마 정방향-3를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatggrcagrcttacwtyy-3'(서열 번호: 36)는 PCR 프라이머, 감마 정방향-4를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-ctacctcgagckyggtsytgctggcygggtg-3'(서열 번호: 37)는 PCR 프라이머, 감마 역방향을 함유하는 XhoI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatggagacagacacactcctgctat-3'(서열 번호: 38)는 PCR 프라이머, 카파 정방향-1을 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatggattttcaggtgcagattttcag-3'(서열 번호: 39)는 PCR 프라이머, 카파 정방향-2를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatgragtcacakacycaggtcttyrta-3'(서열 번호: 40)는 PCR 프라이머, 카파 정방향-3를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatgaggkccccwgctcagytyctkggr-3'(서열 번호: 41)는 PCR 프라이머, 카파 정방향-4를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatgaagttgcctgttaggctgttg-3'(서열 번호: 42)는 PCR 프라이머, 카파 정방향-5를 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-gggaattccaccatgatgagtcctgcccagttcc-3'(서열 번호: 43)는 PCR 프라이머, 카파 정방향-6을 함유하는 EcoRI 제한 부위를 기술한다.
5'-ctacctcgagttaacactcattcctgttgaagc-3'(서열 번호: 44)는 PCR 프라이머, 카파 역방향을 함유하는 XhoI 제한 부위를 기술한다.
gaggtccagctggaggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccagccagcaggaccgcg(서열 번호: 45)는 MIN-C2 Fab 중쇄를 기술한다.
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt(서열 번호: 46)는 MIN-C2 Fab 카파 쇄를 기술한다.
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASRTA(서열 번호: 47)는 MIN-C2 Fab 중쇄를 기술한다.
DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(서열 번호: 48)는 MIN-C2 Fab 카파 쇄를 기술한다.
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(서열 번호: 49)는 MIN-C2 경쇄 CL 영역 아미노산 서열을 기술한다.
FDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASRTA(서열 번호: 50)는 MIN-C2 중쇄 CH1 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSTEIMSASPGEKVTITCSASSSISYIHWFQQKPGTSPKLWIFGTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYCQQRSNYPFTFGSGTKLQIKRADAAPTVS(서열 번호: 51)는 MIN-A2-1 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLAS GAPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYCQQRSSYPSTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 52)는 MIN-A2-2 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQTTAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMYWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPSTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 53)는 MIN-C9-1 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVITQSTAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYTYWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPSTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 54)는 MIN-C9-2 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVITQTPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYCQQRSSYPSTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 55)는 MIN-D7-1 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSTAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYCQQRSSYPSTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(서열 번호: 56)는 MIN-D7-2 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVMTQSPEIMSASPGEKVTITCSASSSISYIHWFQQKPGTSPKLWIFGTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYCQQRSNYPFTFGSGTKLQIKRADAAPTVS(서열 번호: 57)는 MIN-F2-1 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVITQSTEIMSASPGEKVTITCSASSSISYIHWFQQKPGTSPKLWIFGTSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYCQQRSNYPFTFGSGTKLQIKRADAAPTVS(서열 번호: 58)는 MIN-F2-2 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVKLQESGPELKKPGETVEISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYAGDFKGRFAFSLETSASTAYLQINTLKNEDTATYFCARSGDGYWYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(서열 번호: 59)는 MIN-A2-1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYAGDFKGRFAFSLETSASTAYLQINTLKNEDTATYFCARSGDGYWYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(서열 번호: 60)는 MIN-A2-2 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLQESGPELKQPGETVKISCKASGYTFTNNGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLDTSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARTGTARAFYAMDYWGQGTSVTVSSTKTTAPSVY(서열 번호: 61)는 MIN-C9-1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLQQSGPELKQPGETVKISCKASGYTFTNNGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLGTSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARTGTARAFYAMDYWGQGTSVTVSSTKTTAPSVY(서열 번호: 62)는 MIN-C9-2 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(서열 번호: 63)는 MIN-D7-1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYAGDFKGRFAFSLETSASTAYLQINTLKNEDTATYFCARSGDGYWYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(서열 번호: 64)는 MIN-D7-2 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVKLEESGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(서열 번호: 65)는 MIN-F2-1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLEQSGAELVRPGASVKLSCKALGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIHPGSGGTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTNYGSFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVY(서열 번호: 66)는 MIN-F2-2 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
RCRLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSCL(서열 번호: 67)는 MIN-F2-3 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFINYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSARTAYLQINNLKNEDMATYFCARTGTTAILNGMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY(서열 번호: 68)는 MIN-F2-4 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPHVRCWDQAGAETGCCTNC(서열 번호: 69)는 MIN-14 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSW(서열 번호: 70)는 MIN-17-1 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTV(서열 번호: 71)는 MIN-17-2 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSW(서열 번호: 72)는 MIN-29 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSW(서열 번호: 73)는 MIN-34 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVGWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTV(서열 번호: 74)는 MIN-42 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DIQMTQPPASLSASVGETVTITCRASGNIHNFLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTV(서열 번호: 75)는 MIN-45 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATYGNYWYF(서열 번호: 76)는 MIN-14 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
QITLKESGPGIVQPSQPFRLTCTFSGFSLSTSGIGVTWIRQPSGKGLEWLATIWWDDDNRYNPSLKSRLTVSKDTS NNQAFLNIITVETADTAIYYCAQSTMVTA(서열 번호: 77)는 MIN-17-2 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEK-FKSKATLTVDKS SSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCATYGNYWYF(서열 번호: 78)는 MIN-17-1 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
DVKLVESGGDLXKLTEGEDIWEGLTLCRDSDQSPLAPVSKPGRVVRPQRSCTVIQGCVLRLQTAHLQVQGVLGIVSGDGESALHSVWIVGATTITINGCDQLQPLLWSLANPRHVIATESESRGCTG(서열 번호: 79)는 MIN-29 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWGGGSTDYNAAFISRLSISKDNS KSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNDYPAWF(서열 번호: 80)는 MIN-34 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLVESGGDLVKPGRSLKLSCAASGFTFSSFGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCSRRFYYDYD(서열 번호: 81)는 MIN-42 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
cgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt(서열 번호: 82)는 MIN-C2 경쇄 CL 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
Ttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccagccagcaggaccgcg(서열 번호: 83)는 MIN-C2 중쇄 CH1 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMSWVMQSHGKSLEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSTTAHIELRSLASEDSAVYYCARKGLYG(서열 번호: 84)는 MIN-45 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 기술한다.
gacatccagatgacccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcagtctcacttgtcgagcaagtcaggacattggtagtagcttaaactggcttcagcaggaaccagatggaactattaaacgcctgatctacgccacatccagtttagattctggtgtccccaaaaggttcagtggcagtaggtctgggtcagattattctctcaccatcagcagccttgagtctgaagattttgtagactattactgtctacaatatgctagttctcctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggc(서열 번호: 85)는 MIN-14 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaa(서열 번호: 86)는 MIN-17-1 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gacattcagatgacccagtctcctgcctcccagtctgcatctctgggagaaagtgtcaccatcacatgcctggcaagtcagaccattggtacatggttagcatggtatcagcagaaaccagggaaatctcctcagctcctgatttatgctgcaaccagcttggcagatggggtcccatcaaggttcagtggtagtggatctggcacaaaattttctttcaagatcagcagcctacaggctgaagattttgtaagttattactgtcaacaactttacagtactccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgta(서열 번호: 87)는 MIN-17-2 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gtgacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctgg(서열 번호: 88)는 MIN-29 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctgg(서열 번호: 89)는 MIN-34 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtaggttggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacaactatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgta(서열 번호: 90)는 MIN-42 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gacatccagatgactcagcctccagcctccctatctgcatctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgagcaagtgggaatattcacaattttttagcatggtatcagcagaaacagggaaaatctcctcagctcctggtctataatgcaaaaaccttagcagatggtgtgccatcaaggttcagtggcagtggatcaggaacacaatattctctcaagatcaacagcctgcagcctgaagattttgggagttattactgtcaacatttttggagtactccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgta(서열 번호: 91)는 MIN-45 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagcaacggtcgtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaacctatggtaactactggtacttc(서열 번호: 92)는 MIN-14 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
caggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattggagagattaatcctagcaacggtcgtactaactacaatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaacctatggtaactactggtacttc(서열 번호: 93)는 MIN-17-1 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
cagattactctgaaagagtctggccctgggatagttcagccatcccagcccttcagacttacttgcactttctctgggttttcactgagcacttctggtataggtgtaacctggattcgtcagccctcagggaaaggtctggagtggctggcaacgatttggtgggatgatgataaccgctacaacccatctctaaagagcaggctcacagtctccaaagacacctccaacaaccaagcattcctgaatatcatcactgtggaaactgcagatactgccatatactactgtgctcagtctactatggttacggcggga(서열 번호: 94)는 MIN-17-2 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
ccaggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagccctcacagagcctgtccatcacctgcacagtctctggtttctcattaactagctatggtgtacactgggttcgccagtctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgatatggggtggtggaagcacagactataatgcagctttcatatccagactgagcatcagcaaggacaattccaagagccaagttttctttaaaatgaacagtctgcaagctaatgacacagccatatattactgtgccagaaatgactatccggcctggttt(서열 번호: 95)는 MIN-34 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gtgaggtgcaactggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggaaggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctttggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttacacctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgttcaagaaggttctactatgattacgac(서열 번호: 96)는 MIN-42 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
gaggttcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcatttactggctactttatgagctgggtgatgcagagccatggaaagagccttgagtggattggacgtattaatccttacaatggtgatactttctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaaatcctctaccacagcccacatagagctccggagcctggcatctgaggactctgcagtctattattgtgcaagaaagggcctctatggg(서열 번호: 97)는 MIN-45 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열을 기술한다.
DIVITQSTASLGVSLGQRATISC(서열 번호: 98)는 MIN-C2 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVITQTTAIMSASPGEEVTLTC(서열 번호: 99)는 MIN-E6 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSTEIMSASPGEKVTITC(서열 번호: 100)는 MIN-A2-1 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTC(서열 번호: 101)는 MIN-A2-2 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQTTAIMSASPGEKVTITC(서열 번호: 102)는 MIN-C9-1 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVITQSTAIMSASPGEKVTITC(서열 번호: 103)는 MIN-C9-2 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVITQTPAIMSASPGEKVTMTC(서열 번호: 104)는 MIN-D7-1 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSTAIMSASPGEKVTMTC(서열 번호: 105)는 MIN-D7-2 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVMTQSPEIMSASPGEKVTITC(서열 번호: 106)는 MIN-F2-1 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVITQSTEIMSASPGEKVTITC(서열 번호: 107)는 MIN-F2-2 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 108)는 MIN-C2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SATSSVSYIH(서열 번호: 109)는 MIN-E6 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSISYIH(서열 번호: 110)는 MIN-A2-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSVSYMH(서열 번호: 112)는 MIN-A2-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSVSYMY(서열 번호: 113)는 MIN-C9-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSVSYTY(서열 번호: 114)는 MIN-C9-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSVSYMH(서열 번호: 115)는 MIN-D7-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSVSYMH(서열 번호: 116)는 MIN-D7-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSISYIH(서열 번호: 117)는 MIN-F2-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SASSSISYIH(서열 번호: 118)는 MIN-F2-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
WYQQRPGQPPKLLIY(서열 번호: 119)는 MIN-C2 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQRPGTSPKLWIY(서열 번호: 120)는 MIN-E6 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIF(서열 번호: 121)는 MIN-A2-1 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIY(서열 번호: 122)는 MIN-A2-2 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIY(서열 번호: 123)는 MIN-C9-1 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIY(서열 번호: 124)는 MIN-C9-2 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIY(서열 번호: 125)는 MIN-D7-1 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIY(서열 번호: 126)는 MIN-D7-2 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIF(서열 번호: 127)는 MIN-F2-1 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WFQQKPGTSPKLWIF(서열 번호: 128)는 MIN-F2-2 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
LASNLES(서열 번호: 129)는 MIN-C2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
STSNLAS(서열 번호: 130)는 MIN-E6 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
GTSNLAS(서열 번호: 131)는 MIN-A2-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
STSNLAS(서열 번호: 132)는 MIN-A2-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
STSNLAS(서열 번호: 133)는 MIN-C9-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
STSNLAS(서열 번호: 134)는 MIN-C9-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
STSNLAS(서열 번호: 135)는 MIN-D7-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
STSNLAS(서열 번호: 136)는 MIN-D7-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
GTSNLAS(서열 번호: 137)는 MIN-F2-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
GTSNLAS(서열 번호: 138)는 MIN-F2-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(서열 번호: 139)는 MIN-C2 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(서열 번호: 140)는 MIN-E6 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYC(서열 번호: 141)는 MIN-A2-1 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GAPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYC(서열 번호: 142)는 MIN-A2-2 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(서열 번호: 143)는 MIN-C9-1 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(서열 번호: 144)는 MIN-C9-2 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYC(서열 번호: 145)는 MIN-D7-1 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMESEDAATYYC(서열 번호: 146)는 MIN-D7-2 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYC(서열 번호: 147)는 MIN-F2-1 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTSYSLTVSRMEAEDTATYYC(서열 번호: 148)는 MIN-F2-2 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QHSRELPFT(서열 번호: 149)는 MIN-C2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSSSPFT(서열 번호: 150)는 MIN-E6 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSNYPFT(서열 번호: 151)는 MIN-A2-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSSYPST(서열 번호: 152)는 MIN-A2-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSSYPST(서열 번호: 153)는 MIN-C9-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSSYPST(서열 번호: 154)는 MIN-C9-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSSYPST(서열 번호: 155)는 MIN-D7-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSSYPST(서열 번호: 156)는 MIN-D7-2 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QQRSNYPFT(서열 번호: 157)는 MIN-F2-1 경쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
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EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(서열 번호: 159)는 MIN-C2 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
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QVQLQQSGPELKQPGETVKISCKASGYTFT(서열 번호: 165)는 MIN-C9-2 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(서열 번호: 166)는 MIN-D7-1 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT(서열 번호: 167)는 MIN-D7-2 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EVKLEESGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(서열 번호: 168)는 MIN-F2-1 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLEQSGAELVRPGASVKLSCKALGYTFT(서열 번호: 169)는 MIN-F2-2 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
RCRLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(서열 번호: 170)는 MIN-F2-3 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFI(서열 번호: 171)는 MIN-F2-4 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
GYAMS(서열 번호: 172)는 MIN-C2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
RYGMS(서열 번호: 173)는 MIN-E6-7 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
RYGMS(서열 번호: 174)는 MIN-E6-8 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 175)는 MIN-A2-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 176)는 MIN-A2-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NNGMN(서열 번호: 177)는 MIN-C9-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NNGMN(서열 번호: 178)는 MIN-C9-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 179)는 MIN-D7-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 180)는 MIN-D7-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 181)는 MIN-F2-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DYEMH(서열 번호: 182)는 MIN-F2-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 183)는 MIN-F2-3 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 184)는 MIN-F2-4 중쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
WVRQTPEKRLEWVA(서열 번호: 185)는 MIN-C2 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVRQTPDKRLEWVA(서열 번호: 186)는 MIN-E6-7 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVRQTPGKRLEWVA(서열 번호: 187)는 MIN-E6-8 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 188)는 MIN-A2-1 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 189)는 MIN-A2-2 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 190)는 MIN-C9-1 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 191)는 MIN-C9-2 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 192)는 MIN-D7-1 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 193)는 MIN-D7-2 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 194)는 MIN-F2-1 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQTPVHGLEWIG(서열 번호: 195)는 MIN-F2-2 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 196)는 MIN-F2-3 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호: 197)는 MIN-F2-4 중쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 198)는 MIN-C2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 199)는 MIN-E6-7 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
TISGGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 200)는 MIN-E6-8 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYAGDFKG(서열 번호: 201)는 MIN-A2-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYAGDFKG(서열 번호: 202)는 MIN-A2-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYADDFKG(서열 번호: 203)는 MIN-C9-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYADDFKG(서열 번호: 204)는 MIN-C9-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYVDDFKG(서열 번호: 205)는 MIN-D7-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYAGDFKG(서열 번호: 206)는 MIN-D7-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYVDDFKG(서열 번호: 207)는 MIN-F2-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
AIHPGSGGTAYNQKFKG(서열 번호: 208)는 MIN-F2-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYVDDFKG(서열 번호: 209)는 MIN-F2-3 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYVDDFKG(서열 번호: 210)는 MIN-F2-4 중쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCAR(서열 번호: 211)는 MIN-C2 중쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR(서열 번호: 212)는 MIN-E6-7 중쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTR(서열 번호: 213)는 MIN-E6-8 중쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
RFAFSLETSASTAYLQINTLKNEDTATYFCAR(서열 번호: 214)는 MIN-A2-1 중쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
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KATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTN(서열 번호: 221)는 MIN-F2-2 중쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
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SGDGYWYYA(서열 번호: 227)는 MIN-A2-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
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TGTTAILNG(서열 번호: 231)는 MIN-D7-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 3(CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
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TGTTAILNG(서열 번호: 233)는 MIN-F2-1 중쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3 ) 아미노산 서열을 기술한다.
YGSFA(서열 번호: 234)는 MIN-F2-2 중쇄 가변 상보성 결정 영역 3(CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
TGTTAILNG(서열 번호: 235)는 MIN-F2-3 중쇄 가변 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
TGTTAILNG(서열 번호: 236)는 MIN-F2-4 중쇄 가변 상보성 결정 영역 3(CDR3) 아미노산 서열을 기술한다.
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC(서열 번호: 237)는 MIN-14 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISY(서열 번호: 238)는 MIN-17-1 경쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
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RASQDIGSSLN(서열 번호: 244)는 MIN-14 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
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RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 247)는 MIN-29 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
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KASQNVGTNVG(서열 번호: 249)는 MIN-42 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
RASGNIHNFLA(서열 번호: 250)는 MIN-45 경쇄 가변 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
WLQQEPDGTIKRLIY(서열 번호: 251)는 MIN-14 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
WNQQKPGQPPRLLIY(서열 번호: 252)는 MIN-17-1 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
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WNQQKPGQPPRLLIY(서열 번호: 254)는 MIN-29 경쇄 가변 골격 영역 2(FWR2) 아미노산 서열을 기술한다.
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LVSNLES(서열 번호: 271)는 MIN-29 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
LVSNLES(서열 번호: 272)는 MIN-34 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
SASYRYS(서열 번호: 273)는 MIN-42 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
NAKTLAD(서열 번호: 274)는 MIN-45 경쇄 가변 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYC(서열 번호: 275)는 MIN-14 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(서열 번호: 276)는 MIN-17-1 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYC(서열 번호: 277)는 MIN-17-2 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(서열 번호: 288)는 MIN-29 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(서열 번호: 289)는 MIN-34 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC(서열 번호: 290)는 MIN-42 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYC(서열 번호: 291)는 MIN-45 경쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT(서열 번호: 292)는 MIN-14 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT(서열 번호: 293)는 MIN-17-1 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
QITLKESGPGIVQPSQPFRLTCTFSGFSLSTS(서열 번호: 294)는 MIN-17-2 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
DVKLVESGGDLXKLTEGEDIWEGLTLCRDSDQSPLAPVSKPGRVVRPQRSCTVIQGCVL(서열 번호: 295)는 MIN-29 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT(서열 번호: 296)는 MIN-34 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLVESGGDLVKPGRSLKLSCAASGFTFS(서열 번호: 298)는 MIN-42 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFT(서열 번호: 299)는 MIN-45 중쇄 가변 골격 영역 1(FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SYWMH(서열 번호: 300)는 MIN-14 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
SYWMH(서열 번호: 301)는 MIN-17-1 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
GIGVT(서열 번호: 302)는 MIN-17-2 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
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GYFMS(서열 번호: 305)는 MIN-45 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1) 아미노산 서열을 기술한다.
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WVMQSHGKSLEWIG(서열 번호: 312)는 MIN-45 중쇄 가변 골격 영역 2 (FWR1) 아미노산 서열을 기술한다.
EINPSNGRTNYNEKFKS(서열 번호: 313)는 MIN-14 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
EINPSNGRTNYNEKFKS(서열 번호: 314)는 MIN-17-1 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
TIWWDDDNRYNPSLKS(서열 번호: 315)는 MIN-17-2 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
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VIWGGGSTDYNAAFIS(서열 번호: 317)는 MIN-34 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
TISSGGTYTYYPDSVKG(서열 번호: 318)는 MIN-42 중쇄 상보성 결정 영역 2(CDR2) 아미노산 서열을 기술한다.
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ATTITINGCDQLQPLLWSLANPRHVIATES(서열 번호: 323)는 MIN-29 중쇄 가변 골격 영역 3(FWR3) 아미노산 서열을 기술한다.
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METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(서열 번호: 328)는 Ig 카파-쇄 리더 서열을 기술한다.
EQKLISEEDL(서열 번호: 329)는 Myc 태그를 기술한다.
NYGMN(서열 번호: 330)는 VH-CS-CDR1.1: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR1 컨센수스 서열을 기술한다.
GYAMS(서열 번호: 331)는 VH-CS-CDR1.2: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR1 컨센수스 서열을 기술한다.
R/GYA/GMS(서열 번호: 332)는 VH-CS-CDR1.3: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR1 컨센수스 서열을 기술한다.
WINTYTGEPTYA/VG/DDFKG(서열 번호: 333)는 VH-CS-CDR2.1: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR2 컨센수스 서열을 기술한다.
TISSGGTYIYYPDSVKG(서열 번호: 334)는 VH-CS-CDR2.2: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR2 컨센수스 서열을 기술한다.
S/TGT/DT/A--Y/FYA(서열 번호: 335)는 VH-CS-CDR3.1: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR3 컨센수스 서열을 기술한다.
TGTTAILNG(서열 번호: 336)는 VH-CS-CDR3.2: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR3 컨센수스 서열을 기술한다.
SGDGYWYYA(서열 번호: 337)는 VH-CS-CDR3.3: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR3 컨센수스 서열을 기술한다.
DNYG--YDYG/A(서열 번호: 338)는 VH-CS-CDR3.4: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 중쇄에 대한 CDR3 컨센수스 서열을 기술한다.
SASSSV/ISYM/IH/Y(서열 번호: 339)는 VL-CS-CDR1.1: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 경쇄에 대한 CDR1 컨센수스 서열을 기술한다.
RASKSVSTSGYSYMH(서열 번호: 340)는 VL-CS-CDR1.2: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 경쇄에 대한 CDR1 컨센수스 서열을 기술한다.
S/GTSNLAS(서열 번호: 341)는 VL-CS-CDR2.1: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 경쇄에 대한 CDR2 컨센수스 서열을 기술한다.
LASNLES(서열 번호: 342)는 VL-CS-CDR2.2: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 경쇄에 대한 CDR2 컨센수스 서열을 기술한다.
QQRSS/NYPS/FT(서열 번호: 343)는 VL-CS-CDR3.1: IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 경쇄에 대한 CDR3 컨센수스 서열을 기술한다.
QHSRELPFT(서열 번호: 344)는 IgG 항-MUC1* 항체에 대한 가변 경쇄에 대한 VL-CS-CDR3.2: CDR3 컨센수스 서열을 기술한다.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열 번호: 345)는 골격 영역 1 인간 IgG1 경쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' gat atc cag atg acc cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc gat agg gtc acc atc acc tgc cgt gcc 3'(서열 번호: 346)는 골격 영역 1 인간 IgG1 경쇄 DNA 서열을 기술한다.
WYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호: 347)는 골격 영역 2 인간 IgG1 경쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gct ccg aaa cta ctg att tac 3'(서열 번호: 348)는 골격 영역 2 인간 IgG1 경쇄 DNA 서열을 기술한다.
GVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열 번호: 349)는 골격 영역 3 인간 IgG1 경쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' gga gtc cct tct cgc ttc tct gga tcc aga tct ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag ccg gaa gac ttc gca atc tat tac 3'(서열 번호: 350)는 골격 영역 3 인간 IgG1 경쇄 DNA 서열을 기술한다.
FGQGTKVEIK(서열 번호: 351)는 골격 영역 4 인간 IgG1 경쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' ttc gga cag ggt acc aag gtg gag atc aaa 3'(서열 번호: 352)는 골격 영역 4 인간 IgG1 경쇄 DNA 서열을 기술한다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(서열 번호: 353)는 골격 영역 1 인간 IgG1 중쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' gag gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca ggg ggc tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct 3'(서열 번호: 354)는 골격 영역 1 인간 IgG1 중쇄 DNA 서열을 기술한다.
WVRQAPGKGLEWVA(서열 번호: 355)는 골격 영역 2 인간 IgG1 중쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' tgg gtg cgt cag gcc ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt gca 3'(서열 번호: 356)는 골격 영역 2 인간 IgG1 중쇄 DNA 서열을 기술한다.
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR(서열 번호: 357)은 골격 영역 3 인간 IgG1 중쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' cgt ttc act ata agc gca gac aca tcc aaa aac aca gcc tac ctg cag atg aac agc ctg cgt gct gag gac act gcc gtc tat tat tgt tct aga 3'(서열 번호: 358)는 골격 영역 3 인간 IgG1 중쇄 DNA 서열을 기술한다.
WGQGTLVTVSS(서열 번호: 359)는 골격 영역 4 인간 IgG1 중쇄 아미노산 서열을 기술한다.
5' tgg ggt caa gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg 3'(서열 번호: 360)는 골격 영역 4 인간 IgG1 중쇄 DNA 서열을 기술한다.
SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSG(서열 번호: 361)는 링커 서열 아미노산을 기술한다.
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFS(서열 번호: 362)는 IGHV3(Igblast로부터 명명): FWR1: MIN-C2의 대한 가변 중쇄 영역에 대해 84.7% 동질성(249/294)을 갖는 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
WVRQAPGKGLEWVS(서열 번호: 363)는 MIN-C2의 가변 중쇄 영역에 대해 84.7% 동질성(249/294)을 갖는 IGHV3(Igblast로부터 명명): FWR2: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV(서열 번호: 364)는 MIN-C2의 가변 중쇄 영역에 대해 84.7% 동질성(249/294)을 갖는 IGHV3(Igblast로부터 명명): FWR3: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC(서열 번호: 365)는 MIN-C2의 가변 경쇄 영역에 대해 76.4% 동질성(226/296)을 갖는 IGkV7(Igblast로부터 명명): FWR1: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
WYQQKPGQPPKLLIY(서열 번호: 366)는 IGkV7(Igblast로부터 명명): MIN-C2의 가변 경쇄 영역에 대해 76.4% 동질성(226/296)을 갖는 FWR2: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYY(서열 번호: 367)는 MIN-C2의 가변 경쇄 영역에 대해 76.4% 동질성(226/296)을 갖는 IGkV7(Igblast로부터 명명): FWR 3: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(서열 번호: 368)는 MIN-E6의 가변 중쇄 영역에 대해 84.1% 동질성(249/296)을 갖는 IGHV3(Igblast로부터 명명): FWR1: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
WVRQAPGKGLEWVS(서열 번호: 369)는 MIN-E6의 가변 중쇄 영역에 대해 84.1% 동질성(249/296)을 갖는 IGHV3(Igblast로부터 명명): FWR2: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열 번호: 370)은 MIN-E6의 가변 중쇄 영역에 대해 84.1% 동질성(249/296)을 갖는 IGHV3(Igblast로부터 명명): FWR3: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC(서열 번호: 371)는 MIN-E6의 가변 중쇄 영역에 대해 69.5% 동질성(187/269)을 갖는 IGkV3(Igblast로 부터 명명): FWR1: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
WFQQRPGTSPK LLIY(서열 번호: 372)는 MIN-E6의 가변 경쇄 영역에 대해 69.5% 동질성(187/269)을 갖는 IGkV3(Igblast로부터 명명): FWR2: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC(서열 번호: 373)는 MIN-E6의 가변 경쇄 영역에 대해 69.5% 동질성(187/269)을 갖는 IGkV3(Igblast로부터 명명): FWR3: 인간 IgG 항체 골격 영역 서열을 기술한다.
모노클로날 항체
클로닝 모노클로날 항체의 클로닝은 다양한 이유로 유용하다. 단일 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 동일하고 동일한 효과를 발휘하는 다수의 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 이는 치료학적 용도로 예정된 항체에 유용하다. 특히 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 모노클로날 항체의 서열을 결정하는 것은, 예를 들면 일본쇄 항체(예를 들면, scFv) 또는 재조합체 1가 항체(예를 들면, Fab)의 생성을 허용할 많은 형태의 단백질 가공이 가능하기 때문에 특히 유리하다. 모노클로날 및 특히 가변 영역의 서열을 결정하는 것은, 중요하게는, 이들이 인간에서 생성됨으로써 숙주 면역계를 보다 잘 피할 수 있기 때문에 인간 치료제에 때때로 바람직한 "인간화된" 또는 부분적으로 인간화된(키메라) 항체의 생성을 가능하게 한다.
본원에 기재된 모노클로날 항체를 생성하고 항체 변이체, 예를 들면, 일본쇄 항체, 양특이적 항체, 재조합체 Fab, 인간화된 및 특히 인간화된 항체 등을 생성하기 위한 많은 방법이 존재한다. 본원에 기술된 방법은 예시적임을 의미하며 본 발명은 본원에 기술된 방법으로 생산된 것들과 동일한 효과를 가질 다른 방법으로 생성된 모노클로날 항체 및 이들 항체의 유도체에 관한 것이다.
모노클로날 항-MUC1* 항체는 하기 기술된 바와 같이 생산하여 스크리닝하였다. 마우스를 MUC1*(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호: 1)) 또는 단일 아미노산 치환을 함유하는 펩타이드 변이체(GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호: 2))의 세포외 도메인에 상응하는 합성 펩타이드로 면역화하였다. 하이브리도마는 당해 분야의 표준 실시방법에 따라 생성하였다. 항-MUC1* 항체를 생산한 개개 하이브리도마는 ELISA 검정에서 MUC1* 펩타이드에 결합하는 이들의 능력으로 확인하였다. 이후에, 앞서의 선택 라운드에서 확인된, 하이브리도마로부터의 상층액을 MUC1*-양성 및 MUC1-음성 세포에 가하고 FACS를 사용하여 생 세포에서 MUC1*를 인지할 수 있는 항체를 분비한 하이브리도마를 확인하였다. 이후에, 대량의 확인된 MUC1* 인지체 항체는 하이브리도마(복수(ascite))를 마우스에게 주사함으로써 수득하거나 표준 방법에 따라 대규모 배양하여 생산하였다. 수득되는 항체를 앞서 기술된 바와 같이 검정하였다. 또한, 항체 클론은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하여 이량체화함으로써 MUC1*-양성 세포의 성장을 자극하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 이후에, MUC1*-양성 세포(다능성 줄기 세포, 암 세포 및 형질감염된 세포)의 성장을 효과적으로 자극한 항체를 생화학적으로 절단하여 MUC1* 이량체화를 차단함으로써 MUC1* 발현 세포의 성장을 억제하는 1가 항체를 생성하였다. 일부 경우에, 항체는 1가 Fab를 생성하기 위해 분해된 파파인(papain)이며, 이는 MUC1*-양성 세포의 성장을 억제하는 이들의 능력에 대해 검정하였다. 일부 경우에, Fab는 공지된 방법에 따라 PEG화하고 페길화가 항체 단편의 안정성을 증가시켰는지를 관측하였다. 선택된 항체의 중쇄 및 경쇄의 서열을 표준 방법으로 수득하고 2가 및 1가 MUC1* 항체, 및 항체 유도체를 제조하기 위한 각종 작제물을 제조하였다.
링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 둘다의 가변 영역을 함유하는 일본쇄 작제물은 1가이므로 MUC1*-매개된 세포 성장의 억제에 유용하다. 불변 영역의 일부는 또한 상보체의 재보충(ADCC)을 촉진하기 위해 혼입될 수 있으며 이러한 작제물을 가공하기 위한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 2가 항체 유도체를 생성하는, 불변 영역의 이량체화를 방지하기 위하여, 시스테인 치환 등과 같은 돌연변이를 혼입시킬 수 있다. 페길화는 1가 항체 단편의 반감기를 연장시키기 위해 일반적으로 사용된 방법이며 본원에 기술된 Fab 및 일본쇄 항체의 안정성을 증가시키기 위해 사용되었다.
본 발명의 항-MUC1* 항체는 일본쇄 가변 단편 항체(sdFv)일 수 있다. 재조합체 시도는 일본쇄 가변 단편 항체(sdFv)의 개발을 가져왔다. 단량체성 scFv는, 분자량이 단지 약 30kDa이며, GlY/Ser이 풍부한 합성 링커에 의해 단일 VL-VH 쌍으로서 각종 시스템내에서 발현된다(참조: Berezov A. et al., 2001, J Med Chem 44:2565]. 세균 또는 진핵 세포에서 발현되는 경우, scFv는 모 항체의 상응하는 영역과 유사한 구조로 폴드된다. 이는 Fab와 비교가능한 친화성을 보유한다는 것이 밝혀졌다(참조: Kortt et al., 1994, Eur J Biochem 221:151). ScFv는 치료제로서의 이의 효능을 향상시키기 위해 인간화 및 융합 단백질의 생산과 같은 각종의 유전적 변형으로 처리될 수 있다.
파아지 디스플레이 방법은 항-MUC1* scFv를 생산하는데 사용될 수 있다. 당해 방법에서, 항체 가변 영역 cDNA의 거대한 레퍼토리는 B 세포로부터 수집되며 VH 및 VL의 조합은 선형 박테리오파아지의 표면에서 scFv의 형태로 발현된다. scFv를 발현하는 파아지는 항원-피복된 플레이트로부터 팬(pan)된다. 항-MUC1* scFv의 친화성은 작제물로부터 CDR을 돌연변이시킨 후 패닝(panning) 과정을 반복하여 증진시킬 수 있다.
본 발명의 항-MUC1* 항체는 Fab, Fab2 양특이적 항체, Fab3 삼특이적 항체, 2가 미니보디, 3가 트리아보디(triabody), 또는 4가 테트라보디(tetrabody)일 수 있다.
1가 항-MUC1* 항체의 용도들 중의 하나는 흔히 MUC1*을 과발현하는 암 세포의 치료용이다. MUC1*을 또한 발현하는 비-암성 세포의 억제를 피하기 위하여, 하이브리드 항체의 하나의 부위는 MUC1*에 결합하여 이를 차단시키는 한편 다른 부위는 다른 종양-특이적이거나 유사한 항원에 결합한, 양특이적 항체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 하나의 부위는 MUC1*을 인지하는 반면, 다른 부위는 HER2, CEA, 트랜스페린, EGFR, TF(조직 인자), DLLs(델타-유사 리간드), DLL-4, 재깅된(jagged), 노치(notch) 수용체 리간드, 노치 수용체의 일부 등에 결합하게 된다. 단량체성 결합을 초과하는 협동적 결합의 증가된 항원항체결합력은 표적화된 종양 세포상에서 항체를 우선적으로 보유하게 된다.
본 발명의 항-MUC1* 항체는 양특이적 항체일 수 있다. 양특이적 항체는 모노클로날 항체, 바람직하게는 이중-표적화 특이성을 갖는 인간 또는 인간화된 항체이다. 양특이적 항체는 상이한 특이성을 갖는 2개 항체의 가변 도메인의 조합으로부터 유래하며; 따라서, 양특이적 항체는 이들의 모 항체의 항원 둘다에 결합할 수 있다. 항-MUC1*의 경우에, 결합 특이성 중의 하나는 MUC1*에 대해서 일 수 있고 다른 것은 다른 단백질 또는 예를 들면, 특정의 기타 세포 표면 단백질에 대해서 일 수 있다. 이들 양특이적 항-MUC1* 항체는 길항제적 또는 효능제적 항체로서 작용할 수 있다.
양특이적 항체를 제조하는 방법은 잘 공지되어 있다[참조: Traunecker et al., EMBO J, 1991, 10:3655; WO 93/08829; Suresh et al., Methods in Enzmology, 1986, 121:210; Milstein and Cuello, 1983, Nature, 305:537]. 요약하면, 바람직한 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 영역에 융합시킨다. 당해 융합체는 면역글로불린 중쇄 불변 영역(힌지, CH2 및 CH3 영역의 부분)을 함유하고 바람직하게는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 함유한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별개의 발현 벡터내로 삽입하여 동시형질감염시킨다.
MUC1*의 경우에, 양특이적 항체는 MUC1* 리간드 결합 부위의 이량체화를 차단함으로써 세포 성장 억제제로서 작용하게 된다. 하나의 가변 영역이 MUC1*에 의해 인지되고 다른 것이 다른 종양-특이적인 항원을 인지한 경우, MUC1*-매개된 성장을 억제하는 원치않는 부작용을 피하게 된다. 양특이적 항체는 항원 둘다를 나타내는 종양 세포에 우선적으로 결합하게 된다. 이러한 시도는 특이성 및 항-종양 효과가 향상된 HER2-HER3 양특이적 항체(참조: Robinson, et al. 2008), 또한 수용체 둘다로부터의 시그날링을 차단하는 EGFR-IGFR 양특이적 항체(참조; Lu, et al. 2004)를 사용하여 성공하였다. 또한, 양특이적 항체의 제2 "암(arm)"은 CD3와 같은, 면역 시스템의 세포를 표적하여, 보충하고 진입시켜 T 세포를 보충(참조: Baeuerle and Reinhardt, 2009, Bortoletto, et al 2002)하거나, 면역 시스템의 세포를 표적하고, 보충하고 확장시켜 호중구, 천연 킬러 세포 또는 기타 단핵세포를 보충할 수 있다(참조: Bruenke, et al. 2005, McCall, et al. 1999). 치료학적 항체의 암 둘다는 탄뎀 scFv 분자 및 유사한 탄뎀 디아바디와 같은 다중 포맷으로 일본쇄로서 나란히 클로닝할 수 있다(참조: Chames and Baty 2009, Holliger P, 1993). 상이한 항체로부터의 Fab 단편은 또한 화학적으로 접합시켜 양특이적 Fab를 형성할 수 있다(참조: Chames and Baty 2009).
역으로, MUC1* -양성 세포의 성장을 향상시키는 것이 바람직한 많은 예가 존재한다. 예를 들면, 다능성 줄기 세포 및 일부 전구 세포는 MUC1*을 발현한다. 2가 MUC1*-항체는 원시 세포에서 MUC1* 수용체를 이량체화하며 세포를 다능성 상태로 유지시키면서 세포 성장을 향상시킨다. 2가 항-MUC1* 항체는 외인적으로 세포에 가해지거나 유전적으로 세포에 가해질 수 있다. 예를 들면, 2가 항-MUC1* 항체를 암호화하는 유전자를 난자 및 정자 융합이 완료되기 전의 시기에서 조차 원시 세포에 가한다. 이 방식으로, 수득되는 줄기 세포 및 이의 전구는 이의 제한되지 않은 증식을 자극하는 리간드를 생산하여 분비할 것이다. 이와는 달리, 항체를 암호화하는 플라스미드를 원시 세포내로 형질감염시켜 MUC1* 수용체 또는 분화 과정에 도입된 구조 줄기 세포를 활성화시킴으로써 다능성을 유지한다.
유사하게, 다능성은 MMP-14 및 TACE와 같은 MUC1 절단 효소를 암호화하는 유전자, 또는 MUC1*의 천연 리간드인 NM23을 암호화하는 유전자와 같은 MUC1*을 통해 시그날링을 향상시키는 것들을 포함하는, 다른 유전자와 함께 또는 단독으로 도입될 수 있는, MUC1*을 암호화하는 유전자의 도입으로 세포내에서 유도된다.
2가 MUC1* 항체 및 항체 유도체는 화학치료요법, 및 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 증식을 향상시키는 것이 바람직한 기타 상태의 영향으로 고생하는 환자에게 투여된다. 이들 예에서, 환자는 전신적으로 또는 국소 주사를 통해 투여받을 수 있다. 다양한 형태의 줄기 세포 이식 치료요법이 MUC1*-자극 항체를 반응계내 주사하여 분화가 발생하기 전에 이식된 세포 집단의 생존성을 확립시키기에 유리할 수 있다.
본 발명의 여전히 다른 측면에서, MUC1* 발현 및 성장 자극 시그날링의 항-세포자멸사 특징을 지시하는 것이 바람직할 수 있는 많은 예가 존재한다. 이러한 예중 하나는 세포 생존을 지지하는 제제가 상태의 최악의 효과를 피할 수 있는 패혈증의 경우이다. 2가 MUC1* 항체 또는 항체 유도체를 사용한 전신계적 치료는 세포 생존을 향상시키며 이를 수행하는데 있어서 적합한 항생제 또는 다른 치유력이 있는 치료제를 투여하거나 효과를 발휘할 시간에 이를 때까지 생명을 위협하는 증상을 조절할 수 있다. 유사하게는, 악성 세균 균주는 살 부위를 황폐화시키고 독성 효과를 통해 대량의 세포 사멸을 유도한다. 여기서 또한, MUC1*-자극 항체를 투여하는 것은 세포를 세포 사멸에 대해 보다 내성으로 되도록 하며 관리인에게 감염을 조절하기 위한 보다 많은 시간을 제공한다. 따라서, MUC1*-자극 항체는 국소적으로 또는 전신계적으로 투여될 수 있다.
다른 상황은 이들 자체를 MUC1*-매개된 성장 자극으로 이끈다. 예를 들면, 종양을 자발적으로 생산하거나 보다 빠르게 성장하는 종양을 생산하는 동물은 유전자삽입 동물을 제조하는 방법을 통해 생성될 수 있으며, 이 경우에, 동물은, 이의 세포가 MUC1* 자극 항체를 제조하여 분비하도록 생성될 수 있다. 이 경우에 MUC1*-자극 항체에 대한 유전자는 조직-특이적인 프로모터의 하부에 위치한다. 예를 들면, 유방암을 자발적으로 생산한 마우스를 생성시키기 위해, MUC1* 항체 리간드에 대한 유전자를 포유동물 특이적인 단백질에 대한 프로모터의 하부에 위치시킬 수 있다. 조직 특이적인 프로모터의 하부에 삽입된 MUC1* 항체에 대한 유전자는 전핵내로 또는 난자 및 정자가 완전히 융합되기 거의 직전에 주사하여 종양을 자발적으로 형성하거나 종양 형성을 향상시키는 유전자삽입 동물, 예를 들면, 마우스 모델을 생성한다. 항체 유전자는 MMP-14, TACE, NM23 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 MUC1* 절단 또는 시그날링을 향상시키는 다른 유전자와는 별도로 또는 이와 함께 주사할 수 있다.
다른 측면에서, MUC1* 항체를 암호화하는 플라스미드를 항체-생산 하이브리도마내로 외인적으로 가하거나 형질감염시켜 세포 성장율을 증가시키고 MUC1*의 자극을 통해 세포 사멸에 대해 세포가 내성이 되도록 함으로써 항체 생산을 증가시킨다. 본 발명의 이러한 측면에서, 항체-생산 세포의 성장은 바람직한 항체인 생성물을 오염시키지 않고 향상된다. 항체-생산 세포는, 혈청 성분이 많은 항체 자체를 함유하기 때문에, 감소된 혈청을 함유하는 배지에서 통상적으로 성장된다. 세포 배양 배지내에서 혈청의 양을 감소시키는 것은 오염을 통해 운반되는 것(carry)을 최소화할 뿐만 아니라 세포 성장 및 바람직한 항체의 전체 수율을 감소시킨다. 외인성 항-MUC1*의 첨가 또는 항-MUC1*를 암호화하는 플라스미드의 형질감염은 세포 성장 및 생존을 증가시키는 반면, 단일의 공지된 항체는 바람직한 항체인 생성물로부터 선택적으로 정제하여 제거할 수 있다.
모노클로날 항체의 서열을 갖는 것은 또한 하나의 부분이 항체로부터 유래하고 다른 부분이 독소, IL-2와 같은 사이토킨 등, 또는 표지로서 작용할 수 있는 GFP(녹색 형광성 단백질)과 같은 단백질로부터 유래할 수 있는 융합 단백질을 제조할 수 있도록 한다. 본 발명의 항체 및 항체 변이체는 표지, 태그, 독소, 방사활성 물질, 표적화 모티프, 리더 서열 펩타이드, 독성 물질, 단백질 또는 펩타이드에 생화학적으로 융합시키거나 이에 융합되도록 유전적으로 가공시킬 수 있다. 유사하게, 비천연 아미노산은 이것이 커플링을 촉진시킬 수 있으며, 시그날링 능력을 가질 수 있고, 재조합체 단백질 프로테아제가 민감성 또는 비민감성이 되도록 할 수 있는 재조합체 항체 또는 항체 유도체로 혼입될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 항-MUC1* 항체 및 항체 변이체중 일부 또는 모두의 인간화 또는 부분적 인간화를 제공한다. 모노클로날 항체를 클로닝하고 특히 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 이들의 서열을 결정하는 것은 인간화된 항체 및 부분적으로 인간화된(키메라) 항체의 생성을 가능하도록 한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 인간화된 항체는 인간 면역계에 의한 검출을 보다 잘 피할 수 있기 때문에 인간화된 항체 및 키메라 항체는 보다 적은 부작용 및 보다 높은 효능으로 특징화된다 (Lonberg 2005).
당해 분야의 숙련가가 익숙한 바와 같이, 인간화된 항체를 생성하는 일반적인 방법은 문헌(참조: Muzard, et al. 2009)에 기술된 바와 같은 인간 서열에 대해 골격 영역(FWR)과 같은 비-인지 부위에서 비-인간 서열을 교환하는 것을 포함한다. 유사하게, 비-인간 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역(CDR)과 같은 인지 영역은 인간 항체의 CDR로 교환된다(참조: Carter P, et al. Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy Proc. Natl Acad. Sci 89:4285-4289). 서열 번호: 345 내지 360에 나열된 것들과 같은 인간 골격 영역은 본원에 기재된 모노클로날 서열에서 마우스 FWR로 교환될 수 있다. 인간 항체 서열에 대한 데이타베이스의 조사를 또한 사용하여 비-인간 공급원으로부터 바람직한 모노클로날 항체에 대해 상동인 인간 항체를 확인한다. 예를 들면, 서열 362 내지 367의 아미노산 서열은 MIN-C2에 고도로 상동성인 인간 항체로부터의 골격 영역(FWR)이다. 이들 서열 또는 서열들은 MIN-C2(서열 번호: 331, 334, 374, 340, 342, 및 344)의 CDR과 함께 사용될 수 있다.
다른 예에서, 서열 번호: 368 내지 373로 나타낸 아미노산 서열은 MIN-E6에 대해 고도로 상동성인 인간 항체로부터의 골격 영역(FWR)이다. 이들 서열은 MIN-E6의 CDR(서열 번호: 332, 334, 338, 339, 341, 및 343)과 함께 사용될 수 있다. 이들 아미노산 서열을 암호화하는 핵산은 키메라, 부분적으로 인간화된 항체 및 항체 변이체와 같이 유전적으로 가공하기 위해 사용될 수 있다.
쥐 골격 영역을 키메라 항체 작제물을 제조하기 위해 선택된 인간 골격 영역으로 치환하기 위해, 합성 DNA, 및 오우버랩 PCR로 생산된 DNA의 조합을 사용한다. 인간화된 MIN-C2을 작제하기 위해, 서열 번호: 362, 363 및 364의 아미노산 서열을 암호화하는 인간 골격 영역 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 서열 번호: 159, 185 및 211을 지닌 쥐 중쇄 골격 영역 각각을 치환한다. 또한, 서열 번호: 365, 366 및 367의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 서열 번호: 98, 119 및 139 각각을 지닌 MIN-C2 경쇄 골격 영역을 치환하기 위해 사용한다. 인간화된 MIN-E6을 작제하기 위해, 서열 번호: 368, 369 및 370의 아미노산 서열을 암호화하는 인간 골격 영역 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 서열 번호: 160, 186 및 212를 지닌 중쇄 골격 영역 각각을 치환한다. 또한, 서열 번호: 371, 372 및 373의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 서열 번호: 99, 120 및 140을 지닌 MIN-E6 경쇄 골격 영역을 각각 치환하기 위해 사용한다. scFab, 재조합체 Fab, 양특이적 재조합체 항체 및 scFv를 포함하나, 이에 한정되지 않는 많은 설계의 작제물을 이러한 방법을 사용하여 생성시킨다.
본원에 기술된 항-MUC1* 항체 및 항체 변이체는 이러한 방식으로 인간화시킬 수 있다. 인간화 방법에 이어서, 항체 친화성은 파아지 디스플레이 방법을 사용함을 포함하는 다수의 방법으로 개선시킬 수 있다. 항체 및 항체 변이체를 인간화시킨 후, 일부는 친화성을 상실할 것이며 "친화성 성숙"의 과정을 필요로 할 것이다. 하나의 방법은 돌연변이유발에 이어 이들의 인지체 항원에 대한 향상된 친화성을 나타내는 것들을 선택함으로써 달성된 분자 진화를 포함한다(참조: Razai, et al. 2005). 이와는 달리, 인간화된 항체 또는 항체 단편을 재조합체 라이브러리로부터 분리할 수 있다(참조: Nahary and Benhar, 2009, Rothe C, et al.). 완전히 인간화된 항체를 수득하는 다른 방법은 가공된 유전자삽입 마우스를 면역화시켜 인간 항체를 생산하는 것이다(참조: Jakobovitz, et al. 2007, Lonberg, 2005). 본 발명은 시험관내 및 생체내 및 치료학적 용도를 위한 PSMGFR 서열(서열 번호: 1)에 결합하는 항체를 생성하기 위해 MUC1*를 인지하는 항체 영역(CDR)의 서열과 함께 이들 방법들 중 일부 또는 모두의 사용을 예측하고 있다.
라자이(Razai) 등은, 분자 진화로도 공지된, 친화성 성숙 후, 60개의 총 CDR 잔기중 5개가 돌연변이되었으며, 이는 CDR 돌연변이유발의 약 8% 비율에 상응함을 보고하고 있다. 이는, 친화성 성숙 후 약 92%의 CDR 영역이 변화되지 않고 남음을 의미한다. 다른 이들은 친화성 성숙 후 유사한 비율의 변화를 보고하여 왔다[참조: Juarez-Gonzalez, et al 2005; and Finlay, et al (2009)].
본원에 기재된 신규 항체 및 항체 변이체 중 어느 것의 생산은 이. 콜라이(E. coli)와 같은 세균에서 세균 벡터(참조: Zheng, et al.2009)를 사용하고, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모 세포에서 효모 벡터(참조: Schoonooghe, et al. 2009)를 사용하며, S2 세포와 같은 곤충 세포에서 곤충 벡터(참조: Johannson, et al.)를 사용하고, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유동물 세포에서 포유동물 벡터(참조: Majors, et al. 2009)를 사용하는 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 상이한 유기체로부터의 광범위한 세포 속에서 수행할 수 있다. 항체 합성에 유용한 벡터 및 세포는 다수이며 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 항체 및 항체 변이체는 숙주 동물에 의해 생산된다. 예를 들면, 예정된 항체를 제조하여 이를 이들의 우유(참조: Zhang, et al. 2009) 또는 기타 체액에 분비하는 유전자삽입 동물을 제조할 수 있다. 신규하고 유용한 항체 및 항체 유도체를 개발하기 위한 단백질 가공 방법을 조작하기 위한 다른 시나리오는 본원에 기재된 모노클로날 항체의 서열을 사용하여 달성할 수 있다.
본 발명은 MUC1*에 대한 모노클로날 항체를 제공할 수 있다.
본 발명은 하기 본원에 제공된 상세한 설명, 및 단지 예시의 방법으로만 제공되어 본 발명을 제한하지 않는 첨부된 도면으로부터 보다 완벽히 이해될 것이며, 여기서;
도 1은, 선택된 하이브리도마 클론의 상층액이 면역화 펩타이드(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호: 1)에 특이적으로 결합함을 표준 ELISA로 나타낸다.
도 2는 세포 표면에서 MUC1*에 대한 MIN-C2 항체의 특이적인 결합을 나타내며: MIN-C2 하이브리도마 클론으로부터의 정제된 항체는 1:100으로 희석된 후 생 세포의 표면에 대한 결합에 대해 시험되었다. 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)는, MIN-C2가 MUC1-음성 세포인, 엠티 벡터(empty vector)(HCT-VEC8)로 형질감염된 HCT-116 세포에 결합하지 않지만, MUC1*(HCT-MUC1*-10: GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호: 1)로만 이루어진 세포외 도메인)으로 형질감염된 HCT-116 세포에 결합함을 나타낸다. MIN-C2는 MUC1-양성 유방암 세포 ZR-75-1에 유사하게 결합하였다.
도 3은 세포 표면에서 MUC1*에 대한 MIN-E6 항체의 특이적인 결합을 나타낸다: MIN-E6 하이브리도마 클론으로부터의 상층액을 생 세포의 표면에 대한 결합에 대해 시험하였다. 형광성 활성화된 세포 분류(FACS)는, MIN-E6가 MUC1-음성 세포인, 엠티 벡터(HCT-VEC8)로 형질감염된 HCT-116 세포에는 결합하지 않지만, MUC1*(HCT-MUC1*-10: GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열 번호: 1)로만 이루어진 세포외 도메인)으로 형질감염된 HCT-116 세포에 결합함을 나타낸다. MIN-E6은 MUC1-양성 유방암 세포 ZR-75-1에 유사하게 결합하였다.
도 4는 MIN-C2 모노클로날 항체에 의한 세포 증식의 자극을 나타낸다: 세포-계 검정에서, 모노클로날 항체 MIN-C2는 서열 번호: 1 또는 2의 펩타이드를 면역화시켜 생성된 폴리클로날 항체와 필수적으로 동일한 기능을 하는 것으로 나타났다. MUC1-양성 유방암 세포주 T47D의 성장은, 정제된 MIN-C2를 검정 개시시에 세포 배양물에 가한 후 다시 48시간 후에 가하는 경우, 농도 의존적인 방식으로 자극되었다. 벨-형 곡선(bell-shaped curve)은 수용체의 리간드-유도된 이량체화의 특징이며, 극단적으로, 항체는 각각의 2개 수용체를 이량체화하는 하나의 항체보다는 각각의 수용체에 결합한다.
도 5는 MIN-E6 모노클로날 항체에 의한 세포 증식의 자극을 나타낸다: 세포-계 검정에서, 모노클로날 항-MUC1* 항체 MIN-E6은 서열 번호: 1 또는 2의 펩타이드를 면역화시켜 생성된 폴리클로날 항체와 필수적으로 동일하게 작용하는 것으로 밝혀졌다. MUC1-양성 유방암 세포주 T47D의 성장은, 정제된 MIN-E6을 검정 개시시에 세포 배양물에 가한 후, 다시 48시간 후에 가하는 경우 농도 의존적 방식으로 자극되었다. 벨-형 곡선은 수용체의 리간드-유도된 이량체와의 특징이며, 극단적으로, 항체는 각각의 2개 수용체를 이량체화하는 하나의 항체보다는 각각의 수용체에 결합한다.
도 6은 MINC-2 및 MIN-E6 항체로부터 파파인 (papain) 분해에 의한 Fab 단편의 제조를 나타낸다. 분해된 항체는 4 내지 20%의 비-환원 SDS-PAGE상에서 수행하였다. 분해물은 MIN-C2 및 MIN-E6 둘다로부터 예측된 크기(~50kD)의 Fab를 생성하였다(레인 2 및 4).
도 7A 및 7B는 A의 Fab 단편을 나타낸다. MIN-C2 및 B. MIN-E6 모노클로날 항체는 표적 펩타이드에 대한 결합에 대해 전체 항원과 경쟁한다: ELISA 경쟁 검정에서, MUC1*(서열 번호: 1)의 세포외 도메인의 서열에 상응하는 합성 펩타이드를 플레이트상에 흡착시킨 후, 완전한 모노클로날 모 항체에 의해 결합된다. MUC1* 펩타이드에 대한 결합에 대해 모 항체와 경쟁시키기 위해 파파인 분해에 의해 생산된 Fab의 능력을 시험하기 위하여, 변화하는 농도의 Fab를 가하였다. 세척 단계 후에, ELISA를 표준 방법으로 진행시켰다. 그래프는, Fab가 인지체 펩타이드에 대한 결합에 대해 모 항체와 경쟁함을 나타낸다.
도 8은 MIN-C2 Fab에 의한 MUC1-양성 암 세포 증식의 억제를 나타낸다: MUC1 양성 유방암 세포주 T47D의 증식을 억제하기 위한 MIN-C2, 즉, MIN-C2 Fab의 1가 형태의 능력을 시험하였다. 이 시험은 3% 혈청 함유 배지에서 성장시킨 세포를 사용하여 96시간의 기간에 걸쳐 수행하였고; Fab를 시험 개시시 및 다시 48시간 후에 가하였다. 세포를 혈구계산기로 계수하였다.
도 9는 MIN-E6 Fab에 의한 MUC1-양성 암 세포 증식의 억제를 나타낸다: MUC1 양성 유방암 세포주 T47D의 증식을 억제하는 1가 형태의 MIN-E6, 즉, MIN-E6 Fab의 능력을 시험하였다. 이 시험은 3% 혈청 함유 배지에서 성장시킨 세포를 사용하여 96 시간의 기간에 걸쳐 수행하고; Fab를 시험 개시시 및 다시 48시간 후에 가하였다. 세포를 혈구계산기로 계수하였다. PEG화된(MIN-E6 PEG) 및 PEG화되지 않은 형태의 Fab를 시험하였다. MIN-E6 PEG는, 아마도 반감기 증가로 인한 활성의 증가를 나타내었다.
도 10A 내지 10D는 재조합체 항체 변이체의 개략도를 나타낸다. A)는 링커에 의해 연결된, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 포함하는 일본쇄 가변 영역(scFv) 항체 단편을 나타내고; B)는 가변 도메인 외에, 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 일본쇄 Fab(scFab)를 나타낸다. 중쇄 및 경쇄는 링커에 의해 연결되어 있다; C)는 일본쇄 Fab(scFab)를 나타내며, 여기서, 중쇄 및 경쇄는 링커에 의해 연결되지 않는다. 중쇄 및 경쇄는 일반적으로 동일한 세포내에서 별도로 발현된다. 중쇄 및 경쇄는 자발적으로 관련되거나 시스테인이 도입되어 해리를 촉진할 수 있다; D)는 가변 도메인을 포함하는 양특이적 일본쇄 항체 변이체(bscFv)를 나타낸다. 나타낸 bscFv는 MUC1* 및 HER2 수용체를 인지한다.
도 11은 항-MUC1* IgG 모노클로날 항체 경쇄 가변 영역 서열을 나타낸다.
도 12는 항- MUC1* IgG 모노클로날 항체 중쇄 가변 영역 서열을 나타낸다.
도 13은 항-MUC1* IgM 모노클로날 항체 경쇄 가변 영역 서열을 나타낸다.
도 14는 항-MUC1* IgM 모노클로날 항체 중쇄 가변 영역 서열을 나타낸다.
도 15는 MIN-C2(가변성 일본쇄 단편) 설계(가변성 중쇄-링커-가변성 경쇄)를 나타낸다. scFv 작제물을 세균에서 발현시키고 C-말단 폴리-히스티딘 (HHHHHH) 태그를 사용하여 정제하였다.
도 16은 가변성 MIN-E6 scFv(가변성 일본쇄 단편) 중쇄 가변 설계 (MIN-E6 VH7)-링커-가변성 경쇄)의 아미노산 서열을 나타낸다. scFv 작제물은 세균에서 발현시켜 C-말단 폴리-히스티딘 (HHHHHH) 태그를 사용하여 정제하였다.
도 17은 세균에서 발현된 후 NTA-Ni++ 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 된 MIN-C2 scFv의 정제를 확인하는 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 18A 및 18B는 특이적 결합이 10배 이상까지 개선된 친화성 정제되고 리폴딩된 MIN-C2 scFv를 나타낸다: 리폴딩된 MIN-C2 scFv는 비-변성 조건하에서, MUC1* 세포외 도메인 펩타이드(서열 번호: 1)를 지닌 컬럼 위에서 유동시킴으로써 친화성 정제시켰다. MIN-C2 scFv는 ELISA 플레이트 상에 흡착된 서열 번호: 1의 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 항원 친화성 크로마토그래피에 의해 리폴딩된 단백질의 정제 전 및 후 둘다에 대해 ELISA로 시험하였다. 친화성 정제된 단백질은 대략 10배 더 높은 특이적 활성을 갖는다.
도 19는, MIN-C2 scFv가 살아있는 세포에서 MUC1*를 인지함을 나타낸다 (FACS): MIN-C2 scFv, 및 Alexa 488[제조원: 퀴아젠(Qiagen)]에 접합된 제2 항체 Anti-Penta-His를 MUC1-양성 유방암 세포(ZR-75-1/1500)와 함께 항온처리하여 FACS로 분석하였다. MUC1-음성 대조군 세포, HCT-116-VEC8 세포는 MIN-C2 scFv로 염색하지 않았다.
도 20은 MIN-C2 scFv로 친화성에 의해 정제된 표적 펩타이드 암 세포 성장의 억제를 나타낸다: MUC1-양성 유방암 세포주 ZR-75-1(aka 1500) 및 MUC1-음성 HCT-116 결장 암 세포주를 MUC1*의 세포외 도메인에 상응하는 펩타이드를 지닌 컬럼 위에서 친화성 정제된 다양한 농도의 MIN-C2 scFv로 처리하였다. 이 시험은 3% 혈청 함유 배지에서 96시간의 기간에 걸쳐 수행하였다. scFv는 2회 가하였다.
도 21A 내지 21B는 2 조각의 MIN-C2 Fab 작제물 및 발현 단백질을 나타낸다: MIN-C2 중쇄 및 경쇄 영역을 별도로 세균 발현 벡터내에 클로닝하였다. A. 세포 RNA로부터의 MIN-C2 중쇄 및 카파 쇄의 PCR 생성물; 및 B. MIN-C2 Fab 중쇄의 세균 단백질 발현.
도 22는 효율적인 분리를 위해 Ig 카파-쇄 리더 서열(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(서열 번호: 328))과 융합시킨 상기 MIN-C2 Fab 폴리펩타이드의 N-말단을 나타낸다. 이러한 C-말단은 myc 태그(EQKLISEEDL(서열 번호: 329)) 및 폴리히스티딘(HHHHHH) 태그와 융합시켜 정제를 촉진하였다. 이렇게 조립된 MIN-C2 FAb를 고-카피 에피소옴 복제(high-copy episomal replication)를 허용하는 벡터, pCEP4[제조원: 인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아 칼스바드 소재]를 사용하여 포유동물 세포내에서 발현시켰다.
도 23은 정확한 MIN-C2 scFab(일본쇄 Fab) DNA 조립에 상응하는 분자량 밴드를 지닌 DNA 겔을 나타낸다.
도 24는 인간 배아 줄기 세포의 다능성 성장을 자극하기 위한 마우스 모노클로날 MIN-C2에 대한 항-MUC1* 토끼 폴리클로날 항체의 비교를 나타낸다; 형광성은 세포의 다능성을 나타낸다. 시험은, 모노클로날 MIN-C2 및 폴리클로날 항체 둘다가 다능성 줄기 세포 성장을 자극한다는 점에서 모노클로날 MIN-C2가 폴리클로날 항체와 유사하게 작용함을 나타낸다.
본 발명을 본원에 기재된 구체적인 양태에 의해 이의 영역으로 한정해서는 안된다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에 본 발명의 각종 변형이 앞서의 기술 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야의 숙련가에게 익숙해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 영역내에 있는 것으로 의도된다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하는 방식이 아닌, 예시하기 위한 방식으로 제공된다.
실시예
실시예 1-항-MUC1* 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체를 당해 분야의 숙련가에게 익숙한, 표준 하이브리도마 생성 및 후속된 스크리닝을 사용하여 MUC1* 펩타이드에 대해 생성하였다. MUC1* 펩타이드(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA, 서열 번호: 1) 또는 단일 아미노산 치환을 지닌 펩타이드 변이체(GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA, 서열 번호: 2)를 카복시-말단에서 추가의 시스테인 잔기를 사용하여 합성함으로써 KLH에 대해 접합시켰다. 접합된 펩타이드를 사용하여 마우스를 면역화시켰다. 융합된 세포를 함유하는 웰로부터의 상층액을 ELISA에 의해 MUC1* 펩타이드의 인지를 위해 스크리닝하였다. 이들 중에서, 몇가지 클론을 ELISA 결합 검정에서 MUC1* 펩타이드를 인지하는 이들의 능력에 대한 이들의 고 역가를 기준으로 선택하였다. 6개의 하이브리도마 클론으로부터의 상층액의 이러한 결합 결과는 도 1에 나타낸다. 이후에, 클론을 접촉하지 않은 세포상에서 MUC1*에 대해 결합하는 이들의 능력에 대해 FACS(형광성 활성화된 세포 분류)에 의해 시험하였다(도 2 및 3). 이들 중 가장 우수한 것을 하이브리도마로 유지시키고 서열분석하였다. 2개의 클론, MIN-C2 및 MIN-E6이 플라스미드를 암호화하는 MUC1*으로 형질감염된 MUC1 발현 유방암 세포주(ZR-75-1) 및 HCT-116 결장 암종 세포의 세포 표면에서 MUC1*에 대한 이들의 결합을 기준으로 특히 바람직하였다. 이러한 하이브리도마 생성 방법을 1회 이상 반복하여, 또한 PSMGFR 서열(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA, 서열 번호: 1)로 필수적으로 이루어진 MGFR로 명명되는 MUC1*의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 몇개의 모노클로날 항체, IgG 및 IgM을 생산한다. 선택된 모노클로날 항-MUC1* 항체의 가변 영역의 서열은 도 11 내지 14에 나타낸다.
실시예 2-세포 표면에서 MUC1*에 대한 항-MUC1* 모노클로날 항체의 결합의 분석
세포 표면에서 MUC1*의 인지를 FACS를 사용한 세포의 표면 염색으로 분석하였다. MIN-C2 항체의 경우 50μl의 정제된 항체 10㎍/ml 용액을 엠티 벡터(HCT116-VEC8)로 형질감염시키거나 MUC1* 발현 벡터(HCT-MUC1*-10)로 형질감염시킨 MUC1-음성 HCT116 세포, 및 MUC1 양성 ZR-75-1 세포에 4℃에서 30분 동안 개별적으로 결합시켰다. 세포를 2회 세척하고, 10㎍/ml의 항-마우스-PE로 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 세포를 2회 세척하고, PBS중 2% 포름알데하이드 속에 고정시키고 BD FACS 칸톨 유동 세포계산기를 사용하여 분석하였다(도 2). MIN-E6 하이브리도마로부터의 50μl의 희석되지 않은 상층액을 정제된 항체대신 사용하였다는 차이점 외에는 유사한 과정을 MIN-E6 항체에 대해 수행하였다(도 3).
실시예 3 - MUC1 발현 유방암 세포주의 증식을 유도하는 항-MUC1* 모노클로날 항체(2가) MIN-C2 및 MIN-E6
항-MUC1* 모노클로날 항체의 능력을 측정하기 위해서, MUC1 발현 유방암 세포주 T47D를 사용하였다. 7,500개 세포를 10% 혈청을 함유하는 배지 속에서 96 웰 플레이트의 웰당 플레이팅하였다. 1일 경과 후 3개 웰내 세포를 트립신처리하고, 배지 속에 재현탁시키고 혈구세포계산기를 사용하여 계수함으로써 0일째 수를 수득하였다. 세포내 배지를 3% FBS를 함유하는 것으로 교환하고 항-MUC1* 항체를 다양한 농도로 가하였다. 48시간 후 배지를 항체의 두번째 첨가 후 교환하였다. 다른 48시간 후 세포를 계수하고 세포 성장의 자극을 추정하였다(도 4 및 5).
실시예 4 - Fab 단편 생성 및 PEG화
MUC1* 항체의 1가 Fab 단편을 제조하기 위해, 파파인 분해 방법을 사용하였다[제조원: 피어스(Pierce)]. MIN-C2 및 MIN-E6 항체를 파파인으로 효과적으로 분해하고 단백질 A-아가로즈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다(도 6).
이들 Fab 단편을 경쟁적 ELISA 검정에서 이들의 모 mAb와 함께 시험하여 Fab 단편이 이의 항원, MUC1* 펩타이드에 결합할 수 있는지를 확인하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 생성된 Fab 단편은 이들의 모 mAb와 효과적으로 경쟁하였다. Fab를 또한 제조업자의 프로토콜(제조원: 피어스)에 따라 TMS(PEG) 시약으로 PEG화하였다. 페길화된 Fab는 세포-계 성장 억제 검정에서 PEG화되지 않은 Fab에 대해 비교가능하게 작동하였다.
실시예 5 - MUC1*을 과발현하는 세포의 증식 억제용의 1가 MIN-C2 및 MIN-E6 Fab 단편의 효과에 대한 시험
MUC1* 발현 유방암 세포주 T47D을 96 웰 플레이트(5,000 세포/웰) 속에 완전 배지(10% FBS을 함유하는 RPMI) 속에 플레이팅하여 밤새 부착하도록 하였다. 다음날 배지를 3% FBS를 함유하는 것으로 교환하였다. 3개 웰내 세포를 트립신처리 및 혈구세포계산기를 사용한 재현탁 후 계수하여 0일째 수를 수득하였다. 다음에, MIN-C2 또는 MIN-E6 Fab 단백질을 다양한 농도로 개개 플레이트에 가하였다. 48시간 후, 배지를 교체하고, Fab 단백질을 두번째로 가하였다. 추가로 48시간 후, 웰내 세포를 계수하였다. 세포 성장의 억제를 Fab 단백질을 함유하지 않는 세포의 성장에 대해 계산하였다. MIN-E6의 경우에 단백질의 PEG화 형태를 또한 시험하고(도 8, 도 9 ) PEG화되지 않는 Fab에 대해 비교가능하게 작용함을 입증하였다.
실시예 6 - 폴리펩타이드 링커를 사용하는 일본쇄 Fv 단편으로서 MUC1* 결합 폴리펩타이드의 작제 및 발현
MIN-C2의 scFv 단편(아미노산 1110 내지 1155로부터의 MUC1의 45개 아미노산 막 근접 세포외 영역을 인지하는 모노클로날 항체: PSMGFR)를 설계하고, 작제하여 이. 콜라이내에서 발현하였다. 작제물은 6개의 히스티딘 잔기를 함유하는 카복시-말단 태그가 있는 단백질을 생성하는 벡터 pET21b[제조원: 노바겐(Novagen)]을 사용하여 어떠한 분비 시그날 없이 설계하였다. MIN-C2 및 MIN-E6 scFv의 작제물의 설계는 도 10A 및 도 15 및 16에 나타낸다. 카보시-말단 히스티딘 태그는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 통한 scFv 단백질의 정제를 허용한다(도 17).
모노클로날 항체를 서열분석하기 위해, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제안한 바와 같이 G418을 함유하는 RPMI 배지 속에서 성장시켰다. 이후에, 총 RNA를 트리졸 시약을 사용하여 제조하고 이의 제1 가닥 cDNA를 SuperScript III 제1 가닥 cDNA 합성 키트[제조원: 인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아 소재]를 사용하여 생성시켰다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 클로닝하기 위해, 변성 프라이머를 문헌(참조: Wang et al., 2000)에 따라 사용하였다. 중쇄 클로닝을 위해, PCR을 서열 번호: 3 내지 5(역방향)과 서열 번호: 6 또는 서열 번호: 7(정방향)을 사용하여 설정하였다. 카파 쇄의 경우, 서열 번호: 8(역방향)과 서열 번호: 9(정방향)를 사용하였다. 모든 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 역방향 클로닝 목적을 위해 중쇄의 경우 EcoRI 및 HindIII 제한 부위 및 카파 쇄의 경우 SacI 및 SalII 부위를 함유한다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 1분, 45℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 30주기, 및 72℃에서 10분. 이후에, PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔에서 수행하고 중쇄 및 경쇄의 경우 크기가 ~500bp인 주요 PCR 밴드를 검출하였다.
생성물을 아가로즈 겔로부터 정제하고 상응하는 효소로 제한 분해한 후 서열분석과 단순한 세균 발현용 이의 완전한 길이의 발현을 입증하기 위해 pET21b 세균 발현 벡터내로 클로닝하였다.
플라스미드 DNA를 서열분석하였다. 바람직한 모노클로날 항체 MIN-C2에 대한 가변 영역(CDR: 상보성 결정 영역)용 DNA 및 아미노산 서열은 가변 중쇄, VH의 경우 서열 번호: 10 및 11에, 가변 경쇄 또는 카파 쇄, VL의 경우 서열 번호: 12 및 13에 제공한다. MIN-C2의 중쇄 및 경쇄 둘다의 불변 영역의 DNA 및 아미노산 서열을 측정하여 서열 번호: 49 및 50에 나타낸다. 안정성 및 결합 친화성이 보다 큰 재조합체 항체 단편은 당해 불변 영역을 설계내로 포함시킴으로써 생성한다. 재조합체 Fab는 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역 및 불변 영역(CH1 및 CL)으로 구성된다.
다른 바람직한 모노클로날 항체 MIN-E6에 대한 DNA 및 아미노산 서열을 유사하게 결정하여 중쇄의 경우 서열 번호: 19 내지 22에 및 경쇄 또는 카파 쇄의 경우 서열 번호: 23 및 24에 제공한다. 다른 모노클로날 항-MUC1* 항체의 서열은 도 11 내지 14에 나타낸다. 예를 들면, IgG 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 서열 번호: 59 내지 68에 나타내고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 51 내지 58에 나타낸다. IgM 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 서열 번호: 76 내지 81 및 서열 번호: 84에 나타내고; 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 69 내지 75에 나타낸다.
모노클로날 항체의 가변 영역으로 필수적으로 포함되는 일본쇄 항체 단편 (scFv)을 생성하기 위해, 15개 아미노산(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3을 갖는 링커 서열(서열 번호: 14)을 표준 PCR을 사용하여 중쇄 및 카파 가변 서열내에 도입하였다. MIN-C2 및 MIN-E6의 scFv를 생성하였다. 최종의 중쇄-링커-카파 작제물을 생성하는 MIN-C2 scFv의 서열은 (서열 번호: 15 및 17)로서 나타낸다. 카복실-말단 시스테인을 갖는 MIN-C2 scFv의 변이체를 또한 생성하였다: MIN-C2 scFv-Cys(서열 번호: 16 및 18).
모노클로날 항체 MIN-E6의 일본쇄 항체 단편(scFv) 및 scFv-Cys 변이체를 유사하게 생성하였다. 수득되는 MIN-E6 scFv 및 MIN-E6 scFv-Cys의 DNA 및 아미노산 서열은 서열 번호: 25 및 27 및 서열 번호: 26 및 28(Cys)로 나타낸다. 링커에 의해 결합된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 함유하는 조립된 DNA를 제한 효소로 분해하고 pET-21b 세균 발현 벡터내로 클로닝하여 세균 배양물을 형질전환시키는데 사용하였다.
다음에, 세균 배양을 IPTG(이소프로필 티오 갈락토시드)를 1 mM의 농도로 가하고 도입을 8시간 동안 진행시켜 도입하였다. 시험은, scFv 단백질 모두가 봉입체내에 국재화되었음을 나타내었다. MIN-C2, MIN-E6-7 단백질에 대한 scFv는 이. 콜라이 봉입체 분획을 8M 우레아를 사용한 가용화에 이어 표준 공정에 따라 수행된 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용출된 단백질의 SDS-PAGE 분석은 예측된 크기가 약 28 kDa인 단일 종(대략 95% 순도)을 나타내었다. 용출된 단백질의 농도는 흡광도를 280nm에서 측정함으로써 결정하였다. 이 단백질을 결합 완충액(0.02 M 트리스.HCl pH 8.0, 0.5M NaCl, 8M 우레아, 5mM 이미다졸)을 사용하여 150㎍/ml로 희석시켰다. 당해 단백질에 GSH 및 GSSG를 각각 5mM 및 0.5 mM의 최종 농도로 가하고 16시간 동안 4℃에서 교반하였다. 이후에, 용출된 단백질을 리폴딩 과정에 적용시켰다. 리폴딩은 단백질을 투석 막내로 이전시키고 완충액(0.05 M 트리스.HCl pH 8.0, 0.4 M L-아르기닌)을 함유하는 0.4 M L-아르기닌에 대해 투석함으로써 수행하였다. 최종적인 투석은 50 mM pH 8.0 및 5% 글리세롤 속에서 수행하였다. 단백질을 투석 막으로부터 제거하고 회전시켜 침전물을 제거하고 10,000 MW 컷오프(cutoff) 막[제조원: 아미콘 울트라(Amicon Ultra), 밀리포어 소재]을 사용한 원심분리 여과를 사용하여 농축시켰다. 단백질중 일부를 친화성 정제 컬럼으로 추가로 정제하였다. MIN-C2의 재조합체 scFv를 발현시키고, 정제하고(도 17) 리폴딩시켰다. 도 18(A)는 ELISA내에서, MIN-C2 scFv가 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드(PSMGFR)에 특이적으로 결합함을 나타낸다. 리폴딩 후, 일부 MIN-C2 scFv를 비-변성 완충액 속에서 표적 펩타이드 친화성 정제하고, scFv를 PSMGFR 펩타이드 컬럼 위에 유동시켰다. 용출된 MIN-C2 scFv는 특이적인 활성을 나타내었다(도 18B).
실시예 7 - MUC1* 펩타이드를 표적화하기 위한 scFv의 결합 및 모 MIN-C2 항체와 경쟁하기 위한 이의 능력
MUC1* 펩타이드를 밤새 항온처리하여 96 웰 ELISA 플레이트의 웰에 결합시켰다. 이는 슈퍼블록(제조원: 피어스)을 사용하여 차단시키고 또한 밤새 항온처리함으로써 수행하였다. 다음에 슈퍼블록을 제거하고 웰을 3% FBS를 함유하는 DMEM 배지로 30분 동안 차단하였다. scFv 단백질을 50㎍/ml의 최대 농도를 사용하여 8개의 일련 희석을 사용하는 다양한 농도로 가하였다. scFv 단백질의 비 특이적인 결합을 결정하기 위하여, 단백질을 결합된 MUC1* 펩타이드를 함유하지 않는 다른 웰의 세트에 동일한 희석으로 가하였다. 배양을 1시간 동안 계속하였다. 다음에, 웰을 0.3 ml PBST(0.02% 트윈 20을 함유하는 포스페이트 완충된 염수)로 3회 세척하였다. 이어서 여기에 3% FBS를 함유하는 DMEM의 100배 희석으로 제조한 배지 속에 1:40,000의 희석으로 토끼 항-His 항체(AbCam)를 첨가하였다. 이를 1시간 동안 항온처리한 다음, 0.3ml pf PBST로 3회 세척하였다. 다음에, 0.1ml의 기질 테트라 메틸 벤지딘을 웰에 가하고 암실에서 색이 15분 동안 발색되도록 한 후, 0.1ml의 2N HCl을 가하였다. 이들 시험은, 재조합체 scFv가 PSMGFR(MUC1* 세포외 도메인) 펩타이드에 대한 결합에 대해 완전한 모 항체와 효과적으로 경쟁함을 확인하였다.
실시예 8 - 유방암 세포를 발현하는 MUC1에 대한 MIN-C2 scFv의 세포 표면 결합
유방암 세포주 ZR-75-1를 사용하여 세포 표면에서 MUC1*를 인지하기 위한 MIN-C2 scFv의 능력을 시험하였다. 세포를 1:2 또는 1:10 희석의 1.5㎍/ml scFv 스톡 또는 대조군으로 어떠한 scFv 단백질의 부재하에 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 2회 세척한 후, 세포를 1:200, 1:50 또는 1:10의 희석에서 Alexa 488[제조원: 퀴아겐(Qiagen)]에 접합된 제2 항체 항-펜타-His와 함께 항온처리하여 scFv상에서 6X 히스티딘 태그를 검출하였다. 유동 세포계산 분석은 세포 소세트의 농도-의존적인 이동을 나타내었으며 이는 MIN-C2 scFv의 부재하에서 관측되지 않는 특이적인 결합을 나타낸다(도 19).
실시예 9 - MUC1*을 과발현하는 암 세포의 증식에 있어서 MIN-C2 scFv 단백질의 효과에 대한 시험
MUC1* 수용체는 이의 활성화된 리간드에 의해 이량체화되는 경우 세포 성장을 자극하므로, 단량체 항체 및 항체 단편은 MUC1*-양성 세포의 성장을 억제하는 것으로 예측된다. MUC1* 발현 유방암 세포주 ZR- 75-1(aka 1500)을 96웰 플레이트(10,000 세포/웰)에 완전 배지(10% FBS를 함유하는 RPMI) 속에서 플레이팅하고 밤새 부착되도록 하였다. 다음날, 배지를 3% FBs를 함유하는 것으로 교환하였다. 대조군으로서 다른 세포주 HCT116, MUC1*을 발현하지 않는 것으로부터 유래한 결장 암종을 완전 배지(10% FBS를 함유하는 DMEM) 속에서 플레이팅(2,000 세포/웰)하여, 밤새 부착하도록 하고 배지를 3% FBS를 함유하는 것으로 교환하였다. 각각의 세포주에 대해, 3개 웰내 세포를 트립신처리한 후 계수하고 혈구세포계산기를 사용하여 재현탁시켜 0일 째 수를 수득하였다. 다음에, MIN-C2 scFv 항체 변이체를 각종 농도에서 가하였다. 48시간 후, 배지를 교체하고 scFv 단백질을 두번째로 가하였다. 추가로 48시간 후, 모든 웰내 세포를 계수하였다. 세포 성장의 억제는 scFv 단백질을 함유하지 않는 세포의 성장과 비교하여 계산하였다. scFv 단백질은 MUC1* 발현 ZR-75-1 세포의 성장을 억제한 반면, 이들은 MUC1*을 발현하지 않는 대조군 세포주 HCT 116에서 억제 효과를 가지지 않았음이 관측되었다 (도 20).
실시예 10 - 재조합체 Fab 항체의 작제 및 발현
재조합체 Fab를 또한 생성하였다. 일부 상황에서, Fab가 scFv 설계보다 바람직하다. scFv와 비교하여, 재조합체 Fab는 혈청 속에서 보다 긴 반감기를 가지며 이의 결합 친화성은 일반적으로 전체 모 항체의 것과 비교가능하다. 포유동물 시스템내에서 발현은 적절히 폴딩된 단백질의 양에 있어서의 증가를 통해 활성을 향상시킨다. 포유동물 세포로부터 생산된 항체 변이체는 대규모로 생산된다. 포유동물 발현을 위한 재조합체 항체를 생산하기 위해, 가변 영역 및 불변 영역을 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포로부터 클로닝하였다. 재조합체 Fab는 다수의 항체 설계를 사용하여 생산하였다. 이들은 필수적으로 VH, VL, CH 및 CL 영역을 포함한다. 일부 경우에, 링커를 사용하여 중쇄를 경쇄에 결합시킨다. 다른 경우에, 중쇄 및 경쇄는 별도의 벡터상에 수반되며 이들이 작용성 Fab의 형태로 자가 연합하는 동일한 세포내에서 발현된다. 설계 둘다의 Fab를 제조하였다.
모노클로날 MUC1* 항체를 생산하는 하이브리도마 세포(MIN-C2 및 MIN-E6 클론)을 표준 실시에 따라 G418을 함유하는 RPMI 배지 속에서 성장시켰다. 이후에, 총 RNA를 트리졸 시약을 사용하여 제조하고 제1 가닥 cDNA를 SuperScript III 제1 가닥 cDNA 합성 키트(제조원: 인비트로겐, 캘리포니아 소재)를 사용하여 생성하였다. 이의 자체 분비 시그날 서열을 함유하는 중쇄 및 경쇄를 클로닝하기 위해, 변성 PCR 프라이머를 문헌(참조: Morrison, 2002; Kettleborough, 1993)에 따라 사용하였다. 중쇄 클로닝을 위해, PCR을 서열 번호: 33, 34, 35, 또는 36(정방향)과 서열 번호: 37(역방향)을 사용하여 설정하였다. 카파 쇄의 경우, 서열 번호: 38, 39, 40, 41, 42 또는 43(정방향)과 서열 번호: 44(역방향)을 사용하였다. 모든 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 하부 클로닝 목적으로 각각 EcoRI 및 XhoI 제한 부위를 함유한다. 사용된 PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 60초, 55℃에서 60초, 72℃에서 60초로 30 주기, 및 72℃에서 10분. 이후에, PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔상에서 수행하여 어떠한 프라이머가 목적한 생성물을 생성하는지를 측정하였다. 도 21(A)는, 정확한 MIN-C2 중쇄(주요 PCR 밴드 ~800bp)가 서열 번호: 34 및 37의 프라이머를 사용한 경우 생산되었음을 나타낸다. 적절한 MIN-C2 경쇄는 서열 번호: 38 및 44의 프라이머를 사용하여 생성시켰다.
생성물을 아가로즈 겔로부터 정제하고 상응하는 효소를 사용하여 제한 분해한 후 서열 분석 및 단순 세균 발현용 pET21b 세균 발현 벡터내로 클로닝하여 이의 완전한 길이의 발현을 입증하였다. 플라스미드 DNA를 서열분석하여 본 발명자들이 생성한 MIN-C2 scFv 변이체의 것과 동일함을 발견하였으며, 이는 상이한 프라이머 및 상이한 효소적 분해를 수행하는 경우에서도, 수득되는 변이체는 모 모노클로날 항체로부터 동일한 가변 영역을 지님을 확인하는 것이다. 재조합체 MIN-C2 Fab에 대한 중쇄(서열 번호: 45 및 47) 및 경쇄(서열 번호: 46 및 48) 서열을 제공한다.
세균내 개개의 Fab 작제물의 발현을 시험하였다. pET21b-중쇄 또는 -경쇄를 지닌 BL21 형질전환체를 카베나실린(100㎍/ml)를 함유하는 5ml의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 이후에, 50ml의 카베나실린(100㎍/ml)을 함유하는 LB 배지에 세균 배양물(2.5ml)를 밤새 접종하고 이의 OD600nm가 0.5에 이를 때까지 30℃에서 항온처리하였다. 배양물의 나머지를 회전시키고 동결시켰다. IPTG를 50ml의 배양물에 1mM의 최종 농도로 가하였다. 배양물을 추가로 5시간 동안 항온처리한 후 펠렛화하였다. 이후에, 세균 펠렛(IPTG 도입 전 및 후)을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 상에서 분석하였다. 중쇄 또는 경쇄 삽입체에 상응하는 주요 ~25KDa 밴드가 생산되었으며, 이는, 이들 중쇄 및 경쇄가 적절히 발현되었음을 제안한다[도 21 (B)].
위에서 기술한 바와 같이 생성된 재조합체 Fab는 완전한 모 항체로부터 효소적으로 분해된 Fab와 필수적으로 동일하게 작용한다.
포유동물 재조합체 단백질 발현을 위해, 이들 중쇄 및 경쇄 삽입체를 포유동물 발현 벡터, pOptiVec 및 pcDNA3.3내로 TOPO 클로닝 키트(제조원: 인비트로겐, 캘리포니아 소재)를 사용하여 클로닝하였다.
실시예 11 - 재조합체 항-MUC1* 일본쇄 Fab(scFab)의 생성
리폴딩의 효능을 추가로 증가시키고 궁극적으로 항체 변이체의 특이적인 항체를 증가시키기 위해, 일본쇄 Fabs(scFab)를 생성하였다. 항-MUC1* 항체 MIN-C2 및 MIN-E6에 상응하는 재조합체 일본쇄 Fab 작제물을 도 10B 및 도 22에 나타낸 설계를 사용하여 생성한다. N-말단에서 개시하여, scFab 작제물은 경쇄(VL)의 가변 영역, 경쇄의 불변 영역(CL), 34개 아미노산 유연성 링커, 중쇄(VH)의 가변 영역 및 중쇄의 불변 영역의 CH1 부분을 포함한다. 중쇄 및 경쇄를 다음 서열: SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSG(서열 번호: 361)을 갖는 유연성 링커로 연결한다. mRNA를 사용한 역 전사 PCR을 수행함으로써 수득된, 경쇄(VL + CL) 및 중쇄 단편 (VH + CH1)을 특이적인 프라이머를 사용하여 특수 하이브리도마 클론으로부터 분리하였다.
경쇄, 중쇄 단편 및 링커의 정확한 조립 후에, DNA를 골격내에서 포유동물 발현 벡터(psecTag, 제조원: 인비트로겐, 캘리포니아 칼스바드 소재)내로 클로닝하였다. 이는 골격내로 N-말단 Ig-k 리더 서열 및 C-말단 myc 및 폴리히스티딘 태그의 첨가로 정제를 용이하게 한다. 당해 작제물로부터 Ig-k 리더 서열 및 정제 태그를 포함하는 DNA 단편을 PCR을 통해 및 적절한 제한 부위를 사용하여 플라스미드 DNA의 고-카피 복제를 허용하며 고 발현 CMV 프로모터를 사용하는 다른 발현 벡터 pCEP4 내로 서브클로닝한다. 이렇게 생성된 작제물을 포유동물 세포내에서 일시적인 발현에 사용한다. 당해 목적을 위해 현탁액 배양물(제조원: 인비트로겐, 캘리포니아 칼스바드 소재) 속에서 성장시키도록 조절된 인간 배아 신장 세포(HEK-293)를 사용하여 분비된 Fab를 항-myc 태그 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제한다. 도 23은 MIN-C2 서열을 사용한 당해 작제물의 완전한 조립을 나타낸다.
실시예 12 - 인간화된 항-MUC1* 항체 또는 키메라(골격 영역은 인간이고 CDR은 인간이 아님) 항-MUC1* 항체의 생성
본 발명의 항-MUC1* 모노클로날 항체는 인간화된 모노클로날 항체 또는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 전체 항원성 쥐 mAb는, 쥐 항체의 소 부분이 면역글로불린 분자의 단지 Fc 부분이 인간인 키메라 항체 또는 면역글로불린의 단지 상보성 결정 영역(CDR)이 쥐이고 분자의 90 내지 95%가 인간인 인간화된 항체를 창조하는 인간 면역글로불린 분자 상으로 이식한다. 하나의 측면에서, 완전한 인간 모노클로날 항체는 HuMAb-마우스[제조원: 젠팜-메다렉스(GenPharm-Medarex)] 또는 XenoMouse [제조원: 아브게닉스, 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)] 기술과 같은 통상적인 방법을 사용함으로써 유전자삽입 마우스내에서 생성시킬 수 있다. 인간화된 항체는, 수용체의 CDR로부터의 잔기가 바람직한 특이성, 친화성 및 생물학적 작용을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종의 CDR로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린을 포함한다.
인간 항체는 또한 파아지 디스플레이 라이브러리(참조: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 1991, 227:381, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222:581)와 같은 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 서열 또는 CDR로 치환시킴으로써 문헌[참조: Winter et al. as disclosed in Jones et al., Nature, 1986, 321:522; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323; 및 Verhoeyen et al., Science, 1988, 239:1534]의 방법에 따라 수행할 수 있다. 이러한 인간화된 항체는 키메라 항체(참조: 미국 특허 제4,816,567호)이다. 전형적으로, 인간화된 항체는, CDR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 항체이다.
비-인간 종으로부터 유래한 치료학적 항체는 일부 경우에, 인간에게 주사하는 경우 면역 반응을 개시함으로써 이들의 유용성을 제한할 수 있다. 따라서, 인간에서 치료학적 용도를 위한 항체의 인간화 또는 부분적 인간화가 바람직하다. 인간화되거나 또는 부분적으로 인간화된 항체 및 항체 변이체를 생성하는 많은 방법이 존재한다. 본 발명은 본 발명의 조성물을 인간화하기에 적합한 이들 방법중 어느 것의 용도에 관한 것이다. 하나의 방법에서, 인간 항체 유전자위치를 갖는 마우스를 사용하여 완전히 인간화된 항체를 생성한다(참조: Jakobovits et al.). 다른 방법에서, 인간으로부터의 B 세포로부터의 DNA를 선택된 표적에 대한 결합에 대해 선택한 후 완전한 항체의 구조(context)내로 재-삽입한다.
일반적인 방법에서, 비-인간 숙주에서 생성된 항체의 골격 영역을 인간 골격 영역으로 교환하여 원래의 CDR 서열을 보존한다. 이들은 키메라 항체라 명명한다. 당해 방법에서, 단지 6개의 상보성 결정 영역(CDR) 중 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 형성하는 3개가 보유되고 골격 영역의 서열은 밀접하게 관련된 인간 항체로부터의 것으로 치환된다(참조: Muzard et al., 2009에 기술된 방법). 첫째로, 상동성 조사를 수행하여 단백질 데이타 뱅크에 등록된 인간 항체 서열의 레퍼토리에 대해 항-MUC1* 항체(MIN-C2 또는 MIN-E6)의 VH 및 VL 아미노산 서열을 독립적으로 정렬한다. 항-MUC1* VH 및 VL과 가장 잘 일치하는 상이한 인간 항체로부터 유래한 가변 영역 중에서, 항-MUC1* VH 및 VL 서열에 대해 최대의 조합된 상동성을 갖는 특수 항체 서열을 선택한다. 이는 천연 항체에 존재하는 도메인내 접촉을 방지하기 위해 필수적이다. 임의로, 단지 골격 영역에 걸쳐 계산하는 경우 65 내지 70% 범위의 서열 동질성이 바람직하다. DNA 및 PCR의 화학적 합성의 조합을 사용하여, 인간화된 항-MUC1* scFv를 작제하며, 여기서, 골격 영역 서열은 인간 항체로부터의 것들로 교환된다. 수득되는 DNA 단편은 발현 벡터내로 삽입하여 발현, 및 리폴딩시 결합 친화성에 대해 시험한다.
친화성은 항-MUC1* scFv의 인간화된 VL 및 VH 서열에 대해 동일한 인간 항체로부터의 불변 영역(CL 및 CH1) 서열을 가하여 시험함으로써 개선시킨다. 수득되는 키메라 중쇄 및 경쇄는 34개 아미노산 유연성 링커 SGGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGSG(서열 번호: 361)를 통해 연결시켜 일본쇄 인간화된 항-MUC1* scFab를 생산한다. 조립된 DNA 분자는 N-말단에서 IG-k 시그날 서열의 골격내 첨가 및 C-말단에서 myc 및 폴리히스티딘의 골격내 첨가 후 고-카피 복제 및 고 발현 포유동물 발현 벡터 pCEP4(제조원: 인비트로겐, 캘리포니아 칼스바드 소재)내로 클로닝한다. 이렇게 생성된 작제물을 현탁액 배양 속에서 성장하도록 조절한 인간 배아 신장 세포(HEK-293)(제조원: 인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드 소재)와 같은 포유동물 세포내에서의 발현을 위해 사용한다. 이후에, 분비된 Fab를 예를 들면, 항-myc 태크 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제한다.
친화성을 추가로 개선시키기 위해, 원래의 비-인간 모노클로날 항체 또는 키메라 항체 변이체의 실리코 3D 구조를 단백질 구조 데이타 베이스내에 이용가능한 인간 항체의 많은 3D 구조와 비교한다. 이후에, 골격 영역내 추가의 변이를 도입시켜 인간 항체와 보다 근접하게 유사한 키메라 변이체를 제조한다.
친화성 증가는 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된 파아지 디스플레이 방법(참조: Finlay et al 2009)을 사용하여 달성할 수 있다.
실시예 13 - 다능성 줄기 세포의 성장을 자극하기 위한 서열번호: 1을 사용하여 생성된 토끼 폴리클로날 항체와 모노클로날 마우스 항체 MIN-C2의 비교
토끼 폴리클로날 항-MUC1* 항체(서열 번호: 1의 펩타이드를 사용한 면역화로 생성됨)를 bFGF 또는 공급자 세포 추출물의 부재하에서 이들의 다능성을 유지하면서 줄기 세포를 성장시킬 수 있는 이들의 능력에 대해 모노클로날 항-MUC1* 항체 MIN-C2와 비교하였으며; 이는 필수적으로 PSMGFR 서열(서열 번호: 1)을 포함하는 MUC1*의 세포외 도메인을 이량체화함으로써 달성한다.
인간 배아 줄기 세포를 마트리겔(matrigel)-유사 기질상에서 성장시키고 a) 단독; b) 30% 섬유모세포 조건화된 배지와 4 ng/ml bFGF(당해 분야의 기술 상태 참조); c) 50 ng/ml 폴리클로날 항-MUC1* 항체; 또는 d) 50ng/ml 모노클로날 항-MUC1* MIN-C2가 들어있는 최소 줄기 세포 배지 속에서 배양하였다. 수득되는 세포의 다능성을 콜로니 형태학 및 OCT4의 이들의 지속된 발현을 기준으로 평가하였다. 다능성 줄기 세포 콜로니는 심지어 잘-정의된 가장자리를 갖는 별개의 편평하고 둥근 콜로니로 성장하지만 분화되는 것들은 해진 가장자리를 가지며 수직으로 성장하기 시작한다. 다능성 줄기 세포는 이들의 핵내에서 OCT4를 발현한다. OCT4 발현을 상실한 세포는 분화 과정으로 도입된다. OCT4 프로모터없이 GFP(녹색 형광성 단백질)를 발현하도록 가공된 배아 줄기 세포를 사용함으로써, 다능성 줄기 세포, 즉, OCT4-양성 세포는 형광성 녹색일 수 있으므로 분화를 개시한 것들과는 용이하게 구별할 수 있다.
도 24는, 최소 배지 단독(A)의 최소 배지, 또는 당해 분야의 프토토콜의 기술 상태에 따른 최소 배지, 즉, 공급자 세포(B)로부터의 bFGF 및 조건화된 배지에서 성장시킨 줄기 세포를 해진 가장자리와 비-환형 패턴을 갖는 콜로니로 성장시킨다. 추가로, 형광 사진(우측 패널)은, 줄기 세포의 거의 절반이 분화되어 더 이상 OCT4 또는 GFP를 발현하지 않음을 나타낸다. 패널 C 및 D는, 폴리클로날 항-MUC1* 또는 모노클로날 항-MUC1* MIN-C2가 다능성 줄기 세포 형태학의 특징인 잘-정의된 가장자리를 갖는 잘 형성된, 편평하고 둥근 콜로니로 성장하였음을 나타낸다. 상응하는 형광성 상(우측 패널)은, GFP, 및 연장, OCT4 발현에 의해 입증되는 바와 같이 사실상 모든 줄기 세포가 다능성으로 잔류함을 나타낸다. 폴리클로날 및 모노클로날 MIN-C2의 효능은 필수적으로 동일하다.
본원에 인용된 참조문헌 모두는 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
당해 분야의 숙련가는 더 이상의 통상의 시험을 사용하지 않고도 본원에 상세하게 기술된 본 발명의 구체적인 양태에 대한 많은 균등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 특허청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
<110> MINERVA BIOTECHNOLOGIES CORPORATION <120> MUC1* Antibodies <130> IPA110263 <150> 61/103,204 <151> 2008-10-06 <160> 374 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> membrane proximal extracellular region of MUC1 from amino acid 1110 to 1155 <400> 1 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val 20 25 30 Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala 35 40 45 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant of membrane proximal extracellular region of MUC1 from amino acid 1110 to 1155 <400> 2 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val 20 25 30 Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala 35 40 45 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIII restriction site <400> 3 ggaaagctta tagacagatg 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chain complementarity determining region 2 (CDR2) amino acid sequence <400> 314 Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 315 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-17-2 heavy chain complementarity determining region 2 (CDR2) amino acid sequence <400> 315 Thr Ile Trp Trp Asp Asp Asp Asn Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 316 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-29 heavy chain complementarity determining region 2 (CDR2) amino acid sequence <400> 316 Gly Ile Val Ser Gly Asp Gly Glu Ser Ala Leu His Ser Val Trp Ile 1 5 10 15 Val Gly <210> 317 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-34 heavy chain complementarity determining region 2 (CDR2) amino acid sequence <400> 317 Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser 1 5 10 15 <210> 318 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-42 heavy chain complementarity determining region 2 (CDR2) amino acid sequence <400> 318 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 319 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-45 heavy chain complementarity determining region 2 (CDR2) amino acid sequence <400> 319 Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 320 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-14 heavy chain variable framework region 3 (FWR3) amino acid sequence <400> 320 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr 20 25 30 <210> 321 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-17-1 heavy chain variable framework region 3 (FWR3) amino acid sequence <400> 321 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr 20 25 30 <210> 322 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-17-2 heavy chain variable framework region 3 (FWR3) amino acid sequence <400> 322 Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala Phe Leu Asn 1 5 10 15 Ile Ile Thr Val Glu Thr Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln 20 25 30 <210> 323 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-29 heavy chain variable framework region 3 (FWR3) amino acid sequence <400> 323 Ala Thr Thr Ile Thr Ile Asn Gly Cys Asp Gln Leu Gln Pro Leu Leu 1 5 10 15 Trp Ser Leu Ala Asn Pro Arg His Val Ile Ala Thr Glu Ser 20 25 30 <210> 324 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-34 heavy chain variable framework region 3 (FWR3) amino acid sequence <400> 324 Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 325 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-42 heavy chain variable framework region 3 (FWR3) amino acid sequence <400> 325 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ser Arg 20 25 30 <210> 326 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-45 heavy chain variable framework region 3 (FWR3) amino acid sequence <400> 326 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala His Ile Glu 1 5 10 15 Leu Arg Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 327 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-C2 single chain Fab (light chain-linker-heavy chain; VL + CL + linker + VH + CH1) amino acid sequence <400> 327 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Ala Ser Leu Gly Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu 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Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 348 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 2 Human IgG1 Light Chain DNA SEQ <400> 348 tggtatcaac agaaaccagg aaaagctccg aaactactga tttac 45 <210> 349 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 3 Human IgG1 Light Chain Amino Acid SEQ <400> 349 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 350 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 3 Human IgG1 Light Chain DNA SEQ <400> 350 ggagtccctt ctcgcttctc tggatccaga tctgggacgg atttcactct gaccatcagc 60 agtctgcagc cggaagactt cgcaatctat tac 93 <210> 351 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 4 Human IgG1 Light Chain Amino Acid SEQ <400> 351 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 352 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 4 Human IgG1 Light Chain DNA SEQ <400> 352 ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa 30 <210> 353 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 1 Human IgG1 Heavy Chain Amino Acid SEQ <400> 353 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 354 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 1 Human IgG1 Heavy Chain DNA SEQ <400> 354 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 60 tcctgtgcag cttct 75 <210> 355 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 2 Human IgG1 Heavy Chain Amino Acid SEQ <400> 355 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 356 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 2 Human IgG1 Heavy Chain DNA SEQ <400> 356 tgggtgcgtc aggccccggg taagggcctg gaatgggttg ca 42 <210> 357 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 3 Human IgG1 Heavy Chain Amino Acid SEQ <400> 357 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 20 25 30 <210> 358 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 3 Human IgG1 Heavy Chain DNA SEQ <400> 358 cgtttcacta taagcgcaga cacatccaaa aacacagcct acctgcagat gaacagcctg 60 cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt tctaga 96 <210> 359 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 4 Human IgG1 Heavy Chain Amino Acid SEQ <400> 359 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 360 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Framework Region 4 Human IgG1 Heavy DNA SEQ <400> 360 tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc tcg 33 <210> 361 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence amino acid <400> 361 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly <210> 362 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 84.7% homology (249/294) to variable heavy chain region of MIN-C2 <400> 362 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 363 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 84.7% homology (249/294) to variable heavy chain region of MIN-C2 <400> 363 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 364 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 84.7% homology (249/294) to variable heavy chain region of MIN-C2 <400> 364 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 20 25 <210> 365 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGkV7 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 76.4% homology (226/296) to variable light chain region of MIN-C2 <400> 365 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys 20 <210> 366 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGkV7 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 76.4% homology (226/296) to variable light chain region of MIN-C2 <400> 366 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 367 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGkV7 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 76.4% homology (226/296) to variable light chain region of MIN-C2 <400> 367 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr 20 25 30 <210> 368 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 84.1% homology (249/296) to variable heavy chain region of MIN-E6 <400> 368 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 369 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 84.1% homology (249/296) to variable heavy chain region of MIN-E6 <400> 369 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 370 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGHV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 84.1% homology (249/296) to variable heavy chain region of MIN-E6 <400> 370 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 371 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGkV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 69.5% homology (187/269) to variable light chain region of MIN-E6 <400> 371 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 372 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGkV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 69.5% homology (187/269) to variable light chain region of MIN-E6 <400> 372 Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 373 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGkV3 (name from Igblast): Human IgG antibody framework region sequence with 69.5% homology (187/269) to variable light chain region of MIN-E6 <400> 373 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 374 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MIN-C2 variable heavy chain region CDR3 <400> 374 Leu Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Glu Tyr 1 5

Claims (50)

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  2. 삭제
  3. 면역글로불린-유사 VH 도메인이 면역글로불린-유사 VL 도메인에 연결되어 있고, 여기서, 상기 VH 쇄 및 상기 VL 쇄가 펩타이드 링커를 통해 N-말단으로부터 VL-펩타이드 링커-VH 순으로 연결되어 있는, MUC1*에 대해 특이적인 scFv 융합 단백질로서,
    상기 VH 쇄는 (i) CDR1 영역내, 서열 번호: 330, 서열 번호: 331 또는 서열 번호: 332에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내, 서열 번호: 333 또는 서열 번호: 334에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내, 서열 번호: 335, 서열 번호: 336, 서열 번호: 337 또는 서열 번호: 338에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고,
    상기 VL 쇄는 (i) CDR1 영역내, 서열 번호: 339 또는 서열 번호: 340에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내, 서열 번호: 341 또는 서열 번호: 342에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내, 서열 번호: 343 또는 서열 번호: 344에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 scFv 융합 단백질은 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 것인 scFv 융합 단백질.
  5. 서열번호: 1인 MUC1*의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 1가, 2가 또는 다가의 분리된 모노클로날 항체로서, 상기 항체는 (i) CDR1 영역내, 서열 번호: 330, 서열 번호: 331 또는 서열 번호: 332에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내, 서열 번호: 333 또는 서열 번호: 334에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내, 서열 번호: 335, 서열 번호: 336, 서열 번호: 337 또는 서열 번호: 338에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역내 아미노산 서열; 및
    (i) CDR1 영역내, 서열 번호: 339 또는 서열 번호: 340에 대해 적어도 90% 동일한 서열; (ii) CDR2 영역내, 서열 번호: 341 또는 서열 번호: 342에 대해 적어도 90% 동일한 서열; 및 (iii) CDR3 영역내, 서열 번호: 343 또는 서열 번호: 344에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 카파 쇄 가변 영역내 아미노산을 갖는 모노클로날 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 중쇄 가변 영역내에 서열 번호: 172 내지 184로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 중쇄 가변 영역내에 서열 번호: 198 내지 210으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  9. 삭제
  10. 제5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 중쇄 가변 영역내에 서열 번호: 224 내지 236 중에서 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  11. 삭제
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  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 카파 쇄 가변 영역내에 서열 번호: 108 내지 110 및 서열 번호: 112 내지 118 중에서 선택된 CDR1 영역내 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  17. 삭제
  18. 제5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 카파 쇄 가변 영역내에 서열 번호: 129 내지 138 중에서 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  19. 삭제
  20. 제5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 카파 쇄 가변 영역내에 서열 번호: 149 내지 158 중에서의 서열에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역내에 서열 번호: 331에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 334에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 374에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열, 및
    경쇄 가변 영역내에 서열 번호: 340에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 342에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 344에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  27. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역내에 서열 번호: 332에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 334에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 338에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열, 및
    경쇄 가변 영역내에에 서열 번호: 339에 대해 적어도 90% 동일한 CDR1 영역, 서열 번호: 341에 대해 적어도 90% 동일한 CDR2 영역, 및 서열 번호: 343에 대해 적어도 90% 동일한 CDR3 영역내의 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체.
  28. 제5항에 있어서, 인간 중쇄내, 서열 번호: 353에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 355에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 357에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 359에 대해 90% 동일한 FWR4 서열, 및
    인간 경쇄내, 서열 번호: 345에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 347에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 349에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 351에 대해 적어도 90% 동일한 FWR4 서열을 포함하는 인간 FWR 서열을 포함하는, 모노클로날 항체.
  29. 제5항에 있어서, 인간 중쇄내, 서열 번호: 362에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 363에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 364에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 및
    인간 경쇄내, 서열 번호: 365에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 366에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 367에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열을 포함하는, 인간 FWR 서열을 포함하는 모노클로날 항체.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 제26항에 있어서, 인간 중쇄내, 서열 번호: 353에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 355에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 357에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 359에 대해 적어도 90% 동일한 FWR4 서열, 및
    인간 경쇄내, 서열 번호: 345에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 347에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 서열 번호: 349에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 또는 서열 번호: 351에 대해 적어도 90% 동일한 FWR4 서열을 포함하는, 인간 FWR 서열을 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  33. 삭제
  34. 제27항에 있어서, 인간 중쇄내, 서열 번호: 362에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 363에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 364에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 및
    인간 경쇄내, 서열 번호: 365에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 366에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 367에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열을 포함하는 인간 FWR 서열을 추가로 포함하는, 모노클로날 항체.
  35. 삭제
  36. 제5항에 있어서, 인간 중쇄내, 서열 번호: 368에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 369에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 370에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 및
    인간 경쇄내, 서열 번호: 371에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 372에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 373에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열을 포함하는, 인간 FWR 서열을 포함하는 모노클로날 항체.
  37. 제27항에 있어서, 인간 중쇄내, 서열 번호: 368에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 369에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 370에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열, 및
    인간 경쇄내, 서열 번호: 371에 대해 적어도 90% 동일한 FWR1 서열, 서열 번호: 372에 대해 적어도 90% 동일한 FWR2 서열, 또는 서열 번호: 373에 대해 적어도 90% 동일한 FWR3 서열을 포함하는, 인간 FWR 서열을 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  38. 제5항에 있어서, 인간화된 모노클로날 항체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항체의 골격 영역이 공지된 인간 모노클로날 항체.
  40. 제5항에 따른 모노클로날 항체를 암호화하는 분리된 핵산.
  41. 제5항에 따른 모노클로날 항체를 발현하는 분리된 하이브리도마.
  42. 제5항에 있어서, Fab, 또는 일본쇄 1가 항체인 모노클로날 항체.
  43. 제5항에 있어서, 하나의 인지 측면이 서열 번호: 1의 펩타이드에 결합하고 다른 것은 다른 에피토프를 인지하는, 양특이적인 항체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 다른 에피토프가 HER2 또는 DLL4인 항체.
  45. 삭제
  46. 제5항에 따른 1가 모노클로날 항체를 포함하는, MUC1*를 발현하는 세포의 증식 억제용 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인 조성물.
  48. 제5항에 따른 2가 모노클로날 항체를 포함하는, MUC1*를 발현하는 세포의 증식 증가용 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 세포가 다능성 세포인 조성물.
  50. 제48항에 있어서, 상기 세포가 전구 세포인 조성물.
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