KR102533791B1 - 비색법 신호형질 복합체, 이를 이용하는 신장질환 진단용 키트 및 진단법 - Google Patents

비색법 신호형질 복합체, 이를 이용하는 신장질환 진단용 키트 및 진단법 Download PDF

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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 신장질환 관련 바이오마커 특이적 항체; 크로스 링커; 및 상기 크로스 링커에 의해 상기 항체와 공유적으로 결합된 전이금속-유기 프레임워크(MOF);를 포함하는 복합체로서, 상기 크로스 링커는 2개 이상의 -COOH 작용기를 가지는 물질 또는 상기 물질을 유도할 수 있는 전구체이며, 전체 크기가 100 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 비색법 신호형질 복합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 비색법 신호형질 복합체를 활용한 진단 키트 및 질환 진단법을 제공한다.
본 발명의 비색법 나노복합체는 다공성 구조의 사이즈가 작은 친수성 소재이며, 갈색을 띄어 비색법 신호형질로 작용한다. 이를 이용한 진단키트는 암 등을 포함한 4대 중증 질환, 특히 신장질환의 Point of care 진단 키트로 활용가능하며, 단순성, 소형화의 용이성, 뛰어난 선택성 및 감도를 가진다는 장점이 있다.

Description

비색법 신호형질 복합체, 이를 이용하는 신장질환 진단용 키트 및 진단법{Colorimetric signal trait complex, kit for diagnosing kidney disease and diagnostic method using the same}
본 발명은 비색법 신호형질 복합체, 이를 이용하는 신장질환 진단용 키트 및 진단법에 관한 것으로, 상세하게는 MOF 및 신장질환 관련 바이오마커 특이적 항체가 공유적으로 결합된 비색법 신호형질 복합체, 이를 이용하는 신장질환 진단용 키트 및 진단법에 관한 것이다.
최근에는 무기-유기물이 결합된 형태의 효소 모방 센서물질이 보고되었고, 특히 금속-유기 골격체(metalorganic framework; MOF)는 구조적인 특성으로 인해 합성 후 개질(post synthetic modification)을 통해 기능화 및/또는 기공도를 조절하여 촉매 등의 활성을 부여하거나 조절할 수 있으므로, 금속-유기 골격체의 개질을 통한 바이오센서 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이에 본 발명자들은 금속이 함유된 다공성 유무기 혼성체, MOF를 합성하고, 이에 항체를 공유 결합하여 비색법에 활용 가능한 신호형질 복합체 소재를 형성하고, 이를 이용한 진단키트 및 질환 진단법을 개발하고자 한다.
대한민국 등록특허 제10-1832095호
본 발명은 상기와 같은 필요를 해결하기 위하여, 비색법 신호형질 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 상기 복합체를 이용한 신장질환 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 상기 복합체를 이용한 신장질환 진단법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
신장질환 관련 바이오마커 특이적 항체;
크로스 링커; 및
상기 크로스 링커에 의해 상기 항체와 공유적으로 결합된 전이금속-유기 프레임워크(MOF);를 포함하는 복합체로서,
상기 크로스 링커는 2개 이상의 -COOH 작용기를 가지는 물질 또는 상기 물질을 유도할 수 있는 전구체이며, 전체 크기가 100 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 비색법 신호형질 복합체를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 비색법 신호형질 복합체를 이용하여 제조된 신장질환 진단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 비색법 신호형질 복합체와 시료 내 신장질환 관련 바이오마커와 결합시킨 후, LFIA(Lateral flow immunoassay) 칩에 적용하여 면역 샌드위치 복합체 존재 여부를 확인하는 신장질환 진단법을 제공한다.
본 발명의 비색법 나노복합체는 다공성 구조의 사이즈가 작은 친수성 소재이며, 갈색을 띄어 비색법 신호형질로 작용한다. 이를 이용한 진단키트는 신장질환 등을 포함한 4대 중증 질환, 특히 신장질환의 Point of care 진단 키트로 활용 가능하며, 단순성, 소형화의 용이성, 뛰어난 선택성 및 감도를 가진다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체-MOF 나노복합체의 제조과정, LFIA 절차 및 결과를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 MIL101(Fe)-AC의 XRD 및 FTIR 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 MIL101(Fe)-PAA의 FTIR 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 조건의 최적화에 대한 결과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 소변 샘플에서의 TGM2 검출 선택성 및 간섭 분석을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 완충액, 소변 및 탈염된 소변 샘플에서 LFIA 기반 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA-항-TGM2(2F2)의 성능 비교를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 완충액 및 탈염된 소변 샘플에서 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA를 이용하여 0 - 13 nM의 TGM2 농도 측정을 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 완충액 및 소변 샘플에서 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA를 이용한 피팅 곡선 비교를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 MIL101(Fe)-PAA를 사용한 TGM2 검출 ASSAY TIME 결과를 도시한 것이다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일측면에 따르면, 신장질환 관련 바이오마커 특이적 항체; 크로스 링커; 및 상기 크로스 링커에 의해 상기 항체와 공유적으로 결합된 전이금속-유기 프레임워크(MOF);를 포함하는 복합체로서, 상기 크로스 링커는 2개 이상의 -COOH 작용기를 가지는 물질 또는 상기 물질을 유도할 수 있는 전구체이며, 전체 크기가 100 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 비색법 신호형질 복합체를 제공한다.
본 발명의 비색법 신호형질 복합체는 시각적으로 식별가능한 갈색의 색깔을 지니며, 추출한 시료 내의 신장질환 관련 바이오마커와 결합하여 샌드위치 면역 복합체를 형성하고, 키트 스트립 상에서 갈색을 띄게 한다. MOF는 색상을 나타내게 하는 주구성 요소이며, 비색법으로 사용할 수 있는 MOF라면 그 종류를 제한하지 않는다. 본 발명에서 사용 가능한 MOF는 전이금속, 특히 Fe, V, Cr, Mn, Co, Ni, Cu에서 1개 이상의 금속을 함유한 MOF이며, 바람직하게는 Fe을 함유한 MOF이고, 더 바람직하게는 MIL-101(Fe), MIL-100(Fe), MIL-101(Fe)-NH2이고 가장 바람직하게는 MIL-101(Fe)-NH2이다. 본 발명의 실시예에서는 아민기를 갖는 MIL-101(Fe)-NH2(iron-2-aminoterephthalate)를 합성하고 이를 사용한다. MOF의 크기는 1 μm 이하가 바람직하며, 더 바람직하게는 150 내지 250 nm이며, 더욱 더 바람직하게는 150 내지 200nm, 가장 바람직하게는 160 내지 200nm이다.
MOF는 크로스 링커를 통해 항체와 공유적으로 연결되며, 크로스 링커는 MOF의 아민기와 결합하여 항체가 결합할 카르복실기 기능기를 제공한다. 본 발명에서의 크로스 링커는 2개 이상의 -COOH 작용기를 가지는 물질 혹은 이러한 물질을 유도할 수 있는 전구체라면 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 oxalyl chloride (OC), oxalic acid, malonyl chloride, malonic acid, succinyl chloride, succinic acid, glutaryl chloride, glutanic acid, adipoyl chloride (AC), adipic acid, polyacrylic acid (PAA) 등이고, 바람직하게는 OC, AC 및 PAA이며, 더욱 바람직하게는 PAA이다. 카르복실기 말단을 가진 MOF-크로스 링커는 항체의 아민기와 크로스 링커에 의해 결합되어, 비색법 신호형질 복합체를 형성한다.
크로스 링커의 분자량은 시료 속에서의 항체-MOF 복합체의 안정성에 영향을 미치며, 고분자량일수록 형성된 복합체가 분해되지 않고 더 안정적이다. 본 발명에서 사용한 링커의 중량평균분자량(Mw)은 90 내지 1,000,000이며, 바람직하게는 10,000 내지 1,000,000이고, 더욱 바람직하게는 100,000 내지 500,000이다. 앞서 기재한 OC, succinyl chloride, glutaryl chloride 등은 저분자량을 갖는 크로스 링커로 시료 속에서 항체-MOF 복합체가 안정적으로 유지될 수 없기 때문에 시료의 간섭을 최소화하는 과정을 거쳐야 한다. 반면, PAA 등은 바람직하게는 100,000 내지 1,000,000이고, 더 바람직하게는 100,000 내지 500,000이고, 더욱 더 바람직하게는 200,000 내지 300,000의 고분자량 링커로, 시료 속에서 항체-MOF 복합체가 분해되지 않고 안정적으로 유지할 수 있게 하여, 시료의 간섭 최소화 과정을 필수적으로 수행하지 않아도 복합체로서의 기능을 잃지 않는다.
본 발명의 반응 중간에 개입하지만 최종적으로는 생성물에 포함되지 않는 바인더가 사용될 수 있다. 본 발명의 바인더는 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어, dicyclohexyl carbodiimide (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), 3-[(2-aminoethyl)dithio]propionic acid·HCl (AEDP), N-(ε-Trifluoracetylcaproyloxy)succinimide ester (TFCS), Carbonyldiimidazole(CDI), 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide methyl p-toluene sulfonate (CMC), Disuccinimidyl suberate (DSS), Dithiobis(succimidylpropionate) (DSP), Disuccinimidyl suberate (DST), Dithiobis(succimidylpropionate) (DMP), Disuccinimidyl suberate (BS3), Dimethyl suberimidate·2HCl (DMS), dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP), disuccinimidyl glutarate (DSG), 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene (DFDNB), ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate) (Sulfo-EGS), tris-(succinimidyl)aminotriacetate (TSAT), Bis(2-[Succinimidooxycarbonyloxy]ethyl) sulfone (BSOCOES) 및 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide sulfo (NHSS)에서 선택된 하나 이상일 수 있으며,가장 바람직하게는 EDC/NHSS이다. 본 발명의 실시예에서 사용한 EDC/NHSS의 경우, 아민 커플링 반응을 통한 공유결합의 형성에 사용되는 가장 대표적인 바인더이다. 이렇게 형성된 소재의 항체부와 MOF는 컨쥬게이션된 형태로, 항체부가 시료 내 신장 질환 관련 바이오마커와 결합하고 이후 키트 스트립 상에서 샌드위치 면역 복합체를 형성하는 것으로 질병을 진단할 수 있다.
본 발명에서 제조한 비색법 신호형질 복합체는 친수성 특성을 갖는 다공성 구조이고, 그 크기는 50 내지 500nm, 바람직하게는 100 내지 500nm이며, 더 바람직하게는 150 내지 250nm이다.
본 발명의 시료는 인간 세럼, 플라즈마, 혈액 및 소변에서 추출할 수 있으며, 질병 진단에 사용되는 신장질환 관련 바이오마커가 포함된 시료라면 사용에 제한이 없다. 신장 질환은 급성 신손상, 말기 신장 질환(end-stage kidney disease; ESKD), 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병성 신장 질환 (DN), IgA 신장염 (IgAN), HIV- 관련 신증, 비 당뇨병성 만성 신장질환, 국소분절사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 미세변화형 신증후군 (MCD), 및 크산틴 옥시다아제 결핍증 등일 수 있으나, 각 신장질환을 대표할 수 있는 바이오마커가 존재한다면 질환의 종류를 제한하지 않는다. 본 발명의 신장질환 관련 바이오마커는 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 혈액, 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단백질이다. 본 발명의 실시예에서 사용한 Transglutaminase2(TGM2)는 신장암을 대표하는 단백질 마커이며, 다양한 조직에서 정상일 때는 낮은 수치로 발현되다가, 여러 가지 병리적인 상태에서 비정상적으로 활성화되므로 발현 수준을 측정하여 신장암을 진단할 수 있다.
본 발명의 "진단 (diagnosis)"은 넓은 의미는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태 및 합병증의 유무 등이다.
본 발명의 다른 일측면에 따르면, 비색법 신호형질 복합체를 이용한 신장질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 크게 진단 스트립, 하부 케이스, 상부 케이스로 구성되며, 진단 스트립은 멤브레인, 검체 패드, 및 흡수패드를 포함한다. 본 발명의 하부 케이스는 진단 스트립의 일면을 지지하며, 상부 케이스는 하부 케이스에 결합되어 분석 스트립의 다른 일면을 덮으며, 검체 패드에 대응하는 검체 투입구와 멤브레인에 대응하는 결과 표시창 및 상기 흡수 패드에 대응하는 문자 표시구를 포함한다.
본 발명의 멤브레인은 검출 결과를 나타내는 부분으로서 조성물이 고정된 검사선 및 대조선이 위치하는데, 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.
본 발명의 검체패드는 멤브레인 한쪽 끝 상부에 일부 중첩되게 위치하여 신장질환 관련 바이오마커, 신장질환 관련 바이오마커 특이적 항체-MOF 비색 신호형질 복합체를 포함하는 검체 전개액을 흡수한다. 검체 전개액은 채취한 시료, 비색 신호형질 복합체가 혼합된 것으로, 질환이 있다면 검체 전개액에는 시료 내의 신장질환 관련 바이오마커와 비색 신호형질 복합체가 결합한 상태로 존재한다. 이 검체 전개액을 검체 패드 상에 떨어트리면 신장질환 관련 바이오마커와 비색 신호형질 복합체가 결합한 채로 스트립 상에서 흘러 검사선(test line)에 위치하는 상기 바이오마커와 특이적으로 결합하는 고정 항체와 면역 샌드위치 복합체를 형성한다. 이로써 멤브레인 상의 대조선(control line)과 검사선(test line)에 모두 두 줄의 갈색선이 나타나고, 이는 질병이 있다고 판단한다. 이때 대조선은 비색 신호형질 복합체만 결합하며, 상기 복합체와 결합하는 대조선 상의 고정 항체는 교차 반응을 유발하지 않으면, 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나 본 발명에서는 흔히 사용하는 IgG 항체를 사용한다. 검사선과 대조선은 간격을 두고 위치하며, 그 간격은 4 내지 8mm, 바람직하게는 4 내 7mm, 더 바람직하게는 5 내지 7mm이다.
또한, 본 발명의 흡수 패드는 멤브레인의 또 다른 반대 쪽 끝 상부에 위치하여 검체 전개액에서 반응하지 않은 내용물을 흡수하며, 검사창의 멤브레인이 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다.
검체패드, 멤브레인 및 흡수패드가 각각 중첩되어 분석 스트립을 형성하고, 본 발명에서의 분석 스트립은 하나 이상을 포함하는 면역 스트립 형태일 수 있으며, 바람직하게는 단변의 폭과 장변의 길이를 갖는 형태일 수 있다. 또한, 하부 케이스와 상부 케이스는 하나의 분석 스트립을 내장하여 1회에 1가지 질병에 대한 검사만을 가능하게 할 수 있으며, 2개 이상의 분석 스트립을 내장하여 2가지 이상의 질병에 대한 검사를 가능하도록 할 수도 있다.
발명의 또 다른 일측면에 따르면, 비색법 신호형질 복합체를 이용한 신장질환 진단법을 제공한다.
먼저, 신장질환 관련 바이오마커 특이적 항체-MOF 신호형질 복합체를 형성한다. 본 발명의 복합체는 MOF와 항체를 연결하는 크로스 링커의 종류에 따라 완충액 또는 채취 시료에서의 감도 차이가 발생할 수 있는데, 예를 들어, MIL101(Fe)-OC 및 MIL101(Fe)-AC는 채취 시료의 방해 요소에 의해 완충액에서보다 감도가 감소하는 반면에, MIL101(Fe)-PAA는 탈염된 채취 시료 또는 완충액에 관계 없이 반응 차이가 없다. 그래서 PAA와 같은 고분자량의 크로스 링커를 사용하면 시료의 복합한 매질에 의해 복합체의 분해와 같은 간섭을 받지 않으므로 높은 감도를 띌 수 있다.
다음으로, 시료를 채취하여, 간섭을 최소화한다. 시료 내에는 매질들이 다수 존재하기 때문에 탈염과 같은 간섭 최소화를 수행하여, 시료 내 매질의 일부를 제거하는 것으로 감도가 감소하는 것을 방지할 수 있다.
다음으로, 복합체 및 시료를 반응시켜 검체 전개액을 형성하고, 이를 키트의 검체 투입구에 투입하여 멤브레인 상의 고정 항체들과 반응시켜 질병을 진단한다. 멤브레인 상에 Test line에는 신장질환 관련 바이오마커에 특이적인 고정 항체가 존재하며, 시료 내 바이오마커 존재시 Test line과 Control line에서 모두 나타낸다.
본 발명에서 사용된 탈염된 소변 시료에서 MIL101(Fe)-OC는 바이오마커 농도가 0.57nM 이상이면 측정할 수 있으며, MIL101(Fe)-AC 및 MIL101(Fe)-PAA는 바이오마커 농도가 0.05nM 이상이면 측정할 수 있다. 본 발명에서 실시한 예로 신장암을 진단하기 위해 사용되는 Transglutaminase 2 단백질 마커의 경우, 0.057 내지 13 nM 농도까지 검출 가능하며, LOD(3σ/m)는 0.05 내지 0.07 nM이며, 바람직하게는 0.05 내지 0.06nM, 가장 바람직하게는 0.055nM이다.
특히 MIL101(Fe)-PAA 기반 LFA 스트립은 높은 정밀도와 재현성을 나타내는데, 탈염된 시료 샘플 내의 바이오마커 농도가 0.2 내지 3.5 nM일 때, 평균 회수율(Recovery, %)은 85 내지 105%, 바람직하게는 85 내지 104%, 더 바람직하게는 86 내지 104%이며, 변이계수(Coefficient of Variability(CV), %)는 4.0 내지 10.0%, 바람직하게는 4.0 내지 9.0%으로 정밀도와 재현성이 모두 우수하다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에서 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예>
재료
1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC), N-히드록시술포숙신이미드(NHSS), 트랜스글루타미나제 2(TGM2), 염화옥살릴(OC), 염화아디포일(AC), 폴리아크릴산(PAA), (N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄설폰산(10mM HEPES pH 7.4), 트리스아미노메탄(10mM Tris pH 7.4), 소혈청알부민(BSA), 시험선(T선), 대조선(C line), 염소 항마우스 면역글로불린 G 항체(IgG 항체) 및 니트로셀룰로오스(NC)를 사용하였다.
실시예 1 - 신장질환 진단용 LFIA 진단키트의 제조
(1) MIL101(Fe)-항-TGM2(2F2) 항체 나노복합체의 제조
MIL101(Fe)-NH2는 amino terephthalic acid와 FeCl3 6H2O을 원료로 활용하고 물을 용매로 사용하여 마이크로파 반응기에서 60 °C에서 5분간 반응하여 얻었다. MIL101(Fe)-NH2는 -COOH 말단 그룹을 갖는 옥살릴 클로라이드(OC), 아디포일 클로라이드(AC) 및 폴리아크릴산(PAA)와 접목하여, MIL101(Fe)-OC, MIL101(Fe)-AC 및 MIL101(Fe)-PAA를 형성하였다. 이후, EDC/NHSS를 이용하여 MIL101(Fe)-OC, MIL101(Fe)-AC 및 MIL101(Fe)-PAA에 항-TGM2(2F2) 항체를 각각 결합시켰다.
(2) 스트립 조립
LFIA의 스트립은 접착성 백킹 패드에 접착된 NC 멤브레인과 흡수 패드로 구성되었다. 항-TGM2의 포획항체(CUB7402)와 IgG의 대조항체를 NC 막에 각각 6mm의 간격을 두고 확립된 T 및 C선에 분사하였다.
실시예 2 - 테스트 절차
먼저, 2.5 uL의 MIL101(Fe)-항-TGM2(2F2) 및 25 uL의 샘플(TGM2 단백질을 포함하는 Tris/소변 샘플)을 37.5 uL의 실행 완충액(10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 0.5% BSA, 0.5% Triton x-100)이 포함된 96-마이크로웰 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음, LFIA 스트립을 마이크로웰에 수직으로 삽입하여 모든 혼합물 용액이 모세관력으로 흐르도록 하였다.
실시예 3 - 분석 조건의 최적화
NC 멤브레인, 버퍼 조건 및 항체 농도가 최적화되었다. NC 멤브레인의 경우, 모세관 흐름 시간, 위킹 속도, 두께 및 흡수율과 같은 다른 특성을 가진 3개의 다른 회사의 멤브레인을 테스트하였다. 버퍼 조건의 경우, 10mM 인산 완충 식염수 pH 7.4(PBS), 10mM Tris 완충 식염수 pH 7.4(TBS), 및 10mM HEPES 완충 식염수 pH 7.4(HBS)를 면역분석에서 완충액을 위한 주성분으로 수행하였다. 또한, 버퍼에 계면활성제를 사용하여 LFIA의 특정 결합, 혈청 알부민을 사용하여 비특이적 결합 정도를 조사하였다. 항체 농도의 경우, MIL101(Fe)-에 연결된 검출 항-TGM2(2F2) 항체의 농도가 최적화되었다.
실시예 4 - 소변 샘플에서의 간섭 분석
TGM2 분석에 앞서, LFIA 기반 MIL101(Fe)-항-TGM2(2F2)의 성능을 다양한 매트릭스 샘플에서 테스트하였다. 개발된 LFIA [MIL101(Fe)-OC-anti-TGM2(2F2)]를 사용하여 소변 및 완충액에서 동일한 농도의 TGM2 표적을 테스트하였다.
실시예 5 - 소변 샘플에서의 TGM2 검출 성능 분석
건강한 사람 소변의 주요 성분에는 1.108mM Ca2+, 9.911mM 요산, 1.63mM 시트르산, 2.926mM Mg2+, 0.184mM NH4 +, 0.061M Na+, 20.8mM K+, 12mM SO4 2-, 15.5mM PO4-, 0.184mM 옥살레이트, 0.1965M 요소, 1.5mg/mL EDTA 및 5.194mM 크레아티닌이 포함되어 있다. 이러한 구성 요소는 TGM2 단백질(13nM)이 있는 상태에서 개발된 LFIA를 사용하여 평가되었다.
실시예 6 - 소변 샘플에서의 간섭 최소화
탈염 컬럼을 사용한 전처리 샘플은 소변 샘플에서 Ca2+를 제거하기 위해 수행되었다. 이 실험에서는 완충액, 소변 및 탈염된 소변 샘플에서 고정 TGM2 농도를 검출하기 위해 LFIA 기반 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA-항-TGM2(2F2)의 성능을 비교하였다. 탈염된 소변 샘플을 준비하기 위해 TGM2 단백질을 13nM의 최종 농도에서 원시 소변 샘플에 먼저 스파이크하였다. 그런 다음 이 용액을 탈염 컬럼에 적하하고 1500rpm에서 2분간 원심분리하였다. 다른 한편으로, TGM2는 또한 13nM의 최종 농도에서 완충액 및 미가공 소변 샘플에 스파이킹되었다. 이 세 가지 샘플은 항-TGM2(2F2)-표지 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA와 함께 LFIA를 사용하여 측정되었다.
실시예 7 - 링커 종류에 따른 LFIA 성능 비교
LFIA 성능에 대한 다양한 링커의 효과는 완충액 및 탈염된 소변 샘플에서 0 - 13 nM의 TGM2 농도를 측정하여 평가하였다. 또한, 스마트폰 카메라로 캡처한 LFIA 스트립의 이미지는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 추출되었다. 그런 다음, TGM2 농도의 함수로 스트립의 T 라인에서 강도를 플롯하여 보정 곡선을 구성하였다.
실시예 8 - 회수 테스트
상기 실시예 7에서 LFIA 성능을 비교한 결과, MIL101(Fe)-PAA 기반 LFA 스트립이 진단 활용에 가장 적합하였다. 그래서 회수 테스트는 MIL101(Fe)-PAA 기반 LFA 스트립을 이용하여 탈염된 소변 샘플에서 진행하였으며, 재현성과 정밀도를 평가하였다.
실시예 9 - TGM2 검출에 대한 분석 시간 실험
MIL101(Fe)-PAA-항-TGM2를 사용하여 최적화된 LFIA 조건에서, TGM2 검출의 분석 시간은 마이크로웰 플레이트에 샘플 용액을 추가한 후 스마트폰 카메라로 2분마다 기록되었다.
실험예 1 - 특성 분석
H2O, 10 mM citrate buffer(pH 3.0), 10 mM phosphate buffer(pH 7.4), 10 mM HEPES buffer(pH 7.4), 10 mM Tris-HCl buffer(pH 7.4), 10 mM Tris-EDTA buffer(pH 8.0)의 다양한 버퍼 용액 하에서 MIL101(Fe)-OC의 SEM 이미지를 관찰하였다. 또한, MIL101(Fe)-AC 및 MIL101(Fe)-PAA의 XRD 및 FTIR 분석을 수행하였다.
<결과 및 평가>
결과 1 - 테스트 절차
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체-MOF 나노복합체의 제조과정, LFIA 절차 및 결과를 도시한 것이다. 도 1의 (a)를 참조하면, 항체-MOF 나노복합체의 제조과정을 나타낸 것으로, 각 링커의 -COOH는 항-TGM2(2F2) 항체의 1차 아민과 결합하기 위해 EDC/NHSS 공유 결합 화학을 사용하여 활성화되고, MIL101(Fe)-OC/AC/PAA와 항- TGM2(2F2) 항체가 연결된 아미드 생성물이 형성되었다. 또한, 항체가 항원 결합 부위로 작용하기 때문에 MIL101(Fe) 표면에 항-TGM2(2F2) 항체의 구성이 필요하다. Y형으로 알려진 항체는 항원 결합 단편(이 경우 Transglutaminase2(TGM2) 단백질 바이오마커)에 대해 완전히 노출되고 접근 가능해야 한다. LFIA의 검출 성능을 향상시키기 위한 MIL101(Fe)-표면에 물질 링커의 차이가 특정 부위에 로딩된 항체, 더 높은 검출감도, MIL101(Fe)의 안정성을 포함하여 물리화학적 특성의 차이에 기인한다.
도 1의 (b)를 참조하면, MIL101(Fe)-항-TGM2를 사용하여 샘플 용액에서 TGM2 단백질을 검출하기 위한 측면 유동 면역분석 절차 및 LFIA 결과를 나타낸 것이다.
항-TGM2 항체로 표지된 MIL101(Fe)이 용액 내 TGM2 단백질에 결합하면 T 라인의 2차 항체(anti-TGM2 CUB7402)에 포획되었다. 나머지 TGM2 단백질이 결합되지 않은 MIL101(Fe)-항-TGM2은 C라인을 통해 계속 흘러서 C라인에 분사되어 있는 IgG 대조군 항체와 결합하였다. 용액에 사용 가능한 TGM2 단백질이 없는 경우 MIL101(Fe)-항-TGM2는 C 라인에서만 포획되었다. 결과적으로 T와 C 라인의 신호가 함께 나타날 때 양성, C 라인에서만 나타날 때는 음성을 의미한다.
결과 2 - 특성 평가
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 MIL101(Fe)-AC의 XRD 및 FTIR 결과를 도시한 것이다. 도 2의 (a)를 참조하면, 초기 합성한 MIL101(Fe)-NH2와 작용기를 변형시킨 MIL101(Fe)-AC의 결정성을 확인할 수 있으며, 변형시켜 줌에 따라 결정성이 기존의 MIL101(Fe)-NH2에 비해 감소하였다. 도 2의 (b)는 합성한 MOF의 작용기를 확인하기 위한 FTIR 결과이다. Adipoyl chloride가 도입되어 1582, 1120 cm-1에서 amide 결합으로 인한 C=O, C-N peak이 생성되었고, 1161 cm-1에서는 carboxylate에 의한 C=O peak이 기존 peak 대비 증가하는 것을 확인하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 MIL101(Fe)-PAA의 FTIR 결과를 도시한 것이다. MIL-101(Fe)-NH2에 PAA MW:2000, 240,000를 넣고 합성하였으며, MW: 2000은 MIL-101-PAA(S), MW: 240,000은 MIL-101-PAA(L)으로 명명한다. 도 3의 (a)를 참조하면, 1305, 1590, 1722 cm-1 의 파장에서 peak 차이를 확인하였으며, 특히 1722 cm-1 부근에서는 PAA 첨가로 인해 broad 하지만 peak의 변화를 확인하였다.
또한, 도 3의 (b)를 참조하면, MIL-101(Fe)-NH2에 PAA(MW: 240,000)를 50, 100, 150 mg 넣고 합성한 후, 1305, 1590, 1722 cm-1 의 파장에서 peak 차이를 확인하였으며, 특히 1722 cm-1 부근에서는 PAA 첨가로 인해 broad 하지만 peak의 변화를 확인하였다.
결과 3 - 분석 조건의 최적화
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석 조건의 최적화에 대한 결과를 도시한 것이다. 도 4의 (a) 및 (b)를 참조하면, MDI의 멤브레인은 다른 회사의 멤브레인에 비해 더 높은 감지 신호를 가지며, HBS는 TBS 및 PBS에 비해 가장 높은 응답을 나타내었다. 도 4의 (c)를 참조하면, 비이온성 계면활성제로 Tween 20과 Triton x-100 1%는 전하를 함유하지 않기 때문에 사용될 수 있으며, 러닝 버퍼에서 Triton x-100을 사용하면 LFIA의 특정 결합이 크게 향상되었다. 음이온 및 양이온 계면활성제는 시료의 성분과 강하게 상호작용할 수 있으므로 금지된다. 도 4의 (d)를 참조하면, 소 혈청 알부민(BSA)은 표면을 차단하는 것으로 알려져 있는데, 러닝 버퍼에서 BSA 농도의 효과는 비특이적 결합(NSB)을 줄이기 위해 최적화되었다. BSA의 1%가 NSB를 줄이기 위한 우수한 분석 성능을 제공하여 LFIA에서 최소한의 노이즈를 초래할 수 있지만, BSA의 농도가 높을수록 더 강한 NSB를 유발하였다. 도 4의 (e)를 참조하면, 검출 항체의 농도를 증가시키면 LFIA에서 특이적 결합(SB)이 유의하게 증가하였다.
결과 4 - 소변 샘플에서의 간섭 분석
이 실험은 MIL101(Fe)-OC만을 사용하여 수행되었다. 이러한 결과를 분석하여 MIL101(Fe)-AC와 -PAA를 제안하였다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 소변 샘플에서의 TGM2 검출 선택성 및 간섭 분석을 도시한 것이다. 도 5의 (a)를 참조하면, 소변 샘플에서 테스트된 LFIA의 T 라인 강도가 완충 배지에서의 테스트와 비교하여 약간 감소되었다. 이것은 소변 샘플의 LFIA 테스트가 알려지지 않은 복잡한 매트릭스의 간섭으로 인해 흡착 손실(음의 오차)을 겪는다는 것을 의미한다. 따라서 신호 감소에 기여하는 요인을 이해하기 위해 소변 샘플의 잠재적 간섭을 주의 깊게 분석해야 한다.
도 5의 (b)를 참조하면, 소변에 포함된 여러 성분으로 TGM2를 검출한 결과, 개발된 LFIA 플랫폼이 Ca2+와 PO4-를 제외한 거의 모든 혼합 화합물에서 TGM2 단백질을 선택적으로 인식한다는 것을 입증하였다. 여기서 Ca2+와 PO4-는 LFIA에서 간섭 메커니즘의 다른 특성을 보였다. 구체적으로 Ca2+는 T 라인 강도 감소에만 분명히 영향을 미치는 반면 C 라인의 신호는 여전히 생성되었다. 이것은 T 라인에서 샌드위치 면역복합체의 상호작용만이 Ca2+에 의해 방해를 받았다는 것을 의미하며, 이 간섭은 아마도 칼슘과 TGM2 단백질 사이의 상호 작용에서 비롯된 것이다. TGM2의 구조는 활성 부위에 세작용기 촉매(catalytic triad)를 가지며, 칼슘 의존적 방식으로 번역 후 변형의 변화를 겪어 단백질-단백질 가교를 생성한다. 이 현상은 Ca2+에 의해 촉발되는 TGM2의 가교가 응집을 생성할 수 있는 Ca2+를 포함하는 스트립의 바닥에서 관찰될 수 있으며, 그것은 MIL101(Fe)-항-TGM2(2F2) / TGM2-TGM2 / 항-TGM2(2F2)-MIL101(Fe)의 복잡한 형성을 생성한다.
반면, PO4-는 T 및 C 라인 모두에서 강도 손실을 유발하였다. 인산염은 짧은 시간에 MIL101(Fe)-OC의 분해를 유발하며, 이는 갈색에서 황색으로 색이 변하는 것으로 나타났다. 용액에 존재하는 인산염 이온이 금속 이온 또는 MOF 클러스터를 공격하여 리간드 치환에 이어 MIL101(Fe)의 분해가 발생하였으며, T 및 C 라인이 사라졌다. 따라서 Ca2+와 PO4-의 간섭 효과를 최소화해야 한다.
결과 5 - 소변 샘플에서의 간섭 최소화
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 완충액, 소변 및 탈염된 소변 샘플에서 LFIA 기반 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA-항-TGM2(2F2)의 성능 비교를 도시한 것이다. 도 6을 참조하면, 소변 샘플의 TGM2 검출 강도는 MIL101(Fe)-OC 및 -PAA에 대한 완충액에서 얻은 강도의 거의 절반으로 떨어졌다. MIL101(Fe)-AC를 사용할 때 소변에서 TGM2 검출의 반응은 완충액에서의 반응에 비해 약간(~20%) 감소하였다. 탈염 컬럼을 사용하여 소변 샘플을 전처리한 후, 탈염된 소변의 TGM2 강도는 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA에 대해 거의 유사하였다. 이러한 결과는 탈염 컬럼을 사용한 시료 전처리가 소변 시료에서 Ca2+를 성공적으로 제거하여 검출된 TGM2의 강도를 회복했음을 시사한다.
결과 6 - 링커 종류에 따른 LFIA 성능 비교
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 완충액 및 탈염된 소변 샘플에서 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA를 이용하여 0 - 13 nM의 TGM2 농도 측정을 도시한 것이다. LOD는 3σ/m 기준에 따라 계산되었으며, σ는 블랭크의 표준 편차, m은 보정 플롯의 기울기, LOQ는 3.3 x LOD로부터 계산하였다. 도 7을 참조하면, LFIA의 라벨로서 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA는 완충 용액에서 TGM2 농도를 측정할 때 0.05 nM의 가장 낮은 시각적 검출을 달성하였다.
소변 배지의 경우 MIL101(Fe)-AC 및 -PAA는 여전히 0.05nM의 농도에서 TGM2를 검출할 수 있었지만 MIL101(Fe)-OC는 소변 샘플에서 가장 낮은 검출 가능한 농도인 0.57nM에만 도달할 수 있었다. 또 다른 눈에 띄는 특징은 MIL101(Fe)-OC 및 -AC보다 MIL101(Fe)-PAA에서 더 강한 T 및 C 라인의 색상 강도를 나타낸다. MIL101(Fe)-PAA는 다양한 매트릭스 용액(완충액 및 소변)에서 비교적 일관된 결과를 보여주었다. 반면 MIL101(Fe)-OC 및 -AC는 소변에서 수행할 때 신호 강도의 감소를 나타냈었다. 이러한 결과는 고분자량 링커의 사용이 복잡한 매질에서 분해로부터 MOF를 보호하는 데 도움이 될 수 있음을 시사하였다.
결과 7 - 링커 종류에 따른 LFIA 성능 평가
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 완충액 및 소변 샘플에서 MIL101(Fe)-OC/AC/PAA를 이용한 피팅 곡선 비교를 도시한 것이다. 도 8을 참조하면, MIL101(Fe)-OC를 사용한 검출에서 얻은 결과는 완충액 또는 소변 샘플에서 0.057 ~ 13nM의 넓은 선형 범위를 제공하였다. 그러나 소변 샘플에서 얻은 기울기는 완충액보다 낮았다.
MIL101(Fe)-OC와 달리 MIL101(Fe)-AC의 T 라인 강도는 전형적인 S자 곡선을 생성하였다. 약 3.5~13nM의 포화 단계는 LFIA의 전체 표면 적용 범위에 대한 유용한 표시를 제공할 수 있다. 완충액에서 0.057에서 2.3nM까지의 동적 범위는 또한 소변 샘플에서 얻은 것보다 더 높은 감도를 보여주었다.
완충액 및 소변 샘플에서 MIL101(Fe)-PAA 라벨을 사용하여 LFIA 테스트를 수행할 때도 유사한 S자 곡선이 얻어졌다. 0.057 - 2.3 nM 농도에서 선형 범위는 일치하여 탈염된 소변 또는 소변이 없는 배지에서 차이 반응이 없음을 나타낸다.
결과 8 - 재현성 및 정밀도 평가
TGM2(nm) Mean ± SD (nm) Recovery(%) CV(%)
0.29 0.27 ± 0.019 95.9% 7.0%
0.58 0.59 ± 0.028 103.2% 4.7%
1.15 1.12 ± 0.045 97.3% 4.0%
2.30 2.33 ± 0.208 101.4% 8.9%
3.50 3.03 ± 0.171 86.6% 5.7%
Detection method Detection range(nM) LOD(nM) Samples
Fluorescence-based proteinarray 20-2000 43.4 -
PiezoelectricImmunosensor 150-1250 48.3 Human serum
Electrochemical assay 0.01-0.5 0.0025 10% Human serum
MIL101(Fe)-PAAbased LFIA 0.05-13 0.012 Desalted urine
표 1은 평균 회수율 및 재현성을 나타내는 것으로, 표 1에 따르면 평균 회수율(Recovery)은 탈염된 소변 샘플에서 TGM2 검출에 대해 86.6~103.2%였으며, CV 범위는 4.0~8.9%였다. 낮은 CV값은 본 발명이 좋은 재현성을 나타냄을 의미한다.
결과 9 - TGM2 검출의 분석 시간 평가
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 MIL101(Fe)-PAA를 사용한 TGM2 검출 ASSAY TIME 결과를 도시한 것이다. 도 9를 참조하면, T 라인의 시각적 감지는 5분에서 시작하여 약 26분 동안 안정적인 감지 신호를 얻을 때까지 확인할 수 있었다.
전술한 내용은 후술할 발명의 청구범위를 더욱 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 다소 폭넓게 상술하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 신장질환 관련 바이오마커 특이적 항체;
    크로스 링커; 및
    상기 크로스 링커에 의해 상기 항체와 공유적으로 결합된 전이금속-유기 프레임워크(MOF);를 포함하는 복합체로서,
    상기 크로스 링커는 2개 이상의 -COOH 작용기를 가지는 물질 또는 상기 물질을 유도할 수 있는 전구체이며, -COOH 작용기는 상기 바이오마커 특이적 항체와 결합하고,
    상기 MOF는 상기 복합체가 스트립 상에서 샌드위치 면역복합체를 형성한 후 색을 나타내는 것을 특징으로 하는 비색법 신호형질 복합체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 전이금속-유기 프레임워크(MOF)는 색을 나타내는 전이금속을 1개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 비색법 신호형질 복합체.
  3. 삭제
  4. 검출 결과를 나타내는 부분으로서 조성물이 고정된 검사선 및 대조선이 위치한 멤브레인;
    상기 멤브레인 상단에 위치하여 바이오마커, 제 1항의 비색법 신호형질 복합체를 포함하는 검체 전개액을 흡수하는 검체 패드; 및
    상기 멤브레인 상단에 위치하여 멤브레인을 통과한 검체 전개액을 흡수하는 흡수 패드;로 구성된 분석 스트립을 포함하며,
    상기 조성물은 상기 복합체에 결합한 바이오마커에 특이적인 항체를 포함하며,
    상기 바이오마커 및 상기 조성물간 항원-항체 반응을 이용하여 신장 질환 여부를 진단하는 것을 특징으로 하는 신장질환 진단용 키트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 키트는 신장질환 관련 바이오마커에 특이적인 고정 항체를 포함하며, 샌드위치 면역 복합체의 형성 여부를 통해 질병을 진단하는 것을 특징으로 하는 신장질환 진단용 키트.
  6. 제 1항의 복합체와 시료 내 신장질환 관련 바이오마커와 결합시킨 후, LFIA(Lateral flow immunoassay) 칩에 적용하여 면역 샌드위치 복합체 존재 여부를 확인하는 신장질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 시료는 인간 세럼, 플라즈마, 혈액 및 소변 시료 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신장질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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