CN1174993C - Vegi,一种血管发生和肿瘤生长的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血管内皮细胞抑制剂，VEGI，其能够抑制细胞模型中的血管发生以及动物模型中的肿瘤发生，本发明还涉及其应用方法。

Description

VEGI，一种血管发生和肿瘤生长的抑制剂
发明背景：
在非常特限情况中，人或动物在正常生理条件下会进行血管发生，在组织或器官中产生新血管。例如，血管发生通常见于伤口愈合，胚胎发育及黄体，子宫内膜及胎盘的形成。术语“内皮”指位于浆膜腔，淋巴管及血管内的一薄层扁平上皮细胞。术语“抗血管发生”或“血管发生抑制活性”指分子一般地抑制血管发生的能力。
控制的及非控制的血管发生被认为以相似方式进行。基膜围绕的内皮细胞及间质细胞形成毛细血管。血管发生开始于由内皮细胞和白细胞释放的酶对基膜的侵蚀。位于血管腔内的内皮细胞随之通过基膜突出。血管发生刺激物使内皮细胞迁移通过侵蚀的基膜。迁移的细胞形成亲本血管的“萌芽”，在此内皮细胞进行有丝分裂及增殖。内皮萌芽彼此形成毛细环，产生新的血管。
持续的非调节血管发生发生于大量疾病状态，肿瘤转移及内皮细胞异常生长并导致见于这些病症的病理损害。各种各样的呈非调节血管发生的病理性疾病状态已被一起归类于血管发生依赖性或血管发生相关性疾病。
在肿瘤生长期间，内皮细胞增殖，侵入基质，沿血管发生刺激物的源头如癌细胞迁移，与血管周围细胞及基质细胞相互作用，并最后形成连接肿瘤组织和血液循环的毛细血管(J.Folkman(1995)Nat.Med.1：27-31)。尽管无容置疑地高度复杂，且调节血管发生的机制还未知，但渐渐清楚的是此程序的初始或终止是血管发生正性和负性调节物间平衡的结果。通常在肿瘤组织中明显正调节的许多血管生成因子已被阐述，包括一些成纤维细胞生长因子家族的成员，如FGF-1(G.Gimenez-Grallego et al..(1985)科学230：1385)，FGF-2(L.Schweigeret al.，(1987)Nature 325：257)，及血管内皮细胞生长因子家族(VEGF)的成员(D.W.Leung el al.，(1989)Science 246：1306)，以及这些生长因子的受体(L.W.Burrus and B.B.Olwin(1989)生物化学杂志264：18647；S.Wennstrom et al.(1991)生长因子4：197；B.Terman etal.(1992)生物化学生物物理研究通讯187：1579；C.de Vries et al，(1992)科学255：989)。本文前述及下文引用的所有文献全部并入参考。
也已报道了一些血管发生的抑制剂，包括血小板反应蛋白(D.J.Good et al.(1990)美国科学院院刊87：6624)，抑管张素(M.S.O’Reilly et al.(1994)细胞79：315)，内抑制素(endostatin)(M.S.O’Reilly et al.(1997)细胞88：277)，及血小板因子-4(E.Maioneet al.(1997)科学247：77)。显而易见，正常血管发生当需要时被迅速激活，当不再需要时被迅速终止，而病理性血管发生一旦开始，通常拖延并难以结束。这表明在正常血管生长过程中起作用的负性调节机制在病理性血管发生过程中未起作用或被抑制。已推测从许多前体中释放血管发生抑制剂的蛋白酶解活性部分负责血管发生下调节，这通过从纤溶酶原到抑管张素的蛋白酶解激活及从胶原XVIII到内抑制素的蛋白酶解激活表明(M.S.O’Reilly，(1997)Cell 88：277)。许多已知血管发生调节物是多效的，并能对其它细胞类型以及产生调节物的细胞起作用，尽管可想象内皮细胞可产生自泌因子抑制血管发生过程或保持成熟血管的静止。目前对此血管发生的自泌调节物还未加以阐述。在本申请中阐述了一新的血管发生自泌负性调节物，称为血管内皮细胞生长抑制剂(VEGI)，特别地由内皮细胞表达。
尽管本发明申请中阐述的蛋白质首先作为TNF-γ在1994年11月7日申请的EP95903521.3中阐述，但其中未揭示此蛋白质的血管发生抑制功能。此蛋白质通过用衍生自各种内皮细胞的RNA构建8个cDNA文库而发现，从各种内皮细胞中产生30,000个表达序列标记(ESTs)。内皮细胞特有的ESTs进一步鉴定了其与已知蛋白家族特别是细胞因子的序列同源性。一组EST的推断的氨基酸序列含有肿瘤坏死因子(TNFs)的共有氨基酸序列。为获得全长cDNA克隆，用放射标记的探针从原始克隆之一中筛选人脐静脉内皮(HUVE)细胞文库。分离出一些阳性克隆并测试序列。最长的cDNA克隆含有编码174个氨基酸开放读框及在3’和5’末端的长未翻译区的4.5kb插入片段。一框内终止密码子在推断的起始密码子的上游表明：翻译不能在更上游开始。此新蛋白质与人TNFα，TNFβ，及Fas配体呈20-30％的序列同源。用此cDNA克隆做模板，与推定的开放读框一致，在体外转录及翻译试验中产生分子量为22KD的蛋白质。对此蛋白质进行疏水分析推定12个氨基酸的疏水区紧随在14个非疏水氨基酸的N-末端区段之后。这与类似于TNFs的II型跨膜蛋白的结构一致(B.B.Aggarwal and K.Natarajan(1996)Eur.Cytokine News.7：93)。
对各种谱系的22种不同类型的培养细胞的总RNA制备物的最新Northern分析表明，此蛋白质的转录只在二种内皮细胞系中检测到：HUVE细胞和代次较低的人静脉内皮细胞。在代次较高的人静脉内皮细胞中未检测到mRNA，在人动脉细胞中也未见。成鲜明对照的是TNF家族成员大多数在免疫细胞中表达(B.B.Aggarwal andK.Natarajan(1996)见前述)。例如，TNFα由巨噬细胞、单核细胞、嗜中性细胞和T细胞产生，而TNFβ主要由促分裂原刺激的T淋巴细胞及白细胞产生。相似地，Fas和其它TNF家族成员的配体，CD27，CD30，CD40，OX40和4-1BB在免疫系统的细胞中均表达。用多组织Northern印迹，VEGI转录物发现在胎盘、肺、肾、骨骼肌，脑、肝、胸腺、睾丸、卵巢及外周血淋巴细胞中表达。
本发明鉴定并阐述了此蛋白质的新功能。上述蛋白质的截短形式已发现可抑制内皮细胞生长。因而将此蛋白质称为血管内皮细胞生长抑制剂(VEGI)。将由相应于推定的胞外结构域的39-174残基组成一的VEGI的截短形式在E.coli中表达，分离，并进行各种细胞分析测试。发现VEGI的截短形式特别抑制内皮细胞的增殖，抑制体外模型中类毛细管形成，并抑制在雌性无胸腺裸鼠乳垫中人乳癌异种移植物的生长。
发明概述
本发明一般地涉及一种内皮细胞增殖的抑制剂，尤其涉及血管发生抑制剂，及其使用方法。VEGI的完整核苷酸序列见SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：26中所示，编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：26中所示，编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：27。发现由相当于推定胞外结构域的39-174位残基(SEQ ID NO：3)组成的蛋白质截短形式特异抑制内皮细胞的增殖。发现VEGI可抑制体外血管发生模型中类毛细管的形成。最后，发现VEGI可抑制在无胸腺裸鼠中异种移植肿瘤的生长。
在另一实施方案中，本发明提供了一种血管发生抑制剂，所述抑制剂包括本发明的VEGI多核苷酸，多肽或在药物可接受稀释剂内的药物可接受量的修饰形式的VEGI。
在另一实施方案中，本发明提供了一种血管发生促进剂，所述促进剂包括在药物可接受稀释剂中，药物可接受量的抗体，反义寡核苷酸，拮抗剂，核酶，降低或消除VEGI功能的药物或制剂。
在另一实施方案中，本发明提供了一种抑制血管发生的方法，其包括给人或动物施用一种组合物，该组合物含有有效抑制血管发生剂量的基本纯化的本发明的VEGI多核苷酸，多肽或修饰形式的VEGI。
在另一实施方案中，本发明提供一种加速血管发生的方法，其包括给人或动物施用一种组合物，该组合物含有降低或消除VEGI功能的抗体、反义寡核苷酸，拮抗剂、核酶、药物或制剂。
在另一实施方案中，本发明提供一种诊断病理性血管发生的方法，其包括检测样本中VEGI多肽的存在与否，所述方法包括以下步骤：
(i)将疑有病理性血管发生的个体的样本与特异于本发明VEGI多肽的抗体接触；并
(ii)检测VEGI与抗体之间形成的复合物存在与否。
在另一实施方案中，本发明提供一种诊断病理性血管发生的方法，其包括检测样本中VEGI多核苷酸(优选RNA)的存在与否，所述方法包括以下步骤：
(i)将疑有病理性血管发生的个体的样本与特异结合VEGI多核苷酸(如RNA)的寡核苷酸接触；并
(ii)检测VEGI多核苷酸与特异于其的寡核苷酸之间形成的双链体存在与否。
在另一实施方案中，本发明提供一种用聚合酶链反应诊断病理性血管发生的方法，所述方法包括用如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：26所示的VEGI核苷酸序列设计引物，其特别扩增VEGI的区域。引物可用于扩增VEGI DNA或VEGI RNA，后者通过RNA的逆转录将RNA转变为互补DNA(cDNA)后进行。PCR分析通过将扩增产物与用本领域已知方法产生的标准相对比进行定量。
在另一实施方案中，本发明提供一种检测样本中VEGI多核苷酸的方法，其包括通过杂交分析分析样本中VEGI RNA或DNA的存在与否。
在又一实施方案中，本发明提供一诊断或预测试剂盒，其包括结合本发明的VEGI多核苷酸或多肽的抗体，与VEGI DNA或RNA杂交的寡核苷酸，和/或扩增VEGI DNA或RNA的PCR引物，及适用于检测样本中存在的VEGI的辅助试剂。由于VEGI作为膜蛋白起作用，膜结合VEGI的天然存在的可溶形式可作为其拮抗剂，且检测所述可溶形式的方法包含在本发明其它实施方案中。
在另一实施方案中，本发明提供一种诊断分析，其包括检测VEGI多核苷酸中突变的存在，突变导致VEGI表达或功能的降低或提高。如此分析包括杂交分析，限制性酶切图谱多态分析，及基因测序等。
在另一实施方案中，本发明提供一种治疗或改善疾病或过程的治疗方法和组合物，所述疾病或过程由血管发生引发，包括但非限于血管瘤，实体肿瘤、白血病、转移癌、毛细管扩张、牛皮癣、硬皮病、原发性皮肤淀粉样变、心肌血管发生、斑新生血管形成，冠脉并行，缺血肢血管发生，角膜病，潮红，新血管形成性青光眼，糖尿病性视网膜病，晶状体后纤维组织形成，关节炎，糖尿病性新血管形成；其中血管发生是非控制的或过度的，并需要抑制。所述方法包括对需要如此治疗的个体提供有效量的本发明的VEGI多核苷酸或多肽，如此血管发生被抑制。
在另一实施方案中，本发明提供了一种治疗或改善疾病的治疗方法和组合物，此类疾病如斑退化，创伤愈合，消化道溃疡，骨折，疤痕疙瘩，血管发生，血细胞生成，排卵，月经及胎盘形成，其中血管发生是所需的，所述方法包括给需要如此治疗的个体施用本发明的VEGI多核苷酸或多肽的拮抗剂，特异于VEGI多核苷酸的反义寡核苷酸，或存在于药物可接受稀释剂中药物可接受量的降低或消除VEGI功能的抗VEGI的抗体，制剂或药物。
在另一实施方案中，本发明提供一种癌生长的阻抑物或抑剂剂组合物，此组合物含有基本纯化的本发明VEGI多核苷酸或多肽。
在另一实施方案中，本发明提供一种检测及预测癌症的方法，其通过检测样本中本发明VEGI多核苷酸或多肽的存在与否，或检测改变VEGI表达和功能的VEGI多核苷酸中突变存在与否而进行。
在另一实施方案中，本发明提供一种测试有抑制血管发生活性的可能制剂或药物的方法，其通过测试药物或制剂是否能正调节VEGI表达而进行。与其它血管发生抑制剂类似，由于VEGI可能被蛋白酶激活，此蛋白酶从细胞膜释放蛋白质，因而蛋白酶以及其它激发该活性的制剂如金属离子将被用作提高VEGI表达的制剂。
在另一实施方案中，本发明提供了一种测试可能的抗肿瘤制剂或药物的方法，其通过测试此药物或制剂是否能通过正调节VEGI表达而抑制血管发生而进行。
在另一实施方案中，本发明提供了一种测试可能的刺激血管发生的药物或制剂，其通过测试此药物或制剂是否能阻断VEGI功能(如抑制血管发生)而进行。在此情况中，对如上述激活VEGI的蛋白酶或激发该活性所需或促进激发该活性的制剂如金属离子的抑制可用于负调节VEGI，从而正调节血管发生。
附图简要描述
图1代表VEGI转录物的Northern印迹分析。A组，在人细胞中VEGI的表达：Jurkat，人T细胞白血病细胞；L923，人胚肾细胞；HL60，人早幼粒细胞白血病；V.E，人静脉内皮细胞(第10代)；A431，人表皮样癌；V.E-2，人静脉内皮细胞(第20代)；Raji，人Burkitt’s淋巴癌；A.E，人动脉内皮细胞；THP-1，人单核细胞白血病；CCD-29Lu，人肺气肿；CAMA1，乳癌；AN3CA，子宫癌；SK.UT.1，子宫癌；MG63，成骨细胞瘤；HOS，成骨细胞瘤；MCF7，乳癌；OVCAR-3，卵巢癌；CAOV-3，卵巢癌；HUVEC，人脐静脉内皮细胞；AOSMIC，平滑肌。估计信使大小为6.5kb。B组，在各类人组织中VEGI表达。进行了三次独立的印迹。示出此三组试验的任一的阳性结果。
图2表明VEGI对内皮细胞和乳癌细胞增殖的影响。细胞数对所示VEGI浓度标绘图。示出ABAE细胞(空心圆)而非MDA-MB231(三角形)或MDA-MB-435(正方形)细胞的生长被抑制。
图3示出VEGI抑制在胶原凝胶上的ABAE细胞形成类毛细管的能力，通过在存在各种浓度VEGI时，ABAE细胞形成类毛细管的程度，与当将VEGI不存在于培养基中时所得结果相对比而获得在柱之上所提供的p值(t-检验)。类毛细管结构的丰度以相对于总测定面积的白色区域的百分率测定。
图4表明通过VEGI，对在无胸腺裸鼠中的人乳癌异种移植肿瘤的生长的抑制。A组：作为接种后时间(天数)的函数标绘出的MDA-MB-231异种移植肿瘤的大小(mm2)。B组：作为接种后时间(天数)的函数标绘出的im-DA-MB-435异种移植肿瘤大小(mm2)。空心圆，用载体转染的CHO细胞共接种，实心圆，用分泌的VEGI转染的CHO细胞共接种。
图5A，5B和5C图示了本发明的VEGI-α多肽的cDNA(SEQ IDNO：8)和相应推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。初始27个氨基酸(下划线)是推定的前导序列。应用标准单字母缩写代表氨基酸。潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点在图5A，5B和5C中VEGI-α氨基酸序列中黑体的天冬酰胺符号(N)及在VEGI-α核苷酸序列中编码天冬酰胺残基的第一个核苷酸之上以黑体(#)标示。潜在的N-连接的糖基化序列发现位于VEGI-α氨基酸序列的下列位置：N-29～N-32(N-29，Y-30，T-31，N-32)及N125～D128(N-125，V-126，S-127，D-128)。潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点在图5A，5B和5C中以VEGI-α氨基酸序列中的黑体的苏氨酸符号(T)及在VEGI-α核苷酸序列中编码苏氨酸残基的第一个核苷酸上用黑体的(*)标示。潜在的PKC磷酸化序列发现位于VEGI-α氨基酸序列的下列位置：T-32～K-34(T-32，N-33，K-34)和T-50～R-52(T-50，F-51，R-52)。潜在的酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位点也在图5A、5B和5C中，以VEGI-α氨基酸序列中的黑体的丝氨酸或苏氨酸符号(S或T)标示，及在VEGI-α核苷酸序列中编码丝氨酸或苏氨酸残基的第一个核苷酸之上用(*)标示。潜在的CK2磷酸化序列发现位于VEGI-α氨基酸序列的下列位置：S-83～E-86(S-83，Y-84，P-85，E-86)；S-96～E-99(S-96，V-97，C-98，E-99)；S-115～E-118(S-115，L-116，Q-117，E-118)；S-130～D-133(S-130，L-131，V-132，D-133)；及T-135～D-138(T-135，K-136，E-137，D-138)。潜在的十四烷基化位点也在图5A，5B和5C中以VEGI-α氨基酸序列中的双下划线示出。潜在的十四烷基化序列发现位于VEGI-α氨基酸序列的下列位置中：G-20～K-25(G-20，L-21，A-22，F-23，T-24，K-25)及G-111～L-116(G-111，A-112，M-113，F-114，S-115，L-116)。
图6A和6B图示了本发明VEGI-β多肽的cDNA(SEQ ID NO：26)及相应推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)。使用标准单字母代表氨基酸。氨基酸甲硫氨酸-1至色氨酸-35是预测的胞内区。氨基酸残基丙氨酸-36至丙氨酸-61(下划线处)是推定的跨膜序列。氨基酸残基谷氨酰胺-62至亮氨酸-251(下划线处)是推定的跨膜序列。潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点在图6A和6B中，以在VEGI-β氨基酸序列中的黑体的天冬酰胺符号(N)标示，及在VEGI-β核苷酸序列中编码天冬酰胺残基的第一个核苷酸之上以黑体的(#)标示。潜在的N-连接的糖基化序列发现位于VEGI-β氨基酸序的下列位置：N-133～N-136(N-133，Y-134，T-135，N-136)及N-229～D-232(N-229，V-230，S-231，D-232)。潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点也在图6A和6B中用VEGI-β氨基酸序列中的黑体的丝氨酸或苏氨酸符号(S或T)标示，及在VEGI-β核苷酸序列中编码苏氨酸残基的第一个核苷酸之上用(*)标示。潜在的PKC磷酸化序列发现位于VEGI-β氨基酸序列的下列位置：S-23～R-25(S-23，C-24，R-25)；S-32～R-34(S-32，A-33，R-34)；T-135～K-137(T-135，N-136，K-137)；及T-154～R-156(T-154，F-155，R-156)。潜在的酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位点也在图6A和6B中用VEGI-β氨基酸序列中的黑体的丝氨酸或苏氨酸(S或T)标示，及在VEGI-β核苷酸序列中编码丝氨酸或苏氨酸残基的第一个核苷酸之上用(*)标示。潜在的CK2磷酸化序列发现位于VEGI-β氨基酸序列的下列位置：S-8～E-11(S-8，F-9，G-10，E-11)；S-187～E-190(S-187，Y-188，P-189，E-190)；S-200～E-203(S-200，V-201，C-202，E-203)；S-219～E-222(S-219，L-220，Q-221，E-222)；S-234～D-237(S-234，L-235，V-236，D-237)；及T-239～D-242(T-239，K-240，E-241，D-242)。潜在的十四基化位点也在图6A和6B中用VEGI-β氨基酸序列中的双下划线标示。潜在的十四烷基化序列发现位于VEGI-β氨基酸序列的下列位置：G-6～E-11(G-6，L-7，S-8，F-9，G-10，E-11)；G-124～G-129(G-124，L-125，A-126，F-127，T-128，K-129)；及G-215～L-220(G-215，A-216，M-217，F-218，S-219，L-220)。
图7示出VEGI-α氨基酸序列(SEQ ID NO：9)的分析。图中示出α，β，转角及卷曲区；亲水性及疏水性；两亲区；柔性区；抗原指数及表面概率，用列举的计算机程序的缺省参数预测。在“抗原指数或Jameson-Wolf”图中，阳性峰值表示VEGI多肽的高抗原区，即从此区可获得本发明的带有表位的肽。
发明详述
尽管本发明蛋白质的DNA序列和氨基酸序列在EP95903521.3中作为TNF-γ已经阐述，但此分子的新的抗血管发生活性及新的内皮细胞抑制活性未被揭示。
因而，在一实施方案中，本发明涉及抑制血管内皮细胞生长的VEGI多核苷酸及多肽，及通过施用这些多核苷酸和多肽治疗由血管发生引起的或与其相关的疾病的方法。本发明的VEGI多核苷酸或多肽可分离自体液，包括但非限于血清、尿及腹水，或通过化学或生物学方法合成(如细胞培养，重组基因表达)。重组技术包括用PCR从DNA源料中基因扩增，及用逆转录酶/PCR从RNA源料中基因扩增。VEGI抑制血管在组织中的生长，如非血管化的或血管化的肿瘤。本发明包括分子量约为22KD的蛋白质，及此蛋白质的任何修饰形式，包括但非限于截短的或翻译后修饰物，如能压制内源生长因子的血管发生活性的此蛋白质的糖基化形式。VEGI的核苷酸序列分别示于SEQID NO：1，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：26，VEGI的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：27，VEGI的活性形式跨越SEQ ID NO：22，所示蛋白质的39～174氨基酸。VEGI的天然形式未确定。生物活性形式可能是二聚体、三聚体或多聚体。本发明还涉及包含于本发明VEGI多核苷酸或多肽内序列的任何等位基因变异及特异性表位或区域，其导致血管发生的抑制。这些序列可用于设计抗-VEGI制剂如反义寡核苷酸，或用于生产抑制VEGI功能的抗体，如此序列和制剂可用于改善或预防与血管发生相关的疾病。
尽管示出并阐述了人VEGI的序列，应了解的是由于人VEGI能抑制牛及鼠内皮细胞生长，所以VEGI在物种之间是很保守的。来自其它物种的VEGI序列可用本申请揭示的序列及功能信息克隆。因而来自人之外其它物种的VEGI多核苷酸和多肽也包含于本申请内。
本发明另外提供了分离的核酸分子，此分子包括编码图5A，5B和5C所示氨基酸序列(SEQ ID NO：9)的VEGI多肽的多核苷酸，其通过对克隆的cDNA(HUVE091)测序而确定。本发明的VEGI多肽与人VEGI(SEQ ID NO：10)，VEGI-β(SEQ ID NO：11)，人淋巴毒素β(SEQ ID NO：12)和FAS配体(SEQ ID NO：13)呈序列同源。本发明的VEGI多核苷酸或多肽功能包括但非限于抑制血管发生，作为抗肿瘤的类细胞因子分子，通过抑制骨及软骨中与pannus侵入相关的血管发生和/或内皮细胞增殖而治疗关节炎，作为NF-κB和c-Jun激酶(JNK)的诱导剂，细胞粘附的诱导剂，及编程性细胞死亡的诱导剂。SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列可通过对cDNA克隆(HUVE091)进行测序而得，该克隆在1994年10月26日保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，登记号75927。保藏的质粒包含在pBluescript SK(-)质粒中(Stratagene，La Jolla，CA)。
本发明还提供分离的核酸分子，该分子含有编码具有图6A和6B所示氨基酸序列(SEQ ID NO：27)的VEGI-β多肽的多核苷酸(SEQID NO：26)，其通过对一克隆的cDNA(HEMCZ56)测序而确定。VEGI-β多肽是本文揭示的VEGI多肽的一剪切变体。SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列可通过对一cDNA克隆(HEMCZ56)测序而获得，该克隆在1998年7月9日保藏在美国典型培养物保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，登录号为203055。保藏的质粒包含在pBluescript SK(-)质粒中(Stratagene，La Jolla，CA.)
核酸分子
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”，就DNA分子或多核苷酸而言，是指脱氧核糖核苷酸的序列，就RNA分子或多核苷酸而言，指核糖核苷酸(A，G，C和U)的相应序列，其中在特异的脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸苷脱氧核糖核苷酸(T)由核糖核苷酸尿苷(U)置换。
应用本文提供的信息，如图5A，5B和5C中的核苷酸序列(SEQID NO：8)，或图6A，6B中的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)，用标准的克隆及筛选步骤，如用mRNA作起始物克隆cDNAs的程序，可获得编码VEGI或VEGI-β多肽的本发明的核酸分子(即多核苷酸)。例如，编码VEGI多肽的多核苷酸通常可得自表达VEGI的任何细胞或组织源料，如人肾和脐静脉内皮细胞。例如，图5A，5B和5C(SEQ ID NO：8)所述的核酸分子在衍生自人脐静脉内皮细胞的-cDNA文库中发现。此相应于VEGI的cDNA克隆(HVVE091克隆)含有编码174个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，大约头27个氨基酸是推定的前导序列，如此成熟的蛋白质含有147个氨基酸。此蛋白质与兔TNF-α(Ito，H.，et al.，DNA 5：157-165(1986)；Genbank登录号.M12846；SEQ ID NO：14)在C-末端呈最高同源，在111个氨基酸长的序列中38％相同，58％相似。在TNF家族成员中保守的序列在VEGI中也是保守的。
另外，编码VEGI-β多肽的多核苷酸通常可得自诱导的及静息的内皮细胞、脐静脉、扁桃体及一些其它细胞和组织类型。例如，图6A和6B(SEQ ID NO：26)中所述的核酸分子在衍生自诱导的内皮细胞的一cDNA文库中发现。相应于VEGI-β的该cDNA克隆(HEMCZ56)含有编码251个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，大约头35个氨基酸残基是推定的胞内区，且36-61位氨基酸是推定的跨膜区。62-251个氨基酸残基是推定的胞外结构域。
构成胞外、跨膜及胞内区的氨基酸残基已经通过计算机分析而被预测。因而熟练技术人员将意识到：构成这些区的氨基酸残基可依于用于限定每个区的标准轻微变化(如大约1-15个氨基酸残基变化)。
根据本发明的一方面，提供了一种分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图5A，5B和5C(SEQ ID NO：9)的推导的氨基酸序列的成熟多肽，或编码由在1994年10月26日保藏在ATTC的，保藏号为75927的命名为HUVE091的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
另外，根据本发明的另一方面，提供了一种分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图6A和6B(SEQ ID NO：27)的推导的氨基酸序列的成熟多肽，或编码由在1998年7月9日在保藏在ATCC的，保藏号为203055的命名为HEMCZ56的克隆的cDNA编码的成熟多肽。
“分离的”核酸分子或多核苷酸指DNA或RNA分子，其已从其天然环境中移出。例如，包含在载体的重组DNA分子(多核苷酸)在本发明中被认为是分离的。分离的DNA分子(多核苷酸)的其它例子包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子，或在溶液中纯化的(部分或基本上纯化的)DNA分子。分离的RNA分子(多核苷酸)包括本发明的DNA分子(多核苷酸)的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的核酸分子或多核苷酸还包括合成生产的如此分子。
本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA形式，其DNA形式可包括cDNA，基因组DNA及合成DNA。该DNA可以是双链或单链的，且如果是单链可以是编码链或非编码(反义)链。
本发明的分离的核酸分子包括SEQ ID NO：8中揭示的编码成熟VEGI多肽的多核苷酸序列，SEQ ID NO：26中描述的编码成熟VEGI-β多肽的多核苷酸序列，包含于保藏在ATCC，保藏号为75927的保藏克隆(HUVE091)内的编码成熟VEGI-β多肽的多核苷酸序列，包含于保藏在ATCC，保藏号为203055的保藏克隆(HEMCZ56)内的编码成熟VEGI-β多肽的多核苷酸序列，及含有不同于上述序列，但由于遗传密码的简并性而编码与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：26的DNA或保藏的cDNA所编码的相同的成熟多肽的多核苷酸序列。当然本领域熟知此遗传密码，因而本领域技术人员可常规产生如此简并变体。
本发明提供了编码VEGI多肽蛋白成熟形式的核酸分子。此完整VEGI多肽的氨基酸序列包括一前导序列和一成熟蛋白质，如图5A，5B和5C(SEQ ID NO：9)及SEQ ID NO：2所示。根据信号假说，一旦生长蛋白质链穿过粗面内质网的输出已经开始，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一信号或分泌性前导序列，其从完整多肽中切割下以产生分泌的“成熟”形式的蛋白质。大多数哺乳动物细胞和甚至昆虫细胞以相同特异性切割分泌的蛋白质。但在某些情况下，分泌蛋白的切割不是完全一致的，其导致两或多种蛋白质的成熟物种。另外，很早就已知分泌蛋白的切割特异性最终通过完整蛋白的一级结构而确定，即，其是多肽的氨基酸序列中固有的。因而，本发明提供一编码成熟VEGI多肽核苷酸序列，该成熟多肽具有由包含于ATCC保藏号75927的cDNA克隆编码的氨基酸序列。“具有由包含于ATCC保藏号75927的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟VEGI多肽”是指在由保藏克隆的人DNA序列编码的完整开放读框在哺乳动物细胞(如前述COS细胞)中表达产生的VEGI多肽的成熟形式。
编码图6A和6B(SEQ ID NO：26)的成熟多肽，或编码由保藏的cDNA(HEMCZ56)编码的成熟多肽的多核苷酸可包括但非限于：仅成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列及附加的编码序列如前导或分泌序列或跨膜序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(及任选的附加编码序列)及非编码序列，如内含子或成熟多肽5’和/或3’编码序列的非编码序列。
本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可融合有助于多肽在宿主细胞中表达及分泌的多核苷酸序列的相同读框，例如，作为分泌序列调节多肽从细胞的转运的前导序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白并可由宿主细胞切割前导序列以形成成熟形式的多肽。多核苷酸也可编码是成熟蛋白加上附加的5’氨基酸残基的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一种蛋白原，并且是失活形式的蛋白质。一旦序列原被切割，剩下的是活性的蛋白质。
因此，例如本发明的多核苷酸可编码成熟蛋白质，或编码具有序列原的蛋白质，或编码具有序列原或前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸也可具有融入框内的标记序列的编码序列其可使本发明的多肽纯化。此标记序列在细菌宿主情况下可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，以供纯化与标记物融合的成熟多肽，或例如当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素(HA)标记。此HA标记相当于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson，I.，et al；Cell，37：767(1984))。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括只含有多肽编码序列的多核苷酸，以及含有其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变体，其编码具有图5A、5B和5C和6A及6B(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：27)的推导的氨基酸序列的多肽的片段(即一部分)，类似物及衍生物，及由保藏的克隆的cDNA编码的多肽。此多核苷酸的变体可以是多核苷酸的天然发生的等位基因变体，或非天然发生的变体。
因此，本发明包括编码如(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9)所示相同的成熟多肽，或由保藏克隆HUVE091的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸，以及该多核苷酸的变体，此变体编码图1A和1B的多肽或由保藏克隆HUVE091的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物，该核苷酸变体包括缺失变体，取代变体及添加或插入变体。
另外，本发明包括编码如SEQ ID NO：27所示的成熟多肽或由保藏克隆HEMCZ56的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸，以及该核苷酸的变体，该变体编码SEQ ID NO：203055的多肽或由保藏克隆HEMCZ56的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物。该核苷酸变体包括缺失变体、取代变体及添加或插入变体。
如上所示，多核苷酸可具有是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示编码序列的天然发生的等位变体的或是保藏克隆HUVE091的编码序列的天然发生的等位变体的编码序列。或者，此多核苷酸可具有是如SEQ ID NO：26所示编码序列或保藏克隆HEMCZ56的编码序列的天然发生的等位变体的编码序列。如本领域所知，等位变体是多核苷酸序列的一种变化形式，其可取代，缺失或加入一或多个核苷酸，但基本不改变编码的多肽的功能。
本发明还涉及本文所述的分离的核酸分子的片段。具有保藏的cDNA(HUVE091和HEMCZ56)的核苷酸序列，或图5A，5B和5C(SEQ NO：1和SEQ ID NO：8)及图6A和6B(SEQ ID NO：26)所示的核苷酸序列的，或其互补链的分离的核酸分子的片段，是指长度至少15nt，优选至少20nt，更优选至少30nt，还更优选至少40，50，100，150，200，250，300，400，或500nt的片段。这些片段具有多种用途，包括但非限于如本文所述的诊断探针或引物。当然，根据本发明，较长的长度为50-1500nt的片段也是实用的，相应于保藏的cDNA克隆HUVE091、保藏的cDNA克隆HEMCZ56的核苷酸序列，SEQ ID NO：8中揭示的核苷酸序列，或SEQ ID NO：27中揭示的核苷酸序列的大部分，(如果不是全部)的片段同样也是实用的。长度至少为20nt的片段是指如包括保藏的cDNA克隆(HUVE091和HEMCZ56)的核苷酸序列，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8及SEQ IDNO：26所示的核苷酸序列的20或多个连续碱基的片段。
在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸片段编码具有功能活性的多肽具有“功能活性”的多肽是指能显示一或多种已知与完整的或成熟VEGI多肽相关的功能活性的多肽。此功能活性包括但非限于生物学活性(如抑制血管发生，抑制内皮细胞增殖，诱导细胞粘附，抗原性[结合抗VEGI和/或抗VEGI-β抗体〔或与VEGI和/或VEGI-β多肽竞争结合对所述抗体的结合〕的能力，免疫原性(产生与VEGI和/或VEGI-β多肽结合的抗体的能力)，与其它VEGI多肽形成聚合物的能力，及与VEGI多肽受体或配体(如DR3)结合的能力。
本发明还提供具有与SEQ ID NO：8的延伸片段相关的核苷酸序列的核酸分子，其已从以下相关cDNA克隆中确定：HUVE091(SEQ IDNO：15)，HMPAP05(SEQ ID NO：16)，HSXCA44(SEQ ID NO：17)，HEMFG66(SEQ ID NO：18)，和HELAM93(SEQ ID NO：19)。
本发明还提供具有与SEQ ID NO：26的延伸片段相关的核苷酸序列的核酸分子，其已从以下相关cDNA克隆中确定：HUVE091P01(SEQ ID NO：28)，HMPTI24R(SEQ ID NO：29)，HELAM93R(SEQ ID NO：30)，和HEMFG66R(SEQ ID NO：31)。
在特异的实施方案中，本发明的多核苷酸片段含有或由含有SEQID NO：8的1-2442核苷酸残基的至少30个，优选至少50个核苷酸的任何一部分的多核苷酸组成，优选排除从上述cDNA克隆确定的核苷酸序列。本发明的VEGI多核苷酸片段的代表例子包括含有或由SEQ ID NO：1[其互补多核苷酸链，或包含于保藏克隆HUVEO91的cDNA]的下述核苷酸组成的片段：783-1304，800-1300，850-1300，900-1300，950-1300，1000-1300，1050-1300，1100-1300，1150-1300，1200-1300，1250-1300，783-1250，800-1250，850-1250，900-1250，950-1250，1000-1250，1050-1250，1100-1250，1150-1250，1200-1250，783-1200，800-1200，850-1200，900-1200，950-1200，1000-1200，1050-1200，1100-1200，1150-1200，783-1150，800-1150，850-1150，900-1150，950-1150，1000-1150，1050-1150，1100-1150，783-1100，800-1100，850-1100，900-1100，950-1100，1000-1100，1050-1100，783-1050，800-1050，850-1050，900-1050，950-1050，1000-1050，783-1000，800-1000，850-1000，900-1000，950-1000，783-950，800-950，850-950，900-950，783-900，800-900及850-900的。
在另外的特异实施方案中，本发明的多核苷酸片段含有或由含有SEQ ID NO：26从1-1116核苷酸残基的至少30个，优选至少50个核苷酸的任何一部分的多核苷酸组成，优选除去从上述cDNA克隆中确定的核苷酸序列。
本发明优选实施方案包括编码含有或由SEQ ID NO：2的残基-1-147(即-1至147)，1-147(即+1-147)，2-147，3-147，4-147，5-147，6-147，7-147，8-147，9-147，10-147，11-147，12-147，13-147的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。编码这些多肽的多核苷酸也被提供。
本发明的VEGI-β多核苷酸片段的代表例子包括含有或由SEQID NO：19[或其互补核苷酸链，或包含于保藏克隆HEMCZ46的cDNA]的下述核苷酸组成的片段：1-1116，50-1116，100-1116，150-1116，200-1116，250-1116，300-1116，350-1116，400-1116，450-1116，500-1116，550-1116，600-1116，650-1116，700-1116，750-1116，800-1116，850-1116，900-1116，950-1116，1000-1116，1050-1116，1-1100，50-1100，100-1100，150-1100，200-1100，250-1100，300-1100，350-1100，400-1100，450-1100，500-1100，550-1100，600-1100，650-1100，700-1100，750-1100，800-1100，850-1100，900-1100，950-1100，1000-1100，1050-1100，1-1050，50-1050，100-1050，150-1050，200-1050，250-1050，300-1050，350-1050，400-1050，450-1050，500-1050，550-1050，600-1050，650-1050，700-1050，750-1050，800-1050，850-1050900-1050，950-1050，1000-1050，1-1000，50-1000，100-1000，150-1000，200-1000，250-1000，300-1000，350-1000，400-1000，450-1000，500-1000，550-1000，600-1000，650-1000，700-1000，750-1000，800-1000，850-1000，900-1000，950-1000，1-950，50-950，100-950，150-950，200-950，250-950，300-950，350-950，400-950，450-950，500-950，550-950，600-950，650-950，700-950，750-950，800-950，850-950，900-950，1-900，50-900，100-900，150-900，200-900，250-900，300-900，350-900，400-900，450-900，500-900，550-900，600-900，650-900，700-900，750-900，800-900，850-900，1-850，50-850，100-850，150-850，200-850，250-850，300-850，350-850，400-850，450-850，500-850，550-850，600-850，650-850，700-850，750-850，800-850，1-800，50-800，150-800，200-800，250-800，300-800，350-800，400-800，450-800，500-800，550-800，600-800，650-800，700-800，750-800，1-750，50-750，100-750，150-750，200-750，250-750，300-750，350-750，400-750，450-750，500-750，550-750，600-750，650-750，700-750，1-700，50-700，100-700，150-700，200-700，250-700，300-700，350-700，400-700，450-700，500-700，550-700，600-700，650-700，1-650，50-650，100-650，150-650，200-650，250-650，300-650，350-650，400-650，450-650，500-650，550-650，600-650，1-600，50-600，100-600，150-600，200-600，250-600，300-600，350-600，400-600，450-600，500-600，550-600，1-550，50-550，100-550，150-550，200-550，250-550，300-550，350-550，400-550，450-550，500-550，1-500，50-500，100-500，150-500，200-500，250-500，300-500，350-500，400-500，450-500，1-450，50-450，100-450，250-450，200-450，250-450，300-450，350-450，400-450，1-400，50-400，100-400，150-400，200-400，250-400，300-400，350-400，1-350，50-350，100-350，150-350，200-350，250-350，300-350，1-300，50-300，100-300，150-300，200-300，250-300，1-250，50-250，100-250，150-250，200-250，1-200，50-200，100-200，150-200，1-150，50-150，100-150，1-100，50-100及1-50。
本发明优选的核酸片段还包括如下核酸分子，此核酸分子编码-或多个SEQ ID NO：2的以下结构域：VEGI潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点N-29～N-32(N-29，Y-30，T-31，N-32)和N-125D-128(N-125，V-126，S-127，D-128)；潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点T-32～K-34(T-32，N-33，K-34)和T-50～R-52(T-50，F-51，R-52)；潜在的酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化位点S-83～E-86(S-83，Y-84，P-85，E-86)；S-96～E-99(S-96，V-97，C-98，E-99)；S-115～E-118(S-115，L-115，Q-117，E-118)；S-130～D-133(S-130，L-131，V-132，D-133)；及T-135～D-138(T-135，K-136，E-137，D-138)；及潜在的十四烷基化位点G-20～K-25(G-20，L-21，A-22，F-23，T-24，K-25)及G-111～L-116(G-111，A-112，M-113，F-114，S-115，L-116)。
本发明尤为优选的多核苷酸是那些特征在于编码VEGI的结构或功能属性的多核苷酸。该多核苷酸编码包括VEGI的α-螺旋和α-螺旋形成区(“α区”)，β-片层及β-片层形成区(“β区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲及卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两亲区，β两亲区，表面形成区，及高抗原指数区(即具有三或多个连续氨基酸残基的抗原区，每个抗原指数高于或等于1.5)的氨基酸残基。优选区是图7的陈列的那些，并包括但非限于用指出的计算机程序的缺省参数分析SEQ ID NO：9描绘的氨基酸序列而鉴定的前述区域类型，此优选的区域包括：Garnier-Robsonα区，β区，转角区及卷曲区，Chou-Fasman α区，β区及卷曲区，Kyte-Doolittle亲水区及疏水区，Eisenberg α及β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区及抗原指数的Jameson-Wolf区。
在以如上述VEGI方式代表VEGI-β的数据用SEQ ID NO：27中揭示的氨基酸序列可易于制备。如此，以上列出的VEGI的每种上列的结构或功能属性(即Garnier-Robson α区，β区，转角区及卷曲区，Chou-Fasman α区，β区及卷曲区，Kyte-Doolittle亲水区及疏水区，Eisenberg α和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区及高抗原指数的Jameson-Wolf区等)同样适用于VEGI和VEGI-β。
此方面的优选区见于图7中所列出的，但也可以是通过将图7中的数据列表表示而代表或鉴别的。用于产生图7数据的DNA*STAR计算机算法(设为原始缺省参数)易于在如此列表方式中给出图7中的数据。列表形式的图7中数据可用于方便地测定优选区的特异分界线。
图7中所列的上述优选区包括但非限于通过分析SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：27所示氨基酸序列鉴定的前述区域类型。如图7所列所示，该优选区包括Garnier-Robson α区，β区，转角区及卷曲区，Chou-Fasman α区，β区及卷曲区，Kyte-Doolittle亲水区及疏水区，Eisenberg α及β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区及高抗原指数的Jameson-Wolf区。
在此方面高度优选的片段是那些含有兼有一些结构特征，如上述一些(如1，2，3或4)特征的VEGI和/或VEGI-β的区域。
本发明其它优选核酸片段包括编码VEGI多肽一或多个具有表位部分的核酸分子。尤其地，本发明的核酸片段包括如下核酸分子，此核酸分子编码：含有SEQ ID NO：9从大约Thr-24至大约Asn-32的氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9从大约Ile-37至大约Ile-45的氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9从大约Met-54至Arg62的氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9从大约Gln-63至大约Asp-71氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9从大约Glu-57至大约Gly-65氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9从大约Val-80至大约Thr-88氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9从大约Leu-116至大约Val-124氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9从大约Asp-133至大约Phe-141氨基酸残基的多肽。这些多肽片段通过分析Jameson-Wolf抗原指数，如图7所示，已被确定具有VEGI多肽的抗原性表位。测定其它VEGI的如此表位具有部分的方法见下述。
本领域技术人员应用上述Jameson-Wolf抗原指数分析，如图7所示，可方便地测定具有VEGI-β蛋白抗原性表位的多肽片段。测定其它VEGI-β的如此表位具有部分的方法见下述。
本发明的其它实施方案涉及这样的多核苷酸，其优选在严格杂交条件下，与本发明的多核苷酸的一部分多核苷酸序列杂交，如包含于ATCC保藏号75927的cDNA克隆，包含于ATCC保藏号203055的cDNA克隆，或本文所述VEGI多核苷酸片段。“严格杂交条件”指在42℃，在含50％甲酰胺，5XSSC(750mm NaCl，75mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(PH7.6)，5X Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯及20μg/ml变性的，剪切的鲑精DNA的溶液中培养过夜，随后在大约65℃在0.1XSSC中洗涤滤膜。与多核苷酸一“部分”杂交的多核苷酸是指与提及的多核苷酸的至少15个(nt)，优选至少20nt，更优选至少30nt，还更优选30-70或80-150nt，或全长的核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。这些如上述可用作诊断探针及引物并详见下述。当然，只与聚A序列(如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26所示VEGI cDNA的3’末端多段)杂交，或与T(或U)残基的互补序列杂交的多核苷酸不包括在本发明的用于与本发明核酸一部分杂交的多核苷酸中，因为如此多核苷酸将与含聚A序列或其互补序列的任何核酸分子杂交(如实际上用寡dT作引物产生的任何产物双链cDNA克隆)
在优选的实施方案中，与本文揭示的参照多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽基本保持与由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8和/或SEQID NO：26所示多核苷酸序列或保藏的cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。
本发明还涉及本发明核酸分子的变体，其编码VEGI多肽的一部分，类似物或衍生物。变体可天然发生，如天然等位变体。“等位变体”是指占据生物体的染色体上给定的基因座的基因的一些变化形式之一种(Genes II，Lewin B.，ed.，John Wiley & Sons.New York(1985))。非天然发生的变体可用已知诱变技术生产。
如此变体包括那些通过本文所述多核苷酸序列(包括片段)的核苷酸取代，缺失或加入而产生的。取代、缺失或加入可包含一或多个核苷酸。变体可以是在编码区，非编码区，或二者均改变动，在编码区内的改变可产生保守的或非保守的氨基酸取代、缺失或加入。其中尤为优选的是沉默取代，加入及缺失，其不改变VEGI多肽或其部分的性质及活性。在此方面也尤为优选的是保守取代。
本发明的另外实施方案涉及含如下多核苷酸序列的分离的核酸分子，该序列与具有选自由以下各项组成的一组的核苷酸序列的多核苷酸至少70％或80％，优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同性：(a)编码具有SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：9(即SEQ ID NO：9的-27～147位)的完整氨基酸序列的VEGI多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO：9-26-147位)的VEGI多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：9的1-147位氨基酸序列的成熟VEGI多肽的核苷酸序列；(d)编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9的由SEQ ID NO：9的1-147位示出氨基酸序列的VEGI多肽胞外结构域的核苷酸序列；(e)编码具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVE091编码的完整氨基酸序列的VEGI多肽的核苷酸序列；(f)编码具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVE091编码的除N末端甲硫氨酸之外完整氨基酸序列的VEGI多肽的核苷酸序列；(g)编码具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVE091编码的氨基酸序列的成熟VEGI多肽的核苷酸序列；(h)编码具有由ATCC保藏号75927的cDNA克隆HUVE091编码的氨基酸序列的成熟VEGI多肽胞外结构域的核苷酸序列；(i)编码本文所述多肽片段的核苷酸序列：(j)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)或(i)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的多肽也包括具有与上述(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)或(j)中所述序列至少80％，优选至少90％，更优选95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，以及具有与以上那些序列至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。
本发明的其它实施方案涉及含如下多核苷酸序列的分离的核酸分子，该分子与具有选自以下序列的核苷酸序列的多核苷酸至少70％或80％，优选至少90％，更优选95％，96％，97％，98％或99％相同：(a)编码具有SEQ ID NO：27完整氨基酸序列(即SEQ ID NO：27的1-251位)的VEGI-β多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：27中除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO：27的2-251位)的VEGI-β多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO：27中所示62-251位氨基酸序列的成熟VEGI-β多肽的核苷酸序列；(d)编码具有SEQ ID NO：27所示1-35位氨基酸序列的VEGI-β多肽胞外结构域的核苷酸序列；(e)编码具有由SEQ ID NO：27所示的62-251位氨基酸序列的VEGI-β多肽胞外结构域的核苷酸序列；(f)编码具有由ATCC保藏号203055的cDNA克隆HEMCZ56编码的完整氨基酸序列的VEGI-β多肽的核苷序列；(g)编码具有由ATCC保藏号203055的cDNA克隆HEMCZ56编码的除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的VEGI-β多肽的核苷酸序列；(h)编码具有由ATCC保藏号203055的cDNA克隆HUVE091编码的氨基酸序列的成熟VEGI多肽胞外结构域的核苷酸序列；(i)编码本文所述多肽片段的核苷酸序列；(j)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)或(I)中任何核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的多肽也包括具有与上述(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)，(h)，(i)或(j)中所述序列至少80％，优选至少90％，更优选95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，以及具有与以上那些序列至少90％更优选至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。
具有与本发明的参照核苷酸序列至少如95％“相同性”的核苷酸序列的多核苷酸，是指除了此多核苷酸序列中每100个编码VEGI多肽的参照核苷酸序列核苷酸中可包括接近5个点突变之外，此多核苷酸的核苷酸序列与相关序列相同。换言之，为获得具有与参照核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中至多5％的核苷酸可被缺失或用其它核苷酸取代，或者占参照序列总核苷酸5％的核苷酸可被插入参照序列中。此参照(对比)序列可以是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：26中揭示的全部核苷酸序列，或如本文所述的任何片段。
实际上，任何特殊的核苷酸分子是否与例如SEQ ID NO：8，SEQID NO：26所示的核苷酸序列，或保藏的cDNA克隆的核苷酸序列至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，可应用已知计算机程序如Bestift程序常规测定(Wisconsin序列分析软件包第8版，用于Unix，遗传学计算机小组，University Research Park，575Science Drive，Modison，WI 53711)。Bestfit应用Smith及Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981))以在两个序列之间发现最佳同源区段。当使用Bestfit或任何其它序对比程序测定一特殊序列是否与本发明的参照序列有例如95％相同性时，设立参数，当然，使得相同性百分率根据全长参照核苷酸序列计算，且允许有接近参照序列总核苷酸数5％的同源性缺口。
在一特异实施方案中，参照(对比)序列(本发明的序列)与试验序列间相同性，也指作总体序列对比，应用基于Brutlag等的算法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci，6：237-245(1990))进行测定。优选的用于FASTDB的DNA序列对比中以计算相同性百分率的参数是：Matrix＝Unitary，K-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，JoiningPenalty-30，Randomlzation Group Length＝0，Cutoff Score＝1，GapPenalty＝5，Gap Size Penalty 0.05，Window Size＝500或等于试验核苷酸序列的长度，哪个较短取哪个。根据此实施方案，如果试验序列由于5’或3’缺失而非由于内在缺失而比相关序列短，考虑到当计算相同性百分率时，FASTDB程序未考虑试验序列5’和3’的截短，因而对结果进行手工校正。与对比序列相关比在5’或3’末端截短的试验序列相同性百分率的校正通过计算是试验序列的5’和3’的对比序列的未配对/对比的碱基数，占对比序列的总碱基数的百分率而得。测定核苷酸是否是配对/对比的，通过FASTDB序列对比结果而定。然后将此百分率从通过以上FASTDB程序用特异参数计算的相同性百分率中扣除，，以得到最终相同性百分率。此校正值是此实施方案之目的。只有经FASTDB序列对比显示未与相关序列配对/对比的试验序列5’和3’碱基之外的碱基被计算以用于以手工调整相同性百分率。例如，将90个碱基的试验序列与100个碱基的对比序列对比以测定相同性百分率。缺失发生在试验序列5’末端，因而FASTDB对比未示出在5’末端头10个碱基的配对/对比。此10个未配对碱基代表10％的序列(在5’和3’末端未配对的碱基数/对比序列中总碱基数)，因此将此10％从经FASTDB程序计算而得的相同性百分率中扣除。如果剩下的90个碱基完全配对，最终相同性百分率为90％。在另一个例子中，90个碱基的试验序列与100个碱基的对比序列对比，这次缺失是内部缺失，因而在试验序列的3’或5’上没有与对比序列未配对/对比的碱基。在此情况下，经FASTDB计算而得的相同性百分率不用手工校正。再一次，只是未与相关对比序列配对/对比的试验序列的5’和3’碱基需要手工校正。根据此实施方案，无其它手工校正需要进行。
在另一实施方案中，本发明涉及与编码SEQ ID NO：2多肽的多核苷酸至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相同的多核苷酸以及其片段，所述片段至少有30个，优选至少有50个碱基，本发明还涉及由如此多核苷酸编码的多肽。
在另一实施方案中，本发明涉及与编码SEQ ID NO：27多肽的多核苷酸至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相同的多核苷酸以及其片段，此片段至少有30个，优选至少有50个碱基，本发明涉及由如此多核苷酸编码的多肽。
本申请涉及与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：26所示的多核苷酸序列或保藏的cDNA克隆的核酸序列，或其片段至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的核酸分子，不论它们是否编码有VEGI功能活性的多肽。但优选的是本发明的核酸分子编码有VEGI功能活性的多肽。“有VEGI功能活性的多肽”是指在特定免疫分析和/或生物学分析中测定的，与本发明的VEGI和/或VEGI-β多肽(全长蛋白，或优选成熟蛋白)的活性相似，但非必须相同的多肽。例如，在如实施例6中所述在ABAE细胞培养中，或在如实施例10所述绒毛尿囊膜(CAM)血管发生分析中，或在其它实施例及本领域中所述的一些其它方式中，通过测定VEGI抑制FGF-2诱导的类毛细管结构形成的相关能力，可测定VEGI的活性。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域熟练技术人员将立即认识到，大量具有与保藏的cDNA的核酸序列或SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：26所示核酸序列或其片段至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的序列的核酸分子，将编码“具有VEGI活性”的多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的简并变体全部编码相同多肽，在许多情况下，即使不进行上述分析，本领域技术人员也清楚。本领域进一步认识到是，不是简并变体的该核酸分子，有一些也编码有VEGI活性的多肽。这是由于本领域技术人员充分认识可能或不能明显影响蛋白质功能的氨基酸取代(如用一种脂族氨基酸取代另一种脂族氨基酸)。例如，J.U.Bowie等在“Decipheringthe Message in Protein Sequences：Tolerance to Anrino AcidSubstitutions”，Science 247：1306-1310(1990)中提供了关于怎样进行表型沉默氨基酸取代的指导，其中作者指出蛋白质能令人惊奇地耐受氨基酸取代。
本发明的其它实施方案涉及包含编码如下VEGI多肽(如本文所述VEGI片段)的氨基酸序列的多核苷酸的分离的核酸分子，该多肽的氨基酸序列含有至少一个但不超过50个，优选不超过40个，更优选不超过30个，还更选不超过20个，10-20个，5-10个，1-5个，3-5个或1-3个保守氨基酸取代。当然，以渐高优选之中顺序，高度优选的是多核苷酸编码的VEGI多肽的氨基酸序列具有含有不超过10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
载体及宿主细胞
本发明还涉及包含本发明分离的多核苷酸的载体；用重组载体遗传工程化的或其它方式工程化的产生本发明多肽的宿主细胞；以及经重组技术生产本发明的多肽。
宿主细胞用本发明的载体遗传工程化(转导或转化或转染)，载体可以是如克隆载体或表达载体。载体可以是如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式的。工程化的宿主细胞可以在适于激活启动子，选择转化体或扩增VEGI基因的修改的常规营养培养基中培养。培养条件如温度，pH等是那些适于宿主细胞选择性表达并为本领域技术人员熟知的条件。
本发明的多核苷酸通过重组技术可用于生产多肽。这样，例如此多核苷酸可包含于各种表达载体中以表达多肽。如此载体包括染色体，非染色体及合成DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒与噬菌体DNA的组合物载体、病毒DNA如痘苗、腺病毒、禽痘病毒及拟狂犬病病毒。但其它任何载体只要在宿主中可复制并可生存也可应用。
适当的DNA序列可通过各种方法插入载体中。通常用本领域已知方法将DNA序列插入适当的限制性内切酶位点。该方法及其它方法在本领域技术人员应知范围内。
表达载体中的DNA序列与指导mRNA合成的适当的表达控制序列(启动子)可操纵相连。如此启动子的代表例子是LTR或SV40启动子，E.coli Lac或trp，λ噬菌体P启动子及其它已知控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。此表达载体也含有一为翻译起始的核糖体结合位点及一转录终止子。此载体还可包括适当的扩增表达的序列。
另外，此表达载体优选含有一或多个可选择标记基因，以为选择转化的宿主细胞提供表型性状，如对于真核细胞培养物为的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或如在E.coli中的四环素或氨苄青霉素抗性。
如上所述的含适当DNA序列，以及适当的启动子或控制序列的载体可用于转化一适当宿主，以使宿主表达蛋白质。
适当宿主的代表例子是：细菌细胞如E.coli，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；昆虫细胞如Drosophila S2和S19；动物细胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤，腺病毒，植物细胞等。选择适当的宿主根据本文教导在本领域技术范围内。
更特别地，本发明还包括含有一或多个前述序列的重组构建体。此构建体含有一载体，如质粒或病毒载体，在其中本发明的序列已正向或反向插入。在此实施方案一优选方面中，此构建体还含有调节序列，包括如与所述序列可操作相连的启动子。本领域已知大量合适的载体及启动子，并且是可商购的。如以下载体：细胞载体：pHE4-5(ATCC登录号.209311；及其变异)，pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，真核载体，pWLNEO，pSVZCAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。但只要可在宿主中复制并生存的其它质粒或载体也可应用。
应用CAT(氯霉素乙酰转移酶)载体或其它具有可选择标记的载体可从任何所需基因中选择启动子区。二种适当的载体是PKK232-8及PCM7。特殊提到的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λP，P，及trp。真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期及晚期SV40，逆转录病毒LTRs，及鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子在本领域技术范围内。
在另一实施方案中，本发明涉及含上述构建体的宿主细胞。此宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞，或低等真核细胞如酵母细胞，或原核细胞如细菌细胞。此构建体导入宿主细胞可由受磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔实现(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学基本方法(1986))。
除含有本文所述的载体构建体的宿主细胞之外，本发明还包括脊椎动物起源的尤其是哺乳动物起源的原化、次代及无限增殖化的宿主细胞，其已被工程化以缺失或置换内源性遗传物质(如VEGI编码序列)，和/或包括遗传物质(如异源多核苷酸序列)，该遗传物质可操作地与本发明VEGI多核苷酸相连，并激活、改变和/或扩增内源性VEGI多核苷酸。例如，本领域已知技术可用于经同源重组合连接异源控制区(如启动子和/或增强子)及内源性VEGI多核苷酸序列(见如美国专利5,641,670，1997年6月24日颁布；国际公开WO96/29411，1996年9月26日公开；；国际公开.WO94/12650，1994年8月4日公开；Koller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；和Zijlstra et al；Nature 342：435-438(1989)，每篇揭示全部并入参考)
宿主细胞中的构建体可以常规方式用于产生由重组序列编码的基因产物。或者，本发明的多肽可通过常规肽合成仪合成产生。
在适当的启动子的控制下，成熟蛋白质可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。无细胞翻译系统也可用于使用衍生自本发明的DNA构建体的RNA生产如此蛋白质。适当的用于真核及原核宿主的克隆及表达载体见于Sambrook等在分子克隆实验手册，第2版，冷泉港r，N.Y.，(1989)中所述，并全部并入参考。
高等真核细胞编码本发明多肽的DNA对的转录，通过在载体中插入增强子序列而得以提高。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10-300bp，作用于启动子以提高其转录。实例包括在复制起点100-270bp的晚期侧上的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点晚期侧上的多瘤病毒增强子，及腺病毒增强子。
通常地，重组表达载体将包括复制起点及的使宿主细胞转化的可选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因及酿洒酵母TRP1基因，及衍生自高表达的基因的启动子以引导下游结构序列的转录。该启动子可衍生自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)α因素酸性磷酸酶或热激蛋白的操纵子。异源结构序列以合适方式翻译起始与及终止序列，优选能引导翻译的蛋白直接分泌入壁膜间隙或胞外培养基中的前导序列装配。任选地，异源序列可编码一融合蛋白，该蛋白包括呈递所需特性如表达的重组产物的稳定性或纯化简便性的N-末端鉴定肽。
细菌所用有效的表达载体的构建是将编码所需蛋白质的结构DNA序列，与合适的翻译起始及终止信号一起插入具有，功能启动子的可操纵阅读相。此载体将含有一或多个表型选择标记及一复制起点，以保证载体的维持且如果需要，在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核宿主包括：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌及假单胞菌属，链霉菌属和葡萄球菌属的种，当然其它细菌也可根据需要选择应用。
作为一代表性但非限制性实例，细菌用表达载体可包含衍生自可商购质粒选择标记及的细菌复制起点，该质粒包括熟知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件。如此商购载体包括如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)及GEM1(PromegaBioteec Medison，WI，USA)。这些pBR322“主链”部分与适当启动子及待表达的结构序列组合。
在转化合适的宿主菌株并使该宿主菌株生长至适当细胞密度后，通过适当方法(如升温或化学诱导)诱导选择的启动子，并将细胞培养一段时间。经离心收获细胞，通过物理或化学方法破坏，并将所得粗提物进一步纯化。
用于蛋白质表达的微生物细胞可通过任何常规方法破坏，包括冷冻—融化循环、超声处理、机械破碎、或用细胞裂解剂，这些方法为本领域技术人员所熟知。
各种哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括Gluzman(Cell 23：175(1981))所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa及BHK细胞系。哺乳动物表达载体将含有一复制起点，一合适的启动子及增强子，也包括任何必须的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体及受体位点，转录终止序列，及5’侧翼未转录序列。衍生自SV40剪接体的DNA序列及聚腺苷酸化位点可用于提供所要求的未转录的遗传元件。
通过以下方法，可从重组细胞培养物中回收并纯化VEGI多肽：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析及凝集素层析。根据所需，在完成成熟蛋白质的构型时可使用蛋白质重折叠步骤。最后，可使用高效液相层析(HPLC)进行最后纯化。
本发明的多肽可以是天然纯化产物，或化学合成产物，或经重组技术从原核或真核宿主(如培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫及哺乳动物细胞)中生产的。依于用于重组生产步骤之宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽还可包括一起始甲硫氨酸残基。
本发明人已产生出至少15种VEGI表达构建体，以促进不同VEGI多肽的生产的及在不同系统中VEGI多肽的生产。其中4种已经被构建为编码全长VEGI多肽。此全长构建体是：(i)pQE9TNFg-27/147，(ii)pQE70TNFg，(iii)CITNFg及pcDNA3TNFg。在所列第一个表达构建体(pQE9TNFg-27/147)情况中，此构建体用于根据实施例1的方法生产具有N-末端6个组氨酸氨标记的全长VEGI多肽。缺乏组氨酸靶的全长VEGI多肽在细菌中的生产是通过使用pQE70TNFg构建体，基本如实施例1所做进行。另外，缺乏组氨酸标记的全长VEGI多肽在哺乳动物细胞中生产是通过pC1TNFg或pcDNA3TNFg构建体，根据实施例3的方法进行。进一步地，成熟VEGI多肽从哺乳动物细胞中产生及分泌是在来自命名为pcDNA3/IL6TNFg-1/149构建体的的白细胞介素(IL)-6信号肽的引导下进行。
其它VEGI表达构建体用于从细菌、杆状病毒及哺乳动物系统中表达各种VEGI突变蛋白。用pQE60细菌表达载体已产生出4种N-末端缺失突变。这些N-末端缺失突变构建体是：(I)pQE60TNFg-3/147(代表可能的成熟VEGI多肽；由此构建体表达的多肽与SEQ ID NO：27的VEGI-β的107-251氨基酸残基相同)，(ii)pQE60TNFg 12/147(代表SEQ ID NO：9的氨基酸残基12-147及SEQ ID NO：27的残基116-251)，(iii)pQE60TNFg 22/147(代表SEQ ID NO：27的氨基酸残基22-147和126-251残基)，及(iv)pQE60TNFg 28/147(代表SEQ ID NO：27的28-147和132-251残基)。每种表达构建体均可用于在细菌系统中生产VEGI多肽，这些多肽针对全长VEGI多肽而言，在N末端分别缺失25，39，49及55个氨基酸，或针对全长VEGI-β多肽而言，在N末端分别缺失106，115，125及131个氨基酸。
还产生了另外的N-末端缺失突变细菌表达构建体。用细菌表达载载体pHE4已产生出命名为pHE4 VEGI T30-L174，以表达如SEQ IDNO：9的苏氨酸-3至亮氨酸147残基揭示的VEGI序列的苏氨酸-30至亮氨酸-174氨基酸，，其完全相当于SEQ ID NO：27的苏氨酸-107至亮氨酸-251的VEGI-β序列的苏氨酸-107至亮氨酸251氨基酸残基。产生的其它细菌表达构建体包括pQE9.VEGI.his.T28-L174，pHE4. VEGI.T28-L174，pHE4，.VEGI.T51-L174和pHE4.VEGI.T58-L174。这些构建体基于pQE9或pHE4细菌表达载体。构建体的命名表明表达载体、基因名称，及由此构建体表达的氨基酸残基(如pQE9.VEGI.T28-L174表示此pQE9细菌表达载体用于表达VEGI的苏氨酸T28至亮氨酸L174氨基酸。
可用于从哺乳动物系统中产生分泌的成熟VEGI多肽的VEGI表达构建体已生产出。此构建体命名为pC1/IL6TNFg-3/147，其编码与成熟VEGI序列融合的人IL-6基因的信号肽。一相似的构建体已产生出，其基于pC4哺乳动物表达载体，含有与VEGI的12-149位氨基酸的氨基末端(SEQ ID NO：9；即VEGI-β(SEQ ID NO：27)的116-251位氨基酸融合的CK-b8信号肽(公布的PCT/US95/09058，6/23/95申请中揭示的CK-b8序列的-21～-1位氨基酸)。此构建体命名为pC4/CK-b8TNFg12/147)。此构建体的一变体已产生出，其可用于表达在VEGI羧基末端融合有人IgG Fc区的VEGI的12-147位氨基酸。此融合蛋白也在CK-β8信号肽引导下分泌，且命名为pC4/CK-β8 TNFg12/147/Fc。该融合分子的人Fc部分的序列见SEQ ID NO：25所示。本领域技术人员已知的其它序列也可以使用。
VEGI的-3～147位氨基酸(SEQ ID NO：9；相当于VEGI-β(SEQ ID NO：27)的102～251位氨基酸)可从杆状病毒系统中用构建体pA2GPTNFg-3/147表达及分泌。此表达构建体编码在其氨基末端融合有杆状病毒GP信号肽的成熟VEGI编码序列。
两种逆转录病毒VEGI表达构建体也已产生。其中第一个命名为pG1Sam EN/TNFg-3/149。此表达构建体可用于从哺乳动物系统中生产全长VEGI多肽。已产生一相关的构建体，pG1SamEN/CK-8βTNFg12/149用于在CK-β8信号肽的引导下，从哺乳动物系统中生产及分泌成熟VEGI多肽。
本发明的多肽还包括与上述那些多肽至少90％，优选至少95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相似的多肽。本发明的多肽还包括那些与由保藏的cDNA编码的多肽或SEQ ID NO：9的多肽至少80％，优选至少90％或95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相同的多肽，也包括这些多肽的至少有30个，优选至少有50个氨基酸的部分。
生产上述重组或融合蛋白的方法本领域已知(通用克降见如，Marniatis，Fitsch and Sambrook，分子克隆实验手册(1982)或DNA克隆，第I和II卷(D.N.Glover ed.(1985))，并包括将用含编码本发明多肽的DNA片段的表达载体稳定转化的宿主细胞，在DNA片段被表达及重组或融合蛋白产生的条件下培养。另外，此蛋白质或多核苷酸可与增强其功能或限定其在细胞中的定位的多肽，如实施例1-3中的分泌序列融合。通过本领域已知方法可分离重组或融合的蛋白质。转化的宿主细胞可用于分析抑制或激活VEGI功能的药物或制剂的效力，如宿主蛋白或化学衍生的制剂，或其它可与VEGI多核苷酸相互作用以下调或改变VEGI多肽表达或影响其抑制血管发生能力的蛋白质。测试抗VEGI或抗血管发生的药物或制剂效力的方法可例如是阻断VEGI的内皮细胞生长抑制活性。即该抗VEGI制剂的存在将使VEGI抑制内皮细胞生长的能力降低。结果，需要更多的VEGI以达到在无抗VEGI制剂时观测到的可比抑制。另一方面，抗血管发生剂的存在可增大或协同VEGI抑制内皮细胞生长的能力。结果达到在无此制剂下观测到的相似抑制所需的VEGI浓度较低。
多肽及片段
本发明还涉及分离的VEGI多肽，其具有SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：9的推导的氨基酸序列，或具有由保藏的cDNA HUVE091编码的氨基酸序列，以及该多肽的片段、类似物及衍生物。
本发明也涉及VEGI-β多肽，其具有SEQ ID NO：27推导的氨基酸序列，或具有由保藏的cDNA HEMCZ56编码的氨基酸序列，以及该多肽的片段，类似物及衍生物。
本发明的多肽及多核苷酸优选以分离形式，并优选在近于完全(如＞90％纯化)至完全(如＞99％纯化)纯化范围提供。术语“分离的”意为将物质从其原始环境(如天然环境，如果其是天然发生的话)移出。例如，在活体动物体内天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但天然系统中的一些或全部共存物分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。“分离的多肽”是指已从重组宿主细胞中部分或基本纯化的多肽。例如，VEGI多肽重组产生的形式可通过Smith及Johnson所述的一步法基本纯化(Gene 67：31-40(1988))。该多核苷酸可以是载体一部分和/或该多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且由于该载体或组合物不是其天然环境一部分所以其仍是分离的。根据本发明的分离的多肽和多核苷酸也包括天然或合成产生的分子。本发明的多肽和多核苷酸也可通过本领域已知蛋白质纯化法用本发明的抗VEGI抗体从天然或重组源料中纯化。
术语“片段”，“衍生物”及“类似物”当指SEQ ID NO：2，SEQID NO：9或SEQ ID NO：27多肽及由保藏的cDNA编码的多肽时，意为保持VEGI功能活性的多肽，即呈现一或多种与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：27揭示的，和/或由一或两种保藏的克隆(HUVE091 及 HEMCZ56)编码的全长和/或成熟VEGI多肽相关的功能活性。例如，具有所需免疫原性或抗原性的片段、衍生物或类似物可用于如免疫分析以进行免疫、抑制VEGI活性等。因此，本发明一特异实施方案涉及一VEGI片段，其可被与SEQ ID NO：2，SEQID NO：9，SEQ ID NO：27揭示的，和/或由一或两种保藏克隆(HUVE091及HEMCZ56)编码的VEGI多肽序列特异结合的抗体结合。
另一例子是，提供了具有VEGI生物学活性的VEGI片段、衍生物或类似物(如成熟VEGI多肽或VEGI-β多肽的胞外结构域)。保持或缺失所需相应VEGI性质(如抑制细胞增殖、抑制肿瘤、抑制血管发生、通过抑制与侵入骨与软骨相关的血管发生和/或内皮细胞增殖抗关节炎，NF-κB及c-Jun激酶(JNK)的诱导剂，细胞吸附的诱导剂及编程性细胞死亡的诱导剂)的VEGI片段、衍生物及类似物可分别用作该性质及其生理相关性的诱导剂或抑制剂。
本发明的多肽可作为具有跨膜区及胞内及胞外结构域的膜结合受体而存在，或它们可以溶解形式存在，其中跨膜区缺失。这种形式的VEGI的一个例子例如是SEQ ID NO：27所示的，含跨膜、胞内及胞外结构域的VEGI-β多肽序列。
本领域应知VEGI多肽的一些氨基酸序列在不明显影响蛋白质结构或功能的前提下，可有一些变异。如果存在这种该序列差异，应记住其将是确定蛋白质活性的关键区域。因此，本发明还包括VEGI多肽的变异，其呈基本VEGI多肽活性，或其包括VEGI的区域如本文揭示的多肽片段。此变体包括缺失、插入、倒位、重复及根据本领域一般规则对活性影响较小地选择的取代类型。例如，提供了怎样产生表型沉默氨基酸取代的指导，其中作者指出有两种主要方法用于研究氨基酸序列对变化的耐受(Bowie et al.，Science 247-1306-1310(1990))。第一种方法依于进化过程，其中突变是经自然选择接受或排斥的。第二种方法应用遗传工程在克隆基因的特异位置导入氨基酸变化，并选择或筛选以鉴定保持功能的序列。如作者所述，这些研究已揭示蛋白质对氨基酸取代非常耐受。作者进一步指出，氨基酸在一定位置的改变似乎是允许的。例如，大多数隐蔽氨基酸残基要求非极性侧链，而通常表面侧链极少有特征是保守的。其它如此表型沉默取代见如Bowie等人所述(见前述)及其引述的参考文献。保守取代典型地见于脂族氨基酸Ala，Val，Leu及Ile之间一个对一个的置换；羟基残基Ser和Thr的互换，酸性残基Asp和Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg的交换，及芳香族残基Phe，Tyr间的置换。
因此，SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：27的多肽的片段、衍生物或类似物或由保藏的cDNAs编码的多肽的片段、衍生物或类似物，可物以是(1)其中一或多个氨基酸残基用保守或非保守氨基酸残基取代(优选保守的氨基酸残基)，且该取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的；或(2)其中一或多个氨基酸残基包括取代基团；或(3)其中成熟形式的VEGI与其它化合物融合，如可提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)(4)其中附加氨基酸与上述形式的多肽融合，如IgGFc融合区肽或前导或分泌序列，或用于纯化上述形式多肽或前蛋白序列的序列。根据本文教导，如此片段、衍生物及类似物被认为包括在本领域范围内。
因此，本发明的VEGI可包括一或多个氨基酸取代、缺失或加入，经天然突变或人为操作。如上所述，优选是次要性质的变化，如对蛋白质折叠或活性无明显影响的保守氨基酸取代(见表1)。
表1.保守氨基酸取代
    芳香族     苯丙氨酸色氨酸酪氨酸
    疏水的     亮氨酸异亮氨酸缬氨酸
    极性的     谷氨酰胺天冬酰胺
    碱性的     精氨酸赖氨酸组氨酸
    酸性的     天冬氨酸谷氨酸
    小的     丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸
    甘氨酸
本发明的实施方案涉及多肽，其含有本文所述VEGI多肽的氨基酸序列，但与本文所述VEGI多核苷酸序列相比时，具有含至少一个但不超过50个保守氨基酸取代，优选不超过40个，更优选不超过30个，最优选不超过20个保守氨基酸取代的氨基酸序列。当然，依渐高之优选性，特别优选肽或多肽所具有的氨基酸序列含有VEGI多肽的氨基酸序列，其含有至少一个，但不超过10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个保守氨基酸取代。
在另一特异实施方案中，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9及SEQ IDNO：27的氨基酸序列，由保藏的克隆编码的多肽序列，和/或本文所述的任何多肽的片段(如胞外结构域或胞内区)中的取代加入或缺失数目是75，70，60，50，40，35，30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1或150-50，100-50，50-20，30-20，20-15，20-10，15-10，10-1，5-10，1-5，1-3或1-2。
为改进或改变VEGI多肽的特性，可进行蛋白质工程。本领域已知的重组DNA技术可用于生产包括单个或多个氨基酸取代，缺失，加入的新突变蛋白或融合蛋白。如此修饰的多肽呈现如活性增强或稳定性增加。另外，它们可以较高产量纯化，并比相应的天然多肽溶解性好，至少在一定纯化及贮存条件下。
因此，本发明还包括具有一或多个氨基酸残基缺失、加入或取代的VEGI衍生物及类似物，以产生更适于在选择的宿主细胞中表达，放大等的VEGI多肽。例如，半胱氨酸残基可被缺失，或被其它氨基酸残基取代以消除二硫键；N-连接的糖基化位点可被改变或消除，以获得如更易于从酵母宿主中回收并纯化的同源产物的表达，已知酵母高度糖基化N-连接位点。最后，在本发明的VEGI多肽中任何一或多个糖基化识别序列上的任何一或两个第1或第3位氨基酸的各种氨基酸取代，和/或在任何一或多个如此识别序列的第二位的氨基酸缺失。将防止VEGI多肽在修饰的三肽序列处糖基化(见如：Miyajimo etal.，EMBO J5(6)：1193-1197)。
本发明VEGI多肽中为功能所必需的氨基酸可通过本领域已知方法鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells，Science244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子中每个残基导入单一丙氨酸突变。然后将所得突变体分子进行生物活性测试，如受体结合或体外增殖活性。
特别感兴趣的是荷电氨基酸用其它可产生较高度需要的优良特性如低聚集的蛋白质的荷电的或中性氨基酸取代。当制备药物配方时，因为聚集体可以是免疫原性的，因而聚集不仅降低活性而且也是有问题的(Pinckard et al.，clin.Exp.Immunol.2：331-340(1967)；Robbins，et al..Diabetes 36：838-845(1987)；Cleland，et al.，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Systems 10：307-377(1993)。
由于VEGI是TNF相关蛋白质家族的成员，为调节而不是完全消除VEGI的生物活性，在编码保守的类TNF结构域的氨基酸的序列中，即在SEQ ID NO：9的17-147位，或SEQ ID NO：27的121-251位，优选在VEGI相关的多肽家族的所有成员是非保守的区域内的残基中，优选进行加入，取代或缺失。也是本发明一组成部分的是含编码以上VEGI变体的核酸序列的分离的多核苷酸。
VEGI多肽的一些氨基酸在已知TNF相关的蛋白质家族成员中是高保守的。通过在VEGI的如下残基是进行特异突变，可观测到其对生物学活性的显著影响，该残基如酪氨酸-15(SEQ ID NO：9中的编号)，亮氨酸-41，酪氨酸-43，酪氨酸-46，谷氨酰胺-48，亮氨酸-90，亮氨酸-116，甘氨酸-119，天冬氨酸-120，苯丙氨酸-141，苯丙氨酸-142，及亮氨酸-147，。当然这些相同氨基酸残基存在于SEQ ID NO：27所示VEGI-β的相应位置。
本发明还包括上述VEGI多肽的片段。本发明的多肽片段包括含有下述氨基酸序列的多肽，该序列包含于SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：9中，由含于保藏克隆(HUVE091)的cDNA编码，或由与包含于保藏克隆中核苷酸序列，揭示于SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：26中的核苷酸序列，或其互补链杂交(在严格杂交条件下)的核酸编码。
多肽片段可以是“自由存在”的，或包含于较大肽之中，在该较大肽中此片段构成其一部分或区域，优选作为其单一连续区域。本发明多肽片段的代表性实例包括例如含有或由以下氨基酸残基组成的片段：SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：27的1-20，21-40，41-60，61-83，84-100，101-120，121-140，141-160，160-167，161-174，161-180，181-200，201-220，221-240，241-251。另外，多肽片段长度可以至少大约20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150个氨基酸。在此，“大约”包括在一端或两端多或少一些氨基酸(即5，4，3，2或1个)的特别列举的范围。
在其它实施方案中，本发明的多肽片段(即本文中所述那些)长度不超过250，225，200，185，175，170，165，160，155，150，145，140，135，130，125，120，115，110，105，100，90，80，75，60，50，40，30或25个氨基酸残基。
进一步优选的实施方案包括多肽片段，其含有或由VEGI的成熟结构域(SEQ ID NO：9的1-147氨基酸残基)，VEGI-β的胞内结构域(SEQ ID NO：27的1-35氨基酸残基)，VEGI-β的跨膜结构域(SEQ ID NO：27的36-61氨基酸)，和/或VEGI-β的胞外结构域(SEQ ID NO：27的62-251氨基酸)组成。
在特异的实施方案中，本发明的多肽片段含有或由SEQ ID NO：9的亮氨酸35～缬氨酸49，色氨酸104～亮氨酸116，甘氨酸119～丝氨酸127，赖氨酸139～亮氨酸147组成。这些结构域是经与VEGI家族成员多肽对比鉴定为高相同性的区域。
本发明特别优选的片段是具有VEGI结构或功能特性的片段。该片段包括含VEGI的α-螺旋及α-螺旋形成区(“α区”)β折叠及β折叠形成区(“β区”)，转角及转角形成区(“转角区”)，卷曲及卷曲形成区(“卷曲区”)，疏水区，亲水区，α两亲区，β两亲区，表面形成区，及高抗原指数区(即由具有抗原指数等于或大于1.5的氨基酸残基组成的多肽的区域，用Jameson-Wolf程序的缺省参数鉴别)的氨基酸残基。某些优选区域见于图7所揭示的，包括但非限于经分析图5A、5B和5C以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9的氨基酸序列鉴别的前述类型区域，此优选的区域包括：Garnier-Robson预示的α区，β区，转角区及卷曲区；Chou-Fasman预测的α区，β区，转角区及卷曲区；Kyte-Doolitle预测的亲水及疏水区；Eisenbergα及β两亲区；Emini表面形成区；及Jameson-Wolf高抗原指数区，如用这些计算机程序的缺省参数预示的。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
另外，本发明的类似物包括可通过切割蛋白原部分而激活的以生产活性成熟多肽蛋白原。
在另外的实施方案中，本发明提供一VEGI多肽(如片段)，其含有或由本发明多肽的携带表位的部分组成。此多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指，当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质部分。另一方面，抗体可结合的蛋白质分子的区域是指“抗原性表位”，蛋白质的免疫原性表位通常少于抗原性表位数(见如Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4001(1983))。
为选择具有抗原性表位的肽或多肽(即含有抗体可结合的蛋白质分子的区域的肽或多肽)，本领域熟知模拟部分蛋白质序列的相对短的合成肽通常能激发与部分模拟的蛋白反应的抗血清(见如Sutcliffe，J.G.，et al.，Science 219：660-666(1983))。能激发蛋白质反应性血清的肽通常在蛋白质序列的一级序列中表示，可通过一系列简单化学规则定性，并被限于既非完整蛋白质的免疫优势区(即免疫原性表位)也非氨基或羧基末端。从而本发明的携带抗原性表位的肽及多肽可用于产生抗体，包括与本发明多肽特异结合的单克隆抗体(见Wilson et al.，Cell 37：767-778(1984))。
本发明具有抗原性表位的肽及多肽所含的序列优选由包含于本发明多肽氨基酸序列中的至少7个，优选至少9个，更优选15-30个氨基酸组成。可用于生产VEGI特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制性实例包括：含有SEQ ID NO：9中大约从Thr-24～Asn-32的氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9中大约从Ile-37～Ile-45氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9中大约从Met-54～Arg-62氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9中大约从Gln-63～Asp-71氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9中大约从Glu-57～Gly-65氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9中大约从Val-80～Thr-88氨基酸残基的多肽；含有SEQ ID NO：9中大约从Leu-116～Val-124氨基酸残基的多肽，及含有SEQ ID NO：9中大约从Asp-133～Phe-141氨基酸残基的多肽。通过分析Jameson-Wolf抗原性指数，已确定这些多肽片段具有VEGI多肽的抗原性表位，如图7所示。
本领域熟练技术人员通过用缺省参数，经DNA*STAR分极VEGI-β多肽序列(SEQ ID NO：27)所得数据，可易于测定VEGI-β的抗原性区域，并选择如上述高抗原性指数的区域。
通过任何常规方法可生产具有表位的肽及多肽(见如Houghten，R.A.，et al.，Proc.Natl Acad Sci.USA 82：5131-5135(1985)；及Houghtent等人(1986)美国专利No.4,631,211。)
本发明的具有表位的肽及多肽的作用包括但非限于根据本领域已知方法诱导抗体(见如Sutcliffe，(前述)；Wilson等(前述)，Chow，M.，etal.，Proc.Natl Acad Sci.USA 82：910-914；and Bittle，F.J.，et al，J Gen.Virol 66：2347-2354(1985))。当整个蛋白是免疫原时，根据本领域已知方法(见如Geysen等所述)鉴别本发明具有免疫原性表位的肽。另外Geysen的美国专利No.5,194,392阐述一通用的检测或测定是表位的拓扑等价物(即“mimotope”)的单体(氨基酸或其它化合物)序列的方法，该拓扑等价物与相应抗体的特定互补位(抗原结合位点)互补。更一般地，Geysen的美国专利No.4,433,092阐述了一种检测或测定是配体的拓扑图等价物的单体序列的方法，该等价物互补于相应特定受体(如DR3)的配体结合位点。相似地，由Houghten等关于高烷基化寡肽混合物的美国专利No.5,480,971中揭示了线性C1-C7-烷基高烷基化的寡肽，及该肽的同群及文库，以及用该肽同群和文库测定与相应受体分子优选结合的高烷基化寡肽的序列的方法。因此，本发明的携带表位肽的非肽类似物通常也可经这些方法产生。
本领域技术人员应意识到，本发明的VEGI和/或VEGI-β多肽以及上述的其携带表位的片段，可以与免疫球蛋白(IgG)的部分恒定区组合得到嵌合多肽。这些融合蛋白易于纯化并呈现延长的体内半衰期。这已由例如由人CD4多肽的前两个结构域与哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链的恒定区的各种结构域组成的嵌合蛋白示出(EP A394，827；Traunecker，et al.，Nature 331：84-86(1988))。因为IgG部分而具有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白，在结合及中和其它分子方面比单体VEGI多肽或蛋白质片段更有效(Fountoulakis et al.，J.Biochem.270：3958-3964(1995))。例如，如上所述已生产出VEGI-Fc融合蛋白。
本发明VEGI多肽的片段(即部分)的应用包括但非限于作为生产全长多肽的中间体。
就许多蛋白质，包括膜结合蛋白质的胞外结构域或分泌蛋白的成熟形式而言，本领域已知一或多个氨基酸可以从其N-或C-末端缺失而基本不损失其生物学功能。例如，Ron等报道了(J.Biol.Chem.268：2988(1993)修饰的KGF蛋白，其即使缺失N-末端3，8或27个氨基酸残基，也具有肝素结合活性。另外，一些研究人员已报道TNF-α突变蛋白，其中N-末端2、4或7个氨基酸残基已除去，当与天然发生的TNF-α多肽相对比时，呈现功能活性提高2-3倍(Creasey，A.A.et al.，Cancer Res.47：145-149(1987)；Sidhu，R.S.andBollon，A.P.Anticancer Res.9：1569-1576(1989)；Kamijo，R.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.160：820-827(1989))。另外，即使在蛋白质N或C末端缺失一或多个氨基酸引起蛋白质改变或缺失一或多种生物学功能，但其它VEGI功能活性仍可被保存。
在本例中，由于本发明的蛋白质是TNF多肽家族的成员，直至SEQID NO：9的第35位亮氨酸(相当于SEQ ID NO：27的134位亮氨酸)的N-末端氨基酸缺失仍可保留一些生物学活性，如调节许多类型的造血及内皮细胞生长与分化。具有包括SEQ ID NO：9中第36位亮氨酸(相当于SEQ ID NO：27中第135位亮氨酸)进一步N末端缺失的多肽，预计不能保留此生物学活性，因为已知在TNF相关的多肽中的此残基在生物活性所需的保守区域的开始。
然而，即使全长VEGI多肽的N末端缺失一或多个氨基酸导致此多肽生物学功能的改变，或丧失一或多种生物学功能，但其它生物学活性仍可保存。因此当全长或成熟多肽的少数残基从N末端除去时，缩短的多肽诱导和/或结合识别全长或成熟多肽的抗体的能力仍可保存。缺失完整多肽N末端残基的特定多肽是否保存该免疫学活性，通过本文所述方法及本领域已知的其它方法可易于测定。
据此，本发明还提供一种多肽，其从SEQ ID NO：9揭示的VEGI氨基酸序列的，氨基末端缺失一或多个氨基酸，至多达第35位亮氨酸，并提供了编码该多肽的多核苷酸。特别地，本发明提供了含有SEQID NO：9的n1-149残基的氨基酸序列的多肽，其中n1是-27～35范围内一整数，且35据信调节各类造血及内皮细胞生长及分化所需的完整VEGI多肽(SEQ ID NO：9所示)N末端的第一个残基位置。
在特异的实施方案中，本发明提供了编码含有或由以下残基的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：9的-27～147，-26～147，-25～147，-24～147，-23～147，-22～147，-21～147，-20～147，-19～147，-18～147，-17～147，-16～147，-15～147，-14～147，-13～147，-12～147，-11～147，-10～147，-9～147，-8～147，-7～147，-6～147，-5～147，-4～147，-3～147，-2～147，-1～147，1-147，2-127，3-147，4-147，5-147，6-147，7-147，8-147，9-147，10-147，11-147，12-147，13-147，14-147，15-147，16-147，17-147，18-147，19-147，20-147，21-147，22-147，23-147，24-147，25-147，26-147，27-147，28-147，29-147，30-147，31-147，32-147，33-147，34-147及35-147。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
由此，本发明进一步提供了一种多肽，其从SEQ ID NO：27所示的VEGI-β氨基酸序列的氨基末端缺失一或多个残基，至多达第134位亮氨酸，并提供了编码这些多肽的多核苷酸。特别地，本发明提供了含有SEQ ID NO：27的n2-251残基的氨基酸序列的多肽，其中n2是1-134之间的一整数，且135据信是调节各类VEGI-β多肽的造血及内皮细胞活性这所需的、完整VEGI-β多肽(示于SEQ IDNO：27)的N末端的第一个残基位置。
在特异的实施方案中，本发明提供了编码含有或由以下残基的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：27的1～251，2～251，3～251，4～251，5～251，6～251，7～251，8～251，9～251，10～251，11～251，12～251，13～251，14～251，15～251，16～251，17～251，18～251，19～251，20～251，21～251，22～251，23～251，24～251，25～251，26～251，27～251，28～251，29～251，30～251，31～251，32～251，33～251，34～251，35～251，36～251，37～251，38～251，39～251，40～251，41～251，42～251，43～251，44～251，45～251，46～251，47～251，48～251，49～251，50～251，51～251，52～251，53～251，54～251，55～251，56～251，57～251，58～251，59～251，60～251，61～251，62～251，63～251，64～251，65～251，66～251，67～251，68～251，69～251，70～251，71～251，72～251，73～251，74～251，75～251，76～251，77～251，78～251，79～251，80～251，81～251，82～251，83～251，84～251，85～251，86～251，87～251，88～251，89～251，90～251，91～251，92～251，93～251，94～251，95～251，96～251，97～251，98～251，99～251，100～251，101～251，102～251，103～251，104～251，105～251，106～251，4107～251，108～251，109～251，110～251，111～251，112～251，113～251，114～251，115～251，116～251，117～251，118～251，119～251，120～251，121～251，122～251，123～251，124～251，125～251，126～251，127～251，128～251，129～251，130～251，131～251，132～251，133～251，134～251和135～251。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明之内。
如上所述，即使多肽的N-末端缺失一或多个氨基酸导致多肽生物学功能的改变，或丧失了一或多种生物学功能，其它生物学活性仍被保存。因此，缩短的VEGI突变蛋白诱导和/或结合识别全长或成熟多肽的能力，当少数全长或成熟多肽的残基被除去时，仍可保存。缺失完整蛋白N末端残基的特定多肽是否保存该免疫学活性，通过本文所述方法及本领域已知其它方法可易于测定。缺失大量N末端氨基酸残基的VEGI突变蛋白可保存一些生物学或免疫学活性不是不可能的。事实上，由少至6个VEGI氨基酸残基组成的肽通常可引起免疫应答。
由此，本发明还提供了一种多肽，其从SEQ ID NO：9所示VEGI的预测成熟氨基酸序列氨基末端的缺失一或多个残基，至多达SEQ IDNO：9第142位的苯丙氨酸残基，并提供了编码该多肽的多核苷酸。尤其本发明提供了含SEQ ID NO：9的n3-147残基的氨基酸序列的多肽，其中n3是1-169之间一整数，且170据信是VEGI多肽至少的免疫原性活性所需的完整VEGI多肽N末端的第一个残基位置。
更特别地，本发明提供了编码含有或由以下残基的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸：示于图5A，5B和5C的VEGI序列的R-2～L-174；R3～L-174；F4～L-174；L5～L-174；S-6～L-174；K-7～L-174；V-8～L-174；Y-9～L-174；S-10～L-174；F-11～L174；P-12～L-174；M-13～L-174；R-14～L174；K-15～L-174；L-16～L-174；I-17～L-174；L-18～L-174；F-19～L-174；L-20～L-174；V-21～L-174；F-22～L-174；P-23～L-174；V-24～L-174；V-25～L-174；R-26～L-174；Q-27～L-174；T-28～L-174；P-29～L-174；T-30～L-174；Q-31～L-174；H-32～L-174；F-33～L-174；K-34～L-174；N-35～L-174；Q-36～L-174；F-37～L-174；P-38～L-174；A-39～L-174；L-40～L-174；H-41～L-174；W-42～L-174；E-43～L-174；H-44～L-174；E-45～L-174；L-46～L-174；G-47～L-174；L-48～L-174；A-49～L-174；F-50～L-174；T-51～L-174；K-52～L-174；N-53～L-174；R-54～L-174；M-55～L-174；N-56～L-174；Y-57～L-174；T-58～L-174；N-59～L-174；K-60～L-174；F-61～L-174；L-62～L-174；L-63～L-174；I-64～L-174；P-65～L-174；E-66～L-174；S-67～L-174；G-68～L-174；D-69～L-174；Y-70～L-174；F-71～L-174；I-72～L-174；Y-73～L-174；S-74～L-174；Q-75～L-174；V-76～L-174；T-77～L-174；F-78～L-174；R-79～L-174；G-80～L-174；M-81～L-174；T-82～L-174；S-83～L-174；E-84～L-174；C-85～L-174；S-86～L-174；E-87～L-174；I-88～L-174；R-89～L-174；Q-90～L-174；A-91～L-174；G-92～L-174；R-93～L-174；P-94～L-174；N-95～L-174；K-96～L-174；P-97～L-174；D-98～L-174；S-99～L-174；I-100～L-174；T-101～L-174；V-102～L-174；V-103～L-174；I-104～L-174；T-105～L-174；K-106～L-174；V-107～L-174；T-108～L-174；D-109～L-174；S-110～L-174；Y-111～L-174；P-112～L-174；E-113～L-174；P-114～L-174；I-115～L-174；Q-116～L-174；L-117～L-174；L-118～L-174；M-119～L-174；G-120～L-174；T-121～L-174；K-122～L-174；S-123～L-174；V-124～L-174；C-125～L-174；E-126～L-174；V-127～L-174；G-128～L-174；S-129～L-174；N-130～L-174；W-131～L-174；F-132～L-174；Q-133～L-174；P-134～L-174；I-135～L-174；Y-136～L-174；L-137～L-174；G-138～L-174；A-139～L-174；M-140～L-174；F-141～L-174；S-142～L-174；L-143～L-174；Q-144～L-174；E-145～L-174；G-146～L-174；D-147～L-174；K-148～L-174；L-149～L-174；M-150～L-174；V-151～L-174；N-152～L-174；V-153～L-174；S-154～L-174；D-155～L-174；I-156～L-174；S-157～L-174；L-158～L-174；V-159～L-174；D-160～L-174；Y-161～L-174；T-162～L-174；K-163～L-174；E-164～L-174；D-165～L-174；K-166～L-174；T-167～L-174；F-168～L-174；及F-169-L174。(图5A，5B和5C所示VEGI氨基酸序列与SEQ ID NO：9相同；但二者间计数模式不同；在此以上氨基酸残基数反映的是图5A，5B和5C的)，编码这些多肽的多核苷酸也在本发明内。
由此，本发明还提供了一种多肽，其具有缺失自SEQ ID NO：27所示VEGI-β的成熟氨基酸序列氨基末端的至多第246位的苯丙氨酸残基的一或多个残基，并提供了编码这些多肽的多核苷酸。尤其本发明提供了含有SEQ ID NO：27的n4-251残基的氨基酸序列的多肽，其中n4是2-246之间一整数，且247据信是VEGI-β蛋白的至少免疫原性活性所需的完整VEGI-β多肽N末端的第一个残基位置。
更特别地，本发明提供了编码含有或由以下残基的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：27所示VEGI-β序列的A-2～L-251；E-3～L-251；D-4～L-251；L-5～L-251；G-6～L-251；L-7～L251；S-8～L-251；F-9～L-251；G-10～L-251；E-11～L-251；T-12～L-251；A-13～L-251；S-14～L-251；V-15～L-251；E-16～L-251；M-17～L-251；L-18～L-251；P-19～L-251；E-20～L-251；H-21～L-251；G-22～L-251；S-23～L-251；C-24～L-251；R-25～L-251；P-26～L-251；K-27～L-251；A-28～L-251；R-29～L-251；S-30～L-251；S-31～L-251；S-32～L-251；A-33～L-251；R-34～L-251；W-35～L-251；A-36～L-251；L-37～L-251；T-38～L-251；C-39～L-251；C-40～L-251；L-41～L-251；V-42～L-251；L-43～L-251；L-44～L-251；P-45～L-251；F-46～L-251；L-47～L-251；A-48～L-251；G-49～L-251；L-50～L-251；T-51～L-251；T-52～L-251；Y-53～L-251；L-54～L-251；L-55～L-251；V-56～L-251；S-57～L-251；Q-58～L-251；L-59～L-251；R-60～L-251；A-61～L-251；Q-62～L-251；G-63～L-251；E-64～L-251；A-65～L-251；C-66～L-251；V-67～L-251；Q-68～L-251；F-69～L-251；Q-70～L-251；A-71～L-251；L-72～L-251；K-73～L-251；G-74～L-251；Q-75～L-251；E-76～L-251；F-77～L-251；A-78～L-251；P-79～L-251；S-80～L-251，H-81～L-251；Q-82～L-251；Q-83～L-251；V-84～L-251；Y-85～L-251；A-86～L-251；P-87～L-251；L-88～L-251；R-89～L-251；A-90～L-251；D-91～L-251；G-92～L-251；D-93～L-251；K-94～L-251；P-95～L-251；R-96～L-251；A-97～L-251；H-98～L-251；L-99～L-251；T-100～L-251；V-101～L-251；V-102～L-251；R-103～L-251；Q-104～L-251；T-105～L-251；P-106～L251；T-107～L-251；Q-108～L-251；H-109～L-251；F-110～L-251；K-111～L-251；N-112～L-251；Q-113～L-251；F-114～L-251；P-115～L-251；A-116～L-251；L-117～L-251；H-118～L-251；W-119～L-251；E-120～L-251；H-121～L-251；E-122～L-251；L-123～L-251；G-124～L-251；L-125～L-251；A-126～L-251；F-127～L-251；T-128～L-251；K-129～L-251；N-130～L-251；～R-131～L-251；M-132～L-251；N-133～L-251；Y-134～L-251；T-135～L-251；N-136～L-251；K-137～L-251；F-138～L-251；L-139～L-251；L-140～L-251；I-141～L-251；P-142～L-251；E-143～L-251；S-144～L-251；G-145～L-251；D-146～L-251；Y-147～L-251；F-148～L-251；I-149～L-251；Y-150～L-251；S-151～L-251；Q-152～L-251；V-153～L-251；T-154～L-251；F-155～L-251；R-156～L-251；G-157～L-251；M-158～L-251；T-159～L-251；S-160～L-251；E-161～L-251；C-162～L-251；S-163～L-251；E-164～L-251；I-165～L251；R-166～L-251；Q-167～L-251；A-168～L-251；G-169～L-251；R-170～L-251；P-171～L-251；N-172～L-251；K-173～L-251；P-174～L-251；D-175～L-251；S-176～L-251；I-177～L-251；T-178～L-L251；V-179～L-251；V-180～L-251；I-181～L-251；T-182～L-251；K-183～L-251；V-184～L-251；T-185～L-251；D-186～L-251；S-187～L251；Y-188～L-251；P-189～L251；E-190～L-251；P-191～L-251；T-192～L-251；Q-193～L-251；L-194～L-251；L-195～L-251；M-196～L-251；G-197～L-251；T-198～L251；K-199～L-251；S-200～L-251；V-201～L-251；C-202～L-251；E-203～L-251；V-204～L-251；G-205～L-251；S-206～L-251；N-207～L-251；W-208～L-251；F-209～L-251；Q-210～L-251；P-211～L-251；I-212～L-251；Y-213～L-251；L-214～L-251；G-215～L-251；A-216～L-251；M-217～L-251；F-218～L-251；S-219～L-251；L-220～L-251；Q-221～L-251；E-222～L-251；G-223～L-251；D-224～L-251；K-225～L-251；L-226～L-251；M-227～L-251；V-228～L-251；N-229～L-251；V-230～L-251；S-231～L-251；D-232～L-251；I-233～L-251；S-234～L-251；L-235～L-251；V-236～L-251；D-237～L-251；Y-238～L-251；T-239～L-251；K-240～L-251；E-241～L-251；D-242～L-251；K-243～L-251；T-244～L-251；F-245～L-251；和F-246～L-251；编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
相似地，已知有生物学功能的C末端缺失的突变蛋白的许多例子。例如，通过在蛋白质羧基末端缺失8-10个氨基酸残基，γ干扰素活性近于提高10倍(Dobeli et al.，J.Biotechnology 7：199-216(1988))。另外，一些研究人员已报道生物学失活TNF-α突变蛋白，其中C末端除去少如2个氨基酸(Carlino，J.A..et al.，J.Biol.Chem.262：958-961(1987)；Creasey，A.A.，et al.，Cancer Res.47：145-149(1987)；Sidhu，R.S.and Bollon，A.P.Anticancer Res.9：1569-1576(1989)；Gase，K.，et al.，Immunology 71：368-371(1990))。
在本例中，由于本发明的蛋白质是TNF多肽家族的成员，直至SEQID NO：9的第146位的亮氨酸的(相当于SEQ ID NO：27第250位亮氨酸)C-末端氨基酸缺失可保留一些生物学活性，如调节各类造血及内皮细胞的生长及分化。具有包括SEQ ID NO：9的第146位亮氨酸(或在SEQ ID NO：27的第250位的亮氨酸)的C-末端缺失的多肽预计不能保留该生物学活性，因为已知在TNF相关多肽中的此残基是在生物学活性所需保守区域的起始处。
然而，即使蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致蛋白质生物学功能改变或丧失一或多种生物学活性，其它生物学活性仍可保存。因此，当少数完整或成熟蛋白质的残基从C末端除去时缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整或成熟蛋白质的抗体的能力仍可保存。缺失完整蛋白C末端残基的特定多肽是否保存该免疫学活性，通过本文所述方法及本领域已知其它方法可易于测定。
在其它实施方案中，本发明还提供一种多肽，其具有从SEQ IDNO：9所示VEGI多肽的氨基酸序列至多到的羧基末端除去第146位亮氨酸残基的一或多个残基，并提供了编码该多肽的多核苷酸。尤其本发明提供了具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的-27-m1残基的氨基酸序列的多肽，其中m1是146-147之间任一整数，且146据信是通过VEGI多肽调节各类造血和内皮细胞生长及分化所需的完整VEGI多肽(示于SEQ ID NO：9)C末端的第一残基位置。
更特别地，本发明提供了编码具有SEQ ID NO：9的-27～146及-27～147残基的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了一种多肽，其从SEQ ID NO：27所示VEGI-β氨基酸序列的羧基末端的除去一或多个残基至多到第250位亮氨酸，并提供了编码该多肽的多核苷酸。尤其本发明提供了具有SEQ IDNO：27氨基酸序列的1-m2残基的氨基酸序列的多肽，其中m2是250-251间任一整数，且249据信是调节各类造血及内皮细胞生长及分化所需的完整VEGI-β多肽(示于SEQ ID NO：27)C末端的第一残基位。
更特别地，本发明提供了编码具有SEQ ID NO：27的1-250及1-251残基的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了多肽片段，其含有或由从VEGI-α的氨基及羧基末端缺失一或多个氨基酸组成，其可被描述为具有SEQ ID NO：9的n1-m1残基，其中n及m为如上所述之整数。本发明还提供了一种多肽，其具从VEGI-β的氨基及羧基末端缺失一或多个氨基酸，其可被描述为具有SEQ ID NO：27的n2-m2残基，其中n2和m2为如上述之整数。
如上所述，即使多肽C末端缺失一或多个氨基酸导致多肽的生物学功能改变或丧失一或多种生物学功能，但其它生物学活性仍可保留。因此，当少数完整或成熟多肽的残基从C末端除去时缩短的VEGI变体蛋白诱导和/或结合识别全长或成熟多肽的抗体的能力仍可保存。缺失全长多肽C末端残基的特定多肽是否保存该免疫学活性，通过本文所述方法及本领域已知其它方法可易于测定。大量缺失C末端氨基酸残基的VEGI变体蛋白保存一些生物学或免疫学活性不是不可能的。事实上，由少如6个VEGI氨基酸组成的肽通常就可引发免疫应答。
由此，本发明还提供一种多肽，其从图5A，5B和5C所示(或SEQID NO：9)的氨基酸序列的羧基末端缺失一或多个残基，至多到图5A，5B和5C中第6位(或SEQ ID NO：9中第一22位)丝氨酸残基，并提供了编码此多肽的多核苷酸。尤其本发明提供了含有SEQ IDNO：9的1-m3残基的氨基酸序列的多肽，其中m3是6-174之间一整数，且6被认为是VEGI-α的至少免疫原性活性所需的完整VEGI多肽C末端的第一残基位置。
更特别地，本发明提供编码含有或由以下残基的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸：图5A，5B和5C所示VEGI序列的M-1～L-173；M-1～F-172；M-1～A171；M-1～G-170；M-1～F-169；M-1～F-168；M-1～T-167，M-1～K-166；M-1～D-165，M-1～E-164；M-1～K-163；M-1～T-162；M-1～Y-161；M-1～D-160；M-1～V-159；M-1～L-158；M-1～S-157；M-1～I-156；M-1～D-155；M-1～S-154；M-1～V-153；M-1～N-152；M-1～V-151；M-1～M-150；M-1～L-149；M-1～K-148；M-1～D-147；M-1～G-146；M-1～E-145；M-1～Q-144；M-1～L-143；M-1～S-142；M-1～F-141；M-1～M-140；M-1～A-139；M-1～G-138；M-1～L-137；M-1～Y-136；M-1～I-135；M-1～P-134；M-1～Q-133；M-1～F-132；M-1～W-131；M-1～N-130；M-1～S-129；M-1～G-128；M-1～V-127；M-1～E-126；M-1～C-125；M-1～V-124；M-1～S-123；M-1～K-122；M-1～T-121；M-1～G-120；M-1～M-119；M-1～L-118；M-1～L-117；M-1～Q-116；M-1～T-115；M-1～P-114；M-1～E-113；M-1～P-112；M-1～Y-111；M-1～S-110；M-1～D-109；M-1～T-108；M-1～V-107；M-1～K-106；M-1～T-105；M-1～I-104；M-1～V-103；M-1～V-102；M-1～T-101；M-1～I-100；M-1～S-99；M-1～D-98；M-1～P-97；M-1～K-96；M-1～N-95；M-1～P-94；M-1～R-93；M-1～G-92；M-1～A-91；M-1～Q-90；M-1～R-89；M-1～I-88；M-1～E-87；M-1～S-86；M-1～S-85；M-1～E-84；M-1～S-83；M-1～T-82；M-1～M-81；M-1～G-80；M-1～R-79；M-1～F-78；M-1～T-77；M-1～V-76；M-1～Q-75；M-1～S-74；M-1～Y-73；M-1～I-72；M-1～F-71；M-1～Y-70；M-1～D-69；M-1～G-68；M-1～S-67；M-1～E-66；M-1～P-65；M-1～I-64；M-1～L-63；M-1～L-62；M-1～F-61；M-1～K-60；M-1～N-59；M-1～T-58；M-1～Y-57；M-1～N-56；M-1～M-55；M-1～R-54；M-1～N-53；M-1～K-52；M-1～T-51；M-1～F-50；M-1～A-49；M-1～L-48；M-1～G-47；M-1～L-46；M-1～E-45；M-1～H-44；M-1～E-43；M-1～W-42；M-1～H-41；M-1～L-40；M-1～A-39；M-1～P-38；M-1～F-37；M-1～Q-36；M-1～N-35；M-1～K-34；M-1～F-33；M-1～H-32；M-1～Q-31；M-1～T-30；M-1～P-29；M-1～T-28；M-1～Q-27；M-1～R-26；M-1～V-25；M-1～V-24；M-1～P-23；M-1～F-22；M-1～V-21；M-1～L-20；M-1～F-19；M-1～L-18；M-1～I-17；M-1～L-16；M-1～K-15；M-1～R-14；M-1～M-13；M-1～P-12；M-1～F-11；M-1～S-10；M-1～Y-9；M-1～V-8；M-1～K-7及M-1～S-6(图5A、5B和5C中所示VEGI氨基酸序列与SEQ ID NO：9中所示相同，但二者之间计数模式不同；以上氨基酸残基数反映的是图5A、5B和5C的残基数)。也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了从VEGI多肽的氨基末端和羧基末端缺失一或多个氨基酸的多肽，其通常可被描述为具有SEQ ID NO：9的n3-m3残基，其中n3和m3是以上所述的整数，编码此多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明还提供了有一或多个残基从SEQ ID NO：27所示VEGI-β氨基酸序羧基末端缺失并至多到第6位的甘氨酸残基的多肽，并提供了编码如此多肽的多核苷酸。尤其本发明提供了含SEQ ID NO：27的1-m4残基的氨基酸序列的多肽，其中m4是6-250之间一整数，且6被认为是VEGI-β蛋白的至少免疫原活性所需的完整的VEGI-β多肽C末端的第一残基位置。
更特别地，本发明提供编码含有或由以下残基的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：27中所示VEGI-β序列的M-1～L-250；M-1～F-249；M-1～A-248；M-1～G-247；M-1～F-246；M-1～F-245；M-1～T-244；M-1～K-243；M-1～D-242；M-1～E-241；M-1～K-240；M-1～T-239；M-1～Y-238；M-1～D-237；M-1～V-236；M-1～L-235；M-1～S-234；M-1～I-233；M-1～D-232；M-1～S-231；M-1～V-230；M-1～N-229；M-1～V-228；M-1～M-227；M-1～L-226；M-1～K-225；M-1～D-224；M-1～G-223；M-1～E-222；M-1～Q-221；M-1～L-220；M-1～S-219；M-1～F-218；M-1～M-217；M-1～A-216；M-1～G-215；M-1～L-214；M-1～Y-213；M-1～I-212；M-1～P-211；M-1～Q-210；M-1～F-209；M-1～W-208；M-1～N-207；M-1～S-206；M-1～G-205；M-1～V-204；M-1～E-203；M-1～C-202；M-1～V-201；M-1～S-200；M-1～K-199；M-1～T-198；M-1～G-197；M-1～M-196；M-1～L-195；M-1～L-194；M-1～Q-193；M-1～T-192；M-1～P-191；M-1～E-190；M-1～P-189；M-1～Y-188；M-1～S-187；M-1～D-186；M-1～T-185；M-1～V-184；M-1～K-183；M-1～T-182；M-1～I-181；M-1～V-180；M-1～V-179；M-1～T-178；M-1～I-177；M-1～S-176；M-1～D-175；M-1～P-174；M-1～K-173；M-1～N-172；M-1～P-171；M-1～R-170；M-1～G-169；M-1～A-168；M-1～Q-167；M-1～R-166；M-1～I-165；M-1～E-164；M-1～S-163；M-1～C-162；M-1～E-161；M-1～S-160；M-1～T-159；M-1～M-158；M-1～G-157；M-1～R-156；M-1～F-155；M-1～T-154；M-1～V-153；M-1～Q-152；M-1～S-151；M-1～Y-150；M-1～I-149；M-1～F-148；M-1～Y-147；M-1～D-146；M-1～G-145；M-1～S-144；M-1～E-143；M-1～P-142；M-1～I-141；M-1～L-140；M-1～L-139；M-1～F-138；M-1～K-137；M-1～N-136；M-1～T-135；M-1～Y-134；M-1～N-133；M-1～M-132；M-1～R-131；M-1～N-130；M-1～K-129；M-1～T-128；M-1～F-127；M-1～A-126；M-1～L-125；M-1～G-124；M-1～L-123；M-1～E-122；M-1～H-121；M-1～E-120；M-1～W-119；M-1～H-118；M-1～L-117；M-1～A-116；M-1～P-115；M-1～F-114；M-1～Q-113；M-1～N-112；M-1～K-111；M-1～F-110；M-1～H-109；M-1～Q-108；M-1～T-107；M-1～P-106；M-1～T-105；M-1～Q-104；M-1～R-103；M-1～V-102；M-1～V-101；M-1～T-100；；M-1～L-99；M-1～H-98；M-1～A-97；M-1～R-96；M-1～P-95；M-1～K-94；M-1～D-93；M-1～G-92；M-1～D-91；M-1～A-90；M-1～R-89；M-1～L-88；M-1～P-87；M-1～A-86；M-1～Y-85；M-1～V-84；M-1～Q-83；M-1～Q-82；M-1～H-81；M-1～S-80；M-1～P-79；M-1～A-78；M-1～F-77；M-1～E-76；M-1～Q-75；M-1～G-74；M-1～K-73；M-1～L-72；M-1～A-71；M-1～Q-70；M-1～F-69；M-1～Q-68；M-1～V-67；M-1～C-66；M-1～A-65；M-1～E-64；M-1～G-63；M-1～Q-62；M-1～A-61；M-1～R-60；M-1～L-59；M-1～Q-58；M-1～S-57；M-1～V-56；M-1～L-55；M-1～L-54；M-1～Y-53；M-1～T-52；M-1～T-51；M-1～L-50；M-1～G-49；M-1～A-48；M-1～L-47；M-1～F-46；M-1～P-45；M-1～L-44；M-1～L-43；M-1～V-42；M-1～L-41；M-1～C-40；M-1～C-39；M-1～T-38；M-1～L-37；M-1～A-36；M-1～W-35；M-1～R-34；M-1～A-33；M-1～S-32；M-1～S-31；M-1～S-30；M-1～R-29；M-1～A-28；M-1～K-27；M-1～P-26；M-1～R-25；M-1～C-24；M-1～S-23；M-1～G-22；M-1～H-21；M-1～E-20；M-1～P-19；M-1～L-18；M-1～M-17；M-1～E-16；M-1～V-15；M-1～S-14；M-1～A-13；M-1～T-12；M-1～E-11；M-1～G-10；M-1～F-9；M-1～S-8；M-1～L-7；M-1～G-6。也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
本发明还提供了有一或多个氨基酸从VEGI-β多肽的氨基及羧基末端缺失的多肽，其通常可被描述为具有SEQ ID NO：27的n4-m4残基，其中n4-m4是如上述之整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明的其它实施方案涉及多肽片段，其含有或由通式mx-nx所述的氨基酸组成，其中m和n分别相当于任一以上这些符号所代表的氨基酸残基，且x代表任一整数。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明特异的实施方案涉及编码一多肽的核苷酸序列，该多肽由包含于ATCC.号75927的cDNA克隆编码的完整VEGI氨基酸序列的一部分组成，其中该部分不包括ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列氨基末端的1～大约62个氨基酸，或不包括ATCC保藏号75927所合的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列羧基末端的大约1个氨基酸，或上述氨基及羧基末端缺失的任意组合。也提供了编码所有以上缺失突变形式的多肽的多核苷酸。
在其它实施方案中，本发明涉及编码一多肽的核苷酸序列，该多肽由ATCC保藏号203055所含的cDNA克隆编码的完整VEGI-β氨基酸序列的一部分组成，其中该部分不包括ATCC保藏号203055所含cDNA克隆编码的完整氨基酸序列氨基末端的从1-大约134个氨基酸，或不包括ATCC保藏号203055所含cDNA编码的完整氨基酸序列氨基末端一定数目的氨基酸(其中该数目选自1～134之间任一整数)，或缺失该完整氨基酸序列羧基末端的大约1个氨基酸，或以上氨基及羧基末端缺失的任意组合。编码所有以上多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明还提供了含有如下氨基酸序列的分离的VEGI多肽，该氨基酸序列选自(a)具有SEQ ID NO：9所示完整氨基酸序列(即SEQ IDNO：9的-27～147位)的全长VEGI多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQID NO：9所示除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列；(即SEQ IDNO：9的-26～147位)的全长VEGI多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQID NO：9中1～147位氨基酸序列的推断的成熟VEGI多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆HUVE091编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆HUVE091编码的除N-末端甲硫氨酸酚的完整氨基酸序列；(f)由ATCC保藏号75927所含的cDNA克隆HUVE091编码的推断的成熟VEGI多肽的完整氨基酸序列。本发明的多肽还包括具有与(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)所述序列至少70％，优选80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的多肽，及其片段。
本发明还提供含有如下氨基酸序列的分离的VEGI多肽，该氨基酸序列选自(a)具有SEQ ID NO：27所示完整氨基酸序列(即SEQ IDNO：27的1～251位)的全长VEGI-β多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO：27除N末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列(即SEQ ID NO：27的2～251位)的全长VEGI-β多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ IDNO：27的62-251位氨基酸序列的推断的成熟VEGI-β多肽的氨基酸序列；(d)由ATCC保藏号203055的cDNA克隆HEMCZ56编码的完整氨基酸序列；(e)由ATCC保藏号203055的cDNA克隆HEMCZ56编码的除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列；及(f)由于ATCC保藏号203055的cDNA克隆HEMCZ56编码的推断的成熟VEGI多肽的完整氨基酸序列。本发明的多肽还包括具有与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)所述序列至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列的多肽，及其片段。在特异的实施方案中，这些多肽有至少10个，15，20，25，30个，更优选至少50个氨基酸。
具有与本发明的参照VEGI多肽的氨基酸序列至少如95％“相同性”的氨基酸序列的多肽，是指除了此多氨基酸序列中每100个VEGI多肽的参照氨基酸序列可包括接近5个氨基酸改变之外，此多肽的氨基酸序列与相关序列相同。换言之，为获得具有与参照氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参照序列中至多5％的氨基酸残基可被缺失或用其它氨基酸取代，或者占参照序列总氨基酸5％的氨基酸可被插入参照序列中。参照序列的这些变化可发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位，或发生在那些末端位之间的任何部位，散布在参照序列中单个残基之中或相关序列中一或多个连续基团中。
实际上，任何特殊多肽是否与图5A，5B及5C(SEQ ID NO：9)所示氨基酸序列由保藏cDNA克隆HUVE091编码的氨基酸序列或其片段，至少90％，95％，96％，97％，98％或99％相同，应用已知计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Gencties Computer Group，University Researeh Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)通常可测定。当用Bestfit或任何其它序列对比程序测定一特殊序列是否与本发明的相关序列至少95％相同时，当然要设立参数，这样相同性百分率在全长相关氨基酸序列之上计算，且允许占相关序列总氨基酸残基数5％的同源缺失存在。
在特异的实施方案中，相关序列(本发明的序列)与试验序列之间的相同性，也指作总体序列对比，可应用基于Brutlag等的算法的FASTDB计算机程序测定(Corp App.Biosci.b：237-245(1990)、FASTDB氨基酸序列对比中所用的优选参数是：Matrix＝PAM0，K-tuple＝2，Mismatch Pencalty＝1，Joining Denalty＝20，Randomization GroupLength＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长，Gap Penalty＝5，GapSize Penalty＝0.05，Window Sizw＝500或试验序列长，无论哪个较短。根据此实施方案，如果试验序列由于N-末端的缺失而非内在缺失而关序列短，考虑到FASTDB程序在计算总体相同性百分率时不能说明试验序列N-及C-末端截短的原因，因而要进行人为校正。就与相关序列相关的试验序列在N-及C-末端的截短而言，通过计算是试验序列N-及C-末端的相关序列的残基数，其未与相应试验残基匹配/对比，占相关序列总碱基的百分数而加以校正相同性百分率。残基是否是匹配/对比的可通过FASTODB序列对比的结果加以测定。然后将此百分数从用特殊参数经以上FASTDB程序计算出的相同性百分率中除去，以得到最终相同性百分率。此最终相同性百分率范围是此实施方案目的所在。只有未与相关序列匹配/对比的试验序列的N-及C-末端残基被认为是人为调正相同性百分率范围的目的所在。即只有相关残基位在试验序列的最远的N-及C-末端残基之外。例如，将有90个氨基酸残基的试验序列与有100个氨基酸残基的相关序列对比以测定相同性百分率。缺失发生在试验序列的N-末端，从而FASTDB对比示出N末端头10个残基的匹配/对比。此10个未配对残基代表序列的10％(未配对的N-末端及C-末端的残基数/相关序列中总残基数)，因此将此10％从由FASTDB程序计算出的相同性百分率中减去。如果剩余的90个碱基充分配对，则最终相同性百分率为90％。在另一实施例中，对比了有90个残基的试验序列与有100个残基的相关序列。这次缺失是内在缺失，因此在试验序列的N或C-末端没有未与相关序列匹配/对比的残基。在此由FASTDB计算出的相同性百分率不用人为校正。再一次，在用于FASTDB序列对比中，只有残基位在试验序列的N-及C-末端终点，其未与相关序列匹配/对比，此时相同性百分率需人为校正。不需进行其它人为校正。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：9的多肽(尤其成熟多肽)，以及与SEQ ID NO：9的多肽至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相似性(优选相同性)的多肽，也包括如此多肽的一部分，此部分一般至少含有30个，优选至少含有50个氨基酸。
本发明的多肽还包括SEQ ID NO：27的多肽(尤其该肽的胞外结构域)，以及与SEQ ID NO：27的多肽至少70％，优选至少90％，更优选至少95％相似性(优选相同性)的多肽，也包括如此多肽的一部分，此部分一般至少含有30个，优选至少含有50个氨基酸。
本发明的其它多肽包括与在此所述的多肽至少70％，90％，优选至少95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相似性的多肽。本发明的多肽也包括那些与在此所述多肽至少70％，80％，优选至少90％或95％，更优选至少96％，97％，98％或99％相同性的多肽。在特异的实施方案中，如此多肽含有至少30个，优选至少50个氨基酸。
如本领域已知，二多肽之间“相似性”通过对比氨基酸序列及一种多肽对第二种多肽序列的保守氨基酸取代加以测定。二多肽“相似性％”是指通过用Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，SI53711)是测定相似性设立的efcuclt，对比二多肽的氨基酸序列产生的相似性范围。Bestfit用Smith及Waterman的局部同源对比(Advaces in Applied Mathematics 2；482-489，1981)以发现二序列间最相似主节段。
如在此所用，“衍生自”SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：9及SEQ IDNO：27的多肽或氨基酸序列，是指具有与由上述序列编码的多肽相同氨基酸的多肽，或其一部分，其中此部分由至少2-5个，优选至少8-10个，更优选至少11-15个氨基酸组成，或者是用上述序列编码的多肽可免疫学鉴别的。
本发明还包括融合蛋白，其中全长VEGI多肽或其片段、变体、衍生物或类似物与不相关的蛋白质融合。这些融合蛋白通常可在本文所揭示的VEGI核苷酸及多肽序列基础上设计。例如，本领域技术人员将意识到，VEGI和、或VEGI-β多肽及其片段(包括具有表位的片段)可与部分免疫球蛋白(IgG)的恒常区组合，得到嵌合(融合蛋白)。这些融合蛋白易于纯化且在体内呈延长的半衰期。这已由如由人CD4-多肽的头两个区及哺乳动物免疫球蛋白重或轻链各种恒常区组成的嵌合蛋白表明(EPA 394，827；Taunecker，et al.，Nature 331：84-86(1988)。由于IgG部分而具有二硫键连的嵌合结构的融合蛋白，比VEGI单体蛋白或单蛋白质片段在结合及中和其它分子中更有效。(Fountoulakis，et al.，J.Biochem.270：395803964(1995))。如一实施例所述，在此所述的VEGI-Fc融合蛋白自己生产出。包含在本发明内的VEGI融合蛋白的其它实例包括但非限于：VEGI多肽序列与任何使融合蛋白在细胞表面显示的氨基酸序列的融合；或与酶，荧光蛋白质，或提供标记功能的发光的蛋白质融合。
功能活性
VEGI多肽及其片段、变体、衍生物及类似物的功能活性可通过各种方法分析。
例如，在一实施方案中，其中分析了结合能力或用全长VEGI多肽竞争结合抗VEGI抗体的能力，可应用各种本领域已知免疫分析法，包括但非限于用如放射免疫分析法技术竞争及非竞争分析系统，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫分析，免疫放射分析，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散分析，原位免疫分析如(用胶体金、酶或放射性同位素标记)，Westren印迹，沉淀反应，凝集分析(如凝胶凝胶分析，血凝分析)，补体结合分析，免疫荧光分析，A蛋白分析，及免疫电泳分析等。在一实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合以检测抗体。在又一实施方案中，第二抗体是标记的。本领域已知许多方法检测免疫分析中的结合，并是在本发明范围内。
在其它实施方案中，其中TNF-配体是鉴别的，可通过如本领域已知方法分析结合。在另一实施方案中，VEGI结合其底物的生理相关物(信号转导)可被分析。
另外，本文所述的分析(见实施例5～8及10)及本领域已知其它分析通常可用于测定VEGI多肽及其片段、变体衍生物及类似物激发VEGI相关生物活性的能力(如抑制或促进细胞增殖，血管发生，及体内或体外细胞粘附)。
技术人员将知其它方法，并包括在本发明范围内。
抗体
特异识别一或多个VEGI表位，或VEGI保守变体的表位，或VEGI的多肽片段的抗体也包括在本发明内。因此，多肽，其片段或其它衍生物，或其类似物，或表达它们的细胞可用作免疫原从而产生抗体。这些抗体可以是如多克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合、单链及人源化抗体，以及Fab片段，F(ab’)片段，Fab表达文库的产物，抗独特型抗体，及上述任一的表位结合片段。本领域各种已知步骤可用于生产此抗体及片段。
产生的抗相应于本发明序列的多肽的抗体，可通过将此多肽直接注入动物，或将此多肽施用于动物，优选非人而得到。然后如此获得的抗体将与多自身肽结合。以此方式，即使只编码多肽一片段的序列可用于产生结合整个天然多肽的抗体。抗体的作用包括但非限于从表达此多肽的组织中分离此多肽，并在生物样本中检测VEGI，及可用作诊断或预后技术的一部分，据此可测试患者VEGI的异常量，该抗体也可用于抑制VEGI生物学活性的方法中。
就抗体的产生而言，可将各种宿主动物经注射VEGI多肽(如相当于多肽的一功能结构域如胞外结构域)进行免疫。该宿主动物可包括但非限于兔、鼠小和大鼠等。依于宿主物种应用各种佐剂以提高免疫应答，此佐剂包括但非限于Freund佐剂(完全及不完全的)，无机凝胶如氢氧化铝，表面活性剂如溶血卵磷脂，Pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳状液，KLH(匙孔戚血蓝蛋白)，二硝基苯酚及潜在有用的人佐剂如BCG(bacille-Calmette-Guerin)及Corynebacteriumparvum。多克隆抗体是衍生自免疫动物血清的抗体分子的异质群体。
特定抗原同质群体的抗体即单克隆抗体可通过任何培养连续细胞系产生抗体分子的技术获得。这包括但非限于Kohler及Milstein的杂交瘤技术(Nature 256：495-497)(1975))：及美国专利No.4,376,110，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor，et al..Immunology Today 4：72(1983)；Cole，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030(1983))，及EBV-杂交瘤技术(Cole.et al.，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Alan R.Liss.Inc.，PP.77-96(1985))。该抗体可以是任何免疫球蛋白类的，包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD及其任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以体或体外内培养。Mabs在体内的高滴度生产使其成为目前代表性优选生产方法。
另外，通过剪接适当的抗原特异性鼠抗体分子基因与适当生物学活性人抗体分子基因，为生产“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-6855(1984)；Neuberger，et al.，Nature312：604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314：452-454(1985))也可以应用。嵌合抗体是一分子，其中不同部分衍生自不同动物物种，如那些具有衍生自鼠mAb可变区及人免疫球蛋白恒定区的分子。
抗VEGI在人体内应用可优选用“人源化的”嵌合单克隆抗体。此抗体可用衍生自产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞的遗传构建体生产。本领域已知生产嵌合抗体的方法(Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi et al.，Bio Techniques 4：214(1986)；Cabilly，et al.，U.S专利4816567；Taniguchi，et al.，EP 171496；Morrison，et al.，EP 173494；Neuberger，et al.，WO 8601533；Robinson，et al.，WO 8702671；Boulianne et al.，Nature312：643(1984)；Neuberger，et al.，Nature 314：268(1985))。
或者，生产单链抗体的技术(U.S.专利4,946,778；Bird，Science242：423-426(1988)；Huston，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；and Ward et al.，Nature 334：544-546(1989))可用于生产抗VEGI多肽的单链抗体。单链抗体是通过经氨基酸链连接Fv区的重链及轻链片段得到单链多肽而生成的。
识别特异性表位的抗体片段可通过已知技术产生。例如，该片段包括但非限于：可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段，及可通过还原F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库(Huse et al.，Science 246：1275-(1281(1989))而迅速及容易地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab片段。
VEGI多肽的抗体可用本领域熟知技术，用于产生“模拟”ObR的独特型抗体(见如Greenspan & Bona，FASEB J.7(5)：437-444；(1989)aNissinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，与VEGI胞外结构域结合并竞争性抑制配体与VEGI结合的抗体，可用于产生“模拟”VEGI胞外结构域的抗独特型抗体，并因而结合及中和VEGI配休。如此中和抗独特型抗体或其Fab片段可用于中和VEGI配体的治疗中。
因此，如上所述，本领域熟练技术人员用标准方法可产生本发明VEGI蛋白(或多肽)的单克隆及多克隆抗体。本领域熟知生产抗体的物质及方法(见如Goding，单克隆抗体原则及实践，第4章，1986)。另外，多肽可与其它提高其抗原性的蛋白质或多肽融合，从而生产较高滴度的抗体。该蛋白或多肽例如可包括任何佐剂或载体，如氢氧化铝。这些抗体可用于被动抗体治疗，其中特异结合VEGI的抗体可用于调节依赖血管发生的病程，如繁殖，发育，伤口愈合，及组织修补等。
免疫及循环系统相关的及其它疾病
在其它实施方案中，本发明涉及一种减轻动物及人体内血管发生相关疾病症状的方法，该方法通过给患者施用有效量的VEGI进行。由于血管发生为肿瘤生存之所需，因而抑制或逆转血管发生可降低或消除肿瘤。当为患者提供VEGI时，施用剂量将依于如患者年龄、体重、身高、性别、现病史、既往史等因素而变化。一般地，所用的以上化合物的剂量在1pg/kg～10mg/kg(体重)范围内，尽管也可应用较低或较高剂量。本发明的方法涉及单一及多次施用，同时或持续一段时间提供。
通过用如含SEQ ID NO：1所述本发明的VEGI多核苷酸或其一部分，或其等位基因形式的腺病毒或逆转录病毒的质粒或病毒载体，可提供VEGI多核苷酸。所用载体优选能为细胞提供VEGI多核苷酸，由此该多核苷酸被转录及翻译，并产生VEGI多肽。本发明的多核苷酸也可以DNA，包入脂质体内胶囊化的DNA，或截留于含病毒包膜受体蛋白的蛋白脂质体内的DNA施用(Kanoda，Y.et al.，(1989)Science243：375)。或者，本发明的多核苷酸可与载体一起被注射，载体可以是如细胞因子之蛋白质，例如白细胞介素-2，或是聚赖氨酸糖蛋白载体。本领域已知此载体蛋白和载体及使用方法(见如Ascadi G.et al.，Nature 1991，352：815)。另外，本发明的多核苷酸可包被在极小的金珠之上，且所述此珠可用基因枪导入皮肤(Ulmer，J.B.et al.，Science1993，259：1745)。
或者，用本领域技术人员已知的方法，以药物可接受配方提供本发明的VEGI多肽。这些配方可通过标准途径施用。通常地，该组合物可通过局部、穿皮、腹膜内、口腔、直肠、或非肠道(如静脉内、皮下，或肌内)途径施用。另外，本发明的VEGI多肽可掺入生物可降解聚合物中，植入需药物释放或植入处的附近，使VEGI多肽缓慢释放，此生物可降解聚合物及其应用见如Brem等在J，Neurosurg74：441-446(1991)中所述。
该VEGI多肽配方包括那些适于口腔、直肠、眼(包括玻璃体内或眼房内)，鼻腔、局部(包括口腔及舌下)，阴道或非肠道(包括皮下、腹膜内及硬膜外)施用的。该VEGI多肽配方可以单位剂量形式常规存在，并可通过常规制药技术制备。此技术包括加入相关的活性成分及药行载体或受体。一般地，此配方的制备通过均匀并充分地混和活性成分及液体载体，或细分的固体载体，或二种载体，然后如果需要，将产物制成一定形状。
适于非肠道施用的配方包括含水及不含水的无菌注射液，其可含有抗氧化剂，缓冲液及溶质，此溶质使配方与受体的血液等渗；且含水及不含水无菌悬浮液可包括悬浮剂及增稠剂。此配方可以单位剂量，或多剂包含物如密封的安瓿及小瓶存在，并可贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前只需加入无菌液体载体如注射用水。即时注射液及悬浮液可从无菌粉末，颗粒及前述片剂中制备。
优选的单位剂量配方含有一日剂量或单位，一日亚剂量或其适当组分的施用成分的。应知除该成分尤其以上提及的成分之外，本发明的配方可包括本领域常规应用的考虑到配方类型的其它制剂。
在另一实施方案中，本发明涉及一种减轻患者体内不受控制的病理性血管发生症状的方法，其通过为所述患者施用有效量的VEGI多核苷酸，VEGI多肽或其类似物，或能诱导内源性或外源性VEGI多肽的表达，或内源性或外源性VEGI多核苷酸的表达，如此减轻病理性血管发生的症状。此疾病包括但非限于血管瘤，实体肿瘤、白血病、转移癌、毛细管扩张、牛皮癣、硬皮病、原发性皮肤淀粉样变、心肌血管发生、斑新血管形成，冠脉并行(coronary collaterals)，缺血肢血管发生，角膜病，潮红，新血管形成性青光眼，糖尿病性视网膜病，晶状体后纤维组织形成，关节炎，糖尿病性新血管形成。在此所述的疾病不包括癌症或各种良性肿瘤。
在一特异实施方案中，本发明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽与治疗有效量的其它负调节血管发生的分子组合，该分子可以但非限于是血小板因子4，血小板反应蛋白1，金属蛋白酶的组织抑制剂(IMPT1和TIMP2)，催乳素(16Kda片段)，抑管张素(纤溶酶原的38KDa片段)，bFGF可溶解受体，转化生长因子β，α干扰素，及胎盘增殖蛋白相关蛋白。
与新血管发生相关的，可用本发明VEGI-α和/或VEGI-β多肽治疗的眼科疾病包括但非限于新血管形成性青光眼，糖尿病性视网膜病，成视网膜细胞瘤，晶状体后纤维组织形成，眼色素层炎，早产性视网膜病，斑点退化，角膜移植新血管形成及其它眼科炎症及与脉络膜或虹膜新血管形成相关的疾病(见如Waltman，et al.，1978 Am.J.Ophthal.85：704-710 and Gartner，et al.，1978，Surv.Ophthal.22：291-312)。
在另一实施方案中，本发明涉及一种促进患者体内血管发生的方法，其通过为所述患者施用有效量的能降低VEGI多肽功能的制剂进行，降低VEGI多肽功能可通过降低VEGI多核苷酸的转录，降低编码VEGI多肽的RNA量，如经用VEGI特异性核酶或特异于VEGIRNA的反义寡核苷酸，或经蛋白酶的抑制而抑制VEGI多肽的产生，该蛋白酶可加工和/或激活上述VEGI多肽(Kayagaki，et al.，(1995)J.Exp.Med.182：1777-1783；Black.Et al.(1997)Nature，385：729-733)，或经破坏或除去使或促进VEGI多肽活化的制剂和/或金属离子，或经破坏VEGI受体直接抑制VEGI多肽功能，或经用识别并结合VEGI多肽的抗体，或经用抑制VEGI多肽功能的拮抗剂。本领域已知核酶及反义寡核苷酸的工程化及释放(见Usman N.，et al.，(1996)Curr.Opin.Struct.Biol.6：527：533及Ho and Parkinson，(1997)Semin.Oncol.24：187-202)，并能输送入哺乳动物细胞，如经与脂质混合或经用病毒或质粒载体。此类疾病包括但非限于斑退化，创伤愈合，消化道溃疡，骨折疤痕疙瘩，血管发生，血细胞生成，排卵，月经及胎盘形成。
其它实施方案
在另一实施方案中，本发明涉及一种检测样本中是否存在VEGI多肽的方法，以诊断或预后与血管发生相关的疾病，用本领域已知标准方法，通过在表面(即一固体支持物)包被特异于VEGI多肽的抗体，如微量滴定板或膜(如硝基纤维素膜)，并将包被表面与血清、组织或其它得自颖有血管发生相关疾病的人的生物学或化学样本接触，可进行诊断分析。样本中VEGI多肽与特异于其的抗体之间形成的所得复合物的存在与否可通过本领域已知的任何通用方法检测，如荧光抗体光谱或比色法。该检测方法可用于如诊断或预后癌症。
在另一实施方案中，本发明涉及一种诊断试剂盒，其含有特异于VEGI多肽的抗体及本领域熟知的并适用于检测血清、组织或其它样本中VEGI多肽存在与否的辅助试剂。此组织样本可得自猴、人或其它哺乳动物。
在另一实施方案中，本发明涉及RNA，DNA或其它核苷酸序列，其用于用PCR或RT-PCR检测VEGI多核苷酸的存在与否。示于SEQID NO：1，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：26中的本发明DNA序列可用于设计在PCR中与VEGI多核苷酸序列，或与编码VEGI多肽的RNA逆转录产生的VEGI cDNA特异结合的引物，从而检测VEGI多核苷酸的存在与否，或与标准对照对VEGI多核苷酸定量。此引物长度可以是7-40个，优选10-15个，更优选18-25个核苷酸。本领域熟知PCR或RT-PCR所需试剂及对照物。然后分析扩增产物VEGI多核苷酸序列的存在与否，例如通过杂交或不杂交的凝胶分级分离，通过放射化学及免疫化学技术。此方法的优点是仅需少量样本产生足够量的DNA模板以进行PCR或RT-PCR。
在另一实施方案中，本发明涉及一诊断试剂盒，其含有特异于VEGI多核苷酸的PCR或RT-PCR引物，及一辅助试剂，该试剂是本领域熟知并适用于检测VEGI多核苷酸存在与否，或用PCR或RT-PCR确定编码样本中VEGI多肽的RNA的数量。此样本可得自人或其它哺乳动物。
VEGI在人脐静脉内皮细胞，诱导的内皮细胞，巨噬细胞及黑质组织中表达。就一些免疫及循环系统相关的疾病而言，VEGI-α和/或VEGI-β基因表达水平的明显变化(提高或降低)可在免疫及循环系统组织中，或其它取自具有与“标准”VEGI-α和/或VEGI-β基因表达水平相关的疾病的个体的细胞或体液(如血清、血浆、尿、滑液或脊液)中检测，“标准”VEGI-α和/或VEGI-β基因表达水平即在免疫及循环系统组织中或在取自无免疫及循环系统疾病个体的体液中VEGI-α和/或VEGI-β的表达水平。
因此，本发明提供一种在诊断免疫及循环系统疾病中有效的诊断方法，其包括测定编码VEGI-α和/或VEGI-β蛋白质的基因，在免疫及循环系统组织中或在其它取自个体的细胞或体液中的表达水平，并将测定的基因表达水平与标准VEGI-α和/或VEGI-β基因表达水平相对照，其中与标准相对比基因表达水平提高或降低是免疫及循环系统疾病的象征。
当免疫及循环系统中疾病的诊断已经根据常规方法进行时，本发明是有效的预测指示剂，从而呈降低的VEGI-α和/或VEGI-β基因表达的患者将比表达水平接近标准水平的患者经历更差的临床结果。
“分析编码VEGI-α和/或VEGI-β蛋白质的基因的表达水平”是指直接或间接定性或定量测定或估计VEGI-α和/或VEGI-β，或编码VEGI-α和/或VEGI-β多肽的mRNA在第一种生物学样本中的水平，直接测定如测定或估计绝对多肽水平或RNA水平，间接测定如对比在第二种生物样本中VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平。优选地，测定或估计在第一种生物样本中VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平，并与标准VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平相对比，标准是得自取自无此疾病个体的第二种生物样本，或通过平均无此免疫及循环系统疾病群体的水平而测定的。本领域应知，一旦已知标准VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平或mRNA水平，其可以重复用作对照标准。
“生物样本”是指任何得自个体，体液，细胞系、组织培养物，或其它含VEGI-α和/或VEGI-β多肽或mRNA的源料的生物样本。如上所指明的，生物样本包括体液(如血清，血浆，尿，滑液及脊液)，其含有游离VEGI-α和/或VEGI-β多肽，及包括免疫及循环系统组织，和其它发现表达完整或成熟VEGI-α和/或VEGI-β多肽或VEGI-α和/或VEGI-β受体的组织源料。本领域熟知从哺乳动物获得组织活检及体液的方法。当生物样本包括mRNA时，组织活检的生物样本是优选的。
用任何适当的技术，如Chomczynski及Sacchi所述的一步氰酸胍-苯酚-氯仿方法(Anal.Biochem.162：156-159(1989))可从生物样本中分离总细胞RNA。然后用任何适当方法分析编码VEGI-α和/或VEGI-β多肽的mRNA的水平，包括Northern印迹分析，S1核酸酶作图，PCR，RT-PCR，及RT-LCR。
可用基于抗体的技术分析生物样本VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平。例如，用经典免疫组织学方法可研究组织中VEGI-α和/或VEGI-β多肽表达(Jalkanen，M.，等，J.Cell.Biol.101：976～985(1985)；Jalkanen，M.，et al.，J.Biol 105：3087-3096(1987))。其它用于检测VEGI-α和/或VEGI-β多肽基因表达的基于抗体的方法包括免疫分析，如ELISA及RIA。合适的抗体分析标记本领域已知，并包括酶标记如葡萄糖氧化酶，及放射性同位素如125I，14C，35S，3H，112In及99mTc，及荧光物标记如荧光素及罗丹明，及生物素。
除分析在得自个体的生物样本中VEGI-α和/或VEGI-β多肽水平之外，也可通过成像检测体内VEGI-α和/或VEGI-β多肽。体内VEGI-α和/或VEGI-β成像的抗体标记或标志包括那些通过X光，NMR或ESR可检测的。对X光而言，合适的标记包括放射性同位素如钡或锶，其发射可检测的辐射，但对试验病人无明显损害。适于NMR和ESR的标志包括那些具有可检测特性自旋的标志，如氚，其可通过标记相关杂交瘤的养分而掺入抗体中。
将已用适当的可检测的显像剂组分如放射性同位素(如131I，112In，99mTc)，不透射线物质，或经核磁共振(NMR)可检测的物质标记的VEGI-α和/或VEGI-β多肽特异性抗体或抗体片段，导入(如非肠道，皮下或腹膜内)哺乳动物中，以诊查免疫系统疾病。本领域将知晓受试者的大小及所用显像系统将决定需产生诊断显像的显像剂组分的数量。在放射性同位素组分的情况中，对受试验的人而言，注射的放射活性物质的量将在大约5～20毫居里99mTc范围。然后标记的抗体或抗体片段将优选在含VEGI-α和/或VEGI-β多肽的细胞位置积聚。体内肿瘤显像见于Burchiel等所述(第13章肿瘤成像：癌症的放射化学检测，，Burchiel，S.W.和Rhodes，B.A.，eds.，MassonPubliching Inc.(1982))。
如上所述，VEGI-α和/或VEGI-β多核苷酸及多肽可用于诊断含有异常高或低VEGI-α和/或VEGI-β活性表达的疾病。给定其中表达VEGI-α和/或VEGI-β的细胞和组织，以及通过VEGI-α和/或VEGI-β调节的活性，很明显个体中VEGI-α和/或VEGI-β的表达水平与标准或“正常”水平相比明显的变化(提高或降低)，产生与体系相关的病理条件，其中VEGI-α和/或VEGI-β是表达的和/或是活性的。
本发明还用于诊断或治疗哺乳动物，尤其是人体内各种免疫及循环系统相关疾病，如此疾病包括细菌、病毒或其它寄生虫感染，免疫缺陷，炎症疾病，淋巴腺疾病，自身免疫疾病，移植物对宿主疾病，及任何免疫及循环系统细胞功能失调，包括但非限于自身免疫性疾病，白血病、淋巴瘤、免疫抑制、免疫性、体液免疫、炎性肠道疾病，骨髓抑制等。
由于VEGI多肽可诱导细胞NF-κB及c-jun N末端激酶(JNK)的活性，因此其也可用于治疗性地调节如由细菌、病毒及其它寄生虫引起的感染，免疫缺陷，炎症疾病，淋巴腺疾病，自身免疫疾病，移植物抗宿主疾病，自身免疫性，免疫抑制，炎症肠道疾病，骨髓抑制及相关后遗症等细胞及免疫系统疾病。
由于VEGI-α和/或VEGI-β属于TNF超家族，它们还可调节血管发生。另外，由于VEGI-α和/或VEGI-β多肽抑制免疫细胞功能，其将具有广泛抗炎作用，VEGI-α和/或VEGI-β多肽可用作抗新血管发生剂，以刺激宿主防御细胞如胞毒T细胞及巨噬细胞的侵染及活性。本领域技术人员将识别一些非癌症症状，其中血管增殖是非所需的。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于增强宿主抗抵抗性慢性及急性感染的防御力，如经杀微生物的淋巴细胞的引诱及激活抗肌细菌感染。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于抑制T细胞增殖，其通过抑制IL-2生物合成治疗T细胞介导的自身免疫疾病。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于刺激伤口愈合，可经清除残渣及促进炎症细胞的结缔组织复原进行。以相同方式，VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于治疗其它纤维性疾病，包括肝硬化，骨关节炎及肺纤维化。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也提高嗜红性粒细胞的存在，其具有杀伤侵入组织的如schistosomiasis trichinosis及蛔虫等寄生虫幼虫的独特功能。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于调节造血，其通过调节各种造血原细胞的活性及分化而进行，如在化疗后从骨髓中释放成熟白细胞，即在干细胞迁移中。VEGI-α和/或VEGI-β多肽也可用于治疗败血病。
也将为熟练技术人员知晓的是：由于本发明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽是TNF家族成员，成熟分泌形式的蛋白质可以可溶形式经蛋白酶裂解从表达VEGI的细胞中释出。因而，当将VEGI-α和/或VEGI-β的成熟形式或可溶胞外结构域从外源加至细胞，组织或个体中时，此多肽将发挥其对其个体靶细胞的生理作用。也可将表达此II型跨膜多肽的细胞加入细胞，组织或个体中，且这些加入的细胞将结合表达VEGI-α和/或VEGI-β受体的细胞，从而表达VEGI-α和/或VEGI-β多肽的细胞可作用于具有靶细胞的受体(如调节内皮细胞生长及调节)。
因此，应知由VEGI-α和/或VEGI-β在个体中活性比标准或正常水平降低所致的疾病，尤其免疫及循环系统疾病，可以通过施用VEGI-α和/或VEGI-β多肽(以成熟或胞外结构域多肽形式)进行治疗。因此，本发明还提供一种治疗机体中需要VEGI-α和/或VEGI-β活性水平提高的方法，包括为该个体施用一药物组合物，该组合物含有一定量的本发明分离的VEGI-α和/或VEGI-β多肽，尤其是本发明VEGI-α和/或VEGI-β多肽的成熟形式，有效地提高在如此个体中VEGI-α和/或VEGI-β活性水平。
VEGI的细胞粘附活性可用于伤口愈合。VEGI具有强内皮细胞增殖作用，其是VEGI在伤口愈合中起作用的标记。VEGI的细胞粘附作用在伤口愈合中也起作用。
VEGI多肽也可用于治疗需生长促进活性的疾病，如再狭窄。如上所述，VEGI呈现对内皮细胞生长具有强增殖作用。由此，VEGI也可用于调节造血及内皮细胞生长。
由于VEGI多肽能刺激T细胞活性，因此其是免疫应答的一重要中介体。由此，该多肽可用于刺激抗各种寄生虫、细菌及病毒感染的免疫应答。VEGI多肽可裂解病毒感染的细胞，并从而用于抑制HIV感染的细胞。
VEGI多肽也可通过增强T细胞增殖应答而用于治疗自身免疫疾病，如I型糖尿病。
表2.VEGI活性概述
细胞系 来源及类型 胞毒性 增殖 分化 粘附
L929 小鼠成纤维细胞 + - - -
WEHI164 小鼠纤维肉瘤 +++ - - -
NRK-54E 大鼠肾内皮样 + - - -
THP-1 人单核细胞白血病 + - ++ ++
HL-60 人早幼粒细胞白血病 - - - ++
Raji 人Burkitt淋巴瘤 - - - -
Jurkat 人T细胞淋巴瘤 ++ - - -
Primary HUVEC - ++ - ？
Primary 人动脉内皮 +* ++ - ？
A-431 人表皮样癌 ++ - - -
293 人胚肾 - ++ - -
注：*只在高剂量。“+”代表活性的相对水平。“-”代表在测试浓度范围未检测到活性。
VEGI可用于抑制内皮细胞的增殖，如动脉内皮细胞。在近于10μg/ml浓度，VEGI可近于完全地抑制内皮细胞生长，而对人乳腺癌细胞生长无明显作用。结果，VEGI可用于治疗其中内皮细胞生长抑制是有益的疾病。
本发明的VEGI多肽已用于降低体内由内皮细胞形成的类毛细管结构的形成。本发明的VEGI多肽可用于在应答血管生成因子如FGF-2中，抑制类毛细管结构中内皮细胞组织化形成。进一步地，本发明分离的VEGI可用于在修改的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)中抑制内皮细胞在毛细管中生长及组织化。结果，本发明的VEGI可用于抑制体外从内皮细胞中形成毛细管或类毛细管结构。
本发明的多核苷酸及多肽可用作研究试剂，用于发现治疗及诊断人体疾病。
本发明提供一种鉴别VEGI受体的方法。编码该受体的基因可通过各种本领域已知方法如配体淘选及FACS分选。(Coligan，et al.，Current Protocols in Immune.，1(2)，Chapter 5，(1991)。优选地，应用表达克隆，其中聚腺苷酸化RNA从对VEGI应答的细胞中制备，且将从此RNA中产生的文库分成集合体，并用于转染COS细胞或其它对VEGI无应答的细胞。将生长于玻璃载体片上转染的细胞曝光以标记VEGI。可通过各种方法包括碘化或包含位点特异性蛋白激酶的识别位点，以标记VEGI。在固定及培养后，将此载玻片进行放射自显影分析。鉴别阳性集合体，并制备亚集合体，并用重复制备亚集合体及重筛选用方法重转染，最后产生编码推定受体的单克隆。
如一受体鉴别的选择方法，标记的VEGI可与细胞膜或表达受体分子的提取制备物光亲和连接。将交连物经PAGE解离并在X线下曝光。切除含VEGI受体的标记复合物，并解离为肽片段，并进行蛋白质微量测序。得自微时测序的氨基酸序列将用于设计一系列简并寡核苷酸探针，以筛选一cDNA文库以鉴别编码推定受体的基因。
此VEGI多肽组合物将配制成与良好的医学实践相一致，并考虑到患者的临床症状〔尤其只用VEGI多肽治疗的副作用〕。VEGI多肽的释放位点，施用方法，施用程序表及其它方面已为从业者所知。VEGI多肽的“有效量”经如此条件测定。
拮抗剂可与药物可接受载体如后文所述的载体组合应用。
本发明的VEGI多肽及兴奋剂及拮抗剂可与适当药物载体组合应用。该组合物含有治疗有效量的化合物，及药物可接受载体或受体。该载体包括但非限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其组合物。配方应适于施用方式。
本发明还提供一药物成套试剂或试剂盒，其含有一或多个装有一或多个本发明药物组合物的成分的容器。与此容器相关的是政府机构管理使用或出售药品或生物制品生产者的规定，其规定了生产机构使用或出售此制品施用于人经过认可。另外，本发明的药物组合物可与其它治疗性化合物联合应用。
此药物组合物可以如经局部、静脉内，腹膜内，肌肉，皮下，鼻内或皮内途径等常规方式施用。此药物组合物是以有效治疗和或预防量施用。通常地，它们以至少10g/kg(体重)施用，在多数情况下将以每天不超过8mg/kg(体重)施用。在大多数情况中，考虑到施用途径，症状等，剂量每天在大约10g/kg-1mg/kg体重之间。
已知各种释放系统，并可用于施用本发明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽，如在脂质体中包入胶囊，微粒，微胶囊，受体介导的胞吞(见如Wu and Wu 1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。导入方法包括但非限于局部，皮内，肌内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，硬膜外，眼，及口服途径。此化合物可通过任何常规途径施用，例如经灌注或药团注射，经内皮或粘膜皮层吸收(如口腔粘膜，直肠及小肠粘膜等)，并可与其它生物活性制剂一起施用。
在一特异的实施方案中，期望在需要处理的区域局部施用本发明的药物组合物。这可通过如但非限于在手术期间局部灌注，局部施用如与伤口包扎连用，经注射，经导管方式，经栓剂，或经植入，所述植入是一多孔，非多孔，或凝胶物包括膜，如肠系膜或纤维。
本发明VEGI-α和/或VEGI-β多肽的局部施用至少可治疗一些本文所示的眼科疾病，其由有效量的本发明VEGI-α和/或VEGI-β多肽及眼科学可接受赋形剂如缓冲盐水，矿物油，植物油(如豆油或花生油)，石油嗜喱，Miglyol 182，醇溶液或脂质或类脂产物组成。这些组合物也可包括防腐剂，抗氧化剂，抗生素，免疫抑制剂及其它生物或药物有效制剂，其对本发明的VEGI-α和/或VEGI-β多肽无明显影响。
根据本发明，通过体内表达该多肽，VEGI多肽及兴奋剂及拮抗剂也可应用，此兴奋剂及拮抗剂也是多肽。通常称之为“基因疗法”。
因此，例如患者细胞可用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA工程化，然用将工程化的细胞提供给患者以用该多肽进行治疗。本领域已熟知此方法，并经本文教导更显而易见。例如，细胞可经用含编码本发明多肽RNA的逆转录毒颗粒工程化。
相似地，细胞可通过体内表达多肽而体内工程化，如经本领域已知步骤。例如，产生含编码本发明多肽RNA的逆转录病毒颗粒的秤细胞可施用于病人，以体内工程化细胞并体内表达多肽。通过本发明的教导，这些及其它施用本发明多肽的方法应为本领域技术人员熟知。例如，工程化细胞的表达载体可以是逆转录病毒之外的，如腺病毒，其在与适当释放载体组合后可用于工程化细胞。
从中上述逆转录病毒质粒载体可以衍生的逆转录病毒包括但非限于Moloney鼠白血病病毒，脾坏死病毒，逆转录病毒如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白病毒，猿白血病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒。在一实施方案中，逆转录病毒质粒载体衍生自Moloney鼠白血病病毒。
此载体包括一或多个启动子，可应用的适当启动子包括但非限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；及由Miller等所述的人CMV启动子(Biotechniques 7：980-990(1989))，或任何其它启动子(如细胞启动子如真核细胞启动子：包括但非限于组蛋白，pol III，及b-肌动蛋白启动子)。其它可应用的病毒启动子包括但非限于腺病毒启动子，TK启动子，及B19细小病毒子。根据本文教导本领域技术人员将易于选择适当启动子。
编码本发明多肽的核酸序列在适当启动子的控制之下。可应用的适当启动子包括但非限于腺病毒启动子如腺病毒主要晚期启动子；或hetorologous启动子如CMV启动子；RSV启动子；可诱导启动子如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子如Herpes Simplex的苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括上述修改的逆转录病毒LTRS)；b-肌动蛋白启动子；及人生长素启动子。此启动子也可以是天然启动子，其控制编码多肽的基因。
逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可转染的包装细胞包括但非限于PE501，PA317，b-2，b-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，CRE，β-CRIP，GP+E-86，GP+envAm12，及如由Miller(Human Gene Theapy 1：5-14(1990))所述的DAN细胞系，其全部并入参考。此载体可通过本领域任何已知方法转导包装细胞。如此方法包括但非限于电穿孔，应用脂质体及CaPo4沉淀。一种选择是逆转录质粒载体可胶囊化入脂质体中，或与脂质偶联，然后施用于宿主。
生产细胞系产生包括编码多肽的核酸序列的感染逆转录病毒载体颗粒。然后可将此逆转录病毒载体颗粒用于在体内或体外转导真核细胞。此转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可转导的真核细胞包括但非限于胚胎干细胞，胚胎癌性细胞，以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质形成细胞，内皮细胞及支气管上皮细胞。
本发明还涉及一种筛选化合物的方法，其用于鉴别那些模拟VEGI(兴奋剂)或阻止VEGI效应(拮抗剂)的化合物。该方法的一实例是利用VEGI多肽在存在共促分裂原(comitogen)ConA的情况下有效地刺激人内皮细胞增殖的能力。获得内皮并将其在补加10％热灭活的胎牛血清(Hyclone Labs，Logan，VT)，1％L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100g/ml链霉素，0.1％庆大霉素(Gibco Life Technologies，GrandIsland，NY)的RPM11640中，在有2g/ml ConA(Calbiochem，La Jolla，CA)情况下，在96孔平底培养盘(Costar，Cambridge，MA)中培养。将Con-A及待筛选的化合物加入至终体积为0.2ml。在37℃，60h之后，将培养物用1Ci[3H]胸苷(5Ci/mmol；1Ci＝37BGq；NEN)脉冲12-18h，并于玻璃纤维滤器(PhD；Cambridge Technology，Watertown，MA)上收获。用液体闪烁计数仪(Beckman Instruments.Irvine，CA)测定三份培养物的平均[3H]胸苷结合(cpm)。有效的[3H]胸苷结合表明内皮细胞增殖的刺激。
或者，在VEGI多肽和受体的相互作用后，测定已知的第二信使系统的应答，并在有或无此化合物的情况下对比。该第二信使系统包括但非限于cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌苷酸水解。
为分析拮抗剂，进行上述分析，但在本分析中VEGI与筛选的化合物一起加入，此化合物在存在VEGI多肽之下抑制[3H]胸苷结合的能力表明此化合物是VEGI拮抗剂。或者，通过将VEGI及一潜在拮抗剂与膜结合受体或重组受体在适当条件下组合，进行竞争抑制分析，从而可检测VEGI拮抗剂。可通过如放射活性标记VEGI，从而与受体结合的VEGI分子数可确定潜在拮抗剂的效应。
或者，将表达VEGI受体的哺乳动物细胞或膜制备物用标记的VEGI在存在此化合物的情况下培养，然后测定此化合物增强或破坏此相互作用的能力。
本发明的此实施方案另一方面提供了一种鉴别与VEGI多肽特异结合的受体蛋白或其它配体结合蛋白(如DR3)的方法。例如，一细胞区室如膜或其制备物，可从表达结合VEGI多肽的分子的细胞中制备。将此制备物与标记的VEGI多肽保温，并将与受体或其它结合蛋白结合的VEGI多肽复合物分离，并根据本领域已知常规方法定性。或者，VEGI多肽可与固体支持体结合，从而将溶解自细胞的结合分子与柱结合，然后根据常规方法洗脱及定性。
在本发明对兴奋剂或拮抗剂的分析中，一细胞区室如膜或其制备物可从表达结合VEGI的分子的细胞中制备，如经VEGI信号或调节途径调制的分子。将此制备物在有或无也许是VEGI兴奋剂或拮抗剂的候选分子的情况下，用标记的VEGI多肽培养。该候选分子结合结合分子的能力反映在标记的配体结合降低中。无偿结合的分子，即不诱导VEGI对结合VEGI结合分子的效应的分子，大多数是良好拮抗剂。结合较好并引发与VEGI相关的相同或相近效应的分子是兴奋剂。
潜在兴奋剂及拮抗剂的类VEGI效应可通过如在候选分子与细胞或适当细胞制备物相互反应之后，测定第二信使系统活性，并将此效应与VEGI或引发如VEGI相同效应的分子的效应相对比。用于此目的第二信使系统包括但非限于AMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌酸水解第二信使系统。
分析VEGI拮抗剂的另一实例是竞争分析，其是在适当条件下将VEGI多肽和潜在拮抗剂与膜结合的VEGI受体分子或重组VEGI受体分子组合，进行竞争抑制分析。可通过如放射活性将VEGI多肽标记，从而与受体分子结合的VEGI分子数可精确测定以评价潜在拮抗剂的效应。
潜在拮抗剂包括与本发明多肽结合的小有机分子、肽、多肽及抗体，从而抑制或消灭其活性。潜在拮抗剂也可以是结合在结合分子上相同位点的小有机分子、肽、多肽，如类似的相关蛋白质或抗体，结合分子如受体分子，而不诱导VEGI诱导的活性，从而通过使VEGI不能结合而阻止VEGI的作用。
其它潜在拮抗剂包括反义分子。反义技术可用于通过反义DNA或RNA或通过三螺旋形成控制基因表达。反义技术见于许多研究所论述(如Okano，J.Neurochem 56：560(1991)；“Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression.”CRC Press，Boca Rator，FL(1988))。三螺旋形成见于许多研究论述(如Lee，et al.，Nucleic AcidsResearch 6：3073(1979)；Cooney，et al.，Science 241：456(1988)；Dervan，etal.，Science 251：1360(1991))。这些方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸5’编码部分可用于设计一长度大约10～40碱基对的反义RNA寡核苷酸。一DNA寡核苷酸被设计为互补于包含于转录中基因的一区域，从而阻止转录及VEGI产生。此反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并破坏mRNA分子翻译为VEGI多肽。上述寡核苷酸可被输入细胞，从而反义RNA或DNA可体内表达以抑制VEGI多肽的产生。
特异于VEGI多肽的抗体可用作拮抗剂，其与VEGI结合并阻止其与其受体结合。单克隆抗体对此尤为有效。但特异于VEGI受体的抗体可介导另外的细胞应答，其趋于在VEGI与其受体相互作用时增强VEGI的效应。
潜在的VEGI拮抗剂也包括VEGI突变体，其与VEGI受体结合并且不引发第二信使应答，以有效地将受体与其天然配体阻断。特异设计的寡核苷酸及小分子也可结合VEGI受体〔如DR3〕，并阻止其与VEGI结合。小分子例子包括但非限于小肽或类肽分子。
另一种潜在VEGI拮抗剂是VEGI受体的可溶形式，其结合VEGI并阻止其与膜结合的VEGI受体相互作用。在此方式中，该受体不被VEGI刺激。
其它潜在VEGI拮抗剂是用反义技术制备的反义构建体。反义技术可用于通过三螺旋形成或者反义DNA或RNA控制基因表达，二种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分，用于设计一长度大约为10～40碱基对的反义RNA寡核苷酸。一DNA寡核苷酸被设计为互补于参于转录的基因的一区域(三螺旋-见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney et al.，Science，241；456(1988)；and Dervan et al.，Science，251：1360(1991))，从而阻止转录及VEGI产生。此反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并阻断mRNS分子翻译为VEGI多肽(Antisense-Okanno，J.Neurochem.，56：560(1991)；Oligodeoxynueleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，BocaRaton，FL(1988))。上述寡核苷酸也可被输送入细胞，从而反义RNA或DNA可在体内表达，以抑制VEGI的产生。
VEGI拮抗剂也可用于处理恶病质，其是由VEGI抑制的脂蛋白脂酶的全身性缺陷所致的脂质明显缺损。VEGI拮抗剂还用于治疗脑疟疾，其中VEGI似乎起病原体作用。
VEGI拮抗剂还可用于防止移植排斥，其通过防止在移植物存在下，VEGI对免疫系统的刺激而进行的。
VEGI拮抗剂还可用于治疗骨质疏松，这是因为VEGI可诱导骨的再吸收。
VEGI拮抗剂还可用作抗炎剂，这是因为VEGI介导一增强的炎症应答。
拮抗剂还可用于治疗内毒性休克，也称作脓毒性休克。此危险疾病是由对细菌或其它类型感染的过份应答所致。此应答导致VEGI水平升高，而引起休克及组织损伤。
本发明还涉及一诊断分析，以检测VEGI多肽在各种组织中水平的变化，由于与正常对照组织样本相比，蛋白质的过表达可确定疾病是否发生或是否易感疾病，如脑疟疾，用于检测衍生自宿主的样本中VEGI水平的分析已为本领域技术人员所熟知，且包括放射免疫方法，竞争结合分析，Western印迹分析，ELISA分析及“夹心”分析。ELISA分析(Coligan et al.，Current Protocols in Immmunology，1(2)，Chapter6，(1991))最初包括制备特异于VEGI抗原的抗体，优选单克隆抗体。另外制备抗单克隆抗体的报道抗体。报道抗体附着于一可检测试剂，如放射性，荧光性或实施例中的辣根过氧化物酶。从宿主中除去样本并在固体支持物上如结合样本中蛋白质的聚苯乙烯培养皿上培养。然后将培养民上任何游离蛋白质结合位点，通过用非特异性蛋白质如BSA培养包被。接着，将单克隆抗体在培养皿中保温，在此期间单克隆抗体与吸附于聚苯乙烯皿上的任何VEGI多肽附着。用缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。将连于辣根过氧化物酶的报道抗体置于皿中，使报道抗体与和VEGI结合的单克隆抗体结合。然后洗去未吸附的报道抗体。然后向皿中加入过氧化物酶底物。当与标准曲线相对比时，在所给时间内显色量是所供患者样本体积中VEGI的量。
竞争分析可以应用，其中将特异于VEGI多肽的抗体吸附于固体支持物，并将标记的VEGI和衍生自宿主的样本从固体支持物中通过，检测的标记量，如经液体闪烁层析检测，然后可与样本中VEGI量相关。
“夹心”分析类似于ELISA分析。在“夹心”分析中，将VEGI从固体支持物中通过，并与吸附于固体支持物的抗体结合。然后将第二抗体与VEGI结合。将标记的并特异于第二抗体的第三抗体接着通过固体支持物，并与第二抗体结合，然后可定量。
本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。
简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列定位在染色体上。使用cDNA的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增产物。
体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体-特异cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至50或60个碱基cDNA。此技术的综述见Verma et al.，Human Chromosomes：a Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中发现(可在线从JohnsHopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。
接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。
应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。
使用上述技术，VEGI的染色体位置以非常高的可靠性定位于9q32。以前的染色体作图已将几个发育缺陷与染色体9的这一区域中的基因座连锁。
                       实施例
以下描述的是本发明的实施例，其仅为举例性的，并非对本发明范围的限制。根据本发明，在权利要求书范围内的各种实施方案是本领域技术人员显而易见的。
以下将参照实施例进一步描述本发明，但是应理解的是，本发明不受这些实施例的限制。除非另有说明，所有的份或量均为重量份或重量。
为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。
“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μg DNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。
裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。
“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。
除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52：456-457(1973)的方法进行转化。
实施例1VEGI多肽的细菌表达及纯化
构建一表达载体，该载体含有一编码缺失了推定的全长VEGI-α多肽N末端的38个氨基酸的多核苷酸。用特异于VEGI-α编码序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码N末端缺失的VEGI-α多核苷酸的DNA序列。分别在3’及5’序列中加入产生限制位点以促进克隆的其它核苷酸。该5’寡核苷酸引物具有5’-GCG CCA TGG CTC TGCACT GGG AAC AT-3’(SEQ ID NO：3)序列，其含Nco I限制位点随后是编码序列的18个核苷酸。3’引物具有5’-CGC AAG CTTCTA TAG TAA GAA GGC TCC-3’(SEQ ID NO：4)序列，其含HindIII限制位点随后是18个互补于编码序列最后15个核苷酸及终止密码子的核苷酸。在用适当的限制酶消化之后，将扩增的VEGI-αDNA产物克隆入PQE 60(Qiagen)载体中，随后连接。将此连接混合物转化感受态E.coli细胞(M15/rep4菌株)中。将含所需构建体的克隆生长至600nm光密度为0.4-0.6，然后加入IPTG至终浓度为1mM，以诱导蛋白质的表达。3小时后，收获细胞并从破坏的细胞中纯化包涵体，并将包涵体的蛋白质溶于8M尿素中。将溶解的蛋白质在2XPBS中通过PD-10柱，从而除去尿素，交换缓冲液并折叠蛋白质。通过进一步层析除去内毒素将蛋白质纯化。所得VEGI-α多肽制备物经SDS-PAGE发现纯度高于90％，且含＜10EU内毒素/mg。
另外，编码全长VEGI-αORF，的DNA序列，ATCC保藏号75927的DNA序列，用相应于VEGI-α蛋白的5’及3’序列的PCR寡核苷酸引物最初扩增。分别在5’及3’序列中加入其它相应于VEGI-α的核苷酸。5’寡核苷酸引物示于SEQ ID NO：13，并具有5’-GCGCGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAG CAA AGT C-3’序列，其含有BamHI限制酶位点，随后是起始自初始甲硫氨酸密码子的VEGI-α编码序列的头24个核苷酸。3’序列为5’-CGC GTCTAG ACT ATA GTA AGA AGG CTC CAA AGA AGG-3’(SEQ IDNO：14)，其含有互补于XbaI位点的序列及22个VEGI-α的核苷酸。此限制酶位点相当于细菌表达载体pQE-9(Qiagen)中限制酶位点。然后用Bam HI及Xba I消化pQE-9。将扩增的序列连于pQE-9中，并插入具编码组氨酸标记的序列及RBS的框架中。然后将此连接混合物用于转化商标为M15/rep4的得自Qiagen的E.coli菌株，步骤如Sambrook，J.等分子克隆实验手册，Cold Spring LaboratoryPress，(1989)所述。M15/rep4含有质粒pREP4的多重拷贝，其表达LacI阻抑物，并还赋予卡那霉素抗性(Kanr)。通过其在LB平板上的生长能力鉴定转化体，并选择氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并经限制分析证实。将含所需构建体的克隆在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB培养基的液体培养基中生长过夜(O/N)。此O/N培养物用于以1∶100～1∶250比率接种大培养物。将细胞生长至光密度600(O.D.600)在0.4～0.6之间。然后加入IPTG至终浓度为1mM。IPTG通过失活1acI阻抑物，清除P/O引导提高基因表达。将细胞培养3～4小时以上，然后经离心收获细胞。将细胞沉淀溶于离液剂6M盐酸胍中(发现盐酸胍浓度高于或等于2.5M，则回收的重组蛋白质的纯度水平较高)。澄清后，通过在镍螯合柱上，在使其被含6-组氨酸-标记的蛋白质紧密结合的条件下层析，从此溶液中纯化溶解的VEGI-α多肽(Hochuli，E.et al.，J.Chromatography 411：177-184(1984))。经在镍螯合柱上第二次层析将VEGI-α多肽(90％纯化)经6M盐酸胍，pH5.0从柱中洗脱，并为再复性之目的在PBS缓冲液中透析。将此表达产物经SDS-PAGE电泳。
本领域技术人员将认识到：除PQE-9之外其它细菌表达载体也可用于表达VEGI多肽。如此优选的细菌表达载体是pHE4-5。pHE4-5可作为pHE4-5/MPIFD23质粒DNA而获得(此构建体含有一编码非相关ORF的非相关插入)。pHE4-5/MPIFD23质粒保藏在美国典型培养物保藏中心，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852，保藏日1997年9月30日(登录号209311)。p718限制位点，本领域技术人员可便于应用通用分子生物学技术，用本发明的VEGI ORF或其变体置换pHE4-5/MPIFD23质粒中不相关的ORF。
实施例2：用杆状病毒表达系统克隆及表达VEGI多肽
将编码全长VEGI-α多肽的DNA序列，ATCC NO75927的，应用相当于基因5’及3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增。此5’引物序列为5’-GCG CGG ATC CAC CAT GAG ACG CTT TTT AAGCAA AGT C-3’(SEQ ID NO：15)并含有一Bam HI限制酶位点(黑体字处)后接VEGI-α编码序列的24个核苷酸(翻译起始密码子“ATG下划线)。3’引物序列为5’-CGC GTC TAG ACT ATA GTAAGA AGG CTC CAA AGA AGG-3’(SEQ ID NO：16)，并含有限制内切酶XbaI的切割位点及互补于VEGI-α编码序列的3’未翻译序列的22个核苷酸。用商购的试剂盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)将扩增的序列从1％琼脂糖凝胶中分离。然后将此片段用内切酶Bam HI及XbaI消化，并接着在1％琼脂糖凝胶上再纯化。此片段标示为F2。
载体pA2(PVL941载体的修饰物，上述)用于应用杆状病毒表述系统表达VEGI-α多肽(参见Summers，M.D.and Smith，G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序方法年报，Texas AgriculturalExperimental Station Bulletin NO.1555)。此表达载体含有苜蓿银蚊夜蛾核多角体病毒AcMNPV的强多角体蛋白启动子，后接限制内切酶BamHI及XbaI的识别位点。SV40的聚腺苷酸化位点用于有效聚腺苷酸化。为便于选择重组病毒，将E.coli的β-半乳糖苷酶基因与多角体蛋白启动子同向插入，后接多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号，此多角体蛋白序列的两侧为用于进行共转染的野生型病毒DNA的细胞介导的同源重组的病毒序列的。一些其它杆状病毒载体可用于替换pA2，如pRG1，pAc373，pVL941及pAcIM(Luckow，V.A.and Summers，M.D.，Virology，170：31-39)。
将质粒用限制酶Bam HI及XbaI消化，然后用牛小肠磷酸酶经本领域已知程序去磷酸化。接着用商购试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca)从1％琼脂糖凝胶上将DNA分离。此载体DNA标示为V2。
将片段F2与去磷酸化的质粒V2用T4 DNA连接酶连接。然后转化Ecoli XL1蓝色细胞，克隆片段的序列经DNA测序确定。
用脂质转染法(Felgner et al.，Proc Natl Acad Sci USA 84：7413-7417(1987))将5μg质粒pBac VEGI-α与1.0μg商购线性的杆状病毒(“BaculoGold杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA)共转染。
将1μg BaculoGobl病毒DNA与5μg质粒pBac VEGI-α混合于含50μg玩血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，GaithersburgMD)的微滴定培养平板的无菌孔中，随后加入10μg Lipofectin及90μg Grace’s培养基，混合并在室温培养15分钟，然后将此转染混合物滴加至Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)，该昆虫细胞种植在含无血清的1ml Grace’s培养基的35mm组织培养平板中，将此平板前后摇晃以混合新加入的溶液。然后将此平板在27℃培养5小时，5小时之后，从平板移出转染溶液，并加入用10％胎牛血清补加的1mlGrace’s昆虫培养基。将平板放入温箱中，并在27℃持续培养4天。
4天后，收集上清液，并基本如Summers及Smith(见前述)所述进行噬斑分析。一处修改是，具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg)用于使蓝染噬斑易于分离(“噬斑分析”的详细论述也可见于Life Technologies Inc.，Geithersburg出版的昆虫细胞培养及杆状病毒使用手册P9-10)。
在系列稀释4天后，将病毒加入细胞中，用Eppendorf移液管尖挑取蓝染噬斑。然后将含重组病毒的琼脂重悬浮于含200μl Grace’s培养基的Eppendorf管中，经短暂离心移出琼脂，并且将含重组杆状病毒的上清液用于感染植于35mm培养皿中的Sf 9细胞。4天后，收集这些培养皿的上清液然后在4℃贮存。
将Sf9细胞在补加10％热灭活的FBS的Grace’s培养基中培养。将此细胞用重组杆状病毒V-VEGI-α在感染复数(MOI)为2下感染。6小时后，除去培养基，并用不含甲硫氨酸及半胱氨酸的SF 900II培养基置换(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)。42小时后，加入5μCi的[35S]-甲硫氨酸及5μCi的[35S]-半胱氨酸(Amersham)。上在进一步培养16小时，然后将其离心收集并经SDS-PAGE及放射自显影观察标记蛋白质。
实施例3：重组VEGI-α在哺乳动物细胞中的表达
中华仓鼠卵巢(CHO)细胞二氢叶酸还原酶阴性(DHFR-)细胞系购自美国典型培养物保藏中心。基本如下所述将VEGI-αcDNA克隆入pC1 CHO细胞表达载体中。将编码全长VEGI-α多肽的人cDNA序列用引物扩增，该引物特异于VEGI-α编码序列的5’及3’末端，5’引物：GCG gga tcc GCC ACC ATG AAC TCC TTC TCC ACAAGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTCCTG GTG TTG CCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTT GTG AGA C(SEQ ID NO：5)，其含有Bam HI限制位点，后接“Kozak”序列(小写字母处)，及IL6编码序列的头84个碱基和VEGI-α编码序列的13个碱基；3’引物：CGC gga tcc GAT ATT TGC TCT CCT CCTCA(SEQ NO：6)，其含有Bam HI限制位点，后接17个非翻译区的核苷酸及终止密码子。将扩增的片段凝胶纯化，并用Bam HI消化。将CHO细胞表达载体(pC1)用Bam HI消化，然后通过琼脂糖凝胶纯化。将扩增的VEGI-α编码序列用T4 DNA连接酶与纯化的pC1载体连接。接下来转化HB 101细胞。通过PCR筛选/酶消化鉴别阳性克隆(pC1VEGI)，并用自动DNA测序确定插入的DNA序列。如R.Gettzet al.，Eur LT Biochemistry 210.545(1992)所述进行稳定CHO细胞克隆的选择与扩增。将CHO稳定转染体CHO-VEGI-α及CHO-载体保持在含10％FCS的MEM-a培养基中(透析)。
质粒的表达，VEGI-α-HA衍生自载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，该载体含有1)SV 40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)E coli复制起点，4)CMV启动子，后接多接头区，SV 40内含子，及聚腺苷酸化位点。将编码完整VEGI-α前体及融入其3’末端的血凝素抗源(HA)标记的DNA片段克隆入载体的多接头区，因而重组蛋白质表达在CMV启动子的引导下。该HA标记相当于衍生自以前描述的流感血凝素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Conolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA标记与我们的靶蛋白的融合使较易用识别HA表位的抗体检测重组蛋白。
质粒构建策略如下述：将编码VEGI-α的DNA序列，ATCC#75927用两种引物通过PCR在克隆的最初的EST上构建，5’引物(SEQID NO：15)含有一Bam HI位点，后接起始自起始密码子的VEGI-α编码序列的24个核苷酸；3’序列5’-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGATAGTAAGAAGGCTCCAAAG-3’(SEQ ID NO：17)，含有互补于XbaI位点，翻译终止密码子，HA靶及VEGI-α编码序列(不包括终止密码子)的后18个核苷酸的序列。因而，PCR产物含有Bam HI位点，VEGI-α编码序列，后接融入框内的HA标记，接着HA标记的翻译终止密码子及XbaI位点。用Bam HI及XbaI限制酶消化PCR扩增的DNA片段及载体pcDNAI/Amp并连接在一起。将连接混合物转化入E.coli菌株SURE(商购自Stratagene Cloning Systems，11099 North TorreyPines Road，La Jolla，OA 92037)，将转化培养物置于氨苄青霉素培养平板上，并选择抗性克隆。从转化体中分离质粒DNA，并通过限制分析检测正确片段的存在与否。为表达重组VEGI-α多肽，将COS细胞用表达载体通过DEAE-葡聚糖法转染。(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringLaboratory Press，(1989))。VEGI-α-HA蛋白的表达通过放射标记及免疫沉淀法检测(E.Harlow，D.Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。在转染2天后，将细胞用[35S]-S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基，并用去污剂(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5；Wilson.I.Et al.，Id.37：767)(1984))裂解细胞。将细胞裂解物及培养基均用HA特异单克隆抗体沉淀。然后将沉淀的蛋白质在15％SDS-PAGE凝胶上分析。
实施例4：VEGI在各种细胞中的表达模式
进行RNA印迹分析以检测VEGI在人组织中的表达水平。用RNAzolTMB系统分离总细胞RNA样本(Brotecx Laboratories，Inc.6023South Loop East，Houston，TX77033)。将2μg分离自每个人特异组织的总RNA在1％琼脂糖-甲醛凝胶上分离，并印迹在尼龙滤膜上(Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Press，(1989))。根据Stratagene Prime-It试剂盒用50ng VEGI-αcDNA进行标记反应以产生[32P]标记的VEGI-αcDNA。将此标记的DNA用Select-G-50柱纯化(5Prime-3Prime，Inc.5603 ArapahoeRoad，Boulder，CO 80303)。然后将滤膜与放射标记的1,000,000cpm/mlr全长VEGI-α探针在0.5M NaPO4，pH7.4及7％SDS中，在65℃杂交一夜。在用0.5X SSC，0.1％SDS在室温洗2次及在60℃洗2次后，用增感屏在-70℃对印迹进行X光片曝光。VEGI-α的信使RNA在肾中是高丰度的。
VEGI在内皮细胞中特异表达，这已通过对从22种各种谱系的不同类型的培养细胞中制备的总RNA进行Northern印迹分析而确认(图1A)。VEGI信使只在二种类型的内皮细胞的原代培养物中检测出：HUVE细胞及早期代次的人静脉内皮细胞。mRNA在晚期代次的人静脉内皮细胞中未检测出，在人动脉细胞中也未检测出。鲜明对比的是TNF家族成员大多数在免疫细胞中表达CB.B.Aggarwal and K.Natarajan，见前述)。例如，TNF-α由巨噬细胞，单核细胞，嗜中性细胞及T细胞产生，而TNF-β主要由促细胞分裂原刺激的T淋巴细胞及白细胞产生。相似地，Fas CD27，CD30，CD40，OX40，及4-1BB配体都在免疫系统的各型细胞中表达。
应用多重组织Northern印迹，检测到VEGI转录物在胎盘、肺、肾、骨骼肌、胰、脾、前列腺、小肠及结肠中表达。在心、脑、肝、胸腺、睾丸、卵巢及周围血淋巴细胞中检测到微量VEGI信号。由VEGI在大多数主要器官中表达可推测此基因产物可在正常血管功能中起作用。
进行Northern印迹分析也用于测定相对关于HUVEC细胞培养物增殖状态，VEGI RNA的相对表达水平。在这些试验中，将等量的分离自HUVEC细胞的总RNA(15μg)进行电泳分离并如上述印迹。在接种后1，2，3，4，6及7天从培养物中分离RNA。VEGI RNA只在新种植的培养物(1，2及3天)中低水平呈现。但随着培养物中HUVEC细胞开始达到铺满(4，6及7天)明显可见VEGI RNA的表达。这些试验表明VEGI表达随着培养物或组织中的细胞开始达到非增殖或低增殖的静止状态而提高。
实施例5：VEGI介导的ABAE细胞增殖的抑制
将细胞以适当密度以三份重复植于24孔平板中(ABAE细胞，8，000个细胞/孔；MDA-MB-231，2,000个细胞/孔；MDA-MB-435，2,000个细胞/孔)。培养基含有IMEM(Gibco)及10％FCS。在ABAE细胞培养基中有FGF-2(1ng/ml)。将培养物在37℃，5％CO2下保持6天。细胞被胰蛋白酶消化，并用Coulter计数仪测定细胞数。回收的总ABAE细胞的1/5用于校正与癌细胞对比。
将相当于残基38-174组成的推定的胞外结构域的VEGI-α截短的变体如上述在E.coli中表达，纯化，并在各种细胞分析中检测。发现截短的多肽特异抑制内皮细胞增殖(图2)。在10mg/ml，成年牛动脉内皮(ABAE)细胞的生长近于完全抑制，半最大抑制浓度(IC50)大约为1mg/ml(大约70nM)。重组多肽的活性可与抑管张素，内抑制素及血小板因子4相比。相反，此多肽在相似试验条件下不能抑制人乳腺癌细胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)的生长。VEGI-α缺失突变体也发现对人T细胞白血病细胞(Jurkat)，人Burkitts淋巴瘤细胞(Raji)，人单核细胞白血病细胞(THP-1)或人早幼粒细胞白血病细胞(HL60)的增殖几乎没有影响，此突变体呈现与不同受体结合，因为注意到与检测的TNF受体超家族的任何成员无相互作用，该成员包括TNF R1，TNF R2，Fas，DR3及DR4(G.J.Mazzei et al.(1995)J.Biol.Chem.270：7205)。现已示出一些TNF家族成员，包括TNF-α和Fas配体，是从膜结合前体中径金属蛋白酶激活(M.Tanaka等(1996)Nat.Med.2：317；R.A.Black etal.，(1997)Nature 385：729)。
实施例6：VEGI介导的类毛细管形成的抑制
此分析用于测定截短的VEGI-α多肽抑制成年牛动脉内皮(ABAE)细胞培养物中FGF-2诱导的类毛细管结构形成的能力。通过向含1X DMEM的每个孔中加入0.5ml预冷的0.7mg/ml大鼠尾I型胶原(Becton Dickinson Labwares，Bedford，MA)溶液，并用NaHCO3调正至中性pH，制备三维胶原凝胶平板(24孔)。在胶原凝胶形成后(大约1-2mm厚)，将ABAE细胞以5×104个/孔种植于孔内。将培养物在37℃在用5％CO2增湿的培养仪中，保持在含10％小牛血清(HyClone，Logan，UT)，补加L-谷氨酰胺(2mM)的DMEM中直至培养物铺满。然后用含20ng/mlFGF-2的新鲜培养基替换原培养基，通过用0.1，0.3，1，3，或10μg/ml的VEGI-α12-147补加培养基，分析VEGI-α12-147作为ABAE培养物中FGF-2诱导的类毛细管结构形成的抑制剂，的作用。然后将所有培养物保持在37℃，48小时，然后用冷却甲醇(-20℃)固定。
由ABAE细胞形成的类毛细管结构的丰度通过用Kotron IBAS图象分析仪，借助于Hamamatsu C2400图象摄影机及Zeiss Axioshop显微镜的进行分析。类毛细管结构的丰度是以测定总测定区域内白色区域的百分数标示。作为对照血管生成因子FGF-2刺激体外血管发生的EC50值大约为5ng/ml。作为进一步的对照，在10ng/mlFGF-2观测到最大刺激效应。
实施例7：VEGI介导的肿瘤生长抑制
用异种移植的肿瘤样本，进行VEGI多肽对血管发生的潜在效应的体内分析。在此试验方法中，将一百万个人乳腺癌细胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)注入雌性裸鼠的乳房脂肪层中，单独注入或与用表达VEGI-α的哺乳动物表达载体转染的CHO细胞，或与只用CHO载体转染的CHO细胞混合注入(5×106个细胞/鼠)。在这些试验中表达的VEGI多肽由SEQ ID NO：2所示多肽除去N末端22个氨基酸组成。此VEGI突变蛋白的N末端22个氨基酸由人白细胞介素6(IL6)的分泌信号肽(Hirano，T.，et al.，Nature 324：73-76(1986)取代。
在此实施例中观测的VEGI多肽的抗血管发生活性表明：VEGI多肽可抑制肿瘤生长。VEGI潜在的抗癌活性用上述异种移植肿瘤样本可测定，当将乳腺癌细胞植入雌性无胸腺裸鼠的乳房脂肪层时，其是高致瘤性的。通过Northern印迹分析确定转染子中构建体的转录。将过量表达分泌形式VEGI-α的CHO细胞的条件培养基浓缩并部分纯化，并发现其能抑制ABAE细胞生长，而载体转染的或全长VEGI转染的CHO细胞的条件培养基无任何作用(数据未示出)。在人乳腺癌异种移植样本中检测VEGI-α的潜在抗癌活性。将可溶的VEGI-α转染的CHO细胞及人乳腺癌细胞(MDA-MB-231或MDA-MB-435)共注入乳房脂肪层中，并在注射后监测异种移植肿瘤的生长。
过表达可溶VEGI-α突变蛋白的CHO细胞引发对由MDA-MB-231细胞形成的人乳腺癌异种移植肿瘤的生长的显著抑制效应(图4A)，而载体转染的CHO细胞对肿瘤生长无效应。相似地，观测到对裸鼠中MDA-MB-435肿瘤生长的显著抑制(图4B)。在每种情况中，过表达全长VEGI-α的CHO细胞在相似的试验条件下，对异种移植肿瘤的生长无效应。在异种移植样本中观测到的可溶VEGI的抗肿瘤效应可归因于对肿瘤血管内皮细胞的抗血管发生效应。
然后将用人乳癌细胞与表达的VEGI-α的CHO细胞或载体转染的CHO细胞共注射的鼠随机取用，并每周测二次肿瘤情况。通过用测径器测垂直径，乘以二维直径的测定值而计算估计肿瘤大小。在第0天并约间隔5天至28天测量肿瘤。在每种情况中，用表达VEGI-αCHO细胞与人乳癌细胞共注射所致肿瘤的大小。比用载体转染的CHO细胞与乳癌细胞共注射所致肿瘤的大小明显较小。
基于这些发现，我们设想VEGI是一血管发生的内皮细胞特异的阴性调节剂，其可在成熟血管的保持或血管发生过程的终止中起作用。生理条件下的内皮是一静止组织，大约1％的内皮细胞经历增殖(J.Denekamp(1990)Cancen Metas，Rev.9：267)。保持内皮静止的机制还未明确，可以想像存在自我半限制机制，其中内皮细胞产生一生长抑制剂，其通过自泌途径对内皮细胞自身起作用。VEGI在此重要机制中起作用。
实施例8：重组VEGI-α抑制WEHI164，ABAE及L929细胞生长的能力，及诱导HL-60细胞中细胞粘附的能力
粘壁靶细胞制备自在PBS中胰蛋白酶消化的铺满培养物，非粘壁靶细胞收获自静止培养物，并用培养基洗一次。将靶细胞以3×105个/ml悬浮在含10％FCS的培养基中。将0.1ml等份分散入含0.1ml连续稀释的细胞测试样本(WEHI164及L929)的96孔平底微滴定平板中。持续培养70小时。以0.5μg/ml浓度加入TNF-α，TNF-β及细菌产生的VEGI-α。通过向每孔中加入20μl MTS及吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液进行MTS分析，确定胞毒性及增殖活性。在培养3小时后，通过ELISA平板读数仪测定在492nm的OD。OD492是与孔中存活细胞数成比例的。胞毒性百分率如下计算：胞毒性％＝(100-OD试验/OD对照)×100。VEGI-α诱导一形态学改变，表现为黑色圆形细胞(代表杀伤的细胞)。
由SEQ ID NO：2所示完整VEGI-α氨基酸序列的12-147位氨基酸组成的截短形式的VEGI-α多肽(VEGI-α12-147)也用于测试VEGI-α对内皮细胞生长的效应。用VEGI-α12-147处理成年牛动脉内皮(ABAE)细胞得到ABAE培养物中细胞生长的几乎完全抑制，但对乳腺癌细胞系MDA-MB-435或MDA-MB-231中的细胞无作用。10μg/mlVEGI-α39-174可达到对内皮细胞生长的几乎完全抑制，IC50值大约为1μg/ml(大约70nM)。
为测试VEGI-α的粘附能力，使用HL-60细胞，在显微镜下观测及经两个独立调查者的主观评价测定细胞粘附及细胞与细胞接触。在这些试验中，VEGI-α呈诱导细胞粘附。未用VEGI-α处理的培养物含有布满培养血的细胞。但用VEGI-α处理的培养物含有明显聚集一起的细胞。
实施例9基因治疗表达
从实验者中经皮肤活检得到成纤维细胞。将所得组织置入组织培养基中，并分成小片。将小块组织置于组织培养瓶的湿表面上，每瓶约10片。将此瓶例置，紧闭并置于室温下过夜。在室温下2小时后，将烧瓶翻转，组织块仍固定在瓶底。同时加入新鲜培养基(如Ham’sF12培养基，补加10％FBS，青霉素及链霉素)。然后将此培养物在37℃培养近一周。这时加入新鲜培养基并每2-3天更换一次。在又培养二周后，单层成纤维细胞已出现。将此单层细胞用胰蛋白酶消化并按比例置入较大烧瓶中。
将侧翼为Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier，P.T.et al.，DNA，7：219-25(1988))，用Eco RI和HindIII消化，接着用小牛肠磷酸酶处理，将线性载体在琼脂凝胶上分级分离并用玻珠纯化。
将编码本发明多肽的cDNA用分别相应于5’及3’末端序列的PCR引物扩增。5’引物含有-EcoRI位点，3’引物包括一HindIII位点。将等理的Moloney鼠肉瘤病毒线性骨架与扩增的EcoRI和HindIII片段混合，用T4 DNA连接酶连接。将所得混合物保持在适于两片段连接的条件下。此连接混合物用于转化细菌HB101，然后在含卡那霉素的琼脂平板上涂布，以确认载体具有相应适当插入的基因。
将兼嗜性pA317或GP+am12包装细胞在有10％小牛血清(CS)，青霉素及链霉素的Dulbecco修饰的Eagles培养基(DMEM)中组织培养达到铺满密度，然后在培养基中加入含此基因的MSV载体，并将包装细胞用载体转导。现在包装细胞产生含基因的感染病毒颗粒(此包装细胞现称为生产细胞)。
向转导的生产细胞中加入新鲜培养基，并接着从10cm铺满生产细胞的平板中收集培养基。将含感染病毒颗粒的用过的培养基经微孔过滤器过滤，以除去脱附的生产细胞。然后将此培养基用于感染成纤维细胞。从亚铺满成纤维细胞的平板中除去培养基，并迅速用生产细胞的培养基替换。除去此培养基并用新鲜培养基替换。如果病毒的滴度高，则所有成纤维细胞将被感染而不需选择。如果滴度非常低，则需使用具有选择标记如neo或his的逆转录病毒载体。
然后将工程化成纤维细胞注射入宿主，单独注射或在cytodex3微载体珠上生长至铺满之后应用。现在成纤维细胞产生蛋白质产物。
实施例10：鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管发生分析
基本如Nguyen等(Microvasc.Res.47：31-40(1994))及Iruela-Arispe和Dvorak(Thromb.Haemost.78：672-677(1997))所述进行CAM分析。该方法基于直接置于CAM上的胶原凝胶片中新毛细管的生长。将血管生成因子FGF-2(100ng)或VEGI(250ng)包埋在胶原凝胶片中，并放置与CAM接触。在放置凝胶片24小时后，用Nikon荧光显微镜对凝胶中血管发生进行定量。用CCD Sony照相机将图像转入PowerPC100 AV。用HN Image1.61软件评价荧光强度。阳性对照(其只含有血管生成因子)的荧光强度被认为是最大血管发生应答，并设为100。由于分析的可变性，抑制超过20％被认为是显著的。
作为试验性测定VEGI-α对FGF-2或VEGF诱导的血管发生的效应，将细菌产生的VEGI-α(250ng)与FGF-2(100ng)或VEGF(250ng)混合并包埋于胶原凝胶片中。然后如上述将此片与CAM接触。VEGI-α明显地抑制胶原凝胶中新毛细管生长。
根据以上教导对本发明做各种修改与改变是可能的，因而在权利要求范围内，本发明可以不同于所特定描述的方式实施。
            关于微生物保藏的说明
                 (PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
                      关于微生物保藏的说明
                        (PCT细则13之二)
A.对说明书第 4页，第 9-10行所述的微生物的说明。
B.保藏事项                                                其它保藏在补充页中□
保藏单位名称美国典型培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号(2011-2209)
保藏日期1998年7月9日 保藏编号203055
C.补充说明(必要时)                                        本栏有补充页□
DNA质粒号：HEMCZ56对于欧洲专利指定国，保藏微生物的样品至欧洲专利授权通知公布时或者本申请被驳回或撤回或视为撤回之日才允许提供，且仅将该样品提供给由请求获得样品的人指定的专家。
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
Figure C9881288001091
PCT/RO/134表(1992年7月)
                            序列表
<110>人体基因组科学有限公司
<120>VEGI，一种血管生成和肿瘤生长的抑制剂
<130>PF141PCT2
<140>未给出
<141>1998-11-02
<150>08/963,272
<151>1997-11-03
<160>31
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>2683
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1022)..(1543)
<220>
<221>信号肽
<222>(1022)..(1096)
<220>
<221>成熟肽
<222>(1097)..(1543)
<400>1
ttctctcctg tctctctctt tcattcatac actgagtcat tcagagatgg cttctctcca 60
actcggagct gcaagtaatt ctggatctgg tcacacacac aaagtcccca gagttgccaa 120
tttatctagt tcatctgtgc ctgttcaaga tgatgtaact aaacatttac cttcagggag 180
gtgtttccaa agaattttca tcgatatata gaaatcaaga gaaaatccat actatcacca 240
aatcaagaga aattccatac tatcaccagt tggccaactt tccaagtcta gtgcagaaat 300
ccaaggcacc tcacacctag agttcctata cctctgagac tccagaggaa agaacaagac 360
agtgcagaag gatatgttag aacccactga aaacctagaa ggttaaaaag gaagcatacc 420
ctcctgacct ataagaaaat tttcagtctg cagggggata tccttgtggc ccaagacatt 480
ggtgttatca tttgactaag aggaaattat ttgtggtgag ctctgagtga ggattaggac 540
cagggagatg ccaagtttct atcacttacc tcatgcctgt aagacaagtg ttttgttcca 600
attgatgaat ggggataaaa cagttcagcc aatcacttat ggggcaaaga atgggaattt 660
gaagggtctg gtgcctggcc ttgtcatacg taaacaagag aggcatcgat gagttttatc 720
tgagtcattt gggaaaggat aattcttgca gcaagccatt ttcctaaaca cagaagaata 780
gggggattcc ttaaccttca ttgttctcca ggatcatagg tctcaggtaa aattaaaaat 840
tttcaggtca gaccactcag tctcagaaag gcaaagtaat ttgccccagg tcactagtcc 900
aagatgttat tctctttgaa caaatgtgta tgtccagtca catattcttc attcattcct 960
ccccaaagca gtttttagct gttaggtata ttcgatcact ttagtctatt ttgaaaatga 1020
t atg aga cgc ttt tta agc aaa gtc tac agt ttc cca atg aga aaa tta 1069
  Met Arg Arg Phe Leu Ser Lys Val Tyr Ser Phe Pro Met Arg Lys Leu
  -25                 -20                 -15                 -10
atc ctc ttt ctt gtc ttt cca gtt gtg aga caa act ccc aca cag cac   1117
Ile Leu Phe Leu Val Phe Pro Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His
                 -5              -1   1               5
ttt aaa aat cag ttc cca gct ctg cac tgg gaa cat gaa cta ggc ctg   1165
Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu
         10                  15                  20
gcc ttc acc aag aac cga atg aac tat acc aac aaa ttc ctg ctg atc   1213
Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile
     25                  30                  35
cca gag tcg gga gac tac ttc att tac tcc cag gtc aca ttc cgt ggg   1261
Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly
 40                  45                  50                  55
atg acc tct gag tgc agt gaa atc aga caa gca ggc cga cca aac aag   1309
Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys
                 60                  65                  70
cca gac tcc atc act gtg gtc atc acc aag gta aca gac agc tac cct   1357
Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro
             75                  80                  85
gag cca acc cag ctc ctc atg ggg acc aag tct gta tgc gaa gta ggt   1405
Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly
         90                  95                 100
agc aac tgg ttc cag ccc atc tac ctc gga gcc atg ttc tcc ttg caa   1453
Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln
    105                 110                 115
gaa ggg gac aag cta atg gtg aac gtc agt gac atc tct ttg gtg gat   1501
Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp
120                 125                 130                 135
tac aca aaa gaa gat aaa acc ttc ttt gga gcc ttc tta cta           1543
Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
                140                 145
taggaggaga gcaaatatca ttatatgaaa gtcctctgcc accgagttcc taattttctt 1603
tgttcaaatg taattataac caggggtttt cttggggccg ggagtagggg gcattccaca 1663
gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg ccaaaatttc acacttcatg tgccttactg 1723
atgagagtac taactggaaa aaggctgaag agagcaaata tattattaag atgggttgga 1783
ggattggcga gtttctaaat attaagacac tgatcactaa atgaatggat gatctactcg 1843
ggtcaggatt gaaagagaaa tatttcaaca cctcctgcta tacaatggtc accagtggtc 1903
cagttattgt tcaatttgat cataaatttg cttcaattca ggagctttga aggaagtcca 1963
aggaaagctc tagaaaacag tataaacttt cagaggcaaa atccttcacc aatttttcca 2023
catactttca tgccttgcct aaaaaaaatg aaaagagagt tggtatgtct catgaatgtt 2083
cacacagaag gagttggttt tcatgtcatc tacagcatat gagaaaagct acctttcttt 2143
tgattatgta cacagatatc taaataagga agtatgagtt tcacatgtat atcaaaaata 2203
caacagttgc ttgtattcag tagagttttc ttgcccacct attttgtgct gggttctacc 2263
ttaacccaga agacactatg aaaaacaaga cagactccac tcaaaattta tatgaacacc 2323
actagatact tcctgatcaa acatcagtca acatactcta aagaataact ccaagtcttg 2383
gccaggcgca gtggctcaca cctgtaatcc caacactttg ggaggccaag gtgggtggat 2443
catctaaggc cgggagttca agaccagcct gaccaacgtg gagaaacccc atctctacta 2503
aaaatacaaa attagccggg cgtggtagcg catggctgta atcctggcta ctcaggaggc 2563
cgaggcagaa gaattgcttg aactggggag gcagaggttg cggtgagccc agatcgcgcc 2623
attgcactcc agcctgggta acaagagcaa aactctgtcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2683
<210>2
<211>174
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Arg Arg Phe Leu Ser Lys Val Tyr Ser Phe Pro Met Arg Lys Leu
-25                 -20                 -15                 -10
Ile Leu Phe Leu Val Phe Pro Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His
                 -5              -1   1               5
Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu
         10                  15                  20
Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile
     25                  30                  35
Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly
 40                  45                  50                  55
Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys
                 60                  65                  70
Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro
             75                  80                  85
Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly
         90                  95                 100
Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln
    105                 110                 115
Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp
120                 125                 130                 135
Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
                140                 145
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人
<400>3
 gcgccatggc tctgcactgg gaacat                                         26
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>4
 cgcaagcttc tatagtaaga aggctcc                                        27
<210>5
<211>112
<212>DNA
<213>人
<400>5
gcgggatccg ccaccatgaa ctccttctcc acaagcgcct tcggtccagt  tgccttctcc    60
ctggggctgc tcctggtgtt gcctgctgcc ttccctgccc cagttgtgag ac             112
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人
<400>6
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<210>7
<211>28
<212>PRT
<213>人
<400>7
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
  1               5                  10                  15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala
             20                  25
<210>8
<211>2442
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(783)..(1304)
<221>信号肽
<222>(783)..(863)
<220>
<221>成熟肽
<222>(864)..(1304)
<220>
<221>misc_特征
<222>(2265)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(2273)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(2307)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(2336)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(2341)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(2379)
<223>n等于a，t，g或c
<400>8
cccaatcaag agaaattcca tactatcacc agttggccga ctttccaagt ctagtgcaga 60
aatccaaggc acctcacacc tagagttcct atacctctga gactccagag gaaagaacaa 120
gacagtgcag aaggatatgt tagaacccac tgaaaaccta gaaggttgaa aaggaagcat 180
accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240
attggtgtta tcatttgact aagaggaaat tatttgtggt gagctctgag tgaggattag 300
gaccagggag atgccaagtt tctatcactt acctcatgcc tgtaagacaa gtgttttgtt 360
ccaattgatg aatggggaga aaacagttca gccaatcact tatgggcaca gaatggaatt 420
tgaagggtct ggtgcctgcc cttgtcatac gtaaacaaga gaggcatcga tgagttttat 480
ctgagtcatt tgggaaagga taattcttgc accaagccat tttcctaaac acagaagaat 540
agggggattc cttaaccttc attgttctcc aggatcatag gtctcaggat aaattaaaaa 600
ttttcaggtc agaccactca gtctcagaaa ggcaaagtaa tttgccccag gtcactagtc 660
caagatgtta ttctctttga acaaatgtgt atgtccagtc acatattctt cattcattcc 720
tccccaaagc agtttttagc tgttaggtat attcgatcac tttagtctat tttgaaaatg 780
at atg aga cgc ttt tta agc aaa gtc tac agt ttc cca atg aga aaa    827
   Met Arg Arg Phe Leu Ser Lys Val Tyr Ser Phe Pro Met Arg Lys
           -25                 -20                 -15
tta atc ctc ttt ctt gtc ttt cca gtt gtg aga caa act ccc aca cag   875
Leu Ile Leu Phe Leu Val Phe Pro Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln
        -10                  -5              -1   1
cac ttt aaa aat cag ttc cca gct ctg cac tgg gaa cat gaa cta ggc   923
His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly
  5                  10                  15                  20
ctg gcc ttc acc aag aac cga atg aac tat acc aac aaa ttc ctg ctg   971
Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu
                 25                  30                  35
atc cca gag tcg gga gac tac ttc att tac tcc cag gtc aca ttc cgt   1019
Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg
             40                  45                  50
ggg atg acc tct gag tgc agt gaa atc aga caa gca ggc cga cca aac   1067
Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn
         55                  60                  65
aag cca gac tcc atc act gtg gtc atc acc aag gta aca gac agc tac   1115
Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr
     70                  75                  80
cct gag cca acc cag ctc ctc atg ggg acc aag tct gta tgc gaa gta   1163
Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val
 85                  90                  95                 100
ggt agc aac tgg ttc cag ccc atc tac ctc gga gcc atg ttc tcc ttg   1211
Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu
                105                 110                 115
caa gaa ggg gac aag cta atg gtg aac gtc agt gac atc tct ttg gtg   1259
Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val
            120                 125                 130
gat tac aca aaa gaa gat aaa acc ttc ttt gga gcc ttc tta cta       1304
Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
        135                 140                 145
taggaggaga gcaaatatca ttatatgaaa gtcctctgcc accgagttcc taattttctt 1364
tgttcaaatg taattataac caggggtttt cttggggccg ggagtagggg gcattccaca 1424
gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg ccaaaatttc acacttcatg tgccttactg 1484
atgagagtac taactggaaa aaggctgaag agagcaaata tattattaag atgggttgga 1544
ggattggcga gtttctaaat attaagacac tgatcactaa atgaatggat gatctactcg 1604
ggtcaggatt gaaagagaaa tatttcaaca cctccctgct atacaatggt caccagtggt 1664
ccagttattg ttcaatttga tcataaattt gcttcaattc aggagctttg aaggaagtcc 1724
aaggaaagct ctagaaaaca gtataaactt tcagaggcaa aatccttcac caatttttcc 1784
acatactttc atgccttgcc taaaaaaaat gaaaagagag ttggtatgtc tcatgaatgt 1844
tcacacagaa ggagttggtt ttcatgtcat ctacagcata tgagaaaagc tacctttctt 1904
ttgattatgt acacagatat ctaaataagg aagtttgagt ttcacatgta tatcccaaat 1964
acaacagttg cttgtattca gtagagtttt cttgcccacc tattttgtgc tgggttctac 2024
cttaacccag aagacactat gaaaaacaag acagactcca ctcaaaattt atatgaacac 2084
cactagatac ttcctgatca aacatcagtc aacatactct aaagaataac tccaagtctt 2144
ggccaggcgc agtggctcac acctgtaatc ccaacacttt gggaggccaa ggtgggtgga 2204
tcatctaagg ccgggagttc aagaccagcc tgaccaacgt ggagaaaccc catctctact 2264
naaaatacna aattagccgg gcgtggtagc gcatggctgt aancctggct actcaggagg 2324
ccgaggcaga anaattnctt gaactgggga ggcagaggtt gcggtgagcc cagancgcgc 2384
cattgcactc cagcctgggt aacaagagca aaactctgtc caaaaaaaaa aaaaaaaa   2442
<210>9
<211>174
<212>PRT
<213>人
<400>9
Met Arg Arg Phe Leu Ser Lys Val Tyr Ser Phe Pro Met Arg Lys Leu
        -25                 -20                 -15
Ile Leu Phe Leu Val Phe Pro Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His
    -10                  -5              -1   1               5
Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu
                 10                  15                  20
Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile
             25                  30                  35
Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly
         40                  45                  50
Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys
     55                  60                  65
Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro
 70                  75                  80                  85
Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly
                 90                  95                 100
Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln
            105                 110                 115
Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp
        120                 125                 130
Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
    135                 140                 145
<210>10
<211>233
<212>PRT
<213>人
<400>10
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
  1               5                  10                  15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
             20                  25                  30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
         35                  40                  45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
     50                  55                  60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
 65                  70                  75                  80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
                 85                  90                  95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
            100                 105                 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
        115                 120                 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
    130                 135                 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
                165                 170                 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
            180                 185                 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
        195                 200                 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
    210                 215                 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225                 230
<210>11
<211>205
<212>PRT
<213>人
<400>11
Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Arg Gly Thr Thr
  1               5                  10                  15
Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
             20                  25                  30
Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala
         35                  40                  45
Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala
     50                  55                  60
Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg
 65                  70                  75                  80
Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn
                 85                  90                  95
Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln
            100                 105                 110
Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe
    130                 135                 140
His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln
145                 150                 155                 160
Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr
                165                 170                 175
Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val
            180                 185                 190
Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu
        195                 200                 205
<210>12
<211>244
<212>PRT
<213>人
<400>12
Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln Gly Arg
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val Thr Leu
             20                  25                  30
Leu Leu Ala Val Pro Ile Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Pro
         35                  40                  45
Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gln
     50                  55                  60
Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu
 65                  70                  75                  80
Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala Pro
                 85                  90                  95
Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe
            100                 105                 110
Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro
        115                 120                 125
Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg
    130                 135                 140
Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg
145                 150                 155                 160
Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu
                165                 170                 175
Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala
            180                 185                 190
Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly
        195                 200                 205
Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile Ser
    210                 215                 220
His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala
225                 230                 235                 240
Val Met Val Gly
<210>13
<211>281
<212>PRT
<213>人
<400>13
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
  1               5                  10                  15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
             20                  25                  30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
         35                  40                  45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
     50                  55                  60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
                 85                  90                  95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
        115                 120                 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
    130                 135                 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145                 150                 155                 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
                165                 170                 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
        195                 200                 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
    210                 215                 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225                 230                 235                 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
                245                 250                 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
            260                 265                 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
        275                 280
<210>14
<211>235
<212>PRT
<213>Oryctolagus cuniculus
<400>14
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Gly Pro
  1               5                  10                  15
Leu Pro Lys Lys Ala Gly Gly Pro Gln Gly Ser Lys Arg Cys Leu Cys
             20                  25                  30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
         35                  40                  45
Cys Leu Leu His Phe Arg Val Ile Gly Pro Gln Glu Glu Glu Gln Ser
     50                  55                  60
Pro Asn Asn Leu His Leu Val Asn Pro Val Ala Gln Met Val Thr Leu
 65                  70                  75                  80
Arg Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro Leu Ala His Val Val
                 85                  90                  95
Ala Asn Pro Gln Val Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Ser Gln Arg Ala
            100                 105                 110
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Lys Leu Thr Asp Asn Gln Leu Val
        115                 120                 125
Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Ser
    130                 135                 140
Gly Gln Gly Cys Arg Ser Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg
145                 150                 155                 160
Phe Ala Val Ser Tyr Pro Asn Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Cys His Arg Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala Trp
            180                 185                 190
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
        195                 200                 205
Arg Leu Ser Thr Glu Val Asn Gln Pro Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Glu
    210                 215                 220
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225                 230                 235
<210>15
<211>434
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
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<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
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<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(424)
<223>n等于a，t，g或c
<400>15
tctacacaag gtacngacng ctaccctgag ccaacccagc tcctcatggg gaccaagtct 60
gtatgcgaag taggtagcaa ctggttccag cccatctacc tcggagccat gttctccttg 120
caagaagggg acnagctaat ggtgaacgtc agtgacatct ctttggtgga ttacacaaaa 180
gaagataaaa ccttctttgg agccttctta ctataggagg agagcaaata tcattatatg 240
aaagtcctct gccaccgagt tcctaatttt ctttgttcaa atgtaattat aaccaggggt 300
tttcttgggg ccgggagtag ggggcattcc cacagggaca acggtttagc tatgaaattt 360
ggggggccca aaatttcaca acttcatngt tgcccttact tgatgagaag tacttaactt 420
gganaaaagg cttg                                                   434
<210>6
<211>493
<212>DNA
<213>人
<220>
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<400>16
aattcggcag agaaattcca tactatcacc agttggccaa ctttccaagt ctagtgcaga 60
aatccaaggc acctcacacc tagagttcct atacctctga gactccagag gaaagaacaa 120
gacagtgcag aaggatatgt tagaacccac tgaaaaccta gaaggttaaa aaggaagcat 180
accctcctga cctataagaa aattttcagt ctgcaggggg atatccttgt ggcccaagac 240
attggtgtta tcatttgact aagaggaaat tatttgtggt gagctccnag tgaggnttag 300
ggaccaggng gtgnccaagt ttctatcact tacctcatgn ctntaagnca agtgttttgt 360
tcccattgnt gatggggtta aaacnttcag ccatcacttt tggggcaagn atggggnttt 420
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ttgggnagga ctt                                                    493
<210>17
<211>380
<212>DNA
<213>人
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<220>
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<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
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<400>17
ggcagaggtt caatttgatc ataaatttgc ttcaattcag gagctttgaa ggnngtccaa 60
ggaaagctct agaaaacagt ataaactttc agaggcaaaa tccttcacca atttttccac 120
atactttcat gccttgccta aaaaaaatga aaagagagtt ggtatgtctc atggaatgtt 180
cacacagaag gagttggttt tcatgtcatc tacagcatat gagaaaagct acctttcttt 240
tgattatgta cacaggtntc taaataagga agtatgagtt tcacatgtat attcaaaaat 300
acaacagttg cttgtnttca gttngggttt ttcttggccc acccantttt ggtgctgggg 360
gttctanctt taaccccnga                                             380
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<211>458
<212>DNA
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<220>
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ggcacagcng gnagtagggg gcattccaca gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg 60
cccaaaattt cacacttcat gtgccttact gatgagagta ctaactggaa aaaggctgna 120
agagagcaaa tatattatta agatgggttg gaggattggc gagtttctaa atattaagac 180
actggatcac tgaaatgaat ggatgatcta ctcgggtcca ggattgaaag agaaatattt 240
caacaccttc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcca atttggatcc 300
atnaatttgc nttcaattcc aggagctttg gaaggaattc caaggaaagc tccaggaaaa 360
ccgtattaaa ctttccaggg gccaaantcc ttcaccaatt ttttccacna actttccagg 420
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<220>
<221>misc_特征
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<223>n等于a，t，g或c
<400>19
ctgcactggg nncatgaact aggcctggcc ttcaccaaga accgantgan ctataccaac 60
aaattcctgc tgatcccaga ntcgggagac tacttcattt actcccaggt cacattccgt 120
gggaatgaac ctctgaantg ccagtgaaaa tcagncaagc aggccgacca aacaagccag 180
antccatnca ctgtggtcat caccaaggta acagacagct accctgagcc aacccagctc 240
cttcatgggg accaagtttg tttgcgaant aggttagcaa ctggttccag cccattttac 300
cttgggggcc agttctnctt gncaagaagg ggacaagctt atggtggaac gttcatanca 360
tcntttttgg gtggntttac acaaaagg                                    388
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人
<400>20
gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc                          37
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<211>36
<212>DNA
<213>人
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<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人
<400>22
gcgcggatcc accatgagac gctttttaag caaagtc                          37
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>人
<400>23
cgcgtctaga ctatagtaag aaggctccaa agaagg                           36
<210>24
<211>56
<212>DNA
<213>人
<400>24
cgctctagat caagcgtagt ctgggacgtc gtatggatag taagaaggct ccaaag     56
<210>25
<211>733
<212>DNA
<213>人
<400>25
gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60
aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120
tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240
aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300
ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420
catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480
atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540
ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600
acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660
acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720
gactctagag gat                                                    733
<210>26
<211>1116
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(756)
<400>26
atg gcc gag gat ctg gga ctg agc ttt ggg gaa aca gcc agt gtg gaa   48
Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu
  1               5                  10                  15
atg ctg cca gag cac ggc agc tgc agg ccc aag gcc agg agc agc agc   96
Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser
             20                  25                  30
gca cgc tgg gct ctc acc tgc tgc ctg gtg ttg ctc ccc ttc ctt gca   144
Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala
         35                  40                  45
gga ctc acc aca tac ctg ctt gtc agc cag ctc cgg gcc cag gga gag   192
Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu
     50                  55                  60
gcc tgt gtg cag ttc cag gct cta aaa gga cag gag ttt gca cct tca   240
Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser
 65                  70                  75                  80
cat cag caa gtt tat gca cct ctt aga gca gac gga gat aag cca agg   288
His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg
                 85                  90                  95
gca cac ctg aca gtt gtg aga caa act ccc aca cag cac ttt aaa aat   336
Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn
            100                 105                 110
cag ttc cca gct ctg cac tgg gaa cat gaa cta ggc ctg gcc ttc acc   384
Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr
        115                 120                 125
aag aac cga atg aac tat acc aac aaa ttc ctg ctg atc cca gag tcg   432
Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser
    130                 135                 140
gga gac tac ttc att tac tcc cag gtc aca ttc cgt ggg atg acc tct   480
Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser
145                 150                 155                 160
gag tgc agt gaa atc aga caa gca ggc cga cca aac aag cca gac tcc   528
Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser
                165                 170                 175
atc act gtg gtc atc acc aag gta aca gac agc tac cct gag cca acc   576
Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr
            180                 185                 190
cag ctc ctc atg ggg acc aag tct gta tgc gaa gta ggt agc aac tgg   624
Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp
        195                 200                 205
ttc cag ccc atc tac ctc gga gcc atg ttc tcc ttg caa gaa ggg gac   672
Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp
    210                 215                 220
aag cta atg gtg aac gtc agt gac atc tct ttg gtg gat tac aca aaa   720
Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys
225                 230                 235                 240
gaa gat aaa acc ttc ttt gga gcc ttc tta cta tag gaggagagca        766
Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
                245                 250
aatatcatta tatgaaagtc ctctgccacc gagttcctaa ttttctttgt tcaaatgtaa 826
ttataaccag gggttttctt ggggccggga gtaggggcat tccacaggga caacggttta 886
gctatgaaat ttggggccca aaatttcaca cttcatgtgc cttactgatg agagtactaa 946
ctggaaaaag gctgaagaga gcaaatatat tattaagatg ggttggagga ttggcgagtt 1006
tctaaatatt aagacactga tcactaaatg aatggatgat ctactcgggt caggattgaa 1066
agagaaatat ttcaacacct tcctgctata caatggtcac cagtggtcca            1116
<210>27
<211>251
<212>PRT
<213>人
<400>27
Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu
  1               5                  10                  15
Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser
             20                  25                  30
Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala
         35                  40                  45
Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu
     50                  55                  60
Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser
 65                  70                  75                  80
His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg
                 85                  90                  95
Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn
            100                 105                 110
Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr
        115                 120                 125
Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser
145                 150                 155                 160
Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser
                165                 170                 175
Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr
            180                 185                 190
Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp
        195                 200                 205
Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp
    210                 215                 220
Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys
225                 230                 235                 240
Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
                245                 250
<210>28
<211>434
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(15)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(19)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(133)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(388)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(424)
<223>n等于a，t，g或c
<400>28
tctacacaag gtacngacng ctaccctgag ccaacccagc tcctcatggg gaccaagtct 60
gtatgcgaag taggtagcaa ctggttccag cccatctacc tcggagccat gttctccttg 120
caagaagggg acnagctaat ggtgaacgtc agtgacatct ctttggtgga ttacacaaaa 180
gaagataaaa ccttctttgg agccttctta ctataggagg agagcaaata tcattatatg 240
aaagtcctct gccaccgagt tcctaatttt ctttgttcaa atgtaattat aaccaggggt 300
tttcttgggg ccgggagtag ggggcattcc cacagggaca acggtttagc tatgaaattt 360
ggggggccca aaatttcaca acttcatngt tgcccttact tgatgagaag tacttaactt 420
gganaaaagg cttg                                                   434
<210>29
<211>417
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(4)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(8)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(17)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(24)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(28)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(31)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(35)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(41)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(43)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(46)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(48)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(50)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(53)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(55)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(61)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(63)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(66)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(202)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_difference
<222>(209)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(282)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(306)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(321)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(344)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(346)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(380)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(395)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(405)
<223>n等于a，t，g或c
<400>29
attncggnac gagcagnggc atgnccgngg nnctnggact nnnctntngn gananagcca 60
nnnttnnaat gctgccagag cacggcagct gcaggcccaa ggccaggagc agcagcgcac 120
gctgggctct cacctgctgc ctggtgttgc tccccttcct tgcaggactc accacatacc 180
tgcttgtcag ccagcttcgg gnccagggng aggcctgtgt gcagttccag ggtctaaaag 240
gacaggagtt tgcaccttca catcagcaag tttatgcacc tnttagagca gacggagata 300
agccangggg acaactgaca nttgtgagac aaattccaca cagnanttta aaatcagttt 360
ccagttttga atggggacan nattaggctg gcttnacaag accgntggat tttacag    417
<210>30
<211>388
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(11)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(46)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(50)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(81)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(138)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(155)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(182)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(188)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(269)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(317)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(322)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(358)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(363)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(375)
<223>n等于a，t，g或c
<400>30
ctgcactggg nncatgaact aggcctggcc ttcaccaaga accgantgan ctataccaac 60
aaattcctgc tgatcccaga ntcgggagac tacttcattt actcccaggt cacattccgt 120
gggaatgaac ctctgaantg ccagtgaaaa tcagncaagc aggccgacca aacaagccag 180
antccatnca ctgtggtcat caccaaggta acagacagct accctgagcc aacccagctc 240
cttcatgggg accaagtttg tttgcgaant aggttagcaa ctggttccag cccattttac 300
cttgggggcc agttctnctt gncaagaagg ggacaagctt atggtggaac gttcatanca 360
tcntttttgg gtggntttac acaaaagg                                    388
<210>31
<211>458
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(12)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(119)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(303)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(311)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(387)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(409)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
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<220>
<221>misc_特征
<222>(427)
<223>n等于a，t，g或c
<220>
<221>misc_特征
<222>(453)
<223>n等于a，t，g或c
<400>31
ggcacagcng gnagtagggg gcattccaca gggacaacgg tttagctatg aaatttgggg 60
cccaaaattt cacacttcat gtgccttact gatgagagta ctaactggaa aaaggctgna 120
agagagcaaa tatattatta agatgggttg gaggattggc gagtttctaa atattaagac 180
actggatcac tgaaatgaat ggatgatcta ctcgggtcca ggattgaaag agaaatattt 240
caacaccttc ctgctataca atggtcacca gtggtccagt tattgttcca atttggatcc 300
atnaatttgc nttcaattcc aggagctttg gaaggaattc caaggaaagc tccaggaaaa 360
ccgtattaaa ctttccaggg gccaaantcc ttcaccaatt ttttccacna actttccagg 420
cctgncncaa aaaaatggaa agggagttgg tangtccc                         458

Claims (19)

1、选自如下一组的一种多核苷酸在制备用于抑制血管发生的药物组合物中的应用，所述的组由以下成员组成：
(a)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽的多核苷酸；
(b)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽的多核苷酸；
(c)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽的多核苷酸；
(d)编码具有抑制血管发生活性的(a)中多肽的片段的多核苷酸；
(e)与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码具有抑制血管发生活性的多肽；
(f)编码(a)的多核苷酸的等位基因形式的多核苷酸；以及
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的互补链。
2、权利要求1的应用，其中所述的核酸分子与控制基因表达的调控序列可操纵相连。
3、一种检测病理性血管发生的体外方法，包括下述步骤：
(i)将一种生物学样品与识别选自如下一组的一种多肽的抗体接触，所述的组由以下成员组成：
(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽；
(c)由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽；以及
(d)具有抑制血管发生活性的(a)的多肽的片段；以及
(ii)检测该多肽和该抗体之间形成的复合物存在与否。
4、一种检测病理性血管发生的体外方法，包括下述步骤：
(i)将一种生物学样品与一种寡核苷酸接触，该寡核苷酸在严格条件下与选自如下一组的一种多核苷酸杂交，所述的组由以下成员组成：
(a)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽的多核苷酸；
(b)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽的多核苷酸；
(c)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽的多核苷酸；
(d)编码具有抑制血管发生活性的(a)中多肽的片段的多核苷酸；
(e)与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码具有抑制血管发生活性的多肽；
(f)编码(a)的多核苷酸的等位基因形式的多核苷酸；以及
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的互补链；
以及
(ii)检测该寡核苷酸和该多核苷酸之间形成的双螺旋的存在与否。
5、一种检测病理性血管发生的体外方法，包括在一生物学样品中检测血管内皮细胞生长抑制剂多核苷酸的多态性是否存在的步骤。
6、权利要求5的检测病理性血管发生的体外方法，其中所述的检测经Southern杂交进行。
7、权利要求5的检测病理性血管发生的体外方法，其中所述的检测经测序血管内皮细胞生长抑制剂多核苷酸进行。
8、选自如下一组的一种多肽在制备用于抑制血管发生的药物组合物中的应用，所述的组由以下成员组成：
(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽；
(c)由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽；以及
(d)具有抑制血管发生活性的(a)的多肽的片段。
9、权利要求8的应用，其中所述多肽是(a)多肽。
10、权利要求8的应用，其中所述的多肽是(b)多肽。
11、一种检测或预后癌症的体外方法，所述的方法包括：
(i)将一种生物学样品与识别选自如下一组的一种多肽的抗体接触，所述的组由以下成员组成：
(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽；
(c)由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽；以及
(d)具有抑制血管发生活性的(a)的多肽的片段；以及
(ii)检测该多肽和该抗体之间形成的复合物是否存在。
12、体外测试可能具有血管发生抑制活性的制剂或药物的方法，所述方法包括测量所述制剂或药物增加选自如下一组的一种多肽的抗血管发生活性的能力，所述的组由以下成员组成：
(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽；
(c)由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽；以及
(d)具有抑制血管发生活性的(a)的多肽的片段。
13、权利要求12的体外测试具有血管发生抑制活性的制剂或药物的方法，其中所述的药物或制剂是抗肿瘤药物或制剂。
14、体外测试药物或制剂促进血管发生的方法，所述方法包括测量所述药物或制剂降低或消除选自如下一组的一种多肽的血管发生抑制功能的能力，所述的组由以下成员组成：
(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽；
(c)由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽；以及
(d)具有抑制血管发生活性的(a)的多肽的片段。
15、选自如下一组的一种多核苷酸在制备促进血管发生的药物组合物中的应用，所述的组由以下成员组成：
(a)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽的多核苷酸；
(b)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽的多核苷酸；
(c)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽的多核苷酸；
(d)编码具有抑制血管发生活性的(a)中多肽的片段的多核苷酸；
(e)与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码具有抑制血管发生活性的多肽；
(f)编码(a)的多核苷酸的等位基因形式的多核苷酸；以及
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的互补链。
16、选自如下一组的一种多肽在制备促进血管发生的药物组合物中的应用，所述的组由以下成员组成：
(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽；
(c)由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽；以及
(d)具有抑制血管发生活性的(a)的多肽的片段。
17、选自如下一组的一种多核苷酸在制备抑制癌症生长的药物组合物中的应用，所述的组由以下成员组成：
(a)编码由SEQ ID NO：2组成的氨基酸1-174组成的多肽的多核苷酸；
(b)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽的多核苷酸；
(c)编码由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽的多核苷酸；
(d)编码具有抑制血管发生活性的(a)中多肽的片段的多核苷酸；
(e)与SEQ ID NO：1的互补序列杂交的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码具有抑制血管发生活性的多肽；
(f)编码(a)的多核苷酸的等位基因形式的多核苷酸；以及
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的互补链。
18、选自如下一组的一种多肽在制备抑制癌症生长的药物组合物中的应用，所述的组由以下成员组成：
(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸1-174组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸23-174组成的多肽；
(c)由SEQ ID NO：2的氨基酸39-174组成的多肽；以及
(d)具有抑制血管发生活性的(a)的多肽的片段。
19、权利要求1中定义的多核苷酸或权利要求8中定义的多肽在制备用于治疗选自如下一组的一种疾病或过程的药物组合物中的应用，所述的组为：
(a)毛细管扩张；
(b)牛皮癣硬皮病；
(c)心肌血管发生；
(d)斑新血管形成；
(e)缺血肢血管发生；
(f)潮红；
(g)新血管形成性青光眼；
(h)糖尿病性视网膜病；
(i)晶状体后纤维组织形成；
(j)糖尿病性新血管形成；
(k)新血管形成性青光眼；
(l)晶状体后纤维组织形成；
(m)眼色素层炎；
(n)早产性视网膜病；
(o)斑点退化；
(p)角膜移植新血管形成；
(q)移植物抗宿主疾病；
(r)炎性肠疾病；
(s)骨髓抑制；和
(t)再狭窄。
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