CN105503833B

CN105503833B - 吲哚哌嗪-二酮，其制备及治疗作用

Info

Publication number: CN105503833B
Application number: CN201410562336.7A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 王枫
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-10-20
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2034-10-20
Also published as: CN105503833A

Abstract

本发明公开了下式所示的u‑PA抑制剂(3R，6R)‑3‑(4‑丁氨基)‑6‑(吲哚‑3‑乙基)‑哌嗪‑2，5‑二酮。本发明进一步公开了它的制备方法和用途。本发明的化合物除具有优秀的抑制肿瘤细胞侵袭、迁移和抗肿瘤转移作用外，还具有抗肿瘤和抗炎作用。

Description

吲哚哌嗪-二酮，其制备及治疗作用

技术领域

本发明涉及了u-PA抑制剂(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮，涉及它的制备方法和作为u-PA抑制剂在抑制肿瘤侵袭和迁移、抗肿瘤和抗炎方面的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

纤溶酶原激活系统由纤溶酶原激活剂(PAs)、纤溶酶原激活抑制剂(PAIs)和细胞外纤溶酶原激活剂受体(PAR)组成。纤溶酶原激活系统涉及到细胞迁移、血管生成、伤口愈合、胚胎发育、肿瘤细胞扩散和转移等一系列过程。在哺乳动物体内主要有两种纤溶酶原激活剂：组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)。

尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)是从人尿或肾细胞组织培养液中提取的一种丝氨酸蛋白酶，属双链尿激酶型纤溶酶原活化剂(tcu-PA)，其分子量为55000或33000，是外源性纤维溶解系统的激活剂。u-PA可以直接裂解纤溶酶原的精氨酸(560)-缬氨酸(561)肽键，使无活性的单链纤溶酶原转变为有活性的双链纤溶酶。

在肿瘤组织中，u-PA激活纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶直接或间接的造成细胞外基质降解，进一步导致肿瘤细胞的浸润、转移和血管生成，促进肿瘤的增殖。

在炎症应答过程中，u-PA通过与炎症细胞表面的u-PAR结合，参与调节炎症细胞对血管和组织的渗透能力，促进炎症细胞向炎症部位迁移，促进炎症反应以及炎症因子的释放，而炎症因子的释放又会诱导u-PA表达上升。

由于u-PA的酶活性贯穿在肿瘤-纤溶-炎症复杂的交叉联系中,所以影响u-PA的活性会影响复杂的交叉联系。也就是说,发明优秀活性的u-PA抑制剂对于抑制u-PA在肿瘤-血栓-炎症交叉联系有重要意义。这种意义体现在70％以上癌症病人死于癌转移；有大约10％的癌症晚期病人出现出血症状,例如出现几乎无法预测鼻,咽,肺或胃肠道大出血；摘除肿瘤手术发生的出血,也恶化病人的预后。针对这种状况,本发明提出了(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮,其制备及治疗作用。

此前，发明人曾报道下面结构的二酮哌嗪包括CIPPC是u-PA抑制剂(结构见图1)，有优秀的止血活性。1nmol/kg剂量下，CIPPC能显著降低小鼠鼠尾出血时间[33,34]。不幸的是，在10nmol/kg剂量下CIPPC能促进血栓生成。血栓是肿瘤本人重要的并合症，是造成肿瘤本人死亡的重要因素。CIPPC能促进血栓生成的作用为肿瘤病人带来了新的威胁。对比之下，(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮的意想不到的优势是，除了与CIPPC一样有优秀的止血活性外，还有抑制肿瘤细胞浸润和转移，抑制肿瘤本人并发炎症作用，同时不会引起血栓形成。

发明内容

本发明的第一个内容是提供结构式4代表的u-PA抑制剂；

本发明的第二个内容是提供结构式4代表的u-PA抑制剂的制备方法，该方法包括：

(1)在DCC和HOBt存在下D-Trp-OBzl在无水四氢呋喃中与D-Boc-Lys(Z)缩合为D-Boc-Lys(Z)-D-Trp-OBzl；

(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中D-Boc-Lys(Z)-D-Trp-OBzl脱去Boc生成D-Lys(Z)-D-Trp-OBzl；

(3)在乙酸乙酯和5％NaHCO₃存在下D-Lys(Z)-D-Trp-OBzl生成(3R,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮；

(4)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中(3R,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮脱去苄基生成(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮。

本发明的第三个内容是评价结构式4代表的u-PA抑制剂在抑制肿瘤细胞侵袭、转移和抗肿瘤转移方面，以及在制作抗肿瘤和抗炎药物方面的作用。

附图说明

图1.合成路线1.i)DCC,HOBt,NMM,THF；ii)HCl/EA(4N)；iii)EA,TEA,80℃；iv)CH₃OH,Pd/C,H₂。

图2.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮体外对UK激活纤溶酶原活力的影响。其中：1为单组分的人纤溶酶原(PLG)；2为UK与PLG的共孵育组分；3为200μg(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮、UK与PLG的共孵育组分；4为100μg(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮、UK与PLG的共孵育组分；5为50μg(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮、UK与PLG的共孵育组分；6为500μg的EACA、UK与PLG的共孵育组分；7为250μg的EACA、UK与PLG的共孵育组分。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备D-Boc-Lys(Z)-D-Trp-OBzl (1)

将1.9g(5.0mmol)D-Boc-Lys(Z)混悬于20mL无水四氢呋喃，室温搅拌下向溶液中加入0.675g(5.0mmol)HOBt，冰浴搅拌下加入1.133g(5.5mmol)DCC，得到反应液I，冰浴下搅拌30分钟。将1.47g(5.0mmol)D-Trp-OBzl混悬于20mL无水四氢呋喃中，然后逐渐加入NMM，调节pH至8-9，得到反应液II。将反应液II加入反应液I中，先在冰浴下搅拌1h，再在室温搅拌，TLC监测至原料点消失。后处理：减压过滤除去DCU，将滤液减压浓缩除去四氢呋喃，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，将得到的溶液置于250mL分液漏斗中，依次用5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液各洗3次，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥30min，减压过滤，滤液减压浓缩至干，得到的黄色泡状物，经硅胶柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝100:1～20:1)，得到2.919g(89％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):657[M+H]⁺。

实施例2制备D-Lys(Z)-D-Trp-OBzl (2)

将纯品2.62g(4.0mmol)D-Boc-Lys(Z)-D-Trp-OBzl(1)置于50mg茄瓶中，冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加30mL 4N氯化氢-乙酸乙酯溶液，加干燥管，冰浴搅拌下反应4小时后TLC监测原料点消失，终止反应。后处理：搅拌下用水泵将反应液减压抽干，加乙酸乙酯溶解后再次用水泵减压抽干，重复三次；加无水乙醚充分混悬后静置，倾倒出乙醚，抽干产物，重复三次，得2.046g(93％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):557[M+H]⁺。

实施例3制备(3R,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(3)

将1.83g(3.29mmol)化合物D-Lys(Z)-D-Trp-OBzl(2)以80mL乙酸乙酯溶解,用三乙胺调pH至9,油浴80℃反应6小时,TLC显示原料点基本消失。后处理:将反应液直接用硅胶拌样,硅胶柱层析纯化(CH₂Cl₂:CH₃OH＝100:1-20:1),得到1.3g(88.3％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):449[M+H]⁺.¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.89(s,1H),8.03(s,1H),7.85(s,1H),7.56(d,J＝9.0Hz,1H),7.35(m,6H),7.19(t,J＝6.0Hz,1H),7.05(m,2H),6.95(t,J＝6.0Hz,1H),4.99(s,2H),4.07(s,1H),3.25(dd,J＝3.0Hz,J＝15.0Hz,1H),3.09(dd,J＝3.0Hz,J＝15.0Hz,1H),2.99(s,1H),2.91(q,J＝6.0Hz,2H),1.48(m,2H),1.24(m,2H),1.16(m,2H)。

实施例4制备(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮 (4)

将0.112g(0.25mmol)化合物(3R,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(3)置于50mL反应瓶中，加入10mL甲醇溶解，向溶液中加入20mg Pd/C，通入H₂，室温搅拌反应48小时，TLC显示原料的基本消失，滤去Pd/C，减压浓缩得51mg(65％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):315[M+H]⁺.Mp 188-189℃. (c＝0.29,CH₃OH).¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝10.93(s,1H),8.04(s,1H),7.94(s,1H),7.57(d,J＝9.0Hz,1H),7.30(d,J＝9.0Hz,1H),7.02(t,J＝6.0Hz,2H),6.92(t,J＝6.0Hz,1H),4.11(s,1H),3.50(s,1H),3.38(dd,J＝6.0Hz,J＝15.0Hz,1H),3.00(dd,J＝6.0Hz,J＝15.0Hz,1H),2.23(m,2H),1.01(m,3H),0.59(m,3H).¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝167.48,167.40,136.37,128.35,125.08,121.10,119.45,118.71,111.58,109.01,55.86,54.44,33.64,32.56,29.27,21.19.Elem.Anal:C₁₇H₂₂N₄O₂.C,64.95；H,7.05；N,17.82。

实验例1 SDS-PAGE凝胶电泳分析(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对UK激活纤溶酶原活性的影响

1)主要试剂和仪器

试剂：SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂及氨基己酸(EACA)均为市售试剂；

人纤溶酶原(PLG)和尿激酶(UK)购自Sigma公司。

仪器：垂直电泳槽Mini-PROREN Tetra System(BIO-RAD)；

电泳仪Power Pac(BIO-RAD)；

扫描仪Scanmaker 8700(MICROTEK)。

2)溶液的准备

PLG溶液的配制：称取PLG 5mg，置于15mL离心管中，加入1mL生理盐水溶解即得PLG溶液，浓度为5mg/mL；分装，每管0.1mL，-20℃保存待用；

UK溶液的配制：将整瓶UK(100,000U)以10mL生理盐水溶解，得母液；取0.1mL母液以生理盐水稀释至2.5mL，得UK溶液，浓度为400U/mL；分装，每管0.1mL，-20℃保存待用；

EACA溶液的配制：称取50mg化合物，以1mL生理盐水溶解，即得母液1，浓度为50mg/mL；取0.5mL母液1，以生理盐水稀释至1mL，得溶液2，浓度为25mg/mL；

化合物4溶液的配制：称取5mg化合物4，以1mL生理盐水溶解，浓度为5mg/mL；-20℃保存待用。

3)样品的准备

取5μL UK溶液，置于0.5mL离心管中，再向其中分别加入10μL生理盐水或待测化合物溶液，37℃孵育15分钟；再向各离心管中分别加入5μL PLG溶液，37℃孵育15分钟；孵育结束后，再向各离心管中分别加入5μL 5×SDS电泳上样缓冲液，混匀后将各离心管于100℃水浴中变性5分钟，快速冰浴冷却后以12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离。

4)SDS-PAGE凝胶电泳

试剂准备：

30％储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g，混匀后加超纯水(up-H₂O)，37℃溶解，定容至100mL，棕色瓶存于室温；

1.5 M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加up-H₂O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL；

1 M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加up-H₂O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL；

12％SDS：电泳级SDS 12.0g加up-H₂O于68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至100mL；

10％过硫酸铵(AP)：100mg AP加up-H₂O 1mL；

考马斯亮兰染色液：甲醇-水-醋酸＝45mL+45mL+10mL，加入100mg考马斯亮蓝固体，配制成染色液；

脱色液：甲醇-水-醋酸＝10mL+90mL+10mL，配制成脱色液。

操作步骤：

采用垂直式电泳槽装置

(一)聚丙烯酰胺凝胶的配制

1.分离胶(12％)的配制：

超纯水4.0mL

30％储备胶溶液3.3mL

1.5M Tris-HCl 2.5mL

12％SDS 0.1mL

10％AP 0.1mL

取1mL上述混合液，加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL封底，余加TEMED4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平，凝胶完全聚合需大约60min.

2.浓缩胶(4％)的配制：

超纯水1.4mL

30％储备胶溶液0.33mL

1M Tris-HCl 0.25mL

12％SDS 0.02mL

10％AP 0.02mL

TEMED 2μL

将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需大约30min。

(二)样品处理：将样品加入相应量的5×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min使蛋白变性，取出，快速降温。

(三)上样：将处理后的样品加入样品池中，并加入20μL蛋白分子量标准品作对照。

(四)电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压80V，30min，分离胶电压100V至电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需1.5h)。

(五)染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，于摇床(60RPM)室温10min。

(六)脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，于摇床(60RPM)室温脱色过夜。

(七)将脱色后的胶用扫描仪扫描，观察结果。

5)评价结果见图2。

实验例2 Transwell小室实验评价(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对HCCLM3细胞侵袭能力的影响

1)受试样品

(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成50μM浓度；

RGDS用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

2)细胞株

HCCLM3(高转移人肝癌细胞)，购自ATCC。

3)主要仪器及耗材

超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

细胞孵育箱：INC153，memmer公司；

显微镜：Zeiss公司；

8.0μm孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm²培养瓶：Corning Costar公司。

4)主要试剂

DMEM培养基干粉：Gibco公司；

PBS缓冲液：每1L溶液中含有NaCl 8.2g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·H₂O 1.56g、KH₂PO₄0.2g，PH值7.4；

胎牛血清：Hyclone公司；

0.25％胰酶溶液：Hyclone公司；

青霉素、链霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

DMSO(二甲基亚砜)：Hyclone公司；

Matrigel(基质胶)：BD公司；

结晶紫染液：碧云天公司。

5)评价方法

包被基质胶：将冻存于-20℃冰箱的matrigel 4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μL Matrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个；放入37℃、5％CO₂培养箱中，孵育5h；

水化基底膜：吸除小室中残留液体，每孔加入50μL的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min；

接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL；每孔加入100μL细胞悬液，同时加入药物25μL，使化合物终浓度为10μM，RGDS终浓度为20μM；下室加入600μL的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时；

结晶紫染色：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色30min，吸除染色液，用PBS洗3次；

计数：在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数；实验数据统计采用t检验，细胞数以(个)表示。

6)评价结果

表1.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)对HCCLM3细胞侵袭能力的影响^a

a)n＝3；b)与NS组比,p<0.05。

实验例3 Transwell小室实验评价(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对HCCLM3细胞迁移能力的影响

1)受试样品

RGDS用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

2)细胞株

HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)主要仪器及耗材

超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

细胞孵育箱：INC153，memmer公司；

显微镜：Zeiss公司；

4)主要试剂

DMEM培养基干粉：Gibco公司；

胎牛血清：Hyclone公司；

0.25％胰酶溶液：Hyclone公司；

青霉素、链霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

DMSO(二甲基亚砜)：Hyclone公司；

结晶紫染液：碧云天公司。

5)评价方法

接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL；每孔加入100μL细胞悬液，同时加入药物25μL，使化合物终浓度为10μM，RGDS终浓度为20μM；下室加入600μL的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养6小时；

6)评价结果

表2.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)对HCCLM3细胞迁移能力的影响^a

a)n＝3；b)与NS组比,p<0.05。

实验例4(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)体内抗肿瘤转移评价

1)实验材料

受试化合物：(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)；

阴性对照为生理盐水；

实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重18-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；每10只小鼠一组，空白和阳性对照各一组；

溶剂：生理盐水。

2)药物配制

按量称取化合物4，加入生理盐水至所需浓度即可。

3)给药剂量及给药方式

给药剂量：(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)为5μmol/kg；按照小鼠体重，每10g给0.1mL药液或者生理盐水；口服给药。

4)小鼠Lewis肺癌模型的建立

Lewis小鼠肺癌细胞(LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养基，其中含10％经灭活的胎牛血清、1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次，富集细胞。

待细胞生长状态良好、处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至1×10⁷个/mL，胎盘蓝(Tryanblue)染色计数，活细胞数>95％。取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液0.2mL/只。小鼠接种后10天可以长出直径约4-5mm的肿瘤，作为瘤源备用。

5)Lewis肺癌转移模型的建立

取接种8-10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，脱颈椎处死，用75％的乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的肿瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g)：生理盐水体积(mL)为1:3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目细胞筛制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1×10⁷个/mL，胎盘蓝(Tryanblue)染色计数，活细胞数>95％。

取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75％的乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL。接种后10天可以长出直径约4-5mm的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积随机分组。

从接种肿瘤第11天开始给药，共给药11次，每隔两天测量并记录肿瘤体积。第22天测量瘤体积后，脱颈椎处死，取出肿瘤称重，并记录肿瘤的肺部转移率和转移瘤结数。

6)统计方法

本实验数据统计采用t检验。

7)评价结果

表3.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)对小鼠肿瘤体积增长的影响^a

a)n＝10；b)与生理盐水组比较，p<0.05.肿瘤体积计算公式：体积(mm³)＝1/2长×宽×宽。

表4.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)对小鼠瘤重的影响

n＝10；a)与生理盐水组比较，p<0.01。

表5.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)对小鼠肿瘤肺转移的影响

a)n＝10；b)与生理盐水组比较，p<0.01。

实验例5 S180体内抗肿瘤活性评价

1)实验材料

阳性对照为阿霉素(Dox)；阴性对照为生理盐水；

实验动物：ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，每12只小鼠一组，空白和阳性对照各一组；

瘤源：小鼠S180肉瘤，由北京大学医学部动物实验中心提供，自行传代维持。

溶剂：生理盐水。

2)药物配制

按量称取(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)，依次加入生理盐水至所需浓度即可；阿霉素为生理盐水溶液。

3)给药剂量及给药设置

(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)以口服给药方式，按5μmol/kg的给药剂量，0.2mL/20g，连续给药7天，共给药7次；

阴性对照生理盐水以等体积的相应溶液，口服给药，0.2mL/20g，连续给药7天，共给药7次；

阳性对照阿霉素以腹腔注射给药方式，按2μmol/kg的给药剂量，0.2mL/20g，连续给药7天，共给药7次。

4)动物模型的建立

采用体内抗肿瘤腋皮下接种模型：无菌条件下抽取接种生长旺盛的s180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种0.2mL/只，造成实体瘤动物模型。5)实体瘤抑瘤率的测定

实验进行至第8天，称小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％

6)统计方法

本实验数据统计采用t检验，瘤重以(g)表示。

7)评价结果

表6.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)的抗肿瘤活性

a)n＝12；b)与生理盐水组比，p<0.01。

实验例6(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)对二甲苯诱导小鼠耳肿胀抑制活性评价

1)实验材料

阳性对照为阿司匹林，阴性对照为生理盐水；

实验动物：ICR雄性小鼠(清洁级)，体重18-22g，由北京维通利华实验

物技术有限公司提供。每10只小鼠一组，空白和阳性对照各一组。

2)药物配制

按量称取化合物4，依次加入生理盐水至所需浓度即可；阿司匹林为生理盐水溶液。

3)给药剂量及给药方式

给药剂量：阿司匹林为1.11mmol/kg；(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)为0.05μmol/kg；按照小鼠体重，每10g给0.1mL药液或者生理盐水；口服给药。

4)动物模型的建立

ICR雄性小鼠30只，体重18-22g，随机分为(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)组、阿司匹林组和空白对照组，每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后，在小鼠左耳朵耳廓内侧均匀涂抹30μL二甲苯，2小时后颈椎脱臼处死小鼠，分别将左、右两耳外耳廓剪下并重合叠放在一起，用直径7mm的打孔器在同一位置打取圆形耳片，称重，记录并计算两耳重量差；鼠耳肿胀度＝左耳片重-右耳片重。

5)统计方法

本实验数据统计采用t检验，鼠耳肿胀度以(mg)表示。

6)评价结果

表7.(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)对ICR小鼠耳肿胀度的影响

n＝10；b)a)与生理盐水组比,p<0.01。

Claims

1.下式所示的u-PA抑制剂(3R,6R)-3-(4-氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮

2.制备权利要求1的u-PA抑制剂(3R,6R)-3-(4-氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮的方法，该方法由以下步骤构成：

(3)在乙酸乙酯和5％NaHCO₃存在下D-Lys(Z)-D-Trp-OBzl生成(3R,6R)-3-(4-苄氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮；

(4)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中(3R,6R)-3-(4-苄氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮脱去苄基生成(3R,6R)-3-(4-氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮。

3.权利要求1的u-PA抑制剂(3R,6R)-3-(4-氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮在制备抗肿瘤转移和侵润抑制药物中的应用。

4.权利要求1的u-PA抑制剂(3R,6R)-3-(4-氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮在制备抗肿瘤剂中的应用。

5.权利要求1的u-PA抑制剂(3R,6R)-3-(4-氨基丁基)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)哌嗪-2,5-二酮在制备抗炎剂中的应用。