CN107541536A - 一种tnfsf15可溶性蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，包括如下步骤：(1).IPTG诱导；(2).菌体裂解；(3).上柱洗脱；(4).除盐分装。本发明纯化方案通过低温诱导的方式，并且以很低的IPTG诱导浓度，降低蛋白在包涵体中的表达，提升可溶性蛋白的含量，并用较为温和的裂解纯化方式，提高蛋白的稳定性和活性。并且操作简便，制作周期短，消耗资源少，方便放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种可溶性TNFSF15蛋白的制备方法。
背景技术
血管内皮生长抑制因子(Vascular endothelial growth inhibitor,TNFSF15)，也被称为TL1A或者VEGI，是肿瘤坏死因子超家族(Tumor necrosis factor,TNF)的一员，TNFSF15是一种内源性的血管新生抑制剂，它在血管内皮细胞上大量生产并且特异性的抑制内皮细胞的增殖。TNFSF15迫使内皮细胞静止在细胞周期的G0期或者G1早期，但是它却诱导在增殖期的内皮细胞凋亡。(Yu.Circ Res.2001；89:1161-1167；Yue.J Biol Chem.1999；274:1479-1486；Zhai.Int J Cancer.1999；82:131-136.)之前的报道显示，重组的人VEGI-174蛋白可以在体内和荷瘤小鼠模型中通过靶向于新血管形成，显著的抑制肿瘤细胞生长。后续的研究显示TNFSF15可以抑制上皮细胞和多种肿瘤细胞的生长，包括人上皮癌，人组织细胞淋巴瘤U-937，人乳腺癌细胞MCF-7，小鼠结肠癌细胞MC-38，和人骨髓淋巴瘤细胞ML-1a。随后，TNFSF15对于膀胱癌细胞和前列腺癌细胞运动和粘附能力的抑制进一步证明了TNFSF15对于癌细胞的抑制能力。在临床研究中，Parr等人发现TNFSF15表达水平较低的乳腺癌病人相对于TNFSF15表达水平高的病人有更高的局部复发率，更低的生存期，和更差的预后。因此TNFSF15被认为是种最有可能通过抑制血管生成来治疗肿瘤的药物。
TNFSF15有三种剪切亚型，分别称为VEGI-174，VEGI-251，VEGI-192，其中VEGI-192也就是我们的目的蛋白，含有192个氨基酸。在体外实验中，它可以显著抑制ABAE细胞的生长和形成毛细管样结构，其抑制能力要强于内皮抑素20倍。(Chew LJ.FASEB J.2002；16:742–744；Hou W.Clin Cancer Res.2005；11:5595–5602；O’Reilly MS.Cell.1997；88:277–285.)在体内实验中，当荷瘤小鼠注射了重组人VEGI-192蛋白后，其肿瘤血管生成和肿瘤的生长受到了明显的抑制，并且没有检测到蛋白对于肝脏、肾脏、正常状态的内皮细胞和静脉的毒性。这些发现更加明确的证明了VEGI-192蛋白可以作为一种抗血管生成甚至抗肿瘤药物。
TNFSF15蛋白在水溶剂中的溶解度比较低，所以通过大肠杆菌表达TNFSF15的活性片段所得的产物大部分在包涵体中。之前的纯化方案是裂解菌体收集包涵体，溶解到盐酸胍或者尿素中变性，并且通过透析的方法复性。这种纯化方案不但需要消耗较多的资源和人力，制作周期较长，最终溶解蛋白的液体中含有比较高含量的精氨酸，重要的是无法保证最后复性得到的产物折叠回最优的构型，所以所得蛋白的活性无法保证。
发明内容
本发明的目的是提供了一种低温条件下的TNFSF15蛋白的纯化方法。
本发明采用的技术方案为：
一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(1).IPTG诱导
a)将表达菌株划线培养，挑取单克隆，扩增、转接、放大到培养基中，使细菌生长至对数生长期；
b)将菌液置于4℃静置30min；
c)静置后加入终浓度为50μM的IPTG，16℃，220rpm诱导24h；
(2).菌体裂解
a)4℃离心收集菌体；
b)每200mL菌液加25mL裂解液，用探头，超声1s，暂停1s，30％的功率冰上超声1min，共2次；
c)再加入5mL 10％Triton X-100，同样的时间间隔和功率冰上超声1min，共2次；
d)将菌液置于冰上静置30min；
e)静置后的菌液4℃离心分离获得裂解上清液；
(3).上柱洗脱
a)10倍柱体积ddH2O冲洗镍柱，5倍柱体积平衡液平衡镍柱；
b)将裂解上清液和Ni-Agarose以体积比为2:1的比例4℃100rpm充分混合2h；
c)将混合好的溶液上柱，4℃收集流出液；
d)流出液全部流出后，加入8倍柱体积的清洗液4℃洗涤杂蛋白；
e)用4倍柱体积的洗脱液4℃洗脱并收集目的蛋白；
(4).除盐分装
a)在4℃条件下用透析的方法或者除盐柱，去除产物溶液中的咪唑；
b)所得蛋白使用0.22μM滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存。
具体地，该TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(1)表达诱导
a)将表达菌株在含有氨苄抗性的LB平板上划线，在37℃下培养12h；
b)接种环挑取单克隆，在5mL含有氨苄抗性的LB培养基中37℃，220rpm在扩增12h。
c)将扩增所得菌液1:100加入到含有氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm条件下使细菌生长至对数生长期，OD值0.6～0.8；
d)将菌液置于4℃静置30min；
e)静置后加入终浓度为50μM的IPTG，16℃，220rpm诱导24h。
(2)菌体裂解
a)4℃，8000rpm离心10min收集菌体；
b)每200mL菌液加25mL裂解液，用630-0561号探头，超声1s，暂停1s，30％的功率冰上超声1min，共2次；
c)再加入5mL 10％Triton X-100，同样的时间间隔和功率冰上超声1min，共2次；
d)将菌液置于冰上静置30min；
e)静置后的菌液4℃，5000rpm离心30min分离获得裂解上清液；
(3)上柱洗脱
a)10倍柱体积ddH2O冲洗镍柱，5倍柱体积平衡液平衡镍柱；
b)将裂解上清液和Ni-Agarose以体积比为2:1的比例4℃100rpm充分混合2h；
c)将混合好的溶液上柱，4℃收集流出液；
d)流出液全部流出后，加入8倍柱体积的清洗液4℃洗涤杂蛋白；
e)用4倍柱体积的洗脱液4℃洗脱，分别收集前2体积和后2体积的洗脱液。
(4)除盐分装
a)采用以下两种方式中的一种进行除盐：
方式一：将收集到的蛋白装入透析袋，蛋白和透析液以1:100的体积比在4℃进行透析，磁子的搅拌速度为200rpm，每次透析3h，透析2次；
方式二：将收集到的蛋白与换盐液以1:1的比例混合，加入换盐柱，4℃，5000rpm离心15min。收集换盐柱上层的溶液，重复上述操作10次。
b)所得蛋白使用0.22μM滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存。
进一步，所述的步骤(1)中的表达菌株为：表达目的蛋白为VEGI-192亚型，含有192个氨基酸，采用的载体质粒为pET-21b(+)，表达感受态为BL21(DE3)，所得表达菌株为氨苄抗性。
进一步，所述的步骤(2)中的裂解液为NaCl 20mM，Tris-Cl 10mM，十二烷基肌氨酸钠50mM，pH7.9。
进一步，所述的步骤(3)中平衡液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0；清洗液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0；洗脱液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。优选地，所述平衡液、清洗液、洗脱液均在使用前预冷到4℃，所有操作过程也在4℃冰箱内进行。
进一步，所述的步骤(4)中透析液和换盐液均为PBS缓冲液，pH 8.0，预冷到4℃使用。
本发明所具有的有益效果：
本发明纯化方案通过低温诱导的方式，并且以很低的IPTG诱导浓度，降低蛋白在包涵体中的表达，提升可溶性蛋白的含量，并用较为温和的裂解纯化方式，提高蛋白的稳定性和活性。并且操作简便，制作周期短，消耗资源少，方便放大生产。
附图说明
图1是蛋白纯化各步产品和最终产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳后经过考马斯亮蓝染色结果图，其中25kD处为我们的目的蛋白TNFSF15。
图2是TNFSF15对于内皮细胞的活性检测结果，此批TNFSF15的IC50约为0.4055μg/mL。证明此纯化方案所得TNFSF15蛋白活性良好。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1
一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，包括如下步骤：
(1)表达诱导
a)将表达菌株在含有氨苄抗性的LB平板上划线，在37℃下培养12h；
b)接种环挑取单克隆，在5mL含有氨苄抗性的LB培养基中37℃，220rpm在扩增12h。
c)将扩增所得菌液1:100加入到含有氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm条件下使细菌生长至对数生长期，OD值0.6～0.8；
d)将菌液置于4℃静置30min；
e)静置后加入终浓度为50μM的IPTG，16℃，220rpm诱导24h。
(2)菌体裂解
a)4℃，8000rpm离心10min收集菌体；
b)每200mL菌液加25mL裂解液，用630-0561号探头，超声1s，暂停1s，30％的功率冰上超声1min，共2次；
c)再加入5mL 10％Triton X-100，同样的时间间隔和功率冰上超声1min，共2次；
d)将菌液置于冰上静置30min；
e)静置后的菌液4℃，5000rpm离心30min分离获得裂解上清液；
(3)上柱洗脱
a)10倍柱体积ddH2O冲洗镍柱，5倍柱体积平衡液平衡镍柱；
b)将裂解上清液和Ni-Agarose以体积比为2:1的比例4℃100rpm充分混合2h；
c)将混合好的溶液上柱，4℃收集流出液；
d)流出液全部流出后，加入8倍柱体积的清洗液4℃洗涤杂蛋白；
e)用4倍柱体积的洗脱液4℃洗脱，分别收集前2体积和后2体积的洗脱液。
(4)除盐分装
a)除盐：
将收集到的蛋白装入透析袋，蛋白和透析液以1:100的体积比在4℃进行透析，磁子的搅拌速度为200rpm，每次透析3h，透析2次；
b)所得蛋白使用0.22μM滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存。
所述步骤(1)中的表达菌株为：表达目的蛋白为VEGI-192亚型，含有192个氨基酸，采用的载体质粒为pET-21b(+)，表达感受态为BL21(DE3)，所得表达菌株为氨苄抗性。
所述步骤(2)中的裂解液为NaCl 20mM，Tris-Cl 10mM，十二烷基肌氨酸钠50mM，pH7.9。
所述步骤(3)中平衡液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0；清洗液为50mMNaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0；洗脱液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。所述平衡液、清洗液、洗脱液均在使用前预冷到4℃，所有操作过程也在4℃冰箱内进行。
所述步骤(4)中透析液和换盐液均为PBS缓冲液，pH 8.0，预冷到4℃使用。
实施例2：蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳与考马斯亮蓝染色
a)取50μL纯化样品，加入10μL 5X Loading Buffer，混匀，100℃金属浴煮10min。
b)制备分离胶浓度为12％浓度的聚丙烯酰氨凝胶，每孔上样20μL，60V电泳30min压平条带，转120V电泳1.5h。
c)将凝胶取下放入染色盒内，加入50mL考马斯亮蓝染色液，在平板摇床上低速染色5min。
d)将考马斯亮蓝染色液回收，用清水将浮色洗净后倾出废液，加入100mL脱色液，染色盒在平板摇床上300rpm脱色过夜。
e)染色好的凝胶在凝胶成像仪下拍照。结果如图1所示。
从结果可知此次产物主要为可溶性TNFSF15，图中产物1、2和产物A、B分别为同一批生产的菌体裂解后，以相同比例与两只镍柱结合所得产物。产物1和产物A均为收集前2倍于Ni-Agarose体积的洗脱液，所得产物2和产物B均为收集后2倍于Ni-Agarose体积的洗脱液所得。此次生产菌液体积800mL，菌体湿重6.53g，得到的产物经过透析，BCA试剂盒检测蛋白浓度，最后得到41.81mg TNFSF15，产量较高。
实施例3：可溶性TNFSF15活性鉴定
a)ABAE细胞在37℃，5％CO2条件下培养至接近100％融合，使多数细胞进入G0和G1早期。
b)消化，计数，在96孔板内每孔铺入103个细胞，贴壁12h。
c)加入不同浓度的可溶性TNFSF15(采用实施例1的纯化方法制得)，每个浓度梯度6个复孔，37℃，5％CO2培养72h。TNFSF15浓度如下表：
d)弃去孔板内的培养基，PBS清洗2次，每孔加入含有终浓度为0.5μg/mL MTT的无血清培养基。37℃，5％CO2孵育6h。
e)弃去含有MTT的培养基，PBS清洗2次，每孔加入150μL的DMSO。在37℃的摇床上200rpm溶解10min。
f)96孔板在酶标仪上检测其在570nm下的吸光度，制作ABAE细胞生存曲线，计算IC50，测定可溶性TNFSF15的活性。
Claims (6)
1.一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1).IPTG诱导
a)将表达菌株划线培养，挑取单克隆，扩增、转接、放大到培养基中，使细菌生长至对数生长期；
b)将菌液置于4℃静置30min；
c)静置后加入终浓度为50μM的IPTG，16℃，220rpm诱导24h；
(2).菌体裂解
a)4℃离心收集菌体；
b)每200mL菌液加25mL裂解液，用探头，超声1s，暂停1s，30％的功率冰上超声1min，共2次；
c)再加入5mL 10％Triton X-100，同样的时间间隔和功率冰上超声1min，共2次；
d)将菌液置于冰上静置30min；
e)静置后的菌液4℃离心分离获得裂解上清液；
(3).上柱洗脱
a)10倍柱体积ddH2O冲洗镍柱，5倍柱体积平衡液平衡镍柱；
b)将裂解上清液和Ni-Agarose以体积比为2:1的比例4℃100rpm充分混合2h；
c)将混合好的溶液上柱，4℃收集流出液；
d)流出液全部流出后，加入8倍柱体积的清洗液4℃洗涤杂蛋白；
e)用4倍柱体积的洗脱液4℃洗脱并收集目的蛋白；
(4).除盐分装
a)在4℃条件下用透析的方法或者除盐柱，去除产物溶液中的咪唑；
b)所得蛋白使用0.22μM滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存。
2.一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)表达诱导
a)将表达菌株在含有氨苄抗性的LB平板上划线，在37℃下培养12h；
b)接种环挑取单克隆，在5mL含有氨苄抗性的LB培养基中37℃，220rpm在扩增12h。
c)将扩增所得菌液1:100加入到含有氨苄抗性的LB培养基中，37℃，220rpm条件下使细菌生长至对数生长期，OD值0.6～0.8；
d)将菌液置于4℃静置30min；
e)静置后加入终浓度为50μM的IPTG，16℃，220rpm诱导24h；
(2)菌体裂解
a)4℃，8000rpm离心10min收集菌体；
b)每200mL菌液加25mL裂解液，用630-0561号探头，超声1s，暂停1s，30％的功率冰上超声1min，共2次；
c)再加入5mL 10％Triton X-100，同样的时间间隔和功率冰上超声1min，共2次；
d)将菌液置于冰上静置30min；
e)静置后的菌液4℃，5000rpm离心30min分离获得裂解上清液；
(3)上柱洗脱
a)10倍柱体积ddH2O冲洗镍柱，5倍柱体积平衡液平衡镍柱；
b)将裂解上清液和Ni-Agarose以体积比为2:1的比例4℃100rpm充分混合2h；
c)将混合好的溶液上柱，4℃收集流出液；
d)流出液全部流出后，加入8倍柱体积的清洗液4℃洗涤杂蛋白；
e)用4倍柱体积的洗脱液4℃洗脱，分别收集前2体积和后2体积的洗脱液；
(4)除盐分装
a)采用以下两种方式中的一种进行除盐：
方式一：将收集到的蛋白装入透析袋，蛋白和透析液以1:100的体积比在4℃进行透析，磁子的搅拌速度为200rpm，每次透析3h，透析2次；
方式二：将收集到的蛋白与换盐液以1:1的比例混合，加入换盐柱，4℃，5000rpm离心15min，收集换盐柱上层的溶液，重复上述操作10次；
b)所得蛋白使用0.22μM滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存。
3.根据权利要求1或2所述一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的表达菌株为：表达目的蛋白为VEGI-192亚型，含有192个氨基酸，采用的载体质粒为pET-21b(+)，表达感受态为BL21(DE3)，所得表达菌株为氨苄抗性。
4.根据权利要求1或2所述一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的裂解液为NaCl 20mM，Tris-Cl 10mM，十二烷基肌氨酸钠50mM，pH7.9。
5.根据权利要求1或2所述一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(3)中平衡液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0；清洗液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0；洗脱液为50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0。优选地，所述平衡液、清洗液、洗脱液均在使用前预冷到4℃，所有操作过程也在4℃冰箱内进行。
6.根据权利要求1或2所述一种TNFSF15可溶性蛋白的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(4)中透析液和换盐液均为PBS缓冲液，pH 8.0，预冷到4℃使用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180105 |