KR20140018837A - 노텀 단백질 조절 인자 및 사용 방법 - Google Patents

노텀 단백질 조절 인자 및 사용 방법 Download PDF

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KR20140018837A
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로버트 에이. 스툴
스콧 제이. 딜라
오리트 푸드
모네트 오제이
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스템 센트알엑스 인코포레이티드
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Abstract

항체를 비롯한 노텀 조절 인자 및 이의 유도체, 및 상기 조절 인자를 사용하여 과증식성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

노텀 단백질 조절 인자 및 사용 방법{NOTUM PROTEIN MODULATORS AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. 119(e)하에 2010년 8월 27일 출원된 미국 가출원 번호 제61/377,882호, 2010년 9월 3일 출원된 제61/380,181호, 2010년 9월 30일 출원된 제61/388,552호, 및 2011년 7월 21일 출원된 제61/510,413의 이점을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 분야
본 출원은 일반적으로 과증식성 장애, 이의 확장, 재발, 도짐 또는 전이를 치료 또는 호전시키는 데 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 광범위한 측면에서, 본 발명은 신생물성 장애의 치료 또는 예방을 위한, 노텀 길항제 및 융합 구성체를 비롯한 노텀(Notum) 조절 인자의 용도에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, KRAS 및/또는 APC가 돌연변이화된 결장직장암 및 KRAS가 돌연변이화된 췌장암에서의 것을 비롯한, 악성 종양의 면역치료학적 치료를 위한 항노텀 항체의 용도를 제공한다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다. 2011년 8월 26일 작성된 상기 ASCII 카피의 명칭은 11200.3.304.txt이며, 그 크기는 138,922 바이트이다.
줄기 및 전구 세포 분화 및 세포 증식은 기관 형성 조직 성장을 지원하고, 모든 살아있는 유기체의 평생 동안 일어나는 조직 대부분의 세포 대체 및 수복을 지원하는 것과 제휴하여 작용하는 정상적인 진행 과정이다. 분화 및 증식 결정은 대개 세포 운명 결정 및 조직 구조를 유지시키기 위해 균형을 이루는 다수의 인자 및 신호에 의해 조정된다. 정상적인 조직 구조는 세포 분열 및 조직 성숙화를 조절하는 미세환경 표식에 반응하는 세포의 결과로서 유지된다. 따라서, 세포 증식 및 분화는 정상적으로는 손상된 또는 죽어가는 세포의 대체를 위해, 또는 성장을 위해 필요한 경우에만 일어난다. 불행하게도, 다양한 신호전달 화학물질의 과잉 또는 부족, 변경된 미세환경 존재, 유전자 돌연변이 또는 이의 일부 조합을 비롯한, 무수한 요인으로 인해 세포 증식 및/또는 분화는 파괴될 수 있다. 정상적인 세포 증식 및/또는 분화가 파괴되거나, 또는 어찌 됐든 파괴되면, 암을 비롯한, 각종 질환 또는 장애가 유발될 수 있다.
종래의 암 치료법으로는 화학요법, 방사선 요법, 수술, 면역요법(예컨대, 생물학적 반응 개질제, 백신 또는 표적화된 치료제) 또는 이의 조합을 포함한다. 애석하게도, 매우 많은 암들은 상기의 종래 치료법에 대하여 비반응성이거나, 또는 최소한도로 반응을 보이는 바, 환자에게 남아있는 옵션은 거의 없다. 예를 들어, 일부 환자 서브집단은 특정 요법의 일반적인 유효성에도 불구하고, 환자를 비반응성이 되도록 만드는 유전자 돌연변이(예컨대, RAS)를 보인다. 또한, 암 유형에 따라, 일부 이용가능한 치료법, 예컨대, 수술은 실현가능한 대체법이 될 수 없다. 현 치료 지침의 치료제에 내재되어 있는 한계는 특히 이전에 치료를 받은 적이 있고, 이후에 다시 도진 환자를 치료하고자 시도할 때에 명백히 드러난다. 이러한 사례에서, 실패한 치료학적 요법 및 그 결과로 초래된 환자 악화는 대개 최종적으로는 치유가 불가능한 것으로 입증된 보다 침습성인 질환인 것으로 그 모습을 드러내는 난치성 종양의 원인이 될 수 있다. 도짐, 종양 재발 및 전이를 예방하는 현존 요법의 실패로 인해 수년간에 걸쳐 암 진단 및 치료가 크게 개선되기는 하였지만, 많은 고형 종양에 대한 전반적인 생존율에는 대개 변함이 없다. 따라서, 보다 표적화되고, 효능이 있는 요법을 개발하고자 하는 도전 과제가 남아있다.
유망한 한 연구 분야로는 많은 암의 근간이 되는 것으로 보이는 종양신생 "시드" 세포를 추격하는 표적화된 치료제를 사용하는 것을 포함한다. 상기 목적을 달성하기 위해, 대부분의 고형성 조직들은 상기 조직 대부분을 포함하는 분화된 세포 유형을 생성하는 성체 조직 상주 줄기 세포 집단을 포함하는 것으로 현재 알려져 있다. 이러한 조직에서 발생되는 종양은 유사하게 줄기 세포로부터도 발생되는 이질성 세포 군집으로 구성되지만, 이의 전반적인 증식 및 조직화에 있어서는 현저한 차이를 보인다. 종양 세포 대부분은 제한된 증식 능력을 가지고 있는 것으로 점점 더 인식되어 가고 있지만, 암 세포(보통 암 줄기 세포 또는 CSC(cancer stem cell)로도 공지) 중 소수 집단은 광범위하게 자기 재생하여 자신이 종양 재개시 능력을 가질 수 있도록 하는 배타적인 능력을 가지고 있다. 더욱 구체적으로, 암 줄기 세포 가설은, 각 종양 내에는 이의 종양 전구 세포로, 그리고 이어서 최종적으로 분화된 종양 세포로의 분화 결과로서, 무한 자기 재생이 가능하고, 계속해서 이의 복제능이 제한된 종양 세포를 생성할 수 있는 별개의 세포 서브세트(즉, CSC)가 존재한다는 것을 제안한다.
최근에, 이러한 CSC(이는 또한 종양 영구 세포 또는 TPC(tumor perpetuating 세포)로도 공지)는 전통적인 화학요법제 또는 방사선에 대해 더욱 큰 내성을 가질 수 있고, 따라서, 치료 지침의 임상 요법 후, 지속적으로 추후 재발성 종양, 속발성 종양 및 전이의 성장을 가속화시킬 수 있다는 것이 더욱 명백해졌다. 또한, 정상적인 조직 상주 줄기 세포의 기관 형성 및/또는 자기 재생을 조절하는 경로가 CSC에서 탈조절되거나 변경됨으로써 자기 재생 암 세포 및 종양 형성이 계속적으로 확장된다는 것을 제안하는 증거도 증가하고 있다. 일반적으로, 문헌 ([Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087]; 및 [Dalerba et al., 2007, PMID: 17548814])(상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)을 참조할 수 있다. 따라서, 전통적인 것 뿐만 아니라, 보다 최근의 표적화된 치료 방법의 유효성은 심지어 상기와 같은 다양한 치료 방법에 직면에 있는 경우에도 암을 영구화시킬 수 있는 내성을 지닌 암 세포의 존재 및/또는 출현으로 인해 한계가 있다는 것은 자명한 사실이 되었다(문헌 [Huff et al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006)] 및 [Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009)])(상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 상기 관찰 결과는 고형 종양을 앓고 있을 때 실질적으로 환자의 생존을 증가시킬 수 없는 전통적인 용적축소제의 일관된 무능함을 통해, 및 종양이 어떻게 성장하고, 다시 도지고, 전이되는지에 관한 점점 더 복잡한 이해 개발을 통해 확인할 수 있다. 따라서, 신생물성 장애를 치료하기 위한 최근의 전략법은 종양 재발, 전이 또는 환자 도짐의 가능성을 축소시키기 위해 종양 영구 세포의 분화를 제거, 고갈, 침묵화, 또는 촉진시키는 것의 중요성을 인지해 가고 있다.
상기와 같은 전략법을 개발하고자 하는 노력이, 원발성 인간 고형 종양 종을 이식받고, 오직 배타적으로 면역약화된 마우스에만 계대접종되는 것인 비전통적인 이종이식편(NTX: non-traditional xenograft) 모델을 포함하는 최근 연구에 도입되었다. 그러한 기법을 통해 이질성 종양을 생성할 수 있고, 그가 무한대로 성장할 수 있도록 가속화시킬 수 있는 독특한 능력을 지닌 세포 서브집단이 존재한다는 것이 확인되었다. 앞서 세운 가설과 같이, NTX 모델에서의 연구를 통해, 확인된 종양 세포 CSC 서브집단은 예컨대, 화학요법 및 방사선과 같은 용적축소(debulking) 요법에 대하여 보다 큰 내성을 가지고 있는 것처럼 나타났다는 것을 확인할 수 있었고, 이는 잠재적으로는 임상적 반응률과 총 생존율 사이의 차이를 설명한다. 추가로, CSC 연구에서 NTX 모델의 사용이 종양 재발 및 전이에 대해 중요한 영향력을 미침으로써 환자 생존율을 개선시키는 CSC 표적화된 요법을 유도할 수 있는 약물 후보물질의 약물 발견과 임상전 평가에서 근본적인 변화를 불러왔다. 진보하였음에도 불구하고, CSC 정체 및 분화능에 관한 특징을 규명하는 실험 플랫폼의 부족과 함께 원발성 및/또는 이종이식편 종양 조직 취급과 관련된 고유의 기술상의 어려움이 중요한 도전 과제를 제기한다. 따라서, 암 줄기 세포를 선택적으로 표적화하고, 과증식성 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하는 데 사용될 수 있는 진단학적, 예방학적 또는 치료학적 화합물 또는 방법을 개발하는 것이 실질적으로는 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 요약
광범위한 의미에서, 노텀 관련 장애(예컨대, 과증식성 장애 또는 신생물성 장애)의 치료에서 사용될 수 있는 방법, 화합물, 조성물 및 제조물품에 관한 것인 본 발명에 의해 상기과 같은 목적 및 다른 목적이 제공된다. 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 암 줄기 세포를 효과적으로 표적화하고, 매우 다양한 악성 종양을 앓는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있는 신규한 노텀 조절 인자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 개시된 노텀 조절 인자는 하나 이상의 생리학적 경로(예컨대, Wnt/베타 카테닌, Hh 또는 BMP 경로)에서 노텀 폴리펩티드, 이의 리간드 또는 이의 유전자를 인식하거나, 그와 경쟁하거나, 작용시키거나, 길항시키거나, 그와 상호작용하거나, 그와 결합하거나, 또는 회합하여 노텀 단백질의 영향을 조절하거나, 조정하거나, 변경시키거나, 변화시키거나, 변형시키는 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 선택된 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 단리된 형태의, 또는 다른 모이어티와 융합되거나 회합된(associated)(예컨대, Fc-노텀, PEG-노텀 또는 표적 모이어티와 회합된 노텀) 노텀 그 자체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 다른 선택된 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 본 출원의 목적을 위해, 노텀을 인식하거나, 그와 경쟁하거나, 그와 상호작용하거나, 그와 결합하거나, 또는 회합하여, 종양 개시 세포를 비롯한 신생물성 세포의 성장을 중화시키거나, 제거하거나, 감소시키거나, 감작시키거나, 재프로그래밍하거나, 억제시키거나, 또는 제어하는 임의의 구성체 또는 화합물을 의미하는 것으로 간주되어야 하는 노텀 길항제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 노텀 조절 인자는 예상외로, 신생물성 세포의 생존, 재발, 재생 및/또는 전이를 전파시키거나, 유지시키거나, 확장시키거나, 증식시키거나, 또는 다르게는 촉진시킬 수 있는 능력을 침묵화시키거나, 중화시키거나, 감소시키거나, 줄이거나, 고갈시키거나, 완화시키거나, 축소시키거나, 재프로그래밍하거나, 제거하거나, 또는 다르게는 억제시키는 것으로 발견된 항노텀 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함한다.
한 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 항체가 서열 번호: 331에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열, 및 서열 번호: 332에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간화된 항체를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 hSC2.D2.2 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물의 형태일 것이다.
특정 다른 실시양태에서, 본 발명은 피험체에 투여시 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 노텀 조절 인자를 포함할 것이다. 바람직하게, 빈도 감소는 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석(limiting dilution analysis)을 사용하여 측정될 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 분석은 인간 종양 생세포를 면역약화된 마우스에 이식시키는 것을 포함하는 생체내 제한 희석 분석을 사용함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 제한 희석 분석은 인간 종양 생세포를 시험관내 콜로니 지지 조건으로 침착시키는 제한 희석 침착을 포함하는 시험관내 제한 희석 분석을 사용함으로써 수행될 수 있다. 어느 경우에서든, 빈도 감소의 분석, 계산, 또는 정량화는 바람직하게 정확하게 회계할 수 있도록 하기 위해 푸아송 분포(Poisson distribution) 통계를 사용하는 것을 포함할 것이다. 상기와 같은 정량화 방법이 바람직하기는 하지만, 덜 노동 집약적인 방법, 예컨대, 유세포 분석법 또는 면역조직화학법 또한 원하는 값을 제공하는 데 사용될 수 있는 것을 이해할 것이며, 따라서, 이는 명백히 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 간주된다. 그러한 경우, 빈도 감소는 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 알려져 있는 종양 세포 표면 마커에 관한 유세포 분석 또는 면역조직화학적 검출을 사용함으로써 측정될 수 있다.
따라서, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 노텀 관련 장애 치료를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의 노텀 조절 인자를 투여함으로써, 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 단계를 포함하는, 노텀 관련 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 또한, 종양 개시 세포 빈도 감소는 바람직하게는 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 사용함으로써 측정될 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 적어도 부분적으로는 노텀 폴리펩티드가 각종 신생물의 병인에 관여하는 종양 영구 세포(즉, 암 줄기 세포)와 관련이 있다는 발견에 기초한다는 것을 이해할 것이다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 각종의 예시적인 노텀 조절 인자 투여가 종양 개시 세포에 의한 종양신생 신호전달을 감소시키거나, 억제시키거나 또는 제거할 수 있다는 것(즉, 종양 개시 세포의 빈도를 감소시킬 수 있다는 것)을 예상외로 나타낸다. 종양 개시 세포를 감소시키거나, 제거하거나, 재프로그래밍하거나 또는 침묵화시킴으로써든, 또는 종양 세포 형태론적 성질을 변형시킴으로써든(예컨대, 분화 유도, 니치 파괴) 간에 그로 인해 이루어진 상기와 같이 감소된 신호전달을 통해서 결국에는 종양신생, 종양 유지, 확장 및/또는 전이 및 재발을 억제시킴으로써 노텀 관련 장애를 보다 효과적으로 치료할 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시된 조절 인자는 종양 성장을 가속화시킬 수 있는 노텀 매개 주변분비 신호전달을 간섭하거나, 억제시키거나, 또는 다르게는 지연시킬 수 있다. 추가로, 하기에서 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 노텀 폴리펩티드는 Wnt/베타 카테닌, 헤지호그(Hh: hedgehog) 및 골 형태형성 단백질(BMP: bone morphogenetic protein) 종양원성 생존 경로에 긴밀하게 관여한다. 본원에 기술된 신규한 노텀 조절 인자를 사용하여 상기 발생상 신호전달 경로에 개입하면 1 초과의 기전에 의해 장애를 추가로 호전시킴으로써(즉, 종양 개시 세포 감소 및 발생상 신호전달 파괴) 부가 또는 상승 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 노텀 매개 장애 치료를 필요로 하는 피험체에게 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 노텀 매개 장애 치료를 필요로 하는 피험체에서 노텀 매개 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 항암제와 회합(예컨대, 접합)될 것이다. 추가로, 상기와 같은 파괴 및 부수적인 이점은 정상적인 인접한 조직과 비교하였을 때 피험체 종양 조직이 상승된 수준의 노텀을 보이던지 또는 감소되거나 저하된 수준의 노텀을 보이던지 간에 달성될 것이다.
또한, 본 발명의 조절 인자는 특정 고형 조양을 치료하는 데 있어서 특히 효과적일 수 있다고 입증되었다. 따라서, 특히 바람직한 다른 실시양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 1종 이상의 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, KRAS 돌연변이, APC 돌연변이, 또는 CTNNB1 돌연변이를 보이는 고형 종양을 포함하는 신생물성 장애를 앓는 피험체를 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 약학적 유효량의 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 노텀 매개 주변분비 신호전달 억제를 필요로 하는 피험체에서 노텀 매개 주변분비 신호전달을 억제시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 종양 개시 세포를 침묵화시킴과 동시에, 잠재적으로는 다중 종양원성 생존 경로를 파괴시킬 수 있는 개시된 조절 인자의 능력을 사용한다. 상기와 같은 다중 활성 노텀 조절 인자(예컨대, 노텀 길항제)는 치료 지침의 항암제 또는 용적축소제와 함께 병용하여 사용되었을 때에 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있다. 추가로, 2종 이상의 노텀 길항제(예컨대, 노텀 상의 상이한 두 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체)는 본 발명의 교시에 따라 조합하여 사용될 수 있다. 또한, 하기에서 일부 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명의 노텀 조절 인자는 접합된 상태로 또는 비접합된 상태로 사용될 수 있고, 임의로는 다양한 화학물질 또는 생물학적 항암제와 함께 감작제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 피험체에게 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 항암제를 사용하는 치료를 위해 피험체에서 종양을 감작화시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 측면에서, 노텀 조절 인자는 특이적으로는 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는, 종양 개시 세포 빈도를 감소시킬 것이다.
유사하게, 본 발명의 화합물은 다양한 생리학적 기전을 통해 치료적 이점을 발휘할 수 있는 바, 본 발명은 또한 구체적으로 특정 세포 과정을 사용하도록 제조된 선택된 효과기 또는 조절 인자에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 바람직한 조절 인자는 종양 개시 세포의 표면 상의, 또는 그 부근의 노텀과 회합하여 피험체의 면역 반응을 자극시킬 수 있도록 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 효과기는 임의의 노텀 효소적 활성 중화를 촉진시킨 후, 종양 미세환경 중의 노텀 기질의 양과 임의의 관련된 주변분비 신호전달을 감소시키는 데 사용되는, 에피토프에 대한 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 조절 인자는 노텀과 회합된 세포를 고갈 또는 제거함으로써 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 특정 작용 모드로 제한된다기보다는, 원하는 결과를 달성하는 임의의 방법 또는 노텀 조절 인자를 포함한다는 것을 이해하는 것이 중요하다.
상기 골격 내의 개시된 실시양태의 바람직한 실시양태는 치료적 유효량의 1종 이상의 중화 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 신생물성 장애를 앓는 피험체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태는 치료적 유효량의 1종 이상의 고갈 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 노텀 관련 장애를 앓는 피험체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 종양 종괴 중 적어도 일부를 제거하도록 디자인된 초기 시술(예컨대, 화학치료제, 방사선 또는 수술) 이후 일정 기간에 걸쳐 개시된 효과기를 투여하는 것인 유지 요법인 방법을 제공한다. 상기 치료학적 요법은 몇주 간에 걸쳐, 몇개월 간에 걸쳐, 또는 심지어는 몇년 간에 걸쳐 시행될 수 있으며, 여기서, 노텀 조절 인자는 예방학적으로 작용하여 전이 및/또는 종양 재발을 억제시킬 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 개시된 조절 인자는 공지된 용적축소 요법과 협력하여 투여됨으로써 전이를 예방하거나 지연시킬 수 있다.
상기 논의된 치료제를 사용하는 것 이외에도, 본 발명의 조절 인자는 노텀 관련 장애, 특히, 과증식성 장애를 진단하는 데 사용될 수 있다는 것 또한 이해해야 할 것이다. 따라서, 바람직한 실시양태는
a. 과증식성 장애 진단을 필요로 하는 피험체로부터 조직 시료를 수득하는 단계;
b. 조직 시료를 1종 이상의 노텀 조절 인자와 접촉시키는 단계; 및
c. 시료와 회합된(associated) 노텀 조절 인자를 검출하거나 정량하는 단계
를 포함하는, 과증식성 장애 진단을 필요로 하는 피험체에서 과증식성 장애를 진단하는 방법을 포함한다.
상기 방법은 본 출원과 함께 공동으로 쉽게 이해될 수 있으며, 일반적으로 이용가능한 상업적 기술, 예컨대, 자동 플레이트 판독기, 전용 리포터 시스템 등을 사용함으로써 쉽게 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 검출 또는 정량화 단계는 종양 개시 세포 빈도의 감소를 포함할 것이다. 또한, 제한 희석 분석은 앞서 상기에 언급된 바와 같이 수행될 수 있고, 이는 바람직하게는 빈도 감소에 관하여 정확하게 회계할 수 있도록 하기 위해 푸아송 분포 통계를 사용할 것이다.
유사한 방식으로, 본 발명은 또한 노텀 관련 장애, 예컨대, 암의 진단 및 모니터링에 유용한 키트를 제공한다. 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 바람직하게 노텀 조절 인자, 및 노텀 관련 장애를 치료 또는 진단하는 데 상기 노텀 조절 인자를 사용하는 것에 관한 사용 설명서를 포함하는 용기를 포함하는, 노텀 관련 장애를 진단 또는 치료하는 데 유용한 제조물품을 제공한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 또한 형광 활성화된 세포 분류법(FACS: fluorescence activated cell sorting) 또는 레이저 매개 절편화와 같은 방법을 통해 종양 개시 세포 집단 또는 서브집단을 확인, 단리, 절편화(sectioning) 또는 강화(enriching)시키는 데 유용한 수단으로서 개시된 조절 인자의 특성을 사용한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 종양 개시 세포를 노텀 조절 인자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 개시 세포 집단을 확인, 단리, 절편화, 또는 강화시키는 방법에 관한 것이다.
상기 내용은 요약이며, 따라서, 필요에 의해 단순화, 일반화, 및 상세 내용의 생략을 포함한다; 그 결과, 상기 내용은 단지 설명을 위한 것이며, 어느 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 기술된 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 다른 주제의 다른 측면, 특징 및 이점은 본원에 기술된 교시에서 자명해질 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 하기 상세한 설명에서 추가로 기술되는 단순화된 형태의 개념을 선택적으로 도입하기 위해 요약을 제공한 것이다. 상기 요약은 청구되는 주제의 중요한 특징 또는 본질적인 특징을 확인하고자 하는 것도 아니며, 청구되는 주제의 범주를 결정짓는 데 도움을 주는 기구로서 사용하고자 하는 것도 아니다.
도 1a-d는 각각 인간 노텀을 코딩하는 핵산 서열(서열 번호: 1), 아미노 말단 신호 서열을 포함하는 인간 노텀 전구체 단백질의 상응하는 아미노산 서열(서열 번호: 2), 아미노산 차이를 보여주는 일부 마카크, 뮤린 및 인간 단백질 노텀 서열의 정렬(서열 번호: 99-102), 및 Fc-노텀 융합 구성체 형태의 예시적인 노텀 조절 인자의 아미노산(서열 번호: 333) 및 핵산(서열 번호: 334) 서열(여기서, 노텀 부분은 밑줄체로 표시되어 있다)을 도시한 것이다;
도 2는 전체 트랜스크립톰 서열 분석을 사용하여 수득한, 인간 노텀의 유전자 발현 수준을 도시한 그래프적 표현이다;
도 3은 3가지 상이한 비전통적인 이종이식편(NTX) 결장직장 종양 세포주 중 하나를 보유하는 비처리된 마우스 및 이리노테칸으로 처리된 마우스로부터 수득되고, 정량적 RT-PCR을 사용하여 측정된 바, 비종양신생(NTG: non-tumorigenic) 강화된 세포 집단에 대하여 정규화된, 고도로 강화된 종양 전구 세포(TProg) 및 종양 영구 세포(TPC) 집단에서 인간 노텀의 상대적인 유전자 발현 수준을 보여주는 그래프적 표현이다;
도 4A 및 4B는 정상적인 결장 및 직장 조직에서 발현의 평균값에 대하여 정규화된 바, 병기 I-IV인 질환을 앓는 환자로부터 유래된 전체 결장직장 종양 표본에서 인간 노텀의 상대적인 유전자 발현 수준을 보여주는 그래프적 표현이다;
도 5a 및 5b는 각각 18개의 상이한 고형 종양 유형 중 하나를 앓는 환자로부터 유래된 전체 종양 표본(회색 박스) 또는 대응 NAT(흰색 박스)에서의 상대적 또는 절대적 유전자 발현 수준을 보여주는 그래프적 표현이다;
도 6은 p53를 과다발현하는 293T 대조군 세포(흰색) 또는 p53를 과다발현하지 않는 293T 대조군 세포(검은색)와 함께, 11개의 상이한 종양 유형 중 하나를 앓는 환자로부터 수득된 표본으로부터의 정상적인 인접한(흰색) 또는 종양(검은색) 조직에서의 인간 노텀 단백질의 상대적인 발현을 보여주는 그래프적 표현이다;
도 7a 및 7b는 각각 코티아(Chothia) 등에 의해 정의된 바와 같은, 본원 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 단리되고 클로닝된 38개의 별개의 노텀 조절 인자의 유전자 정렬 및 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 보여주는 표로 나타낸 것이다;
도 8a-x는 본원 실시예에 기술되어 있는 바와 같이 단리되고 클로닝된 24개의 별개의 항노텀 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 제공한다;
도 9의 A-D는 동일의 것에 의해 측정된 바, 돌연변이체 노텀 구성체 S232A와 함께 가용성 노텀 조절 인자 노텀-hFc 및 노텀-His(인간, 마우스 및 마카크)의 정규 Wnt3A 검정 및 효과에 관한 그래프적 표현이다;
도 10은 정규 Wnt3A 검정을 사용하여 측정되고, 비억제된 Wnt 유도성 루시퍼라제 활성에 대하여 정규화된, 활성 노텀의 억제에 관한 수개의 항노텀 항체의 활성을 그래프로 도시한 것이다;
도 11a-d는 노텀 조절 인자 SC2.D2.2 및 SC2.A106(aka 10B3)이 다양한 농도의 가용성 노텀 구성체 노텀-His 및 노텀-hFc에 대하여 미치는 효과를 측정하기 위해 사용되고, 비억제된 Wnt 유도성 루시퍼라제 활성에 대하여 정규화된, 정규 Wnt3A 검정에 관한 그래프적 표현이다;
도 12의 A 및 B는 조절 인자 중 어느 것도 주목할 만한 Wnt 경로의 마카크 또는 뮤린 가용성 노텀 구성체 길항작용의 억제를 보이지 않은 것인, 정규 Wnt3A 검정을 이용하여 획득한, 노텀 조절 인자 SC2.D2.2 및 SC2.A106(aka 10B3)에 의한 종 특이 활성 결핍을 그래프로 도시한 것이다;
도 13의 A 및 B는 혼합형 세포 집단에서의 내인적으로 발현된 노텀의 효과(도 13A), 및 노텀 조절 인자 SC2.D2.2의 동일한 것에 대해 미치는 영향(도 13B)을 도시한, 효과적인 공배양 Wnt3A 검정을 확립한 데이터를 제공한 것이다;
도 14의 A 및 B는 본 발명의 노텀에 대한 다중클론 항체 및 단일클론 항체 노텀 조절 인자, 둘 모두 선택된 단백질 세포 용해물 중의 노텀을 검출한다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯의 표현이다;
도 15의 A-G는 수개의 상이한 종양 유형에서 상이한 병기의 질환에서의 노텀 상향조절을 보여주는, 노텀 조절 인자 SC2.A109를 사용하여 측정된 개별 환자 세포 용해물 시료부터의 노텀 단백질 수준에 관한 그래프적 표현이다;
도 16의 A-C는 세포 기반 검정에서 결장직장 종양 세포 증식 및/또는 아포프토시스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 h노텀 단백질(His 및 hFc)의 능력, 및 상기 노텀 매개 효과기를 길항시킬 수 있는 노텀 조절 인자의 능력을 도시한 것이다;
도 17의 A-C는 상이한 두 발색성 에스터라제 기질 p-니트로페닐 아세테이트(PNPA: p-nitrophenyl acetate) 및 p-니트로페닐 부티레이트(PNPB: p-nitrophenyl butyrate)를 사용하여 마우스, 마카크 및 인간 노텀과, 이의 무작용성 돌연변이체의 에스터라제 활성을 정량하는 생화학적 검정의 다양한 측면에 관한 그래프적 표현이다;
도 18의 A 및 B는 h노텀의 농도는 도 18A에서와 같이 달라지고, 노텀 조절 인자의 농도는 도 18B에서와 같이 달라지는, 시험관내 h노텀의 에스터라제 활성을 억제시킬 수 있는 개시된 노텀 조절 인자의 능력을 도시한 것이다;
도 19는 돼지 췌장 리파제의 양성 대조군(검은색 막대)과 함께 제시된 h노텀(회색 막대)의 리파제 활성을 정량한 생화학적 검정의 그래프적 표현이다
도 20은 h노텀의 농도는 일정하게 유지되고, 노텀 조절 인자의 농도는 달라지는, 시험관내 h노텀의 리파제 활성을 억제시킬 수 있는 개시된 노텀 조절 인자의 능력을 그래프로 도시한 것이다;
도 21의 A 및 B는 TCF 리포터 검정(도 21A) 및 4MUH 검정(도 21B)을 사용하여 293.TCF 세포에서 Wnt3A의 활성을 길항시키지 못하는 점 돌연변이화된 인간 노텀 (S232A 및 D340A)의 무능함을 그래프로 도시한 것이다;
도 22는 LEF/TCF 전사 인자의 활성화를 도시한 정규 Wnt 신호전달 경로에 관한 단순화된 다이어그램이다;
도 23은 293.TCF 세포에서 루시퍼라제 전사의 활성화에 의해 입증된 바, 노텀 매개 Wnt3A 활성을 길항시키는 개시된 노텀 조절 인자의 능력을 도시한 것으로서, 여기서, LiCl은 양성 대조군으로서의 역할을 하였다;
도 24의 A 및 B는 Wnt3A 활성 단백질 수준을 억제시킬 수 있는 키메라 노텀 단백질의 능력을 길항시키는 개시된 노텀 조절 인자의 능력을 나타내는 것으로서, 여기서, 도 24A는 키메라 노텀이 Wnt3A 활성을 억제시킬 수 있다는 것, 및 도 24B는 노텀 조절 인자의 첨가가 상기 활성을 회복시킬 수 있다는 것을 보여주는 것인 그래프적 표현이다;
도 25의 A 및 B는 점 돌연변이화된 노텀 구성체는 TCF 검정(도 25A) 및 4MUH 검정(도 25B), 둘 모두에서 루시퍼라제 활성의 Wnt3A 유도를 간섭할 수 있는 이의 능력을 유지한다는 것을 도시한 것이다;
도 26의 A 및 B는 TCF 검정(도 26A) 및 4MUH 검정(도 26B)에서 측정된 바, 인간 및 마카크 노텀에서 제조된 특정 점 돌연변이가 노텀 효소적 활성을 길항시킬 수 있는 노텀 조절 인자 SC2.D2.2의 능력을 간섭할 수 있다는 것을 입증하는 그래프적 표현이다;
도 27의 A 및 B는 노텀 조절 인자를 노텀과 함께 인큐베이션시키고, Wnt3A CM을 첨가하기 전에 세포에 노출시켰을 때(도 27A), 및 세포에 노출시키기 전에 Wnt3A CM과 함께 사전 인큐베이션시켰을 때(도 27B)의, TCF 검정에서 Wnt3A 활성의 노텀 매개 길항작용을 억제시킬 수 있는 개시된 노텀 조절 인자의 능력을 도시하는 그래프적 표현이다;
도 28의 A 및 B는 4MUH 농도 240 μM(도 28A) 및 90 μM(도 28B)에서 측정된 바, 노텀 조절 인자로서 작용할 수 있고, 용량에 의존하는 방식으로 4MUH에서 노텀의 가수분화 활성을 억제시킬 수 있는 오를리스타트 형태의 소분자의 능력을 입증하는 것이다;
도 29a 및 29b는 노텀에 의한 시험관내 탈지시에 Wnt3A의 분배(도 29a), 및 상기의 것을 억제시킬 수 있는 노텀 조절 인자의 능력(도 29b)을 나타내는 웨스턴 블롯이다;
도 30은 TCF 검정으로 측정된 바, 개시된 노텀 조절 인자의 마카크, 마우스 및 인간 노텀에 대한 효소적 중화 특성을 그래프로 도시한 것이다;
도 31의 A 및 B는 각각 SC2.D2.2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 정렬된 아미노산 서열(서열 번호: 56 및 서열 번호: 58) 및 인간화된 SC2.D2.2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 정렬된 아미노산 서열(서열 번호: 331 및 서열 번호: 332)을 도시한 것으로서, 여기서, 상부 서열은 인간화된 유도체이고, 수직선 마크는 각 아미노산이 동일하다는 것은 나타내는 것이고, 여기서, 코티아 등에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄로 표시되어 있다;
도 32의 A-C는 5개의 상이한 항원 농도에 대한 뮤린 SC2.D2.2의 친화도 측정치를 그래프로 나타낸 것이고, 고정량의 항체 및 일련의 항원 희석액을 이용한 무표지 상호작용 분석을 사용하여 측정된 각각의 뮤린 SC2.D2.2 및 인간화된 SC2.D2.2 친화도를 비교한 것이다; 그리고,
도 33의 A 및 B는 각각 개시된 조절 인자를 사용하여 작성된 표준 곡선, 및 건강한 피험체 및 난소암을 앓는 환자로부터 수득된 시료에서 측정되고, 상기 표준 곡선으로부터 외삽된 노텀의 혈장 농도를 도시한 것이다.
I. 도입
광범위한 의미에서, 본 발명의 실시양태는 신규한 노텀 조절 인자, 및 암을 비롯한 과증식성 장애의 발병을 치료, 관리, 호전, 또는 예방하는 데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 어느 특정의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 개시된 조절 인자는 종양 성장을 감소 또는 지연시키고, 종양신생 세포를 제거 또는 중화시킬 뿐만 아니라, 상기 세포의 항암제에 대한 감작성을 변경시키는 데 있어서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 추가로는 놀랍게도, 선택된 종양 영구 세포(TPC)와 노텀으로 알려져 있는 단백질 사이의 표현형상의 연관성에 대해 현재까지 알려져 있는 바가 없는 것으로 밝혀졌다. 이와 관련하여, 선택된 TPC(즉, 암 줄기 세포 또는 CSC)는 정상적인 조직과 비교하였을 때 뿐만 아니라, 종양 전구 세포(TProg), 및 상당부 고형 종양을 함께 포함하는 비종양신생(NTG) 세포와 비교하였을 때에도 노텀을 상승된 수준으로 발현하는 것으로 나타났다. 따라서, 선택된 실시양태에서, 종양 미세환경에서 및 선택된 세포의 표면과 관련된 단백질의 수준이 상승되어 있는 바, 노텀은 종양 관련 마커(또는 항원)를 포함하고, TPC 및 관련된 신생물의 검출, 감작 및/또는 억제에 대해 효과적인 제제를 제공하는 것으로 나타났다. 더욱 구체적으로, 및 더욱더 놀랍게도, 노텀이 외관상 (적어도 어느 정도까지는) 분비된다는 것을 고려하였을 때, Fc-노텀 구성체 및 면역반응성 길항제(예컨대, 상기 단백질에 대한 항체)를 비롯한 노텀 조절 인자는 종양 영구 세포의 분화를 고갈시키거나, 감작시키거나, 제거하거나, 감소시키거나, 재프로그래밍하거나, 촉진시키거나, 또는 다르게는, 환자에서 종양 성장 또는 재발을 확산시키고/거나, 상기 종양 성장 또는 재발을 계속하여 가속화시킬 수 있는 능력을 방해하거나, 제한하는 데 유용할 수 있다는 것이 추가로 밝혀졌다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 노텀 조절 인자는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 것이다. 앞서 언급하고, 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 본원에 개시된 선택된 실시양태는 접합되거나 접합되지 않은 형태의, 노텀에 대한 항체를 포함할 것이다. 노텀 조절 인자의 다른 실시양태는 바람직하게는 노텀, 또는 예를 들어, 노텀 융합 구성체(예컨대, 노텀-Fc, 노텀-표적화 모이어티 등) 또는 노텀-접합체(예컨대, 노텀-PEG, 노텀-세포독성제 등)를 비롯한, 이의 형태, 변이체, 유도체, 또는 단편을 포함할 것이다. 추가의 다른 실시양태에서, 조절 인자는 유전자 수준에서 작동할 수 있고, 안티센스 구성체, siRNA, miRNA 등과 같은 화합물을 포함할 수 있다. 상기 노텀 조절 인자는 예를 들어, 노텀 조절 인자의 형태, 또는 투약 및 전달 방법에 따라 경쟁 기전, 작용시키거나 길항화시키는 선택된 경로, 또는 제거 또는 고갈 특이 세포(비TPC 지지 세포 포함)를 통해 종양 영구 세포 및/또는 관련된 신생물의 성장, 전파 또는 생존을 감쇠시킬 수 있다.
이러한 발견 내용을 고려하며, 당업자는 본 발명의 특히 바람직한 실시양태가 대개는 노텀 조절 인자 및 종양 개시 세포를 감소시키는 데 있어서의 이의 용도에 관한 것이라는 것을 이해할 것이다. 본원에서 광범위하게 논의되는 바와 같이, 본 발명과 화합성인 노텀 조절 인자로는 광범위하게 노텀과 회합하거나, 그와 결합하거나, 복합체를 형성하거나, 또는 다르게는, 그와 반응하거나, 경쟁하고, 임의로는 종양 영구 세포 빈도를 감소시키는 임의의 화합물을 포함한다. 본원에 개시된 예시적인 조절 인자로는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 선택된 조절 인자로는 노텀에 대한 항체 또는 이의 면역반응성 단편 또는 유도체를 포함할 것이다. 상기 항체는 실제로는 길항성이거나, 또는 효능성일 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명과 화합성인 효과기는 노텀 그 자체 또는 이의 반응성 단편을 포함하는 노텀 구성체를 포함할 것이다. 상기 노텀 구성체는 융합 단백질을 포함할 수 있고, 다른 폴리펩티드로부터의 반응성 도메인, 예컨대, 면역글로불린, 스테이플드(stapled) 펩티드 또는 생물학적 반응 개질제를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가의 다른 바람직한 측면에서, 노텀 효과기 또는 조절 인자는 게놈 수준에서 바람직한 효과를 발휘하는 핵산 조립체를 포함할 것이다. 본 교시와 화합성인 추가의 다른 조절 인자는 하기에서 상세하게 논의할 것이다.
관련된 정보에서 보면, 하기 논의는 노텀 조절 인자, 노텀 길항제 및 항노텀 항체에 관한 것이다. 각 용어의 더욱 상세한 정의는 하기에서 제공하지만, 상기 용어는 대개는 상기 개시내용의 목적을 위해 상호교환될 수 있고, 문맥을 통해 달리 언급되지 않는 한, 좁게 해석되지 않아야 한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 노텀 길항제에 관한 것이라고 한 경우, 길항성이 되는 본 발명의 항체 또한 적당할 것이다. 유사하게, 노텀 조절 인자라는 용어는 개시된 노텀 길항제 및 항노텀 항체를 명확하게 포함하고, 후자와 관련된 용어 또한 문맥상 제외되지 않는 정도로 조절 인자로서 적용될 수 있다.
II. 노텀
본원에서 사용되는 바, 노텀이라는 용어는 천연적으로 발생된 노텀 펙틴아세틸에스터라제 단백질, 이의 단편, 또는 변이체를 의미한다. 대표적인 노텀 오르토로그로는 인간(즉, h노텀), 마우스, 마카크 원숭이 및 초파리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 게놈의 인간 오르토로그는, 분자량이 대략 55.7 kDa인 496개의 아미노산(aa: amino acid)으로 이루어진 폴리펩티드 구성체를 제공하는, 1,488개로 된 염기쌍 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 인간 노텀 단백질을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 서열 번호: 1에 제시되어 있는 반면, 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호: 2에 제시되어 있다(각각 도 1a 및 1b). 인간 노텀 단백질은 성숙한 형태의 단백질(즉, 477개의 aa)을 제공하기 위해 잘려지는(clipped off), 서열 번호: 2의 아미노산 1-19를 포함하는 예측 신호 또는 리더 서열을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 참고로, 뮤린 노텀(진뱅크(GenBank) 수탁 번호: NM_175263)은 인간 노텀과 대략 91% 상동성인 반면, 마카크 노텀(진뱅크 수탁 번호: XM_001112829)은 대략 96% 상동성이다. 직접적인 언급이나, 문맥상의 필요에 의해 달리 언급되지 않는 한, 노텀이라는 용어는 인간 노텀 및 면역반응성 등가물에 관한 것이어야 한다. 노텀의 인간 상동체(진뱅크 수탁 번호: NM_178493; 진ID 147111)는 문헌 [Torisu et al. 2008, PMID: 18429952](이는 본원에 참고로 포함된다)에 보다 상세하게 기술되어 있다. 상기 용어는 또한 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프를 포함하는 천연 또는 변이체 형태의 노텀의 단편을 의미할 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다.
또한, 어느 특정의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 노텀 조절 인자, 및 특히 노텀 길항제는 적어도 부분적으로는 치료 지침의 치료제 요법(예컨대, 이리노테칸)에서 벗어난 종양원성 생존을 방해할 뿐만 아니라, 종양 개시 세포 신호전달을 감소 또는 제거함으로써 작용할 수 있다고 간주된다. 예를 들어, 증식 세포를 제거하거나, TPC의 분화를 촉진시켜 이의 자기 재생(즉, 무한 증식) 능력을 상실하도록 하는 화학요법적 요법에도 불구하고, 노텀을 길항시킴으로써 TPC를 제거하는 것은 간단하게는 세포 증식을 촉진시키는 것을 포함할 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 노텀은 특히 Wnt, Hh 및 BMP 경로에 관여하는 것으로 보인다. 이와 관련하여, 노텀은 최초로 초파리에서 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 댈리(Dally) 유사(Dlp) 및 댈리를 변형시킴으로써 무시(Wg: Wingless) 활성을 억제시키는 것으로서 확인된 것인, 분비된 하이드롤라제라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 초파리에서, 노텀 유전자는 671개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 코딩하는 것으로 보이며, 상기 단백질은 α/β 하이드롤라제 수퍼패밀리의 식물 펙틴 아세틸에스터라제와 관련이 있다. 더욱 최근의 증거를 통해, 초파리 노텀(d노텀)은 또한 Dlp의 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI: glycosylphosphatidyl inositol) 앵커를 절단함으로써 세포 표면으로부터 Dlp를 유리시키는 리파제로서의 역할을 할 수 있다는 것이 입증되었다. 노텀에 의한 변형 및/또는 상기와 같은 세포 표면 프로테오글리칸의 유리를 통해 댈리 단백질 발현의 세포 표면 수준은 대폭 감소하게 되고, 겔 전기영동에 의해 입증되는 바, Dlp는 변형된 형태로 전환된다. 그러한 관찰결과는 d노텀이 아마도 이의 글리코아미노글리칸 측쇄를 변형시키고/거나, 세포 표면으로부터 Dlp를 유리시킴으로써 댈리 및 Dlp에 의해 증강되는 Wg 및 헤지호그(Hh) 신호전달을 길항시킨다는 것을 시사하다. d노텀에 의한 상기와 같은 변형은 국소 Wg 및 헤지호그 농도를 변형시킴으로써 이들 모르포겐과 이의 수용체 사이의 상호작용을 길항시키는 작용을 한다. 또한, 댈리 또는 Dlp와 회합된 Wg 또는 헤지호그 단백질의 세포 표면으로부터의 유리는 발생 동안의 조직 패턴 형성에 중요한 영향을 미치면서, 이들 모르포겐의 장기간에 걸친 활성을 촉진시킨다. 일반적으로, 문헌 ([Ayers et al., 2010, PMID: 20412775]; [Giraldez et al., 2002, PMID: 12015973] 및 [Traister et al., 2008, PMID: 17967162])(이들 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)를 참조할 수 있다.
다양한 연구를 통해 댈리 및 Dlp 관련 프로테오글리칸이 척추동물에서의 Wnt 신호전달에서 중요한 역할을 할 가능성이 있다고(문헌 ([Topczewski et al. 2001, PMID: 11702784] 및 [Filmus et al., 2008, PMID: 18505598])), 그리고, 노텀은 유사 단백질이 초파리에서 하는 것처럼, Wnt 신호전달을 이의 수용체 프리즐드(Frizzled)를 통해 조정하는 역할을 한다고도 밝혀졌다. Wg와 마찬가지로, 포유동물 노텀은 (Dlp 및 댈리와 유사한) 글리코실-포스파티딜이노시톨 고정된(GPI) 글리피칸을 세포 표면으로부터 유리시킴으로써 Wnt 경로를 하향조절하는 것으로 제시된다(문헌 [Traister et al., 상기 문헌 동일]). 세포 표면에 결합되어 있을 때, GPI 고정된 글리피칸은 다양한 형태의 Wnt와 이의 프리즐드 수용체의 상호작용을 안정화시킴으로써 Wnt 신호전달을 촉진시키는 반면, 세포 표면으로부터 유리된 글리피칸은 프리즐드 수용체에 인접한 GPI 고정된, 세포 표면 글리피칸과의 Wnt 상호작용을 경쟁적으로 억제시킴으로써 Wnt 신호전달을 억제시킨다([Filmus et al., 상기 문헌 동일]). 글리피칸을 제거하거나, 이의 국소 농도를 최소한으로 줄이면, Fzd 수용체를 통해 베타 카테닌 경로 신호전달을 자극시키기 위해 세포 표면에 존재하여야 하는 Wnt 농도의 역치는 증가하게 된다. 추가 연구와 함께, 상기 데이터를 통해 포유동물(예컨대, 인간) 노텀이 Wnt 신호전달을 길항시키는 것으로 밝혀졌다. 노텀은 또한 전사 활성화를 위한 Wnt/베타 카테닌 표적인 것으로 확인되었으며, 이는 노텀이 Wnt Fzd 베타 카테닌 신호전달 캐스케이드의 피드백 억제제인 것을 제안한다.
Wnt/Fzd 신호전달은 기관 형성 및 발생 동안 많은 조직 내에서 세포 운명 결정 판단에 있어서 큰 역할을 하며, 이러한 경로의 작은 변화는 대개 암을 일으킨다. 또한, 하부 위장관의 줄기 세포가 확인되었고/거나 조작되어 있는 것인 다중 마우스 유전자 모델을 통해 Wnt/베타 카테닌 경로를 통한 신호전달이 조직 상주 줄기 세포 분화 결정에 영향을 주고, 이로 인해 파네트(Paneth) 세포가 생성되는 것으로 것으로 나타났는데, 상기 파네트 세포는 그 스스로, 줄기 세포가 상주하는 것으로 공지된 위치인 소장 음와로 알려져 있는 조직 구조의 바닥에서 줄기 세포 자기 재생 및 확장을 지원하는 것으로 제안된 바 있는 것이다. 노텀에 의한 Wnt 신호전달의 탈조절 및/또는 TPC 집단에 가까운 부위에서의 노텀의 국소 농도 증가로 인한 상기 경로의 피드 조절 손상은 종양신생, 계속하여 종양 성장 및 종양 재발에 원인이 될 수 있다. 종양 세포의 세포 표면에 가까운 부위에서의 Wnt 구배 형성을 변경시킴으로써 노텀 조절 인자를 사용하여 상기와 같은 원인을 개질시키는 것이 치료학적으로 이익이 될 수 있다.
세포 표면에서 글리피칸의 농도를 효과적으로 감소시킬 수 있는 노텀의 능력을 고려해 볼 때, 노텀은 또한 세포 표면으로부터 글리피칸을 유리시킴으로써 헤지호그(Hh) 모르포겐 구배를 통제할 수 있는 영향력을 발휘할 수도 있다. 상기에서 초파리의 경우에 대해 언급된 바와 같이, 댈리 및 Dlp 관련 글리피칸은 또한 Hh에 결합하여 Hh 수용체인 패치드(Ptc: Patched)와 능동적으로 경쟁할 수 있다. Hh 결합을 위한 Ptc와의 경쟁은 근접 부위의 Ptc에의 Hh 결합을 효과적으로 감소시킴으로써, 전사 인자 중 Gli 패밀리를 통해 Hh 효과기 경로에 대해 작용하는 스무든드(Smoothened)를 통한 신호전달을 감소시킨다. 세포 표면으로부터 글리피칸을 절단함으로써, 노텀은 막 근접 부위의 Hh에 대한 경쟁 농도를 감소시키고, 이로써, 스무든드 억제 인자인 Ptc에 결합하고 그를 억제시키는 Hh를 더 높은 유효 농도를 촉진시킴으로써 스무든드를 통한 Hh 신호전달을 증가시키고(문헌 ([Traister et al., 상기 문헌 동일] 및 [Filmus, 상기 문헌 동일])), 잠재적으로는 Ptc의 유전적 불활성화를 통해 Hh 신호전달 캐스케이드를 활성화시키는 유전자 모델을 복제한다. Wnt 패밀리 단백질과 같이, Hh 단백질은 지질이 변형된 것이며, 전체 복합체의 가용성을 개선시키는 관련된 단백질(예컨대, 글리피칸)의 도움없이는 거의 확산되지 않는다(문헌 [Eaton S., 2006, PMID: 16364628]).
Hh 모르포겐 구배는 다양한 고형성 조직의 기관 형성 및 발생에 있어 매우 중요하며, Hh 모르포겐 구배의 작은 변화 또는 Ptc를 통해 스무든드 신호전달을 억제시킬 수 있는 능력은 비정상적인 발생 및 암과 관련이 있다. 글리피칸 및 그와 관련된 Hh 단백질의 발산 증가를 촉진시킴으로써 노텀은 또한 Hh 및 글리피칸과 이의 밀착 결합을 특징으로 하는 난용성으로 인해 이전에는 존재하지 않았던 Hh의 새로운 농도 구배를 형성할 수 있다는 것 또한 이해하여야 한다. Hh 신호전달은 보통 다른 모르포겐 신호전달 경로와 협력하여 작용함으로써 정상적인 세포 운명 결정을 제어하는 반면, 스무든드의 구성적 활성화는 기저 세포 암종, 수모세포종 및 췌장 신생물을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 상승되어 있는 Hh 신호전달은 예를 들어, 암 발병 및 중증도를 증폭시키기 위해 APC 및/또는 KRAS 병터와 협력할 수 있다는 증거 또한 많이 존재한다. TPC 근접 부위의 상승되어 있는 노텀 수준은 Hh의 국소 농도 증가를 촉진시킬 수 있고, 유망하게는 원위부의 글리피칸 관련 Hh의 농도 구배 증가도 촉진시킬 수 있는 노텀의 능력에 기인하여 발암 및 종양 진행에 있어 중요할 수 있고, 아직은 인식되지 못한 주자일 수 있다.
마지막으로, 글리피칸은 다양한 조직에서 BMP/TGF 베타 패밀리 구성원의 국소 농도 구배를 조절하는 것으로 밝혀져 있으며(문헌 [Paine-Saunders et al., 2000, PMID 10964473]), 따라서, BMP 수용체 신호전달이 감소되어 있고/거나, 기능적으로 불활성화되어 있는 종양 및 뮤린 암 모델에서 관찰되는 바와 같이, 사실상 세포 표면으로부터 노텀 절단 및 유리에 대한 글리피칸의 감수성이 암 진행을 촉진시킬 수 있다(문헌 ([Kodach et al, 2008, PMID: 18008360] 및 [Hardwick et al., 2008, PMID: 18756288]). 일례로, BMP 수용체 돌연변이는 인간에서 소아 폴립증 증후군 및 암에 대한 기회 원인이다.
상기에서 논의된 바와 같이, 글리피칸은 조직 특이 방식으로 상이한 종류의 성장 인자 및 모르포겐을 조절한다. 노텀 발현과는 상관없이, 글리피칸의 변경된 유전자 발현 또한 발암을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 글리피칸 3은 특정 종양 유형에서 증식을 억제시키고, 세포 사멸을 유도한다. 따라서, 글리피칸 3은 종양 억제인자로서의 역할을 하고, 기원이 다른 다수의 종양에서 하향조절된다(문헌 [Filmus J, 2001, PMID: 11320054]). 본 발명의 골격에서 볼 때, TPC가 상승되어 있는 수준으로 노텀을 발현하는 종양에서 글리피칸 농도는 효과적으로 감소되어 있고, 이러한 감소가 발암 및 종양 진행에 대한 원인이 된다. 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 제공된 노텀 조절 인자는 이러한 수준을 감쇠시킬 수 있고, 가능하게는 원하는 항신생물성 반응을 부여할 수 있다.
상기 언급한 글리피칸 매개 조절 이외에도, (하기 실시예 24에서 예시된 바와 같이) 노텀의 리파제 활성은 Wnt 활성을 조절할 수 있는 추가의 기전을 제안한다; 예컨대, Wnt 단백질의 탈지질화는 Wnt의 보다 장거리 수송에 영향을 줄 뿐만 아니라, Wnt 수용체 및 공수용체와의 상호작용에 동요를 일으키면서 샤페론과 이의 상호작용을 조절할 수 있다. 광범위한 리파제 활성은 또한 지질 변형된 단백질(예컨대, BMP, Wnt & Hh)에 의해 매개되는 다른 신호전달 경로를 동요시킬 수도 있다. 따라서, 본원에 개시된 노텀 조절 인자는 추가로 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키고, 신생물성 성장 및/또는 전이를 억제시킴으로써 상기와 같은 효소적 활성을 방해할 수 있다.
비록 이러한 경로에 대해 지난 수년간 광범위하게 연구되기는 하였지만, 본 발명을 통해 설명되기 이전에는 노텀의 역할에 관하여 완전하게 인식되지 않았거나, 활용되지 못하였다. 이와 관련하여, 간세포암, 위암, 결장직장암 및 췌장암을 비롯한 다양한 고형 종양의 유전자 발현 프로파일링을 통해 노텀이 상기와 같은 신생물 환자에서 과발현되는 것으로 밝혀져 있다. 예컨대, (U.S.S.N. 제10/568,471호, U.S.S.N. 제10/301,822호, U.S.P.N. 제7,371,840호 및 문헌 [Torisu et al., 상기 문헌 동일])(이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)을 참조할 수 있다. 인간 노텀에 대한 단일 항체 생산이 U.S.S.N. 제10/568,471호에서 입증된 바 있지만, 상기 항체가 임의 유형의 치료학적 환경에서 효과적이라고 제시하는 증거는 없었다. 또한, 본 발명의 신규한 노텀 조절 인자와는 달리, 개시된 항체가 분비된 항체를 길항시킴으로써 본원에 개시된 항신생물성 효과를 가져올 수 있다고 말한 증거도 전적으로 없다. 어느 참고 문헌에서도 노텀이 종양 개시 세포와 관련이 있다거나, 또는 이러한 관련성이, 상기와 같은 종양 선동자가 감작되거나, 제거되거나, 또는 다르게는 중화됨으로써 이질성 종양 벌크가 유효하게 치료될 수 있도록 하는 효과적인 기전을 제공한다는 것을 입증한 증거도 없다.
III. 종양 개시 세포
선행 기술의 임의의 교시와는 대조적으로, 본 발명은 종양 개시 세포, 및 특히, 종양 영구 세포를 표적화함으로써 신생물성 장애의 치료, 관리, 또는 예방을 촉진시키는 데 특히 유용한 노텀 조절 인자를 제공한다. 더욱 구체적으로, 앞서 명시된 바와 같이, 놀랍게도, 특이 종양 세포 서브집단은 노텀을 발현하고, 암 줄기 세포 자기 재생 또는 세포 생존에 중요한 모르포겐 신호전달의 국소적인 조화를 변형시킬 가능성이 있다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 노텀의 조절 인자는 본 교시에 따라 종양 개시 세포 빈도를 감소시킴으로써 과증식성 질환의 치료 또는 관리를 촉진시키는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 종양 개시 세포(TIC)라는 용어는 종양 영구 세포(TPC; 즉, 암 줄기 세포 또는 CSC) 및 고도로 증식성인 종양 전구 세포(TProg로 명명된다), 둘 모두를 포함하는데, 이들은 모두 일반적으로는 벌크한 종양 또는 종괴의 독특한 서브집단(즉, 0.1-40%)을 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 종양 영구 세포 및 암 줄기 세포라는 용어는 본원에서 등가이며, 상호교환적으로 사용될 수 있다. 대조적으로, TPC는 작은 개수의 단리된 세포를 수회에 걸쳐 이식함으로써(마우스를 통해 2회 이상 계대접종) 입증된 바, 종양 내에 존재하는 종양 세포 조성물의 발생을 완전하게 반복할 수 있고, 무한 자기 재생능을 가질 수 있다는 점에서 TProg와는 차이를 보인다. 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 적절한 세포 표면 마커를 사용하는 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)은 적어도 부분적으로는 단일 세포와 세포 응괴(즉, 이중체)를 구별할 수 있는 이의 능력에 기인하여 고도로 강화된 세포 서브집단(순도 > 99.5%)을 단리시키는 데 있어 신뢰할 만한 방법이다. 상기 기법을 사용함으로써 고도로 정제된 TProg 세포를 작은 세포 개수로 면역약화된 마우스에 이식하였을 때, 1차 이식조직에서 종양 성장을 가속화시킬 수 있다. 그러나, 정제된 TPC 서브집단과는 달리, TProg 생성된 종양은 표현형상 세포 이질성에 있어 모체 종양을 완전하게 반영하지 못하고, 후속 이식조직에서 연속적인 종양신생을 재개시함에 있어 명백히 비효율적이다. 그에 반해, TPC 서브집단은 모체 종양의 세포 이질성을 완전하게 재구성하고, 연속하여 단리되고, 이식되었을 때, 종양을 효율적으로 개시할 수 있다. 따라서, 비록 TPC 및 TProg, 둘 모두 1차 이식조직에서 종양을 생성할 수 있기는 하지만, 그 둘 사이의 결정적인 차이는 작은 세포 개수로 연속하여 이식되었을 때, 이질성 종양 성장을 영속적으로 가속화시킬 수 있는 TPC의 독특한 능력이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 비록 마커 발현이 배양 조건 및 시험관내 세포주 계대접종에 따라 변할 수는 있지만, TPC의 특징을 규명하는 다른 일반적인 접근법으로는 형태학적 성질과 세포 표면 마커, 전사 프로파일, 및 약물 반응 조사를 포함한다.
따라서, 본 발명의 목적을 위해, 정상적인 조직에서 세포 계층을 지지하는 정상적인 줄기 세포와 같이, 종양 영구 세포는 바람직하게, 다계통 분화능은 유지하면서, 무한대로 자기 재생할 수 있는 이의 능력에 의해 정의된다. 따라서, 종양 영구 세포는 종양원성 자손(즉, 종양 개시 세포: TPC 및 TProg) 및 비종양신생(NTG) 자손, 둘 모두를 생성할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비종양신생 세포(NTG)란 종양 개시 세포로부터 발생되기는 하지만, 그 스스로 자기 재생능을 가지고 있지 않거나, 또는 종양을 포함하는 종양 세포의 이질성 계통을 가지지 않는 종양 세포를 의미한다. 실험상, NTG 세포는 심지어 과량의 세포 개수로 이식된 경우에도 마우스에 재현가능하게 종양을 형성하지 못한다.
언급한 바와 같이, TProg는 또한 마우스에서 종양을 생성할 수 있는 이의 제한된 능력에 기인하여 종양 개시 세포(또는 TIC)로 분류된다. TProg는 TPC의 자손이며, 이는 전형적으로 한정된 회수의 비자기 재생 세포 분열을 할 수 있다. 또한, TProg 세포는 추가로 조기 종양 전구 세포(ETP: early tumor progenitor cell) 및 후기 종양 전구 세포(LTP: late tumor progenitor cell)로 나누어질 수 있는데, 이들은 각각 표현형(예컨대, 세포 표면 마커) 및 종양 세포 구조의 발생을 반복할 수 있는 상이한 능력에 의해 구별될 수 있다. 상기와 같은 기술상의 차이에도 불구하고, ETP 및 LTP, 둘 모두 일반적으로는 작은 세포 개수로 이식되었을 때에 종양 세포를 연속하여 재구성할 수 있는 능력은 더 작고, 전형적으로는 모체 종양의 이질성을 반영하지 못한다는 점에서 TPC와 기능적으로 차이가 난다. 상기와 같은 차이에도 불구하고, 다양한 TProg 집단은 드물게는, 보통 줄기 세포에 기인하는 자기 재생능을 획득할 수 있고, 그 스스로 TPC(또는 CSC)가 될 수 있다는 것 또한 밝혀졌다. 어느 경우에든, 두 유형의 종양 개시 세포 모두 단일 환자의 전형적인 종양 종괴에서 나타날 수 있고, 본원에 개시된 바와 같이, 조절 인자를 이용한 치료의 대상이 된다. 즉, 개시된 조성물은 일반적으로 종양에서 나타나는 믹스 또는 특정 실시양태와는 상관없이 상기 노텀 양성 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키거나, 이의 화학적감작성을 변경시키는 데 효과적이다.
본 발명과 관련하여, TPC는 벌크한 종양을 포함하는 TProg(ETP 및 LTP, 둘 모두), NTG 세포 및 종양 침윤성 비TPC 유래 세포(예컨대, 섬유아세포/기질, 내피 & 조혈 세포)보다 종양신생성이 더 크고, 상대적으로 휴지성이 더 크며, 대개는 화학 내성이 더 크다. 종래 치료법 및 요법이 주로는 종양의 용적을 축소시키기 위해, 및 빠르게 증식하는 세포를 공격하기 위해, 이 두 목적을 위해 디자인된 것임을 고려해 볼 때, TPC는 보다 빠르게 증식하는 TProg 및 다른 벌크한 종양 세포 집단보다도 종래 치료법 및 요법에 대하여 더 큰 내성을 띨 가능성을 가지고 있다. 추가로, TPC는 대개 예컨대, 다중 약물 내성 수송체 발현 증가, DNA 수복 기전 증진, 및 항아포프토시스 단백질과 같은, 종래 치료법에 대해 상대적으로 화학 내성을 띠도록 만드는 다른 특징들을 나타낸다. 이러한 특성들은 각각 TPC에 의한 약물 저항성에 대한 원인이 되는데, 이러한 특성이 진행성 병기의 신생물을 가진 대부분의 환자에 대해 장기간에 걸쳐 확실하게 이익이 될 수 있는 표준 종양학적 치료 요법을 실패로 만드는, 즉, 계속하여 종양 성장 및 재발을 가속화시키는 세포(즉, TPC 또는 CSC)를 적절하게 표적화하지 못하고, 근절시키지 못하는 주요 원인이 되는 것으로 여겨지다.
상기 언급한 다수의 종래 기술의 치료법과는 달리, 본 발명의 신규한 조성물은 바람직하게는 선택된 조절 인자의 형태 또는 특이 표적(예컨대, 유전 물질, 노텀 또는 노텀 리간드)과는 상관없이, 피험체에게 투여되었을 때에 종양 개시 세포의 빈도를 감소시킨다. 상기 언급한 바와 같이, 종양 개시 세포 빈도는 a) 종양 개시 세포의 제거, 고갈, 감작, 침묵화 또는 억제; b) 종양 개시 세포의 성장, 확장 또는 재발의 제어; c) 종양 개시 세포의 개시, 전파, 유지, 또는 증식 방해; 또는 d) 다르게는, 종양신생 세포의 생존, 재생 및/또는 전이 방해의 결과로서 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 개시 세포 빈도는 하나 이상의 생리학적 경로 변화의 결과로서 감소될 수 있다. 종양 개시 세포의 감소 또는 제거에 의해서든, 또는 이의 잠재능(예컨대, 분화 유도, 니치 파괴)의 변형에 의해서든, 또는 다르게는 종양 환경 또는 다른 세포에 대해 영향을 미칠 수 있는 이의 능력 방해에 의해서든 간에, 경로 변화는 결국 종양신생, 종양 유지 및/또는 전이 및 재발을 억제시킴으로써 노텀과 관련된 장애가 보다 효과적으로 치료될 수 있도록 한다.
상기와 같은 종양 개시 세포의 빈도 감소를 평가하는 데 사용될 수 있는 방법 중에는 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 진행한 후, 바람직하게는 푸아송 분포 통계를 사용하여 계산하거나, 생체내에서 종양을 생성할 수 있거나, 없는 능력과 같은, 기정의된 결정적 이벤트의 빈도를 평가하는 것이 있다. 상기와 같은 제한 희석 분석이 종양 개시 세포 빈도 감소를 계산하는 데 있어 바람직한 방법이지만, 비록 정확도면에 있어서 약간 떨어지기는 하여도 다른 부담이 덜 한 방법 또한 원하는 값을 효과적으로 측정하는 데 사용될 수 있고, 이는 본원의 교시와 전적으로 화합성이다. 따라서, 당업자가 이해하는 바와 같이, 주지된 유세포 측정 또는 면역조직화학적 수단을 통해 빈도 값의 감소를 측정할 수도 있다. 상기 언급된 모든 방법과 관련하여, 예를 들어, 문헌 ([Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402] & [Hoey et al. 2009, PMID: 19664991])(이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)을 참조할 수 있다.
제한 희석 분석과 관련하여, 종양 개시 세포 빈도의 시험관내 계산은 (예컨대, 각각 처리된 및 비처리된 종양으로부터) 분획된 또는 미분획된 인간 종양 세포를, 콜로니 형성을 조성하는 시험관내 성장 조건으로 침착시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 간단하게 콜로니를 계수하고 이의 특징을 규명함으로써, 또는 예를 들어, 인간 종양 세포를 일련으로 희석하여 플레이트로 침착시키고, 플레이팅 후 10일 이상의 시간이 경과한 후, 콜로니 형성에 대해 양성 또는 음성인 것으로 각 웰을 점수화하는 것으로 이루어진 분석에 의해 콜로니 형성 세포를 계산할 수 있다. 일반적으로 종양 개시 세포 빈도를 측정할 수 있는 그 능력에 있어서 보다 정확한 것인 생체내 제한 희석 실험 또는 분석은 비처리 대조군 또는 처리된 조건으로부터의 인간 종양 세포를 예를 들어, 일련으로 희석하여 면역약화된 마우스에 이식시킨 후, 이식 후 60일 이상의 시간이 경과한 후, 종양 형성에 대해 양성 또는 음성인 것으로 각 마우스를 점수화하는 것을 포함한다. 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석에 의한 세포 빈도 값은 바람직하게는 푸아송 분포 통계를 양성 및 음성 이벤트의 공지 빈도에 적용시켜 양성 이벤트의 정의를 준수하는 이벤트에 대한 빈도를 제공함으로써 도출할 수 있는데; 양성 이벤트인 경우, 시험관내 또는 생체내에 있어서 이들은 각각 콜로니 또는 종양 형성이다.
종양 개시 세포 빈도를 계산하는 데 사용될 수 있는 본 발명과 화합성인 다른 방법과 관련하여, 가장 보편적인 것으로는 정량가능한 유세포 측정 기법 및 면역조직화학적 염색 방법을 포함한다. 바로 앞에서 기술된 제한 희석 분석 기법만큼 정확한 것은 아니지만, 상기 방법은 훨씬 덜 노동 집약적이고, 상대적으로 단기간에 적당한 값을 제공한다. 따라서, 당업자는 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 공지된, 당업계에 알려져 있는 세포 표면 단백질(예컨대, 잠재적으로 화합성인 마커는 하기 실시예 1에 기술되어 있다)에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 시약을 사용하는 유세포 측정 세포 표면 마커 프로파일 측정을 사용하여, 다양한 시료로부터 TIC 수준을 측정할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가의 또 다른 화합성 방법에서, 당업자는 상기 세포들의 경계를 구분하는 것으로 여겨지는 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 시약을 사용하여 면역조직화학법에 의해 계내(즉, 조직 절편)에서 TIC 빈도를 계산할 수 있다.
이어서, 상기 언급된 방법들 중 임의의 것을 사용함으로써, 본원의 교시에 따라 개시된 노텀 조절 인자에 의해 제공되는 TIC(또는 그안의 TPC)의 빈도 감소를 정량화할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 화합물은 (제거, 분화 유도, 니치 파괴, 침묵화 등을 비롯한, 상기 언급된 다양한 기전에 의해) TIC의 빈도를 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 만큼 또는 심지어는 35% 만큼 감소시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, TIC의 빈도는 대략 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% 감소될 수 있다. 특정 실시양태에서, 개시된 화합물은 TIC의 빈도를 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 만큼 또는 심지어는 95% 만큼 감소시킬 수 있다. 물론, 임의의 TIC 빈도 감소가 가능하게는 그에 상응하여 종양신생, 신생물 지속, 재발, 및 침습을 감소시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
IV. 노텀 조절 인자
어느 경우에서든, 본 발명은 악성 종양과 관련된 다수의 노텀 중 어느 하나의 진단, 치료 및/또는 예방을 위한, 노텀 길항제를 비롯한, 노텀 조절 인자의 용도에 관한 것이다. 개시된 조절 인자는 단독으로, 또는 매우 다양한 항암 화합물, 예컨대, 화학치료제 또는 면역치료제 또는 생물학적 반응 개질제와 함께 사용될 수 있다. 다른 선택된 실시양태에서, 2가지 이상의 별개의 노텀 조절 인자는 증진된 항신생물성 효과를 제공하기 위해 조합하여 사용될 수 있거나, 다중특이성 구성체를 제작하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 노텀 조절 인자는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 것이다. 더욱더 바람직하게, 조절 인자는 가용성 노텀(s노텀) 또는 이의 형태, 변이체, 유도체 또는 단편, 예를 들어, 노텀 융합 구성체(예컨대, 노텀-Fc, 노텀-표적화 모이어티 등) 또는 노텀-접합체(예컨대, 노텀-PEG, 노텀-세포독성제, 노텀-brm 등)를 포함할 것이다. 다른 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 항체(예컨대, 항노텀 mAb) 또는 이의 면역반응성 단편 또는 유도체를 포함한다는 것 또한 이해할 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 중화 항체 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 다른 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 내재화 항체를 포함할 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 고갈 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 언급한 융합 구성체와 마찬가지로, 상기 항체 조절 인자는 선택된 세포독성제, 중합체, 생물학적 반응 개질제(BRM: biological response modifier) 등에 접합되거나, 연결되거나, 또는 다르게는 회합됨으로써 다양한 (및 임의로 다중의) 작용 기전을 가진 지향성 면역요법을 제공할 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 조절 인자는 유전자 수준에서 작용할 수 있고, 안티센스 구성체, siRNA, 마이크로RNA 등과 같은 화합물을 포함할 수 있다.
개시된 노텀 조절 인자는 예를 들어, 노텀 조절 인자의 형태, 임의의 관련된 페이로드 또는 전달을 위한 투여 및 전달 방법에 따라, 선택된 경로를 작용시키거나 길항시키는 것, 또는 특정 세포를 제거하는 것을 비롯한 다양한 기전을 통해 종양 세포, 특히, TPC, 및/또는 관련된 신생물을 고갈시키거나, 제거하거나, 억제시킬 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 따라서, 본원에 개시된 바람직한 실시양태는 특이적인 종양 세포 서브집단, 예컨대, 종양 영구 세포의 고갈, 억제 또는 침묵화이지만, 그러한 실시양태는 단지 예시적인 것이고, 어떤 의미로든 제한하는 것이 아니라는 것이 강조되어야 한다. 오히려, 첨부된 특허청구범위에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 광범위하게는 어느 특정 기전 또는 표적 종양 세포 집단과는 상관없이 노텀 조절 인자, 및 다양한 노텀 매개 과증식성 장애의 치료, 관리, 또는 예방에서의 이의 용도에 관한 것이다.
같은 의미에서, 본 발명의 개시된 실시양태는 하나 이상의 노텀 길항제를 포함한다. 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 노텀 길항제는 노텀 단백질 또는 이의 단편을 인식하거나, 그와 반응하거나, 그와 결합하거나, 그와 경쟁하거나, 그와 회합하거나, 또는 다르게는 그와 상호작용하고, 종양 개시 세포 또는 벌크한 종양 또는 NTG 세포를 비롯한 다른 신생물성 세포의 성장을 제거하거나, 침묵화시키거나, 감소시키거나, 억제시키거나, 방해하거나, 저지하거나 또는 제어하는 임의의 리간드, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 항체 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 선택된 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 노텀 길항제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 길항제란 수용체의 리간드에의 결합, 또는 효소와 기질의 상호작용을 비롯한, 특정의 또는 언급된 단백질의 활성을 중화, 차단, 억제, 파괴, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 의미한다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 길항제는 항체 및 이의 항원 결합 단편 또는 유도체, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 다당류, 올리고당, 핵산, 안티센스 구성체, siRNA, miRNA, 생체유기 분자, 펩티드 모방체, 약학 제제 및 이의 대사산물, 전사 및 번역 제어 서열 등을 포함할 수 있다. 길항제는 또한 소분자 억제제, 융합 단백질, 수용체 분자 및 상기 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 기질 표적에의 이의 결합을 격리시키는 유도체, 상기 단백질의 길항제 변이체, 상기 단백질에 대한 안티센스 분자, RNA 압타머, 및 상기 단백질에 대한 리보자임을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되고, 2가지 이상의 분자 또는 화합물에 적용되는 바, 인식한다 또는 특이적으로 인식한다라는 용어는 한 분자가 다른 한 분자에 대해 효과를 발휘할 수 있는 방식의, 공유 또는 비공유적인 분자의 반응, 결합, 특이적인 결합, 조합, 회합, 상호작용, 연결, 연관, 연합, 융합, 합병 또는 접합을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
또한, 본원 실시예에서 입증된 바와 같이, 특정 경우에, 인간 노텀의 일부 조절 인자는 인간 이외의 종(예컨대, 뮤린)으로부터 유래된 노텀과 교차 반응할 수 있다. 다른 경우에, 예시적인 조절 인자는 인간 노텀의 하나 이상의 이소폼에 대해 특이적일 수 있고, 다른 종으로부터 유래된 노텀 오르토로그와의 교차 반응성을 보이지 않을 것이다.
어느 경우에서든, 개시된 조절 인자는 접합된 형태 또는 접합되지 않은 형태로 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 즉, 조절 인자는 약학적 활성 화합물, 생물학적 반응 개질제, 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 진단학적 모이어티 또는 생체화합성 개질제와 (예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로) 회합하거나, 또는 이에 접합될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 접합체는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방체 작용제, 합성 약물, 무기 분자, 유기 분자 및 방사성 동위원소를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 상기 언급한 바와 같이, 선택된 접합체는 적어도 부분적으로는 접합을 일으키는 데 사용되는 방법에 따라 다양한 몰비로 공유적으로 또는 비공유적으로 조절 인자에 연결될 수 있다.
V. 항체
a. 개요
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 항체 형태의 노텀 조절 인자를 포함한다. 본원에서 항체라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이는 구체적으로 합성 항체, 단일클론 항체, 올리고클론 또는 다중클론 항체, 다클론 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 인트라바디, 다중특이성 항체, 이특이성 항체, 1가 항체, 다가 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 영장류화된 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 단일 쇄 FvFc(scFvFc: single-chain Fv), 단일 쇄 Fv(scFv: single-chain Fv), 항이디오타입(항Id: anti-idiotypic) 항체, 및 원하는 생물학적 활성(즉, 노텀 회합 또는 결합)을 보이는 한, 임의의 다른 면역학적으로 활성인 항체 단편을 포함한다. 보다 더 광범위한 의미에서, 본 발명의 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉, 항원 결합부를 포함하는 분자를 포함하며, 여기서, 상기 단편은 Fc 영역 또는 이의 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는 또 다른 면역글로불린 도메인에 융합되거나, 또는 융합되지 않을 수 있다. 추가로, 본원에서 더욱 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, 항체 및 항체들이라는 용어는 구체적으로 하기에서 설명되는 바와 같은, 임의로 1 이상의 아미노산 잔기 변형을 포함하고, 면역글로불린의 면역학적으로 활성인 단편에 융합된, 전장의 항체 및 Fc 영역을 포함하는 변이체 Fc 융합물, 또는 이의 단편을 비롯한 Fc 변이체를 포함한다.
하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린이라는 일반 용어는 생화학적으로 구별될 수 있고, 이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 적절한 부류로 쉽게 지정될 수 있는 5가지의 별개 부류의 항체를 포함한다. 역사적 이유에서, 주요 부류의 무손상 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로 명명된다. 인간에서, IgG 및 IgA 부류는 구조 및 특정의 생화학적 특성에 따라 알려진 서브부류(이소형), 즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 인간에서 IgG 이소형은 혈청 중의 이의 존재량의 순서대로 명명되는데, IgG1이 가장 풍부하게 존재한다는 것을 이해할 것이다.
항체의 5가지 부류 모두(즉, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM) 및 이소형 모두(즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2) 뿐만 아니라, 이의 변이체가 본 발명의 범주 내에 포함되며, IgG 부류의 면역글로불린을 포함하는 바람직한 실시양태는 단지 설명 목적으로 좀 더 상세하게 논의될 것이다. 그러나, 그러한 개시내용은 단지 예시적인 조성물 및 본 발명을 실시하는 방법을 증명하는 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주 또는 그에 첨부된 특허청구범위를 제한하고자 하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다.
이와 관련하여, 인간 IgG 면역글로불린은 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 이소형에 따라 분자량이 53,000-70,000인 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 상응하는 소문자 그리스 문자 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 표시된다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 명명되는, 뚜렷이 다른 2개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 당업자는 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열이 주지되어 있음을 이해할 것이다.
4개의 쇄가 Y 배열로 이황화 결합에 의해 연결되어 있는데, 여기서, 경쇄는, Y의 입구(mouth)에서 출발하여 가변 영역을 거쳐 Y의 이중 말단으로까지 계속하여 이어지는 중쇄를 브래킷화하고 있다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있는 반면, 힌지 영역의 2개의 이황화 결합은 중쇄를 연결한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 IgG의 이소형에 기초하여 달라질 수 있는 개수로 일정하게 이격되어 있는 쇄간 이황화 브릿지를 가지고 있다.
각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VH)에 이어서 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에는 가변 도메인(VL)을, 그리고, 이의 나머지 다른 한쪽 말단에는 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부위, 둘 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 이해할 것이다. 대조적으로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대, 분비, 경태반 이동, 순환 반감기, 보체 결합 등을 부여하고, 조절한다. 관례상, 불변 영역 도메인은 항체의 항원 결합부 또는 아미노 말단으로부터 더 원거리에 있을수록 그 번호는 증가한다. 따라서, 항체의 아미노 또는 N 말단은 가변 영역을 포함하고, 카복시 또는 C 말단은 불변 영역을 포함한다. 따라서, CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카복시 말단을 포함한다.
가변이라는 용어는 가변 도메인 중의 특정 부위가 면역글로불린 간에 서열에 있어 광범위하게 차이가 나고, 이들 쟁점 부위가 대개 특정 항체의 결합 및 특이성 특징을 정의한다는 사실을 의미한다. 이들 초가변 부위는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 둘 모두에서 각각 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로 알려져 있는 3개의 세그먼트로 그 모습을 드러낸다. CDR 측면에 위치하는, 가변 도메인의 더욱 고도로 보존되는 부위는 골격 영역(FR: framework region)으로 명명된다. 더욱 구체적으로, 천연적으로 발생된 단량체 IgG 항체에서, 항체의 각 아암에 존재하는 6개의 CDR은, 수성 환경에서는 항체가 이의 3차원 배열을 취하는 바, 항원 결합부를 형성하기 위해 특이적으로 배치되는 짧은, 비연속 아미노산 서열이다.
중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 나머지 부분을 포함하는 골격 영역은 아미노산 서열에서 보다 작은 분자간 가변성을 나타낸다. 오히려, 골격 영역은 대개 β 쉬트 입체형태를 취하고, CDR은 β 쉬트 구조의 일부를 연결하거나, 일부 경우에서는 그를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 이러한 골격 영역은 CDR이 쇄간 비공유 상호작용에 의해 올바른 배향으로 배치되도록 하는 스캐폴드를 형성하는 역할을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합부가 면역반응성 항원(즉, 노텀) 상의 에피토프에 대해 상보적인 표면을 정의한다. 이러한 상보적인 표면이 항체의 면역반응성 항원 에피토프에의 비공유 결합을 촉진시킨다. CDR의 위치는 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 확인될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두 또는 그 일부는 표준 재조합 및 발현 기법을 사용하여 재조합 또는 조작됨으로써 유효 항체를 제공할 수 있다. 즉, 제1 항체(또는 이의 임의 부위)로부터의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 제2 항체로부터의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 임의의 선택된 부위와 혼합하고 매치시킬 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 제1 항체의 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 전체 경쇄 가변 영역을 제2 항체의 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 전체 중쇄 가변 영역과 쌍을 형성하여 작동 항체를 제공할 수 있다. 또한, 다른 실시양태에서, 다양한 항체로부터 유도된 개별 중쇄 및 경쇄 CDR을 혼합하고 매치시켜 최적화된 특징을 가지는 원하는 항체를 제공할 수 있다. 따라서, 예시적인 항체는 제1 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR, 제2 항체로부터 유도된 2개의 중쇄 CDR 및 제3 항체로부터의 세번째 중쇄 CDR을 포함할 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명과 관련하여, 도 7b의 개시된 중쇄 및 경쇄 CDR 중 임의의 것을 상기 방식으로 재정렬함으로써 본 발명의 교시에 따른 최적화된 항노텀(예컨대, 항노텀) 항체를 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
어느 경우에서든, 상보성 결정 영역 잔기 번호는 문헌 [Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)]의 것에 따라 정의될 수 있으며, 구체적으로, 경쇄 가변 도메인에서는 잔기 24-34(CDR1), 50-56(CDR2) 및 89-97(CDR3)이고, 중쇄 가변 도메인에서는 31-35(CDR1), 50-65(CDR2) 및 95-102(CDR3)이다. CDR은 항체마다 상당히 다르다는 것(그리고, 정의상 카바트(Kabat) 컨센서스 서열과 상동성을 보이지 않을 것이다는 것)에 주의한다. 골격 잔기가 최대로 정렬되도록 하기 위해서는 빈번하게는 번호 매김 체계에서 스페이서 잔기 삽입을 Fv 영역에 대하여 사용하여야 한다. 추가로, 종간 또는 대립유전자 차이에 기인하여 임의의 주어진 카바트 부위 번호에서 특정의 개별 잔기의 정체는 항체 쇄마다 달라질 수 있다. 또한, 문헌 ([Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)] 및 [MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745(1996)])(여기서, 서로에 대해 비교하는 경우, 정의는 중복 또는 서브세트 아미노산 잔기를 포함한다)을 참조할 수 있다. 상기 언급된 각각의 참고 문헌은 이의 전문이 본원에 참고로 포함되고, 각각의 상기 인용된 참고 문헌들에 의해 정의되는 바와 같은 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 기술된다.
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비록 본 출원의 컨텐츠가 주어진다면, 당업자는 각각의 중쇄 및 경쇄 서열에 대한 CDR을 문헌 [Kabat et al.] 또는 문헌 [MacCallum et al.]에 의해 정의된 바와 같이 쉽게 확인하고 열거할 수 있지만, 편의상, 도 7b에 제시되어 있고, 도 31A 및 31B에 밑줄로 표시되어 있는 CDR은 문헌 [Chothia et al.]의 명명법을 사용하여 정의한다. 따라서, 상기 명명법에 의해 정의된 CDR을 포함하는 항체는 명백하게 본 발명의 범주 내에 포함된다. 더욱 광범위하게, 가변 영역 CDR 아미노산 잔기라는 용어는 상기 기술된 임의의 서열 또는 구조 기반 방법을 사용하여 확인되는 바와 같은 CDR의 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 가변 영역 골격(FR) 아미노산 잔기라는 용어는 Ig 쇄의 골격 영역의 아미노산을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 골격 영역 또는 FR 영역이라는 용어는 가변 영역의 일부이기는 하지만, (예컨대, 카바트의 CDR 정의를 사용하였을 때), CDR의 일부는 아닌 것인 아미노산 잔기를 포함한다. 그러므로, 가변 영역 골격은 길이가 약 100-120개 사이의 아미노산인 비연속 서열이지만, CDR 바깥쪽의 아미노산만을 포함한다.
문헌 [Kabat et al.]에 의해 정의되는 바와 같이 CDR 및 중쇄 가변 영역이 구체적인 예에 대해서, 골격 영역 1은 아미노산 1-30을 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 골격 영역 2는 아미노산 36-49를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 골격 영역 3은 아미노산 66-94를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 골격 영역 4는 아미노산 103 내지 가변 영역의 말단까지의 가변 영역의 도메인에 상응한다. 경쇄에 대한 골격 영역은 유사하게 각각의 경쇄 가변 영역 CDR에 의해 분리되어 있다. 유사하게, 문헌 [Chothia et al.] 또는 문헌 [McCallum et al.]에 의한 CDR 정의를 사용하면, 골격 영역 경계는 상기 기술되어 있는 바와 같이, 각각의 CDR 말단에 의해 분리되어 있다.
상기 언급된 구조를 고려해 보았을 때, 본 발명의 항체는 다수의 기능적 실시양태 중 어느 하나를 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이와 관련하여, 화합성 항체는 피험체에서 원하는 생리학적 반응을 제공하는 임의의 면역반응성 항체(상기 용어는 본원에 정의되어 있는 바와 같다)를 포함할 수 있다. 개시된 항체 중 임의의 것이 본 개시와 함께 사용될 수 있지만, 본 발명의 특정 실시양태는 키메라, 인간화된 또는 인간 단일클론 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함할 것이다. 추가의 다른 실시양태는 예를 들어, 동종성 또는 이종성 다량체 구성체, Fc 변이체 및 접합된 또는 당화 방식으로 변경된 항체를 포함할 수 있다. 또한, 그러한 배열이 상호 배타적인 것은 아니며, 화합성인 개체 항체는 본원에 개시된 기능적 측면들 중 하나 이상을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 화합성 항체는 인간화된 가변 영역을 포함하는 단일 쇄 디아바디 또는 당화 패턴을 변경시켜 혈청 반감기를 조정하는 Fc 변형을 포함하는 완전 인간 전장의 IgG3 항체를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 실시양태는 당업자에게 쉽게 자명해질 것이며, 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다.
b. 항체 생성
주지되어 있는 바와 같이, 토끼, 마우스, 래트 등을 비롯한 다양한 숙주 동물을 접종하고 사용함으로써 본원의 교시에 따른 항체를 제공할 수 있다. 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 것인, 당업계에 공지된 애주번트로는 접종된 종에 따라서, 프로인트(Freund's)(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예컨대, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애주번트 예컨대, BCG(바실레 칼메트 구에린: bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기와 같은 애주번트는 국소 침착물에 항원을 격리시킴으로써 항원이 빠르게 분산되지 못하도록 보호할 수 있거나, 또는 대식세포 및 면역계의 다른 성분들에 대하여 화학주성을 띠는 인자를 분비하도록 숙주를 자극시키는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게, 폴리펩티드를 투여할 경우, 면역화 스케줄은 수주간의 간격을 두고 진행되는 2회 이상의 폴리펩티드 투여를 포함할 것이다.
노텀 면역원을 이용하여 동물을 면역화시킨 후, 당업계에 알려져 있는 기법을 사용하여 동물로부터 항체 및/또는 항체 생산 세포를 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동물을 출혈시키거나, 희생시킴으로써 다중클론 항노텀 항체 함유 혈청을 수득한다. 혈청은 동물로부터 수득된 형태로 연구 목적을 위해 사용될 수 있거나, 또는 별법으로, 항노텀 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 정제함으로써 면역글로불린 분획 또는 동종성 항체 제제를 제공할 수 있다.
c. 단일클론 항체
다중클론 항체가 본 발명의 특정 측면과 함께 사용될 수 있지만, 바람직한 실시양태는 노텀 반응성 단일클론 항체의 용도를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 단일클론 항체 또는 mAb라는 용어는 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하며, 즉, 집단에 포함되어 있는 개별 항체들은 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예컨대, 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하면 동일한 것이다. 따라서, 단일클론이라는 수식어는 상이한 항체로 이루어진 혼합물이 아니라는 항체의 특징을 의미하며, 이는 임의 유형의 항체와 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 단일클론 항체는 노텀과 결합하거나, 회합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서, 노텀 결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 수득되었다.
바람직한 실시양태에서, 항체 생산 세포주는 면역화된 동물로부터 단리된 세포로부터 제조된다. 면역화 후, 동물을 희생시키고, 림프절 및/또는 비장 B 세포를 당업계에 주지된 수단에 의해 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법으로는 세포를 온코진으로 형질감염시키는 것, 세포를 종양원성 바이러스로 감염시키고, 불멸화된 세포를 선택할 수 있는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 것, 세포를 발암성 또는 돌연변이화 화합물에 가하는 것, 세포를 불멸화된 세포, 예컨대, 골수종 세포와 융합시키는 것, 및 종양 억제 유전자를 불활성화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 골수종 세포와의 융합을 사용할 경우, 골수종 세포는 바람직하게는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다(비분비성 세포주). 불멸화된 세포는 노텀, 또는 이의 면역반응성 부위를 사용하여 스크리닝된다. 바람직한 실시양태에서, 초기 스크리닝은 효소 결합 면역검정법(ELISA: enzyme-linked immunoassay) 또는 방사선면역검정법을 사용하여 수행된다.
더욱 일반적으로, 본 발명과 일치하는 별개의 단일클론 항체는 하이브리도마, 재조합 기법, 파지 디스플레이 기술, 효모 라이브러리, 트랜스제닉 동물(예컨대, 제노마우스(XenoMouse)® 또는 HuMAb 마우스(HuMAb Mouse)®) 또는 이의 일부 조합을 비롯한, 당업계에 공지된 매우 다양한 기법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 예컨대, 상기에 광범위하게 기술되어 있고, 문헌 ([Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)])(이들 각각은 본원에 포함된다)에 더욱 상세하게 교시되어 있는 것과 같은 하이브리도마 기법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 개시된 프로토콜을 사용하여, 바람직하게는 관련 항원 및 애주번트를 다회에 걸쳐 피하 또는 복강내 주사함으로써 포유동물에서 항체를 발생시킨다. 앞서 논의된 바와 같이, 이러한 면역화는 일반적으로 비장세포 또는 림프구로부터 (면역화된 동물이 트랜스제닉일 경우에는 완전한 인간 항체일 수 있는) 항원 반응성 항체 생산을 포함하는 면역 반응을 유도한다. 생성된 항체를 동물의 혈청으로부터 수거하여 다중클론 제제를 수득할 수 있는 반면, 일반적으로는 비장, 림프절 또는 말초 혈액으로부터 개별 림프구를 단리시켜 균질한 단일클론 항체 제제를 수득하는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 가장 전형적으로는, 비장으로부터 림프구를 수득하고, 불멸화시켜 하이브리도마를 수득한다.
예를 들어, 상기 기술된 바와 같이, 선택 과정은 복수개의 클론, 예컨대, 하이브리도마 클론, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론 풀로부터 유일의 클론을 선택하는 것일 수 있다. 예를 들어, 표적에 대한 친화성을 개선시키기 위해, 표적 결합 서열을 인간화시키기 위해, 세포 배양물 중에서의 이의 생산을 개선시키기 위해, 생체내에서의 이의 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이성 항체를 생산하기 위해서 등의 목적으로 선택된 노텀 결합 서열을 추가로 변경시킬 수 있고, 변형된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 단일클론 항체라는 것을 이해하여야 한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대한 별개의 항체를 포함하는 것인 다중클론 항체 제제와는 달리, 단일클론 항체 제제의 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 이의 특이성 이외에도, 단일클론 항체 제제는 교차 반응성일 수 있는 다른 면역글로불린에 의해 전형적으로는 오염되지 않는다는 점에서 이롭다.
d. 키메라 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 2가지 이상의 상이한 종 또는 유형의 항체로부터의 공유적으로 연결된 단백질 세그먼트로부터 유도된 키메라 항체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 키메라 항체라는 용어는, 중쇄 및/또는 경쇄 부위가 특정 종으로부터 유래되거나, 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 그와 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 보이는 한은 상기 항체의 단편 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 그와 상동성인 구성체에 대한 것이라는 것을 이해할 것이다(미국 특허 번호 제4,816,567호; 문헌 [Morrison et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)]). 한 예시적인 실시양태에서, 본원의 교시에 따른 키메라 항체는 뮤린 VH 및 VL 아미노산 서열 및 인간 공급원으로부터 유래된 불변 영역을 포함할 수 있다. 다른 화합성인 실시양태에서, 본 발명의 키메라 항체는 하기 기술하는 바와 같은 CDR 이식된 또는 인간화된 항체를 포함할 수 있다.
일반적으로, 키메라 항체를 제조하는 목적은 의도되는 피험체 종으로부터의 아미노산의 개수가 최대화된 키메라를 생성하고자 하는 것이다. 일례로, 항체가 특정 종으로부터 유래되거나, 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 반면, 항체 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나, 그와 상동성인 것인 CDR 이식된 항체가 있다. 인간에서 사용하기 위해서는, 인간 항체의 천연적으로 발생된 가변 영역 또는 CDR을 대체하면서, 설치류 항체로부터의 가변 영역 또는 선택된 CDR을 인간 항체 내로 이식시킨다. 이러한 구성체는 일반적으로는 피험체에 의한 항체에 대한 원치않는 면역 반응을 감소시키면서, 완전한 강도의 조절 인자 기능(예컨대, CDC, ADCC 등)을 제공할 수 있다는 이점을 가진다.
e. 인간화된 항체
인간화된 항체는 CDR 이식된 항체와 유사하다. 일반적으로, 인간화된 항체는 먼저 비인간 동물에서 유발된 단일클론 항체로부터 생산된다. 본원에서 사용되는 바, 인간화된 형태의 비인간(예컨대, 뮤린) 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 최소로 포함하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수령체 항체)의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 가지는 비인간 종(공여체 항체), 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 CDR로부터의 잔기로 대체된 것인 인간 면역글로불린(수령체 항체)이다.
선택된 실시양태에서, 수용체 항체는 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. 컨센서스 인간 골격을 생성하기 위해, 수개의 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 골격을 정렬하여 컨센서스 아미노산 서열을 확인할 수 있다. 또한, 여러 경우에 있어서, 인간 면역글로불린의 가변 도메인 중의 하나 이상의 골격 잔기는 공여체 항체로부터의 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 이러한 골격 치환은 예컨대, 항원 결합에 중요한 골격 잔기를 확인하기 위한 CDR과 골격 잔기의 상호작용의 모델링, 및 특정 위치의 비정상적인 골격 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의한 것과 같은 당업계에 주지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 그러한 치환은 이식된 CDR(들)의 적절한 3차원 배열을 유지시키는 데 도움이 되고, 대개는 골격 치환이 없는 유사 구성체에 비하여 무한성을 개선시킨다. 추가로, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 추가로 항체 성능을 개선시키기 위해 주지된 기법을 사용하여 상기와 같이 변형시킬 수 있다.
CDR 이식 및 인간화된 항체는 예를 들어, U.S.P.N. 제6,180,370호, 제5,693,762호, 제5,693,761호, 제5,585,089호, 및 제5,530,101호에 기술되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 1 이상의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하게 되는데, 여기서, CDR 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 골격 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 임의로는 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc) 부위, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 상세한 설명을 위해, 예컨대, 문헌 ([Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조할 수 있다. 또한, 예컨대, 문헌 ([Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 U.S.P.N. 제6,982,321호 및 제7,087,409호)를 참조할 수 있다. 추가의 또 다른 방법은 인간공학법으로 지칭되는 것으로, 이는 예를 들어, U.S. 2005/0008625에 기술되어 있다. 본 출원의 목적을 위해, 인간화된 항체라는 용어는 골격 치환이 없거나, 최소한의 골격 치환을 포함하는 CDR 이식된 항체(즉, 하나 이상의 이식된 비인간 CDR을 포함하는 인간 항체)를 분명히 포함하는 것으로 간주될 것이다.
추가로, 비인간 항노텀 항체는 또한 WO 98/52976 및 WO 00/34317에 개시된 방법에 의한 탈면역화 또는 인간 T 세포 에피토프의 특이적인 결실에 의해 변형될 수 있다. 간략하면, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 MHC II형에 결합하는 펩티드에 대하여 분석할 수 있으며; (WO 98/52976 및 WO 00/34317에 정의되어 있는 바와 같이) 이러한 펩티드는 잠재적인 T 세포 에피토프를 나타낸다. 잠재적인 T 세포 에피토프 검출을 위해, 펩티드 스레딩(threading)이라 명명되는 컴퓨터 모델링 접근법이 적용될 수 있고, 추가로, WO 98/52976 및 WO 00/34317에 기술되어 있는 바와 같이, VH 및 VL 서열에 존재한 모티프에 대하여 인간 MHC II형 결합 펩티드의 데이터베이스를 검색할 수 있다. 이러한 모티프는 18개의 주요 MHC II형 DR 알로타입 중 임의의 것에 결합하고, 따라서, 잠재적인 T 세포 에피토프를 구성한다. 가변 영역 중 소수의 아미노산 잔기를 치환하거나, 또는 단일 아미노산 치환에 의해 검출된 잠재적인 T 세포 에피토프를 제거할 수 있다. 가능한 한, 보존적 치환을 수행한다. 대개는 배타적인 것은 아미지만, 인간 생식계열 항체 서열 중의 위치에 공통된 아미노산이 사용될 수 있다. 탈면역화 변화를 확인한 후, 돌연변이유발법 또는 다른 합성 방법(예컨대, 신생 합성, 카세트 대체 등)에 의해 VH 및 VL을 코딩하는 핵산을 구성할 수 있다. 임의로, 돌연변이화된 가변 서열을 인간 불변 영역에 융합시킬 수 있다.
선택된 실시양태에서, 인간화된 항체 가변 영역 잔기의 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 이상이 모체 골격 영역(FR) 및 CDR 서열의 것과 일치할 것이다. 다른 실시양태에서, 인간화된 항체 잔기의 85% 또는 90% 이상이 모체 골격 영역(FR) 및 CDR 서열의 것과 일치할 것이다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 인간화된 항체 잔기의 95% 초과가 모체 골격 영역(FR) 및 CDR 서열의 것과 일치할 것이다.
인간화된 항체는 본원에 기술된 바와 같은 일반 분자 생물학 및 생체 분자 공학 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 1 이상으로부터의 면역글로불린 Fv 가변 영역 모두 또는 그 일부를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 조작하고, 발현시키는 것을 포함한다. 상기 핵산의 공급원은 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 하이브리도마, 진핵 세포 또는 항체 생산 파지로부터, 또는 상기 기술된 바와 같이, 소정의 표적에 대한 면역반응성 단편으로부터, 생식계열 면역글로불린 유전자로부터, 또는 합성 구성체로부터 수득될 수 있다. 이어서, 인간화된 항체를 코딩하는 재조합 DNA를 적절한 발현 벡터로 클로닝할 수 있다.
인간 생식계열 서열은 예를 들어, 문헌 ([Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798]; [Cook, G. P. et al.(1995) Immunol. Today 16: 237-242]; [Chothia, D. et al.(1992) J. Mol. Bio. 227:799-817]; 및 [Tomlinson et al.(1995) EMBO J 14:4628-4638])에 개시되어 있다. V BASE 디렉토리는 인간 면역글로불린 가변 영역 서열에 대한 종합 디렉토리를 제공한다(문헌 [Retter et al., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674] 참조). 이러한 서열은 예컨대, 골격 영역 및 CDR에 대한 인간 서열의 공급원으로서 사용될 수 있다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 컨센서스 인간 골격 영역은 또한 예컨대, U.S.P.N. 제6,300,064호에 기술되어 있는 바와 같이 사용될 수 있다.
f. 인간 항체
상기 언급된 항체 이외에도, 본 발명의 항체는 완전한 인간 항체를 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 출원의 목적을 위해, 인간 항체라는 용어는 인간에 의해 생산된 항체의 것과 일치하는 아미노산 서열을 소유하고/거나, 본원에 개시된 바와 같이 인간 항체를 기법 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체를 포함한다. 인간 항체에 관한 이러한 정의는 구체적으로는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 배제한다.
인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 파지 디스플레이 기법을 사용하여 본 교시에 따른 면역반응성 결합 영역을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태는 파지 상에서 (바람직하게 인간) 항체 라이브러리를 합성하는 단계, 노텀 또는 이의 항체 결합부로 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 노텀에 결합한 파지를 단리시키는 단계, 및 파지로부터 면역반응성 단편을 수득하는 단계를 포함하는, 항노텀 항체 또는 이의 항원 결합부를 제조하는 방법을 제공한다. 일례로, 파지 디스플레이 기법에서 사용하기 위한 항체 라이브러리를 제조하는 한 방법은 인간 또는 비인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 노텀 또는 이의 항원성 부위로 면역화시켜 면역 반응을 일으키는 단계, 면역화된 동물로부터 항체 생산 세포를 추출하는 단계; 추출된 세포로부터 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 RNA를 단리시키는 단계, RNA를 역전사시켜 cDNA를 제조하는 단계, 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시키는 단계, 및 cDNA를 파지 디스플레이 벡터 내로 삽입하여 파지 상에서 항체가 발현될 수 있도록 하는 단계를 포함한다. 더욱 특히, VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합하고, 파지미드 벡터(예컨대, p CANTAB 6 또는 pComb 3 HSS)로 클로닝한다. 이어서, 벡터를 E. 콜라이(E. coli)에 전기천공시킨 후, E. 콜라이를 헬퍼 파지로 감염시킨다. 이러한 방법에서 사용되는 파지는 전형적으로는 fd 및 M13을 비롯한 섬유상 파지이고, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합적으로 융합된다.
본 발명의 재조합 인간 항노텀 항체는 상기와 같이 제조된 재조합형의 조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 라이브러리는 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조된 scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다. 상기 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 파지 디스플레이 라이브러리 제조용 키트는 상업적으로 이용가능하다(예컨대, 파마시아 리컴비난트 파지 안티바디 시스템(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System), 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 스트라타진(Stratagene) SurfZAP™ 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612). 항체 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 다른 방법 및 시약 또한 존재한다(예컨대, U.S.P.N. 제5,223,409호; PCT 공개 번호 WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; [Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991)]; [Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992)]; [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]; [McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990)]; [Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]; [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]; [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]; [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992)]; [Garrad et al, Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991)]; [Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991)]; 및 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)]) 참조).
나이브 라이브러리(천연 또는 합성)에 의해 제조된 항체는 중간 정도의 친화도(Ka = 약 106 내지 107 M-1)를 가질 수 있지만, 당업계에 기술되어 있는 바와 같이, 구성하고, 2차 라이브러리로부터 재선택함으로써 시험관내에서 친화도 성숙 또한 모방할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이를 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896(1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 (문헌 [Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989)]에 보고된) 오류 빈발(error-prone) 폴리머라제를 사용함으로써 시험관내에서 무작위로 도입시킬 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은, 예컨대, 선택된 개별 Fv 클론에서 관심의 대상이 되는 CDR에 이르는 무작위 서열을 보유한 프라이머를 사용하는 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이화시키고, 보다 고친화도 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754에는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하는 방법이 기술되어 있다. 또 다른 효과적인 접근법은 비면역화된 공여체로부터 수득된 천연적으로 발생된 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 사용하여 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기술되어 있는 바와 같이, 수회의 쇄 재셔플링으로 보다 고친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기법을 통해 해리 상수 Kd(K오프/K온)가 약 10-9 M 이하인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
이의 표면상에서 결합 쌍을 발현하는 진핵 세포(예컨대, 효모)를 포함하는 라이브러리를 사용하는 유사한 방법이 이용될 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 파지 디스플레이 기술과 마찬가지로, 진핵 라이브러리를 관심의 대상이 되는 항원(즉, 노텀)에 대해 스크리닝하고, 후보 결합 쌍을 발현하는 세포를 단리시키고, 클로닝한다. 라이브러리 컨텐츠를 최적화하고, 반응성 결합 쌍의 친화도 성숙을 위해 조치를 취할 수 있다. 예를 들어, U.S.P.N. 제7,700,302호 및 U.S.S.N. 제12/404,059호를 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 것인 파지 라이브러리로부터 선택된다(문헌 ([Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]: [Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991)])을 참조할 수 있다). 다른 실시양태에서, 인간 결합 쌍은 진핵 세포, 예컨대, 효모에서 생성된 조합 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 예컨대, U.S.P.N. 제7,700,302호를 참조할 수 있다. 상기 기법을 통해 이롭게는 다수의 후보 조절 인자를 스크리닝할 수 있고, (예컨대, 친화도 성숙 또는 재조합 셔플링에 의해) 상대적으로 용이하게 후보 서열을 조작할 수 있다.
또한, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전하게 불활성화되어 있는 트랜스제닉 동물, 예컨대, 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 시험감염시, 인간 항체 생산이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 면에 있어 인간에서 관찰된 것과 매우 유사하다. 이러한 접근법은 예를 들어, in U.S.P.N 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 제노마우스® 기술과 관련하여 U.S.P.N 제6,075,181호 및 제6,150,584호, 및 하기 과학 공보지에 기술되어 있다: 문헌 ([Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al, Nature 368: 856-859(1994)]; [Morrison, Nature 368:812-13(1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]). 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대한 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통하여 제조될 수 있다(이러한 B 림프구는 신생물성 장애를 앓는 개체로부터 회수할 수 있거나, 또는 시험관내에서 면역화된 것일 수 있다). 예컨대, 문헌 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al, J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991)]; 및 U.S.P.N. 제5,750,373호)를 참조할 수 있다.
VI. 항체 특징
항체 조절 인자를 어떻게 수득하든 간에, 또는 그가 상기 언급된 형태 중 어느 형태(예컨대, 인간화된 항체, 인간 항체 등)를 취하든 간에, 개시된 조절 인자의 바람직한 실시양태는 다양한 특징을 나타낼 수 있다. 이와 관련하여, 항노텀 항체 생산 세포(예컨대, 하이브리도마 또는 효모 콜로니)를 선택하고, 클로닝하고, 추가로 예를 들어, 강건한 성장, 고도의 항체 생산을 비롯한 바람직한 특징, 및 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같은 바람직한 항체 특징에 대하여 스크리닝할 수 있다. 하이브리도마를 동종동계 동물에서, 예를 들어, 누드 마우스와 같은 면역계가 없는 동물에서 생체내에서 확장시킬 수 있거나, 또는 세포 배양물에서 시험관내에서 확장시킬 수 있다. 각각이 별개의 항체 종을 생산하는 것인 하이브리도마 및/또는 콜로니를 선택하고, 클로닝하고, 확장시키는 방법은 당업계의 숙련가에게 주지되어 있다.
a. 중화 항체
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 중화 항체 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 중화 항체 또는 중화 길항제라는 용어는 리간드 또는 효소에 결합하거나, 그와 상호작용하고, 리간드 또는 효소의 이의 결합 파트너에의 결합을 방해하고, 다르게는 두 분자의 상호작용으로부터 발생되는 생물학적 반응을 방해하는 항체 또는 길항제를 의미한다. 항체 또는 이의 면역학적으로 기능성인 단편 또는 유도체의 결합 및 특이성을 평가할 때, 항체 또는 단편은 (시험관내 경쟁 결합 검정법, 예컨대, 본원 실시예에 기술되어 있는 TCF 검정법으로 측정된 바) 과량의 항체가 결합 파트너의 표적 분자에의 결합량을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상만큼 감소시킬 때, 리간드 또는 효소의 이의 결합 파트너 또는 기질에의 결합을 실질적으로 억제시킬 것이다. 노텀에 대한 항체의 경우, 중화 항체 또는 길항제는 GPI를 절단시킬 수 있는 노텀의 능력을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상만큼 감소시킴으로써 유리 글리피칸의 농도를 감소시킬 것이다. 이러한 감소된 글리피칸 농도는 당업계에 알려져 있는 기법을 사용하여 직접 측정될 수 있거나, 그러한 감소가 노텀 관련 경로, 예컨대, Wnt, Hh 또는 BMP에 미치는 영향에 의해 측정될 수 있는 것을 이해할 것이다.
b. 내재화 항체
증거를 통해 노텀이 세포에 의해 분비될 수 있다고 제시된 반면, 적어도 일부의 노텀은 여전히 세포 표면과 그대로 회합된 상태로 남아있음으로써, 이를 통해 개시된 조절 인자는 내재화될 수 있다. 따라서, 항노텀 항체는 적어도 어느 정도는 노텀을 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있다. 예를 들어, 종양 개시 세포의 표면 상의 노텀에 결합하는 항노텀 항체는 종양 개시 세포에 의해 내재화될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항노텀 항체는 내재화시 세포를 사멸시키는 세포독성 모이어티와 회합되거나, 이에 접합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 내재화 항노텀 항체는 포유동물 세포에 회합된 노텀에의 결합시 세포에 의해 흡수되는 것이다. 내재화 항체로는 항체 단편, 인간 또는 인간화된 항체 및 항체 접합체를 포함한다. 내재화는 시험관내 또는 생체내에서 이루어질 수 있다. 치료학적 적용을 위한 경우, 내재화는 생체내에서 이루어질 수 있다. 내재화되는 항체 분자의 개수는 노텀 발현 세포, 특히, 노텀 발현 종양 개시 세포를 사멸시키는 데 충분하거나, 적절할 수 있다. 일부 경우에는, 항체 또는 항체 접합체의 효능에 따라, 단일 항체 분자의 세포 내로의 흡수는 항체가 결합하는 표적 세포를 사멸시키는 데 충분하다. 예를 들어, 항체에 접합된 독소 한 분자의 내재화는 종양 세포를 사멸시키는 데 충분할 정도로 특정 독소는 사멸에 있어 고도로 강력한 효능을 가지고 있다. 항노텀 항체의 내재화가 결합시에 이루어지든 아니든 간에, 포유동물 세포 상의 노텀은 하기 실시예에 기술되어 있는 것을 비록한 다양한 검정법에 의해 측정될 수 있다. 항체의 세포 내로의 내재화 여부를 검출하는 방법은 U.S.P.N. 제7,619,068호(이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있다.
c. 고갈 항체
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 고갈 항체 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 고갈 항체라는 용어는 세포 표면 상의 또는 그 에 가까이 있는 노텀에 결합하거나, 또는 그와 회합하고, (예컨대, 보체 의존성 세포독성 또는 항체 의존성 세포 세포독성에 의해) 세포의 사멸 또는 제거를 유도하거나, 촉진시키거나, 또는 유발하는 항체 또는 단편을 의미한다. 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 일부 실시양태에서, 선택된 고갈 항체는 세포독성제에 회합하거나, 접합될 것이다. 바람직하게, 고갈 항체는 정의된 세포 집단에서 종양 영구 세포를 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 이상 없애거나, 제거하거나, 또는 사멸시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 강화된, 절편화된, 정제된, 또는 단리된 종양 영구 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 집단은 종양 영구 세포를 포함하는 전체 종양 시료 또는 이질성 종양 추출물을 포함할 수 있다. 하기 실시예에 기술된 바와 같은 표준 생화학적 기법을 사용하여 본원의 교시에 따른 종양 영구 세포의 고갈을 모니터링하고 정량화할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
d. 에피토프 결합
개시된 항노텀 항체는 선택된 표적(들)에 의해 제시되는 별개의 에피토프 또는 결정기와 회합하거나, 그에 결합할 것이라는 것을 추가로 이해할 것이다. 본원에서 사용되는 바, 에피토프라는 용어는 특정 항체에 의해 인식되고, 그에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 항원 부위를 의미한다. 항원이 폴리펩티드, 예컨대, 노텀일 경우, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 연속 아미노산 및 비연속 아미노산, 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로는 단백질 변성시에도 그대로 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로는 단백질 변성시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체형태를 띠는 3개 이상, 및 더욱 일반적으로는 5개 또는 8-10개 이상의 아미노산을 포함한다. 더욱 구체적으로, 에피토프라는 용어가 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적인 결합을 할 수 있거나, 또는 다르게는 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 에피토프 결정기는 일반적으로 예컨대, 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자로 된 화학적으로 활성인 표면기로 구성되고, 일반적으로, 특이적인 3차원 구조 특징 뿐만 아니라, 특이적인 전하 특징을 가진다. 추가로 에피토프는 선형이거나, 입체형태를 띨 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예컨대, 항체) 사이의 상호작용 지점들은 모두 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 입체형태를 띠는 에피토프에서, 상호작용 지점들은 서로로부터 선형으로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기 전역에 걸쳐 존재한다.
일단 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되고 나면, 예컨대, 본 발명에 기술된 기법을 사용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 별법으로, 발견하는 과정 동안 항체의 생성 및 특징 규명을 통해 바람직한 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이어서, 이러한 정보로부터, 동일 에피토프에의 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성할 수 있는 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 즉, 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하는 경쟁 연구를 수행하는 것이다. 그들의 교차 경쟁에 기초한 항체를 비닝하는 고처리량 공정은 WO 03/48731에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바, 비닝(binning)이라는 용어는 이의 항원 결합 특징에 기초하여 항체를 군별로 분류하는 방법을 의미한다. 빈 지정은 테스트된 항체의 관찰된 결합 패턴이 얼마나 상이한지에 따라 다소 임의적일 수 있다. 따라서, 상기 기법이 본 발명의 항체를 분류하는 데 있어 유용한 도구이지만, 빈이 에피토프와 항상 직접적인 상관관계에 있는 것은 아니며, 그러한 초기 결정은 당업계에 알려져 있는 다른 방법에 의해 추가로 확인되어야 한다.
이러한 주의 사항에 따라, 선택된 1차 항체(또는 이의 단편)가 동일 에피토프에 결합하는지, 또는 2차 항체와 결합에 대해 교차 경쟁하는지 여부를 당업계에 공지되고, 본원 실시예에 기술된 방법을 사용함으로써 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 포화 조건하에서 본 발명의 1차 항체를 노텀에 결합시킨 후, 2차 항체의 노텀에 결합할 수 있는 능력에 관하여 측정한다. 테스트 항체가 1차 항노텀 항체와 동시에 노텀에 결합할 수 있다면, 이때 2차 항체는 1차 항체와는 다른 에피토프에 결합한다. 그러나, 2차 항체가 동시에 노텀에 결합할 수 없다면, 이때 2차 항체는 동일 에피토프, 중복 에피토프, 또는 1차 항체이 결합되어 있는 에피토프에 아주 근접하게 위치하는 에피토프에 결합한다. 당업계에 공지되어 있고, 하기 실시예에서 상세하게 설명하는 바와 같이, 고체상 직접 또는 간접 방사선면역검정법(RIA: radioimmunoassay), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정법(EIA: enzyme immunoassay), 샌드위치 경쟁 검정법, 비아코어(Biacore)™ 시스템(즉, 표면 플라즈몬 공명 - GE 헬쓰케어(GE Healthcare)), 포르테바이오(ForteBio)® 분석기(즉, 바이오층 간섭계 - 포르테바이오 인코퍼레이티드(ForteBio, Inc.)) 또는 유세포 측정 방법을 사용하여 원하는 데이터를 획득할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 표면 플라즈몬 공명이라는 용어는 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간으로 생체특이적인 상호작용을 분석할 수 있도록 하는 광학 현상을 의미한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 분석은 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이, 비아코어 또는 포르테바이오 기기를 사용하여 수행된다.
동일 에피토프에 대해 경쟁하는 항체와 관련하여 사용될 때, 경쟁하다라는 용어는 항체 사이의 경쟁이, 테스트 중에 있는 항체 또는 면역학적으로 기능성인 단편이 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적인 결합을 방해하거나 억제시키는 것인 검정법에 의해 측정되는 것을 의미한다. 전형적으로, 상기와 같은 검정법은 비표지된 테스트 면역글로불린 및 표지된 참조 면역글로불린, 이들 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원을 사용하는 것을 포함한다. 경쟁 억제는 테스트 면역글로불린의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 일반적으로, 테스트 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정법에 의해 확인되는 항체(경쟁 항체)는 참조 항체와 동일 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애 발생으로 인하여 참조 항체가 결합되어 있는 에피토프에 충분히 근접한 거리에 있는 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 경쟁 결합을 측정하는 방법에 관한 추가의 상세한 설명은 본원 실시예에서 제공한다. 일반적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 공통 항원에의 참조 항체의 특이적인 결합은 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 이상만큼 억제될 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 이상만큼 억제된다.
에피토프 특이성에 기초하여, 예를 들어, 결합 친화도, 용융 온도(Tm), 및 등전점을 비롯한 다수의 상이한 물리적인 특징들을 이용하여 개시된 항체의 특징을 규명할 수 있다.
e. 결합 친화도
이와 관련하여, 본 발명은 추가로 노텀에 대하여 높은 결합 친화도를 가지는 항체를 사용하는 것을 포함한다. 해리 상수 Kd(k오프/k온)가 ≤ 10-8 M일 때, 본 발명의 항체는 이의 표적 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. Kd가 ≤ 5 x 10-9 M일 때, 항체는 고친화도로 항원에 특이적으로 결합하며, Kd가 ≤ 5 x 10-10 M일 때, 초고도의 친화도를 가진다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 ≤ 10-9 M인 Kd 및 약 1 x 10-4/sec인 오프 속도를 가진다. 본 발명의 한 실시양태에서, 오프 속도는 < 1 x 10-5/sec이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 항체는 약 10-8 M 내지 10-10 M 사이의 Kd로 노텀에 결합할 것이며, 추가의 또 다른 실시양태에서, 항체는 Kd ≤ 2 x 10-10 M으로 결합할 것이다. 본 발명의 추가의 다른 선택된 실시양태는 해리 상수 또는 Kd(k오프/k온)가 10-2 M 미만, 5 x 10-2 M 미만, 10-3 M 미만, 5 x 10-3 M 미만, 10-4 M 미만, 5 x 10-4 M 미만, 10-5 M 미만, 5 x 10-5 M 미만, 10-6 M 미만, 5 x 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 5 x 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 5 x 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 5 x 10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 5 x 10-11 M 미만, 10-12 M 미만, 5 x 10-12 M 미만, 10-13 M 미만, 5 x 10-13 M 미만, 10-14 M 미만, 5 x 10-14 M 미만, 10-15 M 미만, 5 x 10-15 M 미만인 항체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 노텀에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 105 M-1s-1 이상, 2 X 105 M-1s-1 이상, 5 x 105 M-1s-1 이상, 106 M-1s-1 이상, 5 x 106 M-1s-1 이상, 107 M-1s-1 이상, 5 x 107 M-1s-1 이상, 108 M-1s-1 이상의 회합 속도 상수 또는 k 온 속도(노텀 (Ab) + 항원 (Ag)k 온←Ab-Ag)를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 노텀에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 10-1 s-1 미만, 5 x 10-1 s-1 미만, 10-2 s-1 미만, 5 x 10-2 s-1 미만, 10-3 s-1 미만, 5 x 10-3 s-1 미만, 10-4 s-1 미만, 5 x 10-4 s-1 미만, 10-5 s-1 미만, 5 x 10-5 s-1 미만, 10-6 s-1 미만, 5 x 10-6 s-1 미만, 10-7 s-1 미만, 5 x 10-7 s-1 미만, 10-8 s-1 미만, 5 x 10-8 s-1 미만, 10-9 s-1 미만, 5 x 10-9 s-1 미만, 또는 10-10 s-1 미만인 k 오프 속도(노텀 (Ab) + 항원 (Ag)k 오프←Ab-Ag)를 가진다.
본 발명의 다른 선택된 실시양태에서, 항노텀 항체는 102 M-1 이상, 5 x 102 M-1 이상, 103 M-1 이상, 5 x 103 M-1 이상, 104 M-1 이상, 5 x 104 M-1 이상, 105 M-1 이상, 5 x 105 M-1 이상, 106 M-1 이상, 5 x 106 M-1 이상, 107 M-1 이상, 5 x 107 M-1 이상, 108 M-1 이상, 5 x 108 M-1 이상, 109 M-1 이상, 5 x 109 M-1 이상, 1010 M-1 이상, 5 x 1010 M-1 이상, 1011 M-1 이상, 5 x 1011 M-1 이상, 1012 M-1 이상, 5 x 1012 M-1 이상, 1013 M-1 이상, 5 x 1013 M-1 이상, 1014 M-1 이상, 5 x 1014 M-1 이상, 1015 M-1 이상, 5 x 1015 M-1 이상인 친화 상수 또는 Ka(k온/k오프)를 가질 것이다.
f. 등전점
상기 언급한 결합 특성 이외에도, 항노텀 항체 및 이의 단편은 모든 폴리펩티드와 같이, 일반적으로는 폴리펩티드의 순 전하가 0일 때의 pH로서 정의되는 등전점(pi: Isoelectric Point)을 가진다. 용액의 pH와 단백질의 등전점(pi)이 같을 때, 단백질의 용해도는 가장 낮은 것으로 당업계에 알려져 있다. 그러므로, 항체 중 이온화가능한 잔기의 개수 및 위치를 변경하여 pi를 조정함으로써 용해도를 최적화시킬 수 있다. 예를 들어, 아미노산을 적절히 치환시킴으로써(예컨대, 비하전된 잔기, 예컨대, 알라닌 대신 하전된 아미노산 예컨대, 리신으로 치환함으로써) 폴리펩티드의 pi를 조작할 수 있다. 어느 특정의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 상기 항체의 pi를 변화시키는 항체의 아미노산 치환을 통해 항체의 용해도 및/또는 안정성은 개선될 수 있다. 원하는 pi를 달성하는 데 특정 항체에 대하여 어떤 아미노산 치환이 가장 적절한지 당업자는 이해할 것이다.
단백질의 pi는 등전성 포커싱 및 다양한 컴퓨터 알고리즘을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14: 1023] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 항노텀 항체의 pi는 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 또는 약 9.0보다 높다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항노텀 항체의 pi는 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 또는 9.0보다 높다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체의 pi를 변경시키는 치환은 노텀에 대한 이의 결합 친화도를 유의적으로 감소시키지는 않을 것이다. 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, FcγR에의 결합을 변경시키는 Fc 영역의 치환(들)은 또한 pi로 변화시킬 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 바람직한 실시양태에서, Fc 영역의 치환(들)은 FcγR 결합을 원하는 대로 변경하고, pi를 임의로 원하는 대로 변화시키는, 둘 모두를 수행할 수 있도록 구체적으로 선택된다. 본원에서 사용되는 바, pi 값은 우세한 전하 형태의 pi로서 정의된다.
g. 열 안정성
항체의 Fab 도메인의 Tm이 항체의 열 안정성의 우수한 지시계일 수 있고, 추가로 반감기를 지시할 수 있음을 추가로 이해할 것이다. Tm은 단순히 주어진 도메인 또는 서열의 50%가 언폴딩되는 온도이다. 더 낮은 Tm은 응집이 더 많이 일어나거나/안정성이 더 낮다는 것을 지시하는 반면, 더 높은 Tm은 응집이 더 적게 일어나거나/안정성이 더 높다는 것을 지시한다. 따라서, 더 높은 Tm을 가진 항체 또는 단편 또는 유도체가 바람직할 수 있다. 또한, 당업계에 알려져 있는 기법을 사용하여 항노텀 항체 또는 이의 도메인의 조성을 변경시킴으로써 분자의 안정성을 최적화시킬 수 있다. 예를 들어, U.S.P.N. 제7,960,142호를 참조할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 선택된 항체의 Fab 도메인은 적어도 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 100℃, 105℃, 110℃, 115℃ 또는 120℃보다 높은 Tm 값을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 항체의 Fab 도메인은 적어도 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 약 95 ℃, 약 100℃, 약 105℃, 약 110℃, 약 115℃ 또는 약 120℃보다 높은 Tm 값을 가진다. 단백질 도메인(예컨대, Fab 도메인)의 열적 용융 온도(Tm)는 당업계에 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여, 예를 들어, 시차 주사 열량법에 의해 측정될 수 있다(예컨대, 문헌 ([Vermeer et al, 2000, Biophys. J. 78:394-404]; [Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154])(상기 두 문헌 모두 본원에 참고로 포함된다) 참조).
VII. 노텀 조절 인자 단편 및 유도체
본 발명의 제제가 무손상 융합 구성체, 항체, 단편 또는 유도체를 포함하는지 여부와는 상관없이, 선택된 조절 인자는 노텀과 반응하거나, 결합하거나, 조합되거나, 복합체를 형성하거나, 부착되거나, 연결되거나, 상호작용하거나, 또는 다르게는 회합함으로써 원하는 항신생물성 효과를 제공할 것이다. 항노텀 항체를 포함하는 조절 인자는 항체 상에 발현된 하나 이상의 결합부를 통해 노텀과 상호작용하거나 회합한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 더욱 구체적으로, 본원에서 사용되는 바, 결합부라는 용어는 관심의 대상이 되는 표적 분자(예컨대, 효소, 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 억제제)에 선택적으로 결합하는 것을 담당하는 폴리펩티드의 영역을 포함한다. 결합 도메인은 1 이상의 결합부를 포함한다(예컨대, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 도메인과 2개의 결합부를 가질 것이다). 결합 도메인의 예로는 항체 가변 도메인, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 효소적 도메인을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, (예컨대, Fc-노텀 융합 구성체의 일부로서) 노텀의 효소적으로 활성인 영역은 기질(예컨대, 글리피칸)에 대한 결합부를 포함할 수 있다.
a. 단편
본 발명의 실시를 위해 어떤 형태의 조절 인자(예컨대, 키메라, 인간화된 것 등)가 선택되는지와는 상관없이, 상기 것의 면역반응성 단편이 본원 교시에 따라 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 가장 광범위한 의미에서, 항체 단편이라는 용어는 무손상 항체(예컨대, 천연적으로 발생된 면역글로불린)의 적어도 일부를 포함한다. 더욱 특히, 단편이라는 용어는 무손상 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄보다 적은 개수의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄(또는 Fc 융합물인 경우, 노텀 분자)의 부분 또는 일부를 의미한다. 항원 결합 단편이라는 용어는, 항원과 결합하거나, 항원 결합(즉, 특이 결합)에 대하여 무손상 항체와(즉, 항원 결합 단편이 유래된 무손상 항체와) 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 항체 분자의 단편이라는 용어는 항체의 항원 결합 단편, 예를 들어, 항체 경쇄(VL), 항체 중쇄(VH), 단일 쇄 항체(scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다. 유사하게, 노텀의 효소적으로 활성인 단편은 노텀 기질과 상호작용할 수 있고, (다소 덜 효율적일 수는 있지만) 무손상 노텀의 것과 유사한 방식으로 그를 변형(예컨대, 그를 고정)시킬 수 있는 노텀 분자의 능력을 보유하는 노텀 분자의 부위를 포함한다.
단편은 무손상 또는 완전한 조절 인자(예컨대, 항체 또는 항체 쇄)의 화학적 또는 효소 처리를 통해 또는 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이와 관련하여, 다양한 항체 단편은 무손상 항체의 분해에 의해 정의되지만, 그러한 단편은 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 새롭게 합성될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 항체라는 용어는 전체 항체의 변형에 의해 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 새롭게 합성된 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 명백하게 포함한다.
더욱 구체적으로, 항체의 파파인 분해를 통해, 각각 단일 항원 결합부와 남은 Fc 단편을 포함하는, Fab 단편이라 명명되는 2개의 동일한 항원 결합 단편이 생성되는데, 상기 명칭은 쉽게 결정화될 수 있는 이의 능력이 반영된 것이다. 펩신으로 처리하면, 2개의 항원 결합부를 가지며, 여전히 항원과 교차 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다. Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 비롯한 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 수개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 1 이상의 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대해 본원에서 지정한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래는 Fab' 단편 쌍 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편 쌍으로서 제조되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다. 다른 항체 단편에 관한 보다 상세한 설명을 위해 예컨대, 문헌 [Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)]을 참조할 수 있다.
Fv 단편이 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 항체 단편이라는 것을 추가로 이해할 것이다. 상기 영역은 예를 들어, scFv의 경우에는 실제로 공유 결합일 수 있는, 밀착 결합으로 회합되어 있는 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성되어 있다. 이러한 배열로 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합부를 정의한다. 종합해 보면, 6개의 CDR 또는 이의 서브세트가 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 비록 일반적으로는 전체 결합부보다는 친화도가 낮지만, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 단 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반부)도 항원을 인식하고, 그에 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어, 항체 단편은 Fc 영역을 포함하고, 무손상 항체에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 회합하는 생물학적 기능, 예컨대, FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 1 이상을 보유하는 것이다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 가지는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
b. 유도체
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 1가 또는 다가(예컨대, 2가, 3가 등)일 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 본원에서 사용되는 바, 결합가라는 용어는 항체와 회합되는 잠재적인 표적(즉, 노텀) 결합부의 개수를 의미한다. 각 표적 결합부는 하나의 표적 분자, 또는 표적 분자 상의 특이적인 위치 또는 자리와 특이적으로 결합한다. 본 발명의 항체가 1 초과의 표적 결합부를 포함하는 경우(다가), 각 표적 결합부는 동일 또는 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예컨대, 상이한 리간드 또는 상이한 항원에, 또는 동일 항원 상의 상이한 에피토프 또는 위치에 결합할 수 있다). 본 발명의 목적을 위해, 대상 항체는 바람직하게 인간 노텀에 대하여 특이적인 1 이상의 결합부를 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 분자의 각 결합부가 단일의 노텀 위치 또는 에피토프에 특이적으로 결합한다는 점에서 1가일 것이다. 다른 실시양태에서, 항체는 항체가 1 초과의 결합부를 포함하고, 상이한 결합부가 1 초과의 단일 위치 또는 에피토프와 특이적으로 회합한다는 점에서 다가일 것이다. 그러한 경우, 다중 에피토프가 선택된 노텀 폴리펩티드 상에 존재할 수 있거나, 또는 단일 에피토프가 노텀 상에 존재할 수 있고, 동시에 제2의 상이한 에피토프가 또 다른 분자 또는 표면 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, U.S.P.N. 제2009/0130105호를 참조할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 다가 항체는 원하는 표적 분자의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있거나, 표적 분자 뿐만 아니라, 이종성 에피토프, 예컨대, 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질, 둘 모두에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 항노텀 항체의 바람직한 실시양태는 오직 두 항원에만 결합하는 반면(즉, 이특이성 항체), 추가의 특이성을 가진 항체, 예컨대, 삼특이성 항체 또한 본 발명에 포함된다. 이특이성 항체의 예로는 제한없이, 노텀에 대한 것인 하나의 아암, 및 임의의 다른 항원(예컨대, 조절 인자 세포 마커)에 대한 나머지 다른 한 아암을 가지는 것을 포함한다. 이특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장의 이특이성 항체를 제조하는 전통적인 방법은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현에 기초하는데, 여기서, 상기 두 쇄는 상이한 특이성을 가지는 것이다(문헌 [Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539]). 더 복잡한 화합성을 띠는 다른 다중특이성 구성체 및 이의 제조 방법은 U.S.P.N. 제2009/0155255호에 기술되어 있다.
추가의 다른 실시양태에서, 원하는 결합 특이성을 가지는 항체 가변 도메인(항체 항원 조합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 힌지, CH2, 및/또는 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 일례로, 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 융합물 중 1 이상에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 함께 공형질감염시킨다. 이는 한 실시양태에 있어서, 구성에 사용되는 3개의 폴리펩티드 쇄의 다른 비율이 최적의 수율을 제공할 때, 3개의 폴리펩티드 단편의 상호간의 비율을 조정할 때 더욱 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 2 이상의 폴리펩티드 쇄가 동일한 비율로 발현됨으로써 높은 수율을 얻거나, 그 비율이 특별히 중요하지 않을 경우, 2개 또는 3개의 폴리펩티드 쇄 모두를 코딩하는 코딩 서열을 한 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
상기 접근법의 한 실시양태에서, 이특이성 항체는 한쪽 아암의 제1 합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄(예컨대, 노텀), 및 나머지 다른 한쪽 아암의 (제2 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성된다. 이특이성 분자의 오직 절반부에만 면역글로불린 경쇄가 존재함으로써 용이한 방식으로 분리될 수 있도록 하는 바, 상기와 같은 비대칭 구조는 원하는 이특이성 화합물이 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 쉽게 분리될 수 있도록 한다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이특이성 항체를 생성하는 것에 관한 추가의 상세한 설명을 위해서는 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210]을 참조할 수 있다. WO 96/27011에 기술된 또 다른 접근법에 따라, 항체 분자 쌍을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율(%)을 최대화시킬 수 있다. 바람직한 게면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예컨대, 티로신 또는 트리토판)으로 대체할 수 있다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동은 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예컨대, 동종이량체에 비하여 이종이량체의 수율을 증가시킬 수 있는 기전을 제공한다.
이특이성 항체는 또한 교차 결합된 또는 헤테로접합체 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합체에서 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 있고, 다른 나머지 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 원치않는 세포에 대한 면역계 세포를 표적화하는 데(U.S.P.N. 제4,676,980호), 및 HIV 감염 치료를 위해(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로접합체 항체는 임의의 용이한 교차 결합 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 적합한 교차 결합제는 당업계에 주지되어 있고, 다수의 교차 결합 기법과 함께 U.S.P.N. 제4,676,980호에 개시되어 있다.
VIII. 노텀 조절 인자 - 불변 영역 변형
a. Fc 영역 및 Fc 수용체
상기 기술된 개시된 조절 인자(예컨대, Fc 노텀 또는 항노텀 항체)의 가변 또는 결합 영역에의 다양한 변형, 치환, 부가 또는 결실 이외에도, 본 발명의 선택된 실시양태는 또한 불변 영역(즉, Fc 영역)의 치환 또는 변형도 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 노텀 조절 인자는 그 중에서도 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기, 치환, 돌연변이 및/또는 변형을 포함함으로써, 약동학적 성질 변경, 혈청 반감기 증가, 결합 친화도 증가, 면역원성 감소, 생산성 증가, Fc 리간드 결합 변경, ADCC 또는 CDC 활성 증진 또는 감소, 당화 및/또는 이황화 결합 변경 및 결합 특이성 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 바람직한 특징을 가질 수 있게 된다고 사료된다. 이와 관련하여, 유리하게는 이러한 Fc 변이체를 사용함으로써 개시된 조절 인자의 효과적인 항신생물성 특성을 증진시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 Fc 영역이라는 용어는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하는 데 사용되며, 이는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 비록 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수는 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로는 아미노산 잔기, 위치 Cys226, 또는 Pro230으로부터 이의 카복시 말단까지 뻗어 있는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C 말단의 리신(EU 번호 매김 체계에 따라 잔기 447)는 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체 조성물은 K447 잔기 모두가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 있는 항체 및 없는 항체의 혼합물을 포함하는 항체 집단을 포함할 수 있다. 기능성 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역의 효과기 기능을 소유한다. 예시적인 효과기 기능으로는 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 포식작용; 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 그러한 효과기 기능은 일반적으로는 Fc 영역이 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 도메인)과 조합될 것으로 필요로 하며, 예를 들어, 본원 정의부에서 개시된 것과 같은 다양한 검정법을 사용함으로써 평가될 수 있다.
Fc 수용체 또는 FcR은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체와 결합하는 것(감마 수용체)이며, 이는 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브부류 수용체와, 대립형질 변이체 및 별법으로 상기 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγII 수용체는 FcγRIIA(활성화 수용체) 및 FcγRIIB(억제 수용체)를 포함하는데, 이는 이의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는, 유사한 아미노산 서열을 가진다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)를 포함한다(예컨대, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR는 예를 들어, 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)])에 리뷰되어 있다. 추후에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR도 본원의 FcR 용어에 포함된다. Fc 수용체 또는 FcR이라는 용어는 또한, 특정 경우에, 모체 IgG를 태아에게 전달하는 역할(문헌 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249(1994)]) 및 면역글로불린의 항상성을 조절하는 역할을 담당하는 신생아 수용체, FcRn도 포함한다. FcRn에의 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다(예컨대, 문헌 ([Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.)) 참조).
b. Fc 기능
본원에서 사용되는 바, 보체 의존성 세포독성 및 CDC라는 것은 보체의 존재 하에서 표적 세포를 용해시키는 것을 의미한다. 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을, 분자, 예를 들어, 이의 동족 항원과 복합체를 형성하고 있는 항체와 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예컨대, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202: 163]에 기술되어 있는 것과 같은 CDC 검정법을 수행할 수 있다.
추가로, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 또는 ADCC라는 것은 특정의 세포독성 세포(예컨대, 자연 살해(NK: Natural Killer) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합된 분비된 IgG로 인해, 이들 세포독성 효과기 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 연속해서 이러한 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 의미한다. 표적에 대한 특이적인 고친화성 IgG 항체는 세포독성 세포를 무장시키고, 이는 상기 사멸을 위해 절대적으로 요구된다. 표적 세포의 용해는 세포외에서 이루어지고, 세포 대 세포인 직접적인 접촉을 필요로 하며, 보체를 포함하지 않는다.
FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성이 변경된 노텀 조절 인자 변이체는 모체 또는 비변형된 항체와 비교하여, 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 조절 인자와 비교하여 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성이 증진되거나 감소된 것이다. FcR에 대하여 증가된 결합을 보이는 조절 인자 변이체는 모체 또는 비변형된 항체보다, 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 조절 인자보다 우수한 친화도로 1 이상의 FcR에 결합한다. FcR에 대하여 감소된 결합을 보이는 변이체는 모체 또는 비변형된 항체보다, 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 조절 인자보다 저조한 친화도로 1 이상의 FcR에 결합한다. FcR에 대하여 감소된 결합을 보이는 상기 변이체는 예컨대, 당업계에 주지된 기법으로 측정한 바, FcR에 대하여 거의 또는 전혀 주목할 만한 결합을 소유할 수 있으며, 예컨대, 천연 서열 IgG Fc 영역과 비교하여 FcR에의 0-20% 결합인 결합을 소유할 수 있다.
FcRn과 관련하여, 본 발명의 항체는 또한 포유동물, 바람직하게, 인간에서 5일 초과, 10일 초과, 15일 초과, 바람직하게, 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2개월 초과, 3개월 초과, 4개월 초과, 또는 5개월 초과의 반감기(예컨대, 혈청 반감기)를 제공하는 불변 영역에 변형을 포함하는 Fc 변이체도 포함하거나, 포함시킨다. 포유동물, 바람직하게, 인간에서 본 발명의 항체(또는 Fc 함유 분자)의 증가된 반감기를 통해 상기 항체 또는 항체 단편은 포유동물에서 보다 더 높은 혈청 역가를 가질 수 있게 되고, 따라서, 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도는 감소하게 되고/거나, 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도도 감소하게 된다. 생체내 반감기가 증가된 항체는 당업자에게 공지되어 있는 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기가 증가된 항체는 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로서 확인된 아미노산 잔기를 변형시킴으로써(예컨대, 치환, 결실, 또는 부가함으로써) 생성될 수 있다(예컨대, 국제 공개 번호 WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.N. 제6,737,056호 및 U.S.P.N. 제2003/0190311호 참조). 생체내 인간 FcRn에의 결합 및 인간 FcRn 고친화성 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예컨대, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 투여받은 영장류에서 검정될 수 있다. WO 2000/42072에는 FcRn에의 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 또한, 예컨대, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조할 수 있다.
c. 당화 변형
추가의 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체의 당화 패턴 또는 조성은 변형된다. 더욱 특히, 본 발명의 바람직한 실시양태는 하나 이상의 조작된 당형태, 즉, Fc 영역을 포함하는 분자에 공유적으로 부착된 변경된 당화 패턴 또는 변경된 탄수화물 조성을 포함할 수 있다. 조작된 당형태는 효과기 기능 증진 또는 감소, 표적 항원에 대한 항체의 친화도 증가, 또는 항체 생산 촉진을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 감소된 효과기 기능을 원하는 경우, 분자는 비당화된 형태로 발현되도록 조작될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열내 하나 이상의 당화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 즉, 하나 이상의 아미노산을 치환시킴으로써 하나 이상의 가변 영역 골격 당화 부위를 제거하여 상기 부위의 당화를 제거할 수 있다(예컨대, U.S.P.N. 제5,714,350호 및 제6,350,861호 참조). 대조적으로, 하나 이상의 추가의 당화 부위에서 조작함으로써 Fc 함유 분자에 증진된 효과기 기능 또는 개선된 결합을 부여할 수 있다.
추가로 또는 별법으로, 당화 조성이 변경된 Fc 변이체, 예컨대, 푸코실 잔기의 양이 감소된 하이포푸코실화된 항체 또는 이분성 GlcNac 구조가 증가된 항체가 제조될 수 있다. 이러한 및 유사한 변경된 당화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시킨다고 입증된 바 있다. 조작된 당형태는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 조작된 또는 변이 발현 균주를 이용함으로써, 하나 이상의 효소(예를 들어, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))와의 공발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터 세포주 내에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현함으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후에 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740]; [Umana et al.(1999) Nat. Biotech. 17: 176-1] 뿐만 아니라, 유럽 특허 번호: EP 1,176,195; PCT 공보 WO 03/035835; WO 99/54342, [Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180]; [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294]; [Shields et al, 2002, 1 Biol Chem 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473], U.S.P.N. 제6,602,684호; U.S.S.N. 제10/277,370호; 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140 A1; PCT WO 02/30954 A1; 포틸레전트(Potillegent)™ 기술(바이오와 인코퍼레이티드(Biowa, Inc.)); 글리코MAb(GlycoMAb)™ 당화 조작 기술(글리카트 바이오테크놀로지 아게(GLYCART biotechnology AG)); WO 00061739; EA01229125; U.S.P.N. 제2003/0115614호; [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49]를 참조할 수 있다.
IX. 조절 인자 발현
a. 개요
원하는 노텀 조절 인자를 코딩하는 DNA는 종래 방법을 사용함으로써(예컨대, 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열 분석될 수 있다. 조절 인자가 항체일 경우, 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포(또는 파지 또는 효모 유래 콜로니)는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 원하는 경우, 핵산은 융합 단백질, 또는 키메라, 인간화된 또는 완전한 인간 항체를 비롯한 제제를 생성하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 추가로 조작될 수 있다. 더욱 특히, U.S.P.N. 제7,709,611호에 기술되어 있는 바와 같이, 항체 제조를 위해 변형될 수 있는 단리된 DNA를 사용하여 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝할 수 있다.
이러한 예시적인 방법은 선택된 세포로부터의 RNA 추출, cDNA로의 전환, 및 항체 특이 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 적합한 프라이머는 당업계에 주지되어 있으며, 본원에 예시되어 있는 바와 같이, 다수의 상업적으로 공급원으로부터 쉽게 이용할 수 있다. 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 또는 비인간 항체를 발현시키기 위해서는 항체를 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터로 클로닝하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 비롯한 숙주 세포로 도입한다는 것을 이해할 것이다. 추가의 다른 실시양태에서, 조절 인자를 다르게는 원하는 구성체를 생산하지 않는 시미안 COS 세포, NSO 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 골수종 세포로 도입하여 그에 의해 발현되도록 한다. 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 원하는 조절 인자를 발현하는 형질전환된 세포를 상대적으로 다량으로 성장시켜 융합 구성체 또는 면역글로불린을 임상적 및 상업적으로 공급할 수 있도록 할 수 있다.
노텀 조절 인자의 원하는 부위를 코딩하는 핵산이 파지 디스플레이 기술, 효모 라이브러리, 하이브리도마 기반 기술, 합성적 방식으로, 또는 상업적 공급원으로부터 수득되든 또는 유래되든 간에, 본 발명은 융합 단백질 및 항노텀 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 유도체를 비롯한 노텀 조절 인자를 코딩하는 핵산 분자 및 서열을 명백히 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 추가로 고도한 엄격도하에서, 또는 별법으로 중간 정도의 또는 보다 낮은 엄격도의 하이브리드화 조건하에서(예컨대, 하기에 정의되는 바와 같은 조건하에서) 본 발명의 조절 인자 또는 이의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 핵산 또는 핵산 분자(예컨대, 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자라는 용어는 적어도 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 또한, 본 발명은 제한없이, 벡터, 플라스미드, 숙주 세포, 코스미드 또는 바이러스 구성체를 비롯한, 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 상기 조절 인자를 도입하는 임의의 비히클 또는 구성체를 포함한다.
단리된 핵산이라는 용어는 핵산이 (i) 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)에 의해 시험관내에서 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예를 들어, 절단, 및 겔 전기영동 분획에 의해 정제되거나, (iv) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성되었다는 것을 의미한다. 단리된 핵산은 재조합 DNA 기법에 의한 조작을 위해 이용가능한 핵산이다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 항체의 쇄 중 하나 또는 그 둘 모두, 또는 이의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체를 비롯한, 조절 인자를 코딩하는 핵산, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인, 분석, 돌연변이화 또는 증폭시키기 위한 하이브리드화 프로브, PCR 프라이머 또는 서열 분석 프라이머로서 사용하기에 충분한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제시키기 위한 안티센스 핵산, 및 상기에 대해 상보적인 서열 또한 제공한다. 핵산의 길이는 임의 길이일 수 있다. 핵산은 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있고/거나, 하나 이상의 추가 서열, 예를 들어, 조절 서열을 포함할 수 있고/거나, 더 큰 핵산, 예를 들어, 벡터의 부분일 수 있다. 이러한 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드, 및 이의 인공 변이체(예컨대, 펩티드 핵산)를 포함할 수 있다. 항체 또는 이의 면역반응성 단편 또는 유도체를 비롯한, 본 발명의 조절 인자를 코딩하는 핵산은 바람직하게 상기 기술된 바와 같이 단리된다.
b. 하이브리드화 및 정체( identity )
언급한 바와 같이, 본 발명은 추가로 특정 하이브리드화 조건하에서 다른 핵산과 하이브리드화하는 핵산을 제공한다. 핵산을 하이브리드화시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]을 참조할 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 중간 정도로 엄격한 하이브리드화 조건은 5 x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)를 함유하는 사전 세척액, 하이브리드화 완충제 약 50% 포름아미드, 6xSSC, 및 하이브리드화 온도 55℃(또는 다른 유사 하이브리드화 용액, 예컨대, 약 50% 포름아미드를 함유하는 것, 하이브리드화 온도 42℃), 및 60℃ 0.5xSSC, 0.1% SDS 중에서의 세척 조건을 사용한다. 엄격한 하이브리드화 조건 45℃ 6xSSC 중에서 하이브리드화한 후, 68℃ O.1xSSC, 0.2% SDS 중에서 1회 이상 세척한다. 추가로, 하이브리드화의 엄격도를 증가시키거나 감소시킴으로써 서로 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로는 서로에 대해 하이브리드화된 상태로 유지될 수 있도록 당업자는 하이브리드화 및/또는 세척 조건을 조작할 수 있다. 더욱 일반적으로, 본 개시내용의 목적을 위해, 핵산 서열과 관련하여 실질적으로 동일하다라는 용어는 참조 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 97% 이상인 뉴클레오티드의 서열로서 해석되어야 한다.
하이브리드화 조건을 선택하는 것에 영향을 미치는 기본 파라미터 및 적합한 조건을 고안하는 것에 관한 가이던스는 예를 들어, 문헌 ([Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4])에 기술되어 있고, 예를 들어, 핵산의 길이 및/또는 염기 조성에 기초하여 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에 따라 핵산은 단독으로 존재할 수 있거나, 또는 동종성 또는 이종성인 다른 핵산과 함께 조합하여 존재할 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 상기 핵산과 관련하여 동종성 또는 이종성인 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된다. 이와 관련하여, 동종성이라는 용어는 핵산이 또한 천연적으로 발현 제어 서열에 기능적으로 연결되어 있다는 것을 의미하고, 이종성이라는 용어는 핵산이 천연적으로 발현 제어 서열에 기능적으로 연결되어 있지 않다는 것을 의미한다.
c. 발현
핵산, 예컨대, RNA 및/또는 단백질 또는 펩티드를 발현하는 핵산, 발현 제어 서열이 상기 핵산의 발현 또는 전사가 제어하에 있도록 또는 상기 발현 제어 서열의 영향하에 있도록 하는 방식으로 서로 공유적으로 연결되어 있다면, 이는 서로 연결되어 있는 것이다. 코딩 서열에 기능적으로 연결되어 있는 발현 제어 서열과 함께 핵산이 기능성 단백질로 번역되는 것이라면, 상기 발현 제어 서열의 유도를 통해 코딩 서열에서의 프레임 쉬프트없이 또는 원하는 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 없는 상기의 코딩 서열없이 상기 핵산은 전사된다.
본 발명에 따라 발현 제어 서열이라는 용어는 프로모터, 리보솜 결합부, 인핸서 및 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 다른 제어 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 발현 제어 서열은 조절될 수 있다. 발현 제어 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로는 각각 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5' 비전사 및 5' 및 3' 비번역 서열, 예컨대, TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 더욱 구체적으로, 5' 비전사 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 제어 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성 인자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 프로모터 또는 프로모터 영역이라는 용어는 발현되는 핵산 서열의 상류(5')에 위치하고, RNA 폴리머라제에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써 서열의 발현을 제어하는 핵산 서열에 관한 것이다. 프로모터 영역은 유전자의 전사 조절에 관여하는 추가의 인자에 대한 인식 및 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵 또는 진핵 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 추가로, 프로모터는 유도성일 수 있으며, 유도제에 대한 반응으로 전사를 개시할 수 있거나, 또는 전사가 유도제에 의해 제어되지 않는다면, 이는 구성적 프로모터일 수 있다. 유도제가 존재하지 않을 경우, 유도성 프로모터의 제어하에 있는 유전자는 발현되지 않거나, 또는 단지 작게 발현된다. 유도제의 존재하에서 유전자는 작동하도록 전환되거나, 전사 수준은 증가한다. 이는 일반적으로는 특이적인 전사 인자의 결합에 의해 매개된다.
본 발명에 따라 바람직한 프로모터로는 SP6, T3 및 T7 폴리머라제에 대한 프로모터, 인간 U6 RNA 프로모터, CMV 프로모터, 및 한 부분 또는 여러 부분들이 다른 세포 단백질, 예컨대, 인간 GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제) 유전자의 한 부분 또는 여러 부분들에 융합되어 있으며, (한) 추가의 인트론(들)을 포함하거나 포함하지 않는, 이의 인공 하이브리드 프로모터(예컨대, CMV)를 포함한다.
본 발명에 따라, 발현이라는 용어는 이의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA의 생산, 또는 RNA 및 단백질/펩티드의 생산을 포함한다. 또한 핵산의 부분적인 발현도 포함한다. 추가로, 발현은 일시적으로 또는 안정적으로 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라, 핵산 분자는 핵산의 발현을 제어하는 프로모터와 함께 적절히 벡터에 존재한다. 본원에서 벡터라는 용어는 이의 가장 일반적인 의미로 사용되며, 예를 들어, 핵산이 원핵 및/또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있도록 하고, 적절하게는 게놈 내로 통합될 수 있도록 하는, 상기 핵산에 대한 임의의 중개자 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게 세포에서 복제되고/거나 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 플라스미드라는 용어는 일반적으로 염색체외 유전 물질의 구성체, 일반적으로 염색체 DNA와는 독립적으로 복제될 수 있는 환형 DNA 이중나선에 관한 것이다.
본 발명을 수행할 때, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술에서 다수의 종래 기법이 임의로 사용된다는 것을 이해할 것이다. 그러한 종래 기법은 본원에서 정의된 바와 같은 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법에 관한 것이다. 이러한 기법은 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 ([Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.]; [Sambrook et al, Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., 상기 문헌 동일])에서 설명되어 있다. 예컨대, 세포 단리 및 배양에 대해(예컨대, 후속 핵산 및 단백질 단리에 대해) 유용한 다른 참고 문헌으로는 문헌 ([Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, iley-Liss, New York and the references cited therein]; [Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.]; [Gamborg and Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture]; [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla])을 포함한다. 핵산을 조작 및 제조하는 데 유용한 (예컨대, 시험관내 증폭, 세포로부터의 정제, 또는 화학적 합성에 의한) 핵산 제조 방법, 핵산 조작 방법(예컨대, 부위 지정 돌연변이유발법, 제한 효소 분해, 결찰 등에 의한 것), 및 다양한 벡터, 세포주 등이 상기 참고 문헌에 기술되어 있다. 추가로, 본질적으로 임의의 폴리뉴클레오티드(예컨대, 표지된 또는 비오틴화된 폴리뉴클레오티드 포함)는 다양한 상업적 공급원들 중 어느 것으로부터 맞춤형으로 또는 표준형으로 주문 제작될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 일부가 재조합적으로 발현될 수 있도록 하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 상기와 같은 재조합 숙주 세포에서 발현에 의해 생산된 항체는 본원에서 재조합 항체로 지칭된다. 본 발명은 또한 상기 숙주 세포의 자손 세포, 및 상기에 의해 생산된 항체를 제공한다.
본원에서 사용되는 바, 재조합 숙주 세포(또는 간단하게 숙주 세포)라는 용어는 재조합 발현 벡터가 그 안으로 도입되어 있는 세포를 의미한다. 재조합 숙주 세포 및 숙주 세포란 특정 피험체 세포뿐만 아니라, 상기 세포의 자손도 의미한다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경상의 영향으로 인해 다음 세대에서도 특정 변형은 발생할 수 있기 때문에, 사실상 상기 자손은 모체 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 바와 같이 숙주 세포라는 용어의 범주내 포함된다. 상기 세포는 상기 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 이의 일부를 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에 따라, 상기 방법은 상기 기술된 바와 같이 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 세포를 배양하는 단계, 및 항체 또는 이의 일부를 회수하는 단계를 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 항체(또는 이의 단편 또는 변이체)의 발현은 바람직하게 원하는 항노텀 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터(들)를 포함한다. 당업자에게 주지되어 있는 방법을 사용하여 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항노텀 항체(예컨대, 전체 항체, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 이의 일부, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR, 단일 쇄 Fv, 또는 이의 단편 또는 변이체)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 항체 분자(또는 이의 단편)의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 항체(또는 이의 단편)의 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 중쇄 및 경쇄, 둘 모두를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일단 본원의 교시에 따라 본 발명의 뉴클레오티드를 단리시키고 변형시키고 나면, 이를 사용하여 항노텀 항체 또는 이의 단편을 비롯한, 선택된 조절 인자를 제조할 수 있다.
X. 조절 인자 제조 및 정제
당업계에 알려져 있는 분자 생물학 기법 및 현 단백질 발현 방법을 사용하여, 상당량의 원하는 조절 인자를 제조할 수 있다. 더욱 구체적으로, 조절 인자, 예컨대, 상기 기술된 바와 같이, 수득되고 조작된 항체를 코딩하는 핵산을, 다양한 유형의 숙주 세포를 포함하는 주지되고, 상업적으로 이용가능한 단백질 제조 시스템으로 통합시켜 임상전, 임상 또는 상업적인 양의 원하는 약학 생성물을 수득할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 선택된 숙주 세포 내로 효율적으로 통합될 수 있도록 하고, 이어서, 원하는 노텀 조절 인자가 높은 수준으로 발현될 수 있도록 하는 벡터 또는 발현 벡터 로 조절 인자를 코딩하는 핵산 분자를 조작하는 것을 이해할 것이다.
바람직하게는, 비록 원핵 시스템이 조절 인자 생산에 사용될 수 있기는 하지만, 노텀 조절 인자를 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터가 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 형질감염은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입시키는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 그 방법으로는 덱스트란 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)의 리포솜 내로의 캡슐화, 및 DNA의 핵 내로의 직접적인 미세주입을 포함한다. 추가로, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예컨대, U.S.P.N 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호, 및 제4,959,455호를 참조할 수 있다. 추가로, 식물 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 그 예로, 아그로박테리움 매개 형질전환, 바이오리스틱 형질전환, 직접 주입, 전기천공 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법 또한 당업계에 주지되어 있다.
또한, 숙주 세포를 본 발명의 두 발현 벡터, 예를 들어, 중쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터, 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 공형질감염시킬 수 있다. 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드가 실질적으로 동일하게 발현될 수 있도록 하는 동일의 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 별법으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드, 둘 모두를 코딩하고, 이들을 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황하에서 경쇄는 과량의 독성을 띠는 유리 중쇄를 회피하기 위해 중쇄 앞에 배치되는 것이 바람직하다. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열을 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
a. 숙주 발현 시스템
다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 상업적으로 이용가능하고, 본원의 교시와 화합성이며, 본 발명의 조절 인자를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 그러한 숙주 발현 시스템으로는 대표적으로 그에 의해 관심의 대상이 되는 코딩 서열이 발현될 수 있고, 이어서, 정제될 수 있는 비히클이 있고, 또한 대표적으로는, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염되었을 때, 계내에서 본 발명의 분자를 발현시킬 수 있는 세포가 있다. 그러한 시스템으로는 조절 인자 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대, 박테리아(예컨대, E. 콜라이, B. 섭틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스(streptomyces)); 조절 인자 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질감염된 효모(예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); 조절 인자 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 바큘로바이러스)로 형질감염된 곤충 세포계; 조절 인자 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예컨대, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV(cauliflower mosaic virus); 담배 모자이크 바이러스, TMV(tobacco mosaic virus))로 감염되거나, 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예컨대, Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물 세포계(예컨대, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 개구리밥, 옥수수, 소맥, 감자 등); 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성체를 보유하는 포유동물 세포계(예컨대, COS, CHO, BH, 293, 3T3 세포)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
박테리아계의 경우, 발현되는 항체 분자의 용도에 따라서 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 조절 인자의 약학 조성물 생성을 위해 이러한 단백질을 다량으로 생산하고자 하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물을 고수준으로 발현될 수 있도록 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역과 함께 프레임내에서 벡터에 개별적으로 결찰되어 융합 단백질을 생성하는 E. 콜라이 발현 벡터 pUR278(문헌 [Ruther et al., EMBO 1. 2: 1791 (1983)]); pIN 벡터(문헌 [Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); [Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)]) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. pGEX 벡터 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST: glutathione 5-transferase)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에의 흡착 및 결합 후, 유리 글루타티온의 존재하에 용리시킴으로써 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 유리될 수 있도록 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인한다.
곤충계의 경우에는, 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(AcNPV: Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)가 외래 유전자를 발현하는 벡터로서 사용될 수 있다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자)으로 개별적으로 클로닝될 수 있고, AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 배치될 수 있다.
포유동물 숙주 세포의 경우에는, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템을 이용하여 원하는 뉴클레오티드 서열을 도입할 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심의 대상이 되는 코딩 서열을 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 3 부분 리더 서열에 결찰시킬 수 있다. 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예컨대, 영역 E1 또는 E3) 내로의 삽입을 통해 생존가능하고, 감염된 숙주에서 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 것이다(예컨대, 문헌 [Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1 :355-359 (1984)] 참조). 또한, 삽입된 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해서는 특정 개시 신호가 필요할 수 있다. 이러한 신호로는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 추가로, 개시 코돈은 전체 삽입체가 확실하게 번역될 수 있도록 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 맞게 작동하여야 한다. 이러한 외인성 버역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성, 둘 모두로 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서, 전사 종결인자 등의 포함으로 증진될 수 있다(예컨대, 문헌 [Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987) 참조). 따라서, 발현을 위해 숙주로서 이용가능한 화합성 포유동물 세포주는 당업계에 주지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC: American Type Culture Collection)으로부터 이용가능한 다수의 불멸화된 세포주를 포함한다. 이들 중에서도 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 프리스타일(Freestyle) 세포(라이프 테크놀로지스(Life Technologies: 샌디에고)), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예컨대, Hep G2), A549 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함한다.
재조합 단백질의 장기간 고수율의 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 따라서, 선택된 조절 인자를 안정하게 발현하는 세포주를 당업계에 알려져 있는 표준 기법을 사용하여 조작할 수 있다. 바이러스의 복제 기점을 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것보다는 적절한 발현 제어 인자(예컨대, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 DNA, 및 선별가능한 마커로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 강화 배지에서 1-2일 동안 성장시킨 후, 선택 배지로 교환시켜준다. 재조합 플라스미드 중의 선별가능한 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 세포가 그 플라스미드를 이의 염색체 내로 안정하게 통합하여 성장함으로써 병소를 형성한 뒤, 클로닝되어 세포주로 확장될 수 있도록 한다. 이 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용할 수 있다. 상기와 같은 조작된 세포주는 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물을 스크리닝 및 평가하는 데 특히 유용할 수 있다.
다수의 선별 시스템이 당업계에 주지되어 있고, 이들이 사용될 수 있으며, 그 예로는 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제(문헌 [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)]), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)]), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Lowy et al., Cell 22:8 17 (1980)]) 유전자가 각각 tk 세포, hgprt 세포 또는 aprt 세포에서 이용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항대사산물 내성이 하기 유전자에 대한 선별의 기본으로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(문헌 ([Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)]; [O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)])); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(문헌 [Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)]); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(문헌 ([Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596(1993)]; [Mulligan, Science 260:926-932 (1993)]; 및 [Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993)]; [TIB TECH 11(5): 155-215 (May, 1993)]); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(문헌 [Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]). 원하는 재조합 클론을 선별하는 데 당업계에 통상 알려져 있는 재조합 DNA 기술 방법이 적용될 수 있고, 그러한 방법은 예를 들어, 문헌 ([Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)]; [Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1(1981)])에 기술되어 있다. 안정한 고수율의 세포를 확립하는 특히 바람직한 방법은, 특정 조건하에서 발현을 증진시키는 효율적인 접근법을 제공하는 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템(GS 시스템)을 포함한다는 것을 이해할 것이다. GS 시스템은 EP 특허 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 및 0 338 841(이들 각각은 본원에 참고로 포함된다)와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의되고 있다.
추가로, 숙주 세포 균주는 삽입 서열의 발현을 조절하거나, 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 프로세싱하는 것이 선택될 수 있다. 그러한 단백질 생성물의 변형(예컨대, 당화) 및 프로세싱(예컨대, 절단)은 단백질의 기능 및/또는 정제에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 프로세싱과 변형에 특징적이고 특이적인 기전을 가지고 있다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 발현되는 발현된 폴리펩티드가 확실하게 원하는 바대로 변형 및 프로세싱될 수 있도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위해, 1차 전사체의 적당한 프로세싱, 당화 및 인산화에 대한 세포 기구를 소유하는 진핵 숙주 세포는 본 발명에서 사용하는 데 특히 효과적이다. 따라서, 특히 바람직한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, NS0, MDCK, 293, 3T3, W138 뿐만 아니라, 유방암 세포주, 예컨대, 예를 들어, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, 및 정상적인 유선 세포주, 예컨대, CRL7030 및 HsS78Bst를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 조절 인자 및 선택된 생산 시스템에 따라, 당업자는 조절 인자의 효율적인 발현을 위해 적절한 숙주 세포를 쉽게 선택하고 최적화시킬 수 있다.
b. 화학적 합성
상기 언급한 숙주 세포 시스템 이외에도, 본 발명의 조절 인자는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다는 것을 이해할 것이다(예컨대, 문헌 [Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y.], 및 [Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-11 1]) 참조). 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 단편에 상응하는 펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 추가로, 원하는 경우, 비고전적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 폴리펩티드 서열에의 치환 또는 부가로서 도입될 수 있다. 비고전적 아미노산으로는 일반적으로 일반 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노 부티르산, a-아미노 이소부티르산, 4-아미노 부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, b-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예를 들어, b-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, Na-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 아미노산은 D(우선성) 또는 L(좌선성)일 수 있다.
c. 트랜스제닉 시스템
본 발명의 노텀 조절 인자는 또한 관심의 대상이 되는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열(또는 이의 단편 또는 유도체 또는 변이체)에 대해 트랜스제닉인 포유동물 또는 식물의 생성 및 회수가능한 형태로 원하는 화합물의 생산을 통해 트랜스제닉 기법에 의해 생산될 수 있다. 포유동물에서의 트랜스제닉 생산과 관련하여, 예를 들어, 항노텀 항체는 염소, 소, 또는 다른 포유동물의 젖으로부터 생산되고, 회수될 수 있다. 예컨대, U.S.P.N. 제5,827,690호, 제5,756,687호, 제5,750,172호, 및 제5,741,957호를 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비인간 트랜스제닉 동물을 노텀 또는 이의 면역원성 부위로 면역화시킨다. 식물에서 항체를 제조하는 방법은 예컨대, U.S.P.N. 제6,046,037호, 및 제5,959,177호에 기술되어 있다.
본원의 교시에 따라, 표준 트랜스제닉 기법에 의해 본 발명의 노텀 조절 인자를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 동물 또는 식물 내로 도입함으로써 비인간 트랜스제닉 동물 또는 식물을 생산할 수 있다. 문헌 [Hogan] 및 미국 특허 번호 제6,417,429호를 참조할 수 있다. 트랜스제닉 동물을 제조하는 데 사용되는 트랜스제닉 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포 또는 수정란일 수 있다. 트랜스제닉 비인간 유기체는 키메라, 비키메라 이형접합체, 및 비키메라 동형접합체일 수 있다. 예컨대, 문헌 ([Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999)]; [Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000)]; 및 [Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)])을 참조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 비인간 동물은 표적화된 파괴 및 예를 들어, 관심의 대상이 되는 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 표적 구성체에 의한 치환을 가진다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 노텀에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 발현한다. 항노텀 항체는 임의의 트랜스제닉 동물에서 제조될 수 있지만, 특히 바람직한 실시양태에서, 비인간 동물은 마우스, 래트, 양, 돼지, 염소, 소, 또는 말이다. 추가의 실시양태에서, 비인간 트랜스제닉 동물은 혈액, 젖, 뇨, 타액, 눈물, 점액 및 그로부터 당업계에 알려져 있는 정제 기법을 사용하여 원하는 약학 생성물이 쉽게 수득될 수 있는 다른 체액 중에서 원하는 약학 생성물을 발현한다.
상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현된, 항체를 비롯한 조절 인자는 서로 상이한 당화 패턴을 가질 수 있을 것이다. 그러나, 본원에서 제공하는 핵산 분자에 의해 코딩되거나, 또는 본원에서 제공하는 아미노산 서열을 포함하는 모든 조절 인자는 그 분자의 당화 상태와는 상관없이, 및 더욱 일반적으로는 번역 후 변형(들)의 존재 또는 부재와는 상관없이 본 발명의 일부가 된다. 추가로, 본 발명은 예컨대, 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기, 단백질 분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드에의 연결에 의한 유도체화 등에 의해 번역 동안 또는 그 이후에 차별적으로 변형된 조절 인자를 포함한다. 다수의 화학적 변형 중 임의의 것은 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4 에 의한 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원, 투니카마이신의 존재하에서의 대사 합성 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 또한 본 발명에 포함되는 다양한 번역 후 변형으로는 예를 들어, N 연결된 또는 O 연결된 탄수화물 쇄, N 말단 또는 C 말단 단부의 프로세싱, 아미노산 골격에의 화학적 모이어티 부착, N 연결된 또는 O 연결된 탄수화물 쇄의 화학적 변형, 및 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N 말단 메티오닌 잔기의 부가 또는 결실을 포함한다. 또한, 본 명세서 및 하기 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, 폴리펩티드는 또한 조절 인자가 검출 및 단리될 수 있도록 하는 검출가능한 표지, 예컨대, 효소, 형광, 방사성 동위원소 또는 친화성 표지로 변형될 수 있다.
d. 정제
일단 본 발명의 조절 인자가 재조합 발현 또는 본원에 개시된 다른 기법 중 어느 하나에 의해 제조되고 나면, 당업계에 공지된 임의의 면역글로불린 정제 방법에 의해, 또는 더욱 일반적으로는 단백질을 정제시키는 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제시킬 수 있다. 이와 관련하여, 조절 인자는 단리될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 단리된 노텀 조절 인자는 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염성 성분은 상기 폴리펩티드의 진단학적 또는 치료학적 사용을 방해할 수 있는 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 조절 인자는 폴리펩티드의 천연 환경의 1 이상의 성분이 존재하지 않는 바, 재조합 세포 내에서 계내에 조절 인자를 포함한다.
재조합 기법을 사용할 때, 노텀 조절 인자(예컨대, 항노텀 항체 또는 이의 유도체 또는 단편)는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생산될 수 있거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 원하는 분자가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 미립자 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter, et al., Bio/Technology 10: 163 (1992)]에는 E. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비된 항체를 단리시키는 방법이 기술되어 있다. 간략하면, 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 세포 페이스트를 해동시킨다. 원심분리에 의해 세포 잔해를 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비된 경우에는 일반적으로 상기 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유니트를 이용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제시키기 위해 상기 단계 중 임의의 단계에 프로테아제 억제제 예컨대, PMSF를 포함시킬 수 있고, 우발성 오염물질의 성장을 막기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 조절 인자(예컨대, fc-노텀 또는 항노텀 항체) 조성물은 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있으며, 바람직한 정제 기법은 친화성 크로마토그래피이다. 단백질 A의 친화성 리간드로서의 적합성은 선택된 구성체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종류와 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는 데 이용될 수 있다(문헌 [Lindmark, et al., J Immunol Meth 62: 1 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 IgG3에 대해 권장된다(문헌 [Guss, et al., EMBO J 5: 1567 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 흔히 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 예컨대, 공극이 조절되는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스를 통해 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 유속은 더 빨라지고, 처리 시간은 단축될 수 있다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지(J. T. 베이커(J. T. Baker; 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 다른 단백질 정제 기법, 예컨대, 이온 교환 칼럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 세파로스 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전 또한 회수하고자 하는 항체에 따라 이용가능하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 적어도 부분적으로는 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 것이다.
XI. 접합된(Conjugated) 노텀 조절 인자
일단 본 발명의 조절 인자를 본원의 교시에 따라 정제하고 나면, 이를 약학적 활성 모이어티 또는 진단학적 모이어티 또는 생체화합성 개질제와 연결시키거나, 그에 융합시키거나, 그에 (예컨대, 공유적으로 또는 비공유적으로) 접합시키거나, 또는 다르게는 회합시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 접합체라는 용어는 광범위하게 사용되며, 회합 방법과는 상관없이, 개시된 조절 인자와 회합된 임의의 분자를 의미하는 것으로 간주된다. 이와 관련하여, 상기와 같은 접합체는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 중합체, 핵산 분자, 소분자, 모방체 작용제, 합성 약물, 무기 분자, 유기 분자 및 방사성 동위원소를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 상기 언급한 바와 같이, 선택된 접합체는 공유적으로 또는 비공유적으로 조절 인자에 연결될 수 있고, 적어도 부분적으로는 접합을 일으키는 데 사용되는 방법에 따라 다양한 몰비를 나타낼 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 선택된 특징을 부여하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드(예컨대, 생체독소, 바이오마커, 정제용 태그 등)와 접합되거나 회합될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 더욱 일반적으로, 선택된 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드가 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상 또는 100개 이상의 아미노산을 포함하는 것인, 이종성 단백질 또는 폴리펩티드에 재조합적으로 융합되거나, 화학적으로 접합된(공유 및 비공유 접합, 둘 모두 포함) 조절 인자 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 구성체는 반드시 직접 연결될 필요는 없지만, 링커 서열을 통해 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조절 인자를 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체에 융합시키거나, 또는 접합시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 노텀을 발현하는 특정 세포 유형에 이종성 폴리펩티드를 표적화시키는 데 항체를 사용할 수 있다. 또한, 이종성 폴리펩티드에 융합되거나, 접합된 조절 인자는 또한 시험관내 면역검정법에 사용될 수 있고, 당업계에 공지되어 있는 정제 방법과 화합성일 수 있다. 예컨대, (국제 공개 번호 WO 93/21232; 유럽 특허 번호 EP 439,095; [Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99]; 미국 특허 번호 제5,474,981호; [Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432]; 및 [Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452])를 참조할 수 있다.
a. 생체화합성 개질제
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 원하는 대로 조절 인자의 특징을 조정하거나, 변경시키거나, 개선시키거나, 또는 완화시키는 데 사용될 수 있는 생체화합성 개질제와 접합되거나, 또를 다르게는 그와 회합될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 융합 구성체는 상대적으로 고분자량의 중합체 분자, 예컨대, 상업적으로 이용가능한 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol) 또는 유사한 생체화합성 중합체 부착에 의해 생성될 수 있다. PEG는 항체에 특이적인 특성을 부여하도록 선택될 수 있는 다수의 상이한 분자량 및 분자 배열로 수득될 수 있다는 것(예컨대, 반감기는 조정될 수 있다)을 당업자는 이해할 것이다. PEG는 상기 항체 또는 항체 단편의 N 또는 C 말단에의 PEG의 부위 특이 접합을 통해, 또는 리신 잔기 상에 존재하는 엡실론 아미노기를 통해 다기능성 링커로 또는 이의 부재하에 조절 인자 또는 항체 단편 또는 유도체에 부착될 수 있다. 생물학적 활성을 최소로 손실시키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 수 있다. 접합 정도는 SDS-PAGE 및 질량 분석에 의해 면밀히 모니터링함으로써 PEG 분자를 항체 분자에 확실히 최적으로 접합시킬 수 있다. 비처리된 PEG는 예컨대, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리시킬 수 있다. 유사한 방식으로, 개시된 조절 인자는 항체 또는 항체 단편이 생체내에서 보다 안정화도록 만들기 위해, 또는 생체내에서 보다 장기간의 반감기를 가지도록 하기 위해 알부민에 접합시킬 수 있다. 기법은 당업계에 주지되어 있고, 예컨대, 국제 공개 번호 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 0 413,622를 참조할 수 있다. 다른 생체화합성 접합체는 당업계의 숙련가에게는 분명해져 있으며, 이는 본원의 교시에 따라 쉽게 확인될 수 있다.
b. 진단제 또는 검출제
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자, 또는 이의 단편 또는 유도체는 생물학적 분자(예컨대, 펩티드 또는 뉴클레오티드) 또는 소분자 또는 방사성 동위원소일 수 있는 진단제 또는 검출제에 접합된다. 그러한 조절 인자는 과증식성 장애의 발생 또는 진행을 모니터링하는 데, 또는 개시된 조절 인자를 포함하는 특정 요법의 효능을 측정하는 임상 테스팅의 일부로서 유용할 수 있다. 그러한 마커는 또한 선택된 조절 인자를 정제하는 데, TIC를 분리 또는 단리시키는 데, 또는 임상전 방법 또는 독성학 연구에서 유용할 수 있다.
그러한 진단 및 검출은 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알카리성 포스파타제, 베타 갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하는 다양한 효소; 보결분자단, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 스트렙트아비딘 및 아비딘/바이오틴; 형광 물질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광 물질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 루미놀; 생체발광 물질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In,), 및 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 크세논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, , 66Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117Tin; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용한 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온, 및 방사성 동위원소 표지된, 또는 특이 방사성 동위원소에 접합된 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 검출가능한 물질에 조절 인자를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 실시양태에서, 적절한 검출 방법은 당업계에 주지되어 있고, 다수의 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 다른 실시양태에서, 조절 인자 또는 이의 단편은 정제 또는 진단학적 방법, 예컨대, 면역조직화학법 또는 FACs가 원활하게 이루어질 수 있도록 마커 서열, 예컨대, 펩티드 또는 형광단에 융합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열들 중 다수는 상업적으로 이용가능한 데, 그 중에서도, 예컨대, pQE 벡터(퀴아젠)에 제공된 태그인 헥사 히스티딘 펩티드가 있다. 문헌 [Gentz et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기술되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 헥사 히스티딘을 융합 단백질은 쉽게 정제될 수 있다. 정제용으로서 유용한 다른 펩티드로는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 유래의 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 "HA" 태그(문헌 [Wilson et al., 1984, Cell 37:767] 및 "플래그" 태그(U.S.P.N. 제4,703,004호)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
c. 치료학적 모이어티
앞에서 언급한 바와 같이, 조절 인자 또는 이의 단편 또는 유도체는 또한 치료학적 모이어티, 예컨대, 세포독소 또는 세포독성제, 예컨대, 세포증식 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예컨대, 알파 또는 베타 방출체에 접합되거나, 연결되거나, 또는 융합되거나, 또는 다르게는 그와 회합될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 유해하고, 세포 성장 또는 생존을 억제시킬 수 있는 임의의 작용제 또는 치료학적 모이어티를 포함한다. 그 예로는 파클리탁셀, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신, 메이탄시노이드, 예컨대, DM-1 및 DM-4(이뮤노겐, 인코퍼레이티드(Immunogen, Inc.)), 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 에피루비신, 및 사이클로포스파미드 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 추가의 세포독소로는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE: monomethyl auristatin E) 및 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF: monomethyl auristatin F)(시애틀 제네틱스, 인코퍼레이티드(Seattle Genetics, Inc.))를 비롯한 아우리스타틴, 아마니틴, 예컨대, 알파 아마니틴, 베타 아마니틴, 감마 아마니틴 또는 엡실론 아마니틴(하이델베르크 파마 아게(Heidelberg Pharma AG)), DNA 마이너 그루브 결합제, 예컨대, 듀오카르마이신 유도체(신타르가, B.V.(Syntarga, B.V.)) 및 개질된 피롤로벤조디아제핀 이량체(PBD: pyrrolobenzodiazepine dimer, 스피로겐, 리미티드(Spirogen, Ltd))를 포함한다. 추가로, 한 실시양태에서, 본 발명의 노텀 조절 인자는 세포독성 T 세포를 동원하여 종양 개시 세포를 표적하기 위해 항CD3 결합 분자와 회합될 수 있다(BiTE 테크놀로지(BiTE Technology); 예컨대, 문헌 [Fuhrmann, S. et. al. Annual Meeting of AACR Abstract No. 5625 (2010)] (이는 본원에 참고로 포함된다) 참조).
추가의 화합성 치료학적 모이어티로는 항대사산물(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카뮤스틴(BSNU) 및 로뮤스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부술판, 디브로모만닛톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 항유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포독성제를 포함한다. 치료학적 모이어티에 관한 보다 광범위한 목록은 PCR 공보 WO 03/075957 및 U.S.P.N. 제2009/0155255호(이들은 각각 본원에 참고로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
선택된 조절 인자는 또한 치료학적 모이어티, 예컨대, 방사성금속 이온을 접합시키는 데 유용한 거대고리 킬레이터 또는 방사성 물질에 접합될 수 있다(예를 들어, 방사성 물질에 대해 상기 참조). 특정 실시양태에서, 거대고리 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"-테트라아세트산(DOTA)이다. 그러한 링커 분자는 통상 당업계에 공지되어 있고, 문헌 ([Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483]; [Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553]; 및 [Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943])에 기술되어 있다.
본 발명의 상기 측면과 화합성일 수 있는 방사성 동위원소의 예로는 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 구리(62Cu, 64Cu, 67Cu), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In,), 비스무트(212Bi, 213Bi), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 크세논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, , 66Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 117Tin, 225 Ac, 76Br, 및 211At를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 방사성 핵종 또한 진단제 및 치료제로서 이용가능하며, 특히, 에너지 범위가 60 내지 4,000 keV인 것이 그러하다. 치료하고자 하는 병증 및 원하는 치료학적 프로파일에 따라, 당업자는 개시된 조절 인자와 함께 사용하기에 적절한 방사성 동위원소를 쉽게 선택할 수 있다.
본 발명의 노텀 조절 인자는 또한 주어진 생물학적 반응을 개질시키는 치료학적 모이어티 또는 약물에 접합될 수 있다. 즉, 본 발명과 화합성인 치료제 또는 모이어티가 고전적 화학 치료제로 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다. 예를 들어, 특히 바람직한 실시양태에서, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다. 그러한 단백질로는 예를 들어, 독소, 예컨대, 아브린, 리신 A, 온코나제(또는 또 다른 세포독성 RN아제), 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대, 종양 괴사 인자, α 인터페론, β 인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 아포프토시스제, 예컨대, TNF α, TNF β, AIM I(국제 공개 번호 WO 97/33899 참조), AIM II(국제 공개 번호 WO 97/34911 참조), Fas 리간드(문헌 [Takahashi et al, 1994, J. Immunol., 6: 1567]), 및 VEGI(국제 공개 번호 WO 99/23105 참조), 혈전제 또는 항혈관신생제, 예컨대, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 개질제, 예컨대, 림포카인(예컨대, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor"), 및 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF: granulocyte colony stimulating factor")), 또는 성장 인자(예컨대, 성장 호르몬("GH: growth hormone"))을 포함할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 조절 인자를 폴리펩티드 모이어티에 융합 또는 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 앞서 개시된 대상 참고 문헌 이외에도, 예컨대, (U.S.P.N. 제5,336,603호; 제5,622,929호; 제5,359,046호; 제5,349,053호; 제5,447,851호; 및 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367, 166; PCT 공보 WO 96/04388 및 WO 91/06570; [Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535]; [Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590]; 및 [Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337])(이들 각각은 본원에 참고로 포함된다)을 참조할 수 있다. 조절 인자와 모이어티의 회합이 반드시 직접적일 필요는 없지만, 이는 링커 서열을 통해 이루어질 수 있다. 그러한 링커 분자는 통상 당업계에 공지되어 있고, 이는 문헌 ([Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483]; [Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553]; [Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943]; [Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53: 171])(이들 각각은 본원에 포함된다)에 기술되어 있다.
더욱 일반적으로, 치료학적 모이어티 또는 세포독성제를 조절 인자에 접합시키는 기법은 주지되어 있다. 모이어티는 알데히드/쉬프(Schiff) 결합, 술프하이드릴 결합, 산 불안정성 결합, 시스 아코니틸 결합, 히드라존 결합, 효소적으로 분해가능한 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 조절 인자에 접합될 수 있다(일반적으로, 문헌 [Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171] 참조). 또한, 예컨대, 문헌 ([Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119])를 참조할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 치료학적 모이어티 또는 세포독성제에 접합된 노텀 조절 인자는 세포 표면와 회합된 노텀 분자에의 결합시 세포에 의해 내재화됨으로써 치료학적 페이로드를 전달할 수 있다.
XII. 진단제 및 스크리닝
언급한 바와 같이, 본 발명은 과증식성 장애를 검출 또는 진단하는 방법, 및 종양 개시 세포를 확인하기 위해 환자로부터 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자로부터 수득된 시료를 본원에 기술된 바와 같은 노텀 조절 인자와 접촉시키고, 시료 중 결합형 또는 유리형 노텀의 존재 여부, 또는 그에의 조절 인자의 회합 수준을 검출하는 것을 포함하는, 암의 치료를 위해, 또는 암의 진행을 모니터링하기 위해 암을 앓는 개체를 확인하는 단계를 포함한다. 조절 인자가 항체 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편을 포함할 때, 시료 중 노텀과의 회합은 시료가 종양 영구 세포(예컨대, 암 줄기 세포)를 함유할 수 있다는 것으로 나타내는 것이며, 이는 암을 앓는 개체가 본원에 기술된 노텀 조절 인자로 효과적으로 치료될 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 본 방법은 대조군에의 결합 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대조적으로, 선택된 조절 인자가 Fc-노텀일 경우, 시료와 접촉하였을 때 본원에 기술된 분자의 효소적 특성을 (직접적으로 또는 간접적으로) 모니터링함으로써 원하는 정보를 제공할 수 있다. 본원의 교시와 화합성인 다른 진단 방법은 당업계에 주지되어 있고, 이는 시판 물질, 예컨대, 전용 리포팅 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
화합성 검정 방법의 예로는 방사선면역검정법, 효소 면역검정법, 경쟁 결합 검정법, 형광 면역검정법, 면역블롯 검정법, 웨스턴 블롯 분석, 유세포 분석 검정법, 및 ELISA 검정법을 포함한다. 더욱 일반적으로, 생물학적 시료 중 노텀의 검출 또는 노텀의 효소적 활성(또는 이의 억제) 측정은 당업계에 공지된 임의의 검정법을 사용하여 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 및 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명은 본원에 기술된 조절 인자, 및 조절 인자가 시료에 미치는 영향을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 과증식성 장애를 검출, 모니터링, 또는 진단하기 위한, 환자에서 상기 장애의 가능한 치료를 위해 또는 이의 진행(또는 퇴행)을 모니터링하기 위해 장애를 앓는 개체를 확인하기 위한 키트를 제공한다.
노텀 조절 인자 및 세포, 이의 자손을 비롯한 상기의 것을 포함하는 배양물, 집단 및 조성물 또한 노텀과의 상호작용에 의해 종양 개시 세포 또는 이의 자손의 기능 또는 활성에 영향을 미치는 화합물 또는 작용제(예컨대, 약물)(예컨대, 폴리펩티드 또는 이의 유전적 성분)를 스크리닝 또는 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 노텀 또는 이의 기질과의 회합에 의해 종양 개시 세포 또는 이의 자손의 기능 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 화합물 또는 작용제를 평가 또는 확인하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 그러한 화합물 및 작용제는 예를 들어, 과증식성 장애 치료를 위해 스크리닝되는 약물 후보일 수 있다. 한 실시양태에서, 시스템 또는 방법은 노텀을 나타내는 종양 개시 세포 및 화합물 또는 작용제(예컨대, 약물)을 포함하는데, 여기서, 세포 및 화합물 또는 작용제(예컨대, 약물)는 서로 접촉하는 것이다.
본 발명은 추가로 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 활성 또는 기능을 변경시키기 위한 노텀 조절 인자 또는 작용제 및 화합물을 스크리닝 및 확인하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 종양 개시 세포 또는 이의 자손을 테스트 작용제 또는 화합물과 접촉시키는 단계; 및 테스트 작용제 또는 화합물이 노텀+ 종양 개시 세포의 활성 또는 기능을 조절하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
집단 내에서 상기 종양 개시 세포 또는 이의 자손의 노텀과 관련된 활성 또는 기능을 조절하는 테스트 작용제 또는 화합물은 테스트 작용제 또는 화합물이 활성제인 것으로 확인된다. 조절될 수 있는 활성 또는 기능의 예로는 세포 형태 변화, 마커 발현, 분화 또는 탈분화, 성숙, 증식, 생존능, 아포프토시스 또는 세포 사멸 신경세포 전구 세포 또는 이의 자손을 포함한다.
세포 또는 세포 배양물 또는 방법 단계 또는 치료와 관련하여 사용될 때, 접촉이란 조성물(예컨대, 노텀+ 세포 또는 세포 배양물)과 또 다른 참조 실체 사이의 직접 또는 간접적인 상호작용을 의미한다. 간접적인 상호작용의 특정 예는 조성물이 중간 분자에 작용하고, 결국에는 이 중간 분자가 참조 실제(예컨대, 세포 또는 세포 배양물)에 작용하는 경우이다.
이러한 본 발명의 측면에서, 조절하다라는 것은 본 발명의 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 특정 측면과 관련하여 측정된 세포 활성 또는 기능(예컨대, 전이 또는 증식)에 미치는 효과를 검출하는 것과 화합성인 방식으로 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 활성 또는 기능에 영향을 미치는 것을 나타낸다. 활성 및 기능의 예로는 형태, 발생상 마커, 분화, 증식, 생존능, 세포 호흡, 미토콘드리아 활성, 막 완전성, 또는 특정 병증과 관련된 마커의 발현의 측정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 종양 개시 세포 또는 자손 세포를 화합물 또는 작용제와 접촉시키고, 본원에 개시된 바와 같이, 또는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 활성 또는 기능의 임의의 조절을 측정함으로써 화합물 또는 작용제(예컨대, 약물 후보)는 그가 종양 개시 세포 또는 자손 세포에 미치는 효과에 대해 평가될 수 있다.
작용제 및 화합물을 스크리닝 및 확인하는 방법은 임의로 소정의 위치 또는 주소에 위치 또는 배치된 세포 어레이(예컨대, 마이크로어레이)를 포함하는, 고처리량 스크리닝에 적합한 것을 포함한다. 고처리량 로보트식 또는 수동식 처리 방법은 단시간에 다수의 유전자의 화학적 상호작용을 프로빙할 수 있고, 발현 수준을 측정할 수 있다. 분자 신호(예컨대, 형광단) 및 초고속으로 정보를 프로세싱하는 자동 분석 연구를 사용하는 기법이 개발되었다(예컨대, 문헌 [Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7: 133 (2004)] 참조). 예를 들어, 마이크로어레이 기술은 특정 유전자에 대한 정보를 제공함과 동시에, 수천여 개의 유전자의 상호작용을 동시에 프로빙하는 데 광범위하게 사용되었다(예컨대, 문헌 [Mocellin and Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593: 19 (2007)] 참조).
상기와 같은 스크리닝 방법(예컨대, 고처리량)을 통해 신속하게 효율적으로 활성제 및 화합물을 확인할 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 치료학적 성질을 띠는 분자를 확인하기 위해 세포를 배양 디쉬, 튜브, 플라스크, 롤러 병 또는 플레이트(예컨대, 단일 다중 웰 플레이트 또는 디쉬, 예컨대, 8, 16, 32, 64, 96, 384 및 1,536 다중 웰 플레이트 또는 디쉬) 상에, 임의로는 정의된 위치에 위치 또는 배치시킬 수 있다(사전에 시딩시켜 놓을 수 있다). 스크리닝될 수 있는 라이브러리로는 예를 들어, 소분자 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 완전 인간 항체 효모 디스플레이 라이브러리(아디맙, LLC(Adimab, LLC)), siRNA 라이브러리, 및 아데노바이러스 형질감염 벡터를 포함한다.
XIII. 약학 제제 및 치료학적 용도
a. 제제화 및 투여 경로
어떤 임의의 접합체, 의도하는 전달 방식, 치료 또는 모니터링되는 질환, 및 다수의 다른 변수와 함께 조절 인자의 형태에 따라서, 본 발명의 조성물은 당업계에 알려져 있는 기법을 사용하여 원하는 대로 제제화될 수 있다. 즉, 본 발명의 다양한 실시양태에서, 노텀 조절 인자를 포함하는 조성물은 매우 다양한 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화된다(예컨대, 문헌 ([Gennaro, Remington : The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons : Drugfacts Plus, 20th ed. (2003)]; [Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems , 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004)]; [Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients , 3rd ed., Pharmaceutical Press (2000)]) 참조). 비히클, 애주번트, 및 희석제를 비롯한, 다양한 약학적으로 허용가능한 담체가 다수의 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용될 수 있다. 또한, 각종 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대, pH 조정제 및 완충화제, 등장성 조정제, 안정제, 습윤제 등도 또한 이용가능하다. 담체의 특정의 비제한적인 예로는 염수, 완충처리된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합을 포함한다.
더욱 특히, 일부 실시양태에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 순수하게, 또는 최소량의 추가의 성분과 함꼐 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대조적으로, 본 발명의 노텀 조절 인자는 임의로, 당업계에 주지되어 있으며, 조절 인자의 투여를 용이하게 하거나, 활성 화합물을 작용 부위로 전달하기 위해 약학적으로 최적화된 제제로 프로세싱하는 것에 도움을 주는, 상대적으로 불활성인 물질인 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 제제로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 부형제는 조절 인자의 약동학적 성질을 개선시킬 수 있는 형태 또는 점조도(consistency)를 제공하거나, 또는 희석제로서의 역할을 할 수 있다. 적합한 부형제로는 안정화제, 습윤제, 및 유화제, 다양한 삼투압의 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 증진제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
전신 투여를 위한 개시된 조절 인자는 장관, 비경구 또는 국부 투여용으로 제제화될 수 있다. 사실상, 활성 성분을 동시에 전신 투여하기 위해 3가지 유형의 제제가 모두 사용될 수 있다. 부형제 뿐만 아니라, 비경구, 및 비경구를 제외한 약물 전달용 제제가 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기술되어 있다. 비경구 투여용으로 적합한 제제로는 수용성 형태, 예를 들어, 수용성 염 형태의 활성 화합물 수성 액제를 포함한다. 추가로, 오일성 주사용 현탁제용으로 적절한 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방유, 예를 들어, 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사용 현탁제는 현탁제의 점성을 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함한다. 임의로, 현탁제는 또한 안정제도 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 세포로의 전달을 위해 작용제를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다.
장관 투여용으로 적합한 제제로는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐제, 환제, 피복된 정제를 비롯한 정제, 엘릭시르, 현탁제, 시럽제 또는 흡입제 및 이의 방출 조절형 제형을 포함한다.
일반적으로, 노텀 조절 인자를 포함하는, 본 발명의 화합물 및 조성물은, 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비내, 근육내, 심장내, 뇌실내, 기관내, 협측, 직장, 복강내, 진피내, 국부, 경피, 및 경막내, 또는 다르게는 이식에 의해 또는 흡입에 의해서인 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 경로에 의해 그를 필요로 하는 피험체에게 생체내 투여될 수 있다. 대상 조성물은 캡슐제, 분제, 과립제, 연고제, 액제, 좌제, 관장제, 주사제, 흡입제, 및 에어로졸을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 고체, 반고체, 액체, 또는 기체 형태의 제제로 제제화될 수 있다. 적절한 제제화 및 투여 경로는 의도하는 적용 및 치료학적 요법에 따라 선택될 수 있다.
b. 투여량
유사하게, 특정 투여량 요법, 즉, 용량, 타이밍 및 반복 회수는 특정 개체, 및 상기 개체의 병력에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 반감기와 같은 실험상의 고려 사항이 일반적으로는 투여량을 결정하는 데 기여할 것이다. 투여 빈도는 요법 진행 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있으며, 이는 종양 개시 세포를 비롯한 과증식성 또는 신생물성 세포 개수 감소, 상기 신생물성 세포 감소 유지, 신생물성 세포 증식 감소, 또는 전이 발생 지연에 기초한다. 별법으로, 대상 치료학적 조성물의 지속 연속형 방출 제제가 적절할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 지속적인 방출을 위한 다양한 제제 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.
치료학적인 관점에서 약학 조성물은 특정 적응증의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 투여된다. 치료적 유효량은 전형적으로는 치료받는 피험체의 체중, 그 또는 그녀의 신체 상태 또는 건강 상태, 치료하고자 하는 병증의 광대함, 또는 치료받는 피험체의 연령에 따라 달라진다. 일반적으로, 본 발명의 노텀 조절 인자는 1회 투약당 약 10 ㎍/kg(체중) 내지 약 100 mg/kg(체중) 범위인 양으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 노텀 조절 인자는 1회 투약당 약 50 ㎍/kg(체중) 내지 약 5 mg/kg(체중) 범위인 양으로 투여될 수 있다. 특정 다른 실시양태에서, 본 발명의 노텀 조절 인자는 1회 투약당 약 100 ㎍/kg(체중) 내지 약 10 mg/kg(체중) 범위인 양으로 투여될 수 있다. 임의로, 본 발명의 노텀 조절 인자는 1회 투약당 약 100 ㎍/kg(체중) 내지 약 20 mg/kg(체중) 범위인 양으로 투여될 수 있다. 추가로 임의로, 본 발명의 노텀 조절 인자는 1회 투약당 약 0.5 mg/kg(체중) 내지 약 20 mg/kg(체중) 범위인 양으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 약 100 ㎍/kg(체중) 이상, 약 250 ㎍/kg(체중) 이상, 약 750 ㎍/kg(체중) 이상, 약 3 mg/kg(체중) 이상, 약 5 mg/kg(체중) 이상, 약 10 mg/kg(체중) 이상인 용량으로 투여되는 것으로 제공된다.
다른 투약 요법은 U.S.P.N. 제7,744,877호(이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 바와 같이, 체표면적(BSA: body surface area) 계산에 기초하여 예측할 수 있다. 당업계에 주지되어 있는 바와 같이, BSA는 환자의 신장 및 체중을 사용하여 계산되며, 이는 그 또는 그녀 신체의 표면적을 나타내는 피험체의 크기에 대한 척도를 제공한다. 본 발명의 선택된 실시양태에서, BSA를 사용함으로써 조절 인자를 10 mg/㎡ 내지 800 mg/㎡인 투여량으로 투여할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 조절 인자는 50 mg/㎡ 내지 500 mg/㎡인 투여량으로 투여될 것이며, 더욱더 바람직하게는, 100 mg/㎡, 150 mg/㎡, 200 mg/㎡, 250 mg/㎡, 300 mg/㎡, 350 mg/㎡, 400 mg/㎡ 또는 450 mg/㎡인 투여량으로 투여될 것이다. 물론, 투여량을 계산하는 방법과는 상관없이, 개별 투여보다는 실질적으로 더 높은 절대 투여량을 제공하기 위해 선택된 기간에 걸쳐 다중 투여량을 투여할 수 있다.
어느 경우든, 노텀 조절 인자는 그를 필요로 하는 피험체에게 필요에 따라 투여되는 것이 바람직하다. 투여 빈도는 치료되는 병증, 치료받는 피험체의 연령, 치료되는 병증의 중증도, 치료받는 피험체의 일반적인 건강 상태 등의 고려 사항에 기초하여 당업자, 예컨대, 주치의에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 유효량의 노텀 조절 인자는 1회 이상에 걸쳐 피험체에게 투여된다. 더욱 특히, 유효량의 조절 인자는 월 1회, 월 1회 초과, 또는 월 1회 미만으로 피험체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 유효량의 노텀 조절 인자는 비롯한, 1개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상이라는 기간을 포함하여 다회에 걸쳐 투여될 수 있다.
투여량 및 요법은 또한 1회 이상 투여(들)를 받은 개체에서 개시된 치료학적 조성물에서 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 개체는 본원에 기술된 바와 같이 생산된 치료학적 조성물을 증분식의 투여량으로 제공받을 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특정 질환, 장애, 또는 병증의 마커를 계속 지켜볼 수 있다. 개체가 암을 앓는 경우인 실시양태에서, 이는 촉진 또는 시각적 관찰을 통한 종양의 크기에 대한 직접적인 측정, x선 또는 다른 영상 기법에 의한 종양의 크기에 대한 간접적인 측정; 직접적인 종양 생검 및 종양 시료의 현미경 검사에 의해 평가된 개선; 간접적인 종양 마커(예컨대, 전립샘 암인 경우, PSA) 또는 본원에 기술된 방법에 따라 확인된 항원 측정, 동통 또는 마비 감소; 언어 능력, 시력, 호흡 또는 종양과 관련된 다른 장애 개선; 식욕 증가; 또는 승인 테스트 또는 생존 연장에 의해 측정되는 삶의 질 증진을 포함한다. 투여량은 개체, 신생물성 병증의 유형, 신생물성 병증의 병기, 신생물성 병증이 개체에서 다른 위치로 전이되기 시작하였는지 여부, 및 과거 및 현재 사용되는 치료법에 따라 달라질 수 있다는 것이 당업계의 숙련가에게는 자명할 것이다.
c. 병용 요법
본 발명에 의해 주시된 병용 요법은 원치않는 신생물성 세포 증식(예컨대, 내피 세포)를 줄이거나, 억제하는 데, 암 발생을 줄이는 데, 암의 재발을 줄이거나 예방하는 데, 또는 암의 확산 또는 전이를 줄이거나 예방하는 데 특히 유용할 수 있다. 그러한 경우, 본 발명의 화합물은 종양 종괴(예컨대, NTG 세포)를 지지하고 영구화시키는 TPC를 제거함으로써 감작제 또는 화학감작제로서 작용할 수 있고, 용적축소제 또는 항암제에 관한 현 치료 지침을 더욱 효과적으로 사용할 수 있게 한다. 즉, 노텀 조절 인자 및 하나 이상의 항암제를 포함하는 병용 요법을 사용하여 확립된 암을 축소시킬 수 있고, 예컨대, 존재하는 암 세포의 개수를 줄이고/거나, 종양 부하량을 줄이거나, 1 이상의 소견 또는 암 부작용을 호전시킬 수 있다. 따라서, 병용 요법이란 노텀 조절 인자와, 세포독성제, 세포증식 억제제, 화학치료제, 표적화된 항암제, 생물학적 반응 개질제, 면역치료제, 암 백신, 항혈관신생제, 사이토카인, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 항전이제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 항암제를 투여하는 것을 의미한다.
본 발명의 방법에 따라, 조합된 결과가 각 치료법(예컨대, 항노텀 항체 및 항암제)이 별개로 수행되었을 때 관찰되는 효과의 가산적인 것일 필요는 없다. 일반적으로는, 적어도 가산 효과가 바람직하지만, 단일 요법들 중 하나의 것보다 더 큰 임의의 증가된 항종양 효과가 이익이 된다. 추가로, 본 발명은 병용된 치료법이 시너지 효과를 보이는 것을 필요로 하지 않는다. 그러나, 바람직한 실시양태를 포함하는 특정 선택된 병용법을 이용하면 시너지 작용이 관찰될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명에 따른 병용 요법을 수행하기 위해, 하나 이상의 항암제와 함께 병용되는 노텀 조절 인자(예컨대, 항노텀 항체)를 그를 필요로 하는 피험체에게 피험체 내에서 항암 활성을 효과적으로 일으키는 방식으로 투여할 수 있다. 노텀 조절 인자 및 항암제는 원하는 바에 따라 종양 환경에서 그들이 조합하여 존재할 수 있게 하고, 그들이 조합된 작용할 수 있도록 하는 데 효과적인 양으로 및 효과적인 기간 동안 제공한다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 노텀 조절 인자 및 항암제는 단일 조성물로, 또는 동일한 또는 상이한 투여 경로를 이용하여 2개 이상의 별개의 조성물로 동시에 피험체에 투여될 수 있다.
별법으로, 조절 인자는 예컨대, 수분 내지 수주 범위의 간격을 두고 항암제 치료 이전에 또는 그 이후에 진행될 수 있다. 항암제 및 항체가 피험체에게 별개로 적용되는 경우인 특정 실시양태에서, 각 전달 시간 사이의 기간은 항암제 및 조절 인자가 종양에 대해 병용 효과를 발휘할 수 있도록 하는 기간이어야 한다. 특정 실시양태에서, 항암제 및 노텀 조절 인자, 둘 모두 서로 약 5분 내지 약 2주 이내에 투여되는 것이 고려된다.
추가의 다른 실시양태에서, 조절 인자 및 항암제 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일), 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 또는 수개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월)이 경과할 수 있다. 노텀 조절 인자 및 하나 이상의 항암제(병용 요법)는 1회, 2회, 또는 적어도 병증이 치료, 완화 또는 치유될 때까지 그 기간 동안 투여될 수 있다. 바람직하게, 병용 요법은 다회에 걸쳐 수행된다. 병용 요법은 1일 3회 내지 매 6개월마다 1회씩으로 투여될 수 있다. 예컨대, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 주 1회, 매 2주마다 1회, 매주 1회, 매 2개월마다 1회, 매 3개월마다 1회, 매 6개월마다 1회인 스케줄로 투여될 수 있거나, 또는 미니펌프를 통해 연속적으로 투여될 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 병용 요법은 경구, 점막, 협측, 비내, 흡인식, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내, 또는 국부 경로를 통해 수행될 수 있다. 병용 요법은 종양 부위로부터 원거리에 있는 부위에서 수행될 수 있다. 병용 요법은 일반적으로 병용 요법이 종양 또는 암의 성장을 멈추게 하거나, 이의 중량 또는 용적을 줄인다면, 종양이 존재하는 한은 수행될 것이다.
한 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 암을 치료하기 위해 암 환자에게 짧은 치료 주기 동안 하나 이상의 항암제와 함께 투여된다. 항체를 사용하는 치료 기간은 사용되는 특정 항암제에 따라 달라질 수 있다. 본 발명은 또한 불연속 투여 또는 수개의 부분 투여로 분할된 1일 투약을 고려한다. 특정 항암제에 대해 적절한 치료 시간에 대해서는 당업자는 이해할 것이고, 본 발명은 각 항암제에 대해 최적의 치료 스케줄을 연속적으로 평가하는 것을 고려한다.
본 발명은 병용 요법이 수행되는 기간 동안 1 이상의 주기, 바람직하게는 1 초과의 주기를 고려한다. 1 주기로 적절한 기간은 총 주기 회수 및 주기 사이의 간격과 같이 당업자가 이해할 것이다. 본 발명은 각 조절 인자 및 항암제에 대해 최적의 치료 스케줄을 연속적으로 평가하는 것을 고려한다. 또한, 본 발명은 또한 항노텀 항체 또는 항암제 중 어느 하나를 1회 초과로 투여하는 것을 제공한다. 조절 인자 및 항암제는 격일로 또는 격주로 상호교환적으로 투여될 수 있거나; 또는 일련의 항체 치료 후, 이어서 항암제 요법 치료를 1회 이상으로 수행할 수 있다. 어느 경우든, 당업계의 숙련가가 이해하고 있는 바와 같이, 화학치료제의 적절한 용량은 일반적으로 대략적으로는 화학치료제가 단독으로 투여되거나, 또는 다른 화학치료제와 함께 병용하여 투여되는 임상 요법에서 이미 사용되고 있는 용량이 될 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 노텀 조절 인자는 종양의 초기 발현 이후 종양 재발의 기회를 감소 또는 제거하는 유지 요법에서 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 장애는 치료되고, 초기 종양 종괴는 제거되거나, 감소되거나, 또는 다르게는 호전되어 환자는 무증상이거나 병에 차도가 있게 된다. 그러한 시간 동안 비록 표준 진단학적 방법을 사용하여 질환의 적응증이 거의 없거나, 전혀 없을지라도 피험체는 약학적 유효량의 개시된 효과기를 1회 이상 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 효과기는 일정 기간 동안에 걸쳐 정기적으로 투여될 것이다. 예를 들어, 노텀 조절 인자는 매주, 매 2주마다, 매월, 매 6주마다, 매 2개월마다, 매 3개월마다, 매 6개월마다, 또는 매년 투여될 수 있다. 본원의 교시를 고려해 볼 때, 당업자는 질환 재발의 가능성을 감소시키는 데 바람직한 투여량 및 투약 요법을 쉽게 결정할 수 있다. 또한, 상기와 같은 치료법은 수주, 수개월, 수년 또는 심지어는 환자 반응 및 임상적 및 진단학적 파라미터에 따라 무기한으로 계속될 수 있다.
추가의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 효과기는 예방학적으로 용적축소술 이후 종양이 전이될 가능성을 막거나, 그러한 가능성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용에서 사용되는 바, 용적축소술(debulking procedure)이란 광범위하게 정의되며, 이는 종양 또는 종양 증식을 제거, 감소, 치료 또는 호전시키는 임의의 수술, 기법 또는 방법을 의미하여야 한다. 용적축소술의 예로는 수술, 방사선 치료(즉, 빔 조사), 화학요법 또는 절제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 종양 전이를 감소시키는 임상적 및 진단학적 방법에 의해 제안되는 바와 같이 본 개시내용을 고려하여 당업자에 의해 쉽게 결정되는 적절한 시점에 노텀 조절 인자는 투여될 수 있다. 효과기는 표준 기법을 사용하여 결정되는 바와 같은 약학적 유효 투여량으로 1회 이상에 걸쳐 투여될 수 있다. 바람직하게, 투약 요법은 필요에 따라 이를 변형시킬 수 있는 적절한 진단학적 기법 또는 모니터링 기법을 동반할 것이다.
d. 항암제
본원에서 사용되는 바, 항암제란 세포독성제, 세포증식 억제제, 항혈관신생제, 용적축소제, 화학치료제, 방사선 요법 ? 방사선치료제, 표적화된 항암제, 생물학적 반응 개질제, 항체, 및 면역치료제를 비롯한, 세포 증식성 장애, 예컨대, 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. 상기 논의된 바와 같은 선택된 실시양태에서, 항암제는 접합체를 포함할 수 있고, 투여 전에 조절 인자와 함께 회합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
세포독성제라는 용어는 세포의 기능을 줄이거나 억제시키고/거나, 세포를 파괴시키는 물질을 의미하며, 즉, 그러한 물질은 세포에 대해 독성을 띤다. 전형적으로 상기 물질은 살아있는 유기체로부터 유래된 천연적으로 발생된 분자이다. 세포독성제의 예로는 박테리아의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소(예컨대, 디프테리아 독소, 슈도모나스 내독소 및 외독소, 스타필로코쿠스(Staphylococcal) 장독소 A), 진균(예컨대, α 사르신, 레스트릭토신), 식물(예컨대, 아브린, 리신, 모데신, 비스쿠민, 포크위드 항바이러스 단백질, 사포린, 겔로닌, 모모리딘, 트리코산틴, 보리 독소, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제 , 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센) 또는 동물, 예컨대, 세포독성 RN아제, 예컨대, 세포외 췌장 RN아제; DN아제 I와 이의 단편 및/또는 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
화학치료제란 암 세포의 성장, 증식, 및/또는 생존을 비특이적으로 줄이거나 억제시키는 화학적 화합물(예컨대, 세포독성 또는 세포증식 억제제)을 의미한다. 그러한 화학제는 대개 세포 성장 또는 분열에 필요한 세포내 과정으로 지시되고, 따라서, 일반적으로는 빠르게 성장하고 분열하는 암성 세포에 대해 특히 효과적이다. 예를 들어, 빈크리스틴은 미세소관을 탈중합화시켜 세포가 유사분열로 진입하지 못하도록 막는다. 일반적으로, 화학치료제로는 암성 세포, 또는 암성이 될 가능성이 있거나, 종양신생 자손(예컨대, TIC)을 생성할 가능성이 있는 세포를 억제하도록 디자인된 임의의 화학제를 포함할 수 있다. 그러한 작용제는 대개 병용하여, 예컨대, 제법 CHOP로 투여되고, 대개 이때 가장 효과적이다.
본 발명의 조절 인자와 함께 병용하여(또는 이에 접합되어) 사용될 수 있는 항암제의 예로는 알킬화제, 알킬 술포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 아세토게닌, 캄포테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 크립토피신, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘레우테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕티인, 스폰지스타틴, 질소 머스타드, 항생제, 엔다이인 항생제, 다이네미신, 비스포스포네이트, 에스페라미신, 색소 단백질 엔다이인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카루비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신(esorubicin), 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조토신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물, 폴산 유사체, 퓨린 유사체, 안드로겐, 항부신성 제제, 폴산 보충제, 예컨대, 폴린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐루라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트렉세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지퀀, 에플로르니틴, 엘립티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 레티난, 로니다민, 메이탄시노이드, 미토구아존, 미토크산트론, 모피다몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로소크산트론, 포도필린산, 2-에틸하이드라지드, 프로카바진, PSK® 다당류 복합체(JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products: 미국 오리건주 유진), 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 독소, 베루카린 A, 로로딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피로브로만; 가시토신; 아리비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 클로람부실; 겜자르(GEMZAR)® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP- 16); 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11), 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린(LV); 옥살리플라틴; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산, 또는 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제시키는 역할을 하는 항호르몬제, 항에스트로겐제 및 선택성 에스트로겐 수용체 조절 인자(SERM: selective estrogen receptor modulator), 피신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제시키는 아로마타제 억제제, 및 항안드로겐제; 뿐만 아니라, 트록사시타빈(1,3-디옥소란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드; 리보자임, 예컨대, VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제; 백신, 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루트로테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산, 또는 유도체 또한 본 정의에 포함된다. 다른 실시양태는 리툭시맙, 트라스투주맙, 겜투주맙 오조가미신, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 오파투무맙, 이필리무맙 및 브렌툭시맙 베도틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 암 요법용으로 승인받은 항체의 용도를 포함한다. 당업자는 본원의 교시와 화합성인 추가의 항암제를 쉽게 확인할 수 있을 것이다.
e. 방사선 요법
본 발명은 또한 노텀 조절 인자와 방사선 요법(즉, 종양 세포 내에서 국소적으로 DNA 손상을 유도하기 위한 기전, 예컨대, 감마 조사, X선, UV 조사, 마이크로파, 전자 방출 등)을 병용하는 것을 제공한다. 방사성 동위원소를 종양 세포에 직접 전달하는 병용 요법 또한 고려되며, 이는 표적화된 항암제 또는 다른 표적화 수단과 함께 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선 요법은 약 1 내지 약 2주 동안의 기간에 걸쳐 펄스로 수행된다. 방사선 요법은 약 6 내지 7주 동안 두부경부암 피험체에게 수행될 수 있다. 임의로, 방사선 요법은 단일 선량 또는 다회, 순차적 선량으로 수행될 수 있다.
f. 신생물성 병증
본 발명의 노텀 조절 인자가 단독으로 또는 항암제 또는 방사선 요법과 함께 병용하여 투여되든 간에, 상기 노텀 조절 인자는 일반적으로는 약성 또는 악성 종양(예컨대, 신장 종양, 간 종양, 신장 종양, 방광 종양, 유방 종양, 위 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 전립샘 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 갑상샘 종양, 간암종; 육종; 아교모세포종; 및 다양한 두부경부 종양); 백혈병 및 림프성 악성 종양; 다른 장애, 예컨대, 신경세포, 아교세포, 성상세포, 시상하부 및 다른 샘, 대식세포, 상피, 기질 및 블라스토코엘릭 장애; 및 염증성, 혈관신생, 면역성 장애 및 병원체에 의해 유발되는 장애를 포함할 수 있는, 환자 또는 피험체에서의 신생물성 병증을 치료하는 데 특히 유용하다. 본 발명의 치료학적 조성물 및 방법으로 치료하는 데 특히 바람직한 표적은 고형 종양을 포함하는 신생물성 병증이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절 인자는 혈액 악성 종양의 진단, 예방, 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 비록 본원에서 사용되는 바, 피험체 또는 환자라는 용어가 임의의 포유동물 종을 포함하는 것으로 명백하게 간주되고 있기는 하지만, 치료하고자 하는 피험체 또는 환자는 인간이 될 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따라 치료를 받게 되는 신생물성 병증은 부신 종양, AIDS관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암(편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암(사기질종, 동맥류 뼈 낭종, 골연골종, 골육종), 뇌척수암, 전이성 뇌 종양, 유방암, 경동맥소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 혐색소 신장 세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 섬유조직형성 소원형 세포 종양, 뇌실막세포종, 유잉 종양, 골외성 점액모양 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 골 섬유형성이상, 담낭암 및 담관암, 임신영양막병, 생식 세포 종양, 두부경부암, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암(신장아세포종, 유두상 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간아세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소세포 암종, 샘암종, 편평 세포 암종, 대세포 암종 등), 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비샘 신생물, 다발성 골수종, 골수형성 이상 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상샘 암종, 부갑상샘 종양, 소아암, 말초신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립샘암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액 장애, 전이성 신장암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 윤활막 육종, 고환암, 가슴샘 암종, 가슴샘종, 전이성 갑상샘암, 및 자궁암(자궁경부 암종, 자궁내막 암종, 및 평활근종)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 암성 세포는 유방암, 비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer), 소세포 폐암, 췌장암, 결장암, 전립샘암, 육종, 전이성 신장암, 갑상샘 전이성 암, 및 투명세포 암종을 포함하나, 이에 한정되지 않는 고형 종양 군으로부터 선택된다.
혈액 악성 종양과 관련하여, 본 발명의 화합물 및 방법은 저등급/NHL 난포 세포 림프종(FCC: follicular cell lymphoma), 외투 세포 림프종(MCL: mantle cell lymphoma), 미만성 대세포 림프종(DLCL: diffuse large cell lymphoma), 소림프구(SL: small lymphocytic) NHL, 중등급/난포 NHL, 중등급 미만성 NHL, 고등급 면역아세포 NHL, 고등급 림프아구성 NHL, 고등급 소비분할 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 림프형질세포성 림프종(LPL: lymphoplasmacytoid lymphoma), 외투 세포 림프종(MCL), 난포 림프종(FL: follicular lymphoma), 미만성 대세포 림프종(DLCL), 버킷 림프종(BL: Burkitt's lymphoma), AIDS 관련 림프종, 단핵구 B 세포 림프종, 혈관면역아세포 림프절병증, 소림프구, 난포, 미만성 대세포, 미만성 소분할 세포, 대세포 면역아세포 림프아세포종, 소비분할, 버킷 및 비버킷, 난포, 주로 대세포; 난포, 주로 소분할 세포; 및 난포, 혼합형 소분할 및 대세포 림프종을 비롯한, 다양한 B 세포 림프종을 치료하는 데 특히 효과적일 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다. 문헌 ([Gaidono et al., "Lymphomas", IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita et al, eds., 5.sup.th ed. 1997])을 참조할 수 있다. 상기 림프종은 대개 분류 체계가 달라짐에 따라 상이한 명칭을 가질 수 있고, 상이한 명칭으로 분류된 림프종을 앓는 환자 또한 본 발명의 병용 치료 요법으로 이익을 얻을 수 있다는 것이 당업자에게는 명백하여야 한다.
추가의 다른 바람직한 실시양태에서, 노텀 조절 인자는 백혈병, 예컨대, 만성 림프구 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia 또는 B CLL)을 비롯한 특정 특정 골수성 및 혈액 악성 종양을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. CLL은 주로 50대 이후에 발병이 증가하기 시작하여 60대 후반에 최고점에 도달하는 노인성 질환이다. 일반적으로 신생물성 말초 혈액 림프구의 증식을 포함한다. CLL의 임상 소견으로는 림프구증가증, 림프절병증, 비장비대, 빈혈 및 혈소판감소증을 포함한다. CLL의 특징적인 특성은 단일클론 B 세포 증식 및 상기 B 세포가 표면 IgM(sIgM: surface IgM) 또는 sIgM 및 sIgD, 둘 모두, 및 단일 경쇄를 정상적인 B 세포 상에서보다 더 낮은 밀도로 발현하는 경우, 중간 정도의 분화 상태에서 정지된 B 림프구의 축적이다. 그러나, 상기에서 논의되고, 본 명세서에 첨부된 실시예에서 제시되어 있는 바와 같이, 선택된 노텀 발현(예컨대, 노텀)은 B CLL 세포 상에서 상향조절됨으로써 개시된 조절 인자에 대하여 관심을 끄는 표적을 제공한다.
본 발명은 또한 양성 또는 전암성 종양을 발현하는 피험체에 대한 예방적 또는 예방학적 치료법을 제공한다. 본 발명을 사용하는 치료법으로부터 임의의 특정 유형의 종양 또는 신생물성 장애가 배제되어야 한다고는 여겨지지 않는다. 그러나, 종양 세포 유형은 2차 치료제, 특히 화학치료제 및 표적화된 항암제와 병용하여 사용되는 경우에 본 발명의 용도와 관련이 있을 수 있다.
본원에서 논의되는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시양태는 고형 종양을 앓는 피험체를 치료하기 위한 노텀 조절 인자의 용도를 포함한다. 상기 피험체에서, 상기 고형 종양 중 다수는 개시된 효과기를 사용하는 치료법으로 특히 쉽게 치료될 수 있도록 만들 수 있는 다양한 유전자 돌연변이를 보이는 조직을 포함한다. 예를 들어, KRAS, APC 및 CTNNB1 돌연변이는 상대적으로 결장직장암 환자에서 일반적이다. 또한, 이러한 돌연변이를 가진 종양을 앓는 환자는 보통 현 요법에 대해서 가장 난치성이다; 특히, KRAS 돌연변이를 가진 환자가 그러하다. 전형적으로 단일 아미노산 치환을 일으키는 KRAS 활성화 돌연변이 또한 폐 샘암종, 점액 샘종, 및 췌장 관암종을 비롯한, 악성 종양 치료에 대한 다른 난점과 연루되어 있다.
현재, 결장직장암 환자가 EGFR 또는 VEGF 억제 약물에 대하여 반응할지 여부를 예측할 수 있는 가장 신뢰할 만한 방법은 특정 KRAS "활성화" 돌연변이에 대해 테스트하는 것이다. KRAS는 결장직장암 중 35-45%에서 돌연변이화되어 있고, 종양이 돌연변이화된 KRAS를 발현하는 환자는 상기 약물에 대해 잘 반응하지 못한다. 예를 들어, KRAS 돌연변이가 결장직장암에서는 파니투무맙 및 세툭시맙 요법에 대한 반응 부족을 예측한다(문헌 [Lievre et al. Cancer Res 66:3992-5]; [Karapetis et al. NEJM 359: 1757-1765])). 결장직장암 환자 중 대략 85%는 APC 유전자에 돌연변이를 가지고 있고(문헌 [Markowitz & Bertagnolli. NEJM 361:2449-60]), 가족성 샘종 폴립증 및 결장직장암 환자에서 800개 초과의 APC 돌연변이에 대한 특징이 규명되어 있다. 대다수의 상기 돌연변이들을 통해 베타 카테닌 파괴를 매개할 수 있는 기능성 능력이 감소되어 있는 절단형 APC 단백질이 생성된다. 베타 카테닌 유전자, CTNNB1에서의 돌연변이는 또한 단백질의 안정화를 증가시켜 핵 유입을 일으킨 후, 수개의 종양원성 전사 프로그램을 활성화시키는데, 이는 또한 돌연변이화된 APC의 기능상실로부터 발생된 발암이 베타 카테닌 파괴를 적절히 매개하는 기전이기도 하며, 이는 정상적인 세포 증식 및 분화 프로그램을 억제시키는 데 필요하다. 본원 실시예에 의해 언급한 바와 같이, 상기 돌연변이를 포함하는 종양은 본 발명의 노텀 조절 인자를 사용하는 치료법에 대해 특히 쉽게 치료될 수 있는 것으로 판명될 수 있다.
XIV. 제조물품
노텀 조절 인자를 1회 이상의 용량으로 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 및 키트 또한 제공한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 하나 이상의 추가의 작용제와 함께, 또는 그를 포함하지 않고 항노텀 항체를 포함하는 소정량의 조성물을 함유하는 단위 제형을 제공한다. 다른 실시양태의 경우, 상기 단위 제형은 1회용인 사전 충전된 주사용 시린지로 공급된다. 추가의 다른 실시양태에서, 단위 제형이 포함되어 있는 조성물은 염수, 수크로스 등; 완충제, 예컨대, 포스페이트 등을 포함할 수 있고/거나; 안정하고 유효한 pH 범위 내로 제제화될 수 있다. 별법으로, 특정 실시양태에서, 조성물은 적절한 액체, 예를 들어, 멸균수 첨가시 재구성될 수 있는 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 수크로스 및 아르기닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질 응집을 억제시키는 하나 이상의 물질을 포함한다. 용기(들) 상의, 또는 그에 회합되어 있는 임의의 라벨은 동봉된 조성물은 선택된 질환 병증을 진단 또는 치료하는 데 사용되는 것임을 나타낸다.
본 발명은 노텀 조절 인자 및 임의로, 하나 이상의 항암제의 단일 투약 또는 다중 투약용 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 용기 및 용기 상의, 또는 그에 회합되어 있는 라벨 또는 패키지 인서트를 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 프라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 병증을 치료하는 데 효과적인 조성물을 수용하고 있으며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사용 니들에 의해 천공가능한 마개를 가진 정맥용 액제 백 또는 바이알일 수 있다). 그러한 키트는 일반적으로 동일한 또는 상이한 용기 중의 노텀 조절 인자 및 임의로, 하나 이상의 항암제의 약학적으로 허용가능한 제제를 적합한 용기에 포함한다. 키트는 또한 진단을 위해 또는 병용 요법을 위해 다른 약학적으로 허용가능한 제제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 노텀 조절 인자 이외에도, 상기 키트는 다양한 항암제, 예컨대, 화학치료제 또는 방사선치료 약물; 항혈관신생제; 항전이제; 표적화된 항암제; 세포독성제; 및/또는 다른 항암제 중 어느 하나 이상의 것을 함유할 수 있다. 상기 키트는 또한 노텀 조절 인자를 항암제 또는 진단학적 제제와 접합시키는 적절한 시약을 제공할 수 있다(예컨대, U.S.P.N. 제7,422,739호(이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다) 참조).
더욱 구체적으로, 키트는 추가의 성분과 함께, 또는 그를 포함하지 않고 노텀 조절 인자를 포함하는 단일 용기를 가질 수 있거나, 또는 각 원하는 제제에 대한 별개의 용기를 가질 수 있다. 접합을 위해 병용 치료제가 제공되는 경우, 단일 용액은 등가인 몰비로 조합되어, 또는 한 성분을 다른 나머지 한 성분보다 과량으로 하여 사전 혼합될 수 있다. 별법으로, 키트의 노텀 조절 인자 및 어느 임의의 항암제는 환자에게로의 투여 이전에 별개의 용기 내에서 따로따로 유지될 수 있다. 키트는 또한 멸균제, 약학적으로 허용가능한 완충제 또는 다른 희석제, 예컨대, 정균 주사용수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate-buffered saline), 링거액 및 덱스트로스 용액을 함유하는 제2/제3 용기 수단을 포함할 수 있다.
키트의 성분들이 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액인 것이 바람직하고, 멸균 수용액이 특히 바람직하다. 그러나, 키트의 성분들은 건식 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 또는 성분들이 건식 분말로서 제공되는 경우, 상기 분말은 적합한 용매 첨가시에 재구성될 수 있다. 용매 또한 또 다른 용기 중에서 제공될 수 있을 것으로 구상된다.
상기에서 간략하게 언급한 바와 같이, 키트는 또한 항체 및 어느 임의의 성분들을 동물 또는 환자에게로 투여하기 위한 수단, 예컨대, 하나 이상의 니들 또는 시린지 또는 심지어는 점안기, 피펫, 또는 다른 유사 기구를 포함할 수 있는데, 그로부터 제제는 동물 내로 주사되거나 도입될 수 있거나, 또는 체내 이환 부위로 적용될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로는 상업적 판매를 위해, 바이알 등, 및 다른 성분을 좁은 제한 공간에 포함시키기 위한 수단, 예컨대, 원하는 바이알 및 다른 기구가 그 안으로 배치되고, 그에 보유되는 주사 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 것이다. 임의의 라벨 또는 패키지 인서트는 노텀 조절 인자 조성물이 암, 예를 들어 결장직장암을 치료하는 데 사용되는 것임을 나타낸다.
XV. 연구용 시약
본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 또한 방법, 예컨대, 형광 활성화된 세포 분류법(FACS), 자기 활성화 세포 분류(MACS: magnetic activated cell sorting) 또는 레이저 매개 절편화를 통해 종양 개시 세포의 집단 또는 서브집단을 확인, 단리, 절편화, 또는 강화시키는 데 유용한 계기로서 개시된 조절 인자의 특성을 활용한다. 조절 인자는 암 줄기 세포를 비롯한 TIC의 특징 규명 및 조작을 위한 수개의 화합성 기법에 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다(예컨대, U.S.S.N. 제12/686,359호, 제12/669,136호 및 제12/757,649호(이들 각각은 그 본문이 본원에 참고로 포함된다) 참조).
XVI. 기타
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업계의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 추가로, 달리 문맥상 달리 요구되지 않는다면, 단수 형태는 복수의 것도 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수의 것도 포함하여야 한다. 더욱 구체적으로, 첨부된 특허청구범위의 상기 명세서에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나"("a," "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 복수의 지시 대상도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 단백질"이라고 언급하는 것은 복수개의 단백질을 포함하고; "하나의 세포"라고 언급하는 것은 세포의 혼합물 등을 포함하는 것이다. 추가로, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 제공된 범위는 종점과, 그 종점들 사의 모든 점들, 모두를 포함하는 것이다. 그러므로, 2.0 내지 3.0이라는 범위는 2.0, 3.0, 및 2.0 내지 3.0 사이의 모든 점들을 포함한다.
일반적으로, 본원에 개시된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 그 기법은 당업계에 주지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기법은 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 당업계에 주지되어 있고, 본 명세서 전역에서 인용되고, 논의된 다양한 일반 참고 문헌 및 보다 구체적인 참고 문헌에 기술되어 있는 바와 같은 종래 방법에 따라 수행된다. 예컨대, 문헌 ([Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)]; [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)]; [Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998)]; 및 [Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)])을 참조할 수 있다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조사의 설명서에 따라, 통상 당업계에서 달성될 수 있는 바와 같이, 또는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 화학 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험실 방법 및 기법은 당업계에 주지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서 내에서 개시되거나, 인용된 모든 참고 문헌 또는 문서는 제한없이, 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 또한, 본원에서 사용된 임의 섹션의 제목은 단지 조직화를 목적으로 한 것이며, 기술된 주제를 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다.
실시예
따라서, 일반적으로 기술되는 바, 본 발명은 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아닌, 일례로서 제공되는 하기 실시예를 참고로 하여 보다 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 하기 실험이 수행되는 모든 실험이거나, 유일한 실험임을 나타내고자 하는 것이 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨도이고, 압력은 대기압이거나, 그에 가까운 값이다.
실시예 1
종양 개시 세포 집단의 특징 규명
고형 종양이 암 환자에 존재하는 바, 이의 세포 이질성의 특징을 규명하고, 특정 표현형 마커를 사용하여 종양 영구 세포(TPC; 즉, 암 줄기 세포: CSC)의 정체를 밝혀내고, 임상적으로 관련된 치료학적 표적을 확인하기 위해, 당업계에 알려져 있는 기법을 사용하여 큰 비전통적인 이종이식편(NTX) 종양 은행을 개발하고, 유지시켰다. 원래는 다양한 고형 종양 악성 종양을 앓는 다수의 암 환자로부터 수득된 이질성 종양 세포를 다회에 걸쳐 계대접종함으로써 다수의 별개의 종양 세포주를 포함하는 NTX 종양 은행을 면역약화된 마우스에 전파시켰다. 계통이 잘 정의된 다수의 별개의 조기 계대접종 NTX 종양 세포주의 연속적인 이용가능성을 통해 상기 세포주로부터 정제된 세포를 재현가능한 방식으로 반복하여 특징 규명을 할 수 있는 바, TPC를 매우 용이하게 확인 및 단리시킬 수 있다. 더욱 특히, 후향적으로 볼 때, 세포의 기원이 된 환자 종양 시료의 발생을 반복하는 마우스에서 표현형적으로 및 형태학적으로 이질성인 종양을 생성할 수 있는 이의 능력에 따르면, 단리된 또는 정제된 TPC가 가장 정확하게 정의된 것이다. 따라서, 마우스에서 완전하게 이질성인 종양을 생성하는 단리된 세포로 이루어진 소집단을 사용할 수 있는 능력은 단리된 세포가 TPC를 포함한다는 사실을 강력하게 나타낸다. 그러한 연구에서, 최소로 계대접종된 NTX 세포주를 사용하면 생체내 실험은 현저히 간소화되고, 쉽게 입증할 수 있는 결과를 얻게 된다. 또한, 조기 계대접종 NTX 종양은 또한 치료제, 예컨대, 이리노테칸(즉, 캄프토사르®)에 대해 반응하는데, 이는 종양 성장, 현 요법에 대한 내성 및 종양 재발을 유도하는 근본적인 기전에 대한 임상적으로 관련된 통찰력을 제시한다.
NTX 종양 세포주는 확립되어 있는 바, 유세포 분석을 사용하여 구성 요소인 종양 세포의 표현형을 분석함으로써 종양 개시 세포(TIC)의 특징을 규명하거나, 단리시키거나, 정제하거나, 또는 강화시키고, 상기 집단 내의 TPC 및 TProg 세포를 분리하거나, 분석하는 데 사용될 수 있는 별개의 마커를 확인하였다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 사유(proprietary) 프로테옴 기반 플랫폼(즉, 페노프린트™ 어레이(PhenoPrint™ Array))을 사용함으로써 단백질 발현에 기초하여 세포의 특징을 신속하게 규명할 수 있었고, 동시에 잠재적으로 유용한 마커를 확인할 수 있었다. 페노프린트 어레이는, 각 웰이 피코에리트린 형광 채널에는 별개의 한 항체를, 및 플레이트 전역의 모든 웰에 어레이되어 있는 상이한 플루오로크롬에는 다중의 추가 항체를 포함하는 것인 96 웰 플레이트에 어레이된, 다수는 상업적 공급원으로부터 입수된 것인 수백여 개의 별개의 결합 분자를 포함하는 사유 프로테옴 플랫폼이다. 이를 이용함으로써 비피코에리트린 채널을 통해 관련 세포는 신속하게 포함시키거나, 또는 비관련 세포는 제거함으로써 선택된 종양 세포의 서브집단 중 관심의 대상이 되는 항원의 발현 수준을 측정할 수 있다. 페노프린트 어레이를 당업계에 주지되어 있는 조직 해리, 이식, 및 줄기 세포 기법과 조합하여 사용하였을 때(문헌 ([Al-Hajj et al., 2004, 상기 문헌 동일], [Dalerba et al., 2007, 상기 문헌 동일] 및 [Dylla et al, 2008, 상기 문헌 동일]) (이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)), 관련 마커를 효과적으로 확인할 수 있었고, 이어서, 고효율로 특이 인간 종양 세포 서브집단을 단리시키고 이식시킬 수 있었다.
따라서, 보통 인간 종양에 대해 수행되고 있는 것과 같이 심하게 면역약화된 마우스에서 다양한 NTX 종양 세포주를 확립할 때, 800-2,000 ㎣에 이르도록 종양을 마우스로부터 절개해 내고, 당업계에 공지되어 있는 효소 분해 기법(예를 들어, U.S.P.N. 제2007/0292414호(이는 본원에 포함되어 있다) 참조)을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다. 페노프린트 어레이를 사용하여 상기 현탁액으로부터 획득한 데이터를 통해 세포 하나씩 차례대로인 방식에 근거하여 절대(세포 1개당인 개념) 및 상대(집단 중의 다른 세포에 대한 개념) 표면 단백질 발현 값을 얻었고, 이로써 세포 집단을 더욱 정교하게 특징 규명하고, 계층화할 수 있었다. 더욱 구체적으로, 페노프린트 어레이를 사용함으로써 전향적으로 TIC 또는 TPC를 NTG 벌크한 종양 세포 및 종양 기질과 구별짓는 단백질 또는 마커를 신속하게 확인할 수 있었고, NTX 종양 모델로부터 단리된 경우에는, 상이한 수준으로 특이 세포 표면 단백질을 발현하는 종양 세포 서브집단의 특징을 상대적으로 신속하게 규명할 수 있었다. 특히, 종양 세포 집단 전역에 걸쳐 이질성 발현을 하는 단백질을 통해 고수준 및 저수준으로 특정 단백질 또는 마커를 발현하는 별개의, 및 고도로 정제된 종양 세포 서브집단을 단리시키고, 면역약화된 마우스 내로 이식함으로써 TPC가 한 서브집단 또는 또 다른 서브집단에서 강화되었는지 여부를 쉽게 평가할 수 있었다.
강화시키다라는 용어는 세포를 단리시키다라는 것과 같은 의미로 사용되는데, 이는 한 유형의 세포 수율(분율)이 출발 또는 개시 세포 집단과 비교하였을 때 다른 유형의 세포 분율에 비하여 증가되었음을 의미하는 것이다. 바람직하게, 강화시키다라는 것은 출발 세포 집단과 비교하여 세포 집단 중의 한 세포 유형의 비율을 약 10% 만큼, 약 20% 만큼, 약 30% 만큼, 약 40% 만큼, 약 50% 만큼 또는 50% 초과만큼 증가시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 세포 또는 조직과 관련하여 마커란, 질환 또는 장애를 앓는 조직 또는 세포 집단 중에서 또는 그 상에서 확인되는 것을 비롯한, 특정 세포, 세포 집단 또는 조직과 확인가능한 방식으로 관련이 있거나, 또는 특정 세포, 세포 집단 또는 조직 중에서 또는 그 상에서 특이적으로 발현되는, 화학적 또는 생물학적 실체 형태의 임의의 특징을 의미한다. 나타낸 바와 같이, 마커는 사실상 형태학적, 기능성 또는 생화학적인 것일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커는 특이 세포 유형(예컨대, TPC)에 의해, 또는 특정 조건하에 있는 세포(예컨대, 세포 생활 주기의 특정 시점 동안의 또는 특정 니치 중의 세포)에 의해 차별적으로 또는 우선적으로 발현되는 세포 표면 항원이다. 바람직하게, 그러한 마커는 단백질이고, 더욱 바람직하게는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 항체, 압타머 또는 다른 결합 분자에 대한 에피토프를 소유한다. 그러나, 마커는 표면 상에서, 또는 세포 내에서 발견되는 임의의 분자로 구성될 수 있고, 그 예로는 단백질(펩티드 및 폴리펩티드), 지질, 다당류, 핵산 및 스테로이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 형태학적 마커 특징 또는 소질의 예로는 형상, 크기, 및 핵 대 세포질의 비율을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기능성 마커 특징 또는 소질의 예로는 특정 기질에 부착할 수 있는 능력, 특정 염료를 혼입 또는 배제시킬 수 있는 능력, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 친유성 염료 배제 능력, 특정 조건하에서 이주할 수 있는 능력, 및 특정 계통으로 따라 분화할 수 있는 능력을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 마커는 또한 예를 들어, 리포터 유전자를 코딩하는 핵산 서열의 세포 내로의 도입 및 이의 전사를 통해 마커로서 사용될 수 있는 리포터 단백질이 생산되는 결과로서 세포에 의해 발현되는 리포터와 같은 리포터 유전자로부터 발현되는 단백질일 수 있다. 마커로서 사용될 수 있는 그러한 리포터 유전자로는 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 형광 단백질 효소, 염색소립 단백질, 내성 유전자 등이 있다.
관련된 의미에서, 조직, 세포 또는 세포 집단과 관련이 있는 마커 표현형(예컨대, 안정한 TPC 표현형)이라는 용어는 특정 세포 또는 세포 집단을 특징 규명하거나, 확인하거나, 분리하거나, 단리시키거나, 또는 강화시키는 데 사용될 수 있는 임의의 마커 또는 마커 조합을 의미한다. 구체적인 실시양태에서, 마커 표현형은 세포 표면 마커 조합의 발현을 검출하거나 확인함으로써 측정될 수 있는 세포 표면 표현형이다.
다수의 마커(또는 이의 부재)가 다양한 암 줄기 세포 집단과 관련이 있으며, 이를 사용하여 종양 세포 서브집단을 단리시키거나, 그 특징을 규명할 수 있음을 당업자는 알고 있을 것이다. 이과 관련하여, 암 줄기 세포 마커의 예로는 OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, 트랜스페린 수용체, JAM3, 카복시펩티다제 M, ADAM9, 온코스타틴 M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, 네스틴, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy 1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4), SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, β 카테닌, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, 데코린, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, 및 CD49f를 포함한다. 예를 들어, 문헌 ([Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329], U.S.P.N. 제7,632,678호 및 U.S.P.N. 제2007/0292414호, 제2008/0175870호, 제2010/0275280호, 제2010/0162416호, 및 제2011/0020221호)(이들 각각은 본원에 참고로 포함된다)를 참조할 수 있다. 다수의 이러한 마커들이 상기 기술된 페노프린트 어레이에 포함되어 있다는 것을 이해할 것이다.
유사하게, 특정 종양 유형의 암 줄기 세포와 관련이 있는 세포 표면 표현형의 비제한적인 예로는 CD44+CD24저, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46+CD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+α2 β1 고CD133 +, CD44+CD24 ESA+, CD271+, ABCB5+ 뿐만 아니라, 당업계에 공지되어 있는 다른 암 줄기 세포 표면 표현형도 포함한다. 예를 들어, 문헌 ([Schulenburg et al., 2010, 상기 문헌 동일], [Visvader et al., 2008, PMID: 18784658] 및 U.S.P.N. 제2008/0138313호(이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다)를 참조할 수 있다. 예컨대, 바로 앞에서 예시된 것과 같은 마커 표현형은 추가 분석을 위해 TIC 및/또는 TPC 세포 또는 세포 집단을 특징 규명하거나, 단리시키거나, 정제하거나, 강화시키기 위한 표준 유세포 분석법 및 세포 분류 기법과 함께 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명과 관련하여, 분석되는 종양 표본이 원발성 환자 종양 표본인지 또는 환자 유래의 NTX 종양인지에는 상관없이, CD46, CD324 및 임의로, CD66c가 다수의 인간 결장직장("CR: colorectal cancer"), 유방암("BR: breast cancer"), 비소세포 폐암(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC: small cell lung cancer), 췌장암("PA: pancreatic cancer"), 흑색종("Mel: melanoma"), 난소암("OV: ovarian cancer"), 및 두부경부암("HN: head and neck cancer") 종양 세포의 표면 상에서 고도로 또는 이질성으로 발현된다는 것은 관심의 대상이 된다.
실시예 2
강화된 종양 개시 세포 집단으로부터의 RNA 시료의 단리 및 분석
확립된 결장직장 NTX 세포주(SCRx-CR4)를 사용하여 면역약화된 마우스에서 종양을 개시하였다. 일단 평균 종양 부하량이 ~300 ㎣에 도달하고 나면, 마우스를 임의 추출하여 20일 동안 매주 2회에 걸쳐 15 mg/kg 이리노테칸 또는 비히클 대조군(PBS)으로 처리하고, 20일이 되는 시점에서 마우스를 안락사시키고, 일반적으로는 실시예 1에 기술된 마커 표현형을 사용하여 새로 절개된 NTX 종양으로부터 TPC, TProg, 및 NTG 세포를 각각 단리시켰다. 더욱 특히, CD46, CD324 및 CD66c 마커를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)에 의해 세포 집단을 단리시킨 후, 즉시 바로 펠릿화시키고, 퀴아젠 RLT플러스(Qiagen RLTPlus) RNA 용해용 완충제(퀴아젠 인코퍼레이티드(Qiagen, Inc.))에서 용해시켰다. 이어서, 사용할 때까지, 용해물을 -80℃에서 보관하였다. RNA 세포 용해물을 해동시킬 때, 제조업체의 설명서에 따라 퀴아젠 RN이지(Qiagen RNEasy) 단리용 키트(퀴아젠 인코퍼레이티드)를 사용하여 전체 RNA를 추출하고, 제조업체의 프로토콜 및 권고되는 장치 설정을 사용하여 나노드롭(Nanodrop)(써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 및 바이오애널라이저 2100(Bioanalyzer 2100)(애질런트(Agilent)) 상에서 정량하였다. 생성된 전체 RNA 시료가 유전자 서열 분석 및 분석에 적합하였다.
상기 기술된 바와 같이 비히클 또는 이리노테칸으로 처리된 마우스로부터 단리된 TPC, TProg 및 NTG 세포 집단으로부터 수득된 RNA 시료를 시료당 전체 RNA 5 ng씩으로 출발하여 어플라이드 바이오시스템즈 SOLiD 3.0(Applied Biosystems SOLiD 3.0)(올리고 결찰/검출에 의한 서열 분석) 차세대 서열 분석 플랫폼(라이프 테크놀로지스)을 이용하여 전체 트랜스크립톰 서열 분석을 위해 제조하였다. 인간 게놈으로부터의 34,609 유전자에 대하여 지도화된 SOLiD 플랫폼에 의해 작성된 데이터를 통해 노텀을 검출할 수 있었고, 모든 시료 중의 노텀 수준을 입증가능하게 측정하였다.
일반적으로, SOLiD3 차세대 서열 분석 플랫폼을 통해서는 비드에 연결된, 클론으로 증식된 RNA/DNA 단편을 동시에 서열 분석할 수 있다. 이어서, 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드와의 결찰에 의한 서열 분석을 사용하여 총 5천만개 초과의 리드를 이용하여 시료 중에 존재하는 각 단편의 50개의 염기 리드를 작성함으로써 게놈 중 단백질의 mRNA 전사체 발현 수준을 더욱더 정확하게 나타낼 수 있다. SOLiD3 플랫폼은 단지 리드 범위(게놈 위치에 대해 특유의 방법으로 지도화된 리드)에만 기초하여 발현 뿐만 아니라, 공지 및 미지의 선택적 스플라이싱 이벤트인 SNP도 포착할 수 있으며, 잠재적으로는 새로운 엑손도 발견할 수 있다. 따라서, 이러한 차세대 플랫폼을 사용함으로써 전사체 발현 수준 상의 차이 뿐만 아니라, 발현된 mRNA 전사체의 특이적인 스플라이스 변이체에 대한 차이 또는 선호도를 측정할 수 있었다. 또한, 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수한 변형된 전체 트랜스크립톰 프로토콜을 이용하여 SOLiD3 플랫폼으로 분석하는 것은 증폭전 단지 대략 5 ng의 출발 물질만을 필요로 하였다. 이는, 세포 중 TPC 서브세트가 예를 들어, 수적으로 NTG 또는 벌크한 종양에 비하여 방대하게 훨씬 더 작고, 이로 인해 사용가능한 출발 물질의 양도 매우 작은 바, 선별된 세포 집단으로부터의 전체 RNA 추출이라는 이유에서 중요하다.
SOLiD3 플랫폼으로부터 이중으로 수행하여 획득한 서열 분석 데이터를 표준 산업적 관행에 따라, 정규화하고, 변환시키고, 배수 비율을 계산하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 데이터 분석 결과, 노텀의 전사체 수준이 TProg 및 NTG 집단에 비하여 TPC에서 2 내지 5배 만큼 상향조절되었고, 추가로는 매주 2회에 걸쳐 15 mg/kg 이리노테칸으로 처리된 NTX 종양 보유 마우스에서 상승한 것으로 나타났다. 초감도 SOLiD3 분석 플랫폼을 사용하여 관찰된 NTX 종양 시료의 TPC 서브집단에서의 노텀의 과발현은 노텀이 결장직장 종양신생 및 유지에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 3
강화된 종양 개시 세포 집단에서의 노텀에 관한 실시간 PCR 분석
TProg 및 NTG 세포에 비하여 TPC 집단에서 증진된 노텀의 발현을 확인하기 위해, 택맨(TaqMan) 실시간 정량 PCR을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 다양한 NTX 세포주로부터 단리된 각 세포 집단 중의 유전자 발현 수준을 측정하였다. 상기 실시간 PCR 분석을 통해 관심의 대상이 되는 특정 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 별개의 표적에 대한 유전자 발현 수준을 보다 직접적으로 신속하게 측정할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다중의 환자 유래의 NTX 세포주 세포 집단 및 상응하는 대조군에서의 노텀 유전자 발현을 측정하는 데 사용된 어플라이드 바이오시스템즈 5900HT 머신(라이프 테크놀로지스)에서 택맨 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 상업적으로 이용가능한 노텀 프라이머/프로브 세트(라이프 테크놀로지스)를 이용하여, 택맨 시스템(TaqMan System)과 함께 제공된 설명서에 명시된 바와 같이 후속 분석을 수행하였다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 3종의 별개의 결장직장 NTX 종양 세포주(예컨대, CR2, CR4 및 CR5)로부터 단리된 NTG, TProg 및 TPC 집단에서의 유전자 발현을 질의하는 실시간 정량 PCR 결과, 노텀 유전자 발현이 TPC 세포에서 대략 2배 정도 상승되어 있고, 이러한 발현은 이리노테칸으로 처리된 마우스에서는 대략 4배 정도 추가로 상승되어 있는 것으로 나타났다. 보다 광범위하게 허용되는 실시간 정량 PCR 방법을 사용하여 얻은, TProg 및 NTG 세포 대조군과 비교하였을 때 NTX TPC 세포 시료에서 노텀 발현 상승이라는 관찰 결과는 이전 실시예의 SOLiD3 전체 트랜스크립톰 서열 분석 데이터를 확인시켜주고, 추가로는 노텀이 결장직장 신생물에서 구동 인자라는 것을 시사한다. 또한, 항암제로 처리된 종양에서의 노텀 발현 증가는 노텀 조절 인자 또는 길항제가 애주번트 요법으로서 가치가 크다고 판명될 수 있음을 보여준다.
실시예 4
미분획된 결장직장 종양 시료에서의 노텀 발현
TProg 및 NTG 세포와 비교하였을 때, 결장직장 종양으로부터의 TPC 집단에서 노텀 유전자 발현이 상승되어 있었다는 사실을 고려하여, 노텀 발현 수준이 또한 정상적인 인접한 조직(NAT: normal adjacent tissue) 및 다른 정상적인 조직 시료에 비하여 미분획된 결장직장 종양 시료에서 상승되어 있는지 여부를 측정하기 위해 실험을 수행하였다. 110개의 결장직장 환자 종양 표본, 정상적인 인접한 조직, 및 48개의 정상적인 조직을 포함하는 커스텀 튜머스캔 qPCR(Custom TumorScan qPCR)(오리진 테크놀로지스(Origene Technologies)) 384 웰 어레이를 디자인하고, 제공된 프로토콜에 따라 주문 제작하였다. 이어서, 실시예 3에 상세하게 설명되어 있는 방법 및 동일한 노텀 특이 프라이머/프로브 세트를 사용하여, 커스텀 플레이트의 웰에서 택맨 실시간 정량 PCR을 수행하였다.
도 4A 및 4B는 그래프 포맷으로 나타낸, 정상적인 결장 및 직장 조직에서의 평균 발현에 대해 정규화된 발현 데이터 결과를 보여주는 것이다. 더욱 구체적으로, 도 4A에는 110명의 결장직장암 환자로부터 수득된 168개의 조직 표본(이중 35개의 조직 표본은 결장직장암 환자로부터 유래된 정상적인 인접한 조직이었다), 및 48개의 정상적인 조직을 사용하여 작성된 데이터가 요약되어 있다. 플롯에서, 데이터는 박스 및 휘스커 플롯으로 제시되어 있고, 중간값은 박스 내부의 선으로 제시되어 있다. 유사하게, 도 4B는 종양 또는 정상적인 인접한 조직으로부터 수득된 24개의 대응 결장직장 환자 표본으로부터 얻은 데이터를 포함한다. 여기서, 플롯팅된 데이터는 각 종양과 NAT 사이와 연관시켜 시료 하나씩 차례대로인 방식에 근거하여 제시되어 있다. 도 4A 및 4B, 둘 모두는 제시된 4개의 병기 모두에서 노텀 유전자의 발현 수준이 정상적인 인접한 조직에 비하여 결장직장 종양 및 대응 종양 표본 에서 상승하였음을 나타낸다.
더욱 특히, NTX 종양과는 대조적으로 상기 원발성 종양 환자의 시료 상에서 수행된 실시간 PCR의 결과에서는 노텀 유전자 발현이 암 병기와는 상관없이(즉, 병기 I-IV 질환) 정상적인 인접한 조직(NAT)에 비하여 환자의 종양에서 대략 1,000배 정도 더 높게 나타났다. 유사하게, 노텀 유전자 발현은 NAT에 비하여 대응 종양에서 대략 10-100배 정도 상승하였다. 또한, 노텀 발현은 대부분의 정상적인 조직에서는 상대적으로 낮았고, 유전자 발현 수준이 결장직장암 환자 종양에서 관찰되는 중간값 수준이거나 그보다 큰 정상적인 태반 및 간 조직만을 병기에 의해 군집화하였다. 미분획된 결장직장 종양 시료에서의 노텀 발현 상승 및 정상적인 대조군 조직에서의 상대적으로 낮은 발현 수준 또한 악성 종양의 발생 및 지지에 있어 노텀 유전자 생성물의 역할에 관하여 시사한다.
실시예 5
예시적인 종양 시료에서의 노텀의 차별적인 발현
추가의 결장직장암 환자 종양 시료 및 17가지의 다른 상이한 고형 종양 유형 중 하나로 진단받은 환자로부터의 종양 표본에서의 노텀 유전자 발현을 추가로 평가하기 위해, 실시예 4와 같은 제공된 프로토콜에 따라 주문 조립된 티슈스캔 qPCR (TissueScan qPCR)(오리진 테크놀로지스) 384 웰 어레이를 사용하여 택맨 qRT-PCR을 수행하였다. 측정 결과는 도 5a 및 5b에 제시되어 있으며, 다수의 종양 시료에서 노텀의 유전자 발현은 유의적으로 상승되어 있는 것으로 나타났다.
이와 관련하여, 도 5a 및 5b는 각각 18개 상이한 고형 종양 유형 중 하나를 앓는 환자로부터 유래된 전체 종양 표본(회색 박스) 또는 대응 NAT(흰색 박스)에서의 인간 노텀의 상대적 또는 절대적 유전자 발현 수준을 보여준다. 도 5a에서, 데이터는 분석된 각 종양 유형에 대한 평균 NAT 유전자 발현에 대하여 정규화된 것이다. 도 5b에서, 절대적인 노텀 발현은 다양한 조직/종양에서 평가된 것인데, 여기서, 데이터는 실시간 정량 PCR에 의해 지수 증폭에 도달하는 필요한 사이클수(Ct)로서 플롯팅된 것이다. 증폭되지 않은 표본의 Ct 값은 45로 지정하였는데, 이는 지수 프로토콜에서 최종 증폭 사이클을 나타낸다. 데이터는 박스 및 휘스커 플롯으로 제시되어 있고, 중간값은 박스 내부의 선으로 제시되어 있다.
결장직장암 진단을 받은 환자 이외에도, 자궁내막암, 식도암 및 자궁암 진단을 받은 환자는 또한 NAT에 비하여 상기 종양에서 유의적으로 더 많은 노텀 유전자 발현을 나타내었고, 이는 노텀이 상기 종양에서 TPC 자기 재생 및 증식에 영향을 미침으로써 병적으로 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 비록 유의적이지는 않지만, 난소 종양, 전립샘 종양, 및 갑상샘 종양에서도 또한 노텀 발현은 상승되어 있다. 또한, 본 연구로부터 명백화된 사실은 대부분의 NAT 시료에서 노텀 유전자 발현이 일반적으로는 검출불가능할 정도로 낮았다는 것이며; 가장 높은 발현은 간, 고환 및 폐에서 관찰되었다. 또한, 이러한 데이터는 노텀 발현이 다수의 과증식성 장애에서 종양신생 또는 영구화를 나타내고, 잠재적으로는 그에 관해 결정적이라는 것을 시사한다.
실시예 6
풀링된 다양한 조직 용해물에서의 차별적인 노텀 단백질 발현
이전 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 다수의 종양신생 시료에서 증진된 노텀 유전자 발현을 입증한 후, 유사 종양 시료에서의 노텀 단백질의 상응하는 증가에 관한 증거를 찾고자 했다. 이와 관련하여, 11개의 상이한 종양 유형 또는 이의 각각의 정상적인 인접한 조직으로부터의 용해물의 두 풀링된 복제물을 포함하는 역상 단백질 어레이를, 외인성 프로모터(오리진 테크놀로지스)에 의해 구동되는 TP53을 과발현하거나, 또는 과발현하지 않는 293 세포 대조군과 함께 제공하였다. 인간 노텀에 대해 생성된 마우스 다중클론 항체, 및 제조사에 의해 제공된 비색 검출용 시약 및 프로토콜을 사용하여 용해물에서의 노텀 단백질 발현을 검출하였다. 평판 스캐너를 이용하여 제작된 어레이 상의 스폿을 디지털 영상으로 변환시킨 후, 알파이지Fc 소프트웨어(AlphaEaseFc Software)(알파 니노테크 인코퍼레이티드(Alpha Innotech, Inc)) 내의 스폿덴소(SpotDenso) 기능을 사용하여 정량하였다.
이러한 검정 결과가 도 6에 제시되어 있는데, 이는 노텀 단백질의 발현이 수개의 상이한 유형의 종양에서 상향조절되어 있음을 나타낸다. 더욱 구체적으로, 도 6은 정상적인 인접한 조직 및 293T P53 음성 대조군(흰색) 또는 293T P53 양성 대조군 및 11개의 상이한 종양 유형 중 하나를 앓는 환자로부터 수득된 표본(즉, 원발성 종양 시료)으로부터의 종양 조직(검은색)에서의 인간 노텀의 발현 수준을 보여주는 것이다. 상기 기술된 바와 같이 데이터를 작성하고, 이는 스폿당 평균 픽셀 강도로 나타내었다. 플롯팅된 데이터는 평균±SEM으로 제시되어 있다.
결장직장암 이외에도, 흑색종, 전립샘암 및 췌장암을 앓는 환자로부터 유래된 종양 표본에서도 노텀 단백질 발현은 유의적으로 상승되어 있는 것으로 보였다. 이러한 데이터는 노텀 과발현이 상기 종양에서 TPC 증식 및/또는 생존에 관여할 수 있다는 것을 시사한다. 추가로, 노텀 단백질의 검출이 상기 질환에 대한 예후가 될 수 있다.
상기와 같은 상승된 발현 수준이 종양신생 및 종양 전파와 관련이 있을 수 있다는 가능성과 결부하여, TPC 강화된 세포 집단 및 다양한 종양에서 (유전자 수준 및 프로테옴 수준, 둘 모두로) 노텀이 과발현되었음을 보여주는 상기 실시예를 고려하며, 노텀 조절 인자 생성에 사용될 수 있는 노텀 면역원을 구성하기로 결정하였다.
실시예 7
태깅된 노텀 조절 인자의 구성 및 발현
노텀 조절 인자를 생성하는 데 사용하기 위해 하기 기술되는 바와 같이 구성체를 제작하고 발현시켰다. 출발점으로서 전체 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame) 서열 번호 1을 코딩하는 인간 노텀 cDNA를 상업적 공급원(오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems); 수탁 번호 BC060882)으로부터 입수하였다. cDNA 클론 ORF 서열을 DNA 서열 분석함으로써 참조 서열(진뱅크 NM_178493)과 비교하여 돌연변이가 없는 것으로 확인되었다.
용이하게 재조합 생성물을 정제하고 검출할 수 있도록 하기 위해, 전장의 노텀 ORF를 코딩하는 cDNA를 PCR에 의해 변형시켜 8x-His 및 스트렙-태그(Strep-tag) II 에피토프(IBA GmBH)를 코딩하는 서열을 포함시켰다. 변형된 노텀 ORF를 코딩하는 DNA를 퀴아퀵(QiaQuick) PCR 클린업 칼럼(퀴아젠)을 사용하여 PCR로부터 정제하고, pCMV-스크립트(pCMV-Script)(스트라타진, 인크(Stratagene, Inc.))의 Not I와 Xho I 부위 사이 내로 DNA를 서브클로닝하고, DNA 서열 분석함으로써 돌연변이가 없음을 확인하였다. 이러한 경우, 야생형 노텀 신호 펩티드 서열은 재조합 단백질의 분비를 지시한다.
본 발명에 따라, 원하는 재조합 생성물을 제조하는 데 사용하기 위한 pSEC 발현 벡터를 구성하였다. pSEC-CAG 발현 벡터는, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 주요 즉시 조기 유전자 인핸서/프로모터 영역, 인핸서/프로모터 영역의 하류에 위치하는 β 글로빈/IgG 키메라 인트론으로 구성된 CAG 프로모터를 포함한다. pSEC-CAG 벡터는 다수의 세포 유형에서 클로닝된 cDNA 삽입체의 강력한 구성적 발현을 촉진시킨다. pSEC-CAG는 또한 플라스미드로 형질감염된 세포로부터의 발현된 재조합 단백질의 분비 증진을 촉진시키기 위한 IgK 신호 펩티드/리더 서열을 포함한다. pCMV-스크립트로부터의 에피토프-태깅된 노텀 ORF를 PCR에 의해 pSEC-CAG 벡터의 Sfi I와 Xho I 부위 내로 서브클로닝하여 pSEC-CAG-노텀-StrepHis를 수득하였다.
현탁액 293 세포 1 ℓ를 형질감염시키기 위해 pSEC-CAG-노텀-StrepHis DNA를 사용하고, 니켈-NTA 칼럼을 사용하여 형질감염된 세포의 상청액으로부터 재조합 단백질을 정제하였다. 더욱 구체적으로, 제조사의 설명서에 따라 리포펙트아민 2000(Lipofectamine 2000)(라이프 테크놀로지스)을 사용하여 플라스미드 pSEC-CAG-노텀-StrepHis를 형질감염시킴으로써 부착성 HEK293T 세포에서 재조합 노텀 단백질을 제조하였다. 48시간째에 부착성 세포로부터의 상청액을 수거하고, AKTA 프라임 장치를 사용하여 재조합 His 태깅된 단백질을 Ni-NTA HisTrap 칼럼(Ni-NTA HisTrap column)(GE 아머샴(GE Amersham)) 상에서 정제하였다. 선형 구배의 이미다졸(최종 농도 500 mM)을 사용하여 칼럼으로부터 재조합 단백질(즉, h노텀-His)을 용리시키고, 노텀 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, AKTA FPLC를 사용하여 수퍼덱스200(Superdex200) 크기 분별 칼럼 상에서 추가로 정제하였다. 정제된 노텀 단백질을 ELISA 및 단백질 블롯 분석에 의해 확인하였다. 수집된 물질을 다음 실시예의 면역화에 사용하였다.
유사하게, 바로 앞에 기술되어 있는 것과 실질적으로 동일한 기법 및 하기 실시예 8에 기술되는 뮤린 노텀 유전자를 사용하여 His 태깅된 뮤린 노텀(즉, 노텀-His)을 순차적으로 제작하고 발현시켰다. 다음 실시예에서 기술되는 바와 같이, 이러한 구성체 또한 사용하여 본 발명의 조절 인자의 특징을 규명하였다.
실시예 8
Fc - 노텀 융합 조절 인자의 구성 및 발현
조절 인자, 면역원, 검정용 시약으로서 사용하기 위해, 및 생체내 연구를 위해 추가의 상대적으로 가용성이 더 큰 노텀 단백질을 제조하였다. 더욱 특히, 인간 노텀 및 마우스 및 레서스 마카크(마카카 물라타(Macaca mulatta) 또는 마카크)에 대한 오르토로그를 사용하여 각각 Fc 구성체를 제조하였다. 달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 목적을 위해, 상기 구성체의 Fc 부위는 인간 기원인 것으로 하였다.
실시예 7에 기술되어 있는 바와 같이, 성숙한 인간 노텀 단백질을 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭시켜 EcoR I 및 Nco I 제한 부위 측면에 위치하는 프레임내 포함시키고, pFUSE-mIgG2b 벡터(인비트로겐(Invivogen))의 EcoR I 및 Nco I 부위 사이로 서브클로닝하여 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하며, 성숙한 인간 노텀 단백질을 코딩하는 서열에 프레임내에서 융합된, 마우스 IgG2b 유전자로부터 유래된 Fc 도메인을 코딩하는 서열과 프레임내에서 융합된 pFUSE-노텀-mIgG를 생성하였다. 마우스 IgG2b Fc 도메인을, 플라스미드 pFUSE-hIgG2(인비트로겐)로부터 PCR에 의해 증폭된 인간 IgG2 Fc를 코딩하는 DNA 서열로 대체하였다. 인간 IgG2 Fc PCR 생성물을 Bgl II 및 Nhe I로 분해하고, 벡터 pFUSE-노텀-mIgG 중의 동일 부위로 서브클로닝하여 IL-2 신호 펩티드 서열을 포함하며, 성숙한 인간 노텀 단백질을 코딩하는 서열에 프레임내에서 융합된, 인간 IgG2 유전자로부터 유래된 Fc 도메인을 코딩하는 서열과 프레임내에서 융합된 p노텀-hIgG2 hFc를 생성하였다. 예시적인 인간 Fc-노텀 융합 구성체의 아미노산 서열(서열 번호: 333) 및 핵산 서열(서열 번호: 334)은 도면 1에 제시되어 있으며, 여기서, 분자의 노텀 부위는 밑줄체로 표시되어 있다.
선형 폴리에틸렌이민 및 표준 방법을 사용하여 p노텀-hIgG2 hFc 플라스미드로 형질감염된 CHO-S 세포(라이프 테크놀로지스)에서 재조합 인간 노텀-Fc 단백질(즉, h노텀-Fc)을 제조하였다(예컨대, 문헌 [Durocher, Y. et al. Nucleic Acids Res. (2002) 30:e9](이는 본원에 참고로 포함된다) 참조). 형질감염 후 5일 경과하였을 때, 단백질 A 칼럼 및 제조사의 설명서(GE 아마샴)를 사용하여 재조합 단백질을 상청액으로부터 정제하였다. 칼럼으로부터 용리된 물질을 (대략 1 mg/mL로) 농축시키고, 농축제를 PBS로 교체하였다.
검정 개발 활동 생체내 생성물 개발에서 사용하기 위해 유사한 분자 생물학적 방법 및 DNA 클로닝 방법을 사용하여, 마우스 노텀 및 마카크 노텀, 및 인간 Fc 영역을 포함하는 융합 구성체를 제작하였다. 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 노텀(진뱅크 NM_175263) 및 마카크 물라타 노텀(진뱅크 XM_0011 12829)의 ORF에 상응하는 서열을 진아트(GENEArt: 독일 레겐스부르크)의 올리고뉴클레오티드로부터 합성하였다. 성숙한 뮤린 노텀 단백질을 코딩하는 DNA를 진아트 제공 벡터로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 마우스 IgG2b Fc 도메인을 코딩하는 서열이 인간 IgG2 Fc 도메인을 코딩하는 서열로 치환된 pFUSE-mIgG2b로부터 유도된 플라스미드인 pSCRXv003의 EcoR I 및 Nco I 부위 내로 서브클로닝하였다. 이를 통해 인간 노텀이 뮤린 노텀으로 치환되고, 대체로는 p노텀-hIgG2 hFc와 유사한 플라스미드 pSCRXv3-무스-노텀을 수득하였다(문헌 [Durocher, Y. et al. 상기 문헌 동일]).
유사하게, 성숙한 M. 물라타(M. mulatta) 노텀 단백질을 코딩하는 DNA를 진아트 제공 벡터로부터 PCR에 의해 증폭시키고, pSCRXv003의 EcoR I 및 Bgl II 부위 내로 서브클로닝하여 (이 또한 인간 노텀이 마카크 노텀으로 치환되고, p노텀-IgG2 hFc와 유사한) pSCRXv003-mac-노텀을 수득하였다. 상기 인간-Fc 태깅된 인간 노텀에 대해 기술된 바와 같이, 재조합 뮤린 및 마카크 노텀-인간 Fc 태깅된 단백질을 필요에 따라 CHO-S 세포에서 제조하였다.
실시예 9
노텀 구성체를 사용한 항노텀 항체 생성
h노텀-His 또는 h노텀-Fc를 접종하여 본원의 교시에 따라 뮤린 항체 형태의 노텀 조절 인자를 제조하였다. 이와 관련하여, 신생물성 장애 치료를 위해 노텀의 작용을 치료학적으로 억제시키는 데 사용될 수 있는 고친화성 뮤린 단일클론 항체를 생성하는 3가지 계통의 마우스를 사용하였다. 구체적으로, Balb/c, CD-I 및 FVB 마우스 계통을 하기 기술하는 바와 같이 인간 재조합 노텀으로 면역화시키고, 이를 사용하여 하이브리도마를 생산하였다:
6마리의 암컷 마우스(Balb/c, CD-I, FVB 각각 2마리씩)를 다양한 노텀 항원 제제로 면역화시켜 뮤린 항체를 생성하였다. 면역원으로는 293 세포에서 발현된 노텀-Fc 또는 His 태깅된 인간 노텀을 포함하였다. 마우스를 모든 주사마다 발바닥 경로를 통해 면역화시켰다. 동량의 티터맥스(TITERMAX) 또는 알룸 애주번트로 유화된 10 ㎍의 노텀 면역원을 면역화에 사용하였다.
고상 ELISA 검정법을 사용하여 인간 노텀에 대하여 특이적인 마우스 IgG 항체에 대하여 마우스 혈청을 스크리닝하였다. 간략하면, 밤새도록 플레이트를 PBS 중 0.01-1 ㎍/mL 범위의 상이한 농도로 (실시예 7로부터 얻은) 노텀-His로 코팅하였다. 0.02% (v/v) 트윈(Tween) 20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 웰을 RT에서 1시간 동안 200 ㎕/웰로 PBS 중 3% (w/v) BSA를 이용하여 차단시켰다. RT에서 1시간 동안 50 ㎕/웰로 마우스 혈청 희석액을 노텀-His로 코팅된 플레이트 상에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 후, 3% BSA-PBS 중 1:10,000으로 희석된 50 ㎕/웰의 HRP로 표지된 염소 항마우스와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, RT에서 15분 동안 100 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질(써모 사이언티픽 34028)로 발색시키고, OD 450에서 분광광도계에 의해 분석하였다.
혈청 양성 면역화된 마우스를 희생시키고, 배출 림프절(림프절이 종대된 경우에는 슬와 및 서혜 림프절)을 절개하고, 항체 생산 세포에 대한 공급원으로서 사용하였다. B 세포의 단일 세포 현탁액(6.35X107개의 세포)을 전기 융합에 의해 1:1의 비율로 비분비형 P3x63Ag8.653 골수종 세포(ATCC #CRL-1580)와 융합시켰다. 융합 발생기, 모델 ECM2001(진트로닉 인코퍼레이티드(Genetronic, Inc.))을 사용하여 전기 세포 융합을 수행하였다. HAT(시그마(Sigma) #A9666)로 보충된 하이브리도마 선별 배지((15% 태아 클론 I 혈청(하이클론(Hyclone)), 1 mM 피루브산나트륨, 4 mM L 글루타민, 10 ㎍/mL 젠타마이신, 50 μM 2-머캅토에탄올, 100 μM 하이포크산틴, 0.4 μM 아미노프테린, 및 16 μM 티미딘을 함유하는 DMEM(셀그로(Cellgro) 카탈로그 번호 15-017-CM) 배지) 중에 세포를 재현탁시킨 후, 최종 플레이팅은 96 웰 플레이트당 2 X 106개의 B 세포인 것에 기초하여 20개의 96 웰 편평한 바닥 조직 배양 플레이트에 200 ㎕/웰로 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 7-10일 동안 5% CO2 및 95% 대기를 함유하는 습윤화된 37℃ 인큐베이터에 놓았다.
상기 기술된 것과 유사한 ELISA 검정법을 사용하여 마우스 면역글로불린을 분비하는 성장 양성 하이브리도마 웰을 노텀 특이성에 관하여 스크리닝하였다. 간략하면, 96 웰 플레이트(VWR, 610744)를 4℃에서 밤새도록 탄산나트륨 완충제 중 0.4 ㎍/mL 인간 노텀-His로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 1% BSA-PBS 차단하고, 즉시 사용하거나, 또는 4℃에 보관하였다. 희석되지 않은 하이브리도마 상청액을 RT에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척한 후, 1% BSA-PBS 중 1:10,000으로 희석된 HRP로 표지된 염소 항 마우스 IgG와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 상기 기술된 바와 같은 기질 용액과 함께 인큐베이션시키고, OD 450에서 판독하였다.
별법으로, h노텀-Fc를 ELISA 플레이트에 포획시키기 위해, ELISA 플레이트를 염소 항인간 IgG Fc로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, RT에서 1시간 동안 3% BSA-PBS로 차단시키고, 이를 사용하여 희석되지 않은 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 3% BSA-PBS 중 1:10,000으로 희석된 HRP로 표지된 염소 항마우스 IgG로 프로빙하였다. 이어서, 플레이트를 상기 기술된 바와 같은 기질 용액과 함께 인큐베이션시키고, OD 450에서 판독하였다.
노텀 특이 하이브리도마를 세포 배양물에서 확장시키고, 재플레이팅하고, 재스크리닝하고, 제한 희석에 의해, 또는 단일 세포 FACS 분류에 의해 일련으로 서브클로닝하였다. 생성된 클론 집단을 확장시키고, 냉동 배지(90% FBS, 10% DMSO) 중에서 냉동보관하고 액체 질소에서 보관하였다.
상기 하이브리도마의 대부분 또는 그 모두로부터의 정제된 항체가 농도에 의존하는 방식으로 노텀에 결합한다는 것을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 노텀의 ELISA 플레이트에의 직접적인 결합이 단백질을 변성시킬 수 있고, 겉보기 결합 친화도는 변성되지 않은 단백질에의 결합을 반영할 수 없다는 것에 주의하여야 한다.
2회에 걸쳐 융합을 수행하고, 각 융합물을 20개의 플레이트(1920개의 웰/융합물)에 시딩하였다. 이를 통해 인간 노텀에 대해 특이적인 수십 개의 뮤린 항체를 수득하였다.
실시예 10
노텀 조절 인자의 특징 규명
상기 실시예에서 생산된 노텀 조절 인자의 특징을 하기와 같이 규명하였다:
항체 포획 비아코어 기술을 사용하여 항체에 대한 결합 특징을 평가하였다. 선별된 항체에 대한 해리 상수값 Kd(K오프/K온)을 측정하였다. 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) 동적 성질 측정을 위해 비아코어 3000(GE 헬쓰케어) 바이오센서를 사용하였다. 정제된 항체를 사용하여 센서 표면 상의 항체 포획을 통해 K오프 상수를 유도하였다. 표준 아민 커플링 화학법을 사용하여 센서 칩의 CM5 표면 상에 항마우스 IgG를 고정시켰다. 항원을 고정화된 항체 상에 주입하기 전에 각 mAb가 항IgG 표면에 포획시켜 분석하고자 하는 항체-항원 상호작용이 일어나도록 하였다.
비아코어 분석을 사용하여 수득된 항노텀 항체의 정량적 Kd 값을 통해 수개의 단일클론 항체가 초고도로 친화성이며, Kd 측정값은 1 x 10-7 M 내지 7 x 10-10 M 범위인 것으로 밝혀졌다.
실시예 11
노텀 조절 인자의 에피토프 측정
다중방식 경쟁 항체 비닝은 문헌 [Jia et al., 2004, PMID: 15183088](이는 본원에 참고로 포함된다)에 개략적으로 설명되어 있다. 참조 mAb를 포획하기 위해 멀티플렉싱 루미넥스(Multiplexing Luminex) 비드를 항마우스 IgG와 커플링시켰다. 각 mAb가 독특한 스펙트럼 어드레스와 관련되도록 각 비드는 독특하 스펙트럼 코딩을 가졌다. mAb 비드 복합체 모두 마스터 믹스로 풀링하고, 96 웰 마이크로티터 플레이트의 개별 웰 내로 분취시켰다. 각 웰 중의 참조 항체 비드 복합체로 이루어진 마스터 믹스를 먼저 항원과 함께 인큐베이션시킨 후, 프로브 mAb와 함께 인큐베이션시켰는데, 이 프로브 mAb는 웰마다 상이한 것이었다. 경쟁 항체 비닝 검정에서 항원은 재조합 노텀-His였다. 프로브 mAb는 오직 상이한 에피토프를 인식하는 참조 mAb에 의해 포획된 항원에만 결합하였다. 루미넥스(Luminex) 100 상에서 신호를 RFU로 판독하였다. 본 실험을 통해 스크리닝된 항체는 노텀 단백질 상의 4가지 이상의 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 12
노텀 조절 인자의 서열 분석
상기 결과에 기초하여, 고정화된 인간 노텀에 겉보기상 고도의 친화도로 결합하는 다수의 예시적인 별개의 단일클론 항체를 선택하였다. 도 7a 및 7b에 표 양식으로 제시되어 있는 바와 같이, 실시예 9로부터의 mAb를 코딩하는 DNA에 관한 서열 분석을 통해 독특한 VDJ 재배열을 가지고 있고, 신규한 상보성 결정 영역을 나타낸다는 것을 확인하였다. 도 7b에 제시된 상보성 결정 영역은 [Chothia et al., 상기 문헌 동일]에 따라 정의된 것임에 주의한다.
서열 분석을 개시하기 위해, 트리졸(TRIZOL) 시약을 인비트로겐(라이프 테크놀로지스)으로부터 구입하였다. 1 단계 RT PCR용 키트 및 퀴아퀵 PCR 정제용 키트는 퀴아젠, 인코퍼레이티드로부터 구입하고, RN아신(RNasin)은 프로메가(Promega)로부터 입수하였다. 커스텀 올리고뉴클레오티드는 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)로부터 구입하였다.
RNA 시료용 트리졸 시약 중에서 하이브리도마 세포를 용해시켰다. 104 ㎕ 내지 105개 사이의 세포를 1 ml 트리졸 중에 재현탁시켰다. 200 ㎕의 클로로포름을 첨가한 후, 튜브를 왕성하게 진탕시켰다. 시료를 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 수성 상을 새 미세분리 튜브로 옮기고, 동량의 이소프로판올을 첨가하였다. 튜브를 왕성하게 진탕시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 시료를 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 1 ml의 70% 에탄올로 한번 세척하고, 실온에서 잠시 동안 건조시켰다. RNA 펠릿을 DEPC로 처리된 물 40 ㎕로 재현탁시켰다. 1% 아가로스 겔 주에서 3 ㎕를 분별화하여 RNA의 시료의 양을 측정하였다. RNA를 사용시까지 -80℃ 냉동기에서 보관하였다.
뮤린 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄에 특이적인 컨센서스 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 하이브리도마의 DNA의 가변 서열을 가변 도메인 프라이머 믹스를 사용함으로써 증폭하였다. 1 단계 RT-PCR용 키트를 사용하여 각 RNA 시료로부터의 VH 및 VK 유전자 세그먼트를 증폭시켰다. 퀴아젠 원스텝(Qiagen One-Step) RT-PCR용 키트는 센시스크립트(Sensiscript) 및 옴니스크리트(Omniscript) 역전사효소의 블렌드, 핫스타Taq(HotStarTaq) DNA 폴리머라제, 퀴아젠 원스텝 RT-PCR 완충제, dNTP 믹스, 및 "난해한"(예컨대, GC가 풍부한) 주형이 효율적으로 증폭될 수 있도록 하는 신규한 첨가제인 Q 용액을 제공한다.
3 ㎕의 RNA, 0.5의 100 μM의 중쇄 또는 카파 경쇄 프라이머 5 ㎕의 5 x RT-PCR 완충제, 1 dNTP, 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 함유하는 효소 믹스 1 ㎕, 및 0.4 ㎕의 리보뉴클레아제 억제제 RN아신(1 유니트)을 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물은 역전사 및 PCR, 둘 모두에 필요한 시약 모두를 포함하였다. 열 사이클러 프로그램은 50℃에서 30분 동안, 95℃에서 15분 동안, 이어서, (95℃에서 30초 동안, 48℃에서 30초 동안, 72℃에서 1.0분 동안 진행되는) 30 사이클인 RT 단계였다. 이어서, 72℃에서 10분 동안 최종적으로 인큐베이션시켰다.
직접적인 DNA 서열 분석을 위한 PCR 생성물을 제조하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 퀴아퀵™ PCR 정제용 키트를 사용하여 정제하였다. 50 ㎕의 멸균수를 사용하여 회전식 칼럼으로부터 DNA를 용리시킨 후, 직접 양 가닥 모두로부터 서열을 분석하였다. PCR 단편의 서열을 직접 분석하고, VBASE2를 사용하여 DNA 서열을 분석하였다(문헌 [Retter et al. Nucleic Acids Res. 33; 671 -674, 2005]).
상기 논의된 바와 같이, 스물 네개(24)의 예시적인 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 핵산 서열이 도 8A - 8X에 각각 제시되고 있고(서열 번호: 3-98), 상기 및 추가의 항h노텀 항체의 유전자 배열 및 유도된 CDR(문헌 [Chothia et al., 상기 문헌 동일]에 의해 정의된 바와 같다)은 각각 도 7A 및 7B에 표 형식으로 제시되어 있다(서열 번호: 103-330).
실시예 13
점 돌연변이를 포함하는 노텀 조절 인자의 구성
앞서 논의된 바와 같이, 노텀은 α/β 하이드롤라제 효소 수퍼패밀리의 구성원이다. 노텀의 서열 분석을 통해 Gly230에서 시작되는 GXSXG로 된 시그니처 촉매성 L자 부분(elbow) 서열과, 어떤 Ser232가 상기 수퍼패밀리의 특징이 되는 친핵체, 산성 잔기, 및 히스티딘으로 이루어진 촉매성 트리아드의 추정상 친핵성 잔기가될 것인지를 확인할 수 있었다. 초파리 (S237A, 문헌 [Kreuger, 2004, PMID: 15469839]) 및 뮤린(S239A, 문헌 [Traister, 2008, 상기 문헌 동일]) 형태에서의 오르토로고스 잔기의 부위 지정 돌연변이유발법을 통해 불활성 단백질을 수득하였고; 이로써 표준 분자 생물학적 기법(퀵 체인지 뮤터제너시스 키트(Quick Change Mutagenesis Kit), 스트라타진/애질런트, 인코퍼레이티드)을 사용하여 야생형 인간 노텀 단백질 상에서 부위 지정 돌연변이유발법을 수행함으로써 His 태깅된 버전의 단백질 중에 S232A 돌연변이를 생성하였다(즉, h노텀-S232A-His). 유사하게, 서열 정렬을 통해 인간 D340이 촉매성 산성 잔기라는 것이 제안되었고; 따라서, 같은 키트를 사용하여 상기 잔기를 변이시킴으로써 D340A 돌연변이화된 버전의 분자를 생성하였다. 실시예 7 및 8에 기술되어 있는 바와 같이, PCR 클로닝을 사용하여 상기 돌연변이를 포함하는 노텀 도메인을 인간 노텀-hFc 발현 벡터로 클로닝하였다(즉, h노텀-S232A-hFc). 이어서, 상기 기술된 바와 같이 구성체를 발현시키고 정제시켰다.
실시예 14
노텀 조절 인자가 Wnt3A 정규 신호전달을 변경시킨다.
초파리 노텀이 무시 신호전달 기능성 길항제인 것으로 밝혀진 반면, 뮤린 노텀은 일과성 형질감염 검정에서 베타 카테닌 루시퍼라제 리포터의 도입을 길항시키는 것으로 나타났다.
정규 Wnt 신호전달의 활성화를 위한 리포터를 포함하는 안정한 세포 집단을 생성하기 위해, TCF에 대한 전사 반응 요소로 이루어진 4개의 연쇄 반복부에 연결된 최소 CMV 리포터의 제어하에 이기능성 GFP 및 루시퍼라제 리포터 카세트를 코딩하는 렌티바이러스 벡터인 pGreenFirel-TCF(시스템 바이오사이언시스(System Biosciences))를 HEK 293T 세포에 형질도입하였다. 이어서, 293.TCF 세포로 명명되는 형질도입된 세포 집단을 하기와 같이 Wnt3 정규 신호전달 검정에 사용하였다: 2.5 x 104개의 293.TCF 세포를 50 ㎕의 무혈청 DME 배지 중 96 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰마다 플레이팅하였다. 24시간의 혈청 고갈 기간이 경과한 후, 25 ㎕의 DMEM +0.2% FBS와 함께, 25 ㎕의, LAVnt3A 세포(ATCC CRL-2647; Willert, 2003)로부터의 조건 배지(CM: conditioned medium)의 다양한 희석액, 또는 모체 L-세포(ATCC CRL-2648)로부터의 희석되지 않은 CM을 각 웰에 첨가하였다. CM 첨가 후 18시간이 경과하였을 때, 100 ㎕의 원-글로(One-Glo) 용액(프로메가 코포레이션(ProMega Corp.))을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰의 내용물을 철저하게 혼합하여 세포를 용해시키고, 100 ㎕의 용해물을 검은색 96 웰 플레이트로 옮기고, 5 min 후, 왈락 빅토르3 멀티라벨 카운터(Wallac Victor3 Multilabel Counter)(퍼킨-엘머 코포레이션(Perkin-Elmer Corp))을 사용하여 각 웰의 발광을 판독하였다. 도 9A에서 알 수 있는 바와 같이, Wnt3A를 함유하는 상이한 농도의 CM에 노출된 세포는 전형적으로 L 세포 대조군 CM에 노출된 세포에 비하여 루시퍼라제 신호를 2 내지 4배 사이로 유도한 것으로 나타났다. 더욱 특히, Wnt3A+ CM 배지를 25% 미만에서부터 대략 3%로 희석시킴에 따라, Wnt 경로의 활성화는 감소하였고, 이에 상응하여 발광도 감소하였다.
일단 루시퍼라제 리포터 시스템이 확립되고 나면, 다양한 노텀 조절 인자의 생체활성을 측정하는 검정을 하기와 같이 수행하였다. 2.5 x 104개의 293.TCF 세포를 50 ㎕의 무혈청 배지 중 96 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰마다 플레이팅하였다. 23시간의 혈청 고갈 기간이 경과한 후, 다양한 농도로 다양한 노텀 조절 인자(예컨대, 상기 실시예 7, 8 및 13에 따라 수득된 h노텀-His, h노텀-hFc, h노텀-S232A-His, 뮤린 노텀- His, 뮤린 노텀-hFc, 마카크 노텀-hFc, 대조군 단백질-His 또는 대조군 단백질-hFc)를 함유하는 25 ㎕의 DMEM+0.2% FBS를 세포에 첨가하였다. 1시간 경과 후, 25 ㎕의 Wnt3A 또는 대조군 L 세포 CM을 각 웰에 첨가하였다. CM 첨가 후 18시간이 경과하였을 때, 100 ㎕의 원-글로 용액(프로메가 코포레이션)을 각 웰에 첨가하고, 각 웰의 내용물을 철저하게 혼합하여 세포를 용해시키고, 100 ㎕의 용해물을 검은색 96 웰 플레이트로 옮기고, 5 min 후, 발광을 판독하였다.
도 9B, 9C 및 9D에서 알 수 있는 바와 같이, 인간 노텀-His, 인간 노텀-hFc, 뮤린 노텀-His, 뮤린 노텀-hFc, 및 마카크 노텀-hFc 모두 293.TCF 세포에서 Wnt3A 매개의 루시퍼라제 유도를 길항시킨 반면, 실시예 13으로부터의 인간-노텀 S232A 돌연변이체 및 대조군-His 및 대조군-hFc 단백질은 293.TCF 세포에서 Wnt3A 매개의 루시퍼라제 유도를 길항시키지 못하였다.
본 발명의 화합물의 특징을 규명하는 데 유용한 기능성 검정 개발을 입증하는 것 이외에도, 도 9B-9D에는 본원의 교시에 따라 가용성 His 태깅된 노텀 구성체 및 Fc-노텀 융합 단백질, 둘 모두가 노텀 조절 인자로서 효과적으로 작용한다는 것이 제시되어 있다. 더욱 구체적으로, 도 9B에는 IC50의 계산치가 각각 0.4702 및 0.5031인 것으로 루시퍼라제 활성이 감소한 것으로 제시된 바와 같이, h노텀-Fc 및 h노텀-His 조절 인자의 Wnt 경로에 대한 농도 의존적 효과가 제시되어 있다. 이러한 결과는 노텀-hFc 및 노텀-His 조절 인자가 농도에 의존하는 방식으로 Wnt3A 경로를 길항시키는 반면, 실시예 13의 돌연변이체 노텀 조절 인자는 길항시키지 못한다는 것을 그래프로 도시한 도 9C에서 확인되었다. 유사하게, 도 9D는 뮤린 노텀 조절 인자(His 및 Fc) 및 마카크 노텀 또한 농도에 의존하는 방식으로 Wnt3A 정규 경로를 길항시킨다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 노텀/Wnt 생체검정을 입증하며, 노텀 세포외 도메인 중 적어도 일부를 포함하는 다양한 가용성 노텀 구성체가 Wnt 경로를 길항시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 15
노텀 조절 인자가 시험관내에서 노텀 활성을 중화시킨다
상기 기술된 293.TCF 세포를 사용하여, (실시예 9의) ELISA 검정법에 의해 노텀에 결합하는 것으로 밝혀진 하이브리도마 및/또는 정제된 항체로부터의 상청액을 h노텀-His 또는 h노텀-Fc 활성을 중화시킬 수 있는 이의 능력에 관하여 하기와 같이 스크리닝하였다. 2.5 x 104개의 293.TCF 세포를 50 ㎕의 무혈청 배지 중 96 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰마다 플레이팅하였다. 23시간의 혈청 고갈 기간이 경과한 후, 다양한 농도로 다양한 노텀 단백질을 함유하는 10 ㎕의 DMEM+0.2% FBS를 하이브리도마로부터의 상청액 15 ㎕, 또는 다양한 농도의 정제된 항체 15 ㎕와 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 25 ㎕의 항체:노텀 혼합물을 293.TCF 세포에 첨가하였다. 1시간 경과 후, 25 ㎕의 Wnt3A 또는 대조군 L 세포 CM을 각 웰에 첨가하였다. CM 첨가 후 18시간이 경과하였을 때, 100 ㎕의 원-글로 용액(프로메가 코포레이션)을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰의 내용물을 철저하게 혼합하여 세포를 용해시키고, 100 ㎕의 용해물을 검은색 96 웰 플레이트로 옮기고, 5 min 후, 발광을 판독하였다. 항체 활성을 분석하기 위해 원형(RAW) 루시퍼라제 RLU를 플롯팅하거나, 또는 Wnt3A CM 활성을 1로 및 L 세포 대조군 배지를 0으로 설정하여 데이터를 정규화하거나(정규화된 Wnt3 유도성 루시퍼라제 활성으로 그래프로 작성하거나), 또는 Wnt3A CM 활성을 1로, 및 최대 노텀 길항제 활성에서의 루시퍼라제 신호를 0으로 설정하여 데이터를 정규화하였다(중화 활성(%)으로 그래프로 작성하였다).
도 10에서 알 수 있는 있는 바와 같이, 수개의 항체는 10 ㎍/mL의 농도로 첨가되었을 때 노텀 활성을 억제시킬 수 있었다. 또한, 선택된 노텀 조절 인자(예컨대, SC2.A106 [aka 10B3] 및 SC2.D2.2)가 특히 효과적인 것으로 판명되었고, 같은 농도에서 80% 초과로 노텀을 억제시키는 것으로 나타났다. 추가로 항체 SC2.D2.2의 특징을 규명함으로써 루시퍼라제 신호를 음성 대조군과 거의 동일한 수준으로 회복시키면서(도 11a), 293.TCF 루시퍼라제 유도 검정에서 인간 노텀의 활성을 억제시킬 수 있는 이의 능력을 입증하였다. 더욱 특히, 도 11a는 SC2.D2.2 상청액 및 정제된 항체가 농도에 의존하는 방식으로 첨가된 h노텀-His의 효과를 길항시키는 작용한다는 것을 보여준다. 이러한 효과는 추가로 SC2.D2.2 정제된 항체가 다양한 농도의 노텀-His(도 11b) 및 노텀-hFc(도 11c)에 대해 각각 적정되어 있는 도 11b 및 11c에 제시되어 있다. 각 도면에서 작성된 곡선상의 변곡점을 통해 항체의 조절 활성이 농도에 의존하는 방식으로 가용성 노텀의 절대량에 비례하여 노텀 활성을 길항시키는 작용을 하는 것으로 확인되었다. 또한, 도 11d에서 알 수 있는 바와 같이, 비록 겉보기상으로는 SC2.D2.2와 동일한 정도는 아니지만, 제2 노텀 조절 인자인 SC2.A106 또한 인간 노텀-His를 억제시킬 수 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 본원에 개시된 노텀 조절 인자가 효과적인 중화 후보를 제공한다는 것을 나타내며, 종양 개시 세포 빈도를 감소시키기 위한 상기 화합물의 용도를 강력하게 시사한다.
실시예 16
ELISA 에 의한 노텀 조절 인자의 특징 규명
항체가 보이는 고도한 특이성은 항원 오르토로그에 대하여 다양한 효능을 형성하며, 이는 질환을 앓는 상이한 동물 모델에서 상기 분자의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 노텀의 구조와 기능 사이의 관계를 조사하기 위해, 인간, 마카크 및 마우스의 노텀 단백질을 코딩하는 cDNA 서열(실시예 7 및 8)을 클로닝하였다. 상기 동물로부터의 노텀 단백질의 유추된 아미노산 서열은 고도의 상동성을 보이는데, 이는 다수의 종에서 관찰된, 생물학적 및 면역학적 교차 반응성을 설명한다. 앞서 논의된 바와 같이, 인간 노텀은 원숭이 노텀과 97% 동일하고, 마우스와는 91% 동일하다. (1) 이황화 결합(성숙한 인간 노텀 서열의 16개의 Cys 잔기는 마우스 노텀 서열에서 보존된다); (2) N 당화 부위; 및 (3) 공통의 효소적 활성에 기초한 예측 활성 도메인은 전체적으로 보존된다. 아미노산 치환 대부분은 보존적이다. 인간 및 마우스 서열의 N 말단부가 가장 큰 변이성을 보이며, 수개의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 가지고 있다(도 1c).
실시예 9에 따라 인간 노텀 항원 구성체를 사용하여 마우스를 면역화시키고, 조절 인자를 생산하였다. 인간과 마우스 노텀 단백질 사이의 서열 상동성이 91%인 바, 이들 항체는 대부분 마우스 노텀 단백질과 교차 반응할 것으로 예측되었다.
인간 및 마우스 노텀 cDNA의 일과성 형질감염으로부터 생성된 정제된 노텀 항원에의 선별된 하이브리도마 유래의 마우스 mAb의 결합을 ELISA 검정법을 이용하여 테스트하였다. 당업계에 알려져 있는 기법을 사용하여 인간 및 마우스 노텀으로 ELISA 플레이트를 직접 코팅하였다. 마우스 mAb의 결합을 HRP 접합된 염소 항마우스 항체에 이어서, 비색 호스래디쉬 퍼옥시다제 기질(TMB 기질, 써모 사이언티픽)로 검출하였다. 마이크로플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 ELISA 플레이트의 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
바로 다음에서 제시하는 하기의 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 테스트된 46개의 항체 중 22개가 인간 노텀에 대해 특이적이었다:
Figure pct00002
실시예 17
SC2 . D2 .2 노텀 조절 인자의 에피토프 지도화
SC2.D2.2와 인간 노텀의 상호작용에 대한 구조적 기반을 보다 잘 이해하기 위해, 키메라 노텀 단백질을 제작하였다. 이러한 접근법은 오르토로그가 구조적으로 관련이 있다는 사실을 이용한다. 상기 목적을 달성하기 위해, 마우스 노텀(마우스 잔기 150-484)에 융합된 인간의 성숙한 노텀 단백질(잔기 19-144)(두 유전자 모두 실시예 7과 일치)의 N 말단으로 구성된 키메라 노텀 분자를 이전 실시예에 기술되어 있는 것과 유사한 방식으로 생성하고, 발현시켰다. 프레임내 융합 노텀 키메라 단백질의 구성을 위해 인간 노텀 유전자 중 BamHI 제한 절단 부위를 사용하였다. His 태깅된 키메라 노텀 서열을 포함하는 발현 벡터를 구성하였다. 키메라 노텀 분자를 테스트하고, 이는 상기 기술된 Wnt 생체검정에서 기능적으로 활성인 것으로 밝혀졌다(하기 실시예 27 참조).
ELISA 플레이트 상에 직접 코팅된 인간 노텀, 마우스 노텀 및 키메라 인간/마우스 노텀을 이용하는 ELISA 검정법을 사용하여 인간 및 마우스 노텀 cDNA의 일과성 형질감염으로부터 생성된 정제된 노텀 분자에의 SC2.D2.2 및 다른 마우스 mAb의 결합을 테스트하였다. 항노텀 mAb의 결합을 HRP 접합된 염소 항마우스 항체에 이어서, 비색 호스래디쉬 퍼옥시다제 기질(TMB 기질, 써모 사이언티픽)로 검출하였다. 마이크로플레이트 자동판독기 상에서 450 nm에서 ELISA 플레이트의 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
상기 언급된 ELISA 검정법을 통해 SC2.D2.2 항체의 인간 노텀에의, 및 노텀 키메라 단백질에의 결합을 확인하였으며, 이를 통해 SC2.D2.2 에피토프가 인간 노텀 단백질의 N 말단의 처음 135개의 잔기 내에 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 18
노텀 조절 인자는 차별적인 종 활성을 보인다
293.TCF 세포를 사용하여 정제된 SC2.D2.2 및 SC2.A106 항체를 뮤린 노텀-His 또는 마카크 노텀-Fc 활성을 중화시킬 수 있는 이의 능력에 대하여 하기와 같이 테스트하였다. 2.5 x 104개의 293.TCF 세포를 50 ㎕의 무혈청 배지 중 96 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰마다 플레이팅하였다. 23시간의 혈청 고갈 기간이 경과한 후, 다양한 농도로 노텀 단백질을 함유하는 10 ㎕의 DMEM+0.2% FBS를 다양한 농도의 정제된 항체 15 ㎕와 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 25 ㎕의 항체:노텀 혼합물을 293.TCF 세포에 첨가하였다. 1시간 경과 후, 25 ㎕의 Wnt3A 또는 대조군 L 세포 CM을 각 웰에 첨가하였다. CM 첨가 후 18시간이 경과하였을 때, 100 ㎕의 원-글로 용액(프로메가 코포레이션)을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰의 내용물을 철저하게 혼합하여 세포를 용해시키고, 100 ㎕의 용해물을 검은색 96 웰 플레이트로 옮기고, 5 min 후, 발광을 판독하였다.
실시예 16에서 알 수 있는 바와 같이, 뮤린 노텀과 교차 반응성이 아닌 것 이외에도, SC2.D2.2는 뮤린 노텀 또는 마카크 노텀의 활성을 억제시키지 않았다(도 12A). 유사하게, 항체 SC2.A106은 실시예 16에서는 뮤린 노텀과 교차 반응성을 보였음에도 불구하고 뮤린 또는 마카크 노텀의 활성을 억제시키지 않았다(도 12B).
에피토프는 성숙한 노텀 단백질의 N 말단의 처음 135개의 아미노산 잔기에 존재한다는 것, 및 마카크 노텀의 기능을 억제시키지 못하거나, 뮤린 노텀에 결합하지 못하거나, 뮤린 노텀의 기능을 억제시키지 못한다는 SC2.D2.2의 무능함을 제안한, 실시예 17의 ELISA 데이터에 따라, SC2.D2.2의 결합은 (성숙한 노텀 단백질의 출발점으로부터 번호 매김하여) Asn129의 활성을 간섭할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 도 1c의 서열 정렬을 참조할 수 있다. 즉, 마카크 및 인간 노텀의 관련 부위에서 유일의 아미노산 차이는 Asn129에 존재하는 바, 직접적인 폐색(즉, 에피토프가 에피토프를 포함), 또는 입체형태상의 변화 또는 입체 장애에 의한 상기 부위 간섭이 강력하게 제안된다.
실시예 19
노텀 조절 인자는 공배양 검정에서 Wnt 경로의 노텀 길항작용을 감소시킨다
생체내에서 노텀 생산 세포의 작용을 한층 더 자세하게 모델링하기 위해, 모체 293T 세포(293. 널) 또는 가용성 노텀을 발현하는 293T 세포(즉, 293.노텀 세포)인 효과기 세포를 다양한 비율로 리포터 293.TCF 세포와 함께 혼합하는 공배양 실험을 수행하였다. 이어서, Wnt3A CM으로 처리한 후, 상기 세포 혼합물로부터 항체의 존재하에 노텀 활성 또는 억제를 측정하였다. 간략하면, 플레이팅하기 전에 50 ㎕의 무혈청 배지 중에 세포를 혼합하여 96 웰 플레이트의 웰당 5 x 104: 2.5 x 104, 2.5 x 104: 2.5 x 104개의 세포, 또는 2.5 x 104:1.0 x 104개의 세포에 상응하는, 2:1, 1:1 및 1:2.5의 3가지 상이한 비율의 효과기 대 리포터 세포를 테스트하였다.
직접적인 공배양 실험을 위해, 23시간의 혈청 고갈 기간이 경과한 후, 최종 100 ㎕로 각 웰당 25 ㎕의 DMEM + 0.2% FBS와 함께 각 웰에 25 ㎕의 Wnt3A 또는 대조군 L 세포 CM을 첨가하였다. CM 첨가 후 18시간이 경과하였을 때, 100 ㎕의 원-글로 용액(프로메가 코포레이션)을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰의 내용물을 철저하게 혼합하여 세포를 용해시키고, 100 ㎕의 용해물을 검은색 96 웰 플레이트로 옮기고, 5 min 후, 발광을 판독하였다.
도 13A에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 경우에 있어, 모체 293T 효과기 세포와 공배양했을 때와 비교하면, 노텀을 분비하는 효과기 세포와 공배양을 통해 Wnt3A 유도성 루시퍼라제 활성 수준은 모든 비율에 있어서 더 낮아졌다. 흥미롭게도, 웰당 세포의 총 개수 감소에 따라 전반적인 루시퍼라제 활성 유도는 증가하였는데, 이는 배지 고갈 효과 또는 가능하게는 모체 293 세포 그 자체로부터 분비된 노텀의 낮은 수준에 기인한 효과를 제안한다.
항체 길항작용 실험을 위해 세포 혼합물을 최종 농도 10 ㎍/mL로 25 ㎕의 DMEM + 0.2% FBS 및 항체를 함유하는 웰 내로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 23시간이 경과하였을 때, 25 ㎕의 Wnt3A 또는 대조군 L 세포 CM을 각 웰에 첨가하였다. CM 첨가 후 18시간이 경과하였을 때, 100 ㎕의 원-글로 용액(프로메가 코포레이션)을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰의 내용물을 철저하게 혼합하여 세포를 용해시키고, 100 ㎕의 용해물을 검은색 96 웰 플레이트로 옮기고, 5 min 후, 발광을 판독하였다.
도 13B에서 알 수 있는 바와 같이, 293.널 및 293.TCF 세포의 공배양물에 SC2.D2.2 첨가는 Wnt3A CM에 의한 루시퍼라제 활성 유도에는 거의 영향을 미치지 않았다. 293.TCF 세포에 대하여 293.노텀을 공배양한 경우, SC2.D2.2 항체의 첨가를 통해 Wnt3A 유도성 루시퍼라제의 양은 증가하였으며, 이는 노텀를 억제하는 항체가 293-노텀 세포로부터 분비되고, 293.TCF 세포에 대한 이의 주변분비 효과를 차단한다는 것과 일치한다. 생체내 조건(예컨대, 노텀의 자가분비 또는 주변분비 효과)을 더욱 유사하게 모방한 실험 시스템에서 얻은 상기 결과는 본원에 개시된 노텀 조절 인자가 동물에서 노텀 매개 이벤트에 효과적으로 영향을 줄 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 20
세포 용해물 중의 노텀 단백질 검출
웨스턴 블롯 및 잠재적으로는 면역조직화학법에 의해 단백질 발현을 검출하는 마우스 단일클론 항체를 확인하고자 하는 시도로, 상이한 세포주(HepG2, SW480, K562 및 CHO)로부터의 단백질 세포 용해물을 당업계의 표준 기법을 사용하여 변성 조건하에서 NuPAGE 4-12% 비스-트리스(Bis-tris) 겔(라이프 테크놀로지스) 상에서 전개시켰다. 이어서, i블롯® 드라이 블롯팅 시스템(iBlot® Dry Blotting System)(라이프 테크놀로지스)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 단백질을 PVDF 막으로 옮겨 놓고, 막을 PBST 중의 3% BSA로 2시간 동안 차단시켰다. 1 ㎍/mL의, 뮤린 다중클론 또는 2개의 뮤린 단일클론 항체(SC2.A101 또는 SC2.A109) 중 하나로 막을 프로빙하고, 각각의 1차 차단 항체 및 2차 차단 항체 인큐베이션 사이의 10분 동안 PBST 중에서 3회에 걸쳐 세척한 후, 차단 완충제 중 1:5,000의 희석률로 희석된 AP-어피니퓨어(AP-AffiniPure) 염소 항마우스 IgG, 페이 프래그 특이(Fey Frag Specific)(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 사용하여 노텀을 검출하였다. 이어서, NBT/BCIP 기질: 알칼리성 포스파타제에 대한 즉석 침전용 기질 시스템을 사용하여 노텀을 검출하였다. 상기 기질 시스템을 통해 색상이 청색에서 보라색이 되며, 시각적으로 관찰이 가능한 불용성 NBT 디포마잔 최종 생성물이 생산된다.
세포 용해물을 프로빙하는 데 사용된 각각의 항체를 통해 SW480 용해물 중 인간 노텀이 검출되었는데, 그 크기는 단량체로서 ~50 kDa 및 다량체로서 ~125 kDa인 것으로 나타났다(도 14A-14B). 3개의 항체 모두로 프로빙하였을 때, 가능하게는 이량체화되지 않는 당형태를 나타내는 것인, ~60 kDa 범위에서의 약간 더 큰 밴드 또한 관찰되었다.
실시예 21
풀링된 다양한 조직 용해물 중에서의 차별적인 노텀 단백질 발현
이전 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 다수의 종양신생 시료에서 증진된 노텀 유전자 발현을 입증한 후, 11개의 상이한 종양 유형 또는 이의 각각의 정상적인 인접한 조직으로부터의 용해물의 두 풀링된 복제물을 포함하는 역상 단백질 확인 어레이(실시예컨대, 오리진 테크놀로지스)를 포함하며, 여기서, 노텀 단백질 발현은 마우스 다중클론 항체를 사용하여 검출하였다. 웨스턴 블롯에 의해 인간 노텀을 인식하는 SCRx2.A109 마우스 단일클론 항체를 사용하여(실시예 20), 외인성 프로모터(오리진 테크놀로지스)에 의해 구동되는 TP53을 과발현하거나, 또는 과발현하지 않는 293 세포 대조군과 함께 11개의 종양 유형 또는 이의 각각의 정상적인 인접한 조직으로부터의 432개의 조직 용해물의 4개의 희석액을 포함하는 보다 종합적인 역상 암 단백질 용해물 어레이를 수득하고, 이를 실행시켰다. 비색 검출용 시약 및 프로토콜을 프로테오스캔 어레이스(ProteoScan Arrays)(오리진 테크놀로지스)의 제조사로부터 제공받고, 평판 스캐너를 이용하여 제작된 어레이 상의 스폿을 디지털 영상으로 변환시킨 후, BZ스캔2 자바 소프트웨어(BZScan2 java Software)(http://tagc.univ-mrs.fr/ComputationalBiology/bzscan/)를 사용하여 스폿 강도를 정량하였다. 상기 기술된 바와 같이 데이터를 작성하고, 이는 스폿당 평균 픽셀 강도로 나타내었다. 플롯팅된 데이터는 각 조직 표본에 대한 개별 스폿 밀도를 나타내며, 여기서, 선은 기하 평균값을 나타낸다.
이러한 어레이로부터 얻은 결과는 도 15A-15G에 제시되어 있고, 이는 노텀 단백질의 발현이 암 환자의 특정 서브집단을 비롯한 수개의 상이한 종양 유형에서 상향조절되어 있다는 것을 나타낸다. 더욱 구체적으로, 도 15A-15G는 인간 노텀 단백질 발현 수준이 흑색종 이외에도, 유방암, 결장직장암 및 난소암을 앓는 환자 서브세트에서 상향조절되어 있다는 것을 보여준다. 또한, 노텀 단백질 발현은 췌장암 중 신경내분비 서브타입을 앓는 대부분의 환자에서 상승되어 있는 것을 나타났다(도 15B). 암 환자 중 다양한 서브세트, 특히 말기 결장직장암 환자, 및 상기 질환의 췌장 신경내분비 서브타입(섬세포 종양) 환자에서 상승되어 있는 노텀 단백질 발현은 진행성 질환 및/또는 상기 종양 유형에서의 전이를 촉진시키는 데 있어서 노텀을 역할을 제안한다.
또한, 도 15F 및 15G 상의 결과에 나타난 바와 같이, 신장 종양 및 간 종양에서도 노텀 단백질 발현이 겉보기상으로 감소되어 있다. 이러한 감소는 일반적으로 상기 질환 중 말기에서 더 크게 나타났으나, 간암 병기 IV에서는 예외적이며, 감소된 국소 노텀 수준이 종양신생 및 종양 진행에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다. 비록 담관암종 종양이 노텀은 거의 가지고 있지 않지만(도 15G), 담관암종은 담관암이며, 어떤 정상적인 담관 조직도 비교를 위한 프로테오스캔 어레이 상에는 없었다.
실시예 22
노텀 조절 인자는 노텀 유도성 세포 생존/증식을 길항시킨다
실시예 2 및 3에 기술되어 있는 바와 같이, 노텀 발현은 결장직장 종양으로부터의 종양 영구 세포에서 상승되어 있는 것으로 입증되었다. 노텀 단백질이 인간 결장직장암 세포의 세포 증식 및/또는 아포프토시스에 영향을 주는지 여부를 측정하기 위해, HCT-116 세포 또는 마우스 계통-고갈 NTX 종양 세포(즉, 인간 종양 세포)를 하기 기술하는 바와 같이 플레이팅하고, 재조합 h노텀(예컨대, h노텀-His 또는 h노텀-hFc) 및 항노텀 항체에 노출시켰다. 이어서, 12-14일 경과 후, 세포 개수를 평가하였다.
더욱 구체적으로, SCRx-CR4 또는 SCRx-CR42 종양으로부터의 마우스 계통-고갈 NTX 종양 세포를, 시험관내에서 종양신생 세포를 유지시키는 것으로 앞서 입증된 무혈청 배지 중에 20,000개의 세포/웰로 플레이팅한 후, 24시간 경과 후, 노텀 조절 인자 SC2.D2.2 또는 SC2.10B3, 또는 이소형 대조군 항체(즉, MOPC)의 존재 또는 부재하에서 재조합 인간 노텀(His 또는 hFc)을 첨가하였다. 이어서, 세포를 5% C02 및 5% 02하에 37℃에서 14일 동안 인큐베이션시키고, 프로메가의 셀타이터글로(Promega's CellTiterGlo) 검정용 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 생존가능한 세포의 개수를 평가하였다. HCT-116 세포주(상업적으로 이용가능한 결장직장 종양 세포주)의 경우, 세포를 DMEM + 1% FBS 중 웰당 2,000개의 세포로 플레이팅한 후, 24시간 경과 후, 단일클론 항체 SC2.D2.2 또는 SC2.10B3의 존재 또는 부재하에 재조합 인간 노텀을 함유하는 무혈청 DMEM을 첨가하였다. 이어서, HCT-116 세포를 5% C02하에 37℃에서 12일 동안 인큐베이션시키고, 프로메가의 셀타이터글로 검정용 키트를 사용하여 세포 생존가능성을 평가하였다. 판독값이 높을수록 생존가능한 세포 계수가 더 높다는 것을 시사한다.
다른 비처리 대조군 또는 MOPC 이소형 대조군 항체에 노출된 세포와 비교하였을 때, 환자 SCRx-CR42로부터의 마우스 계통-고갈 NTX 종양 세포의 h노텀-His(10 ㎍/mL) 노출(도 16A) 또는 SCRx-CR4의 h노텀-Fc(1 또는 10 ㎍/mL) 노출(도 16B)로 세포 계수는 20-45% 증가하였다. 대조적으로, (상승된 수준으로 노텀 유전자를 발현하는) SCRx-CR4 세포를 인간 노텀 중화 항체 SC2.D2.2(10 ㎍/mL)에 노출시켰을 때에는 적절한 MOPC 이소형 대조군 항체 처리된 세포에 비하여 유의적으로 더 적은 증식을 나타내었다(도 16B). 유사하게, 항노텀 항체 SC2.10B3(10 ㎍/mL)은 또한 비록 SC2.D2.2 만큼 효과적이지만 않았지만, 세포 개수에 대한 음성적으로 영향을 미칠 수 있었다(도 16B). 바로 앞의 관찰 결과를 통해 확인한 바, HCT-116 세포를 10 ㎍/mL의 h노텀에 노출시킴에 따라 세포 개수는 2배 초과로 증가하였다. 유의적으로, 용량의 의존성인 것으로 보이는, h노텀 노출의 결과로서 나타나는 세포 개수 증가는 항노텀 단일클론 항체 SC2.D2.2의 존재에 의해 차단되었다(도 16C). 이러한 관찰 결과는 인간 노텀 단백질(예컨대, His 또는 hFc 형태)이 세포 증식을 증가시킬 수 있고/거나, 아포프토시스를 손상시킬 수 있고, 그 결과, 상기 기술된 검정에서 세포 계수는 증가하게 된다는 것을 입증한다. 또한, 본원의 교시에 따라, h노텀 중화 단일클론 항체 SC2.D2.2는 상기 활성을 차단시킬 수 있고, 노텀 매개 증식을 손상시킬 수 있다.
실시예 23
노텀 조절 인자는 노텀 유도성 에스터라제 활성을 길항시킨다
동물 종 간에 걸쳐 발견되는 이의 오르토로그와는 별개로, 인간 노텀이 식물 펙틴 아세틸에스터라제와 가장 밀접하게 관련되어 있다. 또한 α/β 하이드롤라제 수퍼패밀리의 구성원이다. 이러한 관계는 상기 효소에 대한 가능한 생화학적 기능을 제안한다.
노텀이 카복시에스터라제 활성을 가지는지 여부를 테스트하기 위해, 정제된 재조합 h노텀-His를 표준 검정 조건을 사용하여 발색성 에스터라제 기질 p-니트로페닐 아세테이트(PNPA) 및 p-니트로페닐 부티레이트(PNPB)와 함께 인큐베이션시켰다(문헌 [West et al., PMID: 19225166]). 간략하면, PNPA 또는 PNPB를 최종 농도가 10 mM가 되도록 이소프로판올 중에 용해/희석시켰다. 상기 기질 용액을 검정용 완충제(0.1% 아라비아 검, 2.3 mg/mL 데옥시콜산나트륨, 1X PBS)에 1:10으로 희석시키고, 정의된 양의 h노텀 효소와 함께 인큐베이션시키고, 발색단 p-니트로페놀의 효소적 방출을 405 nm에서의 흡광도 측정에 의해 모니터링하였다.
도 17A에서 알 수 있는 바와 같이, 37℃에서 1시간 동안의 인큐베이션 후, h노텀의 양이 증가함에 따라 PNBA로부터의 p-니트로페놀의 방출량은 증가하였는데, 이는 노텀이 카복시에스터라제 활성을 가지고 있음을 입증하는 것이다. 추정 촉매성 친핵체가 부위 지정 돌연변이유발법에 의해 변경된 것인 돌연변이체 노텀(S232A)은 현저하게 감소된 에스터라제 활성을 나타내었다. 도 17B에 제시되어 있는 바와 같이, 뮤린 및 마카크 노텀 단백질 또한 에스터라제 활성을 나타내었다. 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))로부터의 재조합 에스터라제 또한 양성 대조군으로서 본 검정법에 포함시켰다 (도 17C). 구체적으로, 도 17C에서는 임의의 특정 시점에 h노텀은 PNPB 기질(개방형 사각형 및 점선 표시)과 비교하여 PNPA(솔리드형 검은색 사각형 및 실선 표시)로부터 방출되는 p-니트로페놀에 대해 더 강력한 신호를 발생시키는 반면, 바실러스 에스터라제는 PNPA(솔리드형 동그라미 및 실선)와 비교하여 PNPB 기질(개방형 동그라미 및 점선 표시)을 우선적으로 가수분해시키는 것으로 보인다고 제시되어 있다. 상기 데이터는 h노텀이 정량화할 수 있는 방식으로 에스터라제 활성을 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
바로 앞에서 제시한 결과는 측정된 에스터라제 활성을 이용하여 개시된 노텀 조절 인자의 특징을 추가로 규명할 수 있는 검정법을 제공할 수 있다는 것을 시사한다. 이와 관련하여, 도 18A 및 18B는 PNPA 및 PNBA 기질을 첨가하기 전, 노텀 조절 인자 SC2.D2.2와 함께 h노텀 단백질을 사전 인큐베이션시키면, 에스터라제 활성이 감소된다는 것을 입증한다. 이는 이전 실시예에서 제시된 데이터와 전체적으로 일치하며, 이는 다시 SC2.D2.2 항체의 h노텀 효소적 기능을 중화시킬 수 있는 능력을 입증한다. 더욱 구체적으로, 도 18A는 SC2.D2.2의 양은 고정된 상태이고(없거나, 10 ㎍/mL), 노텀 농도가 달라질 때의 용량 반응 곡선을 보여준다. 도 18A에서 알 수 있는 바와 같이, h노텀 수준이 증가함에 따라, 측정된 효소적 활성도 증가하였으며, 심지어, 어느 정도는 SC2.D2.2 항체가 존재하는 경우에도 증가하였다. 대조적으로, 도 18B는 h노텀의 양이 1 ㎍/mL로 고정되어 있고, SC2.D2.2의 농도가 달라질 때의, 측정된 효소적 활성의 용량 반응 곡선을 제공한다. 작성된 곡선은 노텀 조절 인자의 존재가 h노텀 효소적 활성의 양을 농도에 의존하는 방식으로 급격하게 감소시킨다는 것을 명확하게 보여준다. 대조적으로, 대조군 항체(MOPC)는 노텀의 에스터라제 활성에는 어떤 영향도 미치지 않았다(데이터 제시하지 않음).
본 실시예는 노텀의 효소적 활성에 대한 개시된 노텀 조절 인자의 영향을 측정함으로써 개시된 노텀 조절 인자의 특징을 규명하는 데 사용될 수 있는 또 다른 검정법을 입증한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
실시예 24
노텀 조절 인자는 노텀 유도성 리파제 활성을 길항시킨다
노텀의 α/β 하이드롤라제 수퍼패밀리의 구성원으로서의 특징 규명 및 이의 입증된 에스터라제 활성에 기초하여, 상기 단백질이 리파제로서의 역할도 또한 할 수 있다고 가정하였다. 단백질의 리파제 활성은 트윈 20의 지질분해를 측정하는 혼탁도측정 검정법을 사용하여 측정될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다(문헌 [Pratt et al, 2000, PMID: 10706660]). 이에, h노텀의 리파제 활성을 측정하기 위해 및 본 발명의 노텀 조절 인자의 특징을 규명하는 데 사용될 수 있는 추가의 또 다른 검정법을 제공하기 위해 트윈 20을 지질분해하는 단계를 포함하는 실험을 수행하였다.
간략하면, 재조합 h노텀(1 ㎍/웰)을 50 mM 트리스(pH 7.4), 33.3 mM CaCl2, 및 0.33% 트윈 20을 함유하는 검정용 완충제에 첨가하였다. 트윈 20의 모노라우릴기가 리파제(예컨대, h노텀)에 의해 절단되면, 유리 지방산이 Ca2 + 양이온과의 불용성 복합체를 형성하게 되고, 이로써 혼탁한 용액이 형성된다. 양성 대조군으로서, 돼지 췌장 리파제(시그마 알드리치)의 활성을 같은 검정법으로 측정하였다. 도 19는 정제된 재조합 노텀이 용량에 의존하는 방식으로 트윈 20을 절단할 수 있다는 것으로 보여주며, 이러한 측정법은 본 발명의 화합물의 특징을 규명할 수 있는 추가의 또 다른 방법을 제공한다.
이러한 효소적 특성을 이용하고, 추가로는 본 발명의 특성을 예시하기 위해, 노텀 조절 인자가 노텀의 지질분해에 미치는 효과를 측정하는 검정법을 수행하였다. 상기 목적을 달성하기 위해, 다양한 농도의 SC2.D2.2를 h노텀와 함께 설정된 기간 동안 사전 인큐베이션시킨 후, 상기 혼합물을 검정용 완충제에 첨가하고, 상기 기술된 바와 같이 생성된 효소적 활성을 측정하였다. 검정 결과는 도 20에 그래프로 제시되어 있다.
작성된 곡선은 거의 모든 농도의 노텀 조절 인자 SC2.D2.2가 돼지 효소 양성 대조군의 리파제 활성에는 심각한 영향을 미치지 않는 반면, 노텀의 리파제 활성은 실질적으로 제거한다는 것을 명확하게 보여준다. 추가로, 도 20은 음성 대조군 항체(MOPC)는 노텀의 리파제 활성 또는 돼지 췌장 리파제의 활성을 억제시키지 못했다는 것을 보여준다.
상기 결과는 개시된 노텀 조절 인자의, 노텀 단백질의 효소적 특성을 간섭하거나 파괴시킬 수 있고, 생리학적 환경에서 이의 고유의 종양신생 잠재능에도 영향을 미칠 수 있는 가능성을 지니고 있을 수 있는 능력을 명확하게 나타낸다.
실시예 25
노텀 하이드롤라제 활성 및 점 돌연변이를 포함하는 노텀 조절 인자에서의 활성 손실에 관한 형광 검정법
실시예 23 및 24에 기술된 검정법 이외에도, 형광 에스터라제 기질인 4-메틸움벨리페릴 헵타노에이트(시그마)를 사용함으로써 표준 검정 조건을 이용하여 하이드롤라제 활성을 측정할 수 있다(문헌 ([Richardson and Smith, 2007, PMID: 17620441]; [Jacks and Kircher, 1967, PMID: 5582971])). 간략하면, 4-MUH를 DMSO 중에 최종 농도 1.2 mM로 용해시켰다. 상기 기질을 검정용 완충제(0.1 M 트리스(pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.05% Brij)에 1:10으로 희석시키고, 정의된 양의 노텀 효소 또는 점 돌연변이화된 노텀 효소와 함께 인큐베이션시키고, 왈락 빅토르3 멀티라벨 카운터(Wallac Victor3 Multilabel Counter)(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 형광 분자 4-메틸움벨리페론의 효소적 방출을 모니터링하였다(355 nm 여기, 460 nm 방출).
도 21A는 야생형 인간 노텀 효소량의 증가가 293.TCF 세포의 Wnt3A에 대한 반응을 용량에 의존하는 방식으로 억제시킬 수 있다는 것을 보여준다(검정법은 실시예 14에 상세하게 기술되어 있다). 그러나, 점 돌연변이체 S232A 및 D340A는 293.TCF 세포에서 Wnt3A의 활성을 길항시킬 수 있는 어떤 능력도 보이지 않았다. 유사하게, 시간 경과에 따른 상대적인 형광 신호의 선형 증가에 의해 입증된 바, 야생형 인간 노텀(반응당 62.5 ng)은 4-MUH 기질을 가수분해시킬 수 있는 반면, S232A 및 D340A 점 돌연변이체는 4-MUH 기질을 가수분해시키지 못하는 무능함을 보였다(도 21B).
실시예 26
노텀은 Gsk3 의 상류쪽 정규 Wnt 경로의 한 단계에서 작용한다
정규(예컨대, LEF/TCF) 신호전달 경로의 단순화된 대표도가 도 22에 제시되어 있다. 일반적으로, 베타 카테닌(CTNNB1)은, (1) 세포에서 AXIN/APC/GSK3 파괴 복합체의 부분일 때, GSK3(및 도 22에는 도시되어 있지 않은 다른 키나제)에 의한 이의 인산화, 및 (2) 이어서 유비큐틴화(ubiquitination) 이후, 세포의 세포질에서 프로테오좀으로 신속하게 전환된다. Wnt 분자가 이의 수용체인 Fzd에 결합하면 Dsh의 인산화는 촉진되고, 이는 상기 복합체로부터 Axin을 동원하고, 파괴 복합체로부터 베타 카테닌을 유리시킨다. 이를 통해 베타 카테닌은 세포의 핵으로 전위될 수 있고, 그 곳에서 LEF/TCF 전사 인자와 복합체를 형성하여 Wnt 반응 유전자를 활성화시킨다. LiCl은 GSK3의 소분자 억제제(문헌 [Klein and Melton, 1996, PMID 8710892])인데, 이는 정규 Wnt 신호전달 경로와 관련하여 베타 카테닌의 안정화 및 유리를 촉진시킴으로써 Wnt 반응 유전자 하류를 활성화시킨다.
도 23에서 알 수 있는 바와 같이, Wnt3A CM 및 LiCl(40 mM), 둘 모두 293.TCF 세포에서 루시퍼라제 전사를 활성화시킨다. 인간 노텀은 Wnt3A CM을 길항시키는 반면, SC2.D2.2만 단독인 경우에는 Wnt3A CM에 기인한 루시퍼라제의 유도를 억제시키지 않았다. 그러나, SC2.D2.2는 용량에 의존하는 방식으로 인간 노텀의 활성을 억제시킴으로써 Wnt3A 유도성 루시퍼라제 발현을 회복시킬 수 있었다. 가장 중요한 것은 LiCl이 인간 노텀 및/또는 SC2.D2.2의 존재 여부와는 상관없이 루시퍼라제 리포터를 활성화시킬 수 있다는 것이며, 이는 노텀 및 조절 항체가 GSK3의 상류쪽에서 그들의 효과를 발휘한다는 것을 나타낸다.
실시예 27
SC2 . D2 .2 에피토프 중의 이의 생체활성과 관련된 중요한 잔기에 관한 서술
실시예 17에 기술된 키메라 인간/마우스 노텀 단백질을 293.TCF 검정법에 적용시켰다. 도 24A는, 비록 야생형 단백질보다는 그 효능이 낮지만, 키메라 분자가 Wnt3A CM에 의해 매개되는 루시퍼라제 유도를 억제시킬 수 있다는 것으로 보여준다. 도 24B는 이러한 활성은 SC2.D2.2로 중화될 수 있다는 것을 보여주며, 이는 SC2.D2.2의 에피토프가 노텀의 처음 144개의 잔기에 포함되어 있음을 시사하는데, 이는 실시예 17에 제시된 ELISA 데이터와 일치한다. 종합해 보면, 키메라 분자의 생체활성을 중화시킬 수 있는 SC2.D2.2의 능력, 실시예 18에 제시된 바와 같은, 다양한 종 형태의 노텀에 대한 SC2.D2.2의 활성 데이터, 및 도 1c에 제시된 서열 정렬은 인간 노텀의 D141 잔기가 SC2.D2.2의 에피토프에서 중요한 잔기일 수 있다는 것을 제안한다(도 1c에서는 성숙한 노텀 단백질의 출발점으로부터 번호 매김한 것에 기초하여 잔기 D129라고 주석인 달린 것이지만, D141이라는 주석은 야생형 인간 단백질 전구체를 고려하여 그에 기초한 것임에 주의한다).
에피토프에서 상기 잔기의 중요성을 정식으로 입증하기 위해, 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 인간 노텀 중의 상기 잔기를 마카크 잔기로(D141N) 또는 뮤린 잔기로(D141S) 점 돌연변이화시켰다. 유사하게, 상기 위치의 마카크 잔기를 인간 잔기로 점 돌연변이화시켰다(N141D). 도 25는 이들 각각의 점 돌연변이를 통해 293.TCF 검정(도 25A) 및 4-MUH 가수분해 검정(도 25B)에서 생체활성을 유지한 단백질을 생성된다는 것을 보여준다. 그러나, 이러한 점 돌연변이체는 SC2.D2.2에 의해 중화될 수 있는 이의 능력에 있어서는 차이를 보였다(도 26). 인간 잔기의 마카크 또는 뮤린 잔기로의 돌연변이는 돌연변이체 노텀 단백질을 중화시킬 수 있는 SC2.D2.2의 능력을 제거하였지만(도 26A), 마카크 단백질 잔기의 인간 잔기로의 변이(N141D)는 SC2.D2.2가 야생형 마카크 단백질을 중화시키지 못했음에도 불구하고(도 12A), 돌연변이체 단백질은 중화시킬 수 있게 하였다(도 26A). SC2.D2.2에 의한 이러한 중화 작용 패턴은 4-MUH 검정에서의 돌연변이체 단백질에 대해서도 관찰되었다: 인간 D141 잔기의 변이는 생성된 단백질(D141N, D141S)을 중화시킬 수 있는 SC2.D2.2의 능력을 제거한 반면, 마카크 잔기, N141의 변이를 통해서 항체는 돌연변이체 단백질(마카크 N141D)을 중화시킬 수 있었다. 이러한 데이터는 노텀 단백질의 생체활성을 중화시킬 수 있는 SC2.D2.2의 능력에 있어 D141 잔기의 중요성을 명확하게 입증한다.
실시예 28
노텀을 rhWnt3A 와 함께 인큐베이션시키면 Wnt 활성은 불활성화된다
Wnt3A 신호전달의 노텀 매개 길항작용의 동적 성질을 측정하기 위해, SC2.D2.2의 존재하에 재조합 노텀만 단독으로 37℃에서 2시간 동안 재조합 인간 Wnt3A(rhWnt3A: recombinant human Wnt3A)와 함께 사전 인큐베이션시킨 후, 상기 복합체를 293.TCF 세포에 첨가하였다. rhWnt3A에 의해 생성된 이러한 루시퍼라제 유도를, rhWnt3A를 첨가하기 전 2시간 동안 노텀만 단독 또는 노텀 + SC2.D2.2를 세포에 첨가한, 293.TCF 검정용 표준 프로토콜을 사용하여 관찰된 결과와 비교하였다. 도 27A에서 알 수 있는 바와 같이, 표준 검정 조건은 SC2.D2.2 부재하의 노텀은 250 ng/mL rhWnt3A에 노출된 293.TCF 세포에서 루시퍼라제 유도를 억제할 수 있고(폐쇄형 동그라미 표시), rhWnt3A 첨가 이전 노텀과 10 ㎍/mL SC2.D2.2의 인큐베이션은 rhWnt3A를 길항시키는 노텀의 능력을 차단시킨다(개방형 동그라미 표시)는 것을 나타낸다. 그러나, 293.TCF 세포에의 첨가 이전에 노텀과 rhWnt3A를 사전 인큐베이션시키는 것이 관심의 대상이 된다. 이러한 경우, 세포의 rhWnt3A에 대한 반응은 현저하게 감소하였다(폐쇄형 동그라미 표시, 도 27B). 대조적으로, rhWnt3A와의 사전 인큐베이션 이전에 노텀과 SC2.D2.2의 복합체 형성은 세포의 rhWnt3A에의 감수성을 회복시켰다(개방형 사각형 표시, 도 27B). 종합해 보면, 이러한 데이터는 노텀이 세포 표면 상에 존재하는 분자와 상호작용하는 것이 아니라, 직접 rhWnt3A를 불활성화시킬 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 29
노텀 활성의 소분자 억제
실시예 23, 24, 및 25에 제시된 연구는 노텀이 에스테르 및 지질을 가수분해시킬 수 있는 능력을 소유한다는 것을 제시하는 반면, 실시예 28에 제시된 데이터는 노텀이 rhWnt3A에 직접 작용할 수 있다는 것을 제안한다. 노텀에 대한 추정 하이드롤라제 활성과 일관되게, 상기 불활성화는 Wnt3A를 탈지질화시킬 수 있는 노텀의 능력과 관련이 있다고 가정할 수 있다. 2개의 지질, Cys77의 포화된 팔미테이트 쇄, 및 S209의 불포화된 팔미토일 쇄가 Wnt3A에 연결되어 있는 것으로 알려져 있다(문헌 [Lorenowicz and Korswagen, 2009, PMID: 19559695]). 두 지질 쇄 모두 Wnt3A 분비 뿐만 아니라, 신호전달에도 중요한 것으로 제안되었다(문헌 [Franch-Marro et al, 2008, PMID: 18430784]). 팔미테이트에는 Cys77에서 티오에스테르 연결부를 통해 Wnt3A에 연결되어 있기 때문에, 노텀은 공지된 티오에스터라제 효소의 억제제에 의해 불활성화될 수 있는 것으로 제안될 것이다. 그러한 소분자로는 오를리스타트(제니칼(Xenical)®)가 있는데, 이는 다중서브유니트 효소 지방산 신타제의 티오에스터라제 서브유니트를 억제시키는 것으로 밝혀져 있다([Kridel et al, 2004, PMID: 15026345]). 이에, 다양한 양의 4-MUH 기질(240 μM 또는 90 μM) 및 오를리스타트(0 - 170 μM)의 존재하에서 실시예 25에 기술된 4-MUH 검정법을 수행하였다. 도 28에서 알 수 있는 바와 같이, 오를리스타트는 용량에 의존하는 방식으로 4MUH에 대한 노텀의 가수분해 활성을 억제시키는데, 이는 노텀을 억제시킬 수 있는, 소분자 및 공지의 리파제 억제 약물, 둘 모두의 능력을 입증한다.
실시예 30
노텀과의 인큐베이션에 따른 반응으로 일어나는 Wnt3A 의 물리적 작용 변화
노텀이 Wnt3A에 직접 작용하여 상기 단백질을 탈지질화시킨다면, 이러한 절단을 통해서 단백질의 소수성은 바뀌어야 하고, 이는 트리톤 X114 분배 검정에서 수성 상 및 계면활성제 상 사이의 이의 분배 작용의 변화에 의해 측정될 수 있다(문헌 [Bordier, 1981, PMID: 6257680]): 지질화된 Wnt3A는 수성 상에서 발견되는 반면, 탈지질화된 Wnt3A는 수성 상에서 출현하여야 한다(문헌 [Willert et al., 2003, PMID: 12717451]). 노텀의 효소적 특성을 입증하기 위해 0.1% BSA(R & D 시스템즈(R & D Systems)) 중 1.5 ㎍의 rhWnt3A를 250 ng의 노텀과 함께 실온에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 동량의 4.5% 트리톤 X114를 상기 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 얼음상에서 인큐베이션시키고, 이어서, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 실온에서 5분 동안 2,000 x g로 원심분리를 사용하여 상을 분리시켰다. 분리 후, 각 시료를 조정하여 이온 강도 및 트리톤 X114 함량을 조정한 후, PAGE 전기영동에 의해 분취량을 분석하였다. 겔을 전개시킨 후, 항rhWnt3A 항체(셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)를 사용하여 면역블롯팅하기 위해 단백질 밴드를 막으로 옮겨 놓았다. 수퍼시그날 웨스트 피코 케미루머네슨트(SuperSignal West Pico Chemi발광) 기질(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))을 사용하여 밴드를 시각화하였다.
도 29a에 제시된 블롯에서 알 수 있는 바와 같이, 노텀의 부재하에서 rhWnt3A는 수성 상이 아닌(레인 5), 오직 트리톤 X114 상에서만 나타났다(레인 6). 대조적으로, rhWnt 3A를 노텀과 함께 인큐베이션시킨 결과, rhWnt3A는 트리톤 X114 레인(레인 9) 뿐만 아니라, 수성 상(레인 8)에도 출현하였다. 이러한 데이터는 Wnt3A를 탈지질화시킬 수 있는 노텀의 능력을 시사한다. 그러나, 본 실험 조건하에서 상기와 같은 탈지질화는 불완전할 수 있는 바, 이에 트리톤 X114 상에 일부 rhWnt3A가 잔류하는 것이 관찰될 수 있다.
노텀이 초파리에서 소닉 헤지호그(Shh: Sonic hedgehog)의 조절과 연관이 있다는 것 또한 관심의 대상이 된다(문헌 [Ayers et al, 2010, PMID: 20412775]). Shh는 구체적으로 성숙한 단백질 N 말단의 Cys24의 알파 아미노기를 통해 에스테르화된 팔미트산 쇄를 함유하는, 또 다른 지질 변형된 단백질이다(문헌 [Pepinsky et al, 2008, PMID: 9593755]). 따라서, 앞서 기술된, 노텀과 헤지호그 신호전달 경로와의 유전적 상호작용 또한, 이의 신호전달 특성의 조절 이상을 일으켜 그 결과로서 발암을 촉진시키는 효과를 발휘하는, 헤지호그 단백질의 리파제 기반 탈지질화를 반영할 수 있다.
도 29b에 제시된 바와 같이, rhWnt3A의 물리화학적 작용을 변경시킬 수 있는 입증된 노텀의 능력은 노텀 조절 인자 SC2.D2.2에 의해 차단될 수 있는 임의의 경우에서, 레인 1은 rhWnt3A에 대한 양성 분자량 마커인 반면, 각 분취량의 시약의 존재 또는 부재는 각 레인 상에 표기되어 있다(여기서, a는 수성 분획이고, t는 트리톤 X114 분획이며, 슬라이딩 막대는 노텀 조절 인자의 농도를 나타내는 것이다). 또한, 비처린 rhWnt3A는 수성 상이 아닌(레인 2), 트리톤 X114 상(레인 3)에서만 나타났다. h노텀-Fc와 밤새도록 인큐베이션시킨 결과, 추가로 rhWnt3A는 수성 상에 재분포하였다(레인 4 및 5 비교). h노텀-Fc가 먼저 SC2.D2.2와 사전 인큐베이션되었다면, 상기와 같은 재분포는 차단될 수 있다(각각 레인 6 및 7 대 레인 4 및 5 비교). 차단 효과는 SC2.D2.2의 사용량에 의존하는데, SC2.D2.2의 양이 많을수록 트리톤 X114 상이 보유하는 rhWnt3A의 양은 더 많아지게 된다(레인 7 및 9 비교). 재분포 차단 또한 노텀 조절 인자의 특이성에 의존하는데; h노텀-Fc가 먼저 대조군 단일클론 항체, MOPC와 사전 인큐베이션된 경우에는, 재분포 차단은 관찰되지 않았다(레인 10 및 11).
실시예 31
인간, 뮤린 및 원숭이 노텀 조절
상기에서 입증된 바와 같이, 단일클론 항체 SC2.D2.2는 뮤린 또는 마카크 버전의 단백질이 아닌, 인간 버전의 노텀을 특이적으로 억제시키는 것으로 밝혀졌다. 상기 실시예 14에 기술된 293.TCF 검정법을 사용하여 마우스 및 마카크 노텀을 억제시킬 수 있는 이의 능력에 관하여 인간 노텀의 제2 단일클론 항체 조절 인자인 SC2.D16의 특징을 규명하였다. 도 30에 제시되어 있는 바와 같이, SC2.D16은 유사한 효능으로 인간 및 원숭이 노텀을 억제시켰고, 영장류의 노텀 단백질 중 어느 것보다도 뮤린 노텀에 대하여 약간 더 큰 효능을 가질 수 있었다.
실시예 32
단일클론 항체 노텀 조절 인자의 인간화
컴퓨터 지원 CDR 이식 방법(아비시스 데이터베이스(Abysis Database: UCL 비지니스 픽.(UCL Business Pic.)) 및 표준 분가 공학 기법을 사용하여 뮤린 항체 SC2.D2.2를 인간화함으로써 hSC2.D2.2 조절 인자를 수득하였다. 가변 영역의 인간 골격 영역은 마우스 골격 서열과의 이의 최고 서열 상동성 및 이의 정규 구조에 기초하여 선택하였다. 분석 목적으로, 각각의 CDR 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 코티아 등의 번호매긴에 따라 수행하였다. 최적의 인간화된 항체를 생성하기 위해 수개의 인간화된 항체 변이체를 제조하였다. 평가 목적으로 전체 뮤린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 버전의 뮤린 항체를 제작하였다.
당업계에 공지되어 있는 기법을 사용하여 분자 공학 방법을 수행하였다. 상기 목적을 달성하기 위해, 제조사의 프로토콜(트리졸® 플러스 RNA 정제 시스템(Trizol® Plus RNA Purification System), 라이프 테크놀로지스)에 따라 SC2.D2.2 하이브리도마로부터 전체 mRNA를 추출하였다. 완전 마우스 레퍼토리를 표적하도록 디자인된, 32개의 마우스 특이 5' 리더 서열 프라이머를 포함하는 프라이머 믹스를 3' 마우스 Cγ1 프라이머와 조합하여 사용함으로써 SC2.D2.2 중쇄의 가변 영역을 증폭시키고 서열 분석하였다. 유사하게, 마우스 카파 불변 영역에 특이적인 단일 역방향 프라이머와 조합된 Vκ 마우스 패밀리 중 각각을 증폭시키도록 디자인된 32개의 5' Vκ 리더 서열 프라이머 믹스를 사용하여 카파 경쇄를 증폭시키고 서열 분석하였다. 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 사용하여 100 ng의 전체 RNA로부터 VH 및 VL 형질전환체를 증폭시켰다.
SC2.D2.2 하이브리도마에 대하여 총 8회의 RT-PCR 반응을 수행하였는데: 그 중 4회는 V 카파 경쇄에 대한 것이고, 4회는 V 감마 중쇄(γ1)에 대한 것이었다. 증폭을 위해 퀴아젠 원스텝 RT-PCR용 키트를 사용하였다(퀴아젠, 인코퍼레이티드). 특이 V 영역 프라이머를 사용하여 추출된 PCR 생성물을 직접 서열 분석하였다. IMGT를 사용하여 뉴클레오티드 서열에 대해 분석함으로써 최고의 서열 상동성을 가진 생식계열 V, D 및 J 유전자 구성원을 확인하였다. V-BASE2를 사용하고, 마우스 생식계열 데이터베이스에 대해 VH 및 VL 유전자를 정렬함으로써 유도된 서열을 Ig V 및 J 영역의 공지된 생식계열 DNA 서열과 비교하였다.
서열 분석: 뉴클레오티드 서열 정보로부터 SC2.D2.2의 중쇄 및 경쇄의 V, D 및 J 유전자 세그먼트에 관한 데이터를 획득하였다. 재조합 마우스 D2 단일클론 항체의 클로닝을 위해, 서열 데이터에 기초하여, SC2.D2.2의 Ig VH 및 Vκ 쇄의 리더 서열에 특이적인 새로운 프라이머 세트를 디자인하였다. 이어서, V-(D)-J 서열을 마우스 Ig 생식계열 서열과 함께 정렬하였다. SC2.D2.2의 중쇄 유전자는 IGHV5-17, DQ52a.1 및 JH1로서 확인되었다. 경쇄 유전자는 V 카파 IGKV3-12 및 J카파5, 생식계열 유전자 패밀리로부터의 것이었다.
수득된 중쇄 및 경쇄 서열을 기능성 인간 가변 영역 서열에 대해 정렬하였다. 인간 VH3-48 및 Vκ A19 생식계열 서열에 대한 서열 상동성은 81%이고, 동일성은 62%인 것으로 각각 나타났다. 이러한 생식계열을 인간화된 SC2.D2.2 mAb에 대한 인간 골격으로 선택하였다. 일반적으로 인간 및 마우스 서열에서 발견되는 코돈을 사용하여 인간화된 VL 및 VH의 단백질 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 디자인하였다. 각 V 유전자의 합성 DNA 단편을 합성하였다.
도 31A 및 31B에는 각각 뮤린 SC2.D2.2 V 도메인(하부 서열 - 서열 번호: 56 및 58)과 함께 정렬된 인간화된 SC2.D2.2 중쇄(도 31A) 및 경쇄(도 31B) V 도메인(상부 서열 - 서열 번호: 331 및 332)의 서열이 제시되어 있다. 수직선 마크는 뮤린 및 인간화된 버전에서 아미노산이 동일하다는 것을 나타내는 것이다. 코티아 등에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄로 표시되어 있다. 일단 가변 영역을 생성한 후, 추가의 특징 규명을 위해 인간화된 및 키메라 항체를 제조하였다.
항체 생산을 위해, 뮤린 및 인간화된 가변 유전자 PCR 생성물의 인간 면역글로불린 발현 벡터로의 방향성 클로닝에 착수하였다. Ig 유전자 특이 PCR에 사용된 프라이머 모두 제한 부위(IgH인 경우, AgeI 및 XhoI, IgK인 경우, XmaI 및 DraIII)를 포함하였는데, 이를 통해 각각 인간 IgG1, 및 IGK 불변 영역을 포함하는 발현 벡터로의 방향성 클로닝을 수행할 수 있었다. 간략하면, PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제용 키트(퀴아젠 인코퍼레이티드)로 정제한 후, 각각 AgeI 및 XhoI(IgH), XmaI 및 DraIII(IgK)로 분해하였다. 분해된 PCR 생성물을 정제한 후, 발현 벡터로 결찰시켰다. 결찰 반응은 총 부피 10 ㎕로 200U T4-DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), 7.5 ㎕의 분해되고 정제된 유전자 특이 PCR 생성물 및 25 ng 선형화된 벡터 DNA를 사용하여 수행되었다. 열 쇼크를 통해 42℃에서 적격 E. 콜라이 DH10B 박테리아(라이프 테크놀로지스)를 3 ㎕의 결찰 생성물로 형질전환시키고, 이를 암피실린 플레이트(100 ㎍/mL) 상에 플레이팅시켰다. 이어서, VH 영역의 AgeI-EcoRI 단편을 pEE6.4HuIgG1 발현 벡터의 동일 부위 내로 삽입하고, 동시에 합성 XmaI-DraIII Vκ 삽입체를 각 pEE12.4Hu-카파 발현 벡터의 XmaI-DraIII 부위로 클로닝하였다.
293펙틴을 사용하여 적절한 플라스미드로 HEK 293 세포를 형질감염시킴으로써 인간화된(즉, hSC2.D2.2) 항체 및 키메라 SC2.D2.2 항체를 생산하는 세포를 생성하였다. 이와 관련하여, 플라스미드 DNA를 QIA프렙 스핀 칼럼(QIAprep Spin columns)(퀴아젠)으로 정제하였다. 인간 배아 신장(HEK: Human embryonic kidney) 293T(ATCC 번호 CRL-11268) 세포를 10% 열 불활성화된 FCS, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린 G(이들 모두 라이프 테크놀로지스로부터 입수)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 중에 표준 조건하에 150 mm 플레이트(팔콘(Falcon), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에서 배양하였다.
일과성 형질감염을 위해, 세포를 80% 컨플루언시까지 성장시켰다. 동량의 IgH 및 상응하는 IgL 쇄 벡터 DNA(각각의 벡터 DNA 12.5 ㎍)를 1.5 mL 옵티 MEM 중 50 ㎕ HEK 293 형질감염 시약과 혼합된 1.5 mL 옵티 MEM에 첨가하였다. 상기 믹스를 실온에서 30 min 동안 인큐베이션시키고, 배양 플레이트에 고르게 분포시켰다. 형질감염 후 3일 경과하였을 때, 상청액을 수거하고, 10% FBS로 보충된 20 mL의 새 DMEM으로 대체하고, 형질감염 후 6일 경과하였을 때 다시 수거하였다. 10 min 동안 800 x g으로 원심분리하여 배양 상청액을 세포 잔해로부터 제거하고, 4℃에서 보관하였다. 재조합 키메라 및 인간화된 항체를 단백질 G 비드(GE 헬쓰케어)로 정제하였다.
실시예 33
단일클론 항체 노텀 조절 인자의 특징 규명
인간화된 SC2.D2.2를 뮤린 가변 영역을 포함하는, 그와 유사한 mAb와의 비교로 인간화된 SC2.D2.2의 친화성에 대한 특징을 규명하는 데 3가지 방법을 사용하였다. 첫번째 방법으로, ELISA 포맷으로 일련의 항원 희석액에 대해 프로빙된 고정량의 항체에 대한 결합 신호를 측정하였다. 측정된 신호 수준은 실질적으로 유사하였다 (데이터는 나타내지 않음). 두번째 방법으로, 비아코어에 의해 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 뮤린 SC2.D2.2의 친화도를 측정함으로써 도 32A에 제시된 결과를 제공하였다. 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125 nM인 일련의 농도에 기초하고, 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여, 항원에의 항체 결합의 Kd는 0.1 nM 미만인 것으로 추정되었다. 이러한 상호작용의 오프 속도가 길기 때문에, 동적 성질을 통해 친화도를 정확하게 측정하기는 어려웠다. 이어서, 250, 125, 및 62.5 nM인 일련의 농도를 가진 항원을 이용하여 포르테바이오 레드(포르테바이오, 인코퍼레이티드) 상에서 바이오층 간섭계 분석을 사용하여 뮤린 항체를 인간화된 유도체와 직접 비교하였다. 도 32B(뮤린 가변 영역) 및 도 32C(인간화된 가변 영역)에서 알 수 있는 바와 같이, 각 항체는 우수한 친화도를 보였고, 거의 동일한 결합 곡선을 보였다. 곡선이 유사하다는 것은 인간화 과정이 유도체화된 항체의 동정 성질에 어떤 유해한 영향도 미치지 않았다는 것을 시사한다는 것을 이해할 것이다.
실시예 34
노텀 조절 인자는 진단제로서 사용될 수 있다
본원의 교시에 따라, 개시된 노텀 조절 인자는 환자로부터 유래된 생물학적 시료 중 노텀과 관련된 바이오마커를 검출하기 위한 진단제로서 사용될 수 있다.
노텀은 어느 정도로 분비되는 것으로 알려져 있으며, 세포외 체액 중의 가용성 분자로서 또는 세포외 기질과의 회합에 의해 이웃 세포 상에서 주변분비 양식으로 작용할 수 있다. 그러한 특성을 보일 경우, 노텀은 특정 질환 병증에서 체액, 예컨대, 혈청 또는 혈장 중에서 검출될 수 있고, 그러므로, 진단 목적으로 유요할 수 있거나, 또는 질환에 대한 생체마커로서의 역할을 할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면을 확인하기 위해, 도 33A에 제시된 샌드위치 ELISA 포맷을 사용하여 항노텀 항체를 이용함으로써 표준 곡선을 작성하였다. 이어서, 작성된 곡선을 사용하여 도 33B에 제시된 난소암을 앓는 환자 및 건강한 피험체로부터 수득된 혈장 시료 중의 노텀 수준을 정량하였다.
더욱 구체적으로, 뮤린 SC2.D2.2를 50 mM 탄산나트륨 완충제(pH 9.6) 2 ㎍/ml로 표준 ELISA 플레이트 상에 흡착시켰다. 0.05% (v/v) 트윈 20(PBST)을 함유하는 PBS로 플레이트를 세척한 후, 주변 온도에서 2시간 동안 2% (w/v) 우혈청 알부민(BSA 완충제)을 함유하는 PBS 중에서 플레이트를 차단시켰다. 플레이트의 내용물을 털어 내고, BSA 완충제 중 희석된 환자 시료 또는 다양한 농도의(즉, 표준 곡선을 제공하는) 정제된 재조합 노텀-His를 주변 온도에서 최소 2시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 PBST 중에서 세척한 후, BSA 완충제 중 0.5 ㎍/ml로 비오틴에 접합된 노텀 특이 마우스 다중클론 항체를 첨가하였다. 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 PBST로 다시 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제(잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))에 접합된 스트렙트아비딘의 1:2,000 희석액과 함께 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 모두 PBST로 세척한 후, 100 ㎕ TMB 기질(써모 사이언티픽)을 웰에 첨가하고, 암실에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 100 ㎕/웰로 2 M 황산을 첨가함으로써 색상 반응을 종결시켰다. 표준 플레이트 판독기를 사용하여 모든 웰에서 OD 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 33A의 표준 곡선으로부터 외삽된 값을 사용하여, ELISA 샌드위치 포맷을 통해 환자 혈장 시료 중 노텀 피분석물의 농도에 관해 감도로 검출할 수 있다. 더욱 특히, 도 33B는 건강한 성인(n=12) 및 질환 병기가 2-4인 난소암 환자군(n=7)으로부터 유래된 혈장 시료 중의 유도된 노텀 피분석물의 농도를 보여준다. 상기 데이터는 건강한 성인의 혈장 시료 중의 평균 노텀 농도는 대략 8.6 ± 10.3 ng/ml인 반면, 난소암 환자에서의 노텀 농도는 36.5 ± 25.2 ng/ml로 유의적으로 더 높게 나타났다는 것을 보여준다. 이러한 결과를 통해 개시된 본 발명의 조절 인자가 신생물성 장애를 검출 및/또는 모니터링하기 위한 진단제로서 효과적으로 작용할 수 있다는 것이 입증되었다.
본 발명은 본 발명의 정신 또는 중심이 되는 속성으로부터 벗어남 없이 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다는 것을 당업자는 추가로 이해할 것이다. 본 발명의 상기 설명은 단지 이의 예시적인 실시양태만을 개시한다는 점에서, 다른 변형도 본 발명의 범주내 포함되는 것으로서 고려된다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명은 본원에서 상세하게 기술된 특정 실시양태로 제한되는 것이 아니다. 더 정확히 말하면, 본 발명의 범주 및 주제를 나타내는 바와 같이, 첨부된 특허청구범위를 참조하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> STEM CENTRX, LLC <120> NOTUM MODULATORS AND METHODS OF USE <130> 11200.0003-00304 <140> <141> <150> 61/510,413 <151> 2011-07-21 <150> 61/388,552 <151> 2010-09-30 <150> 61/380,181 <151> 2010-09-03 <150> 61/377,882 <151> 2010-08-27 <160> 334 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgggccgag gggtgcgcgt gctgctgctg ctgagcctgc tgcactgcgc cgggggcagc 60 gagggcagga agacctggcg gcgccggggt cagcagccgc ctcctccccc gcggaccgag 120 gcggcgccgg cggccggaca gcccgtggag agcttcccgc tggacttcac ggccgtggag 180 ggtaacatgg acagcttcat ggcgcaagtc aagagcctgg cgcagtccct gtacccctgc 240 tccgcgcagc agctcaacga ggacctgcgc ctgcacctcc tactcaacac ctcggtgacc 300 tgcaacgacg gcagccccgc cggctactac ctgaaggagt ccaggggcag ccggcggtgg 360 ctcctcttcc tggaaggcgg ctggtactgc ttcaaccgcg agaactgcga ctccagatac 420 gacaccatgc ggcgcctcat gagctcccgg gactggccgc gcactcgcac aggcacaggg 480 atcctgtcct cacagccgga ggagaacccc tactggtgga acgcaaacat ggtcttcatc 540 ccctactgct ccagtgatgt 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ggcttcgaca tgcagacggt ggcccagccg 1440 cagggactgg agcccagtga gctgctgggg atgctgagca acggaagcta g 1491 <210> 2 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Arg Gly Val Arg Val Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu His Cys 1 5 10 15 Ala Gly Gly Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln Gln 20 25 30 Pro Pro Pro Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln Pro 35 40 45 Val Glu Ser Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met Asp 50 55 60 Ser Phe Met Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro Cys 65 70 75 80 Ser Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu Asn 85 90 95 Thr Ser Val Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys 100 105 110 Glu Ser Arg Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly Trp 115 120 125 Tyr Cys Phe Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr Asp Thr Met Arg 130 135 140 Arg Leu Met Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr Gly 145 150 155 160 Ile Leu Ser Ser Gln Pro Glu Glu Asn Pro Tyr Trp Trp Asn Ala Asn 165 170 175 Met Val Phe Ile Pro Tyr Cys Ser Ser Asp Val Trp Ser Gly Ala Ser 180 185 190 Ser Lys Ser Glu Lys Asn Glu Tyr Ala Phe Met Gly Ala Leu Ile Ile 195 200 205 Gln Glu Val Val Arg Glu Leu Leu Gly Arg Gly Leu Ser Gly Ala Lys 210 215 220 Val Leu Leu Leu Ala Gly Ser Ser Ala Gly Gly Thr Gly Val Leu Leu 225 230 235 240 Asn Val Asp Arg Val Ala Glu Gln Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Pro Ala 245 250 255 Ile Gln Val Arg Gly Leu Ala Asp Ser Gly Trp Phe Leu Asp Asn Lys 260 265 270 Gln Tyr Arg His Thr Asp Cys Val Asp Thr Ile Thr Cys Ala Pro Thr 275 280 285 Glu Ala Ile Arg Arg Gly Ile Arg Tyr Trp Asn Gly Val Val Pro Glu 290 295 300 Arg Cys Arg Arg Gln Phe Gln Glu Gly Glu Glu Trp Asn Cys Phe Phe 305 310 315 320 Gly Tyr Lys Val Tyr Pro Thr Leu Arg Cys Pro Val Phe Val Val Gln 325 330 335 Trp Leu Phe Asp Glu Ala Gln Leu Thr Val Asp Asn Val His Leu Thr 340 345 350 Gly Gln Pro Val Gln Glu Gly Leu Arg Leu Tyr Ile Gln Asn Leu Gly 355 360 365 Arg Glu Leu Arg His Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Ser Phe Ala Pro 370 375 380 Ala Cys Leu Ser His Glu Ile Ile Ile Arg Ser His Trp Thr Asp Val 385 390 395 400 Gln Val Lys Gly Thr Ser Leu Pro Arg Ala Leu His Cys Trp Asp Arg 405 410 415 Ser Leu His Asp Ser His Lys Ala Ser Lys Thr Pro Leu Lys Gly Cys 420 425 430 Pro Val His Leu Val Asp Ser Cys Pro Trp Pro His Cys Asn Pro Ser 435 440 445 Cys Pro Thr Val Arg Asp Gln Phe Thr Gly Gln Glu Met Asn Val Ala 450 455 460 Gln Phe Leu Met His Met Gly Phe Asp Met Gln Thr Val Ala Gln Pro 465 470 475 480 Gln Gly Leu Glu Pro Ser Glu Leu Leu Gly Met Leu Ser Asn Gly Ser 485 490 495 <210> 3 <211> 351 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 3 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agatactgga taagctgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagat ttttatcctg gtagtggtag aaccgactac 180 aatgagaagt tcaagaccaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagagacggt 300 cacggcgagg gtgactactg gggccagggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 4 <211> 117 <212> 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ataaaacgg 339 <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 7 caggtccaac tgcagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt taagcagagg 120 cctggacgag gccttgagtg gattggaagg attgatccta atcgtggtgg ttctaagttc 180 aatgagaagt tcaagaccaa ggccacactg actgtagaca aaccctccag cacagcctac 240 atgcagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtgc aagagattct 300 tacgggccct acttagacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Ser Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Gly Pro Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 9 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctttg gtgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 ccggtggagg aggaggatgc 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atggagttcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attattgtac aaatgaaggg 300 acgttctggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339 <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Ile Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Asn Glu Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 13 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 13 gacattgtac tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctccagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgtagat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatt ctgcatccga tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttat tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcacc aaagtaatga ggatccattc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggagata aaacgg 336 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 14 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 15 <211> 360 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 15 caggtccaac tgctgcagcc tgggtctgtg ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacattcacc agctactgga tgcactgggt gaagcggagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag atttatccta ataatggtcg gactacctac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 gtggatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attcctgtgc aagagggctc 300 tactatgatt acgactggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 17 <211> 342 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 17 gacattatga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 ctgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacgtggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaagtgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga ggacctggca gtttatcact gtcagcaata ttatcgctat 300 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg 342 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 18 Asp Ile Met Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr His Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 19 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 19 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctaatggcgc cctcacagag cctgtccatc 60 acatgcactg tctcagggtt ctcgttaacc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120 cctggaaagg gtctggagtg gctgggagta atttgggctg gtggaagcac agactataat 180 tcaactctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagtca agttttcata 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa acagaatagg 300 tacgacggga tctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 20 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Ile 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Asn Arg Tyr Asp Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 345 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 21 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgacctgca cgtccagtca gagcctttta tttagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctgg tttcctgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tggaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 cctccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaaatca aacgg 345 <210> 22 <211> 115 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Arg 115 <210> 23 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 23 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tacactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaacggtcg tactaactac 180 aatgagaact tcacgagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcatctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtcc attactgtgc taggaattat 300 ggtaactacc ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Thr Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Gly Asn Tyr Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 25 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctac ttgtctgtat ctctaggagg cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ccacattaat aattggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ctccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 27 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 27 caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60 acctgcacag tctctggttt ctcattaact aattatggtg tacactgggt tcgccagtct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atgtggagtg gtggaagcac agactataat 180 gtagctttca tatccagact gagcatcagc aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240 aaaatgaaca gtctgcaagc tgatgacaca gccatatatt actgtgccag aagcccctat 300 agtaattatg actactttga ctactggggc cgaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 28 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Met Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Val Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Pro Tyr Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 29 gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120 ggaaattttc ctaaactttt gatctttaag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180 aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcaa cctgcagcct 240 gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atcctctgac gttcggtgga 300 ggcacccagc tggagatcaa a 321 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 30 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Phe Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 31 caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180 aatggaaatc tcaaggggaa agccacactg actgcagaca gatcctccag cacagcctac 240 atccagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacagctc 300 gggctacctt atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 32 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Leu 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 324 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 33 gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60 atcacttgcc atgcaagtca ggacattagc agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca 120 gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcaccag cctggaatct 240 gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 34 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 35 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 35 gacgtgaagc tggtggagtc tggggaaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggtgatta catctactat 180 gcagacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagaggat 300 ggttattact ctactatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 36 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 36 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Asp Gly Tyr Tyr Ser Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 324 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 37 gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcagccagat tggtagatgg ggtcccatcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtat 240 gaagatatgg gagtttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324 <210> 38 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 38 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ala Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 39 <211> 351 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 39 caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60 acttgcactg tctcggaatt ttcattaaat agctatggtg ttcaatgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggctg gtggaatcac aaattataat 180 tcggctctca tgttcagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag gagttataat 300 tacgacgtcg tgtttgctta ctggggccaa gggactttgg cccctgtctc t 351 <210> 40 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 40 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Glu Phe Ser Leu Asn Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Phe Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Tyr Asn Tyr Asp Val Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Ala Pro Val Ser 115 <210> 41 <211> 345 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 41 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttaca 60 atgagttgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 cctccgtaca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa aacgg 345 <210> 42 <211> 115 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 42 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Arg 115 <210> 43 <211> 351 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 43 caggtccaat tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggctt cacgttcatc agctactgga tgaactgggt taagcagagg 120 cctgagcaag gccttgagtg gattggaagg attgatcctt acgatagtga aactcactac 180 aatcaaattt tcaaggacaa ggccatattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagacgcggc 300 ctgcactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 44 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 44 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Ile Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Leu His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 334 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 45 atgttttgat gacccaaact ccactctccc tgcctgtcag tcttggagat caagcctcct 60 ctcttgcaga tctagtcaga acattgtaca tagtaatgga aacacctatt tagaatggac 120 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgatttctg 180 gggtcccaga cagggtcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc aagatcgcag 240 agtggaggct gaggatctgg gagtttatta ctgctttcaa ggttcacatg ttccattcac 300 gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa acgg 334 <210> 46 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 46 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 47 <211> 351 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 47 caggtccagc tgcagcaatc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggcta tatcttcaca aacttctata tacattgggt gaaacagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggatat atttatccta gagatggtaa tactaattac 180 aatgagaact tcaagggcaa ggccacactg actgcggaca catcctccac cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagagggggc 300 tgggacgact ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc t 351 <210> 48 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Trp Asp Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 49 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 49 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gaccattgtt cacagaagtg gaagcaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgg 339 <210> 50 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 50 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Arg 20 25 30 Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 51 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 51 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt aaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagtg attgatccct ctgacagtta tagtaactac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccaa cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatatggt 300 gggacgggct atggtatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Gly Thr Gly Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 53 gactttgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctaggaca gagggccacc 60 atatcctgcc aagccagcga aggtgtcagt tttgctggtt caagtttaat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 ggagtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgagtcag acttcactct caccatcgat 240 cctgtggagg aagatgatgc tgcaatgtat tactgtatgc aaagtatgga agatccattc 300 acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgg 336 <210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 54 Asp Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Gly Val Ser Phe Ala 20 25 30 Gly Ser Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Met 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 55 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 55 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaaatc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatat attagtagta gtactgtgac cacctactat 180 gcggacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaacaa caccctgttc 240 ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgttc aagacaaaac 300 tgggacggag ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 56 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 56 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Thr Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gln Asn Trp Asp Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 57 gacattgtgc tgacacagtc tcttgcttcc ttagctgttt ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcttctggct atagttatat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtagggc gcttccgctc 300 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgg 336 <210> 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ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 60 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 60 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 324 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca acagaaacag 120 ggaaaatctc ctcggctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatcg 180 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 240 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324 <210> 62 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 62 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ile Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 63 <211> 342 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 63 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgt tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg gctgtagaca agtcctccac cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgagggt tctgcagtct attactgtgc aagaggggcc 300 tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342 <210> 64 <211> 115 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 64 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala 115 <210> 65 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 65 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 120 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt gggtcaggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339 <210> 66 <211> 116 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 66 Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val 1 5 10 15 Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 20 25 30 Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro 35 40 45 Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 50 55 60 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 80 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Glu Ile Lys Arg 115 <210> 67 <211> 351 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 67 caagtaactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcactcattt ggtgggatga tgataaatac 180 tataacccat ccctgaagag ccagctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggta 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgttcgaact 300 tatggttact atgagagctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 68 <211> 117 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 68 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Thr Tyr Gly Tyr Tyr Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 69 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 69 gatgttgtga tgccccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcgc actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300 cagacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339 <210> 70 <211> 113 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 70 Asp Val Val Met Pro Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 71 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 71 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ttggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacattcact gactactaca tgcactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggatat atttatccta acaatggtgg taatggctac 180 aaccagaagt tcaagggcag ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagacggggg 300 gccactgggt tctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 72 <211> 118 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 72 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Asn Gly Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Ala Thr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 321 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 73 gacatccaga tgactcagtc tccagactcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtga aaatatttac agtactttag catggtatca gcagacaccg 120 ggagaatctc ctcagctcct ggtctatact ggaacaaatt tagcagataa tataccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattctctga agatcaaaag tctgcagcct 240 gaggattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttatggta cggtcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg aactgaaacg g 321 <210> 74 <211> 107 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Thr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Glu Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Thr Gly Thr Asn Leu Ala Asp Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Tyr Gly Thr Val Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 75 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 75 caggttcagc tgcagcagtc tggggatgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cctctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaagtac 180 aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctaac atctgcggac tctgcggtct atttctgtgc ggggccccac 300 tggtacctcg atgtctgggg cgcagggacc acggtcaccg tctcctca 348 <210> 76 <211> 116 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 76 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Gly Pro His Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 324 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 77 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcaattgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaacta ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag actaatacgc ttcctcggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324 <210> 78 <211> 108 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 78 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 79 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 79 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa attgtgaggc ctggggcttc agtgaaactg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc gactattgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagca attgatcctt ctatttctta tactacctac 180 aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccag ctcagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcgatct atttctgtgc aagagatggc 300 gactggggcc aagggactct ggtcgctgtc tctgca 336 <210> 80 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 80 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Ile Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Ser Ile Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ala 100 105 110 <210> 81 <211> 339 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 81 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggttg ccattggaca accagcctcc 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Val Gln Glu Gly Leu Arg Leu Tyr Ile Gln Asn Leu 355 360 365 Gly Arg Glu Leu Arg His Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Ser Phe Ala 370 375 380 Pro Ala Cys Leu Ser His Glu Ile Ile Ile Arg Ser His Trp Thr Asp 385 390 395 400 Val Gln Val Lys Gly Thr Ser Leu Pro Arg Ala Leu His Cys Trp Asp 405 410 415 Arg Ser Leu His Asp Ser His Lys Ala Ser Lys Thr Pro Leu Lys Gly 420 425 430 Cys Pro Val His Leu Val Asp Ser Cys Pro Trp Pro His Cys Asn Pro 435 440 445 Ser Cys Pro Thr Val Arg Asp Gln Phe Thr Gly Gln Glu Met Asn Val 450 455 460 Ala Gln Phe Leu Met His Met Gly Phe Asp Met Gln Thr Val Ala Gln 465 470 475 480 Pro Gln Gly Leu Glu Pro Ser Glu Leu Leu Gly Met Leu Ser Asn Gly 485 490 495 Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 500 505 510 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 515 520 525 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 530 535 540 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 545 550 555 560 Gly Val Glu Val 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ctc ctg tct tgc att gca cta agt ctt gca ctt 48 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 gtc acg aat tcg agc gag ggc agg aag acc tgg cgg cgc cgg ggt cag 96 Val Thr Asn Ser Ser Glu Gly Arg Lys Thr Trp Arg Arg Arg Gly Gln 20 25 30 cag ccg cct cct ccc ccg cgg acc gag gcg gcg ccg gcg gcc gga cag 144 Gln Pro Pro Pro Pro Pro Arg Thr Glu Ala Ala Pro Ala Ala Gly Gln 35 40 45 ccc gtg gag agc ttc ccg ctg gac ttc acg gcc gtg gag ggt aac atg 192 Pro Val Glu Ser Phe Pro Leu Asp Phe Thr Ala Val Glu Gly Asn Met 50 55 60 gac agc ttc atg gcg caa gtc aag agc ctg gcg cag tcc ctg tac ccc 240 Asp Ser Phe Met Ala Gln Val Lys Ser Leu Ala Gln Ser Leu Tyr Pro 65 70 75 80 tgc tcc gcg cag cag ctc aac gag gac ctg cgc ctg cac ctc cta ctc 288 Cys Ser Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Arg Leu His Leu Leu Leu 85 90 95 aac acc tcg gtg acc tgc aac gac ggc agc ccc gcc ggc tac tac ctg 336 Asn Thr Ser Val Thr Cys Asn Asp Gly Ser Pro Ala Gly Tyr Tyr Leu 100 105 110 aag gag tcc agg ggc agc cgg cgg tgg ctc ctc ttc ctg gaa ggc ggc 384 Lys Glu Ser Arg Gly Ser Arg Arg Trp Leu Leu Phe Leu Glu Gly Gly 115 120 125 tgg tac tgc ttc aac cgc gag aac tgc gac tcc aga tac gac acc atg 432 Trp Tyr Cys Phe Asn Arg Glu Asn Cys Asp Ser Arg Tyr Asp Thr Met 130 135 140 cgg cgc ctc atg agc tcc cgg gac tgg ccg cgc act cgc aca ggc aca 480 Arg Arg Leu Met Ser Ser Arg Asp Trp Pro Arg Thr Arg Thr Gly Thr 145 150 155 160 ggg atc ctg tcc tca cag ccg gag gag aac ccc tac tgg tgg aac gca 528 Gly Ile Leu Ser Ser Gln Pro Glu Glu Asn Pro Tyr Trp Trp Asn Ala 165 170 175 aac atg gtc ttc atc ccc tac tgc tcc agt gat gtt tgg agc ggg gct 576 Asn Met Val Phe Ile Pro Tyr Cys Ser Ser Asp Val Trp Ser Gly Ala 180 185 190 tca tcc aag tct gag aag aac gag tac gcc ttc atg ggc gcc ctc atc 624 Ser Ser Lys Ser Glu Lys Asn Glu Tyr Ala Phe Met Gly Ala Leu Ile 195 200 205 atc cag gag gtg gtg cgg gag ctt ctg ggc aga ggg ctg agc ggg gcc 672 Ile Gln Glu Val Val Arg Glu Leu Leu Gly Arg Gly Leu Ser Gly Ala 210 215 220 aag gtg ctg ctg ctg gcc ggg agc agc gcg ggg ggc acc ggg gtg ctc 720 Lys Val Leu Leu Leu Ala Gly Ser Ser Ala Gly Gly Thr Gly Val Leu 225 230 235 240 ctg aat gtg gac cgt gtg gct gag cag ctg gag aag ctg ggc tac cca 768 Leu Asn Val Asp Arg Val Ala Glu Gln Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Pro 245 250 255 gcc atc cag gtg cga ggc ctg gct gac tcc ggc tgg ttc ctg gac aac 816 Ala Ile Gln Val Arg Gly Leu Ala Asp Ser Gly Trp Phe Leu Asp Asn 260 265 270 aag cag tat cgc cac aca gac tgc gtc gac acg atc acg tgc gcg ccc 864 Lys Gln Tyr Arg His Thr Asp Cys Val Asp Thr Ile Thr Cys Ala Pro 275 280 285 acg gag gcc atc cgc cgt ggc atc agg tac tgg aac ggg gtg gtc ccg 912 Thr Glu Ala Ile Arg Arg Gly Ile Arg Tyr Trp Asn Gly Val Val Pro 290 295 300 gag cgc tgc cga cgc cag ttc cag gag ggc gag gag tgg aac tgc ttc 960 Glu Arg Cys Arg Arg Gln Phe Gln Glu Gly Glu Glu Trp Asn Cys Phe 305 310 315 320 ttt ggc tac aag gtc tac ccg acc ctg cgc tgc cct gtg ttc gtg gtg 1008 Phe Gly Tyr Lys Val Tyr Pro Thr Leu Arg Cys Pro Val Phe Val Val 325 330 335 cag tgg ctg ttt gac gag gca cag ctg acg gtg gac aac gtg cac ctg 1056 Gln Trp Leu Phe Asp Glu Ala Gln Leu Thr Val Asp Asn Val His Leu 340 345 350 acg ggg cag ccg gtg cag gag ggc ctg cgg ctg tac atc cag aac ctc 1104 Thr Gly Gln Pro Val Gln Glu Gly Leu Arg Leu Tyr Ile Gln Asn Leu 355 360 365 ggc cgc gag ctg cgc cac aca ctc aag gac gtg ccg gcc agc ttt gcc 1152 Gly Arg Glu Leu Arg His Thr Leu Lys Asp Val Pro Ala Ser Phe Ala 370 375 380 ccc gcc tgc ctc tcc cat gag atc atc atc cgg agc cac tgg acg gat 1200 Pro Ala Cys Leu Ser His Glu Ile Ile Ile Arg Ser His Trp Thr Asp 385 390 395 400 gtc cag gtg aag ggg acg tcg ctg ccc cga gca ctg cac tgc tgg gac 1248 Val Gln Val Lys Gly Thr Ser Leu Pro Arg Ala Leu His Cys Trp Asp 405 410 415 agg agc ctc cat gac agc cac aag gcc agc aag acc ccc ctc aag ggc 1296 Arg Ser Leu His Asp Ser His Lys Ala Ser Lys Thr Pro Leu Lys Gly 420 425 430 tgc ccc gtc cac ctg gtg gac agc tgc ccc tgg ccc cac tgc aac ccc 1344 Cys Pro Val His Leu Val Asp Ser Cys Pro Trp Pro His Cys 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Claims (101)

  1. 단리된 노텀(Notum) 조절 인자.
  2. 제1항에 있어서, 노텀 조절 인자가 노텀 길항제를 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  3. 제1항에 있어서, 노텀 조절 인자가 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  4. 제3항에 있어서, 항체 또는 이의 면역반응성 단편이 단일클론 항체를 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  5. 제4항에 있어서, 단일클론 항체가 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  6. 제4항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 3개의 상보성 결정 영역을 가진 경쇄 가변 영역 및 3개의 상보성 결정 영역을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역은 도 7b에 제시된 상보성 결정 영역을 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 인간화된 항체인 단리된 노텀 조절 인자.
  8. 제4항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 6, 서열 번호: 10, 서열 번호: 14, 서열 번호: 18, 서열 번호: 22, 서열 번호: 26, 서열 번호: 30, 서열 번호: 34, 서열 번호: 38, 서열 번호: 42, 서열 번호: 46, 서열 번호: 50, 서열 번호: 54, 서열 번호: 58, 서열 번호: 62, 서열 번호: 66, 서열 번호: 70, 서열 번호: 74, 서열 번호: 78, 서열 번호: 82, 서열 번호: 86, 서열 번호: 90, 서열 번호: 94 및 서열 번호: 98에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 12, 서열 번호: 16, 서열 번호: 20, 서열 번호: 24, 서열 번호: 28, 서열 번호: 32, 서열 번호: 36, 서열 번호: 40, 서열 번호: 44 및 서열 번호: 48, 서열 번호: 52, 서열 번호: 56, 서열 번호: 60, 서열 번호: 64, 서열 번호: 68, 서열 번호: 72, 서열 번호: 76, 서열 번호: 80, 서열 번호: 84 서열 번호: 88, 서열 번호: 92 및 서열 번호: 96에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  9. 제8항의 아미노산 중쇄 가변 영역 또는 아미노산 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
  10. 제9항의 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제8항의 단일클론 항체로부터 유도된 인간화된 항체.
  12. 제1항에 있어서, 서열 번호: 2에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 단리된 노텀 조절 인자.
  13. 제12항에 있어서, 노텀 조절 인자가 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 추가로 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  14. 제1항에 있어서, 조절 인자가 피험체에 투여시 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  15. 제14항에 있어서, 빈도 감소가 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 알려져 있는 종양 세포 표면 마커에 대한 유세포 분석 또는 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 알려져 있는 종양 세포 표면 마커에 대한 면역조직화학적 검출을 사용하여 측정되는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  16. 제14항에 있어서, 빈도 감소가 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  17. 제16항에 있어서, 빈도 감소가 인간 종양 생세포의 면역약화된 마우스 내로의 이식을 포함하는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  18. 제17항에 있어서, 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정된 빈도 감소가 푸아송 분포(Poisson distribution) 통계를 사용한 종양 개시 세포 빈도의 정량화를 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  19. 제16항에 있어서, 빈도 감소가 인간 종양 생세포의 시험관내 콜로니 지지 조건으로의 제한 희석 침착을 포함하는 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  20. 제19항에 있어서, 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 측정된 빈도 감소가 푸아송 분포 통계를 사용한 종양 개시 세포 빈도의 정량화를 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  21. 제14항에 있어서, 상기 종양 개시 세포가 종양 영구 세포를 포함하는 것인 단리된 노텀 조절 인자.
  22. 노텀 관련 장애 치료를 필요로 하는 피험체에게 치료적 유효량의 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 노텀 관련 장애를 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 노텀 길항제를 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 항체 또는 이의 면역반응성 단편을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 항체 또는 이의 면역반응성 단편이 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 단일클론 항체가 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 3개의 상보성 결정 영역을 가진 경쇄 가변 영역 및 3개의 상보성 결정 영역을 가진 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역은 도 7b에 제시된 상보성 결정 영역을 포함하는 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 6, 서열 번호: 10, 서열 번호: 14, 서열 번호: 18, 서열 번호: 22, 서열 번호: 26, 서열 번호: 30, 서열 번호: 34, 서열 번호: 38, 서열 번호: 42, 서열 번호: 46, 서열 번호: 50, 서열 번호: 54, 서열 번호: 58, 서열 번호: 62, 서열 번호: 66, 서열 번호: 70, 서열 번호: 74, 서열 번호: 78, 서열 번호: 82, 서열 번호: 86, 서열 번호: 90, 서열 번호: 94 및 서열 번호: 98에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 4, 서열 번호: 8, 서열 번호: 12, 서열 번호: 16, 서열 번호: 20, 서열 번호: 24, 서열 번호: 28, 서열 번호: 32, 서열 번호: 36, 서열 번호: 40, 서열 번호: 44 및 서열 번호: 48, 서열 번호: 52, 서열 번호: 56, 서열 번호: 60, 서열 번호: 64, 서열 번호: 68, 서열 번호: 72, 서열 번호: 76, 서열 번호: 80, 서열 번호: 84 서열 번호: 88, 서열 번호: 92 및 서열 번호: 96에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  29. 제22항에 있어서, 상기 과증식성 장애가 신생물성 장애를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 신생물성 장애가 고형 종양을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 고형 종양으로부터의 조직이 KRAS 돌연변이, APC 돌연변이, CTNNB1 돌연변이 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 신생물성 장애가 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립샘암 또는 유방암을 포함하는 것인 방법.
  33. 제22항에 있어서, 상기 피험체에서 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 빈도 감소가 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 알려져 있는 종양 세포 표면 마커에 대한 유세포 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 빈도 감소가 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 알려져 있는 종양 세포 표면 마커에 대한 면역조직화학적 검출을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 빈도 감소가 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 빈도 감소가 인간 종양 생세포의 면역약화된 마우스 내로의 이식을 포함하는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정된 빈도 감소가 푸아송 분포 통계를 사용한 종양 개시 세포 빈도의 정량화를 포함하는 것인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 빈도 감소가 인간 종양 생세포의 시험관내 콜로니 지지 조건으로의 제한 희석 침착을 포함하는 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 측정된 빈도 감소가 푸아송 분포 통계를 사용한 종양 개시 세포 빈도의 정량화를 포함하는 것인 방법.
  41. 제22항에 있어서, 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제22항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 서열 번호: 2에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  45. 제22항에 있어서, 제2 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 제2 노텀 조절 인자는 상기 노텀 조절 인자와는 별개의 것인 방법.
  46. 종양 개시 세포 빈도 감소를 필요로 하는 피험체에게 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 종양 개시 세포 빈도 감소를 필요로 하는 피험체에서 종양 개시 세포 빈도를 감소시키는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 종양 개시 세포가 종양 영구 세포를 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 종양 영구 세포가 하나 이상의 마커를 포함하는 것인 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 노텀 길항제를 포함하는 것인 방법.
  50. 제46항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 항체를 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  52. 제46항에 있어서, 피험체가 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립샘암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생물성 장애를 앓는 것인 방법.
  53. 제46항에 있어서, 종양 개시 세포 빈도가 10% 이상 만큼 감소되는 것인 방법.
  54. 제46항에 있어서, 빈도 감소가 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 알려져 있는 종양 세포 표면 마커에 대한 유세포 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  55. 제46항에 있어서, 빈도 감소가 종양 개시 세포에 대해 풍부한 것으로 알려져 있는 종양 세포 표면 마커에 대한 면역조직화학적 검출을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  56. 제46항에 있어서, 빈도 감소가 시험관내 또는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 빈도 감소가 인간 종양 생세포의 면역약화된 마우스 내로의 이식을 포함하는 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 생체내 제한 희석 분석을 사용하여 측정된 빈도 감소가 푸아송 분포 통계를 사용한 종양 개시 세포 빈도의 정량화를 포함하는 것인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 빈도 감소가 인간 종양 생세포의 시험관내 콜로니 지지 조건으로의 제한 희석 침착을 포함하는 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 시험관내 제한 희석 분석을 사용하여 측정된 빈도 감소가 푸아송 분포 통계를 사용한 종양 개시 세포 빈도의 정량화를 포함하는 것인 방법.
  61. 피험체에게 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 항암제를 사용하는 치료를 위해 피험체에서 종양을 감작화시키는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 항체인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 종양이 고형 종양인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 항암제가 화학치료제를 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 항암제가 생물제제를 포함하는 것인 방법.
  66. a. 과증식성 장애 진단을 필요로 하는 피험체로부터 조직 시료를 수득하는 단계;
    b. 조직 시료를 1종 이상의 노텀 조절 인자와 접촉시키는 단계; 및
    c. 시료와 회합된 노텀 조절 인자를 검출하거나 정량하는 단계
    를 포함하는, 과증식성 장애 진단을 필요로 하는 피험체에서 과증식성 장애를 진단하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 노텀 조절 인자가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 항체가 리포터에 작동가능하게 회합되어 있는 것인 방법.
  69. 노텀 조절 인자, 및 노텀 관련 장애를 치료 또는 진단하는 데 상기 노텀 조절 인자를 사용하는 것에 관한 사용 설명서를 포함하는 용기를 포함하는, 노텀 관련 장애를 진단 또는 치료하는 데 유용한 제조물품.
  70. 제69항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 단일클론 항체인 제조물품.
  71. 제70항에 있어서, 용기가 판독가능한 플레이트를 포함하는 것인 제조물품.
  72. 치료적 유효량의 1종 이상의 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, KRAS 돌연변이, APC 돌연변이 또는 CTNNB1 돌연변이를 나타내는 고형 종양을 포함하는 신생물성 장애를 앓는 피험체를 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 길항제를 포함하는 것인 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 항체를 포함하는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  76. 제72항에 있어서, 신생물성 장애가 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립샘암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  77. 치료적 유효량의 1 이상의 중화 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 신생물성 장애를 앓는 피험체를 치료하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 서열 번호: 2에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 항체를 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 신생물성 장애가 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립샘암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  82. 종양 개시 세포를 노텀 조절 인자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 개시 세포 집단을 확인, 단리, 절편화, 또는 강화시키는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 항체를 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  85. 제82항에 있어서, 종양 개시 세포에 대해 유세포 분석을 실시하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 유세포 분석이 FACS를 포함하는 것인 방법.
  87. 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 과증식성 장애를 앓는 환자에서 종양 개시 세포를 고갈시키는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 노텀 조절 인자가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 세포독성제에 회합되어 있는 것인 방법.
  90. 인간화된 항체를 포함하는 노텀 조절 인자로서, 상기 항체가 실질적으로 서열 번호: 331에 제시된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 실질적으로 서열 번호: 332에 제시된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 노텀 조절 인자.
  91. hSC2.D2.2 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  92. 약학적 유효량의 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 전이 억제 또는 예방을 필요로 하는 피험체에서 전이를 억제 또는 예방하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 피험체가 노텀 조절 인자 투여 이전 또는 이후에 용적축소술을 받는 것인 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 용적축소술이 1 이상의 항암제의 투여를 포함하는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 피험체가 노텀 조절 인자를 투여받은 때에 병에 차도가 있게 되는 것인 방법.
  96. 약학적 유효량의 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 유지 요법 수행을 필요로 하는 피험체에서 유지 요법을 수행하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 피험체가 노텀 조절 인자의 투여 이전에 신생물성 장애에 대한 치료를 받은 것인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 피험체가 노텀 조절 인자를 투여받은 때에 신생물성 장애와 관련하여 무증상인 방법.
  99. 제98항에 있어서, 피험체가 신생물성 장애에 대한 치료를 받은 후 6개월을 초과하여 노텀 조절 인자를 투여하는 것인 방법.
  100. 제99항에 있어서, 노텀 조절 인자가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  101. 약학적 유효량의 노텀 조절 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 노텀 매개 주변분비 신호전달 억제를 필요로 하는 피험체에서 노텀 매개 주변분비 신호전달을 억제시키는 방법.
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