RU2733658C2 - Условно активные биологические белки - Google Patents
Условно активные биологические белки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2733658C2 RU2733658C2 RU2017127972A RU2017127972A RU2733658C2 RU 2733658 C2 RU2733658 C2 RU 2733658C2 RU 2017127972 A RU2017127972 A RU 2017127972A RU 2017127972 A RU2017127972 A RU 2017127972A RU 2733658 C2 RU2733658 C2 RU 2733658C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ion
- protein
- concentration
- acid
- normal physiological
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 299
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 269
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 164
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 138
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims abstract description 83
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 253
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 claims description 124
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 105
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 94
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 85
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 75
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 74
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 66
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 66
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 51
- -1 iron ion Chemical class 0.000 claims description 51
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 45
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 42
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 30
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 27
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 21
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 20
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 19
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 16
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 15
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 12
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 10
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 10
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 9
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 claims description 9
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 8
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 7
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 6
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 6
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 claims description 6
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 5
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940063013 borate ion Drugs 0.000 claims description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 4
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N Acetoacetic acid Natural products CC(=O)CC(O)=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- WOWBFOBYOAGEEA-UHFFFAOYSA-N diafenthiuron Chemical compound CC(C)C1=C(NC(=S)NC(C)(C)C)C(C(C)C)=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 WOWBFOBYOAGEEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 claims description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 claims description 3
- JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L peroxydisulfate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O JRKICGRDRMAZLK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005696 Diammonium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N L-pyrrolysine Chemical compound C[C@@H]1CC=N[C@H]1C(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ZFOMKMMPBOQKMC-KXUCPTDWSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182475 S-glycoside Natural products 0.000 claims description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 claims description 2
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 claims description 2
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 claims description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 2
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 claims description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 2
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 claims description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 2
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 claims description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000006012 monoammonium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 239000004323 potassium nitrate Substances 0.000 claims description 2
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 claims description 2
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims 4
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 18
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 167
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 138
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 125
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 118
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 118
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 118
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 118
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 100
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 79
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 79
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 75
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 74
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 72
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 44
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 40
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 40
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 37
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 31
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 30
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 29
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 239000000306 component Substances 0.000 description 27
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 26
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 24
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 24
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 24
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 23
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 23
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 23
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 20
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 20
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 20
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 17
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 15
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 15
- 238000011160 research Methods 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 14
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 14
- 102100038518 Calcitonin Human genes 0.000 description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 12
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 12
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 12
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 11
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 10
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 8
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 8
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 8
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 8
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 8
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 8
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 8
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 7
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 7
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 7
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 7
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 7
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 7
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 6
- 102000004414 Calcitonin Gene-Related Peptide Human genes 0.000 description 6
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 6
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 6
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 6
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 6
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 6
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 5
- 206010021036 Hyponatraemia Diseases 0.000 description 5
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 5
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 5
- 102400000015 Vasoactive intestinal peptide Human genes 0.000 description 5
- 229940119059 actemra Drugs 0.000 description 5
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- BPMFZUMJYQTVII-UHFFFAOYSA-N guanidinoacetic acid Chemical compound NC(=N)NCC(O)=O BPMFZUMJYQTVII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N invicorp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 5
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010036221 Aquaporin 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010063290 Aquaporins Proteins 0.000 description 4
- 101100356682 Caenorhabditis elegans rho-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 206010021138 Hypovolaemic shock Diseases 0.000 description 4
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 4
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150111584 RHOA gene Proteins 0.000 description 4
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 4
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 4
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- KAQKFAOMNZTLHT-OZUDYXHBSA-N prostaglandin I2 Chemical compound O1\C(=C/CCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-OZUDYXHBSA-N 0.000 description 4
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 206010040560 shock Diseases 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229940071598 stelara Drugs 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 3
- 102000011899 Aquaporin 2 Human genes 0.000 description 3
- 102000010637 Aquaporins Human genes 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 3
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 3
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 3
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 3
- 102000004136 Vasopressin Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108090000643 Vasopressin Receptors Proteins 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 3
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 3
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N histamine Natural products NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 3
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 3
- BPGXUIVWLQTVLZ-OFGSCBOVSA-N neuropeptide y(npy) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 BPGXUIVWLQTVLZ-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 3
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 2
- CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N (3s)-3-amino-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(1s)-1-carboxyethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3-(1h-imidazol-5-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-ox Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 CUKWUWBLQQDQAC-VEQWQPCFSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-diacetyloxypropyl] phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCCN CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N Aldosterone Chemical compound C([C@@]1([C@@H](C(=O)CO)CC[C@H]1[C@@H]1CC2)C=O)[C@H](O)[C@@H]1[C@]1(C)C2=CC(=O)CC1 PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N 0.000 description 2
- PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N Aldosterone Natural products C1CC2C3CCC(C(=O)CO)C3(C=O)CC(O)C2C2(C)C1=CC(=O)CC2 PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800000734 Angiotensin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102400000345 Angiotensin-2 Human genes 0.000 description 2
- 101800000733 Angiotensin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 2
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 2
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 101000862089 Clarkia lewisii Glucose-6-phosphate isomerase, cytosolic 1A Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical compound CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 206010016807 Fluid retention Diseases 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010004460 Gastric Inhibitory Polypeptide Proteins 0.000 description 2
- 102100039994 Gastric inhibitory polypeptide Human genes 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 108050009363 Hyaluronidases Proteins 0.000 description 2
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N Tetranitromethane Chemical compound [O-][N+](=O)C([N+]([O-])=O)([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 2
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 2
- CHKFLBOLYREYDO-SHYZEUOFSA-N [[(2s,4r,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-4-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)C[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 CHKFLBOLYREYDO-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 239000002160 alpha blocker Substances 0.000 description 2
- 102000030484 alpha-2 Adrenergic Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020004101 alpha-2 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 2
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 229950006323 angiotensin ii Drugs 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N dipyridamole Chemical compound C=12N=C(N(CCO)CCO)N=C(N3CCCCC3)C2=NC(N(CCO)CCO)=NC=1N1CCCCC1 IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002768 dipyridamole Drugs 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- 239000002988 disease modifying antirheumatic drug Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 229940006477 nitrate ion Drugs 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001129 nonadrenergic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 229940031826 phenolate Drugs 0.000 description 2
- OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N phenylglyoxal Chemical compound O=CC(=O)C1=CC=CC=C1 OJUGVDODNPJEEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 2
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 2
- 230000010282 redox signaling Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 2
- 230000036454 renin-angiotensin system Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 108010051412 reteplase Proteins 0.000 description 2
- 229960002917 reteplase Drugs 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N sildenafil Chemical compound CCCC1=NN(C)C(C(N2)=O)=C1N=C2C(C(=CC=1)OCC)=CC=1S(=O)(=O)N1CCN(C)CC1 BNRNXUUZRGQAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical class [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000013151 thrombectomy Methods 0.000 description 2
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 2
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 2
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 2
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 2
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 2
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 2
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-3-Hydroxy-2-pyrolidinecarboxylic acid Natural products OC1CCNC1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKUAWRVNDCVEHT-NSHDSACASA-N (2s)-2-(pyren-4-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C34 HKUAWRVNDCVEHT-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- CMXXUDSWGMGYLZ-XRIGFGBMSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CMXXUDSWGMGYLZ-XRIGFGBMSA-N 0.000 description 1
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 1
- VOIZSAUUYAGTMS-LURJTMIESA-N (2s)-2-amino-3-thiophen-3-ylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CSC=1 VOIZSAUUYAGTMS-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JQFLYFRHDIHZFZ-RXMQYKEDSA-N (2s)-3,3-dimethylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC1(C)CCN[C@@H]1C(O)=O JQFLYFRHDIHZFZ-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- CNPSFBUUYIVHAP-AKGZTFGVSA-N (2s)-3-methylpyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC1CCN[C@@H]1C(O)=O CNPSFBUUYIVHAP-AKGZTFGVSA-N 0.000 description 1
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- RTHCYVBBDHJXIQ-MRXNPFEDSA-N (R)-fluoxetine Chemical compound O([C@H](CCNC)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 RTHCYVBBDHJXIQ-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydro-1h-pyrrol-1-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)C1NCC=C1 OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHANCCMWYDZQOR-UHFFFAOYSA-N 2-(methyldisulfanyl)pyridine Chemical compound CSSC1=CC=CC=N1 BHANCCMWYDZQOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-1-(4-bromophenyl)ethanone Chemical compound BrCC(=O)C1=CC=C(Br)C=C1 FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQPFYXFVUKHERX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-cyclohexen-1-one Natural products OC1=CCCCC1=O JQPFYXFVUKHERX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONZQYZKCUHFORE-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-1,1,1-trifluoropropan-2-one Chemical compound FC(F)(F)C(=O)CBr ONZQYZKCUHFORE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHSXWDVVFHXHHB-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-2-[(3-nitropyridin-2-yl)disulfanyl]pyridine Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CN=C1SSC1=NC=CC=C1[N+]([O-])=O QHSXWDVVFHXHHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOJNFONOHINEFI-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]butane-1-sulfonic acid Chemical compound OCCN1CCN(CCCCS(O)(=O)=O)CC1 LOJNFONOHINEFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethyl-1-[3-(2,4,5-trichlorophenoxy)propoxy]-1,6-dihydro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound CC1(C)N=C(N)N=C(N)N1OCCCOC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108700020509 Angiomotin Proteins 0.000 description 1
- 102000043902 Angiomotin Human genes 0.000 description 1
- 108010029748 Angiostat Proteins 0.000 description 1
- 102400000344 Angiotensin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004881 Angiotensinogen Human genes 0.000 description 1
- 108090001067 Angiotensinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 102400000059 Arg-vasopressin Human genes 0.000 description 1
- 101800001144 Arg-vasopressin Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000005528 B01AC05 - Ticlopidine Substances 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002083 C09CA01 - Losartan Substances 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 102000014468 Calcitonin Gene-Related Peptide Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010078311 Calcitonin Gene-Related Peptide Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010067787 Coagulation factor deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000034534 Cotransporters Human genes 0.000 description 1
- 108020003264 Cotransporters Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108010000437 Deamino Arginine Vasopressin Proteins 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- JRWZLRBJNMZMFE-UHFFFAOYSA-N Dobutamine Chemical compound C=1C=C(O)C(O)=CC=1CCNC(C)CCC1=CC=C(O)C=C1 JRWZLRBJNMZMFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 206010049927 Dry gangrene Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N Ethyl hydrogen sulfate Chemical compound CCOS(O)(=O)=O KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017711 Gangrene Diseases 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 101000627872 Homo sapiens 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000620897 Homo sapiens Phosphatidylcholine transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 208000029422 Hypernatremia Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010053198 Inappropriate antidiuretic hormone secretion Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 206010022657 Intestinal infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZLNHFMRPBPULJ-VKHMYHEASA-N L-thioproline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSCN1 DZLNHFMRPBPULJ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KKJQZEWNZXRJFG-UHFFFAOYSA-N L-trans-4-Methyl-2-pyrrolidinecarboxylic acid Chemical compound CC1CNC(C(O)=O)C1 KKJQZEWNZXRJFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 description 1
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 206010027603 Migraine headaches Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-L Oxalate Chemical compound [O-]C(=O)C([O-])=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001111421 Pannus Species 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 206010034476 Pericardial haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 206010060932 Postoperative adhesion Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 102000028391 RNA cap binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000106 RNA cap binding Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038678 Respiratory depression Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 206010038980 Retroperitoneal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 206010067723 Skin plaque Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010041277 Sodium retention Diseases 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 101000915480 Streptococcus pneumoniae serotype 4 (strain ATCC BAA-334 / TIGR4) Zinc metalloprotease ZmpC Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 108010039185 Tenecteplase Proteins 0.000 description 1
- 108010010056 Terlipressin Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003443 Unconsciousness Diseases 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 229940083335 Vasopressin agonist Drugs 0.000 description 1
- 102100026383 Vasopressin-neurophysin 2-copeptin Human genes 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- KPCZJLGGXRGYIE-UHFFFAOYSA-N [C]1=CC=CN=C1 Chemical group [C]1=CC=CN=C1 KPCZJLGGXRGYIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 229940023020 acriflavine Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001295 alanines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 108090000861 alpha Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004305 alpha Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 229940124308 alpha-adrenoreceptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 229960003318 alteplase Drugs 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000006295 amino methylene group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000510 ammonia Drugs 0.000 description 1
- 229940042450 amphadase Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000002266 amputation Methods 0.000 description 1
- 201000007538 anal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N angiotensin I Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N 0.000 description 1
- 239000002333 angiotensin II receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000603 anti-haemophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 125000003785 benzimidazolyl group Chemical group N1=C(NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-LURJTMIESA-N beta(2-thienyl)alanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001244 carboxylic acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 150000001746 carotenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017168 chlorine Nutrition 0.000 description 1
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical compound NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N cis-3-hydroxy-D-proline zwitterion Chemical compound O[C@H]1CCN[C@H]1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 208000014763 coagulation protein disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021821 cold clammy skin Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000036757 core body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229940111134 coxibs Drugs 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000008705 cutaneous vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-dione Chemical compound O=C1CCCCC1=O OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- NFLWUMRGJYTJIN-NXBWRCJVSA-N desmopressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSCCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(N)=O)=O)CCC(=O)N)C1=CC=CC=C1 NFLWUMRGJYTJIN-NXBWRCJVSA-N 0.000 description 1
- 229960004281 desmopressin Drugs 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 201000010064 diabetes insipidus Diseases 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSUGRBWQSSZJOP-RTWAWAEBSA-N diltiazem Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1[C@H]1[C@@H](OC(C)=O)C(=O)N(CCN(C)C)C2=CC=CC=C2S1 HSUGRBWQSSZJOP-RTWAWAEBSA-N 0.000 description 1
- 229960004166 diltiazem Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M dimethylarsinate Chemical compound C[As](C)([O-])=O OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229960001089 dobutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000386 donor Substances 0.000 description 1
- RUZYUOTYCVRMRZ-UHFFFAOYSA-N doxazosin Chemical compound C1OC2=CC=CC=C2OC1C(=O)N(CC1)CCN1C1=NC(N)=C(C=C(C(OC)=C2)OC)C2=N1 RUZYUOTYCVRMRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001389 doxazosin Drugs 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 108010062797 equistatin Proteins 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N ethionamide Chemical compound CCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960002464 fluoxetine Drugs 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical group 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 1
- 229940044734 hydase Drugs 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 229940044700 hylenex Drugs 0.000 description 1
- 230000037417 hyperactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 201000008284 inappropriate ADH syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000005550 inflammation mediator Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000012105 intracellular pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 210000000738 kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- KJJZZJSZUJXYEA-UHFFFAOYSA-N losartan Chemical compound CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C=2[N]N=NN=2)C=C1 KJJZZJSZUJXYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004773 losartan Drugs 0.000 description 1
- 208000012866 low blood pressure Diseases 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010059585 mRNA decapping enzymes Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000011418 maintenance treatment Methods 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229960000901 mepacrine Drugs 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- RMAHPRNLQIRHIJ-UHFFFAOYSA-N methyl carbamimidate Chemical compound COC(N)=N RMAHPRNLQIRHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NEGQCMNHXHSFGU-UHFFFAOYSA-N methyl pyridine-2-carboximidate Chemical compound COC(=N)C1=CC=CC=N1 NEGQCMNHXHSFGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- NKAAEMMYHLFEFN-UHFFFAOYSA-M monosodium tartrate Chemical compound [Na+].OC(=O)C(O)C(O)C([O-])=O NKAAEMMYHLFEFN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 101150049514 mutL gene Proteins 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 230000008035 nerve activity Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001597 nifedipine Drugs 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005346 nocturnal enuresis Diseases 0.000 description 1
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 238000003499 nucleic acid array Methods 0.000 description 1
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000004028 organic sulfates Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M p-chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 208000030940 penile carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008174 penis carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 201000002628 peritoneum cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- HMFAQQIORZDPJG-UHFFFAOYSA-N phosphono 2-chloroacetate Chemical compound OP(O)(=O)OC(=O)CCl HMFAQQIORZDPJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001476 phosphono group Chemical group [H]OP(*)(=O)O[H] 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010036067 polydipsia Diseases 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- IENZQIKPVFGBNW-UHFFFAOYSA-N prazosin Chemical compound N=1C(N)=C2C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=1N(CC1)CCN1C(=O)C1=CC=CO1 IENZQIKPVFGBNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001289 prazosin Drugs 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 229960000286 proflavine Drugs 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000004307 pyrazin-2-yl group Chemical group [H]C1=C([H])N=C(*)C([H])=N1 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 1
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 1
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N quinacrine Chemical compound C1=C(OC)C=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=C(C=CC(Cl)=C3)C3=NC2=C1 GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 101150056906 recJ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940120723 recombinant human hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000025488 response to cold Effects 0.000 description 1
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- XMVJITFPVVRMHC-UHFFFAOYSA-N roxarsone Chemical group OC1=CC=C([As](O)(O)=O)C=C1[N+]([O-])=O XMVJITFPVVRMHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003804 salivary gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101150072534 sbcB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940124834 selective serotonin reuptake inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012896 selective serotonin reuptake inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000020341 sensory perception of pain Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229960003310 sildenafil Drugs 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020408 systemic-onset juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 229960000216 tenecteplase Drugs 0.000 description 1
- BENFXAYNYRLAIU-QSVFAHTRSA-N terlipressin Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CN)CSSC1 BENFXAYNYRLAIU-QSVFAHTRSA-N 0.000 description 1
- 229960003813 terlipressin Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- PHWBOXQYWZNQIN-UHFFFAOYSA-N ticlopidine Chemical compound ClC1=CC=CC=C1CN1CC(C=CS2)=C2CC1 PHWBOXQYWZNQIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005001 ticlopidine Drugs 0.000 description 1
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- PUXBEKLSMBVFNW-UHFFFAOYSA-N triphenylene-2,3,6,7,10,11-hexamine hexahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.Cl.Cl.NC1=CC=2C3=CC(=C(C=C3C3=CC(=C(C=C3C2C=C1N)N)N)N)N PUXBEKLSMBVFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- PBYZMCDFOULPGH-UHFFFAOYSA-N tungstate Chemical compound [O-][W]([O-])(=O)=O PBYZMCDFOULPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 101150115617 umuC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150046028 umuD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940045136 urea Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007487 urography Methods 0.000 description 1
- 229960003824 ustekinumab Drugs 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000012991 uterine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006492 vascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 239000002536 vasopressin receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002455 vasospastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940054953 vitrase Drugs 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 1
- 101150100239 vsr gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
- C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения условно активных белков. Изобретение позволяет методами генной инженерии получить терапевтические и диагностические молекулы белков, которые более активны при абберантном условии, чем при нормальном физиологическом условии. Также раскрываются критерии осуществления отбора исходных белков для методов обнаружения и форматы указанных белков. 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 9 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Данное описание относится к области эволюции и активности белка. Конкретно, данное описание относится к способу получения условно активных биологических белков из белков дикого типа, в частности терапевтических белков, которые обратимым или необратимым образом инактивируются в нормальных для дикого типа физиологических условиях. Например, эволюционированные белки по существу неактивны при температуре тела, но активны при пониженных температурах.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Существует значительный объем литературы, описывающий возможность эволюционирования белков для получения различных характеристик, в частности, например, стабилизации ферментов для работы при различных условиях. Например, можно осуществить эволюцию ферментов для стабилизации при более высоких температурах с различной активностью. В ситуациях, когда происходит улучшение активности при высокой температуре, значительную часть улучшения можно объяснить более высокой кинетической активностью, которую обычно описывают по правилу Q10, согласно которому предполагается, что в случае фермента, скорость обмена удваивается при каждом повышении на 10 градусов Цельсия. Кроме того, существуют примеры природных мутаций, которые дестабилизируют белки в нормальных для них условиях функционирования, такие как температурная активность указанной молекулы дикого типа. В случае температурных мутантов, эти мутанты могут быть активны при более низкой температуре, но обычно уровень их активности ниже, чем у молекул дикого типа (также обычно описывается путем снижения активности согласно правилу Q10 или аналогичным правилам).
[0003] Желательно получить полезные молекулы, которые активируются в зависимости от условий, например, которые практически неактивны в условиях для дикого типа, но активны в других условиях, отличных от условий для дикого типа, на уровне, который равен или превосходит условия для дикого типа, или которые активируются или инактивируются в определенных микроокружениях, или которые активируются или инактивируются во временем. Помимо температуры, другие условия, для которых можно эволюционировать или оптимизировать белки, включают pH, осмотическое давление, осмоляльность, окислительный стресс и концентрацию электролитов. Другие желательные свойства, которые можно оптимизировать в ходе эволюции, включают химическую устойчивость и устойчивость к протеолизу.
[0004] Опубликовано множество стратегий по эволюционированию или модификации (конструированию) молекул. Однако модификация или эволюционирование белка, которые позволяют сделать его неактивным или практически неактивным (менее, чем 10% активности и, в особенности, 1% активности) в условиях, в которых функционирует белок дикого типа, при сохранении активности в новых условиях, равной или повышенной по сравнению с условиями для дикого типа, требует, чтобы дестабилизирующая мутация(-и) существовала совместно с увеличивающими активность мутациями, которые не противодействуют дестабилизирующему эффекту. Ожидается, что дестабилизация могла бы снизить активности белка в большей степени, чем эффекты, предсказанные стандартными правилами, такими как Q10, соответственно, возможность получить путем эволюционирования белки, которые эффективно функционируют, например, при пониженной температуре и в то же время инактивированы при нормальном для них условии функционирования, создает неожиданный новый класс белков, которые авторы настоящего изобретения назвали условно активными биологическими белками.
[0005] Текст настоящей заявки содержит ссылки на различные публикации по их авторам и дате. Описания данных публикаций полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки для того, чтобы более полно описать состояние данной области техники, как оно было известно специалистам в данной области техники на дату раскрытия описанного и заявленного в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0006] В указанном описании предложен способ получения условно активного биологического белка, включающий: отбор биологического белка дикого типа; эволюционирование ДНК, которая кодирует биологический белок дикого типа, с применением одного или более эволюционных методов с получением мутантной ДНК; экспрессию мутантной ДНК с получением мутантного белка; проведение анализа мутантного белка и белка дикого типа при нормальном физиологическом условии и анализа при абберантном условии и отбор условно активного биологического белка из тех мутантных белков, которые проявляют как (а) снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с белком дикого типа, так и (b) увеличение активности в анализе при абберантном условии по сравнению с белком дикого типа. В различных аспектах нормальное физиологическое условие выбрано из одного или более из: температуры, pH, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса и концентрации электролитов. В одном из конкретных аспектов нормальным физиологическим условием является температура, при этом условно активный биологический белок практически неактивен при нормальной физиологической температуре, но активен при аберрантной температуре, меньшей, чем указанная нормальная физиологическая температура. В других аспектах условно активный биологический белок обратимым или необратимым образом инактивирован в нормальных для дикого типа физиологических условиях. В одном конкретном аспекте указанный белок обратимым образом инактивирован при нормальных для дикого типа физиологических условиях. В альтернативном варианте условно активные биологические белки выбраны из белков, которые проявляют обратимые или необратимые изменения активности при двух или более различных физиологических условиях.
[0007] В одном варианте реализации биологический белок дикого типа представляет собой фермент, в определенных аспектах биологический белок дикого типа выбран из группы, состоящей из тканевого активатора плазминогена, стрептокиназы, урокиназы, ренина и гиалуронидазы.
[0008] В другом варианте реализации биологический белок дикого типа выбран из пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP), субстанции Р (SP), нейропептида Y (NPY), вазоактивного пептида кишечника (VTP), вазопрессина и ангиостатина.
[0009] В другом варианте реализации биологический белок является антителом.
[0010] В другом варианте реализации настоящее описание обеспечивает способ получения условно активного модификатора биологического ответа, включающий: отбор медиатора воспалительного ответа; идентификацию антитела дикого типа против указанного медиатора; эволюционирование указанного антитела дикого типа; проведение дифференциального скрининга мутантов, которые проявляют пониженное связывание с указанным медиатором относительно антитела дикого типа при первом условии и проявляют повышенное сродство к связыванию с указанным медиатором при втором условии, для идентификации повышающих мутантов, и рекомбинацию тяжелых цепей и легких цепей указанных повышающих мутантов для получения рекомбинантных повышающих мутантов; и скрининг указанных рекомбинантных повышающих мутантов с целью поиска мутантов, которые проявляют пониженное связывание с указанным медиатором относительно указанного антитела дикого типа при первом условии и демонстрируют повышенное сродство к связыванию с указанным медиатором при втором условии, для идентификации указанного условно активного модификатора биологического ответа. В одном аспекте указанный медиатор воспалительного ответа выбран из рецептора ИЛ-6, рецептора ИЛ-6, ФНО-альфа, ИЛ-23 и ИЛ-12. В другом аспекте первое и второе условия выбраны следующих условий: pH, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса и концентрации электролита.
[0011] В другом варианте реализации настоящее описание обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую условно активный биологический белок и фармацевтически приемлемый носитель.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0012] На ФИГ. 1 изображен график, представляющий условно активные антитела, отобранные в примере 9, и их селективность при pH 6,0 выше 7,4.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0013] Для того, чтобы облегчить понимание приведенных в настоящем документе примеров, в настоящем описании будут определены некоторые часто встречающиеся способы и/или термины.
[0014] В контексте настоящего описания применительно измеряемой величине термин «приблизительно» относится к нормальной вариации данной измеряемой величины, которую мог бы ожидать специалист в данной области техники, производящий измерения и принимающий меры соразмерно с задачей измерения и точностью применяемого измерительного оборудования. Если не указано другое, термин «приблизительно» относится к вариации, равной +/- 10% от приведенного значения.
[0015] В контексте настоящего описания термин «активность» относится к любой функции, которую может выполнять белок, включая катализирование реакций и связывание с партнером. Для ферментов активность может представлять собой ферментативную активность фермента. Для антител активность может представлять собой связывающую активность (т.е. сродство к связыванию) между антителом и его антигеном(-ами). Для рецепторов или лигандов активность может представлять собой сродство к связыванию между рецептором и его лигандом.
[0016] В контексте настоящего описания термин «агент» применяют для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, панелей пространственно локализованных соединений (например, панели пептидов для VLSIPS, панели полинуклеотидов и/или комбинаторная панель малых молекул), биологической макромолекулы, библиотеки пептидов на основе бактериофагового дисплея, библиотеки антител на основе бактериофагового дисплея (например, scFv), библиотеки пептидов на основе полисомного дисплея, или экстракта, полученного из биологических материалов, таких как бактерии, растения, грибы или клетки или ткани животных (в частности, млекопитающих). Агенты оценивают на потенциальную ферментативную активность путем включения в анализы скрининга, описанные ниже в настоящем документе. Агенты оценивают на потенциальную активность в качестве условно активных биологических терапевтических ферментов путем включения в анализы скрининга, описанные ниже в настоящем документе.
[0017] «Нечеткое требование к основанию» в сайте рестрикции относится к требованию в отношении нуклеотидного основания, которое не в полной мере определено, т.е. которое не является конкретным основанием (например, в неограничивающем примере конкретное основание, выбранное из A, C, G и Т), однако может представлять собой любое из по меньшей мере двух или более оснований. Обычно принятые аббревиатуры, применяемые в данной области техники, а также в настоящем описании, для представления альтернативных оснований включают следующие: R=G или A; Y=C или Т; М=A или C; K=G или Т; S=G или C; W=A или Т; Н=A или C или Т; B=G или Т или C; V=G или C или A; D=G или A или Т; N=A или C или G или Т.
[0018] В контексте настоящего описания термин «аминокислота» относится к любому органическому соединению, которое содержит аминогруппу (NH2) и карбоксильную группу (-COOH); предпочтительно либо в качестве свободных групп, либо, альтернативным образом после конденсации, в качестве составной части пептидных связей. Термин «двадцать естественным образом кодируемых альфа-аминокислот, образующих полипептид» понятен в данной области техники и относится к: аланину (ala или A), аргинину (arg или R), аспарагину (asn или N), аспарагиновой кислоте (asp или D), цистеину (cys или C), глутаминовой кислоте (glu или Е), глутамину (gin или Q), глицину (gly или G), гистидину (his или Н), изолейцину (ile или I), лейцину (leu или L), лизину (lys или K), метионину (met или М), фенилаланину (phe или F), пролину (pro или Р), серину (ser или S), треонину (thr или Т), триптофану (tip или W), тирозину (tyr или Y) и валину (val или V).
[0019] Термин «амплификация» обозначает увеличение числа копий полинуклеотида.
[0020] Молекула, которая обладает «химерным свойством», представляет собой молекулу, которая: 1) частично гомологична и частично гетерологична первой референсной молекуле; при этом 2) в то же время частично гомологична и частично гетерологична второй референсной молекуле без 3) исключения возможности представлять собой в то же время частично гомологичную и частично гетерологичную молекулу по отношению к еще одной или более дополнительным референсным молекулам. В неограничивающем варианте реализации химерную молекулу можно получить путем сборки рекомбинации частичных молекулярных последовательностей. В неограничивающем аспекте химерную полинуклеотидную молекулу можно получить при помощи синтеза указанного химерного полинуклеотида с применением множества молекулярных матриц, так что полученный химерный полинуклеотид обладает свойствами множества матриц.
[0021] В контексте настоящего описания термин «родственный» относится к последовательности гена, которая эволюционным и функциональным образом связана у разных видов. Например, без ограничений, в геноме человека ген CD4 человека представляет собой ген, родственный гену 3d4 мыши, поскольку последовательности и структуры данных двух генов указывают на, что они высоко гомологичны, и оба гена кодируют белок, который функционирует при активации сигнальной Т-клетки через ограниченное МНС класса II распознавание антигена.
[0022] В контексте настоящего описания «окно сравнения» относится к концептуальному сегменту из по меньшей мере 20 находящихся в смежной позиции нуклеотидов, в котором последовательность нуклеотидов можно сравнивать с референсной последовательностью по из меньшей мере 20 смежных нуклеотидов и при этом часть указанной последовательности полинуклеотидов в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) 20 процентов или менее по сравнению с референсной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания в окне сравнения можно осуществлять при помощи алгоритма локальной гомологии по Smith (Smith и Waterman, 1981, «Comparison of biosequences», Adv. Appl. Math. 2: 482-489; Smith и Waterman, 1981, «Overlapping genes and information theory», J. Theor. Biol, 91: 379-380; Smith и Waterman, J. Mol. Biol., «Identification of common molecular subsequences», 1981, 147: 195-197; Smith и др., 1981, «Comparative biosequence metrics», J. Mol. Evol, 18: 38-46), при помощи алгоритма гомологичного выравнивания по Needleman (Needleman и Wunsch, 1970, «A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins», J. Mol. Biol. 48(3): 443-453), при помощи метода поиска подобия по Pearson (Pearson и Lipman, 1988, «Improved tools for biological sequence comparison)), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448); при помощи реализации на компьютере вариантов данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics выпуск 7,0 от Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Мэдисон, штат Висконсис) или путем проверки, и выбирают наилучшее выравнивание (т.е. приводящее к наибольшему проценту гомологии в окне сравнения), генерируемое при помощи различных методов.
[0023] Термин «условно активный биологический белок» относится к варианту или мутанту белка дикого типа, активность которого выше или ниже, чем у родительского белка дикого типа, при одном или более нормальных физиологических условиях. Данный условно активный белок также проявляет активность в отдельных участках организма и/или проявляет повышенную или пониженную активность в абберантных или пермиссивных физиологических условиях. Нормальные физиологические условия представляют собой те условия температуры, pH, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса и концентрации электролитов, которые рассматриваются в пределах нормального диапазона в участке введения, или в ткани или органе участка действия, субъекту. Аббератное условие - это такое условие, которое выходит за пределы нормального диапазона допустимых значений для этого условия. В одном из аспектов условно активный биологический белок практически неактивен в условиях дикого типа, однако активен в отличном от дикого типа условии на уровне, который равен или лучше по сравнению с условиями дикого типа. Например, в одном аспекте эволюционированный условно активный биологический белок практически неактивен при температуре тела, однако активен при пониженных температурах. В другом аспекте условно активный биологический белок обратимым или необратимым образом инактивирован при условиях дикого типа. В дополнительном аспекте белок дикого типа представляет собой терапевтический белок. В другом аспекте условно активный биологический белок применяют в качестве лекарственного средства или терапевтического агента. Еще в одном аспекте белок в большей или меньшей степени активен в сильно насыщенной кислородом крови, такой как, например, после прохождения через легкие или в окружающей среде с пониженным pH, обнаруживаемым в почках.
[0024] «Термин «консервативные аминокислотные замены» относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, - это глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатические-гидроксильные боковые цепи, - это серии и треонин; группа аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, - это аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, - это фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, - это лизин, аргинин и гистидин; и группа аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, - это цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин.
[0025] В контексте настоящего описания термин «соответствует» обозначает, что полинуклеотидная последовательность гомологична (т.е. идентична, не строгим образом эволюционно родственна) всей или части референсной последовательности полинуклеотидов или что полипептидная последовательность идентична референсной последовательности полипептидов. В противоположность этому, термин «комплементарен» в контексте настоящего описания обозначает, что комплементарная последовательность гомологична всей или части референсной последовательности полинуклеотидов. Для иллюстрации, последовательность нуклеотидов «ТАТАС» соответствует референсной последовательности «ТАТАС» и комплементарна референсной последовательности «GTATA».
[0026] Термин «эффективное для разложения» количество относится к количеству фермента, которое требуется для обработки по меньшей мере 50% субстрата по сравнению с субстратом, который не контактирует с ферментом.
[0027] В контексте настоящего описания термин «структура определенной последовательности» относится к набору определенных последовательностей, которых отбирают на неслучайной основе, в целом на основе экспериментальных данных или структурных данных, например, определенная структура последовательности может содержать набор аминокислотных последовательностей, которые согласно прогнозу образуют бета-листовую структуру или среди других вариантов могут содержать мотив гептадного повтора лейциновой молнии, цинк-пальцевый домен. «Ядро (kernel) определенной последовательности» представляет собой набор последовательностей, которые охватывают ограниченный объем изменчивости. В свою очередь (1) полностью случайная 10-мерная последовательность из 20 обычных аминокислот может быть любой из (20)10 последовательностей, и (2) псевдослучайная 10-мерная последовательность из 20 обычных аминокислот может быть любой из (20)10, однако она будет проявлять асимметрию для определенных остатков в определенных положениях, и/или в целом (3) ядро определенной последовательности является подмножеством последовательностей, если каждое положение остатка представляет собой любую из допустимых 20 обычных аминокислот (и/или допустимых необычных амино/иминокислот). Ядро определенной последовательности в целом содержит вариантные и инвариантные положения остатков и/или содержит вариантные положения остатков, которые могут содержать остаток, выбранный из определенного подмножества аминокислотных остатков и им подобных, либо сегментарно, либо по всей длине индивидуальным образом отобранной последовательности, являющейся элементом библиотеки. Ядра определенной последовательности могут упоминаться либо по отношению к аминокислотным последовательностям, либо к последовательностям полинуклеотидов. В качестве примера и без ограничений, последовательности (NNK)10 и (NNM)10, где N представляет собой A, Т, G или C; K представляет собой G или Т и М представляет собой A или C, представляют собой ядра определенных последовательностей.
[0028] «Расщепление» ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК под действием эндонуклеазы рестрикции, который действует только на определенные последовательности ДНК. В контексте настоящего описания различные эндонуклеазы рестрикции являются коммерчески доступными и их условия реакции, кофакторы и другие требования применяли таким образом, как это известно обычному специалисту. Для аналитических целей обычно 1 мкг плазмиды или фрагмента ДНК применяют с приблизительно 2 единицами фермента в приблизительно 20 мкл буферного раствора. С целью выделения фрагментов ДНК для конструирования плазмид обычно расщепляют от 5 до 50 мкг ДНК при помощи 20-250 единиц фермента в большем объеме. Соответствующие буферы и количества субстрата для конкретных эндонуклеаз рестрикции определяет изготовитель. Обычно применяют время инкубации, составляющее приблизительно 1 час при 37 градусах Цельсия, однако его можно варьировать в соответствии с инструкциями поставщика. После расщепления указанную реакцию проводят с применением электрофореза непосредственно на геле для выделения желаемого фрагмента.
[0029] Термин «направленное лигирование» относится к лигированию, при котором 5'-конец и 3'-конец полинуклеотида достаточно отличаются для того, чтобы ориентация предпочтительного лигирования была специфической. Например, в противном случае, необработанный и нерасщепленный ПЦР-продукт, который имеет два тупых конца, как правило, не будет иметь ориентации предпочтительного лигирования при лигировании в вектор клонирования, расщепленный с образование тупых концов в своем множественном сайте клонирования; таким образом, направленное лигирование, как правило, не будут отображаться при данных обстоятельствах. Напротив, направленное лигирование, как правило, будет отображаться, если расщепленный ПЦР-продукт, имеющий обработанный при помощи EcoR I 5'-конец и при помощи BamH I 3'-конец, лигируют в вектор клонирования, который имеет сайт множественного клонирования, расщепленный при помощи EcoR I и BamH I.
[0030] В контексте настоящего описания термин «ДНК-шаффлинг» обозначает рекомбинацию между по существу гомологичными, но неидентичными, последовательностями, в некоторых вариантах реализации ДНК-шаффлинг может включать кроссовер посредством негомологичной рекомбинации, как, например, посредством системы cer/lox и/или flp/frt и им подобным. ДНК-шаффлинг может быть случайным или неслучайным.
[0031] Термин «лекарственное средство» или «молекула лекарственного средства» относится к терапевтическому агенту, включающему вещество, которое обладает благоприятным воздействием на организм человека или животного при введении в указанный организм человека или животного. Предпочтительным образом, указанный терапевтический агент включает вещество, которое может лечить, излечить или облегчить один или более симптомов, болезней или абнормальных состояний в организме человека или животного или улучшить самочувствие организма человека или животного.
[0032] «Эффективное количество» представляет собой количество условно активного биологического белка или фрагмента, которое эффективно для лечения или предотвращения состояния в живом организме, в который его вводят в течение некоторого периода времени, например, обеспечивая терапевтический эффект в течение желаемого интервала дозирования.
[0033] В контексте настоящего описания термин «электролит» применяют для определения минерала в крови или в других жидкостях организма, который несет заряд. Например, в одном аспекте нормальное физиологическое условие и аберрантное условие могут представлять собой условие «концентрация электролита». В одном аспекте указанную исследуемую концентрацию электролита выбирают из одной или более концентраций ионизированного кальция, натрия, калия, магния, хлорида, бикарбоната и фосфата. Например, в одном аспекте нормальный диапазон кальция в сыворотке составляет от 8,5 до 10,2 мг/дл. В данном аспекте аберрантная концентрация кальция сыворотки можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона, в другом примере, в одном аспекте нормальный диапазон хлорида сыворотки составляет 96-106 милиэквивалентов на литр (мЭкв/л). В данном аспекте аберрантная концентрация хлорида сыворотки можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона, в другом примере, в одном аспекте нормальный диапазон магния сыворотки составляет от 1,7-2,2 мг/дл. В данном аспекте аберрантная концентрация магния сыворотки можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона, в другом примере, в одном аспекте нормальный диапазон фосфора сыворотки составляет от 2,4 до 4,1 мг/дл. В данном аспекте аберрантная концентрация фосфора сыворотки можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона. В другом примере, в одном аспекте нормальный диапазон натрия сыворотки или крови составляет от 135 до 145 мЭкв/л. В данном аспекте, аберрантная концентрация натрия сыворотки или крови можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона. В другом примере, в одном аспекте нормальный диапазон калия сыворотки или крови составляет от 3,7 до 5,2 мЭкв/л. В данном аспекте, аберрантная концентрация калия сыворотки или крови можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона. В дополнительном аспекте нормальный диапазон бикарбоната сыворотки составляет от 20 до 29 мЭкв/л. В данном аспекте аберрантная концентрация бикарбоната сыворотки или крови можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона. В другом аспекте, уровни бикарбоната можно применять для индикации нормальных уровней кислотности (pH) в крови. Термин «концентрация электролита» также можно применять для обозначения условия для определенного электролита, в особенности, электролита в тканевой жидкости или физиологической жидкости, отличной от крови или плазмы. В этом случае нормальное физиологическое условие считается клинически нормальным диапазоном для данной ткани или жидкости. В данном аспекте аберрантная концентрация электролита в ткани или жидкости можно выбрать из концентрации либо выше нормального диапазона, либо ниже нормального диапазона.
[0034] В контексте настоящего описания термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте на антигене, таком как фермент-полипептид, с которой связывается паратоп антитела, такого как специфичного по отношению к ферменту антитела. Антигенные детерминанты, как правило, состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или Сахаров, и могут обладать специфичными трехмерными структурными характеристиками, а также специфичными характеристиками заряда. В контексте настоящего документа термин «эпитоп» относится к той части антигена или другой макромолекулы, способной образовывать связывающее взаимодействие, которая взаимодействует с вариабельной областью связывающего тела антитела. Как правило, такое связывающее взаимодействие проявляется в виде межмолекулярного контакта с одним или более аминокислотных остатков CDR.
[0035] В контексте настоящего описания термин «фермент» представляет собой белок со специфичными каталитическими свойствами. Факторы, такие как, например, концентрация субстрата, pH, температура и присутствие или отсутствие ингибиторов, могут влиять на скорость катализа. Как правило, для фермента дикого типа Ql0 (температурный коэффициент) описывает увеличение скорости реакции при повышении температуры на 10 градусов Цельсия. Для ферментов дикого типа Ql0 составляет от 2 до 3; другими словами, скорость реакции увеличивается в два или три раза при каждом повышении температуры на 10 градусов. При высоких температурах белки денатурируются. При pH, немного отличающихся от оптимального значения для ферментов, происходят небольшие изменения в зарядах фермента и, возможно, в молекуле субстрата. Изменение ионизации может влиять на связывание молекулы субстрата. При экстремальных уровнях pH указанный фермент будет денатурировать, при этом активный сайт искажается и молекула субстрата больше не будет соответствовать.
[0036] В контексте настоящего описания термин «эволюция» или «эволюционирование» относится к одному или более способам получения при помощи мутагенеза нового полинуклеотида, кодирующего новый полипептид, при этом новый полипептид сам по себе представляет собой усовершенствованную биологическую молекулу и/или способствует образованию другой усовершенствованной биологической молекулы. В конкретном неограничивающем аспекте настоящее описание относится к эволюции условно активных биологических белков из родительского белка дикого типа. В одном аспекте, например, эволюция относится к способу осуществления как нестохастической химеризации полинуклеотидов, так и нестохастического сайт-направленного точечного мутагенеза, раскрытого в публикации заявки на патент США 2009/0130718. Более конкретно, в настоящем описании предложены способы эволюционирования условно активных биологических ферментов, которые демонстрируют пониженную активность при нормальном физиологическом условии по сравнению с родительской молекулой фермента дикого типа, однако улучшенную активность при одном или более аберрантных условиях по сравнению с ферментом дикого типа.
[0037] Термины «фрагмент», «производное» и «аналог», когда речь идет о референсном полипептиде, включают полипептид, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую функцию или активность, которая по меньшей мере по существу является такой же, как функция референсного полипептида. Кроме того, указанные термины «фрагмент», «производное» или «аналог» иллюстрируются «про-формой» молекулы, такой как пробелок с низкой активностью, которую можно модифицировать путем расщепления с получением зрелого фермента со значительно более высокой активностью.
[0038] В настоящем описании предложен способ получения из матричного полипептида набора потомства полипептидов, в котором в каждом положении аминокислоты представлен «полный диапазон одиночных аминокислотных замен». В контексте настоящего описания термин «полный диапазон одиночных аминокислотных замен» относится к 20 естественным образом кодируемым альфа-аминокислотам, образующим полипептид, описанный в настоящем документе.
[0039] Термин «ген» означает сегмент ДНК, участвующий в образовании полипептидной цепи; он включает области, предшествующие и следующие за кодирующей областью (лидерная и трейлерная), а также промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами).
[0040] В контексте настоящего описания «генетическая неустойчивость» относится к естественной тенденции высокоповторяющихся последовательностей, которые теряются в процессе восстановительных событий, обычно включающих упрощение последовательности за счет потери повторяющихся последовательностей. Делеции, как правило, связаны с потерей одной копии повтора и всех копий между повторами.
[0041] Термин «гетерологичный» означает, что одна одноцепочечная последовательность нуклеиновой кислоты не способна гибридизоваться с другой одноцепочечной последовательностью нуклеиновой кислоты или ее комплементом. Таким образом, области гетерологии означают, что области полинуклеотидов или полинуклеотиды имеют области или участки в пределах их последовательности, которые не способны гибридизоваться с другой нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом. Такие участки или области представляют собой, например, области мутаций.
[0042] Термин «гомологичные» или «гомеологичные» означает, что одна одноцепочечная последовательность нуклеиновой кислоты может гибридизоваться с комплементарной одноцепочечной последовательностью нуклеиновой кислоты. Степень гибридизации может зависеть от ряда факторов, включая степень идентичности между последовательностями и условия гибридизации, такие как температура и концентрации солей, обсуждаемые в дальнейшем. Предпочтительным образом, участок идентичности больше, чем приблизительно 5 пар нуклеотидных оснований, более предпочтительно, участок идентичности больше, чем 10 пар нуклеотидных оснований.
[0043] Преимущества данного описания распространяются на «промышленные применения» (или промышленные процессы), термин, который применяют для включения применения собственно в коммерческой промышленности (или просто в промышленности), а также некоммерческих промышленных применений (например, биомедицинские исследования в некоммерческой организации). Соответствующие применения включают применения в областях диагностики, медицины, сельского хозяйства, производства и в научно-исследовательской деятельности.
[0044] Термин «идентичный» или «идентичность» означает, что две последовательности нуклеиновой кислоты имеют одинаковую последовательность или комплементарную последовательность. Таким образом, «области идентичности» означают, что участки или области полинуклеотида или общего полинуклеотида являются идентичными или комплементарны области другого полинуклеотида.
[0045] Термин «выделенный» означает, что материал удаляют из его первоначального окружения (например, природное окружения, если это встречающийся в природе материал). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или фермент, присутствующий в живом организме животного, не является выделенным, однако тот же самый полинуклеотид или фермент, отделенный от некоторых или всех материалов, совместно с которыми он существует в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут представлять собой часть вектора, и/или такие полинуклеотиды или ферменты могут представлять собой часть композиции и по-прежнему являться выделенными в таком векторе или композиции, не являясь частью их природного окружения.
[0046] Термин «выделенная нуклеиновая кислота» применяют для определения нуклеиновой кислоты, например, молекулы ДНК или РНК, которая непосредственно не граничит с 5'- и 3'-фланкирующими последовательностями, с которыми она обычно непосредственно граничит, если присутствует во встречающемся в природе геноме организма, из которого его получают. Таким образом, термин описывает, например, нуклеиновую кислоту, которую включают в вектор, такой как плазмидный или вирусный вектор; нуклеиновую кислоту, которую включают в геном гетерологичной клетки (или геном гомологичной клетки, однако в сайт, отличный от того, который встречается в природе); и нуклеиновую кислоту, которая существует в качестве отдельной молекулы, например, фрагмент ДНК, полученный при помощи ПЦР-амплификации или расщепления с применением эндонуклеазы рестрикции, или молекула РНК, полученная при помощи транскрипции in vitro. Термин также описывает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая образует часть гибридного гена, кодирующего дополнительные полипептидные последовательности, которые можно применять, например, при получении белка слияния.
[0047] В контексте настоящего описания термин «лиганд» относится к молекуле, такой как случайный пептид или последовательность вариабельного сегмента, которая распознается конкретным рецептором. Специалисту в данной области техники будет понятно, что молекула (или макромолекулярный комплекс) может представлять собой и рецептор, и лиганд. В целом партнера по связыванию, обладающего меньшей молекулярной массой, обозначают как лиганд, а партнера по связыванию, обладающего большей молекулярной массой, обозначают как рецептор.
[0048] Термин «лигирование» относится к способу образования фосфодиэфирных связей между двумя двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты (Sambrook и др., (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, p.146; Sambrook и др., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Если иное не предусмотрено, то лигирование можно осуществлять с применением известных буферов и условий с 10 единицами Т4 ДНК-лигазы («лигазы») на 0,5 микрограмм приблизительно эквимолярных количеств фрагментов ДНК, которые требуется лигировать.
[0049] Термины «линкер» или «спейсер» в контексте настоящего описания относится к молекуле или группе молекул, которые соединяют две молекулы, такие как ДНК-связывающий белок и случайный пептид, и служат для того, чтобы расположить две молекулы в предпочтительной конфигурации, например, таким образом, чтобы указанный случайный пептид мог связываться с рецептором с минимальными стерическими помехам со стороны ДНК-связывающего белка.
[0050] В контексте настоящего описания термин «микроокружение» означает любой участок или область ткани или организма, которая обладает постоянными или временными физическими или химическими отличиями от других областей ткани или других областей организма.
[0051] В контексте настоящего описания термин «молекулярное свойство для эволюционирования» включает указание на молекулы, содержащие последовательность полинуклеотидов, молекулы, содержащие последовательность полипептидов, и молекулам, содержащим частично последовательность полинуклеотидов и частично последовательность полипептидов. Особенно важные, но не ограничивающие, примеры молекулярных свойств для эволюционирования, включают активности белка при определенных условиях, таких как связанные к температуре; соленость; осмотическое давление; pH; окислительный стресс и концентрация глицерина, ДМСО, детергента и/или любых других молекулярных частиц, с которыми осуществляется контакт в реакционной среде. Дополнительные особенно важные, но не ограничивающие, примеры молекулярных свойств для эволюционирования включают стабильность - например, количество остаточного молекулярного свойства, которое присутствует по истечении определенного времени воздействия в определенной среде, такой, какая может возникнуть в процессе хранения.
[0052] В контексте настоящего описания термин «мутации» означает изменения в последовательности дикого типа последовательности нуклеиновой кислоты или изменения в последовательности пептида. Такие мутации могут представлять собой точечные мутации, такие как транзиции или трансверсии. Мутации могут представлять собой делеции, вставки или дупликации.
[0053] В контексте настоящего описания вырожденная «N,N,G/T» последовательность нуклеотидов представляет 32 возможных триплета, где «N» может быть A, C, G или Т.
[0054] В контексте настоящего описания термин «встречающийся в природе» (природный) применительно к объекту относится к тому факту, что объект можно обнаружить в природе. Например, последовательность полипептида или полинуклеотида, которая присутствует в организме (включая вирусы), которую можно выделить из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, представляет собой встречающуюся в природе последовательность. В целом встречающиеся в природе относится к объекту, который присутствует у индивидуума, не имеющего патологий (заболеваний), такого, который будет типичным для указанного вида.
[0055] В контексте настоящего описания «нормальные физиологические условия» или «условия функционирования дикого типа» представляют собой такие условия температуры, pH, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса и концентрации электролита, которые будут рассматриваться в пределах нормального диапазона в месте введения, или в месте действия, субъекту.
[0056] В контексте настоящего описания термин «молекула нуклеиновой кислоты» включает по меньшей мере одно основание или одну пару оснований в зависимости от того, является ли она одноцепочечной или двухцепочечной соответственно. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может принадлежать исключительно или в составе химеры к любой группе содержащих нуклеотиды молекул, примерами которых являются, но не ограничиваются ими, следующие группы молекул нуклеиновой кислоты: РНК, ДНК, геномные нуклеиновые кислоты, негеномные нуклеиновые кислоты, встречающиеся и невстречающиеся в природе нуклеиновые кислоты и синтетические нуклеиновые кислоты. Это включает посредством неограничивающего примера нуклеиновые кислоты, ассоциированные с любой органеллой, такой как митохондрии, рибосомальную РНК и молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие в составе химеры один или более компонентов, которые не являются встречающимися в природе компонентами совместно с встречающимися в природе компонентами.
[0057] Кроме того, «молекула нуклеиновой кислоты» может содержать частично один или более ненуклеотидных компонентов, примерами которых являются, но не ограничиваются ими, аминокислоты и сахара. Таким образом, в качестве примера, но не ограничиваясь им, рибозим, который частично представляет собой нуклеотид, а частично белок, рассматривают как «молекулу нуклеиновой кислоты».
[0058] Кроме того, в качестве примера, но не ограничиваясь им, молекула нуклеиновой кислоты, которая помечают при помощи детектируемого фрагмента, такого как радиоактивная или, альтернативным образом, нерадиоактивная метка, также рассматривают как «молекулу нуклеиновой кислоты».
[0059] Термины «последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая» или «кодирующая ДНК последовательность» или «последовательность нуклеотидов, кодирующая» конкретный фермент, а также другие синонимичные термины, относятся к последовательности ДНК, которая транскрибируется и транслируется в ферменте под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. «Последовательность промотора» представляет собой регуляторную область ДНК, способную к связыванию РНК-полимеразы в клетке и инициации транскрипции последовательности, кодируемой по ходу транскрипции (в 3'-направлении). Промоторы представляют собой часть последовательности ДНК. Данная область последовательности содержит старт-кодон на своем 3'-конце. Последовательности промоторов содержат минимальное число оснований, где элементы, необходимые для инициирования транскрипции, находятся на уровнях, обнаруживаемых выше фоновых значений. Однако после того как РНК-полимераза связывается с указанной последовательностью и осуществляется инициация транскрипции на указанном старт-кодоне (3'-конец с промотором), транскрипция протекает ниже по ходу в 3'-направлении. В границах последовательности промотора был обнаружен сайт инициации транскрипции (обычно определяемый путем картирования с нуклеазой SI), а также связывающие белок домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.
[0060] Термины «нуклеиновая кислота, кодирующая фермент (белок)» или «ДНК, кодирующая фермент (белок)» или «полинуклеотид, кодирующий фермент (белок)» и другие синонимичные термины, включают полинуклеотид, который содержит только кодирующую последовательность для указанного фермента, а также полинуклеотид, который содержит дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.
[0061] В одном предпочтительном варианте реализации «специфичный вид молекулы нуклеиновой кислоты» определяется его химической структурой, примером которой является, но не ограничивается им, ее первичная последовательность. В другом предпочтительном варианте реализации специфичный «вид молекулы нуклеиновой кислоты» определяют при помощи функции указанного вида нуклеиновой кислоты или функции продукта, полученного из указанного вида нуклеиновой кислоты. Таким образом, в качестве неограничивающего примера «специфичный вид молекулы нуклеиновой кислоты» можно определить посредством одной или более присущих ей активностей или свойств, включая активности или свойства, присущие продукту ее экспрессии.
[0062] Настоящее определение «сборки рабочего образца нуклеиновой кислоты в библиотеку нуклеиновых кислот» включает процесс включения образца нуклеиновой кислоты в коллекцию на основе векторов, как, например, путем лигирования в вектор и трансформации хозяина. Описание соответствующих векторов, хозяинов и других реагентов, а также их специфичные неограничивающие примеры, предложены ниже. Настоящее определение «сборки рабочего образца нуклеиновой кислоты в библиотеку нуклеиновых кислот» также включает процесс включения образца нуклеиновой кислоты в коллекцию не на основе векторов, как, например, путем лигирования с адаптерами. Предпочтительным образом указанные адапторы можно подвергать отжигу с ПЦР-праймерами для того, чтобы способствовать амплификации при помощи ПЦР.
[0063] Соответствующим образом, в неограничивающем варианте реализации «библиотека нуклеиновых кислот» состоит из коллекции на основе векторов одной или более молекул нуклеиновой кислоты. В другом предпочтительном варианте реализации «библиотека нуклеиновых кислот» состоит из коллекции не на основе векторов молекул нуклеиновых кислот. В еще одном предпочтительном варианте реализации «библиотека нуклеиновых кислот» состоит из комбинированной коллекции молекул нуклеиновых кислот, которая частично представляет собой коллекцию на основе векторов, а частично коллекцию не на основе векторов. Предпочтительным образом коллекция молекул, содержащая библиотеку, представляет собой коллекцию с возможностью поиска и разделения согласно отдельными видами молекул нуклеиновых кислот.
[0064] В настоящем описании предложена «конструкция нуклеиновой кислоты» или, альтернативным образом, «конструкция нуклеотида», или, альтернативным образом, «ДНК-конструкция». В контексте настоящего описания термин «конструкция» описывает молекулу, такую как полинуклеотид (например, полинуклеотид фермента), который необязательно может быть химически связан с одним или более дополнительными молекулярными фрагментами, такими как вектор или части вектора. В специфичном, но не ограничивающем аспекте, примером конструкция нуклеотида являются конструкции экспрессии ДНК, подходящие для трансформации клетки-хозяина.
[0065] Термин «олигонуклеотид» (или в качестве синонима «олиго») относится либо к одноцепочечному полидезоксинуклеотиду, либо к двум комплементарным полидезоксинуклеотидным нитям, которые можно синтезировать химически. Такие синтетические олигонуклеотиды могут содержать или не содержать 5'-фосфат. Такие олигонуклеотиды не могут быть лигированы с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата с АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид будет лигироваться с фрагментом, который не был дефосфорилирован. Для достижения амплификации на основе полимеразы (как, например, при помощи ПЦР) упоминается «32-кратно вырожденный олигонуклеотид, который последовательно состоит из по меньшей мере первой гомологичной последовательности, вырожденной последовательности N,N,G/T и второй гомологичной последовательности. В данном контексте «гомологичный» относится к гомологии между олиго и родительским полинуклеотидом, который подвергают амплификации на основе полимеразы.
[0066] В контексте настоящего описания термин «функциональным образом связанный» относится к увязыванию полинуклеотидных элементов в функциональные взаимоотношения. Нуклеиновая кислота «функциональным образом связана», когда она помещена в функциональные взаимоотношения с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер являются функциональным образом связанными с кодирующей последовательностью, если это влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Функциональным образом связанный означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, обычно представляют собой непрерывные последовательности и там, где необходимо соединение двух кодирующих белок областей, являются непрерывными и в рамке считывания.
[0067] Кодирующая последовательность «функционально связана с» другой кодирующей последовательностью, если РНК-полимераза будет транскрибировать две кодирующие последовательности в единую мРНК, которая затем будет транслирована в одиночный полипептид, содержащий аминокислоты, полученные из обеих кодирующих последовательностей. Указанные кодирующие последовательности не должны быть смежными друг с другом, до тех пор, пока экспрессированные последовательности в конечном счете не будут обработаны для получения желаемого белка.
[0068] В контексте настоящего описания термин «набор родительских полинуклеотидов» представляет собой набор, содержащий один или более различных видов полинуклеотидов. Как правило, данный термин применяют по отношению к набору полинуклеотидов потомства, который предпочтительным образом получают при помощи мутагенеза родительского набора, в случае которого термины «родительский», «стартовый» и «матричный» применяют взаимозаменяемо.
[0069] Термин «пациент» или «субъект» относится к животному, например, к млекопитающему, такому как человек, который представляет собой объект лечения. Указанный субъект или пациент может либо мужчиной, либо женщиной.
[0070] В контексте настоящего описания термин «физиологические условия» относится к температуре, pH, осмотическому давлению, ионной силе, вязкости и подобным биохимическим параметрам, которые совместимы с жизнеспособным организмом, и/или которые, как правило, существуют внутриклеточно в жизнеспособной культивируемой дрожжевой клетке или клетке млекопитающего. Например, условия внутри дрожжевой клетки, выращенной в типичных для лабораторного культивирования условиях, представляют собой физиологические условия. Подходящие условия для реакции in vitro для транскрипционных коктейлей in vitro в целом представляют собой физиологические условия. В целом физиологические условия in vitro включают 50-200 мМ NaCl или KCl, pH 6,5-8,5, 20-45 градусов Цельсия и 0,001-10 мМ двухвалентного катиона (например, Mg++, Ca++); предпочтительным образом приблизительно 150 мМ NaCl или KCl, pH 7,2-7,6, 5 мМ двухвалентного катиона, и часто включают 0,01-1,0 процент неспецифического белка (например, бычий сывороточный альбумин (БСА)). Часто может быть представлен неионогенный детергент (Tween, NP-40, Triton Х-100), как правило, от приблизительно 0,001 до 2%, как правило, 0,05-0,2% (об./об.). Конкретные водные условия может выбрать специалист-практик в соответствии с общепринятыми способами. Для общего руководства можно применить следующие буферные водные условия: 10-250 мМ NaCl, 5-50 мМ Tris HC1, pH 5-8 с необязательным добавлением двухвалентного катиона(-нов) и/или хелаторов металлов, и/или неионных детергентов, и/или мембранных фракций, и/или противовспенивающих агентов, и/или сцинтилляторов. Нормальные физиологические условия относятся к условиям температуры, pH, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса и концентрации электролита in vivo у пациента или субъекта в месте введения, или месте действия, которые будут рассматриваться в границах нормального диапазона у пациента.
[0071] В контексте настоящего описания стандартное обозначение (от 5' к 3') описывает последовательности двухцепочечных полинуклеотидов.
[0072] В контексте настоящего описания термин «популяция» означает коллекцию компонентов, таких как полинуклеотиды, участки полинуклеотидов или белки. «Смешанная популяция» означает коллекцию компонентов, которые принадлежат к тому же семейству нуклеиновых кислот или белков (т.е. являются родственными), но которые различаются по своей последовательности (т.е. не являются идентичными) и, следовательно, по своей биологический активности.
[0073] Молекула, имеющая «про-форму», относится к молекуле, которая претерпевает любую комбинацию из одной или более ковалентных и нековалентных химических модификаций (например, гликозилирование, протеолитическое расщепление, димеризация или олигомеризация, индуцированное температурой или pH-индуцированное конформационное изменение, ассоциация с кофактором и т.п.) на пути к достижению более зрелой молекулярной формы, имеющей отличие в свойствах (например, увеличение в активности) по сравнению с про-формой референсной молекулы. Если две или более химических модификаций (например, два протеолитических расщепления или протеолитическое расщепление и дегликозилирование) можно отличить на пути к образованию зрелой молекулы, то референсную молекулу-предшественника можно обозначить термином «пре-про-форма» молекулы.
[0074] В контексте настоящего описания термин «белок» относится к полимеру, в котором мономеры являются аминокислотами и которые соединены вместе через пептидные или дисульфидные связи. «Белок» относится к полноразмерной встречающейся в природе аминокислотной цепи или ее фрагменту, такому как выбранная область полипептида, которая представляет интерес в отношении связывающего взаимодействия, или синтетической аминокислотной цепи, или их комбинации. Таким образом, фрагмент относится к аминокислотной последовательности, которая представляет собой часть полноразмерного белка, длиной от приблизительно 8 до приблизительно 500 аминокислот, предпочтительно от приблизительно 8 до приблизительно 300 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 8 до приблизительно 200 аминокислот и даже еще более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 50 или 100 аминокислот в длину. Кроме того, в состав белков могут быть включены аминокислоты, отличные от встречающихся в природе аминокислот, например, (3-аланин, фенилглицин и гомоаргинин. В настоящем изобретении также можно применять обычно встречающиеся аминокислоты, которые не кодируются геном. Все аминокислоты, применяемые в настоящем изобретении, могут быть либо D-, либо L-оптическими изомерами. D-изомеры предпочтительны для применения в специфичном контексте, дополнительно описанном ниже. Кроме того, другие пептидомиметики также являются подходящими, например, в линкерных последовательностях полипептидов согласно настоящему изобретению (см. Spatola, 1983, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptide and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, Нью-Йорк, p. 267). В целом термин «белок» не предназначен для передачи какого-либо значимого отличия от термина «полипептид», кроме как для включения структур, которые содержат две или более полипептидных цепей, которые совместно удерживаются ковалентными или нековалентными связями.
[0075] В контексте настоящего описания термин «псевдослучайный» относится к набору последовательностей, которые обладают ограниченной вариабельностью, такой как, например, степень изменчивости остатка в другом положении, однако любое псевдослучайное положение допускает некоторую степень вариации остатков, тем не менее ограниченную.
[0076] В контексте настоящего описания термин «квази-повторяющиеся единицы» относится к повторам, реассортацию которых необходимо осуществить и которые по определению не являются идентичными. Действительным образом, указанный способ предлагается не только для практически идентичных кодирующих единиц, полученных посредством мутагенеза идентичной исходной последовательности, но и также для рекомбинации аналогичных или родственных последовательностей, которые могут значимым образом отличаться по некоторым областям. Тем не менее, если указанные последовательности содержат достаточные гомологии, реассортацию которых необходимо осуществить при помощи данного подхода, их можно отнести к «квази-повторяющимися» единицами.
[0077] В контексте настоящего описания термин «библиотека случайных пептидов» относится к набору последовательностей полинуклеотидов, которые кодируют набор случайных пептидов, и набору случайных пептидов, кодируемых этими последовательностями полинуклеотидов, а также белкам слияния, которые содержат эти случайные пептиды.
[0078] В контексте настоящего описания термин «последовательность случайного пептида» относится к аминокислотной последовательности, состоящей из двух или более аминокислотных мономеров и сконструированной при помощи стохастического или случайного процесса. Случайный пептид может содержать мотивы каркасов или подложек, которые могут содержать инвариантные последовательности.
[0079] В контексте настоящего описания термин «рецептор» относится к молекуле, которая обладает сродством к рассматриваемому лиганду. Рецепторы могут представлять собой встречающиеся в природе или синтетические молекулы. Рецепторы можно использовать в неизмененном условии или в виде агрегатов с другими видами молекул. Рецепторы могут быть присоединены ковалентным или нековалентным образом к связывающемуся участнику либо напрямую, либо через специфическое связывающее вещество. Примеры рецепторов включают, но не ограничиваются ими, антитела, включая моноклональные антитела и антисыворотки, взаимодействующие со специфичными антигенными детерминантами (такими как на вирусах, клетках или других материалах), рецепторы клеточных мембран, сложные углеводы и гликопротеины, ферменты и рецепторы гормонов.
[0080] «Рекомбинантные» ферменты относятся к ферментам, получаемым при помощи методов рекомбинантной ДНК, т.е. получаемым из клеток, трансформированных при помощи конструкции экзогенной ДНК, кодирующей желаемый фермент.«Синтетические» ферменты - это те ферменты, которые получают при помощи химического синтеза.
[0081] Термин «родственные полинуклеотиды» означает, что участки или области полинуклеотидов идентичны, а участки или области полинуклеотидов являются гетерологичными.
[0082] В контексте настоящего описания «восстановительная реассортация» относится к увеличению молекулярного разнообразия, которое нарастает в результате делеций (и/или вставок); событий, опосредованных повторяющимися последовательностями.
[0083] Следующие термины применяют для описания взаимоотношений последовательностей между двумя или более полинуклеотидами: «референсная последовательность», «окно сравнения», «идентичность последовательности», «процент идентичности последовательности» и «существенная идентичность».
[0084] «Референсная последовательность» определяет последовательность, применяемую в качестве основы для сравнения последовательностей, референсная последовательность может представлять собой подкласс более крупной последовательности, например, сегмент полноразмерной последовательности кДНК или последовательности гена, предложенной в перечне последовательностей, или может содержать полную последовательность кДНК или гена. В целом длина референсной последовательности составляет по меньшей мере 20 нуклеотидов, зачастую по меньшей мере 25 нуклеотидов и зачастую по меньшей мере 50 нуклеотидов. Поскольку два полинуклеотида могут каждый (1) содержать последовательность (т.е. часть полной последовательности полинуклеотида), которая аналогична двум полинуклеотидам, и (2) могут дополнительно содержать последовательность, которая дивергентна двум полинуклеотидам, сравнение последовательностей между двумя (или более) полинуклеотидами осуществляют путем сравнения последовательностей указанных двух полинуклеотидов в «окне сравнения» для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей.
[0085] «Индекс повторения (RI)» в контексте настоящего описания представляет собой среднее количество копий квази-повторяющихся единиц, содержащихся в векторе клонирования.
[0086] Термин «сайт рестрикции» относится к последовательности распознавания, что необходимо для проявления действия эндонуклеазы рестрикции, и включает сайт каталитического расщепления. Понятно, что сайт расщепления может содержаться или не содержаться в рамках участка сайта рестрикции, которая содержит последовательность с низкой неопределенностью (т.е. последовательность, содержащую основную детерминанту частоты встречаемости указанного сайта рестрикции). Таким образом, во многих случаях соответствующие сайты рестрикции содержат только последовательность с низкой неопределенностью к внутреннему сайту расщепления (например, G/AATTC в сайте EcoR I) или непосредственно соседнему сайту расщепления (например, CCWGG в сайте EcoR II), в других случаях соответствующие эндонуклеазы рестрикции [например, сайт Есо57 I или CTGAAG (16/14)] содержат последовательность с низкой неопределенностью (например, последовательность CTGAAG в сайте Есо57 1) к внешнему сайту расщепления (например, в участке N.sub.16 сайта Есо57 I). Когда говорят, что фермент (например, эндонуклеаза рестрикции) «расщепляет» полинуклеотид, то подразумевают, что указанная эндонуклеаза рестрикции катализирует или способствует расщеплению полинуклеотида.
[0087] В неограничивающем аспекте «отбираемый полинуклеотид» состоит из 5'-концевой области (или конечной области), промежуточной области (т.е. внутренней или центральной области) и 3'-концевой области (или конечной области). В контексте данного аспекта, 5'-концевая область представляет собой область, которая расположена по направлению к 5'-концевой области полинуклеотида (или 5'-концу полинуклеотида); таким образом, она частично или полностью находится на 5'-половинной части полинуклеотида. Аналогичным образом, 3'-концевая область представляет собой область, которая расположена по направлению к 3'-концевой области полинуклеотида (или 3'-концу полинуклеотида); таким образом, она частично или полностью находится на 3'-половинной части полинуклеотида. В контексте данного неограничивающего примера, может быть перекрытие последовательности между любыми двумя областями или даже между всеми тремя областями.
[0088] Термин «идентичность последовательности» означает, что две последовательности полинуклеотидов идентичны (т.е. при сравнении нуклеотид за нуклеотидом) в окне сравнения.
[0089] Термин «процент идентичности последовательности» вычисляют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определяя число положений, в которых идентичная база нуклеиновых кислот (например, A, Т, C, G, U или I) встречается в обеих последовательностях, что позволяет получить число совпадающий положений путем осуществления деления указанного числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. размер окна) и умножая полученный результат на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Эта «существенная идентичность» в контексте настоящего описания обозначает характеристику последовательности полинуклеотидов, где указанный полинуклеотид содержит последовательность с по меньшей мере 80-процентной идентичностью последовательности, предпочтительным образом с по меньшей мере 85-процентной идентичностью, зачастую от 90 до 95-процентой идентичностью последовательностей, и наиболее часто с по меньшей мере 99-процентной идентичностью последовательности по сравнению с референсной последовательностью окна сравнения по меньшей мере 25-50 нуклеотидов, где процент идентичности последовательности вычисляют путем сравнения референсной последовательности с указанной последовательностью полинуклеотидов, которая может содержать делеции или добавления, которые составляют 20% или менее от референсной последовательности по сравнению с окном сравнения.
[0089] Как известно в данной области техники, «сходство» между двумя ферментами определяют путем сравнения аминокислотной последовательности и ее консервативных аминокислотных заместителей одного фермента с последовательностью второго фермента. Сходство можно определить при помощи процедур, которые хорошо известны в данной области техники, например, при помощи программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool в Национальном центре биологической информации).
[0090] Члены пары молекул (например, пара антитело-антиген и пара лиганд-рецептор) называют «специфически связанными» друг с другом, если они связываются друг с другом с большим сродством, чем с другими неспецифичными молекулами. Например, антитело, выработанное против антигена, с которым оно связывается более эффективно, чем с неспецифическим белком, можно описать как специфически связывающееся с антигеном (похожим образом, зонд нуклеиновой кислоты можно описать как специфически связывающийся с мишенью нуклеиновой кислоты, если он образует специфический дуплекс с указанной мишенью посредством взаимодействий при спаривании оснований (см. выше)).
[0091] «Специфическая гибридизация» в настоящем описании определена как образование гибридов между первым полинуклеотидом и вторым полинуклеотидом (например, полинуклеотидом, имеющим отличную, но по существу идентичную с первым полинуклеотидом последовательность), где по существу неродственные последовательности полинуклеотидов не образуют гибридов в указанной смеси.
[0092] Термин «специфичный полинуклеотид» означает полинуклеотид, содержащий определенные конечные точки и имеющий определенную последовательность нуклеиновой кислоты. Два полинуклеотида, в которых один полинуклеотид имеет идентичную последовательность как часть указанного второго полинуклеотида, но содержит разные концы, включают два разных специфичных полинуклеотида.
[0093] «Строгие условия для осуществления гибридизации» означают, что гибридизация будет происходить только в том случае, если имеется по меньшей мере 90% идентичность, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97% идентичность между последовательностями. См. Sambrook и др., Molecular Cloning: лабораторное руководство, 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[0094] В настоящее описание также включены полипептиды, имеющие последовательности, которые «по существу идентичны» последовательности полипептида фермента. «По существу идентичная» аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от референсной последовательности только консервативными аминокислотными заменами, например, заменами одной аминокислоты на другую того же класса (например, замена одной гидрофобной аминокислоты, такой как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другую или замена одной полярной аминокислоты на другую, такая как замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин).
[0095] Кроме того, «по существу идентичная» аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, которая отличается от референсной последовательности или одной или более неконсервативными заменами, делециями или вставками, особенно когда такая замена происходит на сайте, который не является активным сайтом указанной молекулы и при условии, что указанный полипептид по существу сохраняет свои поведенческие свойства. Например, одну или более аминокислот можно удалить из полипептида фермента, что приводит к модификации структуры указанного полипептида без значимого изменения его биологической активности. Например, можно удалить амино- или карбокси-концевые аминокислоты, которые не требуются для ферментативной биологической активности. Такие модификации могут приводить к образованию полипептидов ферментов с меньшей активностью.
[0096] В настоящем описании предложен «по существу чистый фермент». В контексте настоящего описания термин «по существу чистый фермент» описывает молекулу, такую как полипептид (например, полипептид фермента или его фрагмент), которая по существу не содержит других белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот и других биологических материалов, с которыми она естественным образом ассоциирована. Например, по существу чистая молекула, такая как полипептид, может составлять по меньшей мере 60% по сухой массе представляющей интерес молекулы. Степень чистоты указанных полипептидов можно определить с применением стандартных способов, включая, например, электрофорез в полиакриламидном геле (например, ДСН-ПААГ электрофорез), колоночную хроматографию (например, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)) и анализ на определение аминокислотной последовательности с аминоконцом.
[0097] В контексте настоящего описания термин «по существу чистый» означает, что вид объекта является преобладающим присутствующим видом (т.е. на молярной основе он более распространен, чем любые другие отдельные виды макромолекул в композиции), и предпочтительным образом по существу очищенная фракция представляет собой композицию, где указанный вид объекта содержит по меньшей мере приблизительно 50% (по молярной основе) всех присутствующих видов макромолекул. В целом по существу чистая композиция будет содержать более, чем приблизительно 80-90% всех видов макромолекул, присутствующих в указанной композиции. Наиболее предпочтительно, чтобы очистку указанных видов объектов производили до наступления существенной гомогенности (виды загрязняющих веществ могут не обнаруживаться в указанной композиции обычными способами обнаружения), где указанная композиция состоит в основном из одного вида макромолекул. Виды растворителей, малые молекулы (<500 дальтон) и виды элементарных ионов не рассматриваются в качестве видов макромолекул.
[0098] Термин «лечение» включает: (1) предотвращение или задержку появления клинических симптомов статуса, расстройства или состояния, развивающегося у животного, которые могут быть затронуты или предрасположены к статусу, расстройству или состоянию, но еще не испытывает или проявляет клинических или субклинических симптомов статуса, расстройства или состояния; (2) ингибирование статуса, расстройства или состояния (т.е. приостановка, сжижение или задержка развития заболевания или их рецидива в случае поддерживающего лечения по меньшей мере одного их клинического или субклинического симптома); и/или (3) облегчение состояния (т.е. приведение к ремиссии статуса, расстройства или состояния или по меньшей мере одного из их клинических или субклинических симптомов). Эффективность для пациента, получающего лечение, должна быть либо статистически значимой, либо по меньшей мере заметной для пациента или лечащего врача.
[0099] В контексте настоящего описания термин «вариабельный сегмент» относится к части образующегося пептида, которая содержит случайную, псевдослучайную последовательность или определенную последовательность ядра. «Вариабельный сегмент» относится к части образующегося пептида, которая содержит случайную псевдослучайную последовательность или определенную последовательность ядра. Вариабельный сегмент может содержать как вариантные, так и инвариантные положения остатков, и степень вариации остатков в вариантных положениях остатка может быть ограничена: оба варианта выбирают по усмотрению специалиста-практика. Как правило, вариабельные сегменты составляют в длину от приблизительно 5 до 20 аминокислотных остатков (например, от 8 до 10), хотя вариабельные сегменты могут быть длиннее и могут содержать части антител или белки-рецепторы, таких как фрагмент антитела, белок, связывающий нуклеиновую кислоту, белок-рецептор и им подобное.
[0100] Термин «вариант» относится к полинуклеотидам или полипептидам согласно настоящему описанию, модифицированным по одной или более пар оснований, кодонов, интронов, экзонов или аминокислотных остатков (соответственно) родительской молекулы белка дикого типа. Варианты можно получить при помощи любого количества средств, включая такие способы, как, например, ПЦР с внесением ошибок, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР-сборка, мутагенез при помощи ПЦР с имитацией полового размножения, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, повторная сборка генов, насыщающий мутагенез участка гена, и любую их комбинацию. Способы получения вариантов белков, обладающих пониженной активностью по сравнению с белком дикого типа в нормальном физиологическом условии, например, при одном или более из следующих условий: температуры, pH, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса и концентрации электролита, и улучшенной активностью при абберантом условии, раскрытых в настоящем описании. Варианты можно дополнительно выбрать для свойств улучшенной химической устойчивости и протеолитической устойчивости по сравнению с белком дикого типа.
[0101] В контексте настоящего описания термин «дикого типа» означает, что полинуклеотид не содержит никаких мутаций. «Белок дикого типа», «дикого типа белок», «дикого типа биологический белок» или « биологический белок дикого типа» относится к белку, который можно выделить из природы, который будет активен на уровне активности, обнаруживаемой в природе, и будет содержать аминокислотную последовательность, обнаруживаемую в природе. Термины «родительская молекула» и «белок-мишень» также относятся к белку дикого типа.
[0102] Термин «рабочий» как, например, в словосочетании «рабочий образец» - это просто образец, с которым работают. Аналогичным образом, например, «рабочая молекула» представляет собой молекулу, с которой работают.
[0103] Термин «условно активное антитело» относится к варианту или мутанту антитела дикого типа, активность которого выше или ниже, чем у родительского антитела дикого типа при одном или более нормальных физиологических условиях. Это условно активное антитело может проявлять активность в отдельных областях тела и/или может проявлять повышенную активность или пониженную активность при аберрантных или пермиссивных физиологических условиях. В одном аспекте указанное условно активное антитело практически неактивно при нормальном физиологическом условии, однако является активным при других условиях, отличных от нормальных физиологических условий, на уровне, который лучше, чем нормальные физиологические условия. Например, в одном аспекте эволюционированное условно активное антитело может быть практически неактивным при температуре тела, но активным при более низких температурах. В другом аспекте указанное условно активное антитело может быть обратимым или необратимым образом инактивировано при нормальном физиологическом условии. В еще одном аспекте указанное антитело дикого типа представляет собой терапевтическое антитело. В другом аспекте указанное условно активное антитело применяют качестве лекарственного средства или терапевтического агента. В еще одном аспекте активность указанного антитела выше или ниже в крови, высоконасыщенной кислородом, такой как, например, после прохождения через легкие или в среде с более низким pH, присутствующей в почках.
[0104] Термин «антителозависимая опосредованная клетками цитотоксичность» или «АЗЦТ» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый иммуноглобулин, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствует на определенных цитотоксических клетках (например, природных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), что позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфическим образом связываться с антигенсодержащей клеткой-мишенью и впоследствии вызывать гибель клетки-мишени при помощи цитотоксинов. Лиганд-специфичные высокоаффинные IgG антитела, направленные к поверхности клеток-мишеней, стимулируют указанные цитотоксические клетки и являются необходимыми для такой гибели. Лизис указанной клетки-мишени является внеклеточным, требует непосредственного контакта между клетками и не включает комплемент.
[0105] Можно исследовать способность любого конкретного антитела опосредовать лизис указанной клетки-мишени посредством АЗЦТ. Для оценки активности АЗЦТ представляющее интерес антитело добавляют к клеткам-мишеням, отображающим лиганд-мишень в комбинации с иммунными эффекторными клетками, которые можно активировать при помощи комплексов вида антиген-антитело, что тем самым приводит к цитолизу указанной клетки-мишени. Цитолиз в целом обнаруживают путем высвобождения метки (например, радиоактивных субстратов, флуоресцентных красителей или естественных внутриклеточных белков) из лизированных клеток. Подходящие эффекторные клетки для таких исследований включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки-киллеры (NK). Конкретные примеры исследований АЗЦТ in vitro описаны у Bruggemann и др., 1987, J. Exp. Med., vol. 166, стр. 1351; Wilkinson и др., 2001, J. Immunol. Methods, vol. 258, p. 183; Patel и др., 1995 J. Immunol. Methods, vol. 184, p. 29. Альтернативным или дополнительным образом активность АЗЦТ представляющего интерес антитела можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как раскрытой у Clynes и др., 1998, PNAS USA, vol. 95, p. 652.
[0106] Термины «рак» и «раковые» относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих или описывают их, которые обычно характеризуются нерегулируемым ростом клеток/пролиферацией. «Опухоль» включает одну или более раковых клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию или лимфоидные злокачественные опухоли. Более конкретные примеры таких раков включают плоскоклеточный рак (например, плоскоклеточный рак эпителия), рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого («NSCLC»), аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный, рака желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак груди, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек или почечный почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, анальную карциному, карцинома полового члена, а также рак головы и шеи.
[0107] Термин «мультиспецифическое антитело» в контексте настоящего описания представляет собой антитело, обладающее специфичностями связывания для по меньшей мере двух различных эпитопов. Типичные мультиспецифические антитела могут связываться как с BBB-R, так и антигеном мозга. Мультиспецифические антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab')2-биспецифичные антитела). Также подразумеваются сконструированные антитела, содержащие сайты связывания с двумя, тремя или более (например, четырьмя) функциональными антигенами (см., например, US 2002/0004587 A1). Мультиспецифические антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.
[0108] Термин «полноразмерное антитело» относится к антителу, которое содержит антигенсвязывающую вариабельную область (VH или VL), а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Указанные константные домены могут быть постоянными доменами нативной последовательности (например, константные домены нативной последовательности человека) или их вариантами аминокислотной последовательности.
[0109] В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей полноразмерные антитела можно отнести к различным «классам». Существует пять основных классов полноразмерных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно также разделить на «подклассы» (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно.
[0110] В контексте настоящего описания термин «библиотека» относится к коллекции белков в одном пуле. Библиотеку согласно настоящему изобретению предпочтительным образом получают с применением технологии рекомбинантной ДНК. Например, коллекцию кДНК или любых других кодирующих белок ДНК можно вставить в вектор экспрессии для получения белка библиотеки. Указанный вектор экспрессии можно выбрать из плазмид, космид, искусственных хромосом и векторов вирусной экспрессии. Коллекцию кДНК или кодирующих белок ДНК также можно вставить в фаговый геном для создания библиотеки бактериофагового дисплея белков дикого типа. Коллекцию кДНК можно получить из выбранной популяции клеток или образца ткани, например, при помощи способов, раскрытых Sambrook и др. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Коллекции кДНК из выбранных типов клеток также коммерчески доступны от таких поставщиков, как Stratagene®. В контексте настоящего описания библиотека белков дикого типа не является коллекцией биологических образцов.
[0111] В контексте настоящего описания термин «рекомбинантное антитело» относится к антителу (например, химерному, гуманизированному или антителу человека или его антигенсвязывающему фрагменту), которое экспрессируется рекомбинантной клеткой-хозяином, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антитело. Примеры «клеток-хозяев» для получения рекомбинантных антител включают: (1) клетки млекопитающих, например, клетки яичника китайского хомячка (CHO), COS, клетки миеломы (включая клетки Y0 и NS0), клетки почек детеныша хомяка (BHK), Hela и Vero клетки; (2) клетки насекомых, например sf9, sf21 и Tn5; (3) растительные клетки, например, растений, принадлежащие к роду Nicotiana (например, Nicotiana tabacum); (4) клетки дрожжей, например, тех, которые принадлежат к роду Saccharomyces (например, Saccharomyces cerevisiae) или роду Aspergillus (например, Aspergillus niger); (5) бактериальные клетки, например клетки Escherichia coli или клетки Bacillus subtilis и т.д.
[0112] «Индивидуум» или «субъект» является млекопитающим. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и не являющиеся человеком приматы, такие как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах реализации индивидуум или субъект является человеком.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0113] Настоящее описание относится к способам конструирования или эволюционирования белков для образования новых молекул, которые обратимым или необратимым образом инактивированы при условиях дикого типа, но являются активными в ненормальных условиях на том же или эквивалентном уровне, что и при условиях дикого типа. Эти новые белки упоминаются в настоящем описании как условно активные биологические белки. Эти условно активные биологические белки и способы получения этих белков описаны в US 2012/0164127. Условно активные биологические белки являются особенно ценными для разработки новых терапевтических средств, которые активны в течение коротких или ограниченных периодов времени внутри хозяина. Это особенно ценно тогда, когда длительное воздействие указанного белка при данной дозе будет неблагоприятным для хозяина и когда требуется ограниченная активность для проведения желаемой терапии. Примеры эффективных применений включают местное или системное лечение в высоких дозах, а также локализованные средства для лечения в высокой концентрации. Инактивацию при физиологическом условии можно определить посредством комбинации дозирования и скорости инактивации указанного белка. Эта инактивация, основанная на условии, особенно важна для содержащих ферменты терапевтических средств, когда каталитическая активность вызывает значительные негативные воздействия за относительно короткий период времени.
[0114] Настоящее описание также относится к способам конструирования или эволюционирования белков для получения новых молекул, которые отличаются от молекул дикого типа тем, что они обратимым или необратимым образом активируются или инактивируются в динамике, или активируются или инактивируются только при нахождении в определенных микроокружениях тела, включая определенные органы тела (такие как мочевой пузырь или почка). В некоторых вариантах реализации условно активные биологические белки являются антителами против одного или более белков-мишеней, описанных в настоящем описании.
[0115] Белки-мишени дикого типа
[0116] Любой терапевтический белок может служить в качестве белка-мишени или белка дикого типа для получения условно активного биологического белка. В одном аспекте указанный белок-мишень представляет собой фермент дикого типа. Используемые в настоящее время терапевтические ферменты включают урокиназу и стрептокиназу, применяемые при лечении сгустков крови, и гиалуронидазу, применяемую в качестве адъюванта для улучшения абсорбции и дисперсии других лекарственных средств; в одном аспекте указанный белок дикого типа, выбранный для получения условно активного биологического белка, можно применять в настоящее время в качестве терапевтического фермента для того, чтобы избежать или минимизировать вредные побочные эффекты, связанные с белком или ферментом дикого типа. В альтернативном варианте фермент, который в настоящее время не применяют в качестве терапевтического средства, можно выбрать для получения условно активного биологического белка. Определенные неограничивающие примеры будут рассмотрены более подробно ниже.
[0117] Терапевтические белки - это те белки, которые можно применять в медицине либо самостоятельно, либо совместно с другими препаратами для лечения различных заболеваний или медицинских состояний. Условно активные биологические белки согласно настоящему описанию могут быть подходящими для применения при одном или более показаниях, включая лечение нарушений кровообращения, артрита, рассеянного склероза, аутоиммунных заболеваний, рака, дерматологических состояний и применения в различных диагностических форматах. В зависимости от белка и показаний указанный условно активный белок биологического фермента можно вводить в составах для парентерального, местного или перорального применения, обсуждаемых ниже.
[0118] Нарушения кровообращения - тромбоз и тромболитическая терапия
[0119] Тромб (сгустки крови) определяют как твердую массу, получаемую из компонентов крови, которые образуются в системе кровообращения. Тромб образуется в результате серии событий, включающих факторы свертывания крови, тромбоциты, эритроциты и взаимодействия со стенкой сосуда. Тромбоцит представляет собой внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов, фибрина и захваченных клеток крови, которая может вызывать непроходимость сосудов. Препятствуя или блокируя кровоток, тромб лишает расположенной ниже ткани подачи кислорода. Фрагменты (эмболы) тромба могут разрываться и мешать меньшим по размеру сосудам. Образование артериального тромба провоцируется любым из множества факторов, включая первичный стеноз-атеросклероз, функцию сердечно-сосудистого заболевания с низким течением, гиперкоагуляцию, как, например, при раке, или недостаточность коагуляционного фактора, или инородное тело, такое как стент или катетер. Тромб, приводящий к артериальной ишемии, может обуславливать травмы конечностей или тканей, острый инфаркт миокарда (ОИМ), инсульт, ампутации или инфаркт кишечника. Основными причинами заболеваемости и смертности являются образование артериальных тромбов (тромбов в коронарных артериях и тромбов в церебральных артериях) и легочных тромбов. Образование венозного тромба может происходить вследствие повреждения эндотелия, такого как травма, застоя, вызванного, например, неподвижностью, или гиперкоагуляции, однако атеросклероз не является фактором. Стратегии лечения включают механическую тромбэктомию, фармакомеханическую тромбэктомию и тромболизис. Тромботическую терапию применяют для сведения к минимуму образования и помощи в удалении тромбов.
[0120] Тромботическая терапия включает применение антитромбоцитарных агентов, которые ингибируют активацию тромбоцитов, антикоагулянтных препаратов и/или тромболитическую терапию для разложения сгустков крови. Примеры антитромбоцитарных агентов включают аспирин, дипиридамол и тиклопидин. Примеры антикоагулянтов включают гепарин, варфарин, гирудин и активированный человеческий белок C. Примеры тромболитиков включают тканевый активатор плазминогена (tPA)/варианты tPA, урокиназу и стрептокиназу. Тромболитики проявляют каталитический способ действия.
[0121] Хорошо налажена тромболитическая терапия при остром инфаркте миокарда. Применение тромболитических агентов стало стандартным средством при оказании экстренной помощи. Хотя они и эффективны, эти продукты достигают полной реперфузии только у 50% пациентов, а побочные эффекты включают риск кровотечения (в частности, внутричерепное кровотечение), а также гипертонию. Разложение сгустков крови из поврежденного или больного сосуда называется «фибринолиз» или «фибринолитический процесс». Фибринолиз является протеолитическим процессом, осуществляемым посредством активатора плазминогена, который активирует белок плазминоген, тем самым образуя плазмин. Плазмин протеолитическим образом разлагает фибриновые нити сгустка крови, растворяя указанный сгусток. Фибрин-специфические активаторы плазминогена включают тканевые активаторы плазминогена или варианты. Неспецифические активаторы плазминогена могут включать стрептокиназу и урокиназу.
[0122] В некоторых распространенных тромболитических препаратах используется один из нескольких доступных вариантов тканевого активатора плазминогена (tPA). Например, варианты продукта на основе tPA, которые ранее были одобрены для применения, это Alteplase (rt-PA), Reteplase (r-PA) и Tenecteplase (TNK). Одобренные применения для вариантов tPA включают, например, острый инфаркт миокарда для улучшения функции желудочков после ОИМ, снижение частоты застойной сердечной недостаточности и снижение смертности, связанной с ОИМ, регулирование ишемического инсульта у взрослых для улучшения неврологического восстановления и сокращение случаев инвалидности, регулирование острой массивной эмболии легких у взрослых для лизиса острой эмболии легких и для лизиса эмбол легких, сопровождающегося нестабильной гемодинамикой.
[0123] При другой широко применяемой тромболитической терапии используют урокиназу. Урокиназа является стандартным литическим агентом, применяемым при регулировании заболеваний периферических сосудов.
[0124] Стрептокиназа представляет собой белок, секретируемый несколькими видами стрептококков, который может связывать и активировать плазминоген человека. Комплексы стрептокиназы с плазминогеном человека могут гидролитическим образом активировать другой несвязанный плазминоген путем активации посредством расщепления связи с образованием плазмина. Обычная активация плазминогена происходит посредством протеолиза связи Arg561-Val562. Затем аминогруппа Val562 образует солевой мостик с Asp740, что приводит к конформационному изменению с образованием активной протеазы плазмина. Плазмин образуется в крови для разрушения фибрина, основного составляющего сгустков крови.
[0125] Стрептокиназу применяют в качестве эффективного лекарственного препарата для растворения сгустков при некоторых случаях инфаркта миокарда (сердечный приступ), эмболии легких (сгустки крови в легких) и глубокого венозного тромбоза (сгустки крови в ногах). Стрептокиназа относится к группе лекарственных препаратов, называемых фибринолитиками. Стрептокиназу назначают как можно скорее после начала сердечного приступа, чтобы растворить сгустки в артериях сердечной стенки и уменьшить повреждение сердечной мышцы. Стрептокиназа является бактериальным продуктом, поэтому организм обладает способностью создавать иммунитет против указанного белка. Поэтому рекомендуется, чтобы данный продукт не назначали повторно через четыре дня после первого введения, так как он может быть не столь эффективным и вызывать аллергическую реакцию. По этой причине его обычно назначают только после первого сердечного приступа, а дальнейшие тромботические явления обычно лечат тканевым активатором плазминогена (TPA). Стрептокиназу также иногда применяют для предотвращения образования послеоперационных спаек.
[0126] Побочные эффекты от действия стрептокиназы включают кровотечение (основные и незначительные), гипотонию и угнетение функции дыхания, а также возможную аллергическую реакцию. Кроме того, антикоагулянты, агенты, которые изменяют функцию тромбоцитов (например, аспирин, другие НПВП, дипиридамол), могут увеличить риск кровотечения.
[0127] Введение тромболитиков в целом осуществляют при помощи инфузии или путем болюсной внутривенной дозы, или при помощи механической системы для инфузии. Побочные эффекты могут включать серьезные внутричерепные, желудочно-кишечные, забрюшинные или перикардиальные кровотечения. Если происходит кровотечение, введение следует немедленно прекратить.
[0128] В определенных вариантах реализации настоящего описания tPA, стрептокиназу или урокиназу выбирают в качестве мишени или белка дикого типа.
[0129] В одном варианте реализации способы согласно настоящему описанию применяют для выбора варианта условно активной рекомбинантной или синтетической стрептокиназы с высокой активностью при аберрантных температурных условиях ниже нормальных физиологических условий и существенной дезактивацией или инактивацией при нормальном физиологическом условии (например, 37 градусах Цельсия). В одном аспекте указанное аберрантное температурное условие представляет собой комнатную температуру, например, 20-25 градусов Цельсия. В другом аспекте настоящего описания предложен способ лечения инсульта или сердечного приступа, причем указанный способ включает введение высокой дозы варианта условно активной стрептокиназы для пострадавших от инсульта или сердечного приступа с целью очистки сгустков и в тоже время для того, чтобы обеспечить быструю инактивацию указанного варианта стрептокиназы во избежание чрезмерного кровотечения.
[0130] Нарушения кровообращения - Ренин/Ангиотензин
[0131] Ренин-ангиотензиновая система представляет собой гормональную систему, которая регулирует кровяное давление и баланс воды (жидкости). Почки секретируют ренин при низком объеме крови. Ренин представляет собой фермент, который гидролизует ангиотензиноген, секретируемый печенью, в пептид ангиотензина I. Ангиотензин I далее расщепляется в легких при помощи связанного с эндотелием ангиотензинпревращающего фермента (ACE) в ангиотензин II, наиболее вазоактивный пептид. Ангиотензин II вызывает сокращение кровяных сосудов, что приводит к увеличению кровяного давления. Однако ангиотензин к также стимулирует секрецию гормона альдостерона из коры надпочечников. Альдостерон вызывает увеличение резорбции натрия и воды канальцами почек. Это увеличивает объем жидкости в организме, что также увеличивает кровяное давление. Повышенная активность ренин-ангиотензиновой системы приводит к вазоконстрикции и удерживанию натрия и воды. Эти эффекты приводят к гипертонии. Существует много лекарственных средств, которые препятствуют протеканию различных стадий в этой системе для снижения артериального давления. Эти лекарственные средства являются одним из основных способов контроля за высоким кровяным давлением (гипертонией), сердечной недостаточностью, почечной недостаточностью и неблагоприятными эффектами диабета.
[0132] Гиповолемический шок - это неотложное состояние, при котором сильная потери крови и/или жидкости делает сердце неспособным адекватно перфузировать клетки организма оксигенированным кислородом. Потеря крови может быть вызвана травмой, повреждениями и внутренним кровотечением. Количество циркулирующей крови может падать вследствие чрезмерной потери жидкости в результате ожогов, диареи, чрезмерного потоотделения или рвоты. Симптомы гиповолемического шока включают беспокойство, холодную липкую кожу, спутанность сознания, учащенное дыхание или бессознательное состояние. Исследование показывает признаки шока, включая низкое кровяное давление, низкую температуру тела и учащенный пульс, который может быть слабым или нитевидным. Средство для лечения включает внутривенные жидкости; кровь или продукты крови; лечение шока и лекарственные препараты, такие как допамин, добутамин, адреналин и норадреналин для повышения уровня артериального давления и объемной скорости кровотока сердца.
[0133] В одном варианте реализации настоящего описания предложен способ отбора условно активного рекомбинантного варианта ренина для обратимой дезактивации при нормальной физиологической температуре, но реактивации при аберрантных низких температурах у пациента с гиповолемическим шоком. Условно активный белок можно применять для лечения гиповолемического шока, чтобы способствовать увеличению объема жидкости в организме и увеличению кровяного давления.
[0134] Нарушения кровообращения - феномен Рейно
[0135] Феномен Рейно (ФР) - это вазоспастическое расстройство, вызывающее обесцвечивание пальцев рук, ног и иногда других конечностей. Эмоциональный стресс и холод являются классическими тригерными для указанного феномена факторами. При воздействии холодных температур конечности теряют тепло. Обычно для того, чтобы сохранить внутреннюю температуру тела, происходит замедление кровоснабжения пальцев рук и ног. Поток крови уменьшается за счет сужения мелких артерий под кожей конечностей. Стресс вызывает аналогичную реакцию на холод в организме. При феномене Ли Рейно происходит усиление нормального ответа. Указанное состояние может вызвать боль, обесцвечивание и ощущение холода и онемению. Феномен является результатом вазоспазмов, которые уменьшают кровоснабжение соответствующих областей; при заболевании Рейно (первичный феномен Рейно) указанное заболевание является идиопатическим. Синдром Ли Рейно (вторичный феномен Рейно) - это феномен, который вызывается каким-то другим инициирующим фактором. Измерение градиентов температуры рук представляет собой один из инструментов для различения первичной и вторичной форм. Первичная форма может прогрессировать до вторичной формы и в крайних случаях вторичная форма может прогрессировать до некроза или гангрены кончиков пальцев.
[0136] Феномен Рейно представляет собой усиление ответов на холод или эмоциональный стресс. Первичный ФР по существу опосредуется вазоспазмом микрососудов. Гиперактивация симпатической системы вызывает выраженную вазоконстрикцию периферических кровяных сосудов, что тем самым приводит к гипоксии. Хронические повторяющиеся случаи могут привести к атрофии кожи, подкожной клетчатки и мышц. Это также может редко приводить к образованию язвы и ишемической гангрене.
[0137] Традиционные варианты лечения феномена Рейно включают лекарственные средства, отпускаемые по рецепту, которые расширяют кровеносные сосуды и способствуют кровообращению. К ним относятся блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедипин или дилтиазем; альфа-блокаторы, которые противодействуют действию норадреналина, гормона, который обеспечивает сокращение кровеносных сосудов, такие как празозин или доксазозин; и сосудорасширяющие средства для расслабления кровеносных сосудов, такие как нитроглицериновый крем или ингибитор ангиотензина II лозартан, силденафил или простагландины. Флуоксетин, селективный ингибитор обратного захвата серотонина, и другие лекарственные препараты антидепрессантов могут снижать частоту и тяжесть эпизодов вследствие психологических стрессоров. Эти лекарственные средства могут вызывать побочные эффекты, такие как головную боль, покраснение и отек лодыжки. Лекарственное средство также может терять эффективность с течением времени.
[0138] Регуляция кожной вазоконстрикции и вазодилатации включает в себя измененную активность симпатического нерва и ряд регуляторов нейронов, включая адренергические и неадренергические, а также передачу сигнала REDOX и другие сигналы, такие как путь RhoA/ROCK. Предполагается, что вазоконстрикция гладкомышечных клеток сосудов (vSMC) в коже активируется посредством норадреналина, опосредованного альфа- и альфа-2-адренорецепторами. Alpha2C-ARs транслоцируется из транс-Гольджи на клеточной поверхности vSMC, где происходит их ответ на стимуляцию, и передача сигнала этих ответов включает сигнальный путь RhoA/Rhokinase (ROCK). Холодная стимуляция в кожных артериях приводит к мгновенной генерации активных форм кислорода (ROS) в митохондриях vSMC. ROS участвуют в передаче сигналов REDOX посредством RhoA/ROCK-пути. RhoA представляет собой GTP-связывающий белком, роль которого заключается в регуляции зависимых от актин-миозина процессов, таких как миграция и сокращение клеток в vSMC. Неадренергические нейропептиды с известной функцией в сосудистой сети с возможным участием в ФР включают связанный с геном кальцитонина пептид (CGRP), вещество Р (SP), нейропептид Y (NPY) и вазоактивный интестинальный пептид (VIP). Fonseca и др., 2009, «Neuronal regulators and vascular dysfunction in Raynaud’s phenomenon and systemic sclerosis», Curr. Vascul. Pharmacol. 7: 34-39.
[0139] Новые препараты для ФР включают блокаторы альфа-2 с адренергических рецепторов, ингибиторы протеинтирозинкиназы, ингибиторы Rho-киназы и пептид, связанный с геном кальцитонина.
[0140] Связанный с геном кальцитонина пептид (CGRP) является членом семейства пептидов кальцитонина и существует в двух формах; альфа-CGRP и бета-CGRP. Альфа-CGRP представляет собой состоящий из 37 аминокислот пептид, образуемый при альтернативном сплайсинге кальцитонин/CGRP-гена. CGRP является одним из наиболее распространенных пептидов, образуемого периферическими и центральными нейронами. Он является эффективным пептидным вазодилататором и может функционировать при передаче боли. Мигрень является распространенным неврологическим расстройством, которое ассоциируют с увеличением уровней CGRP. CGRP расширяет внутричерепные кровеносные сосуды и передает сосудистую ноцицепцию. Антагонисты рецепторов CGRP были исследованы в качестве средств для лечения мигрени. Arulmani и др., 2004, «Calcitonin gene-related peptide and it role in migraine pathophysiology», Eur. J. Pharmacol. 500(1-3): 315-330. Идентифицировали по меньшей мере три подтипа рецепторов, и CGRP действует посредством рецепторов, связанных с белком G, чье присутствие и изменение функции модулирует эффект пептида в различных тканях. Трансдукция сигнала CGRP через указанные рецепторы зависит от двух дополнительных белков: модифицирующего активность рецептора белка 1 (RAMP1) и белка компонента рецептора (RCP). Ghatta 2004, Calcitonin gene-related peptide: understanding its role. Indian J. Pharmacol. 36(5): 277-283. Исследовали воздействие внутривенной инфузии трех сосудорасширяющих средств: эндотелийзависимого вазодилататора аденозинтрифосфата (АТФ), эндотелий-независимого вазодилататора простациклина (эпопростенол, PGI2) и CGRP на пациентов с феноменом Рейно, и пациенты аналогичного возраста и пола при сопоставлении с контрольными с применением лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) показали индуцируемые CGRP приливы крови к лицу и рукам посредством повышения кровотока в коже у пациентов с феноменом Рейно, тогда как в контроле CGRP вызывал прилив крови только к лицу. PGI2 вызывал аналогичные увеличения кровотока рук и лица обеих групп. АТФ не вызывал никаких значимых изменений кровотока рук или лица пациентов, однако увеличивал кровоток лица в контрольной группе. Shawket et al., 1989, «Selective suprasensitivity to calcitonin-gene-related peptide in the hands in Reynaud's phenomenon». The Lancet, 334(8676): 1354-1357. В одном аспекте молекула белка-мишени дикого типа представляет собой CGRP.
[0141] В одном варианте реализации настоящего описания предложены способы отбора вариантов условно активных рекомбинантных белков, ассоциированных с синдромом Рейно, которые обратимым образом дезактивируются при нормальной физиологической температуре, однако повторно активируются при аберрантных пониженных температурах в пальцах. Условно активные белки можно применять для лечения феномена Рейно, для предотвращения или уменьшения потери функции пальцев вследствие низкой циркуляции.
[0142] Нарушения кровообращения - вазопрессин
[0143] Аргинин-вазопрессин (AVP, вазопрессин, антидиуретический гормон (ADH)) представляет собой пептидный гормон, обнаруживаемый у большинства млекопитающих, который контролирует реабсорбцию молекул в канальцах почек, тем самым влияя на проницаемость тканей. Одной из важнейших ролей вазопрессина является регулирование удержания воды в организме. В высоких концентрациях он повышает кровяное давление путем введения умеренной вазоконстрикции. Вазопрессин обладает тремя эффекта, которые приводят к увеличенной осмоляльности мочи (повышенная концентрация) и пониженному выделения воды. Во-первых, вазопрессин вызывает увеличение проницаемости клеток собирательных трубочек в почках для воды, что обеспечивает резорбцию воды и выведение меньшего объема концентрированной мочи (антидиуриз). Это происходит посредством внедрения аквапорин-2 водных каналов в апикальную мембрану клеток собирательных трубочек. Во-вторых, вазопрессин вызывает увеличение проницаемости внутреннего медуллярного участка собирательных трубочек для мочевины, способствуя повышенной реабсорбции мочевины в медуллярном интерстиции. В-третьих, вазопрессин вызывает стимуляцию реабсорбции натрия и хлора в толстых восходящих ветвях петли Heme за счет увеличения активности Na+-K+-2Cl''-котранспортера. Реабсорбция NaCl стимулирует процесс противоточного умножения, который обеспечивает осмотический градиент для опосредованной аквапоринами реабсорбции воды в медуллярных собирательных трубочках.
[0144] Гипертоническая интерстициальная жидкость, окружающая собирательные трубочки почек, обеспечивает высокое осмотическое давление для удаления воды. Трансмембранные каналы, состоящие из белков, называемых аквапоринами, встраиваются в плазматическую мембрану, значительно увеличивая ее проницаемость для воды. При открытии аквапориновый канал в каждую секунду обеспечивает пропуск 3 миллиардов молекул воды. Встраивание каналов аквапоринов-2 требует передачи сигнала посредством вазопрессина. Вазопрессин связывается с рецепторами (называемыми V2-рецепторами) на базолатеральной поверхности клеток собирательных трубочек. Связывание гормона запускает механизм повышения уровня цАМФ в клетке. Этот «второй мессенджер» инициирует цепочку событий, которая завершается встраиванием каналов аквапоринов-2 в апикальную поверхность клеток собирательных трубочек. Аквапорины способствуют перемещению воды из нефронов, увеличивая количество воды, повторно адсорбированной из образующейся мочи обратно в кровоток.
[0145] Основным стимулом для высвобождения вазопрессина из гипофиза является повышенная осмоляльность плазмы крови. Все, что обезвоживает организм, как, например, потоотделение, сильно повышает осмотическое давление крови и активирует связывание вазопрессина с V2-рецептором для активации пути аквапоринов-2. В результате, всего 0,5 литра мочи в день может оставаться от первоначальных 180 литров в день почечного фильтрата. Концентрация солей в моче может достигать в четыре раза превышать концентрацию в крови. В случае чрезмерного разбавления крови, как это происходит при выпивании большого количества воды, секреция вазопрессина ингибируется, а каналы аквапоринов-2 возвращаются обратно в клетку посредством эндоцитоза. В результате образуется большой объем водянистой мочи со концентрацией соли, составляющией всего лишь одну четверть от концентрации в крови.
[0146] Сниженное высвобождение вазопрессина или пониженная почечная чувствительность к AVP приводит к несахарному диабету, состоянию, характерному для гипернатриемии (повышенная концентрация натрия в крови), полиурии (избыточное образование мочи) и полидипсии (жажда).
[0147] Высокие уровни секреции AVP (синдром неадекватной секреции антидиуретического гормона, SIADH) и возникающая в результате гипонатриемия (низкие уровни натрия в крови) возникают при заболеваниях мозга и состояниях легких (мелкоклеточная карцинома легких). В периоперационный период эффекты хирургического стресса и некоторых широко применяемых лекарственных препаратов (например, опиатов, синоцинонов, антиэмиттиков) приводят к аналогичному состоянию избыточной секреции вазопрессина. Это может привести к умеренной гипонатриемии в течение нескольких дней.
[0148] Агонистов вазопрессина терапевтическим образом применяют в различных условиях, а его синтетический аналог длительного действия десмопрессин применяют в условиях, характерных для низкой секреции вазопрессина, а также для контроля кровотечения (при некоторых формах заболевания фон Виллебранда) и в экстренных случаях ночного недержания мочи у детей. Терлипрессин и родственные аналоги применяют в качестве вазоконстрикторов при определенных условиях. Инфузию вазопрессина применяют в качестве второй линии регулирования у пациентов с септическим шоком, не реагирующих на высокую дозу инотропов (например, допамин или норадреналин). Антагонист рецептора вазопрессина является агентом, который препятствует действию рецепторов вазопрессина. Их можно применять при лечении гипонатриемии.
[0149] В одном варианте реализации настоящего описания предложены способы отбора условно активных биологических рекомбинантньгх или синтетических белковых вариантов белков, участвующих в ответе вазопрессина, которые обратимым образом дезактивируются при нормальном физиологическом осмотическом давлении, однако реактивируются при аберрантном осмотическом давлении в крови. В другом варианте реализации варианты белков, участвующих в ответе вазопрессина, активируются в условиях гипонатриемии, однако инактивируются при нормальной концентрации натрия в сыворотке. В одном аспекте условиями гипонатриемии являются те условия, при которых концентрация натрия сыворотки <135 мЭкв/л.
[0150] Ангиостатин и рак
[0151] Ангиостатин представляет собой встречающийся в природе у нескольких видов животных белок. Он действует как эндогенный ингибитор ангиогенеза (т.е. он блокирует рост новых кровеносных сосудов). Ангиостатин способен подавлять рост опухолевых клеток и метастаз посредством ингибирования пролиферации и миграции эндотелиальных клеток. Ангиостатин представляет собой 38 кД фрагмент плазмина (который сам по себе является фрагментом плазминогена). Ангиостатин содержит 1-3 крингла (kringle) плазминогена. Ангиостатин образуется, например, путем аутолитического расщепления плазминогена, включая восстановление внеклеточной дисульфидной связи при помощи фосфоглицераткиназы. Ангиостатин также можно отщепить от плазминогена при помощи различных матричных металлопротеиназ (ММР), включая ММР2, ММР 12 и ММР9, и сериновых протеаз (нейтрофильная эластаза, простат-специфический антиген (PSA)). Ангиостатин in vivo ингибирует рост опухоли и сохраняет экспериментальные метастазы в состоянии покоя. Уровень ангиостатина повышен у животных с первичными опухолями и другими воспалительными и дегенеративными заболеваниями.
[0152] Известно, что ангиостатин связывает множество белков, включая ангиомотины и АТФ-синтазу поверхности эндотелиальных клеток, однако также интегрины, аннексии II, рецептор C-met, NG2-протеогликаны, тканевый активатор плазминогена, хондроитинсульфат-гликопротеины и CD26. Одно исследование показывает, что ИЛ-12, ТН1 цитокин с эффективной антиангиогенной активностью, является медиатором активности ангиостатина. Albin, J. Translational Medicine, 4 января 2009 г., 7:5. Ангиостатин связывает и ингибирует АТФ-синтазу на поверхности эндотелиальных клеток. АТФ-синтаза также встречается на поверхности различных раковых клеток. Было обнаружено, что АТФ-синтаза поверхности опухолевых клеток более активна при низком внеклеточном pH, признаке микроокружения опухоли. Было обнаружено, что ангиостатин воздействует на активность АТФ-синтазы поверхности опухолевых клеток при кислотном внеклеточном pH (pHe). При низком внеклеточном pH ангиостатин непосредственным образом являлся противоопухолевым. При низком значении pH ангиостатин и антитело против бета-субъединицы индуцируют внутриклеточное подкисление раковых клеток A549, а также непосредственную токсичность, которая отсутствует в опухолевых клетках с низким уровнем внеклеточной АТФ-синтазы. Было высказано предположение, что механизм цитотоксичности опухоли зависит от дерегулирования pH внутри клетки вследствие ингибирования АТФ-синтазы поверхности клеток. Chi and Pizzo, «Angiostatin is directly cytotoxic to tumor cells at low extracellular pH: a mechanism dependent on cell surface-associated ATP synthase», Cancer Res., 2006, 66(2): 875-82.
[0153] В одном варианте реализации предложен способ идентификации варианта условно активного ангиостатина, который менее активен, чем ангиостат дикого типа при нормальном физиологическом значении pH крови, но проявляет улучшенную активность при низком pH. Низкий pH определяют как pH ниже нормального физиологического pH. В одном аспекте низкий pH составляет менее, чем приблизительно 7,2. В конкретном аспекте низкий pH составляет приблизительно 6,7.
[0154] В одном аспекте вариант условно активного ангиостатина можно приготовливать и использовать в качестве противоопухолевого агента.
[0155] Улучшение проницаемости тканей - гиалуронидаза
[0156] Гиалуронидазы представляют собой семейство ферментов, которые разлагают гиалуроновую кислоту. Катализируя разложение гиалуроновой кислоты, основного составляющего интерстициального барьера, гиалуронидаза снижает вязкость гиалуроновой кислоты, тем самым увеличивая проницаемость тканей. Ее применяют в медицине в сочетании с лекарственными средствами для ускорения их дисперсии и доставки. Наиболее распространено ее использование в офтальмохирургии, где ее применяют в комбинации с местными анестетиками. Гиалуронидаза, полученная из животных, включает Hydase™ (PrimaPharm Inc, Akorn me), Vitrase (ISTA Pharmaceuticals) и Amphadase (Amphastar Pharmaceuticals). В настоящее время рекомбинантная гиалуронидаза человека одобрена в качестве адъюванта для увеличения абсорбции других лекарственных средств; гиподермоциклиса (подкожная инфузия жидкостей); как дополнение к подкожной урографии для улучшения резорбции радиоактивных агентов (Hylenex, Halozyme Therapeutics, Inc., Baxter Healthcare Corp.). В одном варианте реализации гиалуронидаза может служить белком дикого типа (исходной молекулой) для получения условно активного биологического белка. Гиалуронидазы могут играть роль в метастазировании рака и, возможно, в ангиогенезе, поэтому чрезмерное воздействие этих ферментов может быть неблагоприятным, в одном аспекте условно активный биологический белок гиалуронидазы будет необратимым или обратимым образом инактивироваться при нормальной физиологической температуре, однако он будет активен на уровне, равном или превышающем уровень гиалуронидазы дикого типа в определенном диапазоне температур, которые меньше, чем диапазон нормальной физиологической температуры.
[0157] Аутоиммунные заболевания - условно активные модификаторы биологического ответа
[0158] Ревматоидный артрит - это аутоиммунное заболевание, характеризующееся аберрантными иммунными механизмами, которые приводят к воспалению суставов и отеку с прогрессирующим разрушением суставов. PA также может воздействовать на кожу, соединительную ткань и органы тела. Традиционное лечение включает нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAIDS), ингибиторы COX-2 и антиревматические лекарственные средства, модифицирующие заболевание (DMARDS), такие как метотрексат. Ни один из традиционных режимов лечения не является идеальным, особенно для долговременного применения.
[0159] Модификаторы биологического ответа, которые нацеливаются на воспалительные медиаторы, предлагают относительно новый подход к лечению ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний. Такие модификаторы биологического ответа включают антитела или их активные части против различных медиаторов воспаления, таких как ИЛ-6, рецептора ИЛ-6, ФНО-альфа, ИЛ-23 и ИЛ-12.
[0160] Некоторые из первых модификаторов биологического ответа являлись лекарственными препаратами, нацеливающимися на фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), провоспалительный цитокин, участвующий в патогенезе PA. Несколько лекарственных препаратов против ФНО-альфа в настоящее время присутствуют на рынке для лечения PA. Например, Энбрел (Enbrel®) (этанерцепт, Amgen) является блокатором ФНО-альфа. Этанерцеп представляет собой димерный белок слияния, состоящий из внеклеточного лигандсвязывающего участка рецептора фактора некроза опухолей (р75) в 75 килодальтон, связанного с Fc-участком IgGl человека. Fc-компонента этанерцепта содержит домен CH2, домен CH3 и шарнирную область, но не домен CH1 IgGl. Этанерцепт образуется в системе клеточной экспрессии млекопитающих яичника китайского хомячка (CHO). Он состоит из 934 аминокислот и обладает кажущейся молекулярной массой приблизительно 150 килодальтон. Энбрел (Enbrel®) применяют для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилоартрита и псориаза бляшек. Серьезные побочные эффекты энбрела (Enbrel®) включают инфекции, включая туберкулез, грибковую инфекцию, бактериальную или вирусную инфекцию вследствие оппортунистических патогенов. Также может произойти сепсис. Также сообщалось о лимфоме или других злокачественных новообразованиях.
[0161] Ремикад (Remicade®) (инфликсимаб) представляет собой химерное IgGkI моноклональное антитело против ФНО-альфа, состоящее из константных областей человека и вариабельных областей мыши. Ремикад вводят посредством внутривенной инъекции, и его применяют для лечения ревматоидного артрита, псориаза, болезни Крона, язвенного колита и анкилозирующего спондилоартрита. Побочные эффекты ремикада включают серьезную инфекцию или сепсис и редко определенные Т-клеточные лимфомы. Другие побочные эффекты включают гепатотоксичность, определенные тяжелые гематологические явления, реакции гиперчувствительности и некоторые тяжелые неврологические явления.
[0162] Другие модификаторы биологического ответа включают гуманизированные антитела против рецептора интерлейкина-6 (ИЛ-6). ИЛ-6 представляет собой цитокин, который способствует воспалению, отеку и повреждению суставов при PA. Одно гуманизированное антитело против рецептора ИЛ-6, актемра (Actemra) (тоцилизумаб, Roche), одобрено Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (FDA) и Европейской комиссией для лечения взрослых пациентов с ревматоидным артритом. Актемра также одобрено в Японии для лечения PA и ювенильного идиопатического артрита (sJIA). Исследования III фазы показали, что лечение актемра в качестве монотерапии или комбинация с МТХ или другими DMARDs уменьшало признаки и симптомы PA по сравнению с другими видами средств для лечения. Актемра представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против рецептора ИЛ-6 человека, которое конкурентным образом блокирует связывание ИЛ-6 с его рецептором. Таким образом, оно ингибирует пролиферативные эффекты ИЛ-6, которые приводят к синовиальному утолщению и образованию паннуса при PA. Серьезные побочные эффекты актемры включают серьезные инфекции и реакции гиперчувствительности, включая несколько случаев анафилаксии. Другие побочные эффекты включают инфекцию верхних дыхательных путей, головную боль, назофарингит, гипертонию и повышенную АЛТ.
[0163] Другим распространенным аутоиммунным заболеванием является псориаз. Сверхактивная иммунная система может приводить к высоким уровням ИЛ-12 и ИЛ-23, двух белков цитокинов, которых обнаруживают в псориатических кожных бляшках. ИЛ-12 и ИЛ-23 участвуют в воспалительных и иммунных реакциях, таких как активация природных клеток-киллеров и дифференцировка и активация CD4+ Т-клеток.
[0164] Одно лечение умеренного или тяжелого псориаза включает подкожную инъекцию стеларой (Stelara™) (устекинумаб, Centocor Ortho Biotech, Inc.), гуманизированного IgGIk моноклонального антитела против субъединицы р40 цитокинов ИЛ-12 и ИЛ-23. Было показано, что стелара обеспечивает ослабление определенных симптомов, связанных с псориатическими бляшками, такими как утолщение бляшек, образование псориатических чешуек и покраснение. Состав для стелары содержит L-гистидин и моногидрат моногидрохлорида L-гистидина, полисорбат 80 и сахарозу в водном растворе. Применение стелары (Stelara™) воздействует на иммунную систему и может увеличить шанс заражения, включая туберкулез и инфекции, вызванные бактериями, грибами или вирусами; а также повысить риск возникновения определенных видов рака.
[0165] Побочные эффекты модификаторов биологического ответа являются значимыми и они частично вызваны высокими уровнями активности в результате инъекции пациентам, что делает пациентов восприимчивыми к серьезной инфекции или смерти. Это основной побочный эффект, который ассоциируют с этим важным классом лекарственных средств. Одна из проблем заключается в том, чтобы исключить высокий начальный уровень активности дозы антитела, необходимой для обеспечения длительного лечебного эффекта после инъекции.
[0166] В одном варианте реализации настоящего описания предложен способ получения условно активного медиатора биологического ответа или его фрагмента, который позволяет исключить высокий уровень активности дозы антитела, необходимой для обеспечения длительного лечебного эффекта в результате инъекции. Способ согласно настоящему описанию можно применять для разработки антител против медиаторов воспаления, таким как ИЛ-6, рецептор ИЛ-6, ФНО-альфа, ИЛ-23 и ИЛ-12, которые неактивны в условиях дозирования, таких как комнатная температура, однако их рефолдинг медленно происходит (обратимым или необратимым образом) при температуре тела. Эти антитела или их фрагменты были неактивны при первоначальной инъекции, однако их реактивация или рефолдинг осуществлялись в течение периода от нескольких часов до нескольких дней вследствие воздействия на кровь инъекции. Это может способствовать более высокому дозированию и более длительному времени полужизни (или периодам между дозированием) с пониженными побочными эффектами.
[0167] В одном аспекте настоящего описания предложен способ получения условно активного антитела против медиатора воспаления или его фрагмента, которое неактивно в условиях дозирования, таких как комнатная температура, однако его рефолдинг медленно происходит (обратимым или необратимым образом) при температуре тела. Указанный способ включает следующие стадии: отбор медиатора воспаления, скрининг для идентификации антитела против медиатора воспаления посредством гибридомы, гуманизацию указанного антитела против медиатора воспаления, эволюционирование указанного антитела против медиатора воспаления и проведение различным образом скрининга на связывание при двух или более условиях, например, двух или более температурных условиях, таких как при комнатной температуре и при 37°C или выше, отбор мутаций, которые неактивны при первом условии относительно дикого типа, однако проявляют повышенную активность (например, связывание) относительно активности антитела дикого типа (связывание) при втором условии. Рекомбинацию повышающих мутантов, идентифицированных в условиях сильных и легких изменений, затем осуществляют в тяжелой и легкой цепях, а также посредством комбинаторной ассоциации тяжелых и легких цепей. Скрининг этих рекомбинированных тяжелых и легких цепей повторяют при двух условиях, например, при комнатной температуре и при 37°C или выше. Кроме того, можно проводить скрининг указанных рекомбинантных антител или фрагментов на активность и стабильность в условиях хранения и при физиологических условиях.
[0168] В альтернативном варианте указанное антитело дикого типа против медиатора воспаления представляет собой известное антитело или его вариант или его активный фрагмент.
[0169] В одном аспекте первое и второе условия выбирают из следующих условий: pH, осмотическое давление, осмоляльность, окислительный стресса и концентрация электролитов. В другом аспекте указанный медиатор воспаления выбирают из рецептора ИЛ-6, ИЛ-6, ФНО-альфа, ИЛ-23 и ИЛ-12.
[0170] В другом аспекте настоящего описания предложен способ получения условно активного антитела против ИЛ-6 или его фрагмента, которое неактивно в условиях дозирования, таких как комнатная температура, однако его рефолдинг медленно происходит (обратимым или необратимым образом) при температуре тела. Указанный способ включает следующие стадии: скрининг библиотеки полностью человеческого происхождения на антитело против ИЛ-6; эволюционирование указанного антитела против ИЛ-6 и проведение различным образом скрининга на молекулы при комнатной температуре и при 37°C или выше; отбор мутаций, которые неактивны при комнатной температуре относительно дикого типа, но проявляют повышенную активность (например, связывание) относительно активности антитела дикого типа (связывание). Рекомбинацию повышающих активность мутантов, идентифицированных при изменениях тяжелых и легких цепей, затем проводят в тяжелой и легкой цепях, а также посредством комбинаторной ассоциации тяжелых и легких цепей. Скрининг этих рекомбинантных тяжелых и легких цепей повторяют при комнатной температуре и более высокой температуре. Кроме того, исследуют активность и стабильность указанных рекомбинантных антител или фрагментов в условиях хранения и физиологических условиях.
[0171] Условно активные антитела против ИЛ-6, идентифицированные и полученные таким образом, можно применять в способе лечения аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит или псориаз, посредством введения эффективного количества пациенту, нуждающемуся в этом, со снижением тяжести побочных эффектов по сравнению с введением традиционного модификатора биологического ответа антитела против ИЛ-6. Одним из преимуществ этого метода является, что он позволяет сглаживать или выравнивать количество лекарственного средства в течение периода лечения относительно текущего высокого уровня лекарственного средства модификатора биологического ответа с последующим периодом полувыведения в течение недель или месяцев.
[0172] Отбор белка дикого типа из библиотеки
[0173] Белок дикого типа можно отобрать из библиотеки белков дикого типа, такой как библиотека бактериофагового дисплея. В таких вариантах реализации большое количество кандидатов для белка дикого типа экспрессируют в библиотеке бактериофагов, в частности, при помощи метода отображения на поверхности. Скрининг кандидатов из указанной библиотеки проводят на подходящий белок дикого типа. Типичная библиотека бактериофагов может содержать бактериофаги, экспрессирующие указанных кандидатов в бактериальном хозяине. В одном варианте реализации библиотека бактериофагов может содержать множество бактериофагов.
[0174] Для создания бактериофаговой библиотеки обычно филаментные бактериофаги, такие как нитчатый колифаг М13, генетическим образом модифицируют путем внедрения олигонуклеотидов, кодирующих указанных кандидатов, в кодирующую последовательность одного из белков оболочки бактериофага. Следовательно, экспрессия белков оболочки указанных частиц бактериофагов происходит с указанными кандидатами таким образом, что кандидаты отображаются на поверхности частиц бактериофагов. Затем можно провести скрининг отображенных кандидатов на подходящий белок дикого типа.
[0175] Одним распространенным методом для проведение скрининга на подходящий белок дикого типа является иммобилизация бактериофаговой частицы с желаемым кандидатом на подложке. Указанной подложкой может служить пластиковый планшет, покрытый «приманкой», которая может связываться с желаемыми кандидатами. Не способные к связыванию бактериофаговые частицы можно смыть с планшета. Бактериофаговые частицы, связывающиеся с планшетом (с желаемыми кандидатами) элюируют промыванием и указанные элюированные бактериофаговые частицы амплифицируют в бактерии. Последовательность(-ти), кодирующие указанных кандидатов в отобранные бактериофаговые частицы, затем можно определить при помощи секвенирования. Взаимоотношения между указанными кандидатом и «приманкой» могут быть, например, взаимоотношением типа лиганд-рецептор или антиген-антитело.
[0176] Другим распространенным методом проведения скрининга на подходящий белок дикого типа является применение ферментативного анализа отдельных клонов бактериофагов для определения желаемой ферментативной активности, проявляемой кандидатами. В зависимости от специфичной ферментативной активности специалист в данной области техники может разработать подходящий анализ для проведения скрининга на указанных кандидатов с желаемым уровнем ферментативной активности.
[0177] В некоторых вариантах реализации предложена библиотека бактериофага в виде панели, так что каждый клон бактериофага занимает определенное место в указанной панели. Такую панель можно получить на твердой подложке, например мембране, планшете с агаром или планшете для микротитрования, и в этих случаях каждый клон бактериофага библиотеки присоединен или прикреплен с ним в определенном заданном положении на твердой подложке. В случае планшетов с агаром такие пластины предпочтительно содержат среды для роста бактерий, чтобы поддерживать рост бактерий. Когда панель представлена на мембране, например, нитроцеллюлозе или нейлоновой мембране, культуру бактерий наносят на указанную мембрану и данную мембрану пропитывают питательной средой для роста. Кроме того, клоны бактериофагов также можно представить на гранулах, и в этом случае один клон бактериофага можно прикрепить к одной грануле. Альтернативным образом каждый клон бактериофага можно обеспечить на кончике оптического волокна, и в этом случае указанного волокно применяют для оптической передачи ультрафиолетового излучения от источника света.
[0178] Типичная библиотека бактериофагов может содержать от 106 до 1010 рекомбинантных бактериофагов, каждый из которых отличается белком оболочки (например, gp3 или gp8 в случае фага М13), присутствующим у другого кандидата. Бактериальных хозяев для библиотеки бактериофагов можно отобрать из родов бактерий, включая, например, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Shigella, Listeria, Campy icbacter, Klebsiella, Yersinia, Pseudomonas и Escherichia.
[0179] Олигонуклеотиды, кодирующие указанных кандидатов, могут представлять собой коллекцию кДНК, которые кодируют белки дикого типа. Известны способы синтеза кДНК из биологического образца, при помощи которых можно осуществить экспрессию подходящего белка дикого типа. Любую генетическую информацию, которая проявляет физиологическую активность посредством транскриптов, можно собрать в качестве кДНК. При образовании кДНК необходимо синтезировать полноразмерные кДНК. Существует несколько методов, которые можно применять для синтеза полноразмерных кДНК. Например, подходящие способы включают способ, в котором используют Сар-связывающий белок из дрожжей или клеток Hela для мечения 5'-Cap-сайта (I. Edery и др., «An Efficient Strategy То Isolate Full-length cDNAs Based on a mRNA Cap Retention Procedure (CAPture)», Mol. Cell. Biol., vol. 15, pages 3363-3371, 1995), и способ, в котором фосфаты неполных кДНК без 5'-Cap удаляют с применением щелочной фосфатазы и затем все кДНК обрабатывают декэппирующим ферментом вируса табачной мозаики таким образом, что только полноразмерные кДНК содержат фосфаты (K. Maruyama и др., «Oligo-capping: a simple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides», Gene, vol. 138, pages 171-174, 1995 и S. Kato и др., «Construction of a human full-length cDNA bank», Gene, vol. 150, pages 243-250, 1995).
[0180] Библиотеку кандидатов для белка дикого типа также можно получить с применением рекомбинантных антител, полученных из полного спектра антител организма. Генетическая информация, представляющая указанный спектр, собрана в большие коллекции полных антител, скрининг которых можно провести на желаемое антитело дикого типа с желаемой антигенсвязывающей активностью и/или одной или более других функциональных характеристик. В некоторых вариантах реализации выделяют В-клетки из животных, иммунизированных антигеном, такие как В-клетки человека, мыши или кролика. мРНК из выделенных В-клеток собирают (конвертируют в кДНК) и секвенируют. Осуществляют сборку в антитела наиболее часто встречающихся фрагментов кДНК, кодирующих легкую цепь, и наиболее часто встречающихся фрагментов кДНК, кодирующих тяжелую цепь. В одном варианте реализации для получения антител осуществляют сборку 100 наиболее часто встречающихся фрагментов кДНК, кодирующих легкую цепь, и 100 наиболее часто встречающихся фрагментов кДНК, кодирующих тяжелую цепь. В другом варианте реализации наиболее часто встречающиеся фрагменты кДНК кодируют только вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, поэтому полученные в результате сборки антитела содержат только вариабельные области, но не константные области.
[0181] В некоторых вариантах реализации, включая фрагменты из мРНК, выделенной из В-клеток, осуществляют сборку фрагментов кДНК, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи IgG, с наиболее часто встречающимися вариабельными областями IgK или IgK легкой цепи. Полученные в результате сборки антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи IgG и вариабельную область легкой цепи IgK или IgK.
[0182] Затем осуществляют клонирование и экспрессию кДНК, кодирующих указанные получаемые в результате сборки антитела, предпочтительно в формате на основе планшетов. Связывающую активность экспрессированных антител можно исследовать при помощи ИФА-анализа на основе шариков, и можно провести отбор подходящего антитела дикого типа на основе ИФА-анализа. Экспрессию кДНК, кодирующих указанные получаемые в результате сборки антитела, можно также осуществить в библиотеке бактериофагового дисплея, скрининг которой можно затем провести на один или более желаемых антител дикого типа при помощи любого из раскрытых в настоящем документе методов.
[0183] В вариантах реализации, где белок дикого типа представляет собой антитело, указанное антитело дикого типа предпочтительно обладает особыми характеристиками, которые облегчают эволюционирование до условно активного антитела. В определенных вариантах реализации указанное антитело дикого типа может обладать сходной связывающей активностью и/или характеристиками как при нормальном физиологическом условии, так и в аберрантном условии. В таких вариантах реализации в основе отбора антитела дикого типа лежит, что оно обладает наиболее схожей связывающей активностью и/или наиболее схожей комбинацией одной или более характеристик как при нормальном физиологическом условии, так и при аберрантном условии. Например, если нормальное физиологическое условие и аберрантное условие представляют собой pH 7,4 и pH 6,0 соответственно, можно отобрать антитело дикого типа, которое обладает наиболее схожей связывающей активностью при pH 7,4 и 6,0, по сравнению с антителом, обладающим менее схожую связывающую активность при pH 7,4 и 6,0.
[0184] После отбора белка дикого типа осуществляют эволюцию ДНК, кодирующей белок дикого типа, с применением подходящего метода мутагенеза для получения мутантных ДНК, экспрессию которых можно затем осуществить с получением мутантных белков для скрининга для идентификации условно активного биологического белка. В некоторых вариантах реализации эволюция может быть минимальной, например, только небольшое количество мутаций вводят в белок дикого типа для получения мутантного белка с желаемой условной активностью. Например, менее, чем 20 изменений, возможно, менее, чем 18 изменений, введенных при помощи CPE на каждый сайт, может быть достаточно для того, чтобы получить подходящий условно активный биологический белок. Для CPS комбинация из менее, чем 6 повышающих мутаций или менее, чем 5 повышающих мутаций, или менее, чем 4 повышающих мутаций, или менее, чем 3 повышающих мутаций, или менее, чем 2 повышающих в белке дикого типа может быть достаточной для получения желаемого условно активного биологического белка.
[0185] В некоторых вариантах реализации стадии эволюции и экспрессии могут быть необязательными, когда библиотека белков дикого типа (например, библиотека бактериофага и/или библиотека рекомбинантных антител) является достаточно большой. Такая большая библиотека может содержать белок дикого типа с условно активными характеристиками (как с низкой активностью в анализе при нормальном физиологическом условии, так и с высокой активностью в анализе при аберрантном условии). В этих вариантах реализации указанные белки дикого типа в указанной библиотеке подвергаются стадии отбора для обнаружения условно активного биологического белка, который менее активен в анализе при нормальном физиологическом условии, чем тот же самый белок в анализе при аберрантном условии. В одном варианте реализации с указанными белками дикого типа в указанной библиотеке индивидуальным образом проводят анализ при нормальном физиологическом условии и анализ при аберрантном условии совместно с референсным белком. Условно активный биологический белок, который отбирают из указанной библиотеки, представляет собой тот белок, который проявляет более низкую активность при нормальном физиологическом условии по сравнению с активностью того же белка при аберрантном условии. В этом варианте реализации, поскольку указанная библиотека достаточно велика и в данной библиотеке уже существует белок дикого типа с условно активными характеристиками, эволюция белков дикого типа для обнаружения условно активного биологического белка не требуется.
[0186] В некоторых вариантах реализации на стадии отбора можно применять референсный белок для сравнения. Указанный референсный белок не может являться условно активным по той причине, что он обладает аналогичной или одинаковой активностью как при нормальном физиологическом условии, так и при аберрантном условии. Указанный референсный белок представляет собой тот же тип белка, что и белки дикого типа в библиотеке, например, тот же тип фермента, антитела или функционального пептида. Указанный референсный белок может также являться тем же самым типом тканевого активатора плазминогена, стрептокиназы, урокиназы, ренина, гиалуронидазы, пептида, связанного с геном кальцитонин пептида (CGRP), субстанции Р (SP), нейропептида Y (NPY), вазоактивного пептида кишечника (VTP), вазопрессина или ангиостатина. Например, когда библиотека содержит большое количество антител дикого типа против антигена, указанный референсный белок представляет собой антитело против того же антигена с одинаковой или аналогичной связывающей активностью с антигеном как при нормальном физиологическом условии, так и при аберрантном условии.
[0187] В связи с этим в одном варианте реализации белки дикого типа в библиотеке индивидуальным образом подвергают анализу при нормальном физиологическом условии и анализу при аберрантном условии совместно с референсным белком. Условно активный биологический белок выбирают из библиотеки, который проявляет как (а) снижение активности при нормальном физиологическом условии по сравнению с референсным белком, так и (b) повышенную активность при аберрантном условии по сравнению с референсным белком.
[0188] Способы получения условно активных биологических белков
[0189] Один или более методов мутагенеза используют для эволюции ДНК, которая кодирует белок дикого типа, для создания библиотеки мутантной ДНК; указанную мутантную ДНК экспрессируют для создания библиотеки мутантных белков и указанную библиотеку подвергают скрининговому анализу при нормальном физиологическом условии и при одном или более аберрантных условиях. Условно активные биологические белки отбирают из тех белков, которые проявляют как (а) снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с белком дикого типа, так и (b) увеличение активности в анализе при аберрантном условии по сравнению с белком дикого типа. В альтернативном варианте условно активные биологические белки отбирают из тех белков, которые проявляют изменения в активности, обратимым или необратимым образом, при двух или более различных физиологических условиях. В некоторых вариантах реализации указанный белок дикого типа представляет собой антитело.
[0190] В некоторых вариантах реализации указанный белок, который следует эволюционировать, может представлять собой фрагмент белка дикого типа или фрагмент антитела дикого типа. В некоторых других вариантах реализации указанный белок, который следует эволюционировать, может представлять собой белок, отобранный способом мутагенеза, при этом белок отбирают для обеспечения желаемого свойства, такого как высокое сродство к связыванию, высокий уровень экспрессии или гуманизация. Указанный отобранный белок, который в этом случае не является белком дикого типа, можно применять в качестве белка, который следует эволюционировать в раскрытом в настоящем документе способе. В таких вариантах реализации указанный способ согласно настоящему изобретению включает: отбор белка из белка дикого типа, фрагмента белка дикого типа и мутированного белка, эволюцию ДНК, кодирующей указанный отобранный белок, для получения мутантных ДНК, осуществление экспрессии указанных мутантных ДНК с получением мутантных белков, проведение скрининга указанных мутантных белков для получения условно активного биологического белка, который проявляет как: (а) снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с указанным отобранным белком, так и (b) увеличение активности в анализе при аберрантном условии по сравнению с указанным отобранным белком.
[0191] Получение эволюционированных молекул из родительской молекулы
[0192] Условно активные биологические белки можно получить посредством процесса мутагенеза и проведения скрининга на отдельные мутации для снижения активности в условиях дикого типа по сравнению с активностью в условиях недикого типа, которая остается такой же или становится лучше, чем активность в условиях дикого типа.
[0193] В настоящем описании предложен способ получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, обладающего ферментативной активностью, при этом указанный вариант обладает измененной биологической активностью по сравнению с той активностью, которую наблюдают в естественных условиях, причем указанный способ включает (а) модифицирование указанной нуклеиновой кислоты путем (i) замены одного или более нуклеотидов на другой нуклеотид, при этом указанный нуклеотид включает природный или неприродный нуклеотид; (ii) делеции одного или более нуклеотидов, (iii) добавления одного или более нуклеотидов или (iv) любой их комбинации. В одном аспекте указанный неприродный нуклеотид содержит инозин. В другом аспекте указанный способ дополнительно включает проведение исследования полипептидов, которые кодируются указанными модифицированными нуклеиновыми кислотами, на определение измененной ферментативной активности, тем самым осуществляется идентификация указанной модифицированной нуклеиновой кислоты (кислот), кодирующей полипептид, обладающий измененной ферментативной активностью. В одном аспекте модификации стадии (а) осуществляют при помощи ПЦР, ПЦР с внесением ошибок, шаффлинга, олигонуклеотид-направленного мутагенеза, ПЦР-сборки, мутагенеза при помощи ПЦР с имитацией полового размножения, мутагенеза in vivo, кассетного мутагенеза, рекурсивного множественного мутагенеза, экспоненциального множественного мутагенеза, сайт-специфического мутагенеза, повторной сборки генов, насыщающего мутагенеза участка гена, лигазной цепной реакции, мутагенеза in vitro, лигазной цепной реакции, синтеза олигонуклеотидов, любого ДНК-генерирующего метода и любых их комбинаций. В другом аспекте указанный способ дополнительно включает по меньшей мере один повтор стадии модификации.
[0194] В настоящем описании также предложен способ получения полинуклеотида из двух или более нуклеиновых кислот, причем указанный способ включает: (а) идентификацию областей идентичности и областей различий между двумя или более нуклеиновыми кислотами, при этом по меньшей мере одна из указанных нуклеиновых кислот включает нуклеиновую кислоту согласно настоящему описанию; (b) обеспечение набора олигонуклеотидов, которые соответствуют по последовательности по меньшей мере двум из двух или более нуклеиновых кислот; и (с) удлинение указанных олигонуклеотидов при помощи полимеразы, что тем самым обеспечивает получение указанного полинуклеотида.
[0195] Любой метод мутагенеза можно использовать в различных вариантах реализации настоящего описания. Стохастический или случайный мутагенез можно проиллюстрировать ситуацией, в которой родительскую молекулу мутируют (модифицируют или изменяют), что позволяет получить набор молекул потомства, имеющих мутацию(-и), которые не были предопределены. Таким образом, в реакции стохастического мутагенеза in vitro, например, не существует конкретного заранее определенного продукта, который намерены были получить; скорее существует неопределенность - в связи с этим случайность - в отношении точной природы достигнутых мутаций, и, таким образом, также в отношении полученных продуктов. Стохастический мутагенез проявляется в таких способах, как ПЦР с внесением ошибок и стохастический шаффлинг, в которых мутация(-и) достигается случайным или непредопределенным образом. Вариантные формы можно получить при помощи транскрипции с внесением ошибок, такой как ПЦР с внесением ошибок или с применением полимеразы, которая утратила активность по коррекции ошибок (см. Liao (1990) Gene 88: 107-111) первой вариантной формы, или при помощи репликации первой формы в мутаторном штамме (мутаторные клетки-хозяева более подробнее обсуждаются ниже и в целом хорошо известны). Мутаторный штамм может включать любых мутантов в любом организме, ослабленном в отношении функции репарации ошибочно спаренных оснований. Это включает продукты мутантного гена mutS, mutT, mutH, mutL, ovrD, dcm, vsr, umuC, umuD, sbcB, recJ и т.п. Нарушения достигают при помощи генетической мутации, аллельной замены, избирательного ингибирования посредством добавленного реагента, такого как малое соединение, или экспрессированой антисмысловой РНК, или при помощи других методов. Нарушение может быть в указанных генах или в гомологичных генах в любом организме.
[0196] Современные способы мутагенеза, широко применяемые для создания альтернативных белков из исходной молекулы, представляют собой технологии олигонуклеотид-направленного мутагенеза, полимеразные цепные реакции с внесением ошибок (ПЦР с внесением ошибок) и кассетного мутагенеза, в котором специфическую область, которую следует оптимизировать, заменяют на синтетическим образом мутированный олигонуклеотид. В этих случаях вокруг определенных сайтов в оригинальной последовательности образуют ряд мутантных сайтов.
[0197] В олигонуклеотид-направленном мутагенезе короткую последовательность заменяют на синтетическим образом мутированный олигонуклеотид. В олигонуклеотид-направленном мутагенезе, короткую последовательность полинуклеотида удаляют из полинуклеотида, применяя расщепление при помощи эндонуклеазы рестрикции, и заменяют на синтетический полинуклеотид, в котором были изменены различные основания исходной последовательности. Указанную последовательность полинуклеотида также можно изменить при помощи химического мутагенеза. Химические мутагены включают, например, бисульфит натрия, азотистую кислоту, гидроксиламин, гидразин или муравьиную кислоту. Другие агенты, которые представляют собой аналоги предшественников нуклеотида, включают нитрозогуанидин, 5-бромурацил, 2-аминопурин или акридин. В целом данные агенты добавляют в ПЦР-реакцию вместо предшественника нуклеотида, тем самым мутируя последовательность. Также можно применять интеркалирующие агенты, такие как профлавин, акрифлавин, хинакрин и им подобные. Случайного мутагенеза указанной последовательности полинуклеотида также можно достичь посредством облучения рентгеновскими лучами или ультрафиолетовым светом. В целом полинуклеотиды плазмид, мутированные таким способом, вводят в Е. coli и размножают как пул или как библиотеку гибридных плазмид.
[0198] В ПЦР с внесением ошибок применяют условия полимеризация с низкой точностью для введения случайным образом низкого уровня точечных мутаций на протяжении длинной последовательности. В смеси фрагментов неизвестной последовательности, ПЦР с внесением ошибок можно применять для осуществления мутагенеза указанной смеси.
[0199] В кассетном мутагенезе блок последовательностей единственной матрицы, как правило, заменяют (частично) рандомизированной последовательностью. Reidhaar-Olson J.F. и Sauer R.Т.: Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science 241(4861):53-57, 1988.
[0200] В альтернативном варианте любой метод нестохастического или неслучайного мутагенеза можно использовать в различных вариантах реализации настоящего описания.
Нестохастический мутагенез можно проиллюстрировать ситуацией, в которой родительскую молекулу мутируют (модифицируют или изменяют), что позволяет получить молекулу потомства, содержащую одну или более предопределенных мутаций. Следует понимать, что присутствие фоновых продуктов в некотором количестве представляет собой реальность во многих реакциях, в которых происходит молекулярная обработка, и присутствие данных фоновых продуктов не умаляет нестохастическую природу процесса мутагенеза, обеспечивающего предопределенный продукт. Сайт-насыщающий мутагенез и повторная сборка при помощи синтетического лигирования представляют собой примеры методов мутагенеза, в которых точная химическая структура(-ы) предполагаемого продукта(-ов) предопределена(-ы).
[0201] Один из способов сайт-насыщающего мутагенеза раскрыт в публикации заявки на патент США №2009/0130718. Данный способ обеспечивает набор вырожденных праймеров, соответствующих кодонам матричного полинуклеотида, и осуществляет полимеразную элонгацию для получения полинуклеотидов потомства, которые содержат последовательности, соответствующие указанным вырожденным праймерам. Можно осуществить экспрессию и провести скрининг указанного потомства полинуклеотидов на направленную эволюцию. Конкретно это способ получения набора потомства полинуклеотидов, включающий стадии (а) обеспечения копий матричного полинуклеотида, каждая содержащая множество кодонов, которые кодируют последовательность матричного полипептида; и (b) для каждого кодона указанного матричного полинуклеотида выполнение стадий (1) обеспечения набора вырожденных праймеров, в котором каждый праймер содержит вырожденный кодон, соответствующий кодону указанного матричного полинуклеотида и по меньшей мере одну прилегающую последовательность, которая гомологична последовательности, прилегающей к кодону указанного матричного полинуклеотида; (2), обеспечения условий, способствующих отжигу праймеров с копиями указанного матричного полинуклеотида; и (3) проведения полимеразной реакции элонгации от праймеров вдоль матрицы; тем самым получая потомство полинуклеотидов, каждое из которых содержит последовательность, соответствующую вырожденному кодону указанного отожженного праймера; тем самым получая набор полинуклеотидов потомства.
[0202] Сайт-насыщающий мутагенез относится к направленной эволюции нуклеиновых кислот и скринингу клонов, содержащих эволюционированные нуклеиновые кислоты, на представляющую интерес результирующую активность(-и), такую как активность(-и) нуклеиновой кислоты, и/или представляющую интерес активность(-и) определенного белка, конкретно фермента.
[0203] Подвергнутые мутагенезу молекулы, получаемые посредством данного метода, могут содержать химерные молекулы и молекулы с точечными мутациями, включая биологические молекулы, которые содержат углевод, липид, нуклеиновую кислоту и/или белковый компонент, и конкретные, но не ограничивающие примеры этих молекул, включают антибиотики, антитела, ферменты и стероидные и нестероидные гормоны.
[0204] Сайт-насыщающий мутагенез относится в целом к способу: 1) получения поколения потомства молекулы (молекул) (включая молекулу, которая содержит последовательность полинуклеотида, молекулу, которая содержит последовательности полипептида, и молекулу, частично содержащую последовательность полинуклеотида и частично последовательность полипептида), которую подвергают мутагенезу для достижения по меньшей мере одной точечной мутации, вставки, делеции и/или химеризации, полученной из матрицы (матриц) одного или более поколений родителей или предков; 2) проведения скрининга молекулы (молекул) поколения потомства - предпочтительным образом с применением способа с высокой пропускной способностью - на по меньшей мере одно представляющее интерес свойство (такое как улучшение ферментативной активности или увеличение стабильности, или новый хемотерапевтический эффект); 3) необязательно получения и/или каталогизации структурной и/или и функциональной информации в отношении поколения родительских молекул и/или молекул потомства; и 4) необязательно повторения любой из стадий от 1) до 3).
[0205] В сайт-насыщающем мутагенезе создают (например, из матрицы родительского полинуклеотида) - в так называемом «сайт-насыщающем мутагенезе кодона» - поколение потомства полинуклеотидов, каждое из которых содержит по меньшей мере один набор из не более, чем трех непрерывных точечных мутаций (т.е. различных оснований, содержащих новый кодон), так что каждый кодон (или каждое семейство вырожденных кодонов, кодирующее такую же аминокислоту) представлен в каждом положении кодона. В соответствии с данным поколением потомства полинуклеотидов - и кодируемым данным поколением потомства полинуклеотидов - также создают набор полипептидов потомства, каждый из которых содержит по меньшей мере одну аминокислотную точечную мутацию. В предпочтительном аспекте создают - в так называемом «сайт-насыщающем мутагенезе аминокислот» - один такой мутантный полипептид для каждой из 19 естественным образом кодируемых полипептид-формирующих альфа-аминокислотных замен во всех без исключения положениях аминокислоты вдоль указанного полипептида. Это позволяет получить для всех без исключения аминокислот положения вдоль родительского полипептида, всего 20 отличающихся полипептидов потомства, включая исходную аминокислоту, или потенциальным образом более, чем 21 отличающийся полипептид потомства, если применяют дополнительные аминокислоты либо совместно, либо в дополнение к 20 естественным образом кодируемым аминокислотам.
[0206] Также можно использовать другие методы мутагенеза с применением рекомбинации и, более конкретно, способ получения полинуклеотидов, кодирующих полипептид, при помощи реассортации in vivo последовательностей полинуклеотидов, содержащих области частичной гомологии, сборки указанных полинуклеотидов с получением по меньшей мере одного полинуклеотида и скрининга указанных полинуклеотидов на получение полипептида(-ов), обладающих полезным свойством.
[0207] В другом аспекте в методах мутагенеза используют природную способность клеток к рекомбинации молекул и/или к опосредованию восстановительных процессов, которые снижают сложность последовательности и степень повторяемых или следующих друг за другом последовательностей, содержащих области гомологии.
[0208] Различные методы мутагенеза можно применять по отдельности или в комбинации для обеспечения способа получения гибридных полинуклеотидов, кодирующих биологически активные гибридные полипептиды с улучшенной активностью. При достижении данной и других целей, в соответствии с одним аспектом настоящего описания был предложен способ введения полинуклеотидов в подходящие клетки-хозяева и выращивания указанных клеток-хозяев в условиях, при которых получают гибридный полипептид.
[0209] Химерные гены создавали путем объединения 2 полинуклеотидных фрагментов с применением совместимых липких концов, полученных при помощи эндонуклеазы (эндонуклеаз) рестрикции, при этом каждый фрагмент получают из отдельной молекулы-предшественника (или родительской молекулы). Другой пример представляет собой мутагенез одного положения кодона (т.е. для достижения замены, вставки или делеции в кодоне) в родительском полинуклеотиде для получения одиночного полинуклеотида потомства, кодирующего полипептид, подвергаемый мутагенезу по одному сайту.
[0210] Кроме того, для получения гибридов генов использовали системы сайт-специфической рекомбинации in vivo, а также способы случайной рекомбинации in vivo, и рекомбинации между гомологичными, но укороченными генами на плазмиде. Также сообщалось о мутагенезе, осуществляемом при помощи перекрывающегося удлинения и ПЦР.
[0211] Неслучайные способы применяют для достижения большего числа точечных мутаций и/или химеризаций, например, комплексные или всесторонние подходы применяют для получения всех видов молекул внутри определенной группировки мутаций, для приписывания функциональности специфичным структурным группам в молекуле матрицы (например, одно специфичное положение аминокислоты или последовательность, содержащая две или более положений аминокислот), и для категорирования и сравнения специфичных группировок мутаций.
[0212] Любые данные или другие способы эволюционирования можно использовать в настоящем описании для получения новой популяции молекул (библиотеки) из одной или более родительских молекул.
[0213] После формирования указанные конструкции могут быть или не быть разделены по размеру на агарозном геле согласно опубликованным протоколам, вставлены в вектор клонирования и трансфицированы в соответствующую клетку-хозяин.
[0214] Экспрессия эволюционированных молекул
[0215] При создании библиотеки мутантных молекул, можно осуществить экспрессию ДНК с применением обычных методов молекулярной биологии. Таким образом, экспрессию белка можно направлять с применением различных известных способов.
[0216] Например, вкратце, гены дикого типа можно эволюционировать с применением разнообразных случайных или неслучайных способов, таких как те, которые указаны в настоящем документе. Молекулы мутантных ДНК затем расщепляют и лигируют в ДНК-вектор, такой как ДНК-плазмиду с применением стандартных методов молекулярной биологии. ДНК-вектор, содержащий отдельные мутанты, трансформируют в бактерии или другие клетки с применением стандартных протоколов. Это можно выполнить в отдельной лунке многолуночного планшета, такого как 96-луночный планшет для экспрессии, и проведения скрининга высокой производительности. Процесс повторяют для каждой мутантной молекулы.
[0217] Полинуклеотиды, отобранные и выбранные так, как это описано, вводят в подходящую клетку-хозяина. Подходящая клетка-хозяин представляет собой любую клетку, которая способна содействовать рекомбинации и/или восстановительной реассортации. Указанные отобранные полинуклеотиды предпочтительным образом уже находятся в векторе, который содержит подходящие контрольные последовательности. Указанная клетка-хозяин может представлять собой высшую эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего, или низшую эукариотическую клетку, такую как дрожжевая клетка, или, предпочтительным образом, указанная клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкции в указанную клетку-хозяин можно осуществить посредством трансфекции фосфата кальция, опосредованной DEAE-декстраном трансфекции или электропорации (например, Ecker и Davis, 1986, Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. США, 83:5372-5376).
[0218] В качестве примеров векторов экспрессии, которые можно применять, можно упомянуть вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагмиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусную ДНК (например, вируса осповакцины, аденовируса, вируса оспы птиц, вируса ложного бешенства и производных SV40), искусственные хромосомы на основе PI, дрожжевые плазмиды, дрожжевые искусственные хромосомы и любые другие векторы, специфичные для конкретных представляющих интерес хозяев (таких как бациллы, аспергиллы и дрожжи). Таким образом, например, ДНК можно включить в любой из множества векторов экспрессии для экспрессии полипептида. Такие векторы содержат хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК. Большое количество подходящих векторов известны специалистам в данной области техники и коммерчески доступны. Следующие векторы представлены в качестве примера; бактериальные: pQE-векторы (Qiagen), pBluescript-плазмиды, pNH-векторы, (лямбда-ZAP векторы (Stratagene); ptrc99a, рKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); эукариотические: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Однако можно применять любую другую плазмиду или любой другой вектор до тех пор, пока они способны к репликации и жизнеспособны в хозяине. В настоящем описании можно использовать векторы с низким числом копий или с высоким числом копий.
[0219] Последовательность ДНК в векторе экспрессии функционально связана с подходящей последовательностью(-тями) контроля экспрессии (промоторами) для направления синтеза РНК. В особенности названные бактериальные промоторы включают lad, lacZ, Т3, Т7, gpt, лямбда PR, PL и trp.Эукариотические промоторы включают немедленный и ранний CMV, тимидинкиназу HSV, ранний и поздний SV40, LTR, полученный из ретровируса, и металлотионеин-1 мыши. Отбор подходящего вектора и промоторов находится в пределах обычной квалификации специалиста в данной области техники. Указанный вектор экспрессии также содержит сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Указанный вектор также может содержать подходящие последовательности для усиления экспрессии. Области промоторов можно отобрать из любого желаемого гена с применением хлорамфеникол-трансферазных (CAT) векторов или других векторов с селективными маркерами. Кроме того, указанные векторы экспрессии предпочтительным образом содержат один или более отбираемых маркерных генов для обеспечения фенотипического признака для отбора трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофтолат-редуктаза или устойчивость к неомицину, для культивирования эукариотических клеток, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину у Е. coli.
[0220] Следовательно, в другом аспекте настоящего описания можно получить новые полинуклеотиды при помощи процесса восстановительной реассортации. Указанный способ включает получение конструкций, содержащих следующие друг за другом последовательности (исходные кодирующие последовательности), осуществление их вставки в подходящий вектор и их последующее введение в подходящую клетку-хозяин. Реассортация индивидуальных молекулярных идентичностей происходит за счет комбинаторных процессов между следующими друг за другом в указанной конструкции последовательностями, содержащими области гомологии, или между квази-повторяющимися единицами. В процессе реассортации осуществляется рекомбинация и/или происходит снижение сложности и степени повторяющихся последовательностей и это приводит к получению новых видов молекул. Для улучшения скорости реассортации можно применять различные способы обработки. Это может включать обработку ультрафиолетовым светом или повреждающими ДНК химическими реагентами и/или применение линий клеток-хозяев, демонстрирующих улучшенные уровни «генетической нестабильности». Таким образом процесс реассортации может включать гомологичную рекомбинацию или природное свойство квази-повторяющихся последовательностей для направления их собственной эволюции.
[0221] В одном аспекте организм- или клетка-хозяин включает грамотрицательную бактерию, грамположительную бактерию или эукариотический организм. В другом аспекте настоящего описания указанная грамотрицательная бактерия включает Escherichia coli или Pseudomonas fluorescens. В другом аспекте настоящего описания указанная грамположительная бактерия включает Streptomyces diversa, Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris или Bacillus subtilis. В другом аспекте настоящего описания указанный эукариотический организм включает Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula plymorpha или Aspergillus niger. В качестве примеров подходящих хозяев можно отметить: бактериальные клетки, такие как Е. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; клетки грибов, таких как дрожжи; клетки насекомых, такие как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как СНО, COS или меланомы Боуэса; аденовирусы и растительные клетки. Считается, что отбор подходящего хозяина находится в компетенции специалистов в данной области техники на основе идей настоящего документа.
[0222] С конкретными ссылками на различные системы культивирования клеток млекопитающих, которые можно использовать для экспрессии рекомбинантного белка, примеры систем экспрессии млекопитающих включают линии COS-7 фибробластов почек обезьян, описанные в «SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutan» (Gluzman, 1981), и другие клеточные линии, способные экспрессировать совместимый вектор, например, линии клеток С127, 3Т3, СНО, HeLa и ВНK. Векторы экспрессии млекопитающих будут содержать точку начала репликации, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосомы, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. ДНК-последовательности, полученные в результате сплайсинга SV40, и сайты полиаденилирования можно применять для получения требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.
[0223] Затем клетки размножают и осуществляют «восстановительную реассортацию». Скорость процесса восстановительной реассортации можно повысить путем введения повреждения в ДНК, если это необходимо, реассортация in vivo ориентирована на «интермолекулярные» процессы, совместно обозначаемые как «рекомбинация», которая у бактерий в целом рассматривают как «RecA-зависимое» явление. Настоящее описание может ссылаться на процессы рекомбинации клеток-хозяев для рекомбинации и реассортации последовательностей, или способность клеток опосредовать восстановительные процессы для снижения сложности квази-повторяющихся последовательностей в клетке путем делеции. Это процесс «восстановительной реассортации» происходит при помощи «интра-молекулярного», RecA-независимого процесса. Конечный результат представляет собой реассортацию молекул во всех возможных комбинациях.
[0224] Клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, можно культивировать на общепринятых питательных средах, модифицированных как подходящие для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов. Условия культивирования, такие как температура, рН и им подобные, были такими, как примененные ранее при отборе клеток-хозяев для экспрессии, и будут очевидны специалисту среднего уровня в данной области техники.
[0225] Экспрессию белка можно индуцировать при помощи различных известных способов, и было опубликовано много генетических систем для индукции экспрессии белка. Например, при подходящих системах добавление индуцирующего агента будет индуцировать экспрессию белка. Клетки затем осаждают центрифугированием и указанный супернатант удаляют. Периплазматический белок можно обогатить путем инкубирования указанных клеток с ДНКазой, РНКазой и лизоцимом. После центрифугирования, указанный супернатант, содержащий новый белок, переносят в новый многолуночный планшет и хранят до проведения исследования.
[0226] Клетки обычно собирают центрифугированием, разрушают физическими или химическими способами, и полученный неочищенный экстракт сохраняют для дополнительной очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушить при помощи любого общепринятого способа, включая циклы замораживания-оттаивания, обработку ультразвуком, механическое разрушение или применение агента для лизиса клеток. Такие способы хорошо известны специалистам в этой области техники. Экспрессированный полипептид или его фрагмент можно выделить и очистить из культуры рекомбинантных клеток при помощи способов, включающих осаждение с применением сульфата аммония или этанола, экстракцию кислотой, анионно- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите и лектиновую хроматографию. При необходимости в завершение конфигурации указанного полипептида можно применять стадии рефолдинга белка. Если необходимо, можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) для окончательных стадий очистки.
[0227] Клоны, которых идентифицируют как обладающие желаемой активностью, затем можно секвенировать для идентификации последовательности полинуклеотида, кодирующей фермент, обладающий улучшенной активностью.
[0228] Полипептиды, которых идентифицируют из таких библиотек, можно применять для терапевтических, диагностических, исследовательских и родственных целей и/или можно подвергать одному или более дополнительным циклам шаффлинга и/или отбора. В настоящем описании предложен фрагмент условно активного биологического белка длиной по меньшей мере 10 аминокислот и при этом указанный фрагмент обладает активностью.
[0229] В настоящем описании предложен оптимизированный по кодону полипептид или его фрагмент, обладающий ферментативной активностью, при этом применение указанного кодона оптимизируют для конкретного организма или клетки. Narum и др. в публикации «Codon optimization of gene fragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccine protein expression and immunogenicity in mice». Infect. Immun. 2001 Декабрь, 69(12):7250-3 описывает оптимизацию кодонов в системе мыши. Outchkourov и др. в публикации Optimization of the expression of Equistatin in Pichia pastoris, protein expression and purification», Protein Expr. Purif. 2002 Февраль; 24(1): 18-24 описывает оптимизацию кодонов в системе дрожжей. Feng и др. в публикации «High level expression and mutagenesis of recombinant human phosphatidylcholine transfer protein using a synthetic gene: evidence for a C-terminal membrane binding domain» Biochemistry 2000 Декабрь 19, 39(50): 15399-409 описывает оптимизацию кодонов у Е. coli. Humphreys и др. В публикации «High-level periplasmic expression in Escherichia coli using a eukaryotic signal peptide: importance of codon usage at the 5' end of the coding sequence», Protein Expr. Purif. 2000 Nov. 20(2):252-64 описывает, как применение кодонов воздействует на секрецию у Е. coli.
[0230] Эволюцию условно активного биологического белка можно обеспечить благодаря доступности удобного процесса скрининга с высокой пропускной способностью или отбору.
[0231] После идентификации полипептиды и пептиды согласно настоящему описанию могут быть синтетическими или полипептидами, полученными рекомбинантным образом. Экспрессию пептидов и белков можно рекомбинантным образом осуществить in vitro или in vivo. Пептиды и полипептиды согласно настоящему описанию можно получить и выделить с применением любого способа, известного в данной области техники. Полипептид и пептиды согласно настоящему описанию также можно синтезировать полностью или частично с применением химических способов, хорошо известных в данной области техники. См., например, Caruthers (1980) «New chemical methods for synthesizing polynucleotides», Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980), «Synthesis of oligonucleotides on cellulose. Part II: design and synthetic strategy to the synthesis of 22 oligodeoxynucleotides coding for Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP)1», Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Ланкастер, штат Пенсильвания. Например, синтез пептидов можно осуществить с применением различных твердофазных методов (см., например, Roberge (1995) «А strategy for a convergent synthesis of N-linked glycopeptides on a solid support», Science 269:202; Merrifield (1997) «Concept and early development of solid-phase peptide synthesis», Methods Enzymol. 289:3-13), и автоматизированного синтеза можно достичь, например, с применением синтезатора пептидов ABI 43 IA (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя.
[0232] Пептиды и полипептиды согласно настоящему описанию также можно гликозилировать. Гликозилирование можно осуществить посттрансляционно, либо химически, либо при помощи механизмов клеточного биосинтеза, где последний включает применение известных мотивов гликозилирования, которые могут быть нативными для последовательности или которые можно добавить в качестве пептида или добавить в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты. Гликозилирование может быть О-связанным или N-связанным.
[0233] Пептиды и полипептиды согласно настоящему описанию, определенные выше, включают все формы «миметиков» и «пептидомиметиков». Термины «миметик» и «пептидомиметик» относятся к синтетическому химическому соединению, которое по существу обладает теми же структурными и/или функциональными характеристиками полипептидов согласно настоящему описанию. Миметик может либо полностью состоять из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо представлять собой химерную молекулу частично природных пептидов аминокислот и частично неприродных аналогов аминокислот. Миметик может также содержать любое количество консервативных замен природных аминокислот при условии, что такие замены также по существу не изменяют структуру и/или активность миметика. Как и в случае полипептидов согласно настоящему описанию, которые являются консервативными вариантами, проведение серии экспериментов определит, находится ли миметик в пределах объема указанного описания, т.е., что его структура и/или функция по существу не изменены.
[0234] Композиции миметиков полипептидов согласно настоящему описанию могут содержать любую комбинацию неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте композиции миметиков согласно настоящему описанию содержат одну или все из следующих трех структурных групп: а) группы сцепления остатков, отличные от природных амидных связей («пептидных связей»); b) неприродные остатки вместо встречающихся в природе аминокислотных остатков или с) остатки, которые индуцируют вторичную структурную мимикрию, т.е. индуцируют или стабилизируют вторичную структуру, например, бета-поворот, гамма-поворот, бета-лист, конформацию альфа-спирали и им подобные. Например, полипептид согласно настоящему описанию можно охарактеризовать как миметик, когда все или несколько его остатков соединены химическим путем, а не природными пептидными связями. Отдельные остатки пептидомиметиков можно соединить посредством пептидных связей, других химических связей или путем сопряжения, таких как, например, с применением глутаральдегида, N-гидроксисукцинимидных эфиров, бифункциональных малеимидов, N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) или N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIC). Связывающие группы, которые могут быть альтернативой традиционным амидным связям («пептидным связям»), включают, например, кетометилен (например, --С(.=O)--СН2 для --C(.=O)--NH--), аминометилен (CH2NH), этилен, олефин (СН.двойная связь.СН), тиоэфир (CH2--S)), тетразол (CN4-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см, например., Spatola (1983) в Химии и биохимии аминокислот, пептидов и белков, Vol. 7, pages 267-357, «Peptide Backbone Modifications», Marcell Dekker, Нью-Йорк).
[0235] Полипептид согласно настоящему описанию также можно охарактеризовать как миметик, содержащий все или некоторые неприродные остатки вместо встречающихся в природе аминокислотных остатков. Неприродные остатки хорошо описаны в научной и патентной литературе; несколько примеров природных композиций, подходящих в качестве миметиков остатков природных аминокислот, и руководящие принципы описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот можно получить путем замены, например, D- или L-нафилаланина; D- или L-фенилглицина; D- или L-2-тиенилаланина; D- или L-1,-2,3- или 4-пиренилаланина; D- или L-3-тиенилаланина; D- или L-(2-пиридинил)аланина; D- или L-(3-пиридинил)аланина; D- или L-(2-пиразинил)аланина; D- или L-(4-изопропил)фенилглицина; D-(трифторметил)фенилглицина; D-(трифторметил)фенилаланина; D-n-фторфенилаланина; D- или L-n-бифенилфенилаланина; D- или L-n-метоксибифенилфенилаланина; D- или L-2-индол(алкил)аланинов и D- или L-алкиланинов, где алкил может быть замещенным или незамещенным метилом, этилом, пропилом, гексилом, бутилом, пентилом, изопропилом, изобутилом, втор-изотиолом, изопентилом или некислотными аминокислотами. Ароматические кольца неприродной аминокислоты включают, например, тиазолил, тиофенил, пиразолил, бензимидазолил, нафтил, фуранил, пирролил и пиридиловые ароматические кольца.
[0236] Миметики кислотных аминокислот можно получить путем замены, например, некарбоксилатными аминокислотами при сохранении отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартил или глутамил) можно также селективно модифицировать посредством реакции с карбодиимидами (R'~N-C--N--R'), такими как, например, 1-циклогексил-3(2-мофолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3(4-азоний-4,4-диметолпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил также можно преобразовать в аспарагинильные и глутаминильные остатки при помощи реакции с ионами аммония. Миметики основных аминокислот можно получить путем замены на, например, (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислоты орнитин, цитруллин или (гуанидино)уксусную кислоту или (гуанидино)алкилуксусную кислоту, где алкил определен выше. Производное нитрила (например, содержащее CN-фрагмент вместо СООН) можно заместить на аспарагин или глутамин. Аспарагинильные и глутаминильные остатки можно дезаминировать до соответствующих аспартильных или глутамильных остатков. Миметики аргининового остатка можно получить посредством взаимодействия аргинила с, например, одним или более обычных реагентов, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, предпочтительно в щелочных условиях. Миметики тирозиновых остатков можно получить посредством взаимодействия тирозила с, например, ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. N-ацетилимидизол и тетранитрометан можно применять для получения О-ацетил-тирозильных соединений и 3-нитропроизводных соответственно. Миметики цистеиновых остатков можно получить посредством взаимодействия цистеиниловых остатков с, например, альфа-галогенацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и соответствующими аминами с получением карбоксиметил- или карбоксиамидометильных производных. Миметики цистеиновых остатков также можно получить посредством взаимодействия цистеиниловых остатков с, например, бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидозоил)пропионовой кислотой; хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом; метил-2-пиридилдисульфидом; п-хлормеркурибензоатом; 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Можно получить миметики лизина (и можно изменить аминоконцевые остатки) посредством взаимодействия лизинила с, например, с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот.Миметики лизина и других альфа-аминосодержащих остатков также можно получить посредством взаимодействия с имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, О-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и посредством катализируемых трансамидазой реакций с глиоксилатом. Миметики метионина можно получить посредством введения в реакцию с, например, метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3-или 4-метилпролин или 3,3-диметилпролин. Миметики гистидиновых остатков можно получить посредством взаимодействия гистидила с, например, диэтилпрокарбонатом или парабромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, те, которые получают путем гидроксилирования пролина и лизина; фосфорилирования гидроксильных групп серильных или треонильных остатков; метилирования альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилирования N-концевого амина; метилирования остатков амидов основной цепи или замены на N-метиламинокислоты или амидирования С-концевых карбоксильных групп.
[0237] Остаток, например, аминокислота полипептида согласно настоящему описанию, также можно заменить на аминокислоту (или остатком миметика пептида) противоположной хиральности. Таким образом, любую аминокислоту, встречающуюся в природе в L-конфигурации (которая также может упоминаться как R или S, в зависимости от структуры химического объекта), можно заменить на аминокислоту того же химического структурного типа или миметик пептида, но противоположной хиральности, называемую D-аминокислотой, однако ее также можно назвать R- или S-формой.
[0238] В настоящем описании также предложены способы модификации полипептидов согласно настоящему описанию либо посредством естественных процессов, таких как посттрансляционная обработка (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), либо при помощи методов химической модификации. Модификации могут происходить в любой области полипептида, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и амино или карбоксильные концы. Понятно, что такой же тип модификации может присутствовать в той же или различной степени на нескольких сайтах данного полипептида. Также данный полипептид может иметь множество модификаций. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, ПЭГилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гем-фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, циклизацию с поперечным сшиванием, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование ГФИ-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристолирование, окисление, пэгирование, протеолитическую обработку, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование и опосредованное переносом РНК добавление аминокислот в белок, такое как аргилирование. См., например, Creighton, Т.Е., Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, Нью-Йорк (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, В.C. Johnson, Ed., Academic Press, Нью-Йорк, pages 1-12 (1983).
[0239] Спсобы твердофазного химического синтеза пептидов также можно применять для синтеза полипептида или фрагментов согласно настоящему изобретению. Такие методы были известны в данной области технике с начала 1960-х годов (Merrifield, R.B. «Solid-phase synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide», J. Am. Chem. Soc, 85: 2149-2154, 1963) (см. также Stewart, J.M. и Young, J.D, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, 111., pages 11-12)), и недавно их применяли в коммерчески доступных наборах для синтеза и разработки пептидов в лабораторных условиях (Cambridge Research Biochemicals). Такие коммерчески доступные лабораторные наборы в целом использовали учения Н.М. Geysen и др. «Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid», Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3998 (1984) и обеспечивали синтез пептидов на кончиках множества «стержней» или «шпилек», все из которых соединены с одним планшетом. При использовании такой системы планшет, содержащий стержни или шпильки, переворачивают и вставляют во второй планшет со соответствующими лунками или резервуарами, которые содержат растворы для присоединения или прикрепления соответствующей аминокислоты к кончикам стрежней или шпилек. Повторяя эту стадию процесса, т.е. переворачивая и вставляя кончики стержней и шпилек в соответствующие растворы, аминокислоты встраиваются в нужные пептиды. Кроме того, существует ряд доступных систем для осуществления синтеза пептидов с применением FMOC. Например, сборка полипептида или фрагмента можно осуществить на твердой подложке с применением автоматизированного пептидного синтезатора Model 431 А™ от Applied Biosystems, Inc. Такое оборудование обеспечивает свободный доступ к пептидам согласно настоящему описанию либо посредством прямого синтеза, либо посредством синтеза ряда фрагментов, связывание которых можно осуществить с применением других известных методов.
[0240] Синтетический полипептид или его фрагмент можно выделить и очистить при помощи известных способов, включая осаждение с применением сульфата аммония или этанола, кислотную экстракцию, анионо- или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и лектиновую хроматографию. При необходимости в завершении конфигурации указанного полипептида можно применять стадии рефолдинга белка. Если необходимо, можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) для окончательных стадий очистки.
[0241] В настоящем описании предложен вариант условно активного белка или состав, который содержит по меньшей мере один из вариантов белка, при этом указанный препарат является жидким или сухим. Состав белка необязательно содержит буфер, кофактор, второй или дополнительный белок или одно или более вспомогательных веществ. В одном аспекте указанный состав используют в качестве терапевтического условно активного биологического белка, который активен при аберрантных или нефизиологических условиях, однако менее активен или неактивен при нормальном физиологическом условии, например, температуре, рН или осмотическом давлении, окислительном стрессе или осмоляльности.
[0242] Стандартные методы очистки можно использовать либо для рекомбинантных, либо для синтетических условно активных биологических белков.
[0243] Скрининг мутантов для идентификации обратимых или необратимых мутантов
[0244] Идентификацию желаемых молекул наиболее прямым путем осуществляют посредством измерения активности белка при пермиссивном условии и при условии дикого типа. Затем можно отобрать мутантов с наибольшим отношением активности (пермиссивный/дикий тип), а пермутации точечных мутаций получают посредством комбинирования индивидуальных мутаций с применением стандартных способов. В библиотеке белков с комбинированными пермутациями затем проводят скрининг на те белки, которые показывают самую большую дифференциальную активность между пермиссивным условием и условием дикого типа.
[0245] Скрининг активности супернатанов можно осуществить с применением множества способов, например, применяя исследования активности с высокой пропускной способностью, таких как исследования флуоресценции, для идентификации мутантов белков, которые чувствительны по какой-либо желаемой характеристике (температура, рН и т.п.). Например, для проведения скрининга на временно чувствительных мутантов, энзиматическую активность или активность антител каждого индивидуального мутанта определяют при пониженных температурах (таких как 25 градусов Цельсия) и при температурах, при которых функционирует исходный белок (таких как 37 градусов Цельсия) с применением коммерчески доступных субстратов. Реакции изначально можно провести в формате многолуночного анализа, таком как 96-луночный анализ, и подтвердить с применением различных форматов, таких как формат 14-миллилитровых пробирок.
[0246] В настоящем описании также предложен скрининговый анализ для идентификации фермента, причем анализ включает: (а) обеспечение множества нуклеиновых кислот или полипептидов; (b) получение кандидатов полипептидов для проведения исследований на ферментативную активность из указанного множества; (с) анализ указанных кандидатов на ферментативную активность и (d) идентификацию тех кандидатов полипептидов, которые проявляют повышенную ферментативную активность при аберрантных или нефизиологических условиях и пониженную ферментативную активность по сравнению с белком фермента дикого типа при нормальном физиологическом условии, например, температуре, рН, окислительном стрессе, осмоляльности, концентрации электролита или осмотического давления.
[0247] В одном аспекте указанный способ дополнительно включает модификацию по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты или полипептида перед проведением анализа указанных кандидатов на определение условной биологической активности, в другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение улучшенной экспрессии полипептида в клетке-хозяине или организме-хозяине, в еще одном аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности в диапазоне рН от приблизительно рН 3 до приблизительно рН 12. В еще одном аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности в диапазоне рН от приблизительно рН 5 до приблизительно рН 10. В еще одном аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности в диапазоне рН от приблизительно рН 6 до приблизительно рН 8. В еще одном аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности при рН 6,7 и рН 7,5. В другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности в диапазоне температур от приблизительно 4 градусов С до приблизительно 55 градусов С. В другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности в диапазоне температур от приблизительно 15 градусов С до приблизительно 47 градусов С. В другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности в диапазоне температур от приблизительно 20 градусов С до приблизительно 40 градусов С. В другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности в диапазоне температур от приблизительно 25 градусов С до приблизительно 37 градусов С. В другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности при нормальном осмотическом давлении и абберантном (положительном или отрицательном) осмотическом давлении. В другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности при нормальной концентрации электролита и аберрантной (положительной или отрицательной) концентрации электролитов. Концентрацию исследуемого электролита выбирают из концентрации кальция, натрия, калия, магния, хлорида, бикарбоната и фосфата, в другом аспекте стадия исследования (с) дополнительно включает анализ на определение ферментативной активности, которая приводит к стабилизированному продукту реакции.
[0248] В другом аспекте настоящего описания предложено очищенное антитело, которое специфическим образом связывается с полипептидом согласно настоящему описанию или его фрагментом, обладающим ферментативной активностью. В одном аспекте указанного описания предложен фрагмент указанного антитела, который специфическим образом связывается с полипептидом, обладающим ферментативной активностью.
[0249] Антитела и основанные на антителах способы скрининга
[0250] В настоящем описании предложены изолированные или рекомбинантные антитела, которые специфическим образом связываются с ферментом согласно настоящему описанию. Эти антитела можно применять для выделения, идентификации или количественной оценки ферментов согласно настоящему описанию или родственных полипептидов. Данные антитела можно применять для выделения других полипептидов в пределах объема настоящего описания или других родственных ферментов. Антитела можно разработать для связывания с активным сайтом фермента. Таким образом, в настоящем описании предложены способы ингибирования ферментов с применением антител согласно настоящему описанию.
[0251] Указанные антитела можно применять в иммунопреципитации, окрашивании, иммуноаффинных колонках и им подобном. Если необходимо, то последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие специфичные антигены, можно получить при помощи иммунизации с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификации или клонирования и иммобилизации полипептида на панели согласно настоящему описанию. В альтернативном варианте способы согласно настоящему описанию можно применять для модификации структуры антитела, образуемого модифицированной клеткой, например, можно повысить или понизить аффинность антитела. Кроме того, способность создавать или модифицировать антитела может представлять собой фенотип, сконструированный в клетке при помощи способов согласно настоящему описанию.
[0252] Способы иммунизации, получения и выделения антитела (поликлональных и моноклональных) известны специалистам в данной области техники и описаны в научной и патентной литературе, см., например, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, Нью-Йорк (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Лос Альтос, штат Калифорния («Stite»); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, Нью-Йорк (1986); Kohler (1975) «Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity», Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Нью-Йорк. В дополнение к традиционным способам in vivo с применением животных, антитела также можно получить in vitro, например, с применением библиотеки фаговых дисплеев, экспрессирующих сайты связывания рекомбинантных антител. См., например, Hoogenboom (1997) «Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies», Trends Biotechnol. 15:62-70 и Katz (1997) «Structural and mechanistic determinants of affinity and specificity of ligands discovered or engineered by phage display», Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45.
[0253] Полипептиды или пептиды можно применять для получения антител, которые специфическим образом связываются с полипептидами, например, с ферментами согласно настоящему описанию. Полученные антитела можно применять в процедурах иммуноаффинной хроматографии для выделения или очистки указанного полипептида или чтобы определить, присутствует ли указанный полипептид в биологическом образце. В таких процедурах препарат белка, такой как экстракт, или биологический образец вводят в контакт с антителом, способным специфически связываться с одним из полипептидов согласно настоящему описанию.
[0254] В иммуноаффинных процедурах, указанное антитело прикрепляют к твердой подложке, такой как бусина, или другому матриксу колонки. Препарат белка находится в контакте с антителом в условиях, при которых указанное антитело специфическим образом связывается с одним из полипептидов согласно настоящему описанию. После промывки для удаления неспецифически связанных белков, связавшиеся специфическим образом полипептиды элюируют.
[0255] Способность белков в биологическом образце связываться с антителом можно определить при помощи любой из множества процедур, знакомых специалистам в данной области техники. Например, связывание млжно определить путем мечения указанного антитела детектируемой меткой, такой как флуоресцентный агент, энзиматическая метка или радиоактивный изотоп. В альтернативном варианте связывание антитела с указанным образцом можно обнаружить при помощи вторичных антител, имеющих на себе такую детектируемую метку. Конкретные анализы включают ИФА-анализы, сэндвич-анализы, радиоиммуноанализы и вестерн-блоттинг.
[0256] Поликлональные антитела, полученные против полипептидов согласно настоящему описанию, можно получить посредством прямой инъекции полипептидов животному или путем введения полипептидов животному, не являющихся человеком. Антитело, полученное таким способом, затем связывается с самим полипептидом. Таким образом, даже последовательность, кодирующая только фрагмент указанного полипептида, можно применять для получения антител, которые могут связываться с целым нативным полипептидом. Такие антитела затем можно применять для выделения указанного полипептида из клеток, экспрессирующих данный полипептид.
[0257] Для получения моноклональных антител можно применять любой метод, который обеспечивает антитела, получаемые при помощи стабильных культур линии клеток. Примеры включают гибридомный метод, триомный метод, гибридомный метод В-клеток человека и EBV-гибридомный метод (см., например, Cole (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
[0258] Методы, описанные для получения одноцепочечного антитела (см., например, патент США №4946778) можно адаптировать для получения одноцепочечного антитела с полипептидами согласно настоящему описанию. В альтернативном варианте можно применять трансгенных мышей для экспрессии гуманизированных антител против данных полипептидов или их фрагментов. Антитела, созданные против полипептидов согласно настоящему описанию, можно применять в скрининге на схожие полипептиды (например, ферменты) из других организмов и образцов. В таких методах полипептиды, полученные из организма, вводят в контакт с антителом, и обнаруживают те полипептиды, которые специфическим образом связываются с указанным антителом. Любую из описанных выше процедур можно применять для обнаружения связывания антител.
[0259] Методы скрининга и устройства для отслеживания в режиме «on-line»
[0260] При применении на практике способов согласно настоящему описанию, можно применять множество приборов и методов в сочетании с полипептидами и нуклеиновыми кислотами согласно настоящему описанию, например, для проведения скрининга полипептидов на ферментативную активность, для проведения скрининга соединений в качестве потенциальных модуляторов, например, активаторов или ингибиторов, ферментативной активности, скрининга на антитела, которые связываются с полипептидом согласно настоящему описанию, на нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой согласно настоящему описанию, для проведения скрининга на клетки, экспрессирующие полипептид согласно настоящему описанию, и им подобные.
[0261] Панели или «биочипы»
[0262] Нуклеиновые кислоты или полипептиды согласно настоящему описанию можно иммобилизовать на панели или нанести на панель. Панели можно применять для проведения скрининга или отслеживания библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.п.) на их способность к связыванию с нуклеиновой кислотой или полипептидом согласно настоящему описанию или к модулированию их активности. Например, в одном аспекте настоящего описания отслеживаемый параметр представляет собой экспрессию транскрипта гена фермента. Один или более или все транскрипты клетки можно измерить посредством осуществления гибридизации образца, содержащего транскрипты указанной клетки или нуклеиновые кислоты, представляющие транскрипты или комплементарные транскриптам клетки, посредством осуществления гибридизации с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на панели или «биочипе». Путем применения «панели» нуклеиновых кислот на микрочипе, можно одновременно произвести количественную оценку некоторых или всех транскриптов клетки. В альтернативном варианте панели, содержащие геномную нуклеиновую кислоту, также можно применять для определения генотипа вновь сконструированного штамма, выполненного при помощи способов согласно настоящему описанию. «Панели полипептидов» также можно применять для проведения одновременной количественной оценки множества белков. Настоящее описание можно применить на практике с любой известной «панелью», также обозначаемой как «микропанель» или «панель нуклеиновых кислот», или «панель полипептидов», или «панель антител», или «биочип», или их вариациями. Панели в целом представляют собой множество «пятен» или «целевых элементов», каждый целевой элемент содержит определенное количество одной или более биологических молекул, например, олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности субстрата для специфичного связывания с образцом молекулы, например, транскриптов мРНК.
[0263] При применении на практике способов согласно настоящему описанию, любая известная панель и/или способ получения и применения панелей могут быть включены в целом или частично, или их вариации, как описано, например, в патентах США №№6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695; 6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098; 5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854; 5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; см. также, например, публикации WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; см. также, например, Johnston (1998) «Gene chips: Array of hope for understanding gene regulation)), Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) «Inexpensive Handheld Device for the Construction of High-Density Nucleic Acid Arrays», Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) «Direct hybridization of large-insert genomic clones on high-density gridded cDNA filter arrays)), Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) «Matrix-Based Comparative Genomic Hybridization: Biochips to Screen for Genomic Imbalances», Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) «Options Available-From Start to Finish~for Obtaining Expression Data by Microarray», Nature Genetics Supp.21:25-32. См. также опубликованные заявки на патенты США №№20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.
[0264] Капиллярные панели
[0265] Капиллярные панели, такие как GIGAMATRIX™ от Diversa Corporation, Сан Диего, штат Калифорния, можно применять в способах согласно настоящему описанию. Нуклеиновые кислоты или полипептиды согласно настоящему описанию можно иммобилизовать на панели или нанести на панель, включая капиллярные панели. Панели можно применять для проведения скрининга или отслеживания библиотеки композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.п.) на их способность к связыванию с нуклеиновой кислотой или полипептидом согласно настоящему описанию или к модулированию их активности. Капиллярные панели обеспечивают другую систему для удерживания и скрининга образцов. Например, прибор для скрининга образцов может содержать множество капилляров, сформированных в панель из прилегающих капилляров, в которой каждый капилляр содержит по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для удержания образца. Прибор может дополнительно содержать интерстициальный материал, расположенный между прилегающими капиллярами в указанной панели, и один или более референсных устройств индикации, сформированных в интерстициальном материале. Капилляр для скрининга образца, в котором указанный капилляр адаптирован для связывания в панели капилляров, может содержать первую стенку, определяющую просвет для удержания образца, и вторую стенку, сформированную из фильтрующего материала, для фильтрации энергии возбуждения, обеспечиваемой в просвете для возбуждения образца. Полипептид или нуклеиновую кислоту, например, лиганд, можно вводить в первый компонент в по меньшей мере части капилляра капиллярной панели. Каждый капилляр указанной капиллярной панели может содержать по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для удержания указанного первого компонента. Пузырек воздуха можно ввести в капилляр позади указанного первого компонента. Второй компонент можно ввести в капилляр, где указанный второй компонент отделен от указанного первого компонента пузырьком воздуха. Представляющий интерес образец можно вводить в качестве первой жидкости, меченной при помощи детектируемой частицы, в капилляр капиллярной панели, при этом каждый капилляр указанной капиллярной панели содержит по меньшей мере одну стенку, определяющую просвет для удержания указанной первой жидкости и указанной детектируемой частицы, и при этом по меньшей мере одну стенку покрывают связывающим материалом для связывания указанной детектируемой частицы с по меньшей мере одной стенкой. Способ может дополнительно включать удаление указанной первой жидкости из капиллярной трубки, где связана детектируемая частица, поддерживаемая внутри капилляра, и введение второй жидкости в капиллярную трубку. Капиллярная панель может содержать множество индивидуальных капилляров, содержащих по меньшей мере одну внешнюю стенку, определяющую просвет. Указанная внешняя стенка капилляра может представлять собой одну или более стенок, слитых вместе. Аналогичным образом, указанная стенка может определять просвет, который имеет цилиндрическую, квадратную, шестиугольную или любую другую геометрическую форму до тех пор, пока стенки образуют просвет для удержания жидкости или образца. Капилляры указанной капиллярной панели могут удерживаться вместе в непосредственной близости с образованием плоской структуры. Капилляры могут быть связаны друг с другом, будучи слитыми (например, если капилляры выполнены из стекла), склеенными, связанными или зажатыми бок о бок. Капиллярную панель можно образовать из любого числа индивидуальных капилляров, например, в диапазоне от 100 до 4000000 капилляров. Капиллярная панель может образовывать титровальный микропланшет, содержащий приблизительно 100000 или более индивидуальных капилляров, связанных друг с другом.
[0266] В некоторых вариантах реализации активность условно активного биологического белка согласно настоящему изобретению ингибируют при помощи малой молекулы при нормальном физиологическом условии, однако при абберантном условии ингибирование активности посредством той же самой малой молекулы не происходит или происходит на меньшем уровне. Например, активность условно активного биологического белка можно ингибировать при помощи кислорода, глюкозы или бикарбоната, который присутствует в определенной концентрации в плазме крови человека, однако активность одного и того же белка может быть ингибирована в меньшей степени или не ингибирована вообще в микроокружении опухоли, поскольку концентрация кислорода, глюкозы или бикарбоната может быть ниже в указанном микроокружении опухоли, чем в плазме крови человека.
[0267] В некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению может одновременно улучшать сродство к связыванию и селективность матричного полипептида. Например, начиная с матричного антитела, при помощи данного способа можно получить условно активное антитело, которое обладает как более высоким сродством к связыванию с антигеном, чем указанное матричное антитело при аберрантном условии, так и более высоким отношением активности при аберрантном условии к активности при нормальном физиологическом условии, чем указанное матричное антитело. В одном варианте реализации этих результаты достигают с применением комбинаторного синтеза белка (CPS), описанного в патенте США №8859467. Конкретно, CPS можно применять для одновременного включения мутаций, которые улучшают как условную активность, так и сродство, таким образом одновременно улучшая как сродство, так и селективность отобранных условно активных биологических белков.
[0268] Условия для проведения анализа
[0269] Нормальное физиологическое условие и аберрантное условие для проведения анализов, применяемых на стадии скрининга, можно осуществить с применением условия, выбранного из температуры, рН, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса, концентрации электролита, а также комбинаций двух или более таких условий. Например, нормальным физиологическим условием для температуры может являться нормальная температура тела человека в 37,0°С, в то время как аберрантным условием для температуры может быть температура, отличная от температуры в 37,0°С, такая как температура в микроокружении опухоли, которая может быть на 1-2°С выше нормальной физиологической температуры. В другом примере нормальное физиологическое условие и аберрантное условие также могут представлять собой нормальный физиологический рН в диапазоне 7,2-7,6 и аберрантный рН, как, например, в диапазоне 6,2-6,8, представленное в микроокружении опухоли.
[0270] Анализы как при нормальном физиологическом условии, так и при аберрантном условии можно производить в среде для анализа. Среда для анализа может представлять собой раствор, который может содержать, например, буфер, а также другие компоненты. Обычные буферы, которые можно применять в среде для анализа, включают цитратные буферы, такие как цитрат натрия, фосфатные буферы, бикарбонатные буферы, такие как буфер Кребса, фосфатно-солевой буфер (PBS), буфер Хэнкса, буфер Трис, буфер HEPES и т.д. Можно применять другие буферы, известные специалисту в данной области техники, которые являются подходящими для анализа. Эти буферы можно применять для имитации характеристики или компонента композиции физиологической жидкости человека или животного, такой как плазма крови или лимфатическая жидкость.
[0271] Растворы для анализа, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, могут содержать по меньшей мере один компонент, выбранный из неорганических соединений, ионов и органических молекул, предпочтительно тех, которые обычно встречаются в физиологической жидкости млекопитающего, такого как человек или животное. Примеры таких компонентов включают питательные компоненты и метаболиты, а также любые другие компоненты, которые можно обнаружить в физиологической жидкости. В настоящем изобретении предполагается, что этот компонент может являться или не являться частью буферной системы. Например, растворы для анализа могут представлять собой ФСБ с добавленным бикарбонат-ионом, где бикарбонат не является частью ФСБ. В альтернативном варианте бикарбонат-ион является частью бикарбонатного буфера.
[0272] Указанные неорганические соединения или ионы можно выбрать из одной или более борной кислоты, хлорида кальция, нитрата кальция, фосфата диаммония, сульфата магния, фосфата моноаммония, фосфата монокалия, хлорида калия, сульфата калия, сульфата меди, сульфата железа, сульфата марганца, сульфата цинка, сульфата магния, нитрата кальция, хелатов кальция, меди, железа, марганца и цинка, молибдата аммония, сульфата аммония, карбоната кальция, фосфата магния, бикарбоната калия, нитрата калия, соляной кислоты, диоксида углерода, серной кислоты, фосфорной кислоты, угольной кислоты, мочевой кислоты, хлористого водорода, мочевины, иона фосфора, серного иона, хлорид-иона, иона магния, иона натрия, иона калия, иона аммония, иона железа, иона цинка и иона меди.
[0273] Примеры нормальных физиологических концентраций некоторых указанных неорганических соединений включают: мочевую кислоту в диапазоне концентраций 2-7,0 мг/дл, ион кальция в диапазоне концентраций 8,2-11,6 мг/дл, хлорид-ион в диапазоне концентраций 355-381 мг/дл, ион железа в диапазоне концентраций 0,028-0,210 мг/дл, ион калия в диапазоне концентраций 12,1-25,4 мг/дл, ион натрия в диапазоне концентраций 300-330 мг/дл, карбоновую кислоты в диапазоне концентраций 15-30 мМ, ион цитрата в концентрации приблизительно 80 мкМ, гистидин-ион в диапазоне концентраций 0,05-2,6 мМ, гистамин-ион в диапазоне концентраций 0,3-1 мкМ, НАРТ-ион (гидрированный аденозинтрифосфат) в диапазоне концентраций 1-20 мкМ, и HADP-ион в диапазоне концентраций 1-20 мкМ.
[0274] В некоторых вариантах реализации ион, присутствующий в растворах для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия, выбирают из гидроксид-иона, галогенид-иона (хлорида, бромида, иодида), оксигалогенид-иона, сульфат-иона, иона магния, иона кальция, бисульфат-иона, карбонат-иона, бикарбонат-иона, сульфонат-иона, оксигалогенид-иона, нитрат-иона, нитрит-иона, фосфат-иона, гидрофосфат-иона, дигидрофосфат-иона, персульфат-иона, моноперсульфат-иона, борат-иона, иона аммония или органического иона, такого как карбоксилат-ион, фенолят-ион, сульфонат-ион (органосульфат, такой как метилсульфат), ванадат-ион, вольфрамат-ион, борат-ион, органоборонат-ион, цитрат-ион, оксалат-ион, ацетат-ион, пентаборат-ион, гистидин-ион и фенолят-ион.
[0275] Органические соединения, присутствующие в растворах для анализа, как при нормальном физиологическом условии, так и при аберрантном условии, можно выбрать, например, из аминокислот, таких как гистидин, аланин, изолейцин, аргинин, лейцин, аспарагин, лизин, аспарагиновая кислота, метионин, цистеин, фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин, глутамин, триптофан, глицин, валин, пирролизин, пролин, селеноцистеин, серин, тирозин и их смесей.
[0276] Примеры нормальной физиологической концентрации некоторых аминокислот включают: аланин в концентрации 3,97±0,70 мг/дл, аргинин в концентрации 2,34±0,62 мг/дл, глутаминовую кислоту в концентрации 3,41±1,39 мг/дл, глутамин в концентрации 5,77±1,55 мг/дл, глицин в концентрации 1,77±0,26 мг/дл, гистидин в концентрации 1,42±0,18 мг/дл, изолейцин в концентрации 1,60±0,31 мг/дл, лейцин в концентрации 1,91±0,34 мг/дл, лизин в концентрации 2,95±0,42 мг/дл, метионин в концентрации 0,85±0,46 мг/дл, фенилаланин в концентрации 1,38±0,32 мг/дл, треонин в концентрации 2,02±6,45 мг/дл, триптофан в концентрации 1,08±0,21 мг/дл, тирозин в концентрации 1,48±0,37 мг/дл и валин в концентрации 2,83±0,34 мг/дл.
[0277] Органические соединения, присутствующие в растворах для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия, можно выбрать из небелковых азотсодержащих соединений, таких как креатин, креатинин, гуанидиноуксусная кислота, мочевая кислота, аллантоин, аденозин, мочевина, аммиак и холин. Примеры нормальных физиологических концентраций некоторых из данных соединений включают: креатин в концентрации 1,07±0,76 мг/дл, креатинин в концентрации от 0,9 до 1,65 мг/дл, гуанидиноуксусную кислоту в концентрации 0,26±0,24 мг/дл, мочевую кислоту в концентрации 4,0±2,9 мг/дл, аллантоин в концентрации от 0,3 до 0,6 мг/дл, аденозин в концентрации 1,09±0,385 мг/дл, мочевину в концентрации 27,1±4,5 мг/дл и холин в концентрации от 0,3 до 1,5 мг/дл.
[0278] Органические соединения, присутствующие в растворах для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия, можно выбрать из органических кислот, таких как лимонная кислота, α-кетоглутаровая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, ацетоуксусная кислота, β-гидроксимасляная кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, α-кетоновая кислота, уксусная кислота и летучих жирных кислоты. Примеры нормальных физиологических концентраций некоторых из данных органических кислот включают: лимонную кислоту в концентрации 2,5±1,9 мг/дл, α-кетоглутаровую кислоту в концентрации 0,8 мг/дл, янтарную кислоту в концентрации 0,5 мг/дл, яблочную кислоту в концентрации 0,46±0,24 мг/дл, ацетоуксусную кислоту в концентрации от 0,8 до 2,8 мг/дл, β-гидроксимасляную кислоту в концентрации 0,5±0,3 мг/дл, молочную кислоту в концентрации от 8 до 17 мг/дл, пировиноградную кислоту в концентрации 1,0±0,77 мг/дл, α-кетоновую кислоту в концентрации от 0,6 до 2,1 мг/дл, летучие жирные кислоты в концентрации 1,8 мг/дл.
[0279] Органические соединения, присутствующие в растворах для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия, можно выбрать из сахаров (углеводов), таких как глюкоза, пентоза, гексоза, ксилоза, рибоза, манноза и галактоза, а также дисахаридов, включая лактозу, GlcNAcβ1-3Gal, Galα1-4Gal, Manα1-2Маn, GalNAcβ1-3Gal и О-, N-, С- или S-гликозиды. Примеры нормальных физиологических концентраций некоторых из данных Сахаров включают: глюкозу в концентрации 83±4 мг/дл, полисахариды в концентрации 102±73 мг/дл (в виде гексозы), глюкозамин в концентрации 77-63 мг/дл, гексуронаты в концентрации от 0,4 до 1,4 мг/дл (в виде глюкуроновой кислоты) и пентозу в концентрации 2,55±0,37 мг/дл.
[0280] Органические соединения, присутствующие в растворах для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия, можно выбрать из жиров или их производных, таких как холестерин, лецитин, цефалин, сфингомиелин и желчная кислота. Примеры нормальных физиологических концентраций некоторых из данных соединений включают: свободный холестерин в концентрации от 40 до 70 мг/дл, лецитин в концентрации от 100 до 200 мг/дл, цефалин в концентрации от 0 до 30 мг/дл, сфингомиелин в концентрации от 10 до 30 мг/дл и желчных кислот в концентрации от 0,2 до 0,3 мг/дл (в виде желчной кислоты).
[0281] Органические соединения, присутствующие в растворах для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия, можно выбрать из таких белков, как фибриноген, антигемофильный глобулин, иммунный γ-глобулин, иммунные эуглобулины, изоагглютинины, β-псевдоглобулин, гликопротеины, липопротеины и альбумин. Например, нормальная физиологическая концентрация альбумина в сыворотке млекопитающих составляет 3,5-5,0 г/дл. В одном варианте реализации альбумин является бычьим сывороточным альбумином.
[0282] Органические соединения, присутствующие в растворах для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия, можно выбрать из таких витаминов, как витамин А, каротин, витамин Е, аскорбиновая кислота, тиамин, инозит, фолиевая кислота, биотин, пантотеновая кислота, рибофлавин. Примеры нормальных физиологических концентраций некоторых из данных витаминов включают: витамин А в концентрации от 0,019 до 0,036 мг/дл, витамин Е в концентрации от 0,90 до 1,59 мг/дл, инозитол в концентрации от 0,42 до 0,76 мг/дл, фолиевую кислоту в концентрации от 0,00162 до 0,00195 мг/дл и биотин в концентрации от 0,00095 до 0,00166 мг/дл.
[0283] Концентрация неорганического соединения, иона или органической молекулы в растворах для анализа (как для анализа при нормальном физиологическом условии, так и для анализа при аберрантном условии) может находиться в пределах диапазона нормальных физиологических концентраций указанного неорганического соединения, иона или органической молекулы в сыворотке крови человека или животного. Однако также можно применять концентрацию вне нормального физиологического диапазона. Например, величина нормального диапазона в сыворотке человека для ионов магния составляет 1,7-2,2 мг/дл и для ионов кальций составляет 8,5-10,2 мг/дл. Концентрация ионов магния в растворах для анализа может составлять от приблизительно 0,17 мг/дл до приблизительно 11 мг/дл. Концентрация ионов кальция в растворах для анализа может составлять от приблизительно 0,85 мг/дл до приблизительно 51 мг/дл. Как правило, концентрация неорганического соединения, иона или органической молекулы в растворах для анализа может составлять всего лишь 5% или 10%, или 20%, или 30%, или 40%, или 50%, или 60%, или 70%, или 80% от нормальной физиологической концентрации указанного неорганического соединения, иона или органической молекулы в сыворотке человека или может быть в 1,5 раза или в 2 раза, или в 3 раза, или в 4 раза, или 5 раз, или в 7 раз, или 9 раз или в 10 раз или даже в 20 раз больше нормальной физиологической концентрации указанного неорганического соединения, иона или органической молекулы в сыворотке человека. Различные компоненты растворов для анализа можно применять при различных уровнях концентрации по сравнению с их соответствующим уровнем нормальных физиологических концентраций.
[0284] Исследования при нормальном физиологическом условии и аберрантном условии применяют для измерения активности мутантных белков. Во время исследования в растворах для анализа присутствуют как мутантный белок, так и его партнер по связыванию. Связь между указанным мутантным белком и его партнером по связыванию может быть, например, вида антитело-антиген, лиганд-рецептор, фермент-субстрат или гормон-рецептор. Для того, чтобы мутантный белок проявил свою активность, указанный мутантный белок должен быть способен вступать в контакт со свои партнером по связыванию и связываться с ним. Затем мутантный белок проявляет активность на своем партнере по связыванию, и ее измеряют после связывания указанного мутантного белка и его партнера по связыванию.
[0285] В некоторых вариантах реализации применяемые в анализе ионы могут функционировать при образовании мостика между подвергаемым скринингу мутантным белком и его партнером по связыванию, в частности включая заряженные аминокислотные остатки. Таким образом, указанный ион может быть способен связываться как с мутантным белком, так и с его партнером по связыванию посредством водородных связей и/или ионных связей. Это может способствовать связыванию между указанным мутантным белком и его партнером по связыванию, тем самым позволяя иону достигать участка, который может быть труднодоступным для большой молекулы (мутантного белка или его партнера по связыванию). В некоторых случаях ион в растворах для анализа может увеличивать вероятность того, что мутантный белок и его партнер по связыванию свяжутся друг с другом. Кроме того, ион может дополнительно или альтернативно способствовать связыванию мутантного белка с его партнером по связыванию посредством связывания с большей молекулой (мутантным белком или его партнером по связыванию). Это связывание может изменить конформацию указанной большой молекулы и/или способствовать тому, что большая молекула остается в определенной конформации, которая облегчает связывание с ее партнером по связыванию.
[0286] Было обнаружено, что ионы могут способствовать связыванию между указанным мутантным белком и его партнером по связыванию, возможно, путем образования ионных связей с мутантным белком и его партнером по связыванию. Таким образом, скрининг может быть намного более эффективным и можно идентифицировать больше попаданий (кандидатов условно активных биологических белков) по сравнению с теми же исследованиями, проведенными без применения иона. Подходящие ионы можно выбрать из иона магния, сульфат-иона, бисульфат-иона, карбонат-иона, цитрат-иона, НАРТ-иона, HADP-иона, бикарбонат-иона, нитрат-иона, нитрит-иона, фосфат-иона, гидрофосфат-иона, дигидрофосфат-иона, персульфат-иона, моноперсульфат-иона, борат-ион, лактат-ион, цитрат-иона, гистидин-иона, гистамин-иона и ион аммония.
[0287] Было обнаружено, что ионы служат для содействия связыванию мутантного белка с его партнером по связыванию при рН приблизительно равном рKа иона. Такие ионы предпочтительно относительно малы по отношению к размеру указанных мутантных белков.
[0288] В одном варианте реализации, когда аберрантное условие представляет собой рН, отличающийся от нормального физиологического рН при нормальном физиологическом условии, ионы, подходящие для увеличения числа попаданий для условно активных биологических белков, можно выбрать из ионов, обладающих РKа, близким к аберрантному рН, которое исследуют в данном анализе. Например, величина рKа иона может лежать в пределах 1 единицу рН от аберрантного рН, 0,8 единицы рН от аберрантного рН, 0,6 единицы рН от аберрантного рН, 0,5 единицы рН от аберрантного рН, 0,4 единицы рН от аберрантного рН, 0,3 единицы рН от аберрантного рН, 0,2 единицы рН от аберрантного рН или 0,1 единицы рН от аберрантного рН.
[0289] Примеры рKа ионов, подходящих в настоящем изобретении, чьи рKа могут незначительно меняться при разных температурах, следующие: ион аммония, рKа которого составляет приблизительно 9,24, дигидрофосфат-ион, рKа которого составляет приблизительно 7,2, ион уксусной кислоты, обладающий рKа приблизительно 4,76, гистидин-ион, рKа которого составляет приблизительно 6,04, бикарбонат-ион, рKа которого составляет приблизительно 6,4, цитрат-ион, рKа которого составляет 6,4, лактат ион, рKа которого составляет приблизительно 3,86, гистамин-ион, рKа которого составляет приблизительно 6,9, НАТР-ион, рKа которого составляет 6,95 (НАТР3- ⇔ АТР4-+Н+) и HADP-ион, рKа которого составляет 6,88 (HADP3- ⇔ ADP4-+Н+).
[0290] В одном варианте реализации анализ и отбор условно активных биологических белков осуществляют в присутствии сероводорода. Сероводород обладает рKа 7,05. В некоторых вариантах реализации различные концентрации сероводорода можно применять в исследованиях, представляющих нормальные и аберрантные физиологические условия. В альтернативном варианте среда для анализа как при нормальном физиологическом условии, так и аберрантном условии содержит приблизительно одинаковую концентрацию сероводорода, а также имеет место некоторое различие в значении конкретного условия, например, анализ можно проводить при разных значениях рН. Применяемое в анализе концентрация сероводорода может составлять от 100 мкм до приблизительно 100 мМ. Предпочтительным образом, среда для анализа содержит сероводород в концентрации от 1 до 10 мМ или от 1 до 5 мМ, или от 1 до 3 мМ. Известно об исследованиях, проводимых в присутствии сероводорода.
[0291] В определенных вариантах реализации, когда известно рН для аберрантного условия (т.е. аберрантный рН), ион, подходящий для увеличения попаданий для кандидатов на условно активные биологические белки, можно выбрать из ионов, рKа которых совпадает с аберрантным рН или близко к него, например, значением рKа ионов-кандидатов может отличаться на приблизительно 1 единицу рН от аберрантного рН, 0,8 единиц рН от аберрантного рН, 0,6 единиц рН от аберрантного рН, 0,5 единиц рН от аберрантного рН, 0,4 единицы рН от аберрантного рН, 0,3 единицы рН от аберрантного рН, 0,2 единицы рН от аберрантного рН или 0,1 единицу рН от аберрантного рН.
[0292] Как было указано выше, ион наиболее эффективно способствует связыванию между мутантным белком и его партнером по связыванию при рН, который совпадает или близко к рKа указанного иона. Например, было обнаружено, что в растворе для анализа со значением рН 7,2-7,6 бикарбонат-ион (обладающий значением рKа приблизительно 6,4) не очень эффективен при содействии связывания мутантного белка с его партнером по связыванию. Поскольку значение рН в растворе для анализа уменьшался до 6,7 и далее до приблизительно 6,4, бикарбонат-ион становился все более эффективным при содействии связывания указанного мутантного белка с его партнером по связыванию. В результате в данном исследовании можно идентифицировать большее число попаданий при значении рН 6,4 по сравнению с анализом при значении рН 7,2-7,6. Аналогичным образом, гистидин не очень эффективен при содействии связывания мутантного белка с его партнером по связыванию при значении рН 7,4. Поскольку рН раствора для анализа понижается до 6,7 и далее до приблизительно 6,0, гистидин становится все более эффективным при содействии связывания мутантного белка с его партнером по связыванию, также способствуя идентификации большего числа попаданий в диапазоне значений рН, например, приблизительно 6,2-6,4.
[0293] Неожиданным образом в настоящем изобретении было обнаружено, что когда рН растворов для анализа для нормального физиологического условия (т.е. нормальное физиологический рН) и аберрантного условия (т.е. аберрантный рН) различны, ион, рKа которого находится в диапазоне от приблизительно средней величины между нормальным физиологическим значением рН и аберрантным рН до приблизительно аберрантного рН может значимым образом способствовать связыванию подвергаемого скринингу мутантного белка с его партнером по связыванию. В результате скрининговый анализ намного эффективнее при образовании большего числа попаданий или кандидатов условно биологических белков с высокой активностью при аберрантном условии.
[0294] В некоторых вариантах реализации рKа может даже по меньшей мере отличаться на одну единицу рН от аберрантного рН. Когда аберрантный рН является кислотным рН, рKа подходящего иона может находиться в диапазоне от (аберрантный рН -1) до средней величины между аберрантным рН и нормальным физиологическим рН. Когда аберрантный рН является основным рН, рKа подходящего иона может находиться в диапазоне от (аберрантный рН+1) до средней величины между аберрантным рН и нормальным физиологическим рН. Ионы можно выбрать из тех, которые описаны в данной заявке. Однако также можно применять еще много ионов, которые явно не описаны в данной заявке. Понятно, что после отбора аберрантного рН и нормального физиологического рН для проведения скрининговых анализов специалист в данной области техники может применять руководящие принципы настоящего изобретения для осуществления отбора любого иона с подходящим рKа для повышения эффективности скрининга при идентификации большего числа попаданий с высокой активностью при аберрантном условии.
[0295] Например, когда для примера скрининга аберрантный рН составляет 8,4, а нормальное физиологический рН составляет 7,4, любой ион, рKа которого составляет от приблизительно 7,9 (средняя величина) до 9,4 (т.е. 8,4+1), можно применять для проведения скрининга. Некоторые ионы с находящимися в данном диапазоне рKа включают ионы, полученные из трицина (рKа 8,05), гидразина (рKа 8,1), бицина (рKа 8,26), N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(4-бутансульфокислоты) (рKа 8,3), N-трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновой кислоты (рKа 8,4), таурина (рKа 9,06). В другом примере, когда для примера скрининга аберрантный рН равно 6, а нормальное физиологический рН составляет 7,4, любой ион, рKа которого составляет от приблизительно 5 (т.е. 6 - 1) до 6,7 (средняя величина), можно применять для проведения скрининга. Некоторые ионы с находящимися в данном диапазоне рKа включают ионы, полученные из малата (рKа 5,13), пиридина (рKа 5,23), пиперазина (рKа 5,33), какодилата (рKа 6,27), сукцината (рKа 5,64), 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (рKа 6,10), цитрата (рKа 6,4), гистидина (рKа 6,04) и бис-трис (6,46). Специалист в данной области техники сможет проконсультироваться с большим количеством химических руководств и текстовых книг для идентификации известных химических соединений, которые можно преобразовать в ионы, рKа которых находится в указанных диапазонах, включая как неорганические химические соединения, так и органические химические соединения. Среди указанных химических соединений с подходящим рKа могут быть предпочтительными те, которые обладают меньшей молекулярной массой.
[0296] Следовательно, в настоящем изобретении неожиданно было обнаружено, что получение условно активных биологических белков, которых в конечном счете идентифицируют, не только зависит от получения правильных мутантов белков из белка дикого типа, но и также зависит от применения иона с подходящим рKа в растворах для анализа. Изобретение предполагает, что в дополнение к получению большой библиотеки мутантных белков (например, через СРЕ и CPS), необходимо также предпринять усилия для поиска подходящего иона (с соответствующим рKа) для применения в растворах для анализа, поскольку ион может способствовать проведению отбора мутантов с высокой активностью из указанной большой библиотеки. Кроме того, предполагается, что без подходящего иона скрининг менее эффективен и вероятность нахождения мутантов с высокой активностью снижается. Следовательно, для получения такого же количества мутантов с высокой активностью без подходящего иона может потребоваться проведение нескольких циклов скрининга.
[0297] Ион в растворах для анализа можно образовать in situ из компонента раствора для анализа или он непосредственным образом может содержаться в растворе для анализа. Например, СO2 из воздуха может растворяться в растворе для анализа для получения карбонат- и бикарбонат-ионов. В другом примере в раствор для анализа можно добавить раствор дигидрофосфата натрия, чтобы получить дигидрофосфат-ионы.
[0298] Концентрация данного компонента в растворах для анализа (как для анализа при нормальном физиологическом условии, так и для анализа при аберрантном условии) может быть одинаковой или по существу одинаковой, как и концентрация того же компонента, который обычно обнаруживают во встречающейся природе физиологической жидкости млекопитающего, такого как человек. В других вариантах реализации концентрация указанного компонента может быть выше, особенно тогда, когда компонент представляет собой ион, который может функционировать для содействия связывания мутантного белка с его партнером по связыванию, поскольку было обнаружено, что более высокая концентрация такого иона может образовывать ионные связи с указанным мутантным белком и его партнером по связыванию, практическим образом способствовать связыванию и увеличивать вероятность обнаружения большего числа попаданий или кандидатов условно активных белков.
[0299] В некоторых вариантах реализации концентрация иона в растворе для анализа может положительно коррелировать с вероятностью обнаружения большего числа попаданий с применением анализа, особенно при использовании концентраций, превышающих нормальные физиологические концентрации. Например, концентрация бикарбонат-иона в сыворотке человека составляет приблизительно 15-30 мМ. В одном примере, когда концентрация бикарбонат-иона в растворе для анализа увеличивалась от 3 мМ до 10 мМ, от 20 мМ, до 30 мМ, от 50 мМ и до 100 мМ, число попаданий в анализе также увеличивалось с каждым увеличением концентрации бикарбоната. В связи с этим в растворе для анализа можно использовать концентрации бикарбоната, составляющие от приблизительно 3 мМ до приблизительно 200 мМ или от приблизительно 5 мМ до приблизительно 150 мМ, или от приблизительно 5 мМ до приблизительно 100 мМ, или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 ММ, или от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, или от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, или от приблизительно 30 мМ до приблизительно 100 мМ, или от приблизительно 35 мМ до приблизительно 100 мМ, или от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, или от приблизительно 50 ММ до приблизительно 100 мМ.
[0300] В другом варианте реализации концентрация цитрата в растворе для анализа может составлять от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 120 мкМ или от приблизительно 40 мкМ до приблизительно 110 мкМ, или от приблизительно 50 мкМ до приблизительно 110 мкМ, или от приблизительно 60 мкМ до приблизительно 90 мкМ или приблизительно мкМ.
[0301] Было установлено, что условно активные биологические белки содержат более высокую долю заряженных аминокислотных остатков по сравнению с белком дикого типа, из которого они получены. Например, существует три положительно заряженных аминокислотных остатка: лизин, аргинин и гистидин; и два отрицательно заряженных аминокислотных остатка: аспартат и глутамат. Эти заряженные аминокислоты чрезмерно представлены в отобранных условно активных биологических белках по сравнению с белками дикого типа, из которых осуществляют эволюционирование мутантных белков, и условно активные биологические белки отобраны из мутантных белков. Это может быть связано с применением ионов в растворах для анализа, поскольку более заряженные аминокислотные остатки могут образовывать больше водородных связей/ионных связей с указанными ионами.
[0302] В одном варианте реализации нормальное физиологическое условие представляет собой нормальное физиологический рН в диапазоне 7,2-7,6, а аберрантное условие представляет собой аберрантный рН в диапазоне 6,2-6,8. Раствор для анализа для проведения анализа при нормальном физиологическом условии обладает нормальным физиологическим рН и содержит 50 мМ бикарбонат-иона. Раствор для анализа для проведения анализа при аберрантном условии обладает аберрантным рН и содержит 50 мМ бикарбонат-иона. Поскольку рКа бикарбонат-иона составляет приблизительно 6,4, бикарбонат-ион может способствовать связыванию между мутантными белками и их партнерами по связыванию при аберрантном рН 6,2-6,8, таком как рН 6,4,
[0303] В еще одном варианте реализации нормальное физиологическое условие представляет собой нормальное физиологический рН в диапазоне 7,2-7,6, а аберрантное условие представляет собой аберрантный рН в диапазоне 6,2-6,8. Раствор для анализа для проведения анализа при нормальном физиологическом условии обладает нормальным физиологическим рН и содержит 80 мкМ цитрат-иона. Раствор для анализа для проведения анализа при аберрантном условии обладает аберрантным рН и содержит 50 мМ цитрат-иона. Поскольку рKа цитрат-иона составляет 6,4, цитрат-ион может способствовать связыванию между мутантными белками и партнером по связыванию в растворе для анализа при аберрантном условии с рН 6,2-6,8. Поэтому можно идентифицировать большее количество кандидатов условно активных биологических белков, которые обладают более высокой связывающей активностью при условии рН 6,4 и более низкой активностью в условиях рН 7,2-7,8. Другие ионы, включая ионы уксусной кислоты, гистидина, бикарбоната, НАТР и HADP, функционируют аналогичным образом, что позволяет осуществлять эффективный скрининг раствора для анализа, содержащего указанный ион, на мутантные белки с более высокой связывающей активностью при рН, приблизительно равном рKа указанного иона, и более низкой связывающей активностью при рН, который отличается от рKа указанного иона (например, нормальное физиологический рН).
[0304] В еще одном варианте реализации нормальное физиологическое условие представляет собой нормальную физиологическую температуру при 37°С, а аберрантное условие представляет собой аберрантную температуру при 38-39°С (температура в микроокружениях некоторых опухолей). Раствор для анализа для проведения анализа при нормальном физиологическом условии обладает нормальной физиологической температурой и содержит 70 мМ бикарбонат-иона. Раствор для анализа для проведения анализа при аберрантном условии обладает аберрантной температурой и содержит 70 мМ бикарбонат-иона.
[0305] В еще одном варианте реализации нормальное физиологическое условие представляет собой конкретную концентрацию электролита в нормальной сыворотке человека, а аберрантное условие представляет собой концентрацию одного и того же электролита в другой, аберрантной концентрации, которая может быть локализована в другом месте животного или человека или может являться результатом состояния животного или человека, которое изменяет нормальную физиологическую концентрацию электролита в сыворотке человека.
[0306] На связывание между мутантным белком и/или его партнером по связыванию также можно оказывать воздействие рядом других способов. Как правило, это воздействие оказывают посредством включения одного или более дополнительных компонентов в среду для анализа. Эти дополнительные компоненты могут быть сконструированы для взаимодействия либо с мутантным белком, либо партнером по связыванию, или с ними обоими. Кроме того, эти дополнительные компоненты могут применять комбинации двух или более взаимодействий, а также комбинации двух или более типов взаимодействий для воздействия на связывание.
[0307] В одном варианте реализации представляющее интерес связывающее взаимодействие осуществляется между и антителом, и антигеном. В этом варианте реализации один или более дополнительных компонентов можно включить в среду для анализа, чтобы оказывать воздействие на указанное антитело, антиген или и то, и другое. Таким образом, можно улучшить желаемое связывающее взаимодействие.
[0308] При добавлении к ионам, которые могут образовывать ионные связи с мутантным белком и/или его партнером по связыванию для содействия связывания между указанным мутантным белком и указанным партнером по связыванию, в настоящее изобретении также включены другие компоненты, которые можно использовать для содействия связывания мутантного белка с его партнером по связыванию. В одном варианте реализации используют молекулы, которые могут образовывать водородные связи с мутантным белком и/или его партнером по связыванию. В другом варианте реализации можно применять молекулы, которые способны к гидрофобному взаимодействию с мутантным белком и/или его партнером по связыванию. В еще одном варианте реализации подразумеваются молекулы, которые способны к Ван-дер-Ваальсовым взаимодействиям с мутантным белком и/или его партнером по связыванию.
[0309] В контексте настоящего описания «водородная связь» относится к относительно слабому нековалентному взаимодействию между водородом, ковалентно связанным с электроотрицательным атомом, таким как углерод, азот, кислород, сера, хлор или фтор (донор водородной связи), с неподеленной электронной парой атома донора электронов, такого как азот, кислород, сера, хлор или фтор (акцептор водородной связи).
[0310] Компоненты, способные к образованию водородной связи с мутантным белком и/или его партнером по связыванию, включают органические молекулы, а также неорганические молекулы с полярной связью. Мутантные белки и/или партнеры по связыванию для мутантных белков обычно содержат аминокислоты, которые могут образовывать водородные связи. Подходящие аминокислоты имеют боковую цепь с полярной группой, которая способна образовывать водородную связь. Неограничивающие примеры подходящих аминокислот включают глутамин (Gln), глутаминовую кислоту (Glu), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновую кислоту (Asp), лизин (Lys), гистидин (His), серин (Ser), треонин (Thr), тирозин (Туr), цистеин (Cys), метионин (Met) и триптофан (Тrр).
[0311] Эти аминокислоты могут функционировать в качестве как доноров водорода, так и акцепторов водорода. Например, атом кислорода в группе -ОН, как той, которую можно обнаружить в Ser, Thr и Туr, атом кислорода в группе -С=O, как той, которую можно обнаружить в Glu и Asp, атом серы в группе -SH или -SC-, как той, которую можно обнаружить в Cys и Met, атом азота в группе -NH3+, как той, которую можно обнаружить в Lys и Arg, и атом азота в группе -NH-, как той, которую можно обнаружить в Trp, His и Arg, могут функционировать в качестве акцептор водорода. Кроме того, группы в этом списке, содержащие атом водорода (например, -ОН, -SH, NH3+и -NH-), могут функционировать в качестве донора водорода.
[0312] В некоторых вариантах реализации остов мутантного белка и/или его партнера по связыванию также может участвовать в образовании одной или более водородных связей. Например, остов может содержать повторяющуюся структуру -(C=O)-NH-, такую как в пептидных связях. Атомы кислорода и азота в этой структуре могут функционировать в качестве акцепторов водорода, в то время как атом водорода может участвовать в образовании водородной связи.
[0313] Неорганические соединения, которые содержат по меньшей мере одну полярную связь, содержащую атом водорода или кислорода, который можно применять для связывания водорода, могут включать, например, H2О, NH3, Н2О2, гидразин, карбонаты, сульфаты и фосфаты. Органические соединения, такие как спирты; фенолы; тиолы; алифатические амины, амиды; эпоксиды, карбоновые кислоты; кетоны, альдегиды, простые эфиры, сложные эфиры, органохлориды и органофториды. Соединения, которые могут образовывать водородные связи, хорошо известны в химической литературе, например, как те, которые обсуждаются в «Природа химической связи» Линуса Полинга (Linus Pauling), издательство Корнеллского университета, 1940, страницы 284-334, раскрытие которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки для перечисления соединений, способных к взаимодействиям с образованием водородных связей.
[0314] В некоторых вариантах реализации спирты могут включать метанол, этанол, пропанол, изопропанол, бутанол, пентанол, 1-гексанол, 2-октанол, 1-деканол, циклогексанол и высшие спирты; диолы, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин, диэтиленгликоль и полиалкиленгликоли. Подходящие фенолы включают гидрохинон, резорцин, катехол, фенол, о-, м- и n-крезол, тимол, альфа- и бета-нафтол, пирогаллол, гваякол и флорглюцинол. Подходящие тиолы включают метантиол, этантиол, 1-пропантиол, 2-пропантиол, бутантиол, трет-бутилмеркаптан, пентантиолы, гексантиол, тиофенол, димеркаптоянтарную кислоту, 2-меркаптоэтанол и 2-меркаптоиндол. Подходящие амины включают метиламин, этиламин, пропиламин, изопропиламин, анилин, диметиламин и метилэтиламин, триметиламин, азиридин, пиперидин, N-метилпиперидин, бензидин, циклогексиламин, этилендиамин, гексаметилендиамин, о-, м- и n-толуидин и N-фенилпипередин. Подходящие амиды включают этанамид, N,N-диметилацетамид, N,N-диметилформамид, N,N-диметилметоксиацетамид и N-метил-N-п-цианоэтилформамид. Эпоксиды могут включать этиленоксид, пропиленоксид, трет-бутилгидропероксид, оксид стирола, эпоксид-глицидол, оксид циклогексена, ди-трет-бутилпероксид, гидропероксид кумола или гидропероксид этилбензола, изобутиленоксид и 1,2-эпоксиоктан. Карбоновые кислоты могут включать терефталевую кислоту, изофталевую кислоту, фталевую кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, уксусную кислоту, лауриновую кислоту, адипиновую кислоту, молочную кислоту, лимонную кислоту, акриловую кислоту, глицин, гексагидробензойную кислоту, о-, м- и п-толуиловые кислоты, никотиновую кислоту, изоникотиновую кислоту и парааминобензойную кислоту. Кетоны могут включать ацетон, 3-пропанон, бутанон, пентанон, метилэтилкетон, диизобутилкетон, этилбутилкетон, метилизобутилкетон, метил-трет-бутилкетон, циклогексанон, ацетон, метилэтилкетон, метилпропилкетон, метилбутилкетон, метиламилкетон, метилгексилкетон, диэтилкетон, этилбутилкетон, дипропилкетон, диизобутилкетон, диацетоновый спирт, форон, изофорон, циклогексанон, метилциклогексанон и ацетофенон. Альдегиды могут включать формальдегид, ацетальдегид, пропиональдегид, бутиральдегид, бензальдегид, циннамальдегид, собутиральдегид, валериановый альдегид, октальдегид, бензальдегид, циннамальдегид, циклогексанон, салицилальдегид и фурфурол. Сложные эфиры включают этилацетат, метилацетат, этилформиат, бутилацетат, этиллактат, этилбутират, пропилацетат, этилформиат, пропилформиат, бутилформиат, амилформиат, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат, амилацетат, метилизоциамилацетат, метоксибутилацетат, гексилацетат, циклогексилацетат, бензилацетат, метилпропионат, этилпропионат, бутилпропионат, амилпропионат, метилбутират, этилбутират, бутилбутират, амилбутират, метилацетоацетат и этилацетоацетат.Простые эфиры, которые можно применять в настоящем изобретении, включают диметиловый эфир, метилэтиловый эфир, диэтиловый эфир, метилпропиловый эфир и диметоксиэтан. Простые эфиры могут быть циклическими, такими как этиленоксид, тетрагидрофуран и диоксан.
[0315] Органохлориды включают хлороформ, пентахлорэтан, дихлорметан, трихлорметан, тетрахлорид углерода, тетрахлорметан, тетрахлорэтан, пентахлорэтан, трихлорэтилен, тетрахлорэтилен и этилендихлорид. Органофториды могут включать фторметан, дифторметан, трифторметан, трифторэтан, тетрафторэтан, пентафторэтан, дифторпропан, трифторпропан, тетрафторпропан, пентафторпропан, гексафторпропан и гептафторпропан,
[0316] По прочности связи водородные связи можно разделить на: сильные, умеренные или слабые водородные связи (Jeffrey, George A.; An introduction to hydrogen bonding, Oxford University Press, 1997). В сильных водородных связях расстояние донор-акцептор составляет 2,2-2,5 , и величины энергий находятся в диапазоне 14-40 ккал/моль. В умеренных водородных связях расстояние донор-акцептор составляет 2,5-3,2 , и величины энергий находятся в диапазоне 4-15 ккал/моль. В слабых водородных связях расстояние донор-акцептор составляет 3,2-4,0 , а величины энергий находятся в диапазоне <4 ккал/моль. Некоторыми примерами водородных связей с энергетическими уровнями являются F-H…:F (38,6 ккал/моль), О-Н…:N (6,9 ккал/моль), О-Н…O: (5,0 ккал/моль), N-H…:N (3,1 ккал/моль) и N-H…:O (1,9 ккал/моль). См. больше в Perrin и др. «Strong» hydrogen bonds in chemistry and biology, Annual Review of Physical Chemistry, vol. 48, pages 511-544, 1997; Guthrie, «Short strong hydrogen bonds: can they explain enzymic catalysis?» Chemistry & Biology March 1996, 3:163-170.
[0317] В некоторых вариантах реализации применяемые согласно настоящему изобретению компоненты могут образовывать сильную водородную связь с мутантным белком и/или его партнером по связыванию. Эти компоненты имеют атом с сильной электроотрицательностью. Атомами, которые, как известно, обладают наибольшей электроотрицательностью, являются F>O>Cl>Nb этом порядке. Таким образом, в настоящем изобретении предпочтительно применяют органическое соединение, которое содержит фтор, гидроксильную группу или карбонильную группу, при образовании водородной связи. В одном варианте реализации настоящего изобретения можно применять органический фтор для образования сильной водородной связи.
[0318] В другом варианте реализации используют компоненты, способные к гидрофобному взаимодействию с мутантным белком и/или его партнером по связыванию. Такие компоненты включают органические соединения с гидрофобной группой.
[0319] В контексте настоящего описания термин «гидрофобное взаимодействие» относится к обратимым образом взаимным взаимодействиям между гидрофобным соединением или гидрофобной областью соединения и другим гидрофобным соединением или гидрофобной областью другого указанного соединения. Этот тип взаимодействия описан в «Hydrophobic Interactions», A. Ben-Nairn (1980), Plenum Press, Нью-Йорк, раскрытие которого включено в настоящее описание посредством ссылки для описания гидрофобных взаимодействий.
[0320] От гидрофобным материалов молекулы воды отталкиваются вследствие их неполярной природы. Когда относительно неполярная молекула или группы в водном растворе ассоциируются с другими неполярными молекулами, а не с водой, это называют «гидрофобным взаимодействием».
[0321] Мутантные белки и их партнеры по связыванию обычно включают аминокислоты, которые способны к гидрофобным взаимодействиям. Эти аминокислоты обычно характеризуются наличием по меньшей мере одной боковой цепи с неполярной группой, способной к гидрофобному взаимодействию. Гидрофобные аминокислоты включают, например, аланин (Ala), изолейцин (Ilе), лейцин (Leu), фенилаланин (Phe), валин (Val), пролин (Pro), глицин (Gly), в меньшей степени, метионин (Met) и триптофан (Тrр).
[0322] Компоненты, которые способны к гидрофобным взаимодействиям с мутантным белком и/или его партнером по связыванию, включают органические соединения, которые являются гидрофобными молекулами или молекулами, содержащими по меньшей мере один гидрофобный фрагмент. В некоторых вариантах реализации этими гидрофобными компонентами могут являться углеводороды, выбранные из ароматических углеводородов, замещенных ароматических углеводородов, полиароматических углеводородов, ароматических или неароматических гетероциклов, циклоалканов, алканов, алкенов и алкинов. Гидрофобные группы могут включать ароматические группы, алкильные, циклоалкильные, алкенильные и алкинильные группы. В контексте настоящего описания термины «алкил», «алкенил» и «алкинил» относятся к ненасыщенным алифатическим группам, содержащим от одного до тридцати атомов углерода, включая алкенильные/алкинильные группы с неразветвленной цепью, алкенильные/алкинильные группы с разветвленной цепью, циклоалкенильные (алициклические) группы, алкилзамещенные циклоалкильные группы и циклоалкилзамещенные алкенильные/алкинильные группы. Такие углеводородные фрагменты также могут быть заменены на один или более атомов углерода.
[0323] Понятно, что сила гидрофобного взаимодействия основана на доступном количестве «гидрофобных частиц», которые могут взаимодействовать друг с другом. Таким образом, гидрофобное взаимодействие можно регулировать, например, увеличением количества гидрофобного фрагмента в молекулах, участвующих в гидрофобном взаимодействии, и/или повышением его «гидрофобной» природы. Например, гидрофобный фрагмент, который в своей первоначальной форме может содержать углеводородную цепь, можно модифицировать для увеличения его гидрофобности (способность увеличивать силу гидрофобного взаимодействия участвующего фрагмента) путем присоединения гидрофобной боковой цепи к одному из атомов углерода его углеродной основной цепи. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения это может включать присоединение различных полициклических соединений, включая, например, различные стероидные соединения и/или их производные, такие как соединения типа стерола, более конкретно холестерин. В целом боковые цепи могут представлять собой линейные цепи, ароматические, алифатические, циклические, полициклические или любые другие типы гидрофобных боковых цепей, как это предусмотрено специалистами в данной области техники.
[0324] Тип компонентов, которые способны к Ван-дер-ваальсовым взаимодействиям с мутантным белком и/или его партнером по связыванию, обычно, но не всегда, соединяется с полярным фрагментом. В контексте настоящего описания «Ван-дер-Ваальсовые взаимодействия» относятся к притяжению между атомами, фрагментами, молекулами и поверхностями, которые вызваны диполь-дипольными взаимодействиями и/или корреляциями в флуктуирующих поляризациях соседних атомов, фрагментов или молекул вследствие квантовой динамики.
[0325] Ван-дер-Ваальсовые взаимодействия в настоящем изобретении представляют собой силы притяжения между мутантными белками или партнерами по связыванию и компонентом. Ван-дер-Ваальсовые взаимодействия могут возникать из трех источников. Во-первых, некоторые молекулы/фрагменты, хотя и электрически нейтральны, могут представлять собой постоянные электрические диполи. Вследствие фиксированного искажения в распределении заряда электронов в структуре некоторых молекул/фрагментов одна сторона молекулы/фрагмента всегда несколько положительна, а противоположная сторона несколько отрицательна. Тенденция таких постоянных диполей к взаимному выравниванию приводит к возникновению чистой силы притяжения. Это взаимодействие между двумя постоянными диполями (сила Кизома).
[0326] Во-вторых, наличие молекул, которые являются постоянными диполями, может временно искажать заряд электрона в других соседних полярных или неполярных молекулах, тем самым индуцируя дальнейшую поляризацию. Дополнительная сила притяжения возникает вследствие взаимодействия постоянного диполя с соседним индуцированным диполем. Это взаимодействие между постоянным диполем и соответствующим индуцированным диполем можно назвать силой Дебая. В-третьих, хотя ни одна из участвующих молекул не является постоянным диполем (например, органический жидкий бензол), существует сила притяжения между молекулами с двумя мгновенно индуцированными диполями в указанных молекулах. Это взаимодействие между двумя мгновенно индуцированными диполями можно назвать дисперсионной силой Лондона.
[0327] Существует много аминокислот в мутантном белке и/или партнере по связыванию, которые способны к Ван-дер-ваальсовым взаимодействиям. Эти аминокислоты могут содержать полярные боковые цепи, включая глутамин (Gln), аспарагин (Asn), гистидин (His), серии (Ser), треонин (Thr), тирозин (Туr), цистеин (Cys), метионин (Met), триптофан (Тrр). Эти аминокислоты могут также содержать боковую цепь с неполярной группой, включая аланин (Ala), изолейцин (Ilе), лейцин (Leu), фенилаланин (Phe), валин (Val), пролин (Pro), глицин (Gly).
[0328] Компоненты, способные к Ван-дер-ваальсовым взаимодействиям с мутантным белком и/или его партнером по связыванию, включают полярные или неполярные неорганические соединения, которые растворимы в растворе для анализа. Раствор для анализа в целом представляет собой водный раствор, и вследствие этого данные полярные или неполярные неорганические соединения предпочтительным образом растворяются в воде. Предпочтительными материалами для Ван-дер-ваальсовых взаимодействий являются те материалы, которые являются полярными, так что они способны к диполь-дипольным взаимодействиям. Например, AlF3 содержит полярные связи Al-F и он растворим в воде (приблизительно 0,67 г/100 мл воды при 20°С). HgCl2 содержит полярные связи Hg-Cl и он растворим в воде в концентрации 7,4 г/100 мл при 20°С. РrСl2 содержит полярные связи Рr-Сl и он растворим в воде в концентрации приблизительно 1 г/100 мл при 20°С.
[0329] Подходящие полярные соединения, которые способны к Ван-дер-ваальсовым взаимодействиям, включают спирты, тиолы, кетоны, амины, амиды, сложные эфиры, простые эфиры и альдегиды. Подходящие примеры этих соединений были описаны выше в отношении водородной связи. Подходящие неполярные соединения, которые способны к Ван-дер-ваальсовым взаимодействиям, включают ароматические углеводороды, замещенные ароматические углеводороды, полиароматические углеводороды, ароматические или неароматические гетероциклы, циклоалканы, алканы, алкены, алкины.
[0330] Компоненты, способные к образованию водородных связей, гидрофобные компоненты и компоненты, способные к Ван-дер-Ваальсовым взаимодействиям, можно использовать для воздействия на связывание мутантного белка и его партнера по связыванию при помощи нескольких способов. В одном варианте реализации посредством водородных связей, гидрофобного взаимодействия и/или Ван-дер-Ваальсового взаимодействия может образовываться мостик между мутантным белком и его партнером по связыванию. Такой мостик может привести указанный мутантный белок и партнера по связыванию в более тесную близость друг к другу, способствуя связыванию и/или расположению указанного мутантного белка и/или партнера по связыванию относительно друг друга таким образом, которое облегчает связывание.
[0331] В другом варианте реализации взаимодействие с образованием водородных связей и/или гидрофобное взаимодействие может увеличивать вероятность связывания мутантного белка с его партнером по связыванию, например, посредством того, что белки и партнеры по связыванию группируются или ассоциируются друг с другом способом, который увеличивает вероятность связывания. Таким образом, одно или более из этих взаимодействий можно применять по отдельности или в комбинации для того, чтобы сгруппировать мутантные белки и партнеры по связыванию на более близком друг к другу расстоянии или для того, чтобы расположить мутантные белки и партнеров по связыванию способом, который способствует связыванию, например, приводя к тому, что сайты связывания сближаются друг с другом или к тому, что не способные к связыванию части молекул удаляются друг от друга, тем самым способствуя более близкому расположению указанных сайтов связывания друг с другом.
[0332] В еще одном варианте реализации взаимодействие с образованием водородных связей и/или гидрофобное взаимодействие может воздействовать на конформацию мутантного белка и/или его партнера по связыванию с обеспечением конформации, которая более способствует связыванию указанного мутантного белка с его партнером по связыванию. Конкретным образом, связывание или взаимодействие с одной или более аминокислотами указанного мутантного белка и/или партнера по связыванию может вызвать один или более конформационных сдвигов в указанном мутантном белке или партнере по связыванию, что благоприятствует реакции связывания мутантного белка/партнера по связыванию.
[0333] В настоящем изобретении проводят две пары анализов, одно для поиска уменьшения активности для мутантного белка в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с белком, из которого был получен указанный мутантный белок при указанном нормальном физиологическом условии, а другое для поиска увеличения активности мутантного белка в анализе при аберрантном условии по сравнению с белком, из которого был получен указанный мутантный белок при указанном аберрантном условии. В некоторых случаях белок, из которого был получен указанный мутантный белок, будет белком дикого типа. В других случаях белок, из которого был получен указанный мутантный белок, сам по себе может быть мутантным белком, который получали с применением одного или более методов мутации, описанных в других частях настоящего документа.
[0334] Условие, применяемое в паре анализов согласно настоящему изобретению, можно выбрать из температуры, рН, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса, концентрации электролита и концентрации любого другого компонента раствора или среды для анализа. Таким образом, конкретный компонент среды для анализа можно применять при по существу одинаковой концентрации в обеих парах анализов. В этом случае указанный компонент обычно присутствует с целью имитации конкретного окружения в организме человека или животного, такого как сыворотка, микроокружение опухоли, окружение мышц, окружение нейронов или любой другое окружение, которое можно обнаружить в точке введения, через которое может перемещаться средство для лечения или которое можно обнаружить в точке введения лекарственного средства. Одним из важных аспектов отбора одного или более компонентов, имитирующих эти среды, является, что он может улучшать результаты процесса отбора, проведенного с приведением пары анализов. Например, имитация конкретной среды позволяет оценить различные эффекты воздействия конкретных компонентов данной среды на мутантные белки в процессе отбора. Компоненты конкретной среды могут, например, изменять или связываться с указанным мутантным белком, ингибировать активность указанного мутантного белка, инактивировать указанный мутантный белок и т.д.
[0335] В некоторых вариантах реализации один или более компонентов растворов для анализа предпочтительным образом представляют собой малые молекулы, такие как сероводород, бикарбонат, гистамин, молочная кислота и уксусная кислота. В одном варианте реализации указанный низкомолекулярный компонент предпочтительно присутствует в растворе для анализа в концентрации от приблизительно 100 мкм до приблизительно 100 мМ или, более предпочтительно, от приблизительно 0,5 до приблизительного мМ, или от приблизительно 1 до приблизительно 10 мМ.
[0336] Концентрация компонента в растворах для анализа может быть одинаковым или по существу одинакова с концентрацией того же компонента, которая обычно присутствует во встречающейся в природе физиологической жидкости млекопитающего, такого как человек. Это можно назвать нормальной физиологической концентрацией компонента в физиологической жидкости. В других вариантах реализации концентрация конкретного компонента в растворах для анализа может быть меньше или больше, чем значение концентрации того же компонента, которая обычно присутствует во встречающейся в природе физиологической жидкости млекопитающего, такого как человек.
[0337] В другом варианте реализации компонент может присутствовать при по существу различных концентрациях в каждой из пар анализов. В этом случае присутствие, отсутствие или концентрация компонента становится условием, которое исследуют, поскольку именно концентрация указанного компонента является условием, которое отличает растворы для анализа для проведения анализа при нормальном физиологическом условии и раствор для анализа для проведения анализа при аберрантном условии. Таким образом, условно активный биологический белок, полученный при помощи данного варианта реализации способа согласно настоящему изобретению, будет отобран для активности по меньшей мере частично зависящей от концентрации указанного компонента.
[0338] В некоторых вариантах реализации указанный компонент может присутствовать в одной паре растворов для анализа, но полностью отсутствует в другой паре растворов для анализа. Например, концентрацию молочной кислоты в растворе для анализа для аберрантного условия можно установить на уровне, имитирующем концентрацию молочной кислоты в микроокружении опухоли. Молочная кислота может отсутствовать в паре растворов для анализа для нормального физиологического условия.
[0339] В одном варианте реализации нормальное физиологическое условие представляет собой первую концентрацию молочной кислоты, представляющее нормальное физиологическое условие, а аберрантное условие представляет собой вторую концентрацию молочной кислоты, представляющую аберрантное условие, которое существует в определенном участке в организме.
[0340] В другом примере глюкоза может отсутствовать в растворе для анализа для аберрантного условия для имитации отсутствия глюкозы, которую можно обнаружить в микроокружении опухоли, тогда как концентрацию глюкозы можно установить на уровне, который имитирует концентрацию глюкозы в плазме крови в паре растворов для анализа для проведения анализа для нормального физиологического условия. Эту отличительную черту можно применять для предпочтительной доставки условно активного биологического белка в участок или окружение без какой-либо или с минимальной активностью в процессе транспортировки и активации условно активного биологического белка при его поступлении в окружение, где указанный компонент присутствует в концентрации в растворе для анализа для аберрантного условия.
[0341] Например, микроокружение опухоли обычно содержит как более низкую концентрацию глюкозы, так и более высокую концентрацию молочной кислоты по сравнению с сывороткой человека. Нормальная физиологическая концентрация глюкозы составляет от приблизительно 2,5 мМ до приблизительною мМ в сыворотке. С другой стороны, концентрация глюкозы обычно очень мала в диапазоне от 0,05 мМ до 0,5 мМ в микроокружении опухоли. В одном варианте реализации в растворе для анализа для проведения анализа при нормальном физиологическом условии концентрация глюкозы составляет от приблизительно 2,5 мМ до приблизительно 10 мМ, а в растворе для анализа для проведения анализа при аберрантном условии концентрация глюкозы составляет от приблизительно 0,05 мМ до приблизительно 0,5 мМ. Полученный таким образом условно активный биологический белок обладает более высокой активностью в среде с низким содержанием глюкозы, чем в среде с более высоким содержанием глюкозы. Этот условно активный биологический белок будет функционировать в микроокружении опухоли, однако будет обладать низкой активностью в процессе транспортировки в кровоток.
[0342] Нормальная физиологическая концентрация молочной кислоты в сыворотке составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ. С другой стороны, концентрация молочной кислоты обычно составляет от 10 мМ до 20 мМ в микроокружении опухоли. В одном варианте реализации в растворе для анализа для проведения анализа при нормальном физиологическом условии концентрация молочной кислоты составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2 мМ, а в растворе для анализа для проведения анализа при аберрантном условии концентрация молочной кислоты составляет от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ. Полученный таким образом условно активный биологический белок обладает более высокой активностью в среде с высоким содержанием молочной кислотой, чем в среде с низким содержанием молочной кислотой. Этот условно активный биологический белок будет, таким образом, функционировать в микроокружении опухоли, однако будет обладать низкой активностью в процессе транспортировки в кровоток.
[0343] Аналогичным образом, известно, что болящие мышцы содержат более высокую (аберрантную) концентрацию молочной кислоты, чем здоровые. Таким образом, при поиске мутантного белка, который будет активен в окружении болящих мышц можно провести пару анализов при аберрантном условии в присутствии более высокой концентрации молочной кислоты для имитации окружения болящих мышц, тогда как пару анализов при нормальном физиологическом условии можно осуществить при более низкой концентрацией или в отсутствии молочной кислоты. Таким образом, указанный мутантный белок можно отобрать на улучшенную активность в окружении болящих мышц с повышенной концентрацией молочной кислоты. Такой условно активный биологический белок может быть подходящим, например, в качестве противовоспалительного агента.
[0344] В другом варианте реализации два или более компонентов могут использоваться в обеих парах растворов для анализа. В этом типе исследования условно активный биологический белок можно отобрать с применением характеристик обоих двух типов исследований, описанных выше. В альтернативном варианте селективность указанного условно активного биологического белка можно увеличить применением двух или более компонентов. Например, возвращаясь к микроокружению опухоли, пару анализов при аберрантном условии можно провести в средах для анализа как с высокой концентрацией молочной кислоты, так и с низкой концентрацией глюкозы, тогда как соответствующую пару анализов при нормальном физиологическом условии можно провести в среде для анализа как с относительно низкой концентрацией молочной кислоты, так и относительно высокой концентрацией глюкозы.
[0345] Настоящее изобретение предусматривает, что каждый компонент, отобранный из неорганических соединений, ионов и органических молекул, можно применять по отдельности или в комбинации для отбора условно активного биологического белка, активность которого выше при одной концентрации указанного компонента, чем при другой концентрации того же компонента.
[0346] Исследования, основанные на различных концентрациях одного или более метаболитов в качестве дифференцирующего условия(-й) между нормальной средой и аберрантной средой, могут быть особенно подходящими для отбора условно активного биологического белка, активность которого выше в микроокружении опухоли, чем в плазме крови, поскольку микроокружение опухоли обычно содержит значимое количество метаболитов, концентрация которых отличается концентраций тех же метаболитов в плазме крови.
[0347] Kinoshita и др. в публикации «Absolute Concentrations of Metabolites in Human Brain Tumors Using In Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopy», NMR IN BIOMEDICINE, vol. 10, pages 2-12, 1997 проводили сравнение содержания метаболитов здорового головного мозга и в опухолях головного мозга. Эта группа обнаружила, что концентрация N-ацетиласпартата в здоровом головном мозге составляет 5000-6000 мкМ, однако в глиобластоме его концентрация составляет всего лишь 300-400 мкМ, 1500-2000 мкМ в астроцитоме и 600-1500 мкМ в анапластической астроцитоме. Кроме того, концентрация инозитола в здоровом головном мозге составляет 1500-2000 мкМ, однако его концентрация в глиобластоме составляет 2500-4000 мкМ, 2700-4500 мкМ в астроцитоме и 3800-5800 мкМ в анапластической астроцитоме. Концентрация фосфорилэтаноламина в здоровом головном мозге составляет 900-1200 мкМ, однако его концентрация в глиобластоме составляет 2000-2800 мкМ, 1170-1370 мкМ в астроцитоме и 1500-2500 мкМ в анапластической астроцитоме. Концентрация глицина в здоровом головном мозге составляет 600-1100 мкМ, однако его концентрация в глиобластоме составляет 4500-5500 мкМ, 750-1100 мкМ в астроцитоме и 1900-3500 мкМ в анапластической астроцитоме. Концентрация аланина в здоровом головном мозге составляет 700-1150 мкМ, однако его концентрация в глиобластоме составляет 2900-3600 мкМ, 800-1200 мкМ в астроцитоме и 300-700 мкМ в анапластической астроцитоме. Концентрация этих метаболитов может в крови мложет быть различной, например, концентрация N-ацетиласпартата в крови составляет приблизительно 85000 мкМ; концентрация инозитола составляет приблизительно 21700 мкМ в крови; концентрация глицина составляет приблизительно 220-400 мМ; концентрация аланина составляет приблизительно 220-300 мкМ в крови.
[0348] Следовательно, эти метаболиты, включая по меньшей мере N-ацетиласпартат, инозитол, глицин и аланин, можно применять при различных концентрациях в растворах для анализа для осуществления отбора условно активных биологических белков, которые активны в опухолях головного мозга, однако не активны в крови или здоровой ткани головного мозга. Например, раствор для анализа с концентрацией N-ацетиласпартата 85000 мкМ можно применять в паре анализов при нормальном физиологическом условии, а раствор для анализа с концентрацией N-ацетиласпартата 350 мкМ можно применять в паре анализов при аберрантном условии для осуществления отбора условно активных биологических белков, которые активны в микроокружении опухоли глиобластомы, однако не активны или по меньшей мере менее активны в крови или здоровой ткани головного мозга.
[0349] Mayers и др. в публикации «Elevated circulating branched chain amino acids are an early event in pancreatic adenocarcinoma development», Nature Medicine, vol. 20, pages 1193-1198, 2014 изучали концентрации ряда различных метаболитов, включая аминокислоты с разветвленной боковой цепью в преддиагностической плазме крови пациентов с заболеваниями поджелудочной железы. Было обнаружено, что у пациентов с опухолями поджелудочной железы обнаруживается несколько метаболитов, которые присутствуют в кровотоке в разных концентрациях по сравнению с концентрациями тех же метаболитов в крови человека без рака поджелудочной железы. Mayers и др. также обнаружили, что у пациентов с раком поджелудочной железы содержание аминокислот с разветвленной боковой цепью в плазме крови значимым образом повышено по сравнению с нормальными субъектами. Аминокислоты с разветвленной боковой цепью, присутствующие в повышенных концентрациях, включают изолейцин, лейцин и валин (таблица 1 Майерса (Mayers)). Существуют другие метаболиты, представленные на фигуре 1 Майерса, которые присутствуют в значимым образом различных концентрациях в плазме крови пациентов с раком поджелудочной железы, чем нормальных здоровых людей. Эти метаболиты включают по меньшей мере ацетилглицин, глицин, фенилаланин, тирозин, 2-аминоадипат, тауродезоксихолат/таурохенодезоксихолат, аконинат, изоцитрат, лактат, α-глицерофосфат и урат.Таким образом, основываясь на выводах о том, что определенные метаболиты присутствуют в различных концентрациях в плазме крови пациентов с раком поджелудочной железы и нормальных здоровых пациентов, можно предположить, что микроокружение опухоли рака поджелудочной железы будет содержать разные концентрации данных метаболитов, чем они бы присутствовали в микроокружении поджелудочной железы здорового пациента.
[0350] Таким образом, в одном варианте реализации один или более данных метаболитов можно применять в растворе длят анализа для нормального физиологического условия в количествах, которые приблизительно соответствуют концентрациям этих метаболитов в плазме крови у здорового индивидуума (т.е. нормальным физиологическим концентрациям указанных метаболитов). Например, известные нормальные физиологические концентрации в плазме крови здорового человека для изолейцина составляют приблизительно 1,60±0,31 мг/дл, приблизительно 1,91±0,34 мг/дл для лейцина и приблизительно 2,83±0,34 мг/дл для валина. Раствор для анализа для нормального физиологического условия может обладать нормальными физиологическими концентрациям в этих диапазонах одной или более данных аминокислот с разветвленной боковой цепью. Раствор для анализа для аберрантного условия может содержать те же самые аминокислоты с разветвленной боковой цепью в концентрациях, которые приблизительно в 5 раз или приблизительно в 10 раз, или приблизительно в 20 раз, или приблизительно в 50 раз, или приблизительно в 70 раз, или приблизительно в 100 раз, или приблизительно 150, или приблизительно в 200 раз, или приблизительно в 500 раз выше нормальных физиологических концентраций у здорового индивидуума соответствующих аминокислот с разветвленной боковой цепью. Это будет отражать тот факт, что на основании результатов Mayers и др. ожидается, что микроокружение опухоли поджелудочной железы будет содержать значимо повышенные концентрации данных аминокислот с разветвленной боковой цепью, поскольку более высокие концентрации этих аминокислот с разветвленной боковой цепью, обнаруживаемые в плазме крови, которые определили Mayers и др., происходят из микроокружения опухоли и растворяются в кровотоке. Аналогичным образом, анализ при аберрантном условии может отражать концентрации других метаболитов в крови пациента с раком поджелудочной железы, даже если концентрации конкретных метаболитов значимо ниже у пациента с раком, чем у нормального индивидуума. Таким образом, скрининг может имитировать фактическую среду и тем самым обеспечивать, чтобы были отобраны мутанты с наивысшей активностью для этой конкретной среды.
[0351] В некоторых других вариантах реализации раствор для анализа для нормального физиологического условия может содержать одну или более аминокислот с разветвленной боковой цепью при концентрациях, имитирующих концентрации в плазме крови пациентов с раком поджелудочной железы, для имитации фактической среды плазмы крови для этих пациентов. В таких вариантах реализации раствор для анализа для аберрантного условия может содержать те же самые аминокислоты с разветвленной боковой цепью в концентрациях, которые приблизительно в 2 раза или приблизительно в 3 раза, или приблизительно в 4 раза, или приблизительно в 5 раз, или приблизительно в 7 раз, или приблизительно в 8 раз, или приблизительно в 10 раз, или приблизительно в 15 раз, или приблизительно в 20 раз, или приблизительно в 50 раз выше, чем концентрации соответствующих аминокислот с разветвленной боковой цепью в плазме крови пациентов с раком поджелудочной железы, чтобы продемонстрировать тот факт, что данные более высокие концентрации происходят в микроокружение опухоли, а указанные концентрации в кровотоке представляют собой разбавление фактических концентраций микроокружения опухоли. Аналогичным образом, концентрация других метаболитов в растворе для анализа для нормального физиологического условия и аберрантного условия может быть различной, чтобы продемонстрировать ожидаемые фактические различия в данных, собранных для кровотока. В некоторых случаях в кровотоке пациента с панкреотитом можно отметить недостаток определенного метаболита, и в этом случае концентрацию, отображающую измеряемую в кровотоке концентрацию, можно применять в анализе для нормального физиологического условия, и еще более низкую концентрацию можно применять в анализе для аберрантного состояния, ожидая, что указанный метаболит, вероятно, будет поглощен микроокружением опухоли. Условно активные биологические белки, отобранные таким образом с применением растворов для анализа, активность которых будет выше в микроокружении рака поджелудочной железы, чем в плазме крови пациентов с раком поджелудочной железы.
[0352] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения можно применять всю плазму крови пациентов с раком поджелудочной железы. Например, в одном варианте реализации имитацию одного или более компонентов плазмы крови пациента с раком поджелудочной железы можно применять в растворах для анализа для проведения одного или обоих анализов при нормальном физиологическом условии и аберрантном условии. В примере варианта реализации рН раствора для анализа для нормального физиологического условия составляет 7,2-7,6 с добавлением 30 масс. % плазмы крови пациента с панкреатическим раком, а рН раствора для анализа для аберрантного условия составляет 6,4-6,8 с добавлением 30 масс. % плазмы крови пациента с раком поджелудочной железы. В этом варианте реализации плазма крови пациента с раком поджелудочной железы присутствует как для гарантии того, чтобы (1) в крови не происходила активация условно активного биологического белка при рН 7,2-7,6, так и также для гарантии того (2), чтобы рН 6,2-6,8 смогло активировать условно активный биологический белок в микроокружении опухоли даже в присутствии этой композиции метаболитов, которые обнаруживаются в крови пациента с раком поджелудочной железы. Это позволит адаптировать лечение под пациента с раком поджелудочной железы.
[0353] В другом примере варианта реализации рН раствора для анализа для нормального физиологического условия составляет 7,2-7,6 с добавлением 30 масс. % плазмы крови пациента с раком поджелудочной железы, и а рН раствора для анализа для аберрантного условия составляет 6,4-6,8 и в раствор не добавляют какую-либо плазму крови пациента с раком поджелудочной железы.
[0354] Тот же компонент, выбранный из неорганических соединений, ионов и органических молекул, можно применять в каждом из нескольких типов рассмотренных выше анализов. Например, в случае молочной кислоты молочную кислоту можно применять по существу в той же концентрации в паре растворов для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия. Далее нормальное физиологическое условие и аберрантное условие будут отличаться по одному или более другим аспектами, такими как температура, рН, концентрация другого компонента и т.д. В другом варианте реализации молочную кислоту можно применять в качестве одно из дифференцировочных факторов между нормальным физиологическим условием и аберрантным условием, чтобы продемонстрировать тот факт, что молочная кислота обладает более выской концентрацией при аберрантном микроокружении опухоли, чем при нормальном физиологическом условии (неопухолевое микроокружение).
[0355] В некоторых вариантах реализации два или более компонентов добавляют по существу при одной и той же концентрации в оба раствора для анализа для нормального физиологического условия и аберрантного условия. Например, к растворам для анализа добавляют как цитрат, так и бычий сывороточный альбумин (БСА). Концентрация цитрата может составлять приблизительно 80 мкМ, а концентрация БСА может составлять приблизительно 10-20% в обоих растворах для анализа. Более конкретно, раствор для анализа для проведения пары анализов при нормальном физиологическом условии может обладать значением рН 7,2 до 7,6 при концентрации цитрата приблизительно 80 мкМ и концентрации БСА приблизительно 10-20%. Раствор для анализа для проведения пары анализов при аберрантном условии может обладать рН от 6,4 до 6,8 при концентрации цитратов приблизительно 80 мкМ и концентрации БСА приблизительно 10-20%.
[0356] В одном варианте реализации сыворотку человека можно добавить к обоим растворам для анализа для нормального физиологического условия и аберрантного условия при по существу в одинаковой концентрации. Поскольку сыворотка человека содержит большое количество неорганических соединений, ионов, органических молекул (включая белки), растворы для анализа будут содержать множество и большое количество компонентов, выбранных из неорганических соединений, ионов, органических молекул, представленных при по существу одинаковых концентраций в двух растворах для анализа.
[0357] В некоторых других вариантах реализации по меньшей мере один из двух или более компонентов добавляют к растворам для анализа для нормального физиологического условия и аберрантного условия при различных концентрациях. Например, к растворам для анализа добавляют как молочную кислоту, так и бычий сывороточный альбумин (БСА). Концентрация молочной кислоты может различаться между растворами для анализа для нормального физиологического условия и аберрантного условия, тогда как концентрация БСА может быть одинаковой в обоих растворах для анализа. Концентрация молочной кислоты может составлять от 30 до 50 мг/дл в растворе для анализа для аберрантного условия и от 8 до 15 мг/дл в растворе для анализа для нормального физиологического условия. С другой стороны, концентрация БСА будет одинаковой в обоих растворах для анализа, как, например, приблизительно 10-20%. Условно активный биологический белок, таким образом отобранный с применением этих растворов для анализа, более активен при высокой концентрации молочной кислоты при 30-50 мг/дл, чем при низкой концентрации молочной кислоты при 8-15 мг/дл в присутствии БСА.
[0358] В некоторых вариантах реализации растворы для анализа можно разработать для отбора условно активных биологических белков с активностью, зависящей от двух или более условий. В одном пример варианта реализации условно активный биологический белок может обладать активностью, зависящей как от рН, так и от содержания молочной кислоты. Растворы для анализа для проведения отбора такого условно активного биологического белка могут представлять собой раствор для анализа при нормальном физиологическом условия с рН 7,2-7,6, концентрацией молочной кислоты от 8 до 15 мг/дл. Раствор для анализа для аберрантного условия может иметь рН 6,4-6,8, концентрацию молочной кислоты от 30 до 50 мг/дл. Необязательно растворы для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия могут также содержать ион для содействия связыванию между мутантным белком и его партнером по связыванию, таким образом, чтобы увеличить количество попаданий для кандидата биологического активного белка.
[0359] В еще одном примере варианта реализации условно активный биологический белок может обладать активностью, зависящей от рН, содержания глюкозы и молочной кислоты. Растворы для анализа для осуществления отбора такого условно активного биологического белка могут представлять собой растворы для анализа для нормального физиологического условия с рН 7,2-7,6, концентрацией глюкозы от 2,5 до 10 мМ, концентрацией молочной кислоты от 8 до 15 мг/дл. Раствор для анализа для аберрантного условия может иметь рН 6,4-6,8, концентрацию глюкозы от 0,05 до 0,5 мМ, концентрацию молочной кислоты от 30 до 50 мг/дл. Необязательно растворы для анализа как для нормального физиологического условия, так и для аберрантного условия могут также содержать ион, способствующий связыванию между мутантными белками и их партнером по связыванию, таким образом, чтобы увеличить количество связываний кандидата биологически активного белка с партнером по связыванию при рН 6,4-6,8. Отобранный условно активный биологический белок с применением таких аналитических растворов более активен в среде с рН 6,4-6,8, концентрацией глюкозы от 0,05 до 0,5 мМ и концентрацией молочной кислоты от 30 до 50 мг/дл, чем в среде с рН 7,2-7,6, концентрацией глюкозы 2,5-10 мМ и концентрации молочной кислоты от 8 до 15 мг/дл.
[0360] Два или более компонентов, выбранных из неорганических соединений, ионов и органических молекул, предназначены для получения раствора для анализа для аберрантного условия, которое имитирует окружение в том месте/участке, куда будет осуществлена доставка отобранного условно активного биологического белка (т.е. целевой участок). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере три компонента, присутствующих в окружении целевого участка, можно добавить к раствору для анализа, или по меньшей мере четыре компонента, присутствующих в окружении целевого участка, можно добавить к раствору для анализа, или по меньшей мере пять компонентов, присутствующих в окружении целевого участка, можно добавить к раствору для анализа, или по меньшей мере шесть компонентов, присутствующих в окружении целевого участка, можно добавить к раствору для анализа.
[0361] В одном варианте реализации жидкость, извлеченную из целевого участка, можно непосредственным образом применять в качестве раствора для анализа при аберрантном условии. Например, синовиальную жидкость можно извлечь из субъекта, предпочтительно из субъекта с заболеванием суставом, нуждающегося в лечении. Указанную извлеченную синовиальную жидкость, необязательно разбавленную, можно применять в качестве раствора для анализа в паре исследований при аберрантном условии для того, чтобы осуществить отбор условно активного биологического белка. Используя извлеченную синовиальную жидкость, необязательно разбавленную, в качестве раствора для анализа для проведения анализа при аберрантном условии, и раствор для анализа, который имитирует плазму крови человека для проведения анализа при нормальном физиологическом условии, условно активный биологический белок (например, ФНО-альфа), который отбирают, будет более активен в суставе, чем в других местах или органах. Например, субъекты с воспалительными суставами (такими как артрит) могут получать лечение ФНО-альфа. Однако при применении ФНО-альфа, как правило, наблюдают серьезные побочные эффекты от повреждения других тканей и органов. Условно активный ФНО-альфа, который более активен в синовиальной жидкости, однако не активен или менее активен в крови, будет осуществлять доставку активности ФНО-альфа в суставы при одновременном снижении или потенциальном устранении побочных эффектов ФНО-альфа на остальные участки тела.
[0362] Изменение условно активного биологического белка, который обладает активностью, зависящей от множественных условий, приведет к улучшенной селективности условно активного биологического белка в отношении целевого участка в теле субъекта. В идеальном случае в других местах, где присутствуют только некоторые из условий, условно активный биологический белок не активен или по меньшей мере значимым образом менее активен. В одном варианте реализации доставку условно активного биологического белка, который активен при рН 6,4-6,8, концентрации глюкозы от 0,05 до 0,5 мМ и концентрации молочной кислоты от 30 до 50 мг/дл, можно специфичным образом осуществить в микроокружение опухоли, поскольку все эти условия присутствуют в микроокружении опухоли. Другие ткани или органы могут обладать одним или двумя из этих присутствующих условий, в связи с чем этого недостаточно для того, чтобы полностью активировать условно активный биологический белок в других тканях или органах. Например, низкий рН в мышце, подвергаемой физической нагрузке, может составлять от 6,4 до 6,8. Однако она может и не иметь другого исследуемого условия. Таким образом, условно активный биологический белок не активен или по меньшей мере менее активен в мышце, подвергаемой физической нагрузке.
[0363] В некоторых вариантах реализации можно предпринять шаги для подтверждения того, что активность условно активного биологического белка действительно зависит от условий, применяемых для осуществления отбора условно активного биологического белка. Например, условно активный биологический белок отбирают таким образом, чтобы он зависел от трех условий: рН 6,4-6,8, концентрация глюкозы от 0,05 до 0,5 мМ и концентрация молочной кислоты от 30 до 50 мг/дл. Отобранный условно активный биологический белок можно затем исследовать при каждом из трех условий индивидуальным образом и в средах с парами из трех условий для того, чтобы подтвердить, что условно активный биологический белок не активен или менее активен в данных анализах.
[0364] В некоторых вариантах реализации содержание определенных компонентов сыворотки можно намеренно свести к минимуму или исключить из среды для анализа. Например, при проведении скрининга антител содержание компонентов сыворотки, которые связывают или адсорбируют антитела, можно свести к минимуму или исключить из среды для анализа. Такие связанные антитела могут давать псевдоположительные результаты, которые, как следствие, содержат связанные мутантные антитела, которые не являются условно активными, а скорее всего связаны с компонентом, присутствующим в сыворотке, при ряде различных условий. Таким образом, тщательный отбор компонентов для проведения анализа для минимизации или исключения компонентов, которые могут потенциальным образом связываться с мутантами при проведении анализа, можно применять для уменьшения числа нефункциональных мутантов, которых можно непреднамеренно идентифицировать как положительные для условной активности вследствие связывания с компонентом в анализе, отличным от желаемого партнера по связыванию. Например, в некоторых вариантах реализации, где подвергаются скринингу мутантные белки со склонностью к связыванию с компонентами в сыворотке человека, в растворе для анализа можно применять БСА для уменьшения или устранения возможности получения псевдоположительных результатов, вызванных мутантными белками, связывающимися с компонентами сыворотки человека. Другие аналогичные замены также можно осуществить в конкретных случаях для достижения той же цели.
[0365] Формат скрининга
[0366] Стадия скрининга согласно настоящему изобретению может представлять собой любой подходящий способ, известный специалисту в данной области техники. Примеры включают ИФА, анализ ферментативной активности, скрининг реальных тканей in vitro (органов и т.д.), микроскопические препараты тканей, целое животное, линии клеток и применение 3D-систем. Например, подходящие анализы на основе клеток описаны в публикации WO 2013/040445, анализы на основе тканей описаны в патенте США №7993271, способы проведения скрининга на основе целых животных описаны в патенте США №2010/0263599, способы скрининга на основе 3D-систем описаны в патенте США №2011/0143960.
[0367] В некоторых вариантах реализации окружение для проведения скрининга представляет собой окружение вблизи клеточной мембраны, такое как внутри, на или снаружи клеточной мембраны, или окружение в суставе. Некоторые факторы, которые могут влиять на сродство к связыванию при проведении скрининга в окружении клеточной мембраны, включают экспрессию рецепторов, интернализацию, эффективность комплекса антитела с лекарственным средством (ADC) и т.д.
[0368] В некоторых вариантах реализации на стадии эволюционирования можно получать мутантные белки, которые могут одновременно обладать другими желаемыми свойствами помимо условно активных характеристик, рассмотренных выше. Подходящие другие желаемые свойства, которые можно эволюционировать, могут включать сродство к связыванию, экспрессию, гуманизацию и т.д. В связи с этим, настоящее изобретение можно использовать для получения условно активного биологического белка, который также содержит улучшение по меньшей мере одного или нескольких из этих других желаемых свойство.
[0369] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения получают условно активный биологический белок. Можно дополнительно мутировать отобранный условно активный биологический белок с применением одного из методов мутагенеза, раскрытых в настоящем описании, например, на второй стадии эволюционирования, для улучшения другого свойства отобранного условно активного биологического белка, такого как сродство к связыванию, экспрессия, гуманизация и т.д. После второй стадии эволюционирования можно провести скрининг указанных мутантных белков как на условную активность, так и на улучшенное свойство.
[0370] В некоторых вариантах реализации после осуществления эволюции белка дикого типа с получением мутантных белков отбирают первый условно активный биологический белок, который проявляет как: (а) снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с белком дикого типа, так и (b) увеличение активности в анализе при аберрантном условии по сравнению с белком дикого типа. Первый условно активный биологический белок может затем дополнительно подвергнуть одной или более дополнительным стадиям эволюционирования, экспрессии и отбора для того, что осуществить отбор по меньшей мере второго условно активного биологического белка, который проявляет как: (а) снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с белком дикого типа, так и (b) увеличение активности в анализе при аберрантном условии по сравнению с белком дикого типа, а также большее отношение между активностью при аберрантном условии и активностью при нормальном физиологическом условии по сравнению с первым условно активным биологическим белком и/или диким типом.
[0371] В определенных вариантах реализации настоящее изобретение направлено на получение условно активных биологических белков с более высоким отношением активности при аберрантном условии и активности при нормальном физиологическом условии (например, более высокая селективность между аберрантными и нормальными физиологическими условиями). Отношение или селективность активности при аберрантном условии и активности при нормальном физиологическом условии может составлять по меньшей мере приблизительно 2:1 или по меньшей мере приблизительно 3:1, или по меньшей мере приблизительно 4:1, или по меньшей мере приблизительно 5:1, или по меньшей мере приблизительно 6:1, или по меньшей мере приблизительно 7:1, или по меньшей мере приблизительно 8:1, или по меньшей мере приблизительно 9:1, или по меньшей мере приблизительно 10:1, или по меньшей мере приблизительно 11:1, или по меньшей мере приблизительно 12:1, или по меньшей мере приблизительно 13:1 или по меньшей мере приблизительно 14:1, или по меньшей мере приблизительно 15:1, или по меньшей мере приблизительно 16:1, или по меньшей мере приблизительно 17:1, или по меньшей мере приблизительно 18:1, или по меньшей мере приблизительно 19:1, или по меньшей мере приблизительно 20:1, или по меньшей мере приблизительно 30:1, или по меньшей мере приблизительно 40:1, или по меньшей мере приблизительно 50:1, или по меньшей мере приблизительно 60:1, или по меньшей мере приблизительно 70:1, или по меньшей мере приблизительно 80:1, или по меньшей мере приблизительно 90:1, или по меньшей мере приблизительно 100:1.
[0372] В одном варианте реализации условно активный биологический белок представляет собой антитело, которое может характеризоваться отношением между активностью при аберрантном условии и активностью при нормальном физиологическом условии по меньшей мере приблизительно 5:1 или по меньшей мере приблизительно 6:1, или по меньшей мере приблизительно 7:1, или по меньшей мере приблизительно 8:1, или по меньшей мере приблизительно 9:1, или по меньшей мере приблизительно 10:1. В одном варианте реализации условно активный биологический белок применяют для нацеливания на участок опухоли, где условно активный биологический белок активен в участке опухоли и значимо менее активен или неактивен в неопухолевом участке (нормальное физиологическое состояние).
[0373] В одном варианте реализации условно активный биологический белок представляет собой антитело, которое предназначено для конъюгирования с другим агентом, таким как те, которые описаны в других частях настоящего документа. Условно активное антитело может обладать более высоким значением отношения активности при аберрантном условии к активности при нормальном физиологическом условии. Например, условно активное антитело, которое следует конъюгировать с другим агентом, может характеризоваться отношением активности при аберрантном условии к активности при нормальном физиологическом условии по меньшей мере приблизительно 10:1 или по меньшей мере приблизительно 11:1, или по меньшей мере приблизительно 12:1, или по меньшей мере приблизительно 13:1, или по меньшей мере приблизительно 14:1, или по меньшей мере приблизительно 15:1, или по меньшей мере приблизительно 16:1, или по меньшей мере приблизительно 17:1, или по меньшей мере приблизительно 18:1, или по меньшей мере приблизительно 19:1 или по меньшей мере приблизительно 20:1. Это может быть особенно важно, когда указанный конъюгированный агент является, например, токсичным или радиоактивным, поскольку такой конъюгированный агент желательно концентрировать на пораженном участке или подвергающемуся лечению участке.
[0374] Конструирование условно активных антител
[0375] Условно активные антитела согласно настоящему изобретению могут сконструировать при помощи одного или более методов конструирования антител, описанных в настоящем документе. Неограничивающие примеры методов конструирования антител включают конъюгирование антител, разработку мультиспецифических антител и конструирование Fc-области антител.
[0376] Конъюгирование условно активных антител
[0377] Условно активные антитела, предложенные в настоящем изобретении, можно конъюгировать с молекулой. Поскольку условно активное антитело преимущественно действует, например, в головном мозге, синовиальной жидкости, микроокружении опухоли или в нише стволовых клеток, можно провести конъюгирование условно активного антитела с молекулой с целью переноса указанной молекулы в головной мозг, синовиальную жидкость или микроокружение опухоли. В некоторых вариантах реализации указанная конъюгированная молекула имеет некоторую степень токсичности, которую можно снизить при транспортировке путем конъюгирования с условно активными антителами. В результате, указанный токсический агент может таким образом оказывать предпочтительное воздействие на пораженный участок или подвергающийся лечению участок.
[0378] Конъюгирование условно активного антитела с молекулой, такой как терапевтический или диагностический агент, можно осуществить посредством ковалентного или нековалентного связывания. Ковалентное конъюгирование можно осуществить либо напрямую, либо через линкер. В определенных вариантах реализации прямое конъюгирование достигают путем слияния белка (т.е. путем генетического слияния двух генов, кодирующих условно активные антитела, и лекарственного средства для неврологического расстройства и осуществления экспрессии в виде отдельного белка). В определенных вариантах реализации прямое конъюгирование осуществляют путем образования ковалентной связи между реакционноспособной группой на условно активном антителе и соответствующей группой или акцептором на указанной молекуле. В определенных вариантах реализации прямое конъюгирование осуществляют путем модификации (например, генетической модификации) одной из двух молекул, которые следует конъюгировать, с включением реакционноспособной группы (в качестве неограничивающих примеров, сульфгидрильной группы или карбоксильной группы), которая ковалентным образом присоединяется к другой молекула, которую следует конъюгировать, при соответствующих условиях. В качестве одного неограничивающего примера молекулу (например, аминокислота) с требуемой реакционноспособной группой (например, остаток цистеина) можно ввести в условно активное антитело и образовать с молекулой, такой как молекулой неврологического лекарственного средства, дисульфидную связь. Способы ковалентного конъюгирования нуклеиновых кислот с белками известны в данной области техники (т.е. фотосшивание, см., например, Zatsepin и др., Russ. Chem. Rev., 74: 77-95 (2005)).
[0379] Нековалентное конъюгирование можно осуществить при помощи любого нековалентного способа присоединения, включая гидрофобные связи, ионные связи, электростатическое взаимодействие и тому подобное, как будет понятно специалисту в данной области техники.
[0380] Конъюгирование также можно осуществить с применением различных линкеров. Например, можно осуществить конъюгирование условно активного антитела и неврологического лекарственного средства с применением различных бифункциональных связывающих белок агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(n-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис(n-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Также можно применять пептидные линкеры, содержащие от одной до двадцати аминокислот, соединенных при помощи пептидных связей. В определенных таких вариантах реализации аминокислоты выбраны из двадцати встречающихся в природе аминокислот. В определенных других таких вариантах осуществления одна или более аминокислот выбраны из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина.
[0381] Указанный линкер может быть «расщепляемым линкером», способствующим высвобождению неврологического лекарственного средства при доставке на пораженный участок или подвергаемый лечению участок. Например, можно применять кислотно-лабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari и др., Cancer Res., 52: 127-131 (1992), патент США №5208020). Некоторые примеры обеспечивающих сшивающих реагентов для конъюгирования антител включают BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат).
[0382] Указанный конъюгированный терапевтический агент может быть токсичным для организма, такой как радиоактивная частица, химиотерапевтическое лекарственное средство или клеточный токсин (т.е. цитотоксин). Применение условно активных антител согласно настоящему изобретению для осуществления доставки конъюгированного терапевтического агента к пораженному участку будет значимо уменьшать токсические эффекты этих терапевтических агентов в областях организма, где их активность нежелательна. Технология конъюгирования радиоактивных частиц с антителами известна в данной области техники. Ибритумомаб тиуксетан (Зевалин (Zevalin®)) и тозитумомаб (Бексар (Bexxar®)) являются примерами конъюгированных с радиоактивными частицами моноклональных антител. Оба являются антителами против CD20-антигена, конъюгированного с другой радиоактивной частицей. Аналогичным образом, технология конъюгирования химиотерапевтических лекарственных средств с антителами также известна в данной области техники. На рынке существует по меньшей мере два антитела, которые конъюгированы с химиотерапевтическим лекарственным средством: брентуксимаб ведотин (Адцетрис (Adcetris®)) и адо-трастузумаб эмтанзин (Кадсайла (Kadcyla™)). Технология конъюгирования клеточного токсина с антителом также известна в данной области техники. Например, денилейкин дифтитокс (Онтак (Ontak®), раковый препарат) состоит из белка иммунной системы, известного как интерлейкин-2 (ИЛ-2), присоединенного к токсину из возбудителя, который вызывает дифтерию.
[0383] Предполагается, что любые радиоактивные частицы, химиотерапевтические лекарственные средства и клеточные токсины можно конъюгировать с условно активным антителом согласно настоящему изобретению для того, чтобы снизить побочные эффекты этих агентов во время доставки данных агентов к пораженному участку или подвергаемому лечению участка.
[0384] В некоторых вариантах реализации указанные радиоактивные частицы, конъюгированные с условно активными антителами, содержат частицы, импрегнированные одним или более радиоактивными изотопами, и обладают достаточной радиоактивностью для локальной абляции клеток. Указанные частицы могут содержать стекло, металл, смолу, альбумин или полимер(-ы). Металлы в радиоактивных частицах можно выбрать из железа, гадолиния и кальция. Примеры одного или более радиоактивных изотопов в радиоактивных частицах выбраны из галлия-67 (67Ga), иттрия-90 (90Y), галлия-68 (68Ga). таллия-201 (201Tl), стронция-89 (89Sr), индия-111 (111In), йода-131 (131I), самария-153 (153Sm), технеция-99m (99mTc), рения-186 (186Re), рения-188 (188Re), меди-62 (62Cu) и меди-64 (64Cu). Предпочтительным образом радиоактивный изотоп(-ы) в указанной композиции испускает бета-излучение, гамма-излучение и/или позитроны.
[0385] В некоторых вариантах реализации указанные химиотерапевтические лекарственные средства, конъюгированные с условно активными антителами, выбраны из антрациклинов, ингибиторов топоизомеразы I и/или II, алкалоидов растений, вырабатывающих веретенный яд, алкилирующих агентов, антиметаболитов, эллиптицина и хармина.
[0386] Антрациклины (или антрациклиновые антибиотики) получают из бактерий Streptomyces. Эти соединения применяют для лечения широкого спектра раков, включая, например, гепатоцеллюлярную карциному, лейкозы, лимфомы и рак груди, матки, яичников и легких. Антрациклины включают, но не ограничиваются ими, доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин, идарубицин, валрубицин, пирарубицин, зорубицин, акларубицин, деторубицин, карминомицин, морфолинодоксорубицин, морфолиноданурубицин, метоксиморфолинилдоксорубицин и их фармацевтически приемлемые соли.
[0387] Топоизомеразы являются важными ферментами, которые поддерживают топологию ДНК. Ингибирование топоизомеразы типа I или типа II препятствует как транскрипции, так и репликации ДНК, нарушая правильную суперспирализацию ДНК. Некоторые ингибиторы топоизомеразы типа I включают производные камптотецина. Производные камптотецина относятся к аналогам камптотецина, таким как иринотекан, топотекан, гексатан, силатекан, лютортекан, каренитецин (BNP1350), гиматекан (ST1481), белотекан (CKD602) или их фармацевтически приемлемым солям. Примеры ингибиторов топоизомеразы типа II включают, но не ограничиваются ими, амсакрин, этопозид, этопозид фосфат и тенипозид. Это полусинтетические производные эпиподофиллотоксинов, алкалоидов, встречающиеся в природе в корне American Mayapple (Podophyllum peltatum).
[0388] Алкалоиды растений, вырабатывающих веретенный яд, получают из растений, и они блокируют деление клеток, предотвращая функционирование микротрубочек, необходимых для деления клеток. Эти алкалоиды включают, но не ограничиваются ими, алкалоиды барвинка (такие как винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин и винпоцетин) и таксаны. Таксаны включают, но не ограничиваются ими, паклитаксел, доцетаксел, ларотаксел, кабазитаксел, ортатаксел, тезатексел и их фармацевтически приемлемые соли.
[0389] Алкилирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, мехлорэтамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, ифосфамид и соединения платины, такие как оксалиплатин, цисплатин или карбоплатин.
[0390] Антиметаболит представляет собой химическое вещество, которое ингибирует использование метаболита, который является частью нормального метаболизма. Наличие антиметаболитов влияет на рост клеток и деление клеток. Пуриновые или пиримидиновые аналоги предотвращают включение нуклеотидов в ДНК, останавливая синтез ДНК и, следовательно, деление клеток. Они также влияют на синтез РНК. Примеры пуриновых аналогов включают азатиоприн, меркаптопурин, тиогуанин, флударабин, пентостатин и кладрибин. Примеры пиримидиновых аналогов включают 5-фторурацил (5FU), который ингибирует тимидилатсинтазу, флуксуридин (FUDR) и цитозин-арабинозид (Цитарабин).
[0391] Антифолаты представляют собой химиотерапевтические лекарственные средства, которые нарушают функционирование фолиевых кислот. Хорошо известным примером является метотрексат, который представляет собой аналог фолиевой кислоты, который ингибирует фермент дигидрофолатредуктазу (DHFR) и, таким образом, предотвращает образование тетрагидрофолата. Это приводит к ингибированию образования ДНК, РНК и белков (поскольку тетрагидрофолат также участвует в синтезе аминокислот серина и метионина). Другие антифолаты включают, но не ограничиваются ими, триметоприм, ралтитрексед, пириметамин и пеметрексед.
[0392] Другие химиотерапевтические лекарственные средства также можно конъюгировать с условно активными антителами, такими как эллиптицин и хармин. Эллиптицин и его производные, такие как 9-гидроксиэллиптициний, N2-метил-9-гидроксиэллиптициний, 2-(диэтиламино-2-этил)-9-гидроксиэллиптициний ацетат, 2-(диизопропиламиноэтил)-9-гидроксиэллиптициний ацетат и 2-(бета-пиперидино-2-этил)-9-гидроксиэллиптициний являются эффективными химиотерапевтическими лекарственными средствами.
[0393] Хармин представляет собой природный алкалоидный продукт растений, который был выделен из семян Peganum harmala. Химиотерапевтические препараты на основе хармина, включают: хармин, хармалин, хармол, хармалол и харман, а также производные хиназолина: вазицин и вазицинон.
[0394] В некоторых вариантах реализации клеточные токсины, конъюгированные с условно активными антителами, включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Другие токсины включают, например, рицин, СС-1065 и аналоги, дуокармицины. Другие токсины включают дифтерийный токсин и змеиный яд (например, яд кобры).
[0395] В некоторых вариантах реализации условно активные антитела согласно настоящему изобретению можно конъюгировать с диагностическим агентом. Диагностический агент, применяемый в настоящем изобретении, может включать любой диагностический агент, известный в данной области, предложенный, например, в следующих ссылках: Armstrong и др, Diagnostic Imaging, 5th Ed., Blackwell Publishing (2004); Torchilin, V.P., Ed., Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995); Vallabhajosula, S., Molecular Imaging: Radiopharmaceuticals for PET and SPECT, Springer (2009). Диагностический агент можно обнаружить различными способами, включая применение указанного агента для обеспечения и/или улучшения обнаруживаемого сигнала, который включает, но не ограничивается ими, гамма-излучение, радиоактивный сигнал, эхогенный сигнал, оптический сигнал, флуоресцентный сигнал, поглощающий сигнал, магнитный сигнал или томографический сигнал. Методы визуализации диагностического агента могут включать, но не ограничиваются ими, однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ), оптическую визуализацию, позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), компьютерную томографию (КТ), рентгенографию, получение изображений при помощи гамма-лучей и им подобные.
[0396] В некоторых вариантах реализации диагностический агент может содержать хелаторы, которые связываются, например, с ионами металлов, которые будут применять для различных методов диагностической визуализации. Примеры хелаторы включают, но не ограничиваются ими, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), [4-(1,4,8,11-тетраазациклотетрадец-1-ил)метилбензойную кислоту (СРТА), циклогександиаминтетрауксусную кислоту (CDTA), этиленбис(оксиэтилентрило)тетрауксусную кислоту (EGTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), лимонную кислоту, гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту (HEDTA), иминодиуксусную кислоту (IDA), триэтилентетраамингексауксусную кислоту (ТТНА), 1,4,7,10-тетраазацикло до декан-1,4,7,10-тетра(метиленфосфоновую кислоту) (DOTP), 1,4,8,11-тетраазациклододекан-1,4,8,11-тетрауксусную кислоту (ТЕТА), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA) и их хелатирующие производные.
[0397] Радиоизотоп можно включить в некоторые указанные диагностические агенты, описанные в настоящем документе, и он может включать радионуклиды, излучающие гамма-лучи, позитроны, бета- и альфа-частицы или рентгеновские лучи. Подходящие радионуклиды включают, но не ограничиваются ими, Ac, As, At, nB, 128Ва, 212Bi, 75Br, 77Br, 14С, 109Cd, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 123I, 125I, 130I, 131I, 111In, 177Lu, 13N, 150, 32P, 33P, 212Pb, 103Pb, 186Re, 188Re, 47Sc, 153Sm, 89Sr, 99mTc, 88Y и 90Y. в определенных вариантах реализации радиоактивные агенты могут включать mIn-DTPA, 99mTc(CO)3-DTPA, 99mTc(CO)3-ENPy2, 62/64/67Cu-TETA, 99mTc(CO)3-IDA и 99mTc(CO)3тpиaмины (циклические или линейные). В других вариантах реализации указанные агенты могут включать DOTA и ее различные аналоги с 111In, 177Lu, 153Sm, 88/90Y, 62/64/67Cu или 67/68Ga. В некоторых вариантах реализации радиоактивным образом можно пометить липосомы, например, путем введения липидов, присоединенных к хелатам, таких как DTPA-липид, как указано в следующих ссылках: Phillips и др., Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, vol. 1, pages 69-83 (2008); Torchilin, V.P. & Weissig, V., Eds. Liposomes 2nd Ed.: Oxford Univ. Press (2003); Elbayoumi, T.A. & Torchilin, V.P., Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 33: 1196-1205 (2006); Mougin-Degraef, M. и др., Int'l. J. Pharmaceutics, 344: 110-117 (2007).
[0398] В других вариантах реализации указанные диагностические агенты могут включать оптических агентов, такие как флуоресцентные агенты, фосфоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты и им подобные. Многочисленные агенты известны в данной области техники (например, красители, зонды, метки или индикаторы), и их можно применять в настоящем изобретении (см., например, Invitrogen, The Handbook -- A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition (2005)). Флуоресцентные агенты могут включать различные органические и/или неорганические малые молекулы или различные флуоресцентные белки и их производные. Например, флуоресцентные агенты могут включать, но не ограничиваться ими, цианины, фталоцианины, порфирины, индоцианины, родамины, феноксазины, фенилксантены, фенотиазины, феноселеназины, флуоресцеины, бензопорфирины, скварины, дипирролопиримидоны, тетрацены, хинолины, пиразины, коррины, хроконий, акридоны, фенантридины, родамины, акридины, антрахиноны, халькогенопирилиевые аналоги, хлорины, нафталоцианины, метиновые красители, индоленовые красители, азосоединения, азулены, азазазулены, трифенилметановые красители, индолы, бензоиндолы, индокарбоцианины, бензоиндокарбоцианины и производные BODIPY™, имеющие общую структуру 4,4-дифтор-4-бора-3а,4а-диаза-с-индацен, и/или конъюгаты, и/или производные любого из них. Другие агенты, которые можно применять, включают, но не ограничиваются ими, флуоресцеин, конъюгаты флуоресцеин-полиаспарагиновая кислота, конъюгаты флуоресцеин-полиглутаминовая кислота, конъюгаты флуоресцеин-полиаргинин, индоцианин зеленый, конъюгаты индоцианин-додекааспартиновая кислота, конъюгаты индоцианин (NIRD)-полиаспарагиновая кислота, изосульфан синий, индолдисульфонаты, бензоиндолдисульфонат, бис(этилкарбоксиметил)индоцианин, бис(пентилкарбоксиметил)индоцианин, полигидроксииндолсульфонаты, полигидроксибензоиндолсульфонат, жесткий гетероатомный индолсульфонат, индоцианинбиспропановую кислоту, индоцианинбисгексановую кислоту, 3,6-дициано-2,5-[(N,N,N',N'-тетракис(карбоксиметил)амино]пиразин, 3,6-[(N,N,N',N'-тетракис(2-гидроксиэтил)амино]пиразин-2,5-дикарбоновую кислоту, 3,6-бис(N-азатедино)пиразин-2,5-дикарбоновую кислоту, 3,б-бис(N-морфолино)пиразин-2,5-дикарбоновую кислоту, 3,6-бис(N-пиперазино)пиразин-2,5-дикарбоновую кислоту, 3,6-бис(N-тиоморфолино)пиразин-2,5-дикарбоновую кислоту, S-оксид 3,6-бис(N-тиоморфолино)пиразин-2,5-дикарбоновой кислоты, S,S-диоксид 2,5-дициано-3,6-бис(N-тиоморфолино)пиразина, индокарбоцианинтетрасульфонат, хлориндокарбоцианин и 3,6-диаминопиразин-2,5-дикарбоновую кислоту.
[0399] В еще других вариантах реализации указанные диагностические агенты могут включать контрастные агенты, которые в целом хорошо известны в данной области техники, включая, например, суперпарамагнитный оксид железа (SPIO), комплексы гадолиния или марганца и им подобные (см., например, Armstrong и др., Diagnostic Imaging, 5th Ed., Blackwell Publishing (2004)). В некоторых вариантах реализации диагностический агент может включать магнитно-резонансный агент (МР) для визуализации. Примеры магнитно-резонансных агентов для визуализации включают, но не ограничиваются ими, парамагнитные агенты, суперпарамагнитные агенты и им подобные. Примеры парамагнитных агентов могут включать, но не ограничиваться ими, гадопентиновую кислоту, гадотерическую кислоту, гадодиамид, гадолиний, гадотеридол, мангафодипир, гадоверсетамид, цитрат железа аммония, гадобениновую кислоту, гадобутрол или годоксетовую кислоту. Суперпарамагнитные агенты могут включать, но не ограничиваться ими, суперпарамагнитный оксид железа и ферристен. В некоторых вариантах реализации указанные диагностические агенты могут включать рентгеноконтрастные агенты, как предложено, например, в следующих ссылках: H.S Thomsen, R.N. Muller и R.F. Mattrey, Eds., Trends in Contrast Media, (Berlin: Springer-Verlag, 1999); P. Dawson, D. Cosgrove и R. Grainger, Eds., Textbook of Contrast Media (ISIS Medical Media 1999); Torchilin, V.P., Curr. Pharm. Biotech., vol. 1, pages 183-215 (2000); Bogdanov, A.A. и др, Adv. Drug Del. Rev., vol. 37, pages 279-293 (1999); Sachse, А. и др., Investigative Radiology, vol. 32, pages 44-50 (1997). Примеры рентгеноконтрастных агентов включают, без ограничения, иопамидол, иомепрол, иогексол, иопентол, иопромид, иозимид, иоверсол, иотролан, иотасуль, иодиксанол, иодецимол, иоглукамид, иоглунид, иогуламид, иосаркол, иоксилан, иопамирон, метризамид, иобитридол и иозименол. В определенных вариантах реализации рентгеноконтрастные агенты могут включать иопамидол, иомепрол, иопромид, иогексол, иопентол, иоверсол, иобитридол, иодиксанол, иотролан и иосименол.
[0400] В некоторых вариантах реализации условно активное антитело можно конъюгировать с белком, таким как интерлейкины, цитокины, ферменты, факторы роста или другие антитела. Некоторые примеры таких белков включают, например, фактор некроза опухоли, α-интерферон (ИФН-α), β-интерферон (ИФН-β), фактор роста нервов (NGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), тканевый активатор плазминогена (ТРА), апоптотический агент (например, ФНО-α, ФНО-β, AIM I, раскрытый в публикации WO 97/33899), AIM II (см. публикацию WO 97/34911), Fas-лиганд (Takahashi и др., J. Immunol., vol. 6, pages 1567-1574, 1994) и VEGI (публикация WO 99/23105), тромботический агент или антиангиогенный агент (например, ангиостатин или эндостатин) или модификатор биологического ответа, такой как, например, лимфокин (например, интерлейкин-1 («ИЛ-I»), интерлейкин-2 («ИЛ-2»), интерлейкин-6 («ИЛ-6»), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор («GM-CSF») и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («G-CSF»)) или фактор роста (например, гормон роста («GH»)).
[0401] В некоторых вариантах реализации условно активные антитела для пересечения гематоэнцефалического барьера (ВВВ) можно конъюгировать с лекарственным средством для лечения неврологического расстройства. Транспортировка указанного лекарственного средства будет осуществляться через ВВВ при помощи указанных антител и оставаться в мозге для лечения неврологического расстройства. Неврологическое расстройство относится к заболеванию или расстройству, которое поражает центральную нервную систему (ЦНС) и/или имеет этиологию в ЦНС. Примеры заболеваний или расстройств ЦНС включают, но не ограничиваются ими, невропатию, амилоидоз, рак, окулярное заболевание или расстройство, вирусную или микробную инфекцию, воспаление, ишемию, нейродегенеративное заболевание, приступы, нарушения поведения и лизосомальное заболевание.
[0402] Для целей настоящей заявки будет понятно, что ЦНС включает глаза, которые обычно отделены от остальной части тела посредством гематоретинального барьера. Конкретные примеры неврологических расстройств включают, но не ограничиваются ими, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь телец Леви, синдром постполиомиелита, синдром Шая-Дрейджера, оливопонтоцеребеллярную атрофию, болезнь Паркинсона, множественную атрофию системы, стриатонигральную дегенерацию, тауопатии, такие как болезнь Альцгеймера и супрануклеарный паралич, прионные болезни, такие как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, скрейпи, синдром Крейтцфельдта-Якоба, куру, болезнь Герстмана-Штрауслера-Шейнкера, болезнь хронического истощения и фатальная семейная бессонница, бульбарный паралич, болезнь моторных нейронов и гетеродегенеративные расстройства нервной системы, такие как болезнь Канавана, Болезнь Хантингтона, нейрональный цероидный липофусциноз, болезнь Александра, синдром Туретта, синдром курчавых волос Менкеса, синдром Коккейна, синдром Галлевордена-Шпаца, болезнь Лафора, синдром Ретта, гепатолентикулярная дегенерация, синдром Леша-Нихана и синдром Унверрихта-Лундборга, деменция, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Пика и спиноцеребеллярную атаксию, рак (например, ЦНС и/или головного мозга, включая метастазы в головном мозге, вызванные раком в другом месте в организма.
[0403] Лекарственное средство для лечения неврологического расстройства может включать, но не ограничиваться ими, антитела, пептиды, белки, природные лиганды одной или более мишеней(-ями) в ЦНС, модифицированные варианты природных лигандов одной или более мишеней(-ями) в ЦНС, аптамеров, ингибирующих нуклеиновые кислоты (т.е. малые ингибирующие РНК (siRNA) и короткошпилечные РНК (shRNA)), рибозимы и малые молекулы или активные фрагменты любого из вышеперечисленных. Типичные лекарственные средства для неврологического расстройства включают, но не ограничиваются ими: антитела, аптамеры, белки, пептиды, ингибирующие нуклеиновые кислоты и малые молекулы и активные фрагменты любого из вышеперечисленных, которые либо сами, либо специфическим образом распознают и/или действуют на (т.е. ингибируют, активируют или обнаруживают) антиген ЦНС или молекулу-мишень, такую как, но не ограничиваясь ими, предшественник бета-амилоида или его части, амилоид-бета, бета-секретаза, гамма-секретаза, Tau, альфа-синуклеин, паркин, гентингтин, DR6, пресенилин, АроЕ, глиома или другие маркеры рака ЦНС и нейротрофины. Неограничивающие примеры лекарственных средств для неврологического расстройства и те расстройства, при которых их можно применять для лечения, включают антитело против ВАСЕ1 для лечения болезни Альцгеймера, острой и хронической травмы головного мозга, инсульта; антитела против Abeta для лечения болезни Альцгеймера; нейротрофин для лечения инсульта, острой травмы головного мозга, травмы спинного мозга; нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF-2) для лечения хронической травмы головного мозга (нейрогенез); антитело против рецептора антиэпидермального фактора роста (EGFR) для лечения рака мозга; нейронный фактор глиальной линии клеток (GDNF) для лечения болезни Паркинсона; нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) для лечения амиотрофического латерального склероза и депрессии; лизосомальный фермент для лечения лизосомальной болезни накопления головного мозга; цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) для лечения амиотрофического латерального склероза; нейрегулин-1 для лечения шизофрении и антитело против HER2 (например, трастузумаб) для лечения метастаз в головном мозге от HER2-положительного рака.
[0404] В некоторых вариантах реализации условно активные антитела можно конъюгировать в Fc-области антител. Способные к конъюгированию молекулы, соединения или лекарственные средства, описанные выше, можно конъюгировать с Fc-областью, как это описано в патенте США №8362210. Например, Fc-область можно конъюгировать с цитокином или токсином, доставку которого следует осуществить на участок, где условно активные антитела проявляют преимущественную активность. Способы конъюгирования полипептидов с Fc-областью антител известны в данной области. См., например, патент США №№5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5723125, 5783181, 5908626, 5844095 и 5112946; ЕР 307434; ЕР 367166; ЕР 394827; публикации WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 и WO 99/04813; Ashkenazi и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, pages 10535-10539, 1991; Traunecker и др., Nature, vol. 331, pages 84-86, 1988; Zheng и др., J. Immunol., vol. 154, pages 5590-5600, 1995 и ViI и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pages 11337-11341, 1992.
[0405] В одном варианте реализации условно активное антитело, применяемое для конъюгирования, раскрытое в настоящем описании, предпочтительным образом характеризуется отношением активности при аберрантном условии к активности при нормальном физиологическом условии по меньшей мере приблизительно 10:1 или по меньшей мере приблизительно 12:1, или по меньшей мере приблизительно 14:1, или по меньшей мере приблизительно 16:1, или по меньшей мере приблизительно 18:1, или по меньшей мере приблизительно 20:1, или по меньшей мере приблизительно 22:1, или по меньшей мере приблизительно 24:1, или по меньшей мере приблизительно 26:1.
[0406] В некоторых вариантах реализации условно активное антитело можно ковалентно присоединить к конъюгированному агенту через промежуточный линкер, содержащий по меньшей мере две реакционноспособные группы, одна для взаимодействия с условно активным антителом и одна для взаимодействия с конъюгированным агентом. Указанный линкер, который может включать любое совместимое органическое соединение, можно выбрать таким образом, что реакция с условно активным антителом или конъюгированным агентом не оказывает неблагоприятного воздействия на реакционную способность и/или селективность условно активного антитела. Кроме того, присоединение линкера к конъюгированному агенту может не нарушать активность указанного конъюгированного агента.
[0407] Подходящие линкеры для окисленных условно активных антител включают те, которые содержат группу, выбранную из первичных аминов, вторичных аминов, гидразина, гидразида, гидроксиламинов, фенилгидразина, семикарбазида и тиосемикарбазидных групп. Подходящие линкеры для восстановленных условно активных антител включают те, которые имеют определенные реакционноспособные группы, способные к взаимодействию с сульфгидрильной группой восстановленного условно активного антитела. Такие реакционноспособные группы включают, но не ограничиваются ими: реакционноспособные галогеналкильные группы (включая, например, галоацетильные группы), n-меркурибензоатные группы и группы, способные к реакциям присоединения Майкла (включая, например, малеимиды и группы указанного типа, описанного Mitran Lawton, J. Amer. Chem. Soc., vol. 101, pages 3097-3110, 1979).
[0408] Конструирование мультиспецифических условно активных антител
[0409] Мультиспецифическое антитело представляет собой антитело с полиэпитопной специфичностью. Мультиспецифические антитела включают, но не ограничиваются ими, антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), где единица VHVL обладает полиэпитопной специфичностью, антитела, содержащие два или более VL- и VH-доменов, где каждая единица VHVL связывается с различным эпитопом, антитела, содержащие два или более отдельных вариабельных домена с каждым отдельным вариабельным доменом, связывающимся с различным эпитопом, и антитела, содержащие один или более фрагментов антитела, а также антитела содержащие фрагменты антитела, которые ковалентным или нековалентным образом связаны.
[0410] Для конструирования мультиспецифических антител, включая биспецифичные антитела, получают фрагменты антител, содержащих по меньшей мере одну свободную сульфгидрильную группу. Указанные фрагменты антител можно получить из полноразмерных условно активных антител. Условно активные антитела можно энзиматическим образом расщеплять для получения фрагментов антитела. В примерах способов энзиматического расщепления можно использовать пепсин, папаин и Lys-C. Примеры фрагменты антитела включают, но не ограничиваются ими, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диатела (Db); тандемные диатела (taDb), линейные антитела (см. патент США №5641870, пример 2; Zapata и др., Protein Eng., vol. 8, pages 1057-1062 (1995)); неполные антитела, антитела с единственным вариабельным доменом, минититела (Olafsen и др (2004) Protein Eng. Design & Sel., vol. 17, pages 315-323), молекулы одноцепочечного антитела, фрагменты, полученные при помощи библиотеки экспрессии Fab, антиантиидиотипические (анти-Id) антитела, CDR (области, определяющие комплементарность) и эпитоп-связывающие фрагменты. Фрагменты антител также можно получить с применением технологии рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующая фрагменты антител, можно клонировать в плазмидные векторы экспрессии или фагмидные векторы и осуществить экспрессию непосредственно в Е. coli. Способы энзиматического расщепления антител, клонирования ДНК и экспрессии рекомбинантного белка хорошо известны специалистам в данной области техники.
[0411] Фрагменты антител можно очистить с применением общепринятых методов и их можно подвергнуть восстановлению для получения свободной тиоловой группы. Фрагменты антитела, содержащие свободную тиоловую группу, могут вступать во взаимодействие с кросс-линкером, например, бисмалеимидом. Такие перекрестно сшитые фрагменты антител очищают и затем вводят во взаимодействие со вторым фрагментом антитела, содержащим свободную тиоловую группу. Конечный продукт, в котором два фрагмента антитела перекрестно сшиты, очищают. В определенных вариантах реализации каждый фрагмент антитела представляет собой Fab и указанный конечный продукт, в котором два Fab связаны через бисмалеимид, обозначают в настоящем документе как бисмалеимидо-(тио-Fab)2, или бис-Fab. Такие мультиспецифические антитела и аналоги антител, включая бис-Fab, можно применять для быстрого синтеза большого числа комбинации фрагментов антител, или структурных вариантов нативных антител или, в особенности, комбинаций фрагментов антител.
[0412] Мультиспецифические антитела можно синтезировать с модифицированными кросс-линкерами, такими, что их дополнительные функциональные фрагменты можно присоединить к указанным мультиспецифичным антителам. Модифицированные кросс-линкеры позволяют присоединить любой сульфгидрил-реактивный фрагмент. В одном варианте N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA) присоединяют к бисмалеимиду с образованием бисмалеимидоацетилтиоацетата (BMata). После снятия защиты с маскированной тиоловой группы, любую функциональную группу, содержащий сульфгидрил-реактивный (или тиол-реактивный) фрагмент, можно присоединить к мультиспецифичным антителам.
[0143] Примеры тиол-реактивных реагентов включают мультифункциональный линкерный реагент, реагент для захвата, то есть аффинный меченый реагент (например, биотин-линкерный реагент), метку для детекции (например, реагент-флуорофор), реагент для твердофазной иммобилизации (например, SEPHAROSE™, полистирол или стекло) или интермедиат лекарственное средство-линкер. N-этилмалеимид (NEM) представляет собой один из примеров тиол-реактивного реагента. Такие мультиспецифические антитела или аналоги антител, содержащие модифицированные кросс-линкеры, могут дополнительно вступать во взаимодействие с реагентом, представляющим собой фрагмент лекарственного средства, или с другой меткой. Реакция мультиспецифичного антитела или аналога антитела с интермедиатом лекарственное средство-линкер обеспечивает конъюгат мультиспецифическое антитело-лекарственное средство или конъюгат аналог антитела-лекарственное средство соответственно.
[0414] Многие другие методы получения мультиспецифических антител также можно применять в настоящем изобретении. Ссылки, описывающие данные методы, включают: (1) Milstein и Cuello, Nature, vol. 305, page 537 (1983)), публикацию WO 93/08829 и Traunecker и др., EMBO J., vol. 10, page 3655 (1991) по рекомбинантной со-экспрессия двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, обладающих различной специфичностью; (2) патент США №5731168 по конструированию «выступ-во-впадину (knob-in-hole)»; (3) публикацию WO 2009/089004 A1 по конструированию электростатических эффектов при получении гетеродимерных молекул антител с Fc; (4) патент США №4676980 и Brennan и др.. Science, vol. 229, page 81 (1985) по кросс-сшиванию двух или более антител или фрагментов; (5) Kostelny и др., J. Immunol., vol. 148, pages 1547-1553 (1992) по применению лейциновых молний для получения биспецифичных антител; (6) Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pages 6444-6448 (1993) по применению технологии «диатело» для получения фрагментов биспецифических антител; (7) Gruber и др., J. Immunol., vol. 152, page 5368 (1994) по применению одноцепочечных Fv-димеров (sFv); (8) Tutt и др. J. ImmunoL 147: 60 (1991) по получению триспецифичных антител; и (9) патент США №2006/0025576 А1 и Wu и др. Nature Biotechnology, vol. 25, pages 1290-1297 (2007) по конструированию антител с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая «антитела-осминоги» или «иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом» (DVD).
[0415] В одном из вариантов реализации условно активное антитело для пересечения гематоэнцефалического барьера (ВВВ) конструируют для получения мультиспецифичного антитела (например, биспецифичного антитела). Данное мультиспецифическое антитело содержит первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с BBB-R, и второй антигенсвязывающий сайт, который связывается с антигеном головного мозга. По меньшей мере первый антигенсвязывающий сайт для BBB-R является условно активным. Антиген головного мозга представляет собой антиген, экспрессия которого осуществляется в мозге, на который могут быть нацелены антитела или малые молекулы. Примеры таких антигенов включают, без ограничения: бета-секретазу 1 (ВАСЕl), амилоид-бета (Abeta), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), Tau, аполипобелок Е4 (АроЕ4), альфа-синуклеин, CD20, гентингтин, прионовый белок (PrP), богатую лейциновыми повторами киназу 2 (LRRK2), паркин, пресенилин 1, пресенилин 2, гамма-секретазу, рецептор смерти 6 (DR6), предшественник бета-амилоида (АРР), рецептор нейротрофина р75 (p75NTR) и каспазу 6. В одном варианте реализации указанный антиген представляет собой ВАСЕl.
[0416] Мультиспецифические антитела могут обладать высокой селективностью в отношении тканей для преимущественного нацеливания, содержащих все или большинство мишеней (антигенов), с которыми может связываться мультиспецифическое антитело. Например, биспецифичное антитело может обеспечивать селективность для клеток-мишеней, демонстрируя большее предпочтение клеткам-мишеням, которые экспрессируют оба антигена, распознаваемых указанным биспецифичным антителом, по сравнению с нецелевыми клетками, которые могут экспрессировать только один из указанных антигенов. Следовательно, вследствие динамизма данной системы больше биспецифичных антител связано с клетками-мишенями, чем с нецелевыми клетками в состоянии равновесия.
[0417] Конструирование биспецифичного условно активного антитела против поверхностного антигена иммунной эффекторной клетки и антигена-мишени.
[0418] Биспецифичные условно активные антитела согласно изобретению могут привлекать иммунную эффекторную клетку к пораженному участку с присутствующим в нем антигеном-мишенью. Биспецифичное условно активное антитело представляет собой антитело, которое может специфичным образом связываться с двумя различными антигенами: поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки и антигеном-мишенью. Биспецифичное антитело может представлять собой полноразмерное антитело, содержащее два плеча, одно из которых связывается с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клеткой, а другое связывается с антигеном-мишенью. Биспецифичное антитело может представлять собой фрагмент антитела, содержащий только вариабельные домены тяжелой цепи (VH) и вариабельные домены легкой цепи (VL). В одном варианте реализации указанный фрагмент антитела содержит по меньшей мере две единицы VHVL: одна для связывания с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки, а другое плечо для связывания с антигеном-мишенью. В другом варианте реализации указанный фрагмент антитела содержит по меньшей мере два отдельных вариабельных домена (VH или VL): один для связывания с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки, а другое плечо для связывания с антигеном-мишенью. В некоторых вариантах реализации биспецифичное условно активное антитело содержит два scFvs: одно связывается с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки, а другое связывается с антигеном-мишенью.
[0419] Привлеченная иммунная эффекторная клетка с ее связывающей активностью как по отношению к иммунной эффекторной клетке, так и антигену-мишени на пораженной болезнью клетке или пораженной болезнью ткани, может привлекать иммунную эффекторную клетку к пораженным клеткам или пораженным тканям, содержащим антиген-мишень. Привлеченная иммунная эффекторная клетка затем атакует пораженные клетки или пораженные ткани, тем самым способствуя излечению заболевания, поскольку иммунная эффекторная клетка способна подавлять или даже разрушать пораженные клетки или пораженную ткань. Например, иммунные эффекторные клетки могут разрушать опухолевые клетки или инфицированные клетки. Иммунные эффекторные клетки включают природные клетки-киллеры, макрофаги, активируемые лимфокином клетки (LAK) и Т-клетки.
[0420] Биспецифичное условно активное антитело имеет две связывающие активности, по одной в отношении поверхностного антигена иммунных эффекторных клеток и антигена-мишени. В одном варианте реализации обе связывающие активности являются условными, что означает, что величины связывающей активности биспецифичного условно активного антитела с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки и антигеном-мишенью ниже, чем величина связывающей активности антитела дикого типа при нормальном физиологическом условии и выше, чем антитела дикого типа при аберрантном условии. В одном варианте реализации только одна из двух связывающих активностей является условной, что означает, что либо связывающая активность биспецифичного условно активного антитела с поверхностным антигеном иммунных эффекторных клеток, либо связывающая активность биспецифичного условно активного антитела с антигеном-мишенью является условной. В этом случае одна из связывающих активностей биспецифичного условно активного антитела по отношению к поверхностному антигену эффекторной клетки или связывающая активность биспецифичного условно активного антитела по отношению к антигену-мишени ниже, чем соответствующая активность антитела дикого типа при нормальном физиологическом условии и выше соответствующей активности антитела дикого типа при аберрантном условии.
[0421] Два плеча (например, две единицы VHVL или два scFv) в биспецифичном условно активном антителе можно соединить при помощи обычных способов. Как хорошо известно в данной области техники, минимальный фрагмент антитела, содержащий полный сайт связывания антигена, содержит димер вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи (VH и VL) в нековалентной ассоциации. Эта конфигурация соответствует той, которая обнаружена в нативных антителах, где три определяющие комплементарность области (CDR) каждого вариабельного домена взаимодействуют с определением сайта связывания антигена на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть CDR придают антигенсвязывающую специфичность указанному антителу. Каркасы (FR), фланкирующие CDR, имеют третичную структуру, которая по существу сохраняется в нативных иммуноглобулинах у видов, различных, как человек и мышь. Эти FR служат для удержания CDR в соответствующей ориентации. Константные домены не требуются для функции связывания, однако они могут способствовать стабилизации взаимодействия VH-VL. Даже отдельный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низким сродством, чем весь сайт связывания (Painter и др., «Contributions of heavy and light chains of rabbit immunoglobulin G to antibody activity. I. Binding studies on isolated heavy and light chains». Biochemistry, vol. 11 pages 1327-1337, 1972). Следовательно, указанный домен сайта связывания биспецифичного условно активного антитела можно сконструировать как пару доменов VH-VL, VH-VH или VL-VL различных иммуноглобулинов.
[0422] В некоторых вариантах реализации биспецифичное условно активное антитело можно сконструировать в виде непрерывной полипептидной цепи при помощи методов рекомбинантной ДНК, например, таким образом, чтобы экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифичное условно активное антитело, осуществлялась для конструирования непрерывной полипептидной цепи (например, см. Mack и др., «A small bispecific antibody construct expressed as a functional single-chain molecule with high tumor cell cytotoxicity», Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pages 7021-7025, 2005). Порядок доменов VH и VL в полипептидной цепи не является критическим для настоящего изобретения, если домены VH и VL расположены так, что сайты связывания антигена могут надлежащим образом складываться с образованием одного сайта связывания для поверхностного антигена иммунной эффекторной клетки и одного сайта связывания для антигена-мишени.
[0423] Некоторые из методов, описанные в настоящем документе для конструирования мультиспецифических условно активных антител, можно применять для образования биспецифичных условно активных антител против поверхностного антигена иммунной эффекторной клетки и антигена-мишени.
[0424] Биспецифичные антитела, сконфигурированные как отдельная полипептидная цепь, известны в данной области техники и описаны в публикации WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Bruhl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426. Особенно предпочтительной конфигурацией для биспецифичного антитела является полипептидная конструкция, где области VH и VL связаны друг с другом посредством линкерного домена. Порядок областей VH и VL в указанной отдельной полипептидной цепи не является критическим. В одном варианте реализации отдельная полипептидная цепь сконфигурирована как VH1-линкерный домен-VL1-линкерный домен-VH2-линкерный дoмeн-VL2. В другом варианте реализации отдельная полипептидная цепь сконфигурирована как VL1-линкерный домен-VH1-линкерный домен-VL2-линкерный домен-VH2. В другом варианте реализации отдельная полипептидная цепь сконфигурирована как VH1-линкерный домен-VH2-линкерный домен-VL1-линкерный домен-VL2. В другом варианте реализации отдельная полипептидная цепь сконфигурирована как VH1-линкерный домен-VL2-линкерный домен-VL1-линкерный домен-VH2. Отдельная полипептидная цепь может укладываться в два плеча, каждый из которых способен связываться с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки или антигеном-мишенью.
[0425] Линкерный домен в биспецифичном условно активном антителе является фрагментом пептида, достаточно длинным, чтобы способствовать межмолекулярной ассоциации между этими доменами VH и VL. Конструкция линкеров, подходящих для этой цели, описана в предшествующем уровне техники, например, в ЕР 623679 В1, патенте США №5258498, ЕР 573551 В1 и патенте США №5525491. Линкерный домен предпочтительным образом представляет собой гидрофильный гибкий линкер, содержащий от 1 до 25 аминокислот, выбранных из глицина, серина и/или глицина/серина. В одном варианте реализации указанный линкерный домен представляет собой линкер из 15 аминокислот последовательности (Gly4Ser)3.
[0426] Дополнительные линкерные домены включают домены олигомеризации. Домены олигомеризации могут способствовать комбинированию двух или нескольких доменов VH и VL, укладывающихся в два плеча, каждый из которых способен связываться с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки или антигеном-мишенью. Неограничивающие примеры доменов олигомеризации включают лейциновые молнии (например, jun-fos, GCN4, Е/ЕВР, Kostelny, J. Immunol., 148 (1992), 1547-1553, Zeng, Proc. Natl. Acad. Sci., 94 (1997)), 3673-3678, Williams, Genes Dev. 5 (1991), 1553-1563, Suter, «Phage Display of Peptides and Proteins», Chapter 11 (1996), Academic Press), домены олигомеризации, полученные из антител, такие как константные домены СН1 и CL (Mueller, FEBS Letters 422 (1998), 259-264) и/или домены тетрамеризации, такие как GCN4-LI (Zerangue, Proc. Natl., Sci., 97 (2000), 3591-3595).
[0427] В некоторых вариантах реализации технологию «выступ-во-впадину» (knob-in-hole) можно применять для стабилизации укладки отдельной полипептидной цепи биспецифичного условно активного антитела. Технология кnob-in-hole описана у Ridgway и др. («Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization», Protein Eng., 1996, Jul., 9 (7): 617-21). Этот подход применяли для упаковки боковых цепей аминокислот соседних α-спиралей, где боковые цепи остатков в α-спирали представлены как разнесенные в пространстве выступы на поверхности цилиндра, чередующиеся с отверстиями, которым могли бы соответствовать выступы соседних α-спиралей ( и др., (1991) Science, 254, 539-544).
[0428] Поверхностные антигены иммунных клеток-эффекторов должны быть специфичными к одному или к классу иммунных эффекторных клеток. Известны поверхностные антигены для многих иммунных эффекторных клеток. Природные клетки-киллеры имеют поверхностные антигены, включая CD56, CD8, CD16, рецепторы семейства KIR, NKp46, NKp30, CD244 (2В4), CD161, CD2, CD7, CD3 и иммуноглобулин-подобные рецепторы клеток-киллеров (Angelis и др., «Expansion of CD56-negative, CD16-positive, KIR-expressing natural killer cells after Т cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation», Acta Haematol. 2011; 126 (1): 13-20; Dalle и др., «Characterization of Cord Blood Natural Killer Cells: Implications for Transplantation and Neonatal Infections», Pediatric Research (2005) 57, 649-655, Agarwal и др., «Roles and Mechanism of Natural Killer Cells in Clinical and Experimental Transplantation», Expert Rev. Clin. Immunol.; 4 (1): 79-91).
[0429] Макрофаги содержат поверхностный антиген, включая CD11b, F4/80, CD68, CSF1R, МАС2, CD11c, LY6G, LY6C, IL-4Rα, CD163, CD14, CD11b, F4/80 (мышь)/EMR1 (человек), CD68 и МАС-1/МАС-3, РЕСАМ-1 (CD31), CD62, CD64, CD45, Ym1, CD206, CD45RO, 25F9, S100A8/A9 и РМ-2K (Murray и др., «Protective and pathogenic functions of macrophage subsets». Nature Reviews Immunology, 11, 723-737; Taylor и др., «Macrophage receptors and immune recognition», Annu. Rev. Immunol. 2005; 23:901-44; Pilling, и др., «Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts», PLoS ONE 4(10): e7475. doi:10.1371/journal.pone.0007475, 2009).
[0430] Активируемые лимфокином клетки (LAK) содержат поверхностный антиген, включая Т3, Т4, T11, T8, TII, Leu7, Leu11 (Ferrini и др., «Surface markers of human lymphokine-activated killer cells and their precursors». Int. J. Cancer. 1987 Jan. 15;39(1):18-24; Bagnasco и др., «Glycoproteic nature of surface molecules of effector cells with lymphokine-activated killer (LAK) activity», Int. J. Cancer. 1987 Jun. 15;39(6):703-7; Kaufmann и др., «Interleukin 2 induces human acute lymphocytic leukemia cells to manifest lymphokine-activated-killer (LAK) cytotoxicity». The Journal of Immunology, August 1, 1987, vol. 139 no. 3 977-982).
[0431] Т-клетки, особенно цитотоксические Т-клетки, содержат поверхностный антиген, включая CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, Т58, CD27, CD45, CD84, CD25, CD127 и CD196 (CCR6), CD197 (CCR7), CD62L, CD69, TCR, T10, Т11 и CD45RO (Ledbetter и др., «Enhanced transmembrane signalling activity of monoclonal antibody heteroconjugates suggests molecular interactions between receptors on the Т cell surface», Mol. Immunol. 1989 Feb;26(2): 137-45; Jondal и др., «SURFACE MARKERS ON HUMAN Т AND В LYMPHOCYTES», JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, VOLUME 136, 1972, 207-215; Mingari и др., «Surface markers of human Т lymphocytes», Ric. Clin. Lab. 1982 Jul-Sep;12(3):439-448).
[0432] Биспецифичное условно активное антитело после связывания с иммунной эффекторной клеткой, может доставить указанную иммунную эффекторную клетку в клетку или ткань, где присутствует антиген-мишень, предпочтительно на поверхности. Как только биспецифичное условно активное антитело (с иммунной эффекторной клеткой) связывается с антигеном-мишенью, иммунная эффекторная клетка может атаковать пораженную клетку или пораженную ткань. Иммунные эффекторные клетки, такие как природные клетки-киллеры, макрофаги, клетки LAK, Т-клетки (цитотоксические), способны вызывать гибель и/или разрушать пораженную клетку или ткань, например, разрушая опухолевую ткань.
[0433] Пораженные клетки или пораженные ткани могут быть выбраны из рака, воспалительного заболевания, нейрональных расстройств, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний или инфекционных заболеваний. Примеры антигенов-мишеней включают антигены, экспрессия которых осуществляется различными иммунными клетками, карциномами, саркомами, лимфомами, лейкемией, герминогенными опухолями, бластомами и клетками, ассоциированными с различными гематологическими заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и/или воспалительными заболеваниями.
[0434] Антигены-мишени, специфичные для рака, которые могут быть нацелены на биспецифичное условно активное антитело, включают один или несколько из 4-IBB, 5T4, антигена аденокарциномы, альфа-фетопротеина, BAFF, клеток В-лимфомы, С242-антигена, СА-125, карбоангидразы 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (рецептор IgE), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, СЕА, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, дополнительного домена-В фибронектина, рецептора фолата 1, GD2, GG3 ганглиозида, гликопротеина 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, рецепторной киназы фактора роста гепатоцитов человека, рецептора IGF-1, IGF-I, IgGl, LI-CAM, ИЛ-13, ИЛ-6, рецептора инсулиноподобного фактора роста I, интегрина α5β1, интегрин ανβ3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, муцина CanAg, N-гликолилнеураминовой кислоты, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, фосфатидилсерина, клеток карциномы предстательной железы, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, тенаскин С, ФНО-бета 2, ФНО-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, опухолевого антигена СТАА16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 или виментина.
[0435] Типы раков, подвергаемые лечению при помощи генно-инженерных цитотоксических клеток или фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, включают карциному, бластому и саркому, и определенные лейкемии или лимфоидные злокачественные опухоли, доброкачественные и злокачественные опухоли, и злокачественные опухоли, например, саркомы, карциномы и меланомы. Раки могут представлять собой несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли) или солидные опухоли. Также включены опухоли/раки взрослых и опухоли/раки детей.
[0436] Гематологические раки представляют собой раки крови или костного мозга. Примеры гематологических (или гематогенных) раков включают лейкемии, включая острую лейкемию (такую как острая лимфоцитарная лейкемия, острая миелоцитарная лейкемия, острая миелогенная лейкемия и миелобластная, примиелоцитарная, миеломоноцитарная, моноцитарная и эритролейкемия), хронические лейкемии (такие как хроническая миелоцитарная (гранулоцитарная) лейкемия, хроническая миелогенная лейкемия и хроническая лимфоцитарная лейкемия), истинную полицитемию, лимфому, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому (медленно растущую и высокой степени злокачественности формы), множественные миеломы, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, миелодиспластический синдром, лейкоз ворсистых клеток и миелодисплазию.
[0437] Солидные опухоли представляют собой абнормальную массу ткани, которая как правило не содержат цист или жидких областей. Солидные опухоли могут быть доброкачественными или злокачественными. Различные типы солидных опухолей называют по типу клеток, которые их формируют (такие как саркомы, карциномы и лимфомы). Примеры солидных опухолей, которые подвергаются лечению, включают саркомы и карциномы, включая фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеосаркому и другие саркомы, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, леймиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, лимфоидные злокачественные опухоли, рак поджелудочной железы, рак груди, рак легкого, рак яичников, рак предстательной железы, гепатоцеллюлярную карциному, плоскоклеточный рак, базально-клеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, медуллярную карциному щитовидной железы, папиллярную карциному щитовидной железы, феохромоцитому, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, семиному, карциному мочевого пузыря, меланому и опухоли ЦНС (такие как глиома (такие как глиома мозгового ствола и смешанные глиомы), глиобластома (также известную как мультиформная глиобластома), астроцитома, лимфома ЦНС, герминома, медуллобластома, краниофарингиома Шваннома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, менангиома, нейробластома, ретинобластома и метастазы головного мозга).
[0438] Антигены-мишени, специфичные для воспалительных заболеваний, на которые может нацеливаться биспецифичное условно активное антитело, включают один или более из АОС3 (VAP-1), CAM-3001, CCL11 (эотаксин-1), CD125, CD147 (базигин), CD154 (CD40L), CD2, CD20, CD23 (IgE-рецептор), CD25 (цепь ИЛ-2 рецептора), CD3, CD4, CD5, ИФН-а, ИФН-γ, IgE, Fc-области IgE, ИЛ-1, ИЛ-12, ИЛ-23, ИЛ-13, ИЛ-17, ИЛ-17А, ИЛ-22, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-5, ИЛ-6, рецептора ИЛ-6, интегрина а4, интегрина α4β7, Lama glama, LFA-1 (CD1 la), MEDI-528, миостатина, OX-40, rhuMAb β7, склероцина, SOST, ФНО-бета-1, ФНО-а или VEGF-A.
[0439] Антигены-мишени, специфичные для нейрональных расстройств, на которые могут нацеливаться биспецифичные условно активны антитела согласно настоящему изобретению, включают один или более бета-амилоидов или МАВТ5102А. Антигены, специфичные для диабета, на которые может нацеливаться биспецифичное условно активное антитело согласно настоящему изобретению, включают один или более L-Iβ или CD3. Антигены, специфичные для сердечно-сосудистых заболеваний, на которые может нацеливаться биспецифичное условно активное антитело согласно настоящему изобретению, включают один или более С5, кардиальный миозин, CD41 (интегрин альфа-lib), фибрин II, бета-цепь, ITGB2 (CD18) и сфингозин-1-фосфат.
[0440] Антигены-мишени, специфичные для инфекционных заболеваний, на которое может нацеливаться биспецифичное условно активное антитело согласно настоящему изобретению, включают один или более токсинов сибирской язвы, CCR5, CD4, фактор агглютинации А, цитомегаловирус, гликопротеин В цитомегаловируса, эндотоксин, Escherichia coli, поверхностный антиген вируса гепатита В, вирус гепатита В, ВИЧ-1, Hsp90, гемагглютинин вируса гриппа А, липотейхоевую кислоту, Pseudomonas aeruginosa, гликопротеин вируса бешенства, респираторно-синцитиальный вирус и ФНО-а.
[0441] Другие примеры антигенов-мишеней включают поверхностные белки, обнаруживаемые на раковых клетках специфичным или амплифицированным способом, например, рецептор ИЛ-14, CD19, CD20 и CD40 для В-клеточной лимфомы, антигены Lewis Y и СЕА для различных карцином, антиген Tag72 для рака груди и колоректального рака, EGF-R для рака легких, фолатсвязывающий белок и белок HER-2, амплификация которого часто происходит при раке груди человека и карциномы яичников, или вирусные белки, например, белки Gpl20 и gp41 оболочки ВИЧ, белки оболочки, полученные из вирусов гепатита В и С, гликопротеин В и другие гликопротеины оболочки цитомегаловируса человека и белки оболочки, полученные из онковирусов, таких как ассоциированный с саркомой Капоши вирус герпеса. Другие потенциальные антигены-мишени включают CD4, где лиганд представляет собой гликопротеин gpl20 оболочки ВИЧ, и другие вирусные рецепторы, например, ICAM, который является рецептором риновируса человека и связанной с ним рецепторной молекулой для полиовируса.
[0442] Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) не может проникать в клетки человека до тех пора, пока он сначала не связывается с двумя ключевыми молекулами на поверхности клетки, CD4 и корецептором. Корецептором, который изначально распознается, является CCR5, позже в жизненном цикле вируса другой хемокиновый рецептор CXCR4 становится корецептором для ВИЧ-1 (, Nature Med., 2, 1293 (1996), Premack, Nature Med. 2, 1174, Fauci, Nature 384, 529 (1996)). Штаммы ВИЧ-1, которые вызывают наибольшую передачу вирусов при половом контакте, называются М-тропными вирусами. Эти штаммы ВИЧ-1 (также известные как индуцирующий первичные вирусы (NSI) несинитиций) могут реплицироваться в первичных CD4+ Т-клетках и макрофагах и использовать хемокиновый рецептор CCR5 (и реже CCR3) в качестве своих корецепторов. Т-тропные вирусы (иногда называемые индуцирующий первичные вирусы (SI) синцитий) также могут реплицироваться в первичных CD4+ Т-клетках, но могут дополнительно инфицировать сформированные CD4+ Т-клеточные линии in vitro посредством хемокинового рецептора CXCR4 (фузин), Многие из этих Т-тропных штаммов могут использовать CCR5 в дополнение к CXCR4, а некоторые могут вводить макрофаги через CCR5 по меньшей мере при определенных условиях in vitro (, Nature Med., 2, 1293 (1996), Premack, Nature Med. 2, 1174, Fauci, Nature 384, 529 (1996)). Поскольку штаммы М-тропного ВИЧ-1 присутствуют в приблизительно 90% случаях передачи ВИЧ половым путем, CCR5 представляет собой преобладающий корецептор для вируса у пациентов.
[0443] Число и идентичность молекул корецептора на клетках-мишенях и способность штаммов ВИЧ-1 с вероятностью проникать в клетки через различные корецепторы, по-видимому, являются критическими детерминантами прогрессирования заболевания. Высокая экспрессия CCR3 и CCR5 также наблюдали в Т-клетках и В-клетках лимфатических узлов, полученных от пациентов с болезнью Ходжкина. Считают, что диабет I типа опосредован Т-клетками аутоиммунного заболевания. Экспрессию рецептора CCR5 в поджелудочной железе ассоциировали с прогрессированием диабета I типа в соответствующих моделях животных (Cameron (2000) J. Immunol., 165, 1102-1110). В одном варианте реализации биспецифичное условно активное антитело связывается с CCR5 в качестве антигена-мишени, который можно применять для подавления ВИЧ-инфекции клеток-хозяев, а также для замедления прогрессирования других заболеваний.
[0444] Несколько антител, специфичным образом связывающихся с CCR5 (человека), известны в данной области техники и включают МС-1 (Mack (1998) J. Exp. Med. 187, 1215-1224 или МС-5 (Blanpain (2002) Mol Biol Cell. 13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int. 56:52-64, Kraft (2001) Biol. Chem. 14; 276:34408-18). Поэтому предпочтительно, чтобы биспецифичное условно активное антитело содержало, например, VL и VH-домены антитела (т.е. полученного из Ig второго домена), специфичного для CCR5, предпочтительно CCR5 человека, и VH и VL-домены антитела, специфичного для CD3-антигена на Т-клетках.
[0445] В другом варианте реализации настоящего изобретения предложено биспецифичное условно активное антитело против CD3 на Т-клетках и CD19 в качестве антигена-мишени. CD19 оказался очень подходящей медицинской мишенью. Экспрессия CD19 осуществляется во всей линии В-клеток от про-В-клетки до зрелой В-клетки, а также равномерно происходит на всех клетках лимфомы, и она отсутствует в стволовых клетках (Haagen, Clin. Exp. Immunol. 90 (1992), 368-75, Uckun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8603-7). Для лечения злокачественных новообразований В-клеток (в публикации WO 02/04021, США 200200404, США №2002028178) и аутоиммунных заболеваний (в публикации WO 02/22212, США №2002058029) раскрыта комбинационная терапия с использованием как антитела, направленного против CD19, так и дополнительного иммунорегуляторного антитела. В публикации WO 00/67795 раскрыто применение антител против CD19 для лечения индолентных и агрессивных форм В-клеточных лимфом, а также острых и хронических форм лимфатических лейкемий. В публикации WO 02/80987 раскрыто терапевтическое применение иммунотоксинов на основе антител против антигена CD19 для лечения таких заболеваний, как неходжкинская В-клеточная лимфома, лимфома Ходжкина или В-клеточные лейкемии (например, острая В-клеточная лимфатическая лейкемия (B-ALL), (например, волосатоклеточная лимфома), В-клеточный предшественник острой лимфатической лейкемии (pre-B-ALL), В-клеточная хроническая лимфатическая лейкемия (B-CLL)).
[0446] В другом варианте реализации настоящего изобретения предложено биспецифичное условно активное антитело против CD3 на Т-клетках и CD20 в качестве антигена-мишени. CD20 является одним из белков клеточной поверхности, присутствующих на В-лимфоцитах. Антиген CD20 обнаруживают в здоровых и злокачественных пред-В и зрелых В-лимфоцитах, в том числе в более, чем 90% случаях неходжкинских В-клеточных лимфом (NHL). Антиген отсутствует в гематопоэтических стволовых клетках, активированных В-лимфоцитах (плазматических клетках) и здоровой ткани. Было описано несколько антител, главным образом, мышиного происхождения: 1F5 (Press и др., 1987, Blood 69/2, 584-591), 2B8/C2B8, 2H7, 1H4 (Liu и др., 1987, J. Immunol. 139, 3521-3526; Anderson и др., 1998, патент США №5736137; Haisma и др., 199S, Blood 92, 184-190; Shan и др., 1999, J. Immunol. 162, 6589-6595).
[0447] CD20 был описан в иммунотерапевтических стратегиях для лечения плазмоклеточных злокачественных новообразований с применением вакцинации с ДНК, кодирующей scFv, связанной с белком-носителем (Treon и др., 2000, Semin. Oncol. 27 (5), 598) и было показано, что иммунотерапевтическое лечение с применением CD20-антител (IDEC-C2B8), является эффективным при лечении неходжкинской В-клеточной лимфомы.
[0448] В некоторых вариантах реализации биспецифичное условно активное антитело представляет собой одиночную полипептидную цепь, кодируемую молекулой полинуклеотида. Указанный полинуклеотид может представлять собой, например, ДНК, кДНК, РНК или синтетически полученную ДНК или РНК, или рекомбинантным образом полученную молекулу химерной нуклеиновой кислоты, содержащую любой из этих полинуклеотидов либо по отдельности, либо в комбинации. Указанный полинуклеотид может быть частью вектора, например, вектора экспрессии, включая плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги, или любой системы экспрессии, обычно применяемой в генной инженерии. Указанные векторы могут содержать дополнительные гены, такие как маркерные гены, которые позволяют отобрать вектор в подходящей клетке-хозяине и при подходящих условиях.
[0449] В одном аспекте указанный полинуклеотид функционально связан с последовательностями контроля экспрессии, способствующими экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках. Векторы экспрессии, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус коровьей оспы, адено-ассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус папилломы крупного рогатого скота, можно применять для осуществления доставки указанных полинуклеотидов или векторов в клетки млекопитающих. Векторы, содержащие полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, можно перенести в клетку-хозяин при помощи известных способов, которые различаются в зависимости от типа клеточного хозяина. Например, трансфекцию хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработку при помощи фосфата кальция или электропорацию могут применять для других клеточных хозяев.
[0450] Конструирование маскированного условно активного биологического белка
[0451] У условно активного биологического белка, особенно условно активного антитела, согласно настоящему изобретению можно замаскировать условную активность и/или можно замаскировать активность его конъюгированного агента при помощи маскирующего фрагмента. Маскированная активность станет доступной после удаления или расщепления указанного маскирующего фрагмента из условно активного биологического белка. Подходящая технология маскирования описана, например, у Desnoyers и др., «Tumor-Specific Activation of an EGFR-Targeting Probody Enhances Therapeutic Index», Sci. Transl. Med. 5, 207ra144, 2013.
[0452] В некоторых вариантах реализации условно активное антитело связывают с маскирующим фрагментом, который маскирует условную активность и/или активность его конъюгированного агента. Например, когда условно активное антитело связывают с маскирующим фрагментом, такое связывание или модификация могут влиять на структурное изменение, которое уменьшает или ингибирует способность условно активного антитела специфичным образом связываться со своим антигеном. Когда условно активное антитело достигает ткани-мишени или микроокружения, указанный маскирующий фрагмент расщепляется ферментом, присутствующим в ткани-мишени или в микроокружении, тем самым высвобождая маскированную активность. Например, указанный фермент может представлять собой протеазу, обычно активную в микроокружении опухоли, которая может расщеплять указанный маскирующий фрагмент для высвобождения условно активного антитела с активностью в опухолевой ткани.
[0453] В некоторых вариантах реализации активность маскируют менее, чем на приблизительно 50% от первоначальной активности или менее, чем приблизительно на 30% от первоначальной активности, или менее, чем приблизительно на 10% от первоначальной активности, или менее, чем приблизительно на 5% от первоначальной активности, или менее, чем приблизительно на 2% от первоначальной активности, или менее, чем приблизительно на 1% от первоначальной активности, или менее, чем приблизительно на 0,1% от первоначальной активности, или менее, чем приблизительно на 0,01% от первоначальной активности. В некоторых вариантах реализации, например, для того, чтобы обеспечить достаточное время доставки, маскирующий эффект рассчитан на по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов или 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 дней или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или более при измерении in vivo или при вытеснении мишени при проведении иммуноабсорбентного анализа in vitro.
[0454] В определенных вариантах реализации маскирующий фрагмент по своей структуре подобен природному партнеру по связыванию (антигену) условно активного антитела. Маскирующий фрагмент может представлять собой модифицированного природного партнера по связыванию условно активного антитела, который содержит аминокислотные изменения, которые по меньшей мере слегка уменьшают сродство и/или авидность связывания с условно активным антителом. В некоторых вариантах реализации маскирующий фрагмент не обладает или по существу не обладает гомологией с природным партнером по связыванию условно активного антитела. В других вариантах реализации маскирующий фрагмент обладает не более, чем 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% или 80% идентичностью последовательности к природному партнеру по связыванию условно активного антитела.
[0455] Маскирующий фрагмент можно получить в различных формах. В определенных вариантах реализации маскирующий фрагмент может являться известным партнером по связыванию условно активного антитела при условии, что маскирующий фрагмент связывается с условно активным антителом с меньшим сродством и/или авидностью, чем белок-мишень, на которое нацеливается условно активное антитело с последующим расщеплением маскирующего фрагмента, чтобы уменьшить интерференцию маскирующего фрагмента с желаемым связыванием с мишенью. Таким образом, маскирующий фрагмент предпочтительным образом представляет собой фрагмент, который маскирует условно активное антитело от связывания с мишени до того, как маскирующий фрагмент будет расщеплен, однако по существу или значимым образом не препятствует или не конкурирует за связывание активной молекулы с мишенью после того, как маскирующий фрагмент расщепляется от антитела. В конкретном варианте реализации условно активное антитело и маскирующий фрагмент не содержат аминокислотных последовательностей пары встречающихся в природе партнеров по связыванию, так что по меньшей мере одно из условно активных антител и маскирующих фрагментов не содержит аминокислотной последовательности члена встречающегося в природе партнера по связыванию.
[0456] В альтернативном варианте маскирующий фрагмент может специфически не связываться с условно активным антителом, однако препятствовать связыванию условно активного антитела с мишенью посредством неспецифичных взаимодействий, таких как стерическое затруднение. Например, маскирующий фрагмент можно расположить таким образом, что структура или конформация указанного антитела будет способствовать маскирующему фрагменту маскировать условно активное антитело, например, посредством взаимодействия на основе заряда, тем самым препятствуя доступу мишени к условно активному антителу.
[0457] В некоторых вариантах реализации маскирующий фрагмент связан с условно активным антителом посредством ковалентного связывания. В другом варианте реализации связыванию условно активного антитела со своей мишенью препятствует связывание маскирующего фрагмента с N-концом условно активного антитела. В еще одном варианте реализации условно активное антитело связывается с маскирующим фрагментом при помощи дисульфидных мостиков пары цистеин-цистеин между маскирующим фрагментом и условно активным антителом.
[0458] В некоторых вариантах осуществления условно активное антитело дополнительно связывают с расщепляемым фрагментом (CM). CM обладает способностью к расщеплению ферментом, или СМ обладать способностью к восстановлению при помощи восстановителя, или CM обладает способностью к фотолизису. В одном варианте осуществления последовательность аминокислот СМ может перекрывать или быть включена в маскирующий фрагмент. В другом варианте реализации СМ находится между условно активным антителом и маскирующим фрагментом. Следует отметить, что весь СМ или его часть может способствовать маскировке условно активного антитела перед расщеплением. При расщеплении СМ условно активное антитело становится более активным при связывании со своим антигеном.
[0459] CM может быть субстратом для фермента, который совместно локализуется с антигеном-мишенью на пораженном участке у субъекта. Альтернативно или дополнительно СМ может содержать дисульфидную связь пары цистеин-цистеин, которая расщепляется в результате восстановления этой дисульфидной связи. СМ также может представлять собой фотолабильный субстрат, активируемый источником света.
[0460] Ферменты, которые расщепляют СМ, должны предпочтительно располагаться в желаемой ткани-мишени для условно активного антитела, где условно активное антитело является более активным в условии, присутствующим в ткани-мишени (аберрантное условие), как, например, пораженная болезнью ткань или опухолевая ткань. Например, известны известные протеазы с повышенным уровнем активности при ряде видов рака, например, солидных опухолей. См., например. La Rocca и др, (2004) British J. of Cancer 90 (7): 1414-1421. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают: все виды раков (груди, легких, толстой кишки, предстательной железы, головы и шея, поджелудочной железы и т.д.), ревматоидный артрит, болезнь Крона, меланомы, СКВ, сердечнососудистые повреждения, ишемию и т.д. В этой связи можно отобрать выбрать подходящий СМ, который содержит пептидный субстрат, который расщепляется протеазой, присутствующей в опухолевой ткани, в частности, присутствующей в повышенных уровнях в опухолевой ткани по сравнению с не являющимися раковыми тканями.
[0461] В некоторых вариантах реализации СМ может представлять собой субстрат для фермента, выбранного из группы, состоящей из легумина, плазмина, TMPRSS-3/4, MMP-9, MTl-ММР, катепсина, каспазы, эластазы нейтрофилов человека, бета-секретазы, uPA и PSA. Указанный фермент, который расщепляет СМ, присутствует в относительно более высоких уровнях в ткани-мишени подвергающегося лечению участка (например, пораженной болезнью ткани или опухолевой ткани, например, для терапевтического лечения или диагностического лечения), чем в ткани участков, которые лечению не подвергают (например, в здоровых тканях). Следовательно, помимо условной активности антитела, которое может быть более активным в пораженной болезнью ткани или опухолевой ткани, указанный фермент, присутствующий в пораженной болезнью ткани или опухолевой ткани, может расщеплять СМ, что дополнительно улучшает активность условно активного антитела или активность конъюгированного агента. Немодифицированный или нерасщепленный СМ может обеспечивать эффективное ингибирование или маскировку активности условно активного антитела, так что условно активные антитела менее активны в нормальной ткани (нормальное физиологическое состояние). Двойной механизм подавления активности условно активных антител в нормальной ткани (условная активность и маскирующий фрагмент) позволяет применять очень высокую дозировку условно активного антитела, которое можно применять без значимых побочных эффектов.
[0462] В некоторых вариантах реализации СМ может представлять собой субстрат фермента, выбранного из ферментов, перечисленных ниже в Таблице 1.
[0463] Альтернативно или дополнительно СМ может содержать дисульфидную связь цистеиновой пары, которая, таким образом, расщепляется восстановителем, таким как клеточный восстановитель, включающий глутатион (GSH), тиоредоксины, НАДФН, флавины, аскорбат и им подобные, который может присутствовать в больших количествах в ткани или вокруг солидной опухоли.
[0464] В некоторых вариантах реализации условно активное антитело содержит как СМ, так и маскирующий фрагмент. Снятие маскировки с активности условно активного антитела происходит при расщеплении СМ ферментом. В некоторых вариантах реализации может быть желательным осуществить вставку одного или более линкеров, например, гибких линкеров, между антителом, маскирующим фрагментом и СМ, чтобы таким образом обеспечить гибкость. Например, маскирующий фрагмент и/или СМ могут не содержать достаточного количества остатков (например, Gly, Ser, Asp, Asn, особенно Gly и Ser, в частности Gly) для обеспечения требуемой гибкости. В связи с этим, может быть эффективным введение одной или более аминокислот для обеспечения гибкого линкера. Например, маскируемое условно активное антитело может иметь следующие структуры (где приведенная ниже формула представляет собой аминокислотную последовательность либо в направлении от N- до С-конца, либо в направлении от С- до N-конца):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L1-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
Cyclo[L1-(MM)-L2-(CM)-L3-(AB)]
где MM представляет собой маскирующий фрагмент, а АВ представляет собой условно активное антитело; L1, L2 и L3 каждый представляют собой независимо друг от друга и необязательно присутствующие или отсутствующие, являющиеся одним и тем же или различными гибкие линкеры, которые включают по меньшей мере одну гибкую аминокислоту (например, Gly); и там, где присутствует cyclo вся структура представлена в форме циклической структуры вследствие присутствия дисульфидной связи между парой цистеинов на или вблизи как N-, так и С-конца указанной структуры.
[0465] Линкеры, подходящие для применения в настоящем изобретении, в целом представляют собой линкеры, которые обеспечивают гибкость маскирующему фрагменту для содействия ингибированию активности условно активного антитела. Такие линкеры в целом называют гибкими линкерами. Подходящие линкеры можно легко отобрать, и они могут иметь любую подходящую различную длину, например, от 1 аминокислоты (например, Gly) до 20 аминокислот, от 2 аминокислот до 15 аминокислот, от 3 аминокислот до 12 аминокислот, включая от 4 аминокислот до 10 аминокислот, от 5 аминокислот до 9 аминокислот, от 6 аминокислот до 8 аминокислот или от 7 аминокислот до 8 аминокислот, и их длина может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот.
[0466] Примеры гибких линкеров включают полимеры глицина (G)n, полимеры глицин-серина (включая, например, (GS)n, (GSGGS)n и (GGGS)n, где n представляет собой целое число по меньшей мере один, полимеры глицин-аланина, полимеры аланин-серина и другие гибкие линкеры, известные в данной области техники. Примеры гибких линкеров включают, но не ограничиваются ими, Gly-Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly-Ser-Gly, Gly-Ser-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser-Gly, Gly-Ser-Ser-Ser-Gly и им подобные.
[0467] Некоторые из методов, применяемых для маскировки активности условно активного антитела, описаны в публикации WO 020081173А2.
[0468] Фармацевтические композиции
[0469] В настоящем описании предложена по меньшей мере одна композиция, содержащая (а) условно активный биологический белок и (b) подходящий носитель или разбавитель. В настоящем описании также предложена по меньшей мере одна композиция, содержащая (а) условно активный биологический белок, кодирующий нуклеиновую кислоту, описанный в настоящем документе; и (b) подходящий носитель или разбавитель. Указанный носитель или разбавитель необязательно может являться фармацевтически приемлемым согласно известным носителями или разбавителями. Указанная композиция может необязательно дополнительно содержать по меньшей мере одно дополнительное соединение, белок или композицию. В некоторых вариантах реализации указанный условно активный биологический белок является условно активным антителом.
[0470] Указанный условно активный биологический белок может быть в форме фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли, которые обычно можно применять в качестве солей терапевтического белка в фармацевтической промышленности, включают, например, соли натрия, калия, кальция и им подобные, и аминные соли прокаина, дибензиламина, этилендиамина, этаноламина, метилглюкамина, таурина и т.п., а также соли присоединения кислот, такие как гидрохлориды, и основные аминокислоты и им подобные.
[0471] В настоящем описании также предложен по меньшей мере один способ или композиция, содержащая условно активный биологический белок, для введения терапевтически эффективного количества для модуляции или лечения по меньшей мере одного связанного с родительской молекулой состояния в клетке, ткани, органе, животном или пациенте и/или до, после или во время соответствующего состояния, известного в данной области техники и/или описанного в настоящем документе. Таким образом, в настоящем описании предложен способ диагностики или лечения состояния, ассициированного с белком дикого типа, в клетке, ткани, органе или животном, включающий введение в контакт или введение композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного условно активного биологического белка согласно настоящему описанию, с или в указанную клетку, ткань, орган или животное. Указанный способ может необязательно дополнительно включать применение эффективного количества 0,001-50 мг/кг условно активного биологического белка согласно настоящему описанию в указанных клетках, ткани, органе или животном. Указанный способ может необязательно дополнительно включать применение ввода в контакт или введения по меньшей мере посредством одного способа, выбранного из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, интраабдоминального, внутрисуставного, внутрихрящевого, внутриполостного, интрацеллюлярного, внутрицеребеллярного, интрацеребровентрикулярного, внутрь толстой кишки, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазово, внутриперкардиально, внутрибрюшинного, внутрибрюшинные, внутриплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, интраторакального, внутриматочного, интравезикального, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального или трансдермального. Указанный способ может необязательно дополнительно включать введение условно активного биологического белка, которое осуществляют до, во время или после введения в контакт или введения по меньшей мере одной композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранного из по меньшей мере детектируемой метки или репортера, антагониста ФНО, противоревматического средства, миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAK)), анальгетика, анестетика, седативного средства, местного анестетика, нервно-мышечного блокатора, противомикробного средства, антипсориазного средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммунодепрессанта, гормона роста, лекарственного средства для заместительной гормональной терапии, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, неролептического средства, стимулятора, лекарственного препарата от астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, адреналина или его аналога, цитотоксического или другого противоракового агента, антиметаболита, такого как метотрексат, или антипролиферативного агента.
[0472] В настоящем описании дополнительно предложен по меньшей мере один способ с применением одного условно активного биологического белка для диагностики по меньшей мере одного состояния, связанного с белком дикого типа, в клетке, ткани, органе, животном или пациенте и/или до, после или во время соответствующего состояния, известного в данной области техники и/или описанного в настоящем документе.
[0473] Фармацевтически приемлемые носители частично определяют при помощи конкретной вводимой композиции, а также при помощи конкретного способа, применяемого для введения указанной композиции. Соответствующим образом, существует широкое разнообразие подходящих составов фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Можно применять разнообразные водные носители, например, буферный физиологический раствор и ему подобные. Эти растворы являются стерильными и в целом не содержат нежелательных веществ. Стерилизацию данных композиций можно осуществить при помощи обычных хорошо известных методов стерилизации. Указанные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для аппроксимации физиологических условий, как, например, агенты для буферизации и регулирования рН, агенты для регулирования токсичности и им подобные, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и им подобные. Концентрация условно активного биологического белка в этих составах может варьироваться в широких пределах, и ее будут выбирать в основном на основе объемов жидкости, вязкости, массы тела и т.п. в соответствии с выбранным конкретным способом введения и потребностями пациента.
[0474] Составы, подходящие для перорального введения, могут состоять из (а) жидких растворов, таких как эффективное количество упакованной нуклеиновой кислоты, суспендированной в разбавителях, таких как вода, физиологический раствор или ПЭГ 400; (b) капсул, саше или таблеток, каждая из которых содержит заданное количество активного ингредиента в виде жидкостей, твердых веществ, гранул или желатина; (с) суспензий в соответствующей жидкости и (d) подходящих эмульсий. Фармацевтические композиции и составы согласно настоящему изобретению для перорального введения можно приготовить с применением фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области техники, в соответствующих и подходящих дозах. Такие носители позволяют приготавливать фармацевтические препараты в виде таких единичных лекарственных форм как таблеток, пилюль, порошка, драже, капсул, жидкостей, таблеток для рассасывания, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.д., подходящих для приема внутрь пациентом. Фармацевтические препараты для перорального применения можно приготовить в виде твердого вспомогательного вещества, необязательного измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления подходящих дополнительных соединений, если это желательно, для получения таблеток или внутреннего содержимого драже. Подходящими твердыми вспомогательными веществами являются углеводные или белковые наполнители, включая, например, сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; крахмал, полученный из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, как, например, метилцеллюлоза, гидроксипропинелцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза натрия; и камеди, включая арабик и трагакант; и белки, например, желатин и коллаген. Можно добавить дезинтегрирующие или солюбилизирующие агенты, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такие как альгинат натрия. Таблетированные формы могут содержать одну или более из лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, фосфатов кальция, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, трагаканта, микрокристаллической целлюлозы, аравийской камеди, желатина, коллоидного диоксида кремния, кросканнеллозы натрия, талька, стеарата магния, стеариновой кислоты и других вспомогательных веществ, красителей, наполнителей, связующих веществ, разбавителей, буферных агентов, увлажняющих агентов, консервантов, ароматизаторов, красителей, дезинтегрирующих агентов и фармацевтически приемлемых носителей.
[0475] В настоящем изобретении предложены водные суспензии, содержащие условно активный биологический белок в смеси со вспомогательными веществами, подходящими для получения водных суспензий. Такие вспомогательные вещества включают суспендирующий агент, такой как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь, а также диспергирующие или смачивающие агенты, такие как встречающийся в природе фосфатид (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида с жирной кислотой (например, полиоксиэтиленстеарат), продукт конденсации этиленоксида с длинноцепочечным алифатическим спиртом (например, гептадекаэтиленоксицетанол), продукт конденсации этиленоксида с неполным эфиром, полученным из жирной кислоты и гексита (например, полиоксиэтиленсорбит моноолеат) или продукт конденсации этиленоксида с неполным эфиром, полученным из жирной кислоты и ангидрида гексита (например, полиоксиэтиленсорбитан моноолеат). Указанная водная суспензия также может содержать один или более консервантов, таких как этил или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или более красителей, один или более ароматизаторов и один или более подсластителей, таких как сахароза, аспартам или сахарин. Составы можно регулировать по осмоляльности.
[0476] Формы таблеток для рассасывания могут содержать активный ингредиент в ароматизаторе, обычно сахарозе и аравийской камеди или трагаканте, а также пастилки для рассасывания, содержащие указанный активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийские эмульсии, гели и им подобные, содержащие в дополнение к указанному активному ингредиенту, носители, известные в данной области техники. Признано, что условно активный биологический белок при пероральном введении следует защищать от переваривания. Обычно это достигается либо путем комплексообразования условно активного биологического белка с композицией для придания ему устойчивости в отношении кислого и ферментативного гидролиза, либо путем упаковки условно активного биологического белка в подходящий резистентный носитель, такой как липосома. Средства защиты белков от переваривания хорошо известны в данной области техники. Указанные фармацевтические композиции можно инкапсулировать, например, в липосомы или в состав, который обеспечивает медленное высвобождение активного ингредиента.
[0477] Упакованный условно активный биологический белок, отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, можно получить в виде в аэрозольных составов (например, они могут быть «распылены») для введения посредством ингаляции. Аэрозольные составы можно поместить в находящиеся под давлением приемлемые пропелленты, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и им подобные. Подходящие препараты для ректального введения включают, например, суппозитории, которые состоят из упакованной нуклеиновой кислоты с основанием суппозитория. Подходящие основания для суппозиториев включают природные или синтетические триглицериды или углеводороды парафинового ряда, кроме того, также возможно применять желатиновые ректальные капсулы, которые состоят из комбинации упакованной нуклеиновой кислоты с основанием, включая, например, жидкие триглицериды, полиэтиленгликоли и углеводороды парафинового ряда.
[0478] Композиции для осуществления дермальной или местной доставки согласно настоящему изобретению могут содержать в дополнение к условно активному биологическому белку, фармацевтически приемлемый носитель в составе крема, мази, раствора или гидрогеля и другие соединения, если добавляемый компонент не оказывает вредного воздействия на доставку указанного терапевтического белка. Также можно добавить обычные фармацевтически приемлемые эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, суспендирующие агенты, антиоксиданты, осмотические энхансеры, наполнители, разбавители и консерванты. В качестве носителей можно применять водорастворимые полимеры.
[0479] Составы, подходящие для парентерального введения, как, например, посредством внутрисуставного (в суставы), внутривенного, внутримышечного, внутридермального, внутрибрюшинного и подкожного способов, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые приводят к тому, что состав становится изотоничен крови предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты в практической реализации настоящего изобретения, композиции можно вводить, например, внутривенным вливанием, перорально, местно, внутрибрюшинно, интравезикально или интратекально. В одном аспекте парентеральные способы введения являются предпочтительными способами введения композиций, содержащих условно активный биологический белок. Композиции можно удобно вводить в виде единичной лекарственной формы и их пожно получить любым из способов, хорошо известных в фармацевтической области, например, описанных в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания., 18th Ed., 1990. Составы для внутривенного введения могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, такой как стерильная вода или физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрированные нафталины и им подобные. Также см. и адаптировать описание патента США №4318905.
[0480] Составы упакованных композиций, содержащих условно активный биологический белок, могут быть представлены в герметично запаянных контейнерах с единичной дозой или с несколькими дозами, таких как ампулы и флаконы. Растворы для инъекций и суспензии можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных ранее.
[0481] В настоящем описании также предложена по меньшей мере одна композиция условно активного биологического белка, устройство и/или способ доставки для диагностики по меньшей мере одного состояния, связанного с белком дикого типа, в соответствии с настоящим описанием.
[0482] Также предложена композиция, содержащая по меньшей мере один условно активный биологический белок и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Указанная композиция может необязательно дополнительно содержать эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка, выбранного из по меньшей мере одной детектируемой метки или репортера, цитотоксического или другого противоракового агента, антиметаболита, такого как метотрексат, антипролиферативного агента, цитокина или антагониста цитокина, антагониста ФНО, противоревматического средства, миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID)), анальгетика, анестетика, седативного средства, местного анестетика, нервно-мышечного блокатора, противомикробного средства, антипсориазного средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммунодепрессанта, гормона роста, лекарственного средства для заместительной гормональной терапии, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, неролептического средства, стимулятора, лекарственного препарата от астмы, бета-агониста, ингаляционного стероида, адреналина или его аналога.
[0483] Также предложено медицинское устройство, содержащее по меньшей мере один условно активный биологический белок согласно настоящему описанию, при этом указанное устройство является подходящим для введения в контакт или введения по меньшей мере одного условно активного биологического белка по меньшей мере одним способом, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, интраабдоминального, внутрисуставного, внутрихрящевого, внутриполостного, интрацеллюлярного, внутрицеребеллярного, интрацеребровентрикулярного, внутрь толстой кишки, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперкардиально, внутрибрюшинного, внутриплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, интраторакального, внутриматочного, интравезикального, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального или трансдермального.
[0484] В еще одном аспекте настоящего описания предложен набор, содержащий по меньшей мере один условно активный биологический белок или фрагмент согласно настоящему описанию в лиофилизированной форме в первом контейнере и необязательно второй контейнер, содержащий стерильную воду, стерильную буферную воду или по меньшей мере один консервант, выбранный из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, фенилмеркурий нитрита, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния, алкилпарабена, хлорида бензалкония, хлорида бензетония, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смесей в водном разбавителе. В одном аспекте в указанном наборе концентрацию условно активного биологического белка или определенной части или варианта в указанном первом контейнере восстанавливают до концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 500 мг/мл при помощи содержимого указанного второго контейнера; в другом аспекте второй контейнер дополнительно содержит агент изотоничности. В другом аспекте указанный второй контейнер дополнительно содержит физиологически приемлемый буфер. В одном аспекте настоящего описания предложен способ лечения по меньшей мере одного состояния, опосредованного белком дикого типа, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, состава, предложенного в наборе, и его предварительное восстановление до введения.
[0485] Также предлагается изделие производства для фармацевтического или диагностического применения у человека, содержащее упаковочный материал и контейнер, содержащий раствор или лиофилизированную форму по меньшей мере одного условно активного биологического белка согласно настоящему изобретению. Указанное изделие производства может необязательно содержать контейнер в качестве компонента парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, интраабдоминального, внутрисуставного, внутрихрящевого, внутриполостного, интрацеллюлярного, внутрицеребеллярного, интрацеребровентрикулярного, внутрь толстой кишки, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, интрамиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперкардиально, внутрибрюшинного, внутриплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интрасиновиального, интраторакального, внутриматочного, интравезикального, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального или трансдермального устройства или системы для доставки.
[0486] Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает любое раскрытие, описанное в настоящем документе.
[0487] Пример 1. Общее описание многолуночного анализа (например, 96-лу ночного анализа) для температурных мутантов
[0488] Флуоресцентный субстрат добавляют к каждой лунке многолуночного планшета как к дикому, так к новому типу, снижая температуру реакций (например, или 37°С, или 25°С как отмечено выше) в течение подходящего временного периода. Флуоресценцию определяют путем измерения флуоресценции при помощи флуоресцентного планшета-ридера с подходящими спектрами возбуждения и излучения (например, 320 нм возбуждение/405 нм излучение). Определяют относительные единицы флуоресценции (RFU). Супернатант, полученный из молекул дикого типа и клеток, трансформированных при помощи плазмиды/вектора, применяют в качестве положительного и отрицательного контролей. Реакции выполняют в двойном повторе для каждого образца, температуры реакции, и положительного и отрицательного контроля.
[0489] Мутанты, которые активны при пониженной температуре (например, мутанты, активные при 25°С) и которых наблюдают снижение в активности при температуре дикого типа (например, 10%, 20%, 30%, 40% или более снижение в активности при 37°С), таким образом, обладающие отношением активностей выше или равным приблизительно 1,1 или более (например, отношение активностей при 25°С или 37°С (25°С/37°С) больше, чем или равняется 1,1 или более), могут считаться предполагаемыми первичными чувствительными к температуре попаданиями. Данные предполагаемые первичные чувствительные к температуре попадания затем можно подвергнуть скринингу, применяя аналогичный анализ для подтверждения любого первичного попадания.
[0490] Пример 2. Общее описание различных форматов анализов для подтверждения активности (например, 14-мл анализ) для температурных мутантов
[0491] Экспрессию мутантов, которых идентифицируют в качестве чувствительных к температуре первичных попаданий, осуществляют в 14-миллилитровых культуральных пробирках и их энзиматическую активность измеряют при температуре для дикого типа (например, 37°С) и при пониженной температуре (например, 25°С), Экспрессию и очистку белка производят так, как это описано выше для многолуночного формата, за исключением того, что экспрессию осуществляют в другом формате (14-миллилитровые пробирки), а не в многолуночном (96-луночный планшет) формате.
[0492] Супернатант от каждого мутанта переносят в многолуночный планшет, например, в 96-луночный микропланшет. Флуоресцентный субстрат добавляют к каждой пробирке при указанной температуре реакций (дикий тип, пониженная температура) в течение необходимого периода времени. Молекулы дикого типа применяют в качестве положительного контроля и супернатант из клеток трансформируют только при помощи вектора, применяемого в качестве отрицательного контроля. Флуоресценцию определяют путем измерения флуоресценции при помощи флуоресцентного планшета-ридера при подходящих спектрах излучения (например, 320 нм возбуждение/405 нм излучение). Определяют относительные единицы флуоресценции (RFU). Реакции можно проводить в двойном повторе для каждого образца, температуры реакции и положительного и отрицательного контролей.
[0493] Мутанты, которые активны при пониженных температурах (например, 25°С), но которые демонстрируют по меньшей мере на 30% или более сниженную активность в диком типе (например, 37°С), которые таким образом обладают отношением активностей при пониженной температуре (например, 25°С) и температуре дикого типа (например, 37°С) равным или большим, чем 1,5, идентифицируют как чувствительные к температуре попадания.
[0494] Активности мутантов при пониженной температуре (например, 25°С) сравнивают с активностью молекул дикого типа при температуре дикого типа (например, 37°С). Если молекулы более активны по сравнению молекулами с дикого типа при пониженной температуре (например, 25°С), на что указывает остаточная активность >1, предпочтительно 2 или более, чем 2, и если указанные мутанты демонстрируют общее снижение в активности при сравнении с молекулой дикого типа при температуре дикого типа (37°С), то можно подтвердить фенотип мутантов как чувствительных к температуре мутантов.
[0495] Пример 3. Общее описание дополнительных обнаруженных эволюционных попаданий
[0496] Если это необходимо, то создают новую библиотеку комбинаторных вариантов из всех или из ранее идентифицированных отобранных мутантных попаданий. Новую библиотеку можно разработать для содержания всех возможных комбинаций аминокислотных вариантов для каждого из указанных отобранных мутантов, и можно провести скрининг, как описано, на новые попадания.
[0497] Пример 4. Общее описание обратимости энзиматической активности вследствие снижения в температуре
[0498] Чувствительных к температуре эволюционированных мутантов можно дополнительно исследовать для определения того, обратима или необратима энзиматическая активность при пониженных температурах (например, 25°С) при воздействии на указанных мутантов повышенных температур с последующим возвратом к пониженной температуре (например, 25°С). Экспрессию чувствительных к температуре мутантов осуществляют в любом требуемом формате, например, в 14-миллилитровых культуральных пробирках, как коротко описано. Мутантов исследуют на их активности при нескольких условиях, включая температуру дикого типа (например, 37°С), а также другие температуры, и впоследствии повторно подвергают воздействию требуемой пониженной температуры (например, 25°С). Мутанты, которые активны при пониженных температурах, показывают пониженную активность при повышении до более высоких температур или температур дикого типа (т.е. отношение активностей при пониженной и повышенной температурах равно или больше 1, 1,5, или 2 или выше) и демонстрируют активность исходного уровня при повторном понижении до пониженной температуры, оценивают как «Обратимые Попадания». Мутанты, которые активны при пониженных температурах, показывают пониженную активность при повышении до более высоких температур или температур дикого типа (т.е. отношение активностей при пониженной и повышенной температурах равны или более, чем 1, 1,5 или 2 или выше) и демонстрируют по меньшей мере такое же значение пониженной активности при повторном понижении до пониженной температуры, оценивают как «Необратимые Попадания».
[0499] Пример 5. Материалы и способы для проведения скрининга на условно активные варианты ангиостатина. Материалы и способы для проведения скрининга на условно активные варианты ангиостатина можно адаптировать из работы Chi и Pizzo, «Angiosatin is directly cytotoxic to tumor cells at low extracellular pH: a mechanism dependent on cell surface-associated ATP synthase». Cancer Res. 2006; 66(2):875-882.
[0500] Материалы. Кринглы ангиостатина дикого типа от 1 до 3, полученные из плазминогена человека, можно получить от «Calbiochem» (Дармштадт, Германия) и восстановить в стерильном PBS. Можно получить поликлональные антитела, направленные против каталитической бета-субъединицы АТФ-синтазы, а субъединицу Fl АТФ-синтазы быка можно очистить так, как описано ранее (Moser и др., «Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells», Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999;96:2811-6; Moser и др. «Endothelial cell surface Fl-FO ATP synthase is active in ATP synthesis and is inhibited by angiostatin», Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 2001;98:6656-). Карипорид можно солюбилизировать в стерильной воде и стерильно профильтровать.
[0501] Культура клеток. А549 (линия эпителиальных клеток человека, полученная из ткани карциномы легкого) или альтернативную линию раковых клеток (клетки DU145, LNCaP или РС-3) можно получить, например, из АТСС. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) можно выделить из пупочной вены человека, как описано (Grant и др., «Matrigel induces thymosin h 4 gene in differentiating endothelial cells», J. Cell Sci. 1995;108:3685-94.). Клетки HUVEC можно применять в качестве положительного контроля в качестве линии клеток, которые экспрессируют АТФ-синтазы на клеточной поверхности. Клетки можно культивировать в DMEM («Life Technologies», Карльсбад, штат Калифорния) с замещающей средой 3 с 1% пенициллином-стрептомицином и 10% сыворотки (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури) для того, чтобы минимизировать присутствие плазминогена. Среду с низким pH (6,7) можно получить путем понижения содержания бикарбоната до 10 ммоль/л при 5% СО2 и дополнения 34 ммоль/л NaCl для поддержания осмоляльности или путем инкубации в среде с 22 ммоль/л бикарбоната в присутствии 17% CO2. Примененный способ снижения pH можно изменять по экспериментальным ограничениям и исследованию.
[0502] Проточная цитометрия. Для того чтобы убедиться, что АТФ-синтаза функциональна на поверхности клеток линии опухолевых клеток, можно провести эксперименты при помощи проточной цитометрии. Например, линию клеток А549 можно культивировать в среде с различными pH (10, 22, и 44 ммоль/л бикарбоната DMEM) в гипоксии (уравновешенные 0,5% O2, 5% CO2, N2) против нормоксии (21% O2, 5% CO2) в течение 0, 12, 24, 48 и 72 часов. Живые клетки можно блокировать, инкубировать с антителом против β-субъединицы, промыть, блокировать, инкубировать с вторичными FITC-мечеными антителами козы к антителам кролика (Southern Biotech, Бирмингем, штат Алабама) и заново промыть, все стадии выполняются при 4 градусах С. Пропидий йодид (BD Biosciences, Сан Хосе, штат Калифорния) можно включить во все образцы для различения клеток с поврежденными мембранами. Средняя интенсивность флуоресценции FITC в 10000 клетках можно количественно определить при помощи проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson, Франклин Лейке, штат Нью-Джерси), и клетки с поглощенным йодидом пропидия можно исключить для устранения детекции митохондриальной АТФ-синтазы при помощи компьютерного обеспечения CELLQuest (BD Biosciences).
[0503] Анализ образования АТФ на поверхности клеток. Клетки А549 или 1-LN (60000 на лунку) в 96-луночных планшетах можно обновить средой и обработать при помощи ангиостатина, варианта ангиостатина, анителом против бета-субъединицы, IgG кроликах против бычьего сывороточного альбумина (Organon Teknika, Вест Честер, штат Пенсильвания), пикеатаннолом (известный ингибитор Fl АТФ-синтазы, применяемый в качестве положительного контроля, Sigma) или только средой в течение 30 минут при 37 градусов С, 5% CO2. Клетки затем можно инкубировать с 0,05 ммоль/л ADF в течение 20 секунд. Супернатанты можно отобрать и исследовать на образование АТФ при помощи люминесцентного анализа CellTiterGlo (Promega, Мадисон, штат Висконсин), как описано (23). Лизаты клеток можно аналогичным образом исследовать для подтверждения того, что внутриклеточные пулы АТФ не изменяются ни при каких условиях. Регистрацию можно получить на приборе Luminoskan Ascent (Thermo Labsystems, Хельсинки, Финляндия). Данные выражают в молях АТФ на клетку на основе стандартов, определенных для каждого независимого эксперимента.
[0504] Анализ пролиферации клеток. Эффект ангиостатина на линии раковых клеток можно оценить при помощи исследования пролиферации с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолием, внутренней соли (MTS), в свободной от сыворотки среде. Относительное число клеток в каждой лунке 96-луночного микропланшета после инкубации в течение 20 часов, при 37 градусах С и 5% CO2 в присутствии или в отсутствие ангиостатина можно определить при помощи исследования AQueous One Cell Proliferation Assay (Promega) по протоколу производителя. Значение рН среды можно регулировать при помощи 5% CO2 путем изменения концентрации бикарбоната.
[0505] Оценка клеточной цитотоксичности. Для количественной оценки гибели клеток и лизиса клеток, активность лактатдегидрогеназы (LDH), высвобождающейся из цитозоля в супернатант, можно измерить при помощи набора для определения цитотоксичности (Roche, Индианаполис, штат Индиана). Раковые клетки (например, клетки А549) (5000 на лунку), обработанные при помощи ангиостатина, варианта ангиостатина, антитела против бета-субъединицы, IgG кролика, карипоридом и Тритоном Х (детергентом, применяемым для пермиабилизации клеток в качестве положительного контроля), можно инкубировать при 37 градусах С и 5% CO2 или 17% CO2 в течение 15-ти часов в условиях нейтрального и низкого рН соответственно. Индекс цитотоксичности можно рассчитать делением средней оптической плотности обработанных образцов в четырех повторах на среднюю оптической плотности необработанных образцов в четырех повторах, соответствующих тому же рН среды. Оценка клеточного некроза и апоптоза. Для определения образа действия ангиостатин-индуцируемой гибели клеток можно провести ИФА с применением комплекса гистонов и ДНК. Эффекты ангиостатина, варианта ангиостатина, антитела против бета-субъедицы, IgG кролика, карипорида на клетки А549 (5000 на лунку) можно определить при помощи ИФА-анализа апоптоза и некроза (Roche), который зависит от определения экстрануклеарных фрагментов комплекса гистонов и ДНК. Апоптоз или некроз можно определить, соответственно, по клеточным лизатам или супернатантам образцов, взятых в четырехкратном повторе, после 15 часов инкубации при 37 градусах С в присутствии или в отсутствие агентов. Апоптотические или некротические показатели можно рассчитать путем деления средней оптической плотности обработанных образцов, взятых в четырехкратном повторе, на среднюю оптическую плотность необработанных образцов, взятых в четырехкратном повторе, соответствующих такому же рН среды. Значение рН среды можно регулировать путем инкубации при 5% CO2 или 17% CO2.
[0506] Измерение внутриклеточного рН (pHi). pHi можно измерить по флуоресценции в клетках, высеянных на 35-мм микролуночных чашках со стеклянными покровными стеклами (MatTek, Ашланд, штат Массучесетс). Клетки можно высеять на среду Matrigel (BD Biosciences) со сниженным фактором роста и свободную от фенолового красного. После роста в течение ночи, можно изменить среду и клетки можно нагрузить рН-чувствительным флуоресцентным красителем cSNARF (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон) в течение 15 минут с последующим 20-минутным восстановлением в свежей среде. Приготовленный препарат клеток для исследования затем можно закрепить на предметном столике микроскопа при 37 градусах С, 5% CO2 для 1-часового сбора спектров излучения, по которым можно рассчитать pHi, как описано, по полям, каждое из которых содержит от 7 до 15 клеток (Wahl M.L., Grant D.S. «Effects of microenvironmental extracellular рН and extracellular matrix proteins on angiostatin's activity and on intracellular рН», Gen. Pharmacol. 2002;35:277-85). В начале сбора спектров, среды можно удалить из чашек, и к клеткам можно внести 1 мл свежей среды в присутствии или в отсутствии рН-ингибиторов ангиостатина, антитела против бета-субъединиц, IgG кролика или карипорида, ингибитора натрий-протонного обмена. Значение рН среды можно регулировать при помощи концентрации бикарбоната, как описано выше, с фиксированным % CO2.
[0507] Пример 6. Эволюция легкой цепи или тяжелой цепи антитела.
[0508] Эволюцию тяжелой цепи и легкой цепи антитела F1-10F10 осуществляют отдельно с применением СРЕ. Мутантов легкой цепи подвергают скринингу, чтобы обнаружить 26 мутантов легкой цепи с условной активностью, в этом случае указанные мутанты более активны при рН 6,0, чем дикий тип, и указанные мутанты менее активны при рН 7,4, чем дикий тип. У указанных 26 мутантов легкой цепи наблюдали мутации в 8 разных положениях в легкой цепи. 3 из 8 положений появились у более, чем 5 из 26 мутантов легкой цепи. Эти 3 положения рассматривали в качестве горячих точек в легкой цепи. Мутантов тяжелой цепи подвергали скринингу, чтобы обнаружить 28 мутантов тяжелой цепи с условной активностью. У указанных 28 мутантов тяжелой цепи наблюдали мутации в 8 разных положениях в тяжелой цепи. 3 из 8 положений появились у более, чем 5 из 28 мутантов тяжелой цепи. Эти 3 положения рассматривали в качестве горячих точек в тяжелой цепи. Условную активность мутантов легкой цепи и мутантов тяжелой цепи подтверждали при помощи ИФА-анализа.
[0509] Наилучшее условно активное антитело, полученное в этом примере, обладает 17-кратным различием в своей активности при рН 6,0 по сравнению со своей активностью при рН 7,4. Кроме того, многие условно активные антитела обладают активностью, которая была обратимой при величине рН между нормальным физиологическим рН 7,4 и аберрантным рН 6,0. Интересно, что большинство условно активных антител, полученных в этом примере, проявляют оптимальную связывающую активность при рН от приблизительно 5,5 до 6,5, когда активность условно активных антител исследовали в диапазоне рН от 5,0 до 7,4 при помощи ИФА-анализа.
[0510] Активность условно активных антител, полученных в этом примере, также подтверждали при помощи анализа FACS (флуоресцентно-активированная сортировка клеток) с применением цельных клеток, где клетки СНО применяли для экспрессии антигена антител при рН 6,0 и рН 7,4, Условно активные антитела добавляли к клеткам СНО для измерения связывающей активности. Анализ FACS подтвердил общую тенденцию результатов ИФА-анализа для селективности условно активных антител при рН 6,0 относительно рН 7,4.
[0511] Пример 7: Отбор условно активных антител в специальном буфере
[0512] Мутантные антитела, полученные на стадии эволюции в соответствии с настоящим изобретением, подвергали исследованию при нормальном физиологическом рН 7,4 и исследованию при аберрантном рН 6,0. Оба исследования проводили с применением раствора фосфатно-солевого буфера (ФСБ), содержащего бикарбонат, обнаруживаемый в сыворотке человека. Концентрация бикарбоната в растворе соответствовало концентрации бикарбоната в сыворотке человека, т.е. физиологической концентрации. Сравнительный анализ проводили с применением того же раствора ФСБ без бикарбоната.
[0513] Анализ на измерение связывающей активности для мутантных антител или условно активных антител в этом примере представлял собой ИФА-анализ, который проводили следующим образом:
1. День, предшествующий ИФА: лунки покрывали 100 мкл антигена для антитела Ab-А EDC с гистидиновой меткой (2,08 мг/мл) при 1 мкг/мл ФСБ,
3. Буферный раствор отделяли от 96-луночного планшета, покрытого антигеном для антитела Ab-A-His и насухо промачивали бумажными полотенцами.
4. Планшеты промывали 3 раза буфером N или ФСБ,
5. Планшеты блокировали при помощи 200 мкл обозначенного буфера при комнатной температуре в течение 1 часа,
6. Отобранные мутанты CPE/CPS и белок дикого типа разбавляли до концентрации 75 нг/мл в обозначенных буферных растворах в соответствии с планом исследования. Значение рН буферного раствора устанавливали либо на 6,0, либо на 7,4 (в дальнейшем «обозначенный буферный раствор»),
6. Буфер отделяли и 100 мкл образца с концентрацией 75 нг/мл добавляли в каждую лунку в соответствии с расположением планшета,
7. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа,
8. Буфер отделяли от 96-луночного планшета и насухо промачивали бумажными полотенцами,
9. Планшет промывали при помощи 200 мкл обозначенного буферного раствора в общей сложности 3 раза в соответствии с планом исследования,
10. Anti-Flag HRP получали в обозначенном буферном растворе при разведении 1:5000 и 100 мкл пероксидазы хрена (HRP) Anti-Flag добавляли в каждую лунку в соответствии с планом исследования,
11. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа,
13. Пластину промывали 200 мкл обозначенного буферного раствора в общей сложности 3 раза,
14. Планшет обрабатывали 50 мкл 3,3',5,5-тетраметилбензидина (ТМВ) в течение 1,5 мин.
[0514] Было обнаружено, что анализы в буферном растворе ФСБ, содержащем бикарбонат, приводили к значимо большему показателю эффективности при отборе условно активных антител. Кроме того, условно активные антитела, отобранные с применением буферного раствора ФСБ, содержащего бикарбонат, как правило, обладают гораздо более высоким отношением активности при рН 6,0 к активности при рН 7,4, тем самым обеспечивая значимо более высокую селективность.
[0515] Было также отмечено, что когда отобранные условно активные антитела (с применением буферного раствора ФСБ с бикарбонатом) исследовали в буферном растворе ФСБ без бикарбоната, селективность условно активных антител при рН 6,0 относительно рН 7,0 была значимым образом снижена. Однако когда бикарбонат добавляли к этому буферному раствору ФСБ в физиологическом количестве, селективность тех же условно активных антител восстанавливалась.
[0516] В другом анализе отобранные условно активные антитела исследовали в буферном растворе Кребса с добавлением бикарбоната. Более высокое отношение активности при рН 6,0 к активности при рН 7,4 также наблюдали в этом буферном растворе Кребса с добавлением бикарбоната. По всей видимости, это могло по меньшей мере быть частично обусловлено присутствием бикарбоната в указанном буферном растворе Кребса.
[0517] Когда концентрацию бикарбоната восстанавливали в буферном растворе ФСБ до концентраций ниже его физиологической концентрации, было обнаружено, что активность условно активного антитела при нормальном физиологическом рН 7,4 была увеличена. Было обнаружено, что увеличение активности условно активных антител при рН 7 связано с уменьшением концентрации бикарбоната в буферном растворе ФСБ.
[0518] Антитела дикого типа не подвергались воздействию различных количеств бикарбоната в буферном растворе ФСБ при проведении исследования при рН 7,4, так как его активность остается неизменной при всех одинаковых концентрациях бикарбоната в буферном растворе ФСБ, которые исследовали для условно активного антитела.
[0519] Пример 8: Отбор условно активных антител в разных буферах
[0520] Мутантные антитела, полученные на стадии эволюционирования в соответствии с настоящим изобретением, подвергали ИФА-анализу при нормальном физиологическом рН (7,4) и ИФА-анализу при аберрантном рН (6,0). Оба ИФА-анализа проводили с применением различных буферов, включая буферы на основе буфера Кребса с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и буферов на основе буфера ФСБ с бикарбонатом и БСА.
[0521] ИФА-анализ проводили следующим образом:
1. День, предшествующий ИФА: лунки покрывали 100 мкл антигена для антитела Ab-А ECD и гистидиновой меткой (2,08 мг/мл) при 1 мкг/мл посадочного буфера (карбонат-бикарбонатный буфер).
2. Буферный раствор отделяли от 96-луночного планшета, покрытого антителом Ab-A-His против антигена, и насухо промачивали, применяя бумажные полотенца.
3. Планшеты промывали 3 раза при помощи 200 мкл 20 буферов.
4. Планшеты блокировали при помощи 200 мкл 20 буферов при комнатной температуре в течение 1 часа.
5. Мутанты и химеры разбавляли до концентрации 75 нг/мл в 20 буферах в соответствии с планом исследования.
6. Буфер отделяли и 100 мкл разбавленного образца добавляли в каждую лунку в соответствии с расположением планшета.
7. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
8. Буфер отделяли из 96-луночного планшета и указанный планшет насухо промачивали с применением бумажных полотенец.
9. Планшеты промывали при помощи 200 мкл 20 буферов в общей сложности 3 раза.
10. Anti-flag IgG HRP получали в 20 буферах при разведении 1:5000. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора Anti-flag IgG HRP.
11. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
12. Планшеты промывали при помощи 200 мкл 20 буферов в общей сложности 3 раза.
13. Пластины обрабатывали 50 мкл 3,3',5,5-тетраметилбензидина в течение 30 секунд.
[0522] Условно активные антитела, отобранные с применением анализов в буферном растворе ФСБ с бикарбонатом, продемонстрировали гораздо более высокое отношение активности при рН 6,0 к активности при рН 7,4 по сравнению с теми, которые отбирали с применением анализа в буферном растворе ФСБ без бикарбоната. Кроме того, буферный раствор Кребса с добавленным бикарбонатом также обеспечивал более высокое отношение активности при рН 6,0 к активности при рН 7,4 при сравнении с анализом в буферном растворе ФСБ без бикарбоната. По всей видимости, бикарбонат важен для отбора желаемых условно активных антител.
[0523] Пример 9: Отбор условно активных антител в разных буферах
[0524] В данном примере был проведен скрининг условно активных антител против антигена, которые более активны при рН 6,0, чем антитело дикого типа, и менее активны при рН 7,4, чем антитело дикого типа. Стадии скрининга проводили с применением буферов, приведенных ниже в Таблицах 2 и 3. Указанные буферы в Таблице 2 были основаны на буфере Кребса с добавлением дополнительных компонентов, представленных в столбце 1 Таблицы 2.
[0525] Некоторые буферы для проведения анализов на основе буфера ФСБ с дополнительными компонентами представлены ниже в Таблице 3. Следует обратить внимание на, что компоненты в буферах Таблицы 2 и 3 представлены в виде количества в граммах, добавленных в один литр буфера. Однако концентрация в сыворотки человека составляет 10 масс. % от концентрации буфера.
[0526] Скрининг проводили с применением ИФА-анализа с данными буферами для анализа. ИФА-анализ осуществляли так, как описано в Примерах 7-8. Отобранные условно активные антитела для каждого из 10 буферов для анализа представлены в Таблице 4 ниже. Величина OD поглощения при 450 обратно коррелирует со сродством к связыванию в указанном ИФА-анализе.
[0527] Селективность некоторых отбранных условно активных антител подтверждали с применением буферов 8 и 9, и было обнаружено, что они обладают желаемой селективностью при рН 6,0 выше 7,4, как представлено на Фигуре 1. Следует отметить, что применение разных буферов влияет на селективность условно активных антител.
[0528] Следует отметить, что в контексте настоящего описания и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественные ссылки до тех пор, пока в контексте явно не диктует иное. Кроме того, термины «единственное число», «один или более» и «по меньшей мере один» в настоящем документе можно применять взаимозаменяемо. Термины «содержащий», «включающий», «обладающий» и «сконструированный из» можно также применять взаимозаменяемо.
[0529] Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, процент, отношение, условия реакции и применяемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях при помощи термина «приблизительно», независимо от того, присутствует ли или нет термин «приблизительно». Соответствующим образом, если не указано обратное, численные параметры, указанные в описании и формуле изобретения, являются приблизительными, которые можно варьировать в зависимости от желаемых свойств, которые следует получить в соответствии с настоящим описанием. В крайнем случае, а не как попытка ограничить применение доктрины эквивалентов объема формулы изобретения, каждый численный параметр следует по меньшей мере истолковывать в свете количества зарегистрированных значащих цифр и путем применения обычных методов округления. Несмотря на, что числовые диапазоны и параметры, предложенные в широкой области настоящего изобретения, являются приближениями, числовые значения, приведенные в конкретных примерах, описаны на столько точно, насколько это возможно. Любое числовое значение, однако, по своей сути содержит определенные ошибки, неизбежно возникающие в результате стандартного отклонения, обнаруженного в их соответствующих опытных измерениях.
[0530] Следует понимать, что каждый компонент, соединение, заместитель или параметр, раскрытый в настоящем описании, следует истолковывать как раскрытый для применения по отдельности или в комбинации с одним или более из всех без исключения других компонентов, соединений, заместителей или параметров, раскрытых в настоящем документе.
[0531] Также следует понимать, что каждое количество/значение или диапазон количеств/значений для каждого компонента, соединения, заместителя или параметра, раскрытого в настоящем документе, следует интерпретировать как также раскрытое в комбинации с каждым количеством/значением или диапазоном количеств/значений, раскрытых для любого другого компонента(-ов), соединения(-й), заместителя(-ей) или параметра(-ов), раскрытых в настоящем документе, и что любая комбинация количеств/значений или диапазонов количеств/значений для двух или более компонента(-ов), соединения(-й), заместителя(-ей) или параметров, раскрытых в настоящем документе, таким образом также раскрыты в комбинации друг с другом для целей этого описания.
[0532] Кроме того, понятно, что каждый раскрытый в настоящем документе диапазон следует интерпретировать как раскрытие каждого конкретного значения в пределах раскрытого диапазона, который имеет такое же количество значащих цифр. Таким образом, диапазон от 1-4 следует интерпретировать как сокращенное раскрытие значений 1, 2, 3 и 4. Кроме того, следует понимать, что каждый нижний предел каждого раскрытого в настоящем документе диапазона следует интерпретировать как раскрытый в комбинации с каждым верхним пределом каждого диапазона и каждым конкретным значением в каждом раскрытом в настоящем документе диапазоне для одного и того же компонента, соединений, заместителя или параметра. Таким образом, данное раскрытие следует интерпретировать как раскрытие всех диапазонов, полученных путем комбинирования каждого нижнего предела каждого диапазона с каждым верхним пределом каждого диапазона или с каждым конкретным значением в каждом диапазоне или путем комбинирования каждого верхнего предела каждого диапазона с каждым конкретным значением в каждом диапазоне.
[0533] Кроме того, конкретные количества/значения компонента, соединения, заместителя или параметра, раскрытого в настоящем описании или примере, следует интерпретировать как раскрытие либо нижнего, либо верхнего предела диапазона и, следовательно, его можно комбинировать с любым другим нижним или верхним пределом диапазона или конкретным количеством/значением для того же самого компонента, соединения, заместителя или параметра, раскрытого в другом разделе указанной заявки, для формирования диапазона для такого компонента, соединения, заместителя или параметра.
[0534] Содержание всех документов, упомянутых в настоящем документе, полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки или, альтернативным образом, для обеспечения раскрытия, на которое они специальным образом ссылаются. Заявитель(-и) не намерен оглашать любые раскрытые варианты публике и в той мере, в какой любые раскрытые модификации или изменения не могут буквально подпадать в объем формулы изобретения, их рассматривают как часть настоящего документа в соответствии с доктриной эквивалентов.
[0535] Следует понимать, однако, что, несмотря на, что многочисленные характеристики и преимущества настоящего изобретения указаны в предшествующем описании, совместно с деталями структуры и функцией настоящего изобретения, настоящее описание носит только иллюстративный характер и можно в полной мере сделать подробные изменения, особенно в вопросах формы, размера и расположения частей в рамках принципов настоящего изобретения, обозначенных широкими общими значениями терминов, в которых выражены прилагаемые формулы изобретения.
Claims (27)
1. Способ получения условно активного белка из ДНК, которая кодирует матричный белок, обладающий активностью, где указанный условно активный белок представляет собой белок, который проявляет снижение указанной активности в анализе при значении нормального физиологического условия, которое рассматривается в пределах нормального диапазона в участке введения указанного условно активного белка субъекту, по сравнению с активностью этого условно активного белка в анализе при значении аберрантного условия в организме субъекта, которое выходит за пределы нормального диапазона этого условия, причем способ включает стадии:
i. эволюционирования ДНК, которая кодирует указанный матричный белок, обладающий указанной активностью, с применением одного или более методов эволюционирования с получением мутантных ДНК;
ii. осуществления экспрессии указанных мутантных ДНК с получением мутантных белков, по меньшей мере один из которых проявляет снижение активности в анализе при указанном значении указанного нормального физиологического условия по сравнению с активностью того же мутантного белка в анализе при указанном значении аберрантного условия, и
iii. отбора условно активного белка из указанных мутантных белков, который проявляет снижение активности в анализе при указанном значении указанного нормального физиологического условия по сравнению с активностью того же мутантного белка в анализе при указанном значении указанного аберрантного условия,
причем анализ при нормальном физиологическом условии и анализ при аберрантном условии осуществляют в растворах для анализа, содержащих по меньшей мере один компонент при по существу одинаковой концентрации в указанных растворах для анализа, и причем указанный по меньшей мере один компонент выбран из:
(a) неорганического соединения, выбранного из борной кислоты, хлорида кальция, нитрата кальция, фосфата диаммония, сульфата магния, фосфата моноаммония, сульфата калия, сульфата меди, сульфата железа, сульфата марганца, сульфата цинка, хелата кальция, хелата меди, хелата железа, хелата марганца, хелата цинка, молибдата аммония, сульфата аммония, карбоната кальция, фосфата магния, бикарбоната калия, нитрата калия, соляной кислоты, диоксида углерода, серной кислоты, фосфорной кислоты, угольной кислоты, мочевой кислоты, хлористого водорода и мочевины;
(b) иона, выбранного из иона аммония, иона железа, иона цинка, иона фосфора, серного иона, иона меди, сульфат-иона, бисульфат-иона, карбонат-иона, бикарбонат-иона, нитрат-иона, нитрит-иона, персульфат-иона, моноперсульфат-иона и борат-иона; и
(c) органической молекулы, выбранной из аминокислот, органических кислот и сахаров,
где указанные нормальное физиологическое условие и аберрантное условие представляют собой одно и то же условие, выбранное из температуры, pH, осмотического давления, осмоляльности, окислительного стресса и концентрации электролитов.
2. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один компонент представляет собой компонент, который присутствует в физиологической жидкости млекопитающего в нормальной физиологической концентрации.
3. Способ по п. 2, в котором концентрация указанного по меньшей мере одного компонента в растворе для анализа лежит в диапазоне от 5% до 500% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 10% до 400% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 30% до 300% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 50% до 200% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 75% до 150% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего.
4. Способ по п. 1, в котором указанный компонент выбран из одного или более из мочевой кислоты в диапазоне концентраций 2-7,0 мг/дл, иона кальция в диапазоне концентраций 8,2-11,6 мг/дл, хлорид-иона в диапазоне концентраций 355-381 мг/дл, иона железа в диапазоне концентраций 0,028-0,210 мг/дл, иона калия в диапазоне концентраций 12,1-25,4 мг/дл, иона натрия в диапазоне концентраций 300-330 мг/дл и угольной кислоты в диапазоне концентраций 15-30 мМ.
5. Способ по п. 1, в котором указанная органическая молекула представляет собой аминокислоту, выбранную из гистидина, аланина, изолейцина, аргинина, лейцина, аспарагина, лизина, аспарагиновой кислоты, метионина, цистеина, фенилаланина, глутаминовой кислоты, треонина, глутамина, триптофана, глицина, валина, пирролизина, пролина, селеноцистеина, серина и тирозина.
6. Способ по п. 1, в котором указанная органическая молекула представляет собой органическую кислоту, выбранную из лимонной кислоты, α-кетоглутаровой кислоты, янтарной кислоты, яблочной кислоты; фумаровой кислоты, ацетоуксусной кислоты, β-гидроксимасляной кислоты, молочной кислоты, пировиноградной кислоты, α-кетоновой кислоты, уксусной кислоты и летучих жирных кислот.
7. Способ по п. 1, в котором указанная органическая молекула представляет собой сахар, выбранный из глюкозы, пентозы, гексозы, ксилозы, рибозы, маннозы, галактозы, лактозы, GlcNAcβl-3Gal, Galαl-4Gal, Manαl-2Man, GalNAcβ1-3Gal и О-, N-, C- и S-гликозидов.
8. Способ по п. 1, в котором концентрация указанного иона лежит в диапазоне от 5 до 500% от нормальной физиологической концентрации иона в физиологической жидкости млекопитающего, или от 10% до 400% от нормальной физиологической концентрации иона в физиологической жидкости млекопитающего, или от 30% до 300% от нормальной физиологической концентрации иона в физиологической жидкости млекопитающего, или от 50% до 200% от нормальной физиологической концентрации иона в физиологической жидкости млекопитающего, или от 75% до 150% от нормальной физиологической концентрации иона в физиологической жидкости млекопитающего.
9. Способ по п. 1, в котором указанное нормальное физиологическое условие представляет собой нормальный физиологический рН и указанное аберрантное условие представляет собой рН, который отличается от нормального физиологического pH.
10. Способ по п. 9, в котором указанный по меньшей мере один компонент представляет собой ион, имеющий рКа в пределах 1 единицы рН от pH аберрантного условия, или 0,8 единицы рН от pH аберрантного условия, или 0,6 единицы рН от pH аберрантного условиях, или 0,5 единицы рН от pH аберрантного условиях, или 0,4 единицы рН от pH аберрантного условия, или 0,3 единицы рН от рН аберрантного условия, или 0,2 единицы рН от рН аберрантного условия.
11. Способ по п. 1, в котором матричный белок представляет собой белок дикого типа с желаемым свойством, фрагмент белка дикого типа с желаемым свойством, мутантный белок с желаемым свойством или фрагмент мутантного белка с желаемым свойством.
12. Способ по п. 11, в котором матричный белок представляет собой фрагмент белка дикого типа.
13. Способ по п. 11, в котором матричный белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.
14. Способ по любому из пп. 11-13, в котором указанное желаемое свойство выбрано из сродства связывания, уровня экспрессии и гуманизации.
15. Способ по любому из пп. 11-13, дополнительно включающий стадию эволюционирования указанного условно активного белка, отобранного на стадии (iii), с получением улучшенного условно активного белка с улучшением желаемого свойства.
16. Способ по п. 15, в котором улучшение желаемого свойства представляет собой повышенное отношение активности улучшенного условно активного белка в исследовании при аберрантном условии к активности условно активного белка, отобранного на стадии (iii).
17. Способ по п. 1, в котором растворы для анализа в анализе при нормальном физиологическом условии и в анализе при аберрантном условии не содержат сыворотку.
18. Способ по п. 1, в котором указанный по меньшей мере один компонент содержит компонент, выбранный из группы, состоящей из мочевины, бикарбоната калия и диоксида углерода.
19. Способ по п. 1, в котором указанный по меньшей мере один компонент содержит компонент, выбранный из 100 мкМ-100 мМ сероводорода и 25-100 мМ бикарбоната.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562120312P | 2015-02-24 | 2015-02-24 | |
US62/120,312 | 2015-02-24 | ||
US201562249907P | 2015-11-02 | 2015-11-02 | |
US62/249,907 | 2015-11-02 | ||
PCT/US2016/019242 WO2016138071A1 (en) | 2015-02-24 | 2016-02-24 | Conditionally active biological proteins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017127972A RU2017127972A (ru) | 2019-03-25 |
RU2017127972A3 RU2017127972A3 (ru) | 2019-08-09 |
RU2733658C2 true RU2733658C2 (ru) | 2020-10-06 |
Family
ID=56789902
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017127972A RU2733658C2 (ru) | 2015-02-24 | 2016-02-24 | Условно активные биологические белки |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10563194B2 (ru) |
EP (1) | EP3262217A4 (ru) |
JP (3) | JP7025214B2 (ru) |
KR (3) | KR20210096326A (ru) |
CN (1) | CN107580603A (ru) |
AU (2) | AU2016222830B2 (ru) |
CA (2) | CA2977687C (ru) |
MX (2) | MX2017010795A (ru) |
RU (1) | RU2733658C2 (ru) |
SG (2) | SG10202108814VA (ru) |
WO (1) | WO2016138071A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PE20210107A1 (es) | 2013-12-17 | 2021-01-19 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso |
RU2764074C2 (ru) | 2014-08-28 | 2022-01-13 | Байоатла, Ллк | Условно активные химерные антигенные рецепторы для модифицированных т-клеток |
RS63698B1 (sr) * | 2016-05-13 | 2022-11-30 | Bioatla Inc | Anti-ror2 antitela, fragmenti antitela, njihovi imunokonjugati i njihove upotrebe |
CN110121506A (zh) * | 2016-08-31 | 2019-08-13 | 生物蛋白有限公司 | 条件活性多肽及产生它们的方法 |
CA3042435A1 (en) | 2016-11-15 | 2018-05-24 | Genentech, Inc. | Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies |
JP2020511951A (ja) * | 2017-01-03 | 2020-04-23 | バイオアトラ、エルエルシー | 老化細胞の処置のためのタンパク質療法 |
EP3609915A1 (en) * | 2017-04-12 | 2020-02-19 | Pfizer Inc | Antibodies having conditional affinity and methods of use thereof |
EP3802596A4 (en) | 2018-06-05 | 2022-07-20 | BioAtla, Inc. | ANTI-IL-22 ANTIBODIES, ANTIBODY FRAGMENTS, THEIR IMMUNOCONJUGATES AND USES THEREOF |
SG11202012405WA (en) * | 2018-06-14 | 2021-01-28 | Bioatla Inc | Multi-specific antibody constructs |
CN111505288B (zh) * | 2020-05-15 | 2022-03-01 | 重庆医科大学 | 一种新的抑郁症生物标志物及其应用 |
CN114259460B (zh) * | 2020-09-16 | 2024-03-15 | 苏州大学 | 基于免疫佐剂的水凝胶组合物及其应用 |
WO2023069892A1 (en) * | 2021-10-19 | 2023-04-27 | Short Jay M | Conditionally active proteins for neurodegenerative diseases |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2270250C2 (ru) * | 1995-11-28 | 2006-02-20 | Зе Джонс Хопкинс Юнивесити Скул оф Медсин | Условно реплицирующийся ретровирусный вектор (варианты), способ его получения и использования (варианты), выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты |
WO2006031370A2 (en) * | 2004-08-19 | 2006-03-23 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US7527804B2 (en) * | 2001-04-27 | 2009-05-05 | Vivoxid Oy | Method for improvement of soft tissue attachment and implants making use of said method |
US20100260739A1 (en) * | 2009-03-09 | 2010-10-14 | Bioatla, Llc | Mirac Proteins |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US6054270A (en) | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
US5700637A (en) | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
US5527681A (en) | 1989-06-07 | 1996-06-18 | Affymax Technologies N.V. | Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
US5632957A (en) | 1993-11-01 | 1997-05-27 | Nanogen | Molecular biological diagnostic systems including electrodes |
JPH05236997A (ja) | 1992-02-28 | 1993-09-17 | Hitachi Ltd | ポリヌクレオチド捕捉用チップ |
US6045996A (en) | 1993-10-26 | 2000-04-04 | Affymetrix, Inc. | Hybridization assays on oligonucleotide arrays |
US5965452A (en) | 1996-07-09 | 1999-10-12 | Nanogen, Inc. | Multiplexed active biologic array |
US6468742B2 (en) | 1993-11-01 | 2002-10-22 | Nanogen, Inc. | Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip |
US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
US5830645A (en) | 1994-12-09 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
US5959098A (en) | 1996-04-17 | 1999-09-28 | Affymetrix, Inc. | Substrate preparation process |
US5856174A (en) | 1995-06-29 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Integrated nucleic acid diagnostic device |
US6022963A (en) | 1995-12-15 | 2000-02-08 | Affymetrix, Inc. | Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups |
US6013440A (en) | 1996-03-11 | 2000-01-11 | Affymetrix, Inc. | Nucleic acid affinity columns |
WO1997033899A1 (en) | 1996-03-14 | 1997-09-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Apoptosis inducing molecule i |
CA2248868A1 (en) | 1996-03-22 | 1997-09-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Apoptosis inducing molecule ii |
AU3568897A (en) | 1996-06-07 | 1998-01-05 | Eos Biotechnology, Inc. | Immobilised linear oligonucleotide arrays |
US6826296B2 (en) | 1997-07-25 | 2004-11-30 | Affymetrix, Inc. | Method and system for providing a probe array chip design database |
WO1999009217A1 (en) | 1997-08-15 | 1999-02-25 | Hyseq, Inc. | Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species |
CN100337106C (zh) | 1997-09-11 | 2007-09-12 | 生物风险公司 | 制备高密度阵列的方法 |
US6465178B2 (en) | 1997-09-30 | 2002-10-15 | Surmodics, Inc. | Target molecule attachment to surfaces |
MXPA00004256A (es) | 1997-11-03 | 2005-07-01 | Human Genome Sciences Inc | Inhibidor de las celulas endoteliales vasculares, un inhibidor de la angiogenesis y crecimiento del tumor. |
AU3463699A (en) | 1998-04-03 | 1999-10-25 | Phylos, Inc. | Addressable protein arrays |
EP1071752B1 (en) | 1998-04-21 | 2003-07-09 | Micromet AG | CD19xCD3 SPECIFIC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF |
US6048695A (en) | 1998-05-04 | 2000-04-11 | Baylor College Of Medicine | Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support |
US6277628B1 (en) | 1998-10-02 | 2001-08-21 | Incyte Genomics, Inc. | Linear microarrays |
US6277489B1 (en) | 1998-12-04 | 2001-08-21 | The Regents Of The University Of California | Support for high performance affinity chromatography and other uses |
US20090130718A1 (en) | 1999-02-04 | 2009-05-21 | Diversa Corporation | Gene site saturation mutagenesis |
US6723538B2 (en) | 1999-03-11 | 2004-04-20 | Micromet Ag | Bispecific antibody and chemokine receptor constructs |
US6221653B1 (en) | 1999-04-27 | 2001-04-24 | Agilent Technologies, Inc. | Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids |
US6653151B2 (en) | 1999-07-30 | 2003-11-25 | Large Scale Proteomics Corporation | Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement |
EP1106603A3 (en) | 1999-12-06 | 2003-11-19 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | DNA chip and reactive solid carrier |
LT2857516T (lt) | 2000-04-11 | 2017-09-11 | Genentech, Inc. | Multivalentiniai antikūnai ir jų panaudojimas |
WO2003105757A2 (en) | 2002-06-12 | 2003-12-24 | Genencor International, Inc. | Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target |
US7820166B2 (en) | 2002-10-11 | 2010-10-26 | Micromet Ag | Potent T cell modulating molecules |
NZ543202A (en) | 2003-05-31 | 2008-04-30 | Micromet Ag | Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for epcam |
AU2004242846A1 (en) | 2003-05-31 | 2004-12-09 | Micromet Ag | Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-CD3, anti-CD19 antibody constructs for the treatment of B-cell related disorders |
US7235641B2 (en) | 2003-12-22 | 2007-06-26 | Micromet Ag | Bispecific antibodies |
BRPI0507649A (pt) | 2004-02-16 | 2007-07-10 | Micromet Ag | molécula de ligação biespecìfica, seqüência de ácido nucléico, vetor, processo para a produção da molécula de ligação biespecìfica, composição, uso da molécula de ligação biespecìfica na preparação da composição farmacêutica, e kit |
US20050260711A1 (en) | 2004-03-30 | 2005-11-24 | Deepshikha Datta | Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids |
ES2616316T3 (es) | 2005-10-11 | 2017-06-12 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Composiciones que comprenden anticuerpos específicos para diferentes especies y usos de los mismos |
RU2008129080A (ru) | 2005-12-16 | 2010-01-27 | Микромет Аг (De) | Средства и способы лечения опухолевых заболеваний |
EP2527370A1 (en) | 2005-12-21 | 2012-11-28 | Amgen Research (Munich) GmbH | Compounds having resistance to soluble CEA |
JP2009521474A (ja) | 2005-12-21 | 2009-06-04 | メディミューン,エルエルシー | EphA2BiTE分子およびその使用 |
WO2008119566A2 (en) | 2007-04-03 | 2008-10-09 | Micromet Ag | Cross-species-specific bispecific binders |
US10981998B2 (en) | 2008-10-01 | 2021-04-20 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody |
PT2352763E (pt) | 2008-10-01 | 2016-06-02 | Amgen Res (Munich) Gmbh | Anticorpos biespecíficos de cadeia única com especificidade para antigénios-alvo com elevado peso molecular |
KR101695327B1 (ko) | 2008-11-07 | 2017-01-11 | 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 | 급성 림프구성 백혈병의 치료방법 |
EP2379730B1 (en) | 2008-12-31 | 2015-07-22 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of diols |
US20100189651A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-29 | Cytomx Therapeutics, Llc | Modified antibody compositions, methods of making and using thereof |
KR102302146B1 (ko) | 2009-04-30 | 2021-09-14 | 게노마티카 인코포레이티드 | 1,3-부탄다이올 생산 유기체 |
WO2011005782A2 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Brigham Young University | Method for pretreatment of cellulosic and lignocellulosic materials for conversion into bioenergy |
DK3636759T3 (da) | 2009-07-17 | 2023-10-23 | Bioatla Inc | Samtidig, integreret udvælgelse og udvikling af antistof/protein-ydelse og ekspression hos produktionsværter |
MX349622B (es) | 2010-09-08 | 2017-08-07 | Halozyme Inc | Metodos para evaluar e identificar o evolucionar proteinas terapeuticas condicionalmente activas. |
WO2012177619A2 (en) | 2011-06-22 | 2012-12-27 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for producing 1,3-butanediol and methods related thereto |
CA3186007A1 (en) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Ion concentration-dependent binding molecule library |
KR20170036142A (ko) | 2012-03-08 | 2017-03-31 | 할로자임, 아이엔씨 | 조건부 활성 항-표피 성장 인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법 |
US20140206596A1 (en) | 2013-01-18 | 2014-07-24 | University Of Southern California | Design of pH-Sensitive Oligopeptide Complexes For Drug Release Under Mildly Acidic Conditions |
-
2016
- 2016-02-24 AU AU2016222830A patent/AU2016222830B2/en active Active
- 2016-02-24 KR KR1020217024058A patent/KR20210096326A/ko not_active IP Right Cessation
- 2016-02-24 SG SG10202108814VA patent/SG10202108814VA/en unknown
- 2016-02-24 EP EP16756238.8A patent/EP3262217A4/en active Pending
- 2016-02-24 SG SG11201705988UA patent/SG11201705988UA/en unknown
- 2016-02-24 US US15/546,883 patent/US10563194B2/en active Active
- 2016-02-24 CA CA2977687A patent/CA2977687C/en active Active
- 2016-02-24 KR KR1020177023331A patent/KR102286801B1/ko active IP Right Grant
- 2016-02-24 RU RU2017127972A patent/RU2733658C2/ru active
- 2016-02-24 WO PCT/US2016/019242 patent/WO2016138071A1/en active Application Filing
- 2016-02-24 JP JP2017562970A patent/JP7025214B2/ja active Active
- 2016-02-24 MX MX2017010795A patent/MX2017010795A/es active IP Right Grant
- 2016-02-24 CN CN201680012058.5A patent/CN107580603A/zh active Pending
- 2016-02-24 KR KR1020237022948A patent/KR20230109773A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-02-24 CA CA3225013A patent/CA3225013A1/en active Pending
-
2017
- 2017-08-22 MX MX2020011052A patent/MX2020011052A/es unknown
-
2020
- 2020-01-03 US US16/733,358 patent/US11254932B2/en active Active
-
2021
- 2021-05-28 AU AU2021203506A patent/AU2021203506A1/en active Pending
- 2021-11-12 JP JP2021184506A patent/JP2022031720A/ja active Pending
-
2022
- 2022-01-11 US US17/573,389 patent/US20220127595A1/en active Pending
-
2023
- 2023-09-26 JP JP2023163210A patent/JP2023182651A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2270250C2 (ru) * | 1995-11-28 | 2006-02-20 | Зе Джонс Хопкинс Юнивесити Скул оф Медсин | Условно реплицирующийся ретровирусный вектор (варианты), способ его получения и использования (варианты), выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты |
US7527804B2 (en) * | 2001-04-27 | 2009-05-05 | Vivoxid Oy | Method for improvement of soft tissue attachment and implants making use of said method |
WO2006031370A2 (en) * | 2004-08-19 | 2006-03-23 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US20100260739A1 (en) * | 2009-03-09 | 2010-10-14 | Bioatla, Llc | Mirac Proteins |
US20140378660A1 (en) * | 2009-03-09 | 2014-12-25 | Bioatla Llc | Mirac proteins |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
PALACKAL N. et al. An evolutionary route to xylanase process fitness, Protein Sci., 2004, v. 13, p. 494-503, документ в полном объеме. * |
SCHROTER C.et al. A generic approach to engineer antibody pH-switches using combinatorial histidine scanning libraries and yeast display, 2014, v. 7, p. 138-151. * |
SOLBAK A. et al. Discovery of Pectin-degrading Enzymes and Directed Evolution of a Novel Pectate Lyase for Processing Cotton Fabric, J. of Bio.Chem., 2004, v. 280, p. 9431-9438, документ в полном объеме. * |
SOLBAK A. et al. Discovery of Pectin-degrading Enzymes and Directed Evolution of a Novel Pectate Lyase for Processing Cotton Fabric, J. of Bio.Chem., 2004, v. 280, p. 9431-9438, документ в полном объеме. PALACKAL N. et al. An evolutionary route to xylanase process fitness, Protein Sci., 2004, v. 13, p. 494-503, документ в полном объеме. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SG11201705988UA (en) | 2017-08-30 |
JP2023182651A (ja) | 2023-12-26 |
AU2016222830B2 (en) | 2021-02-25 |
US11254932B2 (en) | 2022-02-22 |
CA3225013A1 (en) | 2016-09-01 |
US20220127595A1 (en) | 2022-04-28 |
WO2016138071A1 (en) | 2016-09-01 |
JP7025214B2 (ja) | 2022-02-24 |
JP2018513206A (ja) | 2018-05-24 |
JP2022031720A (ja) | 2022-02-22 |
US20190024078A1 (en) | 2019-01-24 |
RU2017127972A (ru) | 2019-03-25 |
CA2977687C (en) | 2024-02-13 |
KR20210096326A (ko) | 2021-08-04 |
AU2016222830A1 (en) | 2017-08-10 |
KR20170117089A (ko) | 2017-10-20 |
CA2977687A1 (en) | 2016-09-01 |
KR102286801B1 (ko) | 2021-08-09 |
MX2017010795A (es) | 2018-04-11 |
RU2017127972A3 (ru) | 2019-08-09 |
CN107580603A (zh) | 2018-01-12 |
US20200199578A1 (en) | 2020-06-25 |
AU2021203506A1 (en) | 2021-06-17 |
SG10202108814VA (en) | 2021-09-29 |
MX2020011052A (es) | 2020-11-06 |
EP3262217A1 (en) | 2018-01-03 |
EP3262217A4 (en) | 2018-07-18 |
KR20230109773A (ko) | 2023-07-20 |
US10563194B2 (en) | 2020-02-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2733658C2 (ru) | Условно активные биологические белки | |
US20200216834A1 (en) | Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts | |
JP7179400B2 (ja) | 条件的活性型生物学的タンパク質 | |
JP2019528323A (ja) | 条件的活性型ポリペプチド及びそれを生成する方法 | |
JP2018534932A (ja) | 条件的活性型ポリペプチド |