CN105793439B - 以生物样品进行的针对igfbp7的具有改进的性能的测定 - Google Patents
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Abstract
本发明提供特别是在用于评估肾损伤时具有改进的临床性能的IGFBP7免疫测定。所述免疫测定依赖于对在用于诸如生物流体的复杂临床样本中时,并且特别是在用于诸如侧向流动测试装置的快速测定形式中时展现改进的测定性能的抗体和抗体对的选择和使用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年11月6日提交的美国临时申请号61/900,942以及2014年9月23日提交的美国临时申请号62/054,324和2014年10月15日提交的美国临时申请号62/064,380的权益,所述美国临时申请各自据此以包括所有表格、附图和权利要求的方式整体并入本文。
背景
以下对发明背景的讨论仅被提供以帮助读者了解本发明而非被承认描述或构成本发明的先前技术。
IGFBP7(人前体Swiss Prot条目Q16270)是一种涉及调控胰岛素样生长因子在组织中的表达,并且调节IGF结合它的受体的分泌蛋白质。据报道它也刺激前列环素产生和细胞粘附。IGFBP7通过IGF非依赖性机理抑制前列腺癌和乳腺癌细胞系的生长和集落形成,此导致细胞周期的G1期延迟和凋亡增加。IGFBP7在广泛范围的正常人组织中表达,并且它通常显示在前列腺、乳腺、结肠和肺来源的癌细胞系中的表达降低。
此外,各自据此以引用的方式以包括所有表格、附图和权利要求的方式整体并入本文的WO2011/097539和WO2011/075744描述IGFBP7个别地以及于各组多标志物中用于评估受试者的肾状态的用途。具体地,显示通过免疫测定测量的IGFBP7水平与对肾状态的风险分层、诊断、分级、预测、分类和监测相关联。
从诸如免疫测定的特异性结合测定获得的信号是在一种或多种结合物质(例如,抗体)与含有抗体结合所必需的表位的靶标生物分子(即,分析物)和多肽之间形成的复合物的直接结果。免疫测定常常能够“检测”分析物;但因为抗体表位约为8个氨基酸,所以被配置来检测目标标志物的免疫测定也将检测与标志物序列相关的多肽,只要那些多肽含有为结合用于测定中的一种或多种抗体所必需的表位即可。尽管此类测定可检测全长生物标志物,并且测定结果可表示为目标生物标志物的浓度,但由测定获得的信号实际上是样品中存在的所有此类“免疫反应性”多肽的结果。此类结合测定也可检测生物样品中存在的与诸如结合蛋白、受体、肝素、脂质、糖等的其它物质复合的免疫反应性多肽,前提是那些其它物质不干扰结合物质与靶标生物分子之间的结合。通常,然而,特异性结合测定是使用纯化的分析物制定,并且未考虑复合物形成和片段化样式。这在此类其它结合物质的身份未知时尤其确切。
发明概述
本发明的一个目标在于提供特别是在用于评估肾损伤时具有改进的临床性能的IGFBP7免疫测定。具体来说,我们描述对在用于诸如生物流体的复杂临床样本中时,并且特别是在用于快速测定形式中时展现改进的测定性能的抗体和抗体对的选择和使用。
在第一方面,本发明涉及一种特异性结合人IGFBP7,并且适用于夹心式免疫测定中的单克隆抗体。所述抗体特异性结合由LIWNKVKRGHYGVQRTELLPGDRDNL(SEQ ID NO:1)或SSSSSDTCGPCEPASCPPLP(SEQ ID NO:2)组成的多肽。
在一相关方面,本发明涉及一种特异性结合人IGFBP7,并且适用于夹心式免疫测定中的抗体对,所述抗体对包含特异性结合由LIWNKVKRGHYGVQRTELLPGDRDNL(SEQ ID NO:1)组成的多肽的第一单克隆抗体和特异性结合由SSSSSDTCGPCEPASCPPLP(SEQ ID NO:2)组成的多肽的第二单克隆抗体。
在另一相关方面,本发明涉及一种特异性结合人IGFBP7,并且适用于夹心式免疫测定中的单克隆抗体。所述抗体特异性结合IGFBP7的构象表位。构象表位由IGFBP7蛋白中在序列上不连续,但在三维空间中靠近在一起的残基形成。以下描述此类抗体的实例,被称为1D6。
在一相关方面,本发明涉及一种特异性结合人IGFBP7,并且适用于夹心式免疫测定中的抗体对,所述抗体对包含特异性结合IGFBP7的构象表位的第一单克隆抗体,和特异性结合由LIWNKVKRGHYGVQRTELLPGDRDNL(SEQ ID NO:1)或SSSSSDTCGPCEPASCPPLP(SEQ IDNO:2)组成的多肽的第二单克隆抗体。
在某些实施方案中,本发明的抗体包含以下中的一个或两个:(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9至少90%同一的序列的轻链可变区,和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10至少90%同一的序列的重链可变区,其中所述抗体特异性结合人IGFBP7。在优选实施方案中,抗体是在本文中被称为IC9E4.1的抗体。
在其它实施方案中,本发明的抗体包含以下中的一个或两个:(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11至少90%同一的序列的轻链可变区,和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12至少90%同一的序列的重链可变区,其中所述抗体特异性结合人IGFBP7。在优选实施方案中,抗体是在本文中被称为1D6的抗体。
在某些实施方案中,本发明的抗体对包含(i)第一抗体,其包含以下中的一个或两个:(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11至少90%同一的序列的轻链可变区,和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12至少90%同一的序列的重链可变区,其中所述抗体特异性结合人IGFBP7;和(ii)第二抗体,其包含以下中的一个或两个:(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9至少90%同一的序列的轻链可变区,和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10至少90%同一的序列的重链可变区,其中所述抗体特异性结合人IGFBP7。在优选实施方案中,所述抗体对包含在本文中称为1D6的第一抗体和在本文中称为IC9E4.1的第二抗体。
如本文所用的短语“特异性结合由特定序列组成的多肽”不旨在意指抗体不结合包含所述序列的更长多肽或是所述序列的子组的更短多肽。相反,这个短语仅旨在意指抗体将结合特定所述多肽。
用于要求保护的方法中的抗体可从多种物种获得。举例来说,本发明的抗体可包含是兔、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、山羊、绵羊、驴、人、美洲驼或骆驼科动物序列、或此类序列的组合(所谓嵌合抗体)的免疫球蛋白序列。用于本发明中的抗体可通过它们在免疫测定中的性能来鉴定,接着通过表位作图来进一步表征以了解与该性能相关的表位。
表位通常由各组化学活性表面分子,诸如氨基酸或糖侧链组成,并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下,与前者而非与后者的结合丧失。优选地,供各抗体用的表位含在作为从人IGFBP7序列获得的序列的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2内。在某些实施方案中,第一单克隆抗体包含至少1个,并且优选2、3或4个用于结合IGFBP7的连续“关键残基”。“关键残基”定义为SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:2)的在变为丙氨酸时,相对于抗体与SEQ ID NO:1(或SEQ ID NO:2)自身的结合使抗体的结合降低至少50%,并且更优选至少75%的氨基酸。在优选实施方案中,至少一个关键残基是序列TELLPGDRD(SEQ ID NO:3)中的至少一个残基,或序列EPASC(SEQ IDNO:4)中的至少一个残基。
可使此类单克隆抗体缀合于信号显现元件或固定在固体载体上。在夹心式测定的实例中,第一抗体(被可检测标记)和第二抗体(固定在测试装置的预定区处)与样品中的IGFBP7在测试装置的预定区处形成夹心式复合物。在夹心式测定中,第一和第二抗体可相同(特别是当使用多克隆抗体时)或不同。因此,本发明的抗体可以夹心对形式使用,或可个别地与不是单克隆抗体的另一结合实体(诸如多克隆抗体或适体)一起使用。
本发明的抗体可用作用于检测生物样品中的IGFBP7的测试试剂盒中的试剂。此类测试试剂盒可例如包括被配置来产生与生物样品中人IGFBP7的存在或数量相关的可检测信号的一次性测试装置。或者,此类测试试剂盒可被制定以在不利用一次性测试装置的临床分析器中进行测定。优选地,测试试剂盒是体外诊断性的。如本文所用的术语“体外诊断性的”是指是试剂、试剂产品、校准物、对照物质、试剂盒、仪器、器具、设备或系统的医学装置,无论单独或组合使用都由制造商意图在体外用于检查源于人体的样本,包括血液和组织捐献物,以仅仅或主要达成提供关于生理或病理状态或关于先天性异常的信息的目的,或确定安全性和与潜在接受者的相容性,或监测治疗措施。
在某些实施方案中,以侧向流动形式进行免疫测定。侧向流动测试是一种免疫测定形式,其中测试样品以色谱方式沿吸湿性或非吸湿性多孔固体基材流动。侧向流动测试可以竞争性或夹心形式测定来操作。优选侧向流动装置是一次性单次使用测试装置。将样品施加在测试装置的施加区,并且穿过基材,在所述基材处它遇到已用抗体或抗原预处理的管线或区域。如本文所用的术语“测试区”是指侧向流动测试条带上的分立位置,其被探询以产生与目标分析物的存在或数量相关的信号。可检测信号可目视读取或通过将一次性测试装置插入诸如反射计、荧光计或透射光度计的分析仪器中获得。这个清单不意图是限制性的。可在不进行预处理下将样品施加于施加区,或可在施加之前与一种或多种测定试剂预混合。在后述情况下,抗体可提供在独立于一次性测试装置的容器中。
本发明的抗体可散布性固定于一次性测试装置内的表面,以使所述抗体在样品接触所述表面时溶入所述样品中。在夹心式测定形式中,这个散布性结合的抗体可结合样品中它的同源抗原,接着在抗原由非散布性地结合在检测区处的第二抗体结合时固定在所述检测区处。在竞争性形式中,样品中它的同源抗原可与作为测定试剂提供的标记的抗原竞争结合散布性结合的抗体。
本发明的试剂盒还可包括用以使可检测信号与IGFBP7的浓度相关联的校正。举例来说,校正曲线可提供在由接受一次性测试装置的分析仪器读取的电子存储装置(诸如ROM芯片、闪存驱动器、RFID标签等)上。或者,校正曲线可提供在光学读取的编码标签(诸如2维条形码)上,或通过网络连接来传送。分析仪器可接着使用这个校正曲线来将由测定获得的可检测信号关联成IGFBP7浓度。
在某一实施方案中,使用本发明的抗体对执行的测定方法提供与生物样品中人IGFBP7的存在或数量相关的信号,其中所述测定方法中IGFBP7的最小可检测浓度是20ng/mL或小于20ng/mL,更优选是10ng/mL或小于10ng/mL、5ng/mL或小于5ng/mL、1ng/mL或小于1ng/mL,并且最优选是0.1ng/mL或小于0.1ng/mL。
在相关方面,本发明提供用于测定生物样品中人IGFBP7的存在或数量的方法,所述方法包括:
用与人IGFBP7一起形成夹心式复合物的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体对所述生物样品进行免疫测定,其中所述免疫测定提供与所述生物样品中结合在所述夹心式复合物中的人IGFBP7的存在或数量相关的可检测信号;以及
使所述可检测信号与所述生物样品中人IGFBP7的存在或数量相关联。优选地,免疫测定中IGFBP7的最小可检测浓度是20ng/mL或小于20ng/mL,更优选是10ng/mL或小于10ng/mL、5ng/mL或小于5ng/mL、1ng/mL或小于1ng/mL,并且最优选是0.1ng/mL或小于0.1ng/mL。
在特别优选的实施方案中,第一单克隆抗体结合由SEQ ID NO:1组成的多肽,并且第二单克隆抗体结合由SEQ ID NO:2组成的多肽,在各情况下亲和力都是至少108M-1。
优选测定方法包括进行检测人IGFBP7的免疫测定。此类免疫测定可包括使所述体液样品与检测标志物的抗体接触,以及检测与该抗体的结合。优选地,体液样品选自由尿、唾液、血液、血清和血浆组成的组,并且最优选是尿。
关于本发明的抗体,本发明也在其它方面涉及编码此类抗体的核酸和表达此类抗体的抗体表达性细胞系。
本公开的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和以下描述中。本公开的其它特征、目标和优势将根据描述和附图以及根据权利要求而显而易知。
发明详述
定义
如本文所用,术语“胰岛素样生长因子结合蛋白7”和“IGFBP7”是指一种或多种存在于生物样品中的源于胰岛素样生长因子结合蛋白7前体(Swiss-Prot Q16270(SEQ IDNO:5))的多肽
以下结构域已在胰岛素样生长因子结合蛋白7中加以鉴定:
残基 长度 结构域身份
1-26 26 信号肽
27-282 256 胰岛素样生长因子结合蛋白7
除非本文另外明确指示,否则所用术语的定义是用于药物科学领域中的标准定义。除非上下文另外明确规定,否则如说明书和随附权利要求中所用,单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述”包括复数个指示物。因此,举例来说,提及“一种药物载体”包括两种或更多种此类载体的混合物等。
如本文所用的术语“受试者”是指人或非人生物体。因此,本文所述的方法和组合物可适用于人疾病与兽医学疾病两者。此外,尽管受试者优选是活生物体,但本文所述的本发明也可用于死后分析中。优选受试者是人,并且最优选是“患者”,其如本文所用是指接受针对疾病或病状的医学护理的活人。这包括无确定疾病,正被探究病理征象的人士。
优选地,测量样品中的分析物。此类样品可从受试者获得,或可从意图向受试者提供的生物材料获得。举例来说,样品可从被评估以达成可能向受试者中移植的肾获得,并且分析物测量结果用于评估肾的先前存在的损害。优选样品是体液样品。
如本文所用的术语“体液样品”是指出于诊断、预测、分类或评估目标受试者(诸如患者或移植供体)的目的而获得的体液样品。在某些实施方案中,此类样品可出于确定正在进行的病状的后果或治疗方案对病状的作用的目的而获得。优选体液样品包括血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿、唾液、痰和胸腔积液。此外,本领域技术人员将认识到某些体液样品将在分级分离或纯化程序之后更易于分析,所述程序例如将全血分成血清或血浆组分。
如本文所用的术语“诊断”是指熟练技术人员可估计和/或确定患者是否正罹患给定疾病或病状的概率(“可能性”)所采用的方法。在本发明的情况下,“诊断”包括使用针对本发明的肾损伤标志物的测定(最优选是免疫测定)的结果,任选与其它临床特征一起,以达成对从其获得样品并加以测定的受试者的急性肾损伤或ARF的诊断(也就是发生或不发生)。此类诊断被“确定”不意图暗示诊断是100%准确的。许多生物标志物指示多种病状。熟练临床医师在信息空白的情况下不使用生物标志物结果,而是测试结果连同其它临床征候一起被用于达成诊断。因此,相对于在预定诊断阈值的另一侧的测量水平,在预定诊断阈值的一侧的测量的生物标志物水平指示在受试者中发生疾病的可能性更大。
类似地,预后风险预示给定过程或后果将发生的概率(“可能性”)。转而与发病(例如肾功能恶化、未来ARF、或死亡)概率增加相关联的预后指标的水平或水平变化被认为是“指示患者中不利后果的可能性增加”。
如本文所用的术语“侧向流动”是指试剂在纵向上流过基本上扁平的多孔材料。如果材料的厚度是长度和宽度尺寸的至多10%,那么此类多孔材料是“基本上扁平的”。
如本文相对于装置的第一区域所用的术语“下游区域”是指在流体已到达所述第一区域之后接受该流体流的区域。
如本文所用的术语“样品施加区”是指测定装置的向其中引入目标流体样品以达成测定其组分的目的的部分。
标志物测定
一般来说,免疫测定涉及使含有或怀疑含有目标生物标志物的样品与至少一种特异性结合所述生物标志物的抗体接触。接着产生信号,其指示通过样品中多肽与抗体结合形成的复合物的存在或数量。接着使信号与样品中生物标志物的存在或数量相关联。用于检测和分析生物标志物的众多方法和装置为熟练技术人员所熟知。参见例如美国专利6,143,576;6,113,855;6,019,944;5,985,579;5,947,124;5,939,272;5,922,615;5,885,527;5,851,776;5,824,799;5,679,526;5,525,524;和5,480,792,以及The ImmunoassayHandbook,David Wild编Stockton Press,New York,1994,其各自据此以引用的方式以包括所有表格、附图和权利要求的方式整体并入本文。
本领域中已知的测定装置和方法可在各种夹心式、竞争性或非竞争性测定形式中利用标记的分子以产生与目标生物标志物的存在或数量相关的信号。合适的测定形式也包括色谱、质谱和蛋白质“印迹”方法。另外,诸如生物传感器和光学免疫测定的某些方法和装置可用于确定分析物的存在或数量而无需标记的分子。参见例如美国专利5,631,171;和5,955,377,其各自据此以引用的方式以包括所有表格、附图和权利要求的方式整体并入本文。本领域技术人员也认识到包括但不限于BeckmanAbbottRocheDade Behring系统的机器人仪器在能够进行免疫测定的免疫测定分析器之中。但可利用任何合适的免疫测定,例如酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定等。
抗体或其它多肽可固定于多种固体载体上以用于测定中。可用于使特异性结合成员固定的固相包括在固相结合测定中以固相形式开发和/或使用的那些。合适的固相的实例包括膜过滤器、基于纤维素的纸、珠粒(包括聚合、乳胶和顺磁性粒子)、玻璃、硅片、微粒、纳米粒子、TentaGels、AgroGels、PEGA凝胶、SPOCC凝胶和多孔板。测定条带可通过于固体载体上以阵列形式涂布一种或多种抗体来制备。这个条带可接着浸渍至测试样品中,接着通过洗涤和检测步骤快速处理以产生可测量信号,诸如色斑。可通过直接缀合于测定装置表面,或通过间接结合来使抗体或其它多肽结合于测定装置的特定区域。在后述情况的实例中,抗体或其它多肽可固定在粒子或其它固体载体上,并且将该固体载体固定于装置表面。
生物测定需要检测方法,并且一种最常见的结果定量方法是使可检测标记缀合于对所研究的生物系统中的一种组分具有亲和力的蛋白质或核酸。可检测标记可包括自身可检测的分子(例如荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)以及可通过产生可检测反应产物来间接检测的分子(例如酶,诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过自身可检测的特异性结合分子来间接检测的分子(例如生物素、地高辛、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)。
制备固相和可检测标记缀合物常常包括使用化学交联剂。交联试剂含有至少两个反应性基团,并且通常被分为同官能性交联剂(含有相同反应性基团)和异官能性交联剂(含有不相同反应性基团)。通过胺、硫氢基偶联,或非特异性反应的同双官能性交联剂可从许多商业来源获得。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物、α-卤代酰基和吡啶基二硫化物是硫醇反应性基团。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物以及α-卤代酰基与硫氢基反应以形成硫醇醚键,而吡啶基二硫化物与硫氢基反应以产生混合的二硫化物。吡啶基二硫化物产物是可裂解的。亚胺酯也极其适用于蛋白质-蛋白质交联。各自组合不同属性以达成成功缀合的多种异双官能性交联剂可商购获得。
在某些方面,本发明提供用于分析所述标志物的试剂盒。试剂盒包括用于分析至少一种测试样品的试剂,其包括至少一种特异性结合标志物的抗体。试剂盒也可包括用于进行一种或多种本文所述的诊断和/或预后关联的装置和说明书。优选试剂盒将包括用于进行针对分析物的夹心式测定的抗体对,或用于进行针对分析物的竞争性测定的标记的物质。优选地,抗体对包含缀合于固相的第一抗体和缀合于可检测标记的第二抗体,其中所述第一和第二抗体各自结合肾损伤标志物。最优选地,各抗体是单克隆抗体。用于使用试剂盒以及进行关联的说明书可呈标签形式,所述标签是指在试剂盒的制造、运输、销售或使用期间的任何时间附着于或另外随附于试剂盒的任何书面或记录材料。举例来说,术语标签涵盖宣传散页和小册、包装材料、说明书、音频或视频卡带、计算机磁盘以及直接书面压印在试剂盒上。
在某些实施方案中,使用单次使用的一次性测试装置进行标志物测定。此类测试装置常常采用侧向流动装置形式,所述装置目前由于普遍使用非处方妊娠测试而熟知。通常,这些测定装置具有延长的基底层,在所述基底层上可在样品添加区与评估区之间进行区分。在典型使用中,将样品施加于样品添加区,沿平行于基底层延伸的液体运输路径流动,接着流入评估区中。捕获试剂存在于评估区中,并且可通过用以检测与捕获的分析物缔合的可见部分的多种方案来检测捕获的分析物。举例来说,测定可产生视觉信号,诸如变色、荧光、发光等,此时指示生物样品中存在或不存在分析物。
样品添加区可例如以壳体中的开放腔室形式;以吸附垫形式;等提供。样品添加区可为是圆形、长方形、正方形等的各种构型的入口,或所述区域可为装置中的凹槽。
过滤器元件可于样品添加区中,于样品添加区上,或邻近于样品添加区放置以从样品过滤颗粒,诸如以从血液移除或阻滞血细胞以使血浆可进一步穿过装置。滤液可接着移动至与过滤器流体连通的多孔构件中。用于移除或阻滞存在于血液中的细胞物质的合适的过滤器在本领域中是熟知的。参见例如美国专利4,477,575;5,166,051;6,391,265;和7,125,493,其各自据此以引用的方式整体并入本文。许多合适的材料为熟练技术人员所知,并且可包括玻璃纤维、合成树脂纤维、各种类型的膜(包括其中孔径从约65至约15μm变化的不对称膜过滤器)以及此类材料的组合。此外,过滤器元件可包括一种或多种化学物质以促进红血细胞与血浆分离。此类化学物质的实例是凝血酶、凝集素、阳离子聚合物、针对一种或多种红血细胞表面抗原的抗体等。促进红血细胞与血浆分离的此类化学物质可通过共价手段、非特异性吸附等提供于过滤器元件中。
在某些实施方案中,标记区位于样品接受区的下游,并且含有散布性定位的结合目标分析物或与目标分析物竞争与结合物质结合的标记的试剂。或者,如果使标记的试剂与在向样品接受区施加之前的样品预混合,那么可除去标记区。检测区安置在标记区的下游,并且含有结合目标分析物的固定的捕获试剂。
用于本发明中的膜的最优孔直径是约10至约50μm。膜的厚度通常是约1密耳至约15密耳,通常在5或10密耳的范围内,但可多达200密耳以及更厚。膜可背衬有通常水不渗透层,诸如聚酯薄膜(DuPont Teijin Films)。当采用时,通常通过粘合剂,诸如3M444双侧粘合带使背衬紧固于膜。通常,水不渗透背衬用于低厚度膜。可使用广泛多种聚合物,前提是它们不与测定组分非特异性结合,并且不干扰样品的流动。说明性聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等。或者,膜可为自行支撑性的。也可使用其它非吸湿性膜,诸如聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯等。在各种实施方案中,标记区材料可用包括封闭剂和稳定剂的溶液预处理。封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、甲基化BSA、酪蛋白、脱脂奶粉。装置也可包括其它组分,包括例如缓冲剂、HAMA抑制剂、清洁剂、盐(例如钙、镁、钾等的氯化物和/或硫酸盐)和蛋白质组分(例如血清白蛋白、明胶、乳蛋白等)。这个清单不意图是限制性的。
装置还可包括各种对照位置,其被读取以确定测试装置已被适当操作。举例来说,可提供与测定检测区分开的程序对照区以验证样品流动如所预期。对照区优选是在空间上不同的区域,在所述区域处可产生指示适当试剂流动的信号。程序对照区可含有用于分析物测定中的过量标记的抗体可结合的目标分析物或其片段。在操作中,标记的试剂结合对照区,即使当目标分析物不存在于测试样品中时也是如此。使用对照线是有帮助的,因为在对照线中出现信号指示可读取测试结果所处的时间,即使对于阴性结果也是如此。因此,当预期信号出现在对照线中时,可指示捕获区中存在或不存在信号。装置还可包括阴性对照区。这个对照区的目的在于警告使用者测试装置未正常工作。当正常工作时,应无信号或标志可见于阴性对照区中。
此类测定装置的外部罩壳或壳体可采用各种形式。通常,它将包括伸长的罩壳,并且可具有多个互相配合的部件。在一个特别优选的实施方案中,壳体包括顶盖和底部支撑物。顶盖含有施加孔口和观察口。在一个优选实施方案中,壳体由例如塑料材料的水分不渗透固体材料制得。预期多种可商购获得的塑料,包括但不限于聚乙烯、尼龙、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚硫烷、聚酯、聚氨酯和环氧树脂可用于构建壳体。壳体可通过常规方法,诸如本领域中熟知并使用的标准模制技术来制备。壳体可通过模制技术产生,所述技术包括但不限于注射模制、压缩模制、转移模制、吹气模制、挤压模制、泡沫模制和热成形模制。以上提及的模制技术在本领域中是熟知的,并且因此不在本文中详细讨论。参见例如Processes And Materials Of Manufacture,第3版,R.A.Lindsberg(1983)Allynand Baron第393-431页。
必要时,可接着用适合于标记的仪器评估所采用的可检测标记的比色、发光或荧光强度。举例来说,荧光计可用于检测荧光标记;反射计可用于检测吸光标记等。可通过使测量的响应关联于样品流体中分析物的量来确定样品中目标分析物的浓度。
测定关联
如本文关于在测定中测量生物标志物所用的术语“关联”和“相关”是指基于从所述测定获得的信号来确定样品中生物标志物的存在,或更优选是数量。常常,这采用将由参与测定的一种物质上的可检测标记产生的信号与可用于将所述信号换算成生物标志物的浓度或阈值量的预定标准曲线进行比较的形式。
如本文关于使用生物标志物进行诊断或预测所用的术语“关联”和“相关”是指将患者中生物标志物的存在或数量与它在已知罹患给定病状或已知处于给定病状的风险下的人士中;或在已知无给定病状的人士中的存在或数量进行比较。常常,这采用将呈生物标志物浓度形式的测定结果与被选择以指示疾病的发生或不发生或某一未来后果的可能性的预定阈值进行比较的形式。
选择诊断阈值尤其涉及考虑疾病的概率,在不同测试阈值下真诊断和假诊断的分布,以及基于诊断估计治疗(或未能治疗)的结果。举例来说,当考虑施用具有高度有效性,并且具有低风险水平的特定疗法时,需要的测试是少许的,因为临床医师可接受实质性诊断不确定性。另一方面,在其中治疗选项的有效性较小并且更具风险的情况下,临床医师常常需要较高程度的诊断确定性。因此,成本/效益分析涉及选择诊断阈值。
可以多种方式确定合适的阈值。举例来说,一种推荐用于使用心脏肌钙蛋白诊断急性心肌梗塞的诊断阈值是见于正常群体中的浓度的第97.5百分位数。另一方法可在于考察来自同一患者的连续样品,其中先前“基线”结果用于监测生物标志物水平的时序变化。
群体研究也可用于选择判定阈值。接受者操作特征(“ROC”)产生于在二次世界大战期间被产生用于分析雷达图像的信号检测理论的领域,并且ROC分析常常用于选择能够最佳区分“患病”子群体与“非患病”子群体的阈值。当人测试阳性,但实际上不患有疾病时,出现在这个情况下的假阳性。另一方面,当人测试阴性,从而表明他们是健康的,而此时他们实际上确实患有疾病时,出现假阴性。为绘制ROC曲线,随着判定阈值连续变化确定真阳性率(TPR)和假阳性率(FPR)。因为TPR与灵敏性等效,并且FPR等同于1-特异性,所以ROC图有时称为灵敏性对(1-特异性)图。完美测试将具有ROC曲线下面积1.0;随机测试将具有面积0.5。选择阈值以提供可接受水平的特异性和灵敏性。
在这个情形下,“患病”意指群体具有一种特征(存在疾病或病状或发生某一后果),并且“非患病”意指群体缺乏所述特征。尽管单一判定阈值是此类方法的最简单应用,但可使用多个判定阈值。举例来说,在第一阈值以下,可以相对较高置信度指定不存在疾病,并且在第二阈值以上,也可以相对较高置信度指定存在疾病。在两个阈值之间可被视为不确定。这实际上仅意图是示例性的。
除阈值比较之外,用于使测定结果关联于患者分类(发生或不发生疾病、某一后果的可能性等)的其它方法包括决策树、规则集、贝叶斯方法(Bayesian method)和神经网络方法。这些方法可产生代表受试者属于多个分类中的一个分类所处的程度的概率值。
测试准确性的量度可如Fischer等,Intensive Care Med.29:1043-51,2003中所述获得,并且用于确定给定生物标志物的有效性。这些量度包括灵敏性和特异性、预测值、似然比、诊断优势比和ROC曲线面积。ROC图的曲线下面积(“AUC”)等同于分类器对随机选择的阳性实例的分级将高于随机选择的阴性实例的概率。ROC曲线下面积可被认为等效于如果考虑的两个组具有连续数据,那么检验在所述组中获得的评分之间的中值差异的曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test),或等效于威尔卡森秩检验(Wilcoxon test of rank)。
如上所讨论,合适的测试可展现关于这些各种量度的以下结果中的一个或多个:特异性大于0.5,优选是至少0.6,更优选是至少0.7,更优选是至少0.8,甚至更优选是至少0.9,并且最优选是至少0.95,伴有相应灵敏性大于0.2,优选大于0.3,更优选大于0.4,更优选是至少0.5,甚至更优选是0.6,更优选大于0.7,更优选大于0.8,更优选大于0.9,并且最优选大于0.95;灵敏性大于0.5,优选是至少0.6,更优选是至少0.7,更优选是至少0.8,甚至更优选是至少0.9,并且最优选是至少0.95,伴有相应特异性大于0.2,优选大于0.3,更优选大于0.4,更优选是至少0.5,甚至更优选是0.6,更优选大于0.7,更优选大于0.8,更优选大于0.9,并且最优选大于0.95;至少75%灵敏性与至少75%特异性组合;ROC曲线面积大于0.5,优选是至少0.6,更优选是0.7,更优选是至少0.8,甚至更优选是至少0.9,并且最优选是至少0.95;优势比不同于1,优选是至少约2或大于2或约0.5或小于0.5,更优选是至少约3或大于3或约0.33或小于0.33,更优选是至少约4或大于4或约0.25或小于0.25,甚至更优选是至少约5或大于5或约0.2或小于0.2,并且最优选是至少约10或大于10或约0.1或小于0.1;阳性似然比(计算为灵敏性/(1-特异性))大于1,是至少2,更优选是至少3,更优选是至少5,并且最优选是至少10;和或阴性似然比(计算为(1-灵敏性)/特异性)小于1,小于或等于0.5,更优选小于或等于0.3,并且最优选小于或等于0.1。
抗体
如本文所用的术语“抗体”是指由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段获得,以所述免疫球蛋白基因或其片段为模型,或基本上由所述免疫球蛋白基因或其片段编码,能够特异性结合抗原或表位的肽或多肽。参见例如Fundamental Immunology,第3版,W.E.Paul编,Raven Press,N.Y.(1993);Wilson(1994;J.Immunol.Methods 175:267-273;Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。术语抗体包括抗原结合部分,即保留结合抗原的能力的“抗原结合位点”(例如片段、子序列、互补决定区(CDR)),包括(i)Fab片段,即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,即包含两个由在铰链区处的二硫桥连接的Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也以引用的方式包括在术语“抗体”中。
如本文所用,“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链的包括互补决定区(CDR;即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的部分。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。根据用于本发明中的方法,对CDR和FR指定的氨基酸位置可根据Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1987和1991))来确定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也根据Kabat的编号。
“分离的”抗体是已被鉴定并与它的天然环境的组分分离和/或从所述组分回收的抗体。它的天然环境的污染物组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质,并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中,抗体将被纯化(1)以获得大于95重量%的抗体,如通过洛利(Lowry)方法所测定,并且最优选超过99重量%,(2)以达到足以通过使用旋转杯测序仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度,或(3)以达到使用考马斯(Coomassie)蓝或优选银染色在还原性或非还原性条件下,通过SDS-PAGE确定的均质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体,因为将不存在抗体的天然环境的至少一种组分。通常,然而,分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
通常,抗体可包含重链和/或轻链可变结构域,其包含与具有已知结合特征的亲本抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,更优选至少90%,并且最优选至少95%氨基酸序列同一性或类似性的氨基酸序列。关于这个序列的同一性或类似性在本文中定义为在比对序列以及必要时引入空位以获得最大序列同一性百分比之后,候选序列中与物种依赖性抗体残基同一(即相同残基)或类似(即来自基于共同侧链性质的同一组的氨基酸残基)的氨基酸残基的百分比。在可变结构域外部对抗体序列的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入都不应解释为影响序列同一性或类似性。天然存在的残基基于共同侧链性质而分成各组:
(1)疏水性:正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性亲水性:cys、ser、thr、asn、gln;
(3)酸性:asp、glu;
(4)碱性:his、lys、arg;
(5)影响链定向的残基:gly、pro;以及
(6)芳族:trp、tyr、phe。
尽管保守性取代常常是优选的,但也涵盖非保守性取代(其必须将这些类别中的一个的成员交换成另一类别的成员)。
优选治疗性抗体是IgG抗体。如本文所用的术语“IgG”意指属于基本上由认定的免疫球蛋白γ基因编码的抗体的类别的多肽。在人中,这个类别包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中,这个类别包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG类别的抗体中的已知Ig结构域是VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。IgG由于若干实际原因而成为治疗性抗体的优选类别。IgG抗体是稳定的,易于纯化的,并且能够储存在对于药物供应链来说切实可行的条件下。在体内,它们具有长久生物半衰期,所述半衰期不仅仅随它们的尺寸而变,而且也是它们与所谓Fc受体(或FcRn)相互作用的结果。这个受体似乎保护IgG免遭细胞内分解代谢,并且使它再循环回血浆。
抗体是结合特定抗原的免疫蛋白质。在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中,抗体由成对重多肽链和轻多肽链构建。在抗体之间,轻链和重链可变区显示显著序列多样性,并且负责结合靶标抗原。各链由个别免疫球蛋白(Ig)结构域组成,并且因此通用术语免疫球蛋白用于此类蛋白质。
术语“特异性结合”不意图指示抗体仅结合它的预期靶标,因为如上所指示,抗体结合显示所述抗体所结合的表位的任何多肽。相反,如果抗体对它的预期靶标的亲和力在相较于它对不显示适当表位的非靶标分子的亲和力时大近似5倍,那么它进行“特异性结合”。优选地,抗体对靶标分子的亲和力比它对非靶标分子的亲和力大至少约5倍,优选10倍,更优选25倍,甚至更优选50倍,并且最优选100倍或大于100倍。在优选实施方案中,优选抗体结合的亲和力是至少约107M-1,并且优选在约108M-1至约109M-1、约109M-1至约1010M-1、或约1010M-1至约1012M-1之间。
亲和力计算为Kd=k解离/k缔合(k解离是解离速率常数,K缔合是缔合速率常数,并且Kd是平衡常数)。可通过在各种浓度(c)下测量标记的配体的结合分数(r)来在平衡状态下确定亲和力。使用斯卡查德(Scatchard)等式:r/c=K(n-r)将数据绘图,其中r=在平衡状态下结合的配体的摩尔数/受体的摩尔数;c=在平衡状态下游离配体浓度;K=平衡缔合常数;并且n=每个受体分子的配体结合位点数。通过图解分析,将r/c于Y轴上相对于r于X轴上绘图,由此产生斯卡查德图。通过斯卡查德分析进行抗体亲和力测量在本领域中是熟知的。参见例如van Erp等,J.Immunoassay 12:425-43,1991;Nelson和Griswold,Comput.MethodsPrograms Biomed.27:65-8,1988。
本发明的抗体可通过表位作图来进一步表征,以便可选择在本文所述的免疫测定中具有最大临床效用的抗体和表位。术语“表位”是指能够特异性结合抗体的抗原决定簇。表位通常由各组化学活性表面分子,诸如氨基酸或糖侧链组成,并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下,与前者而非与后者的结合丧失。优选地,靶向存在于靶标分子上,但部分或完全不存在于非靶标分子上的表位。
在一些实施方案中,抗体骨架可为来自不同物种的序列的混合物。因此,如果抗体是抗体,那么此类抗体可为嵌合抗体和/或人源化抗体。一般来说,“嵌合抗体”与“人源化抗体”两者均指组合有来自超过一种物种的区域的抗体。举例来说,“嵌合抗体”在传统上包含来自小鼠(或在一些情况下大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”通常是指可变结构域框架区已替换成见于人抗体中的序列的非人抗体。通常,在人源化抗体中,除CDR之外的整个抗体由人来源的多核苷酸编码,或除在它的CDR内之外与此类抗体相同。将其中一些或全部由起源于非人生物体中的核酸编码的CDR移植入人抗体可变区的β折叠框架中以产生特异性由移入的CDR决定的抗体。此类抗体的产生描述于例如WO 92/11018;Jones,1986,Nature321:522-525;Verhoeyen等,1988,Science 239:1534-1536中。使所选接受体框架残基“回复突变”成相应供体残基常常为重新获得在初始移植构建体中丧失的亲和力所需(美国专利号5,530,101;美国专利号5,585,089;美国专利号5,693,761;美国专利号5,693,762;美国专利号6,180,370;美国专利号5,859,205;美国专利号5,821,337;美国专利号6,054,297;美国专利号6,407,213)。人源化抗体最优也将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区,通常是人免疫球蛋白的一部分恒定区,并且因此将通常包含人Fc区。也可使用具有遗传工程改造的免疫系统的小鼠来产生人源化抗体。Roque等,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。多种用于使非人抗体人源化和再成形的技术和方法在本领域中是熟知的(参见Tsurushita和Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,MolecularBiology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)以及其中引用的参考文献)。人源化方法包括但不限于Jones等,1986,Nature 321:522-525;Riechmann等,1988;Nature332:323-329;Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536;Queen等,1989,Proc Natl AcadSci,USA 86:10029-33;He等,1998,J.Immunol.160:1029-1035;Carter等,1992,Proc NatlAcad Sci USA89:4285-9;Presta等,1997,Cancer Res.57(20):4593-9;Gorman等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185;O'Connor等,1998,Protein Eng 11:321-8中所述的方法。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其它方法可包括表面重塑方法,如例如于Roguska等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:969-973中所述。在一个实施方案中,亲本抗体已加以亲和力成熟,如本领域中所知。基于结构的方法可用于人源化和亲和力成熟,例如如U.S.序列号11/004,590中所述。基于选择的方法可用于使抗体可变区人源化和/或亲和力成熟,包括但不限于Wu等,1999,J.Mol.Biol.294:151-162;Baca等,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684;Rosok等,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618;Rader等,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915;Krauss等,2003,ProteinEngineering 16(10):753-759中所述的方法。其它人源化方法可涉及移植CDR的仅仅各部分,包括但不限于U.S.序列号09/810,502;Tan等,2002,J.Immunol.169:1119-1125;DePascalis等,2002,J.Immunol.169:3076-3084中所述的方法。
在一个实施方案中,抗体是完全人抗体。“完全人抗体”或“全面人抗体”是指具有源于人染色体的抗体的基因序列的人抗体。完全人抗体可例如使用转基因小鼠(Bruggemann等,1997,Curr Opin Biotechnol 8:455-458)或与选择方法联用的人抗体文库(Griffiths等,1998,Curr Opin Biotechnol 9:102-108)获得。
抗体的产生
可使用本领域中已知的广泛多种技术来产生单克隆抗体制剂,所述技术包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。举例来说,可使用杂交瘤技术来产生单克隆抗体,所述技术包括本领域中已知以及例如Harlow等,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988);Hammerling,等,MONOCLONALANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS,第563-681页(Elsevier,N.Y.,1981)(其两者均以引用的方式整体并入本文)中教导的那些。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源于单一克隆,包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体,并且不涉及它被产生所采用的方法。
源于除大鼠和小鼠以外的动物的单克隆抗体提供独特优势。与信号转导和疾病相关的许多蛋白质靶标在小鼠、大鼠和人之间是高度保守的,并且因此可被小鼠或大鼠宿主识别为自身抗原,从而使得它们具有较小免疫原性。当使用兔作为宿主动物时,这个问题可被避免。参见例如Rossi等,Am.J.Clin.Pathol.,124,295-302,2005。
用于使用杂交瘤技术产生和筛选特定抗体的方法在本领域中是常规以及熟知的。在非限制性实例中,小鼠可用目标抗原或表达此类抗原的细胞免疫。一旦检测到免疫应答,例如在小鼠血清中检测到对抗原具有特异性的抗体,即收获小鼠脾,并且分离脾细胞。接着通过熟知技术使脾细胞融合于任何合适的骨髓瘤细胞。通过限制性稀释来选择和克隆杂交瘤。接着通过本领域中已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能够结合抗原的抗体的细胞。可通过用阳性杂交瘤克隆腹膜内接种小鼠来产生通常含有高水平的抗体的腹水液。
可用于抗体产生方法中的佐剂包括但不限于蛋白质佐剂;细菌佐剂,例如完整细菌(BCG、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota))和细菌组分,包括细胞壁骨架、海藻糖二霉菌酸酯、单磷酰基脂质A、结核菌的甲醇可提取残余物(MER)、完全或不完全弗氏佐剂(Freund's adjuvant);病毒佐剂;化学佐剂,例如氢氧化铝、碘乙酸盐和半丁二酸胆固醇酯;或裸露DNA佐剂。可用于本发明方法中的其它佐剂包括霍乱毒素、副痘蛋白质、MF-59(Chiron Corporation;也参见Bieg等(1999)“GAD65And Insulin B Chain Peptide(9-23)Are Not Primary Autoantigens In TheType 1Diabetes Syndrome Of The BB Rat,”Autoimmunity,31(1):15-24,其以引用的方式并入本文)、(Corixa Corporation;也参见Lodmell等(2000)“DNA VaccinationOf Mice Against Rabies Virus:Effects Of The Route Of Vaccination And TheAdjuvant Monophosphoryl Lipid A(MPL),”Vaccine,18:1059-1066;Johnson等(1999)“3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid A Derivatives:Synthesis And ImmunostimulantActivities,”Journal of Medicinal Chemistry,42:4640-4649;Baldridge等(1999)“Monophosphoryl Lipid A(MPL)Formulations For The Next Generation OfVaccines,”Methods,19:103-107,其全部以引用的方式并入本文)、RC-529佐剂(CorixaCorporation;来自Corixa的氨基烷基葡萄胺糖苷4-磷酸酯(AGP)化学文库的先导化合物,也参见www.corixa.com)和DETOXTM佐剂(CorixaCorporation;DETOXTM佐剂包括佐剂(单磷酰基脂质A)和分支杆菌细胞壁骨架;也参见Eton等(1998)“Active ImmunotherapyWith Ultraviolet B-Irradiated Autologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX InPatients With Metastatic Melanoma,”Clin.Cancer Res.4(3):619-627;以及Gupta等(1995)“Adjuvants For Human Vaccines—Current Status,Problems And FutureProspects,”Vaccine,13(14):1263-1276,其两者均以引用的方式并入本文)。
众多出版物讨论使用噬菌体展示技术产生和筛选结合所选分析物的多肽文库。参见例如Cwirla等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990;Devlin等,Science 249,404-6,1990;Scott和Smith,Science 249,386-88,1990;以及Ladner等,美国专利号5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念是在编码待筛选的多肽的DNA与所述多肽之间建立实体关联。这个实体关联由噬菌体粒子提供,所述粒子将多肽展示为封闭编码所述多肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。在多肽与它们的遗传物质之间建立实体关联允许同时大量筛选极其大量的携带不同多肽的噬菌体。展示对靶标具有亲和力的多肽的噬菌体结合所述靶标,并且这些噬菌体通过针对所述靶标的亲和力筛选而加以富集。由这些噬菌体展示的多肽的身份可由它们的相应基因组确定。使用这些方法,被鉴定为对所需靶标具有结合亲和力的多肽可接着通过常规手段大批合成。参见例如美国专利号6,057,098,其据此以包括所有表格、附图和权利要求的方式整体并入本文。
可接着通过以下方式选择通过这些方法产生的抗体:首先筛选关于纯化的目标多肽的亲和力和特异性,以及如果需要,那么将结果与抗体关于需要从结合排除的多肽的亲和力和特异性进行比较。筛选程序可涉及将纯化的多肽固定在微量滴定板的单独孔中。接着将含有一种潜在抗体或各组抗体的溶液放置至相应微量滴定孔中,并且孵育约30分钟至2小时。接着洗涤微量滴定孔,并且添加标记的二级抗体(例如如果产生的抗体是小鼠抗体,那么是缀合于碱性磷酸酶的抗小鼠抗体)至各孔中并孵育约30分钟,接着洗涤。添加底物至各孔中,并且当存在针对固定的多肽的抗体时,将出现显色反应。
可接着在所选测定设计中进一步分析如此鉴定的抗体的亲和力和特异性。在开发针对靶标蛋白质的免疫测定时,纯化的靶标蛋白质充当使用已选抗体以其判断免疫测定的灵敏性和特异性的标准物。因为各种抗体的结合亲和力可不同;某些抗体对(例如在夹心式测定中)可在空间上彼此干扰等,所以抗体的测定性能可为比抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。
也可使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白,但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生抗体。举例来说,可随机或通过同源性重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体引入小鼠胚胎干细胞中。或者,除人重链和轻链基因之外,也可将人可变区、恒定区和多样性区域引入小鼠胚胎干细胞中。可单独或与通过同源性重组引入人免疫球蛋白基因座同时致使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因成为非功能性的。具体地,纯合性缺失JH区会防止内源性抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞,并且将其显微注射至胚泡中以产生嵌合小鼠。接着使嵌合小鼠交配以产生表达人抗体的纯合性后代。使用常规方法,用所选抗原,例如本发明多肽的全部或一部分使转基因小鼠免疫。可使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。由转基因小鼠具有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排,并且随后经受类别转换和体细胞突变。因此,使用此类技术,有可能产生治疗适用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于用于产生人抗体的这个技术的概述,参见Lonberg等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol.13:65-93,其以引用的方式整体并入本文。对于用于产生人抗体和人单克隆抗体的这个技术以及用于产生此类抗体的方案的详细讨论,参见例如国际公布号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735;以及美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598,其以引用的方式整体并入本文。此外,诸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)的公司可被雇佣以使用与上述技术类似的技术提供针对所选抗原的人抗体。
抗体的重组表达
一旦已获得编码本发明的抗体的核酸序列,即可通过重组DNA技术,使用本领域中熟知的技术来产生用于产生所述抗体的载体。为本领域技术人员所熟知的方法可用于构建含有抗体编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。(参见例如Sambrook等,1990,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.以及Ausubel等编,1998,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,NY中所述的技术)。
可通过常规技术(例如电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞中,并且接着通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明的抗体。在特定实施方案中,抗体的表达由组成型、诱导型或组织特异型启动子调控。
用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞可为细菌细胞,诸如大肠杆菌(Escherichia coli),或优选是真核细胞,尤其对于表达完整重组免疫球蛋白分子。具体地,诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的哺乳动物细胞与诸如来自人巨细胞病毒的主要中期早期基因启动子元件的载体联合是免疫球蛋白的有效表达系统(Foecking等(1986)“Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian ExpressionVectors.”Gene 45:101-105;Cockett等(1990)“High Level Expression Of TissueInhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells UsingGlutamine Synthetase Gene Amplification,”Biotechnology 8:662-667)。
多种宿主表达载体系统可用于表达本发明的抗体。此类宿主表达系统代表可产生以及随后纯化抗体的编码序列所采用的载体,而且也代表在用适当核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本发明的抗体的细胞。这些包括但不限于微生物,诸如用含有免疫球蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis));用含有免疫球蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母);用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;用含有免疫球蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有免疫球蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统;或具有含有源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子;痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利号5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的大鼠视网膜细胞))。
在细菌系统中,视所表达的抗体的预定用途而定,可方便地选择许多表达载体。举例来说,当将产生用于产生抗体的药物组合物的大量此类蛋白质时,引导高水平的易于纯化的融合蛋白产物的表达的载体可为合乎需要的。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等(1983)“Easy Identification Of cDNA Clones,”EMBO J.2:1791-1794),其中抗体编码序列可与lac Z编码区同框个别地连接至载体中以便产生融合蛋白;pIN载体(Inouye等(1985)“Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichiacoli,”Nucleic Acids Res.13:3101-3110;Van Heeke等(1989)“Expression Of HumanAsparagine Synthetase In Escherichia coli,”J.Biol.Chem.24:5503-5509);等。pGEX载体也可用于以与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白形式表达外来多肽。一般来说,此类融合蛋白是可溶的,并且可易于通过吸附以及结合基质谷胱甘肽-琼脂糖珠粒,随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱来从溶解的细胞纯化。pGEX载体被设计以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以使克隆的靶标基因产物可从GST部分释放。
在昆虫系统中,苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)被用作用以表达外来基因的载体。所述病毒生长在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。抗体编码序列可被个别地克隆至病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中,并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中,可利用许多基于病毒的表达系统。在其中腺病毒被用作表达载体的情况下,可使目标抗体编码序列连接于腺病毒转录/转译控制复合物,例如晚期启动子和三联前导序列。这个嵌合基因可接着通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。插入在病毒基因组的非必需区域(例如区域E1或E3)中将产生在受感染宿主中具有活力并能够表达免疫球蛋白分子的重组病毒。(参见例如Logan等(1984)“Adenovirus TripartiteLeader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)81:3655-3659)。特定起始信号也可为高效翻译插入的抗体编码序列所需。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外,起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保翻译整个插入物。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可具有多种天然来源与合成来源两者。表达效率可通过纳入适当转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见Bitter等(1987)“Expression And Secretion Vectors For Yeast,”Methods in Enzymol.153:516-544)。
此外,可选择调节插入序列的表达,或以所需特定方式修饰以及加工基因产物的宿主细胞株。对蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白质的功能可为重要的。不同宿主细胞具有用于翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特征性和特定性机理。可选择适当细胞系或宿主系统以确保对表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。为此,可使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化以及使基因产物磷酸化的细胞机构的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20以及T47D、CRL7030和Hs578Bst。
对于长期高产率产生重组蛋白,稳定表达是优选的。举例来说,可工程改造稳定表达本发明的抗体的细胞系。胜于使用含有病毒复制起点的表达载体,宿主细胞可用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选择标记控制的DNA转化。在引入外来DNA之后,可使工程改造的细胞在富集培养基中生长1-2天,接着变换为选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予对选择的抗性,并且允许细胞将质粒稳定整合至它们的染色体中,并且生长以形成焦点,所述焦点转而可被克隆以及扩增至细胞系中。这个方法可有利地用于工程改造表达本发明的抗体的细胞系。此类工程改造的细胞系可特别适用于筛选和评估直接或间接与本发明的抗体相互作用的化合物。
可使用许多选择系统,包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等(1977)“Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured MouseCells,”Cell 11:223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等(1962)“Genetics Of Human Cess Line.IV.DNA-Mediated Heritable Transformation Of ABiochemical Trait,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48:2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等(1980)“Isolation Of Transforming DNA:Cloning The Hamster AprtGene,”Cell 22:817-823)基因分别可用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。此外,抗代谢物抗性可被用作针对以下基因进行选择的基础:dhfr,其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等(1980)“Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:3567-3570;O'Hare等(1981)“Transformation OfMouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By ARecombinant PlasmidExpressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:1527-1531);gpt,其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等(1981)“Selection For AnimalCells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-GuaninePhosphoribosyltransferase,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:2072-2076);neo,其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Tachibana等(1991)“Altered Reactivity OfImmunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene,”Cytotechnology 6(3):219-226;Tolstoshev(1993)“Gene Therapy,Concepts,Current Trials And Future Directions,”Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan(1993)“The Basic Science Of Gene Therapy,”Science 260:926-932;以及Morgan等(1993)“Human gene therapy,”Ann.Rev.Biochem.62:191-217)。重组DNA技术的本领域中通常已知的可使用的方法描述于以下中:Ausubel等(编),1993,CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,NY;Kriegler,1990,GENE TRANSFERAND EXPRESSION,A LABORATORY MANUAL,Stockton Press,NY;以及第12和13章,Dracopoli等(编),1994,CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS,John Wiley&Sons,NY.;Colbere-Garapin等(1981)“A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher EukaryoticCells,”J.Mol.Biol.150:1-14;以及hygro,其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等(1984)“Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418Resistance AsDominant-Selection Markers In Mouse L Cells,”Gene30:147-156)。
本发明的抗体的表达水平可通过载体扩增来增加(对于综述,参见Bebbington和Hentschel,“The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The ExpressionOf Cloned Genes In Mammaian Cells,”DNACLONING,第3卷(Academic Press,New York,1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时,增加存在于宿主细胞的培养物中的抑制剂的水平将使标记基因的拷贝数增加。因为扩增的区域伴有抗体的核苷酸序列,所以抗体的产生也将增加(Crouse等(1983)“Expression And Amplification Of EngineeredMouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,”Mol.Cell.Biol.3:257-266)。
宿主细胞可用本发明的两种表达载体共转染,其中第一载体编码重链源性多肽,并且第二载体编码轻链源性多肽。两种载体可含有使得重链和轻链多肽能够相等表达的相同可选择标记。或者,可使用编码重链多肽与轻链多肽两者的单一载体。在此类情况下,轻链应被放置在重链之前以避免毒性游离重链过量(Proudfoot(1986)“Expression AndAmplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,”Nature322:562-565;Kohler(1980)“Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体已被重组表达,它即可通过本领域中已知用于纯化抗体的任何方法纯化,例如通过色谱法(例如离子交换、亲和力(特别是在蛋白A之后通过对特定抗原的亲和力)和尺寸分级柱色谱法)、离心、溶解度差异,或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术。
实施例
实施例1:在兔中产生单克隆抗体
通过用抗原/佐剂乳液皮下注射(SQ)来使雌性新西兰兔免疫。初级免疫用完全弗氏佐剂进行,并且不完全弗氏佐剂用于所有随后加强。每三周以每只兔250μg蛋白质抗原SQ注射兔(两个部位(臀部和肩胛骨)交替)。在第二次加强之后七天从边缘耳静脉获取测试放血。通过间接ELISA测定来测试这个测试放血(免疫血清)以确定兔的免疫应答是否足以产生单克隆抗体。向最佳应答性兔给与最终SQ加强,并且四天后通过放血来安乐死。通过心脏穿刺收集全血。通过关于靶标抗原的间接ELISA鉴定产生目标抗体的B细胞,并且分离免疫球蛋白基因。将重链和轻链克隆至单独哺乳动物表达载体中,转染至HEK细胞中(瞬时转染),并且收获含有兔单克隆抗体的组织培养上清液。
实施例2:在小鼠中产生单克隆抗体
通过根据标准操作程序用抗原/佐剂乳液腹膜内注射(IP)来使雌性BALB/c小鼠(60天龄)免疫。初级免疫用完全弗氏佐剂进行,并且不完全弗氏佐剂用于所有随后加强。每3周以每只小鼠25μg抗原IP注射小鼠(每只小鼠总体积125μL)。在第二次加强之后7至10天,通过隐静脉穿刺进行测试放血。通过间接ELISA测定来测试这个测试放血(免疫血清)以确定小鼠的免疫应答是否足以融合。通过侧向尾部静脉向2只最佳应答性小鼠给与每只小鼠于无菌盐水中的10μg抗原的最终静脉内加强。在IV加强之后4天,使小鼠安乐死,并且收获脾。从脾分离的淋巴细胞在融合过程中用于使用Kohler,G.;Milstein,C.(1975)."Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity".Nature 256(5517):495–497的方法产生杂交瘤。使用PEG1500融合过程产生杂交瘤。
实施例3:用患者样品筛选抗体(基于微量滴定的ELISA方法)
材料:
96孔高结合ELISA板-Costar 3590(Corning)
ELISA涂布缓冲液:PBS
ELISA洗涤缓冲液:具有0.02%吐温-20(Tween-20)的PBS
ELISA封闭缓冲液(Thermo Pierce,目录号N502)
ELISA试剂稀释剂:200mM Tris、1%BSA(BioFx)、0.05%吐温-20,pH 8.1
中和亲和素-HRP缀合物(Thermo Pierce,目录号31001)
1步超敏TMB底物(R&D systems,目录号34028)
终止溶液:2N硫酸
捕获抗体
生物素缀合的检测抗体
重组人IGFBP7(Peprotech,目录号410-02)
EXLx405板洗涤器(Biotek)
多扫描FC板读取器(Fisher Scientific)
测试程序
将纯化的重组IGFBP7分析物加标至试剂稀释剂中,并且连续稀释以产生一组涵盖一定范围的浓度的标准样品。在室温水浴中解冻患者样品的冷冻的单次使用的等分试样10分钟,接着用试剂稀释剂稀释至所需水平。
添加于涂布缓冲液中制备的100μL 5μg/mL捕获抗体溶液至96孔高结合ELISA板上的各孔中,并且在室温(22℃至25℃)下孵育过夜。抽吸各孔,并且使用自动洗涤机用300μL洗涤缓冲液洗涤三次。接着添加250μL ELISA封闭缓冲液至各孔中。在室温下孵育2小时之后,重复上述抽吸/洗涤步骤。
添加100μL标准物或患者样品至制备的板的各孔中,并且在室温下在水平轨道振荡器上孵育。在孵育2小时之后,如上所述将板洗涤。接着添加于试剂稀释剂中制备的100μL0.1μg/mL检测抗体溶液至各孔中。在室温下孵育1小时之后,再次将板洗涤。于试剂稀释剂中制备0.1μg/mL中和亲和素-HRP缀合物溶液,并且添加100μL这种溶液至各孔中。在室温下将板孵育1小时并洗涤。添加100μL 1步超敏TMB底物至各孔中,在室温下避光孵育10分钟,随后添加50μL终止溶液。用设置成450nm波长的微板读取器测量各孔中的光密度。
实施例4:用患者样品筛选抗体(侧向流动条带测试方法)
材料:
硝化纤维素膜
背衬卡
样品垫
芯吸垫
膜封闭缓冲液:10mM磷酸钠、0.1%蔗糖、0.1%BSA、0.2%PVP-40,pH 8.0
样品垫封闭缓冲液:5mM硼酸盐、0.1%吐温-20、0.25%PVP-40、0.5%BSA,pH 8.5
操作缓冲液J:500mM Tris、0.2%10G、0.35%吐温-20、0.25%PVP-40,pH 8.5
荧光缀合抗体
测试线抗体
山羊抗小鼠阳性对照抗体
重组人IGFBP7
条带组件
使用AD3050抽吸分配系统用测试线抗体将硝化纤维素膜分条,用膜封闭缓冲液封闭,并且在37℃下干燥30分钟。在干燥器中固化过夜之后,将分条并封闭的硝化纤维素膜层压于具有芯吸垫和用样品垫封闭缓冲液预处理的样品垫的背衬卡上。将卡切割成5mm宽的测试条带,接着将其放置至柱筒中。
样品制备
将纯化的重组IGFBP7分析物加标至操作缓冲液J中,并且连续稀释以产生一组涵盖一定范围的浓度的标准样品。在室温水浴中解冻患者样品的冷冻的单次使用的等分试样10分钟,接着用操作缓冲液J稀释至所需水平。
测试程序
将10μL含荧光缀合抗体(0.025μg/μL)的PBS添加至100μL样品中。接着将100μL这种溶液装载至柱筒上的输入口中。在t=20分钟时,使用荧光读取器和相关软件读取结果。
实施例5:肽作图
材料:96孔高结合微量滴定板、中和亲和素、生物素化肽、未缀合抗体、小鼠IgG、兔IgG、山羊IgG、HRP缀合于抗小鼠IgG的HRP缀合物、抗兔IgG HRP缀合物、抗山羊IgG HRP缀合物、TMB底物、2N硫酸用于表位作图实验。
将中和亲和素固定在96孔高结合微量滴定板的个别孔中。洗涤各板以移除未反应的中和亲和素,随后进行封闭步骤。将生物素化肽溶解于水性缓冲液中以达到10μg/mL的浓度。添加50μL肽溶液至中和亲和素涂布的微量滴定板的各孔中。在室温下孵育这些板1小时,接着洗涤以移除未结合肽。将未缀合的小鼠和兔抗体稀释至5μg/mL,并且以100μL/孔添加至板中。将抗小鼠IgG(在小鼠抗IGFBP7的情况下)或抗兔IgG(在兔抗IGFBP7的情况下)作为阴性对照添加至相邻孔中。在室温下将板孵育1小时并洗涤。将HRP缀合的抗小鼠IgG(在小鼠抗IGFBP7和小鼠IgG阴性对照的情况下)和HRP缀合的抗兔IgG(在兔抗IGFBP7和兔IgG阴性对照的情况下)稀释至0.2μg/mL,并且添加100μL至板的各孔中。在室温下将这些板孵育20分钟并洗涤。添加100μL/孔的TMB底物,并且在避免暴露于光照下将板孵育20分钟。添加50μL/孔的终止溶液(2N硫酸)至各孔和各板中以终止反应。在设置成在450nm下测量光密度的分光光度性96孔微板读取器上读取吸光度。
实施例6:丙氨酸扫描肽作图
丙氨酸扫描是一种广泛使用的诱变方法,其中通过定点诱变在所选位置处使靶标蛋白质中的残基系统地取代成丙氨酸,表达并测定功能。用丙氨酸残基取代会消除侧链相互作用而不改变主链构象或引入立体或静电效应。使用自动化诱变方案,靶标多肽中每个残基被变为丙氨酸,并且可确定构成各抗体结合结构域的关键残基。
实施例7:结果
使用丙氨酸扫描和肽作图的组合结果,独特的IGFBP7单克隆抗体得以鉴定并基于分析性能加以选择。
实施例8:测序数据
抗体IC9E4.1的同种型被确定为鼠类IgG1/κ抗体。获得来自单克隆细胞系的cDNA以通过标准方法测序。重链可变区和轻链可变区的序列如下:
V轻(SEQ ID NO:9)
V重(SEQ ID NO:10)
抗体1D6
抗体1D6的同种型被确定为鼠类IgG1/κ抗体。通过表位作图,确定1D6抗体结合IGFBP7的构象表位。获得来自单克隆细胞系的cDNA以通过标准方法测序。重链可变区和轻链可变区的序列如下:
V轻(SEQ ID NO:11)
V重(SEQ ID NO:12)
尽管本发明已足够详细地被描述和例示以供本领域技术人员进行和使用本发明,但在不脱离本发明的精神和范围下,各种替代方案、修改和改进应为显而易知的。本文提供的实施例代表优选实施方案,是示例性的,并且不意图作为对本发明的范围的限制。其中修改和其它用途将为本领域技术人员所想到。这些修改涵盖在本发明的精神内,并且由权利要求的范围所限定。
除非另外陈述,否则在本文中使用“或”意指“和/或”。类似地,“包含(comprise/comprises/comprising/include/includes)”和“包括(including)”可互换,并且不意图具有限制性。
应进一步了解当对各种实施方案的描述使用术语“包含”时,本领域技术人员将了解在一些特定情况下,实施方案可使用措辞“基本上由…组成”或“由…组成”加以替代地描述。
除非另外定义,否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与为本公开所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的方法和试剂类似或等效的任何方法和试剂都可用于实施公开的方法和组合物,但现时描述示例性方法和材料。
本文提及的所有出版物都出于描述和公开出版物中所述的可能与本文描述关联使用的方法的目的以引用的方式全部并入本文。说明书中提及的所有专利和出版物都指示在本公开的提交日期之前,本发明所属领域中的普通技术人员的水平。本文中没有内容应解释为承认本发明者由于先前公开而无权先于此类公开。
将为本领域技术人员显而易知的是可在不脱离本发明的范围和精神下对本文公开的本发明进行不同替代和修改。
可在不存在本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制下适合地实施本文以说明方式描述的本发明。因此,例如在本文各情况下,术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”中的任一个可用另外两个术语中的任一个替换。已采用的术语和表述被用作描述术语而非限制术语,并且不意图在使用此类术语和表述时排除所示和所述特征或其各部分的任何等效物,而是应认识到各种修改可能在要求保护的本发明的范围内。因此,应了解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征明确公开,但对本文公开的构思的修改和变化可由本领域技术人员采取,并且此类修改和变化被视为在本发明的如由随附权利要求限定的范围内。
其它实施方案阐述在以下权利要求内。
Claims (12)
1.一种分离的抗体,所述分离的抗体结合人IGFBP7蛋白且包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:11的轻链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区的三个互补决定区。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体,其中所述互补决定区根据Kabat被限定。
4.根据权利要求1所述的分离的抗体,其中所述抗体具有轻链可变区,其具有氨基酸序列SEQ ID NO:11;和重链可变区,其具有氨基酸序列SEQ ID NO:12。
5.一种核酸,其编码抗体,所述抗体结合人IGFBP7蛋白且包含具有氨基酸序列SEQ IDNO:11的轻链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区的三个互补决定区。
6.根据权利要求5所述的核酸,其中所述抗体为单克隆抗体。
7.根据权利要求5或6所述的核酸,其中所述互补决定区根据Kabat被限定。
8.根据权利要求5所述的核酸,其中所述抗体具有轻链可变区,其具有氨基酸序列SEQID NO:11;和重链可变区,其具有氨基酸序列SEQ ID NO:12。
9.一种抗体表达性细胞系,所述细胞系表达结合人IGFBP7蛋白且包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区的三个互补决定区的抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体表达性细胞系,其中所述抗体为单克隆抗体。
11.根据权利要求9或10所述的抗体表达性细胞系,其中所述互补决定区根据Kabat被限定。
12.根据权利要求9所述的抗体表达性细胞系,其中所述抗体具有轻链可变区,其具有氨基酸序列SEQ ID NO:11;和重链可变区,其具有氨基酸序列SEQ ID NO:12。
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