CN102711788B - 使用组织特异性模拟肽配体的靶向递送 - Google Patents

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Abstract

在本文中公开了通过使用组织特异性模拟肽配体，将治疗剂进行组织特异性递送的组合物和方法。所述的配体包含式A-骨架-A’的组合物以及一种或多种共价地连接到所述骨架的疏水锚。连接到所述骨架的A和A’化合物包括单价的模拟肽化合物，其中各个单价的模拟肽化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉。

Description

使用组织特异性模拟肽配体的靶向递送
发明技术领域
本发明总地涉及疾病治疗和诊断领域，并且更具体地涉及用于将药剂递送到特异性靶组织的新组合物和方法的开发。
背景技术
在不限制本发明的范围的前提下，将其背景结合向特异性靶组织递送进行描述。
用于癌症治疗的经静脉注射疗法被认为是最终的疗法，由于所有的肿瘤及其转移瘤是由血管维持的。这些肿瘤血管床是足够渗漏的，从而使脂质体能直接达到肿瘤细胞。可以使用递送到肿瘤脉管系统的抗血管生成药物或者基因疗法来阻止向肿瘤的血液供应，从而引起肿瘤消退。
靶向递送对于最高的疗效和降低的毒性而言是必要的。在多数脂质体递送系统广泛的治疗应用中，主要的限制在于其体内转染效率低，在经静脉递送之后在肺中的累积，聚集，全身性递送之后的清除(例如被Kupffer细胞)，不能将所注射的脂质体复合物的大部分递送到靶细胞和器官以及其他组织。缺少用于有效靶向的已知细胞表面受体使得用于癌症治疗的靶向递送更加复杂。
发明内容
本发明包括用于治疗剂的组织特异性靶向递送的靶向配体。所述的配体包含组合物，该组合物具有式A-骨架-A’和一种或多种共价连接到骨架上的疏水锚。连接到所述骨架上的所述A和A’化合物包括单价模拟肽(peptidomimetic)化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉(morpholino)。化合物A和A’可以是相同的。所述的骨架可以包含反应性二氯三嗪基团。在一个实施方案中，一个或多个所述的疏水锚包含烃部分。在一个实例中，所述的烃部分可以是十八烷基基团。所述的靶向配体还可以包含一个或多个接头，所述的接头是可切割的或者不可切割的，所述的接头官能上(functionally)插入到骨架和疏水锚之间。
本发明还提供了合成用于靶向递送治疗剂的小分子复合物的方法。所述的方法包括将两个或多个单价模拟肽化合物共价地偶联到骨架，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；并且将一个或多个疏水锚偶联到该骨架。A和A’化合物可以是相同的。所述的骨架可以包含反应性二氯三嗪基团。在一个实施方案中，一个或多个所述的疏水锚包含烃部分。在一个实例中，所述的烃部分可以是十八烷基基团。所述的靶向配体还可以包含一个或多个接头，所述的接头是可切割的或者不可切割的，所述的接头官能上插入到骨架和疏水锚之间。
本发明还包括配体官能化的递送系统，所述的递送系统包含治疗剂载体，以及用于将治疗剂的组织特异性靶向递送的靶向配体。在一个实施方案中，所述的治疗剂载体是脂质体。在一个实例中，所述的靶向配体非共价地通过一个或多个疏水锚，锚定在阳离子型脂质体的外部脂双层的外表面上，所述的阳离子型脂质体具有内部脂双层和外部脂双层。
本发明的另一个实施方案包括将有效负载(payload)递送到靶组织的方法。该方法包括步骤：合成用于将治疗剂的组织特异性靶向递送的靶向配体；将该靶向配体引入到包裹了治疗剂的脂双层中，所述的脂双层如细胞膜或者亚细胞的膜，或者多层或两层囊泡，或者更具体地为双室泡；将所述的脂质体使用靶向配体进行覆盖；将此靶向脂质体复合物与可逆掩蔽试剂(reverse masking reagent)组合；并且将治疗有效量的该经掩蔽的靶向脂质体复合物给予患者。在一个实施方案中，所述的脂质体可以是两层内陷的囊泡(bilamellar invaginated vesicle，“BIV”)。具有约500Da或者更低的分子量的小的中性脂质可以用作可逆掩蔽试剂。所述的靶组织可以包括人胰腺癌、人乳腺癌、人非小细胞肺癌、人非小细胞肺癌血管内皮、黑色素瘤或者人胰腺癌血管内皮。靶向配体的实例包括以下化合物中的至少一种，所述化合物为KB995、KB1001、KB1003、KB1005、KB1012、KB1023、KB1029、KB1035、KB1036、KB1039、KB1042、KB1051、KB1061、KB1062、KB1063、KB1064、KB1066、KB1067、KB1096、KB1107、KB1108或者KB1109。在一个方面，所述的靶组织是黑色素瘤，并且所述靶向配体是化合物KB1037、KB1109和KB1123的至少一种。
在另一个实施方案中，本发明包括分离用于结合靶组织的模拟肽化合物的方法，所述的方法包括步骤：制备具有式：A-骨架-A’的组合物，其中A和A’包括单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；并且一种或多种疏水锚共价地连接到骨架上；将靶组织与模拟肽化合物接触；分离与靶组织特异性地结合的模拟肽化合物；并且表征特异性地连接到靶组织的组合物的式。所述的靶组织可以包括人胰腺癌、人乳腺癌、人非小细胞肺癌、人非小细胞肺癌血管内皮、人黑色素瘤或者人胰腺癌血管内皮。在一个方面，该方法包括用于在解离后直接筛选患者细胞的高通量检测。在一个方面，所述的模拟肽化合物文库使用例如铕或者铽穴合物代替疏水尾部来进行标记。使用时间分辨荧光分析直接进行筛选经解离的患者细胞以及肿瘤对正常。
在一个实施方案中，本发明包括筛选结合到靶组织或细胞的模拟肽化合物的方法，所述的方法包括步骤：制备具有式：A-骨架-A’的组合物的模拟肽文库，其中A和A’包括模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；将一种或多种脂双层锚共价连接到所述的模拟肽化合物上；将该模拟肽化合物与脂质混合以形成脂质体；将靶组织与模拟肽化合物接触；分离特异性结合到靶组织的模拟肽化合物；并且表征特异性结合到靶组织的组合物的式。
再另一个实施方案是筛选结合到靶组织或细胞的模拟肽化合物的方法，所述的方法包括步骤：制备组合物的模拟肽文库，所述的组合物具有式：A-骨架-A’，其中A和A’包括模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；将一种或多种脂双层锚共价连接到所述的模拟肽化合物上；将该模拟肽化合物与脂质混合形成脂质体，其中所述的脂质体还包含用于递送到细胞的核酸；将靶组织与模拟肽化合物接触；将特异性结合到靶组织的模拟肽化合物分离；并且表征特异性结合到靶组织的组合物的式。在一个方面，所述的靶组织进一步定义为组织培养物中的细胞。在另一个方面，所述的靶组织进一步定义为组织培养物中的细胞，并且所述的细胞是根据核酸对细胞的影响进行选择的。在再另一个方面，所述的靶组织进一步定义为组织培养物中的细胞，其中所述的核酸是用于阴性或阳性选择的选择性标记物，其表达用于阳性或阴性选择的选择性标记物，或者表达可检测的标记物。
附图说明
为了更完全地理解本发明的特征和优点，在此参考本发明的详述以及所附的图，并且其中：
图1是识别化合物的一般方案(general scheme)的图；
图2显示了通过哌啶与取代的荧光素的选择性反应制备二聚体；
图3显示了靶向策略的优化，经优化的靶向策略用于将90％以上的经静脉注射的BIV复合物专一地递送到靶细胞中；
图4显示了本发明的多种化合物的结构，一般结构在顶部显示，具体结构从左到右列出，分别为KB991-KB1005；
图5总结了本发明的结合部分的组合(A和/或A’)；
图6显示了本发明的结构的一个实例，一般结构在顶部显示，具体结构从左到右列出，分别为KB991-KB1005；
图7a到7d显示了在本发明的结合部分的部分优化(A＝Frag.A和/或A’＝Frag.B)；
图8是显示了所列出的化合物针对MCF7细胞的转染效率的图；
图9是显示了所列出的化合物针对A549细胞的转染效率的图；
图10是显示了所列出的化合物针对MCF10A细胞的转染效率的图；
图11是显示了使用经覆盖的脂质体递送系统中所列出的化合物，在Panc1细胞中相对荧光素酶表达的图；
图12是显示了使用经覆盖的脂质体递送系统中所列出的化合物，在Mia PaCa2细胞中相对荧光素酶表达的图；
图13是显示了使用经覆盖的脂质体递送系统中所列出的化合物，在HPDE细胞中相对荧光素酶表达的图；
图14是显示了使用所列出的化合物，在HUVEC和HI299细胞的共培养物中转染增强；
图15是显示了单独使用所列出的化合物，在HI299细胞的培养物中转染结果的图，未注意到增强；
图16是显示了使用所列出的化合物，在HUVEC细胞的培养物中转染增强的图，未注意到增强；
图17显示了使用所列出的化合物，在HUVEC和PANC1细胞的共培养物中转染增强；
图18是显示了单独使用所列出的化合物，在PANC1细胞的培养物中转染结果的图，未注意到增强；
图19是显示了单独使用所列出的化合物，在HUVEC细胞的培养物中转染结果的图，未注意到增强；
图20a到20c，在共培养后，内皮CD31+表达的增加。在对细胞计数后，我们以30∶1HUVEC∶H1299的点板比建立了共培养物。使用结合藻红蛋白的抗-CD31Ab将内皮细胞染色，并且在接种后使用流式细胞术每天测量内皮细胞的数量(由R3进行分选)。大多数的内皮细胞表达低水平的CD31(由R4进行分选)。少数的内皮细胞表达高水平的CD31(由R2进行分选)。在共培养后8天，所述共培养的内皮细胞群与HUVEC对照相比，CD31表达显著提高(c)。在共培养物中9天后，与HUVEC对照(a，c)相比，共培养中(b，c)CD31表达的提高更多。*P＝0.026。
图21a和21b。在共培养后内皮VEGF-A表达的提高。以10∶1HUVEC∶PANC1的点板比建立共培养物，并在双室transwell盘中培养8天。收获内皮细胞并使用实时RT-PCR和蛋白质印迹法测量VEGF-A的表达。与HUVEC相比，在共培养之后，内皮VEGF-A的表达在转录(a)和翻译(b)的水平上上升了。*P＜0.01，N＝6。
图22a到22f。在共培养后管存活的延长。以10∶1HUVEC∶PANC1的点板比在transwell盘中共培养后8天，收获内皮细胞并且接种到Matrigel上。16小时之后，HUVEC对照(a)和共培养的内皮细胞(b)都形成类似毛细血管的管状结构。这些结构在48小时之后开始降解。到72小时为止，HUVEC对照的管状结构几乎完全降解(c)。然而在共培养物中，有显著量的管状结构存活(d)。这些结构保持了优秀的管状网络并且又存活了11天(e，f)。
图23a和23b。二价小分子结构和文库筛选。二价小分子的一般结构(23a)包括两个用于与细胞表面受体相互作用的β-转角模拟物，用于插入到BIV脂质体复合物的烃尾部，以及接头。还显示了我们“命中”的分子，KB1023的结构。使用高通量的荧光素酶检测(23b)来筛选肿瘤内皮细胞特异性靶向配体。在共培养后7天，收获细胞并且按2×104个细胞/孔接种到96孔板中。在同一天，制备了BIV-荧光素酶DNA∶脂质体复合物，随后将化合物在多个化合物∶DNA的比率下进行覆盖。将经覆盖的复合物在室温下温育过夜。次日将细胞使用含有0.52μL经覆盖的复合物的50μL无血清培养基进行转染。通过将转染培养基更换为含血清的细胞培养基终止转染。在转染之后24小时，将细胞裂解，并且将该细胞裂解液按20μL/孔加载到96孔板上用于荧光素酶分析，所述荧光素酶分析使用Luminoskan板读数仪进行。
图24是本发明方法的流程图。
图25a到25h。靶向胰腺和肺肿瘤内皮细胞的配体。化合物KB1023提高了PANC1+HUVEC共培养物(a)，而非PANC1细胞(b)或HUVEC(c)的转染效率。共培养物中对内皮细胞间隙(endothelium compartment)的靶向(d)使用双室的transwell培养系统证实。KB1023也提高了与AsPC1细胞共培养后的内皮细胞的转染效率(e)。KB1061提高了H1299和HUVEC(f)的共培养物中的转染效率，而非H1299细胞(g)或者HUVECs(h)的转染效率。将荧光素酶基因的表达与未经覆盖的脂质体复合物进行了比较。*P＜0.05。
图26a到26c。体内靶向和优化。在经静脉注射后24小时，大部分KB1023覆盖的脂质体复合物非特异性地转染到肺和心脏中(a)。当使用可逆掩蔽(RM)进行注射，以及采用提高RM试剂浓度时，经静脉注射后14小时的肺和心脏的非特异性摄取显著地下降。在11mM RM下，经静脉注射后14小时肺和心脏显示出很少到没有非特异性摄取(b)，而经静脉注射后14小时在肿瘤组织中的递送和随后的基因表达增加了约10倍(c)。在其他的非特异性组织如肝脏(c)中未发现增加的递送，这表明该靶向对肿瘤中的内皮是特异性的。将肿瘤血管内皮从肿瘤组织中解离从而进行CAT分析和蛋白质分析是不允许的；因此向肿瘤血管内皮中的递送提高10倍是被低估的。由于肿瘤内皮约占整个肿瘤体积的5％，向肿瘤血管中提高的靶向递送很可能比单独使用未经覆盖的BTV复合物高约200倍。RM超过11mM进一步提高未增加向肿瘤组织中的递送，反而削弱了递送和随后的基因表达。因此，对于肿瘤内皮的靶向递送，使用11mM RM是最佳的。在经静脉注射后14小时测量#CAT的表达，并且与使用无RM的靶向递送的对照进行比较。*P＜0.01.^P＜0.05.N＝4～5每组。
图27，使用TSP1基因的靶向递送抑制肿瘤的生长。在经腹腔注射共培养物之后2周，将包裹了35μg TSP1 DNA的BIV脂质体复合物用配体KB1023覆盖，并且与11mM可逆掩蔽(RM)经静脉共同注射到各个小鼠中。所述的注射每两周一次，总计经静脉进行三次注射。最后一次注射后2周(经腹腔注射共培养物后8周)，将小鼠处死从而比较腹内肿瘤的尺寸。与仅注射了脂质体的对照小鼠相比，使用TSP1的人肿瘤内皮靶向递送处理小鼠证实癌症的生长显著延缓。当将靶向递送与最佳的掩蔽(RM)组合时，肿瘤生长被极大程度上抑制，几乎将肿瘤根除。当治疗增加到每周注射总共五次经静脉注射时，肿瘤生长进一步地被抑制。*N＝20。其他组每组包括5～7只小鼠。#P＜0.05。
图28显示了SK-MEL-28细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染后表达的增加。
图29显示了腹壁黑色素瘤肿瘤细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染之后表达的增加；
图30显示了左臀肌黑色素瘤肿瘤细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染之后表达的增加。
发明描述
尽管在下文中详细讨论了本发明的多种实施方案的制备和使用，应当认识到本发明提供了多种可实施的发明构思，所述的发明构思可以在大量的具体环境下进行实施。在本文中讨论的具体实施方案仅仅是为了说明制备和使用本发明的具体方式，而不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，在下文中定义了多个术语。在本文中所定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的意义。术语如“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”不意图仅指单个的实体，而是包括用具体例子说明的一般的类。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是其使用不限制本发明，除非在权利要求中指出。
在脂质体表面多聚化(multimerized)的小肽可以在重复的注射，尤其是全身性注射后产生免疫应答，并且肽可以避免渗透及沿肿瘤的间质压力梯度的递送。其他更大的配体，包括抗体、抗体片段、蛋白质、不完全蛋白等等比使用小肽远远更难用于脂质体表面上的靶向递送。需要的是小的非免疫原性分子，该分子可以位于递送系统如脂质体的表面上，从而将脂质体选择性地靶向到组织。
模拟肽是模拟肽的生物活性的分子，但是在化学本质上不再是肽。术语模拟肽一般描述了不再含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的分子。
如本文中所使用的，术语“模拟肽”指在本质上不完全是肽的分子，例如假肽(pseudopeptides)、半肽(semi-peptides)和类肽(peptoids)。无论是完全地或者部分地非肽，根据本发明的模拟肽提供了反应性化学部分的空间排布，该排布非常类似于在蛋白质-配体相互作用的热点领域发现的二级结构基序的三维分布，例如设计用于对细胞表面受体有亲和性的二价β转角模拟物。
脂质体有效负载的靶向递送对于最大疗效和降低的毒性是必需的。一般地，本发明提供了与现有的方法相比，以更高的效率介导将治疗递送到靶细胞中的配体。本发明还提供了合成该靶向配体的方法，以及使用该配体将治疗有效递送到靶细胞中的方法。这些靶向配体为小分子的事实使其能够无限制地重复注射并且不产生免疫应答。该技术改进了治疗的靶向递送，以及得到了对于患病的细胞有选择性的成像剂。这一技术可以用于大量的疾病和障碍，包括不同类型的癌症。创造了小分子的文库，并且针对多种人癌症组织的特异性筛选了该文库，所述的癌症组织如人胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌血管内皮、黑色素瘤或者NSCLC癌血管内皮。
多数脂质体递送系统在广泛治疗应用上的主要限制在于其在体内的转染效率差，经静脉递送后在肺部的累积，聚集，全身递送之后的清除(如被Kupffer细胞)，不能将大部分注射的脂质体复合物递送到靶细胞和靶器官及其他的组织。双层内陷囊泡(“BIV”)克服了这些限制[1，2]。开发BIV作为治疗工具受限于缺少可以放置于BIV-复合物的表面从而将其导向到靶细胞的非免疫原性配体。在脂质体表面多聚化的小肽可以在重复的注射，尤其是全身性注射后产生免疫应答，并且肽能避免渗透及沿肿瘤的间质压力梯度的递送。其他更大的配体，包括抗体、抗体片段、蛋白质、不完全蛋白等等比使用小肽远远更难用于脂质体表面上的靶向递送。本发明提供了非免疫原性靶向配体，从而将BIV和其他的治疗剂载体选择性地递送到癌症组织。
本发明提供了独特的靶向复合物，在其渗透包括实体瘤的间质压力梯度的密闭障碍的情况下[3]，从而BIV复合物实现了直接向肿瘤细胞的靶向递送。这一治疗方法不限于向肿瘤细胞脉管系统递送来达到治疗癌症的疗效。其他的研究者还显示了肿瘤血管床是足够渗透的，从而使脂质体能直接到达肿瘤细胞[4-6]。此外，近期的出版物报道了能够达到循环的肿瘤细胞经历名为“血管化模拟(vasculogenic mimicry)”的分化过程，其中所述肿瘤细胞在其表面上表达血管标记物而非肿瘤细胞标记物[7，8]。在本发明中提供的小分子靶向配体能够将抗血管生成药物或者基因治疗递送到肿瘤脉管系统中，从而阻碍到肿瘤的血管提供，从而导致肿瘤消退。
用于治疗癌症的靶向递送由于缺少已知的用于有效靶向的细胞表面受体而变得复杂。最理想的配体应当是小的(约500Da或者更少，如药物和小分子)，并且应当具有高的亲和性并内在化到靶细胞上专有地发现的独特受体。在我们的发明之前，还没有识别到最理想的小分子配体，该配体选择性地靶向特异性癌症细胞和癌症子类型上的细胞表面受体。本发明包括小分子靶向配体的文库，该文库用于搜索更好的用于靶向递送的细胞表面受体。该靶向策略不需要知道最好的独特受体的功能和身份。
图1显示了小分子文库设计的必要部分。使用潜在地模拟蛋白质热点的“单价”小分子来形成更大的“二价配体”的文库，所述的二价配体各个地装备了烃锚(如疏水尾部)。所述的二价配体尤其适合用于结合细胞表面受体，并且类似于在蛋白质-配体相互作用的热点处发现的二级结构基序。烃的锚使单价和二价的配体能简单地通过混合和温育过夜锚定到脂质体复合物中。在本发明的一个实施方案中，所使用的脂质体是BIV[1]。在另一个实例中，模拟肽化合物文库使用例如铕或铽的穴合物尾部代替疏水的尾部进行标记。随后，所述的文库可以使用时间分辨荧光分析直接进行筛选。
设计用于结合细胞表面受体的小分子：在细胞表面的多种蛋白质-蛋白质相互作用牵涉到插接了二聚受体或者寡聚受体的二聚配体或者寡聚配体。难以设计模拟在这些相互作用中所牵涉到的配体的小分子。Burgess及同事所使用的方法是制备在有机框架上具有侧链的小分子，所述的侧链精确地对应于蛋白质中发现的氨基酸，所述的有机框架紧密地匹配在蛋白质-蛋白质相互作用的热点处发现的蛋白质二级结构。随后将这些小分子连接到一起形成二价分子，所述的二价分子能潜在地结合受体上的两个位点，相当程度上增加结合如“半肽”β-转角类似物的自由能减少[9-17]。明显的是，这些化合物可以包含任意的氨基酸侧链，从而可以将其设计为模拟任意涉及该基序的热点处的转角。其倾向于和β-转角构型良好匹配，并且对于一些具有转角热点的蛋白质-蛋白质相互作用靶是有活性的[18-25]。这些化合物的二价衍生物可以具有显著提高的结合亲和性。这些二价分子通过方案1中突出显示的化学方法制备，从而使两个单价的、无保护的模拟肽仅通过在三嗪接头的存在下将其混合来进行选择性的偶联。此路线的关键特征在于两个官能化的单价分子可以在溶液中选择性地组合得到异源二聚体，并且只需要碳酸钾来影响此偶联。不像多数的组合合成，在本方法的最后步骤中不涉及保护基团，因此最终产品不必从保护基团残留物以及加入的清除剂材料中分离。
探索性文库的合成：使用所列出的方法制备了用于我们的研究的150个化合物的探索性文库，该文库包括15个同源二聚体和135个异源二聚体的二价小分子。
图2显示了通过将哌啶与取代的荧光素的选择性反应合成二聚体的方案。其结构列于图4、5、6和7a到7d中。所列出的分子量包括了烃尾部以及两个小分子的分子量。这些化合物与此前所制备的其他化合物文库不同，其不同在于这些化合物具有极性“弹头(warhead)”官能团(模拟物A和B)和疏水尾部。
体外递送和高通量检测：对于成功的高通量筛选，需要高度灵敏和准确的检测系统。使用高通量检测来识别连接到BIV复合物表面的单价或二价化合物，并且所述的BIV复合物比非靶向的BIV复合物更有效地内在化到癌症细胞或者人肿瘤内皮中。根据覆盖在BIV复合物上的二价配体通过细胞膜对经包裹的试剂的结合和使该试剂内在化的能力，对此二价配体进行了选择。该筛选方法比同时代最好的以噬菌体展示为主题的方法远远地更加直接和强大，由于后者仅能读出细胞表面结合并且产生大量的假阳性。本发明使得由配体官能化的BIV能通过未识别的癌症细胞表面受体进行递送。
BIV的可逆掩蔽：可逆掩蔽最初提供正电性的BIV复合物在递送中的临时屏蔽，从而绕开非靶向器官，并且随后在靶细胞表面提供重新暴露的电荷，从而允许融合性的(fusogenic)进入。因此，提供了电荷屏蔽的掩蔽从BIV复合物解离，因此是可逆的。BIV递送系统是独特有效的原因之一是因为该复合物将治疗通过与细胞膜融合递送到细胞中，并且避免了内吞途径。本发明通过使用在体内注射或者给药之前，可以添加到用于靶向递送的复合物中的“屏蔽/去屏蔽化合物”，避免了在肺部和其他非特异性靶器官的摄取(Templeton，N.S.于2006年5月2日授权的第7,037,520号美国专利B2文本，相关部分引入本文作为参考)。绕开非特异性的转染的策略称为“可逆掩蔽”并且使用中性的、小分子量的脂质(约500MW和更低)，例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷。这些脂质小并且不带电荷，因此其松散地连接到BIV复合物的表面上并且在其到达靶细胞时，在血流中通过剪切力去除。
BIV-配体覆盖的可逆掩蔽的复合物有效递送的另一个原因在于当其到达靶细胞时再次暴露复合物的全部正电荷。通过在靶细胞去除“掩蔽”，保存了复合物表面上充足的全部正电荷，从而通过融合途径进入到靶细胞中。因此，第一步采用到达和递送大于90％的该复合物到靶细胞实现了该复合物最佳的循环时间，避免了非靶组织的摄取，并且有效地与细胞表面相互作用从而产生了最理想的转染。
图26a显示了在不使用掩蔽试剂时，经静脉(IV)注射包裹了编码CAT的质粒的BIV后，在SCID小鼠的肺部和心脏的最理想的转染。图3显示了用于实现靶向递送的经优化的策略，包括通过可逆掩蔽进行去屏蔽，与细胞膜融合并且治疗剂或者成像剂进入到细胞和进入到细胞核(如果需要的话)中。
探索性文库的筛选：此150个二聚体的文库已经使用MCF-7人乳腺癌细胞、A549人类肺癌细胞、PANC1和Mia PaCa2人类胰腺癌细胞，H1299人小细胞肺癌细胞的人肿瘤内皮，PANC1人类胰腺癌细胞的人肿瘤内皮，以及在相对应的正常细胞类型中，通过体外高通量筛选进行了测试。使用我们独有的手工挤出DOTAP∶胆固醇(50∶45)[1]制备了BIV。我们通过将BIV复合物与具有烃尾部的二价化合物混合(配体覆盖的BIV复合物)并且O/N温育制备了功能化的复合物。经温育，烃尾部自发地插入到BIV复合物的表面脂双层中。这些二价化合物的各个按照从1×10-1到104pg每pg治疗剂(例如化疗药物、基因治疗剂)或者报告子(编码荧光素酶的质粒)的量的表面浓度加入。为了进行体内研究，将复合物通过1.0uM聚砜滤器(Whatman)进行过滤，随后将小分子配体和掩蔽剂加入到配体覆盖的BIV化合物中，随后如前文所述地进行经静脉注射。使用对照研究来识别将BIV导向到癌症细胞的单价或二价配体，所述导向相对于正常细胞具有选择性，或者对肿瘤内皮相对于正常内皮具有选择性。
所有的细胞类型具有上百种或者甚至上千种细胞表面受体(其大多数至今尚未识别)，并且提议的方法将其在各个孔中全部审查从而识别出最理想的配体-受体结合。将“通过”了此筛选的二价化合物包含于经可逆掩蔽的包裹了成像剂或者治疗剂的BIV复合物中，从而成像和/或破坏肿瘤及其转移瘤，或者体内的肿瘤内皮。因此，该方法在递送治疗材料或者成像剂到体内不同的癌细胞的方面尤其地直接。
可以识别结合到提供最成功的靶向递送的配体的细胞表面受体。这些配体可以固定在亲和柱上，并且可以将经可溶化处理的细胞提取物通过该柱。可将所结合的材料通过质谱和数据库分析进行蛋白质鉴定。如果我们所识别的受体是已知的信号受体，则我们还可以研究我们的配体活化该受体或者抑制该受体的活化。
阳性的命中：使用覆盖在BIV复合物表面的化合物#1035、1036、1039、1063、1064、1066和1067在MCF-7细胞的转染中得到了显著阳性的命中(或多个命中)。然而，在A549细胞中，使用化合物#1001、1003、1042、1051、1062、1096、1107、1108和1029发现了命中。图9是显示了所列出的化合物针对A549细胞的转染效率的图。命中定义为与单独使用BIV复合物的转染相比，将转染提高了至少100％(在Y轴上+2)的那些化合物。所观察到的最大的命中使转染效率提高了接近300％(在Y轴上+4)。这些命中在筛选MCF-10A细胞、MCF-7的正常或接近正常的细胞系副本时未发现。图8是显示了所列出的化合物对MCF7细胞的转染效率的图。MCF-10A细胞通常用作接近正常对照的细胞系，由于其是具有正常的或者接近正常的染色体组型的人类乳腺细胞(参考：Soule，HD等人(1990).Isolation andcharacterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line，MCF-10.Cancer Res 50：6075-6086)。图10是显示了所列出的化合物针对MCF10A细胞的转染效率的图。对于胰腺细胞筛选而言，下文的结果显示了针对PANC1和Mia PaCa2细胞的统计学上的显著命中，该命中未见于正常细胞HPDE中。图11、12和13分别显示了在PANC1、Mia PaCa2和HDPE细胞中的相对荧光素酶表达。仅有一种化合物，KB-995显示出对两种细胞系的命中。将HUVEC+人肿瘤细胞与H1299肺癌细胞以及与PANC1胰腺细胞共培养8天之后均显示转变成肿瘤内皮。通过流式细胞术得到的内皮细胞间质中提高的CD31+，以及在共培养物中VEGFA的上调，以及在HUVEC中无此现象证实了这一点(数据未在此显示)。来自体外筛选的数据显示了使用KB1116、KB1063、或者KB1123对于转染H1299肿瘤内皮的命中，以及对于HUVEC或者对于H1299无命中。图14和16显示了在共培养的HUVEC和HI299细胞中，或者单独的HUVEC细胞与在此表示的化合物的转染提高。图15显示了在HI299细胞单独的培养物与本发明的化合物的转染结果，未注意到有提高。然而，使用不同的化合物，KB1124或者KB1125产生了对于PANC1肿瘤内皮的命中。这些化合物当筛选HUVEC或者PANC1时未产生命中。
实施例1
如果导向到肿瘤脉管系统，抗血管生成可以是有效的癌症疗法。通过将肿瘤内皮特异性配体连接到我们独有的双层内陷的脂质体复合物的表面，结合使用可逆掩蔽来绕开非特异性组织和器官，我们实现了将非病毒的基因治疗靶向递送到人肿瘤脉管系统。识别了提高肿瘤内皮细胞的转染效率，而不提高正常内皮细胞或者癌细胞的转染效率的小分子。将我们的靶向的、经可逆掩蔽的复合物静脉给药到人肿瘤内皮-具有胰腺肿瘤的小鼠中，特异性地提高了对肿瘤内皮的转染。使用我们的经优化的靶向递送编码血小板反应蛋白-1的质粒的疗效研究显著地抑制了肿瘤的生长。因此，这些小分析特异性地靶向胰腺或者肺肿瘤内皮，并且因此具有成功用于抗血管生成的癌症治疗的潜力。
血管生成，也即新的血管形成的过程对于维持肿瘤生长和扩散而言是需要的[26，27]。近期FDA批准的抗血管生成药物(例如贝伐单抗(Bevacizumab)、索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib))支持了使用抗血管生成作为癌症治疗的策略[28，29]。用于基因治疗的递送载体包括病毒的、非病毒的和细菌载体(在[30]中综述)。还使用其他的递送方法如体内电穿孔、弹丸(ballistic)和其他的非针递送系统(在[30]中综述)。为了减少安全上的担心，并便于生产，对非病毒载体的使用进行了大量的工作。非病毒载体已经成功地使用在多种临床前和临床研究中(在[30]中综述)，[31-34]。
在本文中，证实了结合我们的可逆掩蔽技术，使用小分子的靶向递送，也用于绕开非靶器官中的摄取(Templeton，N.S.，于2006年5月2日授权的第7,037,520号美国专利，B2文本)。Burgess实验室开发的组合文库使得能够生产设计用于选择性结合蛋白质的小分子[35-38]。文库的成员类似于在蛋白质-配体相互作用的热点中发现的二级结构基序，例如设计为对于细胞表面受体具有亲和性的二价β-转角模拟物。重要的是，二价小分子可以具有结合细胞表面受体的选择性。在此该策略适合产生具有烃尾部的二价分子，并且在我们的实验室从这些制备功能化的BIV复合物是快速和常规的。
最后，疗效研究集中在靶向递送编码抗血管生成蛋白，人血小板反应蛋白1(TSP1)的质粒DNA。TSP1是能够阻碍血管生成，即为了维持肿瘤生长所需要的新血管的形成的分泌蛋白[39]。经修饰的TSP1模拟物ABT-510已经进展到二期临床试验中以治疗晚期癌症[39]。最近的研究还显示了，TSP1的基因递送在动物模型中显著地抑制了大量癌症和肿瘤的微脉管密度[32，33，40-42]。在本文中证明了将TSP表达质粒进行靶向的，可逆掩蔽的递送显著地提高了TSP1基因治疗的疗效。
BIV DNA：脂质体复合物的制备：质粒pCMV-THBS-1编码TSP1基因。将质粒DNA通过阴离子交换层析进行纯化。如前文所述地[43]制备DOTAP和DOTAP:Chol BIV脂质体，BIV DNA：脂质体复合物(BIV复合物)，除了按照50∶45DOTAP∶胆固醇的比例使用合成胆固醇。
二价小分子的生产：简单地说，通过选择性偶联，将β-转角单价小分子在溶液中混合来生产二价小分子同源二聚体，KB991-KB1005和异源二聚体KB1006-KB 1140。在此过程中，仅需要碳酸钾来影响该偶联。在25℃下使用30％TFA的CH2Cl2溶液来处理Boc保护的单体化合物。将溶剂除去，并且将残留物再次溶解于DMSO中从而制备0.03M的溶液。按顺序添加二氯三嗪接头骨架和K2CO3。将所产生的悬液超声15分钟并且摇动7天。将DMSO冻干，并且在上述的固体残留物中加入HCl水溶液(5％，约0.5mL)，并且超声3分钟。大多数的化合物都在酸性溶液中沉淀。在离心后，将沉淀干燥并保存。为了将单价的或者二价的小分子覆盖到BIV复合物的表面上，将烃尾部包括于分子中从而将该分子插入到表面脂双层中。首先将化合物(约10.0mg)溶解在1.0mL THF/H2O(v∶v＝1∶1)中。加入CuSO4溶液(1.0M，10μL)随后加入Cu粉末(1.0mg)。在此步骤后，加入叠氮十八烷的THF溶液(0.1mmol，0.2mL)，并且将所得到的悬液在25℃下搅拌24小时。将悬液通过填充了硅胶的玻璃管过滤，所述过滤使用30％的甲醇的CH2Cl2溶液作为洗脱剂。将溶液干燥并且浓缩成最终产品。在合成后，将固体化合物溶解在玻璃试管中的1∶1的氯仿∶甲醇中。在组织培养罩下，在管的底部在稳定的氩气流中制备薄膜。将薄膜溶解在无菌水中，产生5mg/mL的储存液并且在50℃下进行超声(Lab-Line Trans-sonic 820/H)。将重新组成的化合物按等份在-80℃下储存。
图24.体外递送和高通量荧光素酶检测。使用高通量分析来识别连接到BIV复合物表面的单价的或者二价的化合物，所述的BIV复合物与非靶向的BIV复合物相比，更有效地内在化到肿瘤血管内皮细胞中。
体内的靶向递送和CAT分析：在经腹腔注射上文详述的共培养物之后8周，制备了BIV-CAT DNA复合物，并且使用500pg化合物/μg DNA的小分子KB1023如前文所讨论地进行覆盖。将化合物与不同浓度的可逆掩蔽试剂正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷(Anatrace，Maumee，OH)混合，随后经静脉(IV)注射到小鼠体内。将各个小鼠使用总体积为110μL，含有50μg p4119CAT DNA的复合物进行注射。在经静脉注射之后14小时，将小鼠处死，收获组织并且如前文所述地提取总蛋白质[43]。使用CAT ELISA试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)，按照生产商的说明书测定CAT蛋白质的产量。使用MicroBCA试剂盒(Pierce)，按照生产商的说明书测定蛋白质的浓度。
抗血管生成的癌症治疗：在经腹腔注射前文详述的共培养物之后2周，使用前文所述的方案进行体内递送，除了将35μg TSP1质粒DNA包裹在覆盖复合物BIV-KB1023中，并且在经静脉注射之前使用11mM可逆掩蔽试剂。注射每两周进行一次，共计进行三次注射。在不同的组中，每周进行注射，共计进行五次注射。在最后的注射之后两周(在将共培养物经腹腔注射建立肿瘤模型之后8周)，将小鼠处死并且测量肿瘤的尺寸。将腹腔内肿瘤和其他的器官(肝脏、肺、脾、胰腺和结肠)在10％中性缓冲福尔马林中固定后进行解剖。
体外的人肿瘤内皮模型：肿瘤细胞分泌生长因子和细胞因子，从而引发和刺激用于其生长的血管生成(在[44]中综述)。因此，通过共培养人脐带血管内皮细胞(HUVEC)和人H1299非小细胞肺癌细胞(H1299共培养物)或者人PANC1导管胰腺腺癌(PANC1共培养物)建立了体外的人肿瘤内皮模型。
用于靶向递送的小分子文库。使用了制备的文库，所述的文库为15个同源二聚体和135个异源二聚体的二价化合物，所述二价化合物是“半肽的”β-转角类似物。明显的是，这些化合物可以包含任意的氨基酸侧链，因此其可以设计用于模拟牵涉到其基序的任意热点的转角。这些化合物与此前制备的其他化合物文库不同，其不同在于这些化合物具有极性的“弹头(warhead)”官能团(模拟物1和2)[45]和疏水尾部。在此前的研究中使用的小分子模拟肽针对一些具有β-转角热点的蛋白质-蛋白质相互作用的靶是有活性的[36，37]。该化合物之一连接到神经元的TrkA受体，并且在中风恢复和包括痴呆的神经变性紊乱中有应用[38，46]。对于我们的工作中使用的定制的文库，将两个单价的模拟物通过仅需要碳酸钾的化学步骤进行组合，从而偶合形成二价的同源二聚体和异源二聚体。该修饰极大地增加了化合物对细胞表面受体的亲和性。不像多数的组合合成，在本方法的最后步骤中不涉及保护基团，因此最终产品不需要从保护基团残留物以及加入的清除剂材料中分离。结构上将烃尾部包括在内，用于将该化合物覆盖到脂质体复合物的表面。
高通量的体外筛选：开发了新的、高通量的荧光素酶分析来筛选用于肿瘤内皮靶向配体的小分子文库。为了成功的高通量筛选，需要高度灵敏和准确的检测系统。除此之外，递送进入细胞核中，从而检测潜在的配体结合和通过细胞膜的内在化是最直接也是最终可靠的。由递送到细胞核的质粒DNA产生的荧光素酶表达满足这些标准。
在体外，使用我们的高通量筛选，筛选了针对二价和单价小分子文库的共培养物对癌细胞对HUVEC。命中定义为与单独使用BIV复合物转染相比，将荧光素酶质粒的转染提高了至少100％(在Y轴上+2)的那些化合物。在文库的筛选中，我们识别出了一种化合物KB1023，其在PANC1共培养物中特异性地提高转染效率100％(图17)但是不提高单独的PANC1细胞(图18)或者HUVEC(图19)。KB1023的结构显示在图23b中。
为了进一步证实提高的转染仅在共培养的血管内皮细胞中观察到，在transwell盘中PANC-1细胞和HUVEC的生长进行8天，并将HUVEC在底部的孔中生长。图17中显示的数据证实了仅仅对于共培养的血管内皮细胞，通过覆盖了KB1023的BIV荧光素酶DNA复合物产生了实际提高的转染。其他的人胰腺细胞系与HUVEC共培养，并且为了提高递送使用KB1023转染。仅有AsPC1显示出显著提高的转染，然而miaPaCa2和BxPC3细胞没有显示出显著提高的转染(数据未显示)。这些数据表明，靶向分子在肿瘤内皮上的表达可以在胰腺癌之间不同。
实施例2
用于抗血管生成的癌症治疗的脂质体复合物的靶向递送。如果定向到肿瘤脉管系统，抗血管生成可以是有效的癌症治疗。通过将肿瘤内皮特异性配体附着在我们的独特的双层内陷(双层内陷)脂质体复合物上，并结合使用可逆掩蔽来绕开非特异性组织或者器官，我们实现了将非病毒的基因治疗靶向递送到人肿瘤的脉管系统。通过将原代人内皮细胞与人肺癌细胞或者胰腺癌细胞共培养，建立了体外的人肿瘤脉管系统模型。表达上升的肿瘤内皮表型，包括CD31和VEGF-A，以及内皮的毛细血管样结构存留的延长证实了该模型。该共培养物用于高通量地筛选特异性的小分子文库，从而识别肿瘤内皮特异性的配体。我们识别了提高肿瘤内皮细胞的转染效率，而不提高正常内皮细胞或者癌细胞的转染效率的小分子。将本发明的靶向的、可逆地掩蔽的复合物经静脉给药到具有人肿瘤内皮-胰腺肿瘤的小鼠特异性地提高了向肿瘤内皮的转染。使用我们的经优化的靶向递送编码血小板反应蛋白1的质粒的疗效研究显著地抑制了肿瘤的生长。发现这些小分子特异性地靶向胰腺或者肺肿瘤内皮，并且在抗血管生成的癌症治疗中有用。
人肿瘤内皮的小鼠体外和体内模型。肿瘤细胞分泌生长因子和细胞因子，从而引发和刺激用于其生长的血管生成。因此，通过共培养人脐带血管内皮细胞(HUVEC)和人H1299非小细胞肺癌细胞(H1299共培养物)或者人PANC1导管胰腺腺癌(PANC1共培养物)建立了体外的人肿瘤内皮模型。我们首次寻找了内皮标记物随时间的变化，从而指示正常内皮和肿瘤脉管系统内皮的转变。已出版的文献表明，在此转变中通过流式细胞术检测的CD31在内皮细胞上的增加[30]。流式细胞术数据(图20b，c)显示了此转变在与H1299细胞的共培养中于第8和第9天之间发生。大部分的HUVEC表达低水平的CD31(图20a，由R4进行分选)。少数的内皮细胞表达高水平的CD31(由R2进行分选)。在H1299共培养物中8天后，高水平表达CD31的内皮细胞的百分比与HUVEC对照相比提高了113％(图20b；16.86％对7.9％)。在共培养物中9天后，提高的CD31表达显著地更高，其与HUVEC对照相比提高了264％(图20c，29.96％对8.23％)。
在肿瘤的脉管系统中VEGF-A自分泌环被活化，并且VEGF受体和VEGF-A的表达在mRNA和蛋白质水平上均上升[31]。VEGF-A还是关键的前血管生成因子，并且刺激内皮细胞的增殖和迁移，延长内皮细胞的存活，并且保持内皮细胞所形成的毛细血管样管状结构[32，33]。图21显示了在双室transwell板中共培养第8天时，在PANC-1共培养物中由定量RT-PCR(图21a；225％)和蛋白质印迹(图21b；160％)检测到的VEGF-A的上升的表达，所述的transwell板具有0.4μm尺寸的微孔膜。
当在Matrigel上铺板时，内皮细胞在体外短暂地形成毛细血管样管状网络。在铺板到Matrigel上后16小时(h)，我们的分析显示出在HUVEC(图22a)和PANC1共培养物的内皮细胞(图22b，在transwell板中共培养8天)之间没有显著的区别。HUVEC对照的管状结构在48小时开始降解并且到72小时时几乎全部降解(图22c)。与此相比，在PANC1的共培养物的内皮细胞中，显著量的管状结构在72小时后存留，并且又存活了11天(图22e-f)。当将PANC1细胞插入物从transwell板中去除时，未检测到从PANC1共培养物中和HUVEC中分离的内皮细胞之间在存留上的差别。这些数据证实了通过与癌症细胞共培养所产生的因子延长了共培养物的内皮管状结构的存留，这可能是由于VEGF-A表达的提高。
用于靶向递送的小分子文库的高通量体外筛选。筛选了15个同源二聚体和135个异源二聚体的二价化合物，所述的二价化合物是“半肽”β-转角类似物。其一般结构显示在图4中。在图4中，一般结构在顶部显示，名为KB991-KB1005的具体结构分别地从左到右显示。显然的是，这些化合物可以包含任意的氨基酸侧链，从而其可以设计用来模拟任意涉及该基序的热点处的转角。这些化合物与此前所制备的其他的化合物文库不同，其不同在于这些化合物具有极性的“弹头”官能团(模拟物1和2)和疏水尾部。在此前的研究中使用的小分子模拟肽针对一些具有β-转角热点的蛋白质-蛋白质相互作用的靶是有活性的。该化合物之一连接到神经元的TrkA受体，并且在中风恢复和包括痴呆的神经变性紊乱中有应用。对于我们的工作中使用的定制的文库，将两个单价的模拟物通过仅需要碳酸钾的化学步骤进行组合，从而偶合形成二价的同源二聚体和异源二聚体。发现该修饰极大地增加了化合物对细胞表面受体的亲和性。不像多数的组合合成，在本方法的最后步骤中不涉及保护基团，因此最终产品不需要从保护基团残留物以及加入的清除剂材料中分离。结构上将烃的尾部包括在内，用于将该化合物覆盖到脂质体复合物的表面。
开发了新的、高通量的分析来筛选用于肿瘤内皮靶向配体的小分子文库(图24)。为了成功的高通量筛选，需要高度灵敏和准确的检测系统。除此之外，递送进入细胞核中，从而检测潜在的配体结合和通过细胞膜的内在化是最直接也是最终可靠的。递送到细胞核的质粒DNA产生的荧光素酶表达满足这些标准；其是简明的，成熟建立的技术。使用了Luminoskan Ascent板光度计(Thermo Labsystems)来实现转染效率的高度灵敏的高通量定量。
在体外，使用我们的高通量筛选，筛选了针对二价和单价小分子文库的共培养物对癌细胞对HUVEC。命中定义为与单独使用BIV复合物转染相比，将荧光素酶治疗的转染提高了至少100％(在Y轴上+2)的那些化合物。在筛选文库中，我们识别出了一种化合物KB1023，其在PANC1共培养物中特异性地提高转染效率100％(图25a)但是不提高单独的PANC1细胞(图25b)或者HUVEC(图25c)的转染效率。该二价小分子的一般结构显示在图23a中，其包括两个用于和细胞表面受体相互作用的β-转角模拟物、用于插入到BIV脂质体复合物的烃尾部和接头。KB1023的结构显示在图23b中。
为了进一步证实提高的转染仅在共培养的血管内皮细胞中观察到，在transwell盘中PANC-1细胞和HUVEC的生长进行8天，并将HUVEC在底部的孔中生长。图25d中显示的数据证实了仅仅对于共培养的血管内皮细胞，通过覆盖了KB1023的BIV荧光素酶DNA复合物产生了实际提高的转染。其他的人胰腺细胞系与HUVEC共培养，并且为了提高递送使用KB1023转染。仅有AsPC1细胞显示出显著提高的转染，然而miaPaCa2和BxPC3细胞没有显示出显著提高的转染(图25e)。这些数据表明，靶向分子在肿瘤内皮上的表达可以在胰腺肿瘤之间不同。
用于小分子命中的文库还筛选了对非小细胞肺癌H1299的人肿瘤内皮的特异性结合。识别了不同的化合物，KB1061，其在H1299共培养物中转染效率上升，但是单独的在H1299细胞中(图25g)或者单独的HUVEC(图25h)中的转染效率没有上升。理想地，我们计划识别出一种在我们的HUVEC+肿瘤细胞的共培养物中，可以最好地介导递送到所有肿瘤血管内皮细胞的配体。然而，由于不同肿瘤脉管系统微环境，包括我们的共培养物中已知的复杂性和多样性，我们的数据显示为了达到提高向不同的肿瘤脉管系统表型中的递送，需要多种配体。识别了几种特异性地在经历血管形成反应的内皮细胞的表面上表达的标记物，并已经将其用于靶向递送[23，36-43]噬菌体颗粒、药物、治疗性抗体和其他的试剂。有趣的是，基因表达谱分析[23，37]和消减蛋白质组作图(subtractive proteomic mapping)[43]显示出在来自不同肿瘤类型的肿瘤脉管系统的内皮细胞的表面上发现的标记物有许多区别和一些相似性。在肿瘤微环境中，内皮细胞与肿瘤细胞、免疫细胞、周细胞(pericytes)、成纤维细胞、周细胞和细胞外基质(ECM)相互作用。肿瘤细胞可以直接地通过旁分泌机制或者间接地如通过改变ECM，改变内皮细胞的基因表达和表型。
在体内靶向人肿瘤内皮。证实了KB1023在体内的靶向和优化的递送，所述的递送在经静脉(IV)注射之后使用可逆掩蔽来绕开非特异性摄取。在共培养的第9天，将PANC1共培养物经腹腔注射到SCID小鼠来建立人胰腺肿瘤内皮+PANC1肿瘤模型。评估了胰腺肿瘤为约400mm3时，经腹腔注射后8周的靶向递送。当将覆盖了KB1023的BIV-CAT DNA复合物经静脉注射到我们的SCID小鼠中的PANC-1共培养模型时，大部分非特异性地递送到肺部和心脏中(图26a)。仅有少部分递送到肿瘤组织。该结果和其他报道一致，其他报道显示大部分的DNA：脂质体复合物在经静脉注射后递送到肺部[15，45]。使用了新型的“可逆掩蔽”方法，与PEG化相比其在维持对靶细胞转染的更高水平的同时，在使非特异性递送最小化上更为有效。为了避免在肺部和其他非特异性靶器官中的摄取，本发明还可以使用“屏蔽/去屏蔽化合物”，可以将该化合物在即将注射或者体内给药之前加入到用于靶向递送的复合物中(Templeton，N.S.第7,037,520号美国专利B2文本，相关的部分引入本文作为参考)。本发明的策略使用中性的、小分子量的脂质(约500MW和更低)，例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷。由于这些脂质小并且不带电荷，因此其松散地连接到BIV复合物的表面上并且在其到达靶细胞时在血流中去除。复合物的总电荷在zeta电势分析仪(Delsa 440SX，Beckman-Coulter)上进行测量。表面电荷为45.5mV的BIV复合物以最高的水平转染细胞。然而，使用可逆掩蔽试剂覆盖的BIV复合物的电荷为4.8mV并且不转染细胞、组织或者器官(Templeton，N.S.第7,037,520号美国专利B2文本，相关的部分引入本文作为参考)。因此，复合物的总电荷必须在注射后暂时地屏蔽，并且随后当转染靶细胞时重新暴露。
BIV复合物的总电荷的降低通过加入升高量的可逆掩蔽试剂来完成，所述的可逆掩蔽试剂是正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷(Templeton，N.S.第7,037,520号美国专利B2文本，相关的部分引入本文作为参考)。所述的可逆掩蔽可以针对向给定的靶器官递送，同时绕过对非靶器官和组织进行优化。图26b显示了110μL注射体积中需要11mM的正十二烷基β-D-吡喃麦芽糖苷(可逆掩蔽)来使得BIV-CAT DNA脂质体复合物在经静脉注射后绕过向肺和心脏中的递送(表达减少97％以上)。相应地，与单独递送未经覆盖的BIV复合物(对照)相比，覆盖了KB1023的BIV-CAT DNA复合物+11mM的可逆掩蔽显示出上升约10倍的向肿瘤组织中的递送(图26c)，所述的肿瘤组织包括SCID小鼠中的PANC-1共培养模型的人肿瘤血管内皮。将肿瘤血管内皮从肿瘤组织中解离从而进行CAT分析和蛋白质分析是不允许的；因此向肿瘤血管内皮中的递送提高10倍是被低估的。由于肿瘤内皮约占整个肿瘤体积的5％，向肿瘤血管中提高的靶向递送最可能比单独使用未经覆盖的BTV复合物高约200倍。我们的体内结果，结合我们的体外数据还表明KB1023靶向肿瘤内皮细胞，而非SCID小鼠中PANC-1共培养物的癌细胞。
用可逆掩蔽得到的上升的CAT表达对于针对肝脏的肿瘤也是特异性的。图26c显示了覆盖了KB1023的BIV-CAT DNA复合物+可逆掩蔽未提高在肝脏中的CAT表达，并且在肝脏中11mM的可逆掩蔽表达是微不足道的。因此，靶向是特异性的，并且不提高肝脏的摄取以及Kupffer细胞对该复合物的清除。进一步地提高可逆掩蔽量到高于11mM不导致CAT表达在肿瘤中的进一步提高。反而，表达的下降显示，11mM的可逆掩蔽对于在SCID小鼠的PANC1共培养模型中是最理想的浓度。
肿瘤生长的抑制。在将使用CAT报告基因的体内靶向优化之后，我们测试了我们的靶向递送在肿瘤生长预防中的疗效，所述的预防使用抗血管生成TSP1作为治疗基因。图27显示，在经静脉注射有或者没有小分子(配体)KB1023，以及有或者没有可逆掩蔽(RM)的BIV-TSP1DNA复合物到我们的具有人肿瘤内皮+PANC-1肿瘤的小鼠后所产生的体内疗效数据。如图27中所显示的，使用覆盖了KB1023的BIV-TSP1DNA复合物处理的小鼠证实了胰腺癌生长的显著抑制。与BIV脂质体注射对照相比肿瘤生长抑制了87.99％(平均肿瘤体积为47.27mm3对393.54mm3)。当将靶向递送与可逆掩蔽联合时，肿瘤生长抑制98.67％，同时平均肿瘤体积为5.25mm3，与此相比注射了脂质体的对照为393.54mm3。这些结果是在每两周一次，总计三次经静脉注射给药之后产生的。此外，当我们通过将注射的总次数提高到五次，每周给药一次，提高了总体的TSP1治疗剂量时，肿瘤的生长被进一步抑制，并且肿瘤几乎消除(平均的肿瘤体积是0.7mm3)。尽管使用无靶向递送的TSP1处理的小鼠证实肿瘤生长阻滞62.69％，平均体积为146.82mm3，该降低在统计学上是不显著的(P＞0.05)。有趣的是，我们超过了报道中TSP1抗血管生成基因治疗所报道的疗效数据，所述的报道中使用病毒载体、腺病毒[29]或者腺相关病毒[12]、阳离子聚合物[28]或者细菌载体，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)[27]。由此推测我们的提高的疗效归因于高水平的特异性递送以及专一地在人肿瘤内皮中进行的基因表达。
肿瘤的脉管系统在形态学上是异常的，并且血管的内皮细胞与正常的内皮细胞在分子水平和功能水平上不同。为了开发最为有效的抗血管生成癌症疗法，建立稳健的和合适的动物模型，从而理解肿瘤脉管系统的生物学并且通过高通量筛选来识别抗血管生成试剂是必要的。使用磁性珠子将肿瘤内皮细胞从肿瘤组织中分离是用于探索肿瘤内皮标记物的有力途径，然而该途径的成本和低产率阻碍了此种肿瘤内皮的常规研究。另一种考虑在于，肿瘤内皮表型在从肿瘤的微环境中分离之后不久丧失。为了维持肿瘤和内皮细胞之间的这种重要串扰(crosstalk)，通过将肺癌或者胰腺癌细胞和HUVEC共培养，产生了体外的肿瘤血管生成模型。本模型系统提供了用于发现新的抗血管生成化合物，如VEGF-A阻滞剂的稳健的平台。该模型还允许研究VEGF-A撤销和脉管系统的正常化，由于来自癌细胞的刺激物可以从系统中方便地去除。总之，此模型提供了简单的和可行的方式来包含肿瘤和内皮细胞之间的动态联系。该模型成功地用于识别几种肿瘤内皮靶向配体，这进一步地支持了此观点。
本发明包括通过引入靶向递送的小配体到肿瘤内皮，以及使用提供绕开非特异性器官和组织的可逆掩蔽而极大地提高了BIV脂质体的特异性递送。靶向递送可以使用在脂质体表面多聚化的小肽实现，但是其在重复注射，尤其是全身性注射之后可以产生免疫应答，并且肽可以避免渗透及沿肿瘤的间质压力梯度的递送。其他的更大的配体，包括抗体、抗体片段、蛋白质、不完全蛋白等等比使用小肽远远更难用于脂质体表面上进行靶向递送。我们的经优化的靶向递送在小鼠异源移植模型中癌症生长预防中高度地有效，并且我们的靶向配体是小分子这一事实使得能无限制地进行重复注射，而不产生免疫应答。此外，我们的包含配体(＜500Da)和可逆掩蔽试剂的递送系统是非免疫原性的并且是无毒的，并且对于临床上的使用是安全的。进一步地，我们的每两周一次或者每周一次的经静脉注射给药是方便的，并且可以在医学实践中广泛地使用。因此，我们的靶向的、可逆掩蔽的递送系统在有效进行抗血管生成的癌症治疗中具有巨大的潜力。
与来自其他组中也使用脂质体来递送TSP1基因在人肿瘤异源移植小鼠模型中用于癌症治疗的数据[33，41]相比。在此呈现的结果证实了对癌症生长的显著抑制，这归因于我们的高水平的特异性递送以及专一地在人肿瘤内皮中进行的基因表达。其他的组也显示，p53和TSP-1基因治疗的组合协同地抑制了癌症的生长[33，41]。可以将联合治疗与本发明一起使用。已经使用了非病毒的、病毒的和细菌的载体，包括阳离子型聚合物(Superfect)和几种生物衰减的用于抗血管生成的癌症治疗的病毒载体[32，40-42]。尽管通过局部注射和全身性注射其全部显示出显著的癌症生长延缓，但其疗效数据不如在此证明的数据有稳健性(图27)。将治疗剂直接注射到肿瘤中可以用在一些类型的在宏观上可见的原位癌中，如皮肤癌、乳腺癌。然而此方法是有限制的，并且对于胸内的、腹腔的和其他癌症以及对于癌症转移是没有用的。经静脉注射是治疗这些癌症的最有效的递送途径。对于病毒载体来说安全性也是要考虑的问题，尤其是当全身性给药的时候。减弱病毒是非病原性的，但是仍然是免疫原性的并且不适用于重复注射。Zhang报道了在胰腺癌治疗中抗血管生成基因治疗的重组腺相关病毒(rAAV)介导的递送。然而，对于rAAV介导的转基因而言在经肌肉或者经门静脉递送之后需要4周才能在循环中达到峰表达水平因此在肿瘤确立之前4周开始治疗[32]。用于达到治疗的稳定状态的延长推迟将为其在医学上应用带来限制。与此相比，使用本发明的BIV脂质体递送系统的基因表达在全身性给药之后，在24小时[48]内达峰，并且针对癌症生长提供更快的作用。Lee等人证实了使用表达TSP1基因的沙门氏菌(Salmonella)时，黑色素瘤的肿瘤生长被显著地抑制。然而，此载体向正常组织中有显著的递送(例如肝脏和脾脏)，这强调了改进此载体使其更特异性地靶向的需求[40]。然而对于我们的靶向的、可逆掩蔽的BIV递送系统而言，体内的CAT分析数据显示在包括肝脏的非靶组织中有微不足道的转染。
研究发现了在特定类型的肿瘤上表达的肿瘤内皮标记物(TEM)以及几种pan-TEM[23，37，49]。其次，潜在的受体可以是以相对低的水平在正常内皮细胞上表达，而在一些胰腺肿瘤内皮细胞上表达上调的分子。通过使用我们在此报道的方法，寻找更好的细胞表面受体来用于靶向递送是关键的并且是可以实现的。显而易见的是，对于此靶向策略而言，不需要知道最好的受体的功能和身份。Burgess实验室开发的方法使得能够产生设计用于选择性结合蛋白质的小分子。重要的是，二价小分子具有结合细胞表面受体的选择性，并且类似于在蛋白质-配体相互作用的热点处发现的二级结构基序。设计了对于细胞表面受体具有亲和性的二价β-转角模拟物。尽管迄今为止我们没有识别出配体的受体，我们仍然可以将我们的靶向递送系统在临床上用于抗血管生成的癌症治疗。实际上，多种药物在完全了解其机制之前已经被FDA批准。我们报道了尤其有效的抗血管生成治疗方法。此外，我们的靶向的、可逆掩蔽的BIV递送系统也可以应用到除了癌症及转移瘤之外的疾病和障碍的治疗，所述的BIV递送系统使用靶向递送到其他疾病的靶细胞的小分子。
细胞培养。PANC1、miaPaCa2和H1299细胞系购自American TypeCulture Collection(ATCC，Berthesda，MD)。AsPC-1和BxPC-3是Dr.Johnny(Changyi)Chen(Baylor College of Medicine，Houston，TX)慷慨馈赠的。PANC1和miaPaCa2在高葡萄糖的DMEM中培养。AsPC-1、BxPC-3和H1299在RPMI-1640培养基中培养。上述的全部培养基都补加了10％的胎牛血清(FBS)，并且在用于miaPaCa2细胞生长的培养基中加入了2.5％的马血清。HUVEC购自Lonza(Clonetics，Walkersville，MD)并且在内皮基础培养基(Clonetics)中生长，该培养基补加了SingleQuots(Clonetics)。将HUVEC培养传代3到6代。在细胞计数后，以约10-30∶1 HUVEC∶癌细胞的比例和5,000HUVEC/cm2的接种密度铺板，从而建立HUVEC和癌细胞的共培养物。在一些实验中，将共培养物保持在双室transwell系统中，其从物理上将癌症细胞与EC分开而同时使两种细胞种群通过0.4μm尺寸的微孔膜(Corning)进行自由的扩散。
流式细胞术。收获细胞并将其在1xPBS中以10×106/ml进行再悬浮。将细胞悬液使用抗-CD31:RPE(GeneTex，Irvine，CA)，根据生产商的说明书进行温育。在洗涤之后，向细胞悬液中加入碘化丙啶从而从分析中排除死亡的细胞。将流式细胞术在BD LSRII(BD Biosciences，San Jose，CA)上进行，并且通过CellQuest程序进行分析，所述的程序设置了向前散射对侧面散射的限制。
实时定量RT-PCR。合成了含有如下序列的人VEGF-A引物：正向5′-TGGAATTGGATTCGCCATTT-3′(SEQ ID NO.：1)和反向5′-TGGGTGGGTGTGTCTACAGGA-3′(SEQ ID NO.：2)。β-肌动蛋白的引物序列是：正向5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′(SEQ ID NO.：3)和反向5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′(SEQ ID NO.：4)。使共培养的细胞在transwell板中生长。使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照生产商的方案从该细胞中提取总RNA并且使用DNase I(Invitrogen)处理。使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)将1μg的总RNA反转录成cDNA，所述的试剂盒中含有寡聚(dT)和随机引物的混合物。实时PCR在ABI PRISM7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行，其使用了DyNAmo HS SYBR Green qPCR试剂盒(New England BioLabs，Finnzymes，Finland)。循环的条件如下所示：在95℃下起始变性10分钟，随后在95℃下15s进行40个周期以及60℃下1分钟。
蛋白质印迹。在transwell盘中共培养之后8天，将来自EC裂解液的50mg蛋白质加载到9％SDS-PAGE凝胶上，随后通过蛋白质印迹转移到硝酸纤维素膜(Hybond ECL；Amersham Pharmacia Biotech)上。所述的膜使用5％的脱脂奶粉的TBS溶液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl[pH 7.4]，以及0.05％Tween 20)进行封闭。在与1μg/mL的人抗VEGF一抗(R&D Systems，Minneapolis，MN)在室温下(RT)温育2小时之后，将膜以5分钟的间隔，使用TBS/0.05％Tween 20洗涤6次，并且与抗-山羊辣根过氧化酶(Transduction Laboratories，Lexington，KY)连接的二抗温育[50]。
管形成检测。在transwell盘中共培养后8天，4℃下将Matrigel(BDBiosciences，San Jose，CA)加入到空白6孔transwell板的接收室中，并且在37℃下温育2小时。在Matrigel固化后，将内皮细胞进行胰蛋白酶化，计数并且按5×105个细胞/孔接种在顶部。将细胞温育16小时从而使毛细血管样结构形成。为了保持共培养的条件，将癌症细胞在transwell板的上室中进行培养。每天观察管结构，从而监测形态学和存活的完整性。
BIV DNA：脂质体复合物的制备。质粒p4241和p4119是Robert Debs(California Pacific Medical Center Research Institute，San Francisco，CA)慷慨馈赠的。这些质粒分别编码荧光素酶和CAT基因。pCMV-THBS-1是由DavidRoberts(National Institutes of Health，Bethesda，MD)馈赠的礼物并编码TSP1基因。全部的质粒都在氨苄青霉素选择下于DH5α大肠杆菌中生长。使用Qiagen Endo-Free Plasmid Giga试剂盒(Qiagen，Hilden Germany)通过阴离子交换层析纯化质粒DNA。按照此前描述的，制备DOTAP和DOTAP:Chol BIV脂质体，BIV DNA：脂质体复合物(BIV复合物)[15]，除了按照DOTAP∶胆固醇为50∶45的比例使用合成胆固醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。
二价小分子的生产。简单地说，通过选择性偶联，将β-转角单价小分子在溶液中混合产生二价小分子，所述的二价小分子为同源二聚体KB991-KB1005，以及异源二聚体KB1006-KB1140。在此过程中，仅需要碳酸钾来影响偶联。在25℃下使用30％TFA的CH2Cl2溶液来处理Boc保护的单体化合物。将溶剂去除，并且将残留物再次溶解于DMSO中从而制备0.03M的溶液。随后按顺序添加二氯三嗪接头骨架和K2CO3。将所产生的悬液超声15分钟并且摇动7天。将DMSO冻干，并且在上述的固体残留物中加入HCl水溶液(5％，约0.5mL)，并且超声3分钟。大多数的化合物都在酸性溶液中沉淀。在离心后，将沉淀干燥并保存。为了将单价的或者二价的小分子覆盖到BIV复合物的表面上，将烃尾部包括于分子中从而将该分子插入到表面脂双层中。首先将化合物(约10.0mg)溶解在1.0mLTHF/H2O(v∶v＝1∶1)中。加入CuSO4溶液(1.0M，10μL)随后加入Cu粉末(1.0mg)。在此步骤后，加入叠氮十八烷的THF溶液(0.1mmol，0.2mL)，并且将所得到的悬液在25℃下搅拌24小时。将悬液通过填充了硅胶的玻璃管过滤，所述过滤使用含30％甲醇的CH2Cl2溶液作为洗脱剂。将溶液干燥并且浓缩成最终产品。在合成后，将固体化合物在玻璃试管中溶解于的1∶1的氯仿∶甲醇。在组织培养罩下，在管的底部在稳定的氩气流中制备薄膜。将薄膜溶解在无菌水中，产生5mg/mL的储存液并且在50℃下进行超声(Lab-LineTrans-sonic 820/H)。将化合物按等份在-80℃下储存。
体外递送和高通量的荧光素酶分析。使用本发明的高通量分析来识别连接到BIV复合物表面的单价的或者二价的化合物，所述的BIV复合物与非靶向的BIV复合物相比，更有效地内在化到肿瘤血管内皮细胞中。此分析突出了荧光素酶报告基因，和专用的读板仪光度计的特征，Luminoskan Ascent，其鉴定用于荧光素酶表达的超敏感检测(Thermo Electron Corp.，Waltham，MA)并具有3个进样器/机器人分配器。Luminoskan是多用途的，其多用途在于其允许采用从单个的10cm的组织培养盘到384孔板的许多不同的样品形式，其全部都可以从样品的上部或底部进行分析。其对于除了样品的高动态范围外(在整个取样面积上大于9个数量级)对于观察小的区别，提供了尤其高的灵敏性(＜1fmol ATP/孔)。Luminoskan通过允许优化控制检测的条件提供精确的数据，所述的条件包括温度(发出的光的量对小的变化是很灵敏的)，试剂的充分混合(轨道震荡特征)，各次测量之间恒定的延迟，以及其他的特征如对每个样品进行多次重复(30次/孔以及高达3500次/培养盘)。最后，设计了良好地用于数据管理的Luminoskan Ascent软件。如果编码荧光素酶的质粒DNA被内在化，并且有效地转运到细胞核，则在板上的孔中生长的细胞中检测到生物发光。读出是快速的，从而在一个二价化合物-一个孔的形式下能快速地测试官能化的BIV复合物。将正常的HUVEC用作对照，并且比较了单独向肿瘤细胞中以及向共培养物中的递送。使用Luminoskan数据来识别与人类肿瘤细共培养的HUVEC中产生最高水平的荧光素酶基因表达，而在正常的HUVEC细胞或者在肿瘤细胞中不如此的二价化合物。将小分子文库中的约150个成员在多种浓度下在BIV荧光素酶复合物的表面上进行测试。还测定了最优的转染时间、用于转染的复合物的量、最优的积分时间和延迟时间。
简单地说，在共培养之后7天收获细胞并且将50μL的细胞悬液以2×104个细胞/孔接种到96孔板中。如前所述制备复合物[15]。将化合物稀释到在复合物中包裹有0.5、10、200、500pg化合物/μg DNA的浓度。将1μL的化合物缓慢地移液到预先加载到96孔板上的10μL的BIV-荧光素酶DNA复合物的中心，并且随后在室温下温育过夜以进行最大的覆盖。次日，将细胞使用稀释到5μL的0.52μL覆盖了化合物的BIV复合物进行转染，并置于45μL的无血清培养基中。在转染之后将细胞在细胞培养基中生长。对于HUVEC与H1299细胞的共培养，使用了DOTAP BIV脂质体，并且将细胞转染4小时。对于HUVEC和PANC1的共培养，使用了DOTAP:Chol BIV脂质体，并且将细胞转染2小时。在转染后24小时，将细胞使用1％TritonX-100(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)裂解，随后使用Luminoskan Ascent进行高通量荧光素酶分析，从而检测基因表达。在检测中使用1秒的积分时间和14秒的延迟时间。将覆盖了化合物的BIV脂质体复合物的转染效率与未覆盖的复合物进行比较。对于每个条件测量三次。所有的稀释都是使用5％的右旋糖的水溶液(D5W)进行的。
人肿瘤内皮-胰腺癌小鼠模型。在共培养8天之后，收获HUVEC和PANC1共培养细胞，并且在1xPBS中再悬浮。将含有2×106经共培养的细胞的500μL细胞悬液经腹腔内注射到8～10周龄的中毒联合免疫缺陷小鼠(severe combined immuno deficient mouse)中。全部动物的步骤都按照BaylorCollege of Medicine(Houston，TX)的惯用指导方针，采用经批准的动物方案进行。
体内的靶向递送和CAT检测。在上文详述的共培养物经腹腔注射后8天，制备了BIV-CAT DNA复合物，并且将其使用小分子KB1023以500pg化合物/μg DNA如前文讨论地进行覆盖。在经静脉注射到小鼠之前，将该复合物与不同浓度的可逆掩蔽试剂，正十二烷基-D-吡喃麦芽糖(Anatrace，Maumee，OH)混合。将各个小鼠使用含有50μg的p4119CAT DNA的总体积为110μL复合物进行注射。在经静脉注射后14小时，将小鼠处死，收获组织，并且如前文所描述地提取总蛋白[15]。使用CAT ELISA试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)按照生产商的说明书测定CAT蛋白质的产量。蛋白质的浓度使用Micro BCA试剂盒(Pierce)按照生产商的说明书进行测定。
抗血管生成的癌症治疗。将如前文详述的共培养物经腹腔注射后2周时，使用前文所述的方案进行体内的递送，除了在BIV-KB1023覆盖的复合物中包裹了35μg TSP1的质粒DNA并且在经静脉注射之前使用了11mM的可逆掩蔽试剂。每两周进行注射一次，总计进行三次。在不同的试验组中，每周进行注射一次，总计进行五次。在最终的注射之后(将共培养物经腹腔注射后的8周建立肿瘤模型)两周，处死小鼠，并且测量肿瘤的尺寸。将腹腔内的肿瘤和其他的器官在10％的中性缓冲福尔马林中固定后解剖。
统计分析。数据表示为平均值±SEM。使用unpaired student t检验比较试验组和对照组。P＜0.05时认为是显著的。
SK-MEL-28细胞是得自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA)的黑色素瘤细胞系。腹壁黑色素瘤肿瘤细胞和左臀肌黑色素瘤肿瘤细胞由Medical City，Dallas，TX的外科医生提供，其样品位于Gradalis，Inc.Dallas，Texas。患者组织首先使用胶原蛋白酶和pulmozyme，随后使用组织分离器进行解离，所述的组织分离器解离根据生产商说明书(MiltenylBiotec，Bergisch Gladbach，Germany)的标准步骤进行。SK-MEL-28细胞根据ATCC所规定的条件进行生长。将亲代细胞每周传代一次，并且在第九次传代之后进行检测。将全部的细胞都在补加了10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)中生长。全部的其他条件都如上文中的。
图28显示了将SK-MEL-28细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染后表达提高。图29显示了将腹壁黑色素瘤肿瘤细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染后表达提高。图30显示了左臀肌黑色素瘤肿瘤细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染之后表达的增加。发现了KB1109在来自所有来源的黑色素瘤细胞中显著地提高表达。KB1037和KB1123在SK-MEL-28和来自患者GB0270腹壁的黑色素瘤细胞中提高表达。
预期的是，本说明书中所讨论的任何实施方案可以通过关于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
要理解的是，本文所述的具体实施方案是通过举例说明而不是限制本发明的方法来显示的。本发明的主要特征可以在不脱离本发明范围的情况下用于各种实施方案中。本领域技术人员将认识到，或者仅仅利用常规的实验能够确定本文所述具体步骤的许多等同物。这样的等同物被认为是在本发明的范围内，且被权利要求所涵盖。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请均引入本文作为参考，其引入的程度如同各个独立的出版物或专利申请具体并独立地被指明引入作为参考。
词语“一个(a)”或“一种(an)”当与权利要求和/或说明书中的术语“包含(comprising)”结合使用时，可以指“一种”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的意思相一致。在权利要求中所使用的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指明仅仅是指替代物，或替代物相互排斥，尽管公开内容支持仅仅指替代物及“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“大约”用来说明这样的值，其包括用来测定所述值的装置、方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。
如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的“包含”，如“包含(comprise)和包含(comprises)”)，“具有(having)”(以及任何形式的“具有”，如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及任何形式的“包括”，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的“含有”，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括的或开放式的，且不排除额外的，未述及的元素或方法步骤。
如本文所使用的术语“或它们的组合”是指在该术语之前所列举项目的全部排列和组合。例如，“A、B、C或它们的组合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一种，并且如果在特定的上下文中顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，明显包括的是包含一种或多种项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解的是，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非从上下文中另外是明显的。
如本文中所使用的，近似值的词语例如而非限制的，“约”、“大体的”或者“大体上”是指当如此修饰时，应理解为不必是绝对的或者完美的条件，而应认为该条件对于本领域普通技术人员而言其足够接近指定该条件作为所呈现的保证。说明书可以变化的程度取决于可以进行多大的变化并且本领域普通技术人员仍然认识到经修改的特征仍然具有想要的性质和未修改的特征的性能。一般来说，同时针对当前的讨论，本文被近似值词语如“约”修饰的数值可以从规定的数值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或者15％。
根据本发明的公开内容，在不过度的实验下可以制备和实施本文所公开和要求保护的全部组合物和/或方法。尽管已经以优选的实施方案的形式描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以改变本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或方法的步骤的顺序。对本领域技术人员而言明显的所有这样相似的替代和修改被认为是在所附的权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。
参考文献
在发明详述中的粗体的参考文献号分别地对应于授权专利和文献中的原始编号。斜体的编号是用于专利申请的编号。随后的编号是经改正的编号。
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21.Stereochemical Implications of Diversity in b-Turn Peptidomimetic Libraries，Y.Feng，M.Pattarawarapan，Z.Wang，and K.Burgess，J.Org.Chem.，1999，64，9175-9177.
22.Facile Macrocyclizations to b-Turn Mimics with Diverse Structural，Physical，andConformational Properties，C.Park，and K.Burgess，J.Comb.Chem.，2001，3，257-266.
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Claims (34)

1.一种用于将治疗剂靶向递送到组织的组织特异性靶向配体，其中所述组织特异性靶向配体为具有下式的化合物：
A-骨架-A’，
其中所述的骨架具有式：
a)或
b)
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’是单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自以下的片段：
2.权利要求1所述的配体，其中A和A’是相同的。
3.权利要求1所述的配体，其中所述的组织是癌细胞、组织或者内皮，所述的癌细胞、组织或者内皮选自胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌血管内皮或者NSCLC癌血管内皮。
4.一种用于合成靶向递送治疗剂到组织的小分子复合物的方法，所述的方法包括以下步骤：
将具有式A和A’的两个未保护的单价模拟肽化合物共价地偶联到骨架，
其中所述的骨架具有式：
a)
或者
b)
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’是单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自以下的片段：
5.权利要求4所述的方法，其中所选择的单价模拟肽化合物是相同的。
6.权利要求4所述的方法，其中所述的组织是癌细胞、组织或者内皮，所述的癌细胞、组织或者内皮选自胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌血管内皮或者NSCLC癌血管内皮。
7.一种配体功能化的递送系统，其包括：
作为治疗剂载体的脂质体；
用于将治疗剂靶向递送到组织的组织特异性靶向配体，其中所述组织特异性靶向配体为具有下式的化合物：
A-骨架-A’，
其中所述的骨架具有式：
a)
或者
b)
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’是单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自以下的片段：
8.权利要求7所述的配体功能化的递送系统，其中所述的治疗剂载体是阳离子型脂质体，所述的阳离子型脂质体具有内部的脂质双层和外部的脂质双层。
9.权利要求7所述的配体功能化的递送系统，其中所述的组织是癌细胞、组织或者内皮，所述的癌细胞、组织或者内皮选自胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌血管内皮或者NSCLC癌血管内皮。
10.用于将有效负载递送到靶组织的递送系统，其包括：
(a)具有下式的化合物的靶向配体：
A-骨架-A’，
其中所述的骨架具有式：
a)
或者
b)
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’是单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自以下的片段：
(b)将该化合物掺入在其中的脂质双层，
其中所述的脂质双层选自细胞膜、亚细胞的膜、多层囊泡和双层囊泡，
其中所述的脂质双层包封治疗剂并且由靶向配体包裹以产生靶向的脂质体复合物；和
(c)作为可逆掩蔽试剂的小的中性脂质，其具有500 Da或更低的分子量，所述的小的中性脂质与靶向脂质体复合物组合。
11.权利要求10所述的递送系统，其中所述的脂质体是双层内陷囊泡。
12.权利要求10所述的递送系统，其中所述的小的中性脂质是n-十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷。
13.权利要求12所述的递送系统，其中所述的靶组织是人胰腺癌。
14.权利要求10所述的递送系统，其中所述的靶向配体选自以下的化合物：
KB995，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’具有式：
KB1005，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’具有式：
KB1012，其中所述骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
和
KB1109，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
15.权利要求14所述的递送系统，其中所述的靶组织是人乳腺癌。
16.权利要求10所述的递送系统，其中所述的靶向配体选自以下的化合物：
KB1036，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1039，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1063，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1064，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1066，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
以及
KB1067，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
17.权利要求16所述的递送系统，其中所述的靶组织是人非小细胞肺癌。
18.权利要求10所述的递送系统，其中所述的靶向配体选自以下的化合物：
KB1001，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’具有式：
KB1003，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’具有式：
KB1042，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1051，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1062，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1096，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1107，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
KB1108，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
和
KB1029，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
19.权利要求18所述的递送系统，其中所述的靶组织是人非小细胞肺癌血管内皮。
20.权利要求10所述的递送系统，其中所述的靶向配体是化合物KB1061，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
21.权利要求20所述的递送系统，其中所述的靶组织是人胰腺癌血管内皮。
22.权利要求10所述的递送系统，其中所述的靶向配体是化合物KB1023，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
23.权利要求22所述的递送系统，其中所述的治疗剂是编码抗血管生成蛋白人血小板反应蛋白-1(TSP1)的质粒DNA。
24.权利要求20所述的递送系统，其中所述的靶组织是黑色素瘤。
25.权利要求10所述的递送系统，其中所述的靶向配体是选自以下化合物的化合物：
KB1037，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
以及
KB1109，其中所述的骨架具有式：
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’中的一种具有式：
并且A和A’中的另一种具有式：
26.化合物在制备用于分离模拟肽化合物的模拟肽文库中的用途，所述的模拟肽化合物用于结合至靶组织，其中：
所述的化合物具有式：
A-骨架-A’；
其中所述的骨架具有式：
a)
或者
b)
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’是单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自以下的片段：
并且
将靶组织在体外接触所述的模拟肽化合物；
将特异性地结合至靶组织的那些模拟肽化合物分离；并且
表征特异性地结合至靶组织的化合物的式。
27.权利要求26所述的用途，其中模拟肽文库的结合是通过比较与肿瘤细胞和正常细胞的结合来进行筛选的。
28.权利要求26所述的用途，其中所述的模拟肽文库是使用时间分辨荧光分析来直接筛选的。
29.权利要求26所述的用途，其中所述的模拟肽文库在基于转染的系统中筛选。
30.化合物在制备用于筛选模拟肽化合物的模拟肽文库中的用途，所述的模拟肽化合物结合至靶组织或细胞，其中：
所述的化合物具有式：
A-骨架-A’，
其中所述的骨架具有式：
a)
或者
b)
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’是单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自以下的片段：
并且
将所述的模拟肽化合物与脂质混合以形成脂质体；
将靶组织在体外和模拟肽化合物接触；
分离特异性地结合至靶组织的那些模拟肽化合物；并且
表征特异性地结合至靶组织的化合物的式。
31.化合物在制备用于筛选模拟肽化合物的模拟肽文库中的用途，所述的模拟肽化合物结合至靶组织或细胞，其中：
所述的化合物具有式：
A-骨架-A’，
其中所述的骨架具有式：
a)
或者
b)
其中虚线代表连接到A和A’的点；
其中A和A’是单价模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自以下的片段：
将模拟肽化合物与脂质混合以形成脂质体，其中所述的脂质体还包含用于递送到细胞的核酸；
将靶组织在体外和所述模拟肽化合物接触；
分离特异性地结合至靶组织的那些模拟肽化合物；并且
表征特异性地结合至靶组织的化合物的式。
32.权利要求31所述的用途，其中所述的靶组织进一步限定为组织培养物中的细胞。
33.权利要求31所述的用途，其中所述的靶组织进一步限定为组织培养物中的细胞，并且所述的细胞是根据核酸对细胞的作用选择的。
34.权利要求31所述的用途，其中所述的靶组织进一步限定为组织培养物中的细胞，且其中所述的核酸是用于阴性或者阳性选择的选择性标记物，所述的核酸表达用于阳性或者阴性选择的选择性标记物，或者表达可检测的标记物。
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